SK281543B6

SK281543B6 - Farmaceutická kompozícia na transfekciu nukleovej kyseliny

Info

Publication number: SK281543B6
Application number: SK1118-97A
Authority: SK
Inventors: G�Rardo Byk; Daniel Scherman; Bertrand Schwartz
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-15
Publication date: 2001-04-09
Also published as: HU223263B1; US6200956B1; DE69635609D1; EP0809705B1; JPH11500431A; HUP9801207A3; WO1996025508A1; FR2730637A1; CZ293269B6; ATE313642T1; AU706643B2; ZA961255B; FI973363A; DE69635609T2; NO973745D0; FI973363A0; CA2211162A1; NO973745L; FR2730637B1; EP0809705A1

Abstract

Je opísaná farmaceutická kompozícia vhodná na transfekciu nukleovej kyseliny, ktorej podstata spočíva v tom, že okrem uvedenej nukleovej kyseliny obsahuje aspoň jedno transfekčné činidlo a zlúčeninu pôsobiacu na úrovni kondenzácie uvedenej nukleovej kyseliny, pričom táto zlúčenina je celkom alebo čiastočne odvodená od histónu, nukleolínu, protamínu a/alebo niektorého z ich derivátov.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka oblasti génovej terapie a zaoberá sa predovšetkým prenosom in vitro, ex vivo a/alebo in vivo genetického materiálu. Vynález poskytuje novú farmaceutickú kompozíciu vhodnú na účinnú transfekciu buniek.

Doterajší stav techniky

Chromozomálne nedostatočnosti alebo anomálie (mutácia, aberantná expresia a podobne) predstavujú pôvod početných chorôb dedičného alebo nededičného charakteru. V tomto ohľade bolo konvenčné lekárstvo dlho bezmocné. V súčasnej dobe, keď dochádza k rozvoju génovej terapie, je nádej, že v budúcnosti bude možné korigovať uvedený typ chromozomálnej aberácie alebo mu dokonca predchádzať. Táto nová medikácia spočíva v zavedení genetickej informácie do zasiahnutej bunky alebo do zasiahnutého orgánu s cieľom korigovať uvedenú nedostatočnosť alebo anomáliu, alebo tu exprimovať proteín zainteresovaného génu.

Hlavnou prekážkou pri prenikaní nukleovej kyseliny do cieľovej bunky alebo do cieľového orgánu je veľkosť a polyaniónový charakter tejto nukleovej kyseliny, ktoré sú na závadu uspokojivého priechodu nukleovej kyseliny cez bunkové membrány.

Na odstránenie týchto prekážok boli v súčasnom období navrhnuté rôzne techniky, z ktorých možno uviesť predovšetkým transfekciu holej DNA cez plazmatickú membránu in vivo (WO 90/11092) a transfekciu DNA pomocou transfekčného vektora.

Pokiaľ ide o transfekciu holej DNA, je účinnosť takejto transfekcie stále ešte nízka. Holé nukleové kyseliny majú krátky čas životnosti vzhľadom na ich degradácii enzýmami a ich vylučovaniu močovými cestami.

Z toho dôvodu technika navrhuje dve principiálne rozdielne stratégie:

Prvá používa prírodné vektory transfekcie, ktorými sú vírusy. Navrhuje sa tiež používanie adenovírusov, oparových vírusov, retrovírusov a združených adenovírusov. Tieto vektory sa javia ako výhodné v samotnej transfekcii, ale nanešťastie sa nemôže úplne vylúčiť isté patogénne riziko, replikácia a/alebo riziko imunogénne vlastné ich vírusovej povahe.

Druhá stratégia výhodne spočíva v použití nevírusových činiteľov schopných podporovať prenos a expresiu DNA v bunke eukariotov.

Predložený vynález sa venuje predovšetkým tejto druhej metóde.

Podstata vynálezu

Chemické alebo biochemické vektory znamenajú výhodnú alternatívu prírodných vírusov predovšetkým z dôvodu absencie imunologickej odozvy alebo vírusového rekombinovania. Tieto vektory nemajú patogénnu schopnosť, riziko multiplikácie DNA uprostred týchto vektorov nie je žiadne. Vektor nie je obmedzený žiadnou teoretickou hranicou, pokiaľ sa týka veľkosti DNA na transfekciu.

Tieto syntetické vektory majú dve základné funkcie, kondenzovať transfekčnú DNA a podporovať bunkové väzby, rovnako ako priechod cez plazmatickú membránu, prípadne dve jadrové membrány.

Polyaniónové časti DNA prirodzene nemajú žiadnu afinitu k plazmatickej membráne buniek, tiež polyaniónových.

Z tohto dôvodu na odstránenie tejto nevýhody majú nevírusové vektory vo všeobecnosti polykatiónové náboje.

Medzi vyvinuté syntetické vektory patria katiónové polyméry typu polylyzín a DEAE dextrán alebo ešte katiónové lipidy alebo lipofektanty, ktoré sú najvhodnejšie. Majú vlastnosti kondenzovanej DNA a podporujú svoju väzbu s bunkovou membránou. Táto technika dáva základ princípu kondenzácie DNA. Vďaka katiónovému polyméru sa komplex fixuje k membráne pomocou chemickej väzby medzi katiónovým polymérom a ligandom receptora membrány, ktorý je prítomný na povrchu bunky a ktorý sa vrúbľuje. Sú tiež opísané receptory trasferínu, inzulínu a receptory azoaloglykoproteínov hepatocytov. Syntetické vektory dnes navrhované sú ešte ďaleko, aby boli známe rovnako ako vírusové vektory. Ich dôsledkom je nedostatočná kondenzácia DNA. S ťažkosťami sa môžeme znova stretnúť pri penetrácii DNA do bunkového jadra. Ďalšie nevýhody sú priamo spojené s povahou katiónových polymérov použitých lipofektantov.

Predložený vynález navrhuje riešenie týchto problémov. Presnejšie, predložený vynález sa vzťahuje ku farmaceutickej kompozícii použitej na transfekciu nukleovej kyseliny. Táto kompozícia sa vyznačuje tým, že obsahuje uvedenú nukleovú kyselinu, činiteľ transfekcie a zlúčeninu pôsobiacu na úrovni kondenzácie uvedenej nukleovej kyseliny. Uvedená zlúčenina môže byť odvodená celkom alebo čiastočne od histónu, nukleolínu, protamínu a/alebo ich derivátov.

Neočakávane sa ukázalo, že prítomnosť takýchto zlúčenín v kompozícii umožní v značnej miere znížiť množstvo transfekčného činiteľa s priaznivým dôsledkom z toho vyplývajúcim, bez akéhokoľvek zníženia aktivity transfekcie uvedenej zlúčeniny. Naopak, tieto látky dokonale umožňujú transfekciu.

V zmysle vynálezu zlúčeniny pôsobiace na úrovni kondenzácie nukleovej kyseliny zahrnujú zlúčeniny zahusťujúce nukleovú kyselinu, priamo alebo nepriamo. Tieto zlúčeniny môžu pôsobiť priamo na úrovni transfekovanej nukleovej kyseliny alebo pôsobiť na úrovni pridaných zlúčenín, ktoré sa priamo dodávajú pri kondenzácii tejto nukleovej kyseliny. Prednostne pôsobia na úrovni nukleovej kyseliny. Podľa realizačného modelu vynálezu, zlúčenina pôsobiaca na úrovni kondenzácie nukleovej kyseliny je tvorená celkom alebo čiastočne peptidovými motívmi (KTPKKAKKP) SEQ ID N°1 alebo (ATPAKKAA) SEQ N°2 alebo ich derivátmi, počet motívov sa môže pohybovať medzi 2 a 10. V štruktúre látok podľa vynálezu sa tieto motívy môžu opakovať kontinuálne alebo nekontinuálne. Môžu byť medzi sebou oddelené väzbami biochemickej povahy, napríklad väzby tvorené jednou alebo niekoľkými aminokyselinami alebo väzbami chemickej povahy.

Podľa vynálezu je predovšetkým výhodný výber zlúčenín, ako sú peptidy alebo pseudopeptidy (ktoré obsahujú aminokyseliny prevažne zásaditého charakteru ako je lyzín, histidín alebo arginín) v rámci predloženého vynálezu. Tieto zlúčeniny môžu mať štruktúru skladaného listu. Zásadité aminokyseliny sú špecificky zahrnuté vo väzbe peptid - nukleová kyselina. Tieto aminokyseliny majú podiel na vybudovaní iónových vodíkových mostíkov medzi dvoma postrannými reťazcami priaznivými pre kondenzáciu nukleovej kyseliny. Pokiaľ sa týka štruktúry skladaného listu, táto štruktúra je charakterizovaná ľahšou prístupnosťou k majoritným zväzkom karboxylov a atómov vodíkov, ktoré z časti svojho charakteru akceptora a donora prednostne podporujú tvorbu väzieb so zahustenou nukleovou kyselinou. Ide predovšetkým o histón, nukleolín, protamín a/alebo ich deriváty alebo len o ich časť.

