KR20150010079A - PPAR-ν의 네딜화 억제제를 포함하는 지방세포분화 억제용 조성물 및 그 용도 - Google Patents

PPAR-ν의 네딜화 억제제를 포함하는 지방세포분화 억제용 조성물 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 PPAR-ν의 네딜화 억제제를 포함하는 지방세포분화 억제용 약학적 조성물 및 지방세포 분화와 관련된 본PPAR-ν의 네딜화를 이용한 지방세포분화 억제제 스크리닝방법을 개시한다. 본원에 따른 조성물은 PPAR-ν의 네딜화와 지방세포 분화와의 관련성에 근거한 새로운 개념의 지방세포 분화 억제제로서, 중간엽 줄기세포에서 비만세포로의 분화를 억제하여, 비만치료에 효과적으로 사용될 수 있으며 특히, 기존의 비만치료제로서는 약효를 기대할 수 없는 고도비만의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PPAR-ν의 네딜화 억제제를 포함하는 지방세포분화 억제용 조성물 및 그 용도 {Composition comprising inhibitors of neddylation of PPAR-νfor preventing adipogenesis and its use}
본원은 비만예방 또는 치료 분야에 관한 것이다.
체중 과다 및 비만은 성인뿐만 아니라 어린이나 청소년들에서도 동맥경화, 고혈압, 고지혈증 또는 심장질환 등의 각종 성인병의 발병률을 증가시키는 등 각종 질병의 원인으로 지목되고 있다.
현재 비만치료제는 크게 중추신경계를 조절 하는 메커니즘과 소화 장기를 조절 하는 기전에 근거한 것으로 분류될 수 있다. 로카세린 (lorcaserin; Belviq)은 세로토닌 2C 작용제이고 펜터민 (phentermine; Fastin,Qsymia)는 노르아드레날린 방출제로 작용하며, 오르리스타트(orlistat; Xenical)는 위와 췌장 리파제의 억제제로서 작용을 한다. 하지만 이들의 작용기전은 식욕억제, 열대사촉진제, 소화억제제, 호르몬조절 등에 근거한 것으로 어지러움, 두통 및 불면증과 같은 부작용이 수반된다 (Roger A.H, Trends in Neurosciences 2013;36(2):133 - 140).
특히 고도비만인 경우, 지방줄기세포로부터 비만세포가 계속 분화되어 그 치료가 특히 어려우며, 기존의 비만치료제로는 효능을 기대할 수 없다. 고도비만을 치료하기 위해서 위절제 수술이 유일한 고도비만치료 방법이나, 부작용 및 수술비용 등에 비해 치료효과도 만족할 만한 수준은 아니며, 이러한 고도 비만의 근본적인 치료를 위해서는 지방줄기세포로부터 줄기세포로의 분화를 억제할 수 있는 기전에 근거한 새로운 개념의 비만치료제가 필요하다.
대한민국 특허 제 1232872호는 스핑고신-1-포스페이트（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ） 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 스핑고신-1-포스페이트가 스핑고신-1-포스페이트 수용체 2의 활성화 또는 발현 증가를 통해 지방세포 분화를 유도하는 인자들인 PPAR-gamma (peroxisome proliferator activated receptor-gamma)및 C/EBP (CCAATenhancer-binding proteins)의 발현을 감소시킴으로써 지방세포 분화를 억제를 통한 비만 치료에 대하여 개시하고 있다.
지방세포 분화 기전에 근거한 보다 다양한 치료제의 개발이 필요하다.
본원은 지방세포 분화 기전에 근거한 비만치료방법 및 치료제를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 PPAR-ν의 네딜화 억제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 지방세포분화 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 본원에 따른 PPAR-ν의 네딜화 억제제는 네딜화에 관여하는 인자인 NEDD8, E1 효소인 NAE, E2 효소 또는 E3 효소인 MDM2를 억제하는 것으로, 이러한 기능을 갖는 다양한 억제제가 본원에 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 이러한 억제제는 예를 들면 상기 NEDD8, NAE, E2 또는 MDM2의 발현 또는 활성을 억제하는 물질로, 상기 물질은 저분자화합물, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 폴리펩타이드를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서, 네딜화 억제제는 NAE 억제제인 MLN4924 또는 그염 예를 들면 MLN4924 하이드로클로라이드, 또는 그 유도체 또는 그 유사체 이고, MDM2 억제제인 nutlin-3 또는 그 유도체 또는 그 유사체를 포함한다.
다른 구현예에서 본원의 siRNA 또는 shRNA를 포함하는 것으로, NEDD8 억제제는 서열번호 1, 2 또는 3의 siRNA 또는 서열번호 10 또는 11의 shRNA이고, 상기 NAE 억제제는 서열번호 4, 5 또는 6의 siRNA 또는 서열번호 12 또는 13의 shRNA이고, 상기 MDM2 억제제는 서열번호 7 또는 8의 siRNA를 포함하는 것이다.
본원에 따른 지방세포 분화 억제제는 비만의 예방 또는 치료용, 특히 기존의 비만치료제로 효능을 기대하기 어려운 고도비만의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 PPAR-ν의 네딜화 경로 억제를 통한 인비보 및/또는 인비트로에서의 지방세포 분화 억제 방법을 제공한다. 본원의 방법에서 PPAR-ν의 네딜화 경로 억제는 네딜화에 관여하는 효소인 NEDD8, E1 효소인 NAE, E2 효소 또는 E3 효소인 MDM2 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 억제하는 것으로, 이러한 기능을 하는 다양한 물질이 본원의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 물질의 예로는 저분자화합물, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 폴리펩타이드를 포함하며, 본원에 따른 일 구현예에서는 NAE 억제제로 MLN4924 또는 그 유도체 또는 그 유사체가 사용되며, MDM2 억제제는 nutlin-3 또는 그 유도체 또는 그 유사체가 사용된다. 다른 구현예에서는 NEDD8 억제제는 서열번호 1, 2 또는 3의 siRNA 또는 서열번호 10 또는 11의 shRNA이고, 상기 NAE 억제제는 서열번호 4, 5 또는 6의 siRNA 또는 서열번호 12 또는 13의 shRNA이고, 상기 MDM2 억제제는 서열번호 7 또는 8의 siRNA가 사용된다.
다른 양태에서 본원은 또한 PPAR-ν의 네딜화를 이용한 지방세포분화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다. 본원에 따른 방법은 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 PPAR-ν의 네딜화경로에 관여하는 단백질 중 하나 이상을 제공하는 단계; 상기 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질과의 상호작용 또는 상기 PPAR-ν의 네딜화 중 하나 이상을 억제할 수 있을 것으로 기대되는 시험물질과, 상기 단백질을 접촉하는 단계; 및 상기 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질과의 상호작용 여부 또는 상기 PPAR-ν의 네딜화 여부를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 상기 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질의 상호작용 또는 네딜화가 감소 또는 검출되지 않은 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별한다.
본원의 스크리닝 방법에 사용될 수 있는 단백질은 PPAR-ν의 네딜화경로에 관여하는 단백질로, NEDD8, E1 효소인 NAE, E2 효소 또는 E3 효소인 MDM2를 포함한다. 이러한 스크리닝에 사용되는 단백질은 특히 PPAR-ν와 상기 단백질의 상호작용 영역 또는 네딜화영역을 포함하는 것으로 예를 들면 PPAR-ν의 경우 DNA 결합영역 및/또는 C-말단 리간드 결합 영역이 사용될 수 있으며, 이러한 단백질은 상호작용의 검출이 가능한 다양한 형태 예를 들면 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있거나 또는 분리된 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 세포는 상기 상호작용을 검출할 수 있는 세포로 내인적으로 상기 단백질을 발현할 수 있거나 또는 전달이입 (transient 또는 stable)에 의해 세포로 도입된 것일 수 있다. 이러한 세포는 예를 들면 중간엽줄기세포, 지방전구세포 또는 지방세포 유래이며, 일 구현예에서는 HEK293, 3T3L1, 3T3, 3T3L1-F442A, 3T3-F442A, Ob17, PFC6, TA, 1246, 또는 ST13 세포를 포함한다.
본원은 PPAR-ν의 네딜화와 지방세포 분화와의 관련성에 근거한 새로운 개념의 지방세포 분화 억제제로서, 본원에 따른 조성물은 중간엽 줄기세포에서 비만세포로의 분화를 억제하여, 비만치료에 효과적으로 사용될 수 있으며 특히, 기존의 비만치료제로서는 약효를 기대할 수 없는 고도비만의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 3T3L1 세포에서 지방 세포 분화 시 NEDD8의 발현이 증가하는 것을 나타낸 것으로 도 1a는 Oil-red O 염색을 통해 지방 세포 분화 여부를 확인한 것으로, 지방세포 분화 8일 후, 지방 분화 시 증가되는 전사인자 PPAR-ν, C/EBP-α, ß, δ 와 NEDD8의 발현이 증가하는 것을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이고, 도 1b는 SiRNA를 통해 NEDD8의 발현을 억제 하였을 때와, 네딜화 (Neddylation)가 일어나는데 필요한 E1 효소인 APPBP1를 억제 하였을 때 지방 분화가 억제되는 것을 웨스턴 블랏 및 Oil-red O 염색으로 확인한 결과임. 도 1c는 바이러스 벡터를 이용하여 다음의 유전자의 발현이 지속적으로 저하된 3T3L1의 세포주인 sh-control, sh-APPBP1-I, II, sh-NEDD8 I, II에서 PPAR-ν의 발현의 억제여부를 웨스턴 블랏으로 확인하고, 지방 세포 분화여부를 Oil-red O 염색으로 확인한 결과임. 도 1d는 비만세포로의 분화억제 뿐만 아니라, 이미 형성된 비만세포에도 치료효능이 있을 가능성을 알아보기 위해 지방 세포 분화 전(2일전) 및 후(2일 후)에 siNEDD8을 이용하여 NEDD8의 발현을 억제하였을 때 이 두 조건에서 PPAR-ν의 발현이 감소하는 것을 웨스턴 블랏 및 지방세포 분화에 미치는 영향을 Oil-red O 염색으로 확인한 결과이고, 도 1e는 siCon과 siNEDD8을 지방 분화 전에 세포에 주입한 후 0, 2, 4, 6, 8일째에 PPAR-v, 및 C/EBP-ß의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이고, 도 1f는 siCon과 siNEDD8을 지방세포로의 분화 전에 세포에 주입한 다음 지방 세포로 분화시킨 후 0, 2, 4, 6, 8일에 PPAR-ν, C/EBP-ß, CD36, FABP4, 및 NEDD8 mRNA의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 2는 3T3L1세포에 네딜화에 관여하는 효소인 E1의 억제제인 MLN4924이라는 약물에 의해 지방 세포로 분화가 억제되는 것으로 나타내는 결과임. 도 2a는 지방 세포 분화 전 및 후에 MLN4924를 0.1 및 0.5μM 처리한 후 지방세포 분화에 미치는 영향을 Oil-red O 염색으로 확인한 결과 및 PPAR-v의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이고, 도 2b는 지방 분화 전에 0.5μM의 MLN4924 처리 한 후 지방 세포 분화 0, 2, 4, 6, 8일에 PPAR-ν, C/EBP-ß, CD36, 및 FABP4의 mRNA의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 3은 PPAR-v의 발현이 NEDD8에 의해 안정화되는 것을 나타내는 결과로, 도 3a는 HEK293세포에서 PPAR-ν가 NEDD8에 의해 안정화되고, 네딜화가 될 수 없는 변이 유전자인 NEDD8ΔGG을 함께 발현 하는 경우 안정화가 사라지는 것을 웨스턴블랏으로 확인한 결과(왼편)이고, HEK293세포에서 PPAR-ν만 발현시킨 것과, PPAR-ν+NEDD8을 발현시킨 후 사이클로핵사미드100μM을 0, 3, 6, 9, 12시간 처리시 PPAR-ν+NEDD8을 같이 발현시켰을 때 더 안정화되는 것을 웨스턴블랏을 통해 확인한 결과 (오른편)이고, 도 3b는 HEK293세포에서 변성조건 (denaturing condition)에서 Ni2+ 풀다운 분석 및 웨스턴블랏을 이용하여 PPAR-ν의 네딜화를 확인한 것으로, PPAR-ν의 네딜화가 NEDD8GG와 SENP8에 의해 사라지는 것을 확인한 결과이고, 도 3c는 3T3L1세포에 바이러스벡터인 pLVX-IRES, pLVX-IRES-His-NEDD8을 감염하여 지속적으로 발현되도록 제작한 안정화세포를 이용하여 수행한 결과로, 지방 세포 분화 4일 후 Ni2+ 풀다운 분석 및 웨스턴블랏을 이용하여 PPAR-ν의 내인성 네딜화를 확인한 결과이고, 도 1d는 PPAR-ν의 네딜화가 PPAR-ν의 유비퀴틴화를 방해하여 PPAR-ν의 분해를 방지하는 것으로 나타내는 것으로, PPAR-ν와 Ub를 함께 전달이입하는 경우 PPAR-ν의 유비퀴틴화가 증가 하고 여기에 NEDD8 전달이입시 PPAR-ν의 유비퀴틴화가 감소하는 것을 나타내는 웨스턴블랏결과이고, 도 3e는 PPAR-ν의 유비퀴틴화는 siNEDD8을 이용하여 네딜화를 억제할 경우 증가되는 것을 나타내는 웨스턴블랏결과이다.
도 4는 PPAR-ν의 NEDD8과의 상호작용 부위를 확인한 결과로, 도 4a는 PPAR-ν의 M, 및 CT 영역이 NEDD8에 의해 안정화되는 것을 나타내는 웨스턴블랏 결과이고, 도 4b는 Ni2+ 풀다운 분석 및 웨스턴블랏을 통해 PPAR-g의 네딜화는 M 및 CT에서 일어나는 것을 나타내는 결과이고, 도 4c는 Ni2+ 풀다운 분석 및 웨스턴블랏에서 PPAR-ν의 M, NT 의 네딜화가 NEDD8ΔGG에서는 일어나지 않는 것을 나타내는 결과이다.
도 5는 PPAR-ν의 E3 라이게이즈가 MDM2임을 나타내는 결과로, 도 5a는 HEK293세포에서 PPAR-ν와 MDM2의 상호작용을 PPAR-ν및 MDM2 항체를 한 면역공침전으로 확인한 결과이고, 도 5b는 HEK293세포에서 Ni2+ 풀다운분석 및 웨스턴블랏을 통해 PPAR-ν의 네딜화가 MDM2를 함께 발현시켰을 때 증가하는 것을 나타내는 결과이고, 도 5c는 3T3L1세포에 siCon 및 siMDM2 각각을 10, 20, 또는 50nM 의 농도로 전달이입 하고, 2일 후 지방 세포 분화를 시켰을 때 siMDM2에서 지방 세포분화가 억제되는 것을 Oil-red O 염색 및 웨스턴블랏으로 확인한 결과이고, 도 5d는 MDM2의 억제제인 nutlin-3를 지방 세포 분화개시 및 분화 후에 10 및 20μM 농도로 처리 하였을 때 지방 세포 분화가 억제되는 것을 Oil-red O 염색 및 웨스턴블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 NEDD8이 지방분화에 요구되는 것을 인비보에서 확인한 결과로, 6a는 shCon, 및 shNEDD8 바이러스 벡터를 이용하여 이들 바이러스 벡터가 지속적으로 발현되도록 제작된 안정화 3T3L1세포를 쥐 가슴에 이식하고, 5주 뒤 형성된 지방패드를 H&E 염색하고, 지방분화여부를 확인한 현미경 촬영 결과 (200X)로 양성대조군으로 shCon에서는 지방 분화가 일어났지만, shNEDD8에서는 지방 분화가 억제된 것으로 나타내고, 도 6b는 도 6a와 동일하나 3T3-F442A 세포를 이용한 것으로, 양성대조군으로 shCon에서는 지방 분화가 일어났지만, shNEDD8에서는 지방 분화가 억제된 것으로 나타내고, 도 6c는 anti-perilipin 항체를 이용하여 면역조직화학분석으로 유적을 확인한 현미경 촬영 결과(400X)로, shCon에서는 유적이 잘 형성되었지만 shNEDD8에서는 억제된 것으로 나타낸다.
본원은 PPAR-ν (peroxisome proliferator activated receptor-gamma)가 네딜화를 통해 지방세포 분화에 관여한다는 기전의 발견에 근거한 것으로 PPAR-ν의 네딜화와 지방세포 분화와의 관련성을 규명하였다.
