HU223263B1 - Nukleinsavak transzfekciójára alkalmas gyógyászati kompozíciók és alkalmazásuk - Google Patents

Nukleinsavak transzfekciójára alkalmas gyógyászati kompozíciók és alkalmazásuk Download PDF

Info

Publication number
HU223263B1
HU223263B1 HU9801207A HUP9801207A HU223263B1 HU 223263 B1 HU223263 B1 HU 223263B1 HU 9801207 A HU9801207 A HU 9801207A HU P9801207 A HUP9801207 A HU P9801207A HU 223263 B1 HU223263 B1 HU 223263B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
pharmaceutical composition
composition according
compound
nucleic acid
cooh
Prior art date
Application number
HU9801207A
Other languages
English (en)
Inventor
Gerardo Byk
Daniel Scherman
Bertrand Schwartz
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9476267&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU223263(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S.A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Publication of HUP9801207A2 publication Critical patent/HUP9801207A2/hu
Publication of HUP9801207A3 publication Critical patent/HUP9801207A3/hu
Publication of HU223263B1 publication Critical patent/HU223263B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát nukleinsav transzfekciójára alkalmas gyógyászatikompozíció képezi, amely a transzfektálandó nukleinsavon kívül egytranszfekciós hatóanyagot és legalább egy, a nukleinsavkondenzációjában részt vevő vegyületet tartalmaz, melyre jellemző,hogy az említett vegyület részben vagy egészben, folytonosan vagy nemfolytonosan ismétlődő (KTPKKAKKP) és/vagy (ATPAKKAA) peptidegységekbőláll, ahol az egységek száma 2– 10, vagy az alábbi oligopeptidekegyikét tartalmazza: SRSRYYRQRQRSRRRRRR(COOH) vagyRRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH). ŕ

