KR102441380B1 - 거대분자를 포함하는 세포투과성 펩티드가 도입된 약물전달담체 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 세포 투과 펩티드인 AP-GRR 펩티드(서열번호 1) 또는 상기 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 공유결합 되거나 상기 펩티드를 포함하는 펩티드사슬로 변형된 지질 구조체 또는 고분자 입자를 포함하는 약물전달담체에 관한 것이다. 또한, 본 명세서는 약물전달담체와 그 담체 내부에 포집된 생리활성성분을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 명세서의 약물전달담체의 경우 세포 내로 투입이 어려운 거대분자들을 생체의 세포 내로 효과적으로 전달하여 거대분자들의 생체이용률을 높일 수 있다.

Description

거대분자를 포함하는 세포투과성 펩티드가 도입된 약물전달담체{CELL PENETRATING PEPTIDE INTRODUCED DRUG-DELIVERY CARRIER COMPRISING MACROMOLECULE}
본 명세서는 거대분자를 포함하는 세포투과성 펩티드가 도입된 약물전달담체에 관한 것이다.
일반적으로 친수성이고, 거대한 물질들은 세포막이라는 장벽에 의해 세포안으로 들어갈 수 없다. 세포막은 펩타이드나 단백질, 핵산과 같은 거대 분자가 세포내로 들어오지 못하게 막고, 세포막 수용체에 의한 엔도사이토시스(endocytosis)라는 생리적 기작을 통해 세포내로 들어오더라도 세포의 리소좀(lysosomal compartment)과 융합되어 결국 분해되므로, 이들을 이용한 질병의 치료 및 예방에 있어서 많은 제약이 따른다.
따라서, 생체물질을 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있고 세포독성이 없는 새로운 제재들의 개발이 요구되었으며 필요하다. 최근 새로운 대안들이 제시 되었는데 그 중 세포막 투과성 펩타이드(cell permeable peptide)들이 지금까지 낮은 세포막 투과성 및 빠른 생체내 반감기로 인하여, 약물로 사용하기 어려웠던 치료용 단백질 및 유전자와 같은 거대 분자들의 이용가치를 높일 수 있어 많은 각광을 받고 있다.
이러한 세포막 투과기능을 지닌 펩티드는 주로 단백질에서 유도된 막투과성 펩티드인데, 크게 세 가지 종류로 분류될 수 있다. 첫째는 호메오도메인(homeodomain)에서 유래된 펩티드인 페네트라틴(penetratin) 으로, 서열번호 2(Drosophila melanogaster, 아미노산 서열: Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys)의 아미노산 서열을 가진다. 이는 초파리(Drosophila)의 호메오단백질(homeoprotein)인 안테나페디아(Antennapedia)의 호메오도메인에서 발견되었으며(A. Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,(1991) 88, 1864), 여기서 호메오단백질이란 일종의 전사인자로서 호메오도메인이라고 불리우는 DNA와 결합할 수 있는 60개 정도의 아미노산 구조를 지니고 있다. 둘째는 후천성 면역결핍증후군(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)을 발생시키는 균주인 인간 면역결핍 바이러스 타입-1(human immunodeficiency virus, HIV-1)의 전사관련 단백질인 Tat 단백질의 49-57 번째 사이에 존재하는 Tat49-57 펩티드로서, 서열번호 3(Human immunodeficiency virus type 1, 아미노산 서열: Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg)의 아미노산 서열을 지닌다(P. A. Wender et al., PNAS(2000) 97, 24, 13003-13008). 셋째는 생체막 전위사슬(membrane translocating sequence, 이하 MTS로 명명함) 또는 신호사슬(signal sequences)에 기반한 펩티드로서, RNA에 의해 새로이 합성된 단백질을 생체 내의 적합한 소기관(organelle)들의 막으로 위치시켜주는 것을 돕는 수용체 단백질(acceptor protein)에 의해 인식되며, 핵 국소화 신호(nuclear localization signal, 이하 NLS로 명명함)와 결합된 MTS는 몇 가지 종류의 세포에서 세포막을 통과하여 세포 핵에 축적된다는 것이 밝혀졌다. 예를 들면, 핵 전사 요소 카파 B(nuclear transcription factor kappa B(NF-κB)), 원숭이바이러스 40 T 항원(Simian virus 40(SV40) T-antige) 또는 카포시육종 섬유아세포 성장 인자1(Kaposi sarcoma fibroblast growth factor 1(이하, K-FGF로 명명함))로부터 유래된 NLS 펩티드와 결합된 K-FGF, 인간 베타3 인테그린(human beta3 integrin), HIV-1 gp41 등의 신호 사슬의 소수성 영역으로부터 유래된 MTS들에 있어서 상기의 사실이 확인된 바 있다(Y. Lin et al., J. Biol. Chem.(1996) 271, 5305; X. Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1996) 93, 11819; M. C. Morris et al. Nucleic Acids Res.(1997) 25, 2730; L. Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1998) 95, 9184; Chaloin et al., Biochiem. Biochim. Res. Commun.(1998) 243, 601; Y. Lin et al., J. Biol. Chem. (1995) 270, 14255).
A. Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,(1991) 88, 1864 P. A. Wender et al., PNAS(2000) 97, 24, 13003-13008 Y. Lin et al., J. Biol. Chem.(1996) 271, 5305 X. Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1996) 93, 11819 M. C. Morris et al. Nucleic Acids Res.(1997) 25, 2730 L. Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1998) 95, 9184 Chaloin et al., Biochiem. Biochim. Res. Commun.(1998) 243, 601 Y. Lin et al., J. Biol. Chem. (1995) 270, 14255
세포 안으로 잘 들어가지 못하는 거대분자 물질을 세포 내로 전달하기 위하여 본 발명은 세포 투과성 펩티드와 생리활성성분을 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 측면에 있어서 AP-GRR 펩티드 또는 이를 포함하는 펩티드 사슬과 공유결합된 지질구조체 또는 고분자입자를 포함하는 약물전달담체와 그 담체 내부에 포집된 생리활성성분을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 약물전달담체에 따르면 분자량이 큰 거대분자 물질을, 막투과성 기능을 효과적으로 발휘하는 AP-GRR 펩티드가 도입되어 전달하고자 하는 생리활성성분의 세포 내 전달량을 크게 증진 시킬 수 있는 효과를 나타낸다. 그러므로 본 발명의 일측면에 따른 약물전달담체는 다당류, 효소, 펩타이드 혹은 약물, 단백질 등과 같은 거대 생리활성성분이 세포 내로 잘 전달되지 못하는 단점을 극복하였다.
도 1은 본 발명에 따른 약물전달 담체와 그 비교예를 포함하는 리포좀 수용액을 전자투과현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2는 본 발명의 일측면에 따른 형광물질을 담지한 약물전달담체를 세포에 처리하고 세포 내 이입된 형광물질의 양을 FACS로 분석한 결과를 나타낸 그래프 및 표이다.
도 3은 본 발명의 일측면에 따른 로다민 B를 담지한 약물전달담체를 세포에 처리하고 이를 공초점레이저현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM)으로 관찰한 이미지 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 일측면에 따른 덱스트란-RITC를 담지한 약물전달담체를 세포에 처리하고 이를 공초점레이저현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM)으로 관찰한 이미지 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 로다민 B와 덱스트란-RITC를 각각 PBS와 일반적인 리포존에 적용한 샘플의 피부흡수 실험 결과를 나타낸 현미경 이미지 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 로다민 B와 덱스트란-RITC를 각각 PBS와 본 발명의 일측면에 따른 약물전달담체에 적용한 샘플의 피부흡수 실험 결과를 나타낸 현미경 이미지 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 로다민 B에 대한 피부흡수 실험의 정량적인 결과를 각 샘플에 대하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 덱스트란-RITC에 대한 피부흡수 실험의 정량적인 결과를 각 샘플에 대하여 나타낸 그래프이다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 세포 투과 펩티드 또는 이를 포함하는 펩티드 사슬과 공유결합 된 지질 구조체 또는 고분자 입자를 포함하는 약물전달담체에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 지질 구조체 또는 고분자 입자는 그 구조 내부에 생리활성성분이 포집되는 구조 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 생리활성성분은 수평균분자량 또는 중량평균분자량이 500 Da 이상인 거대분자일 수 있으며, 구체적으로 생리활성성분은 수불용성 또는 수용성 거대분자일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체가 지질 구조체를 포함하는 경우 생리활성성분은 수용성 거대분자 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체가 고분자 입자를 포함하는 경우 생리활성성분은 수불용성 거대분자 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 세포 투과 펩티드는 Gly(Arg)n Gly Tyr Lys Cys의 서열(n = 1 내지 20)을 가지는 AP-GRR 펩티드일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 세포 투과 펩티드에서 n은 3 내지 9임을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 세포 투과 펩티드는 서열번호 1(아미노산 서열: Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Tyr Lys Cys)의 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 세포 투과 펩티드는 서열번호 1(Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Tyr Lys Cys)의 서열일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 지질 구조체 또는 고분자 입자는 양친성 고분자를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 고분자 입자가 양친성 고분자를 더 포함하는 경우, 상기 고분자 입자는 양친성 고분자이거나 또는 그것으로 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 세포 투과 펩티드 또는 이를 포함하는 펩티드 사슬은 양친성 고분자와 공유결합 될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 세포 투과 펩티드 또는 이를 포함하는 펩티드 사슬과 지질 구조체 또는 고분자 입자의 공유결합은 말레이미드(maleimide)기와 티올(thiol)기의 결합에 의해서 생성되는 공유결합인 것일 수 있다. 이러한 공유 결합은 상당히 안정한 것으로 통상의 기술자에게 알려져 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 세포 투과 펩티드 또는 이를 포함하는 펩티드 사슬을 지질 구조체, 고분자 입자, 또는 이들에 포함된 양친성 고분자와 결합시킴에 있어서는 말레이미드기와 티올기의 결합을 통하는 것이 가능하나, 안정한 공유결합이라면 이에 제한되지 않을 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 세포 투과 펩티드는 티올기를 가지고 있으므로, 지질 구조체, 고분자 입자, 또는 이들에 포함된 양친성 고분자에 말레이미드기를 도입하여 세포 투과 펩티드와의 공유결합을 도모할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 지질 구조체, 고분자 입자, 또는 이들에 포함된 양친성 고분자에 말레이미드기를 도입하는 것은 도입하고자 하는 지질 구조체 등의 카르복실기에 말레이미드기를 결합시키는 것에 의하여 도입할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 양친성 고분자는 히알루론산 측쇄에 알킬기가 부착된 알킬화 히알루론산(alkylated hyaluronic acid), 화학식 1의 폴리(메타크릴산-co-n-알킬 메타크릴레이트)랜덤 공중합체, 및 화학식 2의 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트-co-n-알킬 메타크릴레이트)랜덤 공중합체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 양친성 고분자는 일반적인 자유라디칼 열 개시반응(free radical thermal initiation) 방법으로 중합하여 제조되는 일반적인 아크릴레이트 계열의 고분자 일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015089457474-pat00001
[화학식 2]
Figure 112015089457474-pat00002
상기 화학식 1 및 2에서 n = 7~22이고,
x : y 는 몰비율 대비 90 : 10 ~ 50 : 50 이다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 폴리(메타크릴산-co-n-알킬 메타크릴레이트)랜덤 공중합체는 메타크릴산과 n-알킬 메타크릴레이트의 두 종류의 단량체로 구성된 것일 수 있다. 이러한 고분자는 일반적인 자유라디칼 열 개시반응(free radical thermal initiation) 방법으로 중합하여 제조되며, 분자량분포를 조절하기 위해 음이온 또는 양이온 중합을 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트-co-n-알킬 메타크릴레이트)랜덤 공중합체는 하이드록시에틸메타크릴레이트와 n-알킬 메타크릴레이트의 두 종류의 단량체로 구성된 것일 수 있다. 이러한 고분자는 일반적인 자유라디칼 열 개시반응(free radical thermal initiation) 방법으로 중합하여 제조되며, 분자량분포를 조절하기 위해 음이온 또는 양이온 중합을 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 화학식 1 및 2에서 n은 5 이상 내지 30 이하의 정수일 수 있으며, 구체적으로 7 내지 22 사이의 정수, 더 구체적으로는 11 내지 22 사이의 정수 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 화학식 1 및 2에서 x : y는 몰비율 대비 50 내지 90 사이의 정수 : 10 내지 50 사이의 정수 일 수 있으며, 구체적으로 90 : 10, 85 : 15, 70 : 30, 60 : 40, 또는 50 : 50 일 수 있으며, 바람직하게는 85 : 15 내지 70 : 30이 적절하다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 화학식 1 또는 2의 구조를 가지는 양친성 고분자의 분자량은 고분자-리포좀 나노복합체의 구조에 영향을 미치며, 본 발명의 일 측면에 따른 약물전달담체에 사용된느 고분자의 분자량은 수평균 분자량 기준 5,000~100,000이며, 바람직하게는 10,000~50,000이 적절하다.
상기 본 발명의 일 측면에 따른 약물전달담체에 있어서, 지질구조체는 양친성을 가지는 고분자에 의해 보다 더 안정한 구조를 가질 수 있다.
지질-콜레스테롤 기반으로 한 리포좀은 화장품 및 피부외용제에 사용되기 위해서는 제형 내 안정성이 보장되어야 하나, 제형 내 각종 계면활성제들로 인하여 쉽게 그 구조를 잃어버리는 문제점이 있다. 이러한 리포좀에 양친성을 가지는 고분자를 도입함으로써 구조적으로 불안정한 단점을 어느 정도 극복할 수 있다. 양친성 고분자가 도입된 고분자-리포좀 복합체는 지질-콜레스테롤 기반 리포좀과 유사한 형태를 유지하며, 양친성 고분자의 소수성 부분이 지질, 지질-콜레스테롤 기반 지질 이중층 사이에 같이 회합된 구조를 가지게 된다. 따라서 지질 이중층을 단단히 묶어주어 외벽을 보호하여 수상에 존재하는 각종 리포좀 구조를 불안정하게 하는 염 또는 계면활성제 등의 요소들로부터 안정하게 리포좀의 구조를 유지시키는 역할을 하게 된다.
상기 본 발명의 일 측면에 따른 약물전달담체에 있어서, 상기 양친성 고분자로 사용될 수 있는 고분자의 분자량 범위는 수평균 분자량 기준 5,000Da~200,000 Da이며, 바람직하게는 10,000~100,000 Da일 수 있다. 상기 양친성 고분자의 분자량은 1,000 Da 이상, 2,000 Da 이상, 3,000 Da 이상, 4,000 Da 이상, 5,000 Da 이상, 6,000 Da 이상, 7,000 Da 이상, 8,000 Da 이상, 9,000 Da 이상, 10,000 Da 이상, 11,000 Da 이상, 12,000 Da 이상, 13,000 Da 이상, 14,000 Da 이상, 15,000 Da 이상, 20,000 Da 이상, 30,000 Da 이상, 50,000 Da 이상, 또는 100,000 Da 이상이거나, 200,000 Da이하, 150,000 Da이하, 100,000 Da이하, 90,000 Da이하, 80,000 Da이하, 70,000 Da이하, 60,000 Da이하, 50,000 Da이하, 40,000 Da이하, 30,000 Da이하, 20,000 Da이하, 10,000 Da이하, 5,000 Da이하, 3,000 Da이하, 또는 1,000 Da이하일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 양친성 고분자의 소수성 부분은 친수성 부분 대비 몰비율 10%~50%일 수 있다. 10% 미만이면 고분자가 수상에 일부 독립적으로 존재할 가능성이 있을 뿐만 아니라 계면활성제로서의 역할을 할 가능성이 있고, 50%를 초과하는 경우 고분자의 소수성부분이 너무 높아 리포좀과 복합체를 이룰 때 리포좀의 구조를 불안하게 하는 요소로 작용할 가능성이 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 양친성 고분자는 일반적인 자유라디칼 열 개시반응(free radical thermal initiation) 방법으로 중합하여 제조될 수 있으며, 분자량 분포를 조절하기 위해 음이온 또는 양이온 중합을 이용할 수 있다. 또한, 히알루론산과 같은 천연고분자의 경우 소수성을 부가하기 위하여 알킬 사슬을 측쇄에 공유결합 시키는 방법이 사용 될 수도 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 지질구조체 또는 고분자입자:양친성 고분자의 중량비율은 이들의 혼합물 총 중량을 기준으로 50~99중량%:1~50중량%이며, 바람직하게는 70~90중량%:10~30중량% 일 수 있으며, 상기 지질 구조체는 콜레스테롤을 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 약물전달담체의 리포좀의 구조적인 안정도를 증진시키기 위하여 양친성 고분자를 더 포함하는 경우, 이러한 양친성 고분자는 지질 구조체 또는 고분자입자 및 양친성 고분자 혼합물의 총중량에 대하여 1~50 중량%, 바람직하게는 10~30 중량%의 양으로 사용될 수 있다. 이는 상기 함량의 경우 가장 안정한 고분자-리포좀 복합체 제조에 용이하기 때문이다.
본 발명의 일 측면에 있어서, “수평균분자량”은 분자량 분포를 가지는 고분자 화합물의 성분 분자종의 분자량을 수 분율 또는 몰 분율로 평균하여 얻는 평균 분자량을 의미할 수 있으며, “중량평균분자량”은 분자량 분포가 있는 고분자 화합물의 성분 분자종의 분자량을 중량 분율로 평균하여 얻어지는 평균분자량을 의미할 수 있다. 이러한 수평균분자량 및 중량평균분자량의 계산 방법은 본 발명의 기술분야의 통상의 기술자에게 자명한 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 생리활성성분의 수평균분자량 또는 중량평균분자량은 1,000 Da 이상, 2,000 Da 이상, 3,000 Da 이상, 4,000 Da 이상, 5,000 Da 이상, 6,000 Da 이상, 7,000 Da 이상, 8,000 Da 이상, 9,000 Da 이상, 10,000 Da 이상, 11,000 Da 이상, 12,000 Da 이상, 13,000 Da 이상, 14,000 Da 이상, 15,000 Da 이상, 20,000 Da 이상, 30,000 Da 이상, 50,000 Da 이상, 100,000 Da 이상, 300,000 Da 이상, 500,000 Da, 또는 1,000,000 Da 이상이거나, 5,000,000 Da 이하, 4,000,000 Da 이하, 3,000,000 Da 이하, 2,000,000 Da 이하, 또는 1,000,000 Da 이하일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 생리활성성분은 거대분자로서 합성된 수용성 거대분자 물질, 천연물의 추출을 통해 수득되는 거대분자 물질, 효소, EGF(epidermal growth factor), 단백질, 펩타이드, 및 다당류로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 이러한 생리활성성분은 피부 보습, 미백, 및 항산화 효과와 같은 유용한 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 생리활성성분은 제한되지는 않으나 합성, 추출, 또는 천연적으로 수득되는 것을 망라하는 수용성 거대분자로서 가장 광범위한 개념의 수용성 거대분자일 수 있으며, 이러한 거대분자는 피부에 유용한 효과를 제공하는 것일 수 있다.
본 발명은 일측면에 있어서, 본 발명의 일 측면에 따른 약물전달담체 및 담체 내부에 포집된 생리활성성분을 포함하는 조성물에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물의 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물에는 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있으며, 이러한 기능성 첨가물들은 생리활성성분에 해당하여 본 발명의 일측면에 따른 약물전달담체에 포집될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 연질 또는 경질 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 바람직하게는 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 피부 외용제, 좌제, 주사제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 주사제 또는 피부 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은, 통상의 기술자가 용이하게 적용할 수 있는 다양한 경로로 투여될 수 있다. 특히 본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 피부 외용제로서 피부 표면에 도포되는 경로로 투여될 수 있다. 본 발명은 세포 투과 펩티드로서, Gly(Arg)n Gly Tyr Lys Cys의 서열(n = 1 내지 20)을 가지는 것을 특징으로 하는 AP-GRR 펩티드를 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, AP-GRR 펩티드에서 상기 n은 3 내지 9임을 특징으로 한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, AP-GRR 펩티드에서 상기 서열은 서열번호 1의 서열인 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 약물전달담체가 지질구조체를 포함하는 경우, 약물전달담체는 안정화제를 더 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 안정화제는 콜레스테롤 유도체인 것을 특징으로 한다. 구체적으로 상기 안정화제는 콜레스테롤 일 수 있다. 상기 콜레스테롤 유도체는 콜레스테롤을 모핵으로하는 유도체를 의미한다.
구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체는 세포 투과 펩티드 또는 이를 포함하는 펩티드 사슬과 공유결합 된 지질 구조체; 안정화제; 및 생리활성성분을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체는 지질구조체: 안정화제를 1~3 : 1~2 의 몰비율로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 비율은 1.5~3.0 : 1.0~2.0 의 몰비율일 수 있다. 더 구체적으로 지질 구조체의 경우 2가지 이상의 지질의 조합으로 구성된 것일 수 있으며, 이 때 구성된 지질은 1~2 : 1~2 의 지질 몰비율로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체에서 지질구조체는 디올레일포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 및 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜-말레이미드(DSPE-PEG-Mal) 복합체중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체는 디올레일포스파티딜에탄올아민 : 포스파티딜콜린 : 콜레스테롤 : 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜-말레이미드(DSPE-PEG-Mal) 복합체를 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 1.0~3.0 : 0.01~1.0 의 몰비율로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 몰비율은 1.0~1.5 : 1.0~1.5 : 1.5~2.5 : 0.1~0.3 일 수 있다. 상기와 같은 지질 종류와 몰 비율을 가지는 경우에 수용성 거대분자를 세포 내로 전달하는데 가장 뛰어난 효과를 나타내는 약물전달담체를 구성할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체의 지질구조체 또는 고분자 입자와 공유결합 된 AP-GRR 펩티드 또는 이를 포함하는 펩티드 사슬은 지질구조체 또는 고분자 입자를 기준으로 1 몰% 이상, 2 몰% 이상, 4 몰% 이상, 6 몰% 이상, 8 몰% 이상, 또는 10 몰% 이상이거나, 15 몰% 이하, 10 몰% 이하, 8몰% 이하, 6몰% 이하, 4몰% 이하, 2몰% 이하, 1몰% 이하, 또는 0.1 몰% 이하로 도입된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 지질 구조체는 리포좀 또는 에멀젼인 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 리포좀 또는 에멀젼의 지질성분은 탄소수 12 내지 24의 지방산 사슬을 갖는 인지질류 또는 질소지질인 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 인지질류는 난황레시틴(포스파티딜콜린), 대두 레시틴, 리조레시틴(lysolecithin), 스핑고마이엘린(sphingomyelin), 포스파티딘산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 디포스파티딜글리세롤, 카르디오리핀(cardiolipin), 플라즈마로겐의 천연인지질 이들 인지질로부터 통상의 방법에 의해 수득할 수 있는 수소첨가 생성물 디세틸포스페이트, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디팔미토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜세린, 엘레오스테아로일포스파티딜콜린, 엘레오스테아로일포스파티딜에탄올아민, 엘레오스테아로일포스파티딜세린의 합성 지질 및 이들의 가수분해에 의해 수득할 수 있는 지방산 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 인지질류의 조합은 포스파티딜콜린과 포스파티딜에탄올아민의 조합, 포스파티딜콜린과 포스파티딜글리세롤의 조합, 포스파티딜콜린과 포스파티딜이노시톨의 조합, 포스파티딜콜린과 포스파티딘산의 조합, 포스파티딜콜린과 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 조합, 또는 포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린의 조합인 것을 특징으로 한다.
구체적으로 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 리포좀은 포스파티딜콜린 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 조합일 수 있다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조합비는 최소성분에 대한 최대 성분의 혼합비율이 1:5 이하인 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조합은 포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린일 수 있으며, 상기 포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린의 조합의 조합비는 1~4 : 1~2 : 1~2 인 것일 수 있다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 지질성분은 전체 리포좀 분산액 또는 에멀젼 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%인 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 고분자 입자는 생체에 적합하고 염증이나 면역반응을 유발하지 않으며 생체 내에서 분해되고 그 분해산물 역시 생체 내에서 무해한 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 고분자 입자는 양친성 고분자 또는 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 고분자 입자는 락트산과 글리콜산을 기초로 하는 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 하기 화학식 3의 폴리(D,L-락트산)(poly(D,L-lactic acid)), 폴리(L-락트산), 폴리(D-락트산) 하기 화학식 4의 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리(D-락트산-co-글리콜산), 폴리(L-락트산-co-글리콜산) 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone)), 폴리(발레로락톤)(poly(valerolactone)), 폴리(히드록시 부티레이트)(poly(hydroxy butyrate)), 폴리(히드록시 발러레이트)(poly(hydroxy valerate)), 폴리(1,4-디옥산-2-온)(poly(1,4-dioxane-2-one)), 폴리(오르토 에스테르)(poly(ortho ester)) 및 이들의 단량체로부터 제조된 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
[화학식 3]
Figure 112015089457474-pat00003
(상기 식에서 n은 2이상의 정수이다.)
[화학식 4]
Figure 112015089457474-pat00004
(상기 식에서 m과 n은 서로 같거나 다른 2이상의 정수이다.)
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 분자량은 평균 500Da 내지 100,000Da인 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 AP-GRR 펩티드(A)와 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자(B)는 A-B형 또는 A-B-A형으로 공유결합되어 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 공유결합은 AP-GRR 펩티드 또는 AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 상기 리포좀, 에멀젼 또는 고분자 입자 사이에 염기, 링커 또는 멀티리간드 화합물을 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약물전달담체의 평균입자직경은 1,000nm 이하인 것일 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체의 평균입자직경은 100nm 이상, 200nm 이상, 300nm 이상, 400nm 이상, 500nm 이상, 600nm 이상, 700nm 이상, 800nm 이상, 900nm 이상, 1,000nm 이상, 또는 2,000nm 이상이거나, 3,000nm 이하, 2,000nm 이하, 1,000nm 이하, 900nm 이하, 800nm 이하, 700nm 이하, 600nm 이하, 500nm 이하, 400nm 이하, 300nm 이하, 200nm 이하, 또는 100nm 이하일 수 있다.
본 발명은 일측면에 있어서, 상기 약물전달담체를 리포좀 분산액 또는 에멀젼, 고분자 입자 총 중량에 대하여 0.01~30중량%의 생리활성유효성분과 함께 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체에 포집된 생리활성성분은 리포좀 분산액 또는 에멀젼, 고분자 입자의 총 중량에 대하여 0.01~30중량%일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 있어서, 생리활성성분은 리포좀 분산액 또는 에멀젼, 고분자 입자의 총 중량에 대하여 0.01중량% 이상, 0.05 중량%이상, 0.1중량%이상, 0.5중량%이상, 1중량%이상, 2중량%이상, 3중량%이상, 4중량%이상, 5중량%이상, 6중량%이상, 10중량%이상, 15중량%이상, 20중량%이상, 25중량%이상, 또는 30중량%이상 이거나 30중량%이하, 25중량%이하, 20중량%이하, 15중량%이하, 10중량%이하, 6중량%이하, 5중량%이하, 4중량%이하, 3중량%이하, 2중량%이하, 1중량%이하, 0.5중량%이하, 0.1중량%이하, 0.05중량%이하, 또는 0.01중량%이하 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 피부외용제, 경구용 제제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 새롭게 고안된 뛰어난 생체막 투과성을 가진 GRR 펩티드로서 아르기닌이 풍부하고 양 말단에 각각 Glycine(Gly) 아미노산과Glycine(Gly)- Tyrosine(Tyr)- Lysine(Lys)- Cystein(Cys) 아미노산 사슬을 포함하는 펩티드를, 약물, 유전자, 올리고 펩티드, 단백질 등의 수불용성 또는 수용성 거대분자를 포집하는 구조를 가진 리포좀, 고분자 나노입자, 인지질-고분자 복합체, 에멀젼 등의 전달담체 표면에 개질화하여, 전달하고자 하는 물질을 경피, 경구, 주사제 등의 다양한 경로로 전달하였을 경우의 생체이용률(bioavailability)을 높이기 위한 것이다. AP-GRR 펩티드에 있어서 Gly(Arg)n Gly Tyr Lys Cys의 서열에서 Arg의 개수는 1 내지 20개, 바람직하게는, 3 내지 9개를 포함한다. 이는 높은 전달 효율을 가지면서 동시에 약물전달담체와 결합하여 제조하기에 용이하기 때문이다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 AP-GRR 펩티드 또는 AP-GRR을 포함하는 펩티드사슬은 특별히 제한되지는 않지만, 예를 들어, 아미드 4-메틸벤지드릴아민 하이드로클로라이드(MBHA) 수지와 ABI 433 합성기기를 이용하여 Fmoc(N-(9-플루레닐)메톡시카르보닐)/t-부틸 방법을 따라 고체상 펩티드 합성법(solid phase peptide synthesis; SPPS)으로 합성할 수도 있다(M. Bodansky, A. Bodansky, The Practice of Peptide Synthesis; Springer:Berlin, Heidelberg, 1984, J.M. Stewart, J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed; Pierce Chemical Co: Rockford. IL, 1984).
본 발명의 일측면에 있어서, 약물전달담체는 리포좀 또는 에멀젼, 고분자 입자 등의 구조체를 이용할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 리포좀 또는 에멀젼을 제조함에 있어서, 지질 구조체의 지질성분으로는 탄소수가 12~24개의 지방산 사슬을 갖는 인지질류나 질소지질이 사용될 수 있다. 이는 피부외용제, 경구용 제제, 주사제 등의 약제학적 조성물에 사용할 수 있는 지질 기반 약물전달담체의 구성성분으로 활용하기에 용이하기 때문이다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 지질 구조체의 지질성분으로 일반적으로는 인지질이 더 바람직한데, 예를 들면, 난황 레시틴(포스파티딜콜린), 대두 레시틴, 리조레시틴(lysolecithin), 스핑고마이엘린(sphingomyelin), 포스파티딘산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 디포스파티딜글리세롤, 카르디오리핀(cardiolipin), 플라즈마로겐 등의 천연 인지질 이들 인지질로부터 통상의 방법에 의해 수득할 수 있는 수소첨가 생성물 및 디세틸포스페이트, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜-에탄올아민, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜세린, 엘레오스테아로일포스파티딜콜린, 엘레오스테아로일포스파티딜에탄올아민, 엘레오스테아로일포스파티딜세린 등의 합성 지질 및 이들의 가수분해에 의해 수득할 수 있는 지방산 혼합물이 바람직하다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 지질은 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 병용할 수도 있다. 2종의 인지질류를 혼합하여 사용하는 경우, 바람직하게는 예를 들어, 하기의 조합들 포스파티딜콜린:포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린:포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린:포스파티딜이노시톨, 포스파티딜콜린:포스파티딘산, 포스파티딜콜린:디올레오일포스파티딜에탄올아민 등을 사용할 수 있다. 혼합 비율은 혼합되는 성분 구성에 따라 차이가 있는데, 최소 성분에 대한 최대 성분의 혼합비율은 1:5 이하인 것이 바람직하다. 이 경우 2종 이상의 인지질류를 혼합하여 지질기반 약물전달담체 제조시 용이하기 때문이다. 예를 들어, 포스파티딜콜린:디올레오일포스파티딜에탄올아민의 경우 각각 1:1 혹은 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 등의 몰비율로 다양하게 하여 제조할 수 있다. 또한, 3종의 인지질류를 혼합하여 사용하는 경우도, 예를 들어, 포스파티딜콜린:디올레오일포스파티딜에탄올아민:포스파티딜세린을 각각 1:1:1 혹은 2:1:1, 3:1:2, 3:2:1. 3:2:2. 4:1:1, 4:2:1 등의 몰비율로 다양한 혼합비로 제조할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체의 지질성분은 전체 리포좀 분산액 또는 에멀젼 총 중량에 대하여 0.001~20 중량%, 바람직하게는 0.2~10 중량%의 양으로 사용한다. 이는 상기 함량의 경우 약물전달담체 제조에 용이하기 때문이다.
본 발명의 일 측면에 따른 고분자 입자를 제조함에 있어서, 이는 생체에 적합하고, 염증이나 면역반응 등을 유발하지 않으면서 생체 내에서 분해될뿐더러 그 분해산물 역시 생체 내에서 무해한 고분자이어야 한다. 이러한 조건을 만족하는 고분자로서 락트산과 글리콜산을 기본단위로 하는 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자가 미국식품의약국(FDA)에 의해 승인을 받은 고분자로서 가장 널리 이용되고 있다. 그 대표적인 예로서 상기 화학식 3의 폴리(D,L-락트산)(poly(D,L-lactic acid)), 폴리(L-락트산), 폴리(D-락트산)과 상기 화학식 4의 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리(D-락트산-co-글리콜산), 폴리(L-락트산-co-글리콜산), 및 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone)), 폴리(발레로락톤)(poly(valerolactone)), 폴리(히드록시 부티레이트)(poly(hydroxy butyrate)), 폴리(히드록시 발러레이트)(poly(hydroxy valerate)), 폴리(1,4-디옥산-2-온)(poly(1,4-dioxane-2-one)), 폴리(오르토 에스테르)(poly(ortho ester)), 및 이들의 단량체로부터 제조된 공중합체 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 분자량은 특별히 제한되지 않으나, 500 미만이거나 100,000 초과시 약물전달담체로서의 구조 불안정성이 증가될 것으로 우려되므로, 중량 평균 분자량이 500 내지 100,000, 바람직하게는 5,000 내지 50,000인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 분자량은 1,000 Da 이상, 2,000 Da 이상, 3,000 Da 이상, 4,000 Da 이상, 5,000 Da 이상, 6,000 Da 이상, 7,000 Da 이상, 8,000 Da 이상, 9,000 Da 이상, 10,000 Da 이상, 11,000 Da 이상, 12,000 Da 이상, 13,000 Da 이상, 14,000 Da 이상, 15,000 Da 이상, 20,000 Da 이상, 30,000 Da 이상, 50,000 Da 이상, 또는 100,000 Da 이상이거나, 200,000 Da이하, 150,000 Da이하, 100,000 Da이하, 90,000 Da이하, 80,000 Da이하, 70,000 Da이하, 60,000 Da이하, 50,000 Da이하, 40,000 Da이하, 30,000 Da이하, 20,000 Da이하, 10,000 Da이하, 5,000 Da이하, 3,000 Da이하, 또는 1,000 Da이하일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 화학식 4의 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)의 경우에는 락트산과 글리콜산 단량체의 비율을 조절하거나, 고분자 합성과정을 변경시킴으로써 다양한 분해수명을 갖는 생분해성 고분자를 얻을수 있다. 이와 같은 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 약물전달담체 또는 수술용 봉합사로 오랫동안 사용되어 왔고, 그 생체적합성이 이미 증명된 바 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 AP-GRR 펩티드와(A)과 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자(B)는 특별히 제한되지는 않지만, A-B형 또는 A-B-A 형으로 구성될 수 있다. 이는 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자의 양말단에 존재하는 카르복실기 및 수산화기를 공유결합에 용이하도록 다른 기능성 그룹(functional group)으로 치환시키고, 고분자의 치환된 말단을 이와 반응이 용이한 그룹을 가진 AP-GRR 펩티드의 말단기 또는 AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬의 말단기와 반응시켜 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 AP-GRR 펩티드 또는 AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과의 공유결합체는 말레이미드로 치환된 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)과 말단기를 티올로 치환한 AP-GRR 펩티드와의 공유결합을 통하여 합성될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 공유결합은 특별히 제한되는 것은 아니지만, AP-GRR 펩티드 또는 AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬과 상기 리포좀, 에멀젼, 고분자 사이에 별도의 염기, 링커 또는 멀티리간드 화합물을 첨가하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 약물전달담체의 내부 구조에 포집되는 생리활성성분은 생체에 적용할 수 있는 것이라면 수용성 또는 수불용성 등 그 종류에 제한이 없다. 예를 들어, 단일성분이나 동물 또는 식물이나 균주 추출물, 및 이들의 2종 이상이 포함된 혼합물일 수 있으며, 이는 목적과 경우에 따라 조절하여 사용할 수 있다. 미백 증진 또는 주름 및 노화 방지와 치료의 효능을 가진 성분 등이 사용될 수 있다. 이들 생리활성성분은 리포좀 분산액 또는 에멀젼, 고분자 입자 총 중량에 대하여 0.01~30중량%, 바람직하게는 0.1~20중량%의 양으로 함입될 수 있다. 이는 조성물의 피부외용제, 경구용 제제, 주사제 등 제형화에 용이한 함량이기 때문이다.
본 발명의 일 측면에 따른 AP-GRR 펩티드를 이용하여 제조된 약물전달담체의 평균입자직경은 작을수록 바람직하며, 콜로이드의 안정성을 고려할 때, 최소한 1,000 nm 이하, 바람직하게는 500 nm 이하이다.
본 발명에서 제시하는 리포좀, 에멀젼 고분자 입자 등을 제조하는 방법은 특별히 제한되지는 않지만, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서 제시하는 지질 성분을 이용하여 생리활성성분이 함입된 약물전달담체를 형성하는 방법으로서는, 상기 인지질류와 안정화제를 유기용매에 용해시킨 뒤 용매를 증발, 감압시키며 지질 필름을 형성시키고 수용액을 가한 뒤 초음파를 가하는 방법 유기용매에 녹은 인지질류와 안정화제를 수용액에 분산시킨 뒤 초음파를 가하는 방법 인지질류와 안정화제를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 유기용매를 추출 또는 증발시키는 방법, 인지질류와 안정화제를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 균질기 또는 고압유화기를 이용하여 강하게 교반하고 용매를 증발시키는 방법, 인지질류와 안정화제를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 투석하는 방법, 인지질류와 안정화제를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 서서히 물을 첨가하는 방법 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.
상기의 제조방법과 관련하여, 인지질류와 안정화제를 유기 용매에 용해시키기 위해서, 기계적 힘을 가하거나 20~100℃ 바람직하게는 70℃이하로 가열할 수 있다.
생리활성성분이 수용성인 경우, 생리활성성분을 물에 녹이거나 수용액에 녹여서 상기 수용액 또는 물을 첨가하는 단계에서 함께 투여된다. 생리활성성분이 수불용성인 경우에는, 생리활성성분을 유기 용매에 용해시킨 후 지질 성분이 있는 유기 용매상에 포함시켜 상기와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
상기한 방법에서 인지질류와 안정화제 또는 수불용성 생리활성성분을 용해시키기 위해사용할 수 있는 유기 용매로는, 아세톤, 디메틸설폭시드, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 디옥산, 테트라히드로퓨란, 아세트산, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 메틸에틸케톤, 염화메틸렌, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 에틸에테르, 디에틸에테르, 헥산 및 석유에테르 중에서 선택된 1종 또는 이들을 혼합한 용매를 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명에서 제시하는 고분자 입자의 제조방법으로서는 고분자를 바로수용액에 분산시킨 뒤 초음파를 가하는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 유기용매를 추출 또는 증발시키는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 균질기 또는 고압유화기를 이용하여 강하게 교반하고 용매를 증발시키는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 투석하는 방법, 고분자를 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 서서히 물을 첨가하는 방법, 초임계 유체를 이용하여 제조하는 방법 등을 들 수 있다(T. Niwa et al., J. Pharm. Sci.(1994) 83, 5, 727-732; C. S. Cho et al., Biomaterials(1997) 18,323-326; T. Govender et al., J. Control. Rel.(1999) 57, 171-185; M. F. Zambaux et al., J. Control. Rel.(1998) 50, 31-40).
본 발명의 고분자 입자의 제조에 사용될 수 있는 유기용매로서는 아세톤, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 디옥산, 테트라히드로푸란, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 메틸에틸케톤, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 에틸에테르, 디에틸에테르, 헥산, 또는 페트롤리움 에테르를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이때 상기의 용매를 단독으로 사용하거나 또는 2 이상의 용매를 혼합하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜-말레이미드(DSPE-PEG-Mal) 복합체는 하기 화학식 5의 구조를 가지는 것일 수 있다.
[화학식 5]
Figure 112015089457474-pat00005
이하 실시예, 비교예 및 실험예를 기재하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 이하의 예에 나타나는 재료, 시약, 비용, 조작 등은 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 한 적절히 변경할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 이하에 나타내는 구체예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 및 비교예] 약물전달담체의 제조
AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드사슬은 아미드 4-메틸벤지드릴아민 하이드로클로라이드(MBHA) 수지와 ABI 433 합성기기를 이용하여 Fmoc(N-(9-플루레닐)메톡시카르보닐)/t-부틸 방법을 따라 고체상 펩티드 합성법(solid phase peptide synthesis; SPPS)으로 합성하였으며, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Reverse High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 순도 90% 이상으로 정제하였다. 이를 질량 분석기(Agilent 1100 시리즈)로 분석한 결과 분자량을 측정함으로 성공적 합성 여부가 확인되었다. 이로써, AP-GRR 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 합성되었음을 확인하였다. 상기 AP-GRR를 표면에 도입한 지질 구조체 제조과정은 아래와 같다.
표 1의 지질 조성에 기재되어 있는 지질들을 그 지질 몰비율에 따라 섞은 뒤 클로로포름:메탄올(95:5,부피/부피) 혼합 유기용매에 녹인 후, 감압하며 용매를 증발시켜 필름을 형성하였다. 예를 들어, 실시예 2의 경우 디올레일포스파티딜에탄올아민 : 포스파티딜콜린 : 콜레스테롤 : 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜-말레이미드 복합체를 1.5 : 1.1 : 2 : 0.4의 몰비율로 혼합한 뒤 클로로포름 : 메탈올(95:5, 부피/부피) 혼합 유기용매에 녹인 후, 감압하여 용매를 증발시켜 필름을 형성하였다.
유기용매가 제거된 필름에 PBS(WELGENE사, 이하 동일)에 녹인 형광표지물질인 로다민(rhodamine) B(시그마알드리치, CAS NO. 81-88-9)나 덱스트란(dextran)-RITC(수평균분자량 약 10,000Da)(시그마알드리치)을 가한 후, 초음파를 가하여 리포좀 지질 분산액을 제조하였다. 이렇게 제조된 리포좀 지질 분산액에 AP-GRR 펩티드를 PBS에 용해시켜 투입한 뒤 상온(약 25℃)에서 교반하여 반응시켰다. 이러한 반응에 의해 AP-GRR의 티올(thiol)기와 리포좀 표면에 도출된 말레이미드(maleimide) 기능기와 수분 동안 반응 시켜 AP-GRR 도입된 리포좀을 제조하였으며, 이러한 결합 반응은 매우 안정한 것으로 알려져 있다. 지질들의 최종 수용액 내 농도는 0.2 wt% 이다.
상기 방법에 의거하여 하기 표 1과 같은 지질 조성 및 지질 몰비율에 따라서 실시예 및 비교예를 제조하였다. 하기 표에서 실시예 1 내지 5는 AP-GRR이 도입된 리포좀으로서, 단 실시예 1은 형광물질을 담지하지 않은 것이다. 비교예 1은 AP-GRR이 도입되지 않은 리포좀으로서 형광물질을 담지하지 않은 것이고, 비교예 2 및 4는 형광물질을 녹인 PBS 용액에 해당하며 비교에 3 및 5는 AP-GRR이 도입되지 않은 리포좀으로서 형광물질을 함유한 것이다. 실시예 1 내지 5의 지질 몰비율에서 DSPE-PEG-Mal은 PEG와 Mal의 분자량을 뺀 DSPE의 분자량을 기준으로 계산하였으며, 지질 비율로만 계산하여 AP-GRR을 리포좀을 구성하는 지질 중 4 몰% 및 8 몰%로 도입하고자 하였다. 또한 양친성 고분자 도입에 따른 실험을 수행하기 위하여 실시예 6으로서 실시예 5의 조성에 양친성 고분자만을 더 추가한 실시예를 설정하였다. 실시예 6에서 사용된 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트-co-스테아릴 메타크릴레이트)공중합체는 수평균분자량이 47,552(PDI 2.20)에 해당하는 것이다.
이러한 양친성 고분자의 중합방법은 에탄올 150g에 하이드록시에틸메타크릴레이트(시그마 알드리치로부터 구입)와 스테아릴 메타크릴레이트(시그마 알드리치로부터 구입) 단량체를 0.0995654:0.232315의 몰비율로 투입하고, 라디칼 중합 개시제인 AIBN(Azobisisobutyronitrile)(JUNSEI로부터 구입)을 0.003319 몰 첨가하여 75℃에서 하룻밤 동안 교반하여 고분자 중합을 수행하였다. 중합 후 가온을 중단하고 온도가 상온으로 떨어질 때 까지 방치한다. 그런 뒤 에탄올 용액을 기준으로 5배 내지 10배의 에테르를 천천히 첨가하면서 교반하고, 용매를 필터로 제거하여 교반으로 생성된 침전물을 수득하였다. 이렇게 수득된 침전물을 진공건조 하여 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트-co-스테아릴 메타크릴레이트)공중합체 파우더 40g을 수득하였다.
실시예 6의 제조에 있어서 양친성 고분자는 지질들을 유기용매에 녹일 때 함께 첨가하는 것을 제외하고는 동일한 과정으로 제조하였다.
지질 조성 지질 몰비율 양친성 고분자 AP-GRR 도입 유무 최종 용액에서 형광물질의 농도
실시예 1 DOPE:PC:Chol:DSPE-PEG-Mal 1.5:1.1:2:0.4 X O -
실시예 2 DOPE:PC:Chol:DSPE-PEG-Mal 1.5:1.1:2:0.4 X O 로다민B, 0.05 wt%
실시예 3 DOPE:PC:Chol:DSPE-PEG-Mal 1.5:1.3:2:0.2 X O 로다민B, 0.05 wt%
실시예 4 DOPE:PC:Chol:DSPE-PEG-Mal 1.5:1.1:2:0.4 X O 덱스트란-RITC, 1 wt%
실시예 5 DOPE:PC:Chol:DSPE-PEG-Mal 1.5:1.3:2:0.2 X O 덱스트란-RITC, 1 wt%
실시예 6 DOPE:PC:Chol:DSPE-PEG-Mal 1.5:1.3:2:0.2 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트-co-스테아릴 메타크릴레이트)공중합체(최종 용액에서 농도 기준, 0.06wt%) O 덱스트란-RITC, 1 wt%
비교예 1 DOPE:PC:Chol 1.5:1.5:2 X -
비교예 2 - - - 로다민B, 0.05 wt%
비교예 3 DOPE:PC:Chol 1.5:1.5:2 X 로다민B, 0.05 wt%
비교예 4 - - - 덱스트란-RITC, 1 wt%
비교예 5 DOPE:PC:Chol 1.5:1.5:2 X 덱스트란-RITC, 1 wt%
* DOPE : 포스파티딜에탄올 아민(두산바이오텍으로부터 입수), PC : 포스파티딜콜린(LIPOID사), Chol : 콜레스테롤(시그마 알드리치), DSPE-PEG-Mal(분자량 2941.605)(NOF 사) : 디스테아릴포스파티딜 에탄올아민-폴리에틸렌글리콜-말레이미드 복합체(N-[(3-Maleimide-1-oxopropyl)aminopropyl polyethyleneglycol-carbamyl]distearoylphosphatidyl-ethanolamine)
[o/w 나노 에멀젼과 혼합한 실시예의 제조]
양친성 고분자의 도입에 따른 약물전달담체에 있어서 o/w 나노에멀젼과 혼합시에 피부에 대한 흡수 능력 및 입도 분석을 비교 수행하기 위하여 실시예 5 및 실시예 6의 약물전달담체를 o/w 나노에멀젼과 혼합한 실험 샘플로서 실시예 7 및 8을 제조하였다.
구체적으로, 하기 표 2와 같이 물 파트 및 오일파트를 준비하였다.
성분 양(g)
오일 파트(oil phase) 스테아릴산 0.8
세틸 알코올 1.2
펜타에리트리틸 테트라에틸헥사노에이트 4.0
실리콘 오일 4.0
하이드로제네이티드 레시틴 1.5
이눌린 라우릴 카바메이트 1.0
물 파트(Aqueous phase) 정제수(D.I. water) 72.0
테트라에탄올아민 0.1
페녹시에탄올 0.3
글리세린 5.0
폴리에틸렌 글리콜(수평균 분자량 4,000) 2.0
부틸렌 글리콜 8.0
폴리(메타아크릴산)코폴리머(ETD2020) 0.1
상기 조성에 따라 제조된 물파트 및 오일파트를 각각 따로 70℃에서 가온 용해하고, 물 파트에 오일 파트를 천천히 투입하면서 7,000rpm 에서 호모믹서(T.K. Homomixer Mark II, Takushu Kika Kogyo Ltd., Japan)로 3분동안 유화(호모 믹싱)을 수행하였다. 이렇게 유화하여 수득한 o/w 에멀젼을 고압유화기(Microfluidics Corp., USA)에서 1000bar로 3사이클 동안 추가적으로 처리하여 평균입도 150nm정도의 나노에멀전을 수득하였다. 이렇게 제조된 나노에멀전에 대하여 실시예 5 및 실시예 6을 각각 나노에멀전과의 관계에서 무게중량 1:1의 비율로 아지믹싱으로 혼합하였다. 이렇게 각각 실시예 5 및 실시예 6의 약물전달담체와 나노에멀전이 혼합된 조성물을 제조하였으며 이들을 실시예 7 및 실시예 8로 설정하였다.
[시험예 1] 약물전달담체의 입도 분석 및 표면 전위 측정
상기 실시예 1 내지 8 및 비교예 1,3, 및5의 리포좀 용액에 대하여 말번사의 제타사이저로 입도분석 및 표면전위를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다.
평균입도(PDI) 표면 전위(표준편차)
비교예 1 81.34nm(0.255) -27.5 mV(5.16)
실시예 1 108.3nm (0.211) 34.8 mV(6.34)
비교예 3 117.7nm(0.292) -19.9 mV(6.58)
실시예 3 122.6nm(0.210) 14.7mV(9.7)
실시예 2 113.2nm(0.210) 22.1 mV(13.5)
비교예 5 127.3nm(0.266) -22.2 mV(3.84)
실시예 5 115.5nm(0.376) 11.8 mV(8.29)
실시예 4 102.1nm(0.188) 20.6 mV(9.75)
실시예6 200.6nm(0.284) 18.2 mV(8.26)
실시예7 856nm(0.607) -
실시예8 192nm(0.301) -
상기 표 3의 결과에 따르면, 비교예와 실시예 모두 평균 입도가 100nm 정도로 비교적 균일한 샘플들이 제조된 것을 확인할 수 있었다.
또한, AP-GRR를 도입한 경우 그렇지 않은 지질구조체에 비하여 표면전위가 음의 값에서 양의 값으로 변하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, AP-GRR의 도입량이 8몰%로 더 많은 실시예 2 및 4에서는 AP-GRR도입량이 4몰%인 실시예 3 및 5와 비교하여 표면전위가 양의 값을 더 크게 가지는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 약물전달담체들은 AP-GRR가 도입되어 그 물리적인 성질이 변화한 것을 확인할 수 있었다.
또한 나노에멀전 상태에서 입도분석 결과를 살피면 양친성 고분자가 도입된 실시예 8이 그렇지 않은 실시예 7에 비하여 평균입도가 더 작고 입도안정성이 높다는 사실을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 실시예 7에서는 세포투과성 펩드를 포함하는 리포좀과 나노에멀전 사이에서 새로운 에멀전의 재조합이 일어나면서 입도가 커지고 PDI값이 높아진 것으로 판단된다. 이는 간접적으로 리포좀 제제의 단점 중 하나인 유화 제형 내에서 구조적인 불안정성에서 기인되는 것으로 판단된다. 그러나, 실시예 8의 경우 양친성 고분자가 리포좀의 이중 지질층을 붙잡아주면서 보호 콜로이드 역할을 하는 것으로 판단되며, 그 결과 입도결과가 지질구조체로 제조한 실시예 6과 비슷하여 새로운 큰 입도의 입자가 관찰되지 않았다.
[시험예 2] 약물전달담체의 TEM 구조분석 실험
상기 비교예 1 및 실시예 1에 대하여 전자투과현미경(Libra 120, Carl Zeiss, 가속 전압 120kV)을 이용하여 그 구조를 확인하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1의 그림에 따르면 AP-GRR를 도입한 리포좀에 해당하는 약물전달담체인 실시예 1의 리포좀 구조가 AP-GRR를 도입하지 않은 비교예 1에 비하여 다소 커진 것을 확인할 수 있었다. 또한, AP-GRR을 도입하였음에도 비교예 1과 실시예 1은 리포좀의 구조가 유사한 것을 확인할 수 있었으며, 이로부터 본 발명의 거대분자를 담지할 수 있는 구조를 가지는 약물전달담체는 일반적인 리포좀과 구조적으로 유사하다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 하기 실험예에 따르면 본 발명의 약물전달담체는 구조적으로 일반 리포좀과 유사할지 몰라도, 수용성 거대분자를 세포 내로 용이하게 이입시키는 효과를 나타낸다.
[시험예 3] 유세포 분석을 통한 약물전달담체의 세포 내 전달능 평가
상기 실시예 2 내지 5와 비교예 2 내지 5에 대하여 약물전달담체의 세포 내 전달능을 확인하기 위하여 FACS 분석을 실시하였다. 상기 실시예 및 비교예의 리포좀 시스템을 미리 배양된 HaCaT 세포(CLS cell line service 로부터 입수함)에 첨가하여 섭씨 37에서 4시간 동안 배양한 후 각 샘플군의 세포를 수거하여 PBS 액에 분산시킨 뒤, FACS 분석을 실시하였다. FACS 분석은 BD FACSCalibur 장비 (Beckton Dickinson Bioscience, San Jose, CA)를 이용해, 각 실험군별 10,000개의 HaCaT 세포 내 붉은 형광강도(red fluorescence)를 측정하였으며, CellQuest software로 자료를 분석하였다. 이를 통해 세포 내부로 유입된 로다민 B의 양을 정량적으로 비교 분석하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 3의 (A)는 로다민 B에 대한 결과로서 실시예 2 및 3과 비교예 2 및 3에 대한 FACS 분석 그래프 결과이며, (B)는 덱스트란-RITC에 대한 결과로서 실시예 4 및 5와 비교예 4 및 5에 대한 결과를 나타낸 것이다. (C)의 경우 그래프의 결과를 수치적으로 나타낸 것으로서 평균값과 표준편차를 나타낸 것에 해당한다. 그래프에서 y축은 세포의 수를 의미하며, x축은 세포 내로 전달된 양을 의미한다.
도 3의 (A)와 (C)에 따르면, 그래프는 오른쪽부터 평균값이 큰 순서대로 실시예 3, 실시예 2, 비교예 3, 및 비교예 2의 그래프에 해당하며, AP-GRR를 도입한 실시예의 경우 그렇지 않은 비교예에 비하여 세포내로 전달된 양의 평균이 큰 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 세포내 전달능의 경우 PBS 용액 보다는 리포좀으로 처리한 것이 더 높고, 단순 리포좀 보다는 리포좀에 AP-GRR를 도입한 본 발명의 약물전달담체가 전달능이 더 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명에 따른 약물전달담체의 경우 로다민 B와 같은 수용성 저분자 물질을 세포 내로 잘 전달할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, AP-GRR 도입량을 달리한 실시예 2 및 3을 비교하면, 리포좀을 구성하는 지질 중 8몰%로 도입한 실시예 2의 경우가 4몰%를 도입한 실시예 3 보다 평균값이 더 작은것을 확인할 수 있었다. 약물전달담체를 구성함에 있어서, 큰 차이는 없으나 AP-GRR의 도입량은 4몰%가 더 적절하다고 판단된다.
도 3의 (B) 와 (C)에 따르면, 그래프는 오른쪽부터 평균값이 큰 순서대로 실시예 5, 실시예 4, 비교예 5, 및 비교예 4의 그래프에 해당하며, AP-GRR를 도입한 실시예의 경우 그렇지 않은 비교예에 비하여 세포내로 전달된 양의 평균이 큰 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 세포내 전달능의 경우 PBS 용액 보다는 리포좀으로 처리한 것이 더 높고, 단순 리포좀 보다는 리포좀에 AP-GRR를 도입한 본 발명의 약물전달담체가 전달능이 더 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 실시예 4 및 5의 경우 상기 실시예 2 및 3에 포집된 것과는 달리 덱스트란-RITC로서 분자량이 약 20배 차이 나는 고분자임에도 불구하고 세포 내로 전달된 경향은 rhodamine B를 사용하였을 때의 결과와 유사하였다. 이에 따라서, 본 발명의 약물전달담체는 수용성 거대분자의 경우에도 마찬가지로 세포내 전달능이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 또한, AP-GRR 도입량을 달리한 실시예 4 와 5를 비교하면 로다민 B에 대한 실험에서와 마찬가지로 4몰%를 도입한 실시예 5의 경우에 있어서 그 평균값이 더 큰 것을 확인할 수 있었다.
[시험예 4] 면역 형광 염색과 공초점레이저현미경을 이용한 세포 이입률 평가
10중량% FBS(GIBCO 사), 100IU의 페니실린G(LONZA사)를 첨가한 DMEM 배지(LONZA사)에 HaCaT세포(CLS cell line service로부터 입수)를 8 웰 챔버 슬라이드(well chamber slide)에 25,000세포/웰이 되도록 분주하였다. 그 다음 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 웰을 세척한 후에 아무것도 넣지 않은 대조군과 상기 실시예 및 비교예를 배지에 희석하여 3시간 동안 처리하였다. 처리된 세포를 가지고 면역 형광 염색(Immunofluorescence ;IF) 을 하였다. 1mM의 CaCl2와 1mM의 MgCl2가 들어간 PBS(이하 본 시험예에서 PBS는 이와 같다)를 이용하여 각 웰을 세척하여 웰에 포함된 세포를 세척하였다. 3.5중량% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 이용하여 상기 세포를 상온에서 10분간 반응하여 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS를 이용하여 다시 10분간 세 번 세척하였다. 그런 뒤 0.1%의 TritonX-100을 5분간 처리하였다. 처리 후 다시 PBS로 10분간 세 번 세척하였다. 핵을 염색하기 위해 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide(PI))를 이용하여 세포를 약 3분간 염색하였다. 다시 PBST(PBS에 0.05중량%의 Tween20을 혼합하여 제조하였으며, Tween20의 경우 SIGMA사로부터 입수하였다. PBST의 제조를 위한 PBS는 염화칼슘 및 염화마그네슘이 포함되어 있지 않다.)를 이용하여 세 번 세척한 후 마운팅(mounting) 용액을 넣어고 커버글라스(coverglass)를 덮었다. 이렇게 염색된 슬라이드를 공초점 레이저 주사 현미경 (Confocal microscopy, Ziess)을 이용하여 촬영하였다. 이러한 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3은 수용성 저분자인 로다민-B를 형광물질로 포함한 리포좀들에 대한 결과이며 도 4는 수용성 거대분자인 덱스트란-RITC를 형광물질로 포함한 리포좀들에 대한 결과를 나타낸 것이다. 사진에서 붉게 염색된 부분이 로다민-B 또는 덱스트란-RITC를 나타내며, 푸르게 염색된 부분이 핵을 나타낸다.
도 3에 따르면, PBS 용액인 비교예 2에 비하여 단순한 리포좀인 비교에 3에서 좀 더 세포이입율이 높고, 이러한 리포좀에 비하여 AP-GRR가 도입된 본 발명의 약물전달담체의 경우에 세포이입율이 현저히 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 4에 따르면, 분자량이 약 20배 큰 덱스트란-RITC의 경우에서도 로다민-B와 유사한 결과를 확인할 수 있었다. 비교예 4 및 5의 사진을 보면 세포 내로 덱스트란-RITC가 거의 유입되지 않았음을 확인할 수 있으며, 반면 실시예 4 및 5의 결과 사진을 보면 붉은 색의 형광물질이 세포 내로 다량 유입된 것을 확인할 수 있으며, 이를 통하여 본 발명의 약물전달담체는 수용성 거대분자를 세포 내로 전달하는데 현저한 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
[시험예 5] 피부 안정성 평가
상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 5의 피부 안정성을 확인하기 위하여 성인 여성 18명 및 남성 12명을 대상(평균 나이 32.5세)으로 실시예 및 비교예의 리포좀이 포함된 제품을 도포하는 첩포 시험을 진행하여 본 발명의 조성물에 대한 피부 안정성을 평가하였다. 측정 방법은 첩포를 부착한 뒤 28시간 경과 후 첩포를 제거하고, 30분 후에 첫 판독을 시행하였으며 96시간이 경과한 후에 2차 판독을 시행하였다. 조성물의 피부 자극에 대한 강도를 알아보기 위해 피부의 양성반응 정도에 따라 가중치를 부여하여 피부 평균 반응도를 구하여 조성물의 피부 자극을 육안으로 판정하였다. 이러한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
시험물질 평균 반응도 판정 등급
실시예 1~5 0 무자극
비교예 1~5 0 무자극
상기 표 4의 결과에 따르면, 실시예 및 비교에는 모두 조성물에 포함되어 제조되었을 때 피부에 자극을 주지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 리포좀을 포함하는 화장료 조성물은 피부에 대한 안정성이 우수한 것으로 판단할 수 있었다.
[시험예 6] 피부흡수 실험을 통한 약물전달담체의 정성적 효과 평가
비교예 2~5와 실시예 3, 실시예 5, 실시예 7 및 실시예 8에 대하여 피부흡수실험을 수행하였다. 피부흡수실험을 위하여 도축용 돼지의 부산물인 귀(도축장에서 제모되지 않은 돼지귀를 수득하여 실험에 사용함)의 뒷부분에서 적출한 피부를 이용하였으며, 적출한 피부를 세척하고 프란츠-셀(Franz-cell)기기(Franz-type vertical diffusion cell system (Microette Plus Auto Sampling System,Hanson Research, USA))를 통해 각각 4시간 및 18시간 동안 상기 비교예 및 실시예에 함유되어 있는 형광물질들의 피부흡수 실험을 진행하였다.
프란츠-셀을 통해 흡수를 마친 돼지 귀 피부를 몰드에 넣고 OCT compound((#4583, SAKURA Tissue-Tek, USA)로 기포가 생기지 않게 덮었다. 그런 뒤 -196℃에서 액체질소를 이용하여 급속 동결 시켰다. 급속 동결된 돼지 귀 피부를 동결절편기(CM1950 cryostat, Leica, Germany)를 이용하여 6 um 두께로 박절하여 실란(silane)이 코팅된 슬라이드 글래스에 붙였다. 이러한 슬라이드 글래스를 실온(25℃)이고 차광된 곳에서 10분간 건조한 뒤, 형광현미경(BX53, Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 동일한 형광세기와 노출시간 하에서 관찰하였고 대표 이미지는 냉각 디지털 컬러카메라(DP72, Olympus, Japan)를 이용하여 촬영하였으며, 이러한 결과를 도 5및 6에 나타내었다. 도 5 및 6에서 흰색으로 표시된 스케일바는 500um에 해당한다. 도 5의 경우 노출 시간을 256ms로 설정한 것이며 도 6의 경우 노출 시간을 64ms로 설정한 것이다. 또한, 형광 세기의 경우 광원(light source)로 수은램프(U-HGLGPS, olympus, japan)를 사용하였으며 형광 세기의 경우 이러한 기계에서 설정할 수 있는 값(0, 3, 6, 12, 25, 50, 및 100) 중에서 6에 맞추어 놓고 분석을 진행하였다.
도 5에 따르면, 로다민 B의 경우 분자량이 상대적으로 분자량이 작은 물질로서 비교예 2와 같이 PBS에 녹인 경우에도 18시간동안 흡수시킨 경우에는 일정량 이상 경피로 흡수가 되며, 비교예 3과 같이 일반적인 리포좀에 적용된 경우에는 4시간 흡수의 경우부터 경피로 흡수가 일어나는 것을 확인할 수 있다. 이러한 것은 리포좀에 의한 각질층 세포간 지질 교란효과로 인하여 수용성 성분의 흡수가 증진된 것으로 판단된다. 다만, 고분자 물질에 해당하는 덱스트란-RITC의 경우에는 비교예 4 및 5 모두에서 경피로 흡수가 거의 일어나지 않는 것으로 확인되었다.
도 6에 따르면 로다민 B의 경우 본 발명의 일측면에 따른 약물전달담체의 경우 PBS에 녹인 것에 비하여 4시간 흡수에서도 로다민 B의 흡수가 현저하게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 도 5의 비교예 3으로서 일반적인 리포좀과 비교하여도 실시예 3인 약물전달담체에 적용된 로다민 B의 흡수가 형광범위가 더 넓고 두껍게 형성된 것으로 보아 더 뛰어나다는 것을 확인할 수 있다. 이러한 효과는 리포좀의 기본적인 각질층 지질 교란 효과와 세포 투과 펩티드의 폴리알지닌 그룹에 의한 양전하 효과가 더 효과적인 피부 흡수에 도움을 주기 때문이라고 판단된다.
더불어, 비교예 4 및 5의 경우에는 경피로 흡수가 거의 일어나지 않은 덱스트란-RITC의 경우에도 본 발명의 일측면에 따른 약물전달담체에 적용된 실시예 5의 경우 경피로 흡수가 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 일측면에 따른 약물전달담체는 분자량이 10,000 Da 수준에 이르는 고분자 물질의 경우에도 피부 내부로 전달하는 이질적이고 현저한 효과를 나타낸다는 점을 확인할 수 있다.
[시험예 7] 피부흡수 실험을 통한 약물전달담체의 정량적 효과 평가
시험예 6에서 프란츠-셀 기기를 통해 각각의 비교예 및 실시예를 4시간 동안 흡수시킨 돼지 귀 피부에 대하여 각질층, 각질층을 제외한 피부조직 그리고 수용체(receptor) 샘플을 하기와 같이 각각 준비하였다. 각질층 샘플의 경우 흡수시킨 돼지 귀 피부에 대하여 6mm biopsy 후에 피부조직 표면을 3M 테이프 스트리핑(3M tape stripping) 3회 수행하여 테이프를 물과 메탄올을 1:1 비율로 혼합한 용매 6ml로 추출하였다. 각질층을 제외한 피부조직 샘플의 경우 상기 테이프 스트리핑을 하고난 조직샘플로써 물과 메탄올을 1:1 비율로 혼합한 용매 2ml로 추출하였다. 수용체 샘플의 경우 흡수 실험을 수행한 후 수용체 부분(receptor part)에 있는 PBS용액 1ml를 분주하였다.
이렇게 수득된 각 샘플들을 분광 광도계(Spectrophotometer, F4500, HITACHI)로 분석하였으며, 분석조건의 경우 하기와 같다.
분석조건:
-ex slit(excitation slit): 2.5 / emi slit(emission slit): 2.5
-exi(wavelength of light for excitation) : 554nm / emi(wavelength of light for excitation): 579nm
본 분석의 경우 544nm 파장의 빛을 쪼인 후 형광물질의 방출(emission) 결과를 얻은 후, 579nm에 해당하는 강도(intensity)의 값들을 검출하여 계산한 결과에 해당한다. 이러한 분석조건으로 수득한 형광물질의 흡수량의 정량적인 결과를 도 7 및 8과 하기 표 5에 나타내었다. 분석결과 수용체 부분에서는 형광이 검출되지 않았다.
처리샘플 Skin 평균(ug/cm2) STD 각질 평균(ug/cm2) STD
비교예 2 9.526 5.889 1.388 0.091
비교예 3 28.319 7.931 3.588 0.361
실시예 3 38.447 5.134 3.957 0.544
비교예 4 0.000 - 0.000 -
비교예 5 2.516 1.356 0.000 -
실시예 5 77.014 17.673 3.025 0.548
실시예 7 5.735 3.492 0 -
실시예 8 38.251 8.562 2.019 0.478
도 7, 8 및 표 5의 결과에 따르면 로다민 B가 포함된 비교예 2, 비교예 3 및 실시예 3의 경우 각질층과 각질층을 제외한 피부조직에서 비교예 2 < 비교예 3 < 실시예 3의 순서로 흡수된 로다민 B의 농도가 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 분자량이 낮은 물질의 경우 리포좀 구조체에 의한 피부흡수증진 효과의 정도를 확인할 수 있다.
덱스트란-RITC가 포함된 비교예 4, 비교예 5 및 실시예 5의 경우 로다민 B와는 다소 다른 양상을 나타내었다. 각질층에 흡수된 형광물질의 경우 비교예 4에서는 거의 흡수되지 않았으며, 일반 리포좀에 적용한 비교예 5에서도 흡수된 형광물질이 보이지 않았다. 반면, 본 발명의 일측면에 따른 약물전달담체에 적용한 실시예 5의 경우 비교예 4 및 5 보다 현저하게 높은 흡수 효과를 확인할 수 있었다. 각질층을 제외한 피부조직에서도 실시예 5의 경우 현저하게 높은 형광물질 흡수를 확인할 수 있었으며, 이에 반하여 비교예 4 및 5에서는 눈에 띄는 피부 흡수 효과를 볼 수 없었다. 따라서, 이러한 결과에 따르면 본 발명의 일측면에 따른 약물전달담체의 경우 분자량이 큰 물질에 대해서도 각질층 및 피부조직에 대하여 높은 흡수 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 효과는 기존 리포좀에 비하여 현저하고 이질적이 효과에 해당한다.
또한, 나노에멀전 형태의 유화제형과 혼합한 경우에 있어서는 본 발명의 일측면에 따른 약물전달담체가 양친성 고분자를 포함하는 경우에 그렇지 않은 것에 비하여 현저하게 높은 피부 흡수율을 나타낸다는 것을 실시예 7 및 실시예 8의 결과를 통하여 확인할 수 있었다. 구체적으로 나노에멀전(유화제형)에 양친성 고분자를 포함하는 약물전달담체인 실시예 6과 이를 포함하지 않는 실시예 5를 혼합한 경우에, 양친성 고분자를 포함하는 실시예 8이 실시예 7에 비하여 거대분자 생리활성성분인 dextran-RITC의 피부 흡수량이 7배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다. 이는 리포좀의 구조적인 안정도 증진에 따른 피부 흡수의 증진으로 판단되며, 이러한 실험결과를 통해 양친성 고분자가 도입된 약물전달담체는 그 구조적 안정성이 증진되고 화장품에서 사용되는 유화제형 내에서도 거대분자인 생리활성성분을 피부에 잘 전달하는 효과를 가진다는 점을 확인할 수 있었다.
<110> Amorepacific Corporation <120> CELL PENETRATING PEPTIDE INTRODUCED DRUG-DELIVERY CARRIER COMPRISING MACROMOLECULE <130> 15P476/IND <150> 10-2014-0139024 <151> 2014-10-15 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-GRR peptide <400> 1 Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Tyr Lys Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 2 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 3 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5

Claims (34)

  1. 세포 투과 펩티드 또는 이를 포함하는 펩티드 사슬과 공유결합된 지질 구조체를 포함하는 약물전달담체로서,
    상기 지질 구조체는 그 구조 내부에 생리활성성분이 포집되는 구조이며,
    상기 생리활성성분은 수평균분자량 또는 중량평균분자량이 500 Da 이상인 수용성 또는 수불용성 거대분자이고,
    상기 세포 투과 펩티드는 Gly(Arg)n Gly Tyr Lys Cys의 서열(n = 1 내지 20)을 가지는 펩티드이며,
    상기 지질구조체는 디올레일포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 및 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜-말레이미드(DSPE-PEG-Mal) 복합체중 하나 이상을 포함하며,
    상기 지질 구조체는 양친성 고분자를 더 포함하고,
    상기 양친성 고분자는 화학식 2의 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트-co-n-알킬 메타크릴레이트)랜덤 공중합체를 포함하는, 약물전달담체:
    [화학식 2]
    Figure 112022081412385-pat00018

    상기 화학식 2에서 n = 7~22이고,
    x : y 는 몰비율 대비 90 : 10 ~ 50 : 50 이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수용성 또는 수불용성 거대분자의 수평균분자량 또는 중량평균분자량은 5,000Da 이상인 약물전달담체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 수용성 또는 수불용성 거대분자의 수평균분자량 또는 중량평균분자량은 8,000Da 이상인 약물전달담체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열의 n은 3 내지 9임을 특징으로 하는 약물전달담체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 서열은 서열번호 1의 서열인 것을 특징으로 하는 약물전달담체.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 세포 투과 펩티드 또는 이를 포함하는 펩티드 사슬은 양친성 고분자와 공유결합된 약물전달담체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 양친성 고분자는 히알루론산 측쇄에 알킬기가 부착된 알킬화 히알루론산(alkylated hyaluronic acid) 및 화학식 1의 폴리(메타크릴산-co-n-알킬 메타크릴레이트)랜덤 공중합체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는, 약물전달담체.
    [화학식 1]
    Figure 112022081412385-pat00019

    상기 화학식 1 에서 n = 7~22이고,
    x : y 는 몰비율 대비 90 : 10 ~ 50 : 50 이다.
  9. 제1항에 있어서, 지질 구조체 및 양친성 고분자의 총 중량을 기준으로 양친성 고분자를 1-50중량% 및 지질구조체를 50-99중량%로 함유하는 약물전달담체.
  10. 제1항에 있어서, 양친성 고분자는 수평균 분자량이 5,000 내지 200,000 Da인 약물전달담체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 약물전달담체는 콜레스테롤을 더 포함하는 약물전달담체.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 상기 약물전달담체는 디올레일포스파티딜에탄올아민 : 포스파티딜콜린 : 콜레스테롤: 디스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌글리콜-말레이미드(DSPE-PEG-Mal) 복합체를 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 1.0~3.0 : 0.01~1.0 의 몰비율로 포함하는 것인 약물전달담체.
  14. 삭제
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  27. 삭제
  28. 제1항 내지 제5항, 제7항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물전달담체의 평균입자직경은 1,000nm 이하인 것인 약물전달담체.
  29. 제1항 내지 제5항, 제7항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 약물전달담체 및 담체 내부에 포집된 생리활성성분을 포함하고,
    상기 생리활성성분은 수평균분자량 또는 중량평균분자량이 500 Da 이상인 수용성 또는 수불용성 거대분자인 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 생리활성성분은 합성된 수용성 거대분자 물질, 천연물의 추출을 통해 수득되는 거대분자 물질, 효소, EGF, 단백질, 펩타이드, 및 다당류로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 상기 약물전달담체에 포집된 생리활성성분은 상기 지질구조체 총 중량에 대해 0.01~30중량%인 조성물.
  32. 제29항에 있어서, 상기 조성물은 피부외용제, 경구용 제제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것인 약제학적 조성물.
  33. 제29항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형을 가지는 화장료 조성물.
  34. 제29항에 있어서, 상기 생리활성성분은 약물전달담체가 지질구조체를 포함하는 경우 수용성 거대분자인 조성물.
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