Históny a protamíny sú proteíny katiónovej povahy. Sú zodpovedné za kondenzáciu DNA in vivo, netranskribujú DNA určitého vírusu. Históny sa môžu použiť v rámci predloženého vynálezu. Ide predovšetkým o históny Hl, H2a, H3 a H4. Pokiaľ sa týka nukleolínu, ide o nukleárny proteín, pri ktorom sa predpokladá, že má synergický účinok v priebehu kondenzácie DNA v porovnaní s histónom Hl. V rámci predloženého vynálezu môže výhodne ísť o zlúčeninu s peptidovou sekvenciou odvodenou od N-koncovej oblasti nukleolínu so sekvenciou (ATPAKKAA)₂(COOH) (SEQ ID N°3).

Zlúčenina podľa vynálezu je odvodená od histónu Hl, predovšetkým od C-koncovej oblasti a zodpovedá sekvencii (KTPKKAKKP)₂(COOH) (SEQ ID N°4).

Z týchto zlúčenín podľa vynálezu sa môžu citovať nasledujúce oligopeptidy: ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH) (SEQ ID N°5) a KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH) (SEQ ID N°6) ako výhodné.

Pokiaľ sa týka sekvencii odvodených od protamínov môžu sa v rámci predloženého vynálezu citovať predovšetkým nasledujúce oligopeptidy: SESEYYRQRQRSRRRRRR(COOH) (SEQ ID N°7) a RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH) (SEQ ID N°8).

V zmysle predloženého vynálezu odvodený termín opisuje všetky peptidy, pseudopeptidy (peptidy zahrnujúce nebiochemické časti) alebo proteíny odlišné od proteínov alebo peptidov braných do úvahy, získaných jedným alebo viacerými modifikáciami genetickej a/alebo chemickej povahy. Modifikáciami genetickej povahy alebo chemickej povahy sa môžu rozumieť všetky mutácie, substitúcie, vynechanie, prídavok a/alebo modifikácie jedného alebo viacerých rezíduí určitého proteínu. Chemická modifikácia zahrnuje všetky modifikácie peptidu tvorené chemickou reakciou alebo chemickým vrúbľovaním molekuly, biochemické alebo nebiochemické, na akomkoľvek počte rezíduí proteínu.

Genetická modifikácia zahrnuje všetky peptidové sekvencie, ktorých hybrid DNA s týmito sekvenciami alebo fragmentárni má naznačenú aktivitu. Tieto deriváty môžu byť tvorené rôzne. Zväčšovaním afinity polypeptidu k ligandom, zlepšovaním úrovne ich produkcie, zvyšovaním ich rezistencie k proteázam, zlepšovaním a/alebo priamo vložením nových farmakologických a/alebo biochemických vlastností. Medzi výslednými derivátmi adície sa môžu citovať napríklad peptidické sekvencie obsahujúce heterologickú časť viazanú na koniec. Odvodený termín zahrnuje tiež homologickú sekvenciu proteínu, produkty ďalších zdrojov buniek, predovšetkým buniek ľudského pôvodu alebo iných organizmov, ktoré majú aktivitu rovnakého typu. Homologické sekvencie sa môžu získať hybridizáciou zodpovedajúcej DNA. Hybridizácia sa môže uskutočniť z banky nukleových kyselín, ktoré sa používajú ako sonda natívnej sekvencie alebo fragmenty v konvenčných podmienkach (Maniatis a ostatní), (všeobecná technika molekulárnej biológie).

V realizačnom modeli kompozície podľa predloženého vynálezu predovšetkým výhodne ďalej zahrnujú zlúčeninu, umožňujúcu orientovať sa na prenos nukleovej kyseliny. Táto zložka môže byť zložkou extracelulámou, ktorá umožňuje orientovať prenos kyseliny nukleovej cez určitý typ buniek alebo určité požadované tkanivo (nádorové bunky, hepatické bunky, bunky hepatopoetické). Môže ísť tiež o zložky intraceluláme, ktoré umožňujú orientovať prenos nukleovej kyseliny cez určité rozdelenie buniek (mitochondrie, jadro, atď.).

Zlúčenina je viazaná kovalentným spôsobom alebo spôsobom nekovalentným v kompozícii podľa vynálezu.

Zlúčenina môže byť tiež viazaná k nukleovej kyseline. Podľa modelu vynálezu vyššie uvedená zlúčenina je viazané cez doplnkovú heterogénnu časť viazanú k jednému z jeho koncov. Tieto časti môžu byť predovšetkým peptidy typu fiizogén, na uskutočnenie bunkovej transfekcie, dá sa povedať, na uskutočnenie transfekčného prostriedku alebo jeho rôznych zložiek cez membrány. Môže ísť o ligand bunkového receptora, ktorý je prítomný na povrchu bunky, ako napríklad cukor, transferín, inzulín alebo proteín asialo-orozomukoid. Môže ísť tiež o ligand intracelulámeho typu, ako označenie bunkového umiestnenia, ktorý prednostne zhromažďuje transfektovú DNA uprostred jadra.

Medzi cieľovým zložkami použitými v rámci vynálezu sa môžu citovať cukry, peptidy, hormóny, vitamíny, cytokíny, oligonukleotidy, lipidy alebo sekvencie alebo časti jatočného odpadu, umožňujúce špecifické viazanie so zodpovedajúcimi receptormi. Ide o také cukry a/alebo peptidy ako sú protilátky alebo časti protilátok, bunkové receptorové ligandy alebo ich časti, receptory alebo časti receptorov, atď. Môže ísť tiež o ligandy receptora faktorov vývoja, receptorov cytokináz, bunkových receptorov alebo receptorov proteínov adhézie. Môžu sa tiež citovať receptory transferínu, HDL a LDL. Cieľovými zložkami môžu byť tiež cukry umožňujúce viazať lecitín ako receptor asiaglykoproteínových alebo časť fragmentu Fab protilátok, umožňujúce viazať receptor fragmentu Fc imunoglobulínu.

Ako príklad tohto typu viazania sa môže uviesť v rámci predloženého vynálezu zlúčenina typu Hl-nls a predovšetkým peptid, ktorý má sekvenciu PKKKRKV-bAla-(KTPKKAKKP)₂(COOH) (SEQ ID N°9). Zlúčeniny podľa vynálezu a predovšetkým všetky odvodené od histónu, protamínu alebo nukleolínu môžu byť ďalej polyglykozylované, sulfónované alebo fosforylované a/alebo vrúbľova.né na komplexné cukry, alebo na liofilné činidlo ako je napríklad polyuhlíkový reťazec, alebo deriváty cholesterolu..

Kompozície podľa vynálezu môžu pochopiteľne zahrnovať zahustenú nukleovú kyselinu rôznej povahy. Môžu sa tiež spájať zlúčeniny typu histónu k zlúčeninám typu nukleolínu.

Zlúčenina podľa vynálezu je prítomná v dostatočnom množstve na zahustenie nukleovej kyseliny podľa vynálezu. Pomer látka: nukleová kyselina (vyjadrené hmotnostne) sa môže pohybovať v hodnotách medzi 0,1 a 10 a predovšetkým medzi 0,3 a 3. Pokiaľ sa týka činiteľa transfekcie prítomného v kompozícii podľa vynálezu, tento je predovšetkým vybraný medzi katiónovými polymérmi a lipofektantmi.

Podľa predloženého vynálezu katiónový polymér je zlúčeninou všeobecného vzorca (I):

Ň-(CH2)l·

v ktorom

R môže znamenať atóm vodíka alebo skupinu všeobecného vzorca:

(CH2)n-b· n znamená celé číslo, ktoré sa pohybuje medzi 2 a 10, p a q sú celé čísla s takým súčtom p a q, že molekulová hmotnosť polyméru sa pohybuje medzi 100 a 10⁷Da.

SK 281543 Β6

Je pochopiteľné, že vo vzorci (I) sa hodnota n môže pohybovať medzi rôznymi motívmi p. Vzorec (I) zoskupuje zároveň homopolyméry a heteropolyméry.

Vo vzorci (I) sa n pohybuje v rozmedzí hodnôt 2 a 5. Najmä polyméry polyetylénimínu (PEI) a polypropylénimínu (PPI) vykazujú vynikajúce vlastnosti. Polymérmi podľa predloženého vynálezu sú tie, ktorých molekulová hmotnosť sa pohybuje medzi 10³ a 5 x 10⁶. Ako príklad môžme uviesť polyetylénimín so strednou molekulovou hmotnosťou 50 000 Da (PEI50K) alebo polyetylénimín so strednou molekulovou hmotnosťou 800 000 Da (PEI800K). PEI50K alebo PEI800K sú komerčne dostupné. Iné polyméry všeobecného vzorca (I) môžu byť opísané vo FR 9408735. Optimálne podmienky vynálezu, t. j. optimálny pomer polymér: nukleová kyselina sú určené druhom jednotlivých zastúpených látok, tak napr. molámy pomer R = amíny polyméru: fosfáty nukleovej kyseliny. Tento pomer sa pohybuje v hodnotách medzi 0,5 a 50, presnejšie medzi 5 a 30. Predovšetkým výhodné výsledky sa získajú pri použití 5 až 25 ekvivalentov amínov polyméru k množstvu fosfátov nukleovej kyseliny.