Description

A jelen találmány a génterápia területét, illetve egész pontosan genetikai anyag in vitro, ex vivő és/vagy in vivő átvitelét érinti. Pontosabban, egy új, a sejttranszfekció szempontjából hasznos gyógyászati kompozícióra vonatkozik. A találmány tárgyát képezi ezen kompozíció alkalmazása is.
A különböző kromoszóma-rendellenességek és/vagy eltérések (mutációk, megváltozott kifejeződés stb.) sok öröklődő vagy nem öröklődő betegség kialakulásának okozói. Ezekkel a betegségekkel szemben a hagyományos orvostudomány sokáig hatástalannak bizonyult. Napjainkban a génterápia kifejlődésével a jövőre nézve azt reméljük, hogy képesek leszünk előre jelezni és korrigálni ezen kromoszomális rendellenességeket. Ez az új gyógymód egy új genetikai információnak a sejtbe vagy szervbe történő bejuttatását szolgálja azon célból, hogy az említett rendellenességeket vagy eltéréseket korrigálja, vagy még inkább egy gyógyhatású fehérje kifejeződését elősegítse.
A legnagyobb akadályt a nukleinsavak számára a célsejtekbe vagy célszervekbe való bejutás során a méretük és a sejtmembránon való átjutást nehezítő polianionos jellegük jelenti.
Ezen nehézségek legyőzésére manapság különböző technikák javasoltak, úgymint a plazmidmembránon keresztül történő csupasz DNS in vivő transzfekciója (WO90/11092), illetve a transzfekciós vektoron keresztül történő DNS-transzfekció.
Ami a csupasz DNS-transzfekciót illeti, a hatékonysága ez idáig még csekélynek bizonyult. A csupasz nukleinsavak plazmafelezési ideje az enzimek által történő lebontásuk és a húgyúti eltávolítás miatt rövid.
Ami a második technikát illeti, általában két módszer megvalósítását teszi lehetővé.
Az első módszer során olyan természetes transzfekciós vektorokat hoznak létre, mint a vírusok. Itt javasolt az adenovírusok, a herpeszvírusok, a retrovírusok és újabban az adenoasszociált vírusok használata. Ezek a vektorok a transzfekció szempontjából hatékonynak bizonyultak, de sajnos esetükben nem zárhatjuk ki teljesen a vírusjellegükből következő fertőzés-, replikációs és/vagy immunogenitásveszély lehetőségét.
A második módszer előnyösen az eukarióta sejtekben a DNS-expresszió és transzfer elősegítésére képes, nem vírusjellegű hatóanyagok használatára vonatkozik.
A találmány tárgya egész pontosan a második módszer területére tartozik.
A kémiai és biokémiai vektorok a természetes vírusok számára egy előnyös alternatívát biztosítanak, egészen pontosan a vírus immunológiai válasza és/vagy a vírus rekombinációja hiányából következően. Nem rendelkeznek a fertőzőképesség tulajdonságával, a DNS megsokszorozódásának veszélye ezekben a vektorokban nulla, és ezenkívül nincs semmilyen elméleti határ, ami a transzfekció során használt DNS méretét illeti.
Ezeknek a mesterségesen előállított vektoroknak két alapvető funkciója van, egyrészt a transzfekció során használt DNS kondenzációjának, másrészt a sejtekhez való kötődés képességének megnövelése, illetve ugyanígy a plazmidmembránon és adott esetben a két magmembránon való átjutás elősegítése.
Polianionos jellegéből következően a DNS-nek természetesen semmilyen affinitása nincs a szintén polianionos sejtek plazmidmembránja iránt. Ennek a nehézségnek a kiküszöbölésére ezek a nem vírusjellegű vektorok általában mind polikationos töltéssel rendelkeznek.
A kifejlesztett, mesterségesen előállított vektorok között a polilizin és DEAE dextrán jellegű kationos polimerek, a kationos lipidek vagy lipofektánsok a legelőnyösebbek. Ezek DNS-t kondenzáló képességgel rendelkeznek, és elősegítik a DNS-nek a sejtmembránnal való összekapcsolódását. A közelmúltban kifejlesztették a célirányos és egy receptor által elősegített transzfekció módszerét. Ez a technika a DNS-kondenzációt használja fel a kationos polimereknek köszönhetően úgy, hogy elősegíti a komplex kötődését a membránhoz, mégpedig úgy, hogy a kationos polimer és a beoltandó sejt membránreceptorának egy liganduma között kötést hoz létre. Az inzulin és a transzferinreceptorok vagy a májsejtek aszialo-glikoprotein-receptorainak célirányos felkutatását e célból valósították meg.
A napjainkban használt mesterségesen előállított vektorok még korántsem olyan hatékonyak, mint a vírusvektorok. Ennek okai lehetnek a transzfekcióhoz szükséges elégtelen DNS-kondenzáció és/vagy a DNS-nek az endoszómából való kijuttatásakor és a sejtmagba való bejuttatásakor alkalmazott transzfekció során fellépő nehézségek, továbbá egyéb nehézségek, amelyek az alkalmazott lipofektánsok kationos polimereinek természetéből egyenesen következnek.
A találmány előnyös megoldást nyújt ezekre a problémákra.
Még pontosabban, a jelen találmány tárgya egy, a nukleinsavak transzfekcióját elősegítő gyógyászati kompozíció, amely az említett nukleinsavon kívül még tartalmaz legalább egy transzfekciós hatóanyagot és egy, az illető nukleinsav kondenzációjában részt vevő vegyületet, amely vegyület részben vagy egészben egy hisztonból, egy nukleolinból, egy protaminból és/vagy ezek származékából származtatható.
Nem várt módon a feltalálók bebizonyították, hogy egy ilyen kompozíció jelenléte egy klasszikus transzfekciós hatóanyag-alapú transzfekciós keverékben lehetővé teszi ezen hatóanyag mennyiségének jelentős csökkentését és ezáltal a szer toxikológiai hatásának kedvezőbb alakulását anélkül, hogy a nevezett keverék transzfekciós aktivitására káros hatással lenne. Épp ellenkezőleg, ez előnyösen egy hatékonyabb transzfekciót tesz lehetővé.
A találmány tárgya a nukleinsav kondenzációjában részt vevő minden olyan vegyület, amely direkt vagy indirekt módon tömöríti a nukleinsavat. Még pontosabban ez a vegyület vagy direkt módon a transzfekció során használt nukleinsavra hat, vagy egy kapcsolt vegyületre, amely direkt módon vesz részt ezen nukleinsav kondenzációs folyamataiban.
A találmány egy különleges megvalósítási módja szerint a nukleinsavak kondenzációjában részt vevő ve2
HU 223 263 Bl gyület részben vagy egészben a KTPKKAKKP (1. számú szekvencia) és/vagy ATPAKKAA (2. számú szekvencia) peptidelemekből és/vagy ezek származékaiból áll, ezen elemek száma 2 és 10 között változhat. A találmány szerinti vegyület szerkezetében ezek az elemek folytonosan vagy nem folytonosan ismétlődhetnek. Ezáltal biokémiai jellegű, például egy vagy több nukleinsav általi, vagy kémiai jellegű kötések által lehetnek egymástól elválasztva.
A találmány szerinti vegyület különösen előnyös módon egy olyan peptid vagy pszeudopeptid lehet, amely a találmány szempontjából különösen előnyös módon nagyrészt olyan bázikus jellegű aminosavakból áll, mint a lizin, hisztidin vagy az arginin. Az említett vegyület konformációja β-lemez. A bázikus aminosavakról elmondhatjuk, hogy specifikusabban vesznek részt a fehérje-nukleinsav kötések kialakításában. A nukleinsavak kondenzációjában részt vevő két egység ionos hidrogénkötéseinek kialakulásában vesz részt. Eközben a βlemezszerkezetre jellemző, hogy jobb hozzáférhetőséget biztosít a karbonilcsoportok és a hidrogénatomok számára, amelyek viszont akceptor és donor jellegükből következően elősegítik a kondenzálandó nukleinsawal való kötések kialakításának lehetőségét.
Még pontosabban, a hiszton, a nukleolin, a protamin és/vagy ezek deriváltjainak egy részéről vagy egészéről van szó.
A hisztonok és a protaminok kationos fehérjék, amelyek természetesen is tömörítik a DNS-t. így, ezek a vegyületek részt vesznek néhány vírus nem átírt DNSszakaszának in vivő DNS-kondenzációs folyamatában. A jelen leírásban hisztonnak meghatározott vegyületek közül egész pontosan a Hl, H2a, H3 és H4 hisztonokat említhetjük. Ami a nuklealint illeti, itt a sejtmagvacska egyik fehérjéjéről van szó, amely úgy tűnik, szoros együttműködésben van a Hl hisztonnal, annak DNStömörítő működése során. A találmány szerinti vegyület azzal jellemezhető, hogy a nukleolin N-terminális peptidszekvenciájának származéka, még pontosabban az (ATPAKKAA)2(COOH) (3. számú szekvencia).
A találmány szerint előállított vegyület előnyösen a Hl hisztonnak az egyik szekvenciája, még előnyösebben a C-terminális doménjének, egész pontosan a (KTPKKAKKP)2(COOH) szekvenciának (4. számú szekvencia) felel meg.
A találmány szerinti vegyületek közül előnyösek még a következő oligopeptidek: ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH) (5. számú szekvencia) és
KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH) (6. számú szekvencia).
Ami a jelen találmányban szintén használható protamin származék szekvenciáit illeti, egész pontosan a következő oligopeptidszekvenciákat javasoljuk: SRSRYYRQRQRSRRRRRR(COOH) (7. számú szekvencia) és
RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH) (8. számú szekvencia).
A jelen találmányban a származék fogalom magában foglalja az összes peptidet, pszeudopeptidet (nem biokémiai elemeket is tartalmazó peptidet) vagy egy olyan fehérjét, amely különbözik a tárgyalt fehérjéktől vagy peptidektől, és egy vagy több genetikai és/vagy kémiai jellegű módosítással állítottuk elő. A genetikai és/vagy kémiai módosításon mutációt, szubsztitúciót, deléciót, addíciót és/vagy a tárgyalt fehérje egy vagy több aminosavmaradékának megváltoztatását értjük. Még pontosabban, kémiai módosításon az illető peptidek vagy proteinek minden kémiai úton előállított vagy kémiai egységekből előállított biológiai vagy nem biológiai molekuláinak módosítását értjük az említett fehéije bármely számú aminosavmaradékában. Genetikai módosításon minden olyan peptidszekvenciát értünk, amely szekvenciákkal vagy fragmentumokkal a DNS hibridizál, és így a termék az előírt aktivitással rendelkezik. Az ilyen származékok különböző célokkal állíthatók elő, ez lehet például a polipeptidek ligandumaihoz való megfelelő affinitásának megnövelése, a derivált termelékenységének megnövelése, a proteázokkal szembeni rezisztenciájának megnövelése, az aktivitásának növelése és/vagy megváltoztatása, vagy célul tűzhetjük ki azt is, hogy új farmakokinetikai vagy új biológiai tulajdonságokkal lássuk el a származékokat. Az addíció eredményeként létrejött származékok közül megemlíthetjük például az olyan kiméra peptidszekvenciákat, amelyek az egyik extremitásukon egy csatolt heterológ részt tartalmaznak. A származék kifejezés más sejtforrásokból, pontosabban emberi sejtekből vagy más organizmusokból származó és ugyanolyan aktivitással rendelkező, az említett szekvenciával homológ proteinszekvenciát is tartalmazó szekvenciákra is vonatkozik. Az ilyen homológ szekvenciák a megfelelő DNS-hibridizációs kísérlet útján állíthatók elő. A hibridizációk megvalósíthatóak nukleinsavbankok alapján, mintának natív szekvenciákat vagy azok egy fragmentumát használva, hagyományosan szigorú körülmények között (Maniatis et al.) (lásd a molekuláris biológia általános szabályai), vagy előnyösebben fokozottan szigorú körülményeket alkalmazva.
Egy rendkívül előnyös megvalósítási módszer szerint, a jelen találmány szerinti vegyületek többek között egy, a nukleinsavak transzfer folyamatait irányító célelemet tartalmaznak. Ez a célelem lehet egy sejten kívüli (extracelluláris) célelem, amely lehetővé teszi a nukleinsavak transzfer folyamatainak bizonyos sejt- vagy szövettípusok (rákos sejtek, májsejtek, vörösvértestképző sejtek) irányába történő orientálását. Ugyanígy beszélhetünk sejten belüli (intracelluláris) célelemről is, amely a nukleinsavak transzfer folyamatait bizonyos meghatározott sejtalkotók (mitokondrium, mag stb.) irányába próbálja orientálni.
Még előnyösebben a célelem kovalens vagy nem kovalens módon kötődik a találmányban meghatározott vegyülethez. A célelem kötődhet nukleinsavhoz is. A találmány egyik előnyös alkalmazása szerint az említett vegyület egyik extremitásához szupplementer heterológ csatolt részen keresztül kapcsolódik. Ezek a részek a sejttranszfekciót elősegítő fúzogén típusú peptidek, feladatuk, hogy elősegítsék a sejtek transzfekcióját, azaz a transzfekciós vegyületnek vagy különböző ele3
HU 223 263 Bl meinek a membránon való átjutását részesítsék előnyben, segítsék az endoszómából való kijutásnál, vagy a sejtmagmembránon való átjutásnál. Beszélhetünk sejtreceptor-ligandumról is, amely olyan sejttípusok felületén található, mint például a cukor, a transzferin, az inzulin vagy az aszialo-orosomukoid fehéije. Intracelluláris típusú ligandumról is lehet szó, mint például egy mag szignál lokalizációs szekvencia (nls), amely a mag belsejébe transzfektált (szállított) DNS felhalmozódását részesíti előnyben.
A találmány keretein belül alkalmazott célelemek között megemlíthetjük a cukrokat, a peptideket, a hormonokat, vitaminokat, citokineket, oligonukleotidokat, lipideket vagy az ezekből az elemekből származtatható frakciókat, vagy szekvenciákat, amelyek képesek a nekik megfelelő receptorokkal specifikus kötést létesíteni. Előnyösen cukrokról és/vagy olyan peptidekről van szó, mint például az antitestek vagy antitestfragmentumok, a sejtreceptor-ligandumok vagy azok fragmentumai, a receptorok vagy a receptor fragmentumai stb. Különösen fontos megemlíteni a növekedési faktorokat, a citokinek receptorait, a sejtben található lektinek receptorait vagy az adhéziós fehérjék receptorait. Továbbiakban megemlíthetjük a transzferin receptorát, a HDL-eket (nagy sűrűségű lipoprotein) és LDL-eket (kis sűrűségű lipoprotein). A célelem szintén lehet egy olyan cukor, amely a lektineket célozza meg, ilyenek például az aszialo-glikoprotein-receptorok, vagy lehetnek még az antitestek Fab-fragmentumai is, amelyek az immunglobulinok Fc-fragmentumának receptorát célozzák meg.
Ezen kompozíció bemutatásának céljából a jelen találmányban létrehoztunk egy Hrnls típusú vegyületet, illetve még előnyösebben egy PKKKRKV-bAla-(KTPKKAKKP)2(COOH) szekvenciát (9. számú szekvencia) tartalmazó peptidet.
Előnyösen találmány szerinti vegyület lehet minden hiszton-, protamin- vagy nukleolinszármazék, többek között ilyenek a poliglikolizálható, a szulfonálható és/vagy a foszforilálható, és/vagy a komplex cukrokba vagy egy lipofil vegyületbe illeszthető vegyületek, mint például a hosszú szénláncú vegyületek vagy a koleszterinszármazékai.
A találmányban szereplő vegyület magától értetődően más-más módon nukleinsavakat tömörítő különböző vegyületeket tartalmaz. Ily módon összekapcsolhatunk egy hiszton típusú vegyületet és egy nukleolin típusú vegyületet.
