KR20120098696A - 인플루엔자 바이러스 유형 ａ 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 ｐａｒ－１ 길항제 - Google Patents
인플루엔자 바이러스 유형 ａ 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 ｐａｒ－１ 길항제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염, 특히 H1N1 감염의 치료 또는 예방을 위한 PAR1 길항제를 포함하는 방법 및 조성물 (예를 들면, 제약 조성물)을 제공한다. PAR1 길항제는 PAR2 효능제와 조합될 수 있다.
Description
발명의 분야
본 발명은 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물 (예를 들면, 제약 조성물)을 제공한다.
발명의 배경
유행성 바이러스 감염은 보통 감기에서 생명을 위협하는 인플루엔자, 서나일 (West Nile) 및 HIV 감염에 이르는 인간 질병에서의 의미있는 전세계적인 생명 및 소득의 손실의 원인이다. 시기적절한 검출, 진단 및 치료는 유행성, 범유행성 및 동물유행성 환경에서 질환의 확산을 제한하는데 가장 중요하다. 특히, 바이러스 조립 및 증식을 빠르게 억제하는 예방제 및 치료제는 치료 요법에서 특히 유용하다.
유형 A의 인플루엔자 바이러스 (IAV)는 전염성이 높으며, 의미있는 이환율 및 사망율로 인간 및 동물에 해를 입히는 급성 호흡성 감염을 야기한다. 따라서, 임상 분야에서의 새롭고 개선된 항-바이러스 의약제에 대한 필요성이 있다. 본 발명은 이들 필요성을 충족시킨다.
숙주 선천 면역계의 활성화는 IAV 감염의 확산 및 유해한 영향을 조절하는 목적이 있다. 그러나, 사이토킨 방출의 조절장애 및 중성구의 감염의 부위에의 강한 동원으로 인한 과도한 염증성 반응은, 또한 심한 폐 염증 및 IAV의 증가된 발병기전을 매개할 수 있다. 사이토킨 IAV 감염 중의 조절장애는 따라서 종종 IAV의 치명적인 결과와 연관된다.
호흡기에서의 바이러스 복제의 부위는 세포외 프로테아제가 다량으로 존재하는 복잡한 미세환경을 나타낸다. 이들 프로테아제의 일부 (트립신, 트립타제)는 바이러스 복제 (문헌 [Riteau B. et al. 2006; LeBouder F. et al. 2008]) 및 선천 면역 반응 모두에서 역할을 할 수 있는데, 그 이유는 이들이 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)라고 하는 수용체의 족의 활성화를 통한 염증성 절차의 중요한 매개체이기 때문이다 (문헌 [Steinhoff M. et al. 2005; Vergnolle N. et al. 2008]).
지금까지, 상이한 프로테아제에 의해 활성화된 4개 PAR가 클로닝되었다 (PAR1-4). 프로테아제에 의한 수용체의 절단 후, 새롭게 방출된 아미노-말단 서열은 수용체에 결합하고, 내부적으로 활성화시킨다.
폐 IAV 감염에서의 PAR1의 역할은 문서화되지 않았다. 그러나, pAR1의 상승된 PAR 수준이 IAV-감염된 마우스의 기도에서 관찰되었으며 (문헌 [Lan RS. et al. 2004]), 이는 바이러스 질환의 발병기전에서의 이 수용체에 대한 역할을 제시한다. 생체내 또는 시험관내에서의 PAR1 활성화/불활성화에 대한 특정 역할은 다루어지지 않았다.
발명의 요약
본 발명은 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 PAR1 길항제에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1 a: PAR1 효능제는 상피 세포에서의 바이러스 복제를 증가시킨다. A549는 IAV A/PR/8/34로 감염되었고, PAR1 효능제 펩티드로 처리되거나 또는 처리되지 않았다. 감염-후 나타낸 시간 후, 배양물 상등액에서의 감염성 바이러스 역가를 플라크 검정에 의해 결정하였다.
도 1 b, c 및 d: PAR1 효능제는 상피 세포에서 방출되는 사이토킨을 조정한다. A549는 IAV A/PR/8/34로 감염되었고, PAR1 효능제 펩티드로 처리되거나 또는 처리되지 않았다. 감염-후 나타낸 시간 후, 나타낸 사이토킨의 방출을 전형적 ELISA에 의해 결정하였다.
도 2 a 및 b: PAR1 효능제 펩티드는 특정 의존적인 방식으로 마우스에서 IAV 유도된-사멸을 증가시킨다. a- PAR1-효능제 TFLLR-NH2로 처리되거나 또는 처리되지 않은 감염된 마우스의 생존 비율. b- PAR1-효능제 TFLLR-NH2로 처리되거나 또는 처리되지 않은 비-감염된 마우스의 생존 비율 및 체중 (초기 체중의 %): PAR1 효능제 펩티드는 비 감염된 마우스에서 부작용이 없다.
도 2 c : PAR1 효능제는 생체내에서 바이러스 복제를 증가시킨다. 마우스는 IAV A/PR/8/34 (50pfu 또는 500 pfu /마우스)로 감염되었고, PAR1 효능제 펩티드로 처리되거나 또는 처리되지 않았다. 폐에서의 IAV 바이러스 역가를 감염-후 나타낸 시간에서 전형적 플라크 검정에 의해 분석하였다.
도 3 a 및 b: PAR1 길항제 SCH79797은 마우스를 투여량-반응 의존적인 방식 (a)로, 및 상이한 pfu/마우스로의 감염 후 (b) IAV 유도된-사멸로부터 보호한다.
도 3 c: PAR1 길항제 SCH79797은 생체내에서 바이러스 복제를 억제한다. 마우스는 IAV A/PR/8/34 (50pfu 또는 500 pfu /마우스)로 감염되었고, PAR1 길항제 SCH79797로 처리되거나 또는 처리되지 않았다. 폐에서의 IAV 바이러스 역가를 이어서 감염-후 나타낸 시간에서 전형적 플라크 검정에 의해 분석하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물 (예를 들면, 제약 조성물)을 제공한다.
본 발명자들은 실제로 시험관내 및 생체내에서 인플루엔자 발병기전에서의 PAR1의 역할을 조사하였다. 시험관내에서, 상피 세포에 대한 PAR1의 자극은 인플루엔자 바이러스 유형 A (IAV) 복제를 증가시켰다. 생체내에서, 특정 효능제를 사용한 PAR1의 자극은 IAV-유도된 급성 폐 손상 및 사멸에서 유해하였다. 이 효과는 사이토킨 방출의 변형과 연관성이 있었다. 더 중요하게, PAR1의 길항제로의 PAR1의 차단은 마우스를 IAV 유도된 사멸로부터 보호하였다. 이들 결과는 의미있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 PAR1 길항제에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인플루엔자 바이러스 유형 A 감염"은 적혈구응집소 (H1 내지 H15) 및 뉴라미니다아제 (N1 내지 N9) 발현을 기반으로 한 혈청형의 고려 없이 인플루엔자 바이러스 유형 A에 의해 야기된 임의의 감염을 가리킨다. 본 발명에 의해 고려된 예시적인 인플루엔자 바이러스 유형 A는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3 및 H10N7을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 유형은 H1N1이다.
가장 넓은 의미에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 진행의 반전, 경감, 억제, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 유형 A 증식의 억제를 가리킨다. 특히, 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 "예방" 또는 "예방적 치료"는 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 증상을 예방하는 본 발명의 화합물의 투여를 가리킬 수 있다.
투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적이거나 또는 치료적임에 따라 변할 수 있다. 예방적 적용에서, 장기간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격으로 상대적으로 낮은 투여량이 투여된다. 일부 대상체는 계속해서 평생 치료를 받는다. 치료적 적용에서, 상대적으로 짧은 간격으로의 상대적으로 높은 투여량은 때때로 질환의 진행이 감소되거나 또는 종결될 때까지, 바람직하게는 대상체가 질환의 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 나타낼 때까지 요구된다. 그 후에, 대상체는 예방적 요법을 투여받을 수 있다.
예방적 적용에서, PAR1의 길항제를 함유하는 조성물은 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염을 이미 앓고 있지 않은 환자에게 투여된다. 오히려, 조성물은 상기 질환이 발병할 위험이 있거나 또는 소인이 있는 대상체에게 지시된다. 상기 적용은 대상체가 환자의 내성을 향상시키거나 또는 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 진행을 지연시키는 것을 가능하게 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로테아제 활성화된 수용체-1," "프로테이나제 활성화된 수용체-1" 또는 "PAR1" 또는 "PAR-1"은 대체가능하며, 트롬빈 절단에 의해 활성화되어 N-말단 묶인 리간드를 노출시키는 G-단백질-커플링된 수용체를 가리킨다. PAR1은 또한 "트롬빈 수용체" 및 "응고 인자 II 수용체 전구체"로도 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [Vu, et al., Cell (1991) 64(6): 1057-68; Coughlin, et al, J Clin Invest (1992) 89(2):35I-55]; 및 젠뱅크 (GenBank) 등록 번호 NM_001992를 참조한다. 묶인 리간드와 PAR1의 세포외 도메인과의 분자내 결합은 세포내 신호전달 및 칼슘 유동을 야기한다. 예를 들면, 문헌 [Traynelis and Trejo, Curr Opin Hematol (2007) 14(3):230-5]; 및 [Hollenberg, et al, Can J Physiol Pharmacol. (1997) 75(7):832-41]을 참조한다.
