KR20190143656A

KR20190143656A - TRIM25을 유효성분으로 함유하는 PPARγ 분해용 조성물

Info

Publication number: KR20190143656A
Application number: KR1020180071421A
Authority: KR
Inventors: 최장현; 최선실
Original assignee: 울산과학기술원
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2019-12-31
Also published as: KR102072075B1

Abstract

본 발명은 TRIM25(tripartite motif-containing 25)를 유효성분으로 함유하는, PPARγ 분해용 조성물 및 시약 조성물에 관한 것으로서, TRIM25는 PPARγ의 유비퀴틴화 분해를 유도함으로써 3T3-L1 세포의 지방세포로의 분화를 억제 시킬 수 있다.

Description

TRIM25을 유효성분으로 함유하는 PPARγ 분해용 조성물{Composition for degrading PPARγ comprising TRIM25}

본 발명은 TRIM25(tripartite motif-containing 25)을 유효성분으로 함유하는 PPARγ 분해용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 PPARγ의 유비퀴틴화에 이어서 프로테아좀 의존성 분해를 유도함으로써 PPARγ을 분해할 수 있다.

최근 식생활의 다양화 및 서구화로 고열량 및 동물성 식품의 섭취가 증가함에 따라 뇌졸중, 동맥경화, 고지혈증, 당뇨병 및 비만 등 대사기능의 이상으로 인한 질환의 발병률이 높아지고 있다. 또한 소득 수준이 향상됨에 따라 생활의 여유와 건강한 삶을 중시하는 경향이 확산되면서 생명에는 직결되지 않으나 생활에 불편을 가져오는 증상들을 치료하기 위한 의약품의 수요가 급증하고 있다.

퍼옥시좀(Peroxisome)은 이러한 대사기능 이상의 원인이 되는 세포 내 소기관 중 하나로서, 산소, 포도당, 지질 및 호르몬의 대사에 있어 중요한 역할을 하며, 세포 증식 및 분화의 조절, 염증 매개체들의 조절에도 폭 넓게 영향을 미친다. 또한 퍼옥시좀은 지질대사와 포도당대사를 통하여 인슐린 감수성뿐만 아니라 세포막과 비만세포의 형성에 영향을 주고, 산화적 스트레스에 영향을 주어 노화 및 종양 발생(tumorigenesis)에 있어서 중요한 역할을 한다.

퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptor: PPAR)는 리간드(ligand) 결합에 의해 유전자 발현을 조절하는 핵 수용체(nuclear receptors) 중 하나로서, 여러 가지 지방산이 내인성 리간드(endogenous ligand)로 작용한다. 현재 밝혀진 PPAR은 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 알파(PPARα), 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 베타(PPARβδ및 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(PPARγ의 세 가지이다.

PPAR이 에너지 항상성이나 염증반응의 조절에 있어 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려짐에 따라 다양한 합성 PPAR 리간드를 개발하는 연구들이 활성화되었으며, 최근에는 합성 PPAR-δ 작용제를 개발하게 되면서 임상 전 연구를 통해 이들 수용체의 기능을 더욱 명료하게 알 수 있게 되었다. 이와 더불어 다수의 PPAR 아이소형을 활성화시키는 약물(dual PPARα/γ 작용제, pan-PPAR 작용제)에 대한 개발 및 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

특히 PPARγ는 지방 조직에서 가장 많이 발견되고, 그 밖에 혈관 내피, 대식세포, 췌장의 β세포에서 발견되며, 지방 세포의 분화를 조절하고 전신 지질 항상성에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 레티논산 X 수용체 단백질과 이합체를 형성한 뒤, 다양한 지방세포 유전자의 프로모터에 존재하는 PPRE(peroxisome proliferator response elements)에 결합한다. PPARγ와 C/EBP alpha의 상호 작용이 성숙한 지방세포로의 분화에 매우 결정적인데, 지방산 결합 단백질 aP2와 같은 지방세포 특이적 단백질 및 지방 대사 효소의 발현을 조절한다. 더불어 ADD1/SREBPs는 지방 대사에도 중요한 역할을 하지만, 또한 분화과정에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 미성숙 지방세포에서 ADD1/SREBP1c가 발현되는 것은 PPAR gamma의 활성화에 기여하는 것으로 여겨진다. 분화과정을 마친 지방세포만이 지방산을 합성하고 중성지질을 저장하게 된다.

