KR102386705B1 - 알룰로스의 항비만 활성 관련 마커 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

알룰로스의 항비만 활성 관련 마커 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알룰로스의 항비만 활성 관련 마커 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 자세하게는 알룰로스 섭취에 따라 발현이 달라지는 항비만 관련 마커 유전자, 및 상기 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측 또는 검정용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

알룰로스의 항비만 활성 관련 마커 유전자 및 이의 용도{marker gene related with anti-adipogenic activity of allulose and use thereof}
본 발명은 알룰로스의 항비만 활성 관련 마커 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 자세하게는 알룰로스 섭취에 따라 발현이 달라지는 항비만 관련 마커 유전자, 및 상기 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측 또는 검정용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
비만증은 일반적으로 체질량지수 (BMI)가 25 kg/m2 이상으로 정의 되는데, 미국의 경우, 대략 20% 정도의 인구가 비만증에 해당되어 사회적으로도 매우 심각한 문제이다. 비만증은 고혈압, 당뇨병 및 심혈관질환의 주요 위험인자가 되기도 한다. 비만에 대한 관리 비용은 매년 100조원 정도에 이른다. 다이어트 열풍이 불고 있고, 비만과 관련하여 몇몇 식품이나 의약품이 알려져 있으나 아직까지 효과적인 비만 치료방법은 없는 실정이다. 비만은 인체의 에너지 저장기능 장애라고 할 수 있다. 체중의 증가는 에너지 입출입의 불균형 (에너지의 배출수준을 입력이 초과하고 있는 상태)으로 인하여 남아도는 칼로리가 트리글리세라이드(중성지방)의 형태로 지방조직에 축적됨으로써 일어나게 된다.
감미료는 오랫동안 식품 등의 첨가물로 널리 사용되어 왔고, 설탕, 과당 및 포도당과 같은 천연 당류는 그들의 좋은 맛으로 인하여 음료, 식품, 약제 및 구강 위생/화장품 산업에서 많이 사용되고 있다. 특히, 설탕은 소비자에게 바람직한 맛을 부여하여 널리 사용되고 있다.
설탕은 뛰어난 감미도를 지니고 있어 과거부터 여러 음식, 가공 식품 등에 첨가되어 음식의 맛을 좋게 하고 입맛을 돋우는 가장 선호되는 감미료로 여겨져 왔다. 그러나 최근, 설탕의 유해성이 계속하여 밝혀짐에 따라 문제가 제기되고 있다.
최근 전 세계적으로 문제가 되고 있는 성인병, 비만 등을 해결하기 위한 방안 중 하나로써, 한국을 비롯한 다수 국가에서 자국 국민의 당 섭취를 줄이기 위한 다양한 정책이 시행되고 있는 추세이다. 본 명세서에서 용어 "당류 저감"은 특별한 언급이 없는 한, 과잉 섭취시 비만, 당뇨, 심혈관계 질환, 기타 각종 성인병의 발생 위험을 높이는 것으로 알려진 포도당, 과당, 자당 등 단당류 및 이당류의 함량이 낮아짐을 의미하며, 이 때 상기 "당류"에는 알룰로스 등의 희소당은 포함되지 않는다.
알룰로스는 과당의 3번 탄소의 에피머로서, 과당의 70%에 해당하는 감미도를 가지고 있으며, 혈당 조절, 충치예방 및 간에서 지방합성을 저해하는 기능성 당이다. 설탕 대체 감미료로 많이 사용되고 있는 당알코올류는 일정량 이상 섭취 시 설사를 유발하는 등의 부작용이 있으나 알룰로스는 알려진 부작용이 없다. 따라서 알룰로스의 감미료로서의 관심이 높아지고 있다.
본 발명의 목적은 알룰로스 섭취에 따라 유전자 또는 단백질 발현이 상이한, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측 또는 검정용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알룰로스 섭취에 따라 유전자 또는 단백질 발현이 상이한 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측 또는 검정용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 알룰로스 섭취에 따라 유전자 또는 단백질 발현이 상이한 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측 또는 검정에 필요한 정보를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 알룰로스의 항비만 반응성의 예측하고, 상기 알룰로스의 항비만 반응성의 예측결과에 따라 알룰로스를 투여하는 단계를 포함하는 대상의 비만 또는 과체중을 치료, 예방 또는 개선하는 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측을 통해 알룰로스 식이 투여를 위한 대상을 선정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 목적은 대상에게 알룰로스를 투여하고, 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 알룰로스의 항비만 반응성의 검정을 수행하고, 상기 알룰로스의 항비만 반응성의 검정결과에 따라 알룰로스를 투여하는 단계를 포함하는 대상의 비만 또는 과체중을 치료, 예방 또는 개선하는 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로, 알룰로스 투여에 따른 항비만 반응성을 검정, 평가 또는 모니터링하고, 상기 결과에 따라 대상에게 알룰로스를 투여하는 방법에 반영하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명에서는 정상 동물 모델에 고과당 식이를 투여한 것 또는 유전적으로 비만을 유도한 동물을 사용하여 알룰로스 포함 식이를 제공하고, 상기 실험동물의 체중 변화 및 지방조직의 무게 변화를 측정하고, 또한 지방조직 및 간조직에서 지방합성, 지방분해, 염증과 관련된 마커 유전자를 선별하였다. 상기 선별된 마커 유전자를 이용하여 알룰로스의 항비만 반응성의 예측 또는 검정하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 일예는 ADAM12, ADGRE1, CD36, CD44, FOS, IL7R, TLR8, PRAR-alpha, C/EBP-alpha, AP2, LPL, FAS, HSL, CPT-1, FOS, MMP3, FGF21 및 ABCD2로 이루어진 군에서 선택된 마커 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는 상기 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측 또는 검정용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는 상기 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 알룰로스의 항비만 반응성 예측 또는 검정에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 일예는 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 알룰로스의 항비만 반응성의 예측하고, 상기 알룰로스의 항비만 반응성의 예측결과에 따라 알룰로스를 투여하는 단계를 포함하는 대상의 비만 또는 과체중을 치료, 예방 또는 개선하는 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측을 통해 알룰로스 식이 투여를 위한 대상을 선정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일예는 대상에게 알룰로스를 투여하고, 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 알룰로스의 항비만 반응성의 검정을 수행하고, 상기 알룰로스의 항비만 반응성의 검정결과에 따라 알룰로스를 투여하는 단계를 포함하는 대상의 비만 또는 과체중을 치료, 예방 또는 개선하는 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로, 알룰로스 투여에 따른 항비만 반응성을 검정, 평가 또는 모니터링하고, 상기 결과에 따라 대상에게 알룰로스를 투여하는 방법에 반영하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "대상" 이라 함은 알룰로스 식이의 투여 대상, 더욱 자세하게는 알룰로스의 항비만 반응성 예측 또는 검정할 필요가 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 포유류, 예컨대 래트, 마우스, 사람 등을 포함하며 특별히 제한하지 않는다.
