BR112019009446A2 - construtos de expressão da frataxina - Google Patents

Abstract

a invenção fornece polinucleotídeos, vetores e vírus que expressam a frataxina e métodos de tratamento da ataxia de friedreich.

Description

“CONSTRUTOS DE EXPRESSÃO DA FRATAXINA”

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [001]Este pedido incorpora por referência uma Listagem de Sequência (identificada abaixo) que é enviada simultaneamente neste documento em formato de arquivo de texto pelo U.S. Patent Office's Electronic Filing System (EFS). A cópia do arquivo de texto da Listagem de Sequência enviada junto com este documento é marcada como INX00317PCT_ST25, é um arquivo de 40,298 bytes de tamanho e foi criado em 4 de outubro de 2017. Esta Listagem de Sequência é incorporada por referência em sua totalidade a este documento.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002]A ataxia de Friedreich (FA) é a forma mais comum de ataxia hereditária e afeta em torno de 1 em 50.000 pessoas nos Estados Unidos. A ataxia de Friedreich é causada por uma mutação no gene que codifica o gene para frataxina (FXN), que está presente no cromossomo 9. A patologia molecular subjacente da FA é devido à presença de uma expansão repetida de GAA do trinucleotídeo (70-1700) no primeiro intron de FXN (Campuzano et al. (1996) Hum. Mol. Genet. 6:1771-1780). O efeito desta mutação gênica é a produção de quantidades inadequadas da proteína mitocondrial frataxina, que parece desempenhar um papel importante na homeostase de ferro (Pandolfo (2008) Archives of Neurology 65:1296-1303; Campuzano et al. (1996) Hum. Mol. Genet. 6:1771-1780). Níveis reduzidos da proteína frataxina estão associados à disfunção mitocondrial e levam à toxicidade celular e morte celular (Pandolfo (2009) J. Neurol. 256 Supl. 1:3-8). Carreadores heterozigotos do gene defeituoso expressam aproximadamente 50% dos níveis proteicos de frataxina normal e são assintomáticos; pacientes homozigotos expressam 5-25% de níveis de frataxina normal e são sintomáticos. Portanto, é possível que aumentos modestos nos níveis proteicos de frataxina nas células no SNC de pacientes com FA possam resultar em melhorias neurológicas significativas. Além disso, moléculas que aumentam os níveis

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2/127 endógenos de FXN ou métodos de substituição proteica de FXN se mostraram promissores em estudos clínicos e pré-clínicos. Assim, a substituição proteica via terapia gênica é uma opção alternativa convincente para o desenvolvimento terapêutico. Há uma necessidade urgente na técnica por um tratamento e prevenção da ataxia de Friedreich.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [003]A invenção fornece um polinucleotídeo que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica a frataxina humana operacionalmente ligada a elementos de controle que direcionam sua transcrição e tradução. Em algumas modalidades da invenção, o ácido nucleico codifica uma proteína frataxina com sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades da invenção, o ácido nucleico codifica uma proteína de frataxina com sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, os elementos de controle são selecionados do grupo que consiste em um promotor, um elemento regulador 5', um elemento regulador 3' e suas combinações.

[004]Em algumas modalidades, o promotor é selecionado do grupo que consiste em um promotor de CMV, um promotor UBC, um promotor EF1a, um promotor PGK1 e um promotor de frataxina mínimo. Em algumas modalidades, o elemento regulador 5' é selecionado do grupo em uma sequência GAPDH, uma FTH1 5’UTR, uma sequência de Splice RPL6-5' e uma sequência 5U2. Em algumas modalidades, o elemento regulador 3' é selecionado do grupo que consiste em uma sequência precoce SV40, uma sequência tardia SV40, um elemento regulador 3' sintético e uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano.

[005]Em uma modalidade particular da invenção, o ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, e os elementos de controle compreendem um promotor de UBC (por exemplo, SEQ ID NO:3), uma

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3/127 sequência 5U2 (por exemplo, SEQ ID N0:4) e uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano (por exemplo, SEQ ID NO:5).

[006]Em outra modalidade particular da invenção, o ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, e os elementos de controle compreendem um promotor UBC (por exemplo, SEQ ID NO:3), uma sequência 5U2 (por exemplo, SEQ ID NO:4) e uma sequência de elemento regulador 3’ sintética (SEQ ID NO:7).

[007]A invenção também fornece um vetor viral que compreende o polinucleotídeo da invenção. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor viral adeno-associado. Em uma modalidade específica, o vetor viral é AAV5.

[008]A invenção também fornece um vírion recombinante que compreende um vetor viral, e em que o vetor viral compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica frataxina humana operacionalmente ligada a elementos de controle que direcionam sua transcrição e tradução. Em algumas modalidades, o vírion contém um vetor viral adeno-associado. Em certas modalidades específicas, o vetor viral adenoassociado é AAV5. Em algumas modalidades, o vírion compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

[009]Em algumas modalidades, os elementos de controle são selecionados do grupo que consiste em um promotor, um elemento regulador 5', um elemento regulador 3' e suas combinações. Em algumas modalidades, o promotor é selecionado do grupo que consiste em um promotor CMV (por exemplo, SEQ ID NO:13), um promotor UBC (porexemplo, SEQ ID NO:3) um promotor EF1a (por exemplo, SEQ ID NO:18), um promotor PGK1 (por exemplo, SEQ ID NO:17) e um promotor de frataxina mínimo. Em algumas modalidades, o elemento regulador 5' é selecionado do grupo que consiste em uma sequência GAPDH (por exemplo, SEQ ID NO:15), FTH1-5’UTR (por exemplo, SEQ ID NO:14), uma sequência Splice RPL6-5' (por exemplo, SEQ ID

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N0:16) e uma sequência 5U2 (SEQ ID N0:4). Em algumas modalidades, o elemento regulador 3' é selecionado do grupo que consiste em uma sequência precoce SV40 (por exemplo, SEQ ID NO:8), uma sequência tardia SV40 (por exemplo, SEQ ID NO:9), uma sequência de elemento regulador 3’ sintética (SEQ ID NO:7) e uma sequência de poliadenilação de hormônio de crescimento humano (por exemplo, SEQ ID NO:5). Em certas modalidades específicas, o ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, o promotor é um promotor UBC (SEQ ID NO:3), e os elementos reguladores são uma sequência 5U2 (SEQ ID NO:4) e uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano (SEQ ID NO:5). Em outras modalidades específicas, o ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, o promotor é um promotor UBC (SEQ ID NO:3) e os elementos reguladores são uma sequência 5U2 (SEQ ID NO:4) e uma sequência de elemento regulador 3' sintética (SEQ ID NO:7).

[010]A invenção também fornece uma composição compreendendo (a) um vetor viral, em que o vetor viral compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica operacionalmente a frataxina ligada aos elementos de controle que direcionam a transcrição e tradução do mesmo; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[011]Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral adeno-associado. Em certas modalidades específicas, o vetor viral adeno-associado é AAV5.

[012]Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma proteína de frataxina com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:1.

[013]Em algumas modalidades, os elementos de controle são selecionados do grupo que consiste em um promotor, um elemento regulador 5', um elemento regulador 3' e suas combinações. Em algumas modalidades, o promotor é selecionado do grupo que consiste em um promotor CMV (por exemplo, SEQ ID NO:13), um

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5/127 promotor UBC (porexemplo, SEQ ID NO:3) um promotor EF1a (por exemplo, SEQ ID NO:18), um promotor PGK1 (por exemplo, SEQ ID NO:17) e um promotor de frataxina mínimo. Em algumas modalidades, o elemento regulador 5' é selecionado do grupo consistindo em uma sequência GAPDH (por exemplo, SEQ ID NO:15), uma FTH15’UTR (por exemplo, SEQ ID NO:14), uma sequência RPL6-5'Splice (por exemplo, SEQ ID NO:16), e uma sequência 5U2 (SEQ ID NO:4). Em algumas modalidades, o elemento regulador 3' é selecionado do grupo que consiste em uma sequência precoce SV40 (porexemplo, SEQ ID NO:8), uma sequência tardia SV40 (por exemplo, SEQ ID NO:9), uma sequência de elemento regulador 3’ sintética (SEQ ID NO:7) e uma sequência de poliadenilação de hormônio de crescimento humano (por exemplo, SEQ ID NO:5). Em certas modalidades específicas, o ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, o promotor é um promotor UBC (SEQ ID NO:3), e os elementos reguladores são uma sequência 5U2 (SEQ ID NO:4) e uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano (SEQ ID NO:5). Em certas outras modalidades específicas, o ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, o promotor é um promotor UBC (SEQ ID NO:3) e os elementos reguladores são uma sequência 5U2 (SEQ ID NO:4) e uma sequência de elemento regulador 3' sintética (SEQ ID NO:7).

[014]A invenção também fornece uma composição compreendendo (a) um vírion recombinante e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que o vírion recombinante compreende um vetor viral e em que o vetor viral compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de frataxina humana com sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:1, operacionalmente ligada a elementos de controle que direcionam a transcrição e translação dos mesmos. Em algumas modalidades, o vírion contém um vetor viral adeno-associado. Em certas modalidades específicas, o vetor viral adeno-associado é AAV5. Em algumas modalidades, o vírion compreende uma

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6/127 molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

[015]Em algumas modalidades, os elementos de controle são selecionados do grupo que consiste em um promotor, um elemento regulador 5', um elemento regulador 3' e suas combinações. Em algumas modalidades, o promotor é selecionado do grupo que consiste em um promotor de CMV, um promotor UBC, um promotor EF1a, um promotor PGK1 e um promotor de frataxina mínimo. Em algumas modalidades, o elemento regulador 5' é selecionado do grupo consistindo em uma sequência GAPDH (por exemplo, SEQ ID NO:15), uma FTH1-5’UTR (por exemplo, SEQ ID NO:14), uma sequência RPL6-5'Splice (por exemplo, SEQ ID NO:16), e uma sequência 5U2 (SEQ ID NO:4). Em algumas modalidades, o elemento regulador 3' é selecionado do grupo consistindo em uma sequência inicial SV40 (SEQ ID NO:8), uma sequência de atraso SV40 (SEQ ID NO:9), uma sequência de elemento regulador 3’ sintética (SEQ ID NO:7), e uma sequência de poliadenilação de hormônio de crescimento humano (SEQ ID NO:5). Em certas modalidades específicas, o ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, o promotor é um promotor UBC (SEQ ID NO:3), e os elementos reguladores são uma sequência 5U2 (SEQ ID NO:4) e uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano (SEQ ID NO:5). Em outras modalidades específicas, o ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, o promotor é um promotor UBC (SEQ ID NO:3) e os elementos reguladores são uma sequência 5U2 (SEQ ID NO:4) e uma sequência de elemento regulador 3' sintética (SEQ ID NO:7).

[016]Em algumas modalidades, o excipiente farmaceuticamente aceitável é 1 XPBS, (por exemplo, 0,154M NaCI, 0,056M Na₂HPO₄, e 0,0106 Μ KH2PO4) ou DPBS (por exemplo, 0,337M NaCI, 0,027 M KCI, 0,015M Na₂HPO4, e 0,0015M ΚΗ₂ΡΟ₄).

[017]Em algumas modalidades, 0 vetor viral está presente em uma

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7/127 concentração de 2,5 x 10¹¹ vg/MI, 7,5 x 10¹¹ vg/MI, ou 2,5 x 10¹² vg/MI.

[018]Em algumas modalidades, o pH da composição é de 6,5 a 7,5; 7,0 a 7,5; 6,8 a 7,2. Em algumas modalidades, o pH da composição é 7,0 ou 7,4.

[019]A composição pode compreender ainda capsídeos vazios em uma porcentagem de no máximo 95% cp/cp, preferencialmente 50% cp/cp ou menos.

[020]A invenção também fornece um método para tratar a ataxia de Friedrich, compreendendo fornecer uma formulação farmacêutica que compreende um vetor viral (por exemplo, preferencialmente um vetor AAV, tal como, sem limitação, um vetor AAV5), em que o vetor compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de frataxina humana e um excipiente farmaceuticamente aceitável a pelo menos um sítio alvo no SNC do sujeito em uma dose de pelo menos cerca de 1 x 10⁹ vg, 1 x 10¹⁰ vg, 1 x 10¹¹ vg, ou 1 x 10¹²vg ou mais. Em algumas modalidades, a dose é pelo menos cerca de 1 x 10¹³ vg, 5 x 10¹³ vg, 1,5 x 10¹⁴ vg ou 5 x 10¹⁴ vg.

[021 ]Em algumas modalidades, o sítio alvo é o espaço do LCR; o espaço subaracnoide, (por exemplo, cisterna magna); o cérebro, (por exemplo, o espaço cerebroventricular, o cerebelo, o cérebro, o hipocampo, o córtex interior, o gânglio da raiz dorsal, ou núcleo caudado); ou a coluna (por exemplo, a coluna lombar, a coluna torácica, a coluna cervical). Em algumas modalidades, o ingrediente ativo (por exemplo, vetores que expressam frataxina, virions, vírus, rAAVs, etc.) é distribuído em duas injeções: uma no cerebelo direito e uma no cerebelo esquerdo. Em algumas modalidades, estas são duas injeções iguais. Em algumas modalidades, o ingrediente ativo (por exemplo, vetores que expressam frataxina, virions, vírus, rAAVs, etc.) é administrado injetando no cerebelo e também o fornecendo sistematicamente.

[022]Nas modalidades dos métodos, a formulação farmacêutica pode ser administrada por via intraparenquimal, intratecal, intracerebroventricular, sistêmica ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é administrada por via intratecal em porções iguais à cisterna magna e à coluna lombar.

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8/127 [023]Em algumas modalidades do método, a dose é uma quantidade de pelo menos 3,7 x 1O^1ovg/g, 1,11 x 10¹¹ vg/g, ou 3,7 x 10¹¹ vg/g com base no peso do cérebro. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica compreende uma concentração de vetor de pelo menos 2 x 10¹² vg/mL, 7 x 10¹² vg/mL, ou 2 x 10¹³ vg/mL.

[024]Em algumas modalidades do método, a formulação farmacêutica é administrada como uma injeção em bolus única de 0,1 mL a 5 mL (por exemplo, 3 mL ou 2 mL). Em outras modalidades, a formulação farmacêutica é distribuída como uma infusão em uma taxa de 0,001 mL/min a 1 mL/min, (por exemplo, 0,01 mL/min).

[025]A invenção também fornece um método para tratar a Ataxia de Friedreich em um sujeito em necessidade dele. Em algumas modalidades, o método compreende administrar a um sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica de um vírus da invenção que compreende um vírion para expressar a frataxina, em um carreador farmacêutico. Os virions recombinantes transduzem as células no sujeito e a molécula de ácido nucleico é expressa pelas células transduzidas em um nível suficiente para melhorar pelo menos um sintoma da Ataxia de Friedreich no sujeito.

[026]Os sintomas da Ataxia de Friedreich podem ser um ou mais selecionados do grupo que consiste em perda de coordenação nos braços e/ou pernas; fadiga, deficiência visual, perda de audição, fala arrastada, escoliose agressiva, diabetes mellitus, cardiomiopatia hipertrófica e arritmia cardíaca.

[027]Em algumas modalidades, a frataxina é expressa na mitocôndria. Em algumas modalidades, a frataxina é expressa no cerebelo. Em algumas modalidades, a frataxina é expressa no hipocampo. Em algumas modalidades, a frataxina é expressa no córtex anterior. Em algumas modalidades, a frataxina é expressa no gânglio da raiz dorsal.

[028]Em algumas modalidades do método da invenção, a frataxina é expressa

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9/127 no referido sujeito em um nível superior a 25% em relação aos níveis normais de frataxina. Em outras modalidades, a frataxina é expressa no referido sujeito em um nível superior a 30% dos níveis normais de frataxina. Ainda em outras modalidades, a frataxina é expressa no referido sujeito em um nível superior a 40% em relação aos níveis normais de frataxina. Ainda em outras modalidades, a frataxina é expressa no referido sujeito em um nível superior a 50% em relação aos níveis normais de frataxina.

[029]Em certas modalidades, um switch (interruptor) do gene que regula indutivamente (de forma dependente da dose) a expressão de frataxina é incorporado ao polinucleotídeo para expressar a frataxina. O switch do gene pode ser, por exemplo, um switch do gene RHEOSWITCH THERAPEUTIC SYSTEM® (RTS®).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [030]A Figura 1 mostra os resultados de Série 1 para construtos selecionados empregando o promotor UBC em SY5Y não diferenciado, juntamente com os controles de Proteína Verde Fluorescente (GFP), CMV e Simulação. O painel A mostra o rendimento pg de FXN por pg de proteína total. O painel B mostra níveis de expressão em vezes sobre células transfectadas por simulação. Ver Tabela 1 para composição do construto.

[031 ]A Figura 2 mostra os resultados de Série 1 para construtos selecionados empregando o promotor UBC em fibroblastos de paciente com FA, juntamente com os controles de Proteína Verde Fluorescente (GFP), CMV e Simulação. O painel A mostra o rendimento pg de FXN por pg de proteína total. O painel B mostra níveis de expressão em vezes sobre células transfectadas por simulação. Ver Tabela 1 para composição do construto.

[032]A Figura 3 mostra os resultados de Série 2 para construtos selecionados empregando o promotor UBC em SY5Y não diferenciado, juntamente com os controles de Proteína Verde Fluorescente (GFP), CMV e Simulação. O painel A mostra

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10/127 o rendimento pg de FXN por pg de proteína total. O painel B mostra níveis de expressão em vezes sobre células transfectadas por simulação. Ver Tabela 1 para composição do construto.

[033]A Figura 4 mostra os resultados de Série 2 para construtos selecionados empregando o promotor UBC em fibroblastos de paciente com FA, juntamente com os controles de Proteína Verde Fluorescente (GFP), CMV e Simulação. O painel A mostra o rendimento pg de FXN por pg de proteína total. O painel B mostra níveis de expressão em vezes sobre células transfectadas por simulação. Ver Tabela 1 para composição do construto.

[034]A Figura 5 mostra os resultados de Série 3 para construtos selecionados empregando o promotor UBC em SY5Y não diferenciado, juntamente com os controles de Proteína Verde Fluorescente (GFP), CMV e Simulação. O painel A mostra o rendimento pg de FXN por pg de proteína total. O painel B mostra níveis de expressão em vezes sobre células transfectadas por simulação. Ver Tabela 1 para composição do construto.

[035]A Figura 6 mostra os resultados de Série 3 para construtos selecionados empregando o promotor UBC em fibroblastos de paciente com FA, juntamente com os controles de Proteína Verde Fluorescente (GFP), CMV e Simulação. O painel A mostra o rendimento pg de FXN por pg de proteína total. O painel B mostra níveis de expressão em vezes sobre células transfectadas por simulação. Ver Tabela 1 para composição do construto.