용어는 자연적으로 발생하는 PAR1 및 그의 변이체 및 변형된 형태를 포함할 수 있다. PAR1은 임의의 공급원으로부터의 것일 수 있지만, 전형적으로 포유류 (예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류) PAR1, 특히 인간 PAR1이다.
PAR1의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Vu, et al., Cell (1991) 64(6): 1057-68; Coughlin, et al, J Clin Invest (1992) 89(2):351 -55]; 및 젠뱅크 등록 번호 NM_001992를 참조한다. 인간 PAR1의 핵산 서열은 젠뱅크 등록 번호 NM_001 992로 공개되었다 (또한, M62424.1 및 gi45O3636을 참조함). 인간 PAR1의 아미노산 서열은 NP_001 983 및 AAA36743으로 공개되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "길항제"는 수용체에 의해 매개된 반응을 완전히 차단하거나 또는 검출가능하게 억제하기 위해 수용체를 통해 신호전달을 특이적으로 결합 및 억제할 수 있는 제제를 가리킨다. 예를 들면, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PAR1 길항제"는 경로 신호전달 및 추가의 생물학적 절차를 개시하기 위해 PAR1에 결합하여 이를 완전히 또는 부분적으로 불활성화시키는 천연 또는 합성 화합물이다. PAR-1 길항제 활성은 다양한 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 일부 경우에는, PAR1 길항제는 PAR1에 결합하여, PAR1로부터의 세포내 신호전달에 후속적인 트롬빈-유도된 칼슘 유동 또는 트롬빈-유도된 IL-8 생성을 억제하는 그의 능력 (예를 들면, FlipR 검정에서 측정되거나 또는 ELISA에 의해 측정됨)에 의해 확인될 수 있다. 추가의 검정은 문헌 [Kawabata, et al., J Pharmacol Exp Ther. (1999) 288(1):358-70]에 의해 기재된다. 억제는 예를 들면, 본 발명의 길항제에 노출된 PAR1로부터의 칼슘 유동 또는 IL-8 생성에 의해 측정된 PAR1 세포내 신호전달이 길항제에 노출되지 않은 대조군 PAR1로부터의 세포내 신호전달과 비교하여 적어도 약 10% 더 적은 경우, 예를 들면 적어도 약 25%, 50%, 75% 더 적은 경우, 또는 완전히 억제된 경우 발생한다. 대조군 PAR1은 항체 또는 항원 결합 분자에 노출되지 않거나, 또다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 분자, 또는 길항제로서 기능하지 않는 것으로 알려진 항-PAR1 항체 또는 항원 결합 분자에 노출될 수 있다. "항체 길항제"는 길항제가 억제성 항체인 경우를 가리킨다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 PAR1 길항제는 펩티드, 펩티드 모방체, 소분자 유기 화합물, 압타머, 펩두신 (pepducin), 폴리뉴클레오티드 또는 항체일 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, 투여된 PAR1 길항제는 PAR1 신호전달 활성을 억제한다. 이들 방법의 일부는 펩티도모방체, 예를 들면, RWJ-56110 또는 ([알파]S)-W-[(1S)-3-아미노-1-[[{페닐메틸)아미노]카르보닐]프로필]-[알파]-[[[[[1-(2,6-디클로로페닐)메틸]-3-(1-피롤리디닐메틸)-1H-인돌-6-일]아미노]카르보닐]아미노]-3,4-디플루오로벤젠프로판아미드인 PAR1 길항제를 사용한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, PAR1 길항제는 소분자 유기 화합물이다. 용어 "소 유기 분자"는 제약에서 일반적으로 사용되는 유기 분자에 필적하는 크기의 분자를 가리킨다. 용어는 생물학적 거대분자 (예를 들면, 단백질, 핵산 등)를 제외한다. 바람직한 소 유기 분자는 약 5000 Da 이하, 더 바람직하게는 2000 Da 이하, 가장 바람직하게는 약 1000 Da 이하의 크기의 범위를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, PAR1 길항제는 (N3-시클로프로필-7-{[4-(1-메틸에틸)페닐]메틸)-7H-피롤로[3,2-f]퀴나졸린-1,3-디아민)인 소 유기 분자 SCH-79797이다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, PAR1 길항제는 길항제 PAR1 항체 또는 항원-결합 분자이다. 본원에 사용된 바와 같이, 달리 정의되지 않는 한, 용어 "항체"는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 모두, 및 Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편 및 단일 쇄 (sFv) 조작된 항체 분자를 포함하나, 이들로 한정되지는 않는 항원에 대해 특정 결합 친화성을 갖는 항체 단편을 포함한다. 용어는 특정하게 제외되지 않는 한, 키메라 및 인간화 항체, 및 상기 항체가 생성될 수 있는 경우에서의 인간 항체를 추가로 포함한다.
이들 항-PAR1 제제는 PAR1 매개된 신호전달 활성, 예를 들면 PAR1 매개된 인터루킨 분비를 길항할 수 있다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조를 위한 일반적인 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998; Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)]; 문헌 [Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)]; 및 문헌 [Cole et a!., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985]을 참조한다.
추가로, 특정 PAR1 길항제 항체는 당업계에 개시되었다. 예를 들면, 문헌 [R. R. Vassallo, Jr. et al. "Structure-Function Relationships in the Activation of Platelet Thrombin Receptors by Receptor-Derived Peptides," J. Biol. Chem. 267:6081-6085 (1992) ("Vassallo, Jr. et al. (1992")]; 문헌 [L.F. Brass et al., "Structure and Function of the Human Platelet Thrombin Receptor," J. Biol. Chem. 267: 13795-13798 (1992) ("Brass et al. (1992)")]; 및 문헌 [R. Kaufmann et al., "Investigation of PAR-1-Type Thrombin Receptors in Rat Glioma C6 Cells with a Novel Monoclonal Anti-PAR-1 Antibody (Mab COR7-6H9), J. Neurocytol. 27:661-666 (1998) ("Kaufmann et al. (1998)"]을 참조하며, 이들 둘 다는 본원에 참조로 포함된다.
문헌 [Brass et al. (1992)]에서, 모노클로날 항체를 인간 PAR1의 잔기 42-55를 나타내는 면역원 SFLLRNPNDKYEPF (서열 1)에 대해 제조하였다. 이들 모노클로날 항체를 면역원 SFLLRNPNDKYEPF (서열 1) 키홀 림펫 헤모사이아닌 (KLH)에 접합된 마우스의 면역화로 시작하여 표준 기술에 의해 제조하였다. 이들 모노클로날 항체는
(1) 면역원, 구체적으로 SFLLRNPND (서열 2)의 제1 단편에 결합하는 문헌 [Brass et al. (1992)]에 ATAP2로 지정된 모노클로날 항체;
(2) 면역원, 구체적으로 NPNDKYEPF (서열 3)의 제2 단편에 결합하는 문헌 [Brass et al. (1992)]에 ATAP 120으로 지정된 모노클로날 항체; 및 또한 NPNDKYEPF (서열 3)에 결합하는 문헌 [Brass et al.]에 ATAP138로 지정된 모노클로날 항체를 포함한다.
추가로, 본 발명에 따른 조성물 및 방법에서 사용할 수 있는 모노클로날 항체는 SFLLRNPND (서열 2) 또는 NPNDKYEPF (서열 2) 중 하나 또는 이들 모두에 특이적으로 결합하여 SFLLRNPND (서열 2) 또는 NPNDKYEPF (서열 3) 중 하나 또는 이들 모두에 대해 항체-항원 복합체에 대한 해리 상수의 역수에 의해 측정된 임의의 ATAP2, ATAP20 또는 ATAP138의 친화도의 80% 이상의 친화성을 갖도록 하는 모노클로날 항체를 포함한다.
추가로, 본 발명에 따른 조성물 및 방법에서 사용할 수 있는 모노클로날 항체는 ATAP2, ATAP20 또는 ATAP138의 상보성-결정 영역과 동일한 상보성-결정 영역을 갖는 모노클로날 항체를 포함한다. 추가로, 본 발명에 따른 조성물 및 방법에서 사용할 수 있는 모노클로날 항체는 SFLLRNPND (서열 2) 또는 NPNDKYEPF (서열 3) 중 하나 또는 이들 모두에 특이적으로 결합하거나, 또는 SFLLRNPND (서열 2) 또는 NPNDKYEPF (서열 3) 중 하나 또는 이들 모두에 대해 임의의 ATAP2, ATAP20 또는 ATAP138의 친화도의 80% 이상의 친화성을 갖도록 하는 상기 기재된 모노클로날 항체와 동일한 상보성-결정 영역을 갖는 모노클로날 항체를 포함한다.
