KR20160095716A

KR20160095716A - 히스톤의 인산화를 이용한 비만 억제제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20160095716A
Application number: KR1020150016973A
Authority: KR
Inventors: 한정환; 이상아; 엄성희; 유지희
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2016-08-12
Also published as: KR102220907B1

Abstract

본 발명은 지방의 분화 또는 축적을 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보 화합물을 줄기세포에 처리하고, 상기 투여된 줄기세포에서 S6K1(Ribosomal S6 kinase 1)의 발현수준 또는 H2B의 인산화 수준을 측정하는 측정하는 단계를 포함하는 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 제제를 스크리닝하는 방법은 세포수준 뿐만 아니라 생체내에서도 동일한 작용을 나타내는 S6K1에 의한 H2B의 36번 세린잔기의 인산화를 이용하므로, 보다 효과적인 비만억제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

히스톤의 인산화를 이용한 비만 억제제 스크리닝 방법{Method for screening agent for anti-obesity using phosphorylation of histon}

본 발명은 히스톤의 인산화를 이용한 비만 억제제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 지방의 분화 또는 축적을 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보 화합물을 줄기세포에 처리하고, 상기 투여된 줄기세포에서 S6K1(Ribosomal S6 kinase 1)의 발현수준 또는 H2B의 인산화 수준을 측정하는 측정하는 단계를 포함하는 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

비만은 일반적으로 체내에 지방 조직이 과다한 상태인 것을 의미하며, 음식물로 섭취한 에너지가 신체활동 등으로 소비한 에너지와 균형을 이루지 못하여 잉여의 에너지가 체지방으로 축적되는 현상이다. 오랜 시간에 걸쳐 에너지 불균형에 의해 체지방이 비정상적으로 많아지면 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환과 성인병이 유발되며, 이는 서구에서뿐만 아니라 우리나라에서도 심각한 사회문제로 대두되고 있다.

비만은 유전적 요인, 서구화되는 식생활에 의한 환경적 요인, 스트레스에 의한 심리적 요인, 에너지 대사의 이상 등 다양한 원인에 의해 발생한다. 그리고 그 종류는 원인에 따라서 과식과 운동 부족에 의한 단순 비만과 내분비성, 시상하부성, 유전성, 대사성 등에 의한 증후성 비만으로 나눌 수 있다.

비만도 평가에는 체중을 측정하는 방법, 피부주름의 두께를 측정하는 방법이 있는데, 일반적으로 비만도 지수가 25 이상이면 비만으로 정의한다. 신체 비만지수(체질량지수, body mass index, BMI)는 체중(㎏)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 값이며, 서양인은 30 이상이지만 인종 간의 차이를 고려하여 우리나라에서는 25 이상을 비만으로 평가한다.

전 세계적으로 비만 치료제의 개발을 위한 다각적인 측면의 연구가 진행되고 있다. 비만치료용 약물은 크게 지방흡수 억제, 지방 분해 및 열 발생 촉진, 식욕 및 포만감의 조절, 단백질 대사 저해 그리고 음식물의 섭취와 관련된 정서 조절 기전으로 나눌 수 있다. 대표적인 비만 치료제로는 오리스타트(oristat)를 원료로 하여 지방흡수를 억제하는 제니칼™(Xenical™)과 시부트라민(sibutramine)을 주원료로 교감신경계를 자극하여 식욕을 억제시키는 리덕틸™(Reductil™)이 있다. 그러나 제니칼™의 경우 지방변, 복부통증, 구토, 가려움증, 간 손상 등의 부작용이 보고되어 있으며, 리덕틸™의 경우는 두통, 식욕부진, 불면, 변비 등의 부작용뿐만 아니라 심각한 심혈관계 부작용을 일으킨다는 이유로 최근 사용 기준이 강화되는 등의 논란이 일고 있다.