[036]A Figura 7 mostra a frataxina humana sendo expressa e trafegando apropriadamente para a mitocôndria, por imagens de fluorescência de fibroblastos de macaco verde africano (COS-7) transfectados com Frataxina humana: (A) núcleos corados com DAPI, (B) mitocôndria corada com MitoTracker, (C) frataxina humana expressa corada com frataxina anti-humana (Abeam #ab11038) e (D) co-localização de frataxina humana com núcleos e mitocôndrias.

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11/127 [037]A Figura 8 mostra a frataxina humana sendo expressa e trafegando apropriadamente para a mitocôndria por imagens de fluorescência de fibroblastos murines (NC6) transfectados com Frataxina humana: (A) núcleos corados com DAPI, (B) mitocôndria corada com MitoTracker, (C) frataxina humana expressa corada com frataxina anti-humana (Abeam #ab11038) e (D) co-localização de frataxina humana com núcleos e mitocôndrias.

[038]A Figura 9 mostra um western blot de neurônios do Dia 21 FA (3816) que foram transduzidos com frataxina humana AAV5 (026) em 500.000 cópias/células do genoma nos dias 5 e 7 após transdução (Painel A) e nos dias 10 e 14 após transdução (Painel Β). A frataxina humana foi detectada com um anticorpo de frataxina antihumana (Abeam # ab11038) usando técnicas de Western blot padrão. Marcadores de peso molecular foram introduzidos para confirmar o tamanho da proteína frataxina madura (14,2 kDa). FA+: células transduzidas; FA: células não transduzidas; Ctrl: células controle.

[039]A Figura 10 mostra um desenho da estratégia de reprogramação de fibroblastos para que se tornem células pluripotentes que possam se diferenciar em vários tipos de células para uso na modelagem, teste de terapias e transplante.

[040]A Figura 11 mostra os resultados da expressão da frataxina de células neuronais derivadas de iPSC transformadas por eletroporação de um plasmídeo que expressa frataxina para os construtos 024 e 026 (ver Tabela 1), expressos por quantidade de vezes em relação às células de simulação (tratadas com GFP).

[041 ]A Figura 12 mostra os resultados da expressão da frataxina de células neuronais derivadas de iPSC transduzidas com AAV que expressa frataxina para os construtos de AAV 024 e 026 (ver Tabela 1), expressos por quantidade de vezes em relação às células de simulação (tratadas com GFP).

[042]A Figura 13 mostra a expressão de frataxina (pg FXN/mg proteína) no cerebelo com administração de AAV5-FXN-026 por via intraparenquimal.

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12/127 [043]A Figura 14 mostra a expressão de frataxina (pg FXN/mg proteína) no cerebelo (CB), hipocampo (HPC) e córtex anterior (ACX) de camundongos com administração deAAV5-FXN 026 por via intraventricular.

[044]A Figura 15 mostra um Mapa de Vetor AAV5.hFXN Recombinante. Promotor da Ubiquitina C (promotor UBC), um elemento regulador 5' (5U2), cDNA de hFXN não modificado (hFXN GOI), elemento regulador 3' de poliadenilação do hormônio de crescimento humano (hGH-poli A) e um ligante ITR. Toda a sequência é flanqueada por Repetições Terminais Invertidas de AAV (ITR).

[045]A Figura 16 mostra uma Sequência de Aminoácido Deduzida do Precursor da Frataxina Humana Normal (SEQ ID NO:1). A sequência sublinhada é um peptídeo necessário para o transporte do precursor da proteína frataxina para a mitocôndria. O peptídeo em itálico deve ser removido para ativar a proteína. A proteína frataxina canônica totalmente processada (em negrito) tem 130 aminoácidos. A sequência é do banco de dados UniProt: Identificador #: Q16595-1. O consórcio UniProt compreende o Instituto Europeu de Bioinformática (EBI), Instituto Suíço de Bioinformática (SIB) e Recurso de Informação de Proteína (PIR).

[046]A Figura 17 mostra uma Visão Geral Esquemática de um Processo de Fabricação do Vetor AAV5.hFXN.

[047]A Figura 18 mostra um Mapa Esquemático de Plasmídeo do DNA de pAAV5-hFXN.

[048]A Figura 19 mostra uma sequência nucleotídica de um vetor AAV5hFXN: inserção de gene: ITR para ITR-Anotado (SEQ ID NO:19).

[049]A Figura 20 mostra uma sequência nucleotídica de um plasmídeo de pAAV5-hFXN (SEQ ID NQ:20).

[050]A Figura 21 mostra um gráfico que representa a Expressão Induzida pelo vetor de rAAV5-hFXN da Frataxina Humana no Cerebelo de Camundongos Sarsero deficientes em frataxina. rAAV5.hFXN (2 pl_) foi injetado diretamente no cerebelo (IPc,

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N=7 camundongos) ou espaço intracerebroventricular (ICV, N=7) de camundongos com FA em uma dose de 7 x 10⁹ vg/pL. Três camundongos com FA foram injetados com AAV5.GFP (controle, 2 μΙ_) no cerebelo ou ICV em uma dose de 4 x 10⁹ vg/pL. Em 4 semanas após a injeção, os cerebelos foram coletados. O tecido cerebelar de dois camundongos controle não tratados também foi coletado. Os lisados do tecido foram analisados para frataxina humana conforme descrito acima. É mostrada a expressão média para cada tratamento.

[051 ]A Figura 22 é um gráfico que mostra Cópias de DNA por pg de Tecido do Cerebelo de suíno após a biodistribuição do vetor usando vários locais de distribuição e dispositivos.

[052]A Figura 23 é um gráfico que mostra Cópias de DNA por pg de Tecido de Outro Cérebro de suíno após a biodistribuição do vetor usando vários locais de distribuição e dispositivos.

[053]A Figura 24 é um gráfico que mostra Cópias de DNA por pg de Tecido de Tecidos da Coluna Vertebral de suínos após a biodistribuição do vetor usando vários locais de distribuição e dispositivos.

[054]A Figura 25 é um gráfico que mostra Cópias de DNA por pg de Tecido de Tecidos Sistêmicos de suínos após a biodistribuição do vetor usando vários locais de distribuição e dispositivos.

[055]A Figura 26 é um gráfico que mostra a distribuição de rAAV5-FXN-026 após uma única infusão no cerebelo. Cópias do Genoma do Vetor no Cerebelo de Suíno Yucatan macho no Dia 28 vs. 60 (vg DNA/pg Tecido DNA).

[056]A Figura 27 é um gráfico que mostra a distribuição de rAAV5-FXN-026 após uma única infusão no cerebelo do suíno Yucatan macho. Cópias do Genoma do Vetor no Cérebro no Dia 28 vs 60 (vg DNA/pg Tecido DNA).

[057]A Figura 28 é um gráfico que mostra a distribuição de rAAV5-FXN-026 após uma única infusão no cerebelo do suíno Yucatan macho. Cópias do Genoma do

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Vetor na Medula Espinhal e DRG no Dia 28 vs 60 (vg DNA/pg Tecido DNA).

[058]A Figura 29 é um gráfico que mostra a expressão da proteína frataxina em amostras de tecido do córtex cerebelar, núcleo dentado, hipocampo e córtex motor do suíno Yucatan macho. Níveis de frataxina via ELISA.

[059]A Figura 30 é um gráfico que mostra a biodistribuição de um vetor de frataxina humana de AAV5 AAV5-hFXN (026) após a administração intracerebelar a macacos cynomolgus. As amostras de tecido do córtex cerebelar, núcleo dentado, hipocampo e córtex motor foram analisadas quanto aos níveis de frataxina via ELISA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [060]A presente invenção refere-se à expressão de frataxina humana nas células e o tratamento da Ataxia de Friedreich em pacientes em necessidade dele.

[061]Para os métodos descritos neste documento, vários protocolos que poderíam ser usados são divulgados em manuais de referência, tais como: Current Protocols in Molecular Biology (eds. Ausubel et al., Wiley, edição de 2004.) e Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook e Russell (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, terceira edição). Métodos contendo imunorreagente como western blots, ELISAs e imunoprecipitações são realizados conforme descrito em: Using Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow and Lane Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Cada uma dessas referências é incorporada a este documento em sua totalidade.

[062]Quando os termos um, uma ou uns(umas) são usados nesta divulgação, eles se referem a pelo menos um ou um ou mais, salvo indicação em contrário.

[063]O termo vírus AAV se refere a uma partícula de vírus completa, por exemplo, uma partícula de vírus AAV do tipo selvagem (wt). Um vírus AAV tem um revestimento proteico do capsídeo AAV encapsulando genoma de ácido nucleico de

AAV de fita única linear. Um vírus AAV é replicação-incompetente (ou seja, vírus com

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15/127 replicação defeituosa ou dependente de auxiliar). Um vírus AAV é opcionalmente derivado de qualquer sorotipo de vírus adeno-associado, incluindo, sem limitação, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5 ou AAVX7. Os vírus AAV podem ter um ou mais genes do tipo selvagem de AAV deletados no todo ou em parte, preferencialmente, os genes rep e/ou cap, mas retêm sequências de ITR flanqueadoras funcionais. Exemplos de vírus AAV incluem, sem limitação, vírus AAV que estão disponíveis pela American Type Culture Collection (ATCC) sob Números de Acesso 53222, 53223, 53224, 53225 e 53226. Para obter uma descrição dos vírus AAV e seus usos, consulte, por exemplo, Haj-Ahmad e Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-629; e Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461 -476.

[064]Como usado neste documento, um vírion é um polinucleotídeo que compreende uma estrutura principal de ácido nucleico viral com um gene de interesse a ser expresso (por exemplo, frataxina) e pelo menos em elemento regulador para controlar a expressão do gene de interesse.

[065]O termo AAV recombinante, um rAAV, um vetor AAV recombinante, ou um vetor rAAV se refere um vírus infeccioso, porém com defeito de replicação, composto por um envoltório proteico de AAV (isto é, um capsídeo) encapsulando um vetor viral com uma inserção gênica diferente do DNA de AAV de tipo selvagem.

[066]O termo repetição terminal invertida ou ITR se refere a uma sequência de ácido nucleico simétrica em qualquer extremidade do material genético de um vírus. Sem estarem vinculados pela teoria, os relatórios da literatura mostram que ITRs auxiliam a multiplicação eficiente do genoma de AAV. A literatura também relata a capacidade de ITRs de formar um hairpin, o que contribui para o próprio priming que permite a síntese independente de primase de uma segunda fita de ácido nucleico. As

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ITRs também foram mostrados para auxiliar a integração de DNA de AAV em um genoma de célula hospedeira. As ITRs não precisam ser sequências nucleotídicas do tipo selvagem e podem ser alteradas, por exemplo, por inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos, desde que as sequências forneçam resgate funcional, replicação e empacotamento. As sequências nucleotídicas opcionais das regiões de ITR de AAV são conhecidas. Vide, por exemplo, Kotin, R. M. (1994) “Human Gene Therapy” 5:793-801; Berns, K. I. “Parvoviridae and their Replication” em Fundamental Virology, 2- Edição, (B. N. Fields e D. M. Knipe, eds.) [067]O termo inserção gênica se refere a uma molécula de ácido nucleico, incluindo uma porção que codifica um polipeptídeo.

[068]O termo terapia gênica se refere a um tratamento de um sujeito que compreende a introdução, a um sujeito, de uma cópia normal de um ou mais genes defeituosos ou faltantes.

[069]O termo terapia do gene FXN ou terapia do gene da frataxina se refere a um tratamento de um sujeito que compreende a introdução de uma cópia normal de um gene FXN em um sujeito que tem um gene FXA/defeituoso, um gene FXA/faltante, tem expressão insuficiente de um Gene FXN ou produz quantidades inadequadas de frataxina.

[070]O termo sujeito, indivíduo ou paciente deve ser usado de forma intercambiável e se refere a um mamífero, preferencialmente um ser humano em necessidade de terapia. Um sujeito pode ter qualquer idade. Um sujeito pode ser um adulto. Um sujeito pode ser um adulto de cerca de 18 anos a cerca de 60 anos. Um sujeito pode ser uma criança. Um sujeito pode ser uma criança de cerca de 17 anos ou menos. Um sujeito pode ser uma criança de cerca de 10 anos ou menos. Um sujeito pode ser uma criança de cerca de 3 anos ou menos.

[071 ]O termo capsídeo se refere a um revestimento de proteína ou envoltório de um vírus. Um capsídeo compreende, opcionalmente, uma ou mais subunidades

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17/127 estruturais oligoméricas que compreendem proteínas, opcionalmente denominadas protômeros. Um capsídeo pode ser envolto, opcionalmente, por um envelope de bicamada lipídica e glicoproteína. Em uma modalidade, um capsídeo é um capsídeo do vírus adeno-associado (AAV). Em uma modalidade, o capsídeo é um capsídeo de serotipo 5 do vírus adeno-associado recombinante (rAAV).

[072]O termo capsídeo vazio se refere a um revestimento de proteína de vírus que não contém um genoma do vetor. Um capsídeo vazio pode ser uma partícula similar a um vírus na qual ela reage com um ou mais anticorpos que reagem com vírus intacto (por exemplo, carregando genoma do vetor) (por exemplo, vírus adenoassociado, AAV). Em um exemplo não limitante, um capsídeo vazio de AAV5 retém a capacidade de reagir com um ou mais anticorpos que se ligam a um AAV, como um AAV5 ou outro serotipo de AAV. Por exemplo, um capsídeo vazio de AAV2 retém a capacidade de reagir com um ou mais anticorpos que se ligam ao AAV8.

[073]Os capsídeos vazios podem ser encontrados, muitas vezes, naturalmente em preparações de vetor de AAV. Tais preparações podem ser usadas de acordo com a invenção. Opcionalmente, tais preparações podem ser manipuladas para aumentar ou diminuir o número de capsídeos vazios. Por exemplo, a quantidade de capsídeo vazio pode ser ajustada a uma quantidade que seria esperada para reduzir o efeito inibitório de anticorpos. Os capsídeos vazios também podem ser produzidos independentemente de preparações de vetor e, opcionalmente, (i) adicionados às preparações de vetor, ou (ii) administrados separadamente a um sujeito. Vide F. Mingozzi et al., U.S. Publicação do Pedido de Patente n. 2014/0336245 “Virus vectors for highly efficient transgene delivery.” [074]O termo capsídeo modificado se refere a um capsídeo modificado pelo teor ou um capsídeo modificado para que o capsídeo não seja capaz de entrar em uma célula.

[075]O termo capsídeo modificado por teor se refere a um capsídeo que

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18/127 carrega uma inserção gênica que é modificada. Exemplos de inserções gênicas que são modificadas incluem, sem limitação, ácidos nucleicos não codificantes.

[076]O termo capsídeo vazio mutante se refere a um capsídeo vazio que compreende uma mutação que interrompe a ligação do receptor do vírus. Em uma modalidade, um capsídeo vazio mutante é um capsídeo mutante não infeccioso. Em outra modalidade, um capsídeo vazio pode absorver um anticorpo, mas não pode entrar em uma célula alvo. Em outra modalidade, um capsídeo vazio pode absorver um anticorpo neutralizante. Vide C.J. Aalbers, etal., “Empty Capsids and Macrophage Inhibition/Depletion Increase rAAV Transgene Expression in Joints of Both Healthy and Arthritic Mice,” Human Gene Therapy, fevereiro de 2017;28(2):168-1781; e Ayuso E, et al. “High AAV vector purity results in serotype- and tissue independent enhancement of transduction efficiency.” Gene 77?e/-2010; 17:503-510.

[077]O termo inserção do gene FXN” se refere a uma inserção gênica que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica FXN. Em uma modalidade, a inserção gênica compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o FXN humano (hEXTV). Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica hFXN é um cDNA de FXN. Em uma modalidade particular, a sequência de ácido nucleico que codifica hFXN é um cDNA correspondente à sequência de mRNA da frataxina humana normal descrita na Sequência de Referência: NM_000144.4. (Vide JJ Carvajal et al., “The Friedreich's ataxia gene encodes a novel phosphatidylinositol-4- phosphate 5-kinase” Nat. Genet. 14 (2), 157-162 (1996).) [078]O termo genoma do vetor ou vg deve ser amplamente compreendido para abranger vetores ou virions contendo inserção gênica. Por conveniência, “genomas de vetor” incluem, sem limitação, vetores ou virions contendo inserção gênica encapsulados em capsídeos, tais como vírus AAV e vetores e inserções gênicas de rAAV, que não são encapsulados por capsídeos. Por conveniência, vetores ou virions contendo inserção gênica que não são encapsulados por capsídeos

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19/127 incluem vetores ou virions contendo inserção de gene isolado. Vide Patente U.S. n. 9,598,703 “Capsid-free AAV vectors, compositions, and methods for vector productionand gene delivery”.

[079]Para fins quantitativos, vg é calculado como uma contagem de vetores ou virions contendo inserção gênica. Em um exemplo de um genoma de vetor único ou vg único é uma inserção gênica única ou um capsídeo único que carrega um vetor ou vírion contendo inserção gênica. Em outro exemplo, uma partícula do vetor de AAV5.hFXN se refere a 1 vg, enquanto cerca de 5 x 10¹⁴ vg se refere a cerca de 5 x 10¹⁴ vetores de AAV5.hFXN.

[080]O termo partícula do capsídeo ou cp deve ser amplamente compreendido para abranger qualquer capsídeo. Por conveniência, os capsídeos podem estar cheios (por exemplo, encapsulando uma inserção gênica) ou vazios. As partículas do capsídeo incluem, sem limitação, capsídeos que carregam genomas de vetor (por exemplo, vírus AAV e vetores de rAAV), capsídeos vazios, capsídeos modificados, capsídeos modificados por teor e capsídeos vazios mutantes.

[081]Para fins quantitativos, cp é calculado como uma contagem do número total de capsídeos combinados que carregam genomas de vetor (por exemplo, vírus AAV, e vetores de rAAV, virions), capsídeos vazios, capsídeos modificados, capsídeos modificados por teor e capsídeos vazios mutantes. Em um exemplo, 1 cp se refere a um capsídeo vazio, enquanto que cerca de 1,76 x 10¹² cp se refere a cerca de 1,76 x 10¹² capsídeos vazios. Em outro exemplo, uma formulação farmacêutica compreendendo 50% cp/cp de capsídeos vazios compreende 50 partículas de capsídeo vazio por 100 partículas capsídeo total (cheios e vazios). Em outro exemplo, uma formulação farmacêutica compreendendo 10% de capsídeos vazios pode compreender um total de cerca de 5,5 x 10¹⁴ partículas de capsídeo cp, em que a formulação farmacêutica compreende cerca de 5x 10¹⁴ vg vetores de AAV5.hFXN e cerca de 5 x 10¹³ cp capsídeos vazios.

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20/127 [082]O termo transdução se refere ao transporte de um gene para uma célula usando uma partícula de vírus.