대표적인 PPARγ 효능제로는 글리타존(Glitazone), 로지글리타존(Rosiglitazone) 및 피오글리타존(Pioglitazone)이 있으며, 이들 약제는 대표적인 당뇨병 치료제로 지방산을 산화시키는 퍼옥시좀을 활성화시켜 인슐린 감수성을 향상시키는 효과가 있다. 그러나 지방세포 분화에 따른 체중증가, PPARγ활성화에 따른 체액저류, 골절 증가, 울혈성심부전, 심근경색 등과 같은 부작용이 있으며, 특히 심혈관 질환자에의 투여는 금기시되고 있어, 이를 해결할 수 있는 신규한 효능제의 개발이 필요한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자 등은 TRIM25가 3T3-L1 지방세포 분화 유도에 관여하는 대표적인 단백질인 PPARγ의 유비퀴틴화를 직접 유도하는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기 PPARγ 효능제의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 TRIM25을 유효성분으로 함유하는 PPARγ 분해용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 TRIM25을 유효성분으로 함유하는 시험관 내(in vitro) PPARγ 분해용 시약 조성물 및 시험관 내(in vitro)에서 TRIM25를 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내 PPARγ 분해 방법을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, TRIM25(tripartite motif-containing 25)를 유효성분으로 함유하는, PPARγ 분해용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, TRIM25(tripartite motif-containing 25)를 유효성분으로 함유하는, 시험관 내(in vitro) PPARγ 분해용 시약 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 시험관 내(in vitro)에서 TRIM25(tripartite motif-containing 25)을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내 PPARγ 분해 방법이 제공된다.

본 발명의 TRIM25을 유효성분으로 함유하는 PPARγ 분해용 조성물은, PPARγ의 유비퀴틴화를 직접 유도하여 PPARγ를 분해할 수 있으며, 궁극적으로 PPARγ의 분해를 통해 3T3-L1 세포의 지방 세포로의 분화를 억제할 수 있다.

따라서, 본 발명의 PPARγ 분해용 조성물은, PPARγ에 의해 유도되는 질환 연구 및 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 TRIM25와 PPARγ의 상호작용을 관찰한 것으로, 도 1a는 PPARγ와 그에 관련된 단백질의 은 염색 사진, 도 1b는 배양된 지방 세포로부터 TRIM25의 웨스턴 블롯팅 사진, 도 1c는 TRIM25의 PPARγ DBD/H 도메인과의 상호작용을 나타내는 사진이며, 도 1d는 TRIM25가 PPARγ에 결합하는데 필요한 특정 영역을 확인하는 사진이다.
도 2a ~ 2c는 TRIM의 발현 증가 또는 감소에 따른 PPARγ 전사 활성과 단백질 수준을 측정하여 나타낸 것이다. 도 2d 및 2e는 TRIM25^WT와 TRIM25^CS 돌연변이체의 PPARγ 분해 정도를 비교한 것이며, 도 2f는 프로테아좀 억제제를 처리한 후 TRIM25 과발현에 의해 PPARγ 단백질 수준이 감소한 것을 나타낸다.
도 3a는TRIM25^WT와 TRIM25^CS의 PPARγ 반감기를 측정하여 비교한 것이고, 도 3b는 TRIM25의 녹다운을 이용한 PPARγ의 안정화를 확인하는 것이다.
도 4a 및 도 4b는 배양된 지방세포와 HEK 293 세포에서 TRIM25^WT, TRIM25^CS 돌연변이체의 유비퀴틴화 정도를 비교한 것이고, 도 4c 및 도 4d는 TRIM25^WT와 TRIM25^CS의 in vitro 유비퀴틴화 분석 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 TRIM25와 PPARγ, aP2, adiponectin의 상대적인 발현 정도를 비교한 것이고, 도 5c ~ 5e는 TRIM25와 PPARγ 발현 사이의 상관관계를 마우스 및 인간에서 확인한 것이다.
도 6a ~ 6c는 TRIM25^WT 와 TRIM25^CS의 중성 지방 축적, 지방세포 선택적 단백질과 유전자의 mRNA의 발현 정도를 비교한 것이고, 도 6d ~ 6e는 TRIM25의 특이적 녹다운을 이용해 지방세포의 분화, 지방세포 특이적 유전자의 단백질과 유전자의 mRNA의 발현 정도를 비교한 것이다.
도 7a ~ 7c는 야생형(WT)과 TRIM25 녹아웃(KO) MEF의 지질 축적, 지방생성 마커 발현 정도를 비교한 것이다.
도 8a 및 도 8b는 PPARγ^WT, PPARγ^Y78F 또는 PPARγ^Y78E와 TRIM25^WT로 형질 감염된 HEK-293 세포의 PPARγ 발현과 상대적 단백질 발현(PPARγ/HSP90), 유비퀴틴화를 측정한 것이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ)"는 지방세포 분화와 포도당 항상성을 조절하는 리간드 의존성 전사인자를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "TRIM25(tripartite motif-containing 25)"은 TRIM25 유전자에 의해 코딩되는 단백질를 의미한다. TRIM25는 TRIM (Tripartite Motif) 패밀리에 속하며, 링-핑거 도메인을 함유하고 있기 때문에 E3 유비퀴틴 리가아제로 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "3T3-L1 세포"는 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)로서 지방 조직의 생물학적 연구에 많이 사용되는 세포 주(cell line)이다. 3T3-L1 마우스 배아 섬유아세포에 인슐린과 같은 호르몬을 처리하면 지방 합성 신호 경로가 활성화되면서 세포 내 지방량이 증가하고 세포의 모양이 원형으로 변한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, TRIM25(tripartite motif-containing 25)를 유효성분으로 함유하는, PPARγ 분해용 조성물이 제공된다. 본 발명의 분해용 조성물에 함유된 TRIM25은, E3 리가아제 활성을 통해 PPARγ을 분해할 수 있다. 보다 구체적으로는, TRIM25가 PPARγ의 유비퀴틴화를 유도하여 PPARγ를 분해할 수 있으며, 본 발명자들은 TRIM25의 PPARγ 분해 효과를 처음으로 확인하였다.

본 발명의 PPARγ 분해용 조성물은, PPARγ에 의해 유도되는 3T3-L1 세포의 지방세포로의 분화를 억제시킴으로써 당뇨, 고지혈증, 지방간, 동맥경화, 고혈압, 심혈관 질환 및 상기 질환들이 동시다발적으로 발생하는 대사증후군 뿐만 아니라, 암, 알츠하미머병과 같은 질환의 연구 및 상기 질환의 치료제 개발에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 TRIM25(tripartite motif-containing 25)를 유효성분으로 함유하는, 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

한편, TRIM25와 PPARγ는 지방세포 이외에도 다른 세포와 조직, 특히 종양에서 발현되며, PPARγ가 암에서 염증 및 포도당 신진 대사의 역할을 하기 때문에 종양 억제 인자로 작용할 수 있다는 점이 밝혀진 바 있다. 즉, PPARγ의 과발현은 세포 증식과 성장을 억제함으로써 암의 생존을 억제할 수 있다. 특히, TRIM25는 유방암, 대장암 및 폐암에서 과발현되는 반면, 정상 조직에서는 하향조절 된다.

따라서, 본 발명은 TRIM25(tripartite motif-containing 25)를 유효성분으로 함유하는, 유방암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 TRIM25(tripartite motif-containing 25)를 유효성분으로 함유하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 TRIM25(tripartite motif-containing 25)를 유효성분으로 함유하는, 대장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은, 이들의 유효성분에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 도는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화된 약학 조성물로 사용될 수 있다. "약제학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

여기에서, 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 상기 약제학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합하거나 적당한 조합으로 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여하는 경우에는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용될 수 있다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 종류 및 이의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강 및 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 특정 추출물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 특정 추출물과 동시 사용되는 약물의 배합 방법 또는 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

세포 배양

ATCC(Manassas, VA)로부터 3T3-L1, HCT116, HEK-293T 및 HEK-293 세포를 수득하고, 5% CO₂의 가습 하 37℃에서 소태아혈청(Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (DMEM)에서 배양하였다. 10% 소태아혈청, 0.5mM 이소부틸메틸잔틴(isobutylmethylxanthine), 1μM 덱사메타손 및 850nM 인슐린을 함유하는 DMEM 배지로 세포를 처리하여 지방세포 분화를 유도하였다. 유도 2일 후에 세포를 10% FBS 850nM 인슐린을 함유하는 보존 DMEM 배지로 옮겼다. 세포에서의 지질 축적은 Oil Red O 염색으로 검출하였다. 배양을 위한 모든 화합물은 MilliporeSigma (St. Louis, MO)로부터 얻었다.

플라스미드 구조 및 RNA 간섭

TRIM25 #1(5'-CCTCGACAAGGAAGATAAA-3') 및 #2(5'-GCATCTGCTACGGAAGCAT-3')에 대한 siRNA를 Shanghai GenePharma (Shanghai, China)로부터 구입하여 준비하였다. HCT116 세포를 Lipofectamine RNAi MAC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 siRNA로 형질 감염시켰다. TRIM25를 표적으로 하는 lentiviral shRNA 발현 벡터(pLKO.1; Dharmacon, Lafayette, CO)에 사용되는 서열은 # 1 (5'-TTCCTCAGTTTGTACTCCAGG-3 ') 및 # 2 (5'-ATGATCCAGATCTATCTTAGG-3')이다. 렌티 바이러스 생성을 위해, HEK-293T 세포를 10㎍의 렌티 바이러스 벡터로 형질감염 시켰다. 바이러스 벡터로 세포를 감염시킨 후, 2㎍/ml의 퓨로마이신(MilliporeSigma, St. Louis, MO)과 함께 배양하여 3T3-L1 세포를 선별하였다.

결합 분석, 면역 침강반응 및 항체

고정 GST-융합 단백질 (PPARγ 도메인 돌연변이 및 TRIM25 절단 돌연변이)를 글루타티온-아가로오스와 함께 4℃에서 2시간 동안 PPARγ 또는 TRIM25 표현 세포 용해물과 배양했다. 단백질 복합체를 원심 분리에 의해 분리하고 결합 완충액으로 4회 세척하였다. 침전물은 항-PPARγ 또는 TRIM25 항체를 사용하는 면역 블롯팅으로 검출하였다. PPARγ와 TRIM25 사이의 상호 작용을 분석하기 위해, PPARγ, TRIM25 또는 그 돌연변이를 발현하는 HEK-293 세포를 결합 완충액으로 용해시키고 4℃에서 총 세포 용해물을 FLAG M2 아가로오스 (MilliporeSigma, St. Louis, MO)와 함께 배양하였다. 면역 침강제 또는 총 세포 용해물을 특이적 항체로 분석하였으며, 사용된 항체는 다음과 같다: α-TRIM25, α-PPARγ, α-GST, α-Ub, α-aP2 및 α-adipsin(Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX)로부터 구매), α-HA, α-actin, α-HSP90 및 α-adiponectin(Cell Signaling Technology (Danvers, MA)로부터 구매).

PPARγ 결합 복합체의 동정

PPARγ-null 마우스 배아 섬유 아세포(MEFs) 7을 DMEM 및 10 % 소태아 혈청에서 배양하였다. 핵 추출물은 FLAG-PPARγW로 PPARγ-null MEFs를 안정하게 발현시켜 준비하고, 고정화 FLAG M2 아가로오스와 함께 배양하여, 결합 완충액으로 세척하고, FLAG 펩타이드로 배양하여 용출 시켰다. 면역 침강 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 특이 밴드를 잘라내어 트립신으로 분해하였다. 그 다음 고해상도 하이브리드 질량 분석기 (LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific, Waltham, MA))를 사용하여 역상 LC-MS/MS를 수행했다. 모든 MS/MS 스펙트럼은 SequestHT를 통해 Uniprot 단백질 서열 데이터베이스에 대해서 조사되었다.

리포터 유전자 분석

HEK-293 세포를 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 pDR-1 루시페라아제 리포터 플라스미드, PPARγ, RXRα 및 pRL-Renillia로 형질 감염시켰다. 하룻밤 동안 형질 감염시킨 후, 세포를 로시글리타존으로 24 시간 동안 처리하였다. 세포를 수확하고, Dual-Luciferase kit (Promega, Madison, WI)를 사용하여 리포터 유전자 분석을 수행하였다. 루시페라아제 활성은 Renillia 활성으로 정상화되었다.

유전자 발현 분석

총 RNA는 TRIzol 시약 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 세포 또는 조직으로부터 분리되었다. RNA는 ABI Reverse Transcription Kit를 사용하여 역전사되었다. 정량적 PCR 반응은 SYBR 녹색 형광 다이로 ABI9300 PCR 기계상에서 수행하였다. 상대적 mRNA 발현은 tata-binding protein (TBP) 수준으로 표준화된 ΔΔ-Ct 방법으로 결정하였다.

In vitro 유비퀴틴화 분석

FLAG-TRIM25를 HEK-293 세포에서 일시적으로 발현시키고, 항-FLAG M2 친 화성 겔을 사용하여 정제하고, 3X FLAG 펩티드를 첨가하여 녹여서 분리하였다. 재조합 GST-PPARγ 단백질을, 60 ㎕ 반응 완충액 (40 mM Tris-HCl, pH 7.6, 50 mM NaCl 및 1 mM DTT) 중의 TRIM25WT 또는 TRIM25CS 돌연변이의 존재 또는 부재 하에서, 200 ng E1 (UBE1, Boston Biochem, Cambridge, MA), 500 ng E2 (UbcH5c, Boston Biochem, Cambridge, MA), 10 μg Ubiquitin, 2 mM ATP으로 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 반응물을 글루타티온 아가로오스로 분리하고 결합 완충액으로 4 회 세척한 다음, α-Ub 또는 α-PPARγ항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅 하였다. 반응 혼합물은 α-TRIM25 항체를 사용하여 직접 웨스턴 블 로팅하여 TRIM25 자기-유비퀴틴화를 대조군으로 보았다.

인간 지방 조직에서의 상관관계 분석

338 개의 피하 지방 조직 샘플로부터의 TPM-표준화된 RNA-시퀀싱 데이터는 ArrayExpress31에서 다운로드한 샘플 라벨을 사용하여 GTEx 포털로부터 얻었다. 그 다음, 지방 샘플 내에서 TRIM25와 PPARγ 사이의 Pearson 상관 계수는 어느 한 유전자에서의 발현이 평균으로부터 5 표준 편차 이상인 하나의 극단치 샘플을 제거한 후에 계산되었다. 두 유전자는 -0.248의 유의한 음의 상관 관계를 보였다 (p 값 4.14E-6).

동물

모든 동물 실험은 울산 과학 기술원의 동물 실험 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인 한 절차에 따라 수행되었다. 5 주 된 수컷 C57BL/6J 생쥐(DBL, 충북, 한국)는 10 주 동안 고지방식(60 % kcal 지방, D12492, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ)을 먹였다. ob/ob 마우스는 Jackson 실험실 (Bar Harbor, ME)에서 구입하였다.

RT- qPCR에 사용된 프라이머

하기 실시예에서 RT-qPCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다.

QPCR Primer	Foward	Reverse
Mouse TRIM25	ATGGCTCAGGTAACAAGGGAG	GGGAGCAACAGGGGTTTTCTT
Human TRIM25	GTCTCTACCCAGAACAGTTTCC	ATCCAACACAGGCTGATTCC
Mouse PPARη	GCATGGTGCCTTCGCTGA	TGGCATCTCTGTGTCAACCATG
Mouse PPARη	TCTCTCCGTAATGGAAGACC	GCATTATGAGACATCCCCAC
Mouse ap2	AAGGTGAAGAGCATCATAACCCT	TCACGCCTTTCATAACACATTCC
Mouse Adiponectin	TGTTCCTCTTAATCCTGCCCA	CCAACCTGCACAAGTTCCCTT
Mouse CEBPα	CAAGAACAGCAACGAGTACCG	GTCACTGGTCAACTCCAGCAC
Mouse GLUT4	GATTCTGCTGCCCTTCTG	ATTGGACGCTCTCTCTCC
Mouse LPL	AACAAGGTCAGAGCCAAGAG	CCATCCTCAGTCCCAGAAAAG

<실시예 1: TRIM25와 PPARγ의 상호작용 평가>

PPARγ의 잠재적 PTM 조절제를 확인하기 위해, PPARγ로 형성된 결합 복합체의 proteomic 분석을 수행했다. 도 1a는 PPARγ와 그 관련 단백질의 은 염색에 해당하며, FLAG-표지된 PPARγ를 FLAG-M2 아가로오스를 사용하여 정제하였다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 몇 개의 밴드가 관찰되었으며, 이중 질량 분석법과 조합하여 액체 크로마토그래피를 수행하였다.

TRIM25와 PPARγ 사이의 상호 작용을 확인하기 위해 PPARγ를 배양된 지방 세포로부터 면역 침강시키고, TRIM25를 면역 블롯팅(웨스턴 블롯팅)으로 검출하였다. 도 1b에 나타난 바와 같이, PPARγ는 내인성 TRIM25와 상호 작용한다. TRIM25와 PPARγ 사이의 상호 작용의 구조적 측면은 A/B 영역 (전사 조절 영역), DNA 결합 도메인/힌지 영역 (DBD/H) 및 리간드 결합 도메인 (LBD)을 포함하는 재조합 PPARγ 단편을 사용하여 시험관 내에서 추가로 조사되었다. 도 1c에 나타난 바와 같이, TRIM25는 PPARγ의 DBD/H 도메인과 특이적으로 상호 작용한다. 추가로 TRIM25가 PPARγ에 결합하는데 필요한 특정 영역을 결정하기 위해 잘게 절단된 TRIM25 단편의 작은 영역을 HEK-293 세포에 도입하고 TRIM25로 공 면역 침전시켰다. TRIM25의 HA-태그 결실 돌연변이가 생성되었고, 이들은 HEK-293 세포에서 PPARγ과 함께 발현되었다. 도 1d에 도시 된 바와 같이, TRIM25의 아미노산 81-185는 PPARγ와의 상호 작용에 필요하다는 점을 확인할 수 있었다.

<실시예 2: TRIM25의 E3 리가아제 활성과 PPARγ 단백질의 안정성>

E3 리가아제로서 TRIM25의 역할을 밝히기 위해 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 가지지 않는 세린(C50S/C53S) (TRIM25CS)으로 시스테인 50 및 53을 돌연변이 시킴으로써 E3 리가아제 결함 TRIM25 돌연변이를 사용하였다.

먼저, PPARγ 전사 활성에 대한 TRIM25의 효과를 조사하기 위해 PPRE (peroxisome proliferator response element) - 함유 루시페라아제 구조를 발현하는 HEK-293 세포에서 루시페라아제 분석을 수행하였다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, TRIM25^WT의 과발현은 PPARγ 전사 활성을 감소시켰다. 특히, TRIM25^CS는 PPARγ 전사 활성을 억제할 수 없었으며, 이는 E3 유비퀴틴 리가아제가 PPARγ 전사 활성 조절에 중요하다는 것을 의미한다. 이러한 결과와 마찬가지로, 두 개의 서로 다른 siRNA #1 및 #2를 사용한 TRIM25의 특이적 녹다운(knockdown)은 PPARγ 전사 활성을 증가시켰다(도 2b 참조). 또한, 두 개의 다른 TRIM25 siRNA는 mRNA 수준을 변화시키지 않으면서 PPARγ 단백질 수준을 증가시켰다 (도 2c 참조). 결론적으로, 이와 같은 실험결과는 TRIM25는 E3 리가아제 활성에 따라 PPARγ 단백질 수준을 조절할 수 있음을 시사한다.

다음으로, PPARγ 단백질 안정성에 대한 TRIM25의 효과를 조사했다. TRIM25^WT와 TRIM25^CS 돌연변이체 모두 PPARγ와 상호 작용하였으나, TRIM25^WT는 PPARγ 분해를 유도한 반면, TRIM25^CS 돌연변이체는 그렇지 않았다 (도 2d 참조). 또한, TRIM25^WT 발현의 증가는 용량 의존적으로 PPARγ 단백질 발현을 감소시키는 반면, TRIM25^CS 돌연변이체는 그렇지 않았다 (도 2e 참조). 이는 TRIM25의 E3 리가아제 활성이 PPARγ 분해에 관여함을 의미한다.

한편, TRIM25의 강제 발현은 특정 프로테아좀 억제제인 MG132로 처리하여 회복된 PPARγ의 단백질 수준을 유의하게 감소시켰다 (도 2f 참조). 이와 같은 결과들은 PPARγ 분해가 TRIM25에 의한 프로테아좀 경로에 의존한다는 것을 강력히 시사한다.

마지막으로, 과다 발현되거나 하향 조절된 TRIM25를 사용하여 cycloheximide chase assay로 PPARγ의 반감기를 측정했다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, PPARγ의 반감기는 TRIM25^WT에 의해 유의적으로 감소된 반면, TRIM25^CS는 대조군에 비해 유의적으로 감소되지 않았다. 또한, 도 3b에 나타난 결과를 통해, TRIM25의 특이적 knockdown은 PPARγ를 안정화시킬 수 있으며, TRIM25가 PPARγ의 단백질 안정성의 주요 조절 인자임을 확인할 수 있다.

<실시예 3: TRIM25에 의한 PPARγ의 유비퀴틴화>

TRIM25가 PPARγ에 특이적인 E3 리가아제로서 기능하는지 여부를 확인하기 위해 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 레트로 바이러스 시스템을 사용하여 TRIM25^WT 또는TRIM25^CS 돌연변이체를 안정적으로 과발현하는 3T3-L1 세포주를 제조하였다. 공벡터로 형질 감염된 대조군 세포주와 함께 세포들은 지방세포로 완전히 분화되었다. 배양된 지방세포의 내인성 PPARγ를 면역 침강시켜 웨스턴 블롯팅을 통해 PPARγ의 유비퀴틴화를 검출하였다(도 4a). PPARγ의 단백질 수준은 TRIM25^WT에 의해 감소되었으나, TRIM25^WT는 MG132로 전처리한 후 PPARγ 유비퀴틴화를 증가시켰고, TRIM25^CS는 그렇지 않았다. 이러한 결과와 일치하여, 일시적으로 발현된 TRIM25^WT는 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포에서 TRIM25^CS 돌연변이체와 비교하여 PPARγ 유비퀴틴화를 강화시켰다(도 4b).

PPARγ의 유비퀴틴화에 대한 TRIM25의 직접적인 효과를 확인하기 위해 정제된 TRIM25와 PPARγ를 사용하여 in vitro 유비퀴틴화 분석을 수행한 결과, TRIM25^WT는 재조합 PPARγ의 유비퀴틴화를 유도한 반면(도 4c), TRIM25^CS는 그렇지 않았다(도 4d). 이는, PPARγ가 TRIM25의 기질임을 시사한다.

<실시예 4: PPARγ의 티로신 인산화>

또한, PPARγ의 공지된 인산화 부위가 TRIM25를 매개로 하는 PPARγ의 유비퀴틴화 및 분해를 조절할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, HEK-293 세포를 PPARγ^WT, PPARγ^Y78F 또는 PPARγ^Y78E와 TRIM25^WT로 형질 감염시킨 다음, 단백질 발현을 측정하고(도 8a), 세포 용해물을 α-FLAG항체와 함께 배양하여 PPARγ의 유비퀴틴화를 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다(도 8b). 그 결과, PPARγ Y78에서의 인산화는 TRIM25 매개 PPARγ 유비퀴틴화와 PPARγ 축적을 현저하게 억제시키는 것이 관찰되었다. Y78에서의 PPARγ의 티로신 인산화는 c-Abl 또는 c-Src 키나아제에 의해 유도되는 것으로, 두 키나아제는 지방세포 분화에 필요하다. 따라서, 이러한 실험결과는 Y78에서의 PPARγ 인산화의 조절이 단백질 안정성과 지방세포 분화에 중요한 조절 기작일 수 있음을 시사한다.

<실시예 5: TRIM25와 PPARγ의 상관관계>

TRIM 25와 PPARγ의 생리적 관련성을 조사하기 위해 웨스턴 블롯 분석과 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, TRIM25는 지방전구세포(pre-adipocyte)에서 발현되었으며, 지방세포생성(adipogenesis) 과정에서 그 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5a 및 5b). 또한, TRIM25의 발현과는 달리 PPARγ와 aP2 및 adiponectin을 포함하는 지방생성 마커의 유전자가 유의하게 증가하여 TRIM25의 발현이 PPARγ와 음의 상관관계를 보였다.

다음으로, 고지방 사료로 유발된 비만 모델 마우스(high fat diet-induced obesity model mice (HFD))와 유전적으로 유발된 비만 모델 마우스(ob/ob)의 지방 조직에서 TRIM25의 발현을 측정하였다. 그 결과, 도 5c 및 5d에 나타난 바와 같이, TRIM25의 발현은 유의하게 하향 조절된 반면, PPARγ의 발현은 대조군 마우스에 비해 HFD 및 ob/ob 마우스의 지방조직에서 현저하게 상향 조절되었다.

지방 조직에서 TRIM25와 PPARγ 발현 사이의 상관관계가 인간에서도 관련이 있는지 알아보기 위해, 유전자형-장기-표현형(Genotype-Tissue Expression, (GTEx)) 프로젝트로부터 338 개의 인간 지방 조직의 RNA 서열 분석 데이터를 사용하여 TRIM25와 PPARγ 유전자 발현의 상관관계를 분석했다. 그 결과, 도 5e에 나타낸 바와 같이, TRIM25의 발현은 PPARγ의 발현과 유의한 음의 상관관계를 보였다.

<실시예 6: TRIM25의 지방세포 분화 억제효과>

상기 실시예에서 확인된 TRIM25에 의한 PPARγ 안정성의 하향 조절 결과와 일치하여, TRIM25^WT가 3T3-L1 세포의 분화 중에 발현될 때, 중성 지방 축적이 억제된다는 것이 확인되었다(도 6a). 중성 지방의 축적은 Oil-red O 염색을 통해 확인하였다. 또한, aP2, C/EBP-α, adiponectin, adipsin, glucose transporter-4(GLUT4) 및 LPL을 포함하는 지방 세포 선택적 단백질과 유전자의 mRNA의 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 6b 및 6c). 이와는 달리, TRIM25^CS 돌연변이체는 지방 형성 마커의 발현을 변화시키지 않았다. 그리고, TRIM25를 타겟으로 하는 shRNA를 발현하는 렌티 바이러스를 이용한 TRIM25의 특이적 녹다운은 대조군에 비해 지방세포의 분화(도 6d) 및 지방세포 특이적 단백질과 유전자의 발현을 증가시켰다(도 6e 및6f).

야생형(WT)과 TRIM25 녹아웃(KO) MEF를 사용하여 지방생성에 대한 TRIM25의 효과를 확인한 결과, WT MEF에 비해 KO MEF는 매우 향상된 지질 축적을 나타냈다(도 7a). 게다가, 지방생성 마커의 발현은 WT MEF에 비해 KO MEF에서 유의하게 증가하였다(도 7b 및 7c).

상기와 같은 결과는, TRIM25가 PPARγ 의존성 지방생성 과정의 조절에 중요한 역할을 한다는 점을 시사한다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims

TRIM25(tripartite motif-containing 25)를 유효성분으로 함유하는, PPARγ 분해용 조성물.
TRIM25(tripartite motif-containing 25)를 유효성분으로 함유하는, 시험관 내(in vitro) PPARγ 분해용 시약 조성물.
시험관 내(in vitro)에서 TRIM25(tripartite motif-containing 25)을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내 PPARγ 분해 방법.