이러한 비만치료제를 통한 약물요법 이외에도 비만을 예방하고 치료하기 위한 방법으로 음식물의 섭취를 제한하는 식이요법, 에너지 소비를 증가시키는 운동요법이 있으며, 정신요법, 행동요법, 외과요법 등도 실시되고 있다.

바람직한 비만의 치료 방법으로는 운동을 통한 에너지 소비 촉진과 부작용이 적은 비만치료용 약제를 병행하는 것이 가장 안전하고 효과적인 방법으로 제시되고 있다. 그러나, 비만치료용 약제의 경우, 상기의 제니칼™과 리덕틸™의 예처럼 심각한 부작용들이 보고되고 있으며 안전성에 대한 명확한 신뢰가 뒷받침되지 않고 있는 실정이다. 따라서, 인체에 대해서 항비만의 우수한 효능을 나타내면서도 안전성이 보장되는 물질의 개발이 요구되고 있다.

한편, 이 같은 안정성이 보장되는 물질을 개발하기 위하여 다양한 천연물을 대상으로 항비만 효과를 나타내는 물질을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 새싹보리에는 식물섬유, 카로틴, 비타민C 등이 다른 채소 및 과일에 비하여 월등히 높은 함량으로 포함되어 있다고 알려져 있다. 뿐만 아니라, 약리활성의 측면에서 상기 새싹보리는 콜레스테롤 저하, 변비 예방, 동맥경화 예방, 항산화활성, 노화 방지, 골다공증 예방, 불면증 개선, 빈혈 예방 등의 효과를 나타낸다고 알려져 있다(장기창 및 강항원, 새싹보리의 영양학적 가치와 항산화, 항암, 항당뇨 및 미백 효과에 관한 연구, 지구촌 식품과 음식문화, 2010; 한국특허등록 제1174497호; 한국특허공개 제2013-0051181호). 특히, 새싹보리에 포함된 루테오린은 항산화제로 알려진 비타민C, 제니스테인 등에 비하여 월등히 우수한 항산화 활성을 나타낸다고 알려져 있고, 루테오린은 당뇨병 치료제인 아카보스보다 월등히 우수한 항당뇨 활성을 나타낸다고 알려져 있다.

그러나, 이처험 안전성이 확보된 항비만 물질이 개발된 후에도 이의 제품화는 결코 용이하지 않은데, 이는 세포수준에서 지방축적을 억제하는 효과를 나타낸다 하더라도, 생체 수준에서는 이러한 지방축적 억제효과가 감소되는 경우가 많기 때문인데, 이는 신체내의 항상성에 의한 것으로 예측되고 있어, 결과적으로는 막대한 비용과 시간의 손실이 발생한다는 문제점이 있다. 만일, 항비만 물질의 초기 선정과정에서 세포수준 뿐만 아니라 생체수준에서 지방의 분화 또는 축적가능성을 미리 타진할 수 있다면, 이같은 문제점을 상당부분 개선할 수 있을 것으로 예상되고 있으나, 아직까지는 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 항비만 물질의 초기 선정과정에서 세포수준 뿐만 아니라 생체수준에서 지방의 분화 또는 축적가능성을 미리 타진할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 줄기세포에서 나타나는 히스톤 단백질의 일종인 H2B의 인산화가 지방의 분화에 관여하고, 이러한 H2B의 인산화와 지방분화의 연관성은 세포수준 뿐만 아니라 생체수준에서도 그대로 유지됨을 규명하여, 상기 H2B의 인산화 여부를 확인함으로써, 항비만 물질을 스크리닝 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 히스톤의 일종인 H2B의 세포내 인산화 수준의 변화를 이용하여 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 보다 효과적으로 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 제제를 스크리닝하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, S6K1(Ribosomal S6 kinase 1)에 주목하게 되었다. 상기 S6K1는 세포내에서 세포의 성장, 크기 및 세포대사에 영향을 미치는 핵심적인 조절인자로서 알려져 있는데, 상기 S6K1이 핵 내에서 수행되는 히스톤의 인산화가 지방의 분화 또는 축적에 필수적임을 확인하였다. 구체적으로, 상기 S6K1는 히스톤의 일종인 H2B의 36번 세린잔기를 인산화시키는데, 이의 발현이 억제된 줄기세포를 지방세포로 분화시킬 경우, 지방세포의 마커수준이 감소하는 반면, 이의 발현을 증가시킬 경우에는 지방세포의 마커수준이 증가함을 확인하였고, 상기 S6K1의 기질인 H2B의 36번 세린이 인산화될 경우 상기 세린의 인산화가 억제되면, PPARγ의 mRNA 수준이 현저하게 감소함을 확인하였다.