문헌 [Kaufmann et al. (1998)]은 서열 GRAVYLNKSRFPPMPPPPFISEDASG (서열 4)를 갖는 펩티드를 사용함으로써 제조된 래트 PAR1 수용체에 대한 모노클로날 항체를 기재한다. 이 서열은 수용체에 대한 트롬빈 절단 부위 아래에 있는 것으로 기재된다. 인간 PAR1 수용체의 상응하는 영역에 대한 유사한 항체가 제조될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 항체는 임의의 클래스, 예를 들면 IgG, IgA, IgD1, IgE1, IgM1 또는 IgY1의 항체일 수 있지만, IgG 항체가 전형적으로 바람직하다. 항체는 인간, 뮤린 (마우스 또는 래트), 당나귀, 양, 염소, 토끼, 낙타, 말 또는 닭을 포함하는 임의의 포유류 또는 조류 기원의 항체일 수 있다. 일부 대안에서, 항체는 이중특이적일 수 있다. 항체는 임의의 유형의 분자의 항체에의 공유 부착에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 항체 유도체는 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 포스필화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질과의 연결, 또는 당업계에 공지된 다른 변형에 의해 변형된 항체를 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 그의 조합의 사용을 포함하는 당업계에 공지된 광범위하고 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
예를 들면, 모노클로날 항체는 당업계에 공지되고 예를 들면, 문헌 [Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al.], 문헌 [Monoclonal Antibodies and T-CeII Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)] 또는 당업계에 공지된 다른 표준 방법에 의해 계시된 하이브리도마 기술을 포함하는 하이브리도마 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체에 한정되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유도된 항체를 가리키며, 항체가 생성된 방법을 가리키지 않는다. 예를 들면, 적합한 항체는 파지 디스플레이 또는 다른 기술에 의해 생성될 수 있다.
추가로, 인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 사용한 파지 디스플레이 방법을 포함하는 다양한 기술 및 기능적 내인성 이뮤노글로불린을 발현하지 못하지만, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스의 사용에 의해 제조될 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. 예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 유전자 복합체는 임의로 혼입되거나 또는 마우스 배아 줄기 세포에의 상동성 재조합에 의해 혼입될 수 있다. 항체는 또한 이들 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생성될 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 항체는 정제를 촉진시키기 위해 마커 서열, 예를 들면 펩티드 태그에 융합될 수 있으며, 여기서 적합한 태그는 헥사히스티딘 태그이다. 항체는 또한 당업계에 공지된 방법에 의해 진단제 또는 치료제에 접합될 수 있다. 상기 접합체를 제조하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다.
이들 모노클로날 항체, 및 키메라 항체, 인간화 항체 및 단일-쇄 항체의 다른 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
PAR1 생화학적 또는 신호전달 활성을 억제 (inhibit) 또는 억제 (suppress)하는 화합물에 추가로, PAR1 발현을 억제할 수 있거나 또는 PAR1 세포 수준을 하향-조절할 수 있는 화합물이 또한 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. PAR1 발현의 억제 또는 그의 세포 수준의 하향-조절은 대조군 세포 (PAR1 길항제 화합물로 처리되지 않은 세포)에서의 PAR1과 비교하여 검사된 세포 (예를 들면, PAR1 길항제 화합물과 접촉된 세포)에서의 PAR1 발현의 감소 또는 부재를 가리킨다. PAR1 수준 또는 발현은 대조군 세포에서의 PAR1 수준 또는 발현과 비교하여 약 10% 이상 (예를 들면, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%) 감소되거나 또는 줄어들 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 발현의 억제 또는 PAR1 세포 수준의 하향-조절은 PAR1에 대한 유전자의 mRNA로의 전사의 수준 또는 PAR1에 대한 mRNA의 상응하는 단백질로의 번역의 수준에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 억제성 뉴클레오티드는 PAR1 발현을 억제함으로써 PAR1 매개된 심장 리모델링 또는 PAR1의 다른 효과를 길항하기 위해 사용된다.
이들은 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 및 합성 헤어핀 RNA (shRNA), 안티-센스 핵산, 또는 상보성 DNA (cDNA)를 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, PAR1 발현을 표적하는 siRNA가 사용된다. 이중-가닥 RNA, 예를 들면 siRNA에 의한 내인성 유전자의 기능 및 발현의 방해는 다양한 유기체에서 나타냈다. 예를 들면, 문헌 [A. Fire et al., "Potent and Specific Genetic Interference by Double-Stranded RNA in Caenorhabditis elegans" Nature 391 :806-811 (1998)]; [J.R. Kennerdell & R.W. Carthew, "Use of dsDNA-Mediated Genetic Interference to Demonstrate that frizzled and frizzled 2 Act in the Wingless Pathway," CeJ 95:1017-1026 (1998)]; [F. Wianni & M. Zernicka- Goetz, "Specific Interference with Gene Function by Double-Stranded RNA in Early Mouse Development," Nat. Cell Biol. 2:70-75 (2000)]을 참조한다. siRNA는 자가-상보성 서열 또는 이중 가닥 서열을 포함하는 헤어핀 루프 (hairpin loop)를 포함할 수 있다. siRNA는 전형적으로 100 미만의 염기 쌍, 예를 들면 약 30 bps 또는 그보다 짧은 염기 쌍을 가질 수 있고, 상보성 DNA 가닥 또는 합성 접근법의 사용을 포함하는 당업계에 공지된 접근법에 의해 제조될 수 있다. 상기 이중-가닥 RNA는 주형의 양 방향으로부터 판독되는 단일-가닥 RNA의 시험관내 전사 및 센스 및 안티센스 RNA 가닥의 시험관내 어닐링에 의해 합성될 수 있다. PAR1을 표적하는 이중-가닥 RNA는 또한 PAR1 유전자 (예를 들면, 인간 PAR1 유전자)가 역위 반복에 의해 분리된 대립되는 방향으로 클로닝된 cDNA 벡터 구조물로부터 합성될 수 있다. 세포 형질감염 후, RNA는 전사되고, 상보성 가닥은 재어닐링 된다. PAR1 유전자를 표적하는 이중-가닥 RNA는 세포 (예를 들면, 종양 세포)에 적절한 구조물의 형질감염에 의해 혼입될 수 있다.
전형적으로, RNA 방해에 의해 매개된 siRNA, miRNA 또는 shRNA는 번역의 수준에서 매개된다; 즉, 이들 간섭 RNA 분자는 상응하는 mRNA 분자의 번역을 방지하고, 그들의 분해를 야기한다. 또한 RNA 방해는 또한 전사의 수준에서 수행되어, 이들 간섭 RNA 분자에 상응하는 게놈의 영역의 전사를 차단할 수 있는 것이 가능하다.
이들 간섭 RNA 분자의 구조 및 기능은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들면 본원에 참조로 포함된 문헌 [R.F. Gesteland et al., eds, "The RNA World" (3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2006), pp. 535-565]에 기재되어 있다. 이들 접근법에 대해, 벡터 내로의 클로닝 및 형질감염 방법이 또한 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들면 본원에 참조로 포함된 문헌 [J. Sambrook & D. R. Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001)]에 기재되어 있다.
이중 가닥 RNA 외에, PAR1을 표적으로 하는 다른 핵산 작용제, 예를 들면 안티센스 핵산이 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 안티센스 핵산은 특정 표적 mRNA 분자의 적어도 일부분에 상보적인 DNA 또는 RNA 분자이다. 세포에서, 단일 가닥 안티센스 분자는 상기 mRNA에 혼성화하여 이중 가닥 분자를 형성한다. 세포는 이러한 이중 가닥 형태의 mRNA를 번역하지 않는다. 따라서, 안티센스 핵산은 mRNA의 단백질 내로의 번역을 간섭하고, 따라서 상기 mRNA 내로 전사된 유전자의 발현을 간섭한다. 안티센스 방법은 다수의 유전자의 시험관내 발현을 억제하는데 사용되어 왔다. 예를 들면, 모두 본원에 참조로 포함된 문헌 [CJ. Marcus- Sekura, "Techniques for Using Antisense Oligodeoxy ribonucleotides to Study Gene Expression," Anal. Biochem. 172:289-295 (1988)]; [J. E. Hambor et al., "Use of an Epstein-Barr Virus Episomal Replicon for Anti-Sense RNA-Mediated Gene Inhibition in a Human Cytotoxic T-Cell Clone," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4010-4014 (1988)]; [H Arima et al., "Specific inhibition of Interleukin-10 Production in Murine Macrophage-Like Cells by Phosphorothioate Antisense Oligonucleotides," Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 8:319-327 (1998)]; 및 [W.-F. Hou et al., "Effect of Antisense Oligodeoxynucleotides Directed to Individual Calmodulin Gene Transcripts on the Proliferation and Differentiation of PC12 Cells," Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 8:295-308 (1998)] 참조. 안티센스 기술은 본원에 참조로 포함된 문헌 [C. Lichtenstein & W. Nellen, eds., "Antisense Technology: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, 1997)]에 추가로 기재되어 있다. 인간 및 다수의 다른 포유류로부터의 PAR1 폴리뉴클레오티드 서열은 모두 종래 기술에서 설명되어 왔다. 예를 들면, 인간 PAR1 cDNA 서열 (NM_001992)은 본원에 참조로 포함된 문헌 [T.-K. H. Vu et al., "Molecular Cloning of a Functional Thrombin Receptor Reveals a Novel Proteolytic Mechanism of Receptor Activation," CeJ 64: 1057-1068 (1991)]에서 보고되었다. 공지의 서열을 기준으로, PAR1을 표적으로 하는 억제성 뉴클레오티드 (예를 들면, siRNA, miRNA, 또는 shRNA)는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 용이하게 합성될 수 있다.
본 발명에 따른 예시적 siRNA는 29 bp, 25 bp, 22 bp, 21 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp, 5 bp 이하 또는 상기 숫자들 사이의 임의의 정수의 염기쌍을 가질 수 있다. 최적의 억제성 siRNA를 디자인하기 위한 도구는 DNA엔진 인크.(DNAengine Inc.) (미국 워싱턴주 시애틀 소재) 및 앰비온, 인크.(Ambion, Inc.) (미국 텍사스주 오스틴 소재)로부터 입수가능한 도구를 포함한다. 특정 PAR1 억제성 뉴클레오티드 및 PAR1 발현을 하향 조절하는데 있어서의 그의 용도는 당업계, 예를 들면 모두 본원에 참조로 포함된 문헌 [Q. Fang et al., "Thrombin Induces Collagen Gel Contraction Partially Through PAR1 Activation and PKC-[epsilon]," Eur. Respir. J. 24:918-924 (2004)]; 및 [Y.- J. Yin et al., "Mammary Gland Tissue Targeted Overexpression of Human Protease-Activated Receptor 1 Reveals a Novel Link to [beta]-Catenin Stabilization," Cancer Res. 66:5224-5233 (2006)]에 개시되어 있다.
본 발명에 의해 고려되는 다른 예시적 PAR1 길항제는 하기 문헌에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다:
- 미국 특허 제6,017,890호 (Hoekstra et al.:"Azole Peptidomimetics as Thrombin Receptor Antagonists"), 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 2 컬럼, 31 줄 내지 3 컬럼의 하단 및 실시예 1 내지 10 참조).
- 미국 특허 제5,446,131호 (Maraganore: "Thrombin Receptor Antagonists"), 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 요약서 및 청구범위 참조).
- 미국 특허 제5,866,681호 (Scarborough: "Thrombin Receptor Antagonists"), 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 요약서, 청구범위 및 실시예 1 내지 16 참조).
- 미국 특허 제5,759,994호 (Coughlin: "Recombinant Thrombin Receptor and Related Pharmaceuticals"), 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 실시예 5 및 6, 및 청구범위 참조).
- 미국 특허 제5,798,248호 (Coughlin: "Recombinant Thrombin Receptor and Related Pharmaceuticals"), 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 실시예 5 및 6, 및 청구범위 참조).
- 문헌 [Bernatowicz et al. ("Development of Potent Thrombin Receptor Antagonists." J. Mecl. Chem. 39: 4879-4887, 1996)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 표 1 내지 8 참조).
- 문헌 [Vassallo et al. ("Structure-Function Relationships in the Activation of Platelet Thrombin Receptors by Receptor-Derived Peptides." J. Biol. Chem. 267: 6081-6085, 1992)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 표 1 참조).
- 문헌 [Andrade-Gordon et al. ("Design, Synthesis, and Biological Characterization of a Peptide-Mimetic Antagonist for a Tethered-Ligand Receptor." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 12257-12262, 1999)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 도 1 참조).
- 문헌 [Hoekstra et al. ("Thrombin Receptor (PAR-1) Antagonists. Heterocycle-Based Peptidomimetics of the SFLLR Agonist Motif." Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 1649-1654, 1998)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 표 1 및 2 참조).
- 문헌 [Kato et al. ("In Vitro Antiplatelet Profile of FR171113, a Novel Non-Peptide Thrombin Receptor Antagonist." Euro. J. Pharmacol. 384: 197-202, 1999)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 도 1 참조).
- 문헌 [Ruda et al. ("Identification of Small Peptide Analogues Having Agonist and Antagonist Activity at the Platelet Thrombin Receptor." Biochem. Pharmacol. 37: 2417-2426, 1988)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 요약서 및 도 1 참조).
- 문헌 [Ruda et al. ("Thrombin Receptor Antagonists: Structure-Activity Relationships for the Platelet Thrombin Receptor and Effects on Prostacyclin Synthesis by Human Umbilical Vein Endothelial Cells." Biochem. Pharmacol. 39: 373-381, 1990)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 표 2 참조).
- 문헌 [Harmon and Jamieson ("Activation of Platelets by Alpha- Thrombin is a Receptor-Mediated Event." J. Biol. Chem. 261: 15928-15933, 1986)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 15928 페이지 좌측 컬럼의 요약서 참조).
- 문헌 [Doorbar and Winter ("Isolation of a Peptide Antagonist to the Thrombin Receptor Using Phage Display." J. Mol. Biol. 244: 361369, 1994)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 도 3 참조).
- 문헌 [Ahn et al. ("Structure-Activity Relationships of Pyrroloquinazolines as Thrombin Receptor Antagonists." Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2073-2078, 1999)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 표 1 및 2 참조).
- 문헌 [Seiler et al. ("Inhibition of Thrombin and SFLLR-Peptide Stimulation of Platelet Aggregation, Phosphlipase A2 and Na+/H+ Exchange by a Thrombin Receptor Antagonists." Biochem. Pharmacol. 49: 519-528, 1995)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 요약서 참조).
- 문헌 [Elliot et al. ("Photoactivatable Peptides Based on BMS-197525: A Potent Antagonist of the Human Thrombin Receptor (PAR-1)." Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 279-284, 1999)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 표 1 참조).
- 문헌 [Fujita et al. ("A Novel Molecular Design of Thrombin Receptor Antagonists." Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 1351-1356, 1999)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 요약서 참조).
- 문헌 [Debeir et al. ("Pharmacological Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR-1) in Rat Astrocytes." Euro. J. Pharmacol. 323: 111-117, 1997)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 요약서 참조).
- 문헌 [Ahn et al. ("Binding of a Thrombin Receptor Tethered Ligand Analogue to Human Platelet Thrombin Receptor." Mol. Pharmacol. 51: 350356, 1997)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 도 5 및 표 1 참조).
- 문헌 [McComsey et al. ("Heterocycle-peptide hybrid compounds. Aminotriazole-containing agonists of the thrombin receptor (PAR-1)." Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 9: 1423-1428, 1999)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 표: 생물학적 데이타 참조).
- 문헌 [Nantermet et al. ("Discovery of a small molecule of the human platelet thrombin receptor (PAR-1)." Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 319-323, 2002)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 표 1, 표 2, 표 3 참조).
- 문헌 [Barrow et al. ("Discovery and initial structure-activity relationship of trisubstituted ureas as thrombin receptor (PAR-1) antagonists." Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 11: 2691-2696, 2001)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 표 1-5 참조).
- 문헌 [Ahn et al. ("Inhibition of cellular action of thrombin by N3-cyclopropyl-7[[4-(1-methylethyl)phenyl]methyl]-7H-pyrrole[3,2f]quinazoline-1,3-diamine (SCH79797), a non-peptide thrombin receptor antagonist." Biochemical Pharmacol 60: 1425-1434, 2000)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 도 1 참조).
- 문헌 [Chackalamannil ("Thrombin receptor antagonists as novel therapeutic targets." Curr Opin Drug Discovery Development 4: 417-427, 2001)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다.
- 문헌 [Stead et al. ("Eryloside F, a novel penasterol disaccharide possessing potent thrombin receptor antagonist activity." Bioorg. Mecl. Chem. Lett. 10: 661-664, 2000)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 도 1 참조).
- 문헌 [Pakala et al. ("A peptide analogue of thrombin receptor-activating peptide inhibits thrombin and thrombin-receptor-activating peptide induced vascular smooth muscle cell proliferation." J. Cardiovasc. Pharmacol. 37: 619-629, 2001)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다 (예를 들면, 도 1 및 2 참조).
- 문헌 [Zhang et al. ("Discovery and optimization of a novel series of thrombin receptor (PAR-1) antagonists: potent, selective peptide mimetics based on indole and indazole templates." J. Med. Chem. 44: 1021-1024, 2001)], 이 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되며, 구체적으로는 트롬빈 수용체 길항제로서 기능하는 화합물의 교시를 위해 참조로 포함된다.
본 발명의 추가의 목적은 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 PAR1 길항제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 스크리닝 방법은 PAR1, 또는 PAR1을 갖는 세포 또는 구성원, 또는 이들의 융합 단백질에 대한 후보 화합물의 결합을 그 후보 화합물과 직접적으로 또는 간접적으로 관련된 표지를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 스크리닝 방법은 PAR1을 불활성화시키는 상기 후보 화합물의 능력을 측정하거나 또는 정성적으로 또는 정량적으로 검출하는 것을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스크리닝 방법은
a) 표면에 PAR1을 발현하는 다수의 세포를 제공하고;
b) 상기 세포를 후보 화합물과 함께 인큐베이션하고;
c) 상기 후보 화합물이 PAR1에 결합하여 그를 불활성화시키는지 여부를 결정하고;
d) PAR1에 결합하여 그를 불활성화시키는 후보 화합물을 선택하는 것
으로 이루어진 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 단계 d)에서 선택된 후보 화합물을 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 동물 모델에 투여하여 상기 후보 화합물의 보호 효과를 입증하는 것으로 이루어진 단계를 더 포함할 수 있다.
일반적으로, 상기 스크리닝 방법은 표면에 PAR1을 발현하는 적절한 세포를 제공하는 것을 포함한다. 특히, PAR1을 코딩하는 핵산을 이용하여 세포를 형질감염시킴으로써 본 발명의 수용체를 발현시킬 수 있다. 이러한 형질감염은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 PAR1을 발현하는 것으로 이미 보고된 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다 (예를 들면, 상피 세포).
본 발명의 스크리닝 방법은 상기 세포를 스크리닝할 화합물과 접촉시키고 상기 화합물이 PAR1을 불활성화시키는지 여부를 결정함으로써 PAR1 길항제를 결정하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에 따르면, 후보 화합물은 이전에 합성된 화합물의 라이브러리, 또는 데이타베이스에 구조가 결정되어 있는 화합물의 라이브러리, 또는 새로이 합성된 화합물 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 후보 화합물은 (a) 단백질 또는 펩티드, (b) 핵산 및 (c) 유기 또는 화학 화합물 (천연이거나 아님)의 군으로부터 선택될 수 있다.
후보 화합물을 이용한 PAR1 불활성화는 당업자의 다양한 공지 방법에 의해 시험될 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 PAR1 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유류, 예를 들면 돼지 및 영장류를 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 대상체는 인간이다.
PAR1 길항제는 하기 정의된 바와 같은 제약 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 PAR1 길항제는 치료 유효량으로 투여된다. "치료 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합당한 이익/위험 비로 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명에 따른 PAR1 길항체의 충분량을 의미한다.
본 발명의 화합물 및 조성물의 전체 일일 사용은 정상적인 의학적 판단 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것이라고 해석될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 치료 유효 투여량 수준은 치료될 결핍 및 결핍의 중증도; 이용되는 특정 화합물의 활성; 이용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로, 및 이용되는 특정 화합물의 분비율; 치료 지속기간; 이용되는 특정 폴리펩티드와 조합 또는 병용되어 사용되는 약물; 및 의학 분야에 널리 공지된 인자들을 비롯한 다양한 인자에 좌우될 것이다. 예를 들면, 목적하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 수준보다 낮은 수준으로 화합물의 투여를 시작하고, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시키는 것은 당업자의 지식 내에 있다.
그러나, 생성물의 일일 사용은 하루에 성인마다 0.01 내지 1,000 mg의 광범위에 걸쳐 변할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 치료될 환자에 대한 투여량의 징후적 조정을 위해 활성 성분 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15,0, 25.0, 50.0, 100, 250 및 500 mg을 함유한다. 의약은 전형적으로 활성 성분 약 0.01 mg 내지 약 500 mg, 바람직하게는 활성 성분 1 mg 내지 약 100 mg을 함유한다. 약물의 유효량은 통상적으로는 하루에 체중 kg 당 0.0002 mg 내지 약 20 mg, 특히 하루에 체중 kg 당 약 0.001 mg 내지 7 mg의 투여량 수준으로 공급된다.
PAR1 길항제는 제약상 허용되는 부형제, 및 임의로는 지속-방출 매트릭스, 예를 들면 생분해성 중합체와 조합되어 치료 조성물을 형성할 수 있다.
"제약상" 또는 "제약상 허용되는"은 포유류, 특히 인간에게 적절히 투여될 경우 부작용, 알레르기 또는 다른 유해한 반응을 생성하지 않는 분자 실재물(entity) 및 조성물을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체 또는 부형제는 비-독성 고체, 반-고체 또는 액상 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제제화 보조제를 지칭한다.
본 발명의 제약 조성물에서, 활성소(active principle) 단독 또는 다른 활성소와 조합된 활성소는 단위 투여 형태로 전형적인 제약 지지체와의 혼합물로서 동물 및 인간에 투여될 수 있다. 적합한 단위 투여 형태는 경구-경로 형태, 예를 들면 정제, 겔, 캡슐, 분말, 과립 및 경구 현탁액 또는 용액, 설하 및 구강 투여 형태, 에어로졸, 임플란트, 피하, 경피, 국소, 복강내, 근육내, 정맥내, 피하, 경피, 척수강내 및 비강내 투여 형태 및 직장 투여 형태를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 제약 조성물은 비강내 투여 형태로 바람직하게 투여된다.
바람직하게는, 제약 조성물은 주사될 수 있는 제제에 대해 제약상 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성의 멸균 염수 용액 (일나트륨 또는 이나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 상기 염의 혼합물), 또는 경우에 따라서 멸균수 또는 생리학적 염수의 첨가시 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 건조된, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다.
주사가능한 용도에 적합한 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균되어야 하며 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하며 미생물, 예를 들면 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
유리 염기로서의 본 발명의 화합물 또는 약리학상 허용되는 염을 포함하는 용액은 계면활성제, 예를 들면 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
PAR1 길항제는 중성 또는 염 형태의 조성물로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 산 부가염 (단백질의 유리 아민기로 형성됨) 및 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 것을 포함한다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 또한, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 히드록시드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
담체는 또한, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입도의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 작용제, 예를 들면 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 흡수 연장은 조성물에 흡수를 늦추는 작용제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 이루어질 수 있다.
주사가능한 멸균 용액은 필요한 경우 상기 열거한 여러 다른 성분을 갖는 적절한 용매 중에 필요한 양의 활성 폴리펩티드를 혼입시키고, 이어서 여과 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 성분 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조된다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은, 활성 성분 및 이전의 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적 성분의 분말을 생성시키는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
제제화시, 용액은 투여 제제에 적합한 방식으로 및 치료 유효한 양으로 투여될 것이다. 제제는 다양한 투여 형태, 예를 들면 상기 기재된 주사가능한 용액의 유형으로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등도 이용될 수 있다.
예를 들면 수용액의 비경구 투여의 경우, 그 용액은 필요하다면 적합하게 완충되어야 하고, 먼저 액체 희석제를 충분한 염수 또는 글루코스와 등장성이도록 만들어야 한다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시에 비추어 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들면, 1회 투여는 등장성 NaCl 용액 1 ml 중에 용해될 수 있으며, 피하주사액 1000 ml에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다. 투여의 일부 변형은 치료될 대상체의 상태에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어느 경우에서든 개별 대상체에 대한 적절한 투여량을 결정할 것이다.
PAR1 길항제는 치료 혼합물 내에 투여 당 약 0.0001 내지 1.0 mg, 또는 약 0.001 내지 0.1 mg, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 약 10 mg을 포함하도록 제제화될 수 있다. 다중 투여량이 또한 투여될 수 있다.
비경구 투여, 예를 들면 정맥내 또는 근육내 주사를 위해 제제화된 본 발명의 화합물에 대해 추가로, 다른 제약상 허용되는 형태는, 예를 들어 정제 또는 경구 투여를 위한 다른 고형제; 리포솜 제제; 시간 방출형 캡슐; 및 현재 사용되는 임의의 다른 형태를 포함한다.
본 발명에 따라, PAR1 길항제는 하나 이상의 별개의 활성 제약 작용제, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료를 위한 활성 제약 작용제와 조합하여 제제화될 수 있다. 그러한 작용제는 매우 상이한 생화학적 경로에 의해 작용하여 특히 이로운 치료 결과를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른, 하나 이상의 활성제는 공동-투여된 모노테라피 제제, 또는 단일 공동-제제로서 전달될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 활성제 중 하나는 PAR2 효능제이다.
본 발명의 추가의 목적은
(i) 하나 이상의 PAR-1 길항제, 및
(ii) 하나 이상의 프로테아제-활성화된 수용체-2 (PAR-2) 효능제
를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 대상체에서의 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방을 위한 상기 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은
(i) 하나 이상의 PAR-1 길항제, 및
(ii) 하나 이상의 프로테아제-활성화된 수용체-2 (PAR-2) 효능제
를 함유하는, 대상체에서의 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방을 위한 동시, 별도 또는 순차적 사용을 위한 조합된 제제로서의 생성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PAR2"는 당업계에서의 그의 일반적인 의미를 나타내며, 프로테아제-활성화된 수용체-2를 지칭한다. 상기 용어는 천연 발생 PAR2 및 그의 변이체 및 변형된 형태를 포함할 수 있다. PAR2는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있지만, 전형적으로는 포유류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류) PAR2, 특히 인간 PAR2 이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "PAR2 효능제"는 경로 신호 및 추가로 생물학적 절차를 개시하기 위해 PAR2와 결합하고, 활성화시키는 천연 또는 합성 화합물이다. PAR-2 효능제 활성은 공지된 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 홀렌버그 (Hollenberg) 방법 (문헌 [Hollenberg, M. D., et al., Cati. J. Physiol. Pharmacol., 75,832-841 (1997)]), 카와바타 (Kawabata) 방법 (문헌 [Kawabata, A., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 288,358-370 (1999)]) 및 호손 (Hawthorne) 방법 (문헌 [Howthorne et al., A High-Throughput Microtiter Plate-Based Calcium Assay for the Study Of Protease-Activated Receptor 2 Activation, Analytical Biochemistry 290,378-379 (2001)])이 PAR2 효능제 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 PAR2 효능제는 소 유기 분자일 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 예시적인 PAR2 효능제는 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제2007123508호 및 제2008318960호에 기재된 바를 포함하지만 이들로만 제한하지는 않는다. 다른 예는 문헌 [Graddil LR et al. 2008]에 기재되어 있는 것을 포함하고, 보다 특히 AC-55541 [N-[[1-(3-브로모-페닐)-에트-(E)-일리덴-히드라지노카르보닐}-(4-옥소-3,4-디히드로-프탈라진-1-일)-메틸-벤즈아미드] 및 AC-264613 [2-옥소-4-페닐피롤리딘-3-카르복실산 [t(3-브로모-페닐)-(E/Z)-에틸리덴}-히드라지드]를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 PAR2 효능제는 HOOC-SLIGRL-NH2 (서열 5) 또는 HOOC-SLIGKV-NH2 (서열 6)일 수 있는 PAR2 활성화 펩티드이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 PAR2 효능제는 HOOC-LIGRLO-NH2, HOOC-플루오릴-LIGRLO-NH2, 및 트랜스-신나모일-LIGRLO (tc)-NH2로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 PAR2 활성화 펩티드 유도체일 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 다른 PAR2 활성화 펩티드 유도체는 하기 일반 화학식 I 또는 그의 염에 의해 나타나는 WO03/104268 (본원에 참고로 포함되어 있음)에 기재되어 있는 바를 포함한다:
<화학식 I>
Z-(CH2)n-CO-NH-Leu-Ile-Gly-AA1-AA2-CO-R
상기 식에서, Z는 치환체를 갖거나 또는 갖지 않을 수 있는 아릴 기를 나타내거나 또는 치환체를 갖거나 또는 갖지 않을 수 있는 헤테로아릴 기를 나타내고; n은 0, 1 또는 2를 나타내고; AA1-AA2는 Lys-Val 또는 Arg-Leu을 나타내고; R은 -OH 또는-NH2를 나타낸다.
Z로서의 아릴 기는 바람직하게는, 구체적으로 예를 들면 페닐 기 및 나프틸 기를 포함하는, 6 내지 30 개의 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 14 개의 탄소 원자를 갖는 단일-고리 유형, 다중-고리 유형 또는 응축된 고리 유형의 탄소 시클릭 기일 수 있다. Z와 같은 헤테로아릴 기는 다이(die) 고리 내 적어도 1 내지 3 개의 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자를 함유하는 기 및 바람직하게는 구체적으로 예를 들면 푸릴 기, 티에닐 기, 피리딜 기 또는 퀴놀릴 기인, 5- 내지 7-원 단일-고리 유형, 다중-고리 유형 또는 응축된 고리 유형의 헤테로-시클릭 기일 수 있다.
Z로서의 아릴 기 또는 헤테로아릴 기는 구체적으로는 예를 들면 할로겐 원자, 저급 알킬 기, 저급 알콕실 기, 페닐 기, 페닐-저급 알킬 기, 질산칼륨 (nitre) 기, 아미노 기, 히드록실 기, 및 카르복실 기를 포함하여, 치환체를 갖거나 또는 갖지 않을 수 있고, 이는 다이(die) 독창적인 펩티드 유도체의 활성에 대해 역효과가 없는 임의의 아릴 기 또는 헤테로아릴 기를 포함하지만 이들로만 제한되지는 않는다.
할로겐 원자는, 예를 들면 염소 원자, 플루오린 원자, 및 브로민 원자를 포함한다. 저급 알킬 기는 바람직하게는 1 내지 15 개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 n 선형 또는 분지형 저급 알킬 기이고, 이는 예를 들면 메틸 기 및 에틸 기를 포함한다. 저급 알콕실 기는 바람직하게는 1 내지 15 개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 저급 알콕실 기를 포함하고, 이는 예를 들면 메톡실 기 및 에톡실 기를 포함한다.
페닐-저급 알킬 기 중 저급 알킬 기는 저급 알킬 기, 예를 들면 메틸렌 기 및 에틸렌 기를 비롯한 알킬렌 기를 포함한다.
이 저급 알킬 기, 저급 알콕실 기, 페닐 기, 및 페닐-저급 알킬 기에 대한 치환체는 할로겐 원자 등으로 추가로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 일반 화학식 I 중 기 Z는, 예를 들면 치환된 또는 비치환된 페닐 기, 나프틸 기, 푸릴 기, 티에닐 기, 피리딜 기 및 퀴놀릴 기, 구체적으로는 예를 들면 페닐 기, 4-메톡시페닐 기, 3-메톡시페닐 기, 2-메톡시페닐 기, 2,4-디메톡시페닐 기, 3,5-디메톡시페닐 기, 4-페네틸페닐 기, 3-페네틸페닐 기, 2-페네틸페닐 기, 4-니트로페닐 기, 3-니트로페닐 기, 2-니트로페닐 기, 2,4-디니트로페닐 기, 3 ,4-디니트로페닐 기, 4-메틸페닐 기, 3-메틸페닐 기, 2-메틸페닐 기, 2,4-디메틸페닐 기, 3,5-디메틸페닐 기, 4-플루오로페닐 기, 3-플루오로페닐 기, 2-플루오로페닐 기, 2,4-디플루오로페닐 기, 3,5-디플루오로페닐 기, 2,4,5-트리플루오로페닐 기, 4-페닐페닐 기, 3-페닐페닐 기, 2-페닐페닐 기, 2-푸릴 기, 3-푸릴기, 5-메톡시-2-푸릴기, 5-메틸-2-푸릴기, 1-나프틸 기, 2-나프틸 기, 4-메톡시-1-나프틸 기, 4-메틸-1-나프틸 기, 4-메톡시-2-나프틸 기, 4-메틸-2-나프틸 기, 4-피리딜 기, 2-피리딜 기, 3-피리딜 기, 2-메틸-4-피리딜 기, 4-메틸-2-피리딜 기, 2-티에닐 기, 3-티에닐 기, 3-메틸-2-티에닐 기, 4-메틸-2-티에닐 기, 4-메틸-3-티에닐 기, 6-퀴놀릴 기, 7-퀴놀릴 기, 8-퀴놀릴 기, 4-퀴놀릴 기, 및 4-메틸-6-퀴놀릴 기 등을 포함한다.
본 발명에 따른 일반 화학식 I에서, n은 0,1 또는 2를 나타내고, 아래 첨자 "n"을 갖는 기는 기 Z에 결합한다. n이 0인 경우, 기 Z는 카르보닐 기에 직접적으로 결합하고; n이 1인 경우, 기 z는 메틸렌 기를 통해 카르보닐 기에 결합하고; n이 2인 경우, 기 Z는 에틸렌 기를 통해 카르보닐 기에 결합한다.
일반 화학식 I에서 R은 -OH 또는-NH2, 또는 그의 염을 나타낸다.
본 발명에 따른, 일반 화학식 I에서 AA1-AA2는 서로 결합한 아미노산의 두 유형을 나타낸다. 아미노산 AA1은 바람직하게는 Lys 또는 Arg인 반면에 AA2는 바람직하게는 Val 또는 Leu 이다. AA1 및 AA2는 N-말단에서 C-말단 방향을 따라서 AA1-AA2 순서로 서로 결합한다. 바람직하게는 AA1-AA2는 Lys-Val 또는 Arg-Leu을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 PAR2 효능제는 PAR2를 활성화하는 것으로 알려진 프로테아제이다. 예를 들어, 트립신 및 트립타제는 PAR2의 주요 효능제이다. 트립신 및 트립타제는 PAR2를 절단하여 묶인 리간드 SLIGRL (서열 1) (래트 및 마우스 PAR2)를 노출시키고, 그 후 절단된 수용체의 세포외 루프 II에서 보호된 영역에 결합한다. 특정 응고 인자, 예를 들면 인자 VIIa 또는 인자 Xa는 또한 PAR2를 활성화시킬 수 있다. 다른 예는 상피 세포, 예를 들면 맙트립타제, 인간 기도 트립신-유사 프로테아제, 및 엑스트라 (extra) 췌장 트립신 효소로부터 유도된 프로테아제를 포함한다.
또다른 실시양태에서, PAR2 효능제는 항체 (항체 단편을 포함한 용어임)에 존재할 수 있다. 특히, PAR2 효능제는 항체가 수용체를 활성화시키는 것과 같은 방식으로 PAR2에 대해 지시된 항체에서 존재할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 다이 PAR2 효능제는 압타머일 수 있다. 압타머는 분자 식별의 관점에서 항체에 대해 대안을 나타내는 분자의 분류이다. 압타머는 사실상 높은 친화성 및 특이성을 갖는 표적 분자의 임의의 분류를 인식하는 능력을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고펩티드 서열이다. 그러한 리간드는 문헌 [Tuerk C. and Gold L., 1990]에 기재된 바와 같은 랜덤 서열 라이브러리의 지수적 강화에 의한 리간드의 체계적인 발전 (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, SELEX)을 통해서 단리될 수 있다. 랜덤 서열 라이브러리는 DNA의 조합적 화학 합성에 의해 얻을 수 있다. 이 라이브러리에서, 각각의 구성원은 결국 특정 서열의 화학적으로 변형된, 선형 올리고머이다. 분자의 이 분류의 가능한 변형, 용도 및 이점은 문헌 [Jayasena S.D., 1999]에서 검토하였다. 펩티드 압타머는 두 가지 하이브리드 방법에 의해 조합적 라이브러리로부터 선택된 플랫폼 (platform) 단백질, 예를 들면 이. 콜라이 (E. coli) 티오레독신 A에 의해 나타낸 형태적으로 제한된 항체 가변 영역으로 이루어진다 (문헌 [Colas et al., 1996]).
이어서 상기 기술되어 있는 바와 같이 PAR2에 대해 지시된 압타머를 발생시킨 다음, 당업자는 쉽게 PAR2를 활성화시키는 것들을 선택할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 인플루엔자 바이러스 유형 A의 복제를 억제하기 위한 PAR1 길항제에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 대상체가 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염에 대해 소인이 있는지 아닌지를 시험하는 방법에 관한 것이고, 이는
(i) PAR1 유전자 및/또는 그의 연관된 프로모터에서 돌연변이의 존재 검출, 및/또는
(ii) PAR1 유전자의 발현의 분석
을 위해 상기 대상체로부터 생물학적 샘플을 분석하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터의 임의의 샘플, 예를 들면 혈액 또는 혈청을 지칭한다.
PAR1 유전자에서의 돌연변이를 검출하기 위한 전형적인 기술은 제한 단편 길이 다형성, 혼성화 기술, DNA 서열분석, 엑소뉴클라제 저항, 마이크로서열분석, ddNTP를 사용하는 고체 상 확장, ddNTP를 사용하는 용액에서의 확장, 올리고뉴클레오티드 검정, 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하기 위한 방법, 예를 들면 역학적 대립형질-비 혼성화, 라이게이션 연쇄 반응, 미니-서열분석, DNA "칩", PCR 또는 분자 표시 (beacon)와 융합된 단일 또는 이중-표지 프로브를 갖는 대립형질-비 올리고뉴클레오티드 혼성화, 및 다른 것들을 포함할 수 있다.
PAR1 유전자의 발현의 분석은 전사된 핵산 또는 번역된 단백질의 발현의 검출을 위해 임의의 광범위한 잘 알려진 방법으로 평가될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, PAR1 유전자의 발현은 상기 유전자의 mRNA 전사체 또는 mRNA 전구체, 예를 들면 발생기 RNA의 발현을 분석함에 의해 평가된다. 상기 분석은 대상체로부터의 생물학적 샘플에서의 세포로부터 mRNA/cDNA의 제조 및 레퍼런스 폴리뉴클레오티드로의 mRNA/cDNA의 혼성화에 의해 평가될 수 있다. 제조된 mRNA/cDNA는 서던 (Southern) 또는 노던 (Northern) 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 분석, 예를 들면 정량적 PCR (탁만, TaqMan), 및 프로브 어레이 (array), 예를 들면 진칩 (GeneChip)(TM) DNA 어레이 (AFF YMETRIX)를 포함하지만 이들로만 제한되지는 않는 증폭 검정 또는 혼성화에서 사용될 수 있다.
유리하게는, PAR1 유전자로부터 전사된 mRNA의 발현 수준의 분석은 핵산 증폭의 방법, 예를 들어, RT-PCR (실험 실시양태는 미국 특허 제4,683,202호에 기재되어 있음), 리가아제 연쇄 반응 (문헌 [BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991]), 자가 지속 서열 복제 (문헌 [GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.57, p: 1874-1878, 1990]), 전사적 증폭 시스템 (문헌 [KWOH et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989]), Q-베타 레플리카제 (문헌 [LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988]), 회전 환 복제 (미국 특허 제5,854,033호) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법을 포함하고, 이어서 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하는 증폭된 분자의 검출을 포함한다. 이들 검출 반응식은 핵산 분자가 매우 낮은 수로 존재하는 경우에 핵산 분자를 검출하기 위해 특히 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, 증폭 프라이머는 유전자의 5' 또는 3' 영역 (각각 플러스 및 마이너스 가닥, 또는 그 반대로도 마찬가지임)에 어닐링될 수 있는 핵산 분자의 쌍으로서 정의되고, 중간에서의 짧은 영역을 함유한다. 일반적으로, 증폭 프라이머는 약 10 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이이고, 약 50 내지 200 개의 뉴클레오티드 길이의 영역을 플랭킹 (flank)한다. 적절한 조건 및 적절한 시약 하에서, 상기 프라이머는 프라이머에 의해 플랭킹된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 증폭을 허용한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, PAR1 유전자의 발현은 상기 유전자로부터 번역된 단백질의 발현을 분석하여 평가된다. 상기 분석은 구체적으로는 PAR1 유전자로부터 번역된 단백질에 결합하는 항체 (예를 들어, 방사성-표지, 발색단-표지, 형광단-표지, 또는 효소-표지 항체), 항체 유도체 (예를 들어, 항체는 기질 또는 단백질/리간드 쌍 (예를 들어, 비오틴스트렙타비딘)의 단백질 또는 단백질의 리간드와 접합됨), 또는 항체 단편 (예를 들어, 단일-쇄 항체, 단리된 항체 초가변 도메인 등)을 사용하여 평가될 수 있다.
상기 분석은 효소 면역검정 (EIA), 방사성 면역검정 (RIA), 웨스턴 블롯 검정 및 효소 연결 면역흡수 검정 (RIA)을 포함하지만 이들로만 한정되지는 않는, 당업자로부터 잘 알려진 다양한 기술에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 방법은 대조군에서 유전자의 통상적인 발현 수준을 갖는 대상체로부터 생물학적 샘플에서의 PAR2 유전자의 발현 수준 비교를 포함할 수 있다. 통상적인 발현 수준과 비교한 바와 같이 대상체의 생물학적 샘플에서의 상기 유전자의 발현의 유의하게 더 높은 수준은 환자가 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염 발생에 대한 소인이 지표이다. PAR2 유전자의 발현의 "통상적인" 수준은 임의의 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염에 의해 피해를 입지 않은 대상체의 생물학적 샘플에서 상기 유전자의 발현의 수준이다. 바람직하게는, 발현의 상기 통상적인 수준 및 바람직하게는, 몇몇 대조군 샘플에서의 상기 유전자의 평균 발현 수준은 대조군 샘플 (예를 들어, 임의의 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염에 의해 피해를 입지 않은 건강한 대상체로부터의 샘플임)에서 평가된다.
본 발명에 따른, 대상체에서 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방은 호흡 곤란 증후군의 치료 또는 예방이 아니다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 그러나 이들 실시예 및 도면은 어떠한 방법으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예:
재료 및 방법
동물
이 연구에는 암컷 야생형 C57BL6 마우스 (Charles River, Rhone, France)가 사용되었다. 모든 마우스는 수용 시간에서 5주령이었고, 실험에서 채택 전에 7일 동안 이 조건에 적응하도록 하였고, 수돗물 및 표준 실험실 음식에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 마우스는 국제 농업 연구기관 (Institut National de la Recherche Agronomique, INRA) 동물 보호 시설 (Jouy-en-Josas, France)에서 적절한 조건 (불변 광주기, 12:12-시간 명-암 주기, 22℃)하에 유지하였다. 마우스를 포함하는 모든 절차는 디렉션 데스 서비시스 베터리네어스 (des Services Veterinaires)에 의해 발행된 허가증 (승인 N°. 78-114)의 권한 하에 수행하였다.
상피 세포 및 바이러스 균주
본 연구에 사용된 인간 폐포 유형 II (A549) 및 마딘-다비 (Madin-Darby) 개 신장 세포주 (MDCK)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 수득되었고, 각각 MEME (10% SVF, PS, 글루타민) 및 MEME (5% SVF, PS, 글루타민)에서 배양하였다. 쥐.에프.림멜쯔반 (G. F. Rimmelzwaan) (Erasmus Medical Center, Rotterdam, Netherlands)으로부터의 기프트인 IAV A/PR/8/34 (H1N1)를 배양하였고, 전술한 바와 같이 생성하였다 (문헌 [F. LeBouder and al, 2008; K. Khoufache and al, 2009).
사용된 약물
PAR1-효능제 펩티드 TFLLR-NH2 (H-Thr-Phe-Leu-Leu-Arg-NH2, SEQ ID N°7) 및 대조군 펩티드 FTLLR-NH2 (H-Phe-Thr-Leu-Leu-Arg-NH2, SEQ ID N°8)는 스위스 바켐 (BACHEM) (Bubendorf, Switzerland)으로부터 구매하였다. PAR-1 길항제 SCH79797 디히드로클로라이드는 네덜란드 악손 메드켐 (AXON MEDCHEM)(Groningen, Netherlands)으로부터 구매하였다.
PAR1-효능제 TFLLR-NH2로의 A549의 전처리
IAV A/PR8/34 균주로의 감염 전에, A549 세포는 250 μΜ PAR1-비 활성화 펩티드 TFLLR-NH2를 갖는 5 mn에 대해 자극을 받거나 또는 받지 않는다. 방출된 란테스 (RANTES), IL-6 및 IL-8의 양은 ELISA (R&D Systems)에 의해 감염-후 8, 24, 48 및 72 시간에 배양 상등액에서 분석하였다. 바이러스 역가는 또한 고전적인 플라크 검정에 의해 동일한 상등액에서 결정되었다.
생체내 PAR1-효능제 TFLLR-NH2 효과
PAR1-효능제 (TFLLR-NH2) 자극 실험을 위해서, 6주령 C57BL/6 암컷 마우스 (찰스 & 리버 래보러토리스 (Charles & River Laboratories))를 3일 동안 매일 마취시켰고 (IP), 25 μl의 상이한 용액을 비강내로 노출시켰다. 첫째 날, 마취된 마우스는 비강내로 25 μl 용액을 접종하였다 (50μΜ의 TFLLR-NH2 PAR-1 효능제 또는 FTLLR-NH2 PAR-1 대조군의 존재 또는 부재 하에 A/PR/8/34의 5000, 500, 50 또는 10 PFU). 감염-후 2 및 3일에, 비 처리된 마우스 (25μl/마우스)에 대해 마우스를 25 μl의 펩티드 단독 또는 MEME 배지에 비강내로 노출시켰다. 이어서 감염된 마우스는 생존 및 체중에 대해 매일 모니터링하였고, 바이러스 수치는 플라크 검정에 의해 결정하였고, 사이토킨 (RANTES & IL-6) 및 폴리뉴클리어뉴트로필스 (rneutrophils) (PMN)는 희생된 마우스의 폐에서 감염-후 24 및 48 시간 후에 기관지폐포 세척액 (LBA)으로 투여하였다. 마지막으로, 생체내 PAR-1 효능제의 2차 효과를 결정하기 위해서, 본 발명자는 대조군 마우스에 대해 25 μl의 PAR-1 효능제 (50μΜ) 대 MEME 배지를 마우스 비강내로 노출시켰다. 이어서 처리된 마우스는 생존 비율 및 체중에 대해 매일 모니터링하였다.
생체내 PAR1-길항제 SCH79797 효과
생체내 SCH79797 보호 투여량을 결정하기 위해서, 6주령 C57BL/6 암컷 마우스 (찰스 & 리버 래보러토리스)를 3일 동안 매일 마취시켰고 (IP), SCH79797 (50; 5; 0.5 및 0.2μΜ)의 다양한 농도 및 불변 A/PR/8/34 pfu (5000 pfu)를 함유하는 25 μl의 용액에 비강내로 노출시켰다. 첫째 날, 마취된 마우스는 비강내로 50, 5, 0.5 및 0.2 μΜ의 SCH79797 PAR-1 길항제의 존재 또는 부재 하에 25 μl 용액 (5000, A/PR/8/34의 PFU)을 접종하였다. 감염-후 둘째 및 셋째 날, 마우스를 50, 5, 0.5 및 0.2μΜ에서 25 μl의 SCH79797 대 마우스 대조군 (감염됨)에 대해 등가의 MEME 부피로 비강내로 노출시켰다. 이어서 감염된 마우스는 생존 및 체중에 대해 매일 모니터링하였다.
두번째 단계 및 낮은 IAV pfu에서 SCH79797의 보호율을 결정하기 위해, 6주령 C57BL/6 암컷 마우스 (찰스 & 리버 래보러토리스)는 3일 동안 매일 마취시켰고 (IP), A/PR/8/34 (5000, 500, 50 pfu) 바이러스의 가변 pfu 및 SCH79797 (50 μΜ)의 불변 농축액을 함유하는 25 μl의 용액에 비강내로 노출시켰다. 처리-후 둘째 날 및 셋째 날, 동물은 마우스 대조군에 대해 25 μl의 50 μΜ에서의 SCH79797 또는 MEME로 비강내로 노출시켰다. 이어서, 상술한 바와 같이, 감염된 마우스는 생존 및 체중에 대해 매일 모니터링하였고, 바이러스 수치는 플라크 검정에 의해 결정하였고, 사이토킨 (RANTES & IL-6) 및 폴리뉴클리어뉴트로필스 (PMN)는 희생된 마우스의 폐에서 감염-후 24 및 48 시간 후에 기관지폐포 세척액 (LBA)으로 투여하였다.
메이-그륀발트 및 김자 염색법 (May-Grunewald and Giemsa staining)
기관지폐포 세척액 (BALF)을 1 mM EDTA (인비트로겐 (Invitrogen))를 보충한 PBS (인비트로겐)에서 수집하였다. 세포원심분리(cytocentrifugation) 후, 폴리뉴클리어 뉴트로필스의 백분율을 메이-그륀발트 및 김자염색된 세포원심분리 슈퍼프로스트-플러스 (Superfrost-Plus)(등록상표) 슬라이드의 검경에 의해 샘플마다 총 500 개의 세포를 계수하여 결정하였다.
폐 조직학
10% 포르말린 중 고정되고 파라핀 중 내장된 전체 폐로부터 폐 조직 일부를 절단하였다. 12-마이크로미터-두께 부분을 선택하고, 상술된 바와 같은 조직 병리학적 평가를 위해 H&E로 염색하였다.
통계적 분석
바이러스성 복제 및 ELISA 실험의 통계적 유의성을 위해서 만-휘트니 (Mann-Whitney) U 시험을 사용하였다. 마우스에서의 생존 차이에 대해 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 시험을 사용하였다. 필요한 경우, 통계적 유의성을 유의하였고, p< 0.05의 역치로 시험하였다.
결과
PAR1-효능제 TFLLR-NH2는 IAV-감염된 상피 세포에서의 IAV 바이러스 복제의 방출을 증가시킴
IAV 복제에서의 PAR1의 역할을 조사하기 위해서, A549 폐포 상피 세포를 IAV로 감염시키고, 선택적인 TFLLR-NH2PAR1 효능제 또는 대조군 펩티드로 자극시켰다. PAR1 효능제에 노출되는 경우, 그 후 IAV 감염된 세포는 불활성 대조군 펩티드에 노출된 세포에 비해 더 많은 바이러스를 생성하였다 (도 1a). 본 발명자들은 PAR1 활성화가 A549-감염된 세포에서의 증가된 바이러스 생성을 야기한다는 결론을 내렸다.
그 후, 본 발명자들은 IAV로 감염된 폐 상피 세포에서 염증성 사이토킨의 방출에 대해 PAR1 활성화의 효과를 조사하였다. 이들 세포에서의 PAR1의 자극은 란테스, IL-8 및 IL-6 방출을 유의하게 증가시켰다 (도 1b, c, d). 따라서, PAR1의 효능제는 A549-IAV-감염된-세포에서의 사이토킨 방출에 영향을 미친다.
PAR1-효능제 TFLLR-NH2는 생체내 발병기전 및 사멸을 증가시킴
생체내 PAR1의 역할을 조사하기 위해서, 마우스를 상이한 투여량의 IAV (5000, 500, 50 및 10 pfu/마우스)로 비강내로 감염시키고, 50 μΜ의 PAR1 효능제 펩티드로 자극하거나 또는 자극하지 않았다. 결과는 PAR1 효능제로의 처리가 비 자극된 마우스에 비해서 마우스에서 IAV-유도된 사멸을 증가시켰다는 것을 나타냈다 (도 2a). 비감염된 마우스가 PAR1 효능제에 대해 민감하지 않기 때문에 이러한 증가는 PAR1의 부작용을 야기하지 않았다 (도 2b). PAR1 효능제에 의한 IAV-감염된 마우스에서의 이러한 증가된 발병기전은 본 발명자들에게 PAR1 효능제가 생체내 IAV의 복제를 조절할 수도 있다는 추가의 조사를 야기하였다. 따라서 바이러스 수치는 감염-후 24 및 48 시간에서 PAR1 효능제로 자극되거나 또는 자극되지 않은 감염된 마우스의 폐에서 평가하였다. 결과는 PAR1 비 효능제로 처리된 감염된 마우스는 자극되지 않은 감염된 마우스에 비해 그들의 폐에서 감염성 바이러스 수치를 유의하게 증가시킨다는 것을 나타냈다 (도 2c). 이는 두 개의 상이한 pfu/마우스에서 관찰되었다. 따라서, PAR1 효능제는 생체내 IAV 복제를 증가시킨다.
PAR1 길항제 SCH79797에 의한 IAV 유도된 발병기전 및 사멸로부터의 보호
생체내 PAR1 길항제의 역할을 조사하기 위해서, 마우스는 5000 pfu/마우스로 비강내로 감염시켰고, 상이한 농도의 PAR1 길항제 SCH79797로 처리하였다. 결과는 PAR1 길항제로의 처리는 투여량-의존 방식에서 IAV 유도된 사멸로부터 마우스를 보호한다는 것을 나타냈다 (도 3a). 추가로, 50 μΜ의 길항제 PAR1은 상이한 pfu/마우스, 즉: 5000, 500 및 50으로 감염 후, IAV-유도된 사멸로부터 마우스를 보호하였다 (도 3b). 따라서, 본 발명자들은 PAR1 길항제가 마우스에서 IAV-유도된 사멸로부터 마우스를 보호한다고 결론내렸다. 마지막으로, 바이러스 수치는 감염-후 24 및 48 시간에서 PAR1 길항제로 자극되거나 또는 자극되지 않은 감염된 마우스의 폐에서 평가하였다. 결과는 PAR1의 비 길항제로 처리된 감염된 마우스는 비 처리된 마우스에 비해 그들의 폐에서 감염성 바이러스 수치를 유의하게 감소시킨다는 것을 나타냈다 (도 3c). 따라서, PAR1 길항제는 마우스에서 바이러스 복제를 억제하고, 마우스를 IAV 유도된-발병기전 및 사멸로부터 보호한다.
SEQUENCE LISTING
<110> INRA
Riteau, Beatrice
Khoufache, Khaled
<120> PAR-1 ANTAGONISTS FOR USE IN THE TREATMENT OR PREVENTION OF
INFLUENZA VIRUS TYPE A INFECTIONS
<130> BEP090661
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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Pro Pro Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly
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<223> PAR1- agonist peptide
<400> 8
Phe Thr Leu Leu Arg
1 5
Claims (8)
- 대상체에서의 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방에서의 프로테아제-활성화된 수용체-1 (PAR-1) 길항제의 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 유형 A가 H1N1 바이러스인 용도.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PAR-1 길항제가 펩티드, 펩티드 모방체, 소분자 유기 화합물, 압타머, 펩두신 (pepducin), 폴리뉴클레오티드 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PAR-1 길항제가 N3-시클로프로필-7-{[4-(1-메틸에틸)페닐]메틸)-7H-피롤로[3,2-f]퀴나졸린-1,3-디아민인 용도.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 포유류, 바람직하게는 인간인 용도.
- (i) 하나 이상의 PAR-1 길항제, 및
(ii) 하나 이상의 프로테아제-활성화된 수용체-2 (PAR-2) 효능제
를 포함하는 제약 조성물. - 대상체에서의 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방을 위한 제6항에 따른 제약 조성물의 용도.
- (i) 하나 이상의 PAR-1 길항제, 및
(ii) 하나 이상의 프로테아제-활성화된 수용체-2 (PAR-2) 효능제
를 함유하는, 대상체에서의 인플루엔자 바이러스 유형 A 감염의 치료 또는 예방을 위한 동시, 별도 또는 순차적 사용을 위한 조합된 제제로서의 생성물.
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