본 발명에 따른 일에 따른 알룰로스 항비만 활성과 관련된 마커 유전자는 ADAM12, ADGRE1, CD36, CD44, FOS, IL7R, TLR8, PRAR-alpha, C/EBP-alpha, AP2, LPL, FAS, HSL, CPT-1, FOS, MMP3, FGF21 및 ABCD2로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 항비만 반응성은 체중 감소, 체지방 감소, 체지 지방구의 크기 감소, 지방 조직에서 지방합성 감소, 지방조직에서 지방분해 증가를 포함한다.
상기 마커 유전자는, 비만 관련 염증에 관련된 마커 유전자는 ADAM12, ADGRE1, CD36, CD44, FOS, IL7R 또는 TLR8이고, 알룰로스로 유도된 면역 및 지질 대사 관련된 마커 유전자는 FOS, MMP3, FGF21 또는 ABCD2이며, 지방 조직의 지방 분해와 관련된 PPAR-alpha, ATGL 또는 HSL이다.
상기 마커 유전자 중에서, 지방대사에 관련된 마커는 FOS, PRAR-alpha, FGF21, MMP3, C/EBP-alpha, AP2, LPL, 및 FAS이고, 베타-산화와 관련된 마커는 HSL, CPT-1, 및 ABCD2이다.
알룰로스는 과당의 3번 탄소의 에피머로서, 과당의 70%에 해당하는 감미도를 가지고 있으며, 혈당 조절, 충치예방 및 간에서 지방합성을 저해하는 기능성 당이다. 상기 알룰로스 시럽은 알룰로스이외에, 포도당, 과당 및 이당류 이상의 당류를 포함할 수 있다. 알룰로스 시럽은 다양한 방법으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 생물학적 방법, 예를 들면 미생물 효소반응으로 제조될 수 있다.
본 발명의 알룰로스 제조를 위한 일 예로서, 알룰로스 전환효소를 발현하는 균주 또는 알룰로스 전환효소를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 균주, 예를 들면 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물를 이용하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 상기 알룰로스 시럽은 알룰로스 함유 혼합당 또는 이로부터 얻어지는 것이며, 상기 혼합당은 알룰로스 전환 효소, 상기 효소를 생산하는 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 알룰로스 생산용 조성물을 과당-함유 원료와 반응하여 제조된 혼합당 또는 이로부터 얻어지는 것일 수 있다.
이 경우, 보다 바람직하게, 상기 조성물 및 키트는 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 마커 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 대상체의 알룰로스에 대한 반응성 예측용 마이크로어레이에 관한 것이다.
본 발명의 용어, "마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제"는 대상체의 알룰로스 반응성을 예측 또는 검정하기 위하여, 대상체 시료에서 상기 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 직접 또는 간접적으로 측정하여 발현 정도를 확인하는 제제를 의미한다. 예를 들어, 상기 제제는 마커 유전자 중 1종 이상의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제제는 마커 유전자 중 1종 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 마커 유전자의 발현 수준은 해당 유전자의 mRNA 의 발현수준 또는 유전자에 의해 코딩 되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 대상의 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA 의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 동일할 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 말한다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 알룰로스의 반응성을 예측 또는 검정할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 대상의 시료에서 마커 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion),오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 키트는 마커 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명에서 키트는 알룰로스 식이 유무에 따라 발현이 증가되는 마커 유전자 및/또는 특이적으로 발현이 감소되는 마커 유전자의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필수한 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오디트(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 유전자 검출용 키트일 수 있다. 마이크로어레이, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 마이크로어레이에서 선택된 10개 이상의 유전자 또는 그 단편에 해당하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, DNA 마이크로어레이일 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 알룰로스의 항비만 활성을 예측 또는 검정하거나, 또는 대상의 알룰로스에 대한 반응성 예측 또는 검정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체의 시료로부터 마커 유전자중 1종 이상을 검출하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 대상의 시료로부터 ADAM12, ADGRE1, CD36, CD44, FOS, IL7R, TLR8, PRAR-alpha, C/EBP-alpha, AP2, LPL, FAS, HSL, CPT-1, FOS, MMP3, FGF21 및 ABCD2로 이루어진 군에서 선택된 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 알룰로스의 항비만 반응성 예측 또는 검정에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일예는, 일예로, 본 발명은 알룰로스 식이를 투여한 대상의 시료로부터 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 마커 유전자의 발현 수준을 대조구 시료의 마커 유전자 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대상체의 알룰로스의 항비만 활성을 예측 또는 검정하거나, 또는 대상체의 알룰로스에 대한 반응성 예측 또는 검정을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
이 경우, 보다 바람직하게, 상기 방법은 추가적으로, 대상의 시료로부터 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 발현 수준을 대조구 시료의 마커 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 비교단계에서 알룰로스 식이군의 유전자 발현 수준이 증가 또는 감소한 경우, 알룰로스의 항비만 반응성을 갖는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 알룰로스의 항비만 반응성 예측 또는 검정에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다. 마커 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계는, 네트워크 분석을 통해 알룰로스 식이에 반응한 각각의 발현 유전자 사이의 Fold change(FC)가 1.2상, 1.3이상, 1.4이상 또는 1.5이상이거나, 또는 -1.2이하, -1.3이하, -1.4이하, 또는 -1.5이하인 경우를 cut-off 값으로 하여 P<0.05인 유전자를 Ingenuity(상표명)Knowledge Base와 비교하여 결정할 수 있다.
상기 마커 유전자의 발현 수준이 mRNA, DNA, 또는 단백질에 의해서 측정될 수 있으며, 예를 들면, 상기 mRNA가 역전사효소 중합효소연쇄반응, 핵산 하이브리드화, 전기영동, 노던 블럿팅 또는 질량분광법에 의해서 측정될 수 있으며, 구체적으로 마커 유전자의 발현 수준 측정은, 상기 시료에서 RNA를 수득하고, 사기 RNA를 역전사하여 cDNA를 수득하고, 상기 cDNA에 검출가능한 표지를 부착하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 측정하는 것인 방법으로서, 상기 검출가능한 표지가 효소, 방사성 동위원소, 형광물질, 화학발광성 분자, 방사선 물질, 리포좀 또는 햅텐 분자일 수 있다.
