KR20030089218A

KR20030089218A - Ｔａｔ49-57 펩티드 또는 Ｔａｔ49-57 펩티드를 포함하는펩티드사슬과 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자와의공유결합체 및 이를 이용하여 제조된 나노입자

Info

Publication number: KR20030089218A
Application number: KR1020020027328A
Authority: KR
Inventors: 박주영; 남윤성; 한상훈; 장이섭
Original assignee: 주식회사 태평양
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2003-11-21
Also published as: JP2003335796A; US20050112089A1; EP1362599B1; KR100441904B1; JP4477815B2; EP1362599A3; US20030220474A1; EP1362599A2

Abstract

본 발명은 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자와의 공유결합체; 및 이를 이용하여 제조된 나노입자에 관한 것이다. 본 발명의 나노입자는 그 표면에 Tat 펩티드 부분을 노출시킴으로써 Tat_49-57펩티드의 막투과성 기능을 효과적으로 발휘시켜 세포 내 침투기능을 높일 수 있다.

Description

Ｔａｔ49-57 펩티드 또는 Ｔａｔ49-57 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자와의 공유결합체 및 이를 이용하여 제조된 나노입자 {Conjugate of biodegradable aliphatic polyester with Tat49-57 peptide or peptide chain containing Tat49-57 peptide, and nanoparticle manufactured using the same}

본 발명은 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자와의 공유결합체; 및 이를 이용하여 제조된 나노입자에 관한 것이다. 본 발명에서 'Tat_49-57펩티드'란 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 지칭한다.

최근 나노입자를 이용한 약물전달시스템의 유용성이 대두되면서, 다양한 고분자의 합성을 통해 보다 효과적인 나노구조체를 제조하려는 연구들이 주목 받고 있다. 특히, 고분자 나노입자가 생체세포에 점착하는 효율을 향상시키기 위하여 나노입자의 표면에 세포를 인식할 수 있는 점착분자를 접목시키고자 하는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 예를 들어, 난용성 약물을 가용화시킨 뒤 그 생체이용율을 증진시키기 위한 것이나, 단백질이나 유전자와 같은 거대 분자량의 약물의 생체내 흡수를 용이하게 하기 위한 것이나, 암 등의 난치성 질환에 사용하는 약물을 표적 세포에 특이적으로 전달하기 위해 세포인식 또는 세포점착 분자가 도입된 고분자 나노입자에 대한 연구가 진행되고 있다.

상기 세포인식 또는 세포점착 분자로는 당쇄, 항체, 펩티드 등을 들 수 있으며, 이를 약물전달에 응용하려는 시도로서 고분자 약물전구체의 개념이 많이 활용되고 있다. 1977년 Ringsdorf는 수용성 약물과 세포인식 분자 등을 하나의 고분자 사슬에 도입시킨 기능성 고분자를 약물전달에 사용하였으며 (H. Ringsdorf, J.Polymer Science (1977) 51, 155), Kopecek 등은 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 (N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide) (HPMA)의 측쇄에 단일클론 항체나 간세포 특이성을 지닌 당쇄 등을 도입시킨 뒤, 리소좀 (lysosome) 안에 있는 효소에 의해 특이적으로 절단되는 펩티드 결합을 이용하여 약물을 고분자 사슬에 공유결합시킨 바 있다 (R. Duncan et al., Biochim. Biophys. Acta. (1983) 755, 518; P. A. Flanagan et al. Biochim. Biophys. Acta. (1989) 39, 1125; D. Putnam and J. Kopecek, J. Adv. Polymn. Sci. (1995) 122, 55).

특히 1990년대 이후에는 세포점착 분자를 고분자 나노입자에 도입하는 연구들이 활발히 이루어지고 있다. T. Akaike 등은 간실질세포 (肝實質細胞)인 헤파토사이트 (hepatocyte)의 세포표면에 존재하는 아시알로글리코프로테인 (asialoglycoprotein) 수용체와 강한 결합력을 지니는 것으로 알려진 갈락토스 (galactose) 분자를 소수성 고분자 사슬에 도입시킨 N-p-비닐벤질-O-베타-D-갈락토피라노실-(1,4)-D-글루콘아미드 (N-p-Vinylbenzyl-O-beta-D-galactopyranosyl-(1,4)-D-gluconamide)을 새로이 합성한 후, 수용액 상에서 소수성 고분자와 친수성 갈락토스의 상분리 현상을 이용하여 나노입자를 제조하였다. 이들 나노입자에 대한 생체 외 (in vitro) 세포실험과 생체 내 (in vivo) 세포실험의 결과, 상기의 나노입자는 간 조직을 구성하는 세포 중 쿠퍼 (Kupper) 세포와 같은 비실질세포에는 흡수되지 않고, 헤파토사이트에만 선택적으로 흡수된다는 사실이 관찰되었다 (S. Tobe et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992) 184, 225; K. Kobayashi et al., Macromolecules (1997) 30, 2016). 한편, M. Hashida 등은 대식세포(macrophage)에 대한 결합력을 가지는 C-타입의 렉틴계에 속하는 만노스 (mannose) 수용체를 도입하여 콜레스테롤 유도체인 콜레스텐-5-일옥시-N-(4-((1-이미노-2-베타-D-티오만노실에틸)아미노)부틸)포름아미드 (cholesten-5-yloxy-N-(4-((1-imino-2-beta-D-thiomannosylethyl)amino)butyl)formamide) (Man-C4-Chol)를 합성하였고, 이를 리포좀에 삽입시켜 대식세포로의 표적지향성을 향상시켰다 (P. Opanasopit et al., Biochim. Biophys. Acta. (2001) 1511, 134).

한편, 상기의 세포내이입 (endocytosis) 이외에도, 임포트 세포 신호 (import cell signaling) 역할을 감당하는 펩티드에 의해 거대분자가 에너지 비의존적으로 진핵 세포의 세포 막을 투과하여 효율적으로 세포 내로 도입된다는 것이 밝혀지게 되면서, 최근 바이러스의 표면에 존재하는 막투과성 단백질 내지 펩티드를 이용하여 단백질과 같은 거대분자나 리포좀, 나노입자 등의 세포내 투과성을 향상시키고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다 (M. Lindgren et al., Trends in Pharmacological Sciences (2000) 21, 99). 이는 낮은 생체막 투과성과 비교적 빠른 생체 내 반감기로 인하여, 약물로서의 사용에 있어서 많은 한계가 있었던 치료용 단백질이나 유전자와 같은 거대 분자들의 약제학적 가치를 높일 수 있다는 점에서 높게 평가된다. S. R. Schwarze 등은 세포막 투과성 펩티드가 내피세포 (endothelial cells)의 단일막 (monolayer)으로 구성된 뇌혈관장벽 (blood-brain barrier)을 통한 큰 분자량의 약물전달에도 사용될 수 있을 것임을 보고하였고 (S. R. Schwarze et al., Science (1999) 285, 1569), C. Rousselle 등은 항암제인 독소루비신 (doxorubicin)에 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 D-페네트라틴 (D-penetratin, 모든 아미노산이 D-형태로 구성됨)과 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 SynB1이라는 막투과성 펩티드를 결합하여 뇌혈관장벽을 통과시키는 연구를 수행한 바 있다 (C. Rousselle et al., Molecular Pharmacology (2000) 57, 679).

이러한 세포막 투과기능을 지닌 펩티드는 주로 단백질에서 유도된 막투과성 펩티드인데, 크게 세가지 종류로 분류될 수 있다. 첫째는 호메오도메인 (homeodomain)에서 유래된 펩티드인 페네트라틴 (penetratin)으로, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다. 이는 초파리 (Drosophila)의 호메오단백질 (homeoprotein)인 안테나페디아 (Antennapedia)의 호메오도메인에서 발견되었으며 (A. Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., (1991) 88, 1864), 여기서 호메오단백질이란 일종의 전사인자로서 호메오도메인이라고 불리우는 DNA와 결합할 수 있는 60개 정도의 아미노산 구조를 지니고 있다. 둘째는 후천성 면역결핍증후군 (acquired immune deficiency syndrome, AIDS)을 발생시키는 균주인 인간 면역결핍 바이러스 타입-1 (human immunodeficiency virus, HIV-1)의 전사관련 단백질인 Tat 단백질의 49-57 번째 사이에 존재하는 Tat_49-57펩티드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 지닌다 (P. A. Wender et al., PNAS (2000) 97, 24, 13003-13008). 세째는 생체막 전위 사슬 (membrane translocating sequence, 이하 MTS로 명명함) 또는 신호사슬 (signal sequences)에 기반한 펩티드로서, RNA에 의해 새로이 합성된 단백질을 생체 내의 적합한 소기관 (organelle)들의 막으로 위치시켜주는 것을 돕는 수용체 단백질 (acceptor protein)에 의해 인식되며, 핵 국소화 신호 (nuclearlocalization signal, 이하 NLS로 명명함)와 결합된 MTS는 몇 가지 종류의 세포에서 세포막을 통과하여 세포 핵에 축적된다는 것이 밝혀졌다. 예를 들면, 핵 전사 요소 카파 B (nuclear transcription factor kappa B (NF-κB)), 원숭이바이러스 40 T 항원 (Simian virus 40 (SV40) T-antige) 또는 카포시육종 섬유아세포 성장 인자 1 (Kaposi sarcoma fibroblast growth factor 1 (이하, K-FGF로 명명함))로부터 유래된 NLS 펩티드와 결합된 K-FGF, 인간 베타3 인테그린 (human beta3 integrin), HIV-1 gp41 등에서 신호 사슬의 소수성 영역으로부터 유래된 MTS들에 있어서 상기의 사실이 확인된 바 있다 (Y. Lin et al., J. Biol. Chem. (1996) 271, 5305; X. Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1996) 93, 11819; M. C. Morris et al. Nucleic Acids Res. (1997) 25, 2730; L. Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1998) 95, 9184; Chaloin et al., Biochiem. Biochim. Res. Commun. (1998) 243, 601; Y. Lin et al., J. Biol. Chem. (1995) 270, 14255).

이러한 펩티드들은 카르고 (cargo) 분자와 결합하여 세포에 근접하였을 경우에 임포트 신호 (import signal)로 작용하고, 카르고 분자의 세포 내로의 유입을 유도한다. M. Rojas 등은 Grb2SH2 도메인을 포함하고 있는 융합 단백질의 표피성장인자 자극 신호 (EGF-stimulated signaling) 경로에 대한 세포내 효과를 연구하기 위해, 수송 펩티드인 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 신호사슬 펩티드가 접목된 글루타티온-S-트란스페라제-Grb2SH2 (Glutathione-S-transferase-Grb2SH2) 융합 단백질 (41 kDa)에 대한 연구를 수행한 바 있고 (M. Rojas et al., NatureBiotech (1998) 16, 370), S. Fawell 등은 내재화 (internalization) 효율을 조절하는 것으로서 단백질 합성을 저해하는 연구에 의한 세포 독성을 검출하기 위해 Tat 단백질의 32-72 번째 사슬을 RNase A에 접목시키는 연구를 수행한 바 있으며 (S. Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1994) 91, 664), M. Rojas 등은 SAA 세포에서 펩티드에 붙어있는 Grb2SH2의 세포내 전달에 의한 Grb2 단백질의 인산화 효과를 연구하기 위해 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 신호사슬 펩티드를 SHC Tyr 317 영역 (12 residues)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있고 (M. Rojas et al., Biochim. Biophys. Res. Commun. (1997) 234, 675), J. Oehlke 등은 양친수성 모델 펩티드의 세포로의 이동력을 시험하기 위해 양친수성 모델 펩티드인 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 SV40 large T 항원에 접목시키는 연구를 수행한 바 있고 (J. Oehlke et al., Biochim. Biophys. Acta (1998) 1414, 127), L. Theodore 등은 살아있는 신경세포의 PKC 활성을 억제하기 위해 페네트라틴을 PKC 가성-기질 (pseudo-substrate) (14 residues)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있고 (T. Theodore et al., J. Neurosci. (1995) 15, 7158), S. Calvet 등은 살아있는 신경세포의 섬유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor, 이하 FGF라 명명함) 수용체 신호계를 억제하기 위해 페네트라틴을 FGF 수용체 포스포펩티드 (FGF receptor phosphopeptide) (9 residues)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있고 (S. Calvet et al., J. Neurosci. (1998) 18, 9751), M. C. Morris 등은 벡터 펩티드에 의한 세포 내 전달을 검출하기 위해 신호사슬의 일종인 MPG를 HIV 자연 프라이머 결합부위 (natural primer binding site) (36-mer)에 접목시키는 연구를수행한 바 있고 (M. C. Morris et al., Nucleic Acid Res. (1997) 25, 2730), B. Allinquant 등은 신경돌기 생장에 대한 효과를 연구하기 위한 아밀로이드 전구 단백질을 감소 조정하기 위해 페네트라틴을 APP 안티센스 (antisense) (25-mer)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있고 (B. Allinquant et al., J. Cell Biol. (1995) 128, 919), S. Dokka 등은 합성된 임포트 신호에 결합을 시킴으로써 올리고 핵산염의 전달 가능성을 설명하기 위해 신호사슬 펩티드인 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 10개의 올리고 핵산염에 접목시키는 연구를 수행한 바 있고 (S. Dokka et al., Pharm. Res. (1997) 14, 1759), M. Pooga 등은 갈라닌 (galanin) 수용체 수준을 조정하고 통증 전달 (pain transmission)을 변경하기 위해 페네트라틴과 트랜스포탄 (transportan)을 갈라닌 수용체 안티센스 (galanin receptor antisense, 21-mer)에 접목시키는 연구를 수행한 바 있다 (M. Pooga et al., Nature Biotech. (1998) 16, 857).

본 발명에 관계되는 Tat 펩티드는 후천성 면역결핍증후군 (AIDS)을 발생시키는 균주인 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)의 전사에 관련하는 단백질인 Tat 단백질의 일부사슬을 의미한다. 상기 Tat 단백질은 바이러스주에 의존하는 86에서 102개 정도의 아미노산으로 이루어진 전사 활성화 인자인 바, 그 구조는 세 개의 다른 기능성 도메인으로 구성되는데, 첫째, 전활성 (transactivation)에 중요한 산성의 아미노 말단 영역, 둘째, 22에서 37 번째 사슬부위로 징크-핑거 모티프 (zink-finger motif)가 있으며 시스테인이 풍부한 핵산이 붙는 영역, 그리고 세번째로는 49에서 58 번째 사슬부위로 아미노산 핵 투과적 기능을 감당하는 염기성 영역으로 나뉜다.이중 세번째의 염기성 영역이 칼슘 이온과는 독립적으로 단백질의 세포 부착에 관여한다 (S. Ruben et al., J. Virol. (1989) 63,1; B. E. Vogel et al., J. Cell Biol. (1993) 121, 461). 이러한 Tat 단백질은 특정한 호메오단백질이나 HSV-1 단백질 VP22 (herpes simplex virus type 1 protein VP22) 등과 동일하게, 살아있는 세포에 의해 분비되었다가 다시 세포 내로 내재화된다 (B. Ensoli et al., J. Virol. (1993) 67, 277). 그 세포 내 유입은 시간과 농도에 의존적이며, 온도가 낮은 경우 부분적으로 억제되기도 한다. 더욱이 클로로퀸 (chloroquine)이나 lysosomotropic agent는 Tat 단백질이 분해되는 것을 억제하고, 어떤 세포의 경우에는 그 내재화를 자극하기도 하기 때문에 Tat 단백질이 세포내이입 (endocytosis)에 의해 내재화될 수도 있다는 제안이 나오기도 했었다 (A. D. Frankel and C. O. Pabo, Cell (1988) 55, 1189). 하지만, Tat 단백질의 세포 내재화가 온도에 대해 매우 낮은 의존성을 보인다는 점에서 (D. A. Mann and A. D. Frankel, EMBO J. (1991) 10, 1733), 또 다른 기작, 특히 경쟁적 유입 기작이 예상되었다. 예를 들어, 헤파린 (heparin)이나 덱스트란 설페이트 (dextrane sulfates)와 같은 양이온성 고분자를 첨가 시키면 Tat 단백질의 세포내 유입이 감소되는 것으로 알려져 있는데, 이러한 양이온성 고분자의 효과는 세포막 위에 있는 전하를 띤 분자들의 경쟁에 의한 결과라고 보여진다. 한편, Tat 단백질의 세포내 유입은 프로타민 (protamine)이나 Tat 단백질의 일부 사슬 (38-58 아미노산 서열)과 같은 염기성 펩티드의 첨가로 인하여 자극된다는 보고도 있다. 세포 내로 내재화된 후, 전체 단백질이나 Tat 단백질의 1-86 번째 사슬 또는 37-72 번째 사슬은 세포핵에 위치하게되는데, 가장 효과적인 사슬영역은 48-60 번째에 존재하는 아미노산 서열인 것으로 알려져 있는 바, 이 부분은 단백질의 염기성 영역과 NLS를 포함하고 있어서 세포나 핵으로의 위치 이동을 하는 특성을 보여준다.

이러한 Tat 단백질의 세포내 유입현상은 1988년 존스홉킨스 의대의 A. D. Frankel과 C. O. Pabo에 의해 발견되었는데, 이들은 HIV 바이러스가 만드는 'Tat 단백질'이 세포막 안으로 유입될 뿐만 아니라 핵으로 국소화되는 NLS의 특성을 지니기도 하며, 1 나노몰의 낮은 농도의 클로로퀸에 의해 이러한 현상으로 촉진된다는 것을 발견하였다 (A. D. Frankel, C. O. Pabo, Cell (1988) 55, 1189). Tat 단백질 가운데에서 막투과성 기능을 담당하는 펩티드 부분을 조사한 결과, 여섯 개의 아르기닌 (Arginine)과 두 개의 리신 (Lysine), 그리고 하나의 글루타민 (Glutamine)으로 이루어진 부위가 세포 투과 기능을 하는 데에 중요한 역할을 한다는 사실이 그 이후에 발견된 바, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가짐이 밝혀졌다.

최근, 이러한 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬을 이용하여 고분자나 단백질을 생체 내 또는 생체 외로 이동시키는 연구 결과들이 보고되고 있는 바, 현재까지 Tat 단백질로부터 유도된 10개 이상의 펩티드들이 다른 종류의 세포 내부로 위치 이동을 한다는 것이 밝혀졌으며, 이러한 세포 내로의 유입 또는 내재화 현상은 단 몇 분만에 이루어지며, 온도에 대해서도 그리 민감하지 않다고 알려져 있다. 현재 세포 내 전달에 가장 효과적이라고 알려진 Tat 단백질의 아미노산 사슬은 49-57 번째 아미노산 사슬인 것으로 알려져 있으며, 이 아미노산사슬에 여러 가지 종류의 카르고 분자를 결합 시켜 세포 내 전달을 시도하고자 한 연구가 진행되어 왔는데, 그 세포 내로의 전달대상이 된 분자들로는 인간 파필로마비루스-16 억제제 (Inhibitor of human papillomavirus type 16 (HPV-16)), Cdk 억제제 p27^Kip1, p16^INK4a, 그리고 카파제-3 (capase-3) 단백질, 주조직적합복합체 class I 경로 (MHC class I pathway)로의 오브알부민 (ovalbumin), 베타-갈락토시다제 (beta-galactoxidase) 등이 있다. 이외에도 아르기닌이 풍부한 Tat 단백질의 48-60 번째 아미노산 사슬을 이용하여 세포 내로의 유입이 필요한 분자의 전달을 모색하는 연구들이 활발하게 진행되고 있는 바, DNA, 거대 분자, 단백질, 약물, 약물 전달체, 항원, 항체, 친수성 고분자, 무기 나노입자 등을 세포 내로 유입시키고자 하는 연구가 진행되고 있다.

특히, 미국 매사추세츠 제네럴 병원 (Massachusetts General Hospital)의 M. Lewin 등은 생체 내 전구 세포나 줄기 세포의 분화나 분포를 높은 선명도로 이미지화 시키기 위한 진단 물질의 일종으로서 짧은 Tat 단백질의 49-57 번째 아미노산 사슬로 이루어진 Tat 펩티드가 접목된 초양자기성 나노입자 (superparamagnetic nanoparticle)를 개발하였는데, 이 입자에서는 Tat 단백질의 49-57의 아미노산의 결합부분을 위하여 카르복시-말단에 부분에 -Gly-Tyr-Lys-Cys 총 4 mer의 아미노산을 덧붙였으며, 마지막 시스테인의 자유로운 -SH 그룹에 형광물질인 FITC와 직경 45 nm의 나노 입자와 결합을 시켜 하나의 복합체로 만들어서 사용하였다 (M. Lewin et al., Nature Biotech (2000) 18, 410). 상기 연구결과, Tat 펩티드가 수식된 나노입자가 조혈 세포와 신경 전구 세포에 효율적으로 내재화 되었음이 CD34⁺세포를 이용한 생체외 (in vitro) 실험으로 입증이 되었다. 또한 면역 결핍성 마우스에 정맥 주사한 경우 (in vivo)에도 골수로부터 유래된 CD34⁺세포가 자기공명 이미지(magnetic resonance imaging)에 의해 검출되는 것을 확인하였다.

이러한 결과들은 Tat 단백질에서 세포 내재화 기능을 갖고 있는 일부 아미노산 사슬, 보다 구체적으로는 49-57 번째 아미노산 사슬을 약물을 전달하는 데에 사용할 수 있는 합성고분자에 접목하여 사용할 수 있다는 것을 의미한다. 그리하여, 미국 유타대의 J. Kopecek 등은 Tat 펩티드를 이용하여 하이드로젤 (hydrogel)과 같은 거대한 수용성 고분자의 세포 내 전달이 가능한 지를 확인하기 위해, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 (N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide) (HPMA) 공중합체에 형광물질이 붙어있는 Tat 펩티드와 결합시켜 A2780 인간 난소 암종 세포를 이용하여 세포내 전달 실험 수행을 한 결과, Tat 펩티드가 접목된 HPMA가 비-세포내이입 경로 (non-endocytic pathway)에 의하여 시간 의존적 경향을 보이며, 세포 내부, 특히 핵 내부에 축적됨을 확인하였다 (A. Nori et al., 28^thProceed. of International Symposium on Controlled Release Bioactive Materials, 2001, San Diego). 이러한 연구결과, 비교적 분자량이 큰 공중합체의 경우도 Tat 펩티드와의 결합을 통해 세포 내로의 전달이 가능하다는 것을 보여주었다. 하지만, 이러한 연구에 사용된 고분자는 수용액상에서 용해될 수 있는 수용성 하이드로젤이기 때문에, 약물을 함께 전달하기 위해서는 약물을 고분자 사슬에 공유결합시켜야 하고,난용성 약물의 경우에는 이조차 용이하지 않다는 문제점이 있었다.

본 발명의 목적은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 막투과기능을 가지는 펩티드사슬을 고분자에 결합시켜 공유결합체를 얻고, 이를 이용하여 세포 내로의 침투가 보다 용이한 나노입자를 제공하고자 하는 데에 있다.

도 1은 실시예 1에서 제조된 공유결합체 (a)와 순수한 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산) (b)의 전형적인 푸리에 전환 적외선 분광 스펙트럼을 나타낸다.

도 2는 실시예 4에서 제조된 나노입자 (c)와 비교예 1에서 제조된 나노입자 (d)의 크기분포를 나타낸다.

도 3은 실시예 4에서 제조된 나노입자의 투과전자현미경 사진을 나타낸다.

도 4는 실시예 4에서 제조된 나노입자와 비교예 1에서 제조된 나노입자의 MTT 세포독성실험 결과를 나타낸다.

도 5a는 비교예 1에서 제조된 나노입자의 37℃ 조건에서 세포 내로 유입되는 정도를 나타낸 공초점 레이저 주사현미경 사진이고, 도 5b는 실시예 4에서 제조된 나노입자의 37℃ 조건에서 세포 내로 유입되는 정도를 나타낸 공초점 레이저 주사현미경 사진이다.

본 발명은 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자와의 공유결합체; 및 이를 이용하여 제조된 나노입자에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 Tat_49-57펩티드와 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자와의 공유결합체, 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자와의 공유결합체; 및 상기 공유결합체를 이용하여 제조된 나노입자에 관한 것이다.

상기 Tat_49-57펩티드는 후천성 면역결핍증후군 (acquired immune deficiency syndrome, AIDS)을 발생시키는 균주인 인간 면역결핍 바이러스 타입-1 (human immunodeficiency virus type-1, HIV-1)의 전사관련 단백질인 Tat 단백질의 49-57 번째 사이에 존재하는 펩티드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진다. 이때 상기 공유결합에 의해 얻어지는 공유결합체에는 상기의 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬이 적어도 하나 이상 포함될 수 있다.

상기 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬은 특별히 제한되지는 않지만, 예를들어, 아미드 4-메틸벤지드릴아민 하이드로클로라이드 (MBHA) 수지와 ABI 433 합성기기를 이용하여 Fmoc(N-(9-플루레닐)메톡시카르보닐)/t-부틸 방법을 따라 고체상 펩티드 합성법 (solid phase peptide synthesis; SPPS)으로 합성할 수 있다 (M. Bodansky, A. Bodansky, The Practice of Peptide Synthesis; Springer: Berlin, Heidelberg, 1984, J.M. Stewart, J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nded; Pierce Chemical Co: Rockford. IL, 1984).

상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 생체에 적합한 고분자로서, 염증이나 면역반응 등을 유발하지 않으면서 생체 내에서 분해될 뿐 아니라 그 분해산물 역시 생체 내에서 무해할 것이 요구된다. 이러한 조건을 만족하는 고분자로서 락트산과 글리콜산을 기본단위로 하는 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자가 미국식품의약국(FDA)에 의해 승인을 받은 고분자로서 가장 널리 이용되고 있는 바, 그 대표적인 예로서 하기 화학식 1의 폴리(D,L-락트산) (poly(D,L-lactic acid)), 폴리(L-락트산), 폴리(D-락트산)과 하기 화학식 2의 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산) (poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid))을 들 수 있다. 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 폴리(D-락트산), 폴리(L-락트산), 폴리(D,L-락트산), 폴리(D-락트산-co-글리콜산), 폴리(L-락트산-co-글리콜산), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리(카프로락톤) (poly(caprolactone)), 폴리(발레로락톤)(poly(valerolactone)), 폴리(히드록시 부티레이트) (poly(hydroxy butyrate)), 폴리(히드록시 발러레이트) (poly(hydroxy valerate)), 폴리(1,4-디옥산-2-온) (poly(1,4-dioxane-2-one)), 폴리(오르토 에스테르) (poly(ortho ester)) 및 이들의 단량체로부터 제조된 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 선택하여 얻을 수 있다.

(상기식에서 n은 2이상의 정수이다.)

(상기식에서 m과 n은 서로 같거나 다른 2이상의 정수이다.)

상기 화학식 2의 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)의 경우에는 락트산과 글리콜산 단량체의 비율을 조절하거나, 고분자 합성과정을 변경시킴으로써 다양한 분해수명을 갖는 생분해성 고분자를 얻을 수 있다. 이와 같은 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 약물전달용 담체 또는 수술용 봉합사로 오랫동안 사용되어 왔고,그 생체적합성이 이미 증명된 바 있다. 한편 이들 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 분자량은 특별히 제한되지 않으나, 중량평균 분자량이 500 내지 100,000, 바람직하게는 5,000 내지 50,000인 것이 나노입자의 제조시 좋은 효과를 얻을 수 있다.

상기 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬 (A)과 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자 (B)는 특별히 제한되지는 않지만, A-B형 또는 A-B-A 형으로 구성될 수 있다. 이는 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 양말단에 존재하는 카르복실기 및 수산화기를 공유결합에 용이하도록 다른 기능성 그룹 (functional group)으로 치환시키고, 이 고분자의 치환된 말단과 반응이 용이한 그룹을 가진 Tat_49-57펩티드의 말단기 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬의 말단기와 반응시켜 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과의 공유결합체는 말레이미드로 치환된 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과 말단기를 티올로 치환한 Tat 펩티드와의 공유결합을 통하여 합성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 공유결합은 특별히 제한되는 것은 아니지만, Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자 사이에 별도의 염기, 링커 또는 멀티리간드 화합물을 첨가하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은 상기 공유결합체를 이용하여 제조된 나노입자에 관한 것이다. 이때, 상기 나노입자의 평균입자직경은 작을수록 바람직하며, 콜로이드의 안정성을 고려할때 최소한 1,000 nm 이하, 바람직하게는 300 nm 이하이다.

본 발명의 나노입자는 그 표면에 Tat 펩티드 부분을 노출시킴으로써 Tat_49-57펩티드의 막투과성 기능을 효과적으로 발휘시켜 세포 내 침투기능을 높일 수 있다. 본 발명에서 제시하는 나노입자를 제조하는 방법은 특별히 제한되지는 않지만, 예를들어 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다. 즉, 고분자를 바로 수용액에 분산시킨 뒤 초음파를 가하는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 유기용매를 추출 또는 증발시키는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 균질기 또는 고압유화기를 이용하여 강하게 교반하고 용매를 증발시키는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 투석하는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 서서히 물을 첨가하는 방법, 초임계 유체를 이용하여 제조하는 방법 등을 들 수 있다 (T. Niwa et al., J. Pharm. Sci. (1994) 83, 5, 727-732; C. S. Cho et al., Biomaterials (1997) 18, 323-326; T. Govender et al., J. Control. Rel. (1999) 57, 171-185; M. F. Zambaux et al., J. Control. Rel. (1998) 50, 31-40).

본 발명의 나노입자의 제조에 사용될 수 있는 유기용매로서는 아세톤, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 디옥산, 테트라히드로푸란, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 메틸에틸케톤, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 에틸에테르, 디에틸에테르, 헥산, 또는 페트롤리움 에테르를 포함한다. 이때 상기의 용매를 단독으로 사용하거나 또는 2 이상의 용매를 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 본발명의 나노입자는 그 내부에 특정 약물을 봉입함으로써 약물의 생체내 이용률 (bioavailability)을 향상시키는 약물전달 시스템으로 활용될 수 있다

이하에 실시예, 비교예 및 실험예를 기재하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 이하의 예에 나타나는 재료, 시약, 비용, 조작 등을 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 한 적절히 변경할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 이하에 나타내는 구체예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> Tat _49-57 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과의 공유결합체

Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬은 아미드 4-메틸벤지드릴아민 하이드로클로라이드 (MBHA) 수지와 ABI 433 합성기기를 이용하여 Fmoc(N-(9-플루레닐)메톡시카르보닐)/t-부틸 방법을 따라 고체상 펩타이드 합성법 (solid phase peptide synthesis; SPPS)으로 합성하였으며, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Reverse High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 순도 90% 이상으로 정제하였다. 이를 질량 분석기 (Agilent 1100 시리즈)로 분석한 결과 분자량이 1846으로 확인되었다. 이로써, Tat_49-57펩티드를 포함하며, 링커로서 4개의 아미노산으로 이루어진 Gly-Tyr-Lys-Cys 펩티드가 추가된 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 합성되었음을 확인하였다.

상기 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과의 공유결합체는 말레이미드 유도된 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과 말단기를 티올로 치환한 Tat 펩티드와의 간단한 공유결합을 통하여 합성하였다. 그 제조과정은 아래와 같다.

반응 용기에 무수화 1,4-디옥산 80 ml, 10 g의 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산) 및 트리에틸아민 (TEA) 0.2 ml를 넣어 충분히 교반하여 완전히 용해하였다. 이 반응 용기에 1,3-디시클로헥실카보디이미드 (DCC)와 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 첨가하여 고분자 주사슬에 있는 카르복실기를 활성화하였으며, 이때 사용되는 카르복실기와 디시클로헥실카보디이미드와 N-하이드록시숙신이미드의 몰수는 1:2:2의 비율로 하였다. 4 시간 동안 질소 충진 1기압 및 실온 하에서 교반하면서 반응시킨 다음, 10 ml의 무수화 1,4-디옥산에 녹인 200 mg의 헥사메틸렌 디아민 (hexamethylene diamine)을 반응 용기에 첨가하고 2시간 교반하였다. 얻어진 반응물을 0.45 마이크로미터 (μm)의 공극 크기를 지닌 나일론 필터로 여과하여 얻은 용액을 무수의 디에틸 에테르로 침전화 시킨 후, 에테르를 제거하여 백색 고체를 얻었다. 이 고체 반응물을 다시 메틸렌 클로라이드에 첨가하여 상기 미반응물과 반응시약, 부반응물을 용해시키고, 합성된 고분자만을 침전시켜 회수하였으며, 이러한 과정을 3회 반복하여 정제시킨 후, 진공 건조하였다.

상기 얻어진 고분자 즉, 말단에 아민기를 가진 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)을 메틸렌 클로라이드에 용해 시킨 후, 1.5배 (몰비율) 과량의 N-숙신이미딜4-(4-말레이미도페닐)-부티레이트 (N-succinimidyl 4-(4-maleimidophenyl)-butyrate)를 첨가하여 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산) 말단에 말레이미드를 유도하였다. 합성된 고분자는 무수의 디에틸 에테르로 침전화 시킨 후, 상기와 같은 침전법으로 정제하고 진공 건조시켰다. 반응용기에 디메틸포름아미드 (DMSO) 3 ml와 상기 합성된 고분자 100 mg을 첨가한 후, 충분히 교반하여 완전히 용해 시킨 후, 400 마이크로리터 (μl)의 반응 버퍼 (83 mM 소디움 인산화 완충용액, 0.1 M EDTA, 0.9 M 염화나트륨, 0.02% 소디움 아자이드, pH 7.2, 안정화제)에 녹인 5 mg의 상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 펩티드사슬을 첨가하여, 6 시간 이상 실온 하에서 반응시켰다. 반응 후, 얻어진 표제화합물은 셀룰로오즈막과 증류수를 이용한 투석을 통해 정제하였고, 동결 건조하였다.

<실시예 2> Tat _49-57 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(D,L-락트산)과의 공유결합체

폴리(D,L-락트산-co-글리콜산) 대신에 폴리(D,L-락트산)을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법과 동일하게 하여 표제화합물을 제조하였다.

<실시예 3> Tat _49-57 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(L-락트산)과의 공유결합체

폴리(D,L-락트산-co-글리콜산) 대신에 폴리(L-락트산)을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법과 동일하게 하여 표제화합물을 제조하였다.

<실시예 4> Tat _49-57 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과의 공유결합체의 나노입자

본 발명의 나노 입자는 상 반전 방법에 의해 제조되었다. 10 ml의 아세톤에 녹여진 100 mg의 실시예 1에서 얻어진 공유결합체를 0.5% w/v 폴리비닐알코올 (PVA, 88% 가수분해, 분자량 25,000)을 포함한 100 ml 인산염 완충 용액에 빠른 교반과 함께 서서히 가했다. 형광이 도입된 고분자 나노 입자 제조를 위해서는 질량비 5%의 형광 도입된 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과의 공유결합체를 아세톤에 함께 용해시켜 사용하였다.

한편, 상기 형광이 도입된 공유결합체는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 10 g의 실시예 1에서 얻어진 공유결합체를 500 mg의 디시클로헥실카보디이미드와 300 mg의 N-하이드록시숙신이미드와의 반응에 의하여 에스테르화시켜, 상기 공유결합체의 카르복실기를 활성화시킨 후, 형광 아민의 일차 아민과 공유 결합시켰다. 활성화된 상기 공유결합체와 형광 아민의 커플링 반응은 0.5 mg의 트리에틸아민을첨가한 후, 상온에서 질소 충진하에 10 시간 동안 수행되었다. 반응의 부산물로 침전된 디시클로유레아는 여과를 통해 제거하였고, 형광 도입된 상기 공유결합체는 무수 디에틸 에테르로 침전화 시킨 후, 상기와 같은 침전법으로 정제하였다.

<실시예 5> Tat _49-57 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(D,L-락트산)과의 공유결합체의 나노입자

실시예 1에서 제조된 공유결합체 대신에 실시예 2에서 제조된 공유결합체를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 4의 방법과 동일하게 하여 표제화합물을 제조하였다.

<실시예 6> Tat _49-57 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(L-락트산)과의 공유결합체의 나노입자

실시예 1에서 제조된 공유결합체 대신에 실시예 3에서 제조된 공유결합체를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 4의 방법과 동일하게 하여 표제화합물을 제조하였다.

<비교예 1> 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)의 나노입자

실시예 1에서 제조된 공유결합체 대신에 순수한 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 4의 방법과 동일하게 하여 표제화합물을 제조하였다.

<실험예 1> Tat _49-57 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자와의 공유결합체의 분석

본 발명의 공유결합체에 대하여 적외선 분광기를 이용하여 분석하였다. 도 1에는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 공유결합체 (a) 및 순수한 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산) (b)의 푸리에 전환 적외선 분광 스펙트럼을 나타내었다. 실시예 1에서 제조된 공유결합체 (a)의 경우, 1750 cm^-1근처의 에스테르의 특이 피크 이외에도 1656 cm^-1근처의 아민 특이 피크가 관찰됨으로써, 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)에 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬이 공유 결합을 통하여 도입되었음을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> 나노입자의 분석

상기 실시예 4 및 비교예 1에서 제조된 나노 입자의 표면전위는 Zetasizer 3000HS (Malvern, UK)을 이용하여 측정하였다. 표면전위의 측정결과, 비교예 1에서 제조된 나노입자의 표면전위 값은 -7.8 mV를 갖는 데에 반하여, 실시예 4에서 제조된 나노입자는 -0.9 mV의 표면전위 값을 나타내었다. 이는 양이온성 아미노산인 리신과 아르기닌을 다량 포함하고 있는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬이 나노입자의 표면으로 배향되어, 표면전위값을 증가시키기 때문인 것으로 해석된다.

상기 실시예 4 내지 6 및 비교예 1에서 제조된 나노 입자의 평균입자크기는 동적광산란법 (Dynamic Light Scattering, Zetasizer 3000HS, Malvern, UK) 방법에 의해 측정하였다. 산란각도는 90도로 고정하여 측정하였으며, 실험은 25℃ 조건에서 수행되었다. 수동력학적 입자지름은 콘틴 (Contin) 방법에 의해 계산되었다. 실험결과는 표 1과 도 2에 나타낸 바, 비교예 1에서 제조된 나노입자 (d)의 입자크기에 비해 실시예 4 내지 실시예 6에서 제조된 나노입자 (c)의 평균 입자크기가 훨씬 큼을 알 수 있었다. 이는 친수성 성질을 지니고 있는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬이 도입된 나노입자에 비해 순수한 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)의 나노입자의 경우 보다 소수성 성질이 강하여, 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 보다 조밀한 구조의 나노입자가 제조되기 때문인 것으로 추정된다.

	나노입자 제조에 사용한 공유결합체	평균입자 크기
실시예 4	실시예 1에서 제조된 공유결합체	238 nm
실시예 5	실시예 2에서 제조된 공유결합체	220 nm
실시예 6	실시예 3에서 제조된 공유결합체	250 nm
비교예 1	폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)	128 nm

한편, 제조된 나노 입자의 성상과 크기 분포는 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscopy, TEM, JEOL 2010)을 이용하여 관찰하였다. 시편은 1 g/L 농도의 나노 입자가 분포된 PBS 시료 한 방울을 탄소로 코팅된 100 메쉬 구리 그리드에 올려 놓은 뒤, 대략 1 분이 경과 후, 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate) 용액으로 염색하여 제작하였다. 도 3에는 상기 실시예 4에서 제조된 나노입자를 100만배율로 관찰한 투과전자현미경 사진을 나타낸 바, 구형의 나노입자가 제조되었음을 확인할 수 있다.

<실험예 3> 세포 배양을 통한 독성 검사

상기 실시예 4와 비교예 1에서 제조된 나노 입자의 세포 독성은 HaCaT (인간 각질 세포 라인)과 HS-68 (인간 섬유아 세포 라인)을 이용하여 측정하였다. 상기 두 가지 종류의 세포를 부피비 기준 1%의 항생제 (스트렙토마이신, 10,000 마이크로그램/ml; 페니실린, 10,000 IU/ml)와 부피비 기준 10%의 태아 혈청 (fetal bovine serum, 이하 FBS로 명명함)이 첨가된 세포 배양 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium; 이하 DMEM라고 명명함)로 37℃, 5% CO₂를 포함한 습한 공기가 충진된 세포 배양기에서 배양하였다. 평평한 바닥의 96-웰 플레이트에 75% 세포 분포로 배양된 두 가지 종류의 세포를 1.5-50 마이크로그램/ml의 농도의 나노 입자와 함께 100 마이크로리터 (μl)의 배양 배지로 배양하고, 한 시간 뒤 부피비 기준 10%의 FBS를 첨가하여 48 시간 더 배양 후, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; 이하 MTT라고 명명함)와 락테이트 탈수소효소 (Lactate dehydrogenase; 이하 LDH라고 명명함) 분석으로 세포 독성 테스트를 시행하였다.

96-웰 플레이트에 배양되고 있는 세포에 MTT를 최종 농도 500 마이크로그램/ml가 되도록 첨가하고 37℃에서 4 시간 동안 배양 한 후, 100 마이크로리터 (μl)의 산화 이소프로판올 (이소프로판올에 녹인 0.04 N의 염화수소)을 각각의 웰에 넣어 준 뒤, 살아있는 세포의 기능에 의해 전환된 염료 물질을 용해시키기 위해 섞어주었다. 96-웰 플레이트 각각의 웰에 담기어 있는 전환된 염료 물질의 흡광도 세기를 550 nm에서 ELISA plate reader (ELx800, Bio-TEK Instr. Inc.)를 이용하여 측정하였다. MTT 분석 표준선은 96 웰-플레이트 각각의 웰에 세포의 개수가 다르게 넣어 준 뒤, 세포를 상기의 방법으로 배양하고 MTT 분석을 시행한 후, 살아있는 세포 수에 따른 흡광도 세기 증감에 대한 관계 분석에 의하여 구하였다. MTT 분석을 통한 상기 실시예 4에서 제조된 나노 입자의 세포 독성 분석은 % 살아있는 세포로 나타내었다.

세포 배양액에 유출된 LDH의 양은 Cyto Tox 96 비방사성 세포독성 시험 장비 (Cyto Tox 96Non- Radioactive Cytotoxicity Assay kit, Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 측정하였다. 세포를 배양하였던 배양액을 250 g의 속도로 4 분 동안 원심 분리하여 죽은 세포의 잔해를 분리하였다. 원심 분리 후, 상등액 50 마이크로리터 (μl)를 96-웰 플레이트 각각의 웰에 넣은 뒤, 50 마이크로리터 (μl) 기질 용액 (substrate solution)을 첨가하여 상온에서 30 분 동안 방치하였다. 방출된 LDH와 기질 용액 간의 반응을 멈추어 주기 위하여, 50 마이크로리터 (μl)의 1.0 M 아세트산을 가해 준 뒤, 각각의 웰에 있는 시료의 492 nm에서의 흡광도 세기를 ELISA plate reader로 측정하였다. 방출된 LDH (%)는 하기 수학식 1에 의하여 구하였다.

방출 LDH (%) = (손상된 세포로부터 방출된 LDH (실험군) / 괴사 용액 (lysis solution) 처리 후 모든 세포로부터 방출된 최대 LDH)×100

도 4에는 본 발명의 실시예 4에서 제조된 나노입자의 세포독성실험 결과를 비교예 1에서 제조된 나노입자의 세포독성실험 결과와 비교하여 나타낸 바, Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬이 도입된 나노입자와 상기 펩티드사슬이 도입되지 않은 나노입자의 세포독성에 큰 차이가 없음을 확인하였다.

<실험예 4> Tat _49-57 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과의 공유결합체의 나노 입자의 세포내 전이 실험

상기 실시예 4와 실시예 5에서 제조된 나노 입자의 세포내 전이는 상기 실험예 3을 통하여, 비교적 나노 입자에 의한 세포 생존 능력의 변화가 없다는 것이 확인된 HaCaT 세포를 선택하여 실험한 후, 공초점 현미경 (Radiance 2000/MP, Bio-rad)을 이용하여 확인하였다. 투명한 35 ml DT 배양 접시 (0.15 ml 두께)에서 배양된 HaCaT 세포를 1%의 항생제와 형광이 도입된 고분자 나노 입자 (농도 = 50 마이크로그램/ml)에 첨가된 1 ml의 DMEM 배양 배지와 함께 1 시간 동안 두 가지 조건에서 각각 배양하였다. 첫번째로는 기존의 방법과 같은 37℃, 5% 이산화탄소 (CO₂)가 포함된 공기가 있는 조건에서, 두번째로는 4℃, 공기가 있는 조건이었다. 이러한 두 가지 조건에서 각각 배양한 후, 1 ml의 인산염 완충 용액으로 3번 씻어주고, 다시 1 ml의 DMEM 배양 배지를 배양 접시에 넣어준 뒤, 세포에 염색된 형광을 관찰하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5a는 비교예 1에서 제조된 나노입자가 37℃ 조건에서 세포 내로 유입되는 정도를 나타낸 공초점 레이저 주사현미경 사진이며 (도 중 눈금선은 10 마이크로미터를 나타낸다.), 도 5b는 본 발명의 실시예 4에서 제조된 나노입자의 37℃ 조건에서 세포 내로 유입되는 정도를 나타낸 공초점 레이저 주사현미경 사진 (도 중 눈금선은 10 마이크로미터를 나타낸다.)이다. 순수한 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)의 나노입자의 경우, 세포 내로의 유입이 거의 일어나지 않지만, 실시예 4에서 제조된 나노입자의 경우 세포막을 투과하여, 세포 내부로 나노입자가 유입되었음을 확인할 수 있다. 이로써, Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬을 나노입자에 도입하여 나노입자의 세포 내 유입을 촉진시킬 수 있다는 것을 검증하였다.

본 발명에 따른 나노입자는 그 표면에 Tat 펩티드 부분을 노출시킴으로써 Tat_49-57펩티드의 막투과성 기능을 효과적으로 발휘시켜 세포 내 침투기능을 높일 수 있음을 관찰하였다. 이러한 본 발명에서 제안하는 나노입자는 기존의 고분자 나노입자가 세포 내로 잘 유입되지 못하는 단점을, 고분자의 말단기에 생체막 투과증진 기능을 지닌 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬을 공유결합시키는 방법을 통해 극복하였다는 특징이 있다. 이러한 나노입자 안에 약물을 봉입하면, 약물의 생체내 흡수율 (bioavailability)을 증진시키는 효과적인 약물전달시스템으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

서열번호 1의 Tat_49-57펩티드 또는 서열번호 1의 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자와의 공유결합체.
제 1항에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자가 폴리(D-락트산), 폴리(L-락트산), 폴리(D,L-락트산), 폴리(D-락트산-co-글리콜산), 폴리(L-락트산-co-글리콜산), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(히드록시 부티레이트), 폴리(히드록시 발러레이트), 폴리(1,4-디옥산-2-온), 폴리(오르토 에스테르) 및 이들의 단량체로부터 제조된 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 성분임을 특징으로 하는 공유결합체.
제 1항에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자가 폴리(D-락트산), 폴리(L-락트산), 폴리(D,L-락트산), 폴리(D-락트산-co-글리콜산), 폴리(L-락트산-co-글리콜산) 및 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)에서 선택된 1종 이상의 성분임을 특징으로 하는 공유결합체.
제 1항에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 중량평균분자량이 500 내지 100,000인 것을 특징으로 하는 공유결합체.
제 1항에 있어서, 상기 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬 (A)과 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자 (B)가 A-B형 또는 A-B-A 형으로 구성되는 것을 특징으로 하는 공유결합체.
제 1 항에 있어서, 상기 공유결합이 상기 Tat_49-57펩티드 또는 Tat_49-57펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자 사이에 별도의 염기, 링커 또는 멀티리간드 화합물을 첨가하여 이루어진 것임을 특징으로 공유결합체.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 공유결합체를 이용하여 제조된 나노입자.
제 7항에 있어서, 상기 나노입자의 평균입자직경이 1,000 nm 이하인 것을 특징으로 하는 나노입자.