Pokiaľ sa týka lipofektantu, ako lipofentant sa v zmysle vynálezu rozumie zlúčenina lipidového charakteru, ktorá je aktívna vzhľadom na transfekciu nukleovej kyseliny do buniek. Vo všeobecnosti ide o molekuly, obsahujúce aspoň jednu lipofilnú oblasť viazanú alebo neviazanú v hydrofilnej oblasti. V tejto skupine zlúčenín môžu byť lipidy schopné tvoriť lipozómy, ako je POPC, fosfatidylserín, fosfatidylcholín, cholesterol, maleílnimidofenylbutyrylfosfatidyletanolamín, laktozylceramid, v prítomnosti alebo neprítomnosti polyetylénglykolu tvoria latentné lipozómy alebo v prítomnosti, alebo neprítomnosti protilátok, alebo ligandov tvoria imunolipozómy, alebo cieľové lipozómy.

Podľa vynálezu lipidový činiteľ vytvára katiónovú oblasť. Táto katiónová oblasť, oblasť katiónového náboja, je schopná viazať sa reverzibilným spôsobom na nukleovú kyselinu s negatívnym nábojom. Táto interakcia pevne zhusťuje nukleovú kyselinu. Lipofílná oblasť sčíta tieto iónové interakcie v prostredí externej vody, keď sa znova pokryje nukleofilnými časťami tvoriacimi lipidovú vrstvu.

Zistilo sa tiež, že katiónový lipid s pozitívnym nábojom N-[l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamónium chlorid (DOTMA), interferuje vo forme lipozómu alebo peptidových vreciek, spontánne s DNA, ktorá má negatívny náboj, za vzniku komplexu lipid-DNA. Tento komplex je schopný viazať sa k bunkovej membráne a umožňuje tiež intraceluláme odovzdanie DNA. Od DOTMA sú navrhnuté ďalšie katiónové lipidy. Lipofílná skupina je pripojená k aminoskupine prostredníctvom ramena nazvaného „spacer“. Medzi týmito zlúčeninami sa môžu uviesť predovšetkým tie, ktoré obsahujú lipofilnú skupinu dvoch mastných kyselín alebo sú odvodené od cholesterolu, obsahujúce v prípade potreby aminoskupinu alebo kvartému amóniovú skupinu. DOTAP, DOBT alebo ChOTB môžu byť uvedené ako reprezentanti tejto kategórie katiónových lipidov. Ďalšie látky ako DOSC a ChSC sa vyznačujú prítomnosťou cholínovej skupiny namiesto kvartémej amóniovej skupiny. Bola tiež opísaná kategória katiónových lipidov, ako sú lipopolyamíny. V tomto type zlúčenín je katiónová skupina reprezentovaná zvyškom L-5-karboxy- spermínu, ktorý obsahuje štyri amóniové, dve primáme a dve sekundárne skupiny.

Lipofektanty sú účinné predovšetkým na transfekciu endokrinných primárnych buniek. Lipofektanty, ktoré vyhovujú vynálezu môžu byť tiež vybrané z množiny lipopolyamínov, ktorých oblasť polyamínu zodpovedá všeobecnému vzorcu (II)

H₂N-(-(CH)_m-NH)_n-H (II), v ktorom m je celé číslo vyššie alebo rovné 1 a n je celé číslo vyššie alebo rovné 1, m sa môže meniť pre rôzne uhlíkaté skupiny obsiahnuté medzi dvoma amínovými skupinami, jeho hodnota sa pohybuje medzi 2 a 6 vrátane a n sa pohybuje v pohybuje 1 a 5 vrátane. Oblasť polyamínová je tvorená spermínom, thermínom alebo ich analógmi, pri ktorých sú zachované väzbové vlastnosti k DNA. Ak je lipofilná oblasť tvorená uhľovodíkovým reťazcom nasýteným alebo nenasýteným, cholesterolom, prírodným lipidom alebo lipidom syntetickým, je schopná tvoriť lamerálne alebo hcxagonálne fázy, viazané kovalentným spôsobom v hydrofilnej oblasti.

EP 394 111 opisuje ďalšie lipopolyamíny všeobecného vzorca (III) v rámci predloženého vynálezu,

H₂N-(-(CH)_m-NH)_n-H, v ktorom R je predovšetkým zvyšok všeobecného vzorca (R'R²)N-CO-CH-NH-CO-.

Ako príklad týchto lipopolyamínov sa môže uviesť dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS) a 5-kaiboxyspermylamid palmitoylfosfatidyletanolamínu (DPPES).

Lipopolyamíny opísané vo FR 94 14596 sa taktiež môžu výhodne použiť ako činiteľ transfekcie podľa vynálezu. Tieto zlúčeniny sú znázornené všeobecným vzorcom (IV), v ktorom R predstavuje

kde

X a X' znamenajú, nezávisle jeden od druhého, atóm kyslíka, metylénovú skupinu, (CH₂)_q-, kde q zodpovedá hodnotám 0, 1, 2 alebo 3 alebo aminoskupinu -NH- alebo -NR', kde R' znamená alkylovú skupinu, obsahujúcu 1 až 4 atómy uhlíka,

Y a Y’ znamenajú, nezávisle jeden od druhého, metylénovú skupinu, karbonylovú skupinu alebo skupinu C = S,

R³, R⁴ a R⁵ znamenajú, nezávisle jeden od druhého, atóm vodíka alebo alkylovú skupinu, prípadne substituovanú alebo nesubstituovanú, obsahujúcu 1 až 4 atómy uhlíka, p sa môže pohybovať medzi 0 a 5,

R⁶ predstavuje derivát cholesterolu alebo alkylamino skupinu NR’R², kde R¹ a R² znamenajú, nezávisle jeden od druhého, alifatickú skupinu, nasýtenú alebo nenasýtenú, lineárnu alebo rozvetvenú, obsahujúcu 12 až 22 atómov uhlíka.

Môže ísť o zlúčeniny napríklad 2,5-bis-(3-aminopropylamino)pentyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát a l,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát (pozri ďalej lipopolyamín A). EP 394 111 a FR 94 14596 opisujú tiež postup, ktorý sa môže použiť na prípravu zodpovedajúcich lipopolyamínov.

Nové lipopolyamíny, zhodnotené tiež v oblasti predloženého vynálezu, boli opísané vo FR 95/13490. Ako predstavitelia tejto skupiny lipopolyamínov sa môžu uviesť tieto nasledujúce lipopolyamíny: lipopolyamín B: {H₂N(CH₂)₃}₂N(CH₂)₄N{(CH₂)₃NH₂)(CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₇-CH₃]₂ (RP120525)

SK 281543 Β6 lipopolyamín C: H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₈]₂(RP120535) lipopolyamín D:

H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COArgN[(CH₂)₁₈] (RP120531)

V rámci predloženého vynálezu sa výhodne môžu tiež použiť dooktadecylamidoglycylspermín (DOGS), 5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidyletanolamínu (DPPES), 2,5-bis-(3-aminopropylamino)-pentyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxy)-acetát, 1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxy)-acctát, {H₂N(CH₂)₃}₂N(CH₂)₄N{(CH₂)₃NH₂}(CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₇-CH₃]₂H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₈]₂H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COArgN[(CH₂)₁₈].

Na dosiahnutie optimálneho účinku prípravkov podľa vynálezu sú pomery polyamínu a nukleovej kyseliny prednostne určené druhom, kde pomer R pozitívnych nábojov činiteľa transfekcie k negatívnym nábojom nukleovej kyseliny sa pohybuje v hodnotách medzi 0,1 a 1, predovšetkým medzi 0,5 a 6.

Prítomnosť zlúčenín podľa vynálezu v kompozícii transfekcie výhodne umožňuje výrazne znížiť množstvo činiteľa transfekcie. Znížila sa tiež sledovaná toxicita pri použití lipopolyamínov podľa vynálezu, napríklad sa toto pozorovalo pri transfekcii buniek citlivých na pôvod činiteľa transfekcie, ako sú napríklad krvotvomé bunky. Ako ukazujú ďalej uvedené príklady, schopnosť kompozície transfektovať podľa vynálezu je vyššia v porovnaní s tými, ktoré sú transfektované klasickými činiteľmi.

V kompozícii podľa predloženého vynálezu nukleovou kyselinou môže byť rovnako i ribonukleová kyselina. Môže isť o sekvencie prírodného pôvodu alebo umelo pripravenú genomickú DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, hybridové sekvencie alebo syntetické sekvencie alebo sekvencie semisyntetické. Tieto nukleové kyseliny môžu byť pôvodu ľudského, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho, vírusového, atď. Môžu sa tiež získať všetkými pre odborníkov známymi technikami, predovšetkým triedením bánk, chemickou syntézou alebo zmiešanými metódami zahrnujúcimi chemickú alebo enzýmovú modifikáciu. Môžu sa inkorporovať do vektorov, ako je plazmidový vektor.

Dezoxyribonukleové kyseliny môžu byť jednoduché alebo dvojvláknové. Tieto dezoxyribonukleové kyseliny môžu kódovať terapeutické gény riadiace sekvenciu transkripcie alebo replikácie, antimediátorové sekvencie a väzbové oblasti k ďalším častiam buniek, atď.

V zmysle vynálezu sa terapeutickými génmi nazývajú všetky gény obsahujúce proteíny, ktoré majú terapeutický účinok. Kódovanými proteínovými produktami môžu byť proteíny, peptidy, atď. Tieto proteínové produkty môžu byť homologické proti cieľovej bunke (dá sa povedať, že produkt je vyjadrený v cieľovej bunke, v prípade, že nie je prítomná žiadna patológia). V tom prípade expresia proteínu proteínu umožňuje napríklad zmierniť nedostatočnú expresiu v bunke alebo expresiu neaktívneho proteínu alebo slabo aktívneho z dôvodu modifikácie alebo ešte predexprimovanie uvedeného proteínu. Terapeutický gén môže byť tiež kódovaný mutáciou bunkového proteínu, ktorý má stabilnú modifikovanú aktivitu. Proteínové produkty môžu byť tiež heterologické proti cieľovej bunke. V tom prípade exprimovaný proteín môže byť napríklad doplnený alebo vnesený nedostatočnou aktivitou v bunke, ktorá neumožňuje bojovať proti patológii alebo stimulovať imunitnú odozvu.

Medzi terapeutickými produktmi v zmysle predloženého vynálezu sa môžu citovať predovšetkým enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny TNF, atď. (FR 9203120), faktoiy rastu, ich prekurzory, enzýmy syntézy, troíické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofín zodpovedajúci proteínom obsiahnutým v metabolizme lipidov typu apolipoproteín vybranými medzi apolipoproteínmi A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-ίΠ, D, E, F, G, H, J a enzýmy metabolizmu ako napríklad lipoproteínová lipáza, pečeňová lipáza, lecitín cholesterol acyltransferáza, 7 alfa cholesterol hydroxyláza, fosfatáza alebo ešte proteíny prenosu lipidov, ako je proteín prenosu esterov cholesterolu a proteín prenosu fosfolipidov proteínu väzieb HDL alebo receptor vybraný napríklad medzi receptormi skavengeru, dystrifinu alebo minidystroflnu (FR 9111947) proteín GAX, proteín CFTR spojený s génmi potláčajúcimi nádory: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, atď. (FR 9304745) gény kódujúce faktory implikované do koadulácie: Faktory VII, VIII, IX, gény pôsobiace pri oprave DNA, samovražedné gény (tymid kináza, cytozín deamináza) atď.

Terapeutickým génom môže byť tiež gén alebo antimediátorová sekvencia, ktorého/ktorej expresia v cieľovej bunke dovoľuje kontrolovať expresiu génu alebo transkripciu bunkovej mRNA. Táto sekvencia sa môže transkribovať v cieľovej bunke komplementárnej RNA. Môže blokovať ich transdukciu v proteíne podľa opísanej techniky v EP 140 308. Antimediátorová sekvencia obsahuje tiež sekvencie kódujúce ribozómy, ktoré sú schopné výberovo zničiť RNA (EP 321 201).

Ako sa uvádza, nukleová kyselina môže obsahovať jeden alebo viac génov kódujúcich antigénový peptid, schop-, ný generovať u človeka alebo zvieraťa imunitnú odozvu.. Pre tento model sú charakteristické vakcíny, imunoterape-. utická liečba aplikovaná na človeka alebo na zviera, predovšetkým proti mikroorganizmom, vírusom alebo rakovinám. Môže ísť predovšetkým o špecifické antigénové peptidy vírusu Epstein Barr, vírusu HIV, vírusu hepatitídy B (EP 185 573), vírusu pseudobesnoty a špecifické nádory (EP 259 212).

Nukleová kyselina obsahuje predovšetkým sekvencie umožňujúce expresiu terapeutického génu a/alebo génu obsahujúceho gén kódujúci antigénový peptid v bunke alebo požadovanom orgáne. Môže ísť o sekvencie, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu skúmaného génu, ak sú sekvencie schopné fungovať v infikovanej bunke. Môže ísť tiež o sekvenciu rôzneho pôvodu (zodpovednú za expresiu ďalších proteínov alebo rovnakých syntetických). Predovšetkým môže ísť o sekvenciu iniciatóra eukariotických génov alebo vírusov. Napríklad môže ísť o iniciátory sekvencií bunkového genómu alebo genómu vírusu. V tomto ohľade je potrebné iniciovať napríklad iniciátory génov E1A, MLP, CMV, RSV, atď. Tieto sekvencie expresie sa môžu modifikovať adíciou aktivačných sekvencií, regulačných sekvencií, atď.

Z iného hľadiska nukleové kyseliny môžu tiež zahrnovať, predovšetkým proti toku terapeutického génu, signál sekvencie riadiaci syntézu terapeutického produktu sekrečným spôsobom cieľovej bunky. Týmto signálom sekvencie môže byť signál sekvencie prírodné terapeutického produktu, ale môže tiež ísť o všetky ďalšie sekvencie základného signálu alebo signálu umelého.

Kompozície podľa vynálezu ďalej obsahujú jeden alebo viac neutrálnych lipidov. Tieto látky sú predovšetkým výhodné, najmä v prípade, keď pomer R je slabý. Prídavok neutrálneho lipidu umožňuje zlepšovať tvorbu nukleolipidových časti a prekvapivo podporuje penetráciu častí do bunky pri destabilizácii membrány. Použitými neutrálnymi lipidmi v rámci predloženého vynálezu sú lipidy s dvoma mastnými reťazcami.

Predovšetkým výhodné je použitie prírodných lipidov alebo syntetických lipidov zwiterionového typu alebo bez náboja pri fyziologických podmienkach. Môže ísť o lipidy zvolené z množiny zahrnujúcej dioleylfosfatidyletanolamín (DOPE), oleoylpalmitoylfosfatidyletanolamin (POPE), distearoyl, palmitoyl, mirystoylfosfatidyletanolamín a ich I -až 3-násobné N-metylované deriváty, fosfatigylglyceroly, diglyceroly, diacylglyceroly, glykozyldiacylglyceroly, cerebrozidy (predovšetkým galaktocerebrozidy), sfmgolipidy (predovšetkým sfingomyelíny) alebo ešte asialogangliozidy (predovšetkým asialoGMl a GM2).

Tieto rôzne lipidy sa môžu získať ako syntézou, tak extrakciou, napríklad z orgánov (napríklad mozog) alebo vajec dobre známymi klasickými technikami. Predovšetkým extrakcia prírodných lipidov sa môže uskutočňovať prostredníctvom organických rozpúšťadiel (pozri Lehninger, Biochémia).

Kompozície podľa vynálezu sa uvádzajú do činnosti činiteľom transfekcie: lipofektantom, ktorý obsahuje 0,1 až 20 ekvivalentov neutrálnych lipidov na jeden ekvivalent lipopolyamínu. Najvýhodnejší je ekvivalent 1 až 5. V prípade, že transfekčným činiteľom je katiónový polymér, kompozície podľa vynálezu obsahujú okrem katiónového polyméru (v citovanom pomere: 0,1 až 20 molámych ekvivalentov) neutrálny lipid na jeden molámy ekvivalent fosfátu nukleovej kyseliny. Najvýhodnejší je opäť ekvivalent 1 až 5.

Kompozície podľa vynálezu sa môžu deliť na skupiny z pohľadu podávania lieku. Kompozície sa podávajú topicky, rektálne, vaginálne, parenterálne, transškárovo, orálne, kožou, podkožné, vnútrožilovo, intramuskuláme, intraokulárne, intranasálne, atď. Farmaceutické kompozície podľa vynálezu obsahujú farmaceutický prijateľné vehikulum pre injikovanie, predovšetkým na priame injikovanie na úrovni požadovaného orgánu alebo na podávanie topicky (na kožu alebo sliznicu). Môže ísť najmä o sterilné izotonické roztoky alebo suché prípravky predovšetkým lyofilizované. Ako roztok sa používa sterilná voda alebo fyziologické sérum umožňujúce injikovať farmaceutické kompozície. Dávka použitia nukleovej kyseliny pre injekciu, rovnako ako počet podávaní sa môžu upraviť v závislosti od úlohy a spôsobu podávania. Kompozície sa môžu výhodne použiť na transfekciu veľkého počtu buniek ako napríklad krvotvomých buniek, buniek melanómov, karcinómov a sarkómov, buniek hladkého svalstva a astrocytov.

Predložený vynález predkladá tiež metódu výhodnú najmä na liečenie chorôb používajúcich transfekciu in vitro, ex vivo alebo in vivo kyselinu nukleovú, vhodnú na opravu uvedenej choroby v spojení s činiteľom transfekcie typu katiónového polyméru alebo lipofektantu. Takáto kompozícia je vopred definovaná. Kompozície podľa vynálezu sú zaujímavé predovšetkým svojou vysokou úrovňou transfekcie.

Predložený vynález sa tiež týka použitia kompozícií tvorených celkom alebo čiastočne peptidovými motívmi (KTPKKAKKP) a/alebo (ATPAKKAA). Počet týchto motívov sa môže meniť medzi 2 a 10.

Predložený vynález pokrýva tiež všetky použitia oligopeptidov vybraných medzi (ΑΤΡΑΚΚΑΑ)₂(ΟΟΟΗ), (KTPKKAKKP)j(COOH), ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH), KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH), SRSRYYRQRQRSRRRRRR(COOH) a RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH) na uskutočnenie prenosu in vitro, ex vivo alebo in vivo nukleovej kyseliny uvedeného nukleotidu.

Nasledujúce príklady bližšie ilustrujú vynález bez toho aby v akomkoľvek smere obmedzovali jeho rozsah.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiál a metódy

1. Plazmidy použité na prenos génu in vivo

Aktivita kompozície je určená plazmidmi, ktoré obsahujú gén kódujúci luciferázu (Luc).

Ide predovšetkým o plazmidy pCMVluc, pXL 2621, pXL 2622, ktoré obsahujú gén kódujúci luciferázu (vektor pGL2), Promega) pod aktivátorom cytomegalovírusu (CMV) výťažok pCDNA3 (Invitrogén). pCMV luc a pXL 2622 sa odvodzujú od vektora pGL2, pXL 2622 vektora pGL2, a v týchto vektoroch iniciátor SV40 bol umiestnený aktivátorom CMV. Plazmidy sa všeobecne získavajú technickým zrážaním v PEG (Ausubel) a skladujú v Tris lOmM EDTA pH 8 pri teplote 4 °C a pri koncentrácii prostredia 10 pg ADN na μί.

2. Kompozície použité podľa vynálezu

H: KTPKKAKKPKTPKKAKKP(COOH) 18 AA N: ATPAKKAATPAKKAA(COOH) 16 AA nls-H: PKKKRKV-bAla-KTPKKAKKPKTKKAKKP(COOH) 26 AA

PRI: RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR21 AA PR2: SRSRYYRQRQRSRRRRRR sa pripravia nasledujúcimi postupmi:

2. IN: ATPAKKAATPAKKAA(COOH)

Tieto oligopeptidy sa syntetizujú vo forme soli kyseliny trifluóroctovej prostredníctvom syntézy peptidov Applicd Biosystem 431A na živici HMP (Applied Biosystem) metódou FMOC. Po syntéze sa peptid izoluje zo živice v priebehu 90 minút v prítomnosti roztoku voda/TFA v pomere 1 : 19. Po filtrácii sa roztok zahustí na vákuovej odparke, potom sa peptid dvakrát vyzráža prídavkom éteru butylmetylnatého z roztoku v TFA. Usadenina sa premýva éterom butylmetylnatým a potom sa suší. Peptid sa rozpustí v 5 ml vody, prefiltruje sa čistí na nepriamej fáze HPLC na kolóne C18 100 A (Biorad RSL). Peptid sa čistí pomocou gradientu 0 až 25 % acetonitrilu, 0,07 % TFA vo vode 0,07 % TFA. Čistota získaného peptidu je 95 % a jeho rozpustnosť vo vode je 100 mg/ml.

2.2 nsl: PKKKRKV

Tieto oligopeptidy sa syntetizujú vo forme soli kyseliny trifluóroctovej podľa protokolu opísaného pri použití (na štiepenie) roztoku: voda / TFA / fenol / etánditiol / / tioanizol v pomere 2 : 40 :3 :1 : 2 (objem/objem). Čistota získaného peptidu je 90 % a jeho rozpustnosť vo vode je 100 mg/ml pri pH 2,1.

2.3 H: KTPKKAKKPKTPKKAKKP(COOH) a nls-H: PKKKRKV-bAla- KTPKKAKKPKTKKAKKP(COOH)

Tieto oligopeptidy sa syntetizujú vo forme soli kyseliny trifluóroctovej podľa opísaného protokolu. Na tvorbu týchto oligopeptidov sa živica rozdelila na dve časti. Prvá časť je určená na syntézu H. Štiepenie sa uskutočňuje roztokom TFA / fenol/etánditiol/tioanizol/voda v pomere 40:3 :1 : 2:2 (objem/objem). Čistota získaného peptidu je 90 % ajeho rozpustnosť vo vode je 10 mg/ml pri pH 2,1. Druhá časť živice sa použije na syntézu nls-bAla-H. Roztok na štiepenie je rovnaký ako pri príprave H. Čistota získaného peptidu je 95 % a jeho rozpustnosť vo vode je 10 mg/ml pri pH 2,1.

2.4 PRI: RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR a PR2: SRSRYYRQRQSRRRRRR

Tieto oligopeptidy sa syntetizujú vo viacerých etapách na pevnej fáze podľa techniky BocBenzyle. Použije sa živica Boc-L-Arg(Tos)Pam (0,48 meq/g). Odstránenie chrániacej skupiny a viazanie sa uskutočňuje nasledujúcim spôsobom:

1-55 % TFA v dichlórmetáne (DCM)	1 x2 mn
2-55 % TFA v dichlórmetáne	1 x 30 mn
3-dichlórmetán	2x 1 mn
4-DMS	3 x 1 mn
5-viazanie
6-DMF	2 x 1 mn
7-dichlórmetán	2 x 1 mn

V každej etape sa použije 10 ml roztoku na jeden gram živice. Viazanie všetkých aminokyselín (v trojnásobnom nadbytku) sa uskutočňuje v DMF v prítomnosti BOP, Hobt a DIEA. Každá etapa viazania sa kontroluje ninhidrínovým testom.

Finálny peptid sa znova získa zo živice a celkom sa ochráni kyselinou fluorovodíkovou. Používa sa 10 ml kyseliny fluorovodíkovej na gram živicového peptidu pri teplote 0 °C počas 45 minút v prítomnosti para-krezolu a etánditiolu. Po odparení kyseliny fluorovodíkovej sa zmes premýva éterom v kyseline fluorovodíkovej, potom sa zráža éterom a suší.

3. Lipofektanty

Lipopolyamín A:

l,3-bis-(3-amino-propylamino)-2-propyl-(dioktadecyl-karbamoylmetoxy)acetát (RP í 15335)

Lipopolyamín B: {H₂N(CH₂)₃}₂N(CH₂)₄N{(CH₂)₃NH₂}(CH₂)₃NHCH₂COG1 yN[(CH₂)|₇-CH₃]₂ (RP120525)

Lipopolyamín C: H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₈]₂(RP120535)

Lipopolyamín D: H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COArgN[(CH₂)|₈] (RP120531)

Príklad 1

Prenos nukleovej kyseliny do buniek NIH 3T3 in vitro

Tento príklad opisuje prenos nukleových kyselín in vitro prostredníctvom kompozície podľa vynálezu, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu, zlúčeninu podľa vynálezu a lipopolyamín. Prenos sa uskutočňuje pri rôznych podmienkach, rôznom pufri a rôznom pH.

pl zmesi kompozície sa pripraví nasledovne: -0,5 pg plazmidovej DNA pCMV-luc, 0,25 pg zlúčeniny podľa vynálezu v roztoku pufra

- 40 mM dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS) v pomere X, ktorý je určený v každom pokuse

- 2-5.10⁴ buniek NIH3T3 sa inkubuje s predchádzajúcou zmesou pri teplote 37 °C pod atmosférou 5 % CO₂ počas 4 hodín. Bunky sa potom premyjú a opäť vložia do kultivačného média počas 48 hodín v prostredí 10 % séra (DMEM % SVF). Bunková kultúra sa potom lyžuje v 50 pl pufra (Promega sa znova získa odstredením 20 000 g počas 5 minút).

Aktivita luciferázy sa meria v 4 pl vzorky za prídavku 20 pl substrátu (Promega). Odpočítanie sa uskutočňuje na luminometre LKB v jednotkách RLU (relative lights units) za 20 sekúnd.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 1 a 2.

3. Zahusťovanie v 150 mM NaCl, 10 mM HEPES (N-(2-hydroxyetyl)-piperazín-N'-(2-etyl)sulfónová kyseliny pri pH 7,1.

Tabuľka 1

DOGS/DNA	bez prípravku (RLU)	sH (RLU)
0,8 X	32	850
1,8 X	220	23 700
3X	5 400	21 750

4. Zhusťovanie v 5% D-glukózy, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,2

Tabuľka 2

DOGS/DNA	bez látky (RLU)	sH (RLU)	sN (RLU)
0,8 X	880	44 000	1 450
1,8 X	6 600	156 500	-
3X	22 000	297 500	90 300

V týchto príkladoch sú uvedené výsledky, ktoré sa získali pri spojení zahustenej zlúčeniny s DOGS podľa vynálezu. Ukázalo sa, že je možné znížiť množstvo DOGS bez akéhokoľvek negatívneho vplyvu na transfekciu zodpovedajúcich látok.

Príklad 2

Skúška transfekcie v prítomnosti neutrálneho lipidu pl zmesi kompozície sa pripraví nasledovne:

- 0,5 pg plazmidovej DNA pCMV-luc, 0,25 pg látky podľa vynálezu v roztoku pufra 150 mM NaCl, 10 mM fosforečnanový pufer pH 7,4

- 40 mM dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS) v pomere X, ktorý je určený v každom pokuse prítomnosťou dioleylfosfätidyl etanolamínu (DOPE). Použitý pomer DOGS/DOPE je 1 : 2.

V tomto prípade sa 40 mM etanolového roztoku DOGS zmieša s rovnakým objemom dioleylfosfatidyletanolamínu (DOPE) pripraveného v zmesi chloroform / etanol (1 : 5). Na jeden ekvivalent DOGS prípravok obsahuje dva ekvivalenty DOPE.

- 10⁵ buniek NIH3T3 sa inkubuje s predchádzajúcou zmesou pri teplote 37 °C pod atmosférou 5 % CO2 počas 4 hodín. Bunky sa potom premyjú a opäť vložia do kultivačného média na čas 48 hodín v prostredí 10 % séra (DMEM 10 % SVF).

Bunková kultúra sa potom lyžuje v 50 pl pufra (Promega) a znova získa odstredením (20 000 g v priebehu 5 minút).

SK 281543 Bé

Aktivita luciferázy sa meria v 4 μί vzorky pri prídavku 20 μί substrátu (Promega). Odpočítanie sa uskutočňuje na luminometre LKB v jednotkách RLU (relative lights units) za 20 sekúnd.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 3

DOGS/DNA	bez látky (RLU)	sH (RLU)	s nls-H (RLU)
0,8 X	24	3 175	760
1,8 X	19	7 410	2 380
3X	1 800	39 500	52 800

Tieto výsledky potvrdzujú pozorovania v príklade 1. V prítomnosti zásaditých látok podľa vynálezu a predovšetkým H, je možné znížiť o polovicu množstvo lipofektantu.

Príklad 3

Zmena pomeru prípravkov podľa vynálezu / DNA

3.1 V prítomnosti prípravku DOGS

1. 10 μί zmes prípravku sa pripraví nasledovne:

- 0,75 pg plazmidovej DNA pCMV-luc a zlúčenina podľa vynálezu v roztoku pufra 5 % D-glukózy, 150 mM NaCl s 10 mM HEPES (pH zahusťovacieho roztoku je 7,2)

- 40 mM dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS) v pomere 1,8 X

- 2-4.10⁵ buniek NIH3T3, ktoré sú inkubované s predchádzajúcou zmesou pri teplote 37 °C pod atmosférou CO₂ počas 4 hodín. Bunky sa potom premyjú a opäť vložia do kultúry na čas 48 hodín v prostredí 10 % séra (DMEM 10%SVF).

hodín po transfekcii sa bunky lyžujú v 100 μί pufra (Promega) a znova získajú odstredením (20 000 g v priebehu 5 minút).

Aktivita luciferázy sa meria v 5 μί vzorky pri prídavku 20 μί substrátu (Promega). Odpočítanie sa uskutočňuje na luminometre LKB v jednotkách RLU (relative lights units) za 20 sekúnd.

Výsledky sú zhrnuté tabuľke 4.

Tabuľka 4

PEP / ADN hmotnosť/objem	s H s (RLU)	H-nls (RLU)	s N (RLU)
0	2 150	2 150	2 150
0,25	3000	38 000	3 500
0,5	45 000	100 000	35 000
1	84 000	105 000	13 000
2	105 000	200 000	20 000

3.2 V prítomnosti DOGS / DOPE 1,8 X

Postupuje sa rovnako ako v opísanom protokole v 3.1. Na transfekciu sa použije 40 mM roztok 1,8 X dioktadecylglycylspermínu (DOGS) v prítomnosti dioleylfosfatidyletanolamínu (DOPE), DOGS / v pomere 1 : 2 pripravené podľa príkladu 2.

Tabuľka 5 zhrňuje získané výsledky.

Tabuľka 5

látka/DNA hmotnosť/objem	H (RLU)	H-nls (RLU)	N (RLU)
0	580	580	580
0,25	1 300	5 600	7600
0,5	11 000	18 500	1 800
1	14 100	36 000	13 600
2	16 500	58 000	14 100

Príklad 4

Zmena pomeru prípravkov podľa vynálezu / DNA. DOGS je nahradený inými látkami.

4.1 V prítomnosti l,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl-(dioktadecyl-karbamoylmetoxy)acetátu (lipopolyamínu A)

1. 10 μί zmes prípravku sa pripraví nasledovne:

- 0,55 pg plazmidovej DNA pCMV-luc a zlúčenina podľa vynálezu v roztoku pufra 150 mM NaCl

-1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát v uvedenom pomere

- 2-5.10⁵ buniek NIH3T3, ktoré sú inkubované s predchádzajúcou zmesou pri teplote 37 °C pod atmosférou CO₂ počas 4 hodín. Bunky sa potom premyjú a opäť vložia do kultúry na čas 48 hodín v prostredí 10% séra (DMEM 10%SVF).

hodín po transfekcii sa bunky lyžujú v 100 ml pufra (Promega) a znova získajú odstredením (20 000 g v priebehu 5 minút).

Aktivita luciferázy sa meria v 10 ml vzorky pri prídavku 50 μί substrátu (Promega). Odpočítanie sa uskutočňuje na luminometri Berthold lumat 9501^<R> v jednotkách RLU (relative lights units) za 10 sekúnd.

Výsledky sú zhrnuté tabuľke 6.

Tabuľka 6

4.2 V prítomnosti PEI800K

Postupuje sa podľa protokolu opísaného v 4.1 s použitím lipofektantu PEI 800K. Výsledky sú uvedené v tabuľke 7.

Tabuľka 7

PEI 800K	bez látky ,10⁶RLU	sH .10⁶RLU	S	ils-H .10⁸ RLU
amín polyméru fosfát DNA		látka/DNA
	0	0,5	1 2	0,5	1	2
6	7,7	4,9	7 12,3	4	7,3	8,8
9	5	8	11,6 4	16,3	11	12,1
12	7,5	11,3	17,1 1,2

Príklad 5

Prenos in vivo do svalových buniek

Zodpovedajúce pokusy sú opísané v nasledujúcom texte: Prostriedky sa injikujú do holenného svalu myši C57 bl6 alebo OF1 (staršie ako 8 týždňov).

DNA sa zriedi na koncentráciu 0,5 mg/ml roztokom 150 mM NaCl, obsahujúcim 5% D-glukózy. Pred injekciou je koncentrácia peptidu 1 mg v 1 ml vody. K tomuto roztoku sa pridá DNA v dostatočnom množstve na dosiahnutie určitého pomeru (hmotnosť/hmotnosť). Čas inkubácie pred injikovaním je aspoň 20 minút pri teplote prostredia.

Vyhodnotenie výsledkov

Dva dni po injekcii sa sval odoberie, rozseká v 750 μί pufra (Promega E153 A), pridá k aprotininu (Sigma). Odobraná vzorka sa homogenizuje v drvičke (Heidolf) a odoberie sa 10 μί na meranie aktivity luciferázy. Toto meranie sa uskutočňuje luminometrom Lumat 9501 (Berthold) v priebehu 10 sekúnd po prídavku 50 μί substrátu obsahujúceho luciferázu (Promega) k 10 μg vzorky. Šum pozadia pred pridaním substrátu sa úplne odpočíta a aktivita sa vyjadrí v RLU (relative lights units).

μί (20 μί ADN) sa injikuje v prítomnosti 5 mM HEPES s pH roztoku 7,4, potom sa pridá lipopolyamin C (RPR 120535) v množstve 0,01 nmol/μΐ ADN 20 minút pred injikovaním.

Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 8. Tabuľka 8

peptid/DNA hmotnosť/hmotnosť	(priemer) RLU	(odchýlka) RLU	počet zvierat
bez peptidu fosfát DNA	15 228 125	14 618 681	6
nsl-H 0,25 hmotnosť / /hmotnosť +lipopolyamin C	42 722500	66 485 348	6

Tieto výsledky potvrdzujú priaznivý vplyv spojenia lipopolyamínu so zahustenou látkou podľa vynálezu na transfekciu nukleovej kyseliny in vivo vo svale.

Príklad 6

Prenos nárokovanej kompozície in vivo do nádorových buniek

Pokusy sa uskutočňujú na dospelých samiciach myší C57/BL6 (starších ako 6 týždňov), ktoré majú nádor typu 3LL (Lewis Lung carcinoma). Tieto objekty sa získajú pasážovaním nádoru a ich implantovaním zo zvieraťa na zviera pod kožu na úrovni boku.

Roztok na injikovanie sa pripraví nasledujúcim spôsobom. DNA sa najskôr rozpustí v pufre, potom sa pridá peptid a po 20 minútach sa pridá silne koncentrovaný roztok katiónových lipidov (20 alebo 40 mM) a zmes sa mieša. Po pridaní všetkých týchto zložiek zmes obsahuje DNA, peptid a katiónový lipid, 150 mM NaCl, 5 % D- glukózu a 5 mM MES s pH 6,2. V prípade dvoch posledných sérií s lipopolyamínom C (RPR 120535), ako vehikulom na injikovanie sa používa 75 mM NaCl a 150 mM NaCl a 5 % Dglukóza. Injikovanie sa uskutočňuje po 20 až 30 minútach od prípravy roztoku.

V tabuľkách 9 a 10 je uvedené zloženie kompozície, ktorá sa injikuje do nádoru 7 dní po implantácii. U myší sa vykoná anestézia pred injikovaním pomocou zmesi 130 mg Ketamínu a 4 mg Xylazínu na jeden kilogram myši.

Dva dni po injekcii sa tkanivo odoberie, rozseká v 500 μί pufru (Promega Celí Lysis Buffer E153 A). Po odstredení (20 000 g v priebehu 10 minút) sa odoberie 10 ml vzorky na stanovenie aktivity luciferázy. Toto meranie sa uskutočňuje luminometrom Lumat LB 9501 (Berthold) v priebehu 10 sekúnd po prídavku 50 μί substrátu obsahujúceho luciferázu (Promega Luciferase Assay Substráte).

Aktivita sa vyjadrí v jednotkách RLU (relative lights units).

Tabuľka 9 uvádza výsledky získané v prítomnosti rozdielnych lipopolyamínov A, B, C alebo D a tabuľka 10 uvádza výsledky získané v prítomnosti PEI.

Tabuľka 9

plazmid \| peptid	katiónový lipid	výsledok RLU/aÄdar	rvi«r*t
H?/ nádor	[DNA\| 1 Ηβ/μΐ	re*.	pepc/ DNA w/w	reí.	nmol/ μσ DNA	priemer	odchýlka
20	2					0	0	5
20	2			A	1,8	142 300	121 419	5
20	2	H	1		1.8	301 730	243 166	5
30	2				3	99 775	128 726	6
30	2	K	1		3	L 340 460	1 771 624	5
7,5	0,5			A	3	88 712	49 314	5
7.S	C, 5	H	1		3	383 313	234 113	6
7,5	0.5	H	L,5			618 025	530 774	6
15	1	H	1			L 017 372	966 141	S
10	0,5	H	L,5	C		879 358	414 286	9
LQ	0,9	K	1,3	D	3	395 433	219 333	10
19,75	0,25			C	2	333 7QQ	126 036	6
18,75	0,25	Pr 2	0.3		2	1 04« 050	612 401	6
20	0.5			e	4	806 467	887 206	6
20	0,5	H	1	c	4	1 348 233	1 674 10«	S

Tabuľka 10

piaznid	peptid	polyetylén Lmín	výsledok RLtT/aídar	po£«t XVĹasat
inj< ran.	[DNA] yg/ni	rež.	pept·/ DNA v/w	val.	Eq	priemer	odchýlka
20	2					0	0	5
20	2			800 K	9	54 350	52 989	5
50	2			800 K	9	7 783	16 803	6
50	2	KÍ	1	800 K	9	62 230	71 462	S
50	2			800 K	12	6 733	16 493	6
50	2	KÍ	1	800 K	12	72 70Q	150 300	5
40	2			800 K	18	470	1 051	S
40	2	Hl	L	800 K	18	82 608	104 443	6
40	2			800 K	24	1 «30	3 645	5
40	2	Hl		800 K	24	49 790	63 942	5
10	0,9	KÍ	1,5	D	12	14 192	16 948	11
10	0,9	Hl	1. 5	C	12	12 942	22 8S3	11

Príklad 7

Prenos nukleovej kyseliny in vitro do buniek 3LL

Tento príklad opisuje prenos nukleových kyselín in vitro (na bunkovej kultúre) prostredníctvom kompozícií podľa vynálezu, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu, zlúčeninu podľa vynálezu vybranú z množiny derivátov protamínov a lipopolyamínov v 75 mM roztoku NaCl.

μί zmesi sa pripraví nasledujúcim postupom:

- 0,5 pg plazmidovej DNA pCMV-luc, 0,5 pg PRI alebo PR2 látky podľa vynálezu v roztoku 75 mM NaCl

- Lipopolyamin C (RPR 120535), jeho množstvo sa udáva v tabuľke 11 na každý pokus

-1.10⁵ buniek 3LL (v 250 μί kultivačnej pôdy DMEM s 10 % séra teľacieho plodu) sa inkubujú s predchádzajúcou zmesou pri teplote 37 °C pod atmosférou CO₂ počas 4 hodín. Pridá sa 500 pl kultivačnej pôdy a bunky sa znova uvedú na kultiváciu. Nasledujúci deň sa bunky premyjú a opäť vložia na 25 hodín do rovnakého kultivačného média, ktoré obsahuje 10 % séra teľacieho plodu. Bunky sa potom lyžujú v 100 μί pufra (Promega).

Aktivita luciferázy sa meria po pridaní 50 μί substrátu (Promega). Odpočítanie sa uskutočňuje na luminometri LB v jednotkách RLU (relative lights units) za 10 sekúnd.

Výsledky pokusov s PRI a PR2 sú zhrnuté tabuľke 11 a 12.

Tabuľka 11

Lipopolyamín C/DNA	bez prípravku (RLU)	sPR2 (RLU)
4X	107 289	447 214
6X	77 396	1 182 641
8X	14 512	729 285

Tabuľka 12

Lipopolyamín C/DNA	bez prípravku (RLU)	s PR2 (RLU)
4X	12 037	6 304
6X	901	113 113
8X	328	294 743

Príklad 8

Injikovanie zahustených peptidov podľa vynálezu bez lipopolyfektantu do nádora in vivo

- myši typu Swiss/nude dospelé samice

- experimentálne indukované nádory po injekcii 10⁷ buniek 3T3 HER2 podkožnou cestou

- injikovanie zmesi kompozície 7 až 12 dní po injekcii buniek

Zahustený alebo nezahustený roztok DNA s peptidom sa injikuje priamo do nádora striekačkou typu Hamilton.

- dva dni po injekcii sa odoberie nádorové tkanivo, ktoré sa drví a homogenizuje v 750 μί pufra (Promega Celí Lysis Buffer E153 A). Po odstredení (20 000 g v priebehu 10 minút) sa odoberie 10 μί vzorky, ktorá slúži na posúdenie aktivity luciferázy meraním luminiscenčnej emisie získanej po zmiešaní s 50 μί reagentu (Promega Luciferase Assay Substráte) v luminometri Lumat LB 9501 (Berthold), integruje sa 10 sekúnd.

Výsledná aktivita je vyjadrená v jednotkách RLU (Relative Lights Units).

Protokol: 0,5 mg/ml DNA sa rozpusti v roztoku, ktorý obsahuje soli, pufer a glukózu v konečnom množstve, ktoré je uvedené v tabuľke výsledkov. Pred injikovaním je koncetrácia peptidu 1 mg v 1 ml vody. K roztoku sa pridá DNA v množstve dostatočnom na dosiahnutie určitého pomeru hmotnosť/hmotnosť. Pred injikovaním sa roztok inkubuje aspoň 20 minút pri teplote prostredia. Dávka na myš je 20 μί injekčného roztoku, ktorý obsahuje 10 μί DNA.

Tabuľka 13

pufor	peptid	výsledok RUJ / nldór	počet zvierat
NaCl/glu/ MES nebo HEPES S aM	ref.	peptid/DHA w/w	príeeer	odchýlka
150/KEFES			1 60» 930	1 360 072	6
	nls-H	0,02	6 619 100	S 060 709	6
150/S/HW KS			369 S63	577 901	6·
	nla-Hl	0.1	1 654 313	2 145 147	6»
	ula-Hl	0.02	4 031 000	1 007 396	6*
			931 375	214 229	4
	H	0,1	3 420412	1 205 704	6

* myši uspané zmesou Imalgén + Rompun (130 mg/kg Ketamínu, 4 mg/kg Xylazinu, intraperitoneálnou cestou) Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie (1) podávateľ (A) Meno: RHÔNE POULENC RORER S.A.

