JP2003335796A - Ｔａｔ４９−５７ペプチドまたはＴａｔ４９−５７ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステルとのコンジュゲート、およびこれを使用して製造されるナノ粒子 - Google Patents

Ｔａｔ４９−５７ペプチドまたはＴａｔ４９−５７ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステルとのコンジュゲート、およびこれを使用して製造されるナノ粒子

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明はTat49-57ペプチドまたはTat49-57ペ
プチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル
系重合体とのコンジュゲート、およびこれを使用して製
造されるナノ粒子に関する。 【解決手段】 本発明のナノ粒子は、その表面にTatペ
プチド部分を露出させることにより、 Tat49-57ペプチ
ドの膜透過性機能を効果的に発揮させ、細胞内透過性を
高めることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はTat49-57ペプチドま
たはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪
族ポリエステル系重合体とのコンジュゲート、およびこ
れを使用して製造されるナノ粒子に関する。本明細書で
用いられる「Tat49-57ペプチド」という用語は、配列番
号：1のアミノ酸配列を有するペプチドを指す。
【０００２】
【従来の技術】最近ナノ粒子を利用した薬物送達システ
ムの有用性が取沙汰されており、重合体の多様な合成経
路を通じて効果的なナノ構造体を製造しようとする研究
が特に注目されている。特に、高分子ナノ粒子が生体細
胞に粘着する効率を向上させるために、ナノ粒子の表面
に細胞が認識できる粘着分子を結合させようとする研究
が活発に行われている。例えば、難溶性薬物を可溶化さ
せてその生体利用能を増進させたり、タンパク質や遺伝
子のような巨大分子量の薬物の細胞内吸収を高めたり、
癌などの難治性疾患に使用する薬物を標的細胞に特異的
に送達するために、細胞認識分子または細胞粘着分子を
高分子ナノ粒子に導入させたりといった研究が含まれ
る。
【０００３】上記の細胞認識分子または細胞粘着分子と
しては、糖鎖、抗体、ペプチドなどが挙げられ、これを
薬物送達に応用しようとする試みとして、薬物-重合体
プロドラッグコンジュゲートの概念が広く活用されてい
る。1977年Ringsdorfは水溶性薬物と細胞認識分子など
を導入した機能性重合体を薬物の送達に使用しており
(H. Ringsdorf、J. Polymer Science (1977) 51, 15
5)、KopecekらはN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリル
アミド (HPMA)の側鎖にモノクローナル抗体や肝細胞に
特異的な糖鎖などを導入した後、リソソーム内にある酵
素により特異的に切断されるペプチド結合を利用して薬
物を高分子鎖に共有結合できることを報告している(R.
Duncanら、Biochim. Biophys. Acta. (1983) 755, 518;
P. A. Flanaganら、Biochim. Biophys. Acta. (1989)
39, 1125; D. PutnamおよびJ. Kopecek、J. Adv. Polym
n. Sci. (1995) 122, 55)。
【０００４】特に1990年代以後には、細胞粘着分子を高
分子ナノ粒子に導入する研究等が活発に行われている。
T. Akaikeらは肝実質細胞である肝細胞の表面に存在す
るアシアロ糖タンパク質受容体と強い結合力を持ってい
ることが知られているガラクトース分子を疎水性高分子
鎖に組み込むことにより、N-p-ビニルベンジル-O-ベー
タ-D-ガラクトピラノシル-(1,4)-D-グルコンアミドを合
成した後、水溶液相で疎水性重合体と親水性ガラクトー
スの相分離現象を利用してナノ粒子を製造した。これら
のナノ粒子に対するインビトロ実験とインビボ実験の結
果、上記のナノ粒子は肝組織を構成する細胞中、クッパ
ー(Kupper)細胞のような非実質細胞には吸収されず、肝
細胞にのみ選択的に吸収されることが観察された(S. To
beら、Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992) 184, 2
25; K. Kobayashiら、Macromolecules (1997) 30, 201
6)。一方、M. Hashidaらはマクロファージに対して強い
結合力を持つC型レクチンに属するマンノース受容体を
導入することによりコレステロール誘導体であるコレス
テン-5-イルオキシ-N-(4-((1-イミノ-2-ベータ-D-チオ
マンノシルエチル)アミノ)ブチル)ホルムアミド (Man-C
4-Chol)を合成し、これをリポソームに組み込むことに
よりマクロファージへの標的指向性を向上させた(P. Op
anasopitら、Biochim. Biophys. Acta. (2001) 1511, 1
34)。
【０００５】上記のエンドサイトーシス以外にも、イン
ポートセルシグナリング(import cell signaling)を担
うペプチドにより巨大分子がエネルギー非依存的に真核
細胞の細胞膜を透過して、効率的に細胞内に導入される
ということが明らかにされたことにより、ウイルスの表
面に存在する膜透過性タンパク質またはペプチドを利用
してタンパク質のような巨大分子やリポソーム、ナノ粒
子などの細胞内透過性を向上させようとする研究が急速
に進行している(M. Lindgrenら、Trends in Pharmacolo
gical Sciences (2000) 21, 99)。これは低い生体膜透
過性と比較的速い生体内半減期により、薬物としての使
用において多くの制約があった治療用タンパク質や遺伝
子のような巨大分子の薬学的価値が高められるという点
で高く評価される。S. R. Schwarzeらは、細胞膜透過性
ペプチドが、内皮細胞の単層から構成された脳血液関門
を介した高分子量の薬物の送達にも使用できることを報
告しており(S. R. Schwarzeら、Science (1999) 285, 1
569)、C. Rousselleらは、抗癌剤であるドキソルビシン
に配列番号：2のアミノ酸配列を有するD-ペネトラチン
(D-penetratin、すべてのアミノ酸がD型で構成される)
と配列番号：3のアミノ酸配列を有するSynB1という膜透
過性ペプチドとを結合することにより、脳血液関門を介
して薬物を送達する研究を行った(C. Rousselleら、Mol
ecular Pharmacology (2000) 57, 679)。
【０００６】このような細胞膜透過性ペプチドは主にタ
ンパク質から誘導されたものであって、大きく3種類に
分類できる。第一は、ホメオドメインに由来するペプチ
ドであるペネトラチン(penetratin)であって、配列番
号：2のアミノ酸配列を持つ。これはショウジョウバエ
(Drosophila)のホメオプロテインであるアンテナペディ
ア(Antennapedia)のホメオドメインで見いだされた(A.
