KR20110004525A

KR20110004525A - 제니스테인과 ｔｒａｉｌ을 포함하는 간암 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110004525A
Application number: KR1020090061979A
Authority: KR
Inventors: 최영현; 김성윤; 박철; 김병우; 김기영; 김원재
Original assignee: 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2011-01-14

Abstract

본 발명은 제니스테인(genistein)과 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)을 포함하는 간암 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 제니스테인과 TRAIL를 병용 투여함으로써 TRAIL에 내성을 보이는 간암세포의 아폽토시스를 유도하여 효과적으로 간암을 치료할 수 있다.

제니스테인, TRAIL, 간암

Description

제니스테인과 ＴＲＡＩＬ을 포함하는 간암 치료용 조성물{Composition for treatment of liver cancer comprising genistein and TRAIL}

본 발명은 제니스테인과 TRAIL을 포함하는 간암 치료용 조성물에 관한 것이다.

간세포 암종(carcinoma)은 간암의 가장 일반적인 형태이고 전세계적으로 암으로 인한 사망 원인의 4번째에 해당한다. 외과적 절제술이 최적의 치료 전략으로 간주되어 왔으나, 단지 일부 환자에 제한된다; 수술 후 재발율이 높다. 재발을 방지하기 위한 전략으로 수술 전 화학색전술(chemoembolization) 및 수술 후 신보강(neoadjuvant) 요법이 있으나, 어떤 요법도 이롭지 않은 것으로 확인되었다. 따라서, 이러한 악성(malignancy)을 효과적으로 치료하기 위한 새로운 치료 옵션이 필요하다.

TNF(tumor necrosis factor) 패밀리의 일원인 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)은 다양한 유형의 종양 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력으로 인하여 유망한 항암제로 간주되고 있다. TRAIL에 대한 세포의 감수성은 세포 멤브레인 TRAIL 수용체 및 카스파제-8의 발현에 의존한다. 카스파제-8은 TRAIL에 반응하여 활성화되고 사이토플라즘으로 방출되어, 카스파제-3 및 카스파제-7과 같은 효과기(effector) 카스파제들을 활성화시키는 프로테아제 캐스케이드(cascade)를 개시한다. 최근, 간암 암종 Hep3B를 포함한 많은 종양 세포가 TRAIL의 아폽토시스 작용에 대해 내성을 획득한 것으로 보고되었다. 전(pro)-아폽토시스 단백질인 Bax의 돌연변이와 XIAP 및 cIAP와 같은 IAP(inhibitor of apoptosis) 패밀리 일원의 발현 증가가 TRAIL 매개 아폽토시스에 대한 내성을 증가시킨다. 그러나, Hep3B 세포에 TRAIL과, 브로콜리 및 칼리플라워를 포함한 많은 십자화과 야채에서 발견되는 이소티오시아네이트인 설포라판(sulforaphane)의 조합 처리는 TRAIL 유도 아폽토시스를 촉진하는 것으로 보고되었다. 이러한 결과는 항암제가 TRAIL과 조합으로 이용되어 TRAIL 유도 아폽토시스에 내성을 갖는 세포를 민감화시킬 수 있다는 것을 제안한다.

이에, 본 발명자는 TRAIL과 조합으로 이용되어 TRAIL에 내성을 보이는 간암을 치료할 수 있는 물질을 탐색하던 중 간암세포에 TRAIL과 제니스테인을 병용 처리하였을 때 TRAIL에 의한 아폽토시스가 촉진되어 효과적으로 간암이 치료됨을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 한 목적은 제니스테인과 TRAIL을 포함하는 간암 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)에 내성을 보이는 간암 세포에서, 제니스테인(genistein)이 TRAIL에 의한 아폽토시스를 촉진하는 것을 규명한 것에 기초한다. 이하, 그 치료 기전을 구체적으로 설명한다.