이처럼, 본 발명자들은 S6K1의 활성화를 통하여 지방세포 분화를 촉진시키는 과정에서 H2B의 인산화가 수행된다는 점과, 상기 H2B의 인산화가 지방세포의 분화에 필수적이라는 점을 최초로 규명하였다.

따라서, S6K1는 H2B의 36번 세린잔기를 인산화시켜서, 생체내 지방 분화 또는 축적에 관여하며, 이를 이용할 경우 지방의 분화 또는 축적을 억제할 수 있는 제제의 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대되었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 지방의 분화 또는 축적을 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보 화합물을 줄기세포에 처리하고, 상기 투여된 줄기세포에서 S6K1(Ribosomal S6 kinase 1)의 발현수준 또는 H2B의 인산화 수준을 측정하는 측정하는 단계를 포함하는 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 제제의 스크리닝 방법은 (a) 지방세포로 분화될 수 있는 줄기세포에 지방의 분화 또는 축적을 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보 화합물을 처리하는 후보 화합물 처리단계; (b) 상기 후보 화합물을 처리한 세포 내 S6K1(Ribosomal S6 kinase 1)의 발현수준 및 히스톤 H2B(histon H2B)의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 후보 화합물을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 발현수준 또는 인산화 수준을 감소시킨 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.

이때, 상기 S6K1의 발현수준은 바람직하게는 이의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 통해 측정하고, 보다 바람직하게는 S6K1의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 이용하거나 또는 상기 제제를 포함하는 조성물 또는 키트를 이용하여 측정할 수 있으며, 대조군에서 측정된 수준에 비하여 실험군에서 측정된 수준이 유의하게 감소하는 경우, 상기 후보 화합물을 지방의 분화 또는 축적을 억제하는 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정할 수 있다.

본 발명의 용어 "즐기세포"란, 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등과 같은 다양한 세포로 분화될 수 있는 미분화된 성체줄기세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 다양한 조직 중에서도 지방조직으로 분화될 수 있는 줄기세포인 것으로 해석될 수 있는데, 바람직하게는 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cells; MSCs)가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 지방조직을 대량으로 추출할 수 있다는 점에서 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 장점이 있는 지방조직(adipose tissue)에 존재하는 지방줄기세포(adipose-derived stem cells; ASCs)가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 중간엽 줄기세포 중에서 지방세포로의 분화방법이 정립되어 있는 10T1/2 세포가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "S6K1(Ribosomal S6 kinase 1)"란, Ribosomal protein S6 kinase beta-1 이라고도 하고, 세포내에서 세포의 성장, 크기 및 세포대사에 영향을 미치는 핵심적인 조절인자인 단백질로서, RPS6KB1 유전자에 의하여 코딩되는 단백질을 의미한다. 상기 S6K1 또는 이를 코딩하는 유전자의 구체적인 아미노산 서열 또는 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NP_001107806, NM_001114334).

본 발명의 용어 "유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 S6K1를 코딩하는 유전자의 유전자의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머가 될 수 있고, 상기 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 방법으로 증폭시킬 수 있는 한, 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 상기 S6K1를 코딩하는 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 항체가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 S6K1 또는 인산화된 H2B에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 각 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.