A találmányban szereplő vegyület a találmányban szereplő nukleinsav tömörítéséhez szükséges mennyiségben van jelen. így a vegyület és a nukleinsav aránya (tömegben kifejezve) 0,1 és 10 közötti, illetve még előnyösebben 0,3 és 3 közötti.
Ami a vegyületben lévő transzfekciós ágenst illeti, azt előnyösen a kationos polimerek és a lipofektánsok közül választjuk ki.
A jelen találmány szerint egy kationos polimer előnyösen egy (I) általános képletű vegyület - amelyben: R jelentése hidrogénatom vagy egy (a) általános képletű funkciós csoport, n értéke 2 és 10 közötti egész szám;
p és q egész számok -, és ebből következően a p+q összeggel megegyezően a polimer átlagos molekulatömege 100 és 107 D között van.
Nyilvánvaló, hogy az (I) általános képletben az n és p értéke a különböző formulákban változhat. így az (I) általános képlet magában foglalja a homopolimereket és a heteropolimereket is.
Igen előnyösen az (I) általános képletben n értéke 2 és 5 közötti lehet. Különösen az imino-polietilén (PEI) és az imino-polipropilén (PPI) polimerei mutatnak nagyon előnyös tulajdonságokat. A jelen találmány megvalósításánál a 103 és 5 χ 106 közötti molekulatömegű polimerek használata kedvező. Példaként megemlíthetjük az 50 000 D molekulatömegű imino-polietilént (PEI50K) vagy a 80 000 D molekulatömegű imino-polietilént (PEI800K).
A PEI50K vagy a PEI800K a kereskedelemben hozzáférhetőek. Az (I) általános képlet alapján meghatározott többi polimer az FR 9408735 számú szabadalmi bejelentésben közölt módszer szerint állítható elő.
A találmány szerinti kompozíció optimális hatásának eléréséhez a polimer és a nukleinsav arányának előnyösen az R=polimer aminjai/nukleinsav foszfátjai moláris arány meghatározás szerint a 0,5 és 50, még előnyösebben az 5 és 30 érték között kell lennie. A leginkább megfelelő eredményeket akkor kaptuk, amikor nukleinsavtöltésenként 5-25 aminpolimer ekvivalenst használtunk. Ami a lipofektánsokat illeti, a találmány leírásában ezen elnevezés alatt minden lipidjellegű vegyületet és a már a nukleinsavak transzfekciója kapcsán említett aktív ágenst értünk. Általánosságban amfifil molekulákról van szó, amelyekben legalább egy lipofil régió vagy nem lipofil régió kapcsolódik egy hidrofil régióhoz. Az első vegyületcsalád bemutatására illusztrációs jelleggel az olyan lipideket javasolhatjuk, amelyek jellemzően polietilénglikol jelenlétében vagy annak hiányában liposzómákat alakítanak ki, ilyenek a POPC vagy a foszfatidilszerin, a foszfatidil-kolin, a koleszterin, a maleimido-fenil-butiril-foszfatidil-etanol-amin, a laktozil-szeramid, amelyek furtif liposzómák előállítására használhatók, illetve antitestekkel vagy anélkül, vagy ligandumokkal vagy anélkül immunoliposzómákat és célliposzómákat állíthatunk elő belőlük.
A találmány egy különleges megvalósítása szerint az előállított lipidjellegű hatóanyag rendelkezik egy kationos régióval. Ez a kationos régió, amely előnyösen egy kationosan töltött poliamin, képes reverzibilisen kapcsolódni a negatív töltésű nukleinsavhoz. Ez a kölcsönhatás erősen tömöríti a nukleinsavat. A lipofil régió ezt az ionos kötődést a külső vizes közeggel lehetetlenné teszi azáltal, hogy a nukleolipidikus részecskét lipidhártyával veszi körül. Ebből következően tudjuk, hogy egy pozitív töltésű kationos lipid az N-[2,3-(dioleil-oxi)-propil]Ν,Ν,Ν,-trimetil-ammónium (DOTMA) liposzóma vagy kis vezikula formájában spontán interferál a negatív töltésű DNS-sel, hogy azzal lipid-DNS komplexet alkosson, és ezáltal a sejtmembránnal fuzionálhasson, illetve a DNS intracelluláris közegbe való kiszabadulását lehető4
HU 223 263 Bl vé tegye. A kationos lipidek kategóriájából illusztrációs céllal a DOTAP, DOBT vagy ChOTB-ket sorolhatjuk fel. Más vegyületek, mint például a DOSC és a ChOSC azzal jellemezhetőek, hogy a kvatemer ammóniumcsoport helyett kolincsoportot tartalmaznak. Egy másik kationos lipidtípust is meghatároztunk. Ebben a típusú vegyületben a kationos csoportot az l-(5-karboxi-spermin)gyök jellemzi, amely négy ammóniumcsoportot, két prímért és két szekundert tartalmaz. Idetartozik a DOGS és a DPPES is. Ezek a lipopoliaminok a primer belső elválasztású sejtek transzfekciójánál különösen hatékonyak.
Előnyösen a találmány szerinti lipofektánsok olyan lipopoliaminok közül kerülnek ki, amelyek poliaminrégiója a (II) általános képletnek felel meg, amelyben m értéke 1-nél nagyobb vagy azzal egyenlő egész szám, és n értéke is egy 1-nél nagyobb vagy azzal egyenlő egész szám, m a két aminocsoport közötti változó szénatomszámú csoport szénatomjainak számát adja meg;
előnyösen m értéke 2-6 és n értéke 1-5.
Még előnyösebben a poliaminrégiót a spermin, a termin vagy ezek valamely DNS-hez kötő képességgel rendelkező analógja képviseli. A lipofil régiót legalább egy olyan koleszterinnel, természetes lipiddel vagy szintetikus lipiddel szubsztituált telített vagy nem telített szénhidrogéncsoport alkotja, amely képes kovalens módon a hidrofil régióhoz kötődő lamelláris vagy hexagonális fázisok kialakítására.
Az EP 394 111 számú szabadalmi irat a jelen találmányban felhasználható olyan (III) általános képletű lipopoliaminokat mutat be, amelyek képletében R jelentése (R1R2)N-CO-CH-NH-CO- általános képletű csoport.
Ezen lipopoliaminok ismertetése céljából illusztrációsjelleggel különösen a dioktadecil-amido-glicil-spermint (DOGS) és a palmitoil-foszfatidil-etanol-amin 5karboxi-spermil-amidját (DPPES) említhetjük.
Az FR 97 14596 számú szabadalmi bejelentésben leírt lipopoliaminok szintén előnyösen felhasználhatók a találmányban említett transzfekciós hatóanyagként. Ezek a fent említett olyan (III) általános képlettel jellemezhetők, amelyben
R jelentése olyan (IV) általános képletű csoport, amelyben
X és X’ egymástól függetlenül oxigénatomot, egy -(CH2)q- általános képletű (poli)metiléncsoportot - ahol q=0, 1, 2 vagy 3 - vagy egy olyan -NH- képletű vagy -NR’- általános képletű aminocsoportot jelent, ahol R’ 1-4 szénatomos alkilcsoport;
Y és Y’ jelentése egymástól függetlenül metilén-, karbonil- vagy =C=S csoport;
R3, R4 és R5 egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoport;
p értéke 0 és 5 között változhat; és
R6 jelentése koleszterilcsoport vagy egy -NRjR2 általános képletű alkil-amino-csoport, ahol Rj és
R2 egymástól függetlenül telített vagy telítetlen, lineáris vagy elágazó láncú, 12-22 szénatomos alifás csoport.
Ezen lipopoliaminok közül illusztrációs céllal megemlíthetjük a 2,5-bisz[(3-amino-propil)-amino)]pentil-[(dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát]-ot és az {l,3-bisz[(3-amino-propil)-amino]-2-propil}-[(dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát]-ot, amit a későbbiekben lipopoliamin A-nak nevezünk.
Az ezeknek megfelelő lipopoliaminok előállítására használható eljárásokat az EP 394 111 és az FR 94 145 96 szabadalmi iratok tartalmazzák.
Végül még a korábbiakban, az FR 95/134 90 számú szabadalmi iratban leírt új lipopoliaminokat a jelen találmány keretében kívánjuk hasznosítani. Ezen lipopoliaminok közül illusztrációs céllal különösen fontosnak tartjuk a következőket, amelyeket az alábbiakban mutatunk be:
- lipopoliamin B:
{H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2 (RP120525),
- lipopoliamin C:
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)18]2 (RP120535),
- lipopoliamin D:
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)18] (RP12O531).
A jelen találmányban különösen előnyös módon felhasználhatjuk a dioktadecil-amido-glicil-spermint (DOGS), a palmitoil-foszfatidil-etanol-amin 5-karboxispermin-amidját (DPPES), a {2,5-bisz[(3-amino-propil)-amino]-pentil} -[(dioktadecil-karbamoil-metoxi)acetát]-ot, a {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N {(CH2)3NH2) (CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2-t, a H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)18]2-t vagy a H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)I8]-t.
Hogy a találmányban szereplő keverékek optimális hatását érjük el, a poliamin és a nukleinsav megfelelő R arányát úgy választjuk meg, hogy a transzfekciós hatóanyag pozitív töltésének aránya és a nukleinsav negatív töltésének aránya 0,1 és 10, még előnyösebben 0,5 és 6 között legyen.
A találmány szerinti vegyület jelenléte a transzfekciós keverékben előnyösen a transzfekciós hatóanyag jelentős csökkentését teszi lehetővé. Ebből annak lecsökkent toxicitása következik, ami a jövőben lehetővé teszi például az olyan sejtek transzfekcióját, amelyek kezdetben a sejtek transzfekciós hatóanyagaira érzékenyek voltak, mint például a vörösvértestképző sejtek a lipopoliaminokra. Végül, mint ahogy azt az itt következő példa bemutatja, a találmány szerinti kompozíciók transzfekciós hatékonysága magasabb a klasszikus transzfekciós keverékek által elért hatékonyságnál.
A jelen találmány szerinti kompozíciókban szereplő nukleinsav ugyanúgy lehet dezoxiribonukleinsav, mint ribonukleinsav. Beszélhetünk természetes vagy mesterséges eredetű szekvenciákról, illetve pontosabban geno5
HU 223 263 Bl miális eredetű DNS-ről, cDNS-ről, mRNS-ről, tRNSről és rRNS-ről, hibrid szekvenciákról vagy szintetikus szekvenciákról, illetve félszintetikus szekvenciákról. Ezek a nukleinsavak lehetnek humán, állati, növényi, bakteriális vagy vírus- stb. eredetűek. A kutatók által jól ismert technikákkal állíthatók elő, egészen pontosan génbankszelekcióval vagy kémiai szintézissel, továbbá a bankszelekció útján kiválasztott szekvenciákon kémiai vagy enzimatikus módosításokat végrehajtva, azaz kevert technikákat alkalmazva. Ezenkívül beiktathatok vektorokba, például plazmidvektorokba is.
Különösen ami a dezoxiribonukleinsavakat illeti, azok lehetnek egyszálúak vagy kétszálúak. Ezek a dezoxiribonukleinsavak kódolhatnak terápiás géneket, a transzkripció és replikáció regulációs génjeit, antiszensz (ellenirányú) géneket, más sejtalkotók kötőrégióit stb.
A találmány leírásában terápiás génen minden olyan fehérjejellegű terméket kódoló gént értünk, amelynek terápiás hatása van. Az így kódolt fehéijejellegű termék lehet fehéije vagy peptid stb. Ez a fehérjejellegű termék a célsejthez képest lehet homológ (azaz egy olyan termék, ami a célsejtben normálisan is kifejeződik, amikor semmilyen kóros állapot nem áll fenn). Ebben az esetben a fehéije kifejeződése lehetővé teheti valamely változtatás céljából egy másik fehéije elégtelen vagy legyengült aktivitása kifejeződésének álcázását, vagy éppen palástolhatja a fehéije fokozott kifejeződését is. A terápiás gén a sejtben található fehéije egy csökkent stabilitású, megváltoztatott aktivitású stb. mutánsát is kódolhatja. A fehérjetermészetű termék a célsejttel szemben lehet heterológ is. Ebben az esetben egy kifejeződő fehéije például kiegészítheti vagy pótolhatja a sejtben a hiányzó aktivitást, lehetővé téve ezzel, hogy a fehéije felvegye a harcot egy betegséggel, vagy stimuláljon egy immunválaszt.
A jelen találmányban szereplő hatóanyagok közül különösen fontos megemlítenünk az enzimeket, véralkotókat, hormonokat, a limfokineket: interleukinokat, interferonokat, TNF-eket stb. (FR 9203120), a növekedési faktorokat, a neurotranszmittereket vagy azok prekurzorait, vagy azok szintéziséhez szükséges enzimeket, a trofikus faktorokat: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofm, a lipidek metabolizmusában részt vevő fehéijéket kódoló géneket, a következő apolipoproteinfajtákat: A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J és apo(a) típusúakat, a metabolizmusban részt vevő enzimeket, mint például a lipoprotein lipázait, a vérsejt lipázát, a lecitin-koleszterin-acil-transzferázt, a 7-alfakoleszterin-hidroxilázt, a foszfatidil-acil-foszfatázt, illetve a lipidek transzfer fehérjéit, mint például a koleszterinészterek transzfer fehéijéit és a foszfolipidek transzfer fehérjéit, a HDL-ek kötőfehéijéit vagy például az LDL-receptorok közül kiválasztott receptort, vagy például a kilomikron-maradék receptorokat és a scavenger receptorokat, a disztrofint, vagy a minidisztrofint (FR 9111947), a GAX fehérjét, a mukovicidózis során előforduló CFTR fehéijét, a rákos sejtek növekedését elősegítő géneket: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev stb. (FR 93 04 745), a koagulációban részt vevő faktorokat kódoló géneket, a VII, VIII, IX faktorokat, a DNS javításában részt vevő géneket, az öngyilkos géneket (a timidin-kinázt, a citozin-deaminázt) stb.
A terápiás gén lehet egy antiszensz gén vagy szekvencia is, melynek kifejeződése a célsejtben kontrollálni tudja a gének kifejeződését vagy a celluláris mRNS transzkripcióját. Egy ilyen szekvencia a célsejtben átírható a sejt mRNS-éről komplementer RNS-sé, és így blokkolható a fehérjére történő átírás az EP 140 308 szabadalmi iratban leírt technika szerint. Az antiszensz szekvenciák a ribozimoknak kódoló szekvenciákat is magukban foglalják, amelyek képesek a cél-RNS-ek szelektív elpusztítására (EP 321 201).
Mint ahogy azt a fentiekben leírtuk, a nukleinsav szintén tartalmazhat egy vagy több antigén jellegű pepiidet kódoló gént, olyat, amely képes az embernél vagy az állatnál immunválaszt stimulálni. Egy különleges megvalósítási mód szerint a találmány lehetővé teszi vakcinák előállítását vagy immunterápiás gyógymódok használatát emberben vagy állatban, egész pontosan mikroorganizmusok, vírusok vagy különböző rákfajták ellen. Beszélhetünk az Epstein-Barr-vírus specifikus antigén hatású peptidjeiről, a HIV-vírusról, a hepatitis B-vírusról (EP 1885 573), az álveszettségvírusról vagy a tumorok specifikus vírusairól (EP 259 212).
Előnyösen a nukleinsav tartalmaz a terápiás gén kifejeződését lehetővé tevő szekvenciákat és/vagy a kívánt szervezetben vagy sejtben az antigén jellegű pepiidet kódoló géneket is. Beszélhetünk olyan szekvenciákról, amelyek természetesen az említett gén kifejeződéséért felelősek, mihelyt szekvenciái a megfertőzött sejtben működőképessé válnak. Szintén beszélhetünk különböző eredetű (más fehérjék kifejeződéséért felelős vagy akár szintetikus) szekvenciákról. Egész pontosan az eukarióták vagy vírusok promoterszekvenciáiról van szó. Például szó lehet azon sejt genomjából származó promoterszekvenciáról, amelyet meg akarunk fertőzni. Ugyanígy beszélhetünk egy vírus genomjából származó promoterszekvenciáról. Ennek fényében felsorolhatjuk például a El A, MLP, CMV, RSV stb. gének promotereit. Ezek az expressziós szekvenciák aktivációs, regulációs szekvenciák hozzáadásával megváltoztathatók.