간 암종(hepatocellular carcinoma) 세포에 제니스테인 또는 TRAIL 또는 이의 조합을 처리한 후 상기 세포의 생존율을 조사하였다. 그 결과, 제니스테인 또는 TRAIL 단독 처리는 세포 생존율에 거의 영향을 미치지 않은 반면, 이들의 조합은 세포 생존율을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 간 암종 세포에 제니스테인 또는 TRAIL 또는 이의 조합을 처리한 후 sub-G1 단계 세포의 양, 크로마틴 응축 및 아폽토시스 체 형성 정도를 확인함으로써 아폽토시스 정도를 조사하였다. 그 결과, 제니스테인 또는 TRAIL 단독 처리는 아폽토시스를 거의 유도하지 않은 반면, 이들의 조합은 아폽토시스를 유도하는 것을 확인하였다(실시예 2-1 및 도 1 참조).

간 암종 세포에 제니스테인 또는 TRAIL 또는 이의 조합을 처리한 후 아폽토시스 관련 유전자의 발현양을 조사하였다. 그 결과, 제니스테인과 TRAIL의 조합은 항(anti)-아폽토시스 XIAP 단백질의 발현을 현저하게 감소시키고, 전(pro)-아폽토시스 Bax 단백질은 상향 조절하는 한편, 항-아폽토시스 Bcl-2 단백질은 감소시켰 다. 또한, 간 암종 세포에 제니스테인 또는 TRAIL 또는 이의 조합을 처리한 후 MMP(mitochondrial membrane potential)의 소실 정도를 조사하였다. 그 결과, 제니스테인 또는 TRAIL 단독 처리는 MMP 소실을 약간 유도한 반면, 이들의 조합은 MMP의 소실을 현저하게 유도하였다(실시예 2-2 및 도 2 참조).

간 암종 세포에 제니스테인 또는 TRAIL 또는 이의 조합을 처리한 후 아폽토시스 매개 유전자인 카스파제의 발현양과 PARP의 절단 정도를 조사하였다. 그 결과, 제니스테인과 TRAIL의 조합은 전(pro)-카스파제의 양을 현저하게 감소시킨 반면, 카스파제의 양을 증가시키고, PARP의 절단을 현저하게 유도하였다. 상기 결과는 제니스테인과 TRAIL의 조합 처리가 적어도 부분적으로 카스파제 경로를 통해 아폽토시스를 유도한다는 것을 의미한다(실시예 2-3 및 도 3 참조). 이상의 결과는 카스파제 억제제가 제니스테인과 TRAIL에 의해 유도되는 아폽토시스를 억제함으로써 확증되었다(실시예 2-3 및 도 4 참조).

제니스테인에 의한 TRAIL 유도 아폽토시스의 촉진과 p38 MAPK의 관련성을 조사하였다. 간 암종 세포에 TRAIL과 p38 MAPK 억제제를 처리한 결과, sub G1 단계의 세포가 증가되었다. 이는 TRAIL 유도 아폽토시스가 p38 MAPK의 억제를 통해서 유도된다는 것을 의미한다. 또한, TRAIL과 p38 MAPK 억제제의 처리는 MMP의 소실을 현저하게 유도하였다(실시예 2-4 및 도 5 참조). 상기 결과는 p38 MAPK 과발현이 아폽토시스 및 MMP의 소실을 현저하게 억제함으로써 확증되었다. 더 나아가, 제니스테인은 p38-β 활성화(인산화)를 억제함으로써 TRAIL 유도 아폽토시스를 촉진한다는 것을 확인하였다(실시예 2-4 및 도 6 참조).

결론적으로, 제니스테인은 TRAIL 유도 아폽토시스에 대해 간 암종 세포를 Bax와 카스파제를 포함하는 아폽토시스 단백질의 상향 조절 또는 활성화를 통해 민감화시키고, 상기 단백질의 발현 및 활성화 증가는 p38-β 신호화 억제를 통해 매개된다. 따라서, 제니스테인과 TRAIL의 병용 투여는 간암 치료에 유용할 것이다.

본 발명은 제니스테인과 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 간암은 바람직하게는 간 암종(carcinoma)이다.

본 발명의 제니스테인과 TRAIL을 함유하는 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등 경구 투여용 제형, 멸균 주사용액, 좌제 및 경피 투여용 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제형화한다.

한 양태로서, 본 발명의 제니스테인과 TRAIL은 경구 투여용 고상 제제로 제형화할 수 있다. 경구 투여를 위한 고상 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되는데, 이러한 고상 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등 을 혼합하여 제형화된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 제니스테인과 TRAIL을 함유한 약제학적 조성물을 경구 투여용 액상 제제로 제형화할 수도 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 이러한 액상 제제에는 통상적으로 사용되는 불활성 희석제 (예를 들면, 정제수, 에탄올, 리퀴드 파라핀) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명의 제니스테인과 TRAIL을 함유한 약제학적 조성물은 비경구, 바람직하게는 복강내 투여를 위한 제제로 제형화될 수도 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 멸균된 수용액으로는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충용액을 이용할 수 있으며, 비수성용제로, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 이용될 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 이용할 수도 있다. 한편, 좌제의 경우에는 이의 통상적인 기제인 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 조성물은 유효량으로 비경구 또는 경구(경피, 피하, 정맥, 근육, 복강 등)를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상 기에서 "유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 보다 바람직하게는 10~1000㎍/체중kg/day의 유효량으로 투여될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1: 재료 및 방법>

1-1. 시약 및 항체

PI(propidium iodide), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), MTT[3-(4,5)-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 및 JC-1(5,5V, 6,6V-tetrachloro-1,1V,3,3V-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide)은 Sigma (St Louis, MO)로부터 입수하였다. 카스파제 활성 측정 키트는 R&D Systems(Minneapolis, MN)로부터 입수하였다. ECL(enhanced chemiluminescence) 키트는 Amersham(Arlington Heights, IL)로부터 구입하였다. 카스파제-3-억제제인 z-DEVD-fmk, 카스파제-8-억제제인 z-IETD-fmk, 카스파제-9 억제제인 z-LEHD-fmk 및 판(pan)-카스파제 억제제인 z-VAD-fmk는 Calbiochem(San Diego, CA)로부터 입수하였다. RPMI 1640 배지 및 FBS(fetal bovine serum)은 각각 Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) 및 GIBCO-BRL(Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다. 달리 언급하지 않은 모든 화합물은 Sigma로부터 구입하였다. cIAP-1, cIAP-2, XIAP, survivin, Bcl-xL, Bcl-2, Bax, Bid, 시토크롬 c, PARP(poly(ADP-ribose) polymerase), p38-α, p38-β 및 카스파제-3, -8 및 -9는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. p38 MAPK 및 phospho(p)-p38 MAPK에 대한 항체는 PharMingen (San Diego, CA)으로부터 구입하였다. β-액틴에 대한 항체는 Sigma로부터 구입하였다. 퍼옥시다제로 표지된 동키(donkey) 항-레비트 및 시프(sheep) 항-마우스 면역글로불린은 Amersham으로부터 구입하였다.

1-2. 세포 배양 및 형질감염

사람 간세포 암종(carcinoma) HepG2 및 Hep3B 및 사람 폐 샘암 종(adenocarcinoma) A549 세포는 ATCC(American type Culture Collection, Rockville, MD)로부터 입수하였다. 상기 세포를 37℃, 5% CO₂ 습한 배양기에서 배양하고 10%로 열로 불활성화시킨 FBS를 포함한 RPMI 1640 배양 배지에서 유지하였다. Hep3B 세포를 발현 벡터 pCMV5-flag-p38 MAPK 또는 대조군 벡터로 Lipofectamine PLUS 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조업자의 설명문에 따라 형질감염시켰다.

1-3. 세포 생존 및 성장

세포가 70% 콘플루언스까지 성장하였을 때 지정된 농도의 genistein, TRAIL 또는 이의 조합(genistein+TRAIL)으로 처리하였다. 대조군 세포는 다양한 시간 동안 0.1% DMSO(dimethyl sulfoxide, 비히클 대조군)를 포함하는 완전한 배지로 보충하였다. 처리 후 세포 수와 생존율을 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion) 및 MTT 방법으로 측정하였다.