한 양태에서 본원은 PPAR-ν의 네딜화 경로에 관여하는 단백질의 억제제를 포함하는 지방세포분화 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포 (multipotent mesenchymal stem cells; MSC)에서 지방세포 (white adipocyte)로의 분화에는 많은 인자들이 관여하는 것으로 알려져 있으며, C/EBP-베타와 PPAR-감마의 발현이 지방분화에 중요한 것으로 생각되었다 (Ana G. Cristancho, Nature Reviews Molecular Cell Biology 2011;12:722-734). 하지만 지방세포 분화과정에서 이들이 어떻게 조절되는가에 대해서는 알려진 바가 거의 없으며, 특히 이들의 단백질 수준에서의 조절기전을 이용하여 지방세포 분화를 억제하는 것에 관하여는 알려진 바 없다.
네딜화는 NEDD8이 E1 활성화효소 (NAE; NAE1 및 UBA3 서브유니트의 헤테로다이머), E2 전이효소 (Ubc12, UBE2M), 및 E3 라이게이즈인 컨쥬게이션 효소에 의해 표적 단백질에 컨쥬게이션되는 단백질 수식 (modificatin)의 일종이다 (Gong et al. J. Biol. Chem. 2013; 274: 1203612042). 네딜화 시스템은, 단백질 분해를 조절하는 유비퀴틴-활성화 효소(E1), 유비퀴틴-결합 효소(E2) (UBC) 및 유비퀴틴-단백질 이소펩티드 라이게이즈(E3)의 효소가 관여하는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system, UPS)(Hershko, A. Cell Death Differ. 2005; 12: 1191-1197)과 유사한 것이다. Nedd8(Neural precursor cell-Expressed Developmental Downregulation 8 )은 81개 아미노산으로 구성된 약 9kDa의 유비퀴틴과 유사한 단백질로 마우스에서 뇌가 발달동안 하향 발현되는 신경전구세포에서 발현되는 유전자로 세포의 증식, 생활도 및 발단 등에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 이의 지방세포 분화와 관련돼서는 알려진 바 없다.
기존 네딜화에 관여하는 효소인 NAE는 유비퀴틴 라이게이즈의 cullin-RING (really interesting new gene) 서브타입의 활성을 조절하는데 필수적인 역할을 하여 암세포 성장에 중요한 역할을 하는 것을 알려져 있으나 (Pan, Z. Q. et al., Oncogene 2004; 23: 1985-1997), 이의 지방세포 분화 관련성에 대하여는 알려진바 없다.
본원은 PPAR-ν의 네딜화가 지방세포 분화를 유도한다는 것을 규명한 것으로, PPAR-ν의 네딜화 경로에 관여하는 효소의 억제를 통해 네딜화를 억제하여 지방세포의 분화를 억제할 수 있다.
이러한 맥락에서 본원에 포함될 수 있는 PPAR-ν의 네딜화 억제제는 상기 언급한 바와 같은 네딜화 경로에 관여하는 단백질 중 하나 이상을 억제할 수 있는 다양한 억제제가 포함될 수 있는 것으로, NEDD8, E1 효소인 NAE, E2 효소 또는 E3 효소인 MDM2 라이게이즈의 억제제를 포함한다. 일 구현 예에서 이러한 억제제는 후술하는 본원의 스크리닝 방법에 의해 선별될 수 있다.
본원에 따른 조성물에는 PPAR-ν의 네딜화 경로에 관여하는 인자, NEDD8, NAE, E2 및/또는 MDM2를 억제할 수 있는 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 상기 NEDD8, NAE, E2 또는 MDM2의 전사 및/또는 번역 수준에서의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질은 예를 들면 저분자화합물, 항체 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 또는 RNA와 DNA를 포함하는 핵산분자 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 miRNA 또는 이들 임의의 조합을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어발현이란 인비트로 또는 세포내에서 유전자가 단백질로 만들어지는 과정의 모든 단계를 포함하는 것으로, 예를 들면 유전자에서 mRNA로의 전사, mRNA에서 단백질로의 번역을 포함하는 것이다.
본원에서 "활성" 이란 발현된 단백질이 세포내에서 본래의 기능할 수 있도록 하는 생물학적 작용을 의미한다.
본원에 따른 일 구현에서 본원의 조성물에 포함될 수 있는 억제제는 NEDD8 활성화효소 (NAE) 억제제 예를 들면 MLN4924 또는 그 거울상이성질체, 또는 그 유도체 또는 그 유사체이다. MLN4924는 공지된 물질로서 고형암 및 혈액종양의 치료에 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 아데노신 5'-모노포스페이트(AMP)와 유사한 물질이다 (Haas, A. L. et al., J. Biol. Chem. 1982;257:10329-10337; Bohnsack, R. N. et al., J. Biol. Chem.2003;278: 26823-26830). MLN4924와 종양세포 사멸과의 관련성에 대하여는 알려진 바 있지만 (Soucy, T. A. et al., Nature 2009;458:732-737), 이의 지방세포 분화에의 기능에 대하여는 전혀 알려진 바 없다.
본원에 따른 다른 구현 예에서 본원의 조성물에 포함될 수 있는 억제제는 E3 라이게이즈 억제제 즉 MDM2 억제제이다. 본원에서는 처음으로 PPAR-ν의 네딜화에 관여하는 E3 라이게이즈가 MDM-2라는 것을 규명한 것으로, MDM-2의 작용을 억제할 수 있는 다양한 물질이 본원의 조성물에 포함될 수 있으며, 예를 들면 nutlin-1, nutlin-2 및 nutlin-3, nutlin-3a, nutlin-3b 또는 거울상 이성질체, 또는 그 유도체 또는 그 유사체를 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 특히 nutlin-3가 사용된다.Nutlin-3 (4-[4,5-Bis(4-chlorophenyl)-2-(2-isopropoxy-4-methoxy-phenyl)-4,5-dihydro-imidazole-1-carbonyl]-piperazin-2-one)는 시스-이미다졸린 아날로그로서 종양억제단백질인 p53과 MDM-2와의 상호작용을 억제하는 것으로 알려져 있으나 (Vassilev LT, et al. Science 2004;303 (5659): 844-848), 이의 지방세포분화 억제와 관련돼서는 알려진 바 없다.
본원의 다른 구현 예에서, PPAR-ν의 네딜화 억제제는 네딜화에 관여하는 인자 중 하나 이상을 특이적으로 인식하여, 이의 활성 및/또는 작용기전을 방해, 억제, 간섭, 억제할 수 있는 항체이다. 본원에서 사용된 용어 항체는 완전한 항체, 항체분자의 항원결합 단편 및 이들과 기능적으로 동등한 항체 또는 단편을 포함하는 것이다. 또한 본 발명의 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 또는 IgY 타입일 수 있으며, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 클래스 또는 그 하부클래스일 수 있다. 본 발명의 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 단쇄, 이특이성, 유인원화 및 인간화된 항체 및 이의 활성 단편 및 항체 모방체를 포함하는 것이다.
본원의 다른 구현 예에서, PPAR-ν의 네딜화 억제에 관여하는 하나 이상의 억제제는 그 발현, 활성 및/또는 작용/기전을 간섭, 방해 및 또는 억제할 수 있는 폴리펩타이드이다. 본원에서 사용된 용어 폴리펩타이드는 천연 또는 합성의 아미노산의 중합체를 일컫는 것으로 이러한 작용을 갖는 한 특정 길이를 지칭하는 것은 아니며, 펩타이드, 올리고펩타이드를 포함한다. 한 구현예에서 상기 폴리펩타이드는 PPAR-의 네딜화 관여 인자와의 접촉부위의 전부 및 일부, 및/또는 그 주변을 포함하는 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 예를 들면, PPAR-ν와 상호작용하는 단백질 예를 들면 MDM-2와 경쟁하여, 정상적 MDM-2의 작용을 방해하는 역할을 하는 경쟁적 억제자로서 기능할 수 있다. 폴리펩타이드는 자연적 또는 인위적으로 변형된 것 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등으로 변형된 것도 포함한다.
본원에 따른 다른 구현예에서, PPAR-ν의 네딜화에 관여하는 인자 중 하나 이상의 억제제는 NEDD8, NAE, E2 및/또는 MDM-2의 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오타이드 예를 들면 siRNA (small interfereing RNA) 또는 shRNA (small hairpin RNA) 또는 miRNA (microRNA) 이다. siRNA, shRNA 및 miRNA는 RNA 간섭 (interference) 작용을 통해, 예를 들면 짧은 길이의 간섭 RNA (siRNA)가 서열 특이적으로 전사체에 결합하여, RISC(RNA Induced Silencing Complex)를 형성하여, 전사된 RNA가 세포내에 단백질로 발현될 수 없도록 (silencing) 한다. siRNA, shRNA 또는 miRNA는 그 표적 서열에 상당히 상보적인 서열을 갖는다. 상당히 상보적 서열이란, 표적 유전자의 적어도 연속적인 15 베이스 길이의 서열과 적어도 약 70% 상보성, 적어도 약 80% 상보성, 적어도 약 90% 상보성, 또는 약 100% 상보성을 의미한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 NEDD8 억제제로서 서열번호 1, 2 또는 3의 siRNA 또는 서열번호 10 또는 11의 shRNA가 사용될 수 있으며, 다른 구현예에서는 NAE 억제제로 서열번호 4, 5 또는 6의 siRNA 또는 서열번호 12 또는 13의 shRNA가 사용될 수 있으며, 다른 구현예에서는 MDM2 억제제로서 서열번호 7 또는 8의 siRNA가 사용될 수 있다. 하지만 이로 한정하는 것은 아니며, 표적 핵산에 결합하여 사일런싱의 기능을 하는 한 다양한 유래의, 본원에 따른 PPAR-의 네딜화와 관련된 유전자를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및/또는 miRNA가 사용될 수 있으며, 이들의 생물학적 동등체, 유도체 및 유사체도 포함하는 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 바와 같으며, 예를 들면 표적 단백질의 임의의 코딩 서열에 결합하여, 표적 단백질의 발현을 억제/감소시키는 짧은 합성 핵산이다. 안테센스 RNA는 표적 유전자 및 전달 방법에 따라 적절한 길이를 가질 수 있으며, 예를 들면 약 6, 8 또는 10 내지 40, 60 또는 100 뉴클레오타이드이다.
본원에 따른 조성물은 지방세포 분화 억제에 효과적으로 사용될 수 있는 것으로, 비만의 예방 치료, 특히 고도 비만의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이런 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 유효한 양의 PPAR-ν의 네딜화 억제제를 비만의 치료가 필요 대상체 예를 들면 포유동물, 특히 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 비만 치료 방법에 관한 것이다. 비만의 치료와 관련하여 치료적으로 유효한 양이란 비만 또는 이로 인한 질환의 하나 이상의 증상을 경감, 호전시키거나 이롭게 변경하는데 필요한 양을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "비만"은 에너지 불균형에 의하여 체내에 축적된 지방이 정상수치보다 높은 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 세계보건기구 WHO에 의하면 아시아태평양 지역의 경우, 비만의 진단에 이용되는 것은 키(meter단위)의 제곱으로 자신의 체중을 나눈 값이 되며, 이 값이 23이상 25미만은 위험체중, 25 이상은 과체중, 30이상이면 비만, 40이상이면 고도비만 50이상이면 초고도비만으로 정의하고 있다. 비만은 분류에 따라 내분비성 비만 (내분비 이상 또는 뇌질환으로부터 기인), 단순성 비만(과다한 영양 섭취로부터 기인); 증식성 비만 (지방세포수의 증가로 인한 비만), 비대형비만 (지방세포의 크기 증대로 인한 비만); 상반신 비만, 하반신비만; 및 내장형 비만, 피하지방형 비만 등으로 나눌 수 있으며, 이들 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "치료"란 본원에 따른 조성물의 투여로 비만 또는 이로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 비만의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 본원의 조성물의 투여로 비만 또는 이로 인한 다른 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 비만에 치료효과가 있는 본원의 조성물은 비만의 초기증상 또는 증상이 나타나기 전에 복용할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본원의 조성물은 상기 언급한 억제제 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다.
또한 본원의 치료제는 지방세포의 분화 억제 및/또는 비만의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.
본원에서 사용된 "담체"란 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 의미하는 것이다. 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)를 들 수 있다.
필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.
본원의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 공지된 억제제의 투여량을 적용할 수 있다. siRNA, miRNA, 안테센스 올리고뉴클레오타이드, shRNA 제제 및 폴리펩타이드를 포함한 단백질 제제의 경우 비경구 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01 mg 내지 100 mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 PPAR-ν의 네딜화 경로 억제를 통한 지방세포 분화 억제 방법에 관한 것으로 인비트로 및 인비보에서의 방법을 포함하는 것이다. 본원에 따른 방법에 채용될 수 있는 PPAR-ν의 네딜화 경로 억제를 위해 상술한 다양한 억제제를 사용하여 NEDD8, E1 효소인 NAE, E2 효소 또는 E3 효소인 MDM2 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 억제할 수 있다.
본원은 PPAR-ν의 네딜화가 지방세포 분화 유도에 중요하다는 것을 규명한 것에 근거한 것으로, PPAR-ν와 이의 네딜화에 관여하는 인자와의 상호작용을 억제하는 물질을 스크리닝하여 비만치료제로 개발할 수 있다.
이러한 관점에서 본원은 다음의 단계를 포함하는 PPAR-ν의 네딜화 경로를 이용한 지방세포분화 억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 일 구현예에서 상기 방법은 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 PPAR-ν의 네딜화경로에 관여하는 단백질 중 하나 이상을 제공하는 단계; 상기 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질과의 상호작용 또는 상기 PPAR-ν의 네딜화 중 하나 이상을 억제할 수 있을 것으로 기대되는 시험물질과, 상기 단백질을 접촉하는 단계; 및 상기 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질과의 상호작용 여부 또는 상기 PPAR-의 네딜화 여부를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 상기 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질의 상호작용 또는 네딜화가 감소 또는 검출되지 않은 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별한다.
본원의 방법에 사용되는 PPAR-ν 단백질은 전장 또는 그 일부 사용될 수 있으며, 예를 들면 PPAR-ν 단백질과 네딜화 관여 인자와의 접촉 부위 및/또는 네딜화 영역이 포함될 수 있다. PPAR-ν는 N-말단 트랜스활성화 영역 (AF1, NT 아미노산 잔기 1-140), 매우 보존된 DNA 결합 영역 (DBD, M; 아미노산 잔기 141-281), 및 C-말단 리간드 결합 영역(LBD, CT 아미노산 잔기 282-505)으로 구성된다 (Maryam Ahmadian., Nature Medicine 2013;9:557566). 또한 단백질 서열은 공지된 것으로 예를 들면 사람의 경우 NCBI Reference sequence (NP_035276.2)에 개시된 것을 들 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 네딜화 영역인 M 및/또는 CT 영역이 사용될 수 있거나 또는 이러한 부위를 포함하는 한 다양한 길이의 PPAR-ν이 사용될 수 있다.
PPAR-ν와 상호작용하거나/하고 이의 네딜화에 관여하는 인자인 NAE, E2 및 MDM-2의 경우도 공지된 경우 인간 유래의 단백질 서열은 각각 NAE NP_003896.1 , E2 UBC12 또는 UBE2M NP_003960.1 및 MDM-2 NP_002383.2로 공지되어 있다. 상기 이러한 단백질도 다양한 유래의 전장 또는 그 일부가 사용될 수 있으며, 특히 PPAR-ν 단백질과의 상호작용하는 부위가 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 단백질은 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 다양한 유래의 것이 본 방법에 사용될 수 있으며, 예를 들면 포유류, 특히 인간유래 또는 마우스 유래의 것이 사용될 수 있다. 또한 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사 용될 수 있다.
본원의 방법에 사용될 수 있는 단백질은 분리된 형태 또는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 세포의 경우 본원의 방법에 채용되는 단백질을 내인적으로 발현하거나, 또는 이를 발현하는 플라스미드의 도입 (transient 또는 stable 전달이입)에 의해 이를 발현 또는 과발현하는 세포주일 수 있다.
본원에 사용되는 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특히 스크리닝에 사용되는 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 원핵 또는 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 과발현 시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 pcDNA(Clontech Laboratories)과 같은 발현 벡터에 해당 유전자를 클로닝하여 세포주에 전달이입한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
또는 스크리닝에 사용되는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 파쇄물을 만들거나 상기 스크리닝 단백질의 mRNA를 시험관내에서 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 스크리닝 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포잔여물(cell debris) 등을 제거하기위해 상기 세포 파쇄물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-스크리닝 단백질 항체를 이용하여 만들 수 있다.
