KR20020013488A - 핵막을 통하여 핵산을 전이시키기 위한 세포내 수송시스템의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 핵 수송제, 이러한 핵 수송제를 포함하는 유전자 전이 시스템, 상기 핵 수송제를 사용하여 진핵 세포의 핵 내로 DNA를 수송하는 방법, 및 암, 바이러스성 감염, 신경계 질환, 조직이식 거부, 및 단일유전자성 또는 다유전자성 유전병을 치료하기 위한 유전자 요법에 있어서의 상기 핵 수송제의 용도에 관한 것이다.

Description

핵막을 통하여 핵산을 전이시키기 위한 세포내 수송 시스템의 용도 {USE OF THE CELL'S OWN TRANSPORT SYSTEM FOR TRANSFERRING NUCLEIC ACIDS ACROSS THE NUCLEAR MEMBRANE}

본 발명은 핵 수송제, 이러한 핵 수송제를 포함하는 유전자 전이 시스템, 상기 핵 수송제를 사용하여 진핵 세포의 핵 내로 DNA를 수송하는 방법, 및 암, 바이러스성 감염, 신경계 질환, 조직이식 거부 및 단일유전자성 또는 다유전자성 유전병을 치료하기 위한 유전자 요법에 있어서의 상기 핵 수송제의 용도에 관한 것이다.

유전 물질이 의도한 바대로 발현하기 이전에는 분열되지 않는 모든 세포 내로 유전 물질을 전이시키기 위해서는 핵 내로의 능동 수송이 필요하다. 핵산에 대한 핵 수송 시스템이 매우 중요한데, 이는 상기 시스템이, 거의 분열되지 않거나 전혀 분열되지 않는 세포 내로의 DNA의 효율적인 전이를 촉진시키기 때문이다[참조: Dowty et al., 1995, Wilke et al., 1996]. 대부분의 원시 세포는 이 그룹에 속한다. 다음 2가지 이유에서 원시 세포에 대한 과학적인 관심이 고조되어 있다. 첫째, 특정 유기체로부터 신선하게 분리시킨 원시 세포는 이로부터 유도된 세포주 보다 훨씬 더 우수하게 세포 유형의 기능 상태를 반영하고 있다. 둘째, 이들 세포는 유전자 요법에 대한 표적 세포이다. 또한, 핵 수송 시스템은, 전이 개시 시점과 분석 시점 사이 동안에는 분열되지 않는 세포가 또한 전이된 유전 물질을 발현할 수 있도록 함으로써, 수립 세포주(established cell line) 내로의 DNA 전이 효율을 증가시킨다.

유전 물질은 핵 내에서 활성을 나타낸다. 이 내부에서의 수송은 유사분열 과정시 핵막이 일시적으로 붕해되는 세포 분열 동안에 동시에 발생될 수 있거나, 또는 능동적으로 일어나야 한다.

1) 핵 단백질은 핵 국재화 시그날을 통하여 핵 내로 수송된다.

핵을 덮고 있는 이중막은 세공(pore)을 지니고 있다. 어떠한 분자도 확산에 의해 이들 세공 내를 통과할 수 없다. 약 50kDa 보다 큰 단백질이 핵 내로 유입되기 위해서는, 해당 수송기에 의해 인식되어야만 하는 핵 국재화 시그날(NLS)이 필요하다. 전형적으로, 4개 내지 8개의 아미노산으로 이루어진 시그날이면 충분하고, 이에는 양성 아미노산인 아르기닌과 리신이 풍부하며 프롤린을 함유한다. 이는, 포유류 NLS가 또한 효모에서도 작용성이 되도록 진화시 강력하게 보존된다. 표적 분자를 핵 내로 수송하기 위한 도구로서 이종(heterologous) NLS가 사용될 수도 있다. 이를 위하여, NLS를 세포질성 단백질 서열 내로 비교적 무작위 위치에 혼입시킬 수 있거나, 또는 단백질이나 심지어 금 입자와 화학적으로 커플링시킬 수 있다[참조: Gorlich, 1998].

2) 많은 바이러스는 이들의 DNA를 핵 내로 수송하기 위하여 세포의 핵 단백질 수송기를 이용한다.

휴지 세포를 감염시킬 수 있는 HIV 및 기타 렌티바이러스는 이들의 DNA를 핵내로 전이시키기 위해 세포내 수송기 및 바이러스성 단백질을 이용하고 있다. HIV 예비-통합 복합체의 Vpr 및 매트릭스 단백질[참조: Gallay et al., 1996] 내의 NLS는 분열되지 않은 세포를 감염시키는데 필수적이다[참조: Naldini et al., 1996]. 바이러스가 이들의 게놈을 어떤 방법으로 핵 내로 전이시키는에 관해서는 전혀 공지된 바가 없긴 하지만, NLS를 함유하는 바이러스성 구조 단백질의 도움을 받는다는 것이 일반 원칙일 것이다. 이는 또한, 다음과 같은 관찰 결과에 의해 뒷받침된다: HSV 캡시드 단백질 내에서의 특이적 돌연변이가 바이러스성 DNA의 핵 내로의 수송을 억제한다[참조: Batterson et al., 1983]. 아데노바이러스 DNA는 붕해된 캡시드의 헥손 단백질과 함께 핵 내로 수송된다[참조: Greber et al., 1993]. SV40 DNA을 핵 내로 수송하는 것은 DNA와 연합된 상태를 유지하고 있는 바이러스성 단백질(아마도 Vp3)에 의해 중개된다[참조: Nakanishi et al., 1996]. NLS을 함유하는 2개의 세균성 단백질이 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) T-DNA을 식물 핵 내로 이입시키는데 책임이 있다[참조: Citovsky et al., 1994].

휴지 세포를 감염시킬 수 있는 몇몇 바이러스의 능력으로 인해, 예를 들면, HIV, 아데노바이러스 및 헤르페스 바이러스(herpes virus)의 돌연변이체를 유전자 요법 접근법 개발을 위한 DNA 전이 전달체(vehicle)로서 사용한다. 첫째, 이는 바이러스 성분들에 대한 면역학적 반응 위험성과 연관이 있고[참조: Friedmann, 1994, 1996], 둘째는, 헬퍼(helper) 세포주가 이러한 시스템에 사용되는데, 이는 돌연변이가 덜된 바이러스 게놈의 방출을 배제할 수 없기 때문이다. 더욱이, 이들시스템을 조작하는 것은 어렵다.

핵 국재화 시그날을 함유하는 펩티드 또는 단백질을 통하여 트랜스펙션(transfection) 효율을 증가시키는 것으로 추정되는 몇몇 인공 시스템이 보고된 바 있다.

A) 단백질

카네다(Kaneda) 등(1989년) 및 자우(Dzau)와 카네다(1997년 미국 특허 제5,631,237호)는 DNA의 핵 수송을 뒷받침해주는 센다이(Sendai) 바이러스, 리포솜 및 부가 단백질의 사용에 근거한 유전자 전이 시스템을 발표하였다. 이를 위하여, 상기 그룹은 DNA와 결합되는 염색질의 염기성 비-히스톤 단백질인 HMG-1(고 이동도 그룹 1 단백질)을 사용하였다. HMG-1은 긴 염기성 영역을 통하여 DNA와 결합된다. 이는 핵에 국재되었지만, 공지된 NLS는 지니고 있지 않다. 시험관 내에서, HMG-1 단백질은 벡터 DNA와 복합체를 형성한다. 정제된 HMG-1을 생산하는 것이 비용이 많이 들고 노동-집약적이다.

미스트리(Mistry) 등(1997년)은 HMG-1-중개된 핵 수송에 관한 실험을 발표하였다. 이의 양전하로 인해, DNA와 복합체를 형성하는 트랜스펙션용 시약으로서의 HMG-1이, DNA를 세포막 내로 통과시키기 위해 사용되었다. 효율은 낮다. 와코 바이오프로덕츠(Wako BioProducts; Richmond, VA, U.S.A.) 회사는 핵 수송을 중개하기 위한 리포펙틴 시약용 부가제로서 단백질 HMG-1 및 -2를 시판하였다(1997년).

프리츠(Fritz) 등(1996년)은 SV40 NLS와 사람 히스톤 H1으로 이루어진 재조합 단백질 또는 송아지 흉선 히스톤을 이용한 유사한 접근법을 시도하였다. 이들단백질 모두는 명백하게, 상기 공보에 제시된 바와 같이 DNA와 큰 복합체를 형성하고, 세포막을 통과하는데는 적합하지만, 핵 수송에는 적합하지 않다.