[083]O termo quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para afetar um resultado terapeuticamente benéfico ou terapeuticamente desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens.

[084]O termo ponto alvo ou sítio alvo se refere a um local no sistema nervoso central (SNC) de um sujeito onde a formulação farmacêutica é administrada. Em um aspecto, o sítio alvo é o espaço do fluido cefalorraquidiano (LCR). Em uma modalidade, o sítio alvo é o espaço subaracnoide. Em outra modalidade, o sítio alvo é o espaço cerebroventricular. Em uma modalidade, o sítio alvo é o cérebro. Em outra modalidade, o sítio alvo é a coluna vertebral. Em outra modalidade, o sítio alvo é a cauda equina. Um sítio alvo pode ser, opcionalmente, o cérebro, cerebelo, hipocampo, córtex interior, gânglio da raiz dorsal, núcleo dentado, núcleo caudado ou cisterna magna. Um sítio alvo pode ser, opcionalmente, a coluna sacral, lombar, torácica ou cervical. A formulação farmacêutica pode ser administrada a um ou mais sítios alvo.

[085]O termo construto de plasmídeo se refere a uma molécula de ácido nucleico circular que é usada em combinação com pelo menos outro plasmídeo, para transfectar uma linhagem celular in vitro para produzir partículas de capsídeo. Em uma modalidade, o construto do plasmídeo compreende: uma sequência de ácido nucleico que codifica hFXN (por exemplo, cDNA do FXN humano); um promotor de Ubiquitina C Humana (UBC); 5U2, que é um elemento regulador sintético 5’ derivado do segundo intron do gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático canino e a região não traduzida 5' do gene de caseína bovina (Pat. U.S. n. 8,835,621); um Hormônio de Crescimento Humano Poli A(hGH-Poli A); duas repetições terminais de invertidas de AAV2 (ITRs) flanqueando os elementos do gene de AAV2; e um gene de resistência ao antibiótico.

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21/127 [086]Como usado neste documento, ácido nucleico, molécula de ácido nucleico, sequência de ácido nucleico, oligonucleotídeo, sequência de oligonucleotídeo, sequência nucleotídica, polinucleotídeo e sequência polinucleotídica são usados de forma intercambiável e referem-se à forma polimérica de ribonucleosídeos (adenosina, guanosina, uridina ou citidina; moléculas de RNA) ou desoxirribonucleosídeos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina ou desoxicitidina; moléculas de DNA) ou quaisquer análogos de fosfoéster, tal como fosforotioatos e tioésteres, tanto na forma de fita simples quanto em uma hélice de fita dupla. DNA-DNA de fita dupla, hélices de DNA-RNA e RNA-RNA são possíveis. O termo molécula de ácido nucleico e, em particular, molécula de DNA ou RNA, referese apenas à estrutura primária e secundária da molécula e não limita a nenhuma forma terciária específica. Assim, este termo inclui DNA de fita dupla encontrado, entre outros, em moléculas de DNA linear ou circular (por exemplo, fragmentos de restrição), plasmídeos, DNA superenrolado e cromossomos. Ao discutir a estrutura de moléculas de DNA de fita dupla específicas, as sequências podem ser descritas neste documento de acordo com a convenção normal de fornecer apenas a sequência no sentido de 5' a 3' ao longo da fita não transcrita de DNA (ou seja, a fita com uma sequência homóloga ao mRNA).

[087]Como usado neste documento, uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA que foi submetida a uma manipulação biológica molecular. O DNA inclui, sem limitação, cDNA, DNA genômico, DNA de plasmídeo, DNA sintético e DNA semissintético.

[088]Como usado neste documento, o termo fragmento usado em associação a uma sequência polinucleotídica (por exemplo fragmento polinucleotídico) refere-se a uma sequência nucleotídica de comprimento reduzido em relação ao ácido nucleico de referência e que compreende, sobre a porção comum, uma sequência nucleotídica idêntica ao ácido nucleico de referência. Tal

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22/127 fragmento de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser, se apropriado, incluído em um polinucleotídeo maior do qual é um constituinte. Tais fragmentos compreendem, ou consistem, alternativamente em polinucleotídeos que variam em comprimento de pelo menos 6, 8, 9,10,12,15,18, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51,54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000 ou 1500 nucleotídeos consecutivos de um ácido nucleico de acordo com a invenção.

[089]Como usado neste documento, o termo quimérico significa constituído por fragmentos que não são contíguos em seu estado natural. Por exemplo, um polinucleotídeo quimérico se refere a um polinucleotídeo que compreende fragmentos que não são contíguos em seu estado natural.

[090]Como usado neste documento, o termo sintético usado em associação a uma sequência polinucleotídica é um polinucleotídeo não natural (ou porção de um polinucleotídeo) que difere de uma sequência polinucleotídica do tipo selvagem. Por exemplo, um gene sintético (ou porção de um gene) pode conter uma ou mais sequências de ácidos nucleicos não contíguos na natureza (sequências quiméricas) e/ou podem abranger substituições, inserções e deleções e suas combinações.

[091]Conforme usado neste documento, gene refere-se a um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos que codificam uma molécula funcional (por exemplo, um polipeptídeo ou RNA) e inclui cDNA ou ácidos nucleicos de DNA genômico. Entende-se geralmente que o DNA genômico que codifica para um polipeptídeo ou RNA inclui regiões não codificantes (ou seja introns) que são divididos a partir de mRNA maduro e, portanto, não estão presentes no cDNA que codifica para o mesmo polipeptídeo ou RNA. Gene pode compreender um fragmento de ácido nucleico que expressa um RNA, proteína ou polipeptídeo específico. O gene pode compreender ainda sequências reguladoras precedem (sequências não codificantes 5') e sucedem (sequências não codificantes 3') a sequência codificante. O gene

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23/127 também pode compreender oligonucleotídeos de formação de triplex (TFos). “Gene nativo” refere-se a um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. Gene quimérico ou gene recombinante refere-se a qualquer gene que não seja um gene nativo, compreendendo sequências reguladoras e/ou codificantes que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências codificantes que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente da encontrada na natureza. Um gene quimérico pode compreender sequências codificantes derivadas de fontes diferentes e/ou sequências reguladoras derivadas de fontes diferentes. Gene endógeno refere-se a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo.

[092]Um gene estranho ou gene exógeno ou heterólogo ou transgene refere-se a um gene não encontrado normalmente na célula ou organismo hospedeiro, mas que é introduzido na célula ou organismo hospedeiro por transferência gênica. Os transgenes podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos ou sintéticos. Um transgene também pode ser uma versão de cDNA de um gene endógeno. Um gene do transgene também pode ser uma versão não mutante de um gene mutante endógeno ou uma versão mutante de um gene não mutante endógeno. Um gene do transgene também pode ser um gene terapêutico ou um gene experimental como um repórter. Um transgene pode ser introduzido diretamente nas células alvo de um organismo hospedeiro, ou indiretamente introduzido pela transferência de células transformadas, por exemplo células autólogas, no organismo hospedeiro.

[093]Conforme usado neste documento, a região não traduzida 5' ou

5'UTR de um gene deve ser entendida como aquela parte de um gene que é transcrita em um transcrito de RNA primário (pré-mRNA) e cuja parte está localizada

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24/127 a montante da sequência codificante. O transcrito primário é o produto de RNA inicial, contendo introns e éxons, produzidos pela transcrição de DNA. Muitos transcritos primários devem ser submetidos ao processamento de RNA para formar as espécies de RNA fisiologicamente ativas. O processamento em um mRNA maduro pode compreender aparamento das extremidades, remoção de introns, capeamento e/ou corte de moléculas de rRNA individuais de seus RNAs precursores. A 5'UTR de um mRNA é, portanto, aquela parte do mRNA que não é traduzida em proteína e que está localizada a montante da sequência codificante. Em uma sequência genômica, a 5'UTR é tipicamente definida como a região entre o sítio de iniciação de transcrição e o códon de iniciação. As regiões não traduzidas 5' (5'UTRs) de mRNAs de vertebrados podem ser algumas dezenas de bases a várias centenas de bases de comprimento (Crowe et al., 2006 BMC Genomics 7:16). Uma 5'UTR sintética é uma 5'UTR não natural que difere de uma sequência polinucleotídica de 5'UTR do tipo selvagem. Uma 5'UTR sintética pode conter uma ou mais sequências de ácidos nucleicos não contíguas na natureza (sequências quiméricas) e/ou pode abranger substituições, inserções e deleções e suas combinações.

[094]Como usado neste documento, uma união de splice íntron-éxon ou sítio de splice são regiões nos limites de um íntron em pré-mRNAs eucarióticos reconhecidos pelo aparelho de splicing de célula onde dois éxons vizinhos são unidos e o íntron é deletado. Os sítios de splice são representados por sequências conservadas nos limites de íntron/éxon 5' e 3'. Para a grande maioria dos introns, as sequências mais conservadas são GU flanqueando a extremidade 5' do íntron e AG flanqueando na extremidade 3'. No entanto, exceções a essas sequências consenso também são conhecidas como introns com sítios de splice AU-AC. O sítio de splice 5' em um limite de íntron-éxon é conhecido como um sítio doador de splice. O sítio de splice 3' em um limite de íntron-éxon é conhecido como um sítio “receptor de splice”. Um spliceossoma é um grande complexo de ribonucleoproteína que serve como o

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25/127 aparelho de splicing da célula. O spliceossoma é composto de pequenas subunidades de ribonucleoproteínas nuclear (snRNP) que se montam em um substrato pré-mRNA. Os snRNPs são eles mesmos compostos de RNAs pequenos nucleares (snRNAs) e várias subunidades de proteína. Durante a reação de splicing, o reconhecimento dos sítios de splice dentro do pré-mRNA é realizado através de pareamento de bases com snRNAs.

[095]Conforme usado neste documento, DNA heterólogo refere-se ao DNA não naturalmente localizado na célula, ou em um sítio cromossômico da célula. Portanto, o DNA heterólogo inclui um gene estranho à célula. O DNA heterólogo também pode incluir um gene naturalmente existente na célula, mas localizado em um local não nativo. Além disso, uma molécula de DNA heterólogo pode ser uma molécula de DNA contendo um segmento de DNA não hospedeiro, operacionalmente ligado a um segmento de DNA hospedeiro, por exemplo, um promotor de transcrição. Por outro lado, uma molécula de DNA heterólogo pode compreender um gene endógeno operacionalmente ligado a um promotor exógeno. Além disso, heterólogo pode se referir a uma molécula ou fragmento de DNA que é derivado de um gene que não compartilha uma origem evolutiva comum com uma molécula ou fragmento de DNA de referência.

[096]Como usado neste documento, o termo “genoma” inclui o DNA ou RNA cromossômico, bem como mitocondrial, de cloroplasto e viral.

[097]Como usado neste documento, o termo sonda refere-se a uma molécula de ácido nucleico de fita simples que pode fazer par de base com um ácido nucleico alvo de fita simples complementar para formar uma molécula de fita dupla.

[098]Como usado neste documento, uma sequência codificante de DNA refere-se a uma sequência de DNA de fita dupla que codifica um polipeptídeo e pode ser transcrita e traduzida em um polipeptídeo em uma célula in vitro ou in vivo ou fora de uma célula, por exemplo, em um tubo, quando colocada sob controle de

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26/127 sequências reguladoras apropriadas. Sequências reguladoras adequadas refere-se a sequências nucleotídicas localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma sequência codificante e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência codificante associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de tradução, introns, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítio de processamento de RNA, sítio de ligação a efetor e estrutura em haste-alça. Os limites da sequência codificante são determinados por um códon de iniciação no terminal 5' (amino) e um códon de parada de tradução no terminal 3' (carboxil). Uma sequência codificante pode incluir, sem limitação, sequências procarióticas, eucarióticas ou quiméricas, cDNA de mRNA, sequências de DNA genômico e mesmo sequências de DNA sintético.

[099]Como usado neste documento, quadro de leitura aberto é abreviado como ORF e refere-se a um comprimento de sequência de ácido nucleico, DNA, cDNA ou RNA, que compreende um sinal de iniciação de tradução ou códon de iniciação, tal como um ATG ou AUG, e um códon de terminação e pode ser potencialmente traduzido em uma sequência polipeptídica.

[0100]Como usado neste documento, o termo a jusante refere-se a uma sequência nucleotídica que está localizada em 3' para uma sequência nucleotídica de referência. Em particular, sequências nucleotídicas a jusante geralmente se relacionam a sequências que seguem o ponto de iniciação da transcrição. Por exemplo, o códon de iniciação de tradução de um gene está localizado a jusante do sítio de iniciação da transcrição. O termo a montante refere-se a uma sequência nucleotídica que está localizada em 5' para uma sequência nucleotídica de referência. Em particular, sequências nucleotídicas a montante geralmente se relacionam a sequências que estão localizadas no lado 5' de uma sequência codificante ou ponto de iniciação da transcrição. Por exemplo, a maioria dos promotores está localizada a

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27/127 montante do sítio de iniciação da transcrição.

[0101]Como usado neste documento, o termo quimicamente sintetizado, relacionado a uma sequência de DNA, significa que os nucleotídeos do componente foram montados in vitro. A síntese química manual do DNA pode ser realizada usando procedimentos bem estabelecidos, ou a síntese química automatizada pode ser realizada usando uma dentre várias máquinas comercialmente disponíveis. Consequentemente, os genes podem ser adaptados para expressão de gene ideal com base na otimização da sequência nucleotídica para refletir o viés de códon da célula hospedeira. Aqueles versados na técnica apreciam a probabilidade de expressão de gene bem-sucedida se o uso do códon for inclinado para aqueles códons favorecidos pelo hospedeiro. A determinação de códons preferenciais pode se basear em uma pesquisa de genes derivados da célula hospedeira onde as informações de sequência estão disponíveis.

[0102]Conforme usado neste documento, os termos “endonuclease de restrição” e “enzima de restrição” são usados de forma intercambiável e referem-se a uma enzima que se liga e corta dentro de uma sequência nucleotídica específica dentro do DNA de fita dupla.

[0103]Conforme usado neste documento, os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são usados de forma intercambiável e referem-se a um composto polimérico composto de resíduos de aminoácidos ligados covalentemente.

[0104]Conforme usado neste documento, reação em cadeia da polimerase é abreviado como PCR e refere-se a um método in vitro para amplificar enzimaticamente sequências específicas de ácidos nucleicos. A PCR envolve uma série repetitiva de ciclos de temperatura com cada ciclo compreendendo três estágios: desnaturação do modelo de ácido nucleico para separar as fitas da molécula alvo, anelamento do primer de um oligonucleotídeo de PCR de fita simples para o modelo de ácido nucleico e extensão dos primers anelados pela DNA polimerase.

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28/127 [0105]Como usado neste documento, o termo homologia refere-se à porcentagem de identidade entre duas frações de polinucleotídeo ou polipeptídeo. A correspondência entre a sequência de uma fração com a outra pode ser determinada por técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a homologia pode ser determinada por uma comparação direta das informações de sequência entre duas moléculas de polipeptídeo, alinhando as informações de sequência e usando programas de computador prontamente disponíveis. Alternativamente, a homologia pode ser determinada pela hibridização de polinucleotídeos em condições que formam duplexes estáveis entre regiões homólogas, seguida pela digestão com nucleases específicas de fita simples e determinação de tamanho dos fragmentos digeridos. Como usado neste documento, o termo homólogo, em todas as suas formas gramaticais e variações de ortografia, refere-se à relação entre proteínas que têm uma origem evolutiva comum, incluindo proteínas de superfamílias (por exemplo, a superfamília de imunoglobulina) e proteínas homólogas de diferentes espécies (por exemplo, cadeia leve de miosina, etc.) (Reeck et al., (1987) Cell 50:667). Tais proteínas (e seus genes codificantes) têm homologia de sequência, conforme refletido pelo seu alto grau de similaridade sequencial. No entanto, em uso comum e no presente pedido, o termo homólogo, quando modificado com um advérbio, tal como altamente, pode se referir à similaridade de sequência e não a uma origem evolutiva comum.

[0106]Consequentemente, o termo similaridade de sequência, em todas as suas formas gramaticais, refere-se ao grau de identidade ou correspondência entre sequências de ácido nucleico ou de aminoácidos de proteínas que podem ou não compartilhar uma origem evolutiva comum (vide Reeck et al., (1987)Ce//50:667). Em uma modalidade, duas sequências de DNA são substancialmente homólogas ou substancialmente similares quando pelo menos cerca de 21% (preferencialmente pelo menos cerca de 50% e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 75%, 90%,

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95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%) dos nucleotídeos correspondem ao longo do comprimento definido das sequências de DNA. As sequências que são substancialmente homólogas podem ser identificadas comparando as sequências que usam software padrão disponível em bancos de dados de sequência, ou em um experimento de hibridação Southern, por exemplo, em condições rigorosas, conforme definido para aquele sistema específico. A definição das condições de hibridização apropriadas está de acordo com a técnica (vide por exemplo, Sambrook et al., 1989, infra).

[0107]Como usado neste documento, substancialmente similar refere-se a fragmentos de ácido nucleico em que alterações em uma ou mais bases nucleotídicas resultam na substituição de um ou mais aminoácidos, mas não afetam as propriedades funcionais da proteína codificada pela sequência de DNA. Substancialmente similar refere-se também a fragmentos de ácido nucleico, em que alterações em uma ou mais bases nucleotídicas não afetam a capacidade do fragmento de ácido nucleico de mediar a alteração da expressão gênica por tecnologia antisense ou de cossupressão. Substancialmente similar refere-se também a modificações dos fragmentos de ácido nucleico da presente invenção, tais como deleção ou inserção de uma ou mais bases nucleotídicas que não afetam substancialmente as propriedades funcionais do transcrito resultante. Entende-se, portanto, que a invenção engloba mais do que as sequências exemplificativas específicas. Cada uma das modificações propostas está de acordo com a técnica rotineira, assim como a determinação da retenção da atividade biológica dos produtos codificados.

[0108]Além disso, aqueles versados na técnica reconhecem que sequências substancialmente similares abrangidas por esta invenção também são definidas por sua capacidade de hibridizar, em condições rigorosas. Uma molécula de ácido nucleico é hibridizável em outra molécula de ácido nucleico, tal como cDNA, DNA

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30/127 genômico ou RNA, quando uma forma de fita simples da molécula de ácido nucleico pode anelar em outra molécula de ácido nucleico em condições apropriadas de temperatura e força iônica de solução (vide Sambrook etal., 1989 infra). As condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), especialmente Capítulo 11 e Tabela 11.1. As condições de temperatura e força iônica determinam a rigorosidade da hibridização.