한 구현예에서, 본원에 사용되는 단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될수 있다. 예를 들면 단백질을 발현 (Transient 또는 Stable 전달이입 또는 내인성 발현)하는 포유류 세포, 예를 들면 지방세포로 분화될 수 있는 줄기세포, 지방전구세포 및 지방세포를 포함하며, 예를 들면 HEK293 (Human embryonic kidney 유래): 백색 지방 조직/배아 섬유모세포 유래의 3T3L1, 3T3-F442A 또는 3T3L1/3T3 F442A; 백색 지방 조직/고환 지방 세포인 Ob17, 백색지방 조직/부고환 지방의 스트로말-관 분획 세포인 PFC6, 백색 지방 조직/배아 섬유모세포 유래의 TA, 백색지방조직/기형암 유래의 1246, 백색지방 조직/유암 유래의 ST13 세포 (Klein et al. BioEssays 2002;24(4):382388)를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들면 HEK293 세포주에 앞서 언급한 바와 같이 PPAR-ν전부 또는 일부를 발현하는 플라스미드 및 MDM-2 단백질을 발현하는 플라스미드, 또는 상기 단백질을 모두 발현하는 플라스미드로 트랜스펙션한 후, 일정 시간 경과 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교한다. 대조군과 비교하여 상호작용을 감소, 억제한 화합물이 본 발명에서 표적으로하는 지방세포 분화를 억제하여 비만을 치료할 수 있는 물질의 후보가 될 수 있다.
단백질-단백질 상호작용에 대한 시험물질의 효과는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면 세포내 단백질의 결합/상호작용을 확인하는 이스트투하이브리드법, 콘포칼현미경법. 공동면역침전법, 표면플라즈마공명 (SPR) 및 스펙트로스코피법을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 이러한 방법에 관한 비교 및 자세한 실험법에 관한 추가의 참고문헌은 Berggard et al., (2007) "Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions", PROTEOMICS Vol7: pp 2833 - 2842에 기재된 것을 참고할 수 있다.
본원에서 상호작용은 단백질 간의 접촉/결합을 일컫는 것으로서, 공유 및 비공유 결합에 의한 상호작용을 모두 포함하는 것이다. 시험물질 처리 후 상호작용의 변동, 감소를 초래한 물질을 지방세포분화억제제 또는 비만 치료제 후보물질로 선별할 수 있다.
본원은 PPAR-ν의 네딜화가 지방세포 분화와의 연관성 규명에 근거한 것으로 이런 측면에서 본원에 따른 방법에서 시험물질의 선별은 PPAR-ν의 네딜화여부를 통해서도 수행될 수 있다. PPAR-ν의 네딜화를 검출하는 방법은 공지된 것으로 예를 들면 본원의 실시예에 기재된 방법을 통해서도 수행될 수 있다.
본 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 상호작용 또는 네딜화가 검출되지 않거나 또는 감소를 가져오는 물질을 후보물질로 선별한다. 감소의 경우 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.
본원의 "시험물질"은 PPAR-ν의 네딜화를 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
예를 들면 PPAR-ν의 네딜화 억제 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고 머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.
또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 실시예에 사용된 시약 및 실험방법은 하기와 같다:
항체
PPAR-ν(sc-1796, sc-1984), C/EBP- (sc-14AA), C/EBP-α (sc-C-19), C/EBP-ß (M-17), ß-tubulin (H-235), MDM2 (sc-965), Ub (sc-9133) 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서, NEDD8 (2745), perilipin (9349)에 대한 항체는 Cell signaling Technology (Beverly, MA)에서, 그리고 anti-HA는 Roche Applied Science (Penzberg, Germany)에서 입수하였다.
화합물
3-Isobutyl-1-methylxanthine, IBMX (I5879), Dexamethasone (D4902), Insulin (I1507), cycloheximide (C1988), HA-affinity bead (E6779), Oil-red O(O0624), EZviewTMRedAnti-HAAffinityGel(E6779)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), Nutlin-3 (10004372)는 Cayman Chemical Company (Arbor, Michigan, USA)에서, MG132 (BML-PI102)는 ENZO Life Sciences (Farmingdale, NY, USA)에서 그리고 Ni-NTA Agarose bead는 Qiagen사 (USA)에서 입수하였다. MLN4924은 이화여대 정낙신 교수팀이 합성 (J Org Chem. 2011;76(9):3557-61.)한 것을 사용하였으며, FBS(Fetal Bovine Serum) 및 DMEM (Dulbeccos modified Eagles medium)은 Thermo (Waltham, USA), 소혈청은 Invitrogen 사(USA)에서 입수하였다.
세포배양 및 지방세포 분화 방법
HEK293 (human embryonic kidney, AATCC CRL-1573) 은 American Type Culture Collections (USA)에서 입수하였으며, 3T3L1과 3T3-F442A preadipocyte는 김재우 교수로부터 (Yonsei University, Seoul, South Korea) 입수하였다. 3T3L1 preadipocyte는 10% 소태아혈청을 포함하는 DMEM을 이용하여 배양하였다. 지방세포 분화를 위해 5μg/ml insulin, 1μM dexamethasone, 500μM 3-isobutyl-a-methylxanthine을 포함하는 10% FBS함유 DMEM에서 2일간 배양하였다. 이어 10% FBS, 5μg/ml insulin이 들어간 DMEM에서 2일간 추가로 배양하였다. 세포 배양 조건은 5% CO2, 20% O2, 37℃ 조건에서 수행하였다.
플라스미드, siRNA, 및 전달이입 (transient transfection)
HA-PPAR-ν 및 HA-C/EBP-ß를 발현하는 벡터는 서울대 박경수 교수로부터 (Seoul National University, Seoul, South Korea) 입수 하였다. NEDD8 발현 플라스미드는 reverse transcription-PCR (RT-PCR)통해 6개의 히스티딘으로 태깅된 His6-tagged pcDNA3 벡터에 블런트앤드 라이게이션을 수행하여 수득하였다. NEDD8 돌연변이체인 NEDD8-ΔGG는 표적단백질과 컨쥬게이션을 할 수 없는 것으로His-NEDD8의 Gly-75, 카복시 말단이 결실된 것이다 (Ryu et al. J. Biol. Chem. 2011;274:1203612042).
HA-Ub, HA-PPAR-ν-NT, HA-PPAR-ν-M, HA-PPAR-ν-CT를 발현하는 벡터는 PCR로 증폭 및 재조합한 후 HA-tagged pcDNA3 벡터 (Clontech Laboratories, Inc. USA)에 클로닝하였다. pcMDM2는 pcDNA 발현벡터 (Clontech Laboratories)에, Myc-SENP8는 Myc-tagged pcDNA 벡터 (Clontech Laboratories)에, Flag/SBP-MDM2는 SFB-pIRES2-EGFP 벡터(Clontech Laboratories)에 MDM2(NP_002383.2)는 pIRES2-EGFP 벡터 (Sigma-Aldrich, USA)에 블런트앤드 라이게이션을 수행하여 수득하였다.
실험에 사용한 siRNA는 다음과 같으며 IDT Integrated DNA Technologies 사 (USA)에서 수득하였다.
[표 1]
Figure pat00001
상기 표에서 두 번째 컬럼은 각 siRNA 서열이 유래한 핵산서열의 번호를 나타낸다. 구축된 플라스미드와 siRNA는 lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen)을 제조자의 방법대로 사용하여 수행하였다.
RNA 추출 및 실시간 PCR
TRIzol (Invitrogen)을 제조자의 방법대로 사용하여 세포에서 총 RNA를 추출하였다. 실시간 PCR을 위해 Easy ScriptTM cDNA Synthesis Kit (Applied Biological Materials Inc, Canada) 을 제조자의 방법대로 이용하여 cDNA를 합성 후 SYBR Green을 이용하는 Step One Real-time RCR System (Applied Biosystems, USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 정량분석을 수행하였다. 이를 위해 표준곡선을 생성하고, 18S 리보소말 RNA를 정량 대조군으로 사용하였다. 분석에 사용한 프라이머는 하기 표 2와 같다.
