CN105521494B - 含有大分子的、引入有细胞穿透肽的药物输送载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有脂质结构或聚合物颗粒的药物输送载体，该聚合物颗粒共价键合至细胞穿透AP‑GRR肽(SEQ ID NO 1)，或者由含有所述肽的肽链改性。本发明还涉及包含所述药物输送载体和包封在所述载体内的生理活性成分的组合物。本发明的药物输送载体可有效地输送难以被输送至细胞的大分子，从而改善大分子的生物利用度。

Description

含有大分子的、引入有细胞穿透肽的药物输送载体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年10月15日提交的申请号为10-2014-0139024的韩国申请，以及2015年9月15日提交的申请号为10-2015-0130127的韩国申请的优先权，并且基于35U.S.C.§119要求由此产生的所有益处，其全部内容通过参考引入此处。
技术领域
本发明涉及含有大分子的、引入有细胞穿透肽的药物输送载体。
背景技术
通常，亲水性和大的物质不能通过细胞膜屏障穿透细胞。细胞膜防止大分子，如肽、蛋白质和核酸进入细胞。即使当它们通过称为细胞膜受体的内吞作用的生理机理而进入细胞时，在与溶酶体腔融合后，它们也会被降解。因此，利用它们治疗和预防疾病还存在很多障碍。
因此，需要并且有必要开发能够有效将生物分子输送至细胞内，并且没有细胞毒性的新系统。目前已经出现几种方案。具体地，细胞穿透肽引起很大的关注是因为它们可改善大分子的利用值，该大分子为例如由于低的细胞膜透过性和短的体内半衰期而难以用作药物的治疗性蛋白质和基因。
能够穿透进入细胞膜的肽主要为源自蛋白质的膜穿透肽，可大致分为三类。第一类为penetratin，一种源自氨基酸序列为SEQ ID NO 2的同源结构域的肽(Drosophilamelanogaster,氨基酸序列:Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Met Lys TrpLys Lys)。它是在控制触角的基因(Antennapedia)的同源结构域中发现的，其是果蝇的同源蛋白(A.Joliot et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1991)88,1864)。同源蛋白是一种转录因子，且具有称为含有大约60个结合至DNA的氨基酸的同源结构域的结构。第二类为位于Tat蛋白的残基49-57之间的Tat49-57肽，Tat蛋白是一种导致获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的人类免疫缺陷病毒类型1(HIV-1)的转录相关蛋白。它具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列(人类免疫缺陷病毒类型1,氨基酸序列:Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg)(P.A.Wender et al.,PNAS(2000)97,24,13003-13008)。第三类为基于膜转位序列(MTS)或信号序列的肽。发现它由受体蛋白识别，受体蛋白帮助将由RNA新和成的蛋白质定位在合适的细胞器官的膜上，以及结合至核定位信号(NLS)的MTS穿过细胞膜并在一些细胞类型的细胞核内积累。这是在源于结合至NLS肽的信号序列，例如卡波西肉瘤成纤维细胞生长因子1(K-FGF)、人β3整合素、HIV-1gp41等的疏水区内识别的，其中NLS肽源自核转录因子κB(NF-κB)、猿猴病毒40(SV40)T抗原、或K-FGF(Y.Lin et al.,J.Biol.Chem.(1996)271,5305；X.Lin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1996)93,11819；M.C.Morris et al.NucleicAcids Res.(1997)25,2730；L.Zhang et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)95,9184；Chaloin et al.,Biochiem.Biochim.Res.Commun.(1998)243,601；Y.Lin et al.,J.Biol.Chem.(1995)270,14255)。
相关技术参考文献
非专利文献：
A.Joliot et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1991)88,1864.
P.A.Wender et al.,PNAS(2000)97,24,13003-13008.
Y.Lin et al.,J.Biol.Chem.(1996)271,5305.
X.Lin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1996)93,11819.
M.C.Morris et al.Nucleic Acids Res.(1997)25,2730.
L.Zhang et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)95,9184.
Chaloin et al.,Biochiem.Biochim.Res.Commun.(1998)243,601.
Y.Lin et al.,J.Biol.Chem.(1995)270,14255.
发明内容
为了容易地将不能穿透入细胞的大分子物质输送至细胞内，本发明涉及提供包含细胞穿透肽和生理活性成分的组合物。
一方面，本发明提供包含药物输送载体的组合物，该药物输送载体包含脂质结构或共价键合至AP-GRR肽或含有细胞穿透肽的肽链上的聚合物颗粒，以及包封在所述载体内的生理活性成分。
由于将能够有效增加膜穿透性的AP-GRR肽引入其中，根据本发明的一方面的药物输送载体显著地改善了作为生理活性成分的、具有大分子量的大分子物质的输送。因此，根据本发明一方面的药物输送载体克服了多糖、酶、肽、药物、蛋白质等大分子生理活性成分不能很好地输送至细胞内的缺陷。
附图说明
图1展示了包含本发明以及对比实施例的药物输送载体的脂质体水溶液的透射电子显微图像；
图2展示了用根据本发明一方面的携带荧光染料的药物输送载体处理细胞，并通过FACS分析其在细胞中的含量；
图3展示了根据本发明一方面的携带罗丹明B的药物输送载体处理细胞，并利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察细胞；
图4展示了根据本发明一方面的携带葡聚糖-RITC的药物输送载体处理细胞，并利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察细胞；
图5展示了表明在PBS或一般脂质体中的罗丹明B和葡聚糖-RITC通过皮肤的吸收结果的显微图像；
图6展示了表明在PBS或根据本发明一方面的药物输送载体中的罗丹明B和葡聚糖-RITC通过皮肤的吸收结果的显微图像；
图7展示了通过皮肤吸收罗丹明B的定量结果；
图8展示了通过皮肤吸收葡聚糖-RITC的定量结果。
具体实施方式
一方面，本发明还涉及一种药物输送载体，该药物输送载体包含脂质结构或共价键合至细胞穿透肽或含有细胞穿透肽的肽链的聚合物颗粒。
根据本发明的一方面，可将生理活性成分包封在脂质结构中或聚合物颗粒中。
根据本发明的一方面，脂质结构可以是脂质构造。
根据本发明的一方面，聚合物颗粒可以是聚合物结构或聚合物构造。
根据本发明的一方面，生理活性成分可以具有500Da或更大的数均分子量或重均分子量。具体地，生理活性成分可以是水溶性或水不溶性大分子。
根据本发明的一方面，当药物输送载体包含脂质结构时，生理活性成分可以是水溶性大分子。
根据本发明的一方面，当药物输送载体包含聚合物颗粒时，生理活性成分可以是水不溶性大分子。
根据本发明的一方面，细胞穿透肽可以是具有序列为Gly(Arg)n Gly Tyr LysCys(1≤n≤20)的AP-GRR肽。
根据本发明的一方面，n可以满足3≤n≤9。
根据本发明的一方面，细胞穿透肽可以包含SEQ ID NO 1(氨基酸序列:Gly ArgArg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Tyr Lys Cys)的序列。具体地，根据本发明的一方面，细胞穿透肽可以具有SEQ ID NO 1(Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg ArgGly Tyr Lys Cys)的序列。
根据本发明的一方面，脂质结构或聚合物颗粒可以包含双亲性聚合物。
根据本发明的一方面，当聚合物颗粒进一步包含双亲性聚合物时，该聚合物颗粒可以是双亲性聚合物或者可以由其制备。
根据本发明的一方面，细胞穿透肽或含有细胞穿透肽的肽链可共价键合至双亲性聚合物。
根据本发明的一方面，细胞穿透肽或含有细胞穿透肽的肽链与脂质结构或聚合物颗粒之间的共价键可以是在马来酰亚胺基和硫醇基之间形成的共价键。本领域技术人员已知这种共价键相当稳定。
根据本发明的一方面，细胞穿透肽或含有细胞穿透肽的肽链可以通过马来酰亚胺基和硫醇基之间的键键合至脂质结构、聚合物颗粒或包含于其中的双亲性聚合物，但是并不限于此，只要可以形成稳定地共价键即可。因为根据本发明一方面的细胞穿透肽具有硫醇基，所以可将马来酰亚胺基引入脂质结构、聚合物颗粒或包含于其中的双亲性聚合物，以引入具有细胞穿透肽的共价键。根据本发明的一方面，可通过将马来酰亚胺基键合至脂质结构、聚合物颗粒、或包含于其中的双亲性聚合物的羰基来将马来酰亚胺引入脂质结构、聚合物颗粒或包含于其中的双亲性聚合物。
根据本发明的一方面，双亲性聚合物可以是选自具有连接至透明质酸侧链的烷基化透明质酸、化学式1的聚(甲基丙烯酸-共-正烷基甲基丙烯酸酯)无规共聚物、和化学式2的聚(甲基丙烯酸羟乙酯-共-正烷基甲基丙烯酸酯)无规共聚物的一种或多种物质，但并不限于此。根据本发明一方面，双亲性聚合物可以是通过一般的自由基热引发方法由聚合反应制备的一般的丙烯酸酯类聚合物。
Figure BDA0000822321120000051
在化学式1和2中，
7≤n≤22，和
x：y的摩尔比为90:10至50:50。
根据本发明的一方面，聚(甲基丙烯酸-共-正烷基甲基丙烯酸酯)无规共聚物可以由两种单体甲基丙烯酸和正烷基甲基丙烯酸酯构成。该聚合物可通过一般的自由基热引发方法由聚合反应制备。同样地，可利用阴离子或阳离子聚合控制分子量分布。
根据本发明的一方面，聚(甲基丙烯酸羟乙酯-共-正烷基甲基丙烯酸酯)无规共聚物可以由两种单体甲基丙烯酸羟乙酯和正烷基甲基丙烯酸酯构成。该聚合物可通过一般的自由基热引发方法由聚合反应制备。同样地，可利用阴离子或阳离子聚合控制分子量分布。
根据本发明的一方面，在化学式1和2中，n可以是5至30的整数，具体地为7至22的整数，更具体地为11至22的整数。
根据本发明的一方面，在化学式1和2中，x：y的摩尔比可以是50至90的整数：10至50的整数，具体地为90:10、85:15、70:30、60:40、或50:50。更具体地，可以是85:15至70:30。
根据本发明的一方面，化学式1或2的双亲性聚合物的分子量影响聚合物-脂质体纳米复合物的结构。根据本发明的一方面的药物输送载体中使用的聚合物可以具有5,000-100,000，更具体10,000-50,000的数均分子量。
在根据本发明的一方面的药物输送载体中，由于该双亲性聚合物，脂质结构可具有更加稳定的结构。
对于用于皮肤外用的化妆品或试剂的脂质-胆固醇基脂质体，应该保证在剂型中的稳定性。但是，由于剂型中存在的各种表面活性剂，它很容易失去其结构。通过将双亲性聚合物引入脂质体，可以在一定程度上克服结构的不稳定性的缺点。引入双亲性聚合物的聚合物-脂质体复合物保持形状与脂质-胆固醇基脂质体的形状相似，且具有这样的结构：其中双亲性聚合物的疏水部分聚集在脂质-胆固醇基脂质双层之间，紧密地结合脂质双层，从而保护外壁并稳定地保持脂质体的结构抵抗盐、表面活性剂等使脂质体结构不稳定的各种因素。
在根据本发明一方面的药物输送载体中，可用作双亲性聚合物的聚合物可以具有的数均分子量为5,000-200,000Da，具体地为10,000-100,000Da。双亲性聚合物可以具有的数均分子量为1,000Da或更大、2,000Da或更大、3,000Da或更大、4,000Da或更大、5,000Da或更大、6,000Da或更大、7,000Da或更大、8,000Da或更大、9,000Da或更大、10,000Da或更大、11,000Da或更大、12,000Da或更大、13,000Da或更大、14,000Da或更大、15,000Da或更大、20,000Da或更大、30,000Da或更大、50,000Da或更大、100,000Da或更大、或者200,000Da或更小、150,000Da或更小、100,000Da或更小、90,000Da或更小、80,000Da或更小、70,000Da或更小、60,000Da或更小、50,000Da或更小、40,000Da或更小、30,000Da或更小、20,000Da或更小、10,000Da或更小、5,000Da或更小、3,000Da或更小、或1,000Da或更小、但是并不限于此。
根据本发明的一方面，双亲性聚合物的疏水部分和亲水部分的摩尔比可为10-50％。当该摩尔比小于10％，该聚合物可独立地存在于水相中，并可作为表面活性剂。当摩尔比超过50％时，即当聚合物的疏水部分是主导时，具有脂质体的复合物中的脂质体的结构可变得不稳定。
根据本发明的一方面，双亲性聚合物可以通过一般的自由基热引发方法由聚合反应制备。同样地，可利用阴离子或阳离子聚合控制分子量分布。此外，对于天然聚合物，例如透明质酸，烷基链可共价键合至侧链，以赋予疏水性。
根据本发明的一方面，脂质结构或聚合物颗粒与双亲性聚合物基于其混合物总重量的重量比为50-99wt％:1-50wt％，具体为70-90wt％:10-30wt％，脂质结构可包含胆固醇。
当本发明的药物输送载体进一步包含双亲性聚合物以提高脂质体的结构稳定性时，双亲性聚合物的基于脂质结构或聚合物颗粒和双亲性聚合物的混合物的总重量的含量为1-50wt％，具体为10-30wt％。在这种比例下，容易制备最稳定的聚合物-脂质体复合物。
根据本发明的一方面，“数均分子量”可以指通过用数量分数或摩尔分数平均具有分子量分布的聚合物化合物的分子种类的分子量而获得的平均分子量，“重均分子量”可以指通过用重量分数平均具有分子量分布的聚合物化合物的分子种类的分子量而获得的平均分子量。可通过本发明所属领域的技术人员已知的方法计算数均分子量或重均分子量。
根据本发明的一方面，生理活性成分可以具有的数均分子量或重均分子量为1,000Da或更大、2,000Da或更大、3,000Da或更大、4,000Da或更大、5,000Da或更大、6,000Da或更大、7,000Da或更大、8,000Da或更大、9,000Da或更大、10,000Da或更大、11,000Da或更大、12,000Da或更大、13,000Da或更大、14,000Da或更大、15,000Da或更大、20,000Da或更大、30,000Da或更大、50,000Da或更大、100,000Da或更大、300,000Da或更大、500,000Da或1,000,000Da或更大、或5,000,000Da或更小、4,000,000Da或更小、3,000,000Da或更小、2,000,000Da或更小或1,000,000Da或更小、但是并不限于此。
根据本发明的一方面，生理活性成分可以是选自以下的一种或多种物质：合成水溶性大分子物质、从天然产物中提取的大分子物质、酶、EGF(表皮生长因子)、蛋白质、肽和作为大分子的多糖。生理活性成分可以是一种表现为有用的皮肤保湿、皮肤美白或抗氧化效果的成分。
根据本发明的一方面，在最广泛的概念中，生理活性成分可以是水溶性大分子，包括合成的、提取的或天然产生的水溶性大分子。该大分子可以是对皮肤提供有用效果的大分子。
在一个方面，本发明可涉及包含根据本发明一方面的药物输送载体和包封在所述载体内的生理活性成分的组合物。
根据本发明的一方面，该组合物可以是药物组合物或化妆品组合物。
根据本发明的一方面，化妆品组合物的剂型不受具体限制，可以根据目的进行合适地选择。例如，其可以制备成选自以下的一种或多种剂型：皮肤乳液、皮肤柔软剂、爽肤水、收敛剂、乳液、牛奶乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华、营养精华、粉饼、肥皂、洁面泡沫、洁面乳液、洁面霜、身体乳液和身体清洁剂，但不不限于此。
当根据本发明一方面的化妆品组合物制成糊、霜或凝胶时，动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂、膨润土、二氧化硅、滑石粉、氧化锌等可用作载体成分。
当根据本发明一方面的化妆品组合物制备粉末或喷剂时，乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末可用作载体成分。具体地，当剂型为喷剂时，进一步包含推进剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
当根据本发明一方面的化妆品组合物制成溶液或乳液时，溶剂、溶解剂或乳化剂可用作载体成分。例如，可以使用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或脱水山梨醇的脂肪酸酯。
当根据本发明一方面的化妆品组合物制成悬浮液时，可以使用如水、乙醇或丙二醇的液体稀释剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脱水山梨醇酯的悬浮剂，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂，黄芪胶等作为载体成分。
当根据本发明一方面的化妆品组合物为含有表面活性剂的清洁剂时，可以使用脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸酯、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸酯、肌氨酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺甜菜碱，脂族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油，羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分。
根据本发明一方面的化妆品组合物可进一步包含功能性添加剂和一般化妆品组合物中含有的成分。功能性添加剂可包含选自以下的一种或多种成分：水溶性维生素、油溶性维生素、多肽、多糖、鞘脂类和海藻提取物。这些功能性添加剂为生理活性成分，其可以包封在根据本发明的一方面的药物输送载体内。
根据本发明的一方面，如果需要，与功能性添加剂一起，化妆品组合物可进一步包含一般化妆品组合物中含有的成分。该额外含有的成分可以包括油、脂肪、湿润剂、软化剂、表面活性剂、有机或无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、植物提取物、pH控制剂、醇、着色剂、香料、血液循环促进剂、冷却剂、除臭剂、纯净水等。
可将根据本发明一方面的药物组合物制备成各种用于口服或肠胃外给药的剂型。如填料、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂常用于制备该剂型。用于口服给药的固体剂型包括片剂、丸剂、粉末、颗粒、软胶囊或硬胶囊等。通过与至少一种赋形剂，如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等混合制备固体剂型。除了简单的赋形剂，还可以使用硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。用于口服的液体剂型包括悬浮液、供内部使用的溶液、乳液、浆液等。除了通常使用的如水和液体石蜡的简单稀释剂之外，还可以包含各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂。用于肠胃外给药的剂型包括灭菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳液、冻干制剂和栓剂。可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯等作为非水溶液或悬浮液的溶剂。Witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可油、月桂脂、甘油明胶等可用作栓剂的基质。
根据本发明的一方面，该组合物可以以药学上可接受的盐的形式单独或与另一种药物活性化合物结合进行药物上的给药。该盐不受具体限制，只要是药学上可接受的盐即可。例如，可以使用盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、氢氟酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、萘磺酸盐等。
根据本发明的一方面，可以根据目的肠胃外或口服给药所述组合物，每Kg体重可以每天一次或几次给药0.1-500mg，具体为1-100mg。根据患者的体重、年龄、性别、健康状况和饮食，给药次数，给药方法，排泄率，疾病的严重程度等，对于具体患者的给药剂量可以不同。
根据通常使用的方法将本发明的一方面的药物组合物制备成任何药学上合适的剂型，包括口服剂型，如丸剂、颗粒、片剂、软胶囊或硬胶囊、悬浮液、乳液、浆液、烟雾剂等；用于皮肤外用的剂型，如软膏、霜等；栓剂；注射剂；用于注射的无菌溶液等。具体地，它可以制备成注射剂或皮肤外用的溶液。
可通过包括肠胃外和口服途径的各种途径将本发明一方面的组合物给药至哺乳动物，如大鼠、小鼠、牲畜、人类等。可以预期任何可能的给药模式。例如所述组合物可以口服、经皮、直肠、静脉内、肌内，皮下、宫内(intrauterinarily)、或脑室内给药。
根据本发明一方面的组合物可通过本领域容易采用的各种途径进行给药。具体地，根据本发明一方面的药物组合物可以是皮肤外用的剂型，并可以通过涂敷至皮肤表面进行给药。
根据本发明一方面的细胞穿透肽可以是具有Gly(Arg)n Gly Tyr Lys Cys(1≤n≤20)序列的AP-GRR肽。
在根据本发明一方面的AP-GRR肽中，n可以为3至9。
根据本发明的一方面，AP-GRR肽可以具有SEQ ID NO 1的序列。
根据本发明的一方面，当药物输送载体包含脂质结构时，药物输送载体可以进一步包含稳定剂。
根据本发明的一方面，稳定剂可以是胆固醇衍生物。具体地，稳定剂为胆固醇。胆固醇衍生物指的是具有作为主干的胆固醇的衍生物。
具体地，根据本发明的一方面，药物输送载体可以包含：共价键合至细胞穿透肽或含有细胞穿透肽的肽链上的脂质结构；稳定剂；和生理活性成分。
根据本发明的一方面，药物输送载体可以包含摩尔比为1-3:1-2的脂质结构和稳定剂。具体地，该摩尔比可以是1.5-3.0:1.0-2.0。更具体地，脂质结构可以是两种或多种脂质的组合，且包含的脂质的摩尔比可以是1-2:1-2。
根据本发明的一方面，脂质结构可以包含一种或多种作为脂质结构的二油基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-Mal)复合物。
根据本发明的一方面，药物输送载体可以包含摩尔比为1.0-2.0:1.0-2.0:1.0-3.0:0.01-1.0的二油基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-Mal)复合物。具体地，该摩尔比可以是1.0-1.5:1.0-1.5:1.5-2.5:0.1-0.3。当包含上述摩尔比的脂质时，药物输送载体可表现出将水溶性大分子输送至细胞内的最佳效果。
根据本发明的一方面，可以引入基于脂质结构或聚合物颗粒的摩尔数的1mol％或更大、2mol％或更大、4mol％或更大、6mol％或更大、8mol％或更大、或10mol％或更大、或15mol％或更小、10mol％或更小、8mol％或更小、6mol％或更小、4mol％或更小、2mol％或更小、1mol％或更小、或0.1mol％或更小的共价键合至药物输送载体的脂质结构或聚合物颗粒的AP-GRR肽或含有AP-GRR肽的肽链。
根据本发明的一方面，脂质结构可以是脂质体或乳液。
根据本发明的一方面，脂质体或乳液的脂质成分可以是具有C12-C24脂肪酸链的磷脂或硝基脂。
根据本发明的一方面，磷脂为选自以下的一种或多种物质：天然磷脂，例如蛋黄卵磷脂(磷脂酰胆碱)、大豆卵磷脂、溶血卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、双磷脂酰甘油、心磷脂和缩醛磷脂；通过一般方法由所述天然磷脂获得的加氢产物；合成磷脂，例如双十六烷基磷酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、桐酰磷脂酰胆碱(eleostearoylphosphatidylcholine)、桐酰磷脂酰乙醇胺(eleostearoylphosphatidylethanolamine)和桐酰磷脂酰丝氨酸(eleostearoylphosphatidylserine)，及其水解产生的脂肪酸混合物。
根据本发明的一方面，磷脂为磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的组合、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油的组合、磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的组合、磷脂酰胆碱和磷脂酸的组合、磷脂酰胆碱和二油酰基磷脂酰乙醇胺的组合、或磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸的组合。
具体地，根据本发明的一方面，脂质体可以是磷脂酰胆碱和二油酰基磷脂酰乙醇胺的组合。
根据本发明的一方面，包含的最多的成分与包含的最少的成分的混合比例为1:5或更小。
根据本发明的一方面，所述组合为磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸的组合，且所述磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸的混合比例为1-4:1-2:1-2。
根据本发明的一方面，脂质成分基于所述脂质体悬浮液或乳液的总重量的含量为0.001-20wt％。
根据本发明的一方面，聚合物颗粒可以包含一种不会诱发炎症或免疫反应的生物相容性的物质，且在体内降解，其降解产物在体内同样无毒害。
根据本发明的一方面，聚合物颗粒可以包含双亲性聚合物，或者可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物。
根据本发明的一方面，聚合物颗粒可以包含基于乳酸和乙醇酸的可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物。
根据本发明的一方面，可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物可以为选自以下的一种或多种物质：化学式3的聚(D，L-乳酸)、聚(L-乳酸)或聚(D-乳酸)，化学式4的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)、聚(D-乳酸-共-乙醇酸)或聚(L-乳酸-共-乙醇酸)，聚(己内酯)，聚(戊内酯)，聚(羟基丁酸酯)，聚(羟基戊酸酯)，聚(1,4-二恶烷-2-酮)，聚(原酸酯)和它们的单体制成的共聚物：
Figure BDA0000822321120000141
其中n为2或更大的整数，
Figure BDA0000822321120000142
其中，m和n可以相同或不同，分别可以为2或更大的整数。
根据本发明的一方面，可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物可具有500-100,000Da的平均分子量。
根据本发明的一方面，AP-GRR肽(A)和所述可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物(B)可共价键合为A-B或A-B-A的形式。
根据本发明的一方面，可通过将碱、连接体或多配位化合物加入AP-GRR肽或含有AP-GRR肽的肽链与所述脂质结构或所述聚合物颗粒之间来形成所述共价键。
根据本发明的一方面，药物输送载体可具有1,000nm或更小的平均粒径。根据本发明的一方面，药物输送载体可以具有100nm或更大、200nm或更大、300nm或更大、400nm或更大、500nm或更大、600nm或更大、700nm或更大、800nm或更大、900nm或更大、1,000nm或更大或2,000nm或更大、或3,000nm或更小、2,000nm或更小、1,000nm或更小、900nm或更小、800nm或更小、700nm或更小、600nm或更小、500nm或更小、400nm或更小、300nm或更小、200nm或更小或100nm或更小的平均粒径。
根据本发明的一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含药物输送载体和基于脂质结构或聚合物颗粒的总重量的0.01-30wt％的生理活性成分。
根据本发明的一方面，包封在药物输送载体内的生理活性成分的含量可以为基于脂质结构或聚合物颗粒的总重量的0.01-30wt％。具体地，根据本发明的一方面，生理活性成分的含量可以为基于脂质结构或聚合物颗粒的总重量的0.01wt％或更大、0.05wt％或更大、0.1wt％或更大、0.5wt％或更大、1wt％或更大、2wt％或更大、3wt％或更大、4wt％或更大、5wt％或更大、6wt％或更大、10wt％或更大、15wt％或更大、20wt％或更大、25wt％或更大或30wt％或更大、或30wt％或更小、25wt％或更小、20wt％或更小、15wt％或更小、10wt％或更小、6wt％或更小、5wt％或更小、4wt％或更小、3wt％或更小、2wt％或更小、1wt％或更小、0.5wt％或更小、0.1wt％或更小、0.05wt％或更小或0.01wt％或更小。
根据本发明的一方面，组合物可以是选自皮肤外用剂型、口服给药剂型和注射剂的剂型。
本发明涉及利用在每个末端具有甘氨酸(Gly)的氨基酸残基和甘氨酸(Gly)-酪氨酸(Tyr)-赖氨酸(Lys)-半胱氨酸(Cys)的氨基酸残基作为具有优异膜透过性的新设计的GRR肽，对如脂质体、聚合物纳米颗粒、磷脂-聚合物复合物、乳液等的输送载体进行改性，从而当通过包括经皮、口服或注射途径的各种途径输送被输送物质时，增加被输送物质的生物利用度，其中输送载体具有包封水不溶性或水溶性大分子，如药物、基因、寡肽、蛋白质等的结构。AP-GRR肽具有Gly(Arg)n Gly Tyr Lys Cys序列，其中Arg的数目为1至20，具体为3至9。在这种情况下，可获得高的输送效率，且可容易地制备药物输送载体。
根据本发明的一方面，可根据Fmoc(N-(9-芴基)甲氧羰基)/叔丁基方法(M.Bodansky,A.Bodansky,The Practice of Peptide Synthesis；Springer:Berlin,Heidelberg,1984,J.M.Stewart,J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed；Pierce Chemical Co:Rockford.IL,1984)，利用酰胺4-甲苯氢胺(MBHA)树脂(amide 4-methylbenzhydrylamine hydrochloride(MBHA)resin)和ABI 433合成仪，例如通过固相肽合成(SPPS)合成AP-GRR肽或含有AP-GRR肽的肽链，但是并不限于此。
根据本发明的一方面，在药物输送载体中可以使用例如脂质体、乳液、聚合物颗粒等的结构。根据本发明的一方面，当制备脂质体或乳液时，可以使用具有C12-C24脂肪酸链的磷脂或硝基脂作为脂质结构的脂质成分。它用作可用于皮肤外用制剂、口服给药制剂、注射剂等的药物组合物的基本药物输送载体的一种成分是有用的。
具体地，根据本发明的一方面，脂质结构的脂质成分可以是磷脂。具体地，可以使用蛋黄卵磷脂(磷脂酰胆碱)、大豆卵磷脂、溶血卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、双磷脂酰甘油、心磷脂和缩醛磷脂；通过一般方法由所述天然磷脂获得的加氢产物；合成磷脂，例如双十六烷基磷酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、桐酰磷脂酰胆碱(eleostearoylphosphatidylcholine)、桐酰磷脂酰乙醇胺(eleostearoylphosphatidylethanolamine)和桐酰磷脂酰丝氨酸(eleostearoylphosphatidylserine)，及其水解产生的脂肪酸混合物。
根据本发明的一方面，可以单独或组合使用脂质。具体地，当组合使用两种或多种磷脂时，可以使用磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的组合、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油的组合、磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的组合、磷脂酰胆碱和磷脂酸的组合、磷脂酰胆碱和二油酰基磷脂酰乙醇胺的组合等。根据组合物的不同，所述成分的混合比例可以不同。具体地，包含的最多的成分与包含的最少的成分的混合比例为1:5或更小。在这种情况下，通过混合两种或多种磷脂容易地制备脂质基药物输送载体。例如，当使用磷脂酰胆碱和二油酰基磷脂酰乙醇胺的组合时，它们可以以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、1:5、1:4、1:3、1:2等各种摩尔比混合。同样，当使用三种磷脂时，例如，当使用磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸时，它们可以以1:1:1、2:1:1、3:1:2、3:2:1、3:2:2、4:1:1、4:2:1等各种摩尔比混合。
根据本发明的一方面，药物输送载体的脂质成分使用的含量为基于脂质体悬浮液或乳液的总重量的0.001-20wt％,具体为0.2-10wt％。在这种情况下，可容易地制备药物输送载体。
根据本发明的一方面的聚合物颗粒应该为生物相容性的，不会不会诱发炎症、免疫反应等，应该在体内降解。且其降解产物在体内同样应该无毒害。作为满足这些要求的聚合物，由美国食品和药物管理局(FDA)批准的、具有作为基本单元的聚合物乳酸和乙醇酸的可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物为使用最广泛的。代表例子包括化学式3的聚(D，L-乳酸)、聚(L-乳酸)或聚(D-乳酸)，化学式4的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)、聚(D-乳酸-共-乙醇酸)或聚(L-乳酸-共-乙醇酸)，聚(己内酯)，聚(戊内酯)，聚(羟基丁酸酯)，聚(羟基戊酸酯)，聚(1,4-二恶烷-2-酮)，聚(原酸酯)和它们的单体制成的共聚物。
根据本发明的一方面，没有具体限定可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物的分子量。但是，由于如果分子量小于500Da或大于100,000Da，药物输送载体的结构不稳定性可增加，因此，其可具有的重均分子量为500-100,000Da，具体为5,000-50,000Da。
根据本发明的一方面，可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物的分子量可以是1,000Da或更大、2,000Da或更大、3,000Da或更大、4,000Da或更大、5,000Da或更大、6,000Da或更大、7,000Da或更大、8,000Da或更大、9,000Da或更大、10,000Da或更大、11,000Da或更大、12,000Da或更大、13,000Da或更大、14,000Da或更大、15,000Da或更大、20,000Da或更大、30,000Da或更大、50,000Da或更大或100,000Da或更大、或200,000Da或更小、150,000Da或更小、100,000Da或更小、90,000Da或更小、80,000Da或更小、70,000Da或更小、60,000Da或更小、50,000Da或更小、40,000Da或更小、30,000Da或更小、20,000Da或更小、10,000Da或更小、5,000Da或更小、3,000Da或更小或1,000Da或更小，但并不限于此。
根据本发明的一方面，对于化学式4的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)，可通过控制乳酸和乙醇酸单体的比例或者通过更改聚合物合成过程而获得具有各种降解率的可生物降解的聚合物。这种可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物已经长期作为药物输送载体或具有证明的生物兼容性的手术缝合线。
根据本发明的一方面，AP-GRR肽(A)和可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物(B)可共价键合为A-B或A-B-A的形式，但是并不限于此。这可以通过用其他有利于共价键的官能团替换可生物降解的脂肪族聚酯类聚合物的每个末端的羧基和羟基，并使该末端官能团AP-GRR肽或含有该AP-GRR肽的肽链的末端基团反应来实现。例如，可通过共价键合马来酰亚胺取代的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)的末端官能团与硫醇取代的AP-GRR肽可合成聚合物，在该聚合物中AP-GRR肽或含有该AP-GRR肽的肽链共价键合至聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)。
根据本发明的一方面，可通过将碱、连接体或多配位化合物加入AP-GRR肽或含有AP-GRR肽的肽链与脂质结构或聚合物颗粒之间来形成所述共价键，但是并不限于此。
根据本发明的一方面，包封在药物输送载体内的生理活性成分可以是水溶性或水不溶性的，不受特别限制，只要可以在体内使用即可。例如，它可以是源自动物、植物或微生物中的提取物，且根据目的可以是单个成分或两种或多种成分的混合物。可以使用对改善皮肤美白、预防皱纹及老化、治疗疾病等有效的成分。可包含基于脂质结构或聚合物颗粒的总重量的含量为0.01-30wt％，具体为0.1-20wt％的生理活性成分。在这种情况下，可容易地将组合物制备成皮肤外用剂型、用于口服给药的剂型、注射剂等。
理想的是，使用本发明一方面的AP-GRR肽的药物输送载体具有尽可能小的平均粒径。当考虑到胶体的稳定性时，理想的是平均粒径为1,000nm或更小，具体为500nm或更小。
不具体限定用于制备根据本发明的一方面的药物输送载体的方法。例如，可以根据如下方法制备。
可以使用以下方法作为用于形成药物输送载体的方法，在药物输送载体中，利用本发明公开的脂质成分包封生理活性成分：将磷脂和稳定剂溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂，减压形成脂质膜，添加水溶液，然后施加超声波的方法；将磷脂和稳定剂分散溶解于水溶液的有机溶剂中，然后施加超声波的方法；将磷脂和稳定剂分散或溶解于有机溶剂中，然后利用过量的水提取或蒸发有机溶剂的方法；将磷脂和稳定剂分散或溶解于有机溶剂中，使用均化器或高压乳化器剧烈搅拌，然后蒸发溶剂的方法；将磷脂和稳定剂分散或溶解于有机溶剂中，然后用过量的水透析的方法；将磷脂和稳定剂分散或溶解于有机溶剂中，然后缓慢加入水的方法等，但是并不限于此。
在上述方法中，通过施加机械力或加热至20-100℃，具体为70℃或更低可溶解有机溶剂中的磷脂和稳定剂。
当生理活性成分是水溶性的时，该生理活性成分溶解于水或水溶液中，并在加入水溶液或水的步骤中被加入。当生理活性成分是水不溶性的时，该生理活性成分可溶解于有机溶剂，随后被加入存在脂质成分的有机溶剂相中。
当使用有机溶剂溶解磷脂和稳定剂或水不溶性生理活性成分时，可以使用选自以下的一种或多种溶剂：丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二恶烷、四氢呋喃、乙酸、乙酸乙酯、乙腈、甲基乙基酮、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、二乙醚、己烷、和石油醚，但并不限于此。
可以使用以下等方法作为用于形成本发明的聚合物颗粒的方法：将聚合物直接分散在水溶液中，然后施加超声波的方法；将聚合物分散或溶解于有机溶剂中，然后用过量的水提取或蒸发该有机溶剂的方法；将聚合物分散或溶解于有机溶剂中，用均化器或高压乳化器剧烈搅拌，然后蒸发该溶剂的方法；将聚合物分散或溶解于有机溶剂中，然后用过量的水透析的方法；将聚合物分散或溶解于有机溶剂中，然后缓慢加入水的方法；使用超临界流体的方法等(T.Niwa et al.,J.Pharm.Sci.(1994)83,5,727-732；C.S.Cho et al.,Biomaterials(1997)18,323-326；T.Govender et al.,J.Control.Rel.(1999)57,171-185；M.F.Zambaux et al.,J.Control.Rel.(1998)50,31-40)。
用于制备本发明的聚合物颗粒的有机溶剂包括丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二恶烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、甲基乙基酮、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、二乙醚、己烷或石油醚，但并不限于此。溶剂可以单独使用或组合使用。
本发明使用的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-Mal)可具有化学式5的结构。
Figure BDA0000822321120000201
下文中，通过实施例、对比实施例和测试实施例详细描述本发明。在本发明的范围内，可合适地更改下面实施例中描述的材料、试剂、操作等。因此，本发明的范围不限于所述实施例。
【实施例和对比实施例】药物输送载体的制备
根据Fmoc(N-(9-芴基)甲氧羰基)/叔丁基方法，利用酰胺4-甲苯氢胺(MBHA)树脂和ABI 433合成仪，例如通过固相肽合成(SPPS)合成含有AP-GRR肽的肽链，并通过反相高效液相色谱法纯化以得到90％或更高的纯度。利用质谱仪(Agilent 1100series)测量分子量来确定成功的合成。可以确定合成了具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的AP-GRR肽。按照以下制备脂质结构，其中AP-GRR肽被引入该脂质结构的表面。
将指定的脂质摩尔比的表1所示的脂质混合，并溶解于氯仿和甲醇的混合有机溶剂(95:5,v/v)中，通过蒸发该溶剂形成膜。例如，在实施例2中，在将摩尔比为1.5:1.1:2:0.4的二油基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺复合物混合并溶解于氯仿和甲醇的混合有机溶剂(95:5,v/v)中之后，通过蒸发该溶剂形成膜。
将溶解于PBS(Welgene)中的荧光染料罗丹明B(Sigma-Aldrich,CAS NO.81-88-9)或葡聚糖-RITC(数均分子量＝～10,000Da)加入至已去除有机溶剂的膜中之后，通过施加超声波制备脂质体脂质分散液。将溶解于PBS中的AP-GRR肽加入至制备的脂质体脂质分散液中之后，在室温下(～25℃)搅拌进行反应。通过该反应，由AP-GRR肽的硫醇基和脂质体表面伸出的马来酰亚胺官能团之间的键制备AP-GRR引入的脂质体。已知该键非常稳定。最终水溶液中脂质的浓度为0.2wt％。
利用表1中描述的脂质组合物和脂质摩尔比通过所述方法制备实施例和对比实施例。实施例1-5为AP-GRR引入的脂质体，但是实施例1中没有连接荧光染料。对比实施例1为无连接荧光染料无AP-GRR引入的脂质体，对比实施例2和4为荧光染料溶解于PBS中，对比实施例3和5为连接有荧光染料的无AP-GRR引入的脂质体。通过从DSPE-PEG-Mal中减去PEG和Mal的分子量，根据DSPE的分子量计算实施例1-5的脂质的摩尔比。在实施例6中，进一步将双亲性聚合物加入实施例5的组合物中，以研究引入双亲性聚合物的效果。实施例6中使用的聚(甲基丙烯酸羟乙酯-共-甲基丙烯酸十八酯)共聚物具有47,552(PDI＝2.20)的数均分子量。
通过向摩尔比为0.0995654:0.232315的甲基丙烯酸羟乙酯单体(由Sigma-Aldrich处购得)和甲基丙烯酸十八酯单体(由Sigma-Aldrich处购得)添加150g的乙醇，并通过添加0.003319mol的偶氮二异丁腈(AIBN,由Junsei处购得)作为自由基聚合引发剂，并在75℃下搅拌过夜进行聚合反应得到双亲性聚合物。在聚合反应之后，停止加热，使混合物冷却至室温。然后，在搅拌混合液同时缓慢加入基于乙醇溶液的5-10倍的乙醚之后，通过过滤去除溶剂，回收所得沉淀物。真空干燥所得沉淀物，得到40g的聚(甲基丙烯酸羟乙酯-共-甲基丙烯酸十八酯)共聚物粉末。
以相同的方式制备实施例6，除了当脂质溶解于有机溶剂时，添加双亲性聚合物。
表1
Figure BDA0000822321120000221
【具有o/w纳米乳液的混合物的制备】
为了比较在于o/w纳米乳液混合之后，引入或未引入双亲性聚合物的药物输送载体的皮肤的吸收及颗粒尺寸，通过将实施例5和实施例6的药物输送载体与o/w纳米乳液混合来制备作为测试样品的实施例7和8。
具体地，按照表2中描述的制备水相和油相。
表2
Figure BDA0000822321120000231
分别将上述组合物的水相和油相加热至70℃。然后，利用乳化均质机(T.K.Homomixer Mark II,Takushu Kika Kogyo Ltd.,日本)在7,000rpm进行3min的乳化(均匀混合)，同时将油相缓慢加入至水相中。利用高压乳化器(Microfluidics Corp.,USA)在1000bar对所得o/w乳液进一步处理3个循环，以获得平均颗粒尺寸约为150nm的纳米乳液。将制得的纳米乳液与实施例5和实施例6的每种纳米乳液以重量比为1:1搅拌混合。所得的实施例5和实施例6的药物输送载体与纳米乳液的混合组合物称为实施例7和实施例8。
【测试实施例1】药物输送载体的颗粒尺寸的分析及表面电势的测量
对于实施例1-8和对比实施例1、3和5的脂质体溶液，利用Malvern Zetasizer进行颗粒尺寸和表面电势的测量。结果展示于表3。
表3
平均颗粒尺寸(PDI) 表面电势(STD)
对比实施例1 81.34nm(0.255) -27.5mV(5.16)
实施例1 108.3nm(0.211) 34.8mV(6.34)
对比实施例3 117.7nm(0.292) -19.9mV(6.58)
实施例3 122.6nm(0.210) 14.7mV(9.7)
实施例2 113.2nm(0.210) 22.1mV(13.5)
对比实施例5 127.3nm(0.266) -22.2mV(3.84)
实施例5 115.5nm(0.376) 11.8mV(8.29)
实施例4 102.1nm(0.188) 20.6mV(9.75)
实施例6 200.6nm(0.284) 18.2mV(8.26)
实施例7 856nm(0.607) -
实施例8 192nm(0.301) -
从表3中可以看出，对比实施例和实施例的样品是均匀的，平均颗粒尺寸约为100nm。
还可以看出，与没有引入AP-GRR肽的脂质结构相比，引入AP-GRR肽的脂质结构的表面电势表现出从负值转正值的改变。此外，可以看出，引入8mol％的AP-GRR的实施例2和4比引入4mol％的AP-GRR的实施例3和5具有更大的正的表面电势。从这些结果可以确定，由于AP-GRR的引入，本发明的药物输送载体的物理性能发生改变。
从纳米乳液的颗粒尺寸分析可知，引入双亲性聚合物的实施例8比未引入双亲性聚合物的实施例7具有更小平均颗粒尺寸及更高的颗粒尺寸的稳定性。可以认为，对于实施例7，由于在含有细胞穿透肽的脂质体和纳米乳液之间产生新的重组，从而增加了颗粒尺寸和PDI值。这似乎是由于乳液的结构不稳定性而导致，这是脂质体剂型的缺点之一。但是，对于实施例8，颗粒尺寸与由脂质结构制备的实施例6的颗粒尺寸相似，且没有观察到大颗粒尺寸的新颗粒。可以认为，双亲性聚合物通过粘合脂质体的脂质双分子层起到保护胶体的作用。
【测试实施例2】通过TEM进行的药物输送载体的结构分析
利用透射电子显微镜(Libra 120,Carl Zeiss,accelerating voltage＝120kV)对对比实施例1和实施例1进行结构分析。结果展示于图1。
从图1中可知，与未引入AP-GRR的对比实施例1相比，将AP-GRR引入脂质体的实施例1的药物输送载体的脂质结构变得稍大。同样地，可以看出，虽然引入了AP-GRR，实施例1表现出与对比实施例1相似的脂质体结构。结果，可以确认本发明的具有能够输送大分子的结构的药物输送载体结构上与一般脂质体相似。虽然结构上与一般脂质体相似，但是本发明的药物输送载体能够容易地将水溶性大分子输送至细胞，如以下测试实施例证明的。
【测试实施例3】通过流式细胞仪评估药物输送载体的输送至细胞的能力
对实施例2-5和对比实施例2-5进行FACS分析，以评估药物输送载体的输送至细胞的能力。将实施例和对比实施例的脂质体系统添加至此前已被培养的HaCaT细胞(从细胞系服务(CLS)获得)。在37℃下孵化4h之后，从每个样品组回收细胞，并将其分散于PBS之后进行FACS分析。利用BD FACSCalibur仪器(Beckton Dickinson Bioscience,San Jose,CA)测量来自每组10,000HaCaT细胞的红色荧光染料，利用CellQuest软件分析所得数据。从而，比较并定量分析输送至细胞的罗丹明B的量。结果展示于图2。在图2中，(A)展示了实施例2和3以及对比实施例2和3的罗丹明B的FACS分析结果，(B)展示了实施例4和5以及对比实施例4和5的葡聚糖-RITC的结果，(C)展示了从图中获得平均值和标准偏差的数值数据。在图中，y轴表示细胞数目，x轴表示输送至细胞的含量。
从图2的(A)和(C)(其中图像从右至左对应实施例3、实施例2、对比实施例3和对比实施例2)可以看出，与未引入AP-GRR的对比实施例相比，引入AP-GRR的实施例表现出更大的输送至细胞的含量。因此，可以确定脂质体表现出比PBS更好的输送至细胞的能力，且将AP-GRR引入脂质体的本发明的药物输送载体比简单脂质体具有更好的输送能力。为此，可以确定根据本发明的药物输送载体可以很好地将小的水溶性材料，如罗丹明B输送至细胞。此外，当比较引入不同含量的AP-GRR的实施例2和3时，可以看出引入含量为基于构成脂质体的脂质的8mol％的实施例2比引入含量为4mol％的实施例3表现出更小的平均值。因此，尽管差异并不明显，4mol％的AP-GRR引入含量为合适的。
从图2的(B)和(C)(其中图像从右至左对应实施例5、实施例4、对比实施例5和对比实施例4)可以看出，与未引入AP-GRR的对比实施例相比，引入AP-GRR的实施例表现出更大的输送至细胞的含量。因此，可以确定脂质体表现出比PBS更好的输送至细胞的能力，且将AP-GRR引入脂质体的本发明的药物输送载体比简单的脂质体具有更好的输送能力。实施例4和5表现出与用于罗丹明B的实施例2和3的结果相似的结果，虽然包封的葡聚糖-RITC是一种分子量约为罗丹明B的20倍的聚合物。因此，可以确定本发明的药物输送载体对于将水溶性大分子输送至细胞表现出同样优越的能力。此外，当比较引入不同含量的AP-GRR的实施例4和5时，可以看出与罗丹明B的实验相似，引入含量为4mol％的实施例5表现出更大的平均值。
【测试实施例4】通过免疫荧光染色和激光共聚焦扫描显微镜评估向细胞的输送
将添加有10wt％FBS(GIBCO)和100IU青霉素G(Lonza)的DMEM(Lonza)中的GHaCaT细胞(由细胞系服务(CLS)获得)播种至8孔小室载玻片，密度为25,000细胞/孔。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗孔之后，用不含有任何物质的对比介质以及稀释在介质中的实施例或对比实施例处理细胞3h。使处理的细胞经受免疫荧光(IF)染色。在用添加有1mM CaCl2和1mMMgCl2的PBS(在该测试实施例中使用相同的PBS)冲洗每个壁之后，通过在室温下与3.5wt％的多聚甲醛反应10min来固定细胞。用PBS再次冲洗该固定的细胞三次，进行10min。然后，用0.1％Triton X-100处理细胞5min。用PBS再次冲洗细胞三次，进行10min，用碘化丙啶(PI)处理细胞约3min，以染色细胞核。用PBST(通过将PBS与0.05wt％吐温20混合来制备；吐温20由Sigma处购得；用于制备PBST的PBS不含有氯化钙或氯化镁)再次冲洗三次之后，加入封固溶液，并将盖玻片放置在载玻片上。利用共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss)对染色的载玻片照相。结果展示于图3和4中。图3展示了含有小的水溶性分子罗丹明B作为荧光染料的脂质体的结果，图4展示了含有水溶性大分子葡聚糖-RITC作为荧光染料的脂质体的结果。在图像中，红色区域表示罗丹明B或葡聚糖-RITC，蓝色区域表示细胞核。
从图3中可以看出，对比实施例3的简单脂质体表现出比对比实施例2的PBS更好的向细胞的输送性，且引入AP-GRR的本发明的药物输送载体明显表现出比简单脂质体更好的向细胞的输送性。
从图4中可以看出，对于分子量约为罗丹明B的20倍或更大倍数的葡聚糖-RITC具有与罗丹明B相似的结果。从对比实施例4和5的图像可以看出，葡聚糖-RITC难以被输送至细胞内。相比而言，实施例4和5的图像表明大量的红色显示的荧光染料被输送至细胞内。因此，可以确定本发明的药物输送载体对于将水溶性大分子输送至细胞内表现出显著的效果。
【测试实施例5】真皮稳定性的评估
为了研究实施例1-5和对比实施例1-5的真皮稳定性，对18名女性和12名男性成人受试者(平均32.5岁)进行贴附含有实施例或对比实施例的脂质体的斑贴的斑贴试验。在贴附该斑贴28h之后，移除斑贴之后，进行第一次评估30min，96h之后进行第二次评估。用肉眼评估皮肤刺激，根据正向皮肤反应进行权衡。结果如表4所示。
表4
测试物质 平均反应 评估结果
实施例1-5 0 无刺激
对比实施例1-5 0 无刺激
从表4中可以产出，当包含于组合物中时，所有的实施例和对比实施例都不会刺激皮肤。因此，可以确定的是，包含本发明的脂质体的化妆品组合物具有优越的真皮稳定性。
【测试实施例6】通过透皮吸收实验评估药物输送载体的定量效果
对对比实施例2-5，实施例3，实施例5，实施例7和实施例8进行透皮吸收实验。对于透皮吸收实验，使用由屠宰场获得的猪耳皮肤。冲洗该皮肤之后，利用弗兰兹型垂直扩散池系统(Microette Plus Auto Sampling System,Hanson Research,USA)，对含有荧光染料的对比实施例和实施例分别进行4h和18h的透皮吸收实验。
然后将猪耳皮肤放入模具内，并嵌入OCT化合物(#4583,SAKURA Tissue-Tek,USA)。然后用液氮将该组织迅速冷冻至-196℃。利用低温恒温器(CM1950,Leica,Germany)将冷冻的猪耳皮肤分割成厚度为6μm，并附着在硅烷涂敷的载玻片上。在阴凉处室温下将该载玻片干燥10min，然后利用光学显微镜(BX53,Olympus,Japan)观察。所述观察在相同的荧光强度和曝光时间下进行。图5和6展示了冷却数码彩色照相机(DP72,Olympus,Japan)采集的示例性的图像。在图5和6中，白色比例尺对应500μm。在图5中，曝光时间设定为256ms。在图6中，曝光时间设定为64ms。汞灯(U-HGLGPS,Olympus,Japan)用作荧光光源，荧光强度从可选值(0,3,6,12,25,50和100)中设定为6。
从图5可以看出，对于具有相对小的分子量的罗丹明B，当它溶解于PBS中时，超过一定量的被透皮吸收，且吸收18h(对比实施例2)，以及当使用一般脂质体时吸收4h(对比实施例3)。这表明脂质体通过打乱角质层脂质而提高了水溶性成分的吸收。但是，具有大分子量的葡聚糖-RITC难以透皮吸收(对比实施例4和5)。
从图6可以看出，与当罗丹明B溶解于PBS中相比，当罗丹明B溶解于根据本发明的一方面的药物输送载体中时，其可在4h内被显著吸收。进一步地，可以看出与当使用对比实施例3的一般脂质体时(图5)相比，包封在实施例3的药物输送载体内的罗丹明B表现出更广泛的荧光。认为除了脂质体的角质层脂质打乱作用之外，增加的透皮吸收性是由于细胞穿透肽的聚精氨酸基团的阳离子电荷的作用。
此外，对于对比实施例4和5的难以被透皮吸收的葡聚糖-RITC，当使用本发明的一方面的药物载体时(实施例5)，观察到了透皮吸收。因此，可以看出根据本发明的一方面的药物输送载体表现出透皮输送具有约10,000Da的大分子量的聚合物材料的独特且显著的效果。
【测试实施例7】通过透皮吸收实验评估药物输送载体的定量效果
从猪耳皮肤按照以下方法制备角质层样品、不含角质层的皮肤组织样品、和受体样品，其中猪耳皮肤利用测试实施例6中的Franz池分别吸收对比实施例和实施例4h。通过在6-mm活组织检查之后，用3M贴片(tape)剥离皮肤组织3次，然后用6mL的水和甲醇的混合溶剂(1:1)提取该贴片来制备角质层样品。在剥离贴片之后，通过用2mL水和甲醇的混合溶剂(1:1)提取剩余的组织样品得到不含角质层的皮肤组织样品。在吸收1mL的PBS之后，通过添加受体部分获得受体样品。
利用分光光度计(F4500,Hitachi)分析制备的样品。分析条件如下。
分析条件：
-ex slit(激发狭缝):2.5/emi slit(发射狭缝):2.5；
-exi(光激发的波长):554nm/emi(光发射的波长):579nm。
在用波长544nm的光激发之后，检测到从荧光染料发射的荧光强度为579nm。定量结果展示在图7和8以及表5中。从受体部分未检测到荧光反射。
表5
Figure BDA0000822321120000301
从图7和8以及表5中可以看出，对于罗丹明B(对比实施例2、对比实施例3和实施例3)，角质层和不含角质层的皮肤组织吸收的罗丹明B的浓度顺序为对比实施例2<对比实施例3<实施例3。因此，可以确定的是脂质体结构提高了具有小分子量的材料的透皮吸收。
对于葡聚糖-RITC(对比实施例4、对比实施例5和实施例5)观察到不同的行为。在角质层中，对于对比实施例4或使用一般脂质体的对比实施例5，难以吸收荧光染料。相比而言，根据本发明的一方面的药物输送载体(实施例5)产生比对比实施例4和5显著高的吸收。对于实施例5，与对比实施例4和5不同，在不含角质层的皮肤组织中观察到荧光染料的显著吸收。因此，可以确定的是，根据本发明一方面的药物输送载体表现出在角质层和皮肤组织中对具有大分子量的材料提高的吸收效果。与现有脂质体相比，这种效果是显著且独特的。
此外，从实施例7和实施例8的结果可以看出，当与纳米乳液型制剂混合时，根据本发明一方面的药物输送载体提供与不含有双亲性聚合物的物质相比，显著更高的透皮吸收性。具体地，当包含双亲性聚合物(实施例6)的药物输送载体或不含有双亲性聚合物的药物输送载体(实施例5)与纳米乳液混合时，当包含双亲性聚合物时(实施例8)，大分子生理活性成分葡聚糖-RITC的透皮吸收性为实施例7的7倍或更大。认为该提高的透皮吸收性是由于脂质体的增强的结构稳定性。从实验结果可以确定，引入双亲性聚合物的药物输送载体增强了结构稳定性，且当包含化妆品中常用的乳液型制剂时，能够将大分子生理活性成分很好地输送至皮肤内。
Figure IDA0001546953970000011

Claims (17)

1.一种药物输送载体，该药物输送载体包含共价键合至细胞穿透肽或含有细胞穿透肽的肽链的脂质结构，其中
生理活性成分被包封在所述脂质结构内，
所述生理活性成分为数均分子量或重均分子量为500 Da至5,000,000Da的水溶性或水不溶性大分子，且
所述细胞穿透肽为具有SEQ ID NO 1(Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg ArgGly Tyr Lys Cys)序列的肽，
其中，所述脂质结构包含双亲性聚合物，
其中，所述双亲性聚合物包括聚（甲基丙烯酸羟乙酯-共-甲基丙烯酸十八酯）共聚物，
其中，所述脂质结构包括摩尔比为1.0-2.0 : 1.0-2.0 : 1.0-3.0 : 0.01-1.0的二油基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺（DSPE-PEG-Mal）复合物，
其中，所述药物输送载体包括占所述脂质结构的4mole%至8mole%的所述细胞穿透肽，
其中，所述药物输送载体包含占所述脂质结构和所述双亲性聚合物的总重量的10-30wt%的所述双亲性聚合物和70-90wt%的所述脂质结构。
2.根据权利要求1所述药物输送载体，其特征在于，所述水溶性或水不溶性大分子具有的数据分子量或重均分子量为5,000 Da至5,000,000Da。
3.根据权利要求2所述的药物输送载体，其特征在于，所述水溶性或水不溶性大分子具有的数据分子量或重均分子量为8,000 Da至5,000,000Da。
4.根据权利要求1所述的药物输送载体，其特征在于，所述细胞穿透肽或包含细胞穿透肽的所述肽链共价键合至所述双亲性聚合物。
5.根据权利要求1所述的药物输送载体，其特征在于，所述双亲性聚合物进一步包括选自具有连接至透明质酸侧链的烷基化透明质酸和化学式1的聚（甲基丙烯酸-共-正烷基甲基丙烯酸酯）无规共聚物的一种或多种物质：
化学式1
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中
7≤ n ≤ 22，且
x : y的摩尔比为90 : 10至50 : 50。
6.根据权利要求1所述的药物输送载体，其特征在于，所述双亲性聚合物具有的数均分子量为5,000-200,000 Da。
7.根据权利要求1所述的药物输送载体，其特征在于，所述脂质结构为脂质体悬浮液或乳液。
8.根据权利要求7所述的药物输送载体，其特征在于，所述脂质结构占所述脂质体悬浮液或乳液的总重量的0.001-20 wt%。
9.根据权利要求1所述的药物输送载体，其特征在于，通过将碱、连接体或多配位化合物加入所述肽或含有所述肽的肽链与所述脂质结构之间来形成所述共价键。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物输送载体，其特征在于，所述药物输送载体具有1,000 nm或更小的平均粒径。
11.一种包含权利要求1至9中任一项所述的药物输送载体以及包封在所述载体内的生理活性成分的组合物。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述生理活性成分为选自以下的一种或多种物质：合成的水溶性大分子物质和从天然产物中提取的大分子物质。
13.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述生理活性成分为选自以下的一种或多种物质：酶、EGF、蛋白质、肽和多糖。
14.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，包封在所述药物输送载体内的所述生理活性成分占所述脂质结构的总重量的0.01-30 wt%。
15.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物为药物组合物，其剂型选自：皮肤外用剂型、口服给药剂型和注射剂型。
16.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物为化妆品组合物，其剂型选自以下的一种或多种剂型：皮肤乳液、皮肤柔软剂、爽肤水、收敛剂、营养霜、粉底、精华、粉饼、肥皂、洁面泡沫、洁面乳液、洁面霜和身体清洁剂。
17.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，当所述药物输送载体包含脂质结构时，所述生理活性成分为水溶性大分子。
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