[0109]As condições de rigorosidade podem ser ajustadas para triar fragmentos moderadamente similares, tais como sequências homólogas de organismos distantemente relacionados, até fragmentos altamente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos intimamente relacionados. Para triagem preliminar para ácidos nucleicos homólogos, condições de hibridização de baixa rigorosidade, correspondendo a Tm de 55°C, podem ser usadas, por exemplo, 5XSSC, 0,1% SDS, 0,25% de leite e sem formamida; ou 30% de formamida, 5XSSC, 0,5% SDS. Condições de hibridização de rigorosidade moderada correspondem a Tm mais elevada, por exemplo, 40% de formamida, com 5X ou 6XSSC. Condições de hibridização de alta rigorosidade correspondem a maior Tm , por exemplo, 50% de formamida, 5X ou 6X SSC.

[0110]A hibridização requer que os dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, embora sejam possíveis incompatibilidades entre bases dependendo da rigorosidade da hibridização. O termo complementar é usado para descrever a relação entre as bases nucleotídicas que são capazes de hibridizar em outra. Por exemplo, em relação ao DNA, adenosina é complementar à timina e citosina é complementar à guanina. Consequentemente, a invenção instantânea também inclui fragmentos de ácidos nucleicos isolados que são complementares às sequências completas, conforme divulgadas ou usadas neste documento, bem como aquelas

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31/127 sequências de ácidos nucleicos substancialmente similares.

[0111]Em uma modalidade, os polinucleotídeos são detectados pelo emprego de condições de hibridização compreendendo uma etapa de hibridização em Tm de 55°C e utilizando as condições estabelecidas acima. Em outra modalidade, Tm é 60°C; em determinadas modalidades, Tm é 63°C ou 65°C.

[0112]As lavagens posteriores à hibridização determinam também as condições de rigorosidade. Um conjunto de condições preferenciais usa uma série de lavagens começando com 6XSSC, SDS a 0,5% em temperatura ambiente por 15 minutos (min) e, então, repetido com 2XSSC, SDS a 0,5% a 45°C por 30 minutos e, em seguida, repetido duas vezes com 0,2XSSC, SDS a 0,5% a 50°C por 30 minutos. Outro exemplo de condições rigorosas usa temperaturas mais elevadas em que as lavagens são idênticas àquelas acima, exceto para a temperatura das duas lavagens finais de 30 minutos finais em 0,2XSSC, SDS a 0,5% que aumentou para 60°C. Ainda em outro exemplo de condições altamente rigorosas usa duas lavagens finais em 0,1XSSC, SDS a 0,1% a 65°C. A hibridização requer que os dois ácidos nucleicos compreendam sequências complementares, embora sejam possíveis incompatibilidades entre as bases, dependendo da rigorosidade das sequências.

[0113]A rigorosidade apropriada para hibridizar ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas sequências nucleotídicas, maior será o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos com essas sequências. A estabilidade relativa (correspondente a Tm elevada) de hibridizações de ácidos nucleicos diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos com mais de 100 nucleotídeos de comprimento, as equações para calcular Tm foram derivadas (vide Sambrook et al., supra, 9,50-0,51). Para hibridização com ácidos nucleicos mais curtos, ou seja, oligonucleotídeos, a posição das incompatibilidades se torna mais importante e o comprimento do oligonucleotídeo

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32/127 determina sua especificidade (vide Sambrook et a!., supra, 11,7-11,8).

[0114]Em uma modalidade, os polinucleotídeos são detectados pelo empregado de condições de hibridização que compreendem uma etapa de hibridização em menos de 500 mM de sal e pelo menos 37°C, e uma etapa de lavagem em 2XSSPE em uma temperatura de pelo menos 63°C. Em outra modalidade, as condições de hibridização compreendem menos de 200 mM de sal e pelo menos 37°C para a etapa de hibridização. Em certas modalidades, as condições de hibridização compreendem 2XSSPE e 63°C para as etapas de hibridização e lavagem.

[0115]O comprimento para um ácido nucleico hibridizável é, por exemplo, pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável pode ser pelo menos cerca de 15 nucleotídeos; pelo menos cerca de 20 nucleotídeos; ou pelo menos 30 nucleotídeos. Além disso, aqueles versados na técnica reconhecerão que a temperatura e a concentração de sal da solução de lavagem podem ser ajustadas conforme necessário, de acordo com fatores como o comprimento da sonda.

[0116]Fragmentos de ácidos nucleicos substancialmente similares da presente invenção são aqueles fragmentos de ácido nucleico cujas sequências de DNA são pelo menos 70% idênticas à sequência de DNA dos fragmentos de ácido nucleico relatados neste documento. Os fragmentos de ácido nucleico da presente invenção incluem aqueles fragmentos de ácido nucleico cujas sequências de DNA são pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idênticas à sequência de DNA dos fragmentos de ácidos nucleicos relatados neste documento.

[0117]Conforme usado neste documento, o termo correspondente a é usado neste documento para se referir a sequências similares ou homólogas, se a posição exata for idêntica ou diferente da molécula em relação à qual a similaridade ou homologia é medida. Um alinhamento de sequência de ácido nucleico ou aminoácido pode incluir espaços. Assim, o termo correspondente a refere-se à similaridade de

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33/127 sequência e não à numeração dos resíduos de aminoácidos ou bases de nucleotídeos.

[0118]Como usado neste documento, uma porção substancial de uma sequência de aminoácido ou nucleotídeo compreende o suficiente da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou da sequência nucleotídica de um gene para identificar, de forma putativa, esse polipeptídeo ou gene, seja por avaliação manual da sequência por um versado na técnica, ou pela comparação e identificação de sequência automatizada por computador, usando algoritmos tais como BLAST (Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 410 (1993)); BLAST está publicamente disponível na Rede Mundial de Computadores. Em geral, é necessária uma sequência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou trinta ou mais nucleotídeos para identificar, de forma putativa, uma sequência de ou de ácido nucleico como homóloga a uma proteína ou gene conhecido. Além disso, em relação às sequências nucleotídicas, sondas de oligonucleotídeo específicas do gene que compreendem 20 a 30 nucleotídeos contíguos podem ser usadas em métodos dependentes de sequência de identificação gênica (por exemplo, hibridização Southern) e isolamento (por exemplo, hibridização in situ de colônias de bactérias ou placas de bacteriófago). Além disso, oligonucleotídeos curtos de 12 a 15 bases podem ser usados como primers de amplificação em PCR com o intuito de obter um fragmento de ácido nucleico específico que compreende os primers. Consequentemente, uma porção substancial de uma sequência nucleotídica compreende o suficiente da sequência para identificar e/ou isolar especificamente um fragmento de ácido nucleico que compreende a sequência.

[0119]Como usado neste documento, o termo porcentagem de similaridade, conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, conforme determinado pela comparação

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34/127 das sequências. Na técnica, identidade também se refere ao grau de relação sequencial entre sequências polipeptídicas ou polinucleotídicas, conforme for o caso, conforme determinado pela correspondência entre cadeias de tais sequências. Identidade e similaridade podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, sem limitação, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, Nova York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, Nova York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, Nova Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, Nova York (1991). Métodos para determinar a identidade são concebidos para dar a melhor correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os alinhamentos de sequência e cálculos da porcentagem de identidade podem ser realizados usando o programa Megalign do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl). O alinhamento múltiplo das sequências pode ser realizado usando o método de alinhamento Clustal (Higgins et a!., CABIOS. 5:151 153 (1989)) com os parâmetros padrão (PENALIDADE PARA GAP = IO, PENALIDADE PARA COMPRIMENTO DE GAP=IO). Os parâmetros padrão para alinhamentos por pares usando o método Clustal podem ser selecionados: KTUPLE 1, PENALIDADE PARA GAP=3, JANELA=5 e DIAGONAIS SALVAS=5.

[0120]Como usado neste documento, o termo software de análise de sequência refere-se a qualquer algoritmo de computador ou programa de software que seja útil para a análise de sequências de nucleotídeos ou aminoácidos. O software de análise de sequência pode estar comercialmente disponível ou ser desenvolvido de forma independente. O software de análise de sequência típico

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35/127 incluirá, sem limitação, o pacote de programas GCG (Wisconsin Package Versão 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wl), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul etal., J. Mol. Biol. 215:403 410 (1990)), e DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St., Madison, Wl 53715 EUA). De acordo com o contexto deste pedido, será entendido que onde o software de análise de sequência é usado para análise, que os resultados da análise irão se basear nos valores padrão do programa referenciado, salvo especificado em contrário. Como usado neste documento, valores padrão significam qualquer conjunto de valores ou parâmetros que carrega originalmente com o software quando inicializado primeiro.

[0121]Conforme usado neste documento, os termos expressão ou expressão gênica referem-se ao processo de conversão de informações genéticas codificadas em um gene em RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA ou snRNA) por meio da “transcrição” do gene (ou seja, através da ação enzimática de uma RNA polimerase) e para os genes que codificam proteínas, em proteína através da “tradução” de mRNA. A expressão gênica pode ser regulada em muitos estágios no processo. Regulação positiva ou ativação refere-se à regulação que aumenta a produção de produtos de expressão gênica (ou seja, RNA ou proteína), enquanto que regulação negativa ou repressão refere-se à regulação que diminui a produção. Fatores (por exemplo, fatores de transcrição) que estão envolvidos na regulação positiva ou na regulação negativa são frequentemente chamados de ativadores e repressores, respectivamente. Para fins da invenção, um gene alvo pode ser regulado negativamente de maneira pós-transcricional (ou seja no nível do transcrito de RNA) através de interação específica com uma molécula de RNA de regulação negativa.

[0122]Como usado neste documento, o termo sequências de controle transcricional e translacional refere-se a sequências reguladoras de DNA, tais como promotores, potencializadores, terminadores e similares, que fornecem a expressão

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36/127 de uma sequência codificante em uma célula hospedeira.

[0123]O termo baseado em receptor de ecdisona, a respeito de um switch de gene, refere-se a um switch de gene que compreende pelo menos uma parte funcional de um domínio de ligação ao ligante do receptor de ecdisona de ocorrência natural ou sintético e que regula a expressão gênica em resposta a um ligante que se liga ao domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona. Exemplos de sistemas responsivos à ecdisona são descritos nas Patentes U.S. n. 7,091,038 e 6,258,603. Em uma modalidade, o sistema é o RHEOSWITCH THERAPEUTIC SYSTEM® (RTS®), que contém duas proteínas de fusão, os domínios DEF de um receptor de ecdisona mutagenizado (EcR) fundido com um domínio de ligação de DNA de Gal4 e os domínios EF de um RXR quimérico fundido com um domínio de ativação de transcrição VP16, expresso sob um promotor constitutivo.

[0124]Como usado neste documento, o termo operacionalmente ligado refere-se à associação de sequências de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificante quando é capaz de afetar a expressão dessa sequência codificante (ou seja, que a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). Sequências codificantes podem estar operacionalmente ligadas às sequências reguladoras em orientação sense ou antisense.

[0125]Como usado neste documento, vetor refere-se a qualquer veículo para a clonagem e/ou transferência de um ácido nucleico para uma célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicon ao qual outro segmento de DNA pode ser fixado a fim de provocar a replicação do segmento fixado. Um replicon refere-se a qualquer elemento genético (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo, vírus) que funciona como uma unidade autônoma de replicação de DNA In vivo, ou seja, capaz de replicação sob seu próprio controle. O termo vetor inclui ambos os veículos virais

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37/127 e não virais para introduzir o ácido nucleico em uma célula hospedeira in vitro, ex vivo ou in vivo. O termo vetor também pode incluir DNAs minicirculares. Por exemplo, o vetor pode ser um plasmídeo sem sequências de DNA bacteriano. A remoção de sequências de DNA bacteriano que são enriquecidas em regiões CpG mostrou diminuir o silenciamento da expressão do transgene e resultar em expressão mais persistente dos vetores de DNA do plasmídeo (vide por exemplo, Ehrhardt, A.eí al. (2003)Ht/m. Gene Ther. 10: 215-25; Yet, N. S. (2002)Mo/. Ther. 5: 731-38; Chen, Z. Y.eí al. (2004)Gene Ther. 11: 856-64). O termo vetor também pode incluir transposons, tais como Bela Adormecida (Izsvak) et al. (2000) J. Mol. Biol. 302:93102), ou cromossomos artificiais.

[0126]Um grande número de vetores conhecidos na técnica pode ser usado para manipular ácidos nucleicos, incorporar elementos de resposta e promotores em genes, etc., ou transferir um ácido nucleico para uma célula hospedeira. Os vetores possíveis incluem, por exemplo, plasmídeos ou vírus modificados, incluindo, por exemplo, bacteriófagos tais como derivados lambda, ou plasmídeos tais como derivados de plasmídeo pBR322 ou pUC, ou vetor Bluescript. Vetores maiores, tais como cromossomos artificiais (bactérias (BAC), leveduras (YAC), ou humano (HAC)) podem ser usados para acomodar inserções maiores. Por exemplo, a inserção dos fragmentos de DNA correspondentes aos elementos de resposta ou promotores em um vetor adequado pode ser realizada pela ligação dos fragmentos de DNA apropriados em um vetor escolhido que tem terminal coesivo complementar. Alternativamente, as extremidades das moléculas de DNA podem ser modificadas enzimaticamente ou qualquer sítio pode ser produzido pela ligação de sequências nucleotídicas (peptídeos de ligação) no terminal de DNA. Tais vetores podem ser manipulados para conter genes de marcador selecionável que proporcionam a seleção de células transfectadas ou transformadas no vetor. Um vetor recombinante que compreende um polinucleotídeo de acordo com a invenção pode incluir uma ou

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38/127 mais origens para replicação nos hospedeiros celulares nos quais sua amplificação ou expressão é procurada, marcadores ou marcadores selecionáveis.

[0127]Como usado neste documento, o termo marcador selecionável referese a um fator de identificação, geralmente um gene de resistência química ou antibiótica, que é capaz de ser selecionado com base no efeito do gene do marcador, ou seja, resistência a um antibiótico, resistência a um herbicida, marcadores colorimétricos, enzimas, marcadores fluorescentes e similares, em que o efeito é usado para rastrear a herança de um ácido nucleico de interesse e/ou identificar ou selecionar uma célula ou organismo que herdou o ácido nucleico de interesse. Exemplos de genes marcadores selecionáveis conhecidos e usados na técnica incluem: genes que fornecem resistência à ampicilina, estreptomicina, gentamicina, canamicina, higromicina, herbicida de bialafos, sulfonamida e similares; e genes que são usados como marcadores fenotípicos, ou seja, genes reguladores de antocianina, gene da isopentanil transferase e similares.

[0128]Como usado neste documento, o termo gene repórter refere-se a um ácido nucleico que codifica um fator de identificação que é capaz de ser identificado com base no efeito do gene repórter, em que o efeito é usado para rastrear a herança de um ácido nucleico de interesse, para identificar uma célula ou organismo que herdou o ácido nucleico de interesse e/ou medir a indução ou transcrição da expressão gênica. Exemplos de genes repórter conhecidos e usados na técnica incluem: luciferase (Luc), proteínas fluorescentes, tais como proteína verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), beta-galactosidase (LacZ), beta-glucuronidase (Gus) e similares. Genes de marcadores selecionáveis também podem ser considerados genes repórter.

[0129]Como usado neste documento, o termo plasmídeo refere-se a um elemento extracromossômico que porta, frequentemente, um gene que não faz parte do metabolismo central da célula e, geralmente, na forma de moléculas de DNA de

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39/127 fita dupla circular. Tais elementos podem ser sequências de replicação autonômica, sequências integradoras de genoma, sequências de fago ou nucleotídeos, lineares, circulares ou superenroladas de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivado de qualquer fonte, em que um número de sequências nucleotídicas foi unido ou recombinado em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto gênico selecionado juntamente com a sequência não traduzida 3' apropriada em uma célula.

[0130]Como usado neste documento, um vetor de clonagem refere-se a um replicon, que é um comprimento de unidade de um ácido nucleico, por exemplo, DNA, que replica sequencialmente e que compreende uma origem de replicação, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual outro segmento de ácido nucleico pode ser fixado a fim de provocar replicação do segmento fixado. Vetores de clonagem podem ser capazes de replicação em um tipo de célula e expressão em outro (vetor de transporte). O termo vetor de expressão refere-se a um vetor, plasmídeo ou veículo concebido para permitir a expressão de uma sequência de ácido nucleico inserida após transformação em uma célula hospedeira. O gene clonado, ou seja, a sequência de ácido nucleico inserida, é geralmente colocada sob controle de elementos de controle, tais como um promotor, um promotor mínimo, um potencializador ou similares. As regiões ou promotores de controle de iniciação, que são úteis para conduzir a expressão de um ácido nucleico na célula hospedeira, são numerosas e familiares aos versados na técnica.

[0131]Exemplos de vetores eucarióticos incluem, sem limitação, pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI e pSG disponibilizados pela Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponibilizados pela Amersham Pharmacia Biotech; e pCMVDsRed2express, plRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, pCMV-EGFP disponibilizados pela Clontech. Muitos outros vetores são bem conhecidos e comercialmente disponíveis.

[0132]Por exemplo, vetores úteis, que compreendem pivôs de inserção

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40/127 molecular para inserção rápida e remoção de elementos de programas gênicos, são descritos no Pedido de Patente Publicado U.S. n. 2004/0185556, Pedido de Patente U.S. n. 11/233,246 e Pedido Publicado Internacional n. WO 2005/040336 e WO 2005/116231.

[0133]Conforme usado neste documento, os termos promotor e sequências promotoras são usados permutavelmente e referem-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificante ou RNA funcional. Em geral, uma sequência codificante está localizada em 3' para uma sequência promotora. Promotores podem ser derivados, em sua totalidade, de um gene nativo, ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreendem segmentos sintéticos de DNA. Entende-se por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas.

[0134]Promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos de células, na maioria das vezes, são comumente denominados promotores constitutivos. Promotores que fazem com que um gene seja expresso em um tipo de célula específica são comumente denominados promotores condicionais. Exemplos não limitantes de promotores condicionais são promotores célula-específicos ou promotores tecido-específicos. Promotores que fazem com que um gene seja expresso em um estágio específico de desenvolvimento ou diferenciação celular são comumente denominados promotores específicos para desenvolvimento ou promotores específicos de diferenciação celular. Promotores que são induzidos e fazem com que um gene seja expresso após exposição ou tratamento da célula com um agente, molécula biológica, substância química, ligante, luz ou similares que induz o promotor são comumente denominados promotores induzíveis ou promotores

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41/127 reguláveis. Exemplos não limitantes de promotores induzíveis são um promotor induzível TetO, promotor de proteína de choque térmico, promotor de metalotioneína, promotor de hormônio de crescimento e promotor de MMTV-LTR. Reconhece-se ainda que, como na maioria dos casos, os limites exatos das sequências reguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de comprimentos diferentes podem ter atividade promotora idêntica.