[표 2]
Figure pat00002
면역블랏 (웨스턴블랏) 및 면역침전
웨스턴블랏: 총 세포를 2XSDS 시료완충액에서 붕해(lysis)한 후 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동으로 분리한 후 Immobilon-P 막 (Millipore, USA)에 전달한 뒤, 5% 무지방밀크를 포함하는 TTBS (Tris-buffered saline containing 0.1% Tween 20)에서 30분간 블락킹한 후 1차 항체를 1:500-1:3000의 농도로 추가하여 하룻밤 배양하였다. 이어 2차 항체로 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 항체를 1:5000으로 사용하여 1시간 동안 배양한 후 Pierce ECL Plus western blotting substrate를 제조자의 방법대로 사용하여 발색하였다.
면역침전: 면역침전 붕해 완충액으로 5mM EDTA, 50mM Tris-Cl, 100mM NaCl, 0.1% NP-40 buffer를 사용하였다. 면역침전을 위해 1 mg의 단백질을 5μl 항체로 4에서 4시간 동안 배양 한 후 15μl protein A/G-Sepharose bead (GE Health care)와 4℃에서 4시간 동안 배양 한 후 세척하였다. 풀다운 단백질을 2XSDS 시료 완충액으로 용출한 후 SDS-PAGE로 전기영동하고, 위에 기술한 바와 같이 웨스턴블랏을 수행하였다. HA-bead 면역침전의 경우 1mg protein을 10μl HA-bead와 4℃에서 4시간 동안 배양 한 후 세척하였다. 단백질을 2XSDS 시료 완충액으로 용출한 후 SDS-PAGE로 전기영동하고, 위에 기술한 바와 같이 웨스턴블랏을 수행하였다.
His 6 -tagged NEDD8 컨쥬게이션 확인
His6-tagged NEDD8 또는 NEDD8ΔGG 플라스미드 각각을 전달 이입한 후, 두 개로 나누어 한 배양접시는 각 단백질의 발현을 확인하기 위한 웨스턴블랏에 사용하였으며, 다른 배양접시는 풀다운분석에 사용하였다. 풀다운분석을 위해 6M guanidine hydrochloride, 0.1M Na2HPO4/NaH2PO4, 0.01M Tris-Cl(pH8), 10mM imidazole, 10mM ß-mercaptoethanol로 구성된 변성 완충액으로 세포를 붕해한 후 세포 붕해물은 Ni2+-NTA-agarose bead (Qiagen)로 실온에서 4시간 배양한 뒤, 제1 세척완충액 [pH8의 8M urea, 0.1M Na2HPO4/NaH2PO4, 0.01M Tris-Cl(pH8), 20mM imidazole, 10mM ß-mercaptoethanol] 및 제2 세척완충액 [pH6.3의 8M urea, 0.1M Na2HPO4/NaH2PO4, 0.01M Tris-Cl(pH8),20mM imidazole, 10mM ß-mercaptoethanol, 0.2%, 0.1% 의 Triton-X100]로 세척 한 다음 2XSDS 완충액으로 용출한 후 웨스턴블랏으로 분석하였다.
Oil-red O 염색
지방세포 분화가 끝난 후 3.7 % 포르말린으로 고정하였다. 0.5% Oil-red O (Sigma-Aldrich)를 아이소프로판올에 용해하였다. Oil-red O 스탁 용액: H2O= 6:4 비율로 혼합한 후 여과하였다. 상기 60% Oil-red O 스탁 용액을 1시간 동안 배양한 뒤 증류수로 세척한 후 영상을 스캔하였다.
Sh-Con, Sh-Nedd8-I 및 II, sh-APPBP-I 및 II, pLVX-IRES-puro-Con, pLVX-IRES-puro-His-NEDD8를 안정적으로 발현하는 지방전구세포주 (preadipocyte cell line) 제작
안정적 3T3-L1, 3T3-F442A 지방전구세포주를 만들기 위해 pLKO.1-puro (Sigma-Aldrich) 렌티바이러스 플라스미드 벡터와 이에 맞는 패키징 플라스미드를 패키징 세포주인 HEK293T에 함께 전달이입 하고, 2일 후에 상층액을 수집하여 여과하였다. 이 상층액을 3T3-L1, 3T3-F442A 세포에 감염시킨 후 2일뒤 퓨로마이신을 사용하여 세포를 선별하였다.
[표 3]
Figure pat00003
상기 표에서 두 번째 컬럼은 각 siRNA 서열이 유래한 핵산서열의 번호를 나타낸다.
이어 안정적 3T3-L1 지방전구세포에 pLVX-IRES-puro (Clontech Laboratories) 렌티바이러스 플라스미드 벡터와 이에 적합한 패키징 플라스미드를 패키징 세포인 HEK293T에 함께 전달이입하였다. 이어 2일후 상층액을 수집하여 여과하고 이를 3T3-L1 세포에 감염한 후 2일뒤 퓨로마이신으로 선별하였다.
동물실험, 3T3-L1, 3T3-F442A 이식 및 지방 패드 분석
동물실험은 서울대학교 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee: SNUIACUC)의 승인을 받아 진행하였다 (SNU-110718-1). 3T3-L1, 3T3-F442A shControl, shNEDD8 stable cell (3 X 107 cell)을 9 주령의 8 마리의 BALB/c 누드 마우스 (Orient Bio, Inc, South Korea)의 복부에 피하주사로 주입 하고, 5주 뒤 관찰하였다 (Susanne Mandrup et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997: 94: 4300 - 4305 참조). 지방패드는 포르말린에 고정한 후 hematoxylin and eosin (H&E)으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.
면역형광 염색
이식된 지방패드를 포르말린으로 염색한 후, 파라핀 포매된 절편을 4μm 으로 제작한 후 탈파라핀화, 재수화를 거친 후 10mM sodium citrate에서 20분간 가열하면서, 항원을 복구 (retrieval) 하였다. 2.5% 소혈청알부민 (USB)와 10% 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS (pH7,4)에서 1시간 블락킹한 후 1차 항체 anti-perilipin (1:500)와 4℃에서 하룻밤 배양하였다. Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (Invitrogen) 를 1:500으로 1시간 배양한 뒤, DAPI (1:5000 in PBS, Sigma Aldrich) 5분간 배양한 후 400X의 배율로 형광 현미경으로 관찰하였다.
통계분석
모든 데이터는 Microsoft Excel 2007 software에서 분석하였다. MannWhitney U test 로 통계 처리하였다. 결과는 평균 (mean)과 표준편차 (standard deviation)로 나타내었다.
실시예 1 지방세포 분화에 따른 NEDD8의 발현 증가
NEDD8의 지방세포 생성과의 연관성을 조사하기 위하여 지방전구세포인 3T3-L1세포를 DMI 혼합물 (1μM dexamethasone, 500μM 3-isobutyl-a-methylxanthine (IBMX), 5 μg/ml insulin)에서 배양한 후, Oil-red O 염색 및 지방세포로 분화됨에 따라 NEDD8의 단백질의 발현이 증가하는 것으로 웨스턴블랏으로 확인하였다 (도 1a 위 패널 참조). 지방세포 분화 3일째부터 NEDD8 단백질 발현이 증가 (도 1a 아래 패널 참조) 하였으며, 지방세포생성에 중요한 전사인자 PPAR-ν, C/EBP-α, ß, δ의 증가되는 것으로 나타났다 (도 1a 아래 패널 참조). 네딜화의 기질인 NEDD8은 E1-E2-E3 효소 캐스케이드에 표적 단백질에 컨쥬게이션되는데, 분화 2일 전에 E1 효소인 APPBP1과 기질인 NEDD8을 siRNA를 전달이입하여 낙다운하였을 때, 지방세포 생성이 억제되는 것으로 나타났다 (도 1b 참조). pLKO.1-puro 렌티바이러스 플라스미드 벡터 시스템을 이용하여 shAPPBP1, shNEDD8 stable knock-down 3T3-L1세포를 만들어 분화가 억제되는 것을 재확인 하였다 (도 1c 참조). 분화 후에 NEDD8의 지방세포 생성에 미치는 영향을 알아보기 위해 분화를 시킨 후에 siNEDD8으로 낙다운한 경우, 분화가 시작된 후에도 siNEDD8에 의한 NEDD8의 발현 저하로 지방세포 생성이 감소되는 것으로 나타났다. 나아가 PPAR-의 발현도 억제되었다 (도 1d 참조). RNAi시스템을 통해 NEDD8을 낙다운 시킨 후 분화를 유도하여 0, 2, 4, 6, 8일 동안 시간에 따른 변화를 조사한 결과, siNEDD8에 의한 발현억제에 의해 지방세포 생성 관여 유전자인 PPAR-ν, C/EBP-ß의 발현이 대조군과 비교하여 시간의존적으로 더 감소된 것으로 나타났다 (도 1e 참조). C/EBP-ß는 분화 초기에 발현되므로, 분화 시킨 후, 0, 2, 4, 8, 16, 24 시간에서 발현을 확인하였으며, siNEDD8에 의해 단백질 발현이 감소되는 것으로 나타났다 (도 1e 참조). SiNEDD8을 낙다운 시킨 후 0, 2, 4, 6, 8일째 분화 시간대 별로 실시간 PCR을 통해 지방세포생성의 주요 마커 유전자들인 PPAR-ν, C/EBP-ß, FABP4, CD36의 mRNA발현이 감소된 것을 확인하였다 (도 1f 참조).
이러한 결과는 지방세포 생성에 중요한 PPAR-ν등의 단백질등에 네딜화가 관여함을 나타내는 것이다. 따라서 네딜화에 관여하는 모든 과정 중에서 하나라도 억제가 되면 지방세포로의 분화가 억제됨을 밝혔음. 따라서 네딜화에 관여하는 효소반응 및 효소반응에 관여하는 단백질들의 발현을 하나라도 억제하거나 약물로 억제하였을 때 지방세포로의 분화가 억제됨을 밝혔음.
실시예 2
MLN4924 (NEDDylation E1 enzyme inhibitor)에 의한 지방세포생성 억제
네딜화는 NEDD8이 E1 활성화효소 (NAE; NAE1 및 UBA3 서브유니트의 헤테로다이머), E2 전이효소 (Ubc12, UBE2M), 및 E3 컨쥬게이션 효소에 의해 표적 단백질에 컨쥬게이션되는 단백질 수식 (modificatin)의 일종이다(Gong et al., J. Biol. Chem. 1999; 274:12036-12042). MLN4924는 NEDD8 E1 활성화효소의 억제제로 알려져 있다 (Teresa et al. Nature 2008; 458;732-736).
3T3-L1세포에 지방세포 분화 전 또는 분화 후에 MLN4924를 처리하여 지방세포 분화에 대한 영향을 조사하였다. 지방세포 분화 후에 MLN4924을 처리하면 PPAR-ν의 단백질 발현이 억제되었으며 (도 2a 참조), 분화 전에 MLN4924를 처리한 후 분화를 시켰을 때도 PPAR-ν, C/EBP-ß, FABP4, 및 CD36의 mRNA의 발현도 감소하는 것으로 나타났다 (도 2b 참조). 이는 MLN4924은 비만의 예방 및 비만 치료효과를 갖는 물질로 기능할 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 3
NEDD8에 의한 PPAR-ν 유비퀴틴화 억제에 의한 PPAR-안정화
PPAR-ν의 단백질의 발현은 인산화, 수모일화, 유비퀴틴화와 같은 번역후 수식에 의해 조절 된다 (van Beekum. Obesity (Silver Spring) 2009; 17;213-219). 특히, PPAR-ν는 폴리유비퀴틴화로 인해 프로테오좀에 의해 분해되는 것으로 알려져 있다 (Floyd ZE et al.J Biol Chem. 2002; 277:4062-4068).
본 실시예에서는 HEK293세포에서 과발현시킨 PPAR-ν가 NEDD8에 의해 단백질 농도가 증가하며 이러한 현상은 네딜화가 될 수 없는 돌연변이체인 NEDDD8ΔGG에 의해 사라지는 것으로 나타났다 (도 3a 왼편 패널). 합성된 PPAR-ν를 0, 3, 6, 9, 12시간 동안 사이클로헥사미드를 처리하여 PPAR-의 안정성을 비교하였을 때, PPAR-ν은 NEDD8 과발현에 의해 안정화되는 것으로 나타났다 (도 3a 오른쪽 패널). 상기 결과가 PPAR-ν의 네딜화에 의한 것인지 여부를 판단하기 위하여 변성 조건 (denaturing condition)에서 Ni2+ 풀다운분석을 이용하여 PPAR-ν와 NEDD8이 공유결합에 의해 컨쥬게이션되는 것을 확인하였으며, 컨쥬게이션이 일어나지 않는 돌연변이인, NEDDΔGG에서는 이러한 결과나 나타나지 않았다 (도 3b 윗 패널). 또한 PPAR-ν와 NEDD8의 공유결합 컨쥬게이션은 탈네딜화 효소인 SENP8에 의해서도 검출되지 않았다 (도 3b 아래 패널).
이어 내인성 PPAR-ν의 네딜화여부 검출을 위해 3T3-L1세포에 pLVX-IRES 바이러스 감염 시스템을 이용하여 His-NEDD8을 전달이입 시켜 제작된 안정화 세포를 이용하여 확인한 결과, 내인성 PPAR-ν의 네딜화가 검출되었으며, 지방세포생성에 관여하는 다른 중요한 다른 전사인자인 C/EBP-α, ß 및 δ 에서는 네딜화가 검출되지 않았다 (도 3c).
다음으로 이러한 PPAR-ν의 발현을 조절하는 네딜화가 PPAR-ν의 유비퀴틴화억제를 통해 이를 안정화시키는 것을 확인하였다. 즉 HEK293세포에서 PPAR-ν와 Ub DNA를 과발현시킨 결과, PPAR-ν의 유비퀴틴화는 증가하나, NEDD8의 과발현에 의해 PPAR-ν의 유비퀴틴화가 감소하는 것으로 나타났다 (도 3d). 반대로 PPAR-ν의 유비퀴틴화는 siNEDD8에 의해 증가하는 것으로 나타났다 (도 3e).
이러한 결과는 네딜화된 PPAR-ν는 유비퀴틴화에 의한 단백질 분해를 방해하여 안정성을 증가시키는 것을 나타낸다.
실시예 4
PPAR-ν의 네딜화 영역 결정
PPAR-ν는 N-말단 트랜스활성화 영역 (AF1, NT), 매우 보존된 DNA 결합 영역 (DBD, M), C-말단 리간드 결합 영역(LBD, CT)으로 구성된다 (Maryam Ahmadian. Nature Medicine 2013;99:557566). HEK293세포에 PPAR-ν 전장(FL), NT, M, CT을 NEDD8과 함께 전달이입한 경우 NT을 제외한 나머지 M, CT 영역의 농도가 증가하는 것으로 나타났다 (도 4a 참조). 또한, 변성 조건에서 Ni2+ 풀다운 분석결과 PPAR-ν의 M, CT에서 네딜화되는 것을 확인하였으며 (도 4b), NEDD8ΔGG에서는 PPAR-ν의 M, NT에서 네딜화가 되지 않는 것을 확인하였다 (도 4c 참조). 이는 PPAR-ν의 DNA-결합영역 (DBD), 리간드 결합 영역(LBD)이 네딜화되는 것을 나타낸다.
실시예 5
PPAR-ν의 E3 라이게이즈 규명
MDM-2 (murine double minute 2)는 p53의 유비퀴틴 E3 라이게이즈로 알려져 있으며 (Reiko Honda et al. FEBS Letters 1997; 420:25-27), 지방전구세포인 3T3-L1세포에서 양이 증가하고 (Berberich SJ et al. Differentiation 1999; 64: 205-212), CREB을 활성화시켜 지방세포생성을 촉진하는 것으로 알려져 있다 (P Hallenborg et al. Cell Death and Differentiation 2012; 19:1381-1389).
HEK293세포에 PPAR-ν의 네딜화에 관여하는 E3 라이게이즈를 다음과 같이 규명하였다. MDM2 cDNA 벡터를 PPAR-ν발현 벡터와 함께 전달이입 한 후 PPAR-ν와 MDM2의 항체를 이용하여 공면역침전분석을 수행한 결과, 두 단백질이 직접적으로 결합하고 있는 것으로 나타났다 (도 5a 참조). PPAR-와 상호작용하는 MDM2가 PPAR-ν의 네딜화를 매게하는 E3 라이게이즈인 것으로 나타났다 (도 5b 참조).
지방전구세포인 3T3-L1세포에 siMDM2 를 전달이입한 경우 용량의존적으로 지방세포 분화가 억제되는 것으로 나타났다 (도 5c).
나아가 MDM2의 억제제인 nutlin-3에 의해서도 용량의존적으로 지방세포 분화가 억제되는 것으로 나타났다 (도 5d).
이러한 결과는 PPAR-ν가 MDM2에 의해 네딜화되어 안정화됨으로서 지방세포 생성을 유도한다는 것을 나타낸다.
실시예 6
인비보 지방세포생성에서 NEDD8 발현의 중요성
NEDD8의 발현이 in vivo 지방세포생성에서의 역할을 조사하였다. 이를 위해pLKO.1-puro (Sigma-Aldrich) 렌티바이러스 플라스미드 벡터를 이용하여 shControl 혹은 shNEDD8을 구축하고, 이를 3T3-L1, 3T3-F442A세포에 전달이입하여 안정적 낙다운 세포를 구축하였다. 이어 상기 ShControl 혹은 shNEDD8 발현 지방전구세포를 마우스의 복부에 이식하고, 5주 후 지방패드를 분리하여 H&E 염색을 수행하여 형태를 비교한 결과, 3T3-L1, 3T3-F442A세포 모두 shControl 세포는 지방세포 분화가 잘 일어났지만, shNEDD8 낙다운 세포의 경우는 지방세포 분화가 억제되는 것으로 나타났다 (도 6a 및 b 참조).
나아가 지방분화가 정상적으로 발생한 것임을 부고환 지방패드와 비교하였다. 유적 스캐폴드 단백질인 페릴리핀 (perilipin)에 대하여 면역형광염색을 수행한 결과, shControl 세포에서 형성된 지방패드는 유적이 정상적으로 형성되었지만, shNEDD8 발현세포의 지방패드에서는 유적이 정상적으로 형성되지 못한 것으로 나타났다 (도 6c 참조).
이러한 결과는 NEDD8의 발현이 인비보 지방세포생성에서도 중요한 역할을 하며, NEDD8의 발현 저하는 지방세포의 생성을 억제하므로, 네딜화억제제가 비만의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
<110> SNU R&DB Foundation <120> Composition comprising inhibitors of neddylation of PPAR-gamma for preventing adipogenesis and its use <130> DP201306007 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for NEDD8 <400> 1 cagacaaggu ggagcgaauc aagga 25 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for NEDD8 from mouse <400> 2 uccuugauuc gcuccaccuu gucugug 27 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for NEDD8 from mouse <400> 3 uucacuuuaa uuagcaucuu cuuccca 27 <210> 4 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for APPBP1 from human <400> 4 uauauauuug ccugaaucug caaucau 27 <210> 5 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for APPBP1 from mouse <400> 5 gagcagauuc caaagcuucu uguccau 27 <210> 6 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for APPBP1 from mouse <400> 6 agguaaauuu ccuugacccu ccuuggc 27 <210> 7 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for MDM2 from human <400> 7 uuccugaagc ucuuguacaa gguccuu 27 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for MDM2 from mouse <400> 8 gcaaugaucu acagaaauuu agugg 25 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for control <400> 9 uugagcaauu cacguucaut t 21 <210> 10 <211> 112 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA for NEDD8 from mouse <400> 10 cggttgattc gctccacctt gtctctcgag agacaaggtg gagcgaatca atttttatta 60 aaaattgatt cgctccacct tgtctctcga gagacaaggt ggagcgaatc aa 112 <210> 11 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA for NEDD8 from mouse <400> 11 ccggacttta attagcatct tcttcctcga ggaagaagat gctaattaaa gttttttatt 60 aaaaaacttt aattagcatc ttcttcctcg aggaagaaga tgctaattaa agt 113 <210> 12 <211> 112 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA for APPBP1 from mouse <400> 12 cggcagaatt caaagcttct tgtcctcgag gacaagaagc tttggaatct gtttttatta 60 aaaacagatt ccaaagcttc ttgtcctcga ggacaagaag ctttggaatc tg 112 <210> 13 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA for APPBP1 from mouse <400> 13 cggtaaattt ccttgaccct ccttctcgag aaggagggtc aaggaaattt atttttaatt 60 aaaaataaat ttccttgacc ctccttctcg agaaggaggg tcaaggaaat tta 113 <210> 14 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA for control <400> 14 ccggcgtgat cttcaccgac aagatctcga gatcttgtcg gtgaagatca cgtttttatt 60 aaaaacgtga tcttcaccga caagatctcg agatcttgtc ggtgaagatc acg 113

Claims (17)

  1. PPAR-ν의 네딜화 억제제를 포함하는 지방세포분화 억제용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 PPAR-ν의 네딜화 억제제는 NEDD8, E1 효소인 NAE, E2 효소 또는 E3 효소인 MDM2 억제제인, 지방세포 분화 억제용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 NEDD8, NAE, E2 및 MDM2 억제제는 상기 NEDD8, NAE, E2 또는 MDM2의 발현 또는 활성을 억제하는 물질로, 상기 물질은 저분자화합물, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 폴리펩타이드인, 지방세포 분화 억제용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 NAE 억제제는 MLN4924 이고, 상기 MDM2 억제제는 nutlin-3인, 지방세포 분화 억제용 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 NEDD8 억제제는 서열번호 1, 2 또는 3의 siRNA 또는 서열번호 10 또는 11의 shRNA이고, 상기 NAE 억제제는 서열번호 4, 5 또는 6의 siRNA 또는 서열번호 12 또는 13의 shRNA이고, 상기 MDM2 억제제는 서열번호 7 또는 8의 siRNA인, 지방세포 분화 억제용 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 지방세포 분화 억제제는 비만의 예방 또는 치료용인, 지방세포 분화 억제용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 비만은 고도비만인, 지방세포 분화 억제용 조성물.
  8. 인비트로에서 PPAR-ν의 네딜화 경로 억제를 통한 지방세포 분화 억제 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 PPAR-ν의 네딜화 경로 억제는 NEDD8, E1 효소인 NAE, E2 효소 또는 E3 효소인 MDM2 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 억제하는 것인, 지방세포 분화 억제 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 발현 또는 활성의 억제는 저분자화합물, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 폴리펩타이드에 의해 수행되는 것인, 지방세포 분화 억제 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 NAE 억제제는 MLN4924 이고, 상기 MDM2 억제제는 nutlin-3인, 지방세포 분화 억제 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 NEDD8 억제제는 서열번호 1, 2 또는 3의 siRNA 또는 서열번호 10 또는 11의 shRNA이고, 상기 NAE 억제제는 서열번호 4, 5 또는 6의 siRNA 또는 서열번호 12 또는 13의 shRNA이고, 상기 MDM2 억제제는 서열번호 7 또는 8의 siRNA인, 지방세포 분화 억제 방법.
  13. 다음의 단계를 포함하는 지방세포분화 억제제 스크리닝 방법:
    PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 PPAR-ν의 네딜화경로에 관여하는 단백질 중 하나 이상을 제공하는 단계;
    상기 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질과의 상호작용 또는 상기 PPAR-ν의 네딜화 중 하나 이상을 억제할 수 있을 것으로 기대되는 시험물질과, 상기 단백질을 접촉하는 단계; 및
    상기 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질과의 상호작용 여부 또는 상기 PPAR-ν의 네딜화 여부를 검출하는 단계를 포함하며,
    상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 경우 상기 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 또는 C-말단 리간드 결합 영역 중 하나 이상과 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질의 상호작용 또는 네딜화가 감소 또는 검출되지 않은 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질은 NEDD8, E1 효소인 NAE, E2 효소 또는 E3 효소인 MDM2인 것인, 지방세포분화 억제제 스크리닝 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 PPAR-ν 또는 PPAR-ν의 DNA 결합영역 및 C-말단 리간드 결합 영역 및 상기 네딜화경로에 관여하는 단백질은 분리된 형태 또는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되는, 지방세포분화 억제제 스크리닝 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 세포는 중간엽줄기세포, 지방전구세포 또는 지방세포인, 지방세포분화 억제제 스크리닝 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 세포는 HEK293, 3T3L1, 3T3-F442A, Ob17, PFC6, TA, 1246, 또는 ST13 세포인, 지방세포분화 억제제 스크리닝 방법.
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