Másfelől a nukleinsav tartalmazhat a terápiás gén előtt a célsejt szekréciós folyamatai során szintetizált terápiás terméket irányító szignálszekvenciát. Ez a szignálszekvencia lehet a terápiás termék természetes szignálszekvenciája, de lehet egy teljesen más funkcionális szignálszekvencia, vagy akár egy mesterséges szignálszekvencia is.
Még előnyösebben a találmány szerinti kompozíciók magukban foglalnak egy vagy több neutrális lipidet. Ezek a vegyületek különösen előnyösek, egész pontosan akkor, amikor az R arány alacsony. A feltalálók bebizonyították azt is, hogy egy neutrális lipid hozzáadása lehetővé teszi a nukleolipidrészecskék képződésének elősegítését és a részecske sejtbe való bejutását, ezzel destabilizálva annak membránját.
Legelőnyösebb, ha a jelen találmányban felhasznált neutrális lipidek két zsírsavláncot tartalmaznak.
HU 223 263 Bl
Különösen előnyös módon zwitterionos vagy az ionos töltésüktől megfosztott természetes vagy szintetikus zsírokat használunk fiziológiás körülmények között. Egész pontosan ezeket kiválaszthatjuk a dioleoilfoszfatidil-etanol-amin (DOPE), az oleoil-palmitoilfoszfatidil-etanol-amin (POPÉ), a diszteraoil-, -palmitoil-, -mirisztoil-foszfatidil-etanol-aminok és ezek 1,3N-metil-származékai közül, a foszfatidil-glicerinek, cerebrozidok (mint például a galaktocerebrozid), szfrngolipidek (mint például a szfingomielin), vagy még az aszialo-gangliozidok (mint például az aszialoGMl és az aszialoGM2) közül.
Ezek a különböző fajta lipidek előállíthatók vagy szintézissel, vagy különböző szervekből (például az agyból vagy tojásból) történő extrakcióval a szakember által jól ismert klasszikus technikák segítségével. Különösen a természetes lipidek szerves oldószerekkel végzett extrakciója útján állíthatóak elő (lásd Lehninger, Biochemistry).
Előnyösen a találmány szerinti transzfekciós hatóanyagként használt lipofektáns vegyületek 1 ekvivalens lipopoliaminra számítva 0,1-20, még előnyösebben 1-5 ekvivalens neutrális lipidet tartalmaznak.
A találmány szerinti kompozíciók beadása történhet külsőleg, bőrön át, szájon át, végbélen keresztül, hüvelyi úton, parenterálisan, orron át, vénásan, izomba, bőr alá, szemcsamokba, irhaszöveten át stb. való használatra szolgáló készítmények formájában. Előnyösen a találmány szerinti gyógyszerészeti kompozíciók beadási formái tartalmaznak egy gyógyszerészetileg elfogadott hordozóanyagot, pontosabban egy olyat, amely alkalmas a kívánt szervezetbe direkt vagy külsőleg (bőrön és/vagy testnedveken keresztül) történő bejuttatásra. Különösen steril vagy izotóniás oldatokról, vagy száraz, egész pontosan liofilizált vegyületekről lehet szó, amelyekből steril víz vagy fiziológiás szérum hozzáadásával injektálható oldat készíthető. A nukleinsav beadása során használt dózisai, pont úgy, mint az injekciók száma, különböző paraméterek szerint változtatható, egész pontosan függ a beadás módjától, az illető betegségtől, a gén fajtájától, melynek kifejeződését stimulálni akarjuk, vagy függhet az illető kezelési mód időtartamától is.
A nukleinsavak előnyösen különböző sejttípusváltozatok, mint például a hematopoietikus sejtek, a limfociták, a hepatociták, az endoteliális sejtek, a melanomasejtek, a karcinóma- és szarkómasejtek, simaizom-sejtek, neuronok és az asztrociták transzfekciójára használhatók.
A jelen találmány így egy különösen előnyös módszert kínál betegségek kezelésére egy, az illető betegség kezelésére alkalmas nukleinsavnak kationos vagy lipofektáns polimerekkel és egy, az előbbiek során meghatározott vegyületet tartalmazó hatóanyagokkal kombinációban in vitro, ex vivő vagy in vivő transzfekciója útján. Előnyösen e szerint a módszer szerint a fehéijevagy nukleon- és nukleinsavjellegű termékek hiánya által előidézett betegség ellen beadott készítmény az említett fehérjejellegű termékből vagy nukleonjellegű termékből származó szekvenciát kódol. A találmány szerinti kompozíciók a biológiai mozgékonyságuk és magas transzfektálóképességük következtében különösen fontosak.
A jelen találmány vonatkozik továbbá minden, a (KTPKKAKKP) és/vagy az (ATPAKKAA) peptid motívumot tartalmazó vegyületre, amelyben a motívumok száma 2 és 10 között változhat, amikor azok egy sejtreceptorhoz, antitesthez vagy antitestszármazékhoz kötődnek, és egy nukleinsavat irányítanak a receptort kifejező sejtek vagy a megfelelő antitestek felé. Ezekből következően egy ligandum, egy antitest vagy potenciális antitestszármazék a vegyülethez kapcsolódik, illetve ezen kiméramolekula transzfekciós tulajdonságát egyedül a vegyületnek tudjuk be.
A jelen találmány oltalmi körébe tartoznak az alább felsorolt oligopeptidek:
(ATPAKKAA)2(COOH), (KTPKKAKKP)2(COOH), ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH), KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH), SRSRYYRQRQRSRRRRRR(COOH) és RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH), mindennemű olyan felhasználása is, ahol legalább egy, az említett célelemhez kapcsolt vagy célelemhez nem kapcsolt nukleinsav vagy előbbi oligonukleotid in vitro, ex vivő és/vagy in vivő transzferét valósítjuk meg.
A jelen találmány még teljesebb lesz a most következő példák alapján, amelyek csak szemléltető jeliegűként és a teljesség igénye nélkül kezelendők.
Anyagok és módszerek
1. Az in vivő génátvitelhez használt plazmidok
A találmányban szereplő vegyületek aktivitásának kimutatására használt szerkezetek a luciferázt (Luc) kódoló gént tartalmazó plazmidok.
Egész pontosan a pCMV luc, pXL 2621, pXL 2622 plazmidok, amelyek mindannyian tartalmazzák a pCDNA3 (Invitrogén) citomegalovírus (CMV) promotere előtt a luciferázt kódoló gént (pGL2 vektorból kinyerve, Promega). A pCMV luc és a pXL 2622 plazmidok a pGE2 vektorból származnak, a pXL 2621 pedig a pGL2 vektor plazmidja, továbbá mindezen vektorok SV40 promotere a CMV-promoterrel helyettesíthető.
Általánosságban a plazmidokat a PEG (Ausubel) kicsapási technikával állítottuk elő, és a DNS-t körülbelül 10 pg/μΙ koncentrációban 10 mM Trisz-t és 1 mM EDTA-t tartalmazó 8 pH-jú törzsoldatban 4 °C-on tároltuk.
2. A találmányban használt vegyületek
H: KTPKKAKKPKTPKKAKKP(COOH), 18 aminosav;
N: ATPAKKAAATPAKKAA(COOH), 16 aminosav;
nls-H: PKKKRKV-bAla-KTPKKAKKPKTKKAKKP(COOH), 26 aminosav;
PR1: RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR, 21 aminosav;
PR2: SRSRYYRQRQRSRRRRRR.
Ezeket az itt következő módszerek szerint állítottuk elő.
HU 223 263 Bl
2.1. N: ATPAKKAAATPAKKAA(COOH)
Ezt az oligopeptidet trifluor-ecetsavas sója formájában egy HMP-gyantán az FMOC-módszer szerint az Applied Biosystems 431 peptidszintetizátor segítségével állítottuk elő. A szintézis után a pepiidet a gyantától víz/TFA 1/19 arányú keverékének jelenlétében végzett 90 perces kezelés során hasítottuk le. Szűrés után az oldatot rotációs bepárlón koncentráltuk, majd a pepiidet a TFA-oldatból tercier-butil-metil-éter hozzáadásával kétszer kicsaptuk. A végső üledéket tercier-butil-metil-éterrel mostuk, majd szárítottuk. A peptidet 5 ml vízben oldottuk, majd fordított fázisú HPLC-vel C18 100 típusú (Biorad RSL) kolonnán szűrtük. A peptidet O-tól 25%os acetonitril és 0,07% TFA vizes oldatával tisztítottuk. A kapott peptid 95%-nál nagyobb tisztaságú, és oldékonysága vízben 100 mg/ml.
2.2. nls: PKKKRKV
Ezt az oligopeptidet trifluor-ecetsavas sója formájában a fentiekben ismertetett módszer szerint szintetizáltuk, a hasításhoz pedig víz/TFA/fenol/etánditiol/tioanizol 2/40/3/1/2 (v/v) oldatot használtunk. A kapott peptid 95%-nál nagyobb tisztaságú, és oldékonysága vízben 2,1 pH-nál 100 mg/ml.
2.3. H: KTPKKAKKPKTPKKAKKP(COOH) és nls-H: PKKKRKV-bAlaKTPKKAKKPKTKKAKKP(COOH)
Ezeket az oligopeptideket a fentiekben leírt módszer szerint trifluor-ecetsavas sóik formájában szintetizáltuk. Ahhoz, hogy ezt megvalósítsuk, a gyantát két részre osztottuk. Az egyik részt a H szintéziséhez használtuk, a hasítást TFA/fenol/etánditiol/tioanizol/víz 40/3/1/2/2 (v/v) eleggyel végeztük. A kapott peptid 90%-nál nagyobb tisztaságú, és oldékonysága vízben 2,1 pH-nál 10 mg/ml. A gyanta másik részén az nlsbAla-H szintézisét valósítottuk meg, a hasításhoz az előzővel megegyező összetételű oldatot használtunk. A kapott peptid 95%-nál nagyobb tisztaságú, és oldékonysága vízben 2,1-es pH-nál 10 mg/ml.
2.4. PR1: RRRLHR1HRRQHRSCRRRKRR és PR2: SRSRYYRQRQRSRRRRRR
Ezeket az oligopeptideket több lépésben kapcsoltuk össze a szilárd fázisú Boc-Benzyl szintézistechnikát alkalmazva. A kezdeti gyanta egy Boc-L-Arg(Tos)Pam (0,48 meq/g) gyanta. A védőcsoport eltávolítására és a kapcsolásra használt módszer a következő:
1-55% TFA metilén-dikloridban
(DCM) 1x2 perc
2-55% TFA metilén-dikloridban 1x30 perc
3-DCM 2x1 perc
4-DMF 3x1 perc
5-összekapcsolás
6-DMF 2x1 perc
7-DCM 2x1 perc
Minden lépéshez peptid-gyanta grammonként
ml oldatot használtunk. Az összes aminosav kapcsolása (háromszoros feleslegben) BOP-t, Hobt-t és DIEA-t tartalmazó DMF-ben történt. Minden kapcsolási lépést ninhidrinteszttel ellenőriztünk.
A végső peptidet a gyantából kinyertük, és arról folyékony hidrogén-fluoriddal a védőcsoportokat teljes
1. táblázat
DOGS/DNS töltésarány (RLU) vegyület nélkül H (RLU)-val
0,8X 32 850
1,8X 220 23 700
3X 5400 21 750
egészében eltávolítottuk. Peptid-gyanta grammonként 10 ml HF-ot használtunk 0 °C-on, 45 percen keresztül, p-krezol és etánditiol jelenlétében. Miután a hidrogénfluoridot elpárologtattuk, a nyers reakcióelegyet dietil-éterrel mostuk, trifluor-ecetsavban oldottuk, majd dietil-éterrel kicsaptuk és szárítottuk.
3. A használt lipofektáns hatóanyagok
Lipopoliamin A:
{d-l,3-bisz[(3-amino-propil)-aminoJ-2-propil}(dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát (RP115335).
Lipopoliamin B:
{H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2 (RP120525).
Lipopoliamin C:
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyNí(CH2)lg]2 (RP120535).
Lipopoliamin D:
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)18] (RP120531).
1. példa
In vitro nukleinsavtranszfer az NIH3T3 sejtekbe
Ez a példa nukleinsavaknak egy találmány szerinti, nukleinsavat, egy találmány szerinti vegyületet és transzfekciós hatóanyagként egy lipopoliamint tartalmazó kompozíció segítségével, különböző pH- és pufferkörülmények között történő in vitro (sejtkultúrákban) transzferét úja le.
1. Az alábbi összetevőkből 10 μΐ keveréket készítünk:
0,5 μg pCMV-luc plazmid-DNS, 0,25 μg találmány szerinti egyik vegyület egy meghatározott pufferoldatban, mM dioktadecil-amido-glicil-spermin (DOGS) az X töltésnek az egyes kísérletek szerint meghatározott arányában.
2. Az NIH3T3 sejttörzs 5 χ 104 sejtjét az előző keverékkel 37 °C-on inkubáljuk 4 órán keresztül, 5%-os CO2-atmoszférában. A sejteket ezután mossuk, és a 10% szérumot (DMEM 10% SVF) tartalmazó táptalajba 48 órára visszahelyezzük.
A sejttakarót ezután 50 μΐ lízispufferben (Promega) feloldjuk, ezután 20 000 g-nél 5 percig centrifugáljuk.
A luciferázaktivitást 20 μΐ szubsztrát (Promega) hozzáadása után 4 μΐ felülúszóban méijük. A leolvasást LKB luminométerrel végezzük az RLU-kat (Relatíve Lights Units) 20 másodpercenként összegezve.
Az eredményeket az itt következő 1. és 2. táblázatban mutatjuk be.
3. Tömörítés 150 mM NaCl+10 mM 7,1 pH-jú HEPES* [N-(2-hidroxi-etil)-piperazin-N’-(2-etil-szulfonsav)]-oldatban
HU 223 263 Bl
4. Tömörítés 5%-os D-glükóz+150mM NaCl+10 mM HEPES-oldatban (a tömörítőoldat pHja7,2)
2. táblázat
DOGS/DNS 1 töltésarány (RLU) vegyület nélkül H (RLU)-val N (RLU)-val
0,8X 880 44 000 1450
1 i>8x 6 600 156 500 -
1 3x 22 000 297 500 90 300
A kísérletek során összességében jobb eredményekhez jutottunk, ha a DOGS-os tömörítő készítményhez egy találmány szerinti vegyületet adtunk. Úgy tűnik, hogy lehetséges a DOGS mennyiségének nagymértékű csökkentése anélkül, hogy a megfelelő készítmény transzfekciójának hatékonysága romlana.
2. példa
Transzfekciós kísérlet neutrális lipid jelenlétében μΐ keveréket állítunk elő a következők alapján:
pg pCMV-luc plazmid-DNS-t, 0,25 pg találmány szerinti vegyületet előkészítünk 150 mM NaCl és 10 mM 7,4 pH-jú foszfátpufferben, mM dioktadecil-amino-glicil-spermint (DOGS) használva, minden egyes próbánál meghatározott X töltésarány szerint dioleil-foszfatidil-etanol-amin (DOPE) jelenlétében, 1/2 DOGS/DOPE arányban.
Ebben a különleges esetben etanolos 40 mM DOGSoldatot ugyanolyan térfogatú 80 mM dioleil-foszfatidil-etanol-amin (DOPE) kloroform/etanol 1/5 arányú elegyével készült oldatával keverünk össze.
Ebben a keverékben, az előző példában meghatározott körülmények szerint inkubáltuk az NIH3T3 sejttörzs 105 sejtjét. Az inkubáció befejeztével a sejteket ugyanezen példa előírásai szerint kezeltük. Az eredményeket az itt következő táblázatban mutatjuk be.
3. táblázat
DOGS/DNS töltésarány (RLU) vegyület nélkül H (RLU)-val nls-H (RLU) kimérrel
0,8XD/D 24 3 175 760
1XD/D 19 7 410 2 380
1,8XD/D 1800 39 500 52 800
Ezek az eredmények megerősítik az 1. példában kapottakat. A találmány szerinti bázikus vegyület jelenlétében, különösen a H jelenlétében a lipofektáns mennyiségének felére csökkentése lehetséges. 3 *
3. példa
A találmány szerinti vegyület/DNS arány változtatása egy találmány szerinti transzfekciós kompozícióban
3.1. DOGS-készitmény jelenlétében
1.10 pl következő összetételű elegyet állítunk elő:
- 0,75 pg pCMV-luc plazmid-DNS és egy találmány szerinti vegyület meghatározott arányú keveréke 5% D-glükózt, 150 mM NaCl-ot, 10 mM HEPES-t (a tömörítőoldat pH-ja: 7,2) tartalmazó pufferoldatban,
- 40 mM-os dioktadecil-amino-glicil-spermint (DOGS) 1,8X töltésarányban.
2. NIH3T3 sejttörzs 4 χ 105 sejtjét az előző keverékkel együtt 37 °C-on inkubáltuk 4 órán keresztül 5%-os CO2-atmoszférában. A sejteket ezután mostuk, és 48 órára visszahelyeztük a 10%-os szérumot (DMEM 10% SVF) tartalmazó tenyészetbe. A sejttakarót a transzfekció után 48 órával 100 pl lízispufferben (Promega) lízisnek vetettük alá. A leolvasást LKB luminométer segítségével végeztük az RLU-kat (Relatíve Lights Units) 20 másodpercenként összegezve.
Az eredményeket az itt következő 4. táblázat mutatja be.
4. táblázat
PEP/DNS w/v H (RLU)-val H-nls (RLU)-val N (RLU)-val
0 2 150 2150 2 150
0,25 3 300 38 000 35 000
0,5 45 000 100000 35 000
1 84 000 105 000 13 000
2 105 000 200 000 20 000
3.2. DOGS/DOPE 1,8Xjelenlétében Az előzőekben leírt 3.1. előirat szerint járunk el, de transzfekciós ágensként 40 mM dioktadecil-amido-glicil-spermin (DOGS) 1,8X és dioleoil-foszfatidil-etanolamin (DOPE) oldatát használjuk, 1/2 DOGS/DOPE arányt biztosítva, amelyet a 2. példában leírt utasítás szerint készítünk el.
Az 5. táblázat mutatja be a kapott eredményeket.
5. táblázat
| Vegyület/DNS I w/v H(RLU) H-nls (RLU) N(RLU)
1 0 580 580 580
1 0,25 13 000 5 600 7 600
0,5 11 000 18 500 1 800
I 1 14 100 36 000 13 600
1 2 16 500 58 000 14 100
4. példa
A találmány szerinti vegyület/DNS arány változtatása a találmány szerinti transzfekciós keverékben egy másik, a DOGS-tól különböző transzfekciós hatóanyagot használva
4.1. {l,3-bisz[(3-Amino-propil)-amino]-2-propil}(dioktadecil-karbamoil-metoxij-acetát (lipopoliamin A) jelenlétében
1. 10 pl következő vegyületeket tartalmazó keveréket állítunk elő:
HU 223 263 Bl
- 0,55 pg pCMV-luc plazmid-DNS és egy találmány szerinti vegyület meghatározott arányban 150 mM NaCl-pufferoldatban,
- {l,3-bisz[(3-amino-propil)-amino]-2-propil}(dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát a meghatározott töltésarányban.
2. NIH3T3 sejttörzs 5 χ 104 sejtjét az előző keverékkel 37 °C-on 4 órán keresztül inkubáltuk 5%-os CO2-atmoszférában. A sejteket ezután mostuk, és 48 órára 10% szérumot (DMEM 10% SVF) tartalmazó tenyészetbe helyeztük vissza. A sejttakarót a transzfekció után 45 órával 100 pl lízispufferben (Promega) lízisnek vetettük alá, ezután a sejteket összegyűjtöttük, és 20 000 g-nél 5 percig centrifugáltuk. A luciferázakti5 vitást 10 μΐ felülúszóban 50 μΐ szubsztrát hozzáadása után mértük. A leolvasást Berthold lumat 9501® luminométer segítségével végeztük az RLU-kat (Relatíve Lights Units) 10 másodpercenként összegezve. Az eredményeket az itt következő 6. táblázatban foglaltuk össze.
6. táblázat
Lipofektánsok Vegyület nélkül χ 105 6 * RLU H-valxl06RLU nls-H-val χ 106 RLU
A lipofektáns NH2-csoportjának/DNS foszfátjának aránya vegyület/DNS arány
0 0,5 1 2 0,5 1 2
1,8X 3,9 30,4 32,7 4,1 52,4 58,5 39,3
3X 8,9 41,5 61,3 16,6 64,1 60,4 49,2
6X 6,2 23,6 22,3 15,6
4.2. PEI800Kjelenlétében
1. A 4.1. előirat szerint járunk el, ugyanazon közeget, de lipofektánsként a PEI800K-t használva. Az eredményeket az itt következő 7. táblázatban mutatjuk be.
7. táblázat
PEI800K Vegyület nélkül χ 106 RLU H-valxlO6RLU nls-H-val χ 106 RLU
A polimer amin ekvivalens a DNS-foszfátra nézve vegyület/DNS arány
0 0,5 1 2 0,5 1 2
6 7,7 4,9 7 12,3 4 7,3 8,8
1 9 * * 5 8 11,6 4 16,3 11 12,1
1 12 7,5 11,3 17,1 1,2
5. példa
In vivő transzfer izomsejtekbe
Az ennek megfelelő kísérleteket az itt következő eszközök és módszerek segítségével valósítottuk meg.
Modell: Az injekciót a sípcsont felső részébe adtuk C57 bl6 vagy OF1 felnőtt (8 hétnél idősebb) egérnek.
Előirat: A DNS-t 0,5 mg/ml koncentrációban oldottuk egy 150 mM végső koncentrációjú NaCl-ot és 5% D-glükózt tartalmazó oldatban. Némelyik csoportban az injekciózás előtt 1 mg/ml koncentrációjú oldat formájában peptidet adtunk a DNS-hez úgy, hogy meghatározott tömeg/tömeg arányt érjünk el. Mielőtt beadtuk az oldatot, legalább 20 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk.
Az eredmények meghatározása: Két nappal a beinjekciózás után izommintát vettünk, 750 μΐ lízispufferben (Promega E153A) feldaraboltuk. A levett mintát darálóban (Heidolf) homogenizáltuk, és ebből 10 pl-t használtunk a luciferázaktivitás mérésére. Ezt a mérést egy Lumat 9501-es luminométerrel (Berthold) végeztük el a kibocsátott sugárzást 10 másodpercenként összegezve, miután 10 μΐ mintához 50 μΐ luciferázszubsztrátot adtunk. A szubsztrát hozzáadása előtt mért háttérzajt ebből az összegből kivontuk, és az aktivitást (750 ml lízispufferre visszaszámolva) össz-RLU-ban (Relatíve Lights Units) adtuk meg. Ennek megvalósításához 40 μΐ-t (20 pg DNS) injektáltunk 7,4 pH-jú 5 mM végkoncentrációjú HEPES-oldatba, ezután 20 perccel a beinjekciózás előtt lipopoliamint C-t (RPR 120 535) ad60 tünk hozzá 0,01 nmol/μΐ DNS arányban.
HU 223 263 Bl
8. táblázat
1 Peptid, peptid/DNS arány tömeg/tömeg RLU-átlag RLU-szórás Állatok száma
Peptid nélkül 15 228 125 14 618 681 6
nls-H, 0,025 tömeg/tömeg+lipopoliamin C 42 722 500 66 485 348 6
Ezek az eredmények megerősítik, hogy a DNS izomba történő in vivő transzfekciója során a lipopo- 10 liamin és a találmány szerinti tömörítő hatóanyag együttes használata előnyös hatású.
6. példa
Találmány szerinti kompozíciók in vivő transzferé tumorsejtekbe
Az erre vonatkozó kísérleteket C57/BL felnőtt (>8 hét) 3LL (Lewis Lung carcinoma) típusú, állatból állatba történő, a horpasz magasságában a bőr alá bejuttatott tumorfragmentum által előidézett tumort hordozó nőstény egereken végeztük.
A beinjektált oldatokat az itt következők alapján állítottuk elő.
Az itt következő DNS-t először a pufferben feloldottuk, ezután hozzáadtuk a peptidet, majd 20 perc után egy nagy koncentrációjú (20 vagy 40 mM) kationos lipidoldatot adtunk a keverékhez. Miután az összes anyagot hozzáadtuk, a keverék DNS-t, a peptidet és kationos lipidet, 150 mM NaCl-ot, 5% D-glükózt és 6,2 pH-jú 5 mM MES-t tartalmazott. A lipopo- 30 liamin C-t (RPR 120 535) tartalmazó két utolsó sorozat esetében az injekciós hordozóközeg megfelelően mM és 150 mM NaCl-ot és 5% D-glükózt tartalmazó oldat.
20-30 perccel az oldat elkészítése után injekcióztuk be az oldatot.
Minden transzfekciós keveréket (specifikus hatásukat lásd a 9. és 10. táblázatban) 7 nappal a beültetés 15 után injekcióztuk a tumorba, az egeret Ketamin (130 mg/kg)+Xilazin (4 mg/mg) keverékkel altattuk el.
nappal a beinjekciózás után kinyertük a tumorszövetet, amelyet lemértünk, majd feldaraboltunk, és 500 μΐ lízispufferben (Promega Cell Lysis Buffer 20 El53 A) daráltuk. Centrifugálás után (20 000 g-vel 10 percig) 10 μΐ mintát veszünk, amely 50 μΐ reagens (Promega Luciferase Assay Substrate) hozzáadása után egy Lumat LB 9501 (Berthold) típusú luminométerrel az eredményeket 10 másodpercenként összegezve, a lucife25 rázaktivitás teljes fényintenzitásának mérésére szolgál.
A kapott eredményeket RLU-ban (Relatíve Lights Units) a teljes tumorlízis felülúszóra vonatkoztatva vagy RLU-ban pg beinjektált DNS-re vonatkoztatva adtuk meg.
A 9. táblázat a különböző A, B, C, vagy D lipopoliaminok jelenlétében, illetve a 10. táblázat PEI jelenlétében kapott eredményeket mutatja be.
9. táblázat
Plazmid Peptid Kationos lipid Eredmény, RLU/tumor Kezelt állatok száma
pg/tumor (DNS) Mg/μΐ referencia pept/DNS w/w referencia DNS nmol/pg átlag szórás
I 20 2 0 0 5
| 20 2 A 1,8 142 300 121418 5
20 2 H 1 1,8 301 730 243 166 5
30 2 A 3 99 775 128 726 6
30 2 H 1 3 1 340 1 771 5
460 624
7,5 0,5 3 5
7,5 0,5 H 1 3 88 712 49 314 6
7,5 0,5 H 1,5 3 383 313 234 713 6
15 1 H 1 3 618 025 530 774 5
1017 966 141
10 0,5 H 1,5 C 3 372 9
10 0,5 H 1,5 D 3 414 286 10
679 258 219 333
18,75 0,25 C 2 395 433 6
HU 223 263 Bl
9. táblázat (folytatás)
Plazmid Pepiid Kationos lipid Eredmény, RLU/tumor Kezelt állatok száma
pg/tumor (DNS) μ&'μΐ referencia pept/DNS w/w referencia DNS nmol/pg átlag szórás
18,75 0,25 Pr2 0,5 2 126 036 6
222 700 612 401
20 0,5 C 4 1046 6
20 0,5 H 1 c 4 050 887 206 6
1674
806 467 106
1 348
233
10. táblázat
I Plazmid Peptid Polietilénimin Eredmény, RLU/tumor Kezelt állatok száma
beinjektált mennyiség (DNS) pg/pi referencia peptid/DNS w/w méret Ekvivalens (Eq) átlag szórás
20 2 0 0 5
20 2 800 K 9 54 350 52 989 5
I 50 2 800 K 9 7 783 16 803 6
1 50 2 Η 1 1 800 K 9 62 230 71462 5
50 2 800 K 12 6 733 16 493 6
50 2 Hl 1 800 K 12 72 700 150 300 5
40 2 800 K 18 470 1 051 5
I 40 2 Hl 1 800 K 18 82 608 104 443 6
| 40 2 800 K 24 1630 3 645 5
40 2 Hl 1 800 K 24 45 750 63 942 5 6
1 7 * * 10 11 0,5 Hl 1,5 50 K laktóz 12 14152 16 946 11
1 ιθ 0,5 Η 1 1,5 50 K laktóz 12 12 942 22 853 11
7. példa
In vitro nukleinsavtranszfer 3LL sejtekbe
Ez a példa az in vitro (sejtkultúrákban) nukleinsavtranszfert írja le a találmány szerinti nukleinsavat, a találmány szerinti protaminok származékait és egy lipopoliaminok közül kiválasztott vegyületet 75 mM végkoncentrációjú NaCl-oldatban tartalmazó kompozícióban.
Egy 10 pl mennyiségű, az említett vegyületet tartalmazó keveréket állítunk elő az itt következőkből:
- 0,5 pg pCMV-luc plazmid-DNS, 0,5 pg találmány szerinti PR1 vagy PR2 vegyület 0,75 mM végkoncentrációjú NaCl-oldatban,
- Lipopoliamin C (RPR 120 535) a továbbiakban a
11. táblázatban bemutatott különböző kísérletek szerint változó töltésarányoknak megfelelően.
χ 105 3LL sejtet (250 pl, 10% magzati boíjúszérumot tartalmazó DMEM táptalajban) 37 °C-on az előzőekben meghatározott keverékkel 4 órán keresztül inkubáltunk 5%-os CO2-atmoszférában. 500 pl táptalaj hozzáadása után a sejteket visszaoltottuk a kultúrába. Másnap a sejteket mostuk, és 24 órára visszaoltottuk ugyanazon, 10% magzati boíjúszérumot tartalmazó kultúrába.
A sejttakarót ezután 100 pl lízispufferben (Promega) lízisnek vetettük alá. A luciferázaktivitást 50 pl szubsztrát (Promega) hozzáadásával mértük. A leolvasást LB luminométeren végeztük, az RLU-kat (Relatíve Lights Units) 10 másodpercenként összegeztük.
A 11. és 12. táblázat a PRl-gyel és a PR2-vel végzett vizsgálatokat mutatja be.
HU 223 263 ΒΙ
11. táblázat
Töltésarany Lipopoliamin C/ DNS Vegyület nélkül (RLU) PR2-vel (RLU)
1 4X 107 289 447 214
I 6X 77 396 1 182 641
1 8X 14 512 729 285
12. táblázat
1 Töltésarány 1 Lipopoliamin C/ DNS Vegyület nélkül (RLU) PR2-vel (RLU)
1 4X 12 037 6 304
I 6X 901 113 113
1 sx 328 294 743
8. példa (összehasonlító példa)
A találmány szerinti tömöritőpeptidek lipofektáns nélkül in vivő tumorba történő injektálása Modell:
- Swiss típusú, felnőtt nőstény csupasz egér,
- ΙΟ7 3T3 HER2 sejt révén, a horpasz magasságában a bőr alá injektálva kísérletileg előidézett tumor,
- a transzfekciós keverék beinjekciózása 7-12 nappal a sejtek beinjekciózása után történik. A tömörített vagy nem tömörített peptid-DNS-t tartalmazó oldatot közvetlenül a tumorba injektáltuk egy Hamilton fecs5 kendővel,
- 2 nappal az injekciózás után tumorszövetmintát vettünk, melyet lemértünk, majd felaprítottunk, és 750 pl lízispufferben (Promega Cell Lysis Buffer El53 A) homogenizáltunk. Centrifugálás után (20 000 g-vel 10 percig) 10 μΐ mintát vettünk, amely az 50 μΐ reagens (Promega Luciferase Assay Substrate) hozzákeverése után Lumat LB 9501 (Berthold) típusú luminométerrel a fényintenzitást 10 másodpercenként összegezve, teljes fényintenzitás alapján történő lucife15 rázaktivitás méréséhez szükséges.
Az eredményként kapott aktivitásokat RLU-ban (Relatíve Lights Units) a tumorlízis során kapott felülúszó teljes mennyiségre vonatkoztatva határoztuk meg.
Előirat: 0,5 mg/ml koncentrációban oldottuk a
DNS-t egy olyan oldatban, amely az eredménytáblázatban feltüntetett végső koncentrációban tartalmazza a sókat, a puffért és a glükózt. Bizonyos csoportokban a beinjekciózás előtt 1 pg/μΙ peptid vizes oldatát adtuk a DNS-hez, hogy megfelelő mennyiségű és meghatáro25 zott tömeg/tömeg arányú oldathoz jussunk. Az oldatot 20 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az egerekbe összességében 10 pg, tumoregységre kiszámított mennyiségű, DNS-t tartalmazó 20 pl összmennyiségű oldatot injekcióztunk.
13. táblázat
Puffer Peptid Eredmény, RLU/tumor Kezelt állatok száma
NaCl/glükóz/5mM MES vagy HEPES referencia peptid/DNS w/w átlag szórás
I 150/HEPES 1 689 938 1 388 072 6
bls-H 0,02 6 819100 5 860 709 6
150/5/HEPES 369 563 577 901 6*
nls-Hl 0,1 1 654 313 2 145 147 6*
nls-Hl 0,02 4 031 000 1 007 896 6*
931 275 214 229 4
H 0,1 3 420 432 1 285 704 6
*: az injekciózás alatt idegrendszerre ható Imaigen+Rompun (Ketamin 130 mg/kg, Xilazin 4 mg/kg, hashártyán át beadva) neuroleptikus analgetikummal elaltatott egerek.
Ezek az eredmények az mutatják, hogy azok a tumorok, amelyek esetében a csupasz DNS által történő transzfekció lehetséges, ha a csupasz DNS-hez peptidet adunk alacsony peptid/DNS arányban, kationos lipid
SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZ: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav hozzáadása nélkül, ez a kizárólagosan csak csupasz DNS használatához viszonyítva az exogén gén kifejeződésének növekedését teszi lehetővé.
HU 223 263 Bl (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
Lys Thr Pro Lys Lys Alá Lys Lys Pro 5 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZ: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA Alá Thr Pro Alá Lys Lys Alá Alá (3) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZ: 16 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA Alá Thr Pro Alá Lys Lys Alá Alá Alá
Thr
Pro Alá Lys
Lys Alá Alá 15 (4) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZ: 18 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA Lys Thr Pro Lys Lys Alá Lys Lys
Pro Lys Thr 10
Pro Lys
Lys Alá 15
Ly s
Lys Pro (5) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZ: 17 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) Az 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA Alá Thr Pro Lys Lys Ser Alá Lys Lys Thr
10
Pro Lys
Lys Alá Lys Lys 15
Pro (6) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZ: 26 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
Lys Ly s Al a Ly s Ser 5 Pro Ly s Ly s Al a Lys Alá Alá Lys 10 Pro Lys Lys Alá 15
Pro Ly s Ser Pro Al a Ly s Alá Lys Al a
20 25
HU 223 263 Bl (7) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZ: 18 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
Ser Arg Ser Arg Tyr Tyr Arg Gin Arg Gin Arg Ser Arg Arg Arg Arg Arg 5 10 15 (8) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZ: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
Arg Arg Arg Leu His Arg Ile His Arg Arg Gin His Arg Ser Cys Arg Arg 5 10 15
Arg Lys Arg Arg 20 (9) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZ: 26 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Alá Lys Thr Pro Lys Lys Alá Lys Lys Pro 5 10 15
Lys Thr Pro Lys Lys Alá Lys Lys Pro

Claims (35)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Nukleinsavak transzfekciójára alkalmas gyógyászati kompozíció, amely a transzfektálandó nukleinsavon kívül egy transzfekciós hatóanyagot és legalább egy, a nukleinsav kondenzációjában részt vevő vegyületet tartalmaz, azzal jellemezve, hogy az említett vegyület részben vagy egészben, folytonosan vagy nem folytonosan ismétlődő (KTPKKAKKP) és/vagy (ATPAKKAA) peptidegységekből áll, ahol az egységek száma 2-10, vagy az alábbi oligopeptidek egyikét tartalmazza: SRSRYYRQRQRSRRRRRR(COOH) vagy RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH).
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a peptidegységek egymástól aminosav típusú biokémiai és/vagy kémiai jellegű linkerekkel vannak elválasztva.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a linker egy vagy több aminosavat tartalmaz.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a vegyület Hl hiszton származéka.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a vegyület a Hl hiszton C-terminális doménjének származéka.
  6. 6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a következő oligopeptidek valamelyikét tartalmazza:
    (KTPKKAKKP)2(COOH),
    ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH),
    KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH).
    HU 223 263 Bl
  7. 7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a vegyület a nukleolin N-terminális doménjének származéka.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy az (ATPAKKAA)2(COOH) peptidet tartalmazza.
  9. 9. Az 1 -8. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy az említett vegyület β-lemezszerkezetű.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy az említett vegyület egy sejtreceptor-ligandumot is tartalmaz.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a Hl hiszton egy részét vagy egészét és egy maglokalizációs szignálszekvenciát is tartalmaz.
  12. 12. All. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a PKKKRKV-bAla-(KTPKKAKKP)2(COOH) peptidet tartalmazza.
  13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy az említett vegyületet egy füzogén típusú peptiddel együtt alkalmazzuk, mely elősegíti az említett keverék sejtbe történő transzfekcióját.
  14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy poliglikozilezett, szulfonált, foszforilált és/vagy komplex cukrokba vagy egy lipofil hatóanyagba van beillesztve.
  15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a transzfekciós hatóanyag egy kationos polimer vagy egy lipofektáns.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a lipofektáns liposzómák, immunoliposzómák vagy célliposzómák kialakítására hajlamos lipid.
  17. 17. A 15. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a kationos polimer előnyösen egy (I) általános képletű vegyület, mely képletben R jelentése hidrogénatom vagy (a) általános képletű csoport, ahol n értéke 2 és 10 közötti egész szám, p és q egész szám és p+q összeggel egyezően a polimer átlagos molekulatömege ΙΟ2—107 dalton.
  18. 18. A 15. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a kationos polimert a polietiléniminek (PEI) vagy a polipropiléniminek (PPI) közül választjuk ki.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a polimert az 50 000 átlagos molekulatömegű polietiléniminek (PEI50K) és a 800 000 átlagos molekulatömegű polietiléniminek (PEI800K) közül választjuk ki.
  20. 20. A 15. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a lipofektáns legalább egy (II) általános képletű poliaminrégiót tartalmaz, ahol m értéke 2 vagy annál nagyobb egész szám és n értéke 1 vagy annál nagyobb egész szám.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a poliaminrégiót spermin, termin vagy ezek olyan analógja alkotja, amely megőrizte a nukleinsavhoz való kötődés képességét.
  22. 22. A 20. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a lipofektáns legalább egy (IV) általános képletű lipofil régiót tartalmaz, ahol
    X és X’jelentése egymástól függetlenül oxigénatom vagy egy -(CH2)q- általános képletű polimetiléncsoport, ahol q értéke 0, 1, 2 vagy 3; vagy -NH- vagy -NR’képletű csoport, ahol
    R’ jelentése 1 -4 szénatomos alkilcsoport;
    Y és Y’ jelentése egymástól függetlenül metilén-, karbonil- vagy tiokarbonilcsoport;
    Rj, R4 és R5 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkilcsoport;
    p értéke 0-5 közötti egész szám,
    R$ jelentése egy koleszterinszármazék vagy egy -NR,R2 általános képletű alkil-amino-csoport, ahol R, és R2 jelentése egymástól függetlenül telített vagy telítetlen, lineáris vagy elágazó láncú
    12-22 szénatomos alifás csoport.
  23. 23. A 20. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a következő lipopoliaminok egyikét tartalmazza: dioktadecil-amido-glicil-spermin (DOGS), palmitoil-foszfatidil-etanol-amin 5-karboxispermil-amidja (DPPES), {2,5-bisz[(3-amino-propil)amino]-pentil}-(dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát, {l,3-bisz[(3-amino-propil)-amino]-2-propil}-2(dioktadecil-karbamoil-metoxi)-acetát, {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2, H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)18]2 vagy H2N(CH2)3NH(CH^NHÍCH^NHCH^OArgNKCH^jg],
  24. 24. Az 1-15. vagy 20-23. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a transzfekciós hatóanyag dioktadecil-amido-glicil-spermin (DOGS).
  25. 25. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy dezoxiribonukleinsav.
  26. 26. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav ribonukleinsav.
  27. 27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav kémiailag módosított.
  28. 28. A 25-27. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav antiszensz.
  29. 29. A 25-27. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy terápiás gént tartalmaz.
  30. 30. Az 1-29. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy egy vagy több neutrális lipidet tartalmaz.
  31. 31. A 30. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a neutrális lipid egy szintetikus vagy természetes, zwitterionos vagy fiziológiás körülmények között ionos töltéstől mentes lipid.
    HU 223 263 Bl
  32. 32. A 30. vagy 31. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, azzal jellemezve, hogy a neutrális lipid az alábbiak egyike: dioleoil-foszfatidil-etanol-amin (DOPE), oleoil-palmitoil-foszfatidil-etanol-amin (POPÉ), disztearoil-, -palmitoil-, -mirisztoil-foszfatidil-etanol- 5 aminok vagy ezek 1,3-N-metil-származékai, foszfatidilglicerinek, diacil-glicerinek, glikozil-diacil-glicerinek, cerebrozidok, úgymint galaktocerebrozidok, szfingolipidek, úgymint szfingomielinek vagy aszialo-gangliozidok, úgymint aszialoGMl vagy aszialoGM2.
  33. 33. Az 1 -32. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció alkalmazása in vitro és/vagy ex vivő nukleinsavtranszferre.
  34. 34. Egy (KTPKAKKP) és/vagy (ATPAKKAA) peptidegységeket tartalmazó vegyület, melyben a peptid- 15 egységek száma 2-10, alkalmazása nukleinsav transzferére alkalmas 1. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció előállítására.
  35. 35. Egy alábbi oligopeptid (ATPAKKAA)2(COOH), (KTPKKAKKP)2(COOH), ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH), KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH), SRSRYYRQRQRSRRRRRR(COOH) vagy 10 RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH) alkalmazása egy célelemhez kapcsolódó vagy nem kapcsolódó, legalább egy nukleinsav in vitro, ex vivő és/vagy in vivő transzferére szolgáló 1. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció előállítására.
HU9801207A 1995-02-17 1996-02-15 Nukleinsavak transzfekciójára alkalmas gyógyászati kompozíciók és alkalmazásuk HU223263B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9501865A FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1995-02-17 Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
PCT/FR1996/000248 WO1996025508A1 (fr) 1995-02-17 1996-02-15 Compositions contenant des acides nucleiques, preparation et utilisation

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9801207A2 HUP9801207A2 (hu) 1998-08-28
HUP9801207A3 HUP9801207A3 (en) 2000-12-28
HU223263B1 true HU223263B1 (hu) 2004-04-28

Family

ID=9476267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9801207A HU223263B1 (hu) 1995-02-17 1996-02-15 Nukleinsavak transzfekciójára alkalmas gyógyászati kompozíciók és alkalmazásuk

Country Status (18)

Country Link
US (2) US5945400A (hu)
EP (1) EP0809705B1 (hu)
JP (1) JPH11500431A (hu)
KR (1) KR19980702200A (hu)
AT (1) ATE313642T1 (hu)
AU (1) AU706643B2 (hu)
BR (1) BR9607383A (hu)
CA (1) CA2211162A1 (hu)
CZ (1) CZ293269B6 (hu)
DE (1) DE69635609T2 (hu)
FI (1) FI973363A (hu)
FR (1) FR2730637B1 (hu)
HU (1) HU223263B1 (hu)
IL (1) IL117144A0 (hu)
NO (1) NO973745L (hu)
SK (1) SK281543B6 (hu)
WO (1) WO1996025508A1 (hu)
ZA (1) ZA961255B (hu)

Families Citing this family (162)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6383814B1 (en) 1994-12-09 2002-05-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5948767A (en) * 1994-12-09 1999-09-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphile/DNA complexes
US6331524B1 (en) 1994-12-09 2001-12-18 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile / DNA complexes for gene therapy
US5939401A (en) * 1994-12-09 1999-08-17 Genzyme Corporation Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
JP2002514892A (ja) * 1995-06-08 2002-05-21 コブラ セラピューティクス リミテッド 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
FR2741066B1 (fr) * 1995-11-14 1997-12-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
FR2756491B1 (fr) * 1996-11-29 1999-01-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition transfectante utile en therapie genique associan t a un virus recombinant incorporant un acide nucleique exog ene, un agent de transfection non viral et non plasmidique
FR2750704B1 (fr) 1996-07-04 1998-09-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de production d'adn therapeutique
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
IL129986A0 (en) 1996-12-06 2000-02-29 Rhone Poulenc Rorer Pharma Polypeptides encoded by a human lipase-like gene compositions and methods
US6884430B1 (en) 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
WO1998049321A2 (en) 1997-04-28 1998-11-05 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors
FR2763943B1 (fr) * 1997-05-28 1999-07-09 Rhone Poulenc Rorer Sa Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules
US6875606B1 (en) 1997-10-23 2005-04-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Human α-7 nicotinic receptor promoter
HUP0101393A3 (en) 1998-01-30 2004-10-28 Aventis Pharma Sa Transfecting compositions sensitive to reducing conditions, pharmaceutical compositions containing them, and their applications
FR2774394B1 (fr) * 1998-01-30 2002-04-26 Rhone Poulenc Rorer Sa Composes transfectants sensibles aux conditions reductrices, compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs applications
US6225456B1 (en) 1998-05-07 2001-05-01 University Technololy Corporation Ras suppressor SUR-5
US6506889B1 (en) 1998-05-19 2003-01-14 University Technology Corporation Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods
FR2786700B1 (fr) * 1998-12-03 2002-12-06 Aventis Pharma Sa Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs utilisations
HUP0200345A3 (en) * 1998-12-03 2003-12-29 Aventis Pharma Sa Novel nucleic acid transferring agents, compositions containing them and uses
US6441156B1 (en) * 1998-12-30 2002-08-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Calcium channel compositions and methods of use thereof
US9034329B2 (en) * 1999-02-22 2015-05-19 Georgetown University Preparation of antibody or an antibody fragment-targeted immunoliposomes for systemic administration of therapeutic or diagnostic agents and uses thereof
US7780882B2 (en) * 1999-02-22 2010-08-24 Georgetown University Simplified and improved method for preparing an antibody or an antibody fragment targeted immunoliposome for systemic administration of a therapeutic or diagnostic agent
PT1811036E (pt) * 1999-02-22 2011-07-11 Univ Georgetown Imunolipossomas dirigidos por fragmento de anticorpo para distribuição sistémica de genes
GB9918670D0 (en) 1999-08-06 1999-10-13 Celltech Therapeutics Ltd Biological product
EP1541690A3 (en) * 1999-09-09 2005-07-27 CureVac GmbH Transfer of mRNA using polycationic compounds
WO2001023537A1 (en) * 1999-09-24 2001-04-05 Cyto Pulse Sciences, Inc. Process for enhancing electric field-mediated delivery of biological materials into cells
EP1276500B1 (en) 2000-03-13 2011-06-08 Cornell Research Foundation, Inc. Blocking leukocyte emigration and inflammation by interfering with cd99/hec2
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
US20030212022A1 (en) * 2001-03-23 2003-11-13 Jean-Marie Vogel Compositions and methods for gene therapy
GB0018307D0 (en) 2000-07-26 2000-09-13 Aventis Pharm Prod Inc Polypeptides
NZ521563A (en) * 2000-04-12 2004-05-28 Implyx Ltd Peptide conjugates for drug delivery
IL151348A0 (en) 2000-04-13 2003-04-10 Univ Rockefeller Enhancement of antibody-mediated immune responses
US20040142474A1 (en) * 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
US6696038B1 (en) * 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
FR2814370B1 (fr) * 2000-09-22 2004-08-20 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'un complexe acide nucleique/pei pour le ciblage de cellules souches du cerveau
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
US7060442B2 (en) 2000-10-30 2006-06-13 Regents Of The University Of Michigan Modulators on Nod2 signaling
BR0116756A (pt) 2000-12-28 2005-01-04 Wyeth Corp Proteìna protetora recombinante de streptococcus pneumoniae e uso da mesma
US20030125239A1 (en) * 2001-02-02 2003-07-03 Andrea Crisanti Compositions for drug delivery
WO2002063026A1 (en) * 2001-02-08 2002-08-15 Geneporter, Inc. Complexes and components thereof for introducing polynucleotides into eukaryotic cells
US9249207B2 (en) 2001-02-20 2016-02-02 Intrexon Corporation Substitution mutant receptors and their use in an ecdysone receptor-based inducible gene expression system
DK1373470T3 (da) 2001-02-20 2013-07-29 Intrexon Corp Hidtil ukendte substitutionsmutantreceptorer og deres anvendelse i et cellekernereceptorbaseret inducerbart genekspressionssystem
ATE545705T1 (de) 2001-02-20 2012-03-15 Intrexon Corp Neues induzierbares genexpressionssystem auf ecdysonrezeptor/invertebraten-retinoid-x-rezept r-basis
MXPA03007492A (es) 2001-02-20 2004-10-15 Rheogene Holdings Inc Receptores de retinoide x quimerico y su uso en un sistema de expresion de gen inducible basado en receptor de ecdisona novedoso.
EP1499349B1 (en) 2001-03-02 2009-11-18 The Rockefeller University Recombinant hybrid allergen constructs with reduced allergenicity that retain immunogenicity of the natural allergen
US8216585B2 (en) * 2001-05-25 2012-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeted particles and methods of using the same
EP1399189A1 (en) * 2001-06-11 2004-03-24 Universite De Montreal Compositions and methods for enhancing nucleic acid transfer into cells
FR2829136B1 (fr) 2001-08-29 2006-11-17 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques d'aminoglycosides
JP2005507247A (ja) 2001-09-26 2005-03-17 レオジーン・ホールディングス，インコーポレーテッド コナジラミエクジソン受容体核酸、ポリペプチド、およびそれらの使用
MXPA04002810A (es) 2001-09-26 2005-06-06 Rheogene Holdings Inc Acidos nucleicos receptores de ecdisona de saltarilla, polipeptidos, y sus usos.
US20040023910A1 (en) * 2001-09-28 2004-02-05 Zhiming Zhang Use of cyr61 in the treatment and diagnosis of human uterine leiomyomas
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
CN1308643C (zh) 2002-01-17 2007-04-04 阿尔法·拉瓦尔股份公司 包括沉入式蒸发器的壳体
US7037520B2 (en) * 2002-03-22 2006-05-02 Baylor College Of Medicine Reversible masking of liposomal complexes for targeted delivery
US7375093B2 (en) 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
WO2004028560A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-08 Powderject Research Limited Nucleic acid coated particles
AU2004204456A1 (en) * 2003-01-09 2004-07-29 Invitrogen Corporation Cellular delivery and activation polypeptide-nucleic acid complexes
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
JP2007531498A (ja) * 2003-07-15 2007-11-08 セダーズ−シナイ メディカル センター 疾患の診断、処置および予防におけるプレイオトロフィンの使用
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
CA2543257C (en) 2003-10-24 2013-12-31 Gencia Corporation Methods and compositions for delivering polynucleotides
US20090208478A1 (en) * 2003-10-24 2009-08-20 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US7432057B2 (en) 2004-01-30 2008-10-07 Michigan State University Genetic test for PSE-susceptible turkeys
ES2353604T3 (es) 2004-04-20 2011-03-03 Galapagos N.V. Métodos, composiciones y ensayos de compuestos para inhibir la producción de proteína beta-amiloide.
EP1747462A2 (en) 2004-04-27 2007-01-31 Galapagos N.V. Methods, agents, and compound screening assays for inducing differentiation of undifferentiated mammalian cells into osteoblasts
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
EP2256198A1 (en) 2004-06-14 2010-12-01 Galapagos N.V. Methods for identification, and compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
CN101087879B (zh) 2004-06-18 2013-08-14 杜克大学 气味受体的调控剂
JP2008503712A (ja) 2004-06-21 2008-02-07 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 骨関節炎治療の方法及び手段
US7604798B2 (en) 2004-07-15 2009-10-20 Northwestern University Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei
US20090214588A1 (en) 2004-07-16 2009-08-27 Nabel Gary J Vaccines against aids comprising cmv/r-nucleic acid constructs
US7485468B2 (en) 2004-10-15 2009-02-03 Galapagos Bv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
US7964571B2 (en) 2004-12-09 2011-06-21 Egen, Inc. Combination of immuno gene therapy and chemotherapy for treatment of cancer and hyperproliferative diseases
US9034650B2 (en) 2005-02-02 2015-05-19 Intrexon Corporation Site-specific serine recombinases and methods of their use
AU2006259415B2 (en) * 2005-06-15 2012-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
CN101437539B (zh) 2005-07-05 2013-10-02 康奈尔研究基金会（有限公司） 通过干扰cd99l2阻断白细胞迁出和炎症
US7666584B2 (en) 2005-09-01 2010-02-23 Philadelphia Health & Education Coporation Identification of a pin specific gene and protein (PIN-1) useful as a diagnostic treatment for prostate cancer
JP2009537526A (ja) * 2006-05-15 2009-10-29 ジョージタウン・ユニバーシティ 治療もしくは診断剤の全身投与のための抗体もしくは抗体断片標的化免疫リポソームの製造およびその使用
KR100857389B1 (ko) 2006-06-30 2008-09-11 (주)아모레퍼시픽 Ａｐ-ｇｒｒ 펩티드 또는 ａｐ-ｇｒｒ 펩티드를 포함하는펩티드사슬 및 이를 포함하는 약물전달담체
BRPI0714981A2 (pt) 2006-07-28 2013-08-13 Sanofi Aventis composiÇço, mÉtodo para fazer a mesma a qual compreende um inibidor que inibe a atividade de uma proteÍna do complexo iii, um veÍculo e um membro da superfamÍlia da fator de necrose de tumor, mÉtodo para conduzir um ensaio para determinar se um composto É um inibidor de atividade de supressço de tnf de uma proteÍna do complexo iii e uso de um composto
EP2069500B1 (en) 2006-10-04 2014-09-24 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Compositions comprising a sirna and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivatives and uses thereof
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
EP2155910A4 (en) 2007-05-08 2010-06-02 Univ Duke COMPOSITIONS AND METHODS FOR CHARACTERIZING AND REGULATING AN OLFACTORY SENSATION
EP3357904B1 (en) 2007-05-29 2022-07-06 Precigen, Inc. Chiral diachylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
WO2008155397A2 (en) 2007-06-20 2008-12-24 Galapagos N.V. Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of bone and joint degenerative diseases
US20090069266A1 (en) 2007-06-27 2009-03-12 Northwestern University Methods and compositions for nucleic acid transfer into cells
KR101570886B1 (ko) * 2007-07-09 2015-11-23 조지타운 유니버시티 양이온성-리포솜 매개된 핵산 전달을 이용하여 면역 반응을 생성시키는 방법
US9144546B2 (en) 2007-08-06 2015-09-29 Clsn Laboratories, Inc. Nucleic acid-lipopolymer compositions
US20090098055A1 (en) 2007-08-23 2009-04-16 Intrexon Corporation Methods and Compositions for Diagnosing Disease
JP2010539245A (ja) * 2007-09-14 2010-12-16 日東電工株式会社 薬物担体
MX2010002777A (es) * 2007-09-17 2010-05-21 Rohm & Haas Composiciones y metodos para modificacion de respuestas fisiologicas en plantas.
EP2042193A1 (en) 2007-09-28 2009-04-01 Biomay AG RNA Vaccines
EP2205249B1 (en) 2007-09-28 2018-11-07 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
AU2008311292B9 (en) 2007-10-08 2014-10-09 Intrexon Corporation Engineered dendritic cells and uses for the treatment of cancer
FR2928373B1 (fr) 2008-03-05 2010-12-31 Centre Nat Rech Scient Polymere derive de la polyethylenimine lineaire pour le transfert de gene.
AU2009290848A1 (en) 2008-09-11 2010-03-18 Galapagos Nv Method for identifying compounds useful for increasing the functional activity and cell surface expression of CF-associated mutant Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator
NZ592368A (en) 2008-11-05 2013-11-29 Wyeth Llc Multicomponent immunogenic composition for the prevention of beta-hemolytic streptococcal (bhs) disease
WO2010053572A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
WO2010096561A1 (en) 2009-02-18 2010-08-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof
WO2010094732A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Biofocus Dpi B.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
EP2398479A2 (en) 2009-02-19 2011-12-28 Galapagos N.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
JP2012517821A (ja) 2009-02-19 2012-08-09 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 炎症を包含する疾患の診断及び治療に有用な同定方法及び化合物
WO2010115825A2 (en) 2009-03-31 2010-10-14 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
WO2010112569A1 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
US8663930B2 (en) 2009-04-01 2014-03-04 Galapagos Nv Methods and means for treatment of osteoarthritis
CN102724993B (zh) 2009-04-17 2016-04-27 纽约大学 靶向tnf家族受体并拮抗tnf作用的肽、组合物、方法及其用途
WO2011015573A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2011015572A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
CA2793521A1 (en) 2010-03-19 2011-09-22 University Of South Alabama Use of antisense gli1 for reducing the dosage of a therapeutic compound to treat needed to treat a cancer
KR20180108886A (ko) 2010-03-23 2018-10-04 인트렉손 코포레이션 치료적 단백질을 조건부로 발현하는 벡터，상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 이의 용도
PL2608805T3 (pl) 2010-08-23 2017-12-29 Wyeth Llc Trwałe preparaty antygenów rLP2086 Neisseria meningitidis
CN103096920B (zh) 2010-09-10 2016-03-23 惠氏有限责任公司 脑膜炎奈瑟球菌orf2086抗原的非脂质化变体
EP2649178B8 (en) 2010-12-09 2017-08-30 Institut Pasteur Mgmt-based method for obtaining high yield of recombinant protein expression
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display
JP6189754B2 (ja) 2011-03-04 2017-08-30 イントレキソン コーポレーション タンパク質を条件的に発現するベクター
CA2831392C (en) 2011-03-28 2020-04-28 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
US9458456B2 (en) 2011-04-01 2016-10-04 University Of South Alabama Methods and compositions for the diagnosis, classification, and treatment of cancer
EP2546358A1 (en) 2011-07-15 2013-01-16 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Methods and reagents for efficient control of HIV progression
WO2013043720A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Regulation of sodium channels by plunc proteins
WO2013053765A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. A non-human animal model of mucosa-associated lymphoid tissue (malt) lymphoma
CN107522664B (zh) 2011-10-27 2021-03-16 麻省理工学院 能够形成药物包封微球的在n末端上官能化的氨基酸衍生物
CN104114697A (zh) 2011-12-09 2014-10-22 巴斯德研究所 多重免疫筛选分析
WO2013103401A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 University Of South Alabama Methods and compositions for the treatment of cancer
MY198910A (en) 2012-03-09 2023-10-02 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
EP2698377A1 (en) 2012-08-17 2014-02-19 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
WO2014136064A2 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
WO2014139883A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrotic diseases
EP2972381A2 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Galapagos NV Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of diseases associated with epithelial mesenchymal transition
JP2016518812A (ja) 2013-03-14 2016-06-30 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップＧａｌａｐａｇｏｓ Ｎ．Ｖ． 線維症治療において有用な分子標的及び前記標的のインヒビター
KR20150129034A (ko) 2013-03-15 2015-11-18 인트렉손 코포레이션 붕소-함유 디아실하이드라진류
WO2014193800A2 (en) 2013-05-28 2014-12-04 The Johns Hopkins University Aptamers for the treatment of sickle cell disease
KR102199096B1 (ko) 2013-09-08 2021-01-06 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
WO2016004202A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Massachusetts Institute Of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
MX2017003403A (es) 2014-09-17 2017-06-19 Intrexon Corp Compuestos de diacilhidrazina que contienen boro.
AU2016215124B2 (en) 2015-02-06 2020-08-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Optimized human clotting Factor VIII gene expression cassettes and their use
EP3270959A1 (en) 2015-02-19 2018-01-24 Pfizer Inc Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
TW201710503A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院 新穎多核苷酸、載體、醫藥組成物以及其用途
PT3310764T (pt) 2015-06-19 2023-07-11 Massachusetts Inst Technology 2,5-piperazinadionas substituídas por alquenilo e o seu uso em composições para entregar um agente a um sujeito ou célula
KR20180063885A (ko) 2015-09-24 2018-06-12 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 전이 감소를 위한 방법 및 조성물
CA3001590A1 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Intrexon Corporation Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12
JP2019512216A (ja) 2016-02-22 2019-05-16 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル カルシウムチャネルのペプチド阻害剤
BR112019009446A2 (pt) 2016-11-09 2019-07-30 Intrexon Corp construtos de expressão da frataxina
JP6661797B2 (ja) 2016-11-22 2020-03-11 株式会社東芝 核酸凝縮ペプチド、核酸凝縮ペプチドセット、核酸送達キャリア、核酸送達方法、細胞作製方法、細胞検出方法及びキット
EP3577130A2 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Pfizer Inc Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US20200393446A1 (en) 2017-12-08 2020-12-17 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Bioluminescent screening test for detecting cell cytolysis
EP3539975A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Micropeptides and uses thereof
SG11202101169PA (en) 2018-08-10 2021-03-30 Eutilex Co Ltd Chimeric antigen receptor that binds hla-dr and car-t cell
MX2021010831A (es) 2019-03-08 2021-12-15 Obsidian Therapeutics Inc Composiciones de ligando del cumulo de diferenciación 40 (cd40l) y métodos para regulación ajustable.
US20210069242A1 (en) 2019-04-18 2021-03-11 Dmitry Dmitrievich Genkin Reprogramming of polymorphonuclear leukocytes
CN115210250A (zh) 2020-01-08 2022-10-18 黑曜石疗法公司 用于可调节性调控转录的组合物和方法
EP3885440A1 (en) 2020-03-26 2021-09-29 Splicebio, S.L. Split inteins and their uses
WO2023242436A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 Danmarks Tekniske Universitet Allergy vaccines based on consensus allergens

