MXPA03002916A - Metodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades inflamatorias. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se dirige a composiciones y metodos para tratar enfermedades inflamatorias que comprende la administracion de composiciones que efectuan la proteina o gen de 3bgr; cinasa de glucogeno sintasa (GSK- 3bgr;). La presente invencion tambien comprende metodos y composiciones para la identificacion de compuestos o agentes terapeuticos que modulan la actividad de la proteina. La presente invencion proporciona composiciones para y metodos de tratamiento de condiciones biologicas que incluyen, pero no se limitan a, vasculopatia inducida por la diabetes tipo I y tipo II, otras vasculopatias, asma y enfermedades inducidas por inflamacion tales como ateroesclerosis y proliferacion celular.

Description

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METODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a compuestos y métodos para tratar condiciones inflamatorias crónicas y agudas, en particular, la presente invención se dirige a métodos para detectar compuestos que interactúan con la proteína cinasa, glicógeno sintasa-cinasa 3ß (GSK-3 ) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las condiciones inflamatorias crónicas y agudas forman la base para las enfermedades que afectan todos los sistemas orgánicos incluyendo, pero no limitados a asma, enfermedades inflamatorias agudas, enfermedad inflamatoria vascular, inflamación crónica, aterosclerosis , angiopatía, miocarditis, nefrititis, enfermedad de Chron, artritis, diabetes tipo I y tipo II y patologías vasculares asociadas. La incidencia de estas condiciones inflamatorias está en el surgimiento en la población como un total, con diabetes sólo que afecta 16 millones de personas . Aunque la inflamación en y de sí misma es una respuesta inmune normal, la inflamación crónica conduce a complicaciones y progreso en el sistema que daña debido a 2 las interacciones de los factores celulares desconocidos. En particular, la inflamación crónica puede provocar el daño endotelial que resulta en complicaciones vasculares. La arteria coronaria, cerebrovascular y enfermedad vascular periférica que resulta de la macroangiopatía aterosclerotica y tromboembólica son las causas principales de mortalidad en enfermedades inflamatorias crónicas (1,2) . La inflamación se mantiene por citocinas inflamatorias que incrementan la producción del crecimiento de genes de promoción por células vasculares y leucocitos que conducen a la formación de lesión incrementada en los vasos sanguíneos. IL-1, por ejemplo, incrementa la producción de cadena de factor A de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) por células del músculo liso. PDGF induce a la proliferación de fibroblastos, microglia, y músculo liso. PDGF puede también servir como un agente quimiotáctico para células inflamatorias, por lo que continúa el ciclo y conduce al daño adicional. Sin embargo, actualmente existen agentes farmacéuticos dirigidos a tratar condiciones inflamatorias, ninguno de estos agentes son capaces de controlar específicamente componentes celulares provocados por las respuestas y componentes inflamatorios 3 que son los agentes provocados por la inflamación. Lo que se necesitan son composiciones y métodos que específicamente señalen componentes celulares de inflamación para tratar enfermedades y condiciones que son provocadas por o conducen a estados inflamatorios.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La Presente invención comprende composiciones y métodos para tratar condiciones biológicas, particularmente condiciones inflamatorias tales como diabetes tipo I y tipo II inducidas por vasculopatía, otras vasculopatías , asma y enfermedades inducidas por inflamación tales como aterosclerosis y proliferación celular . En particular, una modalidad preferida de la presente invención comprende métodos y composiciones para tratar condiciones biológicas mediadas por GSK-3p. La presente invención también comprende métodos para identificar, marcar y utilizar composiciones que llevan a cabo la actividad de GSK-3p y la actividad de moléculas biológicas que llevan a cabo la actividad de GS -33. Métodos preferidos comprenden administrar una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un activador selectivo de GSK-3P en un sujeto que tiene una condición mediada por inflamación o en un sujeto 4 susceptible a tal condición. Tales condiciones mediadas por inflamatorias, o enfermedad inflamatoria, incluyen, pero no se limitan a, asma, inflamación aguda, inflamación crónica, diabetes tipo I o diabetes tipo II y todas de las patologías relacionadas. Otras condiciones que se tratan por las composiciones y métodos de la presente invención comprenden precursores de enfermedades inflamatorias o condiciones relacionadas como tal hiperinsulinemi . La presente invención además comprende el uso de realizadores GS -3 en el tratamiento de trastornos proli erativos tales como proliferación celular del músculo liso.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una ilustración de un gel de electroforesis que muestra el RT-PCR que resulta en las células endoteliales . La Figura 2 es un gráfico que muestra la producción endotelial de IL-6. La Figura 3 es un gráfico que muestra la producción celular endotelial de VCAM-1. La Figura 4 es un gráfico que muestra la producción celular endotelial de MCP-1. La Figura 5 es un diagrama esquemático que 5 ilustra varias trayectorias que resultan en la inhibición de la producción GSK-3p. La Figura 6a es un gráfico de regulación de T5?-3ß por agentes inflamatorios. La Figura 6b es una fotografía de la transferencia Western de la expresión GSK-3 en respuesta a los agentes inflamatorios. La Figura 7 es un gráfico de los efectos de la secreción IL-6 en las células transfectadas por oligonucleótido sentido y antisentido. La Figura 8 es un gráfico de los efectos de la secreción MCP-1 en las células transfectadas por oligonucleótido sentido y antisentido. La Figura 9a es un gráfico de los efectos de la sobreexpresión GSK-3P en IL-6. La Figura 9b es un gráfico de los efectos de la sobreexpresión GSK-3 en MCP-1. La Figura 9c es una fotografía de transferencia Western que demuestra la sobreexpresión de GSK-3p en las células transducidas por el vector GSK-3 . La Figura 10 es un gráfico de efectos de GSK-3 en la proliferación celular del músculo liso. La Figura 11 A y B son gráficos que muestran la actividad de luciferasa en células transfectadas con la construcción del promotor de GSK-3p. 6 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a composiciones y métodos para el tratamiento de estados de enfermedad inflamatorio, precondiciones y condiciones relacionadas y patologías. La presente invención también se dirige a ensayos y métodos de detección y composiciones para determinar compuestos que llevan a cabo los componentes celulares que involucran los estados de enfermedad inflamatoria, precondiciones y condiciones relacionadas y patologías. En particular, la presente invención comprende modalidades preferidas que se dirigen a métodos y composiciones que llevan a cabo la actividad GSK-3p, más preferiblemente, métodos y composiciones que regulan en forma ascendente la actividad GSK-3P. La presente invención además se dirige a composiciones y métodos para controlar la proliferación celular. En particular, la presente invención comprende composiciones que llevan a cabo la actividad GSK 3p para promover la proliferación celular para el tratamiento de heridas, úlceras, y otras condiciones que comprenden el recrecimiento del tejido saludable . La glicógeno sintasa-cinasa 3 (GSK3) es una proteína cinasa altamente conservada implicada en la determinación del destino celular y la señalización hormonal. Se ha descubierto originalmente como la cinasa 7 que fosforila la glicógeno sintasa (1) . GSK3 consiste de dos isoformas, a (GSK3 ) y ß (T??-3ß) , que están oblicuocidadamente expresadas. GSK3 constitu ivamente activa en las células en reposo, inhibición de glicógeno sintasa por fosforilación directa. GSK3 de preferencia foaforila residuos serina y treonina en el aminoácido que motiva la serina-prolina o treonina-prolin . Deade la descripción original de GSK3 , otras proteínas se ha identificado que se fosforilan o de otra manera regulan por GSK-3p, incluyendo la proteína fosfatasas, cinasas, moléculas de adhesión, proteína Tau asociada con el microtúbulo, el producto de gen adenomatoso poliposis coli (APC) y diversos factores de transcripción incluyendo c-Jun/AP-1 y CCAAT/proteína de enlace-mejorador (C/EBP) (3-6) . Aunque los activadores transcripcionales de GS -3P aún no han sido identificados, la actividad de GSK-3 puede regularse en forma transcripcional posteriormente por fosforilación (7-9) . Por ejemplo, la actividad de GSK-3 pueden ser regulada hacia abajo por la fosforilación directa de serina 9 que se cataliza por la proteína cinasa tal como p70S6K, p90rsk, ciertas isoformas de PKC (por ejemplo, ???d) , así como la trayectoria de 3-cinasa-PKB de fosfatidil inositol activado por insulina (8, 9) . Los niveles elevados de GSK-3p se han encontrado en el 8 músculo del esqueleto de pacientes diabéticos, que pueden contribuir a la actividad glicógeno sintasa deteriorada y la resistencia a la insulina del esqueleto presente en la diabetes tipo II. Aunque GSK-3 se conoce para catalizar la fosforilación de diversas proteínas cinasas y otras proteínas, el rol específico de que GSK-33 tenga la señalización celular permanece poco clara. Los ratones con un gen GSK-3p desestabilizado desarrolla la degeneración del hígado durante la gestación media. Aunque no se desea estar ligado por cualquier teoría particular, se cree que el GSK-3 se requiere para la señalización NF- ? y que GSK-3 promueve a la expresión del gen inducido por NF-??. NF-KB es el factor de transcripción que juega un papel necesario en la activación de genes en respuesta al estímulo inflamatorio tal como TNFa e interleucina -?ß (11, 12) . La regulación en forma ascendente de moléculas involucrada en la inflamación endotelial y la adhesión del leucocito tal como la molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1) , proteína quimioatrayente de monocito-1 (MCP-1) , selectinas, proteína inducible por interferon (IP-10) , monocína inducida por IFN-g (MIG) , quimioatrayente a de célula T inducible por interferon (I-TAC) , e interleucina- 6 , conduce a la disfunción endotelial y vasculopatía (3,4) . 9 NF- ? se compone normalmente de dos subunidades, p50 y p65. En las células en reposo, los complejos NF-?? se retienen en el citoplasma por asociación con una proteína inhibitoria llamada ?-??. La activación de NF-?? requiere la degradación dependiente de la fosforilación de ?-?? por el proteosoma 26S. El dímero NF-?? libre rápidamente transubica al núcleo y lo une a los sitios de respuesta NF-??, por lo que ejerce su efecto en la expresión del gen. Las etapas tempranas conducen a la activación NF-?? (degradación de ?-?? y transubicación de NF- ? en el núcleo) no son afectados por la pérdida de GSK- 3ß, que indican que NF- ? se regula por T3?-3ß después de la transubicación de NF- ? en el núcleo. Sin embargo, una conclusión importante a ser obtenida a partir de este trabajo es que únicamente un subconjunto de genes inducibles por NF-?? son dependientes en la función GSK-33 con base en la observación de tal síntesis ?-?? nueva, que está debajo del control transcripcional de NF-??, se cambian de nuevo en células deficientes GSK-3p. El mecanismo por el cual GSK-3P regula la actividad NF-?? no es clara. Las teorías no ligadas incluyen la modulación, por fosforilación, de las actividades de los factores CCAAT de transcripción/proteína de enlace mejoradora (C/EBP) y la 10 proteína de enlace del elemento de reapuesta AMP cíclica (CREB) (18, 19) . GSK-3p puede fosforilar ambos C/EBP y CREB y positivamente regula su actividad. C/EBP son miembros de una familia de factores de transcripción de cierre de la región de la enzima básica implicada en la regulación de la expresión de la citosina inflamatoria así como otros productos de gen asociados en la activación del macrófago y la respuesta de fase aguda. GS -3P junto con la proteína cinasa A pueden fosforilar CREB. La transfección de las células con GSK-3P induce a un incremento de 60 veces en la transcripción dependiente de CREB, mediada mediante la proteína endógena CREB (18) . CREB regula la transcripción de los agentes de sobrevivencia endotelial clave tales como bel -2 (19) . bcl-2 puede a su vez descender para regular NF-KB resultante en la disminución de la inflamación (20) . En la literatura, GSK-3 se ha dado en diversas funciones. Esto incluye la inhibición de la síntesis de glicógeno, la modulación de la glucosa incorporada por los tejidos y la contribución y la resistencia de insulina (5, 6, 21, 22) . Datos recientes, sin embargo, indican que GSK-33 tiene poca representación, si lo hay en todo el metabolismo de glucosa/glicógeno. Los ratones deficientes en GSK-3P tienen el metabolismo de glicógeno normal y la sobre-expresión de GSK-3P en adipositos y que 11 no significativamente inhiben ya sea la actividad Akt/PKB o la incorporación de glucosa estimulada por insulina. De este modo, GS -3 es improbable que contribuya a la estimulación de insulina de la síntesis de glicógeno y no a la reincorporación de glucosa o transubicación de GLUT4. Sorprendentemente, se ha encontrado que existe función protectora para GSK-3P en oposición a la expresión de gen inflamatorio inducido por NF-?? y que las composiciones y métodos para incrementar la actividad GSK-3 son útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, las precondiciones y condiciones relacionadas y patología. Tales patologías incluyen, pero no se limitan a, diabetes tipo I y tipo II inducidas por vasculopatía, otras vasculopatías tales como nefropatía y retinopatía, asma y ateroesclerosis . Por ejemplo, la presente invención comprende composiciones que llevan a cabo la regulación GSK-3P en los te idos tales como el riñón para el tratamiento de la respuesta inflamatoria local y nefropatía. Un aspecto de la presente invención comprende métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades, precondiciones o patologías asociadas con las citocinas inflamatorias que incluyen, pero no se limitan a TNF , IL-6, VCAM-1, MCP-l inducido por AGE, 12 selectinas, IP-IO, MIG e I-TAC. Estas citocinas se piensa que llevan a cabo las patogénesis de ateroscleroais y el desarrollo de vasculopatía diabética en la diabetes tipo II. Por ejemplo, afectan la actividad del nivel de TNFa en el mediador clave del daño del tejido seguido por las reacciones inflamatorias agudas o crónicas. La presente invención contempla proporcionar composiciones y métodos para regular en forma ascendente GSK-3p para contrarrestar los efectos de citosinas tales como TNFa, IL-6, VCAM-1 IP-10, MIG, I-TAC y MCP-1 inducida por AGE, y tratar las enfermedades asociadas, precondiciones y patologías . Por ejemplo, un método preferido comprende administrar a un individuo que padece una reacción inflamatoria aguda, tal como sepsis, una cantidad efectiva de una composición que provoque un incremento en la cantidad de proteína de GSK-3P o un incremento en el nivel de actividad de GSK-3 . Adicionalmente , un método preferido comprende administrar a un individuo con una reacción inflamatoria crónica, tal como vasculopatía diabética de fase temprana, una cantidad efectiva de una composición que provoque y mantenga una cantidad incrementada de proteína de GSK-3p o un nivel incrementado de la actividad de GSK-3 que controle o detenga el avance de la vasculopatía. 13 Una modalidad preferida de la presente invención comprende métodos y composiciones para el tratamiento de vasculopatía diabética, tal como se ve en la diabetes tipo II. La diabetes tipo II se caracteriza por la resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, y carbohidratos alterados y metabolismo lípido que resulta en hiperglicemia y formación de producto de glucación avanzada final (AGE) . Aunque no se desea que se encuentre por ninguna teoría particular, se teoriza que las condiciones fisiológicas presentes en la diabetes tipo II llevan a la regulación negativa de T? -3ß por dos trayectorias independientes, una trayectoria activada por la insulina y otra trayectoria activada por AGE. AGE incrementa la oxidizabilidad lipoproteínica y aterogénesis . AGE que enlaza a las proteínas de la matriz induce la síntesis de IL-1, TNFa, VCAM-1, Heme oxigenasa, factor de crecimiento tipo insulina e IL-6, y activa NF-KB. Se cree que la regulación de manera descendente de GSK-3P por cualquiera o ambas de las trayectorias lleva a vasculopatía severa (véase Figura 5) . La terapia actualmente recomendada para pacientes tipo II es reducir o invertir la resistencia de insulina, mejorar el control metabólico, e, idealmente, hacerlo así sin exacerbar la hiperinsulinemia. La presente invención comprende métodos para tratar estas condiciones al administrar 14 composiciones que incrementen la actividad de GSK-3p o incrementen la cantidad de GSK-3p para reducir la vasculopatía asociada por la hiperinsulinemia . La dosificación de las composiciones que comprende el compuesto que efectúa GSK-3 dependerá de la condición que se trata, el compuesto particular y otros factores clínicos tales como el peso y condición del humano o animal y la ruta de administración de la composición. Se entenderá que la presente invención tiene aplicación para ambos usos humanos y veterinarios. Para la administración oral a humanos o animales, una dosificación de aproximadamente 0.01 a 300 mg/kg/día, de preferencia entre aproximadamente 0.5 y 50 mg/kg/día, y de mayor preferencia de entre aproximadamente 1 a 10 mg/kg/día, generalmente es suficiente. Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, oftálmica, (incluyendo intravítreo o intracavidad) nasal, tópico (que incluye bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratraqueal , y epidural) . Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación por unidad y pueden prepararse por técnicas farmacéuticas convencionales. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación el ingrediente activo y el portador o 15 portadores farmacéuticos o excipiente o excipientes. En general, las formulaciones se preparan al unir uniforme e íntimamente en asociación el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, conformando el producto. Formulaciones de la presente invención adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, obleas, o tabletas que contienen una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como un polvo o gránulos, como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o un liquido no acuoso, o como una emulsión de líquido de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite y tal como bolos, etc. Una tableta puede hacerse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes no esenciales. Las tabletas comprimidas pueden prepararse por compresión en una máquina adecuada, el ingrediente activo en una forma libre de flujo tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservador, agente activo de superficie o de dispersión. Las tabletas de moldeo pueden hacerse por moldeo, en una máquina adecuada, una mezcla del compuesto en polvo humectado con un diluyente 16 líquido inerte. Las tabletas pueden recubrirse opcionalmente o marcarse o pueden formularse de manera que proporcionen una liberación lenta o controlada del ingrediente activo en el mismo. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen grageas que comprenden los ingredientes en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; Pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuague bucal que comprende el ingrediente para administrarse en un portador líquido adecuado . Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la piel pueden presentarse como ungüentos, cremas, geles y pastas que comprenden el ingrediente administrado en un portador farmacéuticamente aceptable. Un sistema de suministro tópico preferido en un parche transdérmico que contiene el ingrediente a administrarse . Las formulaciones para la administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, mantequilla de cacao o un salicilato. Las formulaciones adecuadas para la administración nasal, en donde el portador es un sólido, 17 incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo en el rango de 20 a 500 micrones que se administra en una forma en la cual se administra por inhalación, por ejemplo, por inhalación rápida a través del pasaje nasal de un contenedor del polvo mantenido cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas, en donde el portador es un líquido, para la administración, por ejemplo, en aspersión nasal o como gotas nasales, incluyen una solución acuosa u oleosa del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden presentarse como pesarios, "tamports", cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aspersión que contienen además del ingrediente activo tales portadores que son conocidos en la técnica por ser apropiados . Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluye soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, reguladores, bacterioestatores y soluciones derretidas que suministran la formulación isotónica con la sangre del recipiente propuesto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en dosis de unidad o contenedores de varias dosis, por ejemplo, ampolletas y 18 frascos sellados, y pueden almacenarse en condiciones secadas por congelación (liofilizadas) requiriendo únicamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones de inyección extemporáneas y suspensiones pueden prepararse de polvos estériles, gránulos y tabletas de la clase previamente descrita. Las formulaciones de dosis de unidad preferida son aquellas que contienen una dosis diaria o unidad, una subdosis diaria, como la misma se cita en lo anterior o una fracción adecuada de la misma, del ingrediente administrado . Debe entenderse que además de los ingredientes, particularmente antes mencionados, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica que se han estimado en el tipo de la formulación en cuestión, por ejemplo, aquellos adecuados para la administración oral pueden incluir agentes saborizantes . Como se utilizan aquí, los "GSK-3p realizados" incluyen inhibir o estimular la actividad de la proteína GSK-3p o incrementar o disminuir la cantidad de la proteína GSK-3 . Los compuestos o composiciones que provocan estos efectos se refieren a aquellos efectos de GSK-3p. 19 Las composiciones comprenden compuestos que inducen GSK-3p que son útiles para controlar TNF-inducida así como la inflamación diabética. Las composiciones con efectos de estimulación GSK-3p son útiles como terapéuticos anti-inflamatorios y anti-proliferativos . Estos activadores selectivos de GSK-3P incluyen pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, peptoides o polinucleótidos que actúan directamente en GSK-33 para modular la actividad enzimática o incrementar la estabilidad biológica de la enzima. Además, los activadores selectivos de GSK- 3ß pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, peptoides o polinucleótidos que incrementan la biosíntesis de GSK-33 incrementando la transcripción del gen GSK-3P, incrementando la estabilidad biológica de la ARNm GSK-3P o incrementando la traducción de ARNm GSK-3P en la protelna. Además, los activadores selectivos de GSK-3P pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, peptoides o polinucleótidos que bloquean o disminuyen los efectos de los agentes o proteínas que inhiben la actividad de GSK-3p. La presente invención también comprende métodos y composiciones para ensayos que son útiles en la identificación de tales activadores selectivos o inhibidores de GSK-3p. Estos ensayos rápida y fácilmente 20 determinan a los activadores que regulan de manera ascendente e inhibidores que regulan de manera descendente la cantidad de GSK-3 en su actividad. En general, tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, ensayos basados en el promotor para identificar loe efectores de GSK-3p; tratar células con inhibidores GSK-3ß, incluyendo pero no limitados a insulina o litio, seleccionando después para los compuestos que alteran la concentración de las citosinas inflamatorias en el medio,-tratar células con moléculas inflamatorias, y selección para los compuestos que son efectores de GSK-3 ; ensayos para la actividad enzimática T8 -3ß recombinantes , parcialmente la proteína purificada o lisatos a partir de las células que expresan GSK-3 en presencia o ausencia de compuestos de interés. Las medidas de GSK-33 incluyen los ensayos de actividad enzimática y cuantificación de la proteína GSK-33 como utilizando las determinaciones de ELISA o transferencia Western o cuantificaciones de ARN ?3?-3ß utilizando RT_PCR, o transf rencias Northern. Un método preferido de la presente invención comprende lo siguiente. La células se incuban con el compuesto a ser probado, tales compuestos están en un efector de potencial de GSK-3P en presencia o ausencia de una molécula inflamatoria, tal como una citosina, preferiblemente un agente inflamatorio tal como TNFa, LDL 21 oxidizada, ?1-1ß o AGE. Las células o sobrenadantes se prueban para un determinante de la actividad GSK-3P o expresión. La medida de los efectos en GSK-3p indican si el compuesto supuesto es un activador o supresor de GSK-3ß. Por ejemplo, un juego de las células endoteliales se incuba con el compuesto a ser solo probado, y un juego de células endoteliales se incuba con el compuesto a ser probado y TNF . Uno o más determinantes de la actividad GSK-3P o expresión se miden, tales como la medición de 11-6, VCAM-1 p MCP-1 utilizando un ELISA específico para cada uno. El determinante para la actividad de GSK-3p o la expresión como se utiliza en la presente, incluyen cualquier cambio que sea medible y ocurra debido al gen GSK-3p, ARNm, proteína o nivel de actividad que han sido alterados. Por ejemplo, la medición de tales determinantes incluyen pero no se limitan a, la medición de la cantidad de la proteína GSK-3P o ARNm presente en células o sobrenadantes, medida de cambios en los factores celulares debido a los cambios en GSK-3P tales como la medida de IL-6, VCAM o MCP-1; y medidas en cambios de la expresión del genómico o genes recombinantes GSK-3p o promotores o proteínas que afectan la expresión. Si el nivel del determinante se disminuye, entonces el compuesto supuesto es un incrementador de GSK-3P y si el nivel del determinante se incrementa, el 22 compuesto supuesto es un inhibidor de GSK-3p. En estos ensayos, las células pueden pretratarse por incubación por agentes inflamatorios talee como AGE o TNFa, previos a la adición de los compuestos que se prueban. Tales ensayos pueden modificarse por autorregulación y una selección de alto rendimiento. Adicionalmente , los efectoB de la inhibición directa de GSK-3P puede confirmarse por la adición de inhibidores específicos conocidos de GSK-3(3, tales como litio, insulina o GSK-3P o oligonucleótido antisentido previo a o en la etapa de la incubación con el compuesto a ser probado. Alternativamente, la determinación de los compuestos que afectan el GSK-3P pueden lograrse en presencia de los estimuladores conocidos de GSK-3p. Un método preferido comprende un ensayo en donde el compuesto a ser probado se incuba sólo con células y los compuestos se incuban con células en presencia de un estimulador conocido de GSK-3P, tal como VEGF , Alternativamente, las células pueden estar preincubadas con el estimulador conocido previo a la incubación con el compuesto a ser probado. Otro método preferido de identificación y determinación de los compuestos que son efectores de GSK-3ß comprenden medir la actividad enzimática GS -3P en lisatos de células que han sido infectados con un vector, preferiblemente un vector adenoviral, que contiene la 23 codificación de ADNc para GSK-3p. La actividad enzimática en tales lisatos se determina en presencia o ausencia de un compuesto a ser probado, tal compuesto es un efector potencial de GSK-3p, y la actividad enzimática medida. El medio para la medición de la actividad enzimática son diversas y conocidas por aquellos expertos en la técnica. Un método preferido involucra la medición de la cantidad de fosforilación de la proteína o sustrato péptido que contiene la secuencia de consenso de proliferación para GSK-3P- Alternativamente, las células también pueden transíectarse con un plásmido que contiene el ADNc GSK-3ß, lisatos de tales células transíectadas preparadas, y la actividad enzimática medida. Otros métodos para la presente invención comprenden medir la actividad de GSK-3 purificado o parcialmente purificado obtenido de las células infectadas o transfectadas como se describe en lo anterior, extractos de tejido, la bacteria que expresa una forma recombinante de GSK-3p o cualquier otro sistema adecuado para la expresión de GSK-3P recombinante. Los métodos de expresión o purificación o recombinante GSK-3P parcialmente purificado se conocen por aquellos expertos en la técnica. Ambos métodos indirectos y directos de medición de cambios en GS -3P se contemplan por la presente invención. Los métodos de ensayo descritos en la presente 24 confían en mediciones indirectas de GSK-3p a través de mediciones de determinantes de la actividad GSK-3p o expresión. Adicionalmente , la determinación directa del cambio en la cantidad de la proteína de GSK-3p puede hacerse utilizando otros métodos inmunológicos tales como transferencia Western, mediciones densitométricas o métodos ELISA. Alternativamente, la determinación directa del cambio en la cantidad de ARNm GSK-3p puede hacerse utilizando RT-PCR o métodos de análisis Northern que son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las mediciones también se hacen directamente utilizando lisatos de células, y proteína GSK-3 purificada o parcialmente purificada que está ya sea en forma natural o recombinante de la proteína. El medio para la medición de la actividad enzimática se conoce por aquellos expertos en la técnica. Un método preferido comprende la medición de la cantidad de fosforilación de la proteína o el sustrato del péptido que contiene la secuencia de consenso de fosforilación para GSK-3p. Otro método preferido de identificación y determinación de los compuestos que son efectores de GS -3ß comprenden identificar compuestos que interactüan con las regiones promotoras del gen GSK-3p, o interactüan y lleva a cabo proteínas que interactüan con la región del promotor, y son importantes en la regulación 25 transcripcional de la expresión de T??-3ß. En general, el método comprende un vector que comprende secuencias regulatorias del gen GS -3P y una región indicadora controlada por las secuencias reguladoras, tales como una enzima, en una construcción de promotor- eportero . El producto de proteína de la región indicadora se refiere en la presente como una enzima reportera o una proteína reportera. La región reguladora de la secuencia de GSK-3P comprende un rango de nucleótidos de aproximadamente -4000 a +953 en donde el sitio de iniciación de transcripción es +1, más preferiblemente, de -2500 a +800, más preferiblemente, de -1478 a +534 con relación al sitio de iniciación de transcripción. Las células son transfectadas con el vector y luego se tratan con compuestos de interés. Por ejemplo, las células transfectadas se tratan con un compuesto supuesto que afecta la transcripción de GS -3p y el nivel de actividad de las secuencias regulatorias de GSK-3 se comparan al nivel de actividad en las células que no se tratan con el compuesto. En otro ejemplo, las células transfectadas se tratan con las citosinas inflamatorias tales como el TNFa, ya sea antes o con adición de un compuesto de interés. El nivel de la actividad de las secuencias regulatorias de GSK-3p se determinan por la medición de la cantidad de la proteína reportera o la 26 determinación de la actividad de la enzima reportera controlada por las secuencias reguladoras. Un incremento en la cantidad de la proteína reportera o la actividad de la enzima reportera muestra un efecto estimulatorio en GS -3p, llevando a cabo positivamente al promotor, mientras que una disminución en la cantidad o la proteína reportera o la actividad de la enzima reportera muestra un efecto negativo sobre el promotor y de este modo, sobre T3?-3ß. Adicionalmente, la presente invención comprende métodos y composiciones para identificar los inhibidores selectivos de la proteína de GSK-3 o la actividad. Estos inhibidores selectivos de GSK-3p son pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, peptoides, o polinucleótidoa que actúan directamente sobre ???-3ß o la región promotora de GSK-3p para modular la actividad enzimática o disminuir la estabilidad biológica de la enzima. Además, los inhibidores selectivos de GSK-3 pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, peptoides, o polinucleótidos que disminuyen la biosíntesis de la GSK-3ß al disminuir la transcripción del gen de ß??-3ß, disminuyendo la estabilidad biológica del ARNm de GS -3 o disminuir la translación de ARNm de GSK-33 en la proteína. Además, los inhibidores selectivos de GSYL-3fii pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, 27 peptoides, o polinucleótidos que bloquean o disminuyen los efectos de agentes o proteínas que incrementan la actividad de GSK-3P. La invención adicionalmente comprende el uso de terapia genética para controlar las respuestas inflamatorias. Un método más preferido comprende la transfección de células con un vector para la expresión de GSK- 33. La invención adicionalmente comprende el uso de terapia genética para controlar la proliferación celular. Un método más preferido comprende la transfección de células, de mayor preferencia células endoteliales o células del músculo liso, con un vector para la expresión Aquellos con experiencia en la técnica ahora observarán que ciertas modificaciones pueden hacerse a la invención descrita en la presente con respecto a las modalidades ilustradas, sin apartarse del espíritu de la invención actual. Y mientras la invención se ha descrito en lo anterior con respecto a las modalidades preferidas, se entenderá que la invención se adapta a numerosas disposiciones, modificaciones y alteraciones, todas las disposiciones, modificaciones y alteraciones se pretenden para estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. 28 EJEMPLOS Ejemplo 1 RT-PCR de T3?-3ß Las células aórticas humanas (HAEC) y endoteliales microvasculares (HMVEC) (Clonetics) se cultivaron y se subcultivaron de acuerdo con el fabricante en un medio de crecimiento (Clonetics) : el medio basal que contiene íiEGF, hidrocortisona, VEGF, HFGF-B (p/heparina) , 3-IGF-1 larga, Ácido Ascórbico, gentamicina/anfotericina y 5% de FBS . Estas células se les permitió alcanzar >90% de confluencia antes de someterse a tratamientos experimentales. HSA glicada (AGE) fue de US Biologicals . El factor a de necrosis tumoral a partir de R&D Systems. Las células HMVEC se trataron con un medio de control o un medio que contiene 10 ng/ml de TNF o 100 µg/ml de HSA glicada durante 24 horas. Todos los tratamientos y controles se llevaron a cabo en un medio libre de suero que contenía 0.2% de albúmina. Las células se recolectaron en PBS frío utilizando un rayador de células utilizado para el aislamiento de ARN. Las células endoteliales se incubaron en un medio solo (control) o medio que contiene TNFa (10 ng/ml) o AGE (100 µ9 p?1) durante 8 horas. El ARN poli (A) se aisló y utilizo como plantilla RT-PC . El ARN poli (A) + se aisló de los cultivos confluentes de HMVEC incubadas bajo 29 diversas condiciones, utilizando el equipo puro de Micropoly (A) (Ambion) . RT-PCR con el sistema de síntesis de Primera Hebra de Superíndice (BRL) ge realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores de oligonucleótidos para la amplificación genética de GS -3 humana fueron; sentido: SEC. DE IDENT . N0.:1: TTCCTTTGGAATCTGCCATC y antisentido: SEC. DE IDENT. N0.:2: GGGTCGGAAGACCTTAGTCC, que representa una región de 406 pb (de 519-925) en la secuencia de codificación de GSK-3p (GS -3p GenBank Accesión No. L33801) . 50 ng del ARN poli (A) y 0.5 µg de cebadores oligo (dT) se utilizaron para la síntesis de la primera hebra de ADNc en una mezcla de reacción que también contenía 10 mM de dNTP y (con o sin) la transcriptasa inversa, Superíndice II RT. Las reacciones se determinaron al calentar las muestras durante 15 minutos a 70 °C. Después, las muestras se pre-trataron durante 20 minutos a 37°C con RNasa H para remover el ARN. PCR se llevó a cabo utilizando una etapa de desnaturalización inicial a 96 °C durante 5 minutos, después se hizo ciclar 35 veces (o 25 veces para RT-PCR cuantitativo) entre 96°C durante 1 minuto, 58°C durante 45 segundos, y 72°C durante 2 minutos. Una etapa de alargamiento final siguió durante 10 minutos a 72°C. Las muestras (10 µ?) se analizaron en un gel de agarosa de 1% y se tiñeron con bromuro de etídio y se visualizó 30 por el iluminador de UV Tran(UVP) . La Figura 1 muestra la inhibición de la expresión de GSK-3p por TNFa y AGE. Un pb 406 (mostrado por la flecha) se observó en las células endoteliales de control solamente cuando se presentó la transcriptasa inversa ( T) . La intensidad de esta banda se disminuyó cuando las células se trataron con TNFa o AGE.

Ejemplo 2 IL-6 ELISA: La inhibición de GSK-3p exacerbó la producción de IL-6 inducida por TNFa por las células endoteliales. Dos inhibidores conocidos de GSK-3p, insulina y litio se utilizaron. Los iones de litio inhiben la actividad de GSK-3p en in vitro y en células intactas (18,19) . Las células aórticas humanas (HAEC) y endoteliales microvasculares (HMVEC) (Clonetics) se cultivaron y se subcultivaron de acuerdo con el fabricante en un medio de crecimiento (Clonetics) : el medio basal que contiene hEGF, hidrocortisona , VEGF, HFGF-B (p/heparina) , R3-IGF-1 larga, Ácido Ascórbico, gentamicina/anfotericina y 5% de FBS . Estas células se les permitió alcanzar >90% de confluencia antes de someterse a tratamientos experimentales. HSA glicada (AGE) fue de US Biologicals. El factor ce de necrosis tumoral fue de R&D Systems. Las células se incubaron con 31 20 mM de litio (como LiCl) o con 20 mM de KC1 como control) en presencia o ausencia de TNF (10 ng/ml) . La insulina (InM) también se utilizó para inhibir T=?-3ß. Las células de H VEC se trataron con el medio de control o el medio que contiene 10 ng/ml de TNFa o 100 µ9/??1 de HSA glicada durante 24 horas. Todos los tratamientos y controles se llevaron a cabo en un medio libre de suero que contiene 0.2% de albúmina. Después del tratamiento, el medio celular se recolectó y se utilizó para IL-6, CP-1 ELISA y las células se utilizaron para VCAM-1 ELISA que se llevó a cabo in situ sin lisis. IL-6 ELISA se llevó a cabo utilizando el equipo de desarrollo ELISA de Doble Conjunto de IL-6 humano como se describe por el fabricante (R&D Systems) . ll-6 anti-humano de ratón se utilizó como el anticuerpo de captura (2 µg/ml) e IL-6 anti-humano de cabra biotinilada (200 ng/ml) se utilizó como el anticuerpo de detección. El medio de cultivo se incubó con el anticuerpo de captura (en 96 pozos) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron tres veces con un regulador de lavado (0.05% de Tween-20 en solución salina regulada por fosfato (PBS) pH 7.4) seguido por la incubación por anticuerpo de detección durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres lavadas, los pozos se incubaron con Streptavidin-HRP durante 20 minutos. El 32 desarrollo de color fue rojo a 450 nm en un lector de microplacas . Como se muestra en la Figura 2, la inhibición de GSK-3 exacerbó la producción de IL-6 inducida por TNFa. Las células endoteliales se expusieron a KC1 (10 mM, como un control) o con TNFa (10 ng/ml) ; LiCl (10 mM) sola y con TNFa (10 ng/ml) , insulina (InM) sola o con TNFa (10 ng/ml) . Después de la incubación durante 24 horas, los medios se recolectaron y se ensayaron por IL-6 por ELISA. Los valores esquematizados son medios de determinaciones duplicadas. La desviación estándar de la media fue de ±10% del valor promedio. Los efectos de estos agentes sobre la secreción de IL-6 se muestran en la Figura 2. Las células endoteliales bajo condiciones básales secretaron aproximadamente 25 pg/ml de IL-6. La incubación de las células endoteliales con KC1, LiCl o insulina no afectaron la secreción de IL-6 (28-34 pg/ml) . TNFa indujo más de 10 veces el incremento en la secreción de IL-6 por las células endoteliales. Aunque los tratamientos de litio e insulina solos no afectaron la secreción de IL-6, cuando se agregó con TNFa, incrementaron adicionalmente las secreciones de IL-6 por el 60-90%. La inhibición específica de GSK-3P exacerbó los efectos de TNFa. La falta de efecto de litio e insulina en la ausencia de 33 TNFa mostró GSK-3 accionada por la regulación de las acciones nucleares de NF-?? pero no indujeron su tranalocación nuclear.

Ejemplo 3 ELISA DE MCP-1 Este Ejemplo mostró que GSK-3p exacerbó la producción de MCP-1 inducida por AGE por las células endoteliales . Igual que TNFa, el tratamiento de AGE disminuyó la expresión de GSK- 3ß en las células endoteliales. AGE ha mostrado que induce MCP-1, otra citosina pro- inflamatoria y albúmina glicada positivamente correlaciona con MCP-1 en pacientes con nefropatía diabética. Los efectos de AGE sobre la MCP-1 endotelial se muestran en la Figura 4. Las células se trataron como se describe en el Ejemplo 2, excepto para el uso de AGE y no para TNFa. Las células endoteliales se expusieron a KC1 (10 mM, como control) o LiCl (10 mM) , KC1 (10 mM) y AGE (300 9/p?1) , LiCl (10 mM) y AGE (300 µg/ml) ; insulina (InM) ; e insulina (InM) y AGE (300 µ9/??1) . Después de la incubación durante 24 horas, los medios se recolectaron y ensayaron para MCP-1 por ELISA. ELISA de MCP-1 se llevó a cabo utilizando el equipo de MCP-1 Humano de Quantikine como se describe por el fabricante (R&D Systems) . El MCP-1 anti-humano de 34 ratón se utilizó como el anticuerpo de captura y el MCP-1 anti -humano de cabra conjugado por HRP se utilizó como el anticuerpo de detección. Los medios de cultivo se incubaron con el anticuerpo de captura (en 96 pozos) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron tres veces con regulador de lavado (0-05% de Tween-20 en PBS seguido por la incubación con el anticuerpo de detección durante 2 horas a temperatura ambiente. El desarrollo de color fue rojo a 450nm en un lector de microplacas. Las células endoteliales cuando se incubaron con 10 mM de KCl produjeron aproximadamente 400 pg/ml de MCP-1. La incubación con el litio solo o la insulina sola incrementó la secreción de MCP-1 por aproximadamente 50%. Cuando se agregaron juntas, el litio y AGE incrementaron MCP-1 por 2.6 veces, mientras que la insulina y AGE incrementaron MCP-1 por aproximadamen e 2.8 veces, lo que muestra que la inhibición de GSK-3p exacerbó los eventos inflamatorios inducidos por AGE. La Figura 4 muestra que la inhibición de GSK-3P exacerbó la producción de MCP-1 inducida por AGE. Los valores esquematizados son medios de determinaciones dobles. La desviación estándar de la media fue de ±10% del valor promedio. 35 Ejemplo 4 ELISA de VCAM-1 La inhibición de GSK-3P alteró la expresión de molécula de adhesión relacionada con la inflamación. VCAM-1 es una molécula de adhesión endotelial que facilita la infiltración de monocitos en el vaso sanguíneo (3) . Las células se trataron como se describe en el Ejemplo 2. LaB células endoteliales se expusieron a KC1 (10 mM; como un control) o con TNFa (10 ng/ml) ; LiCl (10 mM) solo y con TNFa (10 ng/ml) , insulina (InM) sola o con TNFa (10 ng/ml) . Después de la incubación durante 24 horas, los medios se recolectaron y se ensayaron para VCAM-1 por ELISA. ELISA de VCAM-1 se llevó a cabo sobre monocapas de las células endoteliales en placas de 96 pozos. Los pozos se incubaron con 100 µ? de dilución 1:1000 de anticuerpo primario (VCAM-1 anti -humano de cabra policlonal de R&D Systems) en el medio que contiene 10% de FBS . Un IgG-HRP anti-cabra de conejo se utilizó como anticuerpo secundario y ELISA se llevó a cabo como se describe para MCP-1 anterior. Los efectos de la inhibición de Td -3ß sobre la expresión VCAM-1 como se muestra en la Figura 3. El efecto de litio e insulina no es significativo como la expresión VCAM. TNFa incrementa la expresión VCAM-1 a 340% de los niveles básales. La adición de Li a TNFa 36 además incrementó la expresión de VCAM-1 (a 380%) . Notablemente, TNFa cuando se agregó junto con la insulina casi duplica el efecto de TNFa sola sobre la expresión de VCAM-1 que muestra que la inhibición de GSK-3p es pro-inflamatoria. Los valores esquematizados son medios de determinaciones duplicadas. La desviación estándar de la media fue de ±10% del valor promedio.

Ejemplo 5 Expresión de GSK-3P Los anáÜBis de inmunotinción de GSK-3(3 de las células endoteliales tratadas con diferentes agentes inflamatorios y no inflamatorios se realizaron. Estos datos, la transferencia Western y los análisis densitométricos de las bandas, se esquematizaron como se muestra en la Figura 6 (a) . Las células se trataron como se enseña en los Ejemplos 1 y 2. Las células endoteliales se incubaron con un agente durante 24 horas. Los agentes in lamatorios utilizados fueron TNFa, 10 ng/ml, albúmina glicada (AGE 300 , LDL oxidizada (100 ug/ml) e IL-?ß (1 ng/ml) ; y un agente estimulador (VEGF, (10 ng/ml) . Después de la incubación, las células se lavaron, se Usaron y se separaron mediante electroforesis de gel de poliacrilamina . La transferencia Western se realizó, utilizando el anticuerpo dirigido a GSK-3P y se detectó. 37 La expresión de T3?-3ß se disminuyó por todos los agentes inflamatorios probados en este estudio: TNFcc, 10 ng/ml por 70%, albúmina glicada (AGE 300 µ9/t?1) , LDL oxidizada (100 ug/ml) e IL-?ß (1 ng/ml) por 25-50%. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 10 ng/ml) en contraste indujo la expresión de GSK-3P por casi dos veces. De este modo, esos datos muestran que la expresión de GSK-3P se regula de manera descendente por los agentes inflamatorios.

Ejemplo 6 Inhibición antiaentido de QSK-33 Para descartar la posibilidad de efectos no mediados por GSK-3p de litio e insulina y para dirigir específicamente la contribución de GSK-3P a la inhibición de inflamación, oligonucleótidos anti-sentido diseñados para bloquear la translación de GSK-3p se utilizaron. Los derivados de fosforotioato de los siguientes oligonucleótidos basándose en la secuencia de GSK-33 se sintetizaron. Sentido: SEC. DE IDENT. NO . : 3 ATGTCAGGGCGGCCCAGAACCACCTC (ATG representa el codón de inicio de GSK-3p) Antisentido: SEC. DE IDENT. NO.: 4 GAGGTGGTTCTGGGCCGCCCTGACAT (complementario a ARNm de GSK-3ß) Las células endoteliales , como se desarrollan 38 en los Ejemplos 1 y 2, se transfectaron con oligonucleótidos utilizando el reactivo de transfección de citofectina. Después de 24 de transfección, las células se incubaron durante 24 horas con el medio solo o el medio que contiene 300 µg/ml de albúmina glicada (AGE) o el medio que contiene 10 ng/ml de TNFa. IL-6 y MCP-1 se determinaron por ELISA, como se muestra en los Ejemplos 2 y 3. Los efectos de estos tratamientos sobre IL-6 y la secreción de MCP-1 en las células transfectadas por oligonucleótidos sentido y antisentido se muestran en las Figuras 7 y 8. La inhibición de T£?-3ß lleva a un incremento de 4-6 veces en la secreción IL-6 comparada con las células transfectadas sentido. Este incremento se observó en la secreción de IL-6 de nivel basal y la inducida por TNFa y AGE. La inhibición de GSK-3P también resultó en la inducción de la secreción de MCP-1 por 2 veces. Estos datos muestran que la inhibición específica de GSK-3p exacerba la respuesta inflamatoria en las células endoteliales .

Ejemplo 7 Sobre expresión de G3K-3P La inhibición de GSK- 3ß lleva a la expresión genética inflamatoria incrementada en las células endoteliales. La sobre-expresión de la proteína GSK-3p 39 inhibió la expresión genética inflamatoria inducible en las células endoteliales . La longitud completa de ADNc de GSK-33 se clonó en un vector pLIB de retrovirus. Los vectores vacíos o vectores que portan la fosfatasa alcalina se utilizaron como controles. Las partículas de retrovirus que portan diferentes genes se generaron en las células de HEK-293. Las células endoteliales se transdujeron con diferentes vectores y 24 horas después de la transducción, las células se trataron con un medio o el medio que contiene TNF o AGE, como en lo anterior. IL-6 y MCP-1 se determinaron por ELISA como se describe en los Ejemplos 2 y 3. Los efectos de la sobre-expresión de GSK-3p se muestran en la Figura 9. AGE y TNF indujeron la expresión de IL-6 en las células endoteliales transducidas con el vector de control por 7 y 10 veces respectivamente (Figura 9(a)) . Esta inducción se restableció completamente en las células endoteliales transducidas con el vector que porta al GSK-3p. Resultados similares también se encontraron con la inducción de MCP-1. La capacidad de TNF y AGE para inducir MCP-1 se abolió completamente por la sobre-expresión de GSK-3P (Figura 9(b)) . El análisis de transferencia Western de las células reveló la sobre-expresión de GSK-3P en células transducidas con el vector de GS -3P (Figura 9(c)) . Estos 40 datos además confirman que la GSK-3 es una molécula anti-in lamatoria potente, y que la inducción de esta proteína inhibe la expresión genética inflamatoria inducida por los agentes inflamatorios.

Ejemplo 8 Efectos de 03 -3ß sobre la proliferación celular del músculo liso GSK-3 efectúa la proliferación celular del músculo liso. Los efectos de la inhibición de GSK- 3 p sobre el crecimiento celular se probaron utilizando células del músculo liso aórticas humanas. Las células del músculo liso se transfectaron con olígonucleótidos sentido u olígonucleótidos de GSK- 3 p antisentido, como se describe en el Ejemplo 6 , y el crecimiento celular se valoró durante 48 horas. Esos datos se muestran en la Figura 10 . La inhibición de GS - 3 p llevó a un incremento de 60 % en la proliferación celular del músculo liso, que muestra que GSK- 3 p también es anti-proliferativa. Los Ejemplos incluidos en la presente también demostraron que el ARNm de GSK- 3 se expresó en las células endoteliales en las cuales son modulares clave de la respuesta inflamatoria y que GSK- 3 p se reguló en forma de transcripción. Dos diferentes moléculas TNF y AGE pro- inflamatorias diferentes disminuyeron la expresión de ARNm de GSK- 3 ß . Los Ejemplos también muestran que la 41 inhibición de GSK-3p potenció la capacidad de TNFa/AGE para reducir la respuesta inflamatoria. Tres diferentes mediadores de inflamación se indujeron en presencia de dos diferentes inhibidores de GSK~3p, insulina y Litio. Los Ejemplos también demostraron que GS -3P tuvo actividad anti-proliferativa e inhibió la proliferación celular muscular del músculo liso.

Ejemplo 9 Una construcción del promotor- reportero Un promotor de GSK-3p de -2.1 kb (-1478 a +534, con relación al aitio de iniciación de transcripción) se clonó de una biblioteca genómica humana por PCR. El producto de PCR se subclonó en el vector de clonación de pCR2.1 TOPO de T/A (Invitrogen) . El promotor de GSK- 33 se liberó de pCR2.1-TOPO por la digestión de restricción con ??? i y la digestión de restricción de xho I y se ligó en los mismos sitios en el vector pGFL3 -Básico, reportero de la luciferasa (Promega) hacia el extremo 5' del gen de luciferasa. La construcción del promotor/reportero resultante se designó como pGL3-GSK3B-1478/+534.

Ejemplo 10 Transfección con una construcción del promotor- reportero pGL3-GS 3B-1478/+534 se transfectó en células endoteliales aórticas de bovino (BAEC) por 42 electroporación , Las células transíectadae se les aplicó alícuotas en placas de 96 pozos y se dejaron recuperar en un medio completo durante 16-24 horas. Para el estudio de regulación del promotor, ya sea el medio de control, o el medio que contiene TNPa o dexametasona (?µ?) , se agregaron a las células y se incubaron durante 24-48 horas. La actividad de luciferasa se midió en lisatos celulares utilizando el Sistema de Ensayos de Luciferasa de Brillo-Opaco (Promega) . La actividad de luciferasa se incrementó significativamente cuando se transfectó bajo el control del promotor de GSK-3 (pGL3 GSK-3p) comparado con la expresión de luciferasa en ausencia del promotor (pGL3 básico) Figura 11(a) . La actividad del promotor se moduló por los agentes pro- y anti- inflamatorios . El tratamiento con TNFa (10 ng/ml) , un agente pro-inflamatorio conocido, disminuyó la actividad del promotor GSK-33 por más del 50%. En contraste, dexametasona, un agente anti-inflamatorio conocido incrementó la actividad del promotor GSK-3 por el 35% Figura 11 (b) . Estos datos muestran que la expresión de GS -3 se reguló en el nivel de transcripción y que IOB agentes que regulan la expresión de GSK- P pueden identificarse utilizando un procedimiento a base de promotores . Todas las patentes, solicitudes de patentes y 43 artículos científicos citados en la presente se incorporan en su totalidad para referencia. Como se utiliza en la presente, "uno" o "una" pueden significar múltiples. Por ejemplo, "una célula" puede significar por lo menos una célula o más de una célul . Las siguientes referencias se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Referencias : (l)Laight D , Carrier MJ, Anggard EE .

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Claims (1)

1. 47 NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones. 1. Un método para detectar composiciones que efectúan GSK-3p, caracterizado porque comprende: a) agregar una composición que comprenda un compuesto sospechoso de efectuar GSK-3P en las células. b) agregar una molécula inflamatoria; y c) medir el determinante de GSK-3p. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque b) agregar una molécula inflamatoria procede la adición de una composición sospechosa de efectuar el GSK-33 en las células . 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es una molécula orgánica pequeña, péptido, peptoide o polinucleótido . 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula inflamatoria se selecciona del grupo que comprende citosina, AGE o LDL oxidizada. 5. El método de conformidad con la 48 reivindicación 4, caracterizado porque la citosina se selecciona del grupo que consiste de TNFa o IL-?ß. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el determinante de GSK-3 comprende un factor celular seleccionado del grupo que consiste de VCAM-1, MCP-1, IL-6, IP-10, MIG o I-TAC. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque medir el determinante de GSK-3P comprende medir la cantidad de proteína de GSK-3 . 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque medir el determinante de GSK-3p comprende medir la cantidad de 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque medir el determinante de O??-3ß comprende medir la actividad de la cantidad enzimática de GSK-3p\ 10. Un método para detectar composiciones que efectúe GSK-3p, caracterizado porque comprende, a) agregar una composición que comprenda un compuesto sospechoso de efectuar GSK-3P en las células; b) agregar una molécula inflamatoria ,- c) agregar un realizador conocido de GS -3P; y d) medir el determinante de GSK-3 . 49 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el realizador conocido de GSK-3 comprende un inhibidor de GSK-3p. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el inhibidor de GSK-3P es litio o insulina. 13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el realizador conocido de GSK-3P comprende un estimulador de GSK-3p. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el estimulador es VEGF. 15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque b) agregar una molécula inflamatoria procede a) agregar una composición sospechosa de efectuar GSK-3p en las células. 16. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto es una molécula orgánica pequeña, péptido, peptoide o polinucleótido . 17. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la molécula inflamatoria se selecciona del grupo que comprende citosina, AGE o LDL oxidizada. 18. El método de conformidad con la 50 reivindicación 17, caracterizado porque la citosina se selecciona del grupo que consiste de TNFa o IL-?ß. 19. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el determinante de GSK-3p comprende un factor celular seleccionado del grupo que consiste de VCAM-1, MCP-1, IL-6, IP-10, MIG o I-TAC. 20. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque medir el determinante de GSK-3p comprende medir la cantidad de proteína de GS -3p. 21. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque medir el determinante de GSK-3p comprende medir la cantidad de 22. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque medir el determinante de GSK-3P comprende medir la cantidad de la actividad enzimática de GSK-3P . 23. Un método para detectar composiciones que efectúen GSK-3p, caracterizado porque comprende: a) transfectar las células con una construcción de ADN que tenga elementos reguladores promotores del gen de GSK-3P enlazado a un gen reportero; b) agregar una composición sospechosa de 51 efectuar GS -3P en las células; c) medir el determinante del gen reportero. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además comprende agregar una molécula inflamatoria en las células transf ctadas antea de agregar la composición sospechosa de agregar GSK-3p 25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además comprende agregar una molécula inflamatoria cuando ee agregue la composición sospechosa de efectuar GSK-3P en las células transfectadas . 26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además comprende agregar un realizador conocido de GSK-3P después de agregar la composición sospechosa de efectuar GSK-3p en las células. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el realizador conocido de GSK-3p comprende un inhibidor de GSK-3p. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el inhibidor de GS -3P es litio o insulina. 29. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el realizador 52 conocido de GS -3p comprende un estimulador de GS -3P- 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el estimulador es VEGF . 31. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el compuesto es una molécula orgánica pequeña, péptido, peptoide o polinucleótido . 32. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la molécula inflamatoria se selecciona del grupo que comprende citosina, AGE o LDL oxidizada. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la citosina ge selecciona del grupo que comprende TNFa o IL-?ß. 3 . El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el determinante de GSK-3p comprende un factor celular seleccionado del grupo que consiste de VCAM-1, MCP-1, IL-6, IP-10, MIG o I-TAC. 35. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque medir el determinante de GSK-3 comprende medir la cantidad de proteína de GS 3p. 36. El método de conformidad con la 53 reivindicación 23, caracterizado porque medir el determinante de GSK-3P comprende medir la cantidad de 37. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque medir el determinante de GSK- 3 comprende medir la cantidad de la actividad enzimática de GSK-3p. 38. Un método para alterar la proliferación celular, caracterizado porque comprende, administrar a un humano o animal una cantidad efectiva de una composición que comprende por lo menos un compuesto capaz de efectuar GSK-3 . 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque proliferación celular se estimula. 40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la proliferación celular se inhibe. 41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las células son células del músculo liso. 42. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el compuesto estimula GS -3p. 43. Un método para tratar la proliferación 54 celular, caracterizado porque comprende administrar a un humano o animal una cantidad efectiva de una composición que comprende por lo menos un compuesto capaz de efectuar GSK-3p para el tratamiento de restenosis. 44. Un método para tratar la proliferación celular, caracterizado porque comprende administrar a un humano o animal una cantidad efectiva de una composición que comprende por lo menos un compuesto capaz de efectuar GSK-3 para el tratamiento de heridas, úlceras y otras condiciones que comprenden el recrecimiento de tejido saludable . 45. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende por lo menos un compuesto capaz de estimular GSK-3P- 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque por lo menos un compuesto es una molécula orgánica pequeña, péptido, peptoide o polinucleótido . 47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria es diabetes tipo II. 48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria es ateroesclerosis . 55 49. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria es vasculopatia diabética. 50. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria es asma. 51. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria es artritis. 52. La composición para estimular GSK-3p, caracterizada porque comprende el compuesto determinado de conformidad con la reivindicación 1. 53. La composición para estimular GS -3p, caracterizada porque comprende el compuesto determinado de conformidad con la reivindicación 10. 54. La composición para estimular GSK-3p, caracterizada porque comprende el compuesto determinado de conformidad con la reivindicación 23. 55. La composición para inhibir GSK-3p, caracterizada porque comprende el compuesto determinado de conformidad con la reivindicación 1. 56. La composición para inhibir GSK- 3ß, caracterizada porque comprende el compuesto determinado de conformidad con la reivindicación 10. 57. La composición para inhibir GSK-3P,