또한, 상기 DNA가 정량적 폴리머라제 연쇄반응, 게놈 DNA-칩, 전기영동, 서던블랏팅 또는 질량 분광법에 의해 측정될 수 있으며, 상기 단백질이 면역학적 검정법, 웨스턴 블랏, ELISA 또는 질량분광법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 알룰로스 섭취에 따라 유전자 또는 단백질 발현이 상이한, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측 또는 검정용 마커 유전자 및 이의 용도를 제공하여, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측하고, 상기 알룰로스의 항비만 반응성의 예측결과에 따라 알룰로스를 투여하는 단계를 포함하는 대상의 비만 또는 과체중을 치료, 예방 또는 개선할 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 경구 당부하 실험 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따라 실험 동물에 섭취한 식이의 열량을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따라 알룰로스의 지방축적 억제 효능 확인을 위한 고과당 식이 섭취량 및 동물실험 체중변화 측정한 결과이다.
도 5a 내지 도 5d는 본 발명의 실시예 1에 따라 알룰로스가 함유된 실험식이군에서 얻어진 다양한 지방 조직의 무게를 측정한 결과이다.
도 6 및 도 7은 본 발명의 실시예 1에 따라 대조군 및 알룰로스가 함유된 실험식이군의 동물에서 얻어진 부고환 지방조직(Epididymal fat)을 조직학적 분석 결과를 나타내는 사진이다
도 8a 내지 도 8e는 본 발명의 실시예 2에 따라 고과당 식이를 섭취한 정상 동물모델에서 얻어진 지방 조직의 지방 조직 내 지방 분해와 관련된 유전자로서 PPARα, ACADM, CPT1, HSL, adipose triglyceride lipase(ATGL)의 mRNA 발현에 대한 실험 결과를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c는 본 발명의 실시예 2에 따라 고과당 식이를 섭취한 정상 동물모델에서 얻어진 간 조직의 간 조직 내 지방 분해와 관련된 유전자로서 PPARα, CPT1, ACADM의 mRNA 발현 결과를 나타낸다.
도 10a 내지 도 10b는 본 발명의 실시예 3에 따라 유전적으로 비만이 유도된 마우스의 해부에서 얻어진 지방조직의 염색 결과를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11e 및 도 12는 본 발명의 실시예 4에 따라 유전적으로 비만이 유도된 마우스의 지방조직에서 분리한 유전자의 발현분석 결과를 나타낸다.
도 13a 내지 도 13d는 본 발명의 실시예 4에 따라 유전적으로 비만이 유도된 마우스의 지방조직의 염증과 지질 대사에 관련된 유전자의 발현분석 결과를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 알룰로스의 항비만 활성과 관련이 있는 마커 유전자의 발현 수준을 정리한 모식도이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 정상 실험동물 실험
1-1: 실험동물 실험 디자인
실험동물은 5주령의 C57BL/6J 마우스 48마리를 분양 받아 사육함. 사육환경에 적응시키기 위해 7일 동안 예비 사육한 후 실험 시작 시점에 난괴법에 의해 네 군으로 나누어 총 10주간 사육하였다.
실험동물은 일반식이(AIN-93G)를 공급한 대조군과 30% D-fructose 식이를 공급한 군, 15% D-fructose + D-psicose, 15% D-fructose+ 15% tranose가 함유된 식이를 공급한 총 3군의 실험군으로 구성되었다.
이전 실험과는 달리 알룰로스가 열량(0kcal/g)을 거의 내지 않기 때문에 동일한 무게의 식이를 섭취하더라도 동일한 수준의 열량 섭취가 어려운 점이 있다. 이 점을 보완하기 위하여 모든 군이 열량을 동등하게 섭취할 수 있도록 대조군의 평균 섭취량을 측정해 동일한 수준의 열량 제공이 가능하도록 실험군의 식이량을 조절하는 pair feeding 방식을 도입하였다.
실험 식수는 자유롭게 섭취하도록 하며 실험기간 동안 체중은 매주 1회, 식이섭취량은 매주 3회 일정한 시간에 측정하였다. 이 조성표는 표 1에 제시하였으며 각 식이는 식이의 단위 kg당 성분의 양을 그램으로 나타낸 것이다.
성분(g/Kg) 그룹1(대조군)
AIN 93G		 그룹2
(30% 프럭토스)		 그룹3
(15% 프럭토스 + 15% 알룰로스)		 그룹4
(15%프럭토스+15%투라노스)
Cornstarch 397.49 297.49 297.49 297.49
Casein 200 200 200 200
Dextrin 132 32 32 32
Sucrose 100 - - -
D-fructose - 300 150 150
D-psicose - - 150 -
Turanose - - - 150
cellulose 50 50 50 50
Soybean OIL 70 70 70 70
t-buthylhydroquinone1 ) 0.014 0.014 0.014 0.014
Mineral mix2 ) 35 35 35 35
Vitamin mix3 ) 10 10 10 10
L-cysteine 3 3 3 3
Choline bisfate 2.5 2.5 2.5 2.5
합계(g) 1000 1000.004 1000.004 1000.004
Carbohydrate 2528 2528 1958 1958
protein 731 731 731 731
fat 637 637 637 637
Total energy(Kcal/Kg) 3896 3896 3896 3896
상기 표 1에서, 1)항산화제: 0.01 g/ 50 g lipids 2)AIN-93G mineral mix 3)AIN-93G vitamin mix임
1-2: 경구 당부하 실험( OGTT , Oral glucose tolerance test)
설계 실험동물을 이용한 알룰로스의 당 대사 조절 기능 평가를 위한 경구당부하 실험(OGTT, Oral glucose tolerance test)을 수행하였다.
실시예 1-1에서 설계한 고과당 식이 섭취 실험동물에 대해, 고과당 식이 공급 10주차에 각각 12시간 절식시킨 후, 그룹별로 포도당 용액을 2g/kg체중에 해당하도록 경구 공급한 뒤 0분, 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 경과 후에 꼬리정맥을 통해 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 혈당측정기(Johnson&Johnson, New Jersey, USA)를 이용하여 혈당을 측정해 변화를 관찰하였다. 실험결과를 하기 표 2와, 도 2 및 도 3에 나타냈다. 하기 표 2는 고과당 식이 10주차 혈중 포도당 농도(Unit: mg/dl, n=12/group)를 나타낸다.
Figure 112016108784830-pat00001
a, b, c, 그룹간 통계적으로 유의한 함(P<0.05)
상기 혈당 측정결과, 15% fructose + 15% psicose 식이 공급 군(그룹 3)이 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 0분을 제외한 모든 시간에서 가장 낮은 혈당을 보였다. 당부하 후 반응곡선 이하 면적으로 계산한 혈당면적 또한 대조군에 비하여 통계적으로 가장 낮은 것을 확인하였다(도 1 및 도 2).
1-3: 동물실험 체중변화 측정
알룰로스의 지방축적 억제 효능 확인을 위한 고과당 식이 섭취량 및 동물실험 체중변화 측정하였다.
10주간 섭취한 열량은 모든 군에서 통계적으로 유의적인 차이가 존재하지 않았다(표 3, 도 3). 따라서 체중과 체지방의 변화가 열량 섭취 차이로 인해 기인하지 않음을 확인할 수 있었다.
Figure 112016108784830-pat00002
실험종료 시점에 알룰로스가 함유된 식이 공급에 따른 체중변화를 관찰한 결과, 대조군에 비하여 알룰로스가 함유된 식이를 공급한 군이 유의적으로 가장 낮은 체중 증가량을 보였다. 실험종료 시점에 알룰로스가 함유된 식이 공급에 따른 체중변화를 관찰한 결과, 대조군에 비하여 알룰로스가 함유된 식이를 공급한 군이 유의적으로 가장 낮은 체중 증가량을 보였다(표 4, 도 4). 표 4는 실험동물의 최종 체중을 나타낸다.
Figure 112016108784830-pat00003
a, b, c, 그룹간 통계적으로 유의한 함(P<0.05)
1-4: 지방조직 무게 측정
알룰로스의 지방축적 억제 효능 확인을 위한 동물실험 해부하여 얻어진 지방조직의 무게를 측정하였다. 알룰로스의 지방축적 억제 효능을 확인하기 위해 해부 후, 지방조직 무게를 비교하였다.
해부결과 알룰로스가 함유된 실험식이군에서 부고환 지방 조직, 신장후복막하 지방조직, 전체 지방조직의 양이 다른 식이군에 비해 통계적으로 유의하게 감소되었다(표 5, 도 5a 내지 도 5d). 장간막 지방조직 또한 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 감소되었다. 표 5의 단위는 g이며, n=12/group에 대한 것이다.
Figure 112016108784830-pat00004
a, b, c, 그룹간 통계적으로 유의한 함(P<0.05)
1-5: 실험동물의 지방조직 H&E 염색
알룰로스의 지방구 크기 감소 효능을 확인하기 위해, 실시예 1-4에서 얻어진 해부 후 채취된 부고환 지방조직(Epididymal fat)을 조직학적 분석을 위해서, 10% 포르말린 완충액을 이용하여 지방조직을 고정하고, 에탄올로 탈수하고, 파라핀 왁스에 포매하고, H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 통해 관찰하였다.
염색 결과 대조군에 비하여 알룰로스 함유 실험 식이군의 지방 세포구 크기가 유의적으로 감소되었다(도 6 및 도 7).
실시예 2: 유전자 발현 분석
2-1: 지방 조직 내 지방 분해와 관련된 유전자 발현 측정
실시예 1-4에서 고과당 식이를 섭취한 정상 동물모델에서 얻어진 지방조직을 사용하여, 지방조직에서 지방 조직의 분해에 관여하는 유전자 마커를 규명하고자 하였다.
구체적으로, 지방 조직으로부터 분리한 템플릿 RNA를 cDNA 합성 키트 (필코리아테크놀로지㈜, 서울)을 사용하여 역전사 시켰다. Quantimix SYBR 키트(필코리아테크놀로지㈜, 서울)를 사용하여 7500 Fast Real Time PCR system(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 상에서 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)을 수행하였으며, 각각의 유전자 발현 데이터는 CT (comparative threshold) 방법을 사용하여 분석하였다.
지방 조직에서의 PPARα, ACADM, CPT1, HSL, adipose triglyceride lipase(ATGL)의 mRNA 발현에 대한 실험 결과는 도 8a 내지 도 8e에 제시하였다.
지방조직에서 지방 조직의 분해에 관여하는 PPARα, ACADM, CPT1, HSL를 분석한 결과, PPARα, ATGL, HSL의 경우 대조군에 비해 알룰로스 함유 실험 식이군에서 농도가 통계적으로 유의하게 증가하였다(P<0.05). PPARα및 AGTL의 경우 대조군 뿐만 아니라 과당 식이군에 비해서도 알룰로스 함유 실험 식이군에서 농도가 통계적으로 유의하게 증가하였다. CPT1, ACADM의 경우 유의하지는 않았으나 알룰로스 함유 실험식이군에서 증가하는 경향을 보였다.
2-2: 간 조직 내 지방 분해와 관련된 유전자 발현 측정
실시예 2-1과 실질적으로 동일한 방법으로 지방조직에서 텝플릿 RNA를 분리하여 실험을 수행하였으며, 간 조직에서의 PPARα, CPT1, ACADM의 mRNA 발현에 대한 결과는 도 9a 내지 도 9c에 제시하였다.
간 조직에서 지방 조직의 분해에 관여하는 PPARα, CPT1, ACADM 을 분석한 결과, 통계적인 유의차는 나타내지 않았으나 알룰로스 함유 실험식이군에서 증가하는 경향을 보였다.
이러한 결과를 종합하여 보았을 때, 정상 체중 실험동물에서 15%의 과당과 15%의 순수 분말 알룰로스를 공급하면 대조군 혹은 30%의 고과당식이를 공급한 군 대비 포도당 섭취 후 혈당 상승 정도가 완화되었고 체중, 체지방 부피, 지방구의 크기 감소도 유도되었다. 특히 지방 분해에 관여하는 유전자 발현 증가가 두드러지게 관찰되었다.