한편, 본 발명의 방법을 수행함에 있어서, 사용될 수 있는 상기 각 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 키트는 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명의 S6K1를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 S6K1 또는 인산화된 H2B의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, S6K1이 히스톤을 인산화시킬 수 있는지를 확인한 결과, H2B를 특이적으로 인산화시키고(도 1a), 상기 S6K1의 억제제인 PF-4708671를 처리할 경우에는 농도의존적으로 H2B의 인산화를 감소시키며(도 1b), 상기 S6K1는 H2B의 7 내지 26번 아미노산 부위를 인산화시키고(도 1c), 상기 7 내지 26번 아미노산에 위치한 세린 중에서 36번 세린을 인산화시키며(도 1d), 이를 면역블럿 분석을 통해 확인하였다(도 1e). 한편, 이러한 S6K1의 작용효과가 지방세포의 분화에 미치는 영향을 확인한 결과, S6K1의 발현을 억제시킨 줄기세포를 사용하여 분화된 지방세포에서는 지방생성 전사인자인 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준이 감소되고(도 2a), 구조적으로 활성화된 S6K1을 발현시킨 줄기세포를 사용하여 분화된 지방세포에서는 지방생성 전사인자인 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준이 현저히 증가하며(도 2b), H2B 히스톤의 세린의 인산화가 촉진되면 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준이 증가하는 반면, 상기 세린의 인산화가 억제되면, PPARγ의 mRNA 수준이 현저하게 감소함을 확인하였다(도 2c). 또한, 비만을 유도한 쥐의 백색지방조직에서 정상 식이를 섭취한 쥐의 백색지방조직보다 더 많은 H2B 히스톤 세린의 인산화가 관찰되었고(도 3a), 마찬가지로 과체중 및 비만 환자의 복부피하지방조직에서 정상 BMI를 가지는 환자의 복부피하지방조직보다 H2B 히스톤 세린의 인산화가 증가되어 있음을 확인하였다(도 3b).

따라서, S6K1는 H2B의 36번 세린잔기를 인산화시켜서, 생체내 지방 분화 또는 축적에 관여함을 알 수 있었으므로, 상기 S6K1의 발현수준을 억제시키거나 또는 H2B의 36번 세린잔기의 인산화를 억제시킬 수 있는 물질은 지방의 분화 또는 축적을 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 제제를 스크리닝하는 방법은 세포수준 뿐만 아니라 생체내에서도 동일한 작용을 나타내는 S6K1에 의한 H2B의 36번 세린잔기의 인산화를 이용하므로, 보다 효과적인 비만억제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1a는 S6K1에 의한 다양한 히스톤의 인산화를 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 1b는 S6K1 억제제인 PF-4708671의 처리농도에 따른 H2B의 인산화 수준의 변화를 나타내는 사진이다.
도 1c는 히스톤의 어느 부위에 인산화가 수행되는지를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 1d는 H2B의 7 내지 26번 아미노산을 포함하는 재조합 펩타이드에 포함된 세린 잔기를 알라닌으로 치환시킨 변이체 펩타이드를 대상으로 S6K1에 의한 인산화 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 1e는 10T1/2 세포에서 S6K1 발현억제에 의한 H2B의 36번 세린잔기의 인산화억제를 나타내는 면역블럿 분석사진으로서, H2BS36Ph는 인산화된 36번 세린잔기를 포함하는 H2B를 나타낸다.
도 2a는 S6K1가 정상적으로 발현되거나 또는 이의 발현이 억제된 줄기세포에서 분화된 지방세포에서 지방생성 전사인자인 PPARγ and C/EBPα의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 야생형 S6K1 유전자(S6K1-WT), 구조적으로 활성화된 S6K1 유전자(S6K1-CA) 및 우성음성 S6K1 유전자(S6K1-DN)를 포함하는 각 10T1/2 세포에서 분화된 지방세포에서 측정된 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 야생형 H2B(WT), 36번 세린이 아스파르트산으로 치환된 변이체 H2B(36D) 또는 36번 세린이 알라닌으로 치환된 변이체 H2B(36A)를 발현시키는 각 10T1/2 세포에서 분화된 지방세포에서 측정된 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 고지방 식이를 통해 비만이 유도된 마우스(HFD)와 정상 식이를 섭취한 마우스(NCD)의 백색지방조직에서 H2BS36Ph 정도를 면역 블럿으로서 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3b는 비만 환자(Overweight)와 정상인(Normal)의 복부피하지방조직에서 S6K1의 인산화 수준과 H2BS36Ph의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: S6K1 에 의한 히스톤 인산화

실시예 1-1: 다양한 히스톤의 인산화

다양한 재조합 히스톤(H2A, H2B, H3, H4 또는 H5)을 5 mM MgCl₂ and 0.3 mM ^γ-32PATP (0.5 Ci/ml)를 포함하는 인산화효소 완충액에 가하고, S6K1를 가하거나 또는 가하지 않은 조건에서, 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 단백질 또는 펩타이드를 SDS-PAGE에 적용하였다. 전기영동 젤을 Coomassie blue R-150로 염색하여 가시화하고, AGFA 100 NIF 필름에 넣고 -70℃에서 24시간 동안 노출시켜서 형광사진을 촬영하였다(도 1a).

도 1a는 S6K1에 의한 다양한 히스톤의 인산화를 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 1a에서 보듯이, S6K1는 바람직하게는 H2B를 인산화시켰으나, 다른 히스톤 단백질은 효과적으로 인산화시키지 못하였다.

또한, 상기 H2B와 S6K1를 반응시키면서, S6K1 억제제인 PF-4708671를 다양한 농도(0, 10, 50 또는 100mM)로 처리하여, H2B의 인산화 수준을 측정하였다(도 1b).

도 1b는 S6K1 억제제인 PF-4708671의 처리농도에 따른 H2B의 인산화 수준의 변화를 나타내는 사진이다. 도 1b에서 보듯이, H2B의 단백질 수준은 변화되지 않았으나, PF-4708671의 처리수준이 증가할 수록 H2B의 인산화 수준이 감소함을 확인하였으므로, 상기 H2B의 인산화는 S6K1에 의하여 수행되는 것임을 알 수 있었다.

실시예 1-2: 히스톤의 인산화 부위 규명

상기 H2B의 어느 부위에서 인산화가 수행되는지를 확인하기 위하여, 상기 H2B의 7 내지 26번 아미노산을 포함하는 재조합 펩타이드와 27 내지 46번 아미노산을 포함하는 재조합 펩타이드를 기질로서 사용하여 S6K1과 반응시켰다(도 1c).

도 1c는 히스톤의 어느 부위에 인산화가 수행되는지를 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 1c에서 보듯이, H2B의 7 내지 26번 아미노산을 포함하는 재조합 펩타이드가 인산화됨을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 H2B의 7 내지 26번 아미노산을 포함하는 재조합 펩타이드에서 인산화될 수 있는 세린은 32번, 36번 및 38번 아미노산에 해당함을 확인하고, 상기 각 세린을 알라닌으로 치환시킨 각각의 변이체 펩타이드를 하기와 같이 제작하였다.

27-46: N-KKRKRSRKESYSIYVYKVLK-C(서열번호 1)

S32A: N-KKRKRSRKESYSIYVYKVLK-C(서열번호 2)

S36A: N-KKRKRSRKESYSIYVYKVLK-C(서열번호 3)

S38A: N-KKRKRSRKESYSIYVYKVLK-C(서열번호 4)

상기 제작한 각 변이체 펩타이드를 기질로서 사용하여 S6K1과 반응시켰다(도 1d).

도 1d는 H2B의 7 내지 26번 아미노산을 포함하는 재조합 펩타이드에 포함된 세린 잔기를 알라닌으로 치환시킨 변이체 펩타이드를 대상으로 S6K1에 의한 인산화 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 1d에서 보듯이, 36번 세린이 알라닌으로 치환된 변이체 펩타이드는 인산화가 수행되지 않음을 확인하였으므로, 상기 S6K1는 H2B 히스톤의 36번 세린을 인산화시킴을 알 수 있었다.

실시예 1-3: 세포내에서 S6K1 에 의한 히스톤 인산화 검증

10T1/2 세포를 10% BCS와 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 상기 배양된 10T1/2 세포 세포에 라파마이신(Calbiochem, 100 nM)과 PF-4708671(Tocris, 20 μM)를 처리하여 S6K1 활성을 억제하였다. 이어, S6K1를 넉다운시키기 위하여, Lipofectamine 2000 reagent (Life Technologies)를 사용하여 세포에 렌티바이러스 벡터를 사용하여 S6K1에 대한 siRNA를 도입하고, 상기 렌티바이러스가 도입되어 siRNA가 발현되는 세포는 퓨로마이신(2 ㎍/㎖)을 사용하여 선별하였다. 상기 S6K1에 대한 siRNA의 서열은 다음과 같다:

#03 F: 5'-GGACCAGCCAGAAGAUGCAGGCUCU-3'(서열번호 5)

#03 R: 5'-AGAGCCUGCAUCUUCUGGCUGGUCC-3'(서열번호 6)

#04 F: 5'-CACCCUUUCAUUGUGGACCUGAUUU-3'(서열번호 7)

#04 R: 5'-AAAUCAGGUCCACAAUGAAAGGGUG-3'(서열번호 8)

상기 두 가지 siRNA가 발현된 10T1/2 세포를 대상으로 항-p70 S6K1 항체(Cell Signaling Technology)와 항-histone H2B Ser36 phosphorylation 항체(ECM biosciences)를 사용한 면역블럿 분석을 수행하였다(도 1e). 이때, 내부대조군으로는 액틴을 사용하였다.

도 1e는 10T1/2 세포에서 S6K1 발현억제에 의한 H2B의 36번 세린잔기의 인산화억제를 나타내는 면역블럿 분석사진으로서, H2BS36Ph는 인산화된 36번 세린잔기를 포함하는 H2B를 나타낸다. 도 1e에서 보듯이, 줄기세포인 10T1/2 세포 내에서도 S6K1에 의하여 H2B의 36번 세린잔기의 인산화가 수행됨을 알 수 있었다.

실시예 2: 줄기세포의 지방분화 유도에 미치는 S6K1 의 효과규명

상기 S6K1가 지방세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하고자 하였다.

실시예 2-1: S6K1 의 발현여부에 따른 PPAR γ and C/ EBP α의 발현수준 변화

줄기세포에서, 지방생성 전사인자인 PPARγ 및 C/EBPα의 발현수준이 S6K1의 발현여부에 따라 변화되는지를 확인하고자 하였다.

먼저, 10T1/2 세포 및 상기 실시예 1-3에서 제작된 두 가지 siRNA가 발현된 10T1/2 세포(siS6K1 #03 및 siS6K1 #04)를 10% FBS, 1% P/S 및 10 ㎍/㎖ BMP4를 포함하는 DMEM 배지에서 4일 동안 배양하여 지방전구세포로 분화시키고, 상기 분화된지방전구세포를 10% FBS, 1% P/S, 0.5 mM IBMX(3-isobuyl-1-methylxanthine), 1μM 덱사메타손 및 1 ㎍/㎖ 인슐린을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하여 지방세포로 분화시켰다. 상기 분화된 세포로부터 총 RNA를 수득하고, 상기 수득한 총 RNA를 Reverse Transcription kit (Promega, USA)를 사용하여 역전사시켜서 cDNA를 수득하였다. 이어, 상기 cDNA를 주형으로 사용한 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 CFX96TM 및 Chromo4TM real-time PCR detector (Bio-Rad)를 포함하는 KAPATM SYBR FAST qPCR (KAPABIOSYSTEMS)를 사용하여 수행함으로써, PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준을 측정하고 이를 비교하였다(도 2a).

도 2a는 S6K1가 정상적으로 발현되거나 또는 이의 발현이 억제된 줄기세포에서 분화된 지방세포에서 지방생성 전사인자인 PPARγ and C/EBPα의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2a에서 보듯이, S6K1의 발현이 억제된 줄기세포에서는 지방생성 전사인자인 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준이 감소됨을 확인하였다.

실시예 2-2: 활성화된 S6K1 에 의한 PPAR γ and C/ EBP α의 발현수준 변화

상기 실시예 2-1의 결과로부터, S6K1의 발현억제에 따른 PPARγ 및 C/EBPα의 발현수준을 감소시킴을 확인하였으므로, 상기 S6K1의 활성화가 PPARγ 및 C/EBPα의 발현수준에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 10T1/2 세포에 구조적으로 활성화된 S6K1 유전자를 도입하거나(S6K1-CA) 또는 우성음성 S6K1 유전자(S6K1-DN)를 도입하여 각각의 형질전환체를 수득하고, 이들 형질전환체를 지방세포로 분화시킨 다음, 분화된 지방세포에서 발현되는 PPARγ 및 C/EBPα의 발현수준을 실시예 2-1의 방법으로 측정한 후, 비교하였다(도 2b). 이때, 대조군으로는 야생형 S6K1 유전자(S6K1-WT)를 갖고 있는 형질전환되지 않은 10T1/2 세포를 사용하였다.

도 2b는 야생형 S6K1 유전자(S6K1-WT), 구조적으로 활성화된 S6K1 유전자(S6K1-CA) 및 우성음성 S6K1 유전자(S6K1-DN)를 포함하는 각 10T1/2 세포에서 분화된 지방세포에서 측정된 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2b에서 보듯이, 구조적으로 활성화된 S6K1 유전자(S6K1-CA)가 도입된 줄기세포에서는 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준이 증가하였으며, 특히 PPARγ의 mRNA 수준이 현저하게 증가됨을 확인하였다.

실시예 2-3: 히스톤 H2B 의 인산화 여부에 의한 PPAR γ and C/ EBP α의 발현수준 변화

상기 실시예 2-2의 결과로부터, S6K1의 활성이 증가되면 PPARγ 및 C/EBPα의 발현수준을 증가됨을 확인하였으므로, 이러한 현상이 S6K1에 의하여 인산화되는 히스톤 H2B의 36번 세린의 인산화와 연관되는지를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 H2B의 36번 세린을 각각 세린과 유사한 아스파르트산(36D) 또는 세린과 상이한 알라닌(36A)으로 치환시킨 변이체를 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 10T1/2 세포에 도입하여 각각의 형질전환체를 수득하고,이들 형질전환체를 지방세포로 분화시킨 다음, 분화된 지방세포에서 발현되는 PPARγ 및 C/EBPα의 발현수준을 실시예 2-1의 방법으로 측정한 후, 비교하였다(도 2c). 이때, 대조군으로는 야생형 H2B 유전자(WT)를 갖고 있는 형질전환되지 않은 10T1/2 세포를 사용하였다.

도 2c는 야생형 H2B(WT), 36번 세린이 아스파르트산으로 치환된 변이체 H2B(36D) 또는 36번 세린이 알라닌으로 치환된 변이체 H2B(36A)를 발현시키는 각 10T1/2 세포에서 분화된 지방세포에서 측정된 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2c에서 보듯이, 야생형 H2B를 포함하는 세포에 비하여, 36번 세린이 아스파르트산으로 치환된 변이체를 포함하는 세포에서는 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 수준이 증가하는 반면, 상기 36번 세린이 알라닌으로 치환된 변이체를 포함하는 세포에서는 PPARγ의 mRNA 수준이 현저하게 감소됨을 확인하였다.

따라서, 상기 H2B의 36번 세린의 인산화가 PPARγ 및 C/EBPα의 발현수준에 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3: 생체 지방조직 검증

상기 실시예 1 내지 2의 결과로부터, S6K1의 발현억제가 H2B의 36번 세린의 인산화 억제를 통하여 지방분화를 억제할 수 있음을 확인하였으므로, 이러한 작용효과가 생체내에서도 동일하게 적용될 수 있는지를 확인하고자 하였다.

실시예 3-1: 비만 마우스에서의 히스톤의 인산화 정도 분석

고지방 식이를 통해 비만이 유도된 마우스(HFD)와 정상 식이를 섭취한 마우스(NCD)를 대상으로, 부정소의 항-히스톤 H2B Ser36 인산화 항체(ECM biosciences)를 사용한 면역블럿 분석을 수행하였다(도 3a). 이때, 내부대조군으로서는 액틴을 사용하였다.

도 3a는 고지방 식이를 통해 비만이 유도된 마우스(HFD)와 정상 식이를 섭취한 마우스(NCD)의 백색지방조직에서 H2BS36Ph 정도를 면역 블럿으로서 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3a에서 보듯이, 비만이 유도된 마우스의 지방조직에서 H2B의 36번 세린잔기의 인산화 수준이 증가됨을 확인하였다.

실시예 3-2: 비만 환자에서의 S6K1에 의한 히스톤의 인산화 정도 분석

상기 실시예 3-1의 결과로부터, 비만 마우스의 지방조직에서 히스톤 H2B의 36번 세린의 인산화가 증가됨을 확인하였으므로, 이러한 현상이 사람 지방조직에서도 관찰되는지를 확인하고자,

BMI가 23 이상인 과체중 및 비만 환자들(Overweight)과 BMI가 23 미만인 정상 환자(Normal)의 복부피하지방조직에서 S6K1의 인산화 수준과 H2BS36Ph의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 비교하였다(도 3b).

도 3b는 비만 환자(Overweight)와 정상인(Normal)의 복부피하지방조직에서 S6K1의 인산화 수준과 H2BS36Ph의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3b에서 보듯이, 비만 환자의 지방조직에서 S6K1의 총 단백질량 대비 활성화된 S6K1의 단백질량(P-S6K1)이 증가됨을 확인하였다. 또한 H2B의 36번 세린잔기의 인산화 수준 역시 증가됨을 확인하였다.

따라서 S6K1에 의한 히스톤 H2B의 36번 세린 인산화가 항비만제의 타겟이 될 수 있음을 생체 조직에서 확인하였다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Method for screening agent for anti-obesity using phosphorylation of histon <130> KPA140984-KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Ile Tyr Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val Leu Lys 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 2 Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Ile Tyr Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val Leu Lys 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 3 Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Ile Tyr Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val Leu Lys 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 4 Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Ile Tyr Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val Leu Lys 20 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 5 ggaccagcca gaagaugcag gcucu 25 <210> 6 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 6 agagccugca ucuucuggcu ggucc 25 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 7 cacccuuuca uuguggaccu gauuu 25 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 8 aaaucagguc cacaaugaaa gggug 25

Claims

(a) 지방세포로 분화될 수 있는 분리된 줄기세포에 지방의 분화 또는 축적을 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보 화합물을 처리하는 후보 화합물 처리단계;
(b) 상기 후보 화합물을 처리한 세포 내 S6K1(Ribosomal S6 kinase 1)의 발현수준 및 히스톤 H2B(histon H2B)의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 후보 화합물을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 발현수준 및 인산화 수준을 감소시킨 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 제제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cells; MSCs)인 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 S6K1의 발현수준 측정은 S6K1를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 상기 유전자에 특이적으로 결합될 수 있는 프로브를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 S6K1의 발현수준 측정은 S6K1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 H2B의 인산화 수준은 인산화된 H2B와 특이적으로 결합될 수 있는 항체를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 후보 화합물은 S6K1의 발현을 억제하고, H2B의 인산화를 억제하는 활성을 나타내는 것인 방법.