1-4. 핵 염색

세포를 지정된 시간 동안 genistein, TRAIL 또는 이의 조합(genistein+TRAIL)으로 처리한 후 세포를 회수하고, PBS로 세척하고, 실온에서 10분 동안 PBS에 녹인 3.7% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 세척하고, 2.5㎍/ml DAPI 용액으로 실온에서 10분 동안 염색하였다. 상기 세포를 PBS로 2회 세척하고 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 분석하였다.

1-5. 세포 주기 분석

세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 원심분리하였다. 이렇게 형성된 펠렛을 4℃에서 1시간 동안 75%(v/v) 에탄올로 고정하였다. 세포를 PBS로 한 차례 세척하고 암 조건에서 30분 동안 PBS(pH7.4)에 녹인 RNase A(0.1mg/ml)를 포함하는 차가운 PI 용액(50㎍/ml)에 재현탁하였다. 유세포 분석은 FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 수행하였다. 포워드 라이트-스캐터 특징을 이용하여 분석으로부터 세포 데브리스를 배제하였다.

1-6. MMP(mitochondrial membrane potential) 소실의 측정

JC-1의 잔류가 MMP의 소실에 대한 측정치로서 이용되었다. 세포를 약물로 처리하고 다양한 시간 동안 정치배양하였다. JC-1(40nM)을 처리 마지막 30분 동안 추가하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 결합되지 않은 염료를 제거하였다. 잔류한 JC-1 염료의 농도가 유세포 분석에 의해 결정되었다.

1-7. 면역침전, 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯 분석

세포를 회수하여 용균한 후 단백질 농도를 Bio Rad protein assay(BioRad Lab., Hercules, CA)를 이용하여 제조업자의 설명에 따라 정량하였다. 면역침전에 있어서, 세포 추출물을 추출 완충용액(extraction buffer)에서 면역침전 항체로 4 ℃에서 1시간 동안 정치배양하였다. 면역-복합체를 단백질 G/A-세파로스 비즈(Sigma-Aldrich) 상에서 수집하였다. 웨스턴 블롯 분석은 공지된 바에 따라 수행하였다. 면역침전 또는 동량의 총 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하고 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)(Schleicher & Schuell, Keene, NH)으로 트랜스퍼하고 지정된 일차 항체와 ECL 검출 시스템을 이용하여 면역블롯 분석을 실시하였다.

1-8. 카스파제 활성의 측정

약물에 의해 유도된 카스파제의 효소 활성은 colorimetric 측정 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 세포를 지정된 시간 동안 약물의 존재 또는 부재 조건에서 정치배양하였다. 세포를 회수하여 얼음 수조 상에서 30분 동안 용균 완충용액에서 용균하였다. 용균된 세포를 14,000rpm으로 20분 동안 원심분리하고 동량의 단백질(50㎕ 당 100㎍)을 암 조건에서 2시간 동안 37℃에서 50㎕의 반응 완충용액 및 colorimetric 테트라펩타이드인 카스파제-3의 경우 Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-pNA(p-nitroaniline), 카스파제-8의 경우 Ile-Glu-Thr-Asp(IETD)-pNA 및 카스파제-9의 경우 Leu-Glu-His-Asp(LEHD)-pNA로 정치배양하였다. 카스파제 활성은 ELISA 리더를 이용하여 405nm에서 흡광도 변화를 측정함으로써 확인되었다.

<실시예 2: 결과>

2-1. 제니스테인은 Hep3B 세포에서 TRAIL 유도 아폽토시스를 촉진함.

TRAIL 매개 아폽토시스에 대한 제니스테인의 영향을 조사하기 위해, Hep3B 세포를 지정된 약물로 처리하고 MTT 측정법을 실시하였다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, 24시간 동안 제니스테인 단독(50μM) 처리는 Hep3B 세포의 생존율을 감소시키지 못하였고, TRAIL 단독(100ng/ml) 처리는 세포 생존율을 약간 감소시켰다(92±5%). TRAIL과 여러 농도의 제니스테인의 조합으로 처리된 Hep3B 세포는 TRAIL 단독 처리에 비해 세포 생존율을 현저하게 감소시켰다. TRAIL(100ng/ml)과 제니스테인(12, 25 또는 50μM)의 조합 처리는 24시간째에 세포 생존율을 대조군의 73±5%, 47±6% 및 20±6%까지 감소시켰다(도 1A). 지정된 시간 동안 TRAIL(100ng/ml)과 제니스테인(25μM) 조합 처리에 의한 세포독성 효과를 조사하였다. 그 결과 세포 수의 현저한 감소가 시간 의존적 방식으로 나타났다(도 1B). 그 다음, 저이배체(hypodiploid) 세포 군집을 검출하기 위해, 유세포분석을 이용하여 아폽토시스 효과를 분석하였다. 제니스테인과 TRAIL의 공동 처리는 제니스테인 농도 의존적 방식으로 sub-G1 단계 세포의 축적을 현저하게 증가시킨 반면에, 제니스테인 또는 TRAIL 단독 처리는 그렇지 않았다(도 1C). 아폽토시스를 추가로 분석하기 위해, 크로마틴 압축 및 아폽토시스 체(apoptotic body)를 분석하였다. 제니스테인(25μM) 처리는 세포 사멸을 나타내는 형태학적 특징(상단 패널) 또는 아폽토시스 체(하단 패널)를 유도하지 못하였다(도 1D). TRAIL 단독 처리는 형태학적 변화와 아폽토시스 체에서 약간의 증가를 유도하였지만, 제니스테인과 TRAIL의 조합 처리는 Hep3B 세포에서 아폽토시스 체의 출현을 유도하였다. 또한, 간세포 암종 HepG2 세포 및 폐 암종 A549 세포를 포함한 다른 TRAIL-내성 암종 암 세포에서도 제니스테인이 아폽토시스를 유도하는지 조사하였다. 상기 세포들을 제니스테인(50μM) 또는 TRAIL(10ng/ml)을 단독 또는 조합으로 24시간 동안 처리하고 MTT 방법을 이용하여 세포 생존율을 분석하였다. 도 1E에 나타낸 바와 같이, 제니스테인과 TRAIL의 공동 처리는 세포 생존율을 현저하게 감소시킨 반면, 제니스테인 또는 TRAIL 단독 처리는 세포 생존율을 약하게 감소시키거나 그러지 못하였다. 상기 결과는 제니스테인이 Hep3B 세포 및 다른 암종 세포에서 TRAIL 유도 아폽토시스를 현저하게 촉진시킨다는 것을 의미한다.

2-2. 제니스테인은 Hep3B 세포에서 TRAIL 유도 MMP의 소실을 촉진함.

미토콘드리아는 아폽토시스에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 아폽토시스에 의한 세포 사멸 동안에, 발생하는 초기 이벤트(event)는 미토콘드리아의 탈분극(depolarization) 및 미토콘드리아의 인터멤브레인 공간으로부터 시토크롬 c의 소실이다. Bcl-2 및 IAP 단백질 패밀리의 전-아폽토시스 및 항-아폽토시스의 일원은 세포 생존율을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 그러므로, 제니스테인과 TRAIL의 조합 처리가 Bcl-2 및 IAP 단백질 패밀리 일원의 발현을 조절함으로써 아폽토시스를 유도하는지 여부를 조사하였다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, 제니스테인(0-25μM)과 TRAIL(100ng/ml)의 24시간 조합 처리는 제니스테인 농도 의존적 방식으로 항-아폽토시스 XIAP 단백질의 양을 현저하게 감소시켰지만, cIAP1, cIAP2 및 survivin의 발현 양에는 영향을 미치지 못하였다; 제니스테인 또는 TRAIL 단독 처리는 IAP 발현양에 영향을 미치지 못하였다. 또한, 전-아폽토시스 Bax 단백질의 발현이 상향 조절되었고 항-아폽토시스 Bcl-2 단백질은 제니스테인 농도 의존적 방식으로 감소되었다. 이러한 조건에서, 전-아폽토시스 단백질 Bid는 절단된 반면 항-아폽토시스 Bcl-xL은 변하지 않았다(도 2B). JC-1 형광 양이온 염료를 이용하여 MMP의 소실을 조사하였다. 제니스테인(25μM) 또는 TRAIL(100ng/ml) 단독 처리는 Hep3B 세포에서 MMP의 소실을 약간 유도하였다. 그러나, 제니스테인(0-25μM)과 TRAIL(100ng/ml)의 조합 처리는 제니스테인 농도 의존적 방식으로 MMP의 현저한 소실을 유도하였다(도 2C). 이러한 결과는 제니스테인과 TRAIL의 조합 처리는 Hep3B 세포에서 MMP의 소실을 증가시키고 아폽토시스를 유도한다는 것을 의미한다.

2-3. 제니스테인은 Hep3B 세포에서 TRAIL 유도 카스파제의 활성화와 후속 PARP의 절단을 촉진함

카스파제는 아폽토시스의 주요 매개자로 작용하는 것으로 알려져 잇고 또한, 다양한 세포의 기질의 절단을 통해 전체 아폽토시스 형태에 기여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 제니스테인과 TRAIL로 24시간 처리된 Hep3B 및 HepG2 세포에서 카스파제-3, -8 및 -9의 전구 형태(pro-form) 및 후속된 PARP의 단백질 절단을 조사하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석은 TRAIL 단독 처리는 HepG2 세포가 아닌 Hep3B 세포에서 PARP의 절단이 약간 증가하고 전구-카스파제의 양이 약간 감소함을 보여주었다. 그러나, TRAIL(100ng/ml)과 제니스테인(25 또는 50μM)의 조합 처리는 전구-카스파제 양을 현저하게 감소시켰고 Hep3B에서 PARP의 절단을 현저하게 유도하였고 HepG2 세포에서 PARP 분해(degradation)를 유도하였다. 또한, 제니스테인 및 TRAIL로 처리된 세포에서 유래된 동량의 총 단백질을 포함하는 세포 용균물을 분석하여 생체외 카스파제 활성을 측정하였다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, TRAIL(100ng/ml)과 제니스테인의 조합 처리는 Hep3B 세포에서 카스파제-3, -8 및 -9의 활성을 현저하게 증가시켰다. 이러한 결과는 조합 처리가 적어도 부분적으로 카스파제 의존적 경로를 통해 Hep3B 및 HepG2 세포에서 아폽토시스 사멸을 유도한다는 것을 의미한다. 조합 처리에서 카스파제 활성의 중요성을 추가로 평가하기 위해, Hep3B 세포에서 카스파제의 일반적 및 강력한 억제제를 이용하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, TRAIL 유도 세포 사멸의 제니스테인 매개 촉진은 z-DEVD-fmk 카스파제-3 억제제, z-IETD-fmk 카스파제-8 억제제, z-LEHD-fmk 카스파제-9 억제제 및 z-VAD-fmk pan-카스파제 억제제에 의해 유의적으로 억제되었다. 이는 제니스테인의 존재에서 TRAIL에 의해 유도된 Hep3B 세포에서 카스파제-3, -8 및 -9의 활성화를 통해서 매개된다는 것을 의미한다. 또한, 제니스테인과 TRAIL 조합 처리로부터 나온 PARP 절단과 카스파제 활성 촉진에 대한 카스파제 억제제의 영향을 조사하였다. 도 4B와 C에 나타낸 바와 같이, 카스파제-3, -8 및 -9 억제제의 전처리는 PARP의 절단을 유의적으로 억제하였고, z-VAD-fmk pan-카스파제 억제제는 제니스테인과 TRAIL의 조합 처리에 의해 유도된 PARP 절단과 카스파제 활성 모두를 현저하게 억제하였다. 이러한 결과는 제니스테인은 Hep3B 세포를 카스파제 활성화를 통해 TRAIL 유도 아폽토시스에 대해 현저하게 민감화시키는 것을 명 백하게 보여준다.

2-4. 제니스테인과 TRAIL에 의해 유도된 아폽토시스에 대한 p38 MAPK의 영향

이러한 신호화 경로가 아폽토시스 반응을 매개하는지 여부를 확인하기 위해 MAPK의 발현과 활성에 대한 제니스테인과 TRAIL 조합 처리의 영향을 조사하였다. 도 5A와 B에 나타낸 바와 같이, p38 MAPK의 인산화가 TRAIL이 아닌 제니스테인 처리 24시간 후에 현저하게 감소되었다. 그러나, 제니스테인 24시간 처리 후 ERK(extracellular signal-regulated kinase)는 약간 감소하였으나, JNK(c-Jun N-terminal kinase)는 변하지 않았다(데이터 미도시). 그리고, 조합 처리에 의해 유도된 아폽토시스에서 MAPK의 가능한 역할을 평가하였다. 도 5C에 나타낸 바와 같이, p38 MAPK의 특이적인 억제제인 SB203580으로의 전처리는 24시간 TRAIL과의 조합 처리 후에 sub-G1 DNA 함량의 군집을 통계학적으로 유의적으로 증가시켰다. 이러한 결과는 조합 처리가 p38 MAPK의 활성화를 억제한다는 것을 의미하고, 상기 경로가 Hep3B 세포에서의 아폽토시스에 관여한다는 것을 추정하도록 한다. Hep3B 세포에서 SB203580과 TRAIL 조합 처리에 의해 유도된 아폽토시스에서 MMP의 소실에 대한 p38 MAPK 경로의 영향을 조사하였다. 도 5D에 나타낸 바와 같이, 1시간 동안 SB203580(10-20μM)의 전처리와 후속된 TRAIL(100ng/ml)의 24시간 처리는 MMP의 소실을 현저하게 증가시켰다. 제니스테인과 TRAIL에 의해 유도된 세포 사멸에서 p38 MAPK의 역할을 재확인하기 위해, WT-p38 MAPK를 이용한 증가된 p38 MAPK 발현이 세포 사멸에 보호 작용을 하는지 여부를 조사하였다. 도 6A와 B에 나타낸 바와 같 이, p38 MAPK의 과발현은 TRAIL이 더해진 제니스테인에 의해 유도된 아폽토시스와 MMP의 소실을 현저하게 감소시켰다(도 6A와 B). 이는 p38 MAPK의 억제가, 제니스테인-TRAIL 조합이 미토콘드리아의 아폽토시스 프로그램을 촉구하는 메커니즘에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. p38-β의 활성화는 생존을 촉진하는 반면, p38-α의 활성화는 그러한 역할을 길항하여 세포 사멸을 유래한다는 것이 알려져 있다. 그래서, p38의 이소형이 제니스테인에 의해 유도된 아폽토시스에 관여하는지 조사하였다. 도 6C에 나타낸 바와 같이 제니스테인 처리는 p-38α가 아니라 p-38β의 인산화를 감소시켜, 제니스테인은 p-38β의 활성화를 억제하고 TRAIL에 의해 유도되는 아폽토시스를 촉진한다는 것을 보여주었다.

도 1은 제니스테인 또는 TRAIL 또는 이의 조합이 암종 세포의 증식과 사멸에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 2는 제니스테인 또는 TRAIL 또는 이의 조합이 Hep3B 세포에서 아폽토시스 관련 유전자의 발현에 미치는 영향과 MMP 소실에 대한 영향을 나타낸 것이다.

도 3은 제니스테인 또는 TRAIL 또는 이의 조합이 카스파제 활성화 및 PARP 절단에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 4는 카스파제의 억제제가 제니스테인과 TRAIL에 의해 유도되는 아폽토시스에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 5는 p38 MAPK의 억제가 제니스테인과 TRAIL에 의해 유도되는 아폽토시스에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 6은 p38 MAPK의 과발현이 제니스테인과 TRAIL에 의해 유도되는 아폽토시스에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

Claims

제니스테인과 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)을 포함하는 간암 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 간암은 간 암종(carcinoma)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 제니스테인은 TRAIL에 의해 유도되는 아폽토시스를 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 제니스테인은 TRAIL에 의해 유도되는 미토콘드리아 멤브레인의 전위 소실을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 제니스테인은 TRAIL에 의해 유도되는 카스파제의 활성화와 PARP 절단을 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 제니스테인은 p38-β 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.