KR100857389B1

KR100857389B1 - Ａｐ-ｇｒｒ 펩티드 또는 ａｐ-ｇｒｒ 펩티드를 포함하는펩티드사슬 및 이를 포함하는 약물전달담체

Info

Publication number: KR100857389B1
Application number: KR1020060119415A
Authority: KR
Inventors: 박주영; 류주희; 김용진; 임형준; 김준오
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2008-09-11
Also published as: KR20080003177A

Abstract

본 발명은 새로운 세포 투과 펩티드인 AP-GRR 펩티드(서열번호 1) 또는 상기 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 생리활성유효성분이 공유결합된 공유결합체 상기 펩티드 또는 상기 펩티드를 포함하는 펩티드사슬로 변형된 지질 구조체 또는 고분자 입자를 포함하는 약물전달담체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 약물전달담체에 안정화제가 더 포함된 약물전달담체에 관한 것이다.

본 발명의 생리활성유효성분 혹은 약물전달담체는 그 표면에 AP-GRR 펩티드 부분을 노출시킴으로써 AP-GRR 펩티드의 막투과성 기능을 효과적으로 발휘시켜 생체내 전달 기능을 높임으로 전달하고자 하는 생리활성유효성분의 생체이용률을 높일 수 있다.

GRR 펩티드, 약물전달담체, 공유결합체, 생체이용률, 전달효율

Description

ＡＰ-ＧＲＲ 펩티드 또는 ＡＰ-ＧＲＲ 펩티드를 포함하는 펩티드사슬 및 이를 포함하는 약물전달담체 {AP-GRR peptide or peptide chain containing AP-GRR peptide, and drug-delivery carrier comprising the same}

도 1은 AP-GRR 펩티드를 표면 도입시킨 약물전달담체가 세포막과 상호작용하여 세포 내에 물질을 방출하는 현상을 개략적으로 나타낸 모식도이다.

도 2는 AP-GRR 펩티드를 표면 도입시킨 약물전달담체를 투과전자현미경으로 관찰하여 얻은 이미지를 나타낸 그림이다.

도 3은 AP-GRR 펩티드를 표면 도입시킨 약물전달담체에 칼세인을 봉입하여 전달하였을 경우 세포 내 이입된 칼세인의 양을 FACS로 분석한 결과를 나타낸 그림이다.

도 4는 AP-GRR 펩티드를 표면 도입시킨 약물전달담체에 RITC를 봉입하여, 생체 외 실험에서 피부 투과 전달 정도를 분석하기 위하여 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하여 얻은 이미지를 나타낸 그림이다.

도 5는 AP-GRR 펩티드를 단순 혼합시키지 않고 약물전달담체의 표면에 도입시킨 것의 효과를 평가하기 위한 실험에서 세포 내 칼세인의 형광 세기 정도를 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 다른 생체막 투과 펩티드에 대한 AP-GRR 펩티드의 우수성을 확인하기 위한 실험에서 세포 내 칼세인의 형광 세기 정도를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 AP-GRR 펩티드를 표면 도입시킨 약물전달담체의 동물피부 투과능에 대한 생체 내(in vivo) 평가를 위하여, AP-GRR 펩티드를 표면 도입시킨 약물전달담체에 담지된 RITC의 경우(a) 및 약물전달담체에 담지되지 않은 RITC의 경우(b)의 기니아 피그 피부를 공초점 레이저주사현미경으로 관찰하여 얻은 이미지를 나타낸 그림이다.

최근 나노입자를 이용한 약물전달담체의 유용성이 대두되면서, 생체 내 치료 부위에 약물 혹은 생물학적 활성 분자를 전달하기 위하여 다양한 인지질 소재 및 고분자의 합성을 통해 리포좀, 나노캡슐, 나노입자, 나노 에멀젼 등과 같은 보다 효과적인 나노구조체를 제조하려는 연구들이 주목 받고 있다. 특히, 고분자 나노입 자가 생체세포에 점착하는 효율을 향상시키기 위하여 나노입자의 표면에 세포를 인식할 수 있는 점착분자를 접목시키고자 하는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 예를 들어, 난용성 약물을 가용화시킨 뒤 그 생체이용율을 증진시키기 위한 것이나, 단백질이나 유전자와 같은 거대 분자량의 약물의 생체내 흡수를 용이하게 하기 위한 것이나, 암 등의 난치성 질환에 사용하는 약물을 표적 세포에 특이적으로 전달하기 위해 세포인식 또는 세포점착 분자가 도입된 고분자 나노입자 혹은 리포좀에 대한 연구가 진행되고 있다.

상기 세포인식 또는 세포점착 분자로는 당쇄, 항체, 펩티드 등을 들 수 있으며, 이를 약물전달에 응용하려는 시도로서 고분자 약물전구체의 개념이 많이 활용되고 있다. 1977년 링스도르프(Ringsdorf)는 수용성 약물과 세포인식 분자 등을 하나의 고분자 사슬에 도입시킨 기능성 고분자를 약물전달에 사용하였으며(H. Ringsdorf, J. Polymer Science(1977) 51, 155), 코페첵(Kopecek) 등은 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide)(HPMA)의 측쇄에 단일클론 항체나 간세포 특이성을 지닌 당쇄 등을 도입시킨 뒤, 리소좀(lysosome) 안에 있는 효소에 의해 특이적으로 절단되는 펩티드 결합을 이용하여 약물을 고분자 사슬에 공유결합시킨 바 있다(R. Duncan et al., Biochem. Biophys. Acta.(1983) 755, 518; P. A. Flanagan et al. Biochem. Biophys. Acta.(1989) 39, 1125; D. Putnam and J. Kopecek, J. Adv. Polymn. Sci.(1995) 122, 55).

특히 1990년대 이후에는 세포점착 분자를 고분자 나노입자에 도입하는 연구들이 활발히 이루어지고 있다. 티. 아카이케(T. Akaike) 등은 간실질세포(肝實質細胞)인 헤파토사이트(hepatocyte)의 세포표면에 존재하는 아시알로글리코프로테인(asialoglycoprotein) 수용체와 강한 결합력을 지니는 것으로 알려진 갈락토스(galactose) 분자를 소수성 고분자 사슬에 도입시킨 N-p-비닐벤질-O-베타-D-갈락토피라노실-(1,4)-D-글루콘아미드(N-p-Vinylbenzyl-O-beta-D-galactopyranosyl-(1,4)-D-gluconamide)를 새로이 합성한 후, 수용액 상에서 소수성 고분자와 친수성 갈락토스의 상분리 현상을 이용하여 나노입자를 제조하였다. 이들 나노입자에 대한 생체 외(in vitro) 세포실험과 생체 내(in vivo) 세포실험의 결과, 상기의 나노입자는 간 조직을 구성하는 세포 중 쿠퍼(Kupper) 세포와 같은 비실질세포에는 흡수되지 않고, 헤파토사이트에만 선택적으로 흡수된다는 사실이 관찰되었다(S. Tobe et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.(1992) 184, 225; K. Kobayashi et al., Macromolecules(1997) 30, 2016). 한편, 엠. 하시다(M. Hashida) 등은 대식세포(macrophage)에 대한 결합력을 가지는 C-타입의 렉틴계에 속하는 만노스(mannose) 수용체를 도입하여 콜레스테롤 유도체인 콜레스텐-5-일옥시-N-(4-((1-이미노-2-베타-D-티오만노실에틸)아미노)부틸)포름아미드(cholesten-5-yloxy-N-(4-((1-imino-2-beta-D-thiomannosylethyl)amino)butyl)formamide)(Man-C4-Chol)를 합성하였고, 이를 리포좀에 삽입시켜 대식세포로의 표적지향성을 향상시켰다(P. Opanasopit et al., Biochem. Biophys. Acta.(2001) 1511, 134).

한편, 상기의 세포 내이입(endocytosis) 이외에도, 임포트 세포 신호(import cell signaling) 역할을 감당하는 펩티드에 의해 거대분자가 에너지 비의존적으로 진핵 세포의 세포 막을 투과하여 효율적으로 세포 내로 도입된다는 것이 밝혀지게 되면서, 최근 바이러스의 표면에 존재하는 막투과성 단백질 내지 펩티드를 이용하여 단백질과 같은 거대분자나 리포좀, 나노입자 등의 세포 내 투과성을 향상시키고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다(M. Lindgren et al., Trends in Pharmacological Sciences(2000) 21, 99). 이는 낮은 생체막 투과성과 비교적 빠른 생체 내 반감기로 인하여, 약물로서의 사용에 있어서 많은 한계가 있었던 치료용 단백질이나 유전자와 같은 거대 분자들의 약제학적 가치를 높일 수 있다는 점에서 높게 평가된다. 에스. 알. 슈바르츠(S. R. Schwarze) 등은 세포막 투과성 펩티드가 내피세포(endothelial cells)의 단일막(monolayer)으로 구성된 뇌혈관장벽(blood-brain barrier)을 통한 큰 분자량의 약물전달에도 사용될 수 있을 것임을 보고하였고(S. R. Schwarze et al., Science(1999) 285, 1569), 씨. 루젤(C. Rousselle) 등은 항암제인 독소루비신(doxorubicin)에 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 D-페네트라틴(D-penetratin, 모든 아미노산이 D-형태로 구성됨)과 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 SynB1이라는 막투과성 펩티드를 결합하여 뇌혈관장벽을 통과시키는 연구를 수행한 바 있다(C. Rousselle et al., Molecular Pharmacology(2000) 57, 679).

이러한 세포막 투과기능을 지닌 펩티드는 주로 단백질에서 유도된 막투과성 펩티드인데, 크게 세 가지 종류로 분류될 수 있다. 첫째는 호메오도메인(homeodomain)에서 유래된 펩티드인 페네트라틴(penetratin)으로, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다. 이는 초파리(Drosophila)의 호메오단백질(homeoprotein)인 안테나페디아(Antennapedia)의 호메오도메인에서 발견되었으며(A. Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,(1991) 88, 1864), 여기서 호메오단백질이란 일종의 전사인자로서 호메오도메인이라고 불리우는 DNA와 결합할 수 있는 60개 정도의 아미노산 구조를 지니고 있다. 둘째는 후천성 면역결핍증후군(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)을 발생시키는 균주인 인간 면역결핍 바이러스 타입-1(human immunodeficiency virus, HIV-1)의 전사관련 단백질인 Tat 단백질의 49-57 번째 사이에 존재하는 Tat_49-57펩티드로서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 지닌다(P. A. Wender et al., PNAS(2000) 97, 24, 13003-13008). 셋째는 생체막 전위사슬(membrane translocating sequence, 이하 MTS로 명명함) 또는 신호사슬(signal sequences)에 기반한 펩티드로서, RNA에 의해 새로이 합성된 단백질을 생체 내의 적합한 소기관(organelle)들의 막으로 위치시켜주는 것을 돕는 수용체 단백질(acceptor protein)에 의해 인식되며, 핵 국소화 신호(nuclear localization signal, 이하 NLS로 명명함)와 결합된 MTS는 몇 가지 종류의 세포에서 세포막을 통과하여 세포 핵에 축적된다는 것이 밝혀졌다. 예를 들면, 핵 전사 요소 카파 B(nuclear transcription factor kappa B(NF-κB)), 원숭이바이러스 40 T 항원(Simian virus 40(SV40) T-antige) 또는 카포시육종 섬유아세포 성장 인자1(Kaposi sarcoma fibroblast growth factor 1(이하, K-FGF로 명명함))로부터 유래된 NLS 펩티드와 결합된 K-FGF, 인간 베타3 인테그린(human beta3 integrin), HIV-1 gp41 등의 신호 사슬의 소수성 영역으로부터 유래된 MTS들에 있어서 상기의 사실이 확인된 바 있다(Y. Lin et al., J. Biol. Chem.(1996) 271, 5305; X. Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1996) 93, 11819; M. C. Morris et al. Nucleic Acids Res.(1997) 25, 2730; L. Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1998) 95, 9184; Chaloin et al., Biochiem. Biochim. Res. Commun.(1998) 243, 601; Y. Lin et al., J. Biol. Chem. (1995) 270, 14255).

이러한 펩티드들은 전달하고자 하는 약물, 올리고 펩티드, 유전자 혹은 단백질 등과 결합하여 세포에 근접하였을 경우에 임포트 신호(import signal)로 작용하고, 전달하고자 하는 생리활성 효능 물질을 세포 내로 유입되도록 유도한다. 엠. 로하스(M. Rojas) 등은 Grb2SH2 도메인을 포함하고 있는 융합 단백질의 표피성장인자 자극 신호(EGF-stimulated signaling) 경로에 대한 세포 내 효과를 연구하기 위해, 수송 펩티드인 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 신호사슬 펩티드가 접목된 글루타티온-S-트란스페라제-Grb2SH2(Glutathione-S-transferase-Grb2SH2) 융합 단백질(41 kDa)에 대한 연구를 수행한 바 있고(M. Rojas et al., Nature Biotech(1998) 16, 370), 에스. 파웰(S. Fawell) 등은 내재화(internalization) 효율을 조절하는 것으로서 단백질 합성을 저해하는 연구에 의한 세포 독성을 검출하기 위해 Tat 단백질의 32-72 번째 사슬을 RNase A에 접목시키는 연구를 수행한 바 있다(S. Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1994) 91, 664). 또한엠. 로하스(M. Rojas) 등은 SAA 세포에서 펩티드에 붙어있는 Grb2SH2의 세포 내 전달에 의한 Grb2 단백질의 인산화 효과를 연구하기 위해 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 신호사슬 펩티드를 SHC Tyr 317 영역(12 residues)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있고(M. Rojas et al., Biochiem. Biochim. Res. Commun.(1997) 234, 675), 제이. 욀케(J. Oehlke) 등은 양친수성 모델 펩티드의 세포로의 이동력을 시험하기 위해 양친수성 모델 펩티드인 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 SV40 large T 항원에 접목시키는 연구를 수행한 바 있으며(J. Oehlke et al., Biochim. Biophys. Acta(1998) 1414, 127), 엘. 테오도르(L. Theodore) 등은 살아있는 신경세포의 PKC 활성을 억제하기 위해 페네트라틴을PKC 가성-기질(pseudo-substrate)(14 residues)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있다(T. Theodore et al., J. Neurosci.(1995) 15, 7158). 에스. 칼벳(S. Calvet) 등은 살아있는 신경세포의 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, 이하 FGF라 명명함) 수용체 신호계를 억제하기 위해 페네트라틴을FGF 수용체 포스포펩티드(FGF receptor phosphopetide)(9 residues)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있고(S. Calvet et al., J. Neurosci.(1998) 18, 9751), 엠. 씨. 모리스(M. C. Morris) 등은 벡터 펩티드에 의한 세포 내 전달을 검출하기 위해 신호사슬의 일종인 MPG를 HIV 자연 프라이머 결합부위(natural primer binding site)(36-mer)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있다(M. C. Morris et al., Nucleic Acid Res.(1997) 25, 2730). 비. 알린퀀트(B. Allinquant) 등은 신경돌기 생장에 대한 효과를 연구하기 위한 아밀로이드 전구 단백질을 감소 조정하기 위해 페네트라틴을 APP 안티센스(antisense)(25-mer)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있고(B. Allinquant et al., J. Cell Biol.(1995) 128, 919), 에스. 도카(S. Dokka) 등은 합성된 임포트 신호에 결합을 시킴으로써 올리고 핵산염의 전달 가능성을 설명하기 위해 신호사슬 펩티드인 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 10개의 올리고 핵산염에 접목시키는 연구를 수행한 바 있으며(S. Dokka et al., Pharm. Res.(1997) 14, 1759), 엠. 푸가(M. Pooga) 등은 갈라닌(galanin) 수용체 수준을 조정하고 통증 전달(pain transmission)을 변경하기 위해 페네트라틴과 트랜스포탄(transportan)을 갈라닌 수용체 안티센스(galanin receptor antisense, 21-mer)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있다(M. Pooga et al., Nature Biotech.(1998) 16, 857).

현재까지 연구되어 오고 있는 막투과성 펩티드 중에서 상대적으로 전달 효율이 가장 뛰어나며 연구가 가장 활발히 이루어진 펩티드는 Tat 단백질의 49-57 번째 아미노산 사슬로(서열번호 4) 이 아미노산 사슬에 여러 가지 종류의 전달하고자 하는 물질을 결합 시켜 세포 내 전달을 시도하고자 한 연구가 진행되어 왔는데, 그 세포 내로의 전달대상이 된 분자들로는 인간 파필로마바이러스-16 억제제(Inhibitor of human papillomavirus type 16(HPV-16)), Cdk 억제제 p27^Kip1, p16^INK4a, 카파제-3(capase-3) 단백질, 주조직적합복합체 class I 경로(MHC class I pathway)로의 오브알부민(ovalbumin), 및 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase) 등이 있다. 이외에도 아르기닌이 풍부한 Tat 단백질의 48-60 번째 아미노산 사슬을 이용하여 세포 내로의 유입이 필요한 분자의 전달을 모색하는 연구들이 활발하게 진행되고 있는 바, DNA, 거대 분자, 단백질, 약물, 항원, 항체 등을 세포 내로 유입시키고자 하는 연구가 있었다.

한편, 더욱 높은 전달 효율을 위해 안정화된 약물전달담체에 대한 연구가 있었다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 세포 투과 기능을 가지는 새로운 펩티드 또는 그 펩티드를 포함하는 펩티드 사슬을 약물이나 약물전달담체에 결합시켜, 이를 이용하여 세포 내로의 침투가 용이한 약물 혹은 약물전달담체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 약물전달담체에 pH-민감 안정화제를 삽입시켜 더욱효율적으로 전달되고 효과적으로 약물을 방출하는 약물전달담체를 제공하는 것을또 다른 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 투과 펩티드로서, Gly(Arg)n Gly Tyr Lys Cys의 서열(n = 1 내지 20)을 가지는 것을 특징으로 하는 AP-GRR 펩티드를 제공한다.

상기 본 발명의 AP-GRR 펩티드에 있어서, 상기 n은 3 내지 9임을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 AP-GRR 펩티드에 있어서, 상기 서열은 서열번호 1의 서열인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 약물전달을 위한 공유결합체로서, 상기 AP-GRR 펩티드 또는AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 생리활성유효성분이 공유결합된 것을 특징으로 하는 공유결합체를 제공한다.

본 발명은 약물전달담체로서, AP-GRR 펩티드 또는AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 공유결합된 지질 구조체 또는 고분자 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달담체를 제공한다.

상기 본 발명의 약물전달담체는 안정화제를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 안정화제는 pH-민감성 안정화제인 것을특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 안정화제는 스티그마스테릴 헤미숙시네이트, 콜레스테롤 또는 콜레스테릴 헤미숙시네이트인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 지질 구조체는 리포좀 또는 에멀젼인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 리포좀 또는 에멀젼의 지질성분은 탄소수 12 내지 24의 지방산 사슬을 갖는 인지질류 또는 질소지질인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 인지질류는 난황레시틴(포스파티딜콜린), 대두 레시틴, 리조레시틴(lysolecithin), 스핑고마이엘린(sphingomyelin), 포스파티딘산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 디포스파티딜글리세롤, 카르디오리핀(cardiolipin), 플라즈마로겐의 천연인지질 이들 인지질로부터 통상의 방법에 의해 수득할 수 있는 수소첨가 생성물 디세틸포스페이트, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜세린, 엘레오스테아로일포스파티딜콜린, 엘레오스테아로일포스파티딜에탄올아민, 엘레오스테아로일포스파티딜세린의 합성 지질 및 이들의 가수분해에 의해 수득할 수 있는 지방산 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 인지질류의 조합은 포스파티딜콜린과 포스파티딜에탄올아민의 조합, 포스파티딜콜린과 포스파티딜글리세롤의 조합, 포스파티딜콜린과 포스파티딜이노시톨의 조합, 포스파티딜콜린과 포스파티딘산의 조합, 포스파티딜콜린과 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 조합, 또는 포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린의 조합인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 조합비는 최소성분에 대한 최대 성분의 혼합비율이 1:5 이하인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린의 조합의 조합비는 1~4 : 1~2 : 1~2 인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 지질성분은 전체 리포좀 분산액 또는 에멀젼 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 고분자 입자는 생체에 적합하고 염증이나 면역반응을 유발하지 않으며 생체 내에서 분해되고 그 분해산물 역시 생체 내에서 무해한 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 고분자 입자는 생분해성 지방 족 폴리에스테르계 고분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 고분자 입자는 락트산과 글리콜산을 기초로 하는 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 하기 화학식 1의 폴리(D,L-락트산)(poly(D,L-lactic acid)), 폴리(L-락트산), 폴리(D-락트산) 하기 화학식 2의 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리(D-락트산-co-글리콜산), 폴리(L-락트산-co-글리콜산) 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone)), 폴리(발레로락톤)(poly(valerolactone)), 폴리(히드록시 부티레이트)(poly(hydroxy butyrate)), 폴리(히드록시 발러레이트)(poly(hydroxy valerate)), 폴리(1,4-디옥산-2-온)(poly(1,4-dioxane-2-one)), 폴리(오르토 에스테르)(poly(ortho ester)) 및 이들의 단량체로부터 제조된 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

(상기 식에서 n은 2이상의 정수이다.)

(상기 식에서 m과 n은 서로 같거나 다른 2이상의 정수이다.)

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 분자량은 평균 500 내지 100,000인 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 AP-GRR 펩티드(A)와 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자(B)는 A-B형 또는 A-B-A형으로 공유결합되어 구성되는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 공유결합은 AP-GRR 펩티드 또는 AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 상기 리포좀, 에멀젼 또는 고분자 입자 사이에 염기, 링커 또는 멀티리간드 화합물을 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 약물전달담체에 있어서, 상기 약물전달담체의 평균입자직경은 1,000nm 이하인 것을특징으로 한다.

본 발명은 상기 약물전달담체를 리포좀 분산액 또는에멀젼, 고분자 입자 총 중량에 대하여 0.01~30중량%의 생리활성유효성분과 함께 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 피부외용제, 경구용 제제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 새롭게 고안된 뛰어난 생체막 투과성을 가진 GRR 펩티드로서 아르기닌이 풍부하고 양 말단에 각각 Glycine(Gly) 아미노산과Glycine(Gly)- Tyrosine(Tyr)- Lysine(Lys)- Cystein(Cys) 아미노산 사슬을 포함하는 펩티드를, 약물, 유전자, 올리고 펩티드, 단백질 등의 생리활성 유효성분 등에 결합된 형태나 리포좀, 고분자 나노입자, 인지질-고분자 복합체, 에멀젼 등 약물을 담지 할 수 있는 전달담체 표면에 개질화하여, 전달하고자 하는 물질을 경피, 경구, 주사제 등의 다양한 경로로 전달하였을 경우의 생체이용률(bioavailability)을 높이기 위한 것이다. AP-GRR 펩티드에 있어서 Gly(Arg)n Gly Tyr Lys Cys의 서열에서 Arg의 개수는 1 내지 20개, 바람직하게는, 3 내지 9개를 포함한다. 이는 높은 전달 효율을 가지면서 동시에 약물전달담체와 결합하여 제조하기에 용이하기 때문이다.

상기 AP-GRR 펩티드 또는 AP-GRR을 포함하는 펩티드사슬은 특별히 제한되지는 않지만, 예를 들어, 아미드 4-메틸벤지드릴아민 하이드로클로라이드(MBHA) 수지와 ABI 433 합성기기를 이용하여 Fmoc(N-(9-플루레닐)메톡시카르보닐)/t-부틸 방법을 따라 고체상 펩티드 합성법(solid phase peptide synthesis; SPPS)으로 합성할 수도 있다(M. Bodansky, A. Bodansky, The Practice of Peptide Synthesis; Springer:Berlin, Heidelberg, 1984, J.M. Stewart, J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nd ed; Pierce Chemical Co: Rockford. IL, 1984).

본 발명의 약물전달담체는 리포좀 또는 에멀젼, 고분자 입자 등의 구조체를 이용할 수 있다. 리포좀 또는 에멀젼을 제조함에 있어서, 지질 구조체의 지질성분으로는 탄소수가 12~24개의 지방산 사슬을 갖는인지질류나 질소지질이 사용될 수 있다. 이는 피부외용제, 경구용 제제, 주사제 등의 약제학적 조성물에 사용할 수 있는 지질 기반 약물전달담체의 구성성분으로 활용하기에 용이하기 때문이다.

일반적으로는 인지질이 더 바람직한데, 예를 들면, 난황 레시틴(포스파티딜콜린), 대두 레시틴, 리조레시틴(lysolecithin), 스핑고마이엘린(sphingomyelin), 포스파티딘산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 디포스파티딜글리세롤, 카르디오리핀(cardiolipin), 플라즈마로겐 등의 천연 인지질 이들 인지질로부터 통상의 방법에 의해 수득할 수 있는 수소첨가 생성물 및 디세틸포스페이트, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜세린, 엘레오스테아로일포스파티딜콜린, 엘레오스테아로일포스파티딜에탄올아민, 엘레오스테아로일포스파티딜세린 등의 합성 지질 및 이들의 가수분해에 의해 수득할 수 있는 지방산 혼합물이 바람직하다.

지질은 단독으로 사용할 수도있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다. 2종의 인지질류를 혼합하여 사용하는 경우, 바람직하게는 예를 들어, 하기의 조합들 포스파티딜콜린:포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린:포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린:포스파티딜이노시톨, 포스파티딜콜린:포스파티딘산, 포스파티딜콜린:디올레오일포스파티딜에탄올아민 등을 사용할 수 있다. 혼합 비율은 혼합되는 성분 구성에 따라 차이가 있는데, 최소 성분에 대한 최대 성분의 혼합비율은 1:5 이하인 것이 바람직하다. 이 경우 2종 이상의 인지질류를 혼합하여 지질기반 약물전달담체 제조시 용이하기 때문이다. 예를 들어, 포스파티딜콜린:디올레오일포스파티딜에탄올아민의 경우 각각 1:1 혹은 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 등의 몰비율로 다양하게 하여 제조할 수 있다. 또한, 3종의 인지질류를 혼합하여 사용하는 경우도, 예를 들어, 포스파티딜콜린:디올레오일포스파티딜에탄올아민:포스파티딜세린을 각각 1:1:1 혹은 2:1:1, 3:1:2, 3:2:1. 3:2:2. 4:1:1, 4:2:1 등의 몰비율로 다양한 혼합비로 제조할 수 있다.

상기한 약물전달담체의 지질성분은 전체 리포좀 분산액 또는 에멀젼 총 중량에 대하여 0.001~20 중량%, 바람직하게는 0.2~10 중량%의 양으로 사용한다. 이는 상기 함량의 경우 약물전달담체 제조에 용이하기 때문이다.

또한, 고분자 입자를 제조함에 있어서, 이는 생체에 적합하고, 염증이나 면역반응 등을 유발하지 않으면서 생체 내에서 분해될 뿐더러 그 분해산물 역시 생체 내에서 무해한 고분자이어야 한다. 이러한 조건을 만족하는 고분자로서 락트산과 글리콜산을 기본단위로 하는 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자가 미국식품의약국(FDA)에 의해 승인을 받은 고분자로서 가장 널리 이용되고 있다. 그 대표적인 예로서 상기 화학식 1의 폴리(D,L-락트산)(poly(D,L-lactic acid)), 폴리(L-락트산), 폴리(D-락트산)과 상기 화학식 2의 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리(D-락트산-co-글리콜산), 폴리(L-락트산-co-글리콜산), 및 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone)), 폴리(발레로락 톤)(poly(valerolactone)), 폴리(히드록시 부티레이트)(poly(hydroxy butyrate)), 폴리(히드록시 발러레이트)(poly(hydroxy valerate)), 폴리(1,4-디옥산-2-온)(poly(1,4-dioxane-2-one)), 폴리(오르토 에스테르)(poly(ortho ester)), 및 이들의 단량체로부터 제조된 공중합체 등을 들 수 있다.

상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 분자량은 특별히 제한되지 않으나, 500 미만이거나 100,000 초과시 약물전달담체로서의 구조 불안정성이 증가될 것으로 우려되므로, 중량 평균 분자량이 500 내지 100,000, 바람직하게는 5,000 내지 50,000인 것이 바람직하다.

상기 화학식 2의 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)의 경우에는 락트산과 글리콜산 단량체의 비율을 조절하거나, 고분자 합성과정을 변경시킴으로써 다양한 분해수명을 갖는 생분해성 고분자를 얻을수 있다. 이와 같은 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 약물전달담체 또는 수술용 봉합사로 오랫동안 사용되어 왔고, 그 생체적합성이 이미 증명된 바 있다.

상기 AP-GRR 펩티드와(A)과 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자(B)는 특별히 제한되지는 않지만, A-B형 또는 A-B-A 형으로 구성될 수 있다. 이는 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 양말단에 존재하는 카르복실기 및 수산화기를 공유결합에 용이하도록 다른 기능성 그룹(functional group)으로 치환시키고, 고분자의 치환된 말단을 이와 반응이 용이한 그룹을 가진 AP-GRR 펩티드의 말단기 또는 AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬의 말단기와 반응시켜 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 AP-GRR 펩티드 또는 AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬 과 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과의 공유결합체는 말레이미드로 치환된 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과 말단기를 티올로 치환한 AP-GRR 펩티드와의 공유결합을 통하여 합성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 공유결합은 특별히 제한되는 것은 아니지만, AP-GRR 펩티드 또는 AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 상기 리포좀, 에멀젼, 고분자 사이에 별도의 염기, 링커 또는 멀티리간드 화합물을 첨가하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, 안정화제는 pH-민감한 리포좀을 고안하기 위하여 pH-민감성 안정화제를 삽입하는 것이 바람직하다. pH-민감한 리포좀은 리소좀이 접근하여 분해가 일어나기 전에 세포질 또는 핵 내 목표 위치에 약물이 방출되도록 하기 위해 고안된 것이다. pH-민감한 리포좀은, 삽입된 pH-민감성 안정화제가 엔도좀 내부와 같은 산성 환경에서 프로톤화되어 더 이상 리포좀 안정성을 유지할 수 없게 되면 초기 엔도좀 단계에서 약물을 효과적으로 방출하게 된다. 현재까지 연구된 양친매성(amphiphile)의 pH-민감성 안정화제로는 팔미토일호모시스테인(palmytoylhomocyteine), 올레산, 콜레스테릴 헤미숙시네이트(cholesteryl hemisuccinate), 및 디올레오일숙시닐글리세롤(dioleoylsuccinylglycerol) 등이 있다. 본 발명에서는 새로운 pH-민감성 안정화제인 스티그마스테릴 헤미숙시네이트를 포함한다.

스티그마스테릴 헤미숙시네이트 합성 방법은 하기 반응식 1과 같다. 숙신 무수물을 0 ℃에서 메틸렌 클로라이드에 용해된 스티그마스테롤에 TEA 및 DMAP와 함께 첨가하고, 상기 혼합물을 리플럭스 하에서 4시간동안 교반한다. 이후 1N HCl, 물 및 식염수로 세척한 후, 상기 유기상을 재결정화시키고 진공상태에서 건조하면 스티그마스테릴 헤미숙시네이트가 합성된다.

또한, 본 발명에서 리포좀 제제의 안정성이나 조작성을 고려하여 스티그마스테릴 헤미숙시네이트, 콜레스테롤, 콜레스테릴 헤미숙시네이트 이외의 다양한 부형제 또는 안정화제와 같은 첨가제를 사용할 수도 있다.

본 발명의 약물전달담체 내상에 함입되는 생리활성성분은 생체에 적용할 수 있는 것이라면 수용성 또는 수불용성 등 그 종류에 제한이 없다. 예를 들어, 단일성분이나 동물 또는 식물이나 균주 추출물, 및 이들의 2종 이상이 포함된 혼합물일 수 있으며, 이는 목적과 경우에 따라 조절하여 사용할 수 있다. 미백 증진 또는 주름 및 노화 방지와 치료의 효능을 가진 성분 등이 사용될 수 있다. 이들 생리활성성분은 리포좀 분산액 또는 에멀젼, 고분자 입자 총 중량에 대하여 0.01~30중량%, 바람직하게는 0.1~20중량%의 양으로 함입될 수 있다. 이는 조성물의 피부외용제, 경구용 제제, 주사제 등 제형화에 용이한 함량이기 때문이다.

본 발명의 AP-GRR 펩티드를 이용하여 제조된 약물전달담체의 평균입자직경은 작을수록 바람직하며, 콜로이드의 안정성을 고려할 때, 최소한 1,000 nm 이하, 바람직하게는 500 nm 이하이다.

본 발명에서 제시하는 리포좀, 에멀젼, 고분자 등을제조하는 방법은 특별히 제한되지는 않지만, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 제시하는 지질 성분을 이용하여 생리활성성분이 함입된 약물전달담체를 형성하는 방법으로서는, 상기 인지질류와 안정화제를 유기용매에 용해시킨 뒤 용매를 증발, 감압시키며 지질 필름을 형성시키고 수용액을 가한 뒤 초음파를 가하는 방법 유기용매에 녹은 인지질류와 안정화제를 수용액에 분산시킨 뒤 초음파를 가하는 방법 인지질류와 안정화제를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 유기용매를 추출 또는 증발시키는 방법 인지질류와 안정화제를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 균질기 또는 고압유화기를 이용하여 강하게 교반하고 용매를 증발시키는 방법 인지질류와 안정화제를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 투석하는 방법 인지질류와 안정화제를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 서서히 물을 첨가하는 방법 등이 있다.

상기의 제조방법과 관련하여, 인지질류와 안정화제를 유기 용매에 용해시키기 위해서, 기계적 힘을 가하거나 20~100℃ 바람직하게는 70℃이하로 가열할 수 있다.

생리활성성분이 수용성인 경우, 생리활성성분을 물에녹이거나 수용액에 녹여서 상기 수용액 또는 물을 첨가하는 단계에서 함께 투여된다. 생리활성성분이 수불 용성인 경우에는, 생리활성성분을 유기 용매에 용해시킨 후 지질 성분이 있는 유기 용매상에 포함시켜 상기와 같은 방법으로 제조할 수 있다.

상기한 방법에서 인지질류와 안정화제 또는 수불용성 생리활성성분을 용해시키기 위해사용할 수 있는 유기 용매로는, 아세톤, 디메틸설폭시드, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 디옥산, 테트라히드로퓨란, 아세트산, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 메틸에틸케톤, 염화메틸렌, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 에틸에테르, 디에틸에테르, 헥산 및 석유에테르 중에서 선택된 1종 또는 이들을 혼합한 용매를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 제시하는 고분자 입자의 제조방법으로서는 고분자를 바로수용액에 분산시킨 뒤 초음파를 가하는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 유기용매를 추출 또는 증발시키는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 균질기 또는 고압유화기를 이용하여 강하게 교반하고 용매를 증발시키는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 투석하는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 서서히 물을 첨가하는 방법, 초임계 유체를 이용하여 제조하는 방법 등을 들 수 있다(T. Niwa et al., J. Pharm. Sci.(1994) 83, 5, 727-732; C. S. Cho et al., Biomaterials(1997) 18,323-326; T. Govender et al., J. Control. Rel.(1999) 57, 171-185; M. F. Zambaux et al., J. Control. Rel.(1998) 50, 31-40).

본 발명의 고분자 입자의 제조에 사용될 수 있는 유기용매로서는 아세톤, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 디옥산, 테트라히드로푸란, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 메틸에틸케톤, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 에틸에테르, 디에틸에테르, 헥산, 또는 페트롤리움 에테르를 포함한다. 이때 상기의 용매를 단독으로 사용하거나 또는 2 이상의 용매를 혼합하여 사용할 수 있다.

이하 실시예, 비교예 및 실험예를 기재하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 이하의 예에 나타나는 재료, 시약, 비용, 조작 등은 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 한 적절히 변경할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 이하에 나타내는 구체예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체 제조

AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬은 아미드 4-메틸벤지드릴아민 하이드로클로라이드(MBHA) 수지와 ABI 433 합성기기를 이용하여 Fmoc(N-(9-플루레닐)메톡시카르보닐)/t-부틸 방법을 따라 고체상 펩티드 합성법(solid phase peptide synthesis; SPPS)으로 합성하였으며, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Reverse High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 순도 90% 이상으로 정제하였다. 이를 질량 분석기(Agilent 1100 시리즈)로 분석한 결과 분자량을 측정함으로 성공적 합성 여부가 확인되었다. 이로써, AP-GRR 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 합성되었음을 확인하였다. 상기 AP-GRR를 표면에 도입한 지질 구조체 제조 과정은 아래와 같다.

포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민-말레이미드(1:1)(인지질)과 스 티그마스테릴 헤미숙시네이트 안정화제를 몰비율 3:2로 섞어 클로로포름:메탄올(95:5,부피/부피) 혼합 유기용매에 녹인 후, 감압하며 용매를 증발시켜 필름을 형성하였다. 유기용매가 제거된 필름에 생리활성성분으로서 정제수에 녹인 형광표지물질인 칼세인(Calcein)을 가한 후, 초음파를 가하여 리포좀 지질 분산액을 제조하였다. AP-GRR의 티올(thiol)기와 지질 기반 약물전달담체 표면에 도출된 말레이미드(maleimide) 기능기와 수분 동안 반응 시키어 AP-GRR 도입된 약물전달담체를 제조하였다.

제조된 AP-GRR 도입된 지질 기반 약물전달담체를 관찰하기 위하여 크라이요-투과전자현미경(Cyro-TEM)을 이용하여 약물전달담체의 형상을 관찰하고 얻은 이미지를 도 2에 나타내었다.

본 실시예 에서는 먼저, 형광표지물질로써 칼세인을 사용하여 상기약물전달담체를 제조하였으나, 로다민-비-이소시안네이트(Rhodamine-B-Isothiocyanate, 이하 RITC)를 담지 하기도 하였다. 하기 실시예 제조시 지질 분산액 중 지질 성분비는 각각 0.2, 2, 5, 10 중량%의 양으로 제조되었다. 하기 시험예에서 이용된 지질-기반 전달담체는 모두 0.2 중량%의 지질 성분비로 제조하여 이용되었다.

<시험예 1> AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체의 세포 내 전달능 평가

상기 실시예 1에서 제조된 칼세인 봉입된 AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체의 세포 내 전달능을 비교 평가하기 위하여, 대조군으로서 같은 농도의 칼세인 봉입된 포스파티딜콜린:콜레스테롤(몰비율 3:2)과 포스파티딜에탄올아민:스티그 마스테릴 헤미숙시네이트(몰비율 3:2)의 지질 구성으로 제조된 리포좀 2종을 준비하였다. 대조군 리포좀 2종을 포함한 총 준비된 3종 리포좀 시스템을 미리 배양된 COS-7 세포에 첨가하여 섭씨 37에서 4시간 동안 배양한 후 각 샘플군의 세포를 수거하여 PBS 액에 분산시킨 뒤, FACS 분석을 실시하였다. 분석 결과는 도 3에 나타내었다. 각각 도 3a는 포스파티딜콜린:콜레스테롤(몰비율 3:2), 도3b는 포스파티딜에탄올아민:스티그마스테릴 헤미숙시네이트(몰비율 3:2), 도 3c는(포스파티딜에탄올아민:포스파티딜에탄올아민-말레이미드):스티그마스테릴 헤미숙시네이트(몰비율 3:2)에AP-GRR 펩티드가 표면 도입된 약물전달담체로 인해 전달된 칼세인의 세포 내 전달량을 나타내는 것으로 AP-GRR 펩티드가 표면 도입된 약물전달담체의 경우 AP-GRR이 도입되지 않은 포스파티딜에탄올아민:스티그마스테릴 헤미숙시네이트(몰비율 3:2)의 전달시스템 보다 월등히 칼세인 전달량이 많은 것을 알 수 있으며, 전형적인 리포좀 구성인 포스파티딜콜린:콜레스테롤(몰비율 3:2) 리포좀의 전달량보다 월등히 뛰어남을 알 수 있다.

<시험예 2> AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체의 피부 투과 전달능 평가

상기 실시예 1에서 제조된 RITC 봉입된 AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체의 세포 내 전달능을 비교 평가하기 위하여 대조군으로서 같은 농도의 RITC 봉입된 포스파티딜콜린:콜레스테롤(몰비율 3:2)와 포스파티딜에탄올아민:스티그마스테릴 헤미숙시네이트(몰비율 3:2)의 지질 구성으로 제조된 리포좀 2종을 준비하였 다. 대조군 리포좀 2종을 포함한 총 준비된 3종 리포좀 시스템 분산액을 미리 준비된 프란츠 디퓨젼 셀(Franz Diffusion Cell) 위에 올려진 절편된 기니아 피그 피부 위에 동일량 도포하고 18 시간 동안 프란츠 디퓨젼 셀 내부에 인산 완충 용액(PBS)를 와류 시킨다. 18 시간 이후 피부를 수거하여 DI 워터로 4회 이상 씻어 준비 O.C.T. 화합물을 이용하여 섭씨 -26 이하로 동결 시킨 뒤 두께 10~18 마이크로미터로 잘라 슬라이드 글라스에 조직을 올려 놓는다. 남은 O.C.T. 화합물을 씻어 준 뒤, 커버 글라스를 덮고 바로 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)으로 관찰한다. 관찰하여 얻은 이미지는 도 4에 나타내었다. 각각 도 4a는 포스파티딜콜린:콜레스테롤(몰비율 3:2), 도 4b는 포스파티딜에탄올아민:스티그마스테릴 헤미숙시네이트(몰비율 3:2), 도 4c는(포스파티딜에탄올아민:포스파티딜에탄올아민-말레이미드):스티그마스테릴 헤미숙시네이트(몰비율 3:2)에AP-GRR 펩티드가 표면 도입된 약물전달담체로 인해 피부내 전달된 RITC의 세포 내 전달량을 나타내는 것으로 AP-GRR 펩티드가 표면 도입된 약물전달담체의 경우 AP-GRR이 도입되지 않은 포스파티딜에탄올아민:스티그마스테릴 헤미숙시네이트(몰비율 3:2)의 전달시스템 보다 월등히 RITC의 피부내 전달량이 많은 것을 알 수 있으며, 또한, 전형적인 리포좀 구성인 포스파티딜콜린:콜레스테롤(몰비율 3:2) 리포좀의 전달량 보다더 월등히 뛰어남을 알 수 있다. 특히, pH-둔감 리포좀인 포스파티딜콜린:콜레스테롤(몰비율 3:2) 리포좀의 경우, 다른 두 pH-민감 리포좀이 기저막까지 또는 표피세포 안으로 깊숙이 RITC를 전달하는 것과는 달리 형광강도가 거의 나타나지 않았다.

<시험예 3> AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체의 표면도입 효과 평가

AP-GRR 펩티드를 단순 혼합시키지 않고 약물전달담체의 표면에 도입시킨 효과를 평가하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 Calcein 봉입된 AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체 (AP-GRR conjugated), 다른 제조 방법은 동일하되 AP-GRR 펩티드를 포함하지 않은 약물전달담체 (Non-CPP), 및 AP-GRR 펩티드를 화학적으로 공유 결합시키지 않고 약물전달담체와 단순히 혼합시킨 (AP-GRR mix) 경우에 있어서 각각의 제조된 약물전달담체 분산액을 적당량 COS-7 (African Green Monkey Kidney Fibroblasts cell line)과HaCaT (Human keratinocyte cell line) 세포에 4시간 처리하였다. 이후, 약물전달담체에 담지되어있다가 세포 내 전달된 칼세인을 정량 분석하기 위하여, 세포를 떼어 내고 여러 번 씻은 후 세포막을 분해하여 96 웰로 옮겼다. 칼세인의 형광 세기 정도를 형광 멀티레이블 카운터 (fluorescent multilabel counter (Wallac victor, Ex/Em=488/535))를 이용하여 각각 비교, 분석한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, AP-GRR 펩티드가 공유결합된 약물전달담체에 의하여 세포 내 전달된 칼세인양이 다른 경우에 비해 월등히 많고, AP-GRR 펩티드를 약물전달담체와 단순히 혼합한 경우에는 AP-GRR 펩티드를 포함하지 않은 약물전달담체에 의한 칼세인 전달량과 비슷하게 나타났기 때문에, 이를 통하여 AP-GRR 펩티드에 의해 약물의 전달능을 높이기 위해서는 반드시 약물전달담체에 화학적 공유결합방법 등으로 표면 개질 되어야 그 기능을 제대로 발휘할 수 있음을 알 수 있었다.

<시험예 4> AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체와 다른 생체막 투과 펩티드를 포함하는 약물전달담체의 세포 내 전달능 비교 평가

다른 생체막 투과 펩티드에 대한 AP-GRR 펩티드의 우수성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 칼세인 봉입된 AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체 외에 AP-GRR 펩티드가 아닌 Tat 펩티드, 5R 펩티드, 9R 펩티드 및9r 펩티드를 각각 표면 도입시킨 약물전달담체, 그리고 펩티드를 표면 도입하지 않은 약물전달담체 (Non-CPP)를 제조하여 세포 내 전달량을 비교하였다. 상기 제조된 약물전달담체 분산액을 COS-7과 HaCaT 세포에 4 시간 처리하고, 약물전달담체를 처리하지 않은 COS-7 및 HaCaT 세포 (Non-treated)도 두었다. 각각의 경우 세포 내 전달된 칼세인을 정량 분석하기 위하여 세포를 떼어 내고 여러 번 씻은 후, 세포막을 분해하여 96 웰로 옮기고 칼세인의 형광 세기 정도를 형광 멀티레이블 카운터 (fluorescent multilabel counter (Wallac victor, Ex/Em=488/535))를 이용하여 비교, 분석하였다. 그 결과로서 도 6에 나타난 바와 같이, 생체막 투과성이 뛰어나다고 알려진 Tat 펩티드(RKKRRQRRR), 5R (RRRRR), 9R (RRRRRRRRR) 및 9r (rrrrrrrrr; r은 아르기닌 (R)의 D-form 이성질체를 나타냄.) 펩티드가 표면 도입된 약물전달담체에 의해서도 칼세인 전달능이 증진되었으나, AP-GRR 펩티드가 표면 도입된 약물전달담체에 의한 칼세인 전달능이 보다 월등히 뛰어남을 확인할 수 있었다.

<시험예 5> AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체의 동물 피부 투과능에 대한 생체 내(in vivo) 평가

상기 실시예 1에서 제조된 RITC 봉입된 AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체 분산액:PG를 8:2로 혼합한 것, 및 염이 없는 인산완충용액 (PBS):PG를 8:2로 혼합한 혼합액에 RITC를 녹인 것을 각각 거즈에 묻혀 in vivo로 기니아 피그 양쪽 등 피부에 첩포로 붙여 놓았다. 하루 지난 뒤 첩포를 떼어내고 피부를 DI 워터로 4회 이상 씻고 생체검사(biopsy)하였다. O.C.T. 화합물을 이용하여 -26℃ 이하로 동결 시킨 뒤 두께 10~18 마이크로미터로 잘라 슬라이드 글라스에 조직을 올려 놓고, 남은 O.C.T. 화합물을 씻어 준 뒤 커버 글라스를 덮고 바로 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)으로 관찰하였다. 관찰하여 얻은 이미지는 도 7에 나타내었다. AP-GRR 펩티드가 도입된 약물전달담체에 의해 전달된 RITC는 기저막 (basal membrane) 전까지 골고루 전달된 것으로 관찰되었으나, 약물전달담체에 담지되지 않은 RITC는 피부의 각질에만 축적된 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 AP-GRR 펩티드에 의해 담지된 물질 RITC의 전달능은 in vivo 피부에서도 그 효과가 뛰어나다는 것을 관찰할 수가 있었다.

본 발명은 새롭게 고안된 뛰어난 생체막 투과성을 가진 AP-GRR 펩티드를 포함하는 생리활성유효성분 혹은 AP-GRR 펩티드를 포함하는 약물전달담체에 관한 것으로, 막투과성 기능을 효과적으로 발휘하는 AP-GRR 펩티드를 도입함으로써 전달하고자 하는 물질의 세포 내 혹은 피부 투과적 전달량을 크게 증진 시킬 수 있는 약물전달담체에 관한 것이다. 그러므로 본 발명에서 제안하는 약물전달담체는 기존의 리포좀, 에멀젼과 같은 지질 구조체나 고분자 입자 혹은 약물, 단백질과 같은 거대 생리활성유효성분이 세포 내로 잘 유입되지 못하는 단점을, 생체막 투과증진 기능을 지닌 AP-GRR 펩티드 또는 AP-GRR펩티드를 포함하는 펩티드사슬을 도입하는 방법을 통해 극복하였다는 특징이 있다. 또한, pH-적정가능한 안정화제를 지질 구조체 또는 고분자 입자에 삽입하여 더욱 효과적인 전달 및 방출을 가능하게 하였다. 이러한 약물전달담체 안에 약물을 봉입하면, 전달하고자 하는 생리활성유효성분의 생체이용률(bioavailability)을 증진시킬 수 있는 효과적인 약물전달담체로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

<110> Amorepacific Corporation <120> AP-GRR peptide or peptide chain containing AP-GRR peptide, and drug-delivery carrier comprising the same <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Tyr Lys Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 2 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 3 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 4 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 5 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15

Claims

세포 투과 펩티드로서, Gly(Arg)n Gly Tyr Lys Cys의 서열(n = 1 내지 20)을 가지는 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 n은 3 내지 9임을 특징으로 하는 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 서열은 서열번호 1의 서열인 것을 특징으로 하는 펩티드.
약물전달을 위한 공유결합체로서, 제1항의 펩티드 또는 제1항의 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 생리활성유효성분이 공유결합된 것을 특징으로 하는 공유결합체.
약물전달담체로서, 제1항의 펩티드 또는 제1항의 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 공유결합된 지질 구조체 또는 고분자 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제5항에 있어서, 상기 약물전달담체는 안정화제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제6항에 있어서, 상기 안정화제는 pH-민감성 안정화제인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제6항에 있어서, 상기 안정화제는 스티그마스테릴 헤미숙시네이트, 콜레스테롤 또는 콜레스테릴 헤미숙시네이트인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제5항에 있어서, 상기 지질 구조체는 리포좀 또는 에멀젼인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제9항에 있어서, 상기 리포좀 또는 에멀젼의 지질성분은 탄소수 12 내지 24의 지방산 사슬을 갖는 인지질류 또는 질소지질인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제10항에 있어서, 상기 인지질류는 난황 레시틴(포스파티딜콜린), 대두 레시틴, 리조레시틴(lysolecithin), 스핑고마이엘린(sphingomyelin), 포스파티딘산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 디포스파티딜글리세롤, 카르디오리핀(cardiolipin), 플라즈마로겐의 천연인지질 이들 인지질로부터 통상의 방법에 의해 수득할 수 있는 수소첨가 생성물 디세틸포스페이트, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토 일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜세린, 엘레오스테아로일포스파티딜콜린, 엘레오스테아로일포스파티딜에탄올아민, 엘레오스테아로일포스파티딜세린의 합성 지질 및 이들의 가수분해에 의해 수득할 수 있는 지방산 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제11항에 있어서, 상기 인지질류의 조합은 포스파티딜콜린과 포스파티딜에탄올아민의 조합, 포스파티딜콜린과 포스파티딜글리세롤의 조합, 포스파티딜콜린과 포스파티딜이노시톨의 조합, 포스파티딜콜린과 포스파티딘산의 조합, 포스파티딜콜린과 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 조합, 또는 포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린의 조합인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제12항에 있어서, 상기 조합비는 최소 성분에 대한 최대 성분의 혼합비율이 1:5 이하인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제12항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린의 조합의 조합비는 1~4 : 1~2 : 1~2 인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제10항에 있어서, 상기 지질성분은 전체 리포좀 분산액 또는 에멀젼 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제5항에 있어서, 상기 고분자 입자는 생체에 적합하고 염증이나 면역반응을 유발하지 않으며 생체 내에서 분해되고 그 분해산물 역시 생체 내에서 무해한 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제16항에 있어서, 상기 고분자 입자는 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제17항에 있어서, 상기 고분자 입자는 락트산과 글리콜산을 기초로 하는 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제18항에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 하기 화학식 1의 폴리(D,L-락트산)(poly(D,L-lactic acid)), 폴리(L-락트산), 폴리(D-락트산) 하기 화학식 2의 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리(D-락트산-co-글리콜산), 폴리(L-락트산-co-글리콜산) 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone)), 폴리(발레로락톤)(poly(valerolactone)), 폴리(히드록시 부티레이트)(poly(hydroxy butyrate)), 폴리(히드록시 발러레이트)(poly(hydroxy valerate)), 폴리(1,4-디옥산-2-온)(poly(1,4-dioxane-2-one)), 폴리(오르토 에스테르)(poly(ortho ester)) 및 이들의 단량체로부터 제조된 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.

[화학식 1]

(상기 식에서 n은 2이상의 정수이다.)

[화학식 2]

(상기 식에서 m과 n은 서로 같거나 다른 2이상의 정수이다.)
제17항에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 분자량은 평균 500 내지 100,000인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제17항에 있어서, 펩티드(A)와 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자(B)는 A-B형 또는 A-B-A형으로 공유결합되어 구성되는 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제5항에 있어서, 상기 공유결합은 상기 펩티드 또는 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 상기 지질 구조체 또는 고분자 입자 사이에 염기, 링커 또는 멀티리간드 화합물을 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제5항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물전달담체의 평균입자직경은 1,000nm 이하인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
제5항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 상기 약물전달담체를 리포좀 분산액 또는 에멀젼, 고분자 입자 총 중량에 대하여 0.01~30중량%의 생리활성유효성분과 함께 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제24항에 있어서, 상기 조성물은 피부외용제, 경구용 제제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.