실시예 3: 유전적 비만 유도 동물을 이용한 분석
3-1: 실험동물 실험 디자인
6주령 수컷 마우스로서 유전적으로 비만이 유도된 마우스인 C57BL/6J-ob/ob 마우스를 Central Laboratory Animal Inc. (한국, 서울)에서 구입하여 12시간 명/암 사이클 조건에서 유지하였다. 사육환경에 적응시키기 위해 7일 동안 예비 사육한 후 실험 시작 시점에 난괴법으로 각각 15마리씩 2개의 그룹으로 나누어, AIN-93G 식이(대조군)과 5% D-알룰로스 식이(이하 D-알룰로스라 함)을 각각 공급하여 12주간 사육하였다. 식이에 사용된 D-알룰로스는 삼양사에서 제공된 순도 99.83 중량%의 분말을 사용하였다. 식이는 AIN-93G 식이에 따라 제조하였으며, 미네랄과 비타민 혼합물로 AIN-93G 식이에 따라 제조하였다. 구체적 식이는 하기 표 6에 나타냈다. 사육 기간 동안 1주일에 2회씩 동물의 체중 및 음식 섭취에 대해서 기록하였다.
성분 대조구 실험구(D-알룰로스 식이)
Cornstarch 397.5 445
Dextrin 132 132
Sucrose 100 50
D-psicose - 50
Fiber 50 2.5
Casein 200 200
L-Cysteine 3 3
Corn oil 70 70
Mineral Mix 35 35
Vitamin Mix 10 10
Choline bitartrate 2.5 2.5
t-butylhydroquione 0.014 0.014
Total(g) 1000 1000
Carbonhydrate, % energy 64.9 64.9
Protein, % energy 18.8 18.8
Fat, % energy 16.4 16.4
Total energy, Kcal/Kg 3896 3896
3-2: 실험동물의 체중 및 혈청 지질 분석
동물 해부 시에, 혈액과 지방조직을 채취하고, 전혈을 650g에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 -80 ℃도에 보관하고, 지방조직 (장간막 지방조직, 신장주위 지방조직, 정소상체 지방조직)을 즉시 절단 및 세척하고 무게를 측정하여 드라이아이스를 이용하여 냉동하고 -80 ℃ 온도에 보관하였다.
혈청 지질 프로파일 분석을 위해서, 트리글리세라이드, 비에스테르화 지방산 및 전체 콜레스테롤(TC)의 혈청 농도를, 상업적 분석 키트(Wako pure chemical industries Ltd, Osaka, japan)을 이용하여 제조자 매뉴얼에 따라 분석하였다. 혈청 고밀도 콜레스테롤/저밀도 콜레스테롤 비율(HDL/LDL)을 colorimetric/fluorometric assay(BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 하기 표 7은 대조군 식이와 5% 알룰로스 식이를 이용하여 12 주간 사육한 C57BL/6J-ob/ob 마우스의 음식 섭취량, 체중, 혈청 지질 수준 및 흰색 지방조직의 분석 결과를 나타낸다.
구분 대조군 D-알룰로스 섭취 실험군 P-value
식이 섭취량 (g/day) - 4.74±0.39 4.17±0.40 0.336
체중(g) 초기 체중 39.67±1.40 38.06±1.26 0.420
최종 체종 55.77±1.48 50.99±1.01* 0.019
혈청 지질수준 트리글리세라이드(mg/dL) 108.13±3.65 111.78±5.84 0.603
비에스테르화 지방산(mEq/L) 1.03±0.10 0.90±0.10 0.384
전체 콜레스테롤(mg/dL) 376.93±29.46 293.41±22.18* 0.039
HDL/LDL-콜레스테롤 0.56±0.09 0.73±0.06* 0.042
흰색 지방조직무게(체중대비 중량%) 장간막 지방조직 3.06±0.10 2.60±0.11* 0.008
신장주위 지방조직 7.01±0.25 6.16±0.20* 0.021
정소상체 지방조직 5.25±0.18 5.15±0.18 0.742
합계 15.31±0.33 13.91±0.28* 0.006
상기 표 7에 나타낸 데이타는, 대조군 그룹 8마리와 D-알룰로스 식이 13마리에 관한 평균±SEM으로 나타냈으며,(*)는 P<0.05로서 대조군 식이와 비교하여 통계적으로 유의한 결과이다.
3-3: 실험동물의 지방조직 분석
동물 해부 시에 지방조직을 채취하고, 지방조직 (장간막 지방조직, 신장주위 지방조직, 정소상체 지방조직)을 즉시 절단 및 세척하고 무게를 측정하여 드라이아이스를 이용하여 냉동하고 -80 ℃에 보관하였다. 지방조직 무게는 상기 표 7에 나타냈다.
표 7에 나타낸 바와 같이, D-알룰로스 식이는 유전적 비만 동물에서 장간막 지방조직, 신장주위 지방조직, 정소상체 지방조직을 포함하는 흰색 지방조직의 무게를 대조군에 비해 감소시키고(p=0.006), 구체적으로 장간막 지방조직(p=0.008) 및 신장주위 지방조직(p=0.021)의 무게를 더욱 감소시켰으며, 정소상체 지방조직은 대조군과 비교하여 유의적인 차이가 없었다. D-알룰로스 식이를 섭취한 유전적 비만 동물에서 지방 조직의 감소뿐만 아니라, 대조군에 비하여 지방세포의 크기도 유의하게 감소하였다(도 10b 참조)
조직학적 조직 분석을 위해서, 10% 포르말린 완충액을 이용하여 지방조직을 고정하고, 에탄올로 탈수하고, 파라핀 왁스에 포매하고, H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 통해 관찰하였다(도 10a 참조). 도 10a 내지 도 10b는 400배 배율로 염색된 지방조직을 나타낸 것으로서, 각 바 스케일은 평균±SEM(n=4 per dietary group)으로 표시한 것으로서 p=0.001로 대조군에 비해 실험군에서 통계적으로 유의하게 나타난 결과이다.
실시예 4: 지방조직의 유전자 발현 분석
4-1: 비만 마우스의 지방조직의 유전자 발현에 미치는 알룰로스의 영향(네트워크 분석)
비만 마우스에서 혈청 지질 프로파일 변화, 지방조직 무게 감소 및 지방세포 크기 감소에 대해 더욱 자세한 유전적 분석을 위해서, 마이크로어레이 분석 도구인 Illumina MouseRef-8 플랫폼을 이용하여 D-알룰로스 식이 C57BL/6J-ob/ob 마우스의 지방조직에서 유전체 분석 및 네트워크 분석을 실시하였다.
구체적으로, 실시예 3에 따라 유전적으로 비만이 유도된 동물인 C57BL/6J-ob/ob mice에 대한 마이크로어레이를 이용한 유전체 분석을 위해서 지방 조직 샘플에서 얻어진 cRNA를 정제하고 비오틴을 부착시켜 Illumina MouseRef-8 v2 Expression BeadChip (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)와 결합시키고, 세척 및 염색한 후, 각 Beadchip을 Illumina BeadArray Reader를 사용하여 스캔하였다. 각각의 발현 유전자에 대한 데이터 분석과 구상화는 R 버전 2.15.3 (www.r-project.org)를 사용하여 실시하였다. 초기 데이터는 GenomeStudio (상표명) 버전 2011.1 (Illumina, Gene Expression Module version 1.9.0)을 사용하여 추출하였으며, 프로브 신호 값은 대수로 전환하고 변위치 방법으로 표준화하였다. 실험동물에 있어 식이군 간의 비교를 위해, false discovery rate(FDR) Benjamini-Hochberg 다중 테스트 보정(P<0.05)을 사용하여 독립적인 t-test를 실시하였다.
네트워크 분석은 QIAGEN사의 Ingenuity Pathway Analysis (IPA(상표명) QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity)를 사용하여 수행되었으며, 이를 통해 알룰로스 식이에 반응한 각각의 발현 유전자 사이의 조절 관계를 규명하였다. Fold change(FC)>1.5 또는 <-1.5 cut-off 값과 P<0.05인 유전자를 Ingenuity (상표명) Knowledge Base와 비교하였다. 특정 네트워크에 지정된 각 생물학적 기능 및/또는 질환에 대한 통계적 유의성을 검정하기 위한 P 값을 계산하는데 Fisher’s exact test를 사용하였다.
그 결과, D-알룰로스 식이에 따른 64개의 down-regulated genes과 39개의 up-regulated gene을 포함한 총103개의 발현 변화된 유전자를 확인하였다. 상기 103개 발현 변화된 유전자에 대해서 추가적으로 네트워크 분석을 수행하여, D-알룰로스와 관련된 유의한 네트워크와 기능을 확인하고자 하였다. 점수가 높은 5개의 상위 네트워크와 기능을 하기 표 8에 나타냈다.
그 결과, 대조군에 비해 5% 알룰로스 실험 식이군에서 총 103개의 유전자 발현이 유의적으로 변화되었고, 이들 유전자 중 특히 염증 반응, 분자적 물질 수송 및 지질 대사에 관여하는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112016108784830-pat00005
a)Score: 랜덤 확률 즉 우연에 의해 한 네트워크 내 focus genes이 모두 발견될 가능성
b)Focus genes: 분석에 사용된 유전자들 중 해당 유전자의 정보가　Ingenuity Knowledge Base에　존재하는 유전자들
*: 별표로 표시된 유전자는 마이크로어레이 분석 내 여러 개의 probe에서　유의적으로 변화함
4-2: 네트워크 분석결과 상위 유전자에 대한 mRNA 발현 분석
실시예 4-1의 네트워크 분석결과 상위 5개 그룹에서 확인된 유전자에 대해서 mRNA 분석을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 3에 따른 실험동물의 지방조직에서 분리한 주형 RNA를 cDNA 합성 키트(PhileKorea Tehcnology, Seoul, Republic of Korea)를 사용하여 역전사하였다. AuantiMix SBYR Kit (PhileKorea Technolgy, Seoul, Republic of Korea)로 7500 Fast Real Time PCR system(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 리얼타임 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)을 수행하였다. 선택된 유전자의 증폭을 위한 프라이머 서열은 하기 표 9에 나타나 있다. 상대적인 유전자 발현 데이터는 comparative threshold (Ct) method (Livak, L.J., et al., Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-(Delta Delta C(T)) method. Methods 2001, 25, 402-408)을 이용하여 분석하였다. 실험 결과를 도 11a 내지 도 11e와 상기 분석대상 유전자 중에서 4개 유전자에 대한 결과를 도 12에 나타냈다.
Figure 112016108784830-pat00006
선택된 유전자의 증폭을 위한 프라이머 서열은 상기 표 9에 나타나 있다.
D-알룰로스는 염증 및 지방합성/지질합성과 연관이 있는 유전자의 발현을 억제하고, 베타-산화 관련 유전자 발현을 증가시킴으로써 C57BL/6J-ob/ob 마우스에서 지방축적을 억제시킨다.
상기 표 8의 상위 네트워크 중에서 네트워크 1은 D-알룰로스 식이에서 주로 down-regulated 유전자인 ADAM12, ADGRE1, CD36, CD44, FOS, IL7R 및 TLR8을 포함하는 가장 중요한 네트워크로서 이들 유전자들은 비만 관련 염증과 관련된다. 특히, 네트워크 1에 포함되는 FOS (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog)는 지방 세포 분화에 있어 중요한 전사 요소로, FOS 발현이 감소하면 지방 세포의 발달이 저해된다. 네트워크 1에 속하는 상기 유전자 발현의 다운-조절은 본 발명에서 알룰로스 식이를 섭취한 비만 동물에서 최종 체중, 지방조직 무게 및 지방세포의 크기 감소에 관련된다(도 11a 및 도 12 참조).
MMP3 및 ABCD2 (네트워크 2) 유전자는 분자 수송, 세포 발달, 세포 성장 및 증식과 관련이 있는데, 이중 ABCD2 유전자에 의해 암호화된 ABCD2(ATP-binding cassette, sub-family D, member2)는 장쇄 지방 아실-CoA를 베타-산화시키기 위해 퍼옥시좀으로 수송 시, 상기 수송을 촉진시키는 퍼옥시좀 ABC 수송체로서, 마우스의 지방 조직에서 많이 발견된다. 최근 연구에서 ABCD2가 마우스 지방 조직의 미토콘드리아 및 소포체와 연관된 퍼옥51시좀 아강에 위치하는 것이 밝혀졌다. ABCD2 녹아웃 마우스에 에루크산(22:1ω9)을 섭취시키는 경우, 지방 조직이 빨리 확대되고, 지방 세포 크기가 커지며, 인슐린 내성이 증대되는 것이 관찰되었다. 그러므로, D-알룰로스 식이에 반응한 ABCD2의 up-regulation은 beta-산화와 연관이 있음을 알 수 있다. 상기 MMP3의 mRNA 발현 분석 결과는 도 11b 및 도 12에 나타냈다.
MMP(matrix metallopeptidase)는 비만에 있어 지방 조직 리모델링과 염증 반응에 작용한다. MMP 저해제는 in vitro에서 지방 생성을 감소시키는데, 이는 MMP가 지방 세포 분화에 영향을 미침을 보여준다. 또한, 앞서 제시된 FOS는 MMP3의 전사를 유도하여, 세포간 콜라겐분해효소인 MMP1을 활성화시키는 것이 알려져 있다.
네트워크 5에 포함되는 FGF21 (fibroblast growth factor 21)은 글루코스와 지질대사를 조절하는 호르몬으로 작용하는데, FGF21 녹아웃 마우스에 있어 지방 조직의 PPAR-gamma 활성이나 PPAR-gamma 의존한 유전자 발현이 감소되어 지방 조직의 부피나 지방 세포의 크기가 감소되는 결과가 관찰된다. 유전자 전사적 분석에 의해 밝혀진 바에 따르면, FOS, MMP3, 및 FGF21의 down-regulation과 ABCD2의 up-regulation은 지방생성/리피드 생성에 관여하는 유전자의 발현에 영향을 미쳐, D-알룰로스의 지방축적 억제 작용을 일으킨다.
유전체 분석을 종합한 결과, Fos , Mmp3 , Fgf21 과 Abcd2가 알룰로스로 유도된 면역 및 지질 대사의 주된 타겟 유전자일 것으로 제시되었다(표 8).
4-3: 관련 유전자의 mRNA 발현 변화 분석 (RT- qPCR )
실시예 4-1의 실험결과에 따른 염증과 지질 대사에 관련된 유전자들의 mRNA 발현을 결정하고자, 실시예 3의 지방조직에서 분리한 주형 RNA를 cDNA 합성 키트(PhileKorea Tehcnology, Seoul, Republic of Korea)를 사용하여 역전사하였다. AuantiMix SBYR Kit (PhileKorea Technolgy, Seoul, Republic of Korea)로 7500 Fast Real Time PCR system(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 리얼타임 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)을 수행하였다. 선택된 유전자의 증폭을 위한 프라이머 서열은 상기 표 9에 나타나 있다. 상대적인 유전자 발현 데이터는 comparative threshold (Ct) method (Livak, L.J., et al., Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-(Delta Delta C(T)) method. Methods 2001, 25, 402-408))을 이용하여 분석하였다.
도 13a에서 나타낸 바와 같이, 비만과 관련된 염증 반응의 대표적인 사이토카이인 TNF-alpha와 IL-6의 지방조직 발현은, 대조군에 비해 알룰로스 식이를 섭취한 비만 동물에서 감소하였다. 또한, 알룰로스 식이는 비만 동물에서 MCP-1의 발현도 감소시켰으며, MCP-1은 대식세포가 지방조직으로 침투에 관련된 주요한 케모카인으로 알려져 있다. 도 13a에서 나타낸 바와 같이, 알룰로스 식이를 섭취한 비만 동물에서 TNF-alpha, IL-6 또는 MCP-1은 각각 p 수치가 0.007, 0.032 및 0.019로 나타났으며, 이러한 결과는 실시에 4-1의 네트워크 분석에서 down-regulated 염증 반응에 관련된 결과와 일치하였다.
도 13b의 mRNA 발현 분석결과에 나타낸 바와 같이, PPRA-alpha (peroxisome proliferator-activated receptor-alpha), PPPRA-gamma, CCAAT/enhancer-binding protein-alpha(C/EBP-alpha), sterol regulatory element-binding protein-1c(SREBP-1c) adipocyte protein 2(aP2)및 lipoprotein lipase (LPL)은 모두 지방합성(지방세포 분화)와 관련되는 유전자로서, 알룰로스 식이를 섭취한 비만 동물에서 유의적으로 감소하였으며, 유전자 PPRA-alpha, PPPRA-gamma, C/EBP-alpha, SREBP-1c, LPL 의 각각에 대한 p값은 p=0.019(PPRA-alpha), p=0.035(PPPRA-gamma), p=0.029(C/EBP-alpha), p=0.033(SREBP-1c), p= 0.029(aP2) 및 p=0.004 (LPL)이었다.
도 13c의 mRNA 발현 분석결과에 나타낸 바와 같이, 지질 합성과 관련된 지방산 합성효소(fatty acid synthase,FAS)는 SREBP-1c에 의해서 조절되는 유전자로서, 알룰로스 식이를 섭취한 비만 동물에서 유의적으로 감소하였다(p=0.031).
도 13d의 mRNA 발현 분석결과에 나타낸 바와 같이, hormone-sensitive lipase (HSL) 및 carnitine palmitoyltransferase-1 (CPT-1)은 지질분해 및 베타-산화(beta-oxidation)에 각각 관련된 유전자로서, 알룰로스 식이를 섭취한 비만 동물에서 유의적으로 증가하였으며, 유전자 각각에 대한 p 값은, HSL에 대한 p=0.027, CPT-1에 대한 p=0.030이었다. 이러한 실험결과는 알룰로스 식이가 지방합성 및 지질 합성은 감소시키고 반면에 베타-산화(beta-oxidation)를 증가시키는 대사와 관련성을 나타낸다.
따라서, 알룰로스 식이를 섭취한 비만 동물의 지방조직에서, PRAR-alpha, PRAR-gamma, C/EBP-alpha, SREBBP-1c, aP2, LPL 및 FAS를 포함하는 지방 합성 관련 유전자(adipogenesis-related genes)의 발현이 감소하고, HSL 및 CPT-1을 포함하는 베타-산화 관련 유전자의 발현은 증가하였다. 또한, FOS, MMP3 및 FGF21의 down-regulation과 ABCD2의 up-regulation은 지방합성/지질합성 및 베타-산화에 관련된 유전자의 발현에 영향을 미치는 transcriptomic analysis에 의해서 확인되었다. 상기 유전자들은 알룰로스의 항비만 활성과 관련이 있는 것으로 확인되었으며 이들 유전자의 발현 수준을 정리한 모식도를 도 14에 나타냈다.
<110> SAMYANG CORPORATION <120> Marker gene related with anti-adipogenic activity of allulose and use thereof <130> DPP20164475KR <160> 54 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ABCD2 <400> 1 acaggaaggc aaaagcagaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ABCD2 <400> 2 gaggcttctt ttccacgatg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ACC <400> 3 gcctcttcct gacaaacgag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ACC <400> 4 tgactgccga aacatctctg 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ADAM12 <400> 5 cacacggatc attgttacta cca 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ADAM12 <400> 6 attggctcta agctgtacgt tt 22 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for aP2 <400> 7 catggccaag cccaacat 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for aP2 <400> 8 cgcccagttt gaaggaaatc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CD36 <400> 9 ggaactgtgg gctcattgc 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CD36 <400> 10 catgagaatg cctccaaaca c 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CD44 <400> 11 ctcctggcac tggctctga 19 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CD44 <400> 12 ctgcccacac cttctcctac tatt 24 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CD68 <400> 13 cttcccacag gcagcacag 19 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CD68 <400> 14 aatgatgaga ggcagcaaga gg 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for C/EBP-alpha <400> 15 gacatcagcg cctacatcga 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for C/EBP-alpha <400> 16 tcggctgtgc tggaagag 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CPT1 <400> 17 aacatcccca cgctaaacag 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CPT1 <400> 18 ctgacaaggt ggcgtgaag 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for EMR1 <400> 19 ctttggctat gggcttccag tc 22 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for EMR1 <400> 20 gcaaggagga cagagtttat cgtg 24 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for FAS <400> 21 gggggtggga ggacagagat 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for FAS <400> 22 cacatgggct gacagcttgg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for FFAR4 <400> 23 accaagtcaa tcgcacccac 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for FFAR4 <400> 24 gtgagacgac aaagatgagc c 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for FGF21 <400> 25 agatcaggga ggatggaaca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for FGF21 <400> 26 tcaaagtgag gcgatccata 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for FOS <400> 27 ccttcggatt ctccgtttct ct 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for FOS <400> 28 tggtgaagac cgtgtcagga 20 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HSL <400> 29 ggctcacagt taccatctca cc 22 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HSL <400> 30 gagtaccttg ctgtcctgtc c 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL6 <400> 31 tccagttgcc ttcttgggac 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL6 <400> 32 gtactccaga agaccagagg 20 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL7R <400> 33 ctgacctgaa agtcgtttat cgc 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL7R <400> 34 catcctcctt gattcttggg ttc 23 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for LPL <400> 35 ctgctggcgt agcaggaagt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for LPL <400> 36 gctggaaagt gcctccattg 20 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MCP-1 <400> 37 actgaagcca gctctctctt cctc 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MCP-1 <400> 38 ttccttcttg gggtcagcac agac 24 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MMP1 <400> 39 cacaacaatc ctcgttggac 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MMP1 <400> 40 tggtgtcaca tcactccaga 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MMP3 <400> 41 tgtcccgttt ccatctctct c 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MMP3 <400> 42 tggtgatgtc tcaggttcca g 21 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PPAR-alpha <400> 43 cagtggggag agaggacaga 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PPAR-alpha <400> 44 agttcgggaa caagacgttg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PPAR-gamma <400> 45 gatggaagac cactcgcatt 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PPAR-gamma <400> 46 aaccattggg tcagctcttg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SREBP-1C <400> 47 ggagccatgg attgcacatt 20 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for SREBP-1C <400> 48 agacatgctc cagctcatca accaa 25 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TLR8 <400> 49 ggcacaactc ccttgtgatt 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TLR8 <400> 50 catttgggtg ctgttgtttg 20 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TNF-alpha <400> 51 catcttctca aaattcgagt gacaa 25 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TNF-alpha <400> 52 tgggagtaga caaggtacaa ccc 23 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta-actin <400> 53 ctcctaccac acccattctc atcc 24 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for beta-actin <400> 54 gcaatgcctg ggtacatggt gg 22

Claims (20)

  1. 대상의 시료로부터 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 마커 유전자는 ABCD2인, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측 또는 검정에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 마커 유전자는, FOS, MMP3 및 FGF21로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 마커 유전자를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 알룰로스 식이를 투여한 대상인 알룰로스 식이군의 시료에서 상기 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고,
    알룰로스를 포함하지 않는 식이를 투여한 대조군의 시료에서 상기 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고,
    상기 대조군에서 마커 유전자의 발현 수준을 비교하여, 알룰로스 식이군의 유전자 발현 수준이 증가 또는 감소한 경우, 알룰로스의 항비만 반응성을 갖는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현 수준이 mRNA, DNA, 또는 단백질에 의해서 측정되는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 mRNA가 역전사효소 중합효소연쇄반응, 핵산 하이브리드화, 전기영동, 노던 블럿팅 또는 질량분광법에 의해서 측정,
    상기 DNA가 정량적 폴리머라제 연쇄반응, 게놈 DNA-칩, 전기영동, 서던블랏팅 또는 질량 분광법에 의해 측정, 또는
    상기 단백질이 면역학적 검정법, 웨스턴 블랏, ELISA 또는 질량분광법에 의해 측정되는 것인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현 수준 측정은, 상기 시료에서 RNA를 수득하고, 상기 RNA를 역전사하여 cDNA를 수득하고, 상기 cDNA에 검출가능한 표지를 부착하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 측정하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 효소, 방사성 동위원소, 형광물질, 화학발광성 분자, 방사선 물질, 리포좀 또는 햅텐 분자인 방법.
  8. 삭제
  9. 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하며, 상기 마커 유전자는 ABCD2인, 알룰로스의 항비만 반응성의 예측 또는 검정용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 마커 유전자는 FOS, MMP3 및 FGF21로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 마커 유전자를 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 항비만 반응성은 체중 감소, 체지방 감소, 체지 지방구의 크기 감소, 또는 지방 조직에서 지방합성 감소인 조성물.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 마커 유전자는 알룰로스로 유도된 면역 및 지질 대사 관련된 것인 조성물.
  13. 삭제
  14. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는, 상기 마커 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
  15. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 마커 유전자에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 검출은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 칩으로 구성된 군에서 선택되는 KDM4D mRNA 측정 수단에 의하여 수행되는 것인 조성물.
  17. 삭제
  18. 제15항에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 검출은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩으로 구성된 군에서 선택되는 KDM4D 단백질 측정 수단에 의하여 수행되는 것인 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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The FASEB Journal. 01 April 2016, 30(S1).*

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KR20180050991A (ko) 2018-05-16

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