Joliotら、Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A., (1991) 8
8, 1864)。本明細書で用いられる「ホメオプロテイン」
という用語は、ホメオドメインと呼ばれるDNAと結合で
きる約60アミノ酸を有する一種の転写因子を指す。第二
は、後天性免疫不全症候群(AIDS)を仲介する1型ヒト免
疫不全ウイルス (HIV-1)の転写活性化タンパク質である
Tatタンパク質の49〜57位アミノ酸の間に存在するTat
49-57ペプチドであって、配列番号：1のアミノ酸配列を
有する(P. A. Wenderら、PNAS (2000) 97, 24, 13003-1
3008)。第三は、膜転位配列(membrane translocating s
equence、以下「MTS」と称する)またはシグナル配列に
基づいたペプチドである。これは、RNAにより生成され
たタンパク質をインビボで適当な細胞小器官の膜に位置
づけることを助ける受容体タンパク質により認識され
る。また、核局在化シグナル(以下「NLS」と称する)と
結合されたMTSは幾つかの細胞で細胞膜を通過して細胞
核に蓄積されることも明らかになった。例えば、核転写
因子カッパB(NF-κB)、サルウイルス40T抗原(SV40T抗
原)、またはカポシ肉腫繊維芽細胞増殖因子1(以下、「F
GF」と称する)に由来するNLSペプチドに結合されたK-FG
F、ヒトベータ3インテグリン、HIV-1 gp41などでシグナ
ル鎖の疎水性領域に由来するMTSにおいて、上記の事実
が確認されている(Y. Linら、J. Biol. Chem. (1996) 2
71, 5305; X. Linら、Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A.
(1996) 93, 11819; M. C. Morris et al. Nucleic Aci
dsRes. (1997) 25, 2730; L. Zhangら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U. S. A. (1998)95, 9184; Chaloinら、Bioch
em. Biophys. Res. Commun. (1998) 243, 601; Y.Lin
ら、J. Biol. Chem. (1995) 270, 14255)。
【０００７】このようなペプチドはカーゴ(cargo)分子
と結合して細胞に近接した場合にインポートシグナル(i
mport signal)として作用し、カーゴ分子の細胞内への
転位を誘導する。M. Rojasらは、Grb2SH2ドメインを含
む融合タンパク質のEGF刺激シグナル伝達経路に対する
細胞内効果を調べるため、輸送ペプチドである配列番
号：4のアミノ酸配列を有するシグナル鎖ペプチドが結
合されたグルタチオン-S-トランスフェラーゼ-Grb2SH2
融合タンパク質(41kDa)について研究を行った(M. Rojas
ら、Nature Biotech (1998) 16, 370)。S. Fawellら
は、内在化効率を調節することによるタンパク質合成の
阻害に関する研究を通じて細胞毒性を検出するために、
Tatタンパク質の32〜72位アミノ酸鎖をRNase Aに結合さ
せた(S. Fawellら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
(1994) 91, 664)。M. Rojasらは、ペプチドに結合され
たGrb2SH2のSAA細胞への細胞内送達によるGrb2タンパク
質のリン酸化効果を調べるために、配列番号：4のアミ
ノ酸配列を有するシグナル鎖ペプチドをSHC Tyr 317領
域(12残基)に結合させた(M. Rojasら、Biochem. Biophy
s. Res. Commun. (1997) 234, 675)。J. Oehlkeらは、
両親媒性モデルペプチドの細胞への移動性を試験するた
め、両親媒性モデルペプチドである配列番号：5のアミ
ノ酸配列を有するペプチドをSV40ラージT抗原に結合さ
せた(J. Oehlkeら、Biochim. Biophys. Acta (1998) 14
14, 127)。L. Theodoreらは、生きている神経細胞のPKC
活性を抑制するためペネトラチンをPKC偽性-基質(pseud
o-substrate) (14残基)に結合させた(T. Theodoreら、
J. Neurosci. (1995) 15, 7158)。S. Calvetらは、生き
ている神経細胞の繊維芽細胞成長因子(以下「FGF」と称
する)の受容体シグナル系を抑制するためペネトラチン
をFGF受容体ホスホペプチド(9残基)に結合させた(S. Ca
lvetら、J. Neurosci. (1998) 18, 9751)。M. C. Morri
sらは、ベクターペプチドによる細胞内伝達を検出する
ため、シグナル鎖の一種であるMPGをHIV天然プライマー
結合部位 (36-mer)に結合させた (M. C. Morrisら、Nuc
leic Acid Res. (1997) 25, 2730)。B. Allinquantらは
神経突起の生長に対する効果の研究に関してアミロイド
前駆タンパク質の減少を調節するため、ペネトラチンを
APPアンチセンス(25-mer)に結合させた(B. Allinquant
ら、J. Cell Biol.(1995) 128, 919)。S. Dokkaらは、
合成されたインポートシグナルと組み合わせることによ
り、オリゴ核酸塩の送達を研究するために、配列番号：
4のアミノ酸配列を有するシグナル鎖ペプチドを10オリ
ゴ核酸塩に結合させた(S. Dokkaら、Pharm. Res. (199
7) 14, 1759)。M. Poogaらは、ガラニン受容体レベルを
調整してインビボにおける痛症伝達(pain transmissio
n)を変更するためペネトラチンおよびトランスポータン
(transportan)をガラニン受容体アンチセンス(21-mer)
に結合させた(M. Poogaら、Nature Biotech. (1998) 1
6, 857)。
【０００８】本明細書で用いられる「Tatペプチド」と
いう用語は、AIDSを仲介するHIVの転写に関与するTatタ
ンパク質の鎖の一部を意味する。Tatタンパク質はウイ
ルス株に応じて86〜102個のアミノ酸からなる転写活性
化因子である。Tatタンパク質は次の3個の異なる機能性
ドメインから構成される：トランス活性化に重要な酸性
のアミノ末端領域；22〜37位アミノ酸に相当する領域で
あって、ジンク-フィンガーモチーフを含有しシステイ
ンに富んだ核酸が結合可能な領域；および核透過性に寄
与する49〜58位アミノ酸に相当する塩基性領域。中でも
塩基性領域は、カルシウムイオンとは独立的にタンパク
質の細胞付着に関与する(S. Rubenら、J.Virol. (1989)
63, 1; B. E. Vogelら、J. Cell Biol. (1993) 121, 4
61)。このようなTatタンパク質は特定のホメオタンパク
質やHSV-1タンパク質VP22(1型単純ヘルペスウイルスタ
ンパク質 VP22)などと同様に、生きている細胞により分
泌され、再び細胞内に内在化される(B. Ensoliら、J. V
irol. (1993) 67, 277)。その細胞内転位は時間と濃度
に依存的であり、温度の低い場合部分的に抑制されるこ
ともある。さらに、クロロキンやリソソーム指向性因子
（lysosomotropic agent）はTatタンパク質が分解され
るのを抑制し、ある細胞の場合にはその内在化を刺激す
ることもあるので、Tatタンパク質がエンドサイトーシ
スにより内在化され得ると提唱されている(A. D. Frank
elおよびC. O. Pabo、Cell (1988) 55,1189)。しかし、
Tatタンパク質の細胞内在化が温度に対して非常に低い
依存性を見せるという点から(D. A. MannおよびA. D. F
rankel、EMBO J. (1991) 10, 1733)、また別のメカニズ
ム、特に競合的転位メカニズムが存在すると予想され
た。例えば、ヘパリンやデキストランスルフェートのよ
うなカチオン性重合体を添加すると、Tatタンパク質の
細胞内転位が減少することが知られている。このような
効果は、細胞膜の上にある電荷を帯びた分子間の競合に
よる結果であると考えられる。一方、Tatタンパク質の
細胞内転位は、プロタミンもしくはTatタンパク質の部
分ペプチド(38〜58位アミノ酸)のような塩基性ペプチド
の添加により刺激されるという報告もある。細胞内に内
在化された後、タンパク質全体またはTatタンパク質の1
〜86位アミノ酸もしくは37〜72位アミノ酸が細胞核内に
位置する。特に、48〜60位に存在するアミノ酸配列がも
っとも効果的な領域であることが知られている。この領
域はタンパク質の塩基性領域とNLSとを含んでいるた
め、細胞または核へのTatタンパク質の転位が可能とな
る。
【０００９】このようなTatタンパク質の細胞内転位
は、1988年ジョンズホプキンス医大のA. D. Frankelお
よびC. O. Paboにより見いだされ、HIVウイルスにより
生成される「Tatタンパク質」が細胞膜内に転位するだ
けでなく核に局在化されるNLSの特性を有すること、1ナ
ノモルという低濃度のクロロキンによりこのような現象
が促進されることが見出された(A. D. Frankel, C. O.
Pabo, Cell (1988) 55, 1189)。その後、Tatペプチド中
で膜透過性に寄与するペプチド領域を調査した結果、6
個のアルギニン、2個のリシン、および一つのグルタミ
ンからなる部位が、細胞透過性に重要な役割を果たすこ
と、およびその部位が配列番号：1のアミノ酸配列を有
することが明らかにされた。
【００１０】近年、Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペ
プチドを含むペプチド鎖を用いて重合体またはタンパク
質をインビボまたはインビトロで転位させる研究結果が
報告されている。現在までに、Tatタンパク質から誘導
された少なくとも10個のペプチドが異なる細胞の内部に
移動することが明らかにされた。このような細胞内への
転位または内在化はほんの数分間でなされ、温度に対し
てもあまり敏感ではないことが知られている。細胞内送
達に有効なTatタンパク質のアミノ酸配列は49〜57位ア
ミノ酸であることが現在知られている。このアミノ酸配
列に様々なカーゴ分子を結合させることによる細胞内送
達の研究が行われている。カーゴ分子により送達される
分子の例としては、16型ヒトパピローマウイルス(HPV-1
6)の阻害剤、Cdk抑制剤p27Kip1、p16INK4a、カパーゼ-3
(capase-3)タンパク質、主組織適合複合体(MHC)クラスI
経路へのオブアルブミン、ベータ-ガラクトシダーゼな
どがある。この他にも、Tatタンパク質のアルギニンに
富んだ48〜60位アミノ酸配列を利用して、細胞内への分
子の送達に関する多くの研究が行われている。これらの
分子には、DNA、巨大分子、タンパク質、薬物、薬物担
体、抗原、抗体、親水性重合体、無機ナノ粒子などが含
まれる。
【００１１】米国マサチューセッツゼネラル病院(Massa
chusetts General Hospital)のM. Lewinらは、インビボ
での前駆細胞または幹細胞の分化または分布を高解像度
で画像化するための診断物質として機能する、Tatタン
パク質の短い49〜57位アミノ酸配列を含むTatペプチド
が結合された超常磁性ナノ粒子を開発した。このナノ粒
子ではTatタンパク質の49〜57位アミノ酸の結合部分の
ためカルボキシ末端部分に4merのアミノ酸-Gly-Tyr-Lys
-Cysが結合されており、システインの遊離-SH基に蛍光
物質であるFITCと直径45nmのナノ粒子とを結合させるこ
とにより、一つの複合体が製造される(M. Lewinら、Nat
ure Biotech (2000) 18, 410)。上記の研究結果におい
て、Tatペプチドが修飾されたナノ粒子が造血細胞およ
び神経前駆細胞に効率的に内在化されたことが、CD34+
細胞を利用したインビトロ実験で立証された。さらに、
Tatペプチドが修飾されたナノ粒子を免疫不全マウスに
静脈注射した場合にも、骨髄に由来するCD34+細胞が磁
気共鳴映像法により確認された。
【００１２】このような結果は、細胞内在化機能を持っ
ているTatタンパク質の一部のアミノ酸配列、より具体
的には49〜57位アミノ酸を、薬物を送達できる合成重合
体に結合できることを示している。米国ユタ大学のJ. K
opecekらはTatペプチドを利用してヒドロゲルのような
巨大な水溶性重合体が細胞内に送達されるか否かを確認
するため、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド
(HPMA)共重合体に蛍光標識されたTatペプチドを結合さ
せ、A2780ヒト卵巣癌種細胞を利用して細胞内への送達
実験を行った。その結果、Tatペプチドの結合されたHPM
Aが時間依存的な非エンドサイトーシス経路により、細
胞内部、特に核内部に蓄積されることが確認された(A.
Noriら、28th Proceed. of International Symposium o
n ControlledRelease Bioactive Materials, 2001, San
Diego)。このような結果から、比較的高分子量の共重
合体の場合でもTatペプチドとの結合を通じて、細胞内
への送達が可能であることが示された。しかし、使用さ
れた重合体は水溶液に溶解されるヒドロゲルであるた
め、送達される薬物を重合体鎖に結合させる必要があ
る。特に、難溶性薬物の場合には達成困難である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明は
上記の問題点を考慮して成され、本発明の課題は、膜透
過性のペプチド鎖を重合体に結合させることにより得ら
れるコンジュゲートを提供することである。
【００１４】本発明の別の目的は、コンジュゲートの使
用により、細胞内への透過性が増強されたナノ粒子を提
供することである。
【００１５】上記および他の本発明の目的、特徴、およ
び他の利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明か
らより明らかに理解されると思われる。
【００１６】
【発明を解決するための手段】本発明はTat49-57ペプチ
ドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性
脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジュゲート、およ
びこれを使用して製造されるナノ粒子を提供する。即
ち、本発明はTat49-57ペプチドと生分解性脂肪族ポリエ
ステル系重合体とのコンジュゲート、またはTat49-57ペ
プチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル
系重合体とのコンジュゲート、および上記コンジュゲー
トを使用して製造されるナノ粒子を提供する。
【００１７】本発明に係るコンジュゲートにおいては、
（１）配列番号：1のTat49-57ペプチドまたは配列番
号：1のTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性
脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジュゲートである
ことを特徴とする。
【００１８】また、本発明に係るコンジュゲートにおい
ては、（２）生分解性脂肪族ポリエステル系重合体が、
ポリ(D-乳酸)、ポリ(L-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(D
-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(L-乳酸-co-グリコール
酸)、ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(カプロラ
クトン)、ポリ(バレロラクトン)、ポリ(ヒドロキシブチ
レート)、ポリ(ヒドロキシバレレート)、ポリ(1,4-ジオ
キサン-2-オン)、ポリ(オルトエステル)、およびこれら
の重合体に相当する単量体から製造された共重合体から
なる群より選択される少なくとも一つの重合体である、
上記(1)記載のコンジュゲートであることを特徴とす
る。
【００１９】また、本発明に係るコンジュゲートにおい
ては、（３）生分解性脂肪族ポリエステル系重合体が、
ポリ(D-乳酸)、ポリ(L-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(D
-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(L-乳酸-co-グリコール
酸)、およびポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸) からなる
群より選択される少なくとも一つの重合体である、上記
(1)記載のコンジュゲートであることを特徴とする。
【００２０】また、本発明に係るコンジュゲートにおい
ては、（４）生分解性脂肪族ポリエステル系重合体の重
量平均分子量が500〜100,000である、上記(1)記載のコ
ンジュゲートであることを特徴とする。
【００２１】また、本発明に係るコンジュゲートにおい
ては、（５）Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチド
を含むペプチド鎖(A)、および生分解性脂肪族ポリエス
テル系重合体(B)がA-B型またはA-B-A型として構成され
る、上記(1)記載のコンジュゲートであることを特徴と
する。
【００２２】また、本発明に係るコンジュゲートにおい
ては、（６）Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチド
を含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重合
体との間に塩基、リンカー、またはマルチリガンド化合
物が付加される、上記(1)記載のコンジュゲートである
ことを特徴とする。
【００２３】また、本発明に係るナノ粒子においては、
（７）上記(1)〜(6)のいずれか一項に記載のコンジュゲ
ートを使用して製造されるナノ粒子であることを特徴と
する。
【００２４】また、本発明に係るナノ粒子においては、
（８）平均粒径が1,000nm以下である上記(7)記載のナノ
粒子であることを特徴とする。
【００２５】
【発明の実施の形態】上記Tat49-57ペプチドは、後天性
免疫不全症候群(AIDS)を仲介する1型ヒト免疫不全ウイ
ルス(HIV-1)の転写活性化タンパク質であるTatタンパク
質の49〜57位アミノ酸を含み、配列番号：1のアミノ酸
配列を有する。少なくとも一つのTat49 -57ペプチドまた
はTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖がコンジュゲート
に組み込まれうる。
【００２６】Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチド
を含むペプチド鎖は特に制限されないが、例えば、アミ
ド4-メチルベンズヒドリルアミンヒドロクロライド(MBH
A)樹脂とABI433合成機器を利用して、Fmoc(N-(9-フルオ
レニル)メトキシカルボニル)/t-ブチル法により固相ペ
プチド合成法(SPPS)で合成される(M. Bodansky, A. Bod
ansky、The Practice of Peptide Synthesis; Springe
r: Berlin, Heidelberg,1984, J.M. Stewart, J.D. You
ng, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed;Pierce C
hemical Co: Rockford. IL, 1984)。
【００２７】生分解性脂肪族ポリエステル系重合体は生
体適合性の重合体であって、炎症または免疫反応を誘発
させずに分解されるだけでなく、その分解産物もやはり
人体に無害であることが要求される。このような条件を
満たす最も一般的な重合体として、米国食品医薬局(FD
A)により承認を受けている、乳酸とグリコール酸を基本
単位とする生分解性脂肪族ポリエステル系重合体が挙げ
られる。生分解性脂肪族ポリエステル系重合体の代表的
な例として、下記化学式1のポリ(D,L-乳酸)、ポリ(L-乳
酸)、およびポリ(D-乳酸)、ならびに下記化学式2のポリ
(D,L-乳酸-co-グリコール酸)が挙げられる。生分解性脂
肪族ポリエステル系重合体は、ポリ(D-乳酸)、ポリ(L-
乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(D-乳酸-co-グリコール
酸)、ポリ(L-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(D,L-乳酸-c
o-グリコール酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(バレロ
ラクトン)、ポリ(ヒドロキシブチレート)、ポリ(ヒドロ
キシバレレート)、ポリ(1,4-ジオキサン-2-オン)、ポリ
(オルトエステル)、およびこれらの重合体に相当する単
量体から製造された共重合体からなる群より選択される
少なくとも一つの重合体が挙げられる。
【化１】化学式１ (式中、nは少なくとも2の整数である。)
【化２】化学式２ (式中、mおよびnは各々独立に少なくとも2の整数であ
る。)
【００２８】上記化学式2のポリ(D,L-乳酸-co-グリコー
ル酸)の場合には、乳酸とグリコール酸の単量体の比率
を調節させる、または重合体の合成経路を変更させるこ
とにより、多様な分解寿命を持つ生分解性重合体が得ら
れる。このような生分解性脂肪族ポリエステル系重合体
は薬物送達用担体または手術用縫合糸として長い間使用
されてきており、その生体適合性がすでに証明されてい
る。一方、これら生分解性脂肪族ポリエステル系重合体
の分子量は特に制限されないが、重量平均分子量が500
〜100,000、好ましくは5,000〜50,000であるものがナノ
粒子の製造時に良い効果が得られる。
【００２９】上記Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプ
チドを含むペプチド鎖(A)、および上記生分解性脂肪族
ポリエステル系重合体(B)は特に制限されないが、A-B型
またはA-B-A型として構成されうる。まず、生分解性脂
肪族ポリエステル系重合体の両末端に存在するカルボキ
シル基およびヒドロキシル基を、共有結合を促進させる
よう他の官能基に置換する。次に、この重合体の置換さ
れた末端を、Tat49-57ペプチド末端またはTat49-57ペプ
チドを含むペプチド鎖の末端と反応させて上記の構成が
得られる。例えば、Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペ
プチドを含むペプチド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコー
ル酸)とのコンジュゲートはマレイミドに置換されたポ
リ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)と末端基をチオールに置
換したTATペプチドとの共有結合を通じて合成すること
ができる。
【００３０】本発明において、共有結合は特に制限され
ないが、Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含
むペプチド鎖と上記の生分解性脂肪族ポリエステル系重
合体との間に塩基、リンカー、またはマルチリガンド化
合物を添加することによって形成される。
【００３１】本発明はまた、上記のコンジュゲートを使
用して製造されるナノ粒子に関する。この時、ナノ粒子
の平均粒径は、コロイドの安定性の点から小さいほど好
ましい。例えばナノ粒子の平均粒径は1,000nm以下、好
ましくは300nm以下である。
【００３２】本発明のナノ粒子はその表面にTatペプチ
ド部分を露出させることにより、Tatペプチドの膜透過
性を効果的に発揮させ、細胞内への透過性を高めること
ができる。本発明に係るナノ粒子を製造する方法は特に
制限されないが、例えば次のような方法が含まれる。即
ち、重合体を水溶液に直接分散させた後、超音波を加え
る方法；重合体を有機溶媒に分散または溶解させた後、
過量の水で有機溶媒を抽出または蒸発させる方法；重合
体を有機溶媒に分散または溶解させた後、ホモジナイザ
ーまたは高圧乳化機を利用して、強く攪拌して溶媒を蒸
発させる方法；重合体を有機溶媒に分散または溶解させ
た後、過量の水で透析する方法；重合体を有機溶媒に分
散または溶解させた後、徐々に水を添加する方法；超臨
界流体を利用して製造する方法などが挙げられる(T. Ni
waら、J. Pharm. Sci. (1994) 83,5, 727-732; C. S. C
hoら、Biomaterials (1997) 18, 323-326; T. Govender
ら、J. Control. Rel. (1999) 57, 171-185; M. F. Zam
baux et al, J. Control.Rel. (1998) 50, 31-40)。
【００３３】本発明のナノ粒子の製造に使用することが
できる有機溶媒の例としては、アセトン、ジメチルスル
ホキシド、ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリド
ン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチルアセテー
ト、アセトニトリル、メチルエチルケトン、メチレンク
ロライド、クロロホルム、メタノール、エタノール、エ
チルエーテル、ジエチルエーテル、ヘキサン、またはペ
トロリウムエーテルが含まれる。この時、溶媒を単独で
使用することもまたは組み合わせて使用することもでき
る。
【００３４】さらに、本発明のナノ粒子はその内部に特
定の薬物を組み込むことにより、生体利用能が向上した
薬物送達システムとして使用できる。
【００３５】
【実施例】以下に、 実施例、比較例および実験例を記
載して、本発明をさらに具体的に説明する。しかし、使
用する材料、試薬、費用、操作などは、本発明の趣旨お
よび範囲を逸脱することなく当業者であれば変更するこ
とができる。従って、これらの例は、本発明を説明する
ために提示するものであって、制限するものではない。
【００３６】実施例１．Tat49-57ペプチドを含むペプチ
ド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲ
ート Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖を、アミド4-メチル
ベンズヒドリルアミンヒドロクロライド(MBHA)樹脂とAB
I433合成機器を利用して、Fmoc(N-(9-フルオレニル)メ
トキシカルボニル)/t-ブチル方法により、固相ペプチド
合成法(SPPS)で合成し、逆相高速液体クロマトグラフィ
を利用して、純度90%以上に精製した。これを質量分析
機(Agilent 1100シリーズ)で分析した結果、分子量が18
46であることが確認された。これにより、Tat49-57ペプ
チドを含み、リンカーとして4つのアミノ酸からなるGly
-Tyr-Lys-Cysペプチドが付加された配列番号：6のアミ
ノ酸配列を有するペプチドが合成されたことが確認され
た。
【００３７】上記Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と
ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲート
は、マレイミドに置換されたポリ(D,L-乳酸-co-グリコ
ール酸)と末端基をチオールに置換したTatペプチドとの
共有結合により合成した。その製造過程は以下のとおり
である。反応容器に無水1,4-ジオキサン80ml、10gのポ
リ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)、およびトリエチルアミ
ン(TEA)0.2mlを入れ、充分に攪拌して完全に溶解した。
この反応容器に1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(D
CC)とN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)の混合物を添加
して、重合体の主鎖にあるカルボキシル基を活性化し
た。この時カルボキシル基とジシクロヘキシルカルボジ
イミドとN-ヒドロキシスクシンイミドとのモル比は1:2:
2であった。この混合物を室温、窒素下で4時間攪拌し
た。10mlの無水1,4-ジオキサンに溶かした200mgのヘキ
サメチレンジアミンを反応容器に添加し、さらに2時間
攪拌した。得られた反応物を孔径0.45μmのナイロンフ
ィルターで濾過して得た溶液を、無水のジエチルエーテ
ルで沈殿化させた後、エーテルを除去して白色固体を得
た。この固体反応物を再びメチレンクロライドに添加し
て残りの反応物、反応試薬、および副反応物を溶解させ
た。この混合物から、合成された重合体だけを沈殿させ
て回収した。この過程を3回繰り返して重合体をさらに
精製させた。精製された重合体は真空乾燥した。
【００３８】このようにして得られた重合体、即ち末端
にアミン基を持つポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)をメ
チレンクロライドに溶解し、1.5倍(モル比率)過量のN-
スクシンイミジル4-(4-マレイミドフェニル)-ブチレー
トを添加して、ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)の末端
にマレイミドを誘導した。合成された重合体は無水ジエ
チルエーテルで沈殿化し、上記のような沈殿法で精製
し、真空乾燥した。反応容器にジメチルスルホキシド(D
MSO)3mlと上記の合成された重合体100mgを添加し、充分
に攪拌して完全に溶解させた。400μlの反応バッファー
(83mMナトリウムリン酸化緩衝液、0.1M EDTA、0.9M塩化
ナトリウム、0.02%アジ化ナトリウム、pH7.2、安定化
剤)に溶かした配列番号：6のアミノ酸配列を有するペプ
チド鎖5mgを添加して、少なくとも6時間室温下で反応さ
せた。反応後、得られた表題化合物はセルロース膜と蒸
留水を利用した透析により精製し、凍結乾燥した。
【００３９】実施例２．Tat49-57ペプチドを含むペプチ
ド鎖とポリ(D,L-乳酸)とのコンジュゲート ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)の代わりにポリ(D,L-
乳酸)を使用した以外には、実施例1の方法と同様にして
表題の化合物を製造した。
【００４０】実施例３．Tat49-57ペプチドを含むペプチ
ド鎖とポリ(L-乳酸)とのコンジュゲート ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)の代わりに、ポリ(L-
乳酸)を使用した以外には、実施例1の方法と同様にして
表題の化合物を製造した。
【００４１】実施例４．Tat49-57ペプチドを含むペプチ
ド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲ
ートを使用したナノ粒子 本発明のナノ粒子は相反転方法により製造された。実施
例1で得られた100mgのコンジュゲートを10mlのアセトン
に溶解し、0.5%w/vポリビニルアルコール(PVA、88%加水
分解、分子量25,000)を含むリン酸塩緩衝溶液100mlに、
素速く攪拌しながら徐々に加えた。アセトンに溶解し
た、質量比5%の蛍光標識Tat49-57ペプチドを含むペプチ
ド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲ
ートを使用して蛍光標識された高分子ナノ粒子を製造し
た。
【００４２】一方、蛍光標識されたコンジュゲートは、
次のような方法で製造した。まず、実施例1で得られた1
0gのコンジュゲートを500mgのジシクロヘキシルカルボ
ジイミドと300mgのN-ヒドロキシスクシンイミドとの反
応によりエステル化させ、上記コンジュゲートのカルボ
キシル基を活性化させた後、蛍光アミンの第一級アミン
基と共有結合させた。活性化されたコンジュゲートと蛍
光アミンとのカップリング反応は0.5mgのトリエチルア
ミンを添加した後、室温にて窒素下で10時間行った。反
応の副産物として沈殿したジシクロウレアは濾過により
除去し、蛍光標識されたコンジュゲートは無水ジエチル
エーテルで沈殿化させた後、上記のような沈殿法で精製
した。
【００４３】実施例５．Tat49-57ペプチドを含むペプチ
ド鎖とポリ(D,L-乳酸)とのコンジュゲートを使用したナ
ノ粒子 実施例1で製造されたコンジュゲートの代わりに、実施
例2で製造されたコンジュゲートを使用した以外には、
実施例4の方法と同様にして表題の化合物を製造した。
【００４４】実施例６．Tat49-57ペプチドを含むペプチ
ド鎖とポリ(L-乳酸)とのコンジュゲートを使用したナノ
粒子 実施例1で製造されたコンジュゲートの代わりに、実施
例3で製造されたコンジュゲートを使用した以外には、
実施例4の方法と同様にして表題の化合物を製造した。
【００４５】比較例１．ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール
酸)のナノ粒子 実施例1で製造されたコンジュゲートの代わりに、純粋
なポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)を使用した以外に
は、実施例4の方法と同様にして表題の化合物を製造し
た。
【００４６】実験例１．Tat49-57ペプチドを含むペプチ
ド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジ
ュゲートの確認 本発明に係るコンジュゲートを、赤外線分光器を用いて
確認した。図1に、実施例1で製造されたコンジュゲート
(a)および純粋なポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)(b)の
典型的なフーリエ変換赤外線分光スペクトルを示す。実
施例1で製造されたコンジュゲート(a)の場合、1750cm-1
付近のエステル特異的ピークに加えて、1656cm-1付近の
アミン特異的ピークが観察された。これらのピークが存
在することにより、ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)に
Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖が共有結合されたこ
とが示される。
【００４７】実験例２．ナノ粒子の分析 実施例4および比較例1で製造されたナノ粒子の表面電位
を、Zetasizer 3000HS(Malvern, UK)を利用して測定し
た。比較例1で製造されたナノ粒子の表面電位値は-7.8m
Vであるのに対して、実施例4で製造されたナノ粒子は-
0.9mVの表面電位値を示した。このことから、カチオン
性アミノ酸であるリシンとアルギニンを多量に含んでい
るTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖が、ナノ粒子の表
面に配向され、それにより表面電位値が増加することが
示唆される。
【００４８】上記実施例4〜6および比較例1で製造され
たナノ粒子の平均粒子サイズは、動的光散乱法(Zetasiz
er 3000HS, Malvern, UK)により測定した。散乱角度は9
0度に固定して測定し、実験は25℃で行った。受動力学
的粒径はコンチン(Contin)方法により計算された。実験
結果は表1および図2に示す。これらの結果からわかるよ
うに、比較例1で製造されたナノ粒子(d)の粒子サイズに
比べて実施例4〜6で製造されたナノ粒子(c)の平均粒子
サイズの方が大きい。これは、Tat49-57ペプチドを含む
ペプチド鎖に導入されたナノ粒子に比べて純粋なポリ
(D,L-乳酸-co-グリコール酸)のナノ粒子はより強い疎水
性を有し、その疎水性相互作用により、より稠密な構造
のナノ粒子が形成されるためであると推定される。
【００４９】
【表１】
【００５０】さらに、ナノ粒子の形状およびサイズ分布
は、透過型電子顕微鏡(TEM, JEOL 2010)を使用して観察
した。試片は1g/L濃度のナノ粒子が分散されたPBS溶液1
滴を炭素でコートされた100メッシュ銅グリッドに載
せ、1分経過後、2%ウラニルアセテート溶液で染色して
調製した。図3に、実施例4で製造されたナノ粒子の透過
型電子顕微鏡写真を示す。これにより、ナノ粒子が個々
の球形を有することが示される。
【００５１】実験例３．細胞培養による細胞毒性の検査 実施例4および比較例1で製造されたナノ粒子の細胞毒性
は、HaCaT(ヒト角質細胞株)およびHS-68(ヒト繊維芽細
胞株)を用いて評価した。上記の2種類の細胞を、1%容積
の抗生物質 (ストレプトマイシン、10,000μg/ml；ペニ
シリン、10,000IU/ml)および10%容積のウシ胎児血清(以
下「FBS」と称する)を添加した細胞培養培地(Dulbecco
改変Eagle培地；以下「DMEM」と称する)に加え、37℃に
5%CO2を含む湿潤大気が充填されたインキュベーターで
培養した。平底96ウェルプレートに75%細胞密度で培養
された2種類の細胞を1.5〜50μg/ml濃度のナノ粒子とと
もに100μlの培養培地で1時間培養した。その後、10%容
積のFBSを添加して、さらに48時間培養した後、3-(4,5-
ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾ
リウムブロマイド(以下「MTT」と称する)およびラクテ
ート脱水素酵素(以下「LDH」と称する)分析を行い、細
胞の毒性を評価した。
【００５２】96-ウェルプレートで培養されている細胞
にMTTを最終濃度500μg/mlとなるように添加し、37℃で
4時間培養した後、100μlの酸性イソプロパノール(イソ
プロパノールに0.04NのHClを溶解)をそれぞれのウェル
に入れた後、混合して生細胞により転換された色素物質
を溶解させた。96-ウェルプレートの各ウェルに含まれ
る転換された色素物質の吸光度を550nmでELISAプレート
リーダー(ELx800, Bio-TEK Instr. Inc.)を用いて測定
した。MTT分析の標準曲線は、96-ウェルプレートの各ウ
ェルに細胞の個数を変えて添加し、細胞を上記の方法で
培養してMTT分析を施行した後、生細胞の数に対する吸
光度の変化の関係を分析することにより求めた。MTT分
析による実施例4で製造されたナノ粒子の細胞毒性分析
は生存している細胞の率（％）で示した。
【００５３】細胞培養液に溶出したLDH量はCyto Tox 96
非放射性細胞毒性アッセイキット(Cyto Tox 96 Non- R
adioactive Cytotoxicity Assay kit, Promega, Madiso
n, WI, USA)を用いて測定した。培養液を250gの速度で4
分間遠心分離することにより死んだ細胞の残骸を分離し
た。遠心分離後、上清50μlを96ウェルプレートの各ウ
ェルに入れた。50μlの基質溶液を添加して室温で30分
間放置した。溶出したLDHと基質溶液との反応を止める
ため、50μlの1.0M酢酸を加えた。各ウェル中の試料の4
92nmにおける吸光度をELISAプレートリーダーで測定し
た。溶出したLDH(%)は、下記の数学式（式１）により求
めた。
【式１】溶出LDH(%)=(損傷された細胞から溶出したLDH
(実験群)/溶解溶液での処理後、すべての細胞から溶出
した最大LDH)×100
【００５４】図4に、実施例4で製造されたナノ粒子およ
び比較例1で製造されたナノ粒子のMTT細胞毒性アッセイ
法の結果を示す。これらの結果から、Tat49-57ペプチド
を含むペプチド鎖に導入されたナノ粒子と上記ペプチド
鎖の導入されていないナノ粒子との細胞毒性には有意な
差がないことが示される。
【００５５】実験例４．Tat49-57ペプチドを含むペプチ
ド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲ
ートのナノ粒子の細胞内転位 実施例4および実施例5で製造されたナノ粒子（このナノ
粒子は実験例3により、細胞の生存にほとんどまたは全
く影響しないことが確認されている）の細胞内転位を、
共焦点顕微鏡(Radiance 2000/MP, Biorad)を使用しHaCa
T細胞を用いて確認した。透明な35mm Delta T培養皿(厚
さ0.15mm)で培養されたHaCaT細胞を1%容積の抗生物質お
よび蛍光標識された高分子ナノ粒子(濃度＝50μg/ml)を
添加した1mlのDMEM培養培地中で1時間次の2つの条件下
でそれぞれ培養した。第一は37℃、5%二酸化炭素(CO2)
を含む大気下で、第二は4℃、大気下であった。このよ
うな2つの異なる条件でそれぞれ培養した後、1mlのリン
酸塩緩衝溶液で細胞を3回洗浄し、再び1mlのDMEM培養培
地を培養皿に入れた後、染色された細胞の蛍光を観察し
た。その結果を図5に示す。
【００５６】図5aは比較例1で製造されたナノ粒子の37
℃における細胞内転位の程度を示す共焦点レーザー走査
顕微鏡写真であり(図中の目量は10μmを示す)、図5bは
実施例4で製造されたナノ粒子の37℃における細胞内転
位の程度を示す共焦点レーザー走査顕微鏡写真(図中の
目量は10μmを示す)である。これらの図からわかるよう
に、純粋なポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)のナノ粒子
の場合細胞内への転位が全く見られないが、実施例4で
製造されたナノ粒子の場合細胞膜を透過して細胞内部に
ナノ粒子が転位している。したがって、Tat49-57ペプチ
ドを含むペプチド鎖をナノ粒子に導入することにより、
ナノ粒子の細胞内転位が増強できた。
【００５７】
【発明の効果】本発明に係るナノ粒子の表面にTatペプ
チド部分を露出させることにより、Tat 49-57ペプチドの
細胞内透過性が増強されることを本発明者らは確認し
た。したがって、本発明に係るナノ粒子は、重合体の末
端に高い生体膜透過性を有するTat49-57ペプチドまたは
Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖を共有結合させるこ
とにより、先行技術の高分子ナノ粒子の欠点を克服する
ことができた。さらに、本発明に係るナノ粒子は、その
内部に薬物を封入すると、インビボでの生体利用能が向
上した効果的な薬物送達システムとして有用であること
が期待される。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> PACIFIC CORPORATION <120> Conjugate of biodegradable aliphatic polyester with Tat49-57 peptide or peptide chain containing Tat49-57 peptide, and nanoparticle manufactured using the same <130> JS-A0201 <150> Korean Patent Application No: 2002-27328 <151> 2002-05-17 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila Antennapedia <400> 2 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from SynB1 of protegrins <400> 3 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from the src homology 2 (SH2) domain of Grb2 <400> 4 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiphilic model peptide <400> 5 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from Tat49-57 peptide <400> 6 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Tyr Lys Cys 1 5 10
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、実施例1で製造されたコンジュゲート
(a)および純粋なポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)(b)の
典型的なフーリエ変換赤外線分光スペクトルを示す。
【図２】 図2は、実施例4で製造されたナノ粒子(c)お
よび比較例1で製造されたナノ粒子(d)のサイズ分布を示
す。
【図３】 図3は、 実施例4で製造されたナノ粒子の透
過型電子顕微鏡写真を示す。
【図４】 図4は、 実施例4で製造されたナノ粒子およ
び比較例1で製造されたナノ粒子のMTT細胞毒性アッセイ
法の実験結果を示す。
【図５ａおよび５ｂ】 図5aは、 比較例1で製造された
ナノ粒子の37℃における細胞内転位の程度を示した共焦
点レーザー走査顕微鏡写真であり、図5bは実施例4で製
造されたナノ粒子の37℃における細胞内転位の程度を示
した共焦点レーザー走査顕微鏡写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナム ヨン サン 大韓民国 キュンギ−ド ヨンギン−シ スジ−エプ プンダクチョン−リ シンジ ョン−マウル ジュコン アパートメント 901−404 (72)発明者 ハン サン フン 大韓民国 キュンギ−ド スウォン−シ ジャンガン−ク ユルジュン−ドン 276 −３ チュンロク アパートメント ２− 203 (72)発明者 チャン イー セオプ 大韓民国 キュンギ−ド ヨンギン−シ スジ−エプ プンダクチョン−リ 703 ドンボ アパートメント 102−1104 Ｆターム(参考） 4H045 AA10 BA15 BA16 BA17 BA56 BA62 CA05 EA20 FA34 4J029 AA02 AB01 AC01 AC03 AC05 AE06 EA03 EG07 EG09 KH01

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：1のTat49-57ペプチドまたは
    配列番号：1のTat49- 57ペプチドを含むペプチド鎖と生
    分解性脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジュゲー
    ト。
  2. 【請求項２】 生分解性脂肪族ポリエステル系重合体
    が、ポリ(D-乳酸)、ポリ(L-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ポ
    リ(D-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(L-乳酸-co-グリコ
    ール酸)、ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(カプ
    ロラクトン)、ポリ(バレロラクトン)、ポリ(ヒドロキシ
    ブチレート)、ポリ(ヒドロキシバレレート)、ポリ(1,4-
    ジオキサン-2-オン)、ポリ(オルトエステル)、およびこ
    れらの重合体に相当する単量体から製造された共重合体
    からなる群より選択される少なくとも一つの重合体であ
    る、請求項1記載のコンジュゲート。
  3. 【請求項３】 生分解性脂肪族ポリエステル系重合体
    が、ポリ(D-乳酸)、ポリ(L-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ポ
    リ(D-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(L-乳酸-co-グリコ
    ール酸)、およびポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸) から
    なる群より選択される少なくとも一つの重合体である、
    請求項1記載のコンジュゲート。
  4. 【請求項４】 生分解性脂肪族ポリエステル系重合体の
    重量平均分子量が500〜100,000である、請求項1記載の
    コンジュゲート。
  5. 【請求項５】 Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチ
    ドを含むペプチド鎖(A)、および生分解性脂肪族ポリエ
    ステル系重合体(B)がA-B型またはA-B-A型として構成さ
    れる、請求項1記載のコンジュゲート。
  6. 【請求項６】 Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチ
    ドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重
    合体との間に塩基、リンカー、またはマルチリガンド化
    合物が付加される、請求項1記載のコンジュゲート。
  7. 【請求項７】 請求項1〜6のいずれか一項に記載のコン
    ジュゲートを使用して製造されるナノ粒子。
  8. 【請求項８】 平均粒径が1,000nm以下である請求項7記
    載のナノ粒子。
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