MX2009000976A - Composicion y metodo para el tratamiento de tumores. - Google Patents

Composicion y metodo para el tratamiento de tumores.

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Abstract

La presente invención se refiere a una composición que es útil en el tratamiento de un tumor, un método para fabricar dicha composición, y un método para utilizar dicha composición. La invención se refiere también a un método de ensayo para detectar inhibidores de la actividad de la proteína Núcleo 1 y/u otras proteínas del complejo respiratorio III de mitocondrias.

Description

COMPOSICIÓN Y MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES Campo de la Invención Un tumor es un crecimiento anormal de tejido que puede ser maligno o benigno. Un tumor benigno sólo crece en un ámbito local, mientras que un tumor maligno se propaga a otros tejidos. El cáncer es una enfermedad genética. La capacidad para resistir la apoptosis es una característica de las células cancerosas. Se sabe que muchas lesiones genéticas confieren resistencia a la muerte celular programada (apoptosis) en células cancerosas. Durante la apoptosis, unas enzimas denominadas caspasas llevan a cabo el proceso de degradar la célula. Las caspasas iniciadoras rompen las proformas inactivas de las caspasas efectoras, activándolas. Las caspasas efectoras activadas entonces empiezan a romper proteínas dentro de la célula. En el tejido normal, la velocidad de apoptosis se encuentra en equilibrio con la velodidad de crecimiento celular en el tejido, regulando, con ello, el crecimiento del tejido. Si se altera el proceso apoptótico de una célula, la célula puede continuar dividiéndose, conduciendo a un crecimiento incontrolado del tejido. El ligando inductor de la apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL, "Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis Inducing Ligand") es un prometedor reactivo terapéutico para el tratamiento de tumores. El TRAIL es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF), que incluye los potentes inductores apoptóticos TNF and ligando Fas (FasL). El TRAIL tiene un interés particular, no sólo porque induce una apoptosis rápida en una amplia variedad de líneas celulares cancerosas y tumores humanos, sino porque también muestra poca toxicidad frente a las células y tejidos normales. El TRAIL se expresa normalmente en muchos tejidos dentro del cuerpo, pero también se puede administrar de modo exógeno durante el tratamiento de un tumor. La inyección de una forma activa soluble de TRAIL en ratones que portan tumores sólidos indujo la apoptosis, suprimió el avance del tumor y mejoró la supervivencia. También existen pruebas de que un tratamiento combinado que emplea TRAIL y diversos fármacos quimioterapéuticos puede aumentar aún más la regresión de tumores. El TRAIL se une a los receptores de muerte DR4 y DR5 en tumores y líneas celulares cancerosas, e induce, de forma rápida y específica, la apoptosis. La unión de TRAIL a un receptor de muerte induce la vía apoptótica extrínseca o intrínseca, o ambas, dependiendo del tipo celular. En ambas vías, la unión del TRAIL a su receptor crea el sitio de unión para una proteina adaptadora FADD ("Fas Associated protein with Death Domain", proteína asociada a Fas con dominio de muerte), que recluta y activa la caspasa iniciadora 8. En algunas células, la caspasa 8 activa la vía apoptótica extrínseca, conduciendo directamente a la activación de las caspasas efectoras 3, 6 y 7, lo cual es suficiente para inducir la apoptosis. El TRAIL también puede inducir la apoptosis a través de la vía intrínseca, en la que la activación de la caspasa 8 inicia la apoptosis que implica a las mitocondrias y a la formación del apoptosoma. La caspasa 8 rompe la proteína que contiene el dominio BH3 inhibidora de Bcl-2 (Bid), provocando que la Bid truncada se traslade desde el citoplasma hacia la membrana externa de las mitocondrias e induce la oligomerización de Bax y Bak. Los poros formados por Bax (proteína X asociada a Bcl-2) y Bak (antagonista de Bcl-2/asesina 1 ) provocan la pérdida de la polarización de la membrana mitocondrial y la liberación del citocromo c, provocando el fallo metabólico de las mitocondrias de la célula. El citocromo c en el citoplasma entonces interacciona con la caspasa 9 para activar las caspasas efectoras corriente abajo 3, 6 y 7. Sin embargo, el tratamiento con miembros de la superfamilia del TNF tiene algunas limitaciones, porque diversas células tumoraíes son resistentes a la apoptosis inducida por miembros de la superfamilia del TNF, incluyendo TRAIL. La presente invención soluciona dichas limitaciones. Adelantos indicados Se sabe que ciertas moléculas presentes en el cuerpo puede actuar de manera que suprimen la actividad de los miembros de la supefamilia del TNF (estos compuestos se denominan en la presente "supresores de TNF"). Por ejemplo se ha informado de que la proteína inhibidora de FLICE celular (c-FLIP), el inhibidor 1 de Bax 1 , y Bcl-XL suprimen la actividad apoptótica de TRAIL (Burns, T. F. y W.S. El-Deiry, J. Biol. Chem., 276: 37879- 37886 (2001 )). También se ha informado de que los genes AKT y MIRSA también suprimen la actividad apoptótica de TRAIL (véase, por ejemplo, Aza-Blanc et al., Molecular Cell, 12: 627-637 (2003)). También se sabe que las moléculas biológicas que inhiben la actividad de un supresor de TNF actúan para sensibilizar a una célula de manera que mejore la actividad apoptótica de TRAIL. Por ejemplo, se ha demostrado que la administración de ARNsi para que se dirija a los genes AKT y MIRSA en una célula sensibiliza a la célula frente a la actividad apoptótica de TRAIL (véase, por ejemplo, Aza-Blanc et al., Molecular Cell, 12: 627-637 (2003)). La presente invención se refiere a la provisión de medios que actúan también para mejorar la actividad apoptótica de TRAIL. Sumario de la invención La presente invención se refiere a una composición que comprende: (A) un inhibidor que inhibe la actividad de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 ; y (B) un vehículo. Además, la invención se refiere a un método para fabricar una composición, que comprende un inhibidor que inhibe la actividad de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , y un vehículo, que comprende mezclar dicho inhibidor con dicho vehículo. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para fabricar una composición que comprende un inhibidor que inhibe la actividad de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , un vehículo, y un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral, que comprende mezclar dicho inhibidor, dicho vehículo, y dicho miembro. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para realizar un ensayo para determinar sí un compuesto es un inhibidor de la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , que comprende comparar la viabilidad de células que expresan la proteína del Complejo III que se han cultivado en presencia de un miembro de la superfamilia del TNF y que se han puesto en contacto con dicho compuesto, con la viabilidad de células de la misma línea celular que también expresan dicha proteína del Complejo III, que se han cultivado en ausencia de un miembro de la superfamilia del TNF y que se han puesto en contacto con dicho compuesto. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para realizar un ensayo para determinar si un compuesto es un inhibidor de la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , que comprende: poner en contacto el compuesto con células que expresan dicha proteína y que se han cultivado en presencia de un miembro de la superfamilia del TNF durante un periodo de tiempo predeterminado; poner en contacto el compuesto con células de la misma línea celular que las anteriores que expresan la proteína y que se han cultivado en ausencia de un miembro de la superfamilia del TNF durante el mismo periodo de tiempo predeterminado; y comparar la viabilidad de las células. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para realizar un ensayo para determinar si un compuesto es un inhibidor de la actividad de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , que comprende: cultivar células que expresan la proteína procedentes de una línea celular en presencia de un miembro de la superfamilia del TNF; cultivar células que expresan la proteína procedentes de la misma línea celular en ausencia de un miembro de la superfamilia del TNF; y poner en contacto el compuesto con las células; y, después de un periodo de tiempo predeterminado, comparar la viabilidad de las células. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para realizar un ensayo para determinar si un compuesto es un inhibidor de la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , que comprende comparar la viabilidad de células que expresan dicha proteína y que se han puesto en contacto con un miembro de la superfamilia del TNF y el compuesto, con la viabilidad de células de la misma línea celular que expresan la proteína y que se han puesto en contacto con el compuesto pero no con un miembro de la superfamilia del TNF. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para realizar un ensayo para determinar si un compuesto es un inhibidor de la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , que comprende: poner en contacto células que expresan la proteína procedentes de una línea celular, con un miembro de la superfamilia del TNF y dicho compuesto; poner en contacto células que expresan la proteína procedentes de la misma línea celular, con el compuesto pero no con un miembro de la superfamilia del TNF; y comparar la viabilidad de las células. Descripción de los Dibujos La figura 1 A es un diagrama de flujo que describe un método para seleccionar un banco de ADNc para descubrir genes que confieran resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL. El diagrama esquemático muestra la selección genética de un banco de ADNc de ratón E14 para detectar resistencia a la apopotosis inducida por TRAIL. Los ADNc procedentes de células resistentes a TRAIL se aislaron, se secuenciaron y se validaron.
La figura 1 B muestra una secuencia de aminoácidos parcial de ADNc de UQCRC1 de ratón (Núcleo 1 ), comparada con ADNc de UQCRC1 humana de longitud completa. Ambos contienen una secuencia de localización mitocondrial (MLS). La figura 1 C es un diagrama que muestra el nivel de sobreexpresión de Núcleo 1 en diversos tejidos tumorales (datos procedentes de la base de datos Ascenta). La figura 2A es un gráfico de barras que muestra la viabilidad (según se mide mediante el porcentaje de células que son negativas para anexina V) de células HCT1 16 que expresan FADD dominante negativo (dnFADD), proteina fluorescente verde (GFP), o Núcleo 1 parcial, que se han sometido a un tratamiento con TRAIL a 10 ng/ml o 50 ng/ml, o a ningún tratamiento con TRAIL (0 ng/ml). La figura 2B es un gráfico de barras que muestra la viabilidad (según se mide mediante el porcentaje de mitocondrías polarizadas en las células) de células HCT116 que expresan FADD dominante negativo (dnFADD), proteína fluorescente verde (GFP), o Núcleo 1 parcial, que se han sometido a un tratamiento con TRAIL a 10 ng/ml o 50 ng/ml, o a ningún tratamiento con TRAIL (0 ng/ml). La figura 2C es un análisis de transferencia Western, realizado en fracciones citoplásmicas y mitocondriales preparadas a partir de líneas celulares estables que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) o Núcleo 1 humana de longitud completa (FL), utilizando anticuerpos para Núcleo 1 , COX 1 (un marcador mitocondrial), y SOD1 (un marcador citoplásmico). La figura 2D es un gráfico de barras que muestra la viabilidad (según se mide mediante el porcentaje de células que son negativas para anexina V) de células HCT116 que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP), o Núcleo 1 humana de longitud completa, que se han sometido a un tratamiento con TRAIL a 10 ng/ml o 50 ng/ml, o a ningún tratamiento con TRAIL (0 ng/ml). La figura 3A es un análisis de la transferencia Western, realizado en fracciones preparadas a partir de líneas de células HCT1 16 estables que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) o Núcleo 1 humana de longitud completa (FL) que se han tratado con 200 ng/ml de TRAIL durante 24 horas, o no se han tratado con TRAIL, utilizando anticuerpos contra caspasa 8, caspasa 9, caspasa 3, y tubulina (las transferencias se separaron y se volvieron a sondar con anticuerpos contra tubulina como control de carga).
La figura 3B es un gráfico de barras que muestra la cantidad de citocromo c presente en células que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) o Núcleo 1 , que se han tratado con 100 ng/ml de TRAIL, o no se han tratado con TRAIL (0 ng/ml). La cantidad de citocromo c en los lisados se cuantificó mediante ELISA. La figura 3C es un gráfico de barras que muestra la viabilidad de células que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) o Núcleo 1 que no se han sometido a tratamiento, o que han sido tratadas con TRAIL a 100 ng/ml o FasL a 16 ng/ml. La viabilidad de las células se ensayó utilizando azul de valoración celular. La figura 3D es un gráfico de barras que muestra la viabilidad de células que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) o Núcleo 1 humana de longitud completa que no se han sometido a tratamiento, o que han sido tratadas con camptotecina 200 nM, taxótero 10 nM o DMSO. La viabilidad de las células se ensayó utilizando azul de valoración celular. La figura 4A es un análisis de la transferencia Western, realizado en fracciones preparadas a partir de de células HCT1 16 de tipo salvaje que se han incubado sólo con lipofectamina (células control), ARNsi Nuil 3,75 nM, o ARNsi de Núcleo 1 durante 72 horas, utilizando anticuerpos contra Núcleo 1 y tubulina (las transferencias se separaron y se volvieron a sondar con anticuerpos contra tubulina como control de carga). La figura 4B es un gráfico de barras que muestra el nivel de expresión de Núcleo 1 en cada una de las células descritas para la figura 4A anterior. La figura 4C es un gráfico que muestra la viabilidad de células, previamente tratadas sólo con lipofectamina, ARNsi Nuil, o ARNsi de Núcleo 1 , después de un tratamiento con concentraciones crecientes de TRAIL. La figura 5A muestra la secuencia de ácido nucleico del ADNc de UQCRC1 humana (SEQ ID NO: 1 ). La figura 5B muestra la secuencia de ácido nucleico de Núcleo 1 humana (SEQ ID NO: 2). Descripción detallada de la invención La presente invención implica el uso de un inhibidor que inhibe la actividad supresora del TNF de una proteína que es un miembro del complejo respiratorio mitocondrial III. Por conveniencia, esta proteína se denomina en la presente proteína del "Complejo III". La invención es aplicable a la proteína en una forma que esté asociada con el Complejo III, así como a la proteína cuando está en una forma que no está asociada con el Complejo III, por ejemplo, en una forma aislada. En una realización de la invención, la proteína del Complejo III es Núcleo 1 . La composición de la presente invención comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de un inhibidor que inhibe la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 . Casi cualquier compuesto que es capaz de inhibir la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , puede utilizarse en la práctica de la presente invención. Los ejemplos de compuestos que pueden emplearse en la práctica de la presente invención incluyen: un ácido nucleico antisentido que inhibe la expresión del gen que codifica una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 ; un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico antisentído que inhibe la expresión del gen de una proteína Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 ; un ARNsí que inhibe la expresión del gen que codifica una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 ; un ácido nucleico que codifica dicho ARNsi; un anticuerpo que es capaz de unirse y disminuir la actividad de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 ; un ácido nucleico que codifica un anticuerpo que es capaz de unirse y disminuir la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 ; una hbozima que es capaz de disminuir la expresión de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 ; un ácido nucleico que codifica una bozima que es capaz de disminuir la expresión de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 ; y un compuesto de molécula pequeña que es capaz de disminuir la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1. El inhibidor está presente en la composición en una concentración eficaz para inhibir la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 . Los expertos en la técnica pueden determinar esto considerando que las concentraciones eficaces varían dependiendo del inhibidor concreto utilizado, y de las cantidades y naturaleza de los otros componentes de la composición. Con el fin de ofrecer una guía, se cree que la mayoría de las aplicaciones implican el uso del inhibidor en una cantidad de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 15 % en peso de la composición. En algunas realizaciones, el inhibidor está presente en una cantidad de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 10 % en peso de la composición, o de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 5 % en peso de la composición.
En realizaciones en las que se utiliza un ácido nucleico antisentido como inhibidor, el ácido nucleico antisentido se híbrida con al menos parte del ácido desoxirribonucleíco (ADN) que codifica una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , para inhibir, con ello, la expresión de la proteína. El ácido nucleico antisentido también puede disminuir la expresión del gen que codifica una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , inhibiendo la ruptura de su transcripto primario. El ácido nucleico antisentido puede comprender ADN o ácido ribonucleico (ARN), o ambos. Cualquier longitud de secuencia antisentido es adecuada para la práctica de la invención, con la condición de que sea capaz de inhibir la expresión de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1. Preferiblemente, la secuencia antisentido tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico antisentido es un oligonucleótido. Los ácidos nucleicos antisentido pueden prepararse de modo sintético, por ejemplo, mediante la expresión de todo o parte de un ácido nucleico que codifica una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , en la orientación opuesta, como se describe en la patente europea n° 140308. La secuencia del ácido nucleico que codifica Núcleo 1 aparece en la figura 5A. La preparación y uso de ácidos nucleicos antisentido sintéticos se describe, en general, en la publicación de solicitud internacional n° WO 92/15680. El ácido nucleico antisentido puede modificarse químicamente, por ejemplo, para mejorar la estabilidad y/o selectividad. Por ejemplo, una de estas modificaciones implica el uso de un grupo azufre para sustituir el oxígeno libre del enlace fosfodiéster, creando, con ello, un enlace fosforotioato. Los ácidos nucleicos antisentido de fosforotioato son solubles en agua, polianiónicos y resistentes a nucleasas endógenas. Además, pueden sintetizarse ácidos nucleicos antisentido con enlaces fosforoamidita y poliamida (peptídicos). Estos ácidos nucleicos son, de forma típica, muy resistentes a la degradación por nucleasas. Ademas, pueden añadirse grupos químicos en el carbono 2' del resto azúcar, y el carbono 5 (C-5) de las pihmidinas para aumentar la estabilidad del ácido nucleico antisentido y facilitar la unión del ácido nucleico antisentido a su sitio diana. Las modificaciones pueden incluir 2'-desoxi, O-pentoxi, O-propoxi, O-metoxi, fluoro, metoxietioxifosforotioatos, bases modificadas, así como otras modificaciones conocidas por los expertos en la técnica.
El ácido nucleico antisentido está presente en la composición en una concentración eficaz para inhibir la expresión del ácido nucleico que codifica una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1. En las realizaciones en las que se utiliza un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico antisentido como inhibidor, el ácido nucleico codifica un ácido nucleico antisentido del tipo descrito anteriormente. El ácido nucleico está presente en la composición en una concentración eficaz para expresar una cantidad de ácido nucleico antisentido eficaz para inhibir la expresión de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 . En las realizaciones en las que se utiliza un ARNsi (ARN de interferencia pequeño, "small interfering RNA") como inhibidor, el ARNsi se híbrida con una porción del ARNm que codifica una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , y es capaz de ser incorporado en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) que identifica e inhibe la expresión del ARNm. El ARNsi está presente en la composición en una concentración eficaz para inhibir la expresión del ácido nucleico que codifica la proteina. En otra realización de la presente invención, puede utilizarse un ácido nucleico que codifica el anterior ARNsi como inhibidor. En las realizaciones en Is que se utiliza un anticuerpo como inhibidor, el anticuerpo se une a Núcleo 1 e inhibe su actividad supresora del TNF. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal, quimérico, un fragmento Fab, un fragmento Fv, o un producto de un banco de expresión de Fab o Fv. Pueden prepararse anticuerpos policlonales contra un fragmento antigéníco de la proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , o la proteína intacta. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales, por ejemplo, utilizando el método de Mishell, B. B., et al., Selected Methods in Cellular Immunology, (W.H. Freeman, ed.), San Francisco (1980). Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden "humanizarse" para evitar que el hospedante produzca una respuesta inmunológica contra los anticuerpos. Un "anticuerpo humanizado" es aquel en el que las regiones determinantes de la complementahedad (CDR) y/u otras porciones del marco del dominio variable ligero y/o pesado se derivan de una inmunoglobulina no humana, y el resto de las porciones de la molécula se derivan de una o más inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos humanizados también incluyen anticuerpos que se caracterizan por una cadena pesada humanizada asociada con una cadena ligera no modificada del donante o aceptor o una cadena ligera quimérica, o viceversa. La humanización de anticuerpos puede realizarse mediante métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, G.E. Mark y E.A. Padlan, capítulo 4, Humanization of Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 1 13, Springer-Verlag, Nueva York, 1994). Pueden utilizarse animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de cadena sencilla. Las técnicas conocidas en la técnica para la producción de anticuerpos de cadena sencilla pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla contra una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 . El anticuerpo está presente en la composición en una concentración eficaz para inhibir la actividad de la proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 . En las realizaciones en las que se utiliza un ácido nucleico que codifica un anticuerpo como inhibidor, el ácido nucleico codifica un anticuerpo que se une a una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , e inhibe su actividad. El ácido nucleico está presente en la composición en una concentración eficaz para expresar una cantidad de anticuerpo eficaz para inhibir la actividad de la proteína. En las realizaciones en las que se utiliza una ribozima (enzima de ácido ribonucleico) como inhibidor, la ribozima contiene un dominio catalítico y un dominio de unión al sustrato. El dominio de unión al sustrato es aquel que se híbrida con al menos parte de un ARNm que codifica una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 . El dominio catalítico es aquel que es capaz de romper el ARNm. En realizaciones preferidas de esta invención, la ribozima se forma en un motivo de cabeza de martillo. Otras formas incluyen un motivo de horquilla, un virus de hepatitis delta, un motivo de intrón del grupo I o ARNasaP-ARN (en asociación con una secuencia guía de ARN), o un motivo de ARN de Neurospora VS. Los motivos de cabeza de martillo se describen en Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8: 83 (1992). Los motivos de horquilla se describen en Hampel y Tritz, Biochemistry, 28: 4929 (1989), y Hampel et al., Nucleic Acids Res., 18: 299 (1990). El motivo del virus de hepatitis delta se describe en Perrotta y Been, Biochemistry, 31 : 16 (1992), el motivo de ARNasaP se describe en Guerrier-Takada et al., Cell, 35: 849 (1983), el motivo de ribozima de ARN de Neurospora VS se describe en Collins (Saville y Collins, Cell, 61 : 685-696 (1990); Saville y Collins, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 8826-8830 (1991 ); Collins y Olive, Biochemistry, 32, 2795-2799 (1993). El motivo del intrón del grupo I se describe en Cech et al., patente de EEUU n° 4.987.071 . Un ejemplo de método para preparar una ribozima es sintetizar químicamente un oligodesoxirribonucleótido con un dominio catalítico de ribozima (aproximadamente 20 nucleótidos) flanqueado por secuencias que se hibridan con el ARNm de Núcleo 1 diana después de la transcripción. El oligodesoxirribonucleótido se amplifica utilizando las secuencias de unión al sustrato como cebadores. El producto amplificado se clona en un vector de expresión eucariota. Una ribozima de la presente invención puede expresarse en células eucariotas a partir del vector de ADN apropiado. Si se desea, la actividad de la ribozima puede aumentar mediante su liberación del transcripto primario por una segunda ribozima (Ohkawa et al., Nucleic Acids Symp. Ser., 27: 15-16 (1992); Taira et al., Nucleic Acids Res., 19: 5125-5130 (1991 ); Ventura et al., Nucleic Acids Res., 21 , 3249-3255 (1993)). La ribozima está presente en la composición en una concentración eficaz para inhibir la expresión del ácido nucleico que codifica una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 . En las realizaciones en las que se utiliza un ácido nucleico que codifica una ribozima como inhibidor, el ácido nucleico codifica una ribozima que es capaz de hibridarse y romper un ARNm que codifica una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1. El ácido nucleico está presente en la composición en una concentración eficaz para producir una ribozima en una cantidad que inhibe la expresión de la proteína. Esto puede ser determinado por los expertos en la técnica. En las realizaciones en las que se utiliza un compuesto de molécula pequeña que inhibe la actividad de una proteina del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , el compuesto es aquel que sensibiliza a las células frente a la apoptosis inducida por TRAIL mediante la inhibición del funcionamiento del complejo mitocondrial III, por ejemplo, mediante la inhibición de la actividad de la proteína mencionada anteriormente. El compuesto de molécula pequeña está presente en la composición en una concentración eficaz para inhibir la actividad de la proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , o para potenciar el efecto de TRAIL sobre células tumorales, independientemente de la actividad de la proteína del Complejo III en estas células.
En las realizaciones en las que se utiliza un ácido nucleico que codifica un compuesto de molécula pequeña, el ácido nucleico es aquel que codifica un compuesto de molécula pequeña que inhibe la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1. El ácido nucleico está presente en la composición en una concentración eficaz para producir el compuesto mencionado anteriormente en una cantidad que inhibe la actividad de la proteína. Esto puede ser determinado por los expertos en la técnica. En las realizaciones anteriores que implican el uso de un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico antisentido o una proteína, por ejemplo, un anticuerpo, una ribozima o una molécula pequeña, para inhibir la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , el ácido nucleico también puede comprender una o más regiones reguladoras que regulan la expresión de la porción codificadora del ácido nucleico. La selección de la región o regiones reguladoras apropiadas es un asunto habitual y está dentro del nivel de los expertos en la técnica. Las regiones reguladoras incluyen promotores, potenciadores, supresores, etc. Los promotores que pueden utilizarse en la presente invención incluyen promotores constitutivos y promotores regulados (inducibles). Los ejemplos de promotores útiles para la práctica de esta invención son: promotores ubicuos (por ejemplo, HPRT, vimentina, actina, tubulina); promotores filamentosos intermedios (por ejemplo, desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP); promotores de genes terapéuticos (por ejemplo, de tipo MDR, CFTR, factor VIII); y promotores específicos de tejido (por ejemplo, promotor de actina en células de músculo liso, o promotores Flt y Flk activos en células endoteliales). Los promotores específicos de tejidos incluyen regiones de control transcripcional que muestran especificidad de tejido, por ejemplo: región de control del gen de la elastasa I que es activo en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell, 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); región de control del gen de insulina que es activo en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature, 315:1 15-122), región de control del gen de inmunoglobulina que es activo en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell, 38:647- 658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activo en testículo, mama, células Nnfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell, 45:485-495), región de control del gen de albúmina que es activo en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel., 1 :268-276), región de control del gen de la alfa-fetoproteína que es activo en hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science, 235:53-58), región de control del gen de alfa-1-antit psina que es activo en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel., 1 : 161 -171 ), región de control del gen de beta-globina que es activo en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature, 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell, 46:89-94), región de control del gen de la proteína básica de mielina que es activo en células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell, 48:703-712), región de control del gen de la cadena ligera-2 de miosina que es activo en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature, 314:283-286) y región de control de la hormona de liberación gonadotrópica que es activo en el hipotálamo (Masón et al., 1986, Science, 234:1372-1378). Otros promotores que pueden utilizarse en la práctica de la invención incluyen, por ejemplo, promotores que se activan preferentemente en células en división, promotores que responden a un estímulo (por ejemplo, receptor de hormonas esteroideas, receptor del ácido retinoico), moduladores transcripcionales regulados por tetraciclina, promotor inmediato temprano de citomegalovirus, promotores LTR retrovíricos, metalotioneína, SV-40, E1 a, y MLP. Los moduladores transcripcionales regulados por tetraciclina y los promotores de CMV se describen en la publicación de solicitud internacional n° WO 96/01313, y en las patentes de EEUU n° 5.168.062 y 5.385.839. En una realización de la presente invención, la composición comprende un vector que, a su vez, comprende el ácido nucleico descrito anteriormente. Un vector es cualquier medio para transferir un ácido nucleico en una célula. El término "vector" incluye medios víricos y no víricos para introducir el ácido nucleico en una célula. Los vectores no víricos incluyen, por ejemplo, plásmidos, liposomas, lípidos cargados eléctricamente (citofectinas), complejos de ADN-proteína, y biopolímeros. Los vectores víricos incluyen, por ejemplo, vectores de retrovirus, virus adenoasociados, poxvirus, baculovirus, vaccinia, herpes simplex, Epstein-Barr y adenovirus. Además de un ácido nucleico, el vector también puede contener uno o más marcadores seleccionabas útiles para seleccionar, medir y controlar los resultados de la transferencia del ácido nucleico (la transferencia a tejidos concretos, la duración de la expresión, etc.).
Con respecto al uso de un vector vírico, puede ser de replicación defectuosa, es decir, es incapaz de replicarse de forma autónoma en la célula diana. En general, el genoma de los vectores víricos de replicación defectuosa carece de al menos una región que es necesaria para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden eliminarse (por completo o en parte), o volverse no funcionales mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Estas técnicas incluyen la retirada total, sustitución (por otras secuencias, en particular por el ácido nucleico insertado), deleción parcial, o adición de una o más bases en una región esencial (para la replicación). Dichas técnicas pueden realizarse in vitro (sobre el ADN aislado) o in situ, usando las técnicas de manipulación genética o por tratamiento con agentes mutagénicos. Preferiblemente, el virus de replicación defectuosa mantiene las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsidar las partículas víricas. Con respecto al uso de retrovirus, son virus integrantes que infectan a las células en división. El genoma retrovírico incluye dos LTR, una secuencia de encapsidación y tres regiones codificadoras (gag, pol y env). La construcción de vectores retrovíricos recombínantes se ha descrito, por ejemplo, en las patentes europeas n° 453242 y 178220, y en Bernstein et al., Genet. Eng., 7: 235 (1985), y McCormick, BioTechnology, 3: 689 (1985). En vectores retrovíricos recombínantes, los genes gag, pol y env están generalmente delecionados, por completo o en parte, y reemplazados por una secuencia de ácido nucleico heteróloga de interés. Estos vectores pueden construirse a partir de diferentes tipos de retrovirus, tales como MoMuLV ("virus de la leucemia de Moloney murína"), MSV ("virus del sarcoma de Moloney murino"), HaSV ("virus del sarcoma de Harvey"), SNV ("virus de la necrosis del bazo"), RSV ("virus del sarcoma de Rous") y virus de Friend. También pueden utilizarse sistemas de vector de lentivirus en la práctica de la presente invención. El genoma lentivírico es un ARN poliadenilado de cadena positiva de 9.000 a 10.000 pares de bases que contiene tres genes estructurales organizados de 5' a 3' (gag, pol, env), típicos de todos los retrovirus. Para un informe en profundidad de sistemas lentivíricos, véase Fíelds Virology, 2a edición, volumen 2, capítulo 55, "Lentíviruses," pp. 1571-1589, Raven Press, Nueva York, 1990. En general, para construir retrovirus recombínantes que contengan un ácido nucleico de la presente invención, se construye un plásmido, que contiene las LTR, la secuencia de encapsidación y la secuencia codificadora. Esta construcción se usa para transfectar una línea celular de encapsulación que es capaz de suministrar en trans las funciones retrovíricas que son defectuosas en el plásmido. En general, las líneas celulares de encapsulación son, por lo tanto, capaces de expresar los genes gag, pol y env. Dichas líneas celulares de encapsulación se han descrito en la técnica anterior, en particular la línea celular PA317 (documento US 4.861.719); la linea celular PsiCRIP (publicación de solicitud internacional n° WO90/02806) y la línea celular GP+envAm-12 (publicación de solicitud internacional n° WO89/07150). Además, los vectores retrovírícos recombinantes pueden contener modificaciones en las LTR para suprimir la actividad transcripcional, asi como secuencias de encapsidación extensivas que pueden incluir una parte del gen gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Los vectores retrovírícos recombinantes se purifican medíante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. Con respecto al uso de virus adenoasociados (AAV), son virus de ADN de tamaño relativamente pequeño que pueden integrarse, de un modo estable y con especificidad de sitio, en el genoma de las células que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento, morfología o diferenciación celular, y no parecen estar implicados en patologías humanas. Se ha clonado, secuenciado y caracterizado el genoma de AAV. Incluye aproximadamente 4700 bases y contiene una región repetida terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que actúa como origen de la replicación para el virus. El resto del genoma está dividido en dos regiones esenciales que llevan las funciones de encapsidación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicación vírica y la expresión de los genes víricos; y la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las proteínas de la cápsída del virus. El uso de vectores derivados de los AAV para trasferir genes in vitro e in vivo se ha descrito (véanse las publicaciones de solicitudes internacionales n° WO 91/18088 y WO 93/09239; las patentes de EEUU n° 4.797.368 y 5.139.941 ; y la patente europea n° 488528). Estas publicaciones describen diversas construcciones derivadas de AAV en las que los genes rep y/o cap están delecionados y reemplazados por un gen de interés, y el uso de estas construcciones para transferir dicho gen de interés in vitro (en células cultivadas) o in vivo (directamente en un organismo). Los AAV recombinantes de replicación defectuosa utilizados en la presente invención pueden preparase cotransfectando un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico de interés flanqueada por dos regiones repetidas terminales invertidas (IT ) de AAV, y un plásmido que lleva los genes de encapsidación de AAV (genes rep y cap), en una línea celular que está infectada con un virus auxiliar humano (por ejemplo un adenovirus). Los AAV recombinantes que se producen después se purifican mediante técnicas convencionales.
En una realización preferida, el vector utilizando en la presente invención es un vector de adenovirus. Los adenovirus son virus de ADN eucariota que pueden modificarse para suministrar de forma eficaz un ácido nucleico a una diversidad de tipos celulares. Existen diversos serotipos de adenovirus. Los serotipos preferidos para su uso en la práctica de la presente invención son los adenovirus humanos de tipo 2 o tipo 5 (Ad 2 o Ad 5), o adenovirus de origen animal (véase la publicación de solicitud internacional n° WO 94/26914). Los adenovirus de origen animal incluyen, por ejemplo, adenovirus caninos, bovinos, murinos (por ejemplo: Mav1 , Beard et al., Virology, 75: 81 (1990)), ovinos, porcinos, aviares, y simios (por ejemplo: SAV). Preferiblemente, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más preferiblemente un adenovirus CAV2 (por ejemplo, la cepa Manhattan o A26/61 (ATCC VR-800), por ejemplo). Preferiblemente, los vectores adenovíricos de replicación defectuosa comprenden las ITR, una secuencia de encapsidación y el ácido nucleico de interés. Aún más preferiblemente, al menos la región E1 del vector adenovírico es no funcional. La deleción en la región E1 se extiende preferiblemente de los nucleótidos 455 a 3329 en la secuencia del adenovirus Ad5. También pueden modificarse otras regiones, en particular: la región E3 (véase la publicación de solicitud internacional n° WO 95/02697); la región E2 (véase la publicación de solicitud internacional n° WO 94/28938); la región E4 (véanse las publicaciones solicitudes internacionales n° WO 94/28152, WO 94/12649 y WO 95/02697), o en cualquiera de los genes tardíos L1 -L5. Se describen vectores de replicación defectuosa en la publicación de solicitud internacional n° WO 95/02697. En una realización preferida, el vector adenovírico tiene una deleción en las regiones E1 y E4. En otra realización preferida, el vector adenovírico tiene una deleción en la región E1 en la que se insertan la región E4 y la secuencia que codifica el ácido nucleico de interés (véase la publicación francesa n° 94 13355). Puede utilizarse cualquier técnica adecuada para preparar adenovirus recombinantes de replicación defectuosa. Se describen ejemplos de técnicas en Levrero et al., Gene, 101 : 195 (1991 ); la patente europea n° 185 573; y Graham, EMBO J., 3: 2917 (1984). En particular, los adenovirus pueden prepararse mediante recombinación homologa entre un adenovirus y un plásmido que porta, entre otros, el ácido nucleico de interés. La recombinación homologa se realiza después de la cotransfección de dicho adenovirus y del plásmido en una linea celular apropiada. La linea celular que se emplea debe preferiblemente (i) ser transformable por dichos elementos, y (ii) contener las secuencias que son capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus de replicación defectuosa, preferiblemente en forma integrada para evitar los riesgos de recombinación. Los ejemplos de líneas celulares que pueden usarse son la línea celular de riñon embrionario humano 293 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)) que contiene la parte izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12%) integrado en su genoma, y lineas celulares que son capaces de complementar las funciones de E1 y E4, como se describe en las publicaciones de solicitudes internacionales n° WO 94/26914 y WO 95/02697. Los adenovirus recombinantes se recuperan y purifican usando técnicas de biología molecular convencionales, que son bien conocidas por los expertos en la técnica. En la técnica se han utilizado ciertos sistemas no víricos y pueden facilitar la introducción de un ácido nucleico en una célula. Un ácido nucleico puede introducirse en una célula mediante lipofección, por ejemplo, utilizando un liposoma. El uso de lípidos catiónicos puede estimular la encapsulacion de ácidos nucleicos cargados negativamente, y también puede estimular la fusión con membranas celulares cargadas negativamente (véase Felgner y Ringold, Nature, 337:387-388 (1989)). Se describen compuestos y composiciones lipídicas particularmente útiles para transferir ácidos nucleicos en las publicaciones de solicitudes internacionales WO 95/18863 y WO 96/17823, y en la patente de EEUU n° 5.459.127. El uso de la lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. El transporte molecular dirigido de liposomas a células específicas representa un área de beneficio. Es evidente que dirigir la transfección a tipos celulares particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, por ejemplo, páncreas, hígado, riñon, y el cerebro. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas con el objetivo del transporte dirigido. Los péptidos dirigidos, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y las proteínas, por ejemplo, anticuerpos, o las moléculas no peptídicas, podrían acoplarse a liposomas químicamente.
Otras moléculas también son útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, por ejemplo, un oligopéptido catiónico (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 95/21931 ), péptidos derivados de proteínas de unión al ADN (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 96/25508), y un polímero catiónico (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 95/21931 ). También es posible introducir un ácido nucleico en una célula en forma de un vector de ácido nucleico desnudo (véanse las patentes de EEUU n° 5.693.622; 5.589.466; y 5.580.859). Los vectores de ácido nucleico desnudos para terapia génica pueden introducirse en las células hospedantes deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, el uso de una pistola génica, o el uso de un transportador de vectores de ADN (véase, por ejemplo, Wilson et al., J. Biol. Chem, 267:963-967 (1992); Wu y Wu, J. Biol. Chem., 263: 14621 -14624 (1988); Hartmut et al., patente canadiense n° 2.012.31 1 ; Williams et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:2726-2730 (1991 )). También pueden usarse estrategias de transporte de ADN mediadas por receptores (Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3:147-154 (1992); Wu y Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)). La presente invención proporciona composiciones que comprenden el inhibidor de la presente invención y un vehículo. El vehículo es aquel en el que el inhibidor se mantiene en una forma activa, por ejemplo, en una forma capaz de realizar una actividad biológica. Por ejemplo, un ácido nucleico será capaz de replicarse, traducir un mensaje, o hibridarse con un ácido nucleico complementario; un vector será capaz de transfectar una célula diana; y un anticuerpo se unirá a Núcleo 1. En general, este vehículo será un tampón acuoso, por ejemplo, tampón Tris, fosfato o HEPES, que contiene sales iónicas. Normalmente, la concentración de sales iónicas será similar a los niveles fisiológicos. Con el fin de ofrecer una guía, se cree que la mayoría de las aplicaciones implicarán el uso de un vehículo en una cantidad de 40 % a aproximadamente 98 % en peso de la composición. En algunas realizaciones, el vehículo está presente en una cantidad de aproximadamente 50 % a aproximadamente 98 % en peso de la composición.
La composición también puede comprender agentes estabilizantes, conservantes y otros excipientes. La composición de la presente invención puede formularse para su administración por medios orales y parenterales (por ejemplo, por vía tópica, intranasal, subcutánea e intraocular). Se pretende que la administración parenteral incluya la inyección intravenosa, la inyección intramuscular, la inyección intraarteríal o técnicas de infusión. La composición puede administrarse por vía parenteral en formulaciones de dosificación unitarias que contienen vehículo, adyuvantes y portadores convencionales muy conocidos, no tóxicos y fisiológicamente aceptables según se desee. Las preparaciones inyectables estériles preferidas pueden ser una disolución o suspensión del inhibidor en un vehículo parenteralmente aceptable no tóxico. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son disolución salina, disolución salina tamponada, disolución salina isotónica (por ejemplo, fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, o mezclas de estas sales), disolución de Ringer, dextrosa, agua, agua estéril, glicerol, etanol y sus combinaciones. De forma conveniente, se emplean 1 ,3-butandiol y aceites no volátiles estériles como disolventes o medios de suspensión. Puede emplearse cualquier aceite no volátil suave, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. También se pueden utilizar ácidos grasos, tales como el ácido oleico, en la preparación de inyectables. El vehículo también puede ser un hidrogel que se prepara a partir de cualquier (homo o hetero) polímero bíocompatible o no citotóxico, tal como un polímero de poli(ácido acrílico) hidrófilo, que puede actuar como una esponja en la que se absorbe el inhibidor. Estos polímeros se han descrito, por ejemplo, en la publicación de solicitud internacional n° WO 93/08845. Un hidrogel puede depositarse directamente sobre la superficie del tejido que se va a tratar. Otra realización preferida de la presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende un poloxámero como vehículo, que está impregnado con un virus recombinante de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico según la presente invención. Un poloxámero preferido es Poloxamer 407, que está disponible en el mercado (BASF, Parsippany, NJ) y es un poliol no tóxico y bíocompatible. Los poloxámeros poseen fundamentalmente las mismas ventajas que los hidrogeles, pero tienen menor viscosidad.
La presente invención proporciona un método de tratamiento que comprende la administración a un ser humano u otro animal de una cantidad eficaz de una composición de la presente invención. Las cantidades eficaces de la composición pueden variar, dependiendo de la edad, tipo y gravedad del trastorno que se va a tratar, el peso corporal, la duración deseada del tratamiento, la vía de administración y otros parámetros. El médico u otro profesional médico cualificado determinará las cantidades eficaces. La presente invención también proporciona un método para ensayar compuestos para determinar si son capaces de actuar como inhibidores de la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 . En el ensayo, se compara la viabilidad de células que expresan una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , y que se sabe que son resistentes naturales a la apoptosis inducida por TNF, y que se han puesto en contacto con un miembro de la superfamilia del TNF (en lo sucesivo "TNF") y el compuesto, con la viabilidad de células control que proceden de la misma línea celular y que también expresan la proteína y se han puesto en contacto con el compuesto, pero no con TNF. La viabilidad puede determinarse utilizando el ensayo de azul de valoración celular, que mide la capacidad metabólica (y, por tanto, la viabilidad) de una célula mediante su capacidad para reducir el tinte resazurina para producir su forma muy fluorescente resorrufina, que puede detectarse utilizando un espectrofotómetro. Si el compuesto reduce significativamente la viabilidad de las células que se han puesto en contacto con el TNF y las células control, se considera que la actividad del compuesto no está relacionada con el TNF, y el compuesto no se considera un compuesto de interés. Si el compuesto reduce significativamente la viabilidad de las células que se han puesto en contacto con el TNF, pero no la viabilidad de las células control, entonces se considera que sensibiliza a las células frente a la actividad apoptótíca del TNF, puesto que se sabía previamente que la línea celular era resistente al TNF. Puesto que la célula expresa la proteína del Complejo III, se infiere que el compuesto ensayado actúa inhibiendo la actividad supresora del TNF de la proteína del Complejo III.
Se considera que un compuesto reduce significativamente la viabilidad de una célula cuando la viabilidad de las células que se han puesto en contacto con TRAIL y con el compuesto ensayado es aproximadamente 30 % menor, como mínimo, comparada con la viabilidad de las células control.
En una realización de la presente invención, las células que expresan una proteína del Complejo III, por ejemplo Núcleo 1 , y que proceden de una línea celular conocida por ser naturalmente resistente a la apoptosis inducida por TNF, se cultivan en presencia de TNF, por ejemplo, durante 24 horas, y después se ponen en contacto con el compuesto que se va a ensayar. Las células control de la misma línea celular se cultivan en ausencia de TNF durante el mismo periodo de tiempo y se ponen en contacto con el mismo compuesto. Entonces se mide y se compara la viabilidad de las células. Para llevar a cabo este ensayo puede utilizarse casi cualquier línea celular conocida por ser naturalmente resistente a la apoptosis inducida por TRAIL y que exprese la proteína del Complejo III de interés, o que ha sido modificada para expresar la proteína, por ejemplo, mediante transfección de un transgén que expresa la proteína. Un ejemplo de esta línea celular es la línea celular de tumor de colon HCT1 16 que se ha modificado para que exprese Núcleo 1 de forma estable. El transgén de Núcleo 1 puede introducirse, por ejemplo, mediante infección de células HCT1 16 utilizando los vectores de expresión lentivíricos, retrovíricos o adenovíricos habituales que se emplean en la técnica. La presente invención también contempla que no es necesario que la célula exprese la proteína entera, siempre que exprese la porción de la proteína que confiere la capacidad de suprimir la activida inductora de la apoptosis del TNF. Por consiguiente, la célula puede contener, o puede modificarse para que contenga sólo un ácido nucleico que codifique dicha porción de la proteína del Complejo III. Una célula puede exponerse al compuesto que se está ensayando en un intervalo de concentración de nanomolar a micromolar durante 24 a 96 horas a 37°C, y la viabilidad de las células se puede medir utilizando ensayos disponibles en el mercado, por ejemplo, ensayos WST-1 , MTT y caspasa-3. El efecto de los compuestos sobre el avance del ciclo celular puede medirse medíante análisis FACS o mediante otros ensayos basados en la formación de imágenes convencionales que se emplean en la técnica. Todos los experimentos basados en compuestos descritos también puede realizarse bajo condiciones hipóxicas (1 -2% de oxígeno) para estudiar si las condiciones hipóxicas potencian o inducen la muerte celular en presencia de TRAIL. Las células pueden exponerse a TRAIL mediante la adición directa de TRAIL en una disolución de un vehículo apropiado (por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato) a un recipiente que contenga las células a una concentración de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 ng/ml, y cultivando las células en presencia de éste durante hasta aproximadamente 96 horas. EJEMPLOS Ejemplo 1 Este ejemplo describe el descubrimiento de que Núcleo 1 está implicada en la resistencia a la apoptosis mediada por TRAIL. Se realizó una selección genética funcional en un banco de ADNc de E14 de ratón de la línea de carcinoma de colon HCT1 16, una línea celular conocida por ser sensible a la apoptosis inducida por TRAIL [figura 1 A]. La selección identificó a UQCRC1 , que codifica Núcleo 1 , como implicada en la resistencia a la apoptosis mediada por TRAIL. Se cultivaron por separado células HCT1 16 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia) y la línea celular de encapsulación 293 EBNA (Invitrogen) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal inactivado con calor al 10% (FBS) y penicilina-estreptomicina al 1 % (Gibco) a 37°C y 5% de C02. Un banco de ADNc retrovirico de ratón embrionario de 14 días (obsequio de George Daley, MIT, Cambridge, Massachusetts) se clonó en el vector retrovirico pEYK y se transfectó en la anterior línea celular de encapsulación 293 EBNA utilizando lipofectamina (Invitrogen). De 48 a 72 horas después de la transfección se recogió el sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con polibeno 10 mg/ml y se utilizó para infectar las anteriores células HCT1 16 que se habían cultivado en placa 48 horas antes de la infección. Después de 48 horas de infección, se cultivaron en placa 1 ,0 X 106 células en placas de 15 cm y se trataron con TRAIL recombinante humano 200 ng/ml (BioMol, Plymouth Meeting, Pennsylvania) durante 10 días, añadiéndose medio fresco y TRAIL cada 48 horas. Se recogieron los clones individuales resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL Se aisló ADN genómico a partir del clon resistente resuspendiendo las células en tampón de digestión (NaCI 100 nM, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 25 mM, SDS al 0,5%), seguido de un tratamiento con proteinasa K a una concentración final de 100 µg/ml a 50°C durante 12 horas. Las muestras se extrajeron medíante fenol-cloroformo y precipitación en etanol. Los ADNc candidatos entonces se amplificaron utilizando cebadores específicos de banco, o el plásmido retrovirico recuperado se utilizó directamente para realizar otra iteración de la selección. Uno de los ADNc candidatos interesantes que se descubrió que podía potencialmente conferir resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL fue el ADNc de la subunidad 1 de núcleo de la ubiquinol citocromo c reductasa (UQCRC1 ), que codifica Núcleo 1 [figura 1 B]. Ejemplo 2 Para caracterizar aún más la capacidad de Núcleo 1 para proteger frente a la apoptosis inducida por TRAIL, el vector pEYK que contenía el ADNc parcial de UQCRC1 aislado a partir de la selección se utilizó para infectar directamente a células HCT1 16. Se utilizaron como control células que expresan FADD dominante negativo (dnFADD), que inhibe la señal de los receptores de TRAIL. Las células se trataron durante 48 horas con 0, 10 ó 50 ng/ml de TRAIL y se ensayaron para anexina V, un marcador temprano de la apoptosis [figura 2A]. La expresión de dnFADD inhibió la apoptosis inducida por TRAIL, siendo 78% de las células negativas para anexina V o no apoptóticas a TRAIL 50 ng/ml. En células que expresan la proteína flurorescente verde (GFP), sólo 2% eran negatias para anexina V a 50 ng/ml, comparado con 14,5% en células que expresan Núcleo 1 , un aumento de 7 veces en la protección frente a la apoptosis inducida por TRAIL. Esto sugiere que la expresión de la proteína Núcleo 1 parcial proporciona alguna protección, pero no inhibe completamente la apoptosis inducida por TRAIL. Ejemplo 3 Puesto que Núcleo 1 es una subunidad del complejo respiratorio mitocondrial III, se realizaron estudios para determinar si la expresión de Núcleo 1 protege contra la despolarización mitocondrial, una etapa crítica en la apoptosis mediada por mitocondrias. Los cambios en el potencial de membrana mitocondrial durante el tratamiento con TRAIL se estudiaron utilizando el kit de ensayo JC-1 (Molecular Probes). La JC-1 (5, 5',6,6\- tetracloro-1 ,1 ',3,3'-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina) es un tinte catiónico que tiene una fluorescencia verde difusa en el citoplasma. La acumulación de JC-1 en las mitocondrias, que depende de mitocondrias intactas, polarizadas, produce la formación de agregados fluorescentes rojos. La proporción de fluorescencia verde a roja se midió en las células descritas en el ejemplo 2 anterior mediante análisis de clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). El FACS es un método para clasificar células basado en marcadores específicos de la superficie celular (por ejemplo, fluorescencia roja o verde). La proporción anterior se representa gráficamente como porcentaje de mitocondrias polarizadas.
La expresión de dnFADD protegió completamente frente a la despolarización de las mitocondrias en todas las concentraciones de TRAIL, mientras que las células que expresan GFP mostraron sólo 7% de mitocondrias polarizadas remanentes a 50 ng/ml de TRAIL. La expresión de Núcleo 1 parcial mostró 38% de mitocondrias polarizadas, proporcionando un aumento de la protección en 5 veces frente a la despolarización mitocondrial con respecto a GFP [figura 2B]. Por tanto, Núcleo 1 también protege frente a la despolarización mitocondrial. Ejemplo 4 Para confirmar que la protección observada de la proteína Núcleo 1 parcial sea indicativa de su función, se clonó la proteína Núcleo 1 humana de longitud completa en el vector pLenti (que contiene un marcador HA) y se utilizó para infectar HCT1 16 para producir una línea celular estable que expresa Núcleo 1 . Se preparó una línea celular control de forma similar para que expresara la proteína fluorescente amarilla (YFP). Para confirmar la expresión proteica de Núcleo 1 de longitud completa, las células se homogeneizaron para preparar un lisado mitocondrial y citoplásmico, y se realizó un análisis de la transferencia Western con anticuerpos contra Núcleo 1 [figura 2C]. Se detecta Núcleo 1 endógeno en la fracción mitocondrial en las células que expresan YFP y Núcleo 1 . Núcleo 1 expresado de forma exógena está marcado con HA y se detecta como una banda de migración mayor en la fracción mitocondrial, así como en la fracción citoplásmica. Este patrón de expresión no es el resultado de la contaminación de la fracción citoplásmica con proteínas mitocondriales, puesto que COX1 (subunidad I del Complejo IV) se detecta sólo en la fracción mitocondrial, mientras que SOD1 (superóxido dismutasa 1 ), un marcador citoplásmico, no detecta proteínas citopiásmicas en la fracción mitocondrial. Por tanto, Núcleo 1 se expresa en estas líneas celulares HCT1 16 estables. Para determinar si Núcleo 1 de longitud completa también protege frente a la apoptosis inducida por TRAIL, las células se trataron con TRAIL y se ensayaron para la apoptosis mediante análisis FACS para células que sean anexina V positivas o negativas. Las células que expresan Núcleo 1 muestran un aumento de la protección en 2,5 veces frente a la apoptosis inducida por TRAIL a 50 ng/ml [figura 2D]. Estos datos demuestran que la expresión de Núcleo 1 en HCT1 16 protege frente a la apoptosis inducida por TRAIL y la despolarización mitocondrial. Ejemplo 5 Este ejemplo demuestra el efecto inhibidor de Núcleo 1 sobre la actividad de las caspasas 8, 9 y 3. Se trataron células que expresan de forma estable YFP o Núcleo 1 humana de longitud completa durante 24 horas con TRAIL 200 ng/ml, se lisaron y se realizó un análisis de la transferencia Western con anticuerpos contra varias caspasas. Se detectó la activación de las caspasas mediante la ruptura de la procaspasa de longitud completa para producir la forma activa, más pequeña. Las células HCT1 16 que expresan Núcleo 1 humana de longitud completa mostraron una caspasa 8 menos activa tras la estimulación con TRAIL que las células que expresan YFP [figura 3A]. Además, la expresión de Núcleo 1 produjo, de forma similar, una activación reducida de la caspasa 9 y la caspasa 3. Por tanto, la expresión de Núcleo 1 inhibe la activación completa de las caspasas 8, 9 y 3 tras la estimulación con TRAIL. Ejemplo 6 Este ejemplo demuestra el efecto de Núcleo 1 sobre la liberación del citocromo c de las mitocondrias. Células HCT1 16 que expresan de forma estable YFP o Núcleo 1 humana de longitud completa se trataron con TRAIL 100 ng/ml durante 24 horas. Las células control, que expresan de forma estable YFP o Núcleo 1 humana de longitud completa, no se trataron con TRAIL. Entonces las células se recogieron. Primero se retiró el medio que contenia células flotantes hacia nuevos tubos. El resto de las células adherentes se desprendieron utilizando un raspador de células en PBS enfriado en hielo y se añadieron al medio que contenía las células flotantes. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 1000 X g durante 10 minutos a 4°C y se resuspendieron en un tampón isoosmótico (sacarosa 0,3 M, Tris 10m M, pH 7,5, EDTA 1 mM, comprimido de proteasa exento de EDTA). Después de una incubación durante cinco minutos en hielo, las células se lisaron utilizando homogeneizadores Dounce hasta que aproximadamente 90% de las membranas plasmáticas se hubieron lisado. Esto se realizó para aislar la fracción citoplásmica. El grado de la lisis celular se controló mezclando 10 µ? de lisado con azul de tripano y se visualizó en un hemocitómetro. El sobrenadante se trasladó a tubos frescos y se centrifugó a 8000 X g durante 10 minutos a 4°C pra sedimentar las mitocondrias. La concentración de lisados se determinó utilizando el ensayo de proteínas BioRad DC (BioRad) o el método BCA (Pierce, Rockford, Illinois). Para detectar cuantitativamente los niveles de citocromo c, los lisados se ensayaron para el citocromo c utilizando un kit de citocromo c ELISA de función (Active Motif, Carlsbad, California) [figura 3B]. En células sin tratar, se detectaron unos bajos niveles de línea de base de citocromo c en el citoplasma. Tras el tratamiento con TRAIL, las células que expresan YFP mostraban un aumento en 10 veces en la cantidad de citocromo c liberado hacia la fracción citoplasmica, mientras que las células que expresaban Núcleo 1 liberaban sólo la mitad de esta cantidad de citocromo c [figura 3B]. Este estudio sugiere que la expresión de Núcleo 1 también reduce la cantidad de citocromo c liberado desde las mitocondrias hacia el citosol tras el tratamiento con TRAIL. Ejemplo 7 Para determinar si Núcleo 1 protege frente a la apoptosis inducida por TRAIL o a través de otras vías, se trataron células con varios inductores de la apoptosis diferentes y se ensayaron para la viabilidad celular. El ligando Fas (FasL), también un miembro de la familia del TNFa que señaliza a través de los receptores de muerte, utiliza la misma proteína adaptadora FADD para inducir la activación de caspasas y la apoptosis. Se trataron células que expresan de forma estable la proteína fluorescente amarilla (YFP) o Núcleo 1 humana de longitud completa con 100 ng/ml de TRAIL o 16 ng/ml de FasL durante 24 horas. Se ensayó la viabilidad celular utilizando el ensayo de azul de valoración celular, en el que la conversión del tinte indicador resazurina se utiliza para medir la capacidad metabólica de las células, un indicador de la viabilidad celular. La expresión de Núcleo 1 ofrece un aumento de protección en 3 veces frente a la apoptosis inducida por FasL similar a TRAIL [figura 3C]. Esto sugiere que Núcleo 1 puede proteger frente a la apoptosis inducida por la señalización de los receptores de muerte. Entonces las células se trataron con dos compuestos que inducen la apoptosis a través de vías que no son de los receptores de muerte. La camptotecina inhibe la ADN topoisomerasa I, conduciendo, en último término, a daños en el ADN y muerte, mientras que el taxótero es un inhibidor de la despolimerización de microtúbulos, que evita la división celular y conduce a la muerte mitótica. No se observó diferencia en la viabilidad entre células que expresan YFP o Núcleo 1 humana de longitud completa tras un tratamiento con camptotecina 200 nM en sulfóxido de dimetilo, o taxótero 10 n en sulfóxido de dimetilo [figura 3D]. Estos resultados demuestran que Núcleo 1 no protege contra otras apoptosis no mediadas por receptores de muerte provocadas por daños en el ADN o por la inhibición de la despolimerización de microtúbulos. Estos datos sugieren con fuerza que Núcleo 1 desempeña un papel en la regulación de la apoptosis inducida por TRAIL y son coherentes con la observación de que Núcleo 1 ofrece protección parcial frente a la apoptosis inducida por TRAIL. Ejemplo 8 Este ejemplo describe el uso de ARNsi para inhibir la expresión de Núcleo 1. Se cultivaron en placa células HCT1 16 que contienen Núcleo 1 endógena (y no contienen Núcleo 1 exógena) a 1 X 105 células por placa de 6 pocilios en medio exento de penicilina/estreptomicina durante 24 horas antes de la transfección. Las células se transfectaron con lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo los protocolos del fabricante. Las células se incubaron durante 72 horas con mezcla de transfección que contiene sólo lipofectamina (células control), ARNsi para UQCRC1 3,75 nM (SMARTpool), o ARNsi sin dirigir (Nuil) (Dharmacon, Lafayette, CO). Se determinó la concentración de proteínas preparando lisados y análisis de la transferencia Western utilizando anticuerpos contra Núcleo 1 [figura 4A]. Las transferencias se volvieron a separar y a sondar utilizando anticuerpos antitubulina como control de carga. Las transfección de Núcleo 1 produjo una reducción de 90% de la proteína Núcleo 1 , mientras que la transfección sólo con lipofectamina o ARNsi Nuil no afectó a los niveles de proteína Núcleo 1 [figura 4B]. Entonces cada uno de los anteriores grupos de células se trató con diversas concentraciones de TRAIL durante 24 horas más y se ensayó la viabilidad celular utilizando el ensayo de azul de valoración celular (Promega, Madison, Wisconsin). Este ensayo mide la capacidad metabólica de una célula (y, por tanto, su viabilidad) mediante su capacidad para reducir el tinte resazurina para producir resorrufina, muy fluorescente. La cantidad de reactivo de azul de valoración celular (una disolución tamponada que contiene resazurina muy purificada) añadida era 20% del volumen del medio. Las células se incubaron a 37°C durante 2-3 horas y se ensayaron utilizando un lector de placas de lectura fluorescente inferior a excitación a 560 nm y emisión a 590 nm. Las células se cultivaron en placa por triplicado. Las células entonces se lavaron en 2X PBS frío (Gibco) y se lisaron en 100 µ? de tampón de lisis enfriado en hielo (HEPES 50 nM, pH 7,4, NaCI 250 nM, EDTA 2 nM, Tritón X-100 al 1 %, inhibidores de proteasas exentos de EDTA (Roche)). Los lisados se centrifugaron durante 10 minutos a 3500 rpm a 4°C. El sobrenadante se mezcló con 4X de tampón de muestra de LDS (Invitrogen) y se calentó a 90°C durante 10 minutos, y se conservó a -20°C. Los resultados del ensayo se muestran en la figura 4C. Los resultados mostrados son una media de 4 experimentos distintos. Las células con inhabilitación de Núcleo 1 mostraron sólo 60% de viabilidad a TRAIL 25 ng/ml, comparado con 90-95% a la misma concentracón en las células control o transfectadas con Nuil [figura 4C]. Las células con inhabilitación de Núcleo 1 presentaban menos de 50% de viabilidad a 50 ng/ml, mientras que hace falta dos veces la cantidad de TRAIL para inducir 50% de viabilidad en células transfectadas con Nuil. Aunque parece que la transfeccion sólo con ARNsi Nuil tiene un efecto sensibilizador frente a TRAIL con respecto a sólo lipofectamina, estos datos demuestran claramente que la reducción de la proteina Núcleo 1 sensibiliza a las células frente a la apoptosis inducida por TRAIL, en especial a bajas concentraciones. Estos datos apoyan con fuerza la idea de que Núcleo 1 desempeña un papel en la regulación de la apoptosis inducida por TRAIL. Ejemplo 9 Este ejemplo describe un ensayo para determinar si un compuesto inhibe la actividad de Núcleo 1 . El compuesto que se va a ensayar se añade a una concentración 10 µ? en un vehículo adecuado (por ejemplo, sulfóxido de dimetilo, etanol, disolución salina tamponada) a células HCT1 16 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) que se habían preinfectado con ADN de Núcleo 1. Las células entonces se cultivan en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con FBS al 10% en presencia de unas concentraciones apropiadas de hasta 200 ng/ml de TRAIL y se mantuvieron durante 24 horas. El compuesto se añade también a una concentración 10 µ? a las células HCT1 16 que se habían preinfectado con ADN de Núcleo 1 . Las células entonces se cultivan en DMEM con FBS al 10% en ausencia de TRAIL (células control) y se mantuvieron durante 24 horas. Las células entonces se lavaron en PBS y se midió la viabilidad de estas células utilizando el ensayo WST-1. El ensayo WST-1 mide la viabilidad celular midiendo la reducción del sustrato químico WST para producir una sal de formazán soluble, que es detectable mediante un espectrofotómetro. El ensayo de azul de valoración celular puede utilizar como alternativa al ensayo WST-1.
Si el compuesto reduce significativamente la viabilidad de las células que se cultivaron en presencia de TRAIL y de las células control que se cultivaron en ausencia de TRAIL, se considera que la actividad del compuesto no está relacionada con TRAIL y el compuesto no se considera un compuesto de interés. Si el compuesto reduce 5 significativamente la viabilidad de las células que se cultivaron en presencia de TRAIL, pero no la viabilidad de las células control, entonces se considera que sensibiliza a las células frente a la actividad apoptótica de TRAIL, puesto que se sabe que la línea celular HCT1 16 que expresa Núcleo 1 previamente era resistente a TRAIL. Como también se conocía previamente que la resistencia celular a la apoptosis inducida por TRAIL está i o provocada por Núcleo 1 , se infiere que el compuesto ensayado actúa suprimiendo la actividad supresora del TRAIL de Núcleo 1 .

Claims (43)

REIVINDICACIONES
1. - Una composición que comprende: (A) un inhibidor que inhibe la actividad de una proteína del Complejo III; y (B) un vehículo.
2. - Una composición según la reivindicación 1 , en la que dicha proteína del Complejo III es Núcleo 1.
3. - Una composición según la reivindicación 1 , en la que dicho inhibidor es un ácido nucleico antisentido que inhibe la expresión de la proteína del Complejo III.
4. - Una composición según la reivindicación 1 , en la que dicho inhibidor es un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico antisentido que inhibe la expresión del gen que codifica la proteína del Complejo III.
5. - Una composición según la reivindicación 4, en la que dicho ácido nucleico incluye una región de promotor.
6. - Una composición según la reivindicación 4, en la que dicho ácido nucleico está contenido dentro de un vector.
7. - Una composición según la reivindicación 1 , en la que dicho inhibidor es un ARNsi que inhibe la expresión del gen que codifica la proteína del Complejo III.
8. - Una composición según la reivindicación 1 , en la que dicho inhibidor es un anticuerpo que es capaz de unirse y disminuir la actividad de la proteína del Complejo III.
9. - Una composición según la reivindicación 1 , en la que dicho inhibidor es un ácido nucleico que codifica un anticuerpo que es capaz de unirse y disminuir la actividad de la proteína del Complejo III.
10. - Una composición según la reivindicación 9, en la que dicho ácido nucleico incluye un promotor.
11 . - Una composición según la reivindicación 9, en la que dicho ácido nucleico está contenido dentro de un vector.
12. - Una composición según la reivindicación 1 , en la que dicho inhibidor es una ribozima que es capaz de disminuir la expresión de la proteína del Complejo III.
13. - Una composición según la reivindicación 1 , en la que dicho inhibidor es un ácido nucleico que codifica una ribozima que es capaz de disminuir la expresión de la proteína del Complejo III.
14. - Una composición según la reivindicación 13, en la que dicho ácido nucleico incluye un promotor.
15. - Una composición según la reivindicación 13, en la que dicho ácido nucleico está contenido dentro de un vector.
16. - Una composición según la reivindicación 1 , que comprende también un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral.
17. - Una composición según la reivindicación 16, en la que dicho miembro es TRAIL.
18. - Una composición según la reivindicación 16, en la que dicho miembro es el ligando Fas.
19. - Un método para tratar un tumor en un paciente, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente una composición que comprende un inhibidor que inhibe la actividad de una proteína del Complejo III y un vehículo.
20. - Un método según la reivindicación 19, en el que dicha proteína del Complejo III es Núcleo 1.
21 . - Un método según la reivindicación 19, en el que dicha composición comprende un inhibidor que inhibe la actividad de un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral.
22. - Un método según la reivindicación 21 , en el que dicho miembro es TRAIL.
23. - Un método según la reivindicación 21 , en el que dicho miembro es el ligando Fas.
24. - Un método según la reivindicación 19, que comprende también la administración de un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral.
25. - Un método según la reivindicación 21 , en el que dicho miembro es TRAIL
26. - Un método según la reivindicación 21 , en el que dicho miembro es el ligando Fas.
27. - Un método para fabricar una composición que comprende un inhibidor que inhibe la actividad de una proteína del Complejo III y un vehículo, que comprende mezclar dicho inhibidor con dicho vehículo.
28. - Un método según la reivindicación 27, en el que dicha proteína del Complejo III es Núcleo 1.
29. - Un método para fabricar una composición, que comprende un inhibidor que inhibe la actividad de una proteína del Complejo III, un vehículo, y un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral, que comprende mezclar dicho inhibidor, dicho vehículo, y dicho miembro.
30. - Un método según la reivindicación 29, en el que dicha proteína del Complejo III es Núcleo 1.
31 . - Un método para realizar un ensayo para determinar si un compuesto es un inhibidor de la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, que comprende comparar la viabilidad de (A) células que expresan dicha proteína del Complejo III que se han cultivado en presencia de un miembro de la superfamilia del TNF y que se han puesto en contacto con dicho compuesto, con la viabilidad de (B) células de la misma línea celular que también expresan dicha proteína del Complejo III, que se han cultivado en ausencia de un miembro de la superfamilia del TNF y que se han puesto en contacto con dicho compuesto.
32. - Un método según la reivindicación 31 , en el que dicha proteina del Complejo III es Núcleo 1.
33. - Un método según la reivindicación 32, en el que dichas células proceden de la línea celular HCT1 16 y han sido transfectadas con un transgén exógeno que codifica una proteína Núcleo 1.
34. - Un método según la reivindicación 33, en el que dicho transgén es humano.
35. - Un método según la reivindicación 32, en el que dichas células proceden de la línea celular HCT1 16 y han sido transfectadas con un transgén exógeno que codifica una porción de una proteína Núcleo 1.
36. - Un método según la reivindicación 31 , en el que dicho miembro de la superfamilia del TNF es TRAIL.
37. - Un método para realizar un ensayo para determinar si un compuesto es un inhibidor de la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, que comprende: (A) poner en contacto dicho compuesto con células que expresan dicha proteína y que se han cultivado en presencia de un miembro de la superfamilia del TNF durante un periodo de tiempo predeterminado; (B) poner en contacto el compuesto con células de la misma línea celular que . las anteriores que expresan dicha proteína y que se han cultivado en ausencia de un miembro de la superfamilia del TNF durante el mismo periodo de tiempo predeterminado; y (C) comparar la viabilidad de las células de (B) anterior con las células de (A) anterior.
38. - Un método según la reivindicación 37, en el que dicha proteína del Complejo III es Núcleo 1.
39. - Un método para realizar un ensayo para determinar si un compuesto es un inhibidor de la actividad de una proteína del Complejo III, que comprende: (A) cultivar células que expresan dicha proteína procedentes de una línea celular en presencia de un miembro de la superfamilia del TNF ; (B) cultivar células que expresan dicha proteína procedentes de la misma línea celular en ausencia de un miembro de la superfamilia del TNF; (C) poner en contacto dicho compuesto con las células de (A) anterior; (D) poner en contacto dicho compuesto con las células de (B) anterior; y (E) después de un periodo de tiempo predeterminado, comparar la viabilidad de las células de (B) anterior con la viabilidad de las células de (A) anterior.
40. - Un método según la reivindicación 39, en el que dicha proteína del Complejo III es Núcleo 1.
41. - Un método para realizar un ensayo para determinar si un compuesto es un inhibidor de la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, que comprende comparar la viabilidad de células que expresan dicha proteína y que se han puesto en contacto con un miembro de la superfamilia del TNF y dicho compuesto, con la viabilidad de células de la misma línea celular que expresan dicha proteína y que se han puesto en contacto con dicho compuesto pero no con un miembro de la superfamilia del TNF.
42. - Un método según la reivindicación 41 , en el que dicha proteína del Complejo III es Núcleo 1.
43. - Un método para realizar un ensayo para determinar si un compuesto es un inhibidor de la actividad supresora del TNF de una proteína del Complejo III, que comprende: (A) poner en contacto células que expresan dicha proteína procedentes de una línea celular, con un miembro de la superfamilia del TNF y dicho compuesto; (B) poner en contacto células que expresan dicha proteína procedentes de la misma línea celular, con dicho compuesto pero no con un miembro de la superfamilia del TNF; y (C) comparar la viabilidad de las células de (B) anterior con las células de (A) anterior. 44.- Un método según la reivindicación 36, en el que dicha proteína del Complejo úcleo 1. ESUMEN La presente invención se refiere a una composición que es útil en el tratamiento de un tumor, un método para fabricar dicha composición, y un método para utilizar dicha composición. La invención se refiere también a un método de ensayo para detectar inhibidores de la actividad de la proteína Núcleo 1 y/u otras proteínas del complejo respiratorio III de mítocondrias.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101537447B1 (ko) * 2013-09-23 2015-07-16 아주대학교산학협력단 폴리에테르 항생제를 유효성분으로 함유하는 뇌종양에 대한 항암활성 보조제
CN108379597B (zh) * 2018-03-15 2019-10-01 上海市第一人民医院 一种基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3486053T3 (de) 1983-10-20 2004-01-08 The Research Foundation Of State University Of New York Regulierung von Gen-Expression durch Translationshemmung unter Verwendung von m-RNS hinderndem Komplementär-RNS.
GB8424757D0 (en) 1984-10-01 1984-11-07 Pasteur Institut Retroviral vector
FR2573436B1 (fr) 1984-11-20 1989-02-17 Pasteur Institut Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
AU3069189A (en) 1988-02-05 1989-08-25 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Retroviral packaging cell lines and processes of using same
CA1339354C (en) 1988-09-01 1997-08-26 The Whitehead Institute For Biomedical Research Recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
CA2039921A1 (en) 1990-04-16 1991-10-17 Xandra O. Breakefield Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991018088A1 (en) 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
WO1992015680A1 (en) 1991-03-06 1992-09-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
AU3129993A (en) 1991-11-08 1993-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Localized oligonucleotide therapy
EP0673431A1 (en) 1992-12-03 1995-09-27 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
US5866755A (en) 1993-06-14 1999-02-02 Basf Aktiengellschaft Animals transgenic for a tetracycline-regulated transcriptional inhibitor
CA2144040A1 (fr) 1993-07-13 1995-01-26 Michel Perricaudet Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2715847B1 (fr) 1994-02-08 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
WO1996000286A1 (fr) * 1994-06-27 1996-01-04 Toagosei Co., Ltd. Compose d'acide nucleique antisens
FR2726285B1 (fr) * 1994-10-28 1996-11-29 Centre Nat Rech Scient Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation
FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1997-01-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
CA2372053C (en) * 1999-04-28 2008-09-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
US20070224201A1 (en) * 2002-10-02 2007-09-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP2007506441A (ja) * 2003-05-14 2007-03-22 エクセリクシス， インク． ＰＴＥＮ／ＩＧＦ経路のモディファイヤーとしてのＭＰＴＥＮｓおよび使用方法
US20060134653A1 (en) 2004-07-28 2006-06-22 Bayer Healthcare Llc Differential expression of genes in microsatellite instability

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