(B) Ulica: 20, Avenue Raymond Aron (C) Mesto: Antony (D) Krajina: Francúzsko (E) Smerovacie číslo: 92165 (F) Telefón: 40 91 69 22 (H) Fax: 4091 72 96 (ii) názov vynálezu: Prostriedky obsahujúce amínové kyseliny, ich príprava a použitie (iii) počet sekvencií: 9 (iv) spôsob lúštenia počítačom (A) Typ nosiča: tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilný (C) systém využitia: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentr Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 1:

(1) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 9 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 2:

(1) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 8 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

Ala Thr Pro Ala Lys Lys Ala Ala (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 3:

(1) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 16 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

Ala Thr Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Thr Pro Ala Lys Lys 5 10

Ala Ala (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 4:

(1) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 18 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys Pro Lys Thr Pro Lys Lys 5 10

Ala Lys Lys Pro (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 17 aminokyselín

SK 281543 Β6 (B) typ: aminokyselina (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:

Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala

10

Lys Lys Pro (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 6:

(1) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 26 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:

Lys Lys Ala Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Ala Ala Lys Pro

10

Lys Lys Ala Pro Lys Ser Pro Ala Lys Ala Lys Ala 15 20 25 (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 7:

(1) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 18 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 7: Ser Arg Ser Aig Tyr lýr Arg Gin Arg Gin Arg Ser Aig Arg

10

AigAigAigAig (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 8:

(1) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 21 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 8: Arg Arg Arg Leu His Arg íle His Arg Arg Gin His Arg Ser 5 10

Cys Arg Arg Arg Lys Arg Arg

20 (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 9:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 26 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 9: Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Lys Thr Pro Lys Lys Ala

10

Lys Lys Pro Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys Pro 15 20 25

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozícia na transfekciu nukleovej kyseliny a obsahujúca okrem uvedenej nukleovej kyseliny transfekčné činidlo a aspoň jednu zlúčeninu pôsobiacu na úrovni kondenzácie uvedenej nukleovej kyseliny, v y z n a í u j ú c a sa tým, že uvedená zlúčenina je tvorená celkom alebo čiastočne peptidovými motívmi KTPKKAKKP a/alebo ATPAKKAA opakujúcimi sa kon tinuálne alebo nekontinuálne, pričom počet týchto motívov sa môže pohybovať medzi 2 a 10, alebo je tvorená oligopeptidom zvoleným z množiny zahrnujúcej SRSRYYRQRQRSRRRRRR(COOH) a RRRLHRIH RRQHRSCRRRKRR(COOH).
2. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 1, v y značujúca sa tým, že peptidové motívy môžu byť medzi sebou oddelené väzbami biochemickej povahy typu aminokyselín a/alebo väzbami chemickej povahy.
3. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že väzbami biochemickej povahy sú väzby tvorené jednou alebo niekoľkými aminokyselinami.
4. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 3, v y značujúca sa tým, že zlúčeninou je histón Hl alebo jeho časť.
5. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 4, v y značujúca sa tým, že zlúčeninou je C-koncová oblasť histónu Hl alebo jej časť.
6. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 4 alebo 5, vyznačujúca sa tým, že zlúčeninou je výhodne oligopeptid zvolený z množiny zahrnujúcej (KTPKKAKKP)₂(COOH), ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH) a KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH).
7. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov laž 3, vyznačujúca sa tým, že zlúčeninou je N-koncová oblasť nukleolínu alebo jej časť.
8. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 7, v y značujúca sa tým, že zlúčeninou je peptid (ATPAKKAA)₂- (COOH).
9. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že uvedená zlúčenina má štruktúru skladaného listu beta, v ’·
10. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nái rokov laž 9, vyznačujúca sa tým,že uvedená zlúčenina je navyše združená s ligandom bunkového receptora.
11. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým,že zlúčeninou je histón Hl alebo jeho časť, združený alebo združená so signálnou sekvenciou jadrovej lokalizácie.
12. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 11, vyznačujúca sa tým, že zlúčeninou je peptid PKKKRKV-bAla-(KTPKKAKKP)2(COOH).
13. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov laž 12, vyznačujúca sa tým, že uvedená zlúčenina je navyše združená s peptidom typu fuzogénu podporujúceho bunkovú transfekciu uvedenej kompozície.
14. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov laž 13, vyznačujúca sa tým, že uvedená zlúčenina je navyše polyglykozylovaná, sulfónovaná, fosforylovaná a/alebo navrúbľovaná na komplexné cukry alebo na lipofilné činidlo.
15. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa t ý m , že transfekčným činidlom je katiónový polymér alebo lipofektant.
16. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 15, vyznačujúca sa tým, že lipofektantomje lipid schopný tvoriť lipozómy, latentné lipozómy, imunolipozómy alebo cieľové lipozómy.
17. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 15, vyznačujúca sa tým, že katiónovým polymérom je výhodne zlúčenina všeobecného vzorca (I) |íHCH2)rI R

-Jp (i), v ktorom R môže znamenať atóm vodíka alebo skupinu všeobecného vzorca <CH2)n-b· pričom n znamená celé číslo medzi 2 a 10, p a q znamenajú celé čísla a súčet p + q má takú hodnotu, že stredná molekulová hmotnosť polyméru leží medzi 100 a 10⁷.
18. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 15, vyzná í u j ú c a sa tým, že katiónový polymér je zvolený z množiny zahrnujúcej polyletylénimín (PEI) a polypropylénimín (PP1).
19. Farmaceutická kompozícia podľa nároku ^vyznačujúca sa tým, že polymér je zvolený z množiny zahrnujúcej polyetylénimin so strednou molekulovou hmotnosťou 50 000 (PEI50K) a polypropylénimín so strednou molekulovou hmotnosťou 800 000 (PEI800K).
20. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 15, vyzná ŕ u j ú c a sa tým, že lipofektant obsahuje aspoň jednu polyamínovú oblasť všeobecného vzorca (II)

H₂N-(-(CH)_m-NH)„-H (II), v ktorom m znamená celé číslo väčšie alebo rovné 2 a n znamená celé číslo väčšie alebo rovné 1, pričom hodnota m sa môže meniť pre rôzne uhlíkaté skupiny obsiahnuté medzi dvoma amínovými skupinami, ktorá je kovalentne viazaná k lipofilnej oblasti typu nasýteného alebo nenasýteného uhľovodíkového reťazca cholesterolu, alebo prírodný alebo syntetický lipid schopný tvoriť lamerálne alebo hexagonálne fázy.
21. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 20, v y značujúca sa tým, že polyamínová oblasť je tvorená spermínom, thermínom alebo niektorým z ich analógov, pri ktorých sú zachované ich väzbové vlastnosti k nukleovej kyseline.
22. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 20, v y značujúca sa tým, že lipofektant obsahuje aspoň jednu lipofilnú oblasť všeobecného vzorca (IV) v ktorom X a X' znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm kyslíka, metylénovú skupinu -(CH₂)q, kde q je rovné 0,

1,2 alebo 3, alebo aminoskupinu -NH- alebo -NR'-, kde R' znamená alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, Y a Y’ znamenajú nezávisle jeden od druhého metylénovú skupinu, karbonylovú skupinu alebo skupinu C=S, R³, R⁴ a R⁵ znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm vodíka, alebo prípadne substituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, p sa môže meniť medzi 0 a 5 a R⁶ znamená derivát cholesterolu alebo alkylaminoskupinu NR*R², v ktorej R¹ a R² znamenajú nezávisle jeden od druhého lineárnu alebo rozvetvenú, nasýtenú alebo nena sýtenú alifatickú skupinu obsahujúcu 12 až 22 uhlíkových atómov.
23. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 20, v y značujúca sa tým, že ide olipopolyamín zvolený z množiny zahrnujúcej dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS) a 5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidyletanol amínu (DPPES), 2,5-bis-(3-aminopropylamino)pentyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát a 1,3-bis(3-aminopropylamino)-2-propyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetát {H₂N(CH₂)₃} ₂N(CH₂)₄N {(CH₂)₃NH₂) (CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₇-CH₃]₂, H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₈]₂alebo H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COArgN[(ch₂)₁₈],
24. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 15 a 20 až 23, vyznačujúca sa t ý m , že transfekčným činidlom je dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS).
25. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa t ý m , že nukleovou kyselinou je dezoxyribonukleová kyselina.
26. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 24, vyznačujúca sa tým, že nukleovou kyselinou je ribonukleová kyselina.
27. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 25 alebo 26, vyznačujúca sa tým, že nukleová kyselina je chemicky modifikovaná.
28. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 25, 26 alebo 27, vyznačujúca sa tým,že nukleová kyselina je antimediátorová.
29. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 25 až 27, vyznačujúca sa tým, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gén.
30. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa t ý m , žc navyše obsahuje jeden alebo niekoľko neutrálnych lipidov.
31. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 30, v y značujúca sa tým, že lipid alebo lipidy sú zvolené z množiny zahrnujúcej syntetické alebo prírodné lipidy zwiteriónového typu alebo zbavené náboja pri fyziologických podmienkach.
32. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 30 alebo 31,vyznačujúci sa tým, že neutrálny lipid alebo lipidy sú zvolené z množiny zahrnujúcej dioleylfosfatidyletanolamín (DOPE), oleoyl-palmitoylfosfatidyletanolamín (POPE), distearyl, palmitoyl, myristoylfosfatidyletanolamín a ich 1- až 3-násobné N-metylované deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykozyldiacylglyceroly cerebrozidy (ako predovšetkým galaktocerebrozidy), sfingolipidy (ako predovšetkým sfingomyelíny) a asialogangliozidy (ako predovšetkým asialoGMl a GM2).