B) 생산 과정이 보다 간단하고 더 저렴하기 때문에, NLS 서열을 함유하는 합성 펩티드가 또한 사용된다.

피. 알레스트룀(P. Alestrom)[참조: Collas et al., 1996, Collas and Alestrom, 1996, 1997a,b] 그룹은 DNA와 복합체를 형성하기 위해 SV40으로부터의 NLS 펩티드를 이용하고, 이를 상기 세포에 의해 핵 내로 수송하였다. 이러한 DNA 결합은 이의 기능에 필수적인, 양전하를 띤 NLS의 아미노산을 통해서만 일어난다. 이로써, 상기 DNA가 상기 펩티드와 복합체를 형성하는 한은 핵 수송 단백질에 대한 실제적인 시그날이 차폐된다. 섬게(sea urchin) 정자로부터 시험관내에서 형성된 분리된 웅성 전핵을 수정된 얼룩무늬 물고기 알의 용해물에서 배양시킨 경우에, 상기 분리된 웅성 전핵에서 형광성 표지된 DNA의 NLS-의존적 수송이 관찰될 수 있었다. 세포당 ≥100:1(NLS 펩티드:벡터) 및 ≥1,000 벡터 복사수의 분자비에서는, 벡터 DNA를 세포의 세포질 내로 미세주사한 경우에, 루시퍼라제 발현 증가가 얼룩무늬 물고기 배아에서 관찰될 수 있었다(100 펩티드/벡터 및 1,000 주사된 벡터에서는, 0 펩티드와 비교해서 6배 증가가 획득되었다). 고밀도로 인해, 가능하게는 모든 NLS가 DNA와 완벽하게 결합되지는 않으므로, 일부가 수송기에 접근가능한 상태를 유지하는데; 이는 특정 효과를 조금이라도 파악할 수 있는 근거가 될 수도 있다[참조: Sebastyen et al., 1998]. 이러한 수송기는 아마도, 2개의 펩티드 서열로 이루어진 시그날을 인식할 수 있다[참조: Boulikas, 1993].

세바스티엔(Sebastyen) 등(1998년)은 수 많은 SV40 NLS 펩티드를 DNA 분자와 공유적으로 커플링시켰는데, 이러한 NLS는 완전한 길이의 DNA 쇄 전반에 걸쳐 산포되어 있다. 이의 광범위한 변형으로 인해, 상기 DNA는 더 이상 전사될 수 없다. 상기 문헌에 논의된 바와 같이, 이러한 DNA는, 그렇게 많은 NLS 펩티드가 결합되는 경우에만 명백하게 핵 내로 수송되므로, 입체적인 이유로 인해, 이들 전부가 DNA의 음전하와의 상호작용에 의해 차폐되는 것은 아니다.

고팔(Gopal)의 미국 특허 제5,670,347호에는 DNA-결합 염기성 영역, 가요성 힌지(hinge) 영역 및 NLS로 이루어진 펩티드가 기재되어 있다. DNA 결합은 이러한 경우에도 또한 아미노산의 양전하에 의해 달성되기 때문에, 상기 시약은, 세포막을 통하여 동시에 수송하도록 작용해야만 하는 DNA와 복합체를 형성한다. 상기 펩티드가 커플링되어 있는 한은 핵 수송 단백질에 대한 실제적인 시그날이 DNA에 의해 다시 차폐될 수 있도록 NLS 서열이 상기 DNA의 결합에 왜 참여하지 말아야 하는지에 대해서는 명백하지 않다. 더욱이, 이로써 발생된 복합체는 매우 클 수 있는데[참조: Emi et al., 1997, Niidome et al., 1997, Wadhwa et al., 1997, Trubetskoy et al., 1998], 이는 핵공을 통한 수송에 손상을 입힐 것이다[참조: Lanford et al., 1986, Yoneda et al., 1987, 1992]. 세포막 내로의 DNA의 접종을 뒷받침해주는[참조: Sorgi et al., 1997, Hawley-Nelson et al., 1997], 트랜스펙션용 시약으로서의 다양이온성 펩티드의 공지된 기능 이외의 효과는 밝혀지지 않았다.

게르하르트(Gerhard) 등(DE-OS 195 41 679)은 유전자 전이용 NLS 폴리리신 접합체를 제안하였다. 이는 또한, 양이온성 폴리리신, 양이온성 NLS 및 DNA로 이루어진 최근 만들어진 복합체가 DNA와 커플링되어 있는 한은 이러한 복합체가 핵 수송을 차폐시키는 경우에도 해당된다.

스조카(Szoka)[참조: PCT 1993, 청구항 23 내지 27]는 삽입용 제제를 통하여 NLS 펩티드를 DNA에 커플링시켰다. 벡터와 펩티드(1:300 비율)를 예비-항온 배양한 후, 리포펙틴의 효율이 4배 내지 5배 증가되었다. 이의 높은 양전하로 인해, 사용된 SV40 펩티드가 DNA와 복합체를 형성할 수 있다. DNA를 양이온성 펩티드와 복합 체 형성시키면, 세포막 내로의 통과 효율이 향상됨으로써 리포펙틴 효율이 증가하게 된다[참조: Sorgi et al., 1997, Hawley-Nelson et al., 1997]. 적어도 큰 복합체가 생성되는 경우에는, 핵 수송이 오히려 상기에 의해 손상을 입는다(상기 참조). 사용된 NLS 펩티드는 이의 전하로 인해 DNA와 결합되기 때문에, 핵 수송기에 의한 수송 시그날의 인식이 손상된다(상기 참조). 실시예에 기재된 돌연변이유발성 삽입인자를 사용하는 것이 이러한 응용 가능성을 제한한다. 스조카는 DNA와 비공유적이고도 비특이적으로 결합하지만, 전과 같이 NLS 펩티드 자체가 DNA와 결합되어 이와 복합체를 형성하지 못하도록 할 수 없는 트랜스펙션용 부가 분자를 제안하였다. NLS 펩티드가 DNA와 직접적으로 연합하는 것과 관련된 문제점은 논의되지 않았다.

호리-넬슨(Hawley-Nelson) 등의 미국 특허 제5,736,392호에는 유사한 시스템이 기재되어 있다. NLS 펩티드를 벡터 DNA와 직접적으로 혼합하거나 DNA-결합 분자와 공유 커플링한 후에 혼합한다. 이어서, 이로써 발생된 복합체를 리포펙틴(또는 기타 트랜스펙션)에 사용한다. 이 시스템에서는, NLS를 함유하지 않는 다양이온성 펩티드를 부가하는 것이 양이온성 NLS을 부가하는 것 보다 훨씬 더 트랜스펙션 효율을 증가시켜 준다. 스페르미딘을 NLS 펩티드에 커플링시키면, 트랜스펙션 효율이 추가로 증가된다. 따라서, 이러한 경우에는 또한, 양이온성 펩티드를 통하여 DNA와 복합체를 형성시킴으로써만 증폭 효과가 설명된다. NLS의 존재가 트랜스펙션 효율을 추가로 증가시키지 않기 때문에, 핵 수송기에 대한 인식 서열이 이 경우에 또한 차폐되는 것으로 추정된다.

TIB 몰바이올(Molbiol) 회사의 1998년도 리플릿에는 선별된 유전자의 발현을 특이적으로 억제하기 위하여 C-말단 NLS 펩티드를 함유한 PNA 올리고뉴클레오티드를 수송하는 것이 기재되어 있다. 상기 NLS는 PNA 올리고뉴클레오티드를 핵 내로 수송하여 이들이 이들의 표적 서열과 하이브리드화할 수 있도록 해준다.

지금까지, DNA를 핵 내로 수송하는 것으로 공지된 제제는 효율이 극히 낮다는 단점을 지니고 있다. 이러한 낮은 효율은 휴지 세포를 트랜스펙션 가능하게 만드는데 불충분하다.

본 발명의 기초가 되는 문제점은 핵 내로의 효율적인 DNA 수송을 촉진시켜 휴지 세포 또는 극히 느리게 분열되는 세포가 유용한 정도로 트랜스펙션 가능하게 되도록 해주는 핵 수송제를 제공하는 것이다.

이러한 문제점은 2가지 모듈(module) A 및 B로 이루어진 핵 수송제에 의해 해결되는데, 여기서 모듈 A는 DNA와 특이적으로 결합되고, 비-특이적 결합에 의해 하나 이상의 DNA 분자를 함유하는 복합체의 형성을 유발시키지 않으며, 모듈 B는DNA와 비-특이적으로 결합되지 않는 핵 국재화 시그날 또는 비-NLS 시그날을 함유한다. 본 발명에 따르는 바람직한 핵 수송제는 DNA와 서열 특이적으로 결합되고/되거나 DNA 말단과 특이적으로 결합되는 모듈 A를 포함한다. 모듈 A가 합성 펩티드, 단백질 또는 펩티드 핵산(PNA)인 핵 수송제가 특히 바람직하다.

본 발명에 따르는 핵 수송제의 추가의 양태에서는, 모듈 B가 이의 전하로 인해 DNA와 복합체를 형성하지 않는 연장된 핵 국재화 시그날을 함유한다. 모듈 B가 대략적으로 중성 총 전하를 보유하고 있는 연장된 핵 국재화 시그날을 함유하는 핵 수송제가 바람직하다. 모듈 B가 핵 국재화 시그날과 음전하를 띤 플랭킹 아미노산을 포함하는 연장된 핵 국재화 시그날을 함유하는 핵 수송제가 특히 바람직하다. NLS 서열이 천연의 NLS 서열과 동일하지는 않지만, 이것이 NLS로서 작용하는 한은 이론적으로 고려할 때 특정 아미노산 서열일 수 있다. 더욱이, 모듈 B는 핵 국재화 시그날 또는 연장된 핵 국재화 시그날에 직접적으로 속하지 않는 펩티드 서열 또는 비-펩티드 성분을 함유할 수 있다. 핵 국재화 시그날과 모듈 A 간의 거리를 증가시키는 성분이 바람직하다.

더욱이, 본 발명은 본 발명에 따르는 핵 수송제, 및 양이온성 지질, 펩티드, 폴리아민 또는 양이온성 중합체를 포함하는 유전자 전이 시스템에 관한 것이다.

더욱이, 본 발명은 진핵 세포, 바람직하게는 원시 세포를, 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 수송시키고자 하는 DNA 및 본 발명에 따르는 핵 수송제로 트랜스펙션시키는, DNA를 상기 세포의 핵 내로 수송하는 방법에 관한 것이다.

추가의 양태는 유전자 요법, 특히 암, 바이러스성 감염, 신경계 질환, 조직이식 거부 뿐만 아니라 단일유전자성 또는 다유전자성 유전병을 치료하기 위한, 본 발명에 따르는 핵 수송제의 용도에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 바와 같은 표현 "DNA에 대한 핵 국재화 시그날의 비-특이적 결합"이란 핵 국재화 시그날이 핵 수송기에 대해 완벽하게 인식 가능하지 못하도록 하는 결합을 의미한다.

본 발명에서 사용된 바와 같은 표현 "DNA에 대한 모듈 A의 특이적 결합"이란 첫째, DNA 뉴클레오티드의 서열이 해당 상호작용에 있어서 결정적인 서열-특이적 결합을 의미하고, 둘째는 DNA 단일쇄 또는 이중쇄 말단에 의해 중개되는 DNA와의 공유 결합을 의미한다.

본 발명에서 사용된 바와 같은 표현 "연장된 핵 국재화 시그날"은 핵 국재화 시그날이 부가의 플랭킹 아미노산을 보유하고 있다는 것을 의미한다. 2개 내지 40개, 바람직하게는 4개 내지 20개의 부가의 플랭킹 아미노산을 보유하고 있는 연장된 핵 국재화 시그날이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 바와 같은 표현 "이의 전하로 인해 DNA와 복합체를 형성하지 않는 연장된 핵 국재화 시그날"이란 모듈 B가, DNA와 비-특이적으로 상호작용하지 않으므로 핵 수송기에 완벽하게 접근 가능한 상태를 유지하는 방식으로 이의 전하가 분포되어 있는 핵 국재화 시그날을 함유하고 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용된 바와 같은 표현 "대략 중성의 총 전하"란 핵 국재화 시그날의 연장된 부분이 실제적인 핵 국재화 시그날의 양전하와 균형을 맞추기 위해 음성적으로 하전된 아미노산을 보유함으로써, 연장된 핵 국재화 시그날의 전체 영역에서는 단지 3개의 잉여 양전하가 발생하도록 하는 것을 의미한다.

본 발명에 따르는 핵 수송제는 이것이 DNA와의 복합체 형성을 유발시키지 않는다는 이점을 지니고 있다. 핵 국재화 시그날이 핵 수송기에 자유롭게 접근 가능한 상태를 유지한다는 추가의 이점이 있다. 본 발명에 따르는 핵 수송제를 사용하는 경우에 핵 수송기에 대한 핵 국재화 시그날의 접근 가능성과 핵 수송을 손상시키는 큰 DNA 복합체를 피하게 되면, DNA가 핵 내로 보다 효율적으로 명백히 수송된다.

본 발명에 따르면, DNA-결합 부분(모듈 A)이나 핵 국재화 시그날(모듈 B) 어떠한 것도 큰 DNA 복합체의 형성을 유발시키지 않는다.

모듈 A

모듈 A는 DNA와 특이적으로 결합되고 하나 이상의 DNA 분자와의 복합체 형성을 유발시키지 않는다. 모듈 A는 서열 특이적으로 결합되거나(즉, 단지 양전하로 인해 비특이적이지 않음) DNA 말단과 공유적으로 결합된다.

모듈 A는 각종 길이의 펩티드, 또는 단백질 또는 PNA 서열일 수 있거나[참조: Nielson et al., 1991] 또는 핵산과 서열 특이적 방식으로 결합되는 또 다른 물질일 수 있다. 더욱이, 모듈 A는 DNA와 특이적으로 결합되는 재조합 단백질, 예를 들면, lac 억제인자 또는 이의 고친화성 돌연변이체[참조: Kolkhof, 1992, Fieck et al., 1992]이거나, 또는 DNA 말단과 서열 특이적으로 결합되는 레트로바이러스성 인테그라제(retroviral integrase)(LTR 코어 서열을 함유함)일 수 있다[참조: Ellison and Brown, 1994].

DNA 쇄의 말단에 대한 공유 결합은, 선형 DNA 쇄의 말단이 "자살 기질"인 서열을 지니고 있고 재연결에 의해서가 아니라 토포이소머라제(topoisomerase)에 의해 절단될 수 있는 경우에, 예를 들면, 폭스바이러스(poxvirus)의 토포이소머라제 I에 의해 생물학적으로 중개될 수 있다.

모듈 B

모듈 B는 DNA와 비특이적으로 결합되지 않는 핵 국재화 시그날 또는 비-NLS 시그날이다.

본 발명에 따르는 용어 비-NLS 시그날은 핵 국재화 시그날은 아니지만, 트랜스펙션, 유전자 요법 또는 DNA 백신 접종과 관련하여, DNA를 세포 내로 수송하거나 DNA를 세포 내에서 수송하는 작용을 하는 시그날을 의미한다.

다음이 비-NLS 시그날에 속한다: DNA 흡수, 예를 들면, 수용체 중개된 DNA 흡수를 중개할 수 있는, 세포내 표면 구조물에 대한 리간드; 예를 들면, 엔도솜으로부터의 DNA의 미숙한 배출을 증진시키기 위하여 막을 탈안정화시키는 펩티드; 핵으로의 세포내 수송을 선호하는 수송 구조물에 대한 세포 결합을 중개하는 시그날.

핵 국재화 시그날은 바람직하게는, 이의 전하 또는 DNA 결합성 모듈 A에 대한 공간적 배향으로 인해 DNA와 복합체를 형성하지 않는 연장된 핵 국재화 시그날(상기 정의된 바와 같음)이다. 이러한 핵 국재화 시그날은 합성적으로 생성되거나 또는 특정 단백질의 일부일 수 있다.

본 발명에 따르는 핵 수송제에 사용된 바와 같은 핵 국재화 시그날에서는, 대부분의 핵 국재화 시그날의 필수 부분인 이들의 양전하가 핵 수송기에 대한 시그날로서 차폐되는 방식으로 이들 양전하를 통하여 DNA와 결합되지 않는 시그날 서열(플랭킹 영역을 함유하거나 함유하지 않음)이 사용된다.

핵 국재화 시그날 또는 비-NLS 시그날과는 별도로, 모듈 B는 핵 국재화 시그날 또는 연장된 핵 국재화 시그날의 일부가 아닌 펩티드 서열 및 비-펩티드 성분을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 이들은 핵 국재화 시그날을 보다 우수하게 입체적으로 위치시키도록 해주는데, 특히 DNA 분자와의 거리를 증가시켜 준다.

고전적인 NLS의 연장된 서열이 매우 적합한데, 단 상기 펩티드의 총 전하는 음전하를 띤 아미노산을 플랭함으로써 거의 균형을 맞출 수 있어야 한다. 이들 아미노산은 단백질 내에서의 이들 위치로 천연적으로 생성될 수 있거나, 또는 구조적 사항을 고려하여 도입할 수도 있다. 본래의 맥락에서는, 음성 아미노산이 많은 NLS 코어 서열에 인접하여 위치하고 있다[참조: Xiao et al., 1997]. 가장 철저하게 연구 조사된 NLS인 SV40으로부터의 NLS의 경우에는, 이들 플랭킹 서열이 핵 수송 효율을 명백하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Rihs and Peters, 1989, Rihs et al., 1991, Chen et al., 1991, Jans et al., 1991, Xiao et al., 1997]. 큰 단백질(lgM)은 이를 SV40 코어 NLS 펩티드에 커플링시킨 후가 아니라, 인접한 서열에 의해 연장시킨 SV40 NLS에 화학적으로 커플링시킨 후에만 핵 내로 수송되었다[참조: Yoneda et al., 1992].

NLS가, DNA와 서열 특이적으로 결합되는 단백질의 일부인 경우에는, 이들 서열이 DNA에 의해 차폐될 위험율은 비교적 낮다. 그러나 보다 큰 효율로 인해, 연장된 NLS 서열이 이 경우에 사용될 수도 있다.

예를 들면, 양전하를 상당히 과량으로 지니고 있지 않거나 통상적인 수송 경로를 통하여 핵에 도달되지 않는 인플루엔자 바이러스 핵 단백질[참조: Wang et al., 1997, Neumann et al., 1997]로부터의 NLS로서 비-고전적인 NLS가 사용될 수도 있다.

본원에서 의도한 바와 같은 NLS의 개략적인(불완전한) 고찰이 문헌[참조: T Boulikas, 1993, 1996, 1997]에 제시되어 있다.

최종적으로, 예를 들면, 임포틴(importin) α의 임포틴 β결합성 도메인(IBB)으로서, 핵 수송기 자체의 성분으로부터 취한 핵 수송 시그날을 사용할 수 있다. 이러한 도메인을 통하여, NLS 결합성 단백질 임포틴 α를 핵 수송기의 나머지 부분에 연결시킨다[참조: Gorlich et al., 1996, Weiss et al., 1996].

추가의 바람직한 양태에서는, PNA(모듈 A로서)을 통한 비-NLS 시그날을 실재의 벡터 서열에 결합시킨다. PNA와 벡터 간의 결합은 서열 특이적이다. 이로써, 이들을 변형시킬 필요없이, 상기 비-NLS 시그날을 거의 모든 통상적인 발현 벡터에 커플링시킬 수 있게 된다.

DNA에 대한 PNA의 서열 특이적 결합의 경우에는, 상기 벡터의 DNA 서열 만이 사용되는데, PNA에 의한 이의 차폐는 이러한 DNA의 의도된 목적을 거의 손상시키지 않는다.

발현 벡터의 경우, 대부분의 통상적인 발현 벡터에 존재하는, 플라스미드 주쇄 내의 특정 서열이 특별히 사용된다(예를 들면, 앰피실린 내성 유전자의 프로모터). 그러나, 발현 영역의 비-암호화 쇄에서의 결합도 가능하다. 서열 특이적 결합의 이점은 PNA-펩티드-하이브리드가 DNA에 간단하고도 신속하게 결합된다는 것이다. 실시예 2는, 예를 들어, PNA-펩티드 하이브리드가 이중쇄 DNA에 간단하고도 신속하게 결합 반응(5분, 65℃)되는 것을 입증해준다. PNA 부분과 실제적인 시그날 사이에는 스페이서가 존재할 수 있다. 이러한 스페이서는 예를 들어, 입체 장애를 감소시키기 위해 시그날과 DNA 간의 거리를 증가시키는 작용을 할 수 있다. 이 스페이서는 또한, 예를 들어, 엔도솜 환경 내의 리간드를 분리시키기 위해, 예정된 파단점을 도입하는 작용을 할 수 있는데, 이를 통하여 DNA가 세포내 이입된 세포 표면 수용체에 결합된다.

처음으로, 본 발명은 휴지 세포 또는 서서히 분열되는 세포가 후속 분석을 허용해주는 정도(비율)로 트랜스펙션 가능하게 만든다. 동물 또는 사람의 체내로부터 신선하게 분리된 대부분의 세포(원시 세포)는 전혀 또는 거의 분열되지 않아, DNA가 세포막을 통하여 성공적으로 수송된 후에야 불활성화되어 핵에 도달하고 이어서 발현될 수 있다. 지금까지는, 이러한 원시 세포를 배양물 중에서 인공적으로 자극하여 증식시키지 않는 한은, 원시 세포가 트랜스펙션 가능하지 않았다. 이로 인한 피할 수 없는 결과는, 이들 세포가 본래의 상태로부터 벗어난다는 것이다. 원시 세포를 트랜스펙션시키는 방법은, 유전 물질을 체 세포의 본래 환경 하에서 분석할 수 있게 해준다. 이는 유전적 기전을 조사하고 체 세포 내부의 프로세스들을 연구하는데 상당히 중요하다.

원시 세포를 트랜스펙션 가능하게 만드는 본 발명에 따른 교시 또한, 유전자 요법을 위해 완벽하게 만든 인공 유전자 전이 시스템 개발에 대한 필수 단계이다.이러한 유전자 전이 시스템은 다음 3가지 작용성 성분을 지녀야만 한다: 한 성분은 DNA를 세포막 내로 통과시키기 위한 것이고, 이에 대해서는 양이온성 지질과 기타 양이온성 중합체가 비교적 적합한 것으로 입증되었다. 이는 DNA를 (통상 비-분열성) 표적 세포의 핵 내로 전이시키기 위한 추가의 성분과, DNA를 게놈 내로 통합시키는 것을 중개하는 제3의 성분을 함유해야 한다. 본 발명에는, 두 번째 성분으로서 작용할 수 있는 효능제가 처음으로 기재되어 있다. 유전자 요법에 이용될 수 있는 완벽한 인공 유전자 전이 전달체가, 현재 이용되고 있는 바이러스성 시스템 보다 용이하고 저렴하게 제조되며, 조작이 편리한 것으로 예상되며, 이들 시스템에 내재되어 있는 위험에 처하지도 않는다. 예를 들면, 암, AIDS 및 각종 유전병을 치료하기 위한 유전자 치료 접근법이 제안되었으며, 이는 의약 분야에서 중요한 역할을 할 것이다.

본 발명에 따라서 기재된 핵 수송제는 또한, DNA가 세포막 내를 통과하고 분석하는 기간에는 분열되지 않는 세포가 DNA를 흡수할 수 있도록 만듬으로써 지금까지 트랜스펙션 가능하도록 배양되어 왔던 세포 내에서의 트랜스펙션 효율을 증가시킨다. 이는, 심지어 많은 수립 세포주에 대해서도, 트랜스펙션 효율 증가가 분석을 촉진시켜주고 세포 물질 요구량 감소로 인해 보다 적은 비용으로 도움을 줄 수 있기 때문에 중요하다. 물론, 이는 원시 세포와 수립 세포주 간의 모든 단계에 대해서도 마찬가지이다.

다음 실시예는 본 발명을 예시하는 것이지, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.

실시예 1: PNA-펩티드 하이브리드

NLS PNA 핵 수송제를 사용하였다. DNA 이중쇄를 침범할 수 있는 PNA 서열을 사용하였다[참조: Nielson et al., 1991, Nielson, 미국 특허 제5,539,082호].

거의 모든 발현 벡터의 플라스미드 주쇄에서는, PNA와의 고친화적 연합에 매우 적합한 2가지 서열이 앰피실린 내성 유전자와 복제 기점에 위치하고 있다.

펩티드 성분으로서 이용된 펩티드는

1) "SV21" NH₂-GKPTADDQHSTPPKKKRKVED-COOH(펩티드 1: 서열 1) 또는

2) "SV27: NH₂-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH(펩티드 2: 서열 2)을 함유한다.

다음 PNA 서열이 각 펩티드의 N-말단에 위치하고 있다:

A) "ori" NH₂-CCTTTCTCCCTTC-펩티드(서열 3),

B) "ssp" NH₂-CTCTTCCTTTTTC-펩티드(서열 4), 또는

C) 평균 발현 벡터(5kb) 내에 약 30개의 결합 부위를 가지고 있는 펩티드-PNA 하이브리드 서열 NH₂-CCTTT-GGGGGGG-TTTCC-펩티드(서열 5)(여기서, G는 아미노산 글리신이다).

물에 용해된 5㎍의 벡터 DNA를 10㎕ 25μM NLS-PNA에서 60℃ 하에 10분 동안 항온 배양한다. 이어서, 이 반응 혼합물을 RPMI를 사용하여 250㎕으로 조정한다.

60 내지 80% 밀집되어 있는 5 x 10⁶중국산 햄스터 난소(CHO) 세포를 5mM EDTA로 분리시키고, 15ml PBS에서 세척한다(50 xg로 10분 동안 원심분리시킴). 이 팰릿을 250㎕ RPMI에 재현탁시키고 예비-항온 배양된 DNA와 혼합하며, 전기천공용 큐벳(갭 폭 0.4cm)에 옮긴 다음, 실온에서 10분 동안 항온 배양한다. 전기천공(210V, 975μF, BioRad GenePulser) 후, 상기 큐벳을 37℃에서 10분 더 항온 배양한 다음, 세포를 예비-가온된 배지에 접종한다.

실험 개시와 분석 기간 동안에는 분열되지 않는 이들 세포가 트랜스펙션되었는지를 명료하게 나타내기 위해서, 세포를 본원에 기재된 방법에 따라서 pMACS 4.1(사람 CD4에 대한 발현 벡터)로 트랜스펙션시키고 세포 분열을 다음과 같이 평가한다: 트랜스펙션 전에, 세포를 1μM 카복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미드 에스테르(CFDA, SE)(Molecular Probes, Eugene, U.S.A.)에서 항온 배양함으로써 녹색 형광으로 표지시킨다. 세포의 휘도는 세포 분열에 의해 50% 정도 감소된다. 유동 혈구계산기(FACSCalibur)를 사용하여, 단일-세포 수준 상에서, 분열되지 않은 세포(100% 녹색 형광)가 또한 트랜스펙션된 유전자를 발현하였다는 것을 결정하였다(Cy5에 커플링된 항-CD4 항체로 염색한 후의 암적색 형광).

실시예 2: 실재의 벡터 서열에 대한 PNA-NLS의 신속한 결합

PNA-펩티드-하이브리드를 이중쇄 DNA에 커플링시킨다.

실재의 벡터 서열을 NLS-펩티드로 5분 이내에 PNA를 통하여 거의 정량적으로(>90%) 표지시킬 수 있다. PNA를 통하여 열 불안정한 성분의 결합을 달성하기 위해서는, 37℃에서 1시간 동안 항온 배양하는 것이 대부분의 DNA를 표지시키는데 충분하다(표 1).

100ng의 발현 벡터를 65℃ 또는 37℃ 하에 5분 내지 3시간 동안 TE(pH 7.8) 중에서 25μM의 상이한 PNA-펩티드 하이브리드와 함께 항온 배양한다. 본 실시예에서 사용된 PNA-서열 NH₂-CTCTTCCTTTTTC-COOH(서열 6)가 앰피실린 내성 유전자의 프로모터와 결합된다.

C-말단에는, 21개 아미노산의 펩티드(펩티드 1) 또는 27개 아미노산의 펩티드(펩티드 2) 또는 10 AEEA-단위의 스페이서(Fmoc-AEEA-OH 스페이서; 제조원: PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, USA)에 이어서 27개 아미노산의 펩티드(펩티드 3)이 위치하고 있다. 연속적으로, 결합 분석물을 제한 엔도뉴클레아제 Earl와 함께 항온 배양한다. 제한된 DNA를 YOYO(제조원: Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA)로 염색하고, 아가로즈 겔 상에서 분리한 다음, 형광 스캐너(Image Plate Reader FLA 2000, 분석용 소프트웨어 L-프로세스, 버젼 1.6, Fuji Photo Film Co., Ltd., Tokyo)를 사용하여 정량화한다. 제한 엔도뉴클레아제 Earl에 의한 DNA의 절단은 PNA 결합 부위에서 억제된다. 부가의 Earl 제한 부위는 상기 반응의 내부 대조군으로서 작용한다.

DNA 유입량의 비율(%)로서 나타낸 펩티드-표지된 DNA의 부분

℃	분	펩티드 1	펩티드 2	펩티드 3
65	51015	94%96%96%	96%97%97%	91%95%95%
37	60120180	85%91%94%	90%91%94%	74%76%90%

DNA에 대한 PNA의 결합 반응은 간단하고, 강력하며 신속하다. 이 결합은 거의 비가역적이므로 세포내 수송 과정에 적합하다. 단백질과 비교해서, 펩티드 및 PNA가 더 저렴하게 합성될 수 있으며 장기간 동안 보다 용이하게 저장할 수 있다.

실시예 3: PNA-NLS를 사용한 트랜스펙션

분열하는 세포주에서는, 트랜스펙션된 DNA의 능동 핵 수송이 수송되지 않은 DNA와 비교해서 상기 DNA를 보다 신속하게 발현하는 것으로 나타났다. 이와 같이 트랜스펙션된 DNA가 세포질에서 충분히 장기간 동안 생존하는 경우, 핵 수송제의 존재 및 부재하에 신속하게 분열하는 세포 내에서의 트랜스펙션된 DNA의 발현 속도는 서서히 비슷해져야 한다. 그 이유는 세포질에 남아 있는 트랜스펙션된 DNA가 세포 분열 동안에 핵에 도달할 수 있다는 사실 때문이다. 아피디콜린(aphidicolin)을 사용하여, 세포의 분열 활성 및 트랜스펙션 능력을 강력하게 저하시킬 수 있다. 능동 핵 수송은 이러한 트랜스펙션 효율 감소 효과를 완전히 없앤다.

전기천공의 경우, 물에 용해된 선형화 벡터-DNA 5㎍을 65℃에서 10분 동안 25μM PNA-NLS(펩티드 3: NH₂-(AEEA)₁₀-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH)의 존재하 또는 부재하에 10㎕의 최종 용적으로 항온 배양한다. 추가의 과정은 실시예 1에 기재된 바와 같다.

리포펙틴의 경우, 물에 용해된 벡터-DNA 3㎍을 65℃에서 10분 동안 25μMPNA-NLS(펩티드 3)의 존재하 또는 부재하에 10㎕의 최종 용적으로 항온 배양한다. 제조업자의 지시에 따라서 리포펙타민(제조원: Life Technologies GmbH, Karlsruhe)으로 트랜스펙션을 수행한다. CHO 세포의 분열을 실질적으로 억제하기 위하여, 세포를 혈청 부재하에 24시간 동안 항온 배양한 다음, 혈청 및 20㎍/ml 아피디콜린(제조원: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen)의 존재하에 12시간 동안 항온 배양한다. 리포펙틴의 모든 후속 단계를 20㎍/ml 아피디콜린의 존재하에 수행한다. 트랜스펙션의 결과가 도 1에 도시되어 있다.

대부분의 발현 벡터에 존재하는 서열에 커플링시킨, 전기적으로 중성인 2개의 NLS는, 단지 소수의 세포만이 분열되긴 하였지만 트랜스펙션 직후에 트랜스펙션된 세포의 비율을 2배로 증가시킬 수 있다. 아피디콜린을 사용하여 세포 분열 속도를 감소시킴으로써 야기된 트랜스펙션 효율 감소는 이러한 방식에 의해 완전히 없앨 수 있다.

실시예 4: 서열-특이적 결합성 NLS-융합 단백질

이. 콜라이(E. coli) lac 억제인자의 고친화적 결합성 돌연변이체를 서열-특이적 DNA-결합성 단백질로서 사용한다. 이 돌연변이체는 lac 오퍼레이터(operator) 서열에 대한 결합 상수가 10^-15M이다[참조: Kolkhof, 1992]. 고친화성은 세린 61을 루이신으로 아미노산 대체함으로써 달성된다.

본 실시예에서 사용된 핵 수송 단백질은 마지막 30개 C-말단 아미노산(331번에서 360번 위치)이 결실되어 있고 330번 위치에서의 루이신이 세린으로 대체되었다. 이들 돌연변이체 단백질은 동종 사량체 대신 동종 이량체를 형성하므로, 2개의 부위 대신 1개의 단일 DNA-결합 부위를 함유한다. 그러나, 사량체 또한 본 발명의 핵 수송제로서 사용될 수 있다.

이량체-변이체 각각이 하나의 NLS에 대한 N-말단에서 연장되었다:

〃N1D" NLS1:MPKKKRKV-MKPVTLYDVA...

〃N2D" NLS2:MEEDTPPKKKRKVEDL-KPVTLYDVA...

(NLS 서열은 진하게 나타냈고 서열 8 및 서열 9에 각각 상응한다. 서열 MKPVTLYDVA... 및 KPVTLYDVA...는 상기에서 특정하게 언급된 이. 콜라이 lac 억제인자를 지시한다).

NLS1은 SV40 바이러스 큰 T 항원의 NLS에 상응한다. NLS2는 SV40-NLS와 폴리오마 바이러스 VP2-단백질로부터의 NLS의 N-말단 플랭킹 영역으로 이루어진 중성 총 전하를 지닌 하이브리드를 나타낸다.

lac-오퍼레이터-서열은 수 많은 발현 벡터에서 발견될 수 있고 PCR 프라이머의 연장물로서 어떠한 서열에도 용이하게 결합될 수 있다.

실시예 5: NLS를 함유하는 lac-억제인자 돌연변이체의 DNA-결합

다음 lac-오퍼레이터-서열이 결합 검정에 사용되었다:

천연 오퍼레이터: AATTGTGAGC GGATAACAATT 및 완벽하게 회문구조인 오퍼레이터-서열: AATTGTGAGC GCTCACAATT.

1kb 길이의 방사성 표지된 DNA-단편 0.7ng을 제한 엔도뉴클레오틱 분해함으로써 절단하여 914bp 길이 및 86bp 길이의 단편으로 만든 다음, 각각 lac-억제인자 NLS-1-이량체 또는 NLS-2-이량체의 존재하에 실온에서 30분 동안 항온 배양한다.이어서, 이 단편을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리시킨다(도 2). lac-오퍼레이터를 함유하는 86bp 단편은 특이적 결합으로 인해 지연된다. 비-특이적 결합으로 인해, lac-오퍼레이터가 결여된 914bp-단편이 지연되었다. 완전한 특이적 결합의 경우에는, 어떠한 비-특이적 결합도 거의 관찰되지 않는다.

추가의 실험은, 시험된 양 오퍼레이터-서열을 사용하여, 각종 조건, 예를 들면, 세포 배양 배지 RPMI, 150mM 염화나트륨, 또는 10mM 트리스/HCl(pH 7.2), 10mM 염화칼륨 및 3mM 마그네슘 아세테이트로 이루어진 완충액에서 안정한 결합이 달성된다는 것을 입증해주었다.

실시예 6: lac-억제인자-NLS에 의한 DNA의 핵 수송

대략 8㎍(100pmol)의 lac-억제인자-NLS-돌연변이체를 실온하에 300㎕ 10mM 트리스/HCl(pH 7.2), 10mM KCl, 3mM Mg-아세테이트 및 50㎍/ml BSA의 총 용적에서, 양 말단을 형광성 염료 Cy5로 표지시킨 30bp 길이의 이중쇄 DNA 2㎍(100pmol)과 함께 30분 동안 항온 배양한다. 결합되지 않은 DNA는 마이크로콘-필터(제조원: Amicon)를 통하여 원심분리시킴으로써 분리시킨다. 이어서, 샘플의 완충액을 세포 주사용 완충액(76mM K₂HPO₄, 17mM KH₂PO₄, 14mM NaH₂PO₄(pH 7.2))로 바꾼다.

lac-억제인자-돌연변이체에 결합된 DNA와 플루오레세인-표지된 BSA(BSA-FITC)로 이루어진 혼합물을 50개의 NIH3T3-세포 내로 각각 미세주사한다[펨토팁을 갖는 에펜도르프 트랜스젝터(Eppendorf Transjektor) 5246, 직경 0.5㎛, 주사압 55hPa, 주사 시간 0.5초]. 주사한지 10 내지 15분 후에, 세포를 형광 현미경 검사하여 분석한다(도 3). 세포질 내로 성공적으로 주사한 후, BSA-FITC는 이 세포질에만 존재한다(1a, 2a 및 3a). lac-억제인자-NLS-돌연변이체에 결합시키면, 분석될 수 있는 거의 모든 세포가 15분 미만 내(NLS1-이량체, 2b) 및 10분 미만 내(NLS2-이량체, 3b)에 각각 DNA를 핵 내로 수송하였으며, 이로써 세포질에는 DNA가 전혀 존재하지 않는다. 대조군은 결합 단백질의 부재하에 표지된 DNA가 세포질에 남아있다는 것을 입증해준다(1b).

실시예 7: lac-억제인자-NLS로의 트랜스펙션

완전한 발현-카셋트 및 폴리아데닐화 서열에 이어서 완벽한 회문구조의 lac-오퍼레이터-서열을 함유하는, 1.1kb 길이의 선형 DNA 1㎍을 상이한 농도의 lac-억제인자-단백질(각각 대략 2.5㎍, 0.3㎍ 및 0.15㎍ 이량체, 및 5㎍, 0.6㎍ 또는 0.3㎍ 사량체)의 존재하에 실온에서 50㎕ 등장성 0.5 x RPMI(리포펙틴의 경우) 또는 150mM NaCl(폴리에틸렌이민을 사용한 트랜스펙션의 경우)에서 30분 동안 항온 배양한다. 이 샘플을 제조업자의 지시에 따라서 리포펙타민(제조원: Life Technologies) 또는 폴리에틸렌이민(제조원: PEI, ExGen 500, Fermentas)와 복합체를 형성시키고, 밀집되어 있는 NIH3T3-세포에 가한다. 그 결과가 도 4에 도시되어 있다.

트랜스펙션한지 4시간 후에 결정된 트랜스펙션 효율은 lac-억제인자-NLS에 의해 3 내지 4인자 정도 증가할 수 있다. 본 실시예에서는, 유착성 NIH3T3 세포를 트랜스펙션 이전에 밀집되도록 배양하여, 세포 분열을 광범위하게 억제시킨다. 트랜스펙션시킨지 4시간 후에는 소수의 세포만이 분열되었다. 본 실시예에서 어떠한 방식으로든 제한된 분열 속도가 트랜스펙션과 관계되는 기간은, 세포내 이입에 의해 흡수되는 트랜스펙션된 DNA가 엔도솜 및 후속적으로 양이온성 트랜스펙션용 시약과의 복합체를 잔존시킨 후에 이를 발현될 핵에 수송시켜야 한다는 사실로써 부가적으로 감소된다. 리포펙타민-DNA-복합체는 아마도, 폴리에틸렌이민과의 DNA-복합체 보다 훨씬 더 오랫동안 지속되어, 리포펙타민을 사용한 lac-억제인자-NLS의 효과가 덜 명백해진다. 대부분의 세포가 24시간 후에 1회 분열된 후, 핵 수송제의 존재 및 부재하에서의 트랜스펙션된 DNA의 발현 속도는 점차적으로 비슷해진다.

참조문헌

1983년도에 발행된 잡지(J. Virol. 45; 397)에 실린 "단순 포진 바이러스의 분자 유전학. VIII. 바이러스성 DNA의 방출과 바이러스성 재생 주기의 기타 단계가 결핍되어 있는 온도-민감성 돌연변이체의 추가의 특징 확인"이란 명칭의 문헌(저자: Batterson, W., Furlong, D. and Roizman, B.).

1993년도에 발행된 잡지(Crit. Rev. Euk. Gene Expr. 3: 193)에 실린 "핵 국재화 시그날(NLS)"이란 명칭의 문헌(저자: Boulikas, T.).

1996년도에 발행된 잡지(J. Cell Biochem. 60: 61)에 실린 "단백질 키나제 및 사이클린의 핵 이입"이란 명칭의 문헌(저자: Boulikas, T.).

1997년도에 발행된 잡지(Anticancer Res. 17: 843)에 실린 "DNA 수복 단백질의 핵 이입"이란 명칭의 문헌(저자: Boulikas, T.).

1991년도에 발행된 잡지(J. Virol. 65: 5131)에 실린 "사람 DNA-활성화 단백질 키나제는 아미노- 및 카복시-말단 부위에서 원숭이 바이러스 40 T 항원을 인산화시킨다"라는 명칭의 문헌(저자: Chen, Y.-R., Lees-Miller, S.P., Tegtmeyer, P.and Anderson, C.W.).

1994년도에 발행된 잡지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3210)에 실린 "옥수수 및 담배에서 아그로박테륨 VirD2 및 VirE2 단백질의 핵 이입"이란 명칭의 문헌(저자: Citovsky, V., Warnick, D., and Zambryski, P.).

1996년도에 발행된 잡지(Transg. Res. 5: 451)에 실린 "SV40 T 항원의 핵 국재화 서열은 얼룩무늬 물고기 배아 핵에서의 형질전환된 유전자 흡수 및 발현을 증진시킨다"란 명칭의 문헌(저자: Collas, P. Husebye, H. and Alestrom, P.).

1996년도에 발행된 잡지(Mol. Repr Dev. 45: 431)에 실린 "SV40 T 항원의 핵 국재화 시그날은 시험관내에서 섬게 웅성 전핵 내로의 플라스미드 DNA의 이입을 지시한다"란 명칭의 문헌(저자: Collas, P. and Alestrom, P.).

1997년도(a)에 발행된 잡지(Mol. Mar. Biol. Biotech. 6: 48)에 실린 "SV40 T 항원의 핵 국재화 시그날에 의한 얼룩무늬 물고기 배아 핵으로의 플라스미드 DNA의 신속한 표적화"란 명칭의 문헌(저자: Collas, P. and Alestrom, P.).

1997년도(b)에 발행된 잡지(Biochem. Cell. Biol. 75: 633)에 실린 "핵 국재화 시그날: 얼룩무늬 물고기에서 플라스미드 DNA를 핵 수송시키기 위한 구동력"이란 명칭의 문헌(저자: Collas, P. and Alestrom, P.).

1995년도에 발행된 잡지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4572)에 실린 "원시 랫트 미오튜브의 유사분열후 핵 내로의 플라스미드 유입"이란 명칭의 문헌(저자: Dowty, M.E., Williams, P. Zhang, G., Hagstrom, J.E. and Wolff, J.A.).

1994년도에 발행된 잡지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7316)에 실린 "인테그라제와 바이러스성 DNA 말단 간의 안정한 복합체는 시험관내에서 사람 면역결핍증 바이러스 통합을 중개한다"란 명칭의 문헌(저자: Ellison, V. and Brown, P.O.).

1997년도에 발행된 잡지(Biochem. Biophys. Res. Commun. 231: 421-424)에 실린 "폴리아르기닌에 의해 중개된 유전자 전이는 DNA 응집체의 큰 담체-복합체의 형성을 필요로 한다"란 명칭의 문헌(저자: Emi, N., Kidoaki, S., Yoshikawa, K. Salto, H.).

1992년도에 발행된 잡지(Nucl. Acids Res. 20: 1785)에 실린 "진핵 세포에서의 발현을 위한 이. 콜라이 lac 억제인자의 변형: 단백질 활성 및 핵 축적에 대한 핵 시그날 서열의 효과"란 명칭의 문헌(저자: Fieck, A., Wyborski, D.L. and Short, J.M.).

1994년도에 발행된 잡지(Trends in Genetics 10: 210)에 실린 "신경학적 장애에 대한 유전자 요법"이란 명칭의 문헌(저자: Friedmann, T.).

1996년도에 발행된 잡지(Nature Med. 2: 144)에 실린 "사람 유전자 요법-병으로부터 확실이 나온 미숙한 지니"란 명칭의 문헌(저자: Friedmann, T.).

1996년도에 발행된 잡지(Human gene therapy 7: 1395)에 실린 "히스톤-축합된 플라스미드 DNA를 사용한 포유류 세포로의 유전자 전이"란 명칭의 문헌(저자: Fritz, J.D., Herweijer, H. Zhang, G. and Wolff, J.A.).

1996년도에 발행된 잡지(J. Virol. 70: 1027)에 실린 "사람 면역결핍증 바이러스 유형 1 핵 이입에 있어서의 카료페린 경로의 역할"이란 명칭의 문헌(저자:Gallay, P., Stitt, V. Mundy, C., Oettinger, M., and Trono, D.).

1993년도에 발행된 잡지(Cell 75: 477)에 실린 "세포 내로의 유입 동안 아데노바이러스 2를 단계별로 분해함"이란 명칭의 문헌(저자: Greber, U.F., Willetts, M. Webster, P. and Helenius, A.).

1996년도에 발행된 잡지(EMBO J. 15: 1810)에 실린 "임포틴-a에서의 41개 아미노산 모티브는 임포틴-b에 대한 결합을 부여하므로 핵 내로 수송시켜 준다"란 명칭의 문헌(저자: Gorlich, D., Henklein, P., Laskey, R.A. and Hartmann, E.).

1998년도에 발행된 잡지(EMBO J. 17: 2721)에 실린 "세포 핵 내로의 수송 및 세포 핵으로부터의 수송"이란 명칭의 문헌(저자: Gorlich D.).

1991년도에 발행된 잡지(J. Cell. Biol. 115: 1203)에 실린 "T¹²⁴에서 p43^cdc2-중개된 인산화는 SV-40 T 항원 단백질의 핵 이입을 억제시킨다"란 명칭의 문헌(저자: Jans, D.A., Ackerfmann, M.J. Bischoff, J.R., Beach, D.H. and Peters, R.).

1989년도에 발행된 잡지(Science 243: 375)에 실린 "DNA 발현 증가는 다 자란 랫트 간에서 핵 단백질과 함께 도입되었다"란 명칭의 문헌(저자: Kaneda, Y., Iwai, K. and Uchida, T.).

1992년도에 발행된 잡지(Nucl. Acids Res. 20: 5035)에 실린 "3개의 단단히 결합되는 lac 억제인자의 특이성"이란 명칭의 문헌(저자: Kolkhof, P.).

1986년도에 발행된 잡지(Cell 46: 575-582)에 실린 "SV40 T 항원 수송 시그날과 동종인 합성 펩티드를 사용하여 핵 수송을 유도시킴"이란 명칭의 문헌(저자: Lanford, R.E., Kanda, P. Kennedy, R.C.).

1997년도에 발행된 잡지(Biotechniques 22: 718)에 실린 "피치아 파스토리스에서 생성된 재조합 HMG1 단백질"이란 명칭의 문헌(저자: Mistry, A.R., Falciola, L., Monaco, L. Tagliabue, R., Acerbis, G., Knight, A., Harbottle, R.P., Soria, M., Bianchi, M.E., Coutelle, C. and Hart, S.L.).

1996년도에 발행된 잡지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 96)에 실린 "캡시드 단백질과의 연합은 원숭이 바이러스 40 DNA의 핵 표적화를 증진시킨다"란 명칭의 문헌(저자: Nakanishi, A. Clever, J., Yamada, M., Li, P.P., and Kasamatsu, H.).

1996년도에 발행된 잡지(Science 272: 263)에 실린 "렌티바이러스성 벡터에 의한 비-분열성 세포의 생체내 유전자 전달 및 안정한 형질도입"이란 명칭의 문헌(저자: Naldini, L. Blomer, U., Gallay, P. Ory, D., Mulligan, R., Gage, F.H., Verma, I.M. Trono, D.).

1997년도에 발행된 잡지(J. Virol. 71: 9690)에 실린 "인플루엔자 바이러스 핵 단백질의 핵 이입 및 수출"이란 명칭의 문헌(저자: Neumann, G., Castrucci, M.R. and Kawaoka, Y.).

1991년도에 발행된 잡지(Science 254: 1497)에 실린 "티민-치환된 폴리아미드로의 쇄 전위에 의한 DNA의 서열 선택적 인식"이란 명칭의 문헌(저자: Nielson, P., Egholm, M., Berg, R.H. and Buchardt, O.).

1997년도에 발행된 잡지(J. Biol. Chem. 272: 15307-15312)에 실린 "플라스미드 DNA에 대한 양이온성 알파-나선형 펩티드의 결합 및 세포 내로의 이들의 유전자 전이 능력"이란 명칭의 문헌(저자: Niidome, T., Ohmori, N, Ichinose, A., Wada, A., Mihara, H, Hirayama, T., Aoyagi, H.).

1989년도에 발행된 잡지(EMBO J., 8: 1479)에 실린 "핵 수송 역학은 원숭이 바이러스 40 T 항원의 카료필릭 시그날을 플랭킹하는 인산화-부위-함유 서열에 의존한다"란 명칭의 문헌(저자: Rihs, H.-P. and Peters, R.).

1991년도에 발행된 잡지(EMBO J. 10: 633)에 실린 "핵 세포질성 단백질 수송 속도는 SV40 T-항원의 핵 국재화 서열을 플랭킹하는 카세인 키나제 II 부위에 의해 결정된다"란 명칭의 문헌(저자: Rihs, H.-P., Jans, D.A., Fan, H. and Peters, R.).

1994년도에 발행된 잡지(J. Biol. Chem. 269: 32678)에 실린 "백시니아 DNA 토포이소머라제를 사용한 분자 클로닝 및 폴리뉴클레오티드 합성에 대한 신규 접근법"이란 명칭의 문헌(저자: Shuman, S.).

1998년도에 발행된 잡지(Nature Biotech. 16: 80)에 실린 "DNA 벡터 화학: 플라스미드 DNA에 대한 시그날 펩티드의 공유적 부착"이란 명칭의 문헌(저자: Sebastyen, M.G., Ludtke, J.J., Bassik, M.C., Zhang, G., Budker, V., Lukhtanov, E.A., Hagstrom, J.E. and Wolff, J.A.).

1997년도에 발행된 잡지(Gene Ther. 4: 961-968)에 실린 "프로타민 설페이트는 지질-중개된 유전자 전이를 향상시킨다"란 명칭의 문헌(저자: Sorgi, F.L.,Bhattacharya, S., Huang, L.).

1998년도에 발행된 잡지(Nucleic Acids Res. 26: 4178-4185)에 실린 "주형 중합 반응을 이용한 DNA-중합체 복합체의 자가 어셈블리"란 명칭의 문헌(저자: Trubetskoy, V.S., Budker, V.G., Hanson, L.J., Slattum, P.M., Wolff, J.A., Hagstrom, J.E.).

1997년도에 발행된 잡지(Bioconjug. Chem. 8: 81-88)에 실린 "펩티드-중개된 유전자 전달: 유전자 발현에 대한 펩티드 구조의 영향"이란 명칭의 문헌(저자: Wadhwa, M.S., Collard, W.T., Adami, R.C., McKenzie, D.L., Rice, K.G.).

1997년도에 발행된 잡지(J. Virol. 71: 1850)에 실린 "인플루엔자 A 바이러스 핵 단백질 상에서의 NPI-1/NPI-3(카료페린 a) 결합 부위는 특이한 핵 국재화 시그날이다"란 명칭의 문헌(저자: Wang, P., Palese, P. and O'Neill, R.E.).

1997년도에 발행된 잡지(EMBO J. 15: 1818)에 실린 "hSRP1a의 보존된 아미노-말단 도메인은 핵 단백질 이입에 필수적이다"란 명칭의 문헌(저자: Weiss, K., Ryder, U. and Lamond, A.I.).

1996년도에 발행된 잡지(Gene Ther. 31: 1133-1142)에 실린 "펩티드-이용한 유전자 전달 시스템의 효능은 유사분열 활성에 의존한다"란 명칭의 문헌(저자: Wilke, M., Fortunati, E., van den Broek, M., Hoogeveen, A.T. and Scholte, B.J.).

1997년도에 발행된 잡지(J. Biol. Chem. 272: 22191)에 실린 "SV40 큰 종양 항원 핵 이입은 이중쇄 DNA-의존적 단백질 키나제 부위에 의해 조절된다"란 명칭의문헌(저자: Xiao, C.-Y., Hubner, S. and Jans, D.A.).

1987년도에 발행된 잡지(Exp. Cell Res. 170: 439-452)에 실린 "핵 국재화와 연관된 SV 40 큰 T-항원 영역을 함유하는 합성 펩티드는 핵 내로의 단백질의 수송을 지시한다"란 명칭의 문헌(저자: Yoneda, Y., Arioka, T., Imamoto-Sonobe, N., Sugawa, H., Shimonishi, Y., Uchida, T.).

1992년도에 발행된 잡지(Exp. Cell Res. 201: 313)에 실린 "핵 국재화 시그날 및 SV40 T-항원의 플랭킹 서열을 함유하는 긴 합성 펩티드는 핵 내로의 IgM의 수송을 효율적으로 지시한다"란 명칭의 문헌(저자: Yoneda, Y., Semba, T., Kaneda, Y., Noble, R.L., Matsuoka, Y., Kurihara, T., Okada, Y. and Imamoto, N.).

인용된 특허

"리포솜을 통한 치료제의 생체내 전달 생성 방법"이란 발명의 명칭의 미국 특허 제5631237호(1997년)(발명가: Dzau, V.J. and Kaneda, Y.).

DE 195 41 679 A1(발명가: Gerhard, F.Kuhn C-S., Mittenbuhler, K. und Appel K(Offenlegungsschrift vom 15.5.1997).

"펩티드-중개된 유전자 전이"란 발명의 명칭의 미국 특허 제5670347호(1997년)(발명가: Gopal, T.V.).

"펩티드-향상된 양이온성 지질 트랜스펙션"이란 발명의 명칭의 미국 특허 제5736392호(1998년)(발명가: Hawley-Nelson, P., Lan, J., Shih, P.J., Jessee, J.A. and Schifferli, K.P.).

"펩티드 핵산"이란 발명의 명칭의 미국 특허 제5539082호(1996년)(발명가: Nielson, P.E., Buchardt, O.Egholm, M., and Berg, R.H.).

"자가-어셈블링 폴리뉴클레오티드 전달 시스템"이란 발명의 명칭의 국제공개공보 WO 93/19768(PCT vom 14. 10. 1993; 청구항 23 내지 27항)(발명가: Szoka, F.C.Jr.).

Claims (17)

1. DNA와 특이적으로 결합되고, 하나 이상의 DNA 분자를 함유하는 복합체의 형성을 유발시키지 않는 모듈(module) A; 및 DNA에 대한 핵 수송제의 비-특이적 결합은 중개하지 않는 핵 국재화 시그날을 함유하는 모듈 B로 이루어진 핵 수송제.
2. 제1항에 있어서, 모듈 A가 DNA와 서열 특이적으로 결합되는 핵 수송제.
3. 제1항에 있어서, 모듈 A가 DNA 말단과 특이적으로 결합되는 핵 수송제.
4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 모듈 A가 펩티드, 단백질 또는 PNA(펩티드 핵산)인 핵 수송제.
5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 모듈 B가 이의 전하로 인해 DNA와 복합체를 형성하지 않는 연장된 핵 국재화 시그날을 함유하는 핵 수송제.
6. 제5항에 있어서, 모듈 B가 대략 중성의 총 전하를 보유하고 있는 연장된 핵 국재화 시그날을 함유하는 핵 수송제.
7. 제6항에 있어서, 모듈 B가 핵 국재화 시그날과 음전하를 띤 플랭킹 아미노산을 포함하는 연장된 핵 국재화 시그날을 함유하는 핵 수송제.
8. 제5항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 모듈 B가 핵 국재화 시그날 또는 연장된 핵 국재화 시그날 이외에도, 이러한 핵 국재화 시그날에 직접적으로 속하지 않는 부가의 펩티드 서열 또는 비-펩티드 성분을 함유하는 핵 수송제.
9. 제1항에 있어서, 모듈 A가 PNA이고 모듈 B가 NLS 시그날 대신 또는 이에 덧붙여 비-NLS 시그날을 함유하는 핵 수송제.
10. 제1항에 있어서, 모듈 A가 DNA와 서열 특이적 방식으로 결합되는 단백질이고, 모듈 B가 NLS 시그날 대신 또는 이에 덧붙여 비-NLS 시그날을 함유하는 핵 수송제.
11. 제9항에 있어서, 비-NLS 시그날이, DNA 흡수를 중개할 수 있는 세포내 표면 구조에 대한 리간드, 수송 구조물에 대한 세포 결합을 중개하는 시그날 및 막을 탈안정화시키는 펩티드, 및 핵에서 보존되게 해주는 시그날로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵 수송제.
12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 핵 수송제, 및 양이온성 지질, 펩티드, 폴리아민 또는 양이온성 중합체를 포함하는 유전자 전이 시스템.
13. 진핵 세포를 수송될 DNA와 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 핵 수송제로 트랜스펙션(transfection)시킴으로써, 상기 진핵 세포의 핵 내로 DNA를 수송하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 진핵 세포가 원시 세포인 방법.
15. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 핵 수송제를 포함하는 약제학적 조성물.
16. 유전자 요법에 있어서의 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 핵 수송제의 용도.
17. 암, 바이러스성 감염, 신경계 질환, 조직이식 거부, 및 단일유전자성 또는 다유전자성 유전병을 치료하기 위한 유전자 요법에 있어서의 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 핵 수송제의 용도.