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3486479T2 (de) 1983-10-20 2001-09-20 Univ New York State Res Found Regulierung der Genexpression durch Translationshemmung unter Verwendung von mRNA hindernder Komplementär-RNA
FR2573436B1 (fr) 1984-11-20 1989-02-17 Pasteur Institut Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins
FR2602790B1 (fr) 1986-08-13 1990-06-01 Transgene Sa Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante
WO1989005852A1 (en) 1987-12-15 1989-06-29 Macphillamy Cummins & Gibson Ribozymes
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
JP3250802B2 (ja) 1989-03-21 2002-01-28 バイカル・インコーポレイテッド 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現
FR2646161B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5286634A (en) 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
JP3222461B2 (ja) * 1990-05-18 2001-10-29 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 新規タンパク質―ポリカチオン結合体
FR2681786A1 (fr) 1991-09-27 1993-04-02 Centre Nat Rech Scient Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires.
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
WO1993019768A1 (en) * 1992-04-03 1993-10-14 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5631237A (en) 1992-12-22 1997-05-20 Dzau; Victor J. Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes
FR2704234B1 (fr) 1993-04-22 1995-07-21 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique.
SG54115A1 (en) 1993-04-27 1998-11-16 Gerber Scient Products Inc Thermal printing apparatus with improved power supply
FR2704556B1 (fr) 1993-04-30 1995-07-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants et leur utilisation en thérapie génique.
FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1997-01-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations

Also Published As

Publication number Publication date
IL117144A0 (en) 1996-06-18
CZ259297A3 (en) 1997-11-12
ATE313642T1 (de) 2006-01-15
FI973363A0 (fi) 1997-08-15
US6200956B1 (en) 2001-03-13
FR2730637A1 (fr) 1996-08-23
WO1996025508A1 (fr) 1996-08-22
FI973363A (fi) 1997-08-15
MX9706016A (es) 1997-11-29
CZ293269B6 (cs) 2004-03-17
NO973745D0 (no) 1997-08-14
AU4835396A (en) 1996-09-04
HUP9801207A2 (hu) 1998-08-28
JPH11500431A (ja) 1999-01-12
FR2730637B1 (fr) 1997-03-28
AU706643B2 (en) 1999-06-17
ZA961255B (en) 1996-08-27
CA2211162A1 (fr) 1996-08-22
EP0809705B1 (fr) 2005-12-21
HUP9801207A3 (en) 2000-12-28
SK111897A3 (en) 1998-02-04
SK281543B6 (sk) 2001-04-09
US5945400A (en) 1999-08-31
KR19980702200A (ko) 1998-07-15
NO973745L (no) 1997-08-14
BR9607383A (pt) 1997-11-25
DE69635609D1 (de) 2006-01-26
EP0809705A1 (fr) 1997-12-03
DE69635609T2 (de) 2006-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU223263B1 (hu) Nukleinsavak transzfekciójára alkalmas gyógyászati kompozíciók és alkalmazásuk
US6172048B1 (en) Composition containing nucleic acids, preparation and uses
US8771728B2 (en) Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
AU722700B2 (en) Lipophilic peptides for macromolecule delivery
US5856435A (en) Nucleic acid-containing composition, its preparation and use
US7214384B2 (en) Lipid-conjugated polyamide compounds
US20030212031A1 (en) Stable lipid-comprising durg delivery complexesand methods for their production
JPH09500136A (ja) 樹枝状体ポリ陽イオンを含む自己集合性ポリヌクレオチド配送系
JPH10502918A (ja) 核酸を含有する組成物、その製造および使用
US6372720B1 (en) Liposome fusion and delivery vehicle
US7297759B2 (en) Peptides for increasing transfection efficiency
CA2406233A1 (en) Compositions for drug delivery
AU720697B2 (en) Pharmaceutical composition which is useful for the transfection of nucleic acids, and uses thereof
MXPA97006016A (en) Composition containing nucleic acids, preparation and use
AU737314B2 (en) Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same
MXPA98001920A (en) Pharmaceutical composition useful for the transfection of nucleic acids and its u

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20040227

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee