KR101537447B1 - 폴리에테르 항생제를 유효성분으로 함유하는 뇌종양에 대한 항암활성 보조제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리에테르 항생제를 유효성분으로 함유하는 뇌종양에 대한 항암활성 보조제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 트레일 내성을 보이는 뇌종양에 대하여 폴리에테르 항생제를 함께 투여하거나, 폴리에테르 항생제가 함께 포함하는 조성물로 제공되면 뇌종양에서 트레일 내성을 극복할 수 있기 때문에 본 발명에 따라 폴리에테르 항생제는 트레일의 뇌종양에 대한 항암활성을 증진시킬 수 있다.

Description

폴리에테르 항생제를 유효성분으로 함유하는 뇌종양에 대한 항암활성 보조제{Anti-cancer supplement agent comprising polyether antibiotics for gliomas}

본 발명은 종양세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 트레일(TRAIL)이 악성 뇌종양에 대한 저항성을 나타내므로 폴리에테르 항생제를 항암활성 보조제로 함께 투여하여 뇌종양에 대한 트레일(TRAIL) 저항성을 극복하고 항암효과를 유도한 뇌종양 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

트레일은 종양괴사인자(TNF)의 일종으로 종양세포의 자가 세포사멸을 유도하는 리간드로서 세 개의 트레일 분자가 구조적으로 결합된 삼량체 구조이며, 이러한 삼량체 구조의 트레일이 종양세포의 표면에 있는 데쓰 수용체(death receptor)에만 결합하여 종양세포의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 트레일은 과다 활성화된 면역세포의 사멸을 유도하지만 정상세포에는 영향을 주지 않기 때문에 효과적인 종양치료법이다.

그러나 뇌종양을 비롯한 많은 악성 고형암에서 트레일 내성이 나타나고 있으며, 트레일을 지속적으로 사용하면 처음에 트레일 감수성을 보이던 암세포주에서도 트레일 내성을 가지는 것으로 밝혀졌다.

폴리에테르 이온 운반 항생제는 세포의 양이온 금속 종 세포막의 투과성을 수정하여 표적 세포에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며 폴리에테르 이온 항생제로는 모넨신, 살리노마이신, 나라신 그리고 라살로시드 A와 같은 항생제가 있다.

그중 모넨신은 스트렙토마이세스 신나미넨시스(Streptomyces cinnaminensis)의 발효에 의해 생산되는 폴리에테르계의 이온 운반 항생물질로서 콕시듐병 치료제로 개발되었으나 젖소의 우유 생산 효율을 증진시키는 사료 내 첨가물로 더 많이 사용되고 있다.

한편, 한국공개특허 제2005-0085914호에서는 암 및 기타 질병의 치료 및 관리를 위한 면역 조절화합물로 트레일이 인코딩된 폴리펩티드를 이용하는 방법에 대하여 개시하고 있다. 그러나 상기 특허는 트레일이 다발성 골수종과 흑색종, 바이러스 감염증 치료에 효과를 보이는 반면, 뇌종양에 있어서는 항암 효과를 입증하지 못하고 있으며, 본 발명의 기술인 트레일 다재내성 극복에 대한 방법은 개시하지 못하고 있다.

그러므로, 뇌종양에서 선택적으로 종양세포의 세포사멸을 유도하는 트레일의 내성을 극복하여 암세포 증식을 막고 세포사멸을 촉진시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하여 본 발명자는 안전하고 효과적으로 트레일 민감성을 회복하기 위한 방법을 연구하였다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 뇌종양에 트레일과 폴리에테르 이온운반 항생제를 포함하는 조성물을 병용투여 함으로써 뇌종양의 트레일 내성을 극복하여 정상세포에는 영향을 주지 않고 뇌종양 세포의 자가 세포사멸을 유도하여 트레일의 항암활성을 증가시킬 수 있는 폴리에테르 항생제가 함유된 뇌종양 활성보조제에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리에테르 항생제를 유효성분으로 함유하는 뇌종양에 대한 항암활성 보조제를 제공한다.

삭제

상기 폴리에테르 항생제는 모넨신, 니제리신, 살리노마이신, 나라신 및 라살로시드 A로 이루어진 군에서 선택 될 수 있다.

상기 폴리에테르 항생제는 트레일의 항암활성을 증진시키는 뇌종양에 대한 항암활성 보조제로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 폴리에테르 항생제와 트레일를 유효성분으로 함유하는 뇌종양 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 약학조성물은 트레일의 1~50 중량% 및 폴리에테르 항생제 50~99 중량%를 포함할 수 있다.

삭제

또한, 본 발명은 폴리에테르 항생제와 트레일를 뇌종양 세포에 병용투여 하여 암세포 사멸을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 뇌종양세포에서 트레일를 단독으로 처리할 경우와 달리 트레일과 폴리에테르 항생제를 함께 포함하는 조성물 또는 이들을 병용 투여하면 트레일에 내성을 가지는 뇌종양 세포의 사멸이 일어난 반면, 정상세포에서는 세포독성을 나타내지 않았기 때문에 폴리에테르 항생제는 안전하면서 효과적인 트레일의 뇌종양 치료 또는 예방효과를 증진시키는 항암보조제로서 유용하게 사용될 것이다. 또한, 폴리에테르 항생제와 트레일을 함께 포함한 조성물 또는 병용 투여는 뇌종양의 항암 치료 효과를 증진시킬 수 있다.

도 1은 신경교종세포에서 모넨신과 트레일의 단독 및 병합 처리 효과를 나타낸 것으로 도 1a는 모넨신과 트레일을 농도별 단독처리 및 병합처리 후 세포 생존도를 나타냈으며 도 1b는 모넨신과 트레일을 병합처리 시 아이소볼로그램 분석 결과이다. 도 1c는 U251MG과 U87MG 세포에 모넨신과 트레일 단독 및 병합 처리 후 시간대별 세포추출물을 이용한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 1d는 카스파제 억제제들을 미리 처리한 세포에 모넨신(0.25 μM)과 트레일(100 ng/ml)을 병합처리하고 24시간 후 세포생존도를 분석한 것이다.
도 2은 모넨신이 유도하는 ER 스트레스를 나타낸 것으로 도 2a는 모넨신을 처리한 군과 대조군으로 나누어 16시간 후 각각의 항체에 대한 면역세포화학(ICC)을 진행한 결과이며 도2b는 U251MG 와 U87MG 세포에 모넨신을 각 시간 동안 처리한 후의 세포 추출물로 웨스턴 블롯을 진행한 결과이다. 도 2c는 모넨신을 16시간 처리한 군과 대조군의 KDEL, 인산화된 elF2α, ATF4 그리고 CHOP에 대한 면역세포화학을 진행한 결과이다.
도 3은 CHOP에 의해 증가된 DR5 수용체로 인한 트레일 매개 세포사멸을 나타낸 것으로 도 3a는 모넨신(0.25 μM)을 20시간 처리한 군과 대조군의 세포표면의 DR5를 유동세포계수법으로 확인한 결과이며 도 3b는 0.25 μM 모넨신을 처리한 세포의 각 시간대별 세포추출물로 웨스턴 블롯을 진행한 결과이다.
또한 도 3c는 0.25 μM 모넨신을 처리한 U251MG세포에서 전체 RNA를 추출하여 역전사 PCR을 진행한 결과이다. 도 3d는 재조합 플라스미드를 이용하여 U251MG세포를 형질 전환시키고 0.25 μM 모넨신을 처리하고 12시간 후 루시퍼레이즈 활성 분석을 진행한 결과이다.
도 3e는 U251MG세포에 DR5를 차단하는 키메라 항체를 처리한 군과 처리하지 않은 군에 모넨신(0.25 μM)과 트레일(100 ng/ml)을 병합 처리하고 24시간 후에 세포 생존도를 나타낸 것이며, 도 3f는 U251MG세포에 형광 올리고뉴클레오티드와 DR5 siRNA로 형질 전환시킨 세포에 모넨신(0.25 μM)과 트레일(100 ng/ml)을 병합 처리하고 24시간 후에 DR5의 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과와 DR5 수용체 감소에 따른 모넨신 유도 트레일 매개 세포사멸의 효과를 나타낸 결과이다.
도 3g는 형광 올리고뉴클레오티드와 CHOP siRNA로 형질 전환시킨 U251MG 세포에 CHOP와 DR5 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯과 CHOP 발현 감소에 따른 모넨신 유도 트레일 매개 세포사멸의 효과를 나타낸 세포생존도이다.
도 4는 프로테아좀에 의한 c-FLIP 감소에 따른 트레일 매개 세포사멸에 대한 모넨신 민감성을 나타낸 것으로 도 4a는 모넨신(0.25 μM)을 처리한 U251MG과 U87MG 세포의 시간대별 추출물로 웨스턴 블롯을 진행한 결과이며 도 4b는 모넨신을 처리한 세포에서 전체 RNA를 추출하여 역전사 PCR을 진행한 결과이다.
도 4c는 MG132를 미리 처리한 세포에 16시간 모넨신을 처리한 실험 군과 처리하지 않은 대조군의 세포추출물에 c-FLIP를 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4d 과발현된 c-FLIP(L)과 c-FLIP(S)를 나타낸 웨스턴 블롯 결과와 c-FLIP(L)과 c-FLIP(S) 발현 플라스미드를 형질전환한 후 모넨신(0.25 μM)과 트레일(100 ng/ml)을 병합 처리하고 24시간 후 세포생존도를 확인한 결과이다.
도 5는 다양한 폴리에테르 이온운반 항생제가 신경교종 세포에서 트레일 매개 세포사멸의 민감성을 나타낸 것으로 도 5a는 다양한 폴리에테르 이온운반 항생제의 화학구조이다. 도 5b는 폴리에테르 항생제와 트레일을 U251MG 세포에 표시된 농도의 단독 또는 병합처리 시 효과를 알아보기 위한 세포생존도를 나타낸 것이다.
도 5c는 다양한 폴리에테르 이온운반 항생제와 트레일을 단독 또는 병합 처리한 U251MG 세포의 시간대별 추출물로 카스파제-3과 PARP에 대한 웨스턴 블롯을 진행한 결과이다.
도 6은 다양한 폴리에테르 이온운반 항생제가 공통적으로 유도하는 ER 스트레스와 DR5 수용체 증가와 c-FLIP의 감소를 나타낸 것으로 도 6a와 도 6b는 다양한 폴리에테르 이온운반 항생제를 처리한 U251MG 세포의 시간대별 추출물로 웨스턴 블롯을 진행한 결과이며, 도 6c는 U251MG 세포에 다양한 폴리에테르 이온운반 항생제를 처리하고 16시간 후 세포추출물로 DR5와 c-FLIP 단백질의 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과이다.
또한 도 6d는 모넨신을 포함한 폴리에테르 이온운반 항생제와 트레일 병용처리가 유도하는 세포사멸 신호전달과정을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리에테르 항생제를 유효성분으로 포함하는 뇌종양에 대한 항암활성 보조제를 제공한다.

상기 폴리에테르 항생제는 트레일의 뇌종양에 대한 내성을 극복하여 항암활성을 증진시키는 뇌종양에 대한 항암활성 보조제이다.

상기 폴리에테르 항생제는 모넨신, 니제리신, 살리노마이신 및 라살로시드 A로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

삭제

또한, 본 발명은 트레일과 폴리에테르 항생제를 유효성분으로 함유하는 뇌종양 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 트레일의 1~50 중량% 및 폴리에테르 항생제 50~99 중량%를 포함할 수 있다.

이때, 본 발명에 따른 약학조성물에서 상기 트레일이 상기 함량범위를 벗어나 과량으로 함유되면 악성 빈혈, 구역, 식욕 부진, 불안, 수면 장애, 호흡 곤란, 두통, 피부 발진, 간세포에 일부 독성을 나타내는 문제가 야기될 수 있고, 소량으로 함유되면 약제 효과 부족의 문제가 야기될 수 있다.

또, 본 발명에 따른 약학조성물에서 상기 폴리에테르 항생제가 상기 함량범위를 벗어나 과량으로 함유되면 복통, 설사, 구역, 피부 발진, 수면 장애, 아연 결핍, 발작 등의 문제와 심장혈관 질환 유도가 야기될 수 있고, 소량으로 함유되면 약제 효과 부족의 문제가 야기될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 트레일 0.05 mg/day 내지 10.0 mg/day 및 폴리에테르 항생제 0.4 mg/day 내지 10.0 mg/day의 양을 일일 1회 내지 일일 수회 분복 투여할 수 있다.　

또한, 이러한 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물을 구성하는 트레일과 폴리에테르 항생제는 이미 다른 의학적 용도에 처방되고 있어 안전성이 확보되어 있는 물질이다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 트레일과 폴리에테르 항생제를 뇌종양 세포에 병용투여 하여 암세포 사멸을 증가시키는 방법을 제공한다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

하기의 실험예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

< 실험예 >

1. 화학물질 및 항체

모넨신, 니게리신, 살리노마이신, 바필로마이신 A, 클로로퀸(CQ)과 하이드록시 클로로퀴(HCQ)은 시그마(Sigma Chemical Corporation)에서 구입하였으며, 나라신과 라살로시드 A는 산타크루즈(Santa Cruz Biotechnology)에서 구입하였다.

재조합된 사람 트레일/아포2 리간드 (the non-tagged 19 kDa protein, amino acid 114-281)는 KOMA Biotech (Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 칼세인 아세톡실메틸 에스터(calcein-AM)와 에티듐 브로다이머(EthD-1)는 인비트로젠(Invitrogen , Carlsbad, CA)에서 구입하였다.

카스파제 억제제 벤질록시-카르보닐-발-알라-Asp-(OMe)-플루오로메틸 케톤(z-VAD-fmk), 벨질록시-카르보닐-아이소-글루-(OMe)-티르-Asp-(OMe)- 플루오로메틸 케톤(z-IETD-fmk)과 벤질록시-카르보닐-Asp-(OMe)- 글루-(OMe)-발-Asp-(OMe)-플루오로메틸 케톤(z-DEVD-fmk)은 알엔디 시스템에서 구입하였다(Minneapolis, MN). 항-카스파제-8, 카스파제-3, 카스파제-4, 단백질 다이설파이드 이성질화효소 (PDI), XIAP 와 KDEL는 Stressgen(British Columbia, Canada)에서 구입하여 사용하였으며; 항-비드(Bid), 항-인산-p65, 항-p65, 항-인산-eIF2α, 항-eIF2α와 항-CHOP은 Cell Signaling Technology(Beverly, MA)에서 구입하여 사용하였다; 항-폴리 (ADP ribose) 폴리머라이즈 (PARP) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)를 구입하여 사용하였다; 항-절개된 PARP (Epitomics, Burlingame, CA), 항-DR5 (KOMA Biotech); 항-ATF4, 항-Bcl-2, 항-Bcl-xL과 항-DR4 (Santa Cruz Biotechnology)를 각각 구입하여 사용하였다; 항-c-FLIP (Alexis, San Diego, CA); 항-Flag (sigma); 항-α-튜불린 (Calbiochem, San Diego, CA)를 각각 구입하여 사용하였다; 호래디쉬 퍼옥시다이즈(HRP)-결합된 항-래빗 IgG와 HRP-결합된 항-마우스 IgG HRP는 인비트로젠에서 구입하여 사용하였다.

2. 신경교종세포와 사람 정상세포 배양

사람 악성 신경교종세포인 U251MG, U87MG, A172, T98G와 U251N세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY)에 10% 태아소혈청과 항생제(Gibco BRL, Life Technologies)를 넣은 배지에 5% 이산화탄소와 37℃에서 배양하였다.

사람 정상 세포는 DMEM배지에 고함량 글루코스와 10% 태아소혈청과 20 mg/ml 겐타마이신을 첨가하여 2주마다 계대 배양하였으며 5 이하로 계대 배양된 세포를 사용하여 실험을 진행하였다.

3. 세포생존도 측정

세포의 생존은 2μM 칼세인-AM(calcein-AM)과 4μM 에티듐-1(EthD-1)의 이중 표시로 측정되었다. 칼세인 양성 생존 세포와 EthD-1 양성 죽은 세포를 형광 현미경(Axiovert 200M, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 측정하였다.

4. 면역 블로팅

세포를 PBS로 세척 후 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 시료 완충용액[62.5 mM 트리스 (pH 6.8), 1% 소디움 도데실 설페이트, 10% 글리세롤과 5%β-멀캅토에탄올]을 넣고 5분간 끓여 용해시킨다. 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동 후 임모빌론 멤브레인(Millipore, Bredford, MA)에 옮긴 후 5% 탈지유에 1시간 동안 블로킹시킨 후 멤브레인에 1차 항체를 2시간 동안 반응시키고 TNET 버퍼[50 mM 트리스-Cl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM 에틸렌다이아민테트라아세틱 산, 0.05% Tween20]로 3번 세척하였다. 그 후에 HRP가 결합된 안티-래빗 또는 안티-마우스로 1시간 동안 반응시켰으며 단백질 밴드가 두드러질 수 있도록 화학발광제를 이용하였다.

5. 면역세포화학(Immunocytochemistry, ICC)

약물이 처리된 세포를 아세톤/메탄올 (1:1)로 5분 동안 -20℃에서 고정시키고 5% 정상 말 혈청이 들어있는 PBS로 30분 동안 블로킹시켰다. 고정된 세포에 1차 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.

1차 항체로 항-사이토크롬C 산화효소 서브유닛 IV (COX IV, 1:500, 래빗; GeneTex, Irvine, CA), 항-리소좀 관련 세포막 단백질-2 (LAMP2, 1:200, 마우스; Santa Cruz Biotechnology), 항-골지체 인산화단백질 2 (GOLPH2, 1:500, 래빗; GeneTex), 과 항-PDI (1:500, 래빗; Stressgen), 항-KDEL (1:500, 마우스; Stressgen), 항-인산-eIF2α (1:100, 래빗; Cell Signaling), 항-ATF4 (1:500, 래빗; Santa Cruz Biotechnology) 와 항-CHOP (1:500, 마우스; Cell Signaling)을 PBS에 희석하여 사용하였고 반응 후 PBS로 세 번 세척 후 형광염료인 안티-래빗과 안티-마우스 Alexa Fluor 594(1:500; Molecular Probes)로 1시간 동안 반응시켰다.

슬라이드 글래스에 프로롱 골드 안티페이드 마운팅(ProLong Gold antifade mounting )시약 (Molecular Probes)으로 형광염료로 염색된 세포를 올려놓고 형광 현미경(Axiovert 200M, Carl Zeiss)으로 시각화 하였다.

6. DR5 유동세포계수법(Flow cytometry)

세포표면의 DR5를 분석하기 위하여 1차 항체로 고트(goat) 항-사람 DR5로 스테이닝하고 그 후에 플루오레세인이소티오시안산염이 결합되어 있는 래빗 항-고트 IgG (Sigma)를 스테이닝하였는데, 먼저 U251MG 세포(1×10⁶)를 항-DR5항체가 포함되어 있는 PBS 200㎕에 아이스에서 30분간 스테인시킨다. 그렇게 인큐베이션 후에 세포를 두 번 반복하여 세척하고 플루오레세인이소티오시안산염이 결합되어 있는 래빗 항-고트 IgG (Sigma)를 아이스에서 30분간 반응시킨다.

그 후에 PBS로 세척하고 형광이용세포분류기(fluorescence-activated cell sorting; Becton Dickinson and Co.)를 사용하여 세포사멸 수용체의 발현을 확인한다.

7. 역전사 PCR 분석

전체 RNA는 U251MG세포에서 트라이졸을 이용하여 추출하였으며 역전사 PCR(RT-PCR) 제조사(Takara Shuzo Co., Otsu, Shiga, Japan)의 프로토콜로 진행되었다. cDNAs는 Taq DNA 중합효소(Takara Shuzo Co.)를 이용하여 94℃에서 30분, 60℃에서 30초 그리고 72℃에서 1분 PCR조건으로 증폭하였으며, 최종 분석을 위한 조건으로 메신저 RNA(mRNA)의 증폭은 0.25μM 모넨신에 대한 지수 증폭단계의 중간으로 선택되어졌다.

글리세르알데하이드 3-인산탈수효소(GAPDH)에 대한 정방향 프라이머(Forword primer)로 5′-CGGCCATCACGCCCACAGTTT-3′과 역방향 프라이머(Reverse primer) 5′-CGGCCATCACGCCCACAGTTT-3′(GAPDH의 310bp 부분에 해당)을 사용하였으며, CHOP의 정방향 프라이머는 5′-CAACTGCAGAGATGGCAGCTA-3′과 역방향 프라이머 5′-CTGATGCTCCCAATTGTTCAT-3′(CHOP의 536bp 부분에 해당)을 사용하였다.

또한 사람 DR5의 정방향 프라이머는 5′-GTCTGCTCTGATCACCCAAC-3′과 역방향 프라이머 5′-CTGCAAACTGTGACTCCTATG-3′(DR5의 424bp 부분에 해당)을 사용하였으며, c-FLIP(L)의 정방향 프라이머로는 5′-CGGACTATAGAGTGCTGATGG-3′과 역방향 프라이머 5′-GATTATCAGGCAGATTCCTAG-3′(c-FLIP(L)의 655bp부분에 해당)을 사용하였고, c-FLIP(S)의 정방향 프라이머는 5′-CGGACTATAGAGTGCTGATGG-3′과 역방향 프라이머 5′-AGATCAGGACAATGGGCATAG-3′(c-FLIP(S) 561bp 부분에 해당)을 사용하였다.

PCR 조건은 1단계 94℃에서 30초; 2단계는 CHOP의 경우 52℃에서 45초, DR5는 68℃에 30초, c-FLIP(L)는 56℃에 30초, c-FLIP(S)는 55℃에 30초, GAPDH는 60℃에 30초이며; 3단계는 72℃로 1분 30초 이후에 72℃에 10분까지 확장 가능하다.

PCR 반응생성물은 2% 아가로즈겔에 에티디움 브로마이즈로 밴드를 확인하였다.

8. 플라스미드 형질 전환 과 루시퍼레이즈 실험

DR5 프로모터 염기서열(-605/+3)이 포함되어 있는 pDR5-WT에 정방향 프라이머로 mCHOP (5′-CTTGCGGAGGAGGTAGTTGACGA 와 5’-TCGTCAACTACCTCCTCCGAAAG)를 이용하여 두 단계 PCR 방법으로 CHOP결합 부위를 변이시킨 돌연변이체를 만들었다.

이 변이부분을 포함한 플라스미드를 pDR5-mCHOP라 명명했다.

또한 사람 c-FLIP(L)와 c-FLIP(S)이 엔코딩 되어있는 cDNA는 pCA-FLAG-hFLIP(L)플라스미드와 pCA-FLAG-hFLIP(S)플라스미드로 PCR증폭하였다.

c-FLIP(L)와 c-FLIP(S) cDNA 조각은 KpnI와 XhoI 제한효소로 pcDNA 3.1(+) 벡터(Invitrogen)안의 서브클론으로 절단되고 소화되어 졌으며, 그 생성물은 염기서열을 통해 확인되었다.

형질전환시키기 위해 플라스미드와 3×10⁵ 세포를 60 mm 디쉬에 하룻밤 동안 배양하였고 리포펙타민 플러스 시약을 사용하여 (Invitrogen)제조업체의 방법에 따라 각각 루시퍼레이즈 리포트를 구성하고 있는 1㎍로 형질전환되었다.

24시간 배양된 형질전환세포는 모넨신을 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 루시퍼레이즈 활성을 분석하였는데 제조사의 프로토콜(Promega, Madison, WI)로 진행하였다.

9. 아이소볼로그램 분석

U251MG, U87MG, A172, T98G와 U251N 세포에서 트레일과 모넨신의 단독 또는 병합처리 시 효과 확인과 각 화합물의 효과적인 농도를 결정하기 위하여 아이소볼로그램 분석을 진행하였다. 모넨신과 트레일의 상호작용은 전형적인 아이소볼로그램에 따른 조합 지수(CI)를 측정하여 정량하였다.

아이소볼로그램 정량법은 CI = (D)₁/(Dx)₁ + (D)₂/(Dx)₂로 여기서 (Dx)₁과 (Dx)₂는 모넨신과 트레일이 효과를 나타내는데 필요한 개별 용량이며, (D)₁과 (D)₂는 모넨신과 트레일을 병합처리 하였을 때 동등한 효과를 나타낼 수 있는 용량을 나타낸다. 이러한 분석을 통하여 두 약물의 병합효과를 CI < 1은 상승작용, CI = 1은 가중, CI > 1 길항작용으로 나타내었다.

10. 통계분석

모든 데이터는 적어도 3번의 반복 실험 결과를 ±표준편차(SD)로 나타내었으며, t-테스트 통하여 약물 처리군과 대조군간의 세포 생존도 차이를 평가하였다.

여러 그룹의 결과는 본펠로니 다중비교법(Bonferroni multiple comparison test)에 따라 일원 분산 분석하였으며, P < 0.05 을 의미 있는 값으로 보았다.

<실시예 1>

1. 모넨신의 신경 교종세포에서 트레일 매개 세포사멸을 유도 확인

폴리에테르 항생제인 모넨신이 다양한 신경 교종 세포에서 트레일 매개 세포사멸에 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 진행했다.

신경 교종 세포 U251MG, U87MG, A172, T98G, U251N 과 정상세포에 트레일과 폴리에테르 항생제 모넨신을 도 1a에 표시된 농도로 24시간 동안 단독 또는 병합 처리하였고 칼세인-아세톡시메틸 에테르와 에티듐 동종이중체-1을 이용하여 세포 생존도를 조사하였다.

U251MG와 U87MG세포는 트레일 단독 처리 시 100 ng/mL에서도 높은 저항성을 보였으며, A172와 T98G는 트레일 단독 처리에는 보통의 민감성을 나타냈고 U251N은 상당한 민감성을 나타냈다. 또한 모넨신 0.5μM을 단독 처리한 경우 모든 신경 교종세포에서 저항성을 나타냈으나, 트레일과 함께 병합 처리한 경우 트레일 매개 세포사멸을 향상시켰다. 또한 도 1b와 같이 아이소블로그램 분석에서도 모넨신과 트레일을 병합처리 한 경우 모든 세포에서 트레일 시너지를 나타내며 트레일 매개 세포사멸이 유도되었음을 알 수 있었다.

2. 카스파제 활성을 통한 모넨신의 트레일 매개 세포사멸 확인

신경 교종 세포 U251MG와 U87MG에 0.25μM 모넨신과 100 ng/mL 트레일을 단독 또는 병합처리 한 후 0, 12, 24시간의 세포에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯을 진행하였다. 또한 U251MG와 U87MG에 카스파제의 특이적 억제를 유도하는 z-VAD-fmk(pan-caspase inhibitor), z-DEVD-fmk(caspase-3 inhibitor), z-IETD-fmk (caspase-8 inhibitor) 억제제를 미리 처리한 후 0.25 μM 모넨신과 100 ng/mL 트레일을 단독 또는 병합처리하고 24시간 후 칼세인-아세톡시메틸 에테르와 에티듐 동종이중체-1을 이용하여 세포 생존도를 확인하였으며 통계 분석을 진행하였다.

도 1c은 웨스턴 블롯 결과로 모넨신 0.25μM을 단독으로 처리한 경우 카스파제-8 또는 카스파제-3의 단백질 가수분해가 유도되지 않았음을 확인하였다.

반면, 트레일 100 ng/mL을 단독 처리한 경우 프로카스파제-3의 부분 절단을 유도하였고 그 결과를 20 kDa 부분에서 확인할 수 있었다. 그러나 17 kDa 부분에서는 더 이상의 활성 소단위체를 확인할 수 없었다. 또한 트레일 단독 처리 시 카스파제-8, 비드(Bid, 카스파제-8의 특이적 기질)의 감소 또는 PARP(a classical substrate of caspase-3)의 절단을 유도하지 못하였음을 확인하였다. 반면, 모넨신과 트레일을 병용 처리 한 경우 카스파제-3의 17kDa 부분에서 밴드를 확인할 수 있었으며, 카스파제-8, 비드, PARP와 카스파제-3의 감소 및 절단을 효과적으로 유도하였음이 확인되었다.

또한, 도 1d를 참조하면 z-VAD-fmk를 미리 처리한 U251MG와 U87MG 세포는 모넨신과 트레일 병합 처리에도 거의 완벽하게 세포사가 차단되었으며, z-IETD-fmk와 z-DEVD-fmk를 처리한 경우에도 모넨신과 트레일 병합 처리 시 대부분의 세포사가 억제되었다.

이러한 결과들을 종합하여 보면, 모넨신은 신경 교종세포에서 카스파제 매개성 세포사멸을 유도하는 트레일 활성을 회복시킬 수 있음을 확인하였다.

3. 모넨신 자가소화작용 억제기능의 트레일 매개 세포사멸 유도 확인

모넨신은 리소좀의 pH를 올려 자가소화작용을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이러한 모넨신이 유도하는 자가소화작용 억제가 트레일 매개 세포사멸 향상에 영향을 미치는지를 살펴보기 위한 실험을 진행하였다.

먼저, 리소좀 기능 억제를 통하여 자가소화작용을 억제하는 다른 물질에서도 트레일 매개 세포사멸이 민감성을 나타내는지 알아보기 위하여, 액포형 ATPase 억제제인 바필로마이신 A(bafilomycin A)와 리소좀 성향 작용제인 클로로퀸(CQ) 및 클로로퀸 유도체(HCQ)를 처리해 본 결과 CQ와 HCQ는 트레일 매개 세포사멸을 유도하지 못하였으며, 바필로마이신 A는 트레일 매개 세포사멸을 향상시켰으나 모넨신 보다는 매우 적은 정도의 수준이었다. 본 발명가는 상기 연구 결과에서 자가소화작용억제 활동의 차이는 자가소화작용 기질 단백질과 p62, NBR1(브라카1 유전자와 이웃한 유전자)과 관련 있음을 평가하였고 이러한 연구 결과는 바필로마이신 A, CQ 와 HCQ가 모넨신보다 현저하게 LC3Ⅱ형태의 p62와 NBR1의 축적을 유도하였으며 주요 리소좀 단백질 분해효소인 카펩신D(28kDa)의 성숙형태에 대한 단백질 분해 처리가 제 기능을 하지 못하였음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 바필로마이신 A, CQ 및 HCQ의 자가소화작용 억제활성은 모넨신의 자가소화작용 억제활성보다 강한 것을 확인할 수 있었으며 모넨신의 자가소화억제 활성은 트레일 매개 세포사멸을 유도하는 역할에 중요하게 작용하지 않음을 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

1. 모넨신에 의해 유도되는 ER 스트레스와 CHOP 매개 DR5의 분비량 증가 확인

U251MG 세포를 커버슬립에 분할하고 한쪽에는 0.25μM의 모넨신을 처리하고 한쪽에는 처리하지 않았다. 그리고 각각의 세포 소기관 마커 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역세포화학(immunocytochemistry, ICC)를 수행하였다. 소기관 마커 단백질 항체로 COX IV (미토콘드리아), GOLPH2 (골지체), PDI (소포체, ER)와 LAMP2 (리소좀)을 사용하였다.

그 결과 도 2a와 같이, 모넨신 처리에 의해서 미토콘드리아의 섬유상 형태 차이와 세포핵들 주위의 리소좀의 기능적 형태 차이는 눈에 띄지 않았다. 그러나 골지체와 ER의 경우 모넨신을 처리하지 않은 U251MG 세포에서는 전형적인 핵주위 연결 모습을 확인할 수 있었으나, 모넨신을 처리한 세포의 골지체는 응집과 확산이 확인되었고 모넨신 처리가 ER 마커 단백질 PDI의 발현을 뚜렷하게 향상시켰다.

또한 PDI 증가에 따른 모넨신의 ER 스트레스 유도를 확인하기 위하여 ER 스트레스와 연관된 다른 단백질의 발현정도를 확인해 보았다. U251MG 세포와 U87MG 세포에 모넨신 0.25μM을 처리하고 0, 12, 24시간마다 세포 단백질을 추출하여 ER 스트레스와 관련된 단백질을 웨스턴 블롯하여 확인하였으며 0.25μM 모넨신을 처리한 군과 처리하지 않은 군의 U251MG 세포에 16시간 후 ICC를 진행하였다.

그 결과 도 2b에서처럼 KDEL(소포체 잔류서열), 인산화된 eIF2α, ATF4, PDI와 CHOP의 발현이 뚜렷하게 증가되었으며 모넨신이 프로카스파제-4의 절단을 유도하는 것을 확인하였다. 반면, 도1c와 같이 프로카스파제-8과 프로카스파제-3의 절단은 일어나지 않았다.

또한 ER 스트레스와 관련된 단백질의 발현정도를 ICC로 확인한 도 2c에서 모넨신 0.25μM을 처리한 U251MG 세포에서 역시 KDEL(소포체 잔류서열), 인산화된 eIF2α, ATF4, PDI와 CHOP의 발현이 뚜렷하게 증가되었음이 확인되었다. 더욱이 세포핵에서 ATF4와 CHOP의 발현을 극적으로 증가시켰는데 이를 통하여 모넨신이 ER 스트레스를 유도한다는 것이 확인되었다.

트레일은 세포표면의 DR5와 관련되어 세포사멸신호를 유도하는 것으로 알려져 있는데 대표적인 ER 스트레스 유도물질인 탭시가긴(thapsigargin)과 튜니카마이신(tunicamycin)은 CHOP 매개 DR5 발현증가를 통하여 트레일 매개 세포사멸을 향상시킨다고 보고되어있다. 그래서 본 발명가는 U251MG 세포에 모넨신 0.25μM 처리하고 20시간 후 모넨신을 처리하지 않은 U251MG 세포군과 함께 세포표면에 DR5 발현여부를 유동세포계수법(Flow cytometry, FACS)으로 확인하였고 CHOP와 DR5의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯도 진행하였다. 웨스턴 블롯은 도 3b의 시간대별로 각 세포에서 단백질을 추출하여 확인하였으며, α-튜블린을 대조군으로 함께 로딩하였다. 또한 각 시간대별로 모넨신을 처리한 U251MG 세포에서 전체 RNA를 분리하여 CHOP, DR5 및 GAPDH의 RT-PCR 분석을 진행하였다.

먼저, FACS결과인 도 3a에서 확인 할 수 있듯이 DR5의 발현이 증가될수록 트레일 매개 세포사멸의 민감성이 증가되었다. 또한 웨스턴 블롯 결과인 도 3b를 통하여 U251MG 세포와 U87MG세포 모두에서 CHOP 단백질 발현의 증가가 모넨신에 의해 유도된 DR5의 발현 증가보다 앞서 진행되었음을 확인하였고 도 3c의 RT-PCR 분석결과로부터 모넨신을 처리한 U251MG 세포에서 CHOP와 DR5의 mRNA가 모두 증가 되는 것을 확인하였다.

그래서 모넨신이 유도하는 DR5 프로모터의 전사활성화와 CHOP의 직접적인 관련성을 확인하기 위하여 이미 알려져 있는 CHOP결합 부위(pDR5-605)가 포함되어진 DR5 프로모터 염기서열과 CHOP결합 부위가 변이된 DR5 프로모터(pDR5-605-mCHOP) 염기서열로 루시퍼레이즈 분석(luciferase assay)을 진행하였다.

U251MG 세포에서 분리한 CHOP결합 부위 pDR5-605와 CHOP결합 부위가 변이된 pDR5-605-mCHOP에 0.25μM의 모넨신을 12시간 동안 처리하고 용해 후에 루시퍼레이즈분석을 3번 진행하여 그 평균값을 도 3d로 나타내었다. 그 결과 모넨신 처리로 DR5 프로모터의 전사활성화가 증가됨을 확인하였으나 CHOP결합 부위가 변이된 실험군에서는 전사활성화가 나타나지 않았음이 확인되었다.

<실시예 3> CHOP 매개 DR5 발현 증가에 따른 모넨신에 의한 트레일 매개 세포사멸

트레일 매개 세포사멸에 대한 세포 민감화에서 모넨신에 의해 유도된 DR5 발현 증가가 기능적으로 유의성이 있는지 확인하기 위해 DR5/FC 키메라 단백질과 DR5 siRNA를 이용하였다. 먼저 특이적 차단을 하는 키메라 항체인 DR5/FC를 처리한 U251MG 세포군과 처리하지 않은 U251MG 세포군에 0.25μM 모넨신과 100ng/ml 트레일을 24시간 처리하고 칼세인-아세톡시메틸 에테르와 에티듐 동종이중체-1을 이용하여 세포생존도를 3번 분석한 평균값이 도 3e이다.

또한 대조군으로 형광 올리고타이드(siF-Oligo)를 처리한 U251MG 세포군과 DR5 siRNA(AUCAGCAUCGUGUACAAGGUGUCCC, invitrogen)를 처리한 U251MG 세포군에 0.25μM 모넨신과 100 ng/ml 트레일을 24시간 처리하고 그 세포 추출물에서 DR5의 발현억제를 확인하기 위해서 웨스턴 블롯을 진행하였으며 칼세인-아세톡시메틸 에테르와 에티듐 동종이중체-1을 이용하여 세포생존도를 3번 분석 후 평균값을 구하였다.

또한 형광 올리고타이드를 처리한 U251MG 세포군과 CHOP에 대한 siRNA (UUCACCAUUCGGUCAACAGAGCUC, invitrogen)를 24시간 동안 처리한 U251MG 세포군에 0.25μM 모넨신과 100ng/ml 트레일을 추가로 처리하고 그 세포 추출물을 준비하였다. 그리고 그 세포 추출물로 CHOP와 DR5의 확인을 위한 웨스턴 블롯을 진행하였으며 세포생존도를 확인하였다.

그 결과 도 3e에 나타난 바와 같이, DR5/FC 키메라 단백질이 처리된 U251MG 세포군에서 모넨신과 트레일에 의한 세포사멸이 억제되었고 도 3f에서는 DR5 siRNA에 의한 DR5 발현이 억제된 세포에서도 세포사멸이 억제된 것을 확인 할 수 있었다. 도 3g의 결과로 siRNA에 의해 CHOP 발현이 억제되면 모넨신에 의한 DR5 단백질의 증가가 억제되며 모넨신과 트레일에 의해 유도되는 세포사멸 또한 약화되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 프로테아좀에 의해 유도된 c-FLIP 감소에 따른 모넨신 유도 트레일 매개 세포사멸

다른 세포사멸 조절자들에 의해서도 모넨신이 트레일 매개 세포사멸을 유도하는지를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 도 4a와 같이 U251MG 세포와 U87MG 세포에 각각 0.25μM 모넨신을 0, 12 24 시간처리하고 각 시간대의 세포 추출물을 준비하여 웨스턴 블롯을 진행하였으며, 그 결과 도 4a와 같이 모넨신을 처리한 세포에서 c-FLIP 발현의 감소가 확인되었으나 이와 대조적으로 DR4, XIAP, Bcl-2, Bcl-xL과 인산화된 p65 단백질은 영향을 받지 않았다. 그래서 본 발명가는 모넨신이 c-FLIP의 전사 수준을 감소시키는지를 확인하기 위하여 0.25μM 모넨신을 처리한 세포에서 0, 4, 8, 12, 16 시간대별 전체 RNA를 추출하였다. 그렇게 추출된 전체 RNA로 RT-PCR을 진행하였고 대조군으로 GAPDH를 이용하였다. RT-PCR 분석결과 도 4b처럼 주목할 만한 모넨신에 의한 c-FLIP(L)과 c-FLIP(S) 감소는 확인되지 않았다. 그 이유로, c-FLIP(L)과 c-FLIP(S)의 단백질 수준이 모넨신에 의해 감소하였기 때문이다.

c-FLIP의 발현은 프로테아좀에 의하여 조절된다고 알려짐에 따라 프로테아좀 억제제가 모넨신의 존재 여부에 따라 c-FLIP의 단백질 수준에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 U251MG 세포에 프로테아좀 억제제인 MG132를 표시된 농도로 전 처리하고 0.25μM 모넨신을 16시간 동안 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누었다. 그리고 웨스턴 블롯을 진행하여 c-FLIP(L)과 c-FLIP(S)의 단백질 수준에 차이가 있음을 확인하였는데 그 결과를 도 4c에서 확인할 수 있듯이, MG132가 전처리된 U251MG세포에서는 c-FLIP에 의한 의존적 단백질 증가와 특히, c-FLIP(S)의 증가가 확인되었다. 또한 모넨신은 프로테아좀 경로를 통하여 c-FLIP의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.

본 발명가는 모넨신이 유도하는 트레일 매개 세포사멸에서 c-FLIP(L)과 c-FLIP(S) 감소가 주요한 기능을 하는지 확인하기 위하여 U251MG세포에 c-FLIP(L)와 c-FLIP(S)를 표시된 농도로 인코딩된 플라스미드 pcDNA3로 c-FLIP(L)과 c-FLIP(S)이 과발현 되도록 형질 전환시키고 그렇게 형질 전환된 세포에 0.25 μM 모넨신을 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 100 ng/ml의 트레일을 24시간 동안 처리하였다. 그렇게 처리된 세포의 추출물을 준비하고 항-Flag 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 진행하였으며 칼세인-아세톡시메틸 에테르와 에티듐 동종이중체-1을 이용하여 세포생존도를 3번 분석 후 평균값으로 그래프를 나타내었는데 그 결과가 도 4d이다.

도 4d를 참조하면 c-FLIP(S)가 과발현된 세포군에서는 모넨신과 트레일 처리 시에도 세포 사멸이 감소하는 것을 확인 할 수 있다.

< 실시예 5> 모넨신과 유사한 폴리에테르 카르복실 이온운반 항생제를 통한 트레일 매개 세포사멸 확인

모넨신과 유사한 구조의 다른 폴리에테르 이온운반체 또한 트레일 매개 세포사를 유도하는지 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 도 5a와 같은 화학 구조를 가진 다양한 이온운반 항생제들(니게리신, 살리노마이신, 나라신, 라살로신 A)을 U251MG세포에 도 5b의 농도로 각각 처리하고 30분 후에 트레일 100 ng/ml을 처리하고 24시간 뒤에 칼세인-아세톡시메틸 에테르와 에티듐 동종이중체-1을 이용하여 세포생존도를 확인하였다. 또한 U251MG세포에 모넨신(0.25μM), 살리노마이신(20μM), 니게리신(0.25μｇ/ml), 나라신(4μM), 라살로시드 A(5μｇ/ml)에 트레일 100 ng/ml을 함께 또는 각각 처리한 군의 시간대별 세포 추출물로 카스파제-3과 PARP의 웨스턴 블롯을 진행하였다. 그 결과 도 5b에서처럼 트레일 매개 세포사멸이 증가하였으며, 도 5c와 같이 이온 항생제와 트레일을 함께 처리한 경우 트레일에 의한 부분적인 프로카스파제-3 단백질 분해가 진행되었고 p17 소단위의 활성과 PARP절단이 일어났다.

또한 모넨신(0.25μM), 살리노마이신(20μM), 니게리신(0.25μｇ/ml), 나라신(4μM), 라살로시드 A(5μｇ/ml)의 각 시간대별 세포추출물을 이용하여 도 6a, 도 6b와 같이 웨스턴 블롯을 진행하였는데 니게리신, 살리노마이신, 나라신 그리고 라살로신 A 모두 ER 스트레스와 관련된 KDEL, 인산화된 eIF2α, ATF4, CHOP와 카스파제-4와 같은 단백질의 발현이 증가되었음을 확인하였다.

상기 이온 운반 항생제들이 ER 스트레스를 유도하는 것을 기본으로 모넨신과 같은 방법으로 트레일 매개 세포사멸을 자극하는 것인지를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 먼저 U251MG세포에 도 6c와 같은 농도로 모넨신, 살리노마이신, 니게리신, 나라신, 라살로시드 A를 16시간 동안 처리하고 그 세포 추출물로 웨스턴 블롯하여 DR5 와 c-FLIP 단백질을 확인하였다.

그 결과 도 6b와 도 6c와 같이 폴리에테르 이온운반체들은 시간과 농도에 따라 DR5 수용체 증가와 c-FLIP 감소를 유도하였고 본 발명가는 도 6d와 같이 폴리에테르 이온운반체가 모넨신에 의한 트레일 매개 세포사멸 유도 방법과 같은 세포내 신호전달 과정을 이용하는 것을 확인하였다.

이하, 본 발명의 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 주사제의 제조

트레일 3.5 mg, 폴리에테르 항생제 4 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎, 메틸파라벤 0.8 ㎎, 프로필파라벤 0.1 ㎎ 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

트레일 3.5 mg, 폴리에테르 항생제 4 mg, 유당 100 ㎎, 전분 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

트레일 3.5 mg, 폴리에테르 항생제 4 mg, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

Claims (8)

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3. 모넨신, 니제리신, 살리노마이신, 나라신 및 라살로시드 A로 이루어진 군에서 선택되는 폴리에테르 항생제를 유효성분으로 포함하며, 트레일(TRAIL)의 뇌종양에 대한 내성을 극복하고 항암활성을 증진시키는 뇌종양에 대한 트레일의 항암활성 증진용 조성물.
4. 모넨신, 니제리신, 살리노마이신, 나라신 및 라살로시드 A로 이루어진 군에서 선택되는 폴리에테르 항생제와 트레일을 유효성분으로 함유하는 뇌종양 치료용 약학조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 약학조성물은 폴리에테르 항생제 1~50 중량% 및 트레일 50~99 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌종양 치료용 약학조성물.
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