KR101941845B1 - 생리활성 물질 전달을 위한 나노 구조체, 이의 이용방법, 및 이의 제조방법 - Google Patents

생리활성 물질 전달을 위한 나노 구조체, 이의 이용방법, 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리활성 물질 전달을 위한 나노입자, 이의 이용방법, 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 나노입자는 무독성의 양이온성 리간드로 인해 표면이 대전되어 음전하를 띠는 세포표면과 상호작용할 수 있는 양전하를 띤 나노입자로, 독성이 낮고, 생리활성 물질을 목적하는 세포의 세포질 또는 세포핵으로 보다 효율적으로 전달할 수 있다는 장점이 있다.

Description

생리활성 물질 전달을 위한 나노 구조체, 이의 이용방법, 및 이의 제조방법 {Nano-Complex for delivering bioactive materials, uses thereof and preparation method thereof}
본 발명은 생리활성 물질 전달을 위한 나노 구조체, 이의 이용방법, 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 펩타이드를 포함하는 양이온성 리간드로 표면이 대전된, 낮은 독성의 나노 금속입자 및 생체적합성 고분자로 이루어지는 나노 구조체를 포함하는 생리활성 물질 전달체, 이의 이용방법, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
유전자 전달은 각종 바이러스성 또는 비 바이러스성 질병을 정복하는데 있어서 높은 잠재력을 가진 치료 전략이다. 이러한 유전자 전달은 바이러스성 전달체와 비 바이러스성 전달체를 매개체로 이용하게 된다. 그러나, 바이러스는 강력한 면역 반응을 일으켜 독성을 나타낼 뿐만 아니라, 다시 투여하는 것도 어렵다는 단점 때문에 바이러스를 사용하지 않는 방법이 많이 연구되고 있다.
폴리에틸렌이민 (polyethylenimine, PEI)은 에틸아민을 반복단위로 함유하고 있고 매 3번째 원소가 질소이어서 수소이온과의 결합을 통해 높은 양전하를 띠고 있다. 따라서 음전하를 띠는 DNA와의 정전기적 상호작용에 의하여 나노미터 크기 (≤100 nm)의 고분자 전해질 (polyelectrolyte) 복합체 형성이 용이하다. PEI는 직선형 (linear) 또는 가지형 (branched) 등의 형태로, 25KDa, 75KDa, 150KDa 등 다양한 분자량을 갖는 것들이 제조되거나 시판되고 있다.
PEI를 유전자 전달체로 사용하는 경우, 유전자 발현효율은 PEI와 유전자의 배합비율 즉 PEI/DNA complex의 Nitrogen/phosphate (N/P)에 따라 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다. N/P 비율이 증가하면 DNA를 더 응축 시킬 수 있고, 전체적으로 양이온을 띠어 세포 내로 높은 효율로 전달된다. 다만, 이 경우 독성이 커지는 단점이 있다. 특히 in vivo 상에서 전달시킬 때 여러 단백질과 결합하여 발현 효율이 떨어지고 독성이 높아진다.
양이온성 고분자인 Poly-L-lysine (PLL)은 최초로 사용된 유전자 전달용 고분자 중의 하나이며 다양한 크기의 분자량으로 자유자재로 합성할 수 있기 때문에 많은 연구가 진행되고 있다. PLL은 생분해성인 펩타이드 결합으로 연결되어 있기 때문에 in vivo 실험에 활발히 응용되고 있으며 유전자와 나노복합체를 형성해서 세포 내로 전달될 수 있으나, 어느 정도의 독성도 나타내고 있어 단독으로 높은 전달효율을 나타내는 데는 한계가 있다. 이를 극복하기 위해 엔도좀 파괴 물질이나 엔도좀 융합펩타이드 등을 부착시킴으로써 높은 전달효율을 보여주는 예가 보고된 바 있다 (M. A. Wolfert, P. R. Dash, O. Nazarova, D. Oupicky, L. W. Seymour, S. Smart, J. Strohalm, and K. Ulbrich, Bioconjug.Chem., 10, 993 (1999)).
한편, 암세포는 정상세포와 달리 혈관의 생성을 촉진하는 여러 가지 인자들을 세포 주위로 분비한다. 이러한 혈관생성 촉진인자들은 주위의 혈관을 자극하여 암세포를 향해 새로운 혈관들을 형성하게 하고, 암세포들은 형성된 혈관을 통해 여러 가지 영양분, 산소 등을 공급받아 지속적으로 증식하며 전이하는데, 이것을 암세포 주위의 혈관신생 (Angiogenesis) 이라고 한다. 혈관생성 촉진인자들의 자극을 받은 암세포 주위의 혈관내피세포의 표면에는 인테그린 (Integrin)이라는 수용체가 다량으로 발현되어 있는데, RGD 펩타이드와 특이작용을 하는 것으로 알려져 있다. 이를 바탕으로 RGD 펩타이드를 고분자 유전자 전달체에 부착시킴으로써 전달체의 암세포 선택성을 높이는 전략이 보고된 바 있다 (W. J. Kim, J. W. Yockman, J. H. Jeong, L. V. Christen, M. Lee, Y.-H. Kim, and S. W. Kim, J. Control. Release, 114, 381 (2006)). 또한 암세포에는 트랜스페린 (transferrin)과 엽산 (folate) 수용체도 다량으로 존재하므로 트렌스페린과 엽산 고분자 유전자 전달체에 부착하여 치료유전자를 암세포에 선택적으로 전달함으로써 비바이러스성 벡터의 전달효율을 높이고 다른 세포에 대한 독성을 낮추는 전략이 이용되고 있다.
최근 나노입자를 유전자 전달체로 이용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 나노입자의 효과적인 유전자 전달을 위해서는 나노입자의 크기와 표면의 특성 등을 고려하여 적절하게 변형, 조절하여 이용하는 것이 중요하다. 또한 금 나노입자에 PEG와 메틸아크릴 등을 이용한 새로운 고분자 나노물질로 코팅하여 세포막을 쉽게 가로지를 수 있는 방법도 개발되고 있으며, 특정 세포와 선택적으로 반응하는 리간드를 이용하여 전달체의 특정세포 선택성을 높이는 전략도 보고되고 있다.
또한, 안정성을 높이기 위하여 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol, PEG)와 같이 인체에 해가 없는 생체 적합성 고분자를 도입시킴으로써, 표적 세포에 이르기 전 활성이 저해되는 것을 방지하고, 체내 안정적으로 유전물질 전달이 이루어질 수 있도록 하는 방법이 수행되어 오고 있다. 그 밖에 폴리락티드코글리콜리드 (poly-lactide-co-glycolide, PLGA), 폴리카프로락톤 (poly-e-carprolactone, PCL), 히알루론산 (hyaluronic acid, HA), 또는 혈청알부민 같은 물질이 생체적합성 고분자에 해당한다.
유전자 전달을 위해서는 음전하를 띠는 유전자와 쉽게 결합하고 역시 음전하를 띠는 세포 표면과 상호작용 할 수 있는 양전하를 띤 나노입자가 주로 활용되고 있으나, 다수의 연구에서 양전하를 띠는 나노입자에 의해 세포독성이 나타나는 것으로 보고되고 있다. 기존에 개발된 양이온성 리간드는 1차 내지 4차 아민을 보유하는 화합물로, 대표적으로는 11-amino-undecanethiol (MUAM) 또는 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)를 들 수 있는데, 이러한 표면 개질 물질들은 강한 세포 독성을 띠고 있으므로, 유전자 전달 물질로 활용하기 어렵다. 따라서, 생리활성물질 전달을 위한 양전하를 띤 저독성 나노물질의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 세포 독성을 나타내지 않는 생리활성물질 전달체를 연구하던 중, 양이온성 아미노산인 아르기닌 또는 리신이 포함된 펩타이드 리간드에 의해 양전하로 하전된 금 나노입자에서 낮은 독성, 우수한 유전자와의 결합력 및 세포막 투과성을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금속 나노입자를 포함하는, 생리활성 물질 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 생리활성 물질 전달체를 유효성분으로 포함하는, 약물 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금속 나노입자를 제조하는 단계; 및 상기 양전하로 표면이 대전된 금속 나노입자와 양전하성 고분자를 결합시키는 단계를 포함하는 생리활성 물질 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 생리활성 물질 전달체를 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 생리활성 물질 전달방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금속 나노입자를 포함하는, 생리활성 물질 전달체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예로, 상기 생리활성 물질 전달체는 양전하성 고분자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예로, 상기 금속 나노입자는 금, 은, 구리, 백금, 팔라듐, 니켈, 철 또는 이들 중 둘 이상의 혼합금속으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 금속을 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예로, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine, PEI) 또는 그의 유도체, 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine, PLL) 또는 그의 유도체, 및 키토산 (chitosan) 또는 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예로, 상기 생리활성 물질은 체내에서 약리 활성을 나타내는 DNA, RNA, 안티센스 핵산, 리보좀, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 그의 조합일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예로, 상기 생리활성 물질 전달체는 세포 표면 인지질과 정전기적 인력에 의해 결합될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예로, 상기 생리활성 물질 전달체는 낮은 세포 독성을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예로, 상기 생리활성 물질 전달체는 높은 생리활성 물질 전달 효율을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 생리활성 물질 전달체를 유효성분으로 포함하는, 약물 전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금속 나노입자를 제조하는 단계; 및 상기 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금속 나노입자와 양전하성 고분자를 결합시키는 단계를 포함하는 생리활성 물질 전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예로, 상기 생리활성 물질은 체내에서 약리 활성을 나타내는 DNA, RNA, 안티센스 핵산, 리보좀, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 그의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 생리활성 물질 전달체를 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 생리활성 물질 전달방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예로, 상기 생리활성 물질은 체내에서 약리 활성을 나타내는 DNA, RNA, 안티센스 핵산, 리보좀, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 그의 조합일 수 있다.
본 발명은 생리활성 물질 전달을 위한 나노입자, 이의 이용방법, 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 나노입자는 무독성의 양이온성 리간드로 인해 표면이 대전되어 음전하를 띠는 세포표면과 상호작용할 수 있는 양전하를 띤 나노입자로, 독성이 낮고, 생리활성 물질을 목적하는 세포의 세포질 또는 세포핵으로 보다 효율적으로 전달할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 유전자 및 단백질 전달을 위한 나노 구조체, 및 양이온성 리간드로 인해 표면이 대전된 나노 구조체가 음전하를 갖는 유전자와 정전기적 상호작용을 통해 세포의 세포질 또는 세포핵으로 유전자와 단백질을 효율적으로 전달함을 모식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 UV-vis (A), FE-SEM (B), DLS 및 제타포텐셜 (C), 및 순차적 리간드 교환 반응 (D)을 통하여, 금 나노입자의 성질을 나타낸 도이다.
도 3은 UV-vis, DLS 및 제타포텐셜을 통하여, 리간드 종류에 따른 금 나노입자의 성질을 나타낸 도이다.
도 4는 MTT 및 트리판 블루 분석을 통하여 리간드 종류에 따른 금 나노입자 처리 시, HeLa 세포 및 인간 섬유아세포의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 5는 MTT 분석을 통하여 자유 리간드 처리 시, HeLa 세포의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 6은 운동성 분석을 통하여 리간드 종류에 따른 금 나노입자의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 7은 콜로니 형성 효율 (CFE) 분석을 통하여 리간드 종류에 따른 금 나노입자의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 8은 DNA 복제 분석을 통하여 리간드 종류에 따른 금 나노입자의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 9는 F-액틴 형성 확인을 통하여 세포 운동성에 리간드 종류에 따른 금 나노입자의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 10은 리간드 종류에 따른 금 나노입자와 DNA 간의 결합능을 확인한 도이다.
도 11은 PCR 활성에 대한 리간드 종류에 따른 금 나노입자의 효과를 확인한 도이다.
도 12는 금 나노입자 및 유전자의 결합물질을 이용한 살아있는 세포 내의 유전자 절달 효율을 평가하는 도이다.
도 13은 금 나노입자 및 단백질의 결합물질을 이용한 살아있는 세포 내의 유전자 절달 효율을 평가하는 도이다.
본 발명자들은, 양이온성 아미노산인 아르기닌 또는 리신이 포함된 펩타이드 리간드에 의해 양전하로 하전된 금 나노입자가 낮은 독성과 높은 생리활성 물질 전달 효율을 보이는 점에 기반하여, 상기 양이온성 리간드가 결합된 금 나노입자의 물성, 세포 독성, 유전자와의 결합 정도 및 금 나노입자/유전물질 복합체의 생리활성 물질 전달 효과 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 본 발명은 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금속 나노입자를 포함하는, 생리활성 물질 전달체를 제공한다.
본 발명의 생리활성 물질 전달체는 양전하성 고분자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 양이온성 리간드는 말단에 티올기 (-SH)를 포함할 수 있으며, 그 외 다른 적절한 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 금속 나노입자는 금, 은, 구리, 백금, 팔라듐, 니켈, 철 또는 이들 중 둘 이상의 혼합금속으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 금일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 양전하성 고분자는 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine, PEI) 또는 그의 유도체, 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine, PLL) 또는 그의 유도체, 및 키토산 (chitosan) 또는 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 플리에틸렌이민 (PEI)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 본 발명의 폴리에틸렌이민 (PEI)은 직선형 (linear) 또는 가지형 (branched)이 있고, 다양한 분자량으로 합성이 가능하며, 바람직하게는 직선형 폴리에틸렌이민일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 생리활성 물질은 체내에서 약리 활성을 나타내는 DNA, RNA, 안티센스 핵산, 리보좀, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 DNA, RNA, 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 생리활성 물질 전달체는 세포 표면 인지질과 정전기적 인력에 의해 결합될 수 있으며, 낮은 세포 독성 및 높은 생리활성 물질 전달 효율을 가질 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금속 나노입자를 제조하는 단계 및 상기 양전하로 표면이 대전된 금속 나노입자와 양전하성 고분자를 결합시키는 단계를 포함하는 유전물질 전달체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 생리활성 물질 전달체를 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 생리활성 물질 전달방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금속 나노입자의 세포 독성을 확인한 결과, 상기 펩타이드 리간드가 부착된 금 나노입자 대부분이 높은 세포 생존율을 나타냈으며, 특히, AP1-AuNPs, CP1-AuNPs 및 CP2-AuNPs로 표시된 금속 나노입자의 경우, 양성 대조군인 MUAM-AuNPs보다 낮은 세포 독성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다(실시예 3 참조).
따라서, 본 발명에 따른 생리활성 물질 전달체는 천연 아미노산으로 이루어져 세포에 독성을 나타내지 않으며, 세포 표면 인지질과의 높은 친화력을 갖는 바, 생리활성 물질의 높은 전달효율이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 실험 준비 및 실험 방법
1-1. 실험 재료
아미노산 및 수지는 NovaBiochem (Darmstadt, Germany) 및 AnaSpec (Fremont, CA, USA)에서 구입하였으며, 11 아미노-1-운데칸티올 염산염 (11-amino-1-undecanethiol hydrochloride, MUAM), HAuCl4 및 시트르산 나트륨은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 세포 생존 및 증식 분석을 위한 비색 MTT 키트는 Roche (Mannheim, Germany)에서 구입하였으며, mPEG350-SH는 BiopolyMed (서울, 한국)에서 구입하였다. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 페니실린-스트렙토마이신, 트립신-EDTA 및 소 태아 혈청 (FBS)은 Welgene (대구, 한국)에서 구입하였고, 트리판 블루 (0.4 %)는 Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 초순수 (Ultrapure water, 18.2 MΩ·cm)는 Daihan scientific (원주, 한국)의 Pure power I water system을 사용하여 얻었으며, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 Grace (Columbia, MD, USA)의 Vydac C18 columns (5 micron, 4.6ⅹ150 mm)을 사용하여 Waters 2487 dual λ absorbance detector (Milford, MA, USA)와 함께 Waters 2796 Bioseparations Module instrument에서 측정하였다. 1 ml/min의 유속으로 용매 A (0.1 % 수용성 포름산) 대 용매 B (90 % 아세토니트릴, 10 % 증류수, 0.1 % 포름산)의 선형 구배를 사용하여 측정하였다. 합성 리간드의 분자량은 Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)의 High Sensitive Triple Quadrupole LC/MS/MS System으로 측정하였으며, 제타포텐셜 및 금 나노입자 (AuNPs)의 크기는 각각 Malvern Zetasizer (Malvern, Worcestershire, UK) 및 Ostuka Electronics (Osaka, Japan)의 ELS Z analyzer를 사용하여 측정하였다.
1-2. 금 나노입자 (AuNPs)의 제작
금 나노입자 (AuNPs)의 제작은 이전에 공지된 절차에 의하여 진행하였다 (Bastus, N.G., J. Comenge, and V. Puntes, Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir, 2011. 27(17): p. 11098-105.). 보다 자세하게는, 0.01 % 수용성 HAuCl4 (500 ml)를 격렬하게 교반하면서 가열한 후, 상기 용액에 1 % 수용성 시트르산 나트륨 (7.5 ml)을 첨가 (25 초 내에 파란색으로 변하고, 70 초 내에 붉은 보라색으로 변하였다.)하고, 10 분 동안 추가로 가열한 후, 가열원을 제거하고 15 분 동안 추가 교반하였다.
생성된 금 나노입자 용액은 UV-Vis 분광법에 의해, 520 nm에서 최대의 흡광도를 얻었으며, 동적 레이저 산란 (Dynamic laser scattering, DLS)을 사용하여 평균 입자 크기가 25 ℃에서 약 20.0 ± 2.0 nm이고, 평균 표면 전하가 약 -50.0 ± 3.0 mV임을 확인하였으며, 상기 결과는 도 2에 나타내었다.
1-3. 고체상 펩타이드의 합성
펩타이드는 표준 Fmoc-기반 전략에 따라 Rink amide AM resin의 0.1 mmol의 규모로 합성하였다. 보다 자세하게는, DMF (v/v) 내에서 수지에 20 % 피페리딘을 15 분마다 3 회 처리하여, 수지-결합 아미노산으로부터 Fmoc 보호기를 제거하였다. Fmoc-아미노산은 DMF에 HBTU 및 DIPEA를 첨가하여 활성화시키고, 혼합물을 아미노산:HBTU:DIPEA:수지=2:18:4:1의 몰비로 수지에 첨가하였다. 30 분 동안 커플링 반응 후, 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였으며, 지지체로부터의 global deprotection 및 cleavage는 실온에서 3 시간 동안 절단 칵테일 (90 % TFA, 5 % 에탄티올, 2.5 % H2O, 및 2.5 % 트라이이소프로필실란)로 처리하여 수행하였다. 생성된 조펩타이드는 침전시킨 후 차가운 무수 Et2O로 세척하였으며, preparative HPLC를 사용하여 정제하였다. 정제된 펩타이드 종류는 다음과 같다.
CP1 (cationic peptide 1, RRRGYC). LC/MS [예상 질량= 808.4 Da; 측정 질량= 807.4 Da]
CP2 (cationic peptide 2, KKKGYC). LC/MS [예상 질량=724.4 Da; 측정 질량= 725.4 Da]
CP3 (cationic peptide 3, RRGYC). LC/MS [예상 질량= 652.3 Da; 측정 질량= 651.0 Da]
CP4 (cationic peptide 4, KKGYC). LC/MS [예상 질량=596.3 Da; 측정 질량= 597.3 Da]
CP5 (cationic peptide 5, RGYC). LC/MS [예상 질량= 496.2 Da; 측정 질량= 495.2 Da]
CP6 (cationic peptide 6, KGYC). LC/MS [예상 질량=468.2 Da; 측정 질량= 469.3 Da]
1-4. 리간드-금 나노입자 (AuNPs)의 제작 및 특성
티올 (thiol)-보호 금 나노입자는 시트르산염-코팅된 금 나노입자로부터 시트르산염 분자를 티올 리간드로 교환함으로써 수득하였으며, 상기와 같이 수정된 리간드 종류에 따른 금 나노입자는 이하, 리간드-금 나노입자 (AuNPs)로 표현하였다. 개질 반응은 순차적 리간드 교환에 의하여 수행하였다. 즉, 일차 티올 리간드의 친수성 용액 (10 mM, 0.05 ml)을 시트르산염-코팅된 금 나노입자 용액 (56.6 μg/ml, 1 ml)에 첨가한 후, 시트르산염 계면활성제를 함유하는 리간드 용액을 원심분리에 의해 제거하고, 이차 티올 리간드 용액 (10 mM, 0.05 ml)를 일차 리간드가 캡핑된 금 나노입자에 첨가하였다. 24 시간 후, 리간드 용액을 원심분리에 의해 제거하고, 리간드-금 나노입자를 세척한 후, 증류수에서 재분산시켰다. 리간드 종류에 따른 금 나노입자는 UV-Vis 분광법, DLS 및 제타포텐셜 측정을 통하여 물성을 확인하였으며, 모든 실험은 3 회 이상 수행하였다.
1-5. 생존능 분석
두 종류의 사람 세포주인, HeLa 세포 및 인간 섬유 아세포에 24 시간 동안 리간드 종류에 따른 금 나노입자로 처리하고, 비색 MTT 분석법 및 트리판 블루 분석법을 수행하였다.
먼저, 상대적인 세포 생존을 확인하기 위해, MTT 분석을 수행하였다. 96-웰 플레이트에 웰당 1×104 세포를 접종하고, 10 % FBS (완전 배지)를 함유하는 DMEM에서 24 시간 동안 배양 후, 배양 배지를 1 % FBS를 함유하는 DMEM으로 교체하고, 세포에 각각 다양한 농도 (0, 0.028, 0.28, 2.8, 28, 50 및 100 μg/ml)의 리간드 종류에 따른 금 나노입자를 처리하였다. 24 시간 후, 생존율은 벤더 (vendor)의 프로토콜에 따라 Roche (Mannheim, Germany)의 세포 증식 키트 I (MTT)을 사용하여 측정하였다.
다음으로, 트리판 블루 분석법을 위해, 6-웰 플레이트에 웰당 4×104 세포를 접종하고, 완전 배지에서 24 시간 동안 배양 후, 배양 배지를 1 % FBS를 함유하는 DMEM으로 교체하고, 세포에 각각 다양한 농도 (0, 0.028, 0.28, 2.8, 28, 50 및 100 μg/ml)의 리간드 종류에 따른 금 나노입자를 처리하였다. 24 시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 트립신-EDTA 용액 (0.5 ml)으로 분리하였으며, 완전 배지 (1 ml)로 수거하였다. 각 시료를 트리판 블루로 처리하고, 염색된 세포는 hemocytometer를 사용하여 계수하였다.
상기 각 데이터는 3 회의 독립적 실험의 평균값 ± 표준 오차 (SE)로 표시하였으며, 용매 대조군에 대해 퍼센트 생존률로 표시하였다.
1-6. 세포 운동성 분석
살균 진공 그리스 (sterile vacuum grease)를 사용하여 12-웰 배양 플레이트의 각 웰 상에 모세관 (1.1 mm 직경)을 고정시켰다. 각각의 웰에 8×104 세포를 접종하고, 표면에 부착되도록 완전 배지에서 12 시간 동안 배양 후, 배지를 1 % FBS를 함유하는 DMEM (1 ml)으로 교체하고, 최종 농도가 10 μg/ml가 되도록 리간드-금 나노입자를 첨가하였다. 24 시간 후, 배지를 신선한 완전 배지로 교체하고, 모세관을 조심스럽게 제거한 후, 현미경을 사용하여 0, 12, 및 24 시간 째에 각각 이미지를 촬영하였으며, NIH ImageJ analysis software (버전 1.48)를 이용하여 간극에 이동한 셀의 개수를 측정하였다. 분석 결과는 미처리 대조군 세포로부터 얻어진 데이터를 이용하여 규격화하였다.
1-7. 콜로니 형성 효율 (CFE) 분석
세포를 디쉬 (60 mm 직경) 당 200 세포의 밀도로 접종하고, 24 시간 동안 완전 배지에서 배양한 후, 배지를 1 % FBS를 함유하는 DMEM (2 ml)으로 교체하고, 최종 농도가 10 μg/ml가 되도록 리간드-금 나노입자를 첨가하였다. 24 시간 후, 배지를 신선한 완전 배지로 교체하고, 8 일째에, 세포를 PBS에서 3.7 % (v/v) 포름알데히드 용액으로 고정하여 10 % (v/v) 김자액 (Giemsa stain)으로 염색하였다. 현미경을 사용하여 콜로니를 계수하고, 획득된 콜로니의 개수는 3 회의 독립적 실험의 평균값 ± 표준 오차 (SE)로 표시하였으며, 음성 대조군에 대해 퍼센트 CFE로 표시하였다.
1-8. DNA 복제 분석
DNA 복제 분석은 제조사의 지시에 따라, Calbiochem (Darmstadt, Germany)의 bromodeoxyuridine (BrdU) cell proliferation assay kit를 사용하여 수행하였다. HeLa 세포 (1×104 세포/웰)에 리간드 종류에 따른 금 나노입자의 최종 농도가 10 μg/ml가 되도록 리간드 종류에 따른 금 나노입자를 첨가하여 24 시간 동안 처리한 후, 추가로 24 시간 동안 BrdU를 처리하였다. 세포를 고정하고, 항-BrdU 항체-HRP 접합체로 처리 한 후, 흡광도 450-540 nm에서 microplate reader를 사용하여 측정하였다. 배양 배지를 블랭크 (blank)로 사용하였으며, 미처리 세포를 배경으로 사용하였다. 3 회의 독립적인 실험을 3 중으로 수행하였다.
1-9. 겔 위상차 (Gel retardation) 분석
정제된 플라스미드 DNA 및 리간드-금 나노입자 사이의 복합체 형성은 겔 위상차 분석법으로 확인하였다. 리간드 종류에 따른 DNA/금 나노입자 혼합물의 제작을 위하여, 플라스미드 DNA에 리간드 종류에 따른 금 나노입자를 다양한 질량비로 첨가한 후, 혼합물을 20 분 동안 배양하고, 에티 디움 브로마이드 (0.5 μg/ml)의 존재 하에 1 % 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 플라스미드 DNA는 UV 트랜스일루미네이터를 사용하여 시각화하였다.
1-10. 금 나노입자의 세포 흡수
HeLa 세포는 커버글라스 상에서 배양한 후, 리간드 종류에 따른 금 나노입자 (10 μg/ml)를 처리하여 24 시간 동안 반응시켰다. 그 후 3% 글루타르알데히드로 고정하고, PBS로 3 회 세척하였다. 샘플을 30 % (5 분), 50 % (5 분), 60 % (5 분), 70 % (5 분), 80 % (5 분), 90 % (5 분), 및 100 % (3 분) 농도의 친수성 메탄올을 사용하여 탈수한 후, 실온에서 밤새 건조하였다. 이때, 차징 효과를 방지하기 위해서 백금으로 도금하고, Carl Zeiss (Jena, Germany)의 필드 방사 주사 전자 현미경 (FE-SEM) instrument SIGMA를 사용하여 5 내지 15 kV의 범위의 전압에서 이미지를 취득하였다.
1-11. 세포 골격 구조의 시각화
금 나노입자가 처리된 세포의 골격 구조는 공초점 현미경을 사용하여 모니터링하였다. 커버글라스 상에서 성장한 HeLa 세포는 이들이 ~80 % 융합될 때까지 완전 배지에서 계속하여 성장시켰으며, 24 시간 동안 리간드 종류에 따른 금 나노입자 (10 μg/ml)를 개별적으로 처리한 후 고정하고, 제조사의 지시에 따라 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)의 Alexa Fluor 568 phalloidin을 사용하여 F (filamentous)-액틴을 염색하였다. 핵은 DAPI를 통하여 염색하였으며, 염색된 세포는 Eclipse Ti 공초점 레이저 주사 현미경 (Nikon Instruments, Ontario, Canada)을 사용하여 분석하였다. 형광 이미지를 통하여 골격 구조를 모니터링하였고, 위상차 이미지를 통하여 금 나노입자에 의한 세포 흡수를 관찰하였다.
실시예 2: 금 나노입자의 제작
먼저, 상기 실시예 1-2 및 1-3의 방법으로, 다양한 표면 전하를 띠는 일련의 금 나노입자를 제조하였으며, 제조된 리간드 종류에 따른 금 나노입자는 표 1에, 리간드로 사용된 펩타이드 아미노산 서열은 표 2에 나타내었다.
리간드-금 나노입자 구조
CP1-AuNPs Arg-Arg-Arg-Gly-Tyr-Cys-AuNPs
CP2-AuNPs Lys-Lys-Lys-Gly-Tyr-Cys-AuNPs
CP3-AuNPs Arg-Arg-Gly-Tyr-Cys-AuNPs
CP4-AuNPs Lys-Lys-Gly-Tyr-Cys-AuNPs
CP5-AuNPs Arg-Gly-Tyr-Cys-AuNPs
CP6-AuNPs Lys-Gly-Tyr-Cys-AuNPs
CP7-AuNPs Cys-Tyr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-AuNPs
CP8-AuNPs Arg-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Cys-AuNPs
CP9-AuNPs Arg-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-C11-Cys-AuNPs
아미노산 서열
서열번호 1 CP1 Arg Arg Arg Gly Tyr Cys
서열번호 2 CP2 Lys Lys Lys Gly Tyr Cys
서열번호 3 CP3 Arg Arg Gly Tyr Cys
서열번호 4 CP4 Lys Lys Gly Tyr Cys
서열번호 5 CP5 Arg Gly Tyr Cys
서열번호 6 CP6 Lys Gly Tyr Cys
서열번호 7 CP7 Cys Tyr Gly Arg Gly Asp Ser
서열번호 8 CP8 Arg Arg Arg Gly Tyr Lys Cys
서열번호 9 CP9 Arg Arg Arg Gly Tyr Lys C11 Cys
실시예 3: 제작된 리간드-금 나노입자의 작용 및 특성
표면 전하 및 리간드의 구조와 관련된 생물학적 시스템상 금 나노입자의 영향을 확인하기 위해, 상기 실시예 1-4의 방법으로 금 나노입자의 물성을 평가하였다.
한편, 상기 금 나노입자는 장기 보관시 매우 안정하고, 생물·의약학적 응용에도 안정하다고 인정받은 직경 20 nm 시트르산염-캡핑 금 나노체를 이용하였다. 또한, 일차 티올 리간드는 생체에 대한 독성을 낮추고 생체 적합성을 높일 수 있는 친수성 고분자를 사용하였으며, 이차 티올 리간드는 다양한 작용기의 도입을 통해 양이온성 리간드로 표면이 대전될 수 있도록 하기 위하여 pI값에 기초한 다양한 아미노산 서열을 선택하였다 (하기 표 3 참조). 이러한 펩타이드 리간드는 구조적으로 다양하여 금 나노입자의 표면에 다른 전하를 띠는 다양한 작용기의 도입에 적합하며, 상기 다양한 작용기의 도입에 의한 리간드 종류에 따른 금 나노입자 (이하, 리간드-금 나노입자)의 특성은 UV-Vis 분광, DLS 측정, 및 제타포텐셜 측정을 통하여 확인하였다.
Sample R pI value Hydrodynamic radii (nm) z-potential (mV) l max (nm)
name structure
MUAM - AuNPs MUAM NH2CH2(CH2)9CH2SH - 49.0±1.0 41.0±2.0 522
CP1- AuNPs RRRGYC Arg-Arg-Arg-
Gly-Tyr-Cys		 12.1 45.0±1.0 31.0±1.0 526
CP2- AuNPs KKKGYC Lys-Lys-Lys-
Gly-Tyr-Cys		 10.5 38.0±1.0 27.0±2.0 532
CP3- AuNPs RRGYC Arg-Arg-Gly-
Tyr-Cys		 11.1 40.0±2.0 24.0±2.0 524
CP4- AuNPs KKGYC Lys-Lys-Gly-
Tyr-Cys		 10.2 32.0±2.0 22.0±1.0 533
CP5- AuNPs RGYC Arg-Gly-Tyr-
Cys		 9.9 48.0±1.0 22.0±1.0 533
CP6- AuNPs KGYC Lys-Gly-Tyr-
Cys		 9.7 35.0±1.0 26.0±3.0 526
CP7- AuNPs CYGRGDS Cys-Tyr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser 8.9 26.0±5.0 16.0±2.0 526
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 양이온성 펩타이드 리간드의 도입에 따라 최대 흡수파장이 522~533 nm 정도의 값을 갖는 것을 UV-Vis 스펙트럼을 통해 확인하였고, 응집에 의한 심한 스펙트럼 변화는 보이지 않았다. 티로신-함유 티올 리간드가 도입되었을 때, 280 nm에서 새로운 최대 흡수도가 관찰되는 것으로 펩타이드-금나노입자 가교가 검증되었다. 또한, DLS을 이용하여 리간드 종류에 따른 금 나노입자의 크기를 확인한 결과, 26.0 ± 5.0에서 49.0 ± 1.0 nm로 단분산 형태의 안정한 금 나노입자가 제작된 것을 확인하였다.
나아가, 제타포텐셜 측정을 통해 리간드-금 나노입자의 표면 전하를 확인한 결과, 16.0 ± 2.0에서 41 ± 2.0 mV 폭의 전하 스펙트럼을 얻었으며, MUAM-AuNPs의 경우, 41.0 ± 2.0 mV로 가장 양전하를 띠는 것을 확인하였고, 다른 양이온성 펩티드 리간드가 도입된 금 나노입자 또한 상대적으로 양의 값을 보여주었다 (상기 표 3 참조). 이러한 결과는 전하의 크기와 하전된 금 나노입자의 크기가 양의 상관관계를 가짐을 의미한다.
이하, 상기 제작한 금 나노입자를 유전제 전달 물질로 사용하기 위하여, 이의 세포독성 및 유전체와의 상호작용을 살펴보았다.
실시예 4: 표면개질된 금 나노입자의 세포독성 평가
상기 실시예 2에서 관찰된 다양한 전하 및 특성을 갖는 금 나노입자에 대하여, 생물학적 효과를 모니터링하기 위하여 상기 실시예 1-5의 방법으로 생존능 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 다양한 리간드-금 나노입자 중에서 양성 대조군인 MUAM-AuNPs의 LD50은 HeLa 세포 및 인간 섬유아세포에서 약 19.0 μg/ml로, 두 세포주에서 현저한 세포 독성을 나타냄을 확인하였다. 다른 양이온성 펩타이드 리간드로 코팅된 금 나노입자는 100 μg/ml 농도에 이르기까지 유의한 세포 독성을 보이지 않았다. 또한 트리판 블루 분석을 통해 죽은 세포의 수를 계산하여 세포 생존능을 분석한 결과, MTT 분석과 유사하게 MUAM-AuNP의 LD50은 16.5 μg/ml로 세포 독성을 나타냄을 확인하였다.
한편, 이전의 연구들에서 양이온성-금 나노입자가 독성이 있다고 보고된 바 있어, 본 발명자들은 세 종류의 양이온성-금 나노입자의 세포 독성을 확인한 결과, 이 중 MUAM-AuNPs만이 세포 독성이 있다는 결과를 얻었는바, 상기 결과가 일반적으로 유효한지 여부를 확인하기 위하여, 추가적으로 실험을 수행하였다.
리간드-금 나노입자로부터 분리되는 미량의 자유 리간드의 영향을 배제하기 위하여, 원심분리 후 금 나노입자 용액의 상층액을 사용하여 별도의 MTT 분석을 이용하여 세포 생존능을 결정하였으며, 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, MUAM 자유 리간드만이 LD50 11 μM로, 확인한 농도 범위에서 세포 독성을 나타냄을 확인하였다.
이러한 결과는, MUAM-AuNPs가 다른 양이온성-금 나노입자인 CP1-AuNPs 및 CP2-AuNPs에 비하여 훨씬 높은 세포 독성을 나타내는 것을 의미한다.
이에, 상기 결과에 기초하여, MUAM-AuNPs의 높은 세포 독성이 표면전하 값이 크기 때문이라고 가정하고, 이를 확인하기 위하여 표면에 낮은 밀도의 아민을 처리한 MUAM-AuNPs인 MUAM1-AuNPs 및 MUAM2-AuNPs를 준비하고, 상기와 같은 실험을 수행하였다.
그 결과, MUAM1-AuNPs 및 MUAM2-AuNPs는 비-독성 CP1-AuNPs 및 CP2-AuNPs의 제타포텐셜 값과 유사하게 각각 33.0 ± 4.0 mV 및 29.0 ± 2.0 mV로 나타났다. 또한, MUAM1-AuNPs 및 MUAM2-AuNPs는 MTT의 생존 분석을 통해 MUAM-AuNPs와 유사한 LD50 값을 보임을 확인하였다.
이러한 결과는, 상기에서 관찰된 MUAM-AuNPs의 세포 독성이 높은 표면 전하에 의한 것이 아니라는 것을 의미하며, 일반적으로 종종 독성의 잘못된 원인으로 알려져있는 1차 아민 작용기 또한 독성의 원인이 아님을 나타낸다.
상기 내용을 종합한 결과, 본 발명의 CP1-AuNPs 및 CP2-AuNPs를 포함하는 양이온성-금 나노입자는, 낮은 세포 독성을 나타내는바, 효과적인 유전물질 전달체로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 5: 표면개질된 금 나노입자의 세포 기능 평가
상기 실시예 결과를 바탕으로, 리간드-금 나노입자에 대하여, 생물학적 효과를 모니터링하기 위하여 상기 실시예 1-6 내지 1-8의 방법으로 세포 운동성, 콜로니 형성 효율 (CFE), 및 DNA 복제 분석 등 세포 기능을 분석하였다.
5-1. 세포 운동성 분석
본 발명자들은 갭 필링 (gap-filling) 분석을 통하여 HeLa 세포의 운동성에 대한 각종 금 나노입자의 효과를 확인하였다. 이때, 균일 크기의 갭을 생성하기 위하여, 세포를 접종하기 전에 각각의 웰에 모세관을 설치하고, 세포를 접종한 후, 24 시간 동안 리간드-금 나노입자를 10 μg/ml 농도로 처리하였다. 그 후, 모세관은 갭의 균일한 크기의 차이를 나타내기 위해 제거하고, 24 시간 후, 갭 내로 이주 된 세포의 수는 NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산하고, 비처리된 음성 대조군 세포로부터 얻은 데이터를 이용하여 정규화하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 다양한 금 나노입자들 중 오직 MUAM-AuNPs를 처리했을 때, 갭 내로 이주 된 세포의 수가 70 % 감소한 것을 확인하였다.
5-2. 콜로니 형성 효율 (Colony forming efficiency, CFE) 분석
다음으로, CFE 분석을 통하여 세포 분열에 있어, 다양한 금 나노입자의 효과를 모니터링하였다. HeLa 세포에 10 μg/ml의 농도로 양이온성 금 나노입자를 24 시간 동안 처리하고, 8일 후에 콜로니를 계수하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, CP1-AuNPs 및 CP2-AuNPs로 처리된 세포는 비처리 대조군과 비슷한 수준의 콜로니를 확인할 수 있었다. 또한, MUAM-AuNPs 처리된 세포의 경우, 8 일 째에 김자-염색된 살아있는 세포를 관찰하였지만, 50 세포 이상의 콜로니는 관찰되지 않았다.
상기 내용을 종합한 결과, CP1 및 CP2를 포함하는 양이온성 펩타이드가 도입된 금 나노입자는 낮은 세포 독성을 나타내는바, 효과적인 유전물질 전달체로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
5-3. DNA 복제 분석
또한, 상기 결과에 기초하여, DNA 복제의 효율성을 모니터링하여 그 효과를 더 확인하였다. 리간드-금 나노입자에 노출시킨 HeLa 세포에 BrdU를 처리하고, 새로이 합성된 DNA에서 BrdU의 혼입을 형광 표지된 항-BrdU 항체를 사용하여 시각화하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 리간드-금 나노입자에 24 시간 노출 후, 세포 주기의 이상 현상을 보인 세포의 비율이 상당한 변화를 나타냄을 확인하였다. 특히, MUAM-AuNPs로 처리된 세포의 경우, BrdU의 혼입이 크게 감소하였으며, 이는, CFE 분석의 결과와 일치하였다. 반면, 다른 양이온성 금 나노입자인 CP1-AuNPs 및 CP2-AuNPs의 경우, 대조군에 비해 유의한 차이를 보이지 않았다.
5-4. 세포 골격 구조의 시각화
F (filamentous)-액틴 세포 골격의 형성 및 기계적 행동의 적절한 규제는 세포 분열, 접착 및 이주 등 다양한 세포 과정에서 중요하다. 이에, 금 나노입자가 포유동물 세포의 골격 구조상에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 다양한 리간드-금 나노입자로 세포를 처리 한 후, 공초점 형광 현미경을 사용하여 F-액틴을 모니터링하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, MUAM-AuNPs 처리 시, 긴 F-액틴의 형성이 현저하게 억제되는 것으로 나타났으며, 또한, F-액틴 (흰색 화살표)의 짧은 단편들은 결과적으로 더 둥근 형태로 관찰되었다.
나아가, 세 종류의 양이온성 금 나노입자는 세포 원형질막 근처에서 발견되었으며, 상기 양이온성 금 나노입자의 경우도, 도입된 리간드의 종류에 따라, MUAM-AuNPs가 가장 높게 나타났으며, CP1-AuNPs 및 CP2-AuNPs 순으로, 원형질막 근처에서 발견되는 리간드-금 나노입자의 양이 달라짐을 확인하였다.
상기 내용을 종합한 결과, MUAM-AuNPs와 달리 양이온성 펩티드 리간드로 대전된 금 나노입자는 세포 분열 중에 DNA 합성을 방해하지 않음으로써 효과적인 유전물질 전달체로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 6: 금 나노입자와 유전자 간의 상호작용 검출
상기 실시예 결과에 기초하여, DNA 복제에 대한 선택적 독성이 양이온성-금 나노입자 또는 음이온성-금 나노입자와 DNA 사이의 결합 친화도의 차이에 기인한 것인지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-9의 방법으로 겔 위상차 (Gel retardation) 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, DNA 결합 효율은 리간드-금 나노입자의 표면 전하와 음의 상관관계를 보였으며, CP2-AuNPs, CP1-AuNPs, MUAM-AuNPs 순으로 우수한 유전자와의 결합력을 가짐을 알 수 있었다.
다음으로, MUAM-AuNPs로 처리된 세포의 감소 비율이 DNA 중합효소와 금 나노입자 사이의 직접적인 상호 작용에 기인한 것인지 여부를 확인하기 위하여, Taq 중합효소를 이용하여 다양한 리간드-금 나노입자의 존재 하에 PCR을 수행하여 중합효소 활성에 대한 리간드-금 나노입자의 효과를 확인하였다. 이때, PCR 산물은 전기영동을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, MUAM-AuNPs 및 CP2-AuNPs는 높은 농도에서 중합 반응을 억제함을 확인하였다.
이러한 결과는, MUAM-AuNPs가 금 나노입자가 DNA에 결합하거나 직접 중합효소 활성을 저해하는 방법으로 DNA 복제를 억제하는 것이 아님을 시사하고 있는바, 비-독성 양이온성 금 나노입자에 기초한 효과적인 유전자 전달을 위한 유전자 담체를 설계할 수 있는 가능성이 있음을 나타낸다.
실시예 7: 리간드 종류에 따른 금 나노입자- 양이온성 고분자-유전물질 결합체 (유전물질 전달체)의 제작 및 전달 효율 평가
상기 실시예 결과에 기초하여, 무독성의 양이온성 리간드가 결합된 금 나노입자를 이용하여 본 발명의 유전물질 전달체 (나노입자-PEI-유전물질의 결합체)를 제작하고, 이를 이용하여 세포 내 유전자 전달 효율을 평가하였다.
먼저, 유전자의 경우, HeLa 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 형질감염 전 12 시간 동안 완전 배지에서 배양하였다. 이어서 배지를 제거하고 무-혈청 DMEM 배지로 교체하였다. 이어서, 1 μg의 EGFP-N1 플라스미드를 함유하는 리간드-금 나노입자/PEI/DNA를 각각의 웰에 첨가하였다. 37 ℃, 5% CO2 조건에서 4 시간동안 배양한 후, 형질감염 용액을 주입하고 완전 배지로 교체하였다. 추가로 24 시간 배양한 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2 회 세척한 다음, 공초점 현미경을 사용하여 관찰하였으며, 모든 이미지는 동일한 레이저 설정으로 촬영하였다.
추가적으로, 단백질의 경우, 금 나노입자 및 EGFP의 최종 농도를 각각 1.5 μM 및 600 nM로 하여 리간드-금 나노입자/단백질 착물을 실온에서 10 분 배양하여 준비하였다. HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 접종하고 전달하기 전 24 시간 동안 완전 배지에서 배양하고, PBS로 3 회 세척하였다. EGFP/금 나노입자 복합체는 24-웰 플레이트에서 세포와 함께 1 시간 동안 배양한 후, 10 % FBS를 포함하는 신선한 DMEM 배지에서 유지하였다. 추가로 1 시간 배양한 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2 회 세척 한 다음, 공초점 현미경을 사용하여 관찰하였으며, 모든 이미지는 동일한 레이저 설정으로 촬영하였다.
그 결과, 도 12 및 13에 나타낸 바와 같이, CP1-AuNPs/PEI/DNA 전달체 및 CP2-AuNPs/PEI/DNA 전달체의 경우, 높은 유전자 전달 효율을 보임을 알 수 있었으며, CP1-AuNPs/단백질 전달체 및 CP2-AuNPs/단백질 전달체 또한 높은 단백질 전달 효율을 보임을 알 수 있었다.
이러한 결과는 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금 나노입자를 유전체 전달 물질로 사용하는 경우, 독성이 낮추고 유전자 전달 효율 높일 수 있는 바, 이를 약물 및/또는 유전 물질을 이용한 치료에 응용할 수 있음을 시사하고 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Nano-Complex for delivering bioactive materials, uses thereof and preparation method thereof <130> MP16-279 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> CP1 <400> 1 Arg Arg Arg Gly Tyr Cys 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> CP2 <400> 2 Lys Lys Lys Gly Tyr Cys 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> CP3 <400> 3 Arg Arg Gly Tyr Cys 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> CP4 <400> 4 Lys Lys Gly Tyr Cys 1 5 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> CP5 <400> 5 Arg Gly Tyr Cys 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> CP6 <400> 6 Lys Gly Tyr Cys 1 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> CP7 <400> 7 Cys Tyr Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> CP8 <400> 8 Arg Arg Arg Gly Tyr Lys Cys 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> CP9 <400> 9 Arg Arg Arg Gly Tyr Lys C11 Cys 1 5

Claims (13)

  1. 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금 나노입자를 포함하는, 생리활성 물질 전달체로,
    상기 양이온성 리간드는 서열번호 1, 2, 또는 7의 양이온성 리간드인 것을 특징으로 하는, 생리활성 물질 전달체 :
    서열번호 1: Arg Arg Arg Gly Tyr Cys
    서열번호 2: Lys Lys Lys Gly Tyr Cys
    서열번호 7: Cys Tyr Gly Arg Gly Asp Ser.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 생리활성 물질 전달체는 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine, PEI)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생리활성 물질 전달체.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은 체내에서 약리 활성을 나타내는 DNA, RNA, 안티센스핵산, 리보좀, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 생리활성 물질 전달체.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 생리활성 물질 전달체는 세포 표면 인지질과 정전기적 인력에 의해 결합하는 것을 특징으로 하는, 생리활성 물질 전달체.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 생리활성 물질 전달체는 낮은 세포 독성을 갖는 것을 특징으로 하는, 생리활성 물질 전달체.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 생리활성 물질 전달체는 높은 생리활성 물질 전달 효율을 갖는 것을 특징으로 하는, 생리활성 물질 전달체.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 따른 생리활성 물질 전달체를 유효성분으로 포함하는, 약물 전달체.
  10. 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는 생리활성 물질 전달체의 제조방법으로,
    상기 양이온성 리간드는 서열번호 1, 2, 또는 7의 양이온성 리간드인 것을 특징으로 하는
    생리활성 물질 전달체의 제조방법:
    서열번호 1: Arg Arg Arg Gly Tyr Cys
    서열번호 2: Lys Lys Lys Gly Tyr Cys
    서열번호 7: Cys Tyr Gly Arg Gly Asp Ser.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은 체내에서 약리 활성을 나타내는 DNA, 안티센스 핵산, 리보좀, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 생리활성 물질 전달체의 제조방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 양이온성 리간드로 표면이 대전된 금 나노입자와 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine, PEI)을 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생리활성 물질 전달체의 제조방법.
  13. 삭제
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