[0135]A sequência promotora é tipicamente delimitada em seu terminal 3' pelo sítio iniciação da transcrição e estende-se a montante (sentido 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima da referência. Dentro da sequência promotora será encontrado um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido, por exemplo, pelo mapeamento com nuclease S1), bem como domínios de ligação a proteínas (sequências consenso) responsáveis pela ligação de RNA polimerase.

[0136]Uma sequência codificante está sob o controle de sequências de controle transcricional e translacional em uma célula quando a RNA polimerase transcreve a sequência codificante em mRNA, que é então trans-RNA com splice (se a sequência codificante contiver introns) e traduzida na proteína codificada pela sequência codificante.

[0137]Regiões de controle de terminação, ou seja, sequências de terminador ou poliadenilação, também podem ser derivadas de vários genes nativos para hospedeiros preferenciais. Opcionalmente, um sítio de terminação pode ser desnecessário, no entanto, pode ser incluído. Em uma modalidade da invenção, a região de controle de terminação pode ser compreendida ou derivada de uma sequência sintética, sinal de poliadenilação sintética, um sinal de poliadenilação tardio de SV40, um sinal de poliadenilação de SV40, um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (BGH), sequências de terminador viral ou similares.

[0138]Como usado neste documento, o termo transfecção refere-se à

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42/127 absorção de RNA ou DNA exógeno ou heterólogo por uma célula. Uma célula foi transfectada por RNA ou DNA exógeno ou heterólogo quando tal RNA ou DNA foi introduzido dentro da célula. O RNA ou DNA transfectado pode ser integrado (ligado covalentemente) ao DNA cromossômico que compõe o genoma da célula hospedeira. Transformação refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o genoma de um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável.

[0139]Como usado neste documento, os termos modular e modula se referem a induzir, reduzir ou inibir a expressão de ácido nucleico ou gênica, resultando na respectiva indução, redução ou inibição da produção de proteína ou polipeptídeo.

[0140]Como usado neste documento, transcrito de RNA refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada por RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia complementar perfeita da sequência de DNA, é denominado transcrito primário ou pode ser uma sequência de RNA derivada do processamento pós-transcricional do transcrito primário e é denominado RNA maduro. RNA mensageiro (mRNA) refere-se ao RNA sem introns e que pode ser traduzido em proteína pela célula. cDNA refere-se a um DNA de fita dupla que é complementar e derivado do mRNA. RNA sense refere-se ao transcrito de RNA que inclui o mRNA e, assim, pode ser traduzido em proteína pela célula.

[0141]As sequências de volume (“stuffer sequence”) constituídas por polinucleotídeos não codificantes que variam de 1001 a 3000 bp para garantir o tamanho ideal do empacotamento do genoma para AAV, podem ser incorporadas aos vetores virais da invenção.

[0142]A invenção fornece polinucleotídeos que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína frataxina. Como usado neste documento, uma proteína frataxina refere-se a um polipeptídeo que tem a atividade biológica de frataxina e tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à sequência de frataxina humana mostrada na SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades,

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43/127 o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Os ácidos nucleicos que codificam a proteína frataxina podem ser os mostrados em SEQ ID NO:2 ou qualquer sequência que codifica SEQ ID NO:1 que difere da SEQ ID NO:2 devido à degeneração do código genético. Ácidos nucleicos que codificam as variantes da proteína frataxina podem ser um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:1.

Moléculas de ácido nucleico

Frataxinas [0143]A ataxia de Friedreich (FRDA) está ligada a uma deficiência de frataxina (FXN), uma proteína mitocondrial envolvida na síntese do agrupamento enxofre-ferro. As proteínas frataxina que são úteis na invenção são proteínas frataxina de comprimento total, truncamentos funcionais, variantes funcionais e análogos funcionais. Por funcional entende-se que a frataxina usada na invenção retém atividade de frataxina suficiente para aliviar pelo menos um sintoma da ataxia de Friedreich. A sequência da proteína frataxina contém preferencialmente uma porção no N-terminal que direciona a proteína para translocação para a mitocôndria. Sequências de localização mitocondrial (também denominadas peptídeos de trânsito) são conhecidas na técnica. A sequência de localização de frataxina é aminoácidos 1-41 da SEQ ID NO:1. Esta sequência pode ser substituída por outros translocadores mitocondriais cujas sequências são conhecidas na técnica. A SEQ ID

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N0:1 mostra a pré-proteína frataxina para a qual os aminoácidos 1-41 constituem ο peptídeo de trânsito, os aminoácidos 42-210 constituem a pró-proteína, e os aminoácidos 56-2010 constituem a proteína madura.

[0144]Em um estudo detalhado da proteína frataxina, Faraj etal. investigou a relação estrutural-funcional da região C-terminal (CTR) ou frataxina e o efeito de alterações na estabilidade da proteína frataxina (Faraj, S.E. et al. (2014) FEBS J. 281(15):3397-3419) (incorporado por referência a este documento em sua totalidade). Faraj et al. descobriu que um certo mutante com uma mutação L198R ou um truncamento completo de 81-193 foi suficiente para causar a ataxia de Friedreich. Outros mutantes, tais como uma mutação L203C, aumentaram a estabilidade da proteína. Em outro estudo para a Tese de Mestrado da Universidade A&M do Texas (2013), Melissa Thorstad descobriu que os resíduos das folhas FXN β4 e β5 Q153, W155 e R165 foram implicados como vitais para a ligação de SDU, e resíduos N146, Q148, Q153 e W155 parecem ser essenciais para ativação de SDU. Assim, as proteínas frataxina funcionais de uso na invenção incluem aquelas que mantêm a estrutura e estabilidade do CTR de frataxina, em que um exemplo é a variante L203C. Em geral, a proteína frataxina que é útil na invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àquela da SEQ ID NO:1, desde que certos resíduos, incluindo um peptídeo de trânsito e pró-sequência (aminoácidos 42-55 da SEQ ID NO:1), e Q153, W155, R165, N146, Q148, Q153, e W155, estejam incluídos. Tais proteínas frataxina podem ser determinadas pelos versados na técnica usando os métodos de Faraj et al. e podem avaliar a estabilidade e estrutura do CTR e manter resíduos críticos, conforme descrito por Faraj e Thorstad.

Promotores [0145]Promotores, que são úteis para conduzir a expressão de um ácido nucleico na célula hospedeira desejada são numerosos e familiares aos versados na

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45/127 técnica. Praticamente qualquer promotor capaz de conduzir a expressão do polinucleotídeo que codifica a frataxina pode ser usado em um vetor de expressão, incluindo, sem limitação, promotores virais, promotores bacterianos, promotores de células animais, promotores de células de mamíferos, promotores sintéticos, promotores constitutivos, promotores tecido-específicos, promotores relacionados à patogênese ou doença, promotores específicos para desenvolvimento, promotores induzíveis e promotores regulados por luz. Os promotores de animais e de mamíferos conhecidos na técnica incluem, sem limitação, região do promotor precoce de SV40 (SV40e), o promotor contido na repetição terminal longa (LTR) 3' do vírus de sarcoma de Rous (RSV), os promotores de E1A ou genes de promotor tardio principal (MLP) de adenovirus (Ad), promotor precoce citomegalovírus (CMV), promotor da timidina quinase (TK) do vírus da herpes simplex (HSV), promotor IE1 de baculovírus, promotor do fator alongamento alfa 1 (EF1), promotor da fosfoglicerato quinase (PGK1), promotor da ubiquitina (UBC), promotor da albumina, sequências reguladoras do promotor de metalotioneína-L e regiões de controle transcricional de camundongo, promotores ubíquos (HPRT, vimentina, (x-actina, tubulina e similares), promotores de filamentos intermediários (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP e similares), promotores de genes terapêuticos (de MDR, CFTR ou de fator tipo VIII, e similares), promotores relacionados à patogênese ou doença e promotores que apresentam especificidade de tecido e foram utilizados em animais transgênicos, tais como região de controle de gene de proteína básica de mielina ativa em células de oligodendrócito no cérebro, região de controle do gene de cadeia leve 2 de miosina ativa no músculo esquelético. Além disso, essas sequências de expressão podem ser modificadas pela adição de potencializador ou sequências reguladoras e similares. Nos polinucleotídeos da invenção, o gene da frataxina está operacionalmente ligado a um promotor para conduzir a transcrição do gene da frataxina. O promotor pode ser qualquer promotor conhecido que tenha o efeito de conduzir a transcrição do gene da

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46/127 frataxina. Em certos exemplos específicos de tais promotores incluem, sem limitação, um promotor CMV, um promotor UBC, um promotor EF1a, um promotor PGK1 e um promotor de frataxina mínimo. Em modalidades específicas, o polinucleotídeo que codifica a frataxina está operacionalmente ligado a um promotor UBC, tal como, por exemplo, o mostrado na SEQ ID NO:3.

Elementos reguladores 5' [0146]No polinucleotídeo que compreende um gene da frataxina, o polinucleotídeo compreende, preferencialmente, pelo menos uma porção de uma região não traduzida 5' (5’UTR) operacionalmente ligada ao gene da frataxina em que a 5’UTR pode ser de qualquer espécie de mamífero. 5’UTRs não limitantes que poderíam ser usadas incluem a 5’UTR de um gene da frataxina humana, um gene da frataxina bovina, um gene da frataxina de camundongo, um gene da frataxina de rato, um gene da frataxina de ovelha, um gene da frataxina de macaco, um gene da frataxina de cabra, um gene da frataxina de cavalo, um gene da frataxina de porco, um gene da frataxina de camelo, um gene da frataxina de gato ou um gene da frataxina de cachorro.

[0147]Em certas modalidades, pelo menos uma porção de uma 5’UTR de nãofrataxina é usada. Exemplos de 5’UTRs de não-frataxina incluem, sem limitação, um elemento regulador 5' de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (por exemplo, SEQ ID NO:15), um elemento regulador sintético 5’ (tal como aqueles descritos na Patente U.S. n. 8,835,621, incorporada por referência a este documento em sua totalidade, incluindo 5U2 (SEQ ID NO:4)), um elemento regulador 5' de proteína ribossomal L5 60S (RPL6-5'Splice) (por exemplo, SEQ ID NO:16), e um elemento regulador 5' de cadeia pesada de Ferritina (FTH1 -5'UTR) (por exemplo, SEQ ID NO:14).

[0148]Em algumas modalidades, a 5’UTR pode ter pelo menos cerca de 25 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, a 5'UTR pode ter pelo menos

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47/127 cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 185, 190, 195, 200 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo que compreende uma 5'UTR do gene da frataxina pode representar pelo menos cerca de 50% da sequência de 5'UTR natural. Em outras modalidades, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo uma 5'UTR do gene da frataxina pode representar pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mais da sequência de 5’ UTR natural. Em outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo que compreende uma 5'UTR do gene da frataxina pode representar toda a sequência de 5' UTR natural.

Elementos reguladores 3' [0149]No polinucleotídeo que compreende um gene da frataxina, o polinucleotídeo compreende, preferencialmente, uma região reguladora 3' operacionalmente ligada ao gene da frataxina, em que a região reguladora 3' pode ser de qualquer espécie de mamífero. Em certas modalidades, o polinucleotídeo que compreende um gene de frataxina compreende adicionalmente um elemento regulador 3', tal como um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento humano (hGHpA) (por exemplo, SEQ ID NO:5), uma região de poliadenilação precoce do vírus símio 40 (SV40 precoce) (por exemplo, SEQ ID NO:8), uma região de poliadenilação tardio do vírus símio 40 (SV40 final) (por exemplo, SEQ ID NO:9) e um elemento regulador 3' sintético (tal como SEQ ID NO:7).

Vetores [0150]Vários métodos conhecidos na técnica podem ser usados para propagar um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Uma vez que um sistema hospedeiro adequado e condições de crescimento são estabelecidos, vetores de expressão recombinantes podem ser propagados e preparados em quantidade.

Conforme descrito neste documento, os vetores de expressão que podem ser usados

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48/127 incluem, sem limitação, os seguintes vetores ou seus derivados: vírus de humano ou de animal, tais como vírus vaccinia ou adenovirus; vírus de insetos, tais como baculovírus; vetores de levedura; vetores de bacteriófago (por exemplo, lambda) e vetores de DNA de plasmídeo e cosmídeo e similares.

[0151]Um grande número de vetores conhecidos na técnica pode ser usado para manipular ácidos nucleicos, incorporar elementos de resposta e promotores em genes, etc. Os vetores possíveis incluem, por exemplo, plasmídeos ou vírus modificados, incluindo, por exemplo, bacteriófagos tais como derivados lambda, ou plasmídeos tais como derivados de plasmídeo pBR322 ou pUC, ou vetor Bluescript. Outro exemplo de vetores que são úteis na invenção é o Sistema de Produção ULTRAVECTOR® (Intrexon Corp., Blacksburg, Va.) conforme descrito em WO 2007/038276. Por exemplo, a inserção dos fragmentos de DNA correspondentes aos elementos de resposta e promotores em um vetor adequado pode ser realizada pela ligação dos fragmentos de DNA apropriados em um vetor escolhido que tem terminal coesivo complementar. Alternativamente, as extremidades das moléculas de DNA podem ser modificadas enzimaticamente ou qualquer sítio pode ser produzido pela ligação de sequências nucleotídicas (peptídeos de ligação) no terminal de DNA. Esses vetores podem ser manipulados para conter genes de marcadores selecionáveis que proporcionam a seleção de células que incorporaram o marcador no genoma celular. Esses marcadores permitem a identificação e/ou seleção de células hospedeiras que incorporam e expressam as proteínas codificadas pelo marcador.

[0152]Os vetores virais e, particularmente, os vetores retrovirais, foram usados em células e animais. Vetores virais que podem ser usados incluem, sem limitação, retrovirus, vírus adeno-associado, pox, baculovírus, vaccinia, herpes simplex, Epstein-Barr, adenovirus, geminivírus e vetores de caulimovirus. Vetores não virais incluem plasmídeos, lipossomas, lipídios eletricamente carregados (citofectinas), complexos de proteína-DNA e biopolímeros. Além de um ácido nucleico,

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49/127 um vetor também pode compreender uma ou mais regiões reguladoras e/ou marcadores selecionáveis úteis na seleção, medição e monitoramento dos resultados de transferência de ácido nucleico (transferência para quais tecidos, duração da expressão, etc.).

[0153]Os vetores podem ser introduzidos nas células hospedeiras desejadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, transdução, fusão celular, dextrano DEAE, precipitação fosfato de cálcio, lipofecção (fusão de lisossoma), uso de uma pistola de genes ou um transportador de vetor de DNA (vide, por exemplo, Wu et al., (1992)J. Biol. Chem.267:963; Wu etal., (1988)J. Biol. Chem. 263:14621; e Hartmut etal., Pedido de Patente Canadense n. 2,012,311).

[0154]Um polinucleotídeo de acordo com a invenção também pode ser introduzido in vivo por lipofecção. (Feigner et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 84:7413; Mackey et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8027; e Ulmer et al. (1993) Science 259:1745; Feigner etal. (1989) Science 337:387). Vários compostos lipídicos e outras composições para transferência de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, aqueles descritos nas Publicações PCT n. WO 95/18863, WO 96/17823, Pat. U.S. n. 5,459,127, WO 95/21931, WO 96/25508 e WO 95/21931.

[0155]Também é possível introduzir um vetor in vivo como um plasmídeo de DNA nu conforme descrito na Pat. U.S. n. 5,693,622, 5,589,466 e 5,580,859.

[0156]Em certas modalidades, os polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados a um vetor viral para distribuir a um sujeito. Exemplos não limitantes de vetores virais incluem vetores adenovirais, vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores do vírus da herpes e vetores do vírus adeno-associado (AAV).

[0157]Em modalidades particulares, os polinucleotídeos da invenção são fornecidos em vetores virais adeno-associados (AAV). O vetor viral adeno-associado

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50/127 pode ser AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrhLo ou quaisquer outros sorotipos de AAV que podem infectar seres humanos. Em certas modalidades específicas, o vetor viral adeno-associado é AAV5.

[0158]Os vetores AAV são vetores derivados de um sorotipo de vírus adenoassociado. Os vetores AAV podem ter um ou mais dos genes do tipo selvagem AAV deletados no todo ou em parte, preferencialmente, por genes rep e/ou cap, mas retêm sequências de ITR flanqueadoras funcionais. Os vetores AAV incluem pelo menos aquelas sequências necessárias em cis para replicação e empacotamento (por exemplo, ITRs funcionais) do vírus. As sequências nucleotídicas das regiões de ITR de AAV são conhecidas (Kotin, RM (1994)/7t/m. Gene 77?e/-.5(7):793-801; Berns, Kl “Parvoviridae and their Replication” em Virology, 2- Edição, (Fields, BN e Knipe, DM, eds.) Nova York: Raven Press; 1990b: 1743-1763). As ITRs podem ser derivadas de sorotipos diferentes, desde que sejam funcionais. Os vetores de expressão AAV da invenção podem ser construídos por qualquer meio conhecido na técnica para ligar operativamente componentes no sentido da transcrição, (ou seja, elementos de controle incluindo promotor, 5’UTR, gene da frataxina e elemento regulador 3' (tal como uma região de terminação transcricional)).

[0159]Em um aspecto particular, a invenção é direcionada a um vetor que compreende o sorotipo 5 de AAV (AAV5) e uma inserção do gene FXN. Em uma modalidade, o vetor é um vetor AAV5-hFXN que compreende um capsídeo de rAAV5 e uma sequência de DNA complementar (cDNA) que codifica hFXN.

[0160]Um exemplo de um vetor AAV5.hFXN com inserção gênica é mostrado na Fig.15.

// - ITR - UBC - 5U2 - hFXN GOI - hGH-Poli A -Peptídeo de ligação de ITR - ITR - //

ITR = repetição do terminal invertido de AAV2,

UBC = promotor da Ubiquitina C Humana (UBC)

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5U2 = elemento regulador 5' Sintético hFXN GOI = cDNA de FXN Humano hGH-Poli A = Hormônio de Crescimento Humano Poli A [0161]Vírus recombinantes que compreendem os construtos de frataxina podem ser produzidos por qualquer técnica conhecida na técnica, incluindo, sem limitação, transfectando e empacotando células (por exemplo, células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293) ou transfecção transitória com plasmídeos ou vírus auxiliares. A descrição e protocolos para fazer vírus recombinantes com defeito de replicação podem ser encontrados, por exemplo, em WO 94/19478, WO 95/14785, WO 96/22378, Patente U.S. n. 5,882,877, 6,013,516, 4,861,719 e 5,278,056.

[0162]Em uma modalidade específica da invenção, o polinucleotídeo compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína Frataxina com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 operacionalmente ligada a um promotor UBC (SEQ ID NO:3) e uma 5U2 5’UTR (SEQ ID NO:4) e um elemento regulador 3' sintético (SEQ ID NO:7). Em uma modalidade específica da invenção, o polinucleotídeo compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína Frataxina com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 operacionalmente ligada a um promotor UBC (SEQ ID NO:3) e uma 5U2 5’UTR (SEQ ID NO:4) e um elemento regulador 3' de hGHpA (SEQ ID NO:5). Em certas modalidades da invenção, cada um destes dois polinucleotídeos é incorporado a um vetor AAV5 fazendo, assim, dois tipos de vetores AAV5 para expressar frataxina. Em outras modalidades particulares, cada um desses tipos de vetores AAV5 para expressar frataxina é empacotado em virions produzindo dois tipos de rAAV5s para expressar frataxina, cada um deles pode ser formulado, opcionalmente, em composições da invenção.

Formulação Farmacêutica [0163]Opcionalmente, o vetor AAV5.hFXN é formulado em tampão fosfatosalino (PBS), 1X PBS, 2X PBS, 10X PBS, PBS de Dulbecco (DPBS), ou DPBS que

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52/127 não compreende Magnésio ou Cálcio.

[0164]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica compreende um vetor AAV5.hFXN e 1X PBS. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica compreende um vetor AAV5.hFXN, 1X DPBS e cerca de 200mM de NaCI.

[0165]Em um aspecto, a formulação farmacêutica tem um pH substancialmente similar ao pH do líquido cefalorraquidiano humano. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica tem um pH de cerca de 6,5 a cerca de 7,5. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica tem um pH de cerca de 6,8 a cerca de 7,2. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica tem um pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,5. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica tem um pH de cerca de 7. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica tem um pH de cerca de 7,1. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica tem um pH de cerca de 7,2. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica tem um pH de cerca de 7,2. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica tem um pH de cerca de 7,4.

[0166]Em uma modalidade particular, a formulação farmacêutica compreende o vetor AAV5.hFXN, 0,154M de NaCI, 0,056M de Na2HPO4e 0,0106M de KH2PO4. Em outra modalidade particular, a formulação farmacêutica compreende 0 vetor AAV5.hFXN, 0,337M de NaCI, 0,027M de KCI, 0,015M de Na₂HPO₄e 0,0015 M de KH2PO4.

[0167]Exemplos de formulações farmacêuticas incluem, sem limitação, formulações farmacêuticas mostradas na Tabela 2.

Tabela 2. Exemplo de Formulações de AAV5.hFXN

Componente	Formulação 1	Formulação 2
AAV5-hFXN	2,5 x 1011 vg/mL	2,5 x 1012 vg/mL
Excipientes	PBS	PBS de Dulbecco (sem Mg, sem Ca) + 200mM de NaCI

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Componente	Formulação 1	Formulação 2
PH	7,4	7,0

[0168]Em um aspecto, a formulação farmacêutica compreende capsídeos vazios em uma porcentagem de no máximo cerca de 25% a cerca de 95% cp/cp. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica compreende capsídeos vazios em uma porcentagem de no máximo cerca de 50% cp/cp a cerca de 75% cp/cp. Em outras modalidades, a formulação farmacêutica compreende capsídeos vazios em uma porcentagem de no máximo cerca de 25% cp/cp a cerca de 50% cp/cp. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica compreende capsídeos vazios em uma porcentagem de no máximo cerca de 95% cp/cp. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica compreende capsídeos vazios em uma porcentagem de 0% a no máximo cerca de 25% cp/cp. Os intervalos neste documento incluem todos os números inteiros entre os números indicados (por exemplo, 25% a 50% inclui 25%, 26%, 27%, 28%, etc., até e incluindo 50%). Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica está substancialmente livre de capsídeos vazios. Como usado neste documento, substancialmente livre se refere a uma formulação que tem pouca ou nenhuma quantidade do componente. Substancialmente livre de capsídeos vazios refere-se a uma formulação que tem 1 % a 0% de capsídeos vazios.

Via de Administração; Distribuição de formulação farmacêutica:

[0169]Em um aspecto, a formulação farmacêutica é administrada por distribuição intratecal (IT). Em outro aspecto, a formulação farmacêutica é administrada por distribuição intracerebroventricular (ICV). Em outro aspecto, a formulação farmacêutica é administrada por distribuição intraparenquimal.

[0170]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é administrada pela distribuição intraparenquimal ao cérebro. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é administrada por distribuição intraparenquimal para o cerebelo. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é administrada por distribuição

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54/127 intraparenquimal para o cérebro. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é administrada por distribuição intraparenquimal para o núcleo dentado. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é administrada por distribuição intraparenquimal para o gânglio da raiz dorsal.

[0171]A formulação farmacêutica pode ser administrada usando qualquer dispositivo de distribuição adequado, incluindo, sem limitação, agulha, cateter ou dispositivo relacionado. A formulação farmacêutica pode ser administrada usando quaisquer técnicas adequadas conhecidas na técnica, incluindo, sem limitação, injeção estereotática (vide Davidson etal., “Recombinant adeno-associated virus type 2, 4, and 5 vectors: Transduction of variant cell types and regions in the mammalian central nervous system” PNAS 97:3428-3432, 2000; e Alisky et al., “Gene therapy for amyotrophiclateral sclerosis and other motor neuron diseases” Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000).

[0172]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é administrada usando uma injeção em bolus única. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é administrada usando uma infusão contínua. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é administrada usando múltiplas injeções. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é administrada usando uma injeção, duas injeções, três injeções ou quatro injeções.

[0173]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é administrada bilateralmente. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é administrada bilateralmente. Em uma modalidade particular, a formulação farmacêutica é administrada como uma injeção bilateral para o cerebelo.

[0174]A formulação farmacêutica pode ser distribuída por injeção manual, por uma bomba de infusão ou por uma bomba osmótica. Injeção não manual inclui, sem limitação, distribuição intensificada por convecção (CED). É feita referência a L.

Samaranch etal., “MR-guided parenchymal Delivery of Adeno-Associated ViralVector

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Serotype 5 in Non-Human Primate Brain” GeneTherapy (2017) 24,253-261; e Patente U.S. n. 9,701,984 “CNS targeting AAV Vectors and Methods of use Thereof.” Ambas as bombas osmóticas e de infusão estão comercialmente disponíveis por uma variedade de fornecedores, por exemplo, Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc., Paio Alto, CA. Um exemplo não limitative de uma bomba de seringa é a Pump 11 Elite Series, Harvard Pump, Harvard Apparatus Holliston, MA. Um exemplo não limitativo de uma bomba de seringa é uma Bomba de Seringa Legato™, KD Scientific Inc. Holliston, MA.

[0175]Qualquer Cânula ou agulha adequada pode ser usada. Qualquer estilo de ponta adequado pode ser usado. A cânula ou agulha pode incluir, opcionalmente, uma ou mais regiões afuniladas. Em várias modalidades, a cânula ou agulha pode ser chanfrada.

[0176]As Agulhas Espinhais exemplificativas incluem, sem limitação, agulhas chanfradas Pencil-Point (Pencan® - Braun; Reganesth® - Sarstedt AG; Whitacre; Sprotte) e Quincke (Spinocan® - Braun).

[0177]Quaisquer dimensões adequadas de cânula ou agulha podem ser usadas. As dimensões podem depender do local para implantação. Por exemplo, a largura do espaço epidural é de apenas cerca de 3-5 mm para a região torácica e cerca de 5-7 mm para a região lombar. Exemplos de comprimentos da cânula ou agulha podem incluir, sem limitação, cerca de 15 a 150 mm de comprimento, por exemplo, cerca de 65 mm para uso pediátrico epidural, cerca de 85 mm para um adulto padrão e cerca de 110 mm para um paciente adulto obeso. As espessuras exemplificativas de cânula ou agulha incluem, sem limitação, cerca de 0,05 mm a cerca de 2 mm.

[0178]Qualquer calibre adequado de cânula ou agulha pode ser usado.

Exemplos incluem, sem limitação, cerca de 14G a cerca de 22G. Em algumas modalidades, o calibre da agulha ou cânula é de cerca de 18 a cerca de 22G.

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56/127 [0179]Exemplos de dispositivos de acesso ICV incluem, sem limitação, reservatórios de Ommaya e Rickham. É feita referência a Cohen-Pfeffer et al., “Intracerebroventricular Delivery as a Safe, Long-Term Route of Drug Administration” Pediatric Neurology, Volume 67, fevereiro de 2017, Páginas 23-35; “Safety of Ommaya reservoirs in children with brain tumors: a 20-year experience with 5472 intraventricular drug administrations in 98 patients” J Neurooncol., 120 (2014), pp. 139145; A. Desi eta/Gibaldi’s Drug Delivery Systems In Pharmaceutical Care,” American Society of Health-System Pharmacists, 2007; e Cook AM, et al., Intracerebroventricular administration of drugs. Pharmacotherapy. Julho de 2009;29(7):832-45.

[0180]Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é administrada por distribuição intratecal via punção lombar para o LCR usando sistema de distribuição de cateter intratecal Medtronic ASCENDA™. Em uma modalidade particular, a formulação farmacêutica é administrada pela inserção de um cateter no espaço subaracnoide e pela administração de % a dose da formulação farmacêutica para a lombar e % a dose da formulação farmacêutica para a cisterna magna.

[0181]Em uma modalidade, o kit do sistema de distribuição de Cateter Intratecal ASCENDA™ 8781 inclui, sem limitação: Segmento espinhal com fio guia inserido, Segmento de bomba com conector de bomba sem sutura anexado, Conector do cateter com 2 pinças anexadas, agulha introdutora de calibre 16 T (11,4 cm) Âncora com dispenser de âncora. Comprimento: Cateter total, 139,7 cm, Segmento espinhal 66,0 cm, Segmento da bomba 73,7 cm. Segmento espinhal: Diâmetro externo 1,2 mm (4 French), Diâmetro interno 0,5 mm, Marcador de intervalo 1 cm, Ponta do cateter Fechada com 6 furos laterais. Segmento de bomba: diâmetro externo (apenas cateter) 1,2 mm (4 French), diâmetro interno 0,5 mm (apenas cateter), marcador de intervalo de 1 cm. Volume do cateter: 0,0022 mL/cm. Conector do cateter: diâmetro interno 0,3 mm, diâmetro externo do colar 4,3 mm, Fio guia: diâmetro externo

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0,5 mm, Agulha introdutora calibre 16 T, 11,4 cm. Segmentos aparáveis: Extremidades do conector do cateter dos segmentos espinhais e da bomba força de separação do segmento da bomba até segmento espinhal > 10,0 N. Conector da bomba sem sutura para força de separação da bomba: > 10,0 N.

[0182]A formulação farmacêutica é opcionalmente distribuída por cateter e bomba de infusão. Qualquer combinação de cateter e bomba adequada para infusão do SNC é usada opcionalmente. Um exemplo não limitante de uma combinação de cateter e bomba é o sistema de distribuição de Cateter Intratecal Medtronic ASCENDA™. Exemplos de bombas úteis incluem, sem limitação, bombas SynchroMedOEL 18 mL, SynchroMed® II 20 mL e SynchroMed® II 40 mL.

[0183]Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída, opcionalmente, por Cânula Alcyone MEMS (AMC™, Alcyone Lifesciences, Inc., Lowel, MA.), uma injeção compatível com MR de duplo lúmen e cânula neuroventricular de aspiração. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é opcionalmente distribuída pelo cateter intratecal Alcyone Pulsar.

Recipiente:

[0184]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica está contida em um recipiente de vidro de borossilicato de grau farmacêutico com fechamento de plástico revestido de fluoropolímero. Exemplos de fluoropolímeros incluem, sem limitação, politetrafluoretileno (PTFE) (Teflon®). polietilenotetrafluoroetileno (ETFE). (Fluorotec®) e um copolímero de etileno e tetrafluoroetileno (Tefzel®). Em uma modalidade, o fechamento é revestido com politetrafluoretileno (PTFE) (Teflon®).

Dose:

[0185]As dosagens do vetor dependem de fatores que incluem, sem limitação, modo de administração, condição individual do sujeito e o vetor particular distribuído.

[0186]Em uma modalidade da presente invenção, a dose por indivíduo varia de cerca de 1 x 10¹⁰ vg a cerca de 1 x 10¹⁵vg. Em outra modalidade, a dose é pelo

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58/127 menos cerca de 1 χ 10¹¹ vg, pelo menos cerca de 1 χ 10¹² vg, pelo menos cerca de 1 x10¹³ vg, pelo menos cerca de 1 x 10¹⁴ vg, ou pelo menos cerca de 1 x 10¹⁵ vg.

[0187]Em outra modalidade, a dose é pelo menos cerca de 5 x 10¹³vg, pelo menos cerca de 1,5 x 10¹⁴vg ou pelo menos cerca de 5 x 10¹⁴vg.

[0188]Em outra modalidade, a dose é cerca de 5x10¹³vg, cerca de

1.5 x 10¹⁴vg ou cerca de 5 x 10¹⁴vg.

[0189]Em outra modalidade, a dose é uma quantidade de cerca de 3,7 χ 1O¹⁰ vg/g com base no peso do cérebro, cerca de 1,11 χ 10¹¹ vg/g com base no peso do cérebro ou cerca de 3,7 χ 10¹¹ vg/g com base no peso do cérebro.

[0190]A dose é uma dose total por sujeito por administração em todos os locais alvo.

[0191]Para um exemplo não limitante, uma dose total por sujeito de cerca de 5x 10¹³vg inclui duas injeções de cerca de 2,5 x 10¹³vg (isto é, uma injeção de

2.5 x 10¹³ vg na metade direita do cerebelo e uma injeção de 2,5 x 10¹³ vg na metade esquerda do cerebelo). Para outro exemplo não limitante, uma dose total por sujeito de cerca de 1,5 x 10¹⁴ vg inclui duas injeções de cerca de 7,5 x 10¹³ vg (isto é, uma injeção de 7,5 x 10¹³ vg na metade direita do cerebelo e uma injeção de 7,5 x 10¹³ vg na metade esquerda do cerebelo). Para outro exemplo não limitante, uma dose total por sujeito de cerca de 5 x 10¹⁴vg inclui duas injeções de cerca de 2,5 x 10¹⁴vg (isto é, uma injeção de 2,5x10¹⁴vg na metade direita do cerebelo e uma injeção de

2.5 x 10¹⁴ vg na metade esquerda do cerebelo).

[0192]Para outro exemplo não limitante, uma dose total por sujeito de cerca de 5 x 10¹³vg inclui duas injeções de cerca de 2,5 x 10¹³vg (isto é, uma injeção de

2,5 x 10¹³ vg na Lombar e uma injeção de 2,5 x 10¹³ vg na cisterna magna). Para outro exemplo não limitante, uma dose total por sujeito de cerca de 1,5 x 10¹⁴ vg inclui duas injeções de cerca de 7,5 χ 10¹³ vg (isto é, uma injeção de 7,5 χ 10¹³ vg na Lombar e uma injeção de 7,5 χ 10¹³ vg na cisterna magna). Para outro exemplo não limitante,

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59/127 uma dose total por sujeito de cerca de 5 x 10¹⁴vg inclui duas injeções de cerca de 2,5x10¹⁴vg (isto é, uma injeção de 2,5x10¹⁴vg na Lombar e uma injeção de

2,5 x 10¹⁴ vg na cisterna magna).

[0193]É feita referência a D. J. Schuster, “Supraspinal genetransfer by intrathecal adeno-associated virus serotype 5.” Front. Neuroanat. (2014b), 8:66; S.J. Gray. “Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates.” Gene Then 2013;20(4):450459.; T. Federici, etal., “Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs,” Gene Ther, 19(8):852,2012; e B. Snyder, etal., “Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery,” Hum. Gene Ther, 22(9):1129, 2011.

Volume da dose:

[0194]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em um volume de dose que varia de cerca de 0,1 mL a cerca de 10 mL por local alvo. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em um volume de dose que varia de cerca de 1 mL a cerca de 5 mL por local alvo. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em um volume de dose que varia de cerca de 1 mL a cerca de 3 mL por local alvo. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em um volume de dose que varia de cerca de 1,5 mL a cerca de 2,5 mL por local alvo. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em um volume de dose que varia de cerca de 1 mL a cerca de 2 mL por local alvo. Em uma modalidade particular, a formulação farmacêutica é distribuída em um volume de dose de cerca de 1 mL por local alvo. Em outra modalidade particular, a formulação farmacêutica é distribuída em um volume de dose de cerca de 2 mL por local alvo. Em outra modalidade particular, a formulação farmacêutica é distribuída em um volume de dose de cerca de 3 mL por local alvo.

Concentração da dose:

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60/127 [0195]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica compreende uma concentração de vetor AAV5.hFXN de cerca de 1 x 10⁹ a cerca de 2 x 10¹³ vg/mL. Em algumas modalidades, a concentração do vetor AAV5.hFXN é de cerca de 1 x 10¹° a cerca de 2 x 10¹³. Em outras modalidades, a concentração do vetor AAV5.hFXN é de cerca de 1 x 10¹¹ a cerca de 2 x 10¹³. Em outras modalidades, a concentração do vetor AAV5.hFXN é de cerca de 1 x 10¹² a cerca de 2 x 10¹³ vg/mL. Em outra modalidade, a concentração do vetor AAV5.hFXN é de cerca de 2,5 x 10¹² a cerca de 2 x 10¹³ vg/mL. Em outras modalidades, a concentração do vetor AAV5.hFXN é de cerca de 5 x 10¹² a cerca de 2 x 10¹³ vg/mL. Ainda em outras modalidades, a concentração do vetor AAV5hFXN é de cerca de 7 x 10¹² a cerca de 2 x 10¹³ vg/mL.

[0196]Em certas modalidades, a concentração do vetor AAV5.hFXN é de pelo menos cerca de 1 x 10⁹, pelo menos cerca de 1 x 10¹¹, pelo menos cerca de 2,5 x 10¹¹, pelo menos cerca de 5 x 10¹¹, pelo menos cerca de 1 x 10¹², pelo menos cerca de 2 x 10¹², pelo menos cerca de 2,5 x 10¹², pelo menos cerca de 5 x 10¹², pelo menos cerca de 7 x 10¹², pelo menos cerca de 1 x 10¹³ ou pelo menos cerca de 2 x 10¹³ vg/mL.

[0197] Em uma modalidade, a formulação farmacêutica compreende uma concentração do vetor AAV5.hFXN de cerca de 1 x 10⁹ vg/mL, cerca de

1 x 101° vg/mL,	cerca	de	1 x 1011 vg/mL,	cerca	de	1 x 1012 vg/mL,	cerca	de
1 x 1013 vg/mL,	cerca	de	2,5 x 1011 vg/mL,	cerca	de	5 x 1011 vg/mL,	cerca	de
2 x 1012 vg/mL,	cerca	de	2,5 x 1012 vg/mL,	cerca	de	5 x 1012 vg/mL,	cerca	de

x 10¹² vg/mL, cerca de 1 x 10¹³ vg/mL ou cerca de 2 x 10¹³ vg/mL.

Taxa de administração:

[0198]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída como uma injeção em bolus única durante cerca de um minuto a cerca de 10 minutos. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída como uma injeção em bolus única durante cerca de 1 minuto, a cerca de 5 minutos.

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61/127 [0199]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em uma taxa que varia de cerca de 0,001 mL/min a cerca de 10mL/min. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em uma taxa que varia de cerca de 0,01 mL/min a cerca de 1 mL/min. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em uma taxa que varia de cerca de 0,01 mL/min a cerca de 0,1 mL/min. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em uma taxa que varia de cerca de 1 mL/min a cerca de 10mL/min. Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em uma taxa que varia de cerca de 1 mL/min a cerca de 2mL/min.

[0200]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em uma taxa de cerca de 0,1 mL/min, cerca de 0,2mL/min, cerca de 0,3mL/min, cerca de 0,4mL/min, cerca de 0,5mL/min, cerca de 0,6mL/min, cerca de 0,7mL/min, cerca de 0,8mL/min, cerca de 0,9mL/min ou cerca de 1,0mL/min.

[0201 ]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é distribuída em uma taxa de cerca de 0,01 mL/min, cerca de 0,02mL/min, cerca de 0,03mL/min, cerca de 0,04mL/min, cerca de 0,05mL/min, cerca de 0,06mL/min, cerca de 0,07mL/min, cerca de 0,08mL/min, cerca de 0,09mL/min ou cerca de 0,1 mL/min.

[0202]Em uma modalidade, a formulação farmacêutica, que compreende uma concentração de vetor AAV5.hFXN de 1 x 10¹² vg/mL, é distribuída a um volume de dose de cerca de 1 mL por local alvo em uma taxa de cerca de 0,001 mL/min.

[0203]0 médico versado na técnica será capaz de ajustar a dose para mais ou para menos e determinar um regime de dose/dose adequado dependendo de fatores como via de administração (por exemplo, uma dose sistêmica pode ser tanto quanto um aumento de 2-3 log), tempo de doses, melhoria de sintomas (isto é, eficácia), ou necessidades individuais do paciente em particular.

Mensurações do Resultado:

[0204]É feita referência a M. Patel et al., “Progression of Friedreich ataxia:

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62/127 quantitative characterization over 5years,” Annals of Clinical and Translational Neurology, 2016; 3(9): 684-69; D. Lynch et al. “Friedreich ataxia: effects of genetic understanding on clinical evaluation and therapy” Arch. Neurol, 2002, 59:743-747; C. Wilson etal., “Quality of life in Friedreich ataxia: what clinical, social and demographic factors are important?” Eur. J Neurol. 200714(9):1040-1047; G. Rance etal., “Speech perception ability in individuals with Friedreich ataxia.” Brain. 2008131:2002-2012; A. Koeppen, “Friedreich’s ataxia: Pathology, pathogenesis, and molecular genetics.” J. Neurol. Sci. 2011, 303(1-2): 1-12; e S.R. Regner et al. “Friedreich ataxia clinical outcome measures: natural history evaluation in 410 participants” J. Child Neurol. 2012, 27(9):1152-8.

[0205]Qs dados de eficácia são coletados em 1, 3, 6 e 12 meses após a administração da droga em estudo. A eficácia é avaliada em sujeitos usando imagens do tensor de difusão e vários desfechos funcionais (incluindo, entre outros, FARS total e FARS Neuro; avaliação de um teste de caminhada de 25 pés; avaliação em um sistema GAITRite Walkway; avaliação usando um sistema de equilíbrio Biodex SD; avaliação usando o teste 9-hole peg). As imagens do tensor de difusão podem ser medidas, por exemplo, pela relaxometria T2 do núcleo dentado e dos níveis de DRG e/ou NAA e níveis de ferro por geração de imagens por ressonância magnética (MRS).

[0206]Excipientes farmacêuticos para uso in vivo, os ingredientes ativos (por exemplo, vetores que expressam frataxina, virions, vírus, rAAVs, etc.) descritos neste documento podem ser assimilados em carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como, por exemplo, soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas, pomadas, elixires e composições injetáveis. As composições farmacêuticas podem conter de 0,01% a 99% em peso do ingrediente ativo. As composições podem estar na forma de dose única ou de dose múltipla. A quantidade de ligante em qualquer composição farmacêutica particular dependerá da dose eficaz, ou seja, a dose necessária para eliciar a expressão ou supressão gênica desejada.

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63/127 [0207]As vias adequadas de administração das preparações farmacêuticas incluem oral, retal, tópica (incluindo dérmica, bucal e sublingual), vaginal, parenteral (incluindo subcutânea, intraparenquimal, intramuscular, intravenosa, intratumoral, intradérmica, intratecal, intraventricular e epidural), intravítrea e por tubo nasogástrico. Em certas modalidades, a via de administração é para o espaço do LCR; espaço subaracnoide, (por exemplo, cisterna magna); cérebro, (por exemplo, espaço cerebroventricular, cerebelo, cérebro, hipocampo, córtex interior, gânglio da raiz dorsal ou núcleo caudado); ou coluna vertebral (por exemplo, coluna lombar, coluna torácica, coluna cervical). Em algumas modalidades, o ingrediente ativo (por exemplo, vetores que expressam frataxina, virions, vírus, rAAVs, etc.) é distribuído em duas injeções: uma no cerebelo direito e uma no cerebelo esquerdo. Em algumas modalidades, estas são duas injeções iguais. Em algumas modalidades, o ingrediente ativo (por exemplo, vetores que expressam frataxina, virions, vírus, rAAVs, etc.) é administrado injetando no cerebelo e também o fornecendo sistematicamente. Será entendido pelos versados na técnica que a via de administração dependerá da condição que está sendo tratada e pode variar com fatores como a condição do destinatário.

[0208]0s polinucleotídeos da invenção para a expressão de frataxina (por exemplo, virions, AAVs, vetores, vírus, etc.) podem ser usados para tratar a Ataxia de Friedreich. A administração dos polinucleotídeos, virions e/ou composições da invenção a um sujeito em necessidade dos mesmos melhora pelo menos um sintoma da ataxia de Friedreich. Os sintomas da ataxia de Friedreich que podem ser amenizados incluem, sem limitação, perda de coordenação nos braços e/ou pernas, fadiga, deficiência visual, perda de audição, fala arrastada, escoliose agressiva, diabetes mellitus, cardiomiopatia hipertrófica e arritmia cardíaca.

[0209]0 tratamento da Ataxia de Friedreich usando os construtos e as composições da invenção permite a expressão da frataxina em um sujeito em um nível

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64/127 de pelo menos 25% da expressão normal da frataxina ou maior até níveis normais (incluindo níveis que excedem os níveis normais, desde que não causem efeitos indesejáveis). Em algumas modalidades, o nível será pelo menos 30% do normal. Em outras modalidades, o nível será pelo menos, ou maior que 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% dos níveis normais de frataxina. Em outras modalidades, são obtidos níveis normais de frataxina.

[0210]Usando as composições e métodos da invenção, a frataxina é expressa na mitocôndria. Preferencialmente, a frataxina é expressa nas mitocôndrias de pelo menos um tecido selecionado do grupo que consiste em cerebelo, hipocampo, córtex anterior e gânglio da raiz dorsal.

Sistemas de Switch de Gene [0211 ]O switch de gene pode ser qualquer switch de gene que regula a expressão gênica por adição ou remoção de um ligante específico. Em uma modalidade, o switch de gene é um tal que o nível de expressão gênica depende do nível de ligante que está presente. Exemplos de complexos de fator de transcrição dependente de ligante que podem ser usados nos switches gênicos da invenção incluem, sem limitação, membros da superfamília do receptor nuclear ativados por seus respectivos ligantes (por exemplo, glicocorticoide, estrogênio, progestina, retinoide, ecdisona e seus análogos miméticos) e rTTA ativado por tetraciclina. Em um aspecto da invenção, o switch de gene é um switch de gene baseado em EcR. Exemplos de tais sistemas incluem, sem limitação, os sistemas descritos nas Patentes U.S. n. 6,258,603, 7,045,315, Pedido de Patente Publicado U.S. n. 2006/0014711, 2007/0161086, e Pedido Publicado Internacional n. WO 01/70816. Exemplos de sistemas de receptor de ecdisona quimérico são descritos na Patente U.S. n. 7,091,038, Pedido de Patente Publicado U.S. n. 2002/0110861, 2004/0033600, 2004/0096942, 2005/0266457, e 2006/0100416, e Pedido Publicado Internacional n. WO 01/70816, WO 02/066612, WO 02/066613, WO 02/066614, WO 02/066615, WO

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02/29075, e WO 2005/108617, cada um dos quais está integralmente incorporado neste documento por referência. Um exemplo de sistema de ecdisona não esteroidal regulado por agonista é o Sistema de Expressão Induzível de Mamíferos RheoSwitch® (New England Biolabs, Ipswich, MA). Em outro aspecto da invenção, o switch de gene é baseado na heterodimerização da proteína de ligação FK506 (FKBP) com proteína associada à rapamicina FKBP (FRAP) e é regulada por meio da rapamicina ou seus análogos não imunossupressores. Exemplos de tais sistemas incluem, sem limitação, a Tecnologia Transcricional ARGENT™ (ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, MA) e os sistemas descritos nas Patentes U.S. n. 6,015,709, 6,117,680, 6,479,653, 6,187,757 e 6,649,595.

[0212]Em uma modalidade, o switch de gene compreende uma sequência de fator de transcrição única que codifica um complexo de fator de transcrição ligantedependente sob controle de um promotor de switch terapêutico. A sequência do fator de transcrição pode codificar um complexo de fator de transcrição ligante-dependente que é um complexo de fator de transcrição ligante-dependente natural ou artificial. Um fator de transcrição artificial é aquele em que a sequência natural do fator de transcrição foi alterada, por exemplo, por mutação da sequência ou pela combinação de domínios de diferentes fatores de transcrição. Em uma modalidade, o fator de transcrição compreende um domínio de ligação do ligante do receptor nuclear do Grupo H. Em uma modalidade, o domínio de ligação do ligante do receptor nuclear do Grupo H é de um receptor de ecdisona, um receptor ubíquo (UR), um receptor órfão 1 (OR-1), um receptor nuclear 1 do hormônio esteroide (NER-1), uma proteína de interação-15 ao receptor retinoide X (RIP-15), um receptor do fígado X β (Ι_ΧΒβ), uma proteína tipo receptor do hormônio esteroide (RLD-1), um receptor do fígado X (LXR), um receptor do fígado X oc (LXRoc), um receptor de farnesoide X (FXR), uma proteína 14 de interação ao receptor RIP-14) ou um receptor de farnesol (HRR-1). Em outra modalidade, o receptor nuclear do Grupo H LBD é de um receptor de ecdisona.

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A.Switch de Gene Baseado em Ecdisona [0213]O EcR e os outros receptores nucleares do Grupo H são membros da superfamília do receptor nuclear, em que todos os membros são geralmente caracterizados pela presença de um domínio de transativação amino-terminal (AD, também denominado intercambiavelmente TA ou TD), fundido, opcionalmente, a um parceiro de heterodimerização (HP) para formar uma proteína de coativação (CAP), um domínio de ligação de DNA (DBD) e LBD fundido ao DBD via uma região de dobradiça para formar um fator de transcrição ligante-dependente (LTF). Como usado neste documento, o termo domínio de ligação de DNA compreende uma sequência de polipeptídeo mínima de uma proteína de ligação de DNA, até o comprimento total de uma proteína de ligação de DNA, desde que as funções do domínio de ligação de DNA se associem a um elemento de resposta específico. Membros da superfamília do receptor nuclear também são caracterizados pela presença de quatro ou cinco domínios: A/B, C, D, E e, em alguns membros, F (vide US 4.981.784 e Evans, Science 240:889 (1988)). O domínio A/B corresponde ao domínio de transativação, C corresponde ao domínio de ligação de DNA, D corresponde à região de dobradiça e E corresponde ao domínio de ligação do ligante. Alguns membros da família também podem ter outro domínio de transativação no lado carboxi-terminal do LBD correspondente a F.

[0214]A sequência polipeptídica a seguir foi relatada como uma sequência polipeptídicado receptor de Ecdisona (receptor Ecdiesteroide) (receptor de 20-hidróxiecdisona) (receptor de 20E) (EcRH) (membro 1 do grupo H dasubfamília 1 do receptor nuclear) e tem o número de acesso P34021 no Genbank.

Sequência de proteína do receptor de ecdisona de Drosophila melanogaster (SEQ ID NO:10)

MKRRWSNNGG FMRLPEESSS EVTSSSNGLV LPSGVNMSPS

SLDSHDYCDQ DLWLCGNESG

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SFGGSNGHGL SQQQQSVITL AMHGCSSTLP AQTTIIPING NANGNGGSTN GQYVPGATNL

121 GALANGMLNG GFNGMQQQIQ NGHGLINSTT PSTPTTPLHL

QQNLGGAGGG GIGGMGILHH

181 ANGTPNGLIG VVGGGGGVGL GVGGGGVGGL GMQHTPRSDS

VNSISSGRDD LSPSSSLNGY

241 SANESCDAKK SKKGPAPRVQ EELCLVCGDR ASGYHYNALT

CEGCKGFFRR SVTKSAVYCC

301 KFGRACEMDM YMRRKCQECR LKKCLAVGMR PECVVPENQC

AMKRREKKAQ KEKDKMTTSP

361 SSQHGGNGSL ASGGGQDFVK KEILDLMTCE PPQHATIPLL

PDEILAKCQA RNIPSLTYNQ

421 LAVIYKLIWY QDGYEQPSEE DLRRIMSQPD ENESQTDVSF

RHITEITILT VQLIVEFAKG

481 LPAFTKIPQE DQITLLKACS SEVMMLRMAR RYDHSSDSIF

FANNRSYTRD SYKMAGMADN

541 IEDLLHFCRQ MFSMKVDNVE YALLTAIVIF SDRPGLEKAQ

LVEAIQSYYI DTLRIYILNR

601 HCGDSMSLVF YAKLLSILTE LRTLGNQNAE MCFSLKLKNR

KLPKFLEEIW DVHAIPPSVQ

661 SHLQITQEEN ERLERAERMR ASVGGAITAG IDCDSASTSA AAAAAQHQPQ PQPQPQPSSL

721 TQNDSQHQTQ PQLQPQLPPQ LQGQLQPQLQ PQLQTQLQPQ

IQPQPQLLPV SAPVPASVTA

781 PGSLSAVSTS SEYMGGSAAI GPITPATTSS ITAAVTASST

TSAVPMGNGV GVGVGVGGNV

841 SMYANAQTAM ALMGVALHSH QEQLIGGVAV KSEHSTTA

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68/127 [0215]Em uma modalidade, o domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona é selecionado do grupo que consiste em um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de invertebrado, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de Artrópodes, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de Lepidópteros, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de Dípteros, domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de Ortópteros, domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de Homópteros, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de Hemípteros, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de EcR da lagarta Choristoneura fumiferana, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da larva da farinha Tenebrio molitor, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da mariposa Manduca sexta, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da lagarta das maçãs Heliothis virescens, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona do mosquito Chironomus tentans, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona do bicho da seda Bombyx mori, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da borboleta Bicyclus anynana, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da borboleta castanheira Junonia coenia, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da mosca da fruta Drosophila melanogaster, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona do mosquito Aedes aegypti, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da mosca varejeira Lucilia capitata, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da mosca varejeira Lucilia cuprina, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da mosca varejeira Calliphora vicinia, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da mosca do Mediterrâneo Ceratitis capitata, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona do gafanhoto Locusta migratória, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de afídio Myzus persicae, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de uca Celuca pugilator, um

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69/127 domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona do carrapato ixodideo Amblyomma americanum, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da mosca branca Bamecia argentifoli, um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona da cigarrinha Nephotetix cincticeps.

[0216]Em outra modalidade, o domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona é o domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de Choristoneura fumiferana, para o qual a sequência de aminoácidos está indicada na SEQ ID NO:11.

[0217]Em outra modalidade, o domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona é um análogo do domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de Choristoneura fumiferana que retém pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% ou 100% da atividade de ligação do ligante do receptor de ecdisona de Choristoneura fumiferana in vitro do domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona de Choristoneura fumiferana. Os ensaios de ligação do ligante do receptor de ecdisona in vitro são bem conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, consulte WO 02/066612.

[0218]Em outra modalidade, o análogo do domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona é um domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona divulgado em WO 02/066612, US 2006/0100416, WO 05/108617 e 2005/0266457. Em outra modalidade, o análogo do domínio de ligação do ligante do receptor de ecdisona é o mutante de substituição V107I/Y127E do receptor de ecdisona de Choristoneura fumiferana que é indicado na SEQ ID NO: 12.

[0219]O DBD é caracterizado pela presença de duas cisteína dedo de zinco entre as quais estão dois motivos de aminoácidos, P-box e D-box, que conferem especificidade para elementos de resposta. Esses domínios podem ser nativos, modificados ou quimeras de diferentes domínios de proteínas receptoras heterólogas. O EcR, como um subconjunto da família do receptor nuclear, também tem regiões menos bem definidas responsáveis por propriedades de heterodimerização. Como os

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70/127 domínios de receptores nucleares são de natureza modular, o LBD, DBD e AD podem ser intercambiados.

[0220]Em outra modalidade, o fator de transcrição compreende um AD, um DBD que reconhece um elemento de resposta associado à proteína terapêutica ou polinucleotídeo terapêutico cuja expressão deve ser modulada; e um LBD do receptor nuclear do Grupo H. Em certas modalidades, o LBD do receptor nuclear do Grupo H compreende uma mutação por substituição.

[0221 ]O domínio de ligação de DNA pode ser qualquer domínio de ligação de DNA (DBD) com um elemento de resposta conhecido incluindo domínios de ligação ao DNA sintético e quimérico, ou seus análogos, combinações ou modificações. Em uma modalidade, o domínio de ligação de DNA é selecionado do grupo que consiste em um DBD de GAL4, DBD de LexA, um DBD do fator de transcrição, um DBD do membro do receptor nuclear do Grupo H, um DBD do membro da superfamília do receptor nuclear do hormônio esteroide/da tireoide, um DBD de LacZ bacteriano, um DBD de EcR, um DBD de GAL4 e um DBD de LexA.

[0222]O domínio de transativação (abreviado AD ou TA) pode ser qualquer AD do membro do receptor nuclear do Grupo H, do AD do receptor nuclear do hormônio esteroide/da tireoide, do AD sintético ou quimérico, do AD da poliglutamina, do AD do aminoácido básico ou ácido, um AD de VP16, um AD de GAL4, um AD de NF-kb B, um AD de BP64, um domínio de ativação ácida de B42 (B42AD), um domínio de transativação de p65 (p65AD) ou seu análogo, combinação ou modificação.

[0223]Em outra modalidade, o switch de gene compreende uma primeira sequência do fator de transcrição, por exemplo, CAP, sob controle de um primeiro promotor de switch terapêutico (TSP-1) e uma segunda sequência do fator de transcrição, por exemplo, LTF, sob controle de um segundo promotor de switch terapêutico (TSP-2), em que as proteínas codificadas pela referida primeira sequência do fator de transcrição e a referida segunda sequência do fator de transcrição

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71/127 interagem para formar um complexo de proteína (LDTFC), ou seja, um switch de gene baseado em um switch duplo ou dois híbridos. O primeiro e o segundo TSPs podem ser iguais ou diferentes. Nesta modalidade, a presença de dois TSPs diferentes no switch de gene que são necessários para a expressão da molécula terapêutica potencializa a especificidade do método terapêutico (vide Figura 2 de WO 2011/119773). A Figura 2 de WO 2011/119773 também demonstra a capacidade de modificar o switch de gene terapêutico para tratar qualquer doença, distúrbio ou condição simplesmente inserindo os TSPs apropriados.

[0224]Em outra modalidade, tanto a primeira quanto a segunda sequência do fator de transcrição, por exemplo, CAP ou LTF, está sob controle de um promotor único do switch terapêutico (por exemplo TSP-1 na Figura 1 de WO 2011/119773). A ativação deste promotor gerará CAP e LTF com um quadro de leitura aberto único. Isso pode ser obtido com o uso de um peptídeo de ligação transcricional como IRES (sítio de entrada ao ribossoma interno). Nesta modalidade, ambas as porções do complexo do fator de transcrição ligante-dependente são sintetizadas mediante ativação do TSP-1. O TSP-1 pode ser um promotor constitutivo ou ativado apenas em condições associadas à doença, distúrbio ou condição.

[0225]Em outra modalidade, uma sequência do fator de transcrição, por exemplo, LTF, está sob controle de um promotor do switch terapêutico ativado apenas em condições associadas à doença, distúrbio ou condição (por exemplo, TSP-2 ou TSP-3 na Figura 4 em WO 2011/119773) e a outra sequência do fator de transcrição, por exemplo, CAP, está sob controle de um promotor do switch terapêutico constitutivo (por exemplo, TSP-1 na Figura 4 em WO 2011/119773). Nesta modalidade, uma porção do complexo do fator de transcrição ligante-dependente está presente constitutivamente enquanto a segunda porção será sintetizada apenas em condições associadas à doença, distúrbio ou condição.

[0226]Em outra modalidade, uma sequência do fator de transcrição, por

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72/127 exemplo, CAP, está sob controle de um primeiro TSP (por exemplo, TSP-1 na Figura 3 em WO 2011/119773) e duas ou mais segundas sequências do fator de transcrição diferentes, por exemplo, LTF-1 e LTF-2, estão sob controle de TSPs diferentes (por exemplo, TSP-2 e TSP-3 na Figura 3 em WO 2011/119773). Nesta modalidade, cada LTF pode ter um DBD diferente que reconhece uma sequência promotora regulada por fator diferente (por exemplo, DBD-A se liga a um elemento de resposta associado ao promotor-1 regulado por fator (FRP-1) e DBD-B se liga a um elemento de resposta associado ao promotor-2 regulado por fator (FRP-2). Cada promotor regulado por fator pode estar operacionalmente ligado a um gene terapêutico diferente. Desta forma, vários tratamentos podem ser fornecidos simultaneamente.

[0227]Em uma modalidade, a primeira sequência do fator de transcrição codifica um polipeptídeo que compreende um AD, um DBD que reconhece um elemento de resposta associado à sequência do produto terapêutico cuja expressão deve ser modulada; e um LBD do receptor nuclear do Grupo H, e a segunda sequência do fator de transcrição codifica um fator de transcrição que compreende um LBD do receptor nuclear selecionado de um receptor retinoide X de vertebrado, um RXR de vertebrado, uma proteína ultraspiracle (USP) ou um receptor nuclear quimérico que compreende pelo menos dois fragmentos de polipeptídeo do domínio de ligação do receptor nuclear selecionados a partir de um RXR de vertebrado, um RXR de invertebrado, e uma USP (vide WO 01/70816 A2 e US 2004/0096942 A1). O domínio de ligação do ligante do receptor nuclear parceiro pode compreender ainda uma mutação por truncamento, uma mutação por deleção, uma mutação por substituição ou outra modificação.

[0228]Em outra modalidade, o switch de gene compreende uma primeira sequência do fator de transcrição que codifica um primeiro polipeptídeo que compreende um LBD do receptor nuclear e um DBD que reconhece um elemento de resposta associado à sequência do produto terapêutico cuja expressão deve ser

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73/127 modulada e uma segunda sequência do fator de transcrição que codifica um segundo polipeptídeo que compreende um AD e um LBD do receptor nuclear, em que um dos LBDs do receptor nuclear é um LBD do receptor nuclear do Grupo H. Em uma modalidade, o primeiro polipeptídeo está substancialmente livre de um AD e o segundo polipeptídeo está substancialmente livre de um DBD. Para fins da invenção, substancialmente livre significa que a proteína em questão não contém uma sequência suficiente do domínio em questão para fornecer ativação ou atividade de ligação.

[0229]Em outro aspecto da invenção, a primeira sequência do fator de transcrição codifica uma proteína que compreende um parceiro de heterodimerização e um AD (CAP) e a segunda sequência do fator de transcrição codifica uma proteína que compreende um DBD e um LBD (LTF).

[0230]Quando apenas um receptor nuclear LBD é um LBD do Grupo Η, o outro receptor nuclear LBD pode ser de qualquer outro receptor nuclear que forme um dímero com o LBD do Grupo H. Por exemplo, quando o LBD do receptor nuclear do Grupo H é um LBD de EcR, o outro parceiro do LBD do receptor nuclear pode ser derivado de um EcR, RXR de vertebrado, RXR de invertebrado, uma proteína ultraspiracle (USP) ou um receptor nuclear quimérico que compreende pelo menos dois fragmentos de polipeptídeo de LBD do receptor nuclear selecionados dentre RXR de vertebrado, RXR de invertebrado ou USP (vide WO 01/70816 A2, Pedido de Patente Internacional n. PCT/US02/05235, US 2004/0096942 A1 e Patente U.S. n. 7,531,326, incorporada a este documento por referência em sua totalidade). O domínio de ligação do ligante do receptor nuclear parceiro pode compreender ainda uma mutação por truncamento, uma mutação por deleção, uma mutação por substituição ou outra modificação.

[0231 ]Em uma modalidade, o RXR LBD é de um RXR de humano Homo sapiens, camundongo Mus musculus, rato Rattus norvegicus, frango Gallus gallus,

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74/127 porco Sus scrota domestica, sapo Xenopus laevis, peixe-zebra Danio rerio, tunicado Poliandrocarpa misakiensis, ou água-viva Tripedalia cisophora.

[0232]Em uma modalidade, o domínio de ligação do ligante de RXR de invertebrado é de polipeptídeo ultraspiracle de gafanhoto Locusta migratória (LmUSP), um homólogo 1 de RXR de carrapato ixodídeo Amblyomma americanum (AmaRXRI), homólogo 2 de RXR de carrapato ixodídeo Amblyomma americanum (AmaRXR2), um homólogo de RXR do caranguejo violonista Celuca Pugilator (“CPrXR”), um homólogo de RXR da larva da farinha Tenebrio molitor (“TMrXR”), um homólogo de RXR da abelha europeia Apis mellifera (AmRXR), um homólogo de RXR de afídio Myzus persicae (“MpRXR”) ou um homólogo de RXR de nãoDíptero/não-Lepidóptero.

[0233]Em uma modalidade, o RXR LBD quimérico compreende pelo menos dois fragmentos selecionados de um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de vertebrados, um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de invertebrados ou um fragmento de polipeptídeo homólogo de RXR de espécies de invertebrados de não Dípteros/não-Lepidópteros. Um domínio de ligação do ligante de RXR quimérico para uso na presente invenção pode compreender pelo menos dois fragmentos de polipeptídeo de RXR de espécies diferentes, ou quando as espécies forem as mesmas, dois ou mais fragmentos de polipeptídeo podem ser de duas ou mais isoformas diferentes do fragmento de polipeptídeo de RXR da espécie. Tais LBDs de RXR quimérico são divulgados, por exemplo, em WO 2002/066614.

[0234]Em uma modalidade, o domínio de ligação do ligante de RXR quimérico compreende pelo menos um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de vertebrados e um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de invertebrados.

[0235]Em outra modalidade, o domínio de ligação do ligante de RXR quimérico compreende pelo menos um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de vertebrados e um fragmento de polipeptídeo homólogo de RXR de

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75/127 espécies de invertebrados não-Dípteros/não-Lepidópteros.

[0236]O ligante, quando combinado com LBD dos receptores nucleares que, por sua vez, estão ligados ao elemento de resposta de um FRP associado a uma sequência de produto terapêutico, fornece regulação temporal externa da expressão da sequência do produto terapêutico. O mecanismo de ligação ou a ordem em que os vários componentes desta invenção se ligam entre si, isto é, por exemplo, ligante ao LBD, DBD ao elemento de resposta, AD ao promotor, etc., não é crítico.

[0237]Em um exemplo específico, a ligação do ligante ao LBD de um receptor nuclear do Grupo H e seu parceiro LBD do receptor nuclear permite a expressão da sequência do produto terapêutico. Este mecanismo não exclui o potencial de ligação do ligante ao receptor nuclear do Grupo H (GHNR) ou seu parceiro e a formação resultante de complexos de homodímero ativo (por exemplo, GHNR + GHNR ou parceiro + parceiro). Preferencialmente, um ou mais dos domínios do receptor são alterados produzindo um switch de gene híbrido. Tipicamente, um ou mais dos três domínios, DBD, LBD e AD, podem ser escolhidos de uma fonte diferente da fonte de outros domínios de modo que os genes híbridos e as proteínas híbridas resultantes sejam otimizadas na célula ou organismo hospedeiro para atividade de transativação, ligação complementar do ligante e reconhecimento de um elemento de resposta específico. Além disso, o próprio elemento de resposta pode ser modificado ou substituído por elementos de resposta para outros domínios de proteína de ligação de DNA, tais como proteína GAL-4 da levedura (vide Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)) ou proteína LexA de Escherichia coli(v\de Brent etal., Cell 43:729 (1985)), ou elementos de resposta sintéticos específicos para interações direcionadas com proteínas designadas, modificadas e selecionadas para tais interações específicas (vide, por exemplo, Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 94:3616 (1997)) para acomodar receptores híbridos. Outra vantagem dos sistemas de dois híbridos é que eles permitem escolher um promotor usado para conduzir a expressão gênica de

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76/127 acordo com um resultado final desejado. Tal controle duplo pode ser particularmente importante em áreas de terapia gênica, especialmente quando proteínas citotóxicas são produzidas, porque tanto o momento da expressão como as células em que a expressão ocorre podem ser controlados. Quando genes, ligados operacionalmente a um promotor adequado, são introduzidos nas células do sujeito, a expressão dos genes exógenos é controlada pela presença do sistema desta invenção. Promotores podem ser regulados de forma constitutiva ou indutiva ou podem ser tecidoespecíficos (isto é, expressos apenas em um tipo específico de células) ou específicos para certos estágios de desenvolvimento do organismo.

[0238]O domínio de ligação de DNA da primeira proteína híbrida se liga, na presença ou ausência de um ligante, à sequência de DNA de um elemento de resposta para iniciar ou suprimir a transcrição de genes a jusante sob regulação deste elemento de resposta.

[0239]O LDTFC funcional, por exemplo, um complexo de EcR, também pode incluir proteínas adicionais, tais como imunofilinas. Membros adicionais da família de proteínas do receptor nuclear, conhecidos como fatores transcricionais (como DHR38 ou betaFTZ-1), também podem ser dependentes ou independentes para EcR, USP e/ou RXR. Além disso, outros cofatores podem ser necessários, tais como proteínas geralmente conhecidas como coativadores (também denominados adaptadores ou mediadores). Essas proteínas não ligam especificamente a sequência ao DNA e não estão envolvidas na transcrição basal. Eles podem exercer seu efeito na ativação da transcrição por meio de vários mecanismos, incluindo estimulação da ligação de DNA de ativadores, afetando a estrutura da cromatina, ou mediando as interações do complexo ativador-iniciação. Exemplos de tais coativadores incluem RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoa-1, TIF2/GRIP/NCoa-2, ACTR/AIB1/RAC3/pCIP assim como proteína de ligação B do elemento de resposta C do coativador promíscuo, CBP/p300 (para revisão vide Glass et a!., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222

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77/127 (1997)). Além disso, os cofatores de proteína geralmente conhecidos como correpressores (também conhecidos como repressores, silenciadores ou mediadores de silenciamento) podem ser necessários para inibir efetivamente a ativação transcricional na ausência de ligante. Esses correpressores podem interagir com o EcR não ligado para silenciar a atividade no elemento de resposta. As evidências atuais sugerem que a ligação do ligante muda a conformação do receptor, o que resulta na liberação do correpressor e recrutamento dos coativadores descritos acima abolindo, assim, sua atividade de silenciamento. Exemplos de correpressores incluem N-CoR e SMRT (para revisão, vide Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:^67 (1996)). Esses cofatores podem ser endógenos dentro da célula ou do organismo, ou podem ser adicionados de forma exógena como transgenes para que sejam expressos de forma regulada ou não regulada.

B.Switch de Gene Baseado em Rapamicina [0240]A presente invenção fornece ainda um sistema de switch de gene que utiliza proteína de ligação FK506 como complexo do fator de transcrição ligantedependente e rapamicina como ligante. Em uma modalidade, o construto que codifica o switch de gene compreende:

(a) um primeiro polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína quimérica que se liga à rapamicina ou seu análogo e que compreende pelo menos um domínio da proteína de ligação a F/Í5O6(FKBP) e pelo menos um domínio de proteína heterólogo à mesma, em que o domínio de FKBP compreende uma sequência peptídica selecionada dentre:

(1) FKBP de ocorrência natural (2) uma variante de FKBP de ocorrência natural em que até 10 resíduos de aminoácidos foram deletados, inseridos ou substituídos por aminoácidos substitutos, e (3) FKBP codificada por uma sequência de DNA que hibridiza seletivamente

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78/127 em uma sequência de DNA que codifica uma FKBP de (1) ou (2);

(b) um segundo polinucleotídeo que codifica uma segunda proteína quimérica que forma um complexo com (a) rapamicina ou um análogo de rapamicina e (b) a primeira proteína quimérica, e que compreende pelo menos um domínio de ligação de FKBP:rapamicina (FRB) e pelo menos um domínio de proteína heterólogo a ele, em que o domínio de FRB compreende uma sequência peptídica selecionada dentre:

(4) um domínio de FRB de ocorrência natural, (5) uma variante de um domínio de FRB de ocorrência natural em que até 10 resíduos de aminoácidos foram deletados, inseridos ou substituídos por aminoácidos substitutos, e (6) um domínio de FRB codificado por uma sequência de DNA que hibridiza seletivamente em uma sequência de DNA que codifica FRB de (4) ou (5).

[0241]Neste sistema de switch de gene, cada um dentre primeiro polinucleotídeo e segundo polinucleotídeo estão sob o controle de um ou mais promotores do switch terapêutico, conforme descrito em outra parte neste documento. Além disso, em certas modalidades, pelo menos um domínio de proteína heterólogo aos domínios de FKBP e/ou FRB na primeira e na segunda proteína quimérica pode ser um ou mais domínios de ação ou efetor. Os domínios efetores podem ser selecionados de uma ampla variedade de domínios de proteína incluindo domínios de ligação de DNA, domínios de ativação de transcrição, domínios de localização celular e domínios de sinalização (ou seja, domínios que são capazes mediante formação de agrupamentos ou multimerização, de desencadear crescimento celular, proliferação, diferenciação, apoptose, transcrição genética, etc.).

[0242]Em certas modalidades, uma proteína de fusão contém pelo menos um domínio de ligação de DNA (por exemplo, um domínio de ligação de DNA a GAL4 ou

ZFHD1) e outra proteína de fusão contém pelo menos um domínio de ativação de transcrição (por exemplo, um domínio de ativação de transcrição VP16 ou p65). A

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79/127 associação mediada por ligantes das proteínas de fusão representa a formação de um complexo de fator de transcrição e resulta na iniciação da transcrição de um gene alvo ligado a uma sequência de DNA reconhecida pelo (ou seja, capaz de se ligar com) domínio de ligação de DNA em uma das proteínas de fusão. Informações sobre o sistema de expressão gênica, bem como do ligante, são divulgadas nas Patentes U.S. n. 6,187,757; 6,649,595; 6,509,152; 6,479,653; e 6,117,680.

[0243]Em outras modalidades, a presente invenção fornece um sistema de switch de gene que compreende polinucleotídeos que codificam duas proteínas de fusão que se autoagregam na ausência de um ligante, em que (a) a primeira proteína de fusão compreende um domínio de agregação condicional que se liga a um ligante selecionado e um domínio de ativação de transcrição, e (b) a segunda proteína de fusão compreendendo um domínio de agregação condicional que se liga a um ligante selecionado e um domínio de ligação de DNA, e (c) na ausência de ligante, as células expressam um gene operacionalmente ligado ao DNA regulador ao qual o referido domínio de ligação de DNA se liga. As células modificadas que compreendem o sistema de switch de gene são expandidas na presença do ligante em uma quantidade suficiente para repressão gênica. A remoção do ligante induz a expressão da proteína codificada que causa a morte celular. Os ácidos nucleicos que codificam as duas proteínas de fusão estão sob controle de pelo menos um promotor condicional. O sistema de expressão gênica que utiliza domínios de agregação condicional é divulgado na Publicação U.S. n. 2002/0048792.

C. Sistema de Switch de Gene Baseado em Repressor/Operador Procariótico [0244]Em uma modalidade, a presente invenção fornece um sistema de switch de gene que compreende (a) um primeiro polinucleotídeo que codifica para uma proteína de fusão de transativador compreendendo um repressor de tetraciclina procariótica (tet) e um domínio de proteína ativadora transcricional eucariótica; e (b) um segundo polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo de frataxina, em que o

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80/127 referido segundo polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor mínimo e pelo menos uma sequência do operador de tet. O primeiro polinucleotídeo que codifica para uma proteína de fusão de transativador pode compreender promotor de switch terapêutico conforme descrito em outra parte deste documento.

[0245]Em outra modalidade, o sistema de switch de gene compreende os sistemas de repressor-operador de lactose (Lac) da bactéria Escherichia Coli. Ο sistema de switch de gene da presente invenção também pode compreender (a) um primeiro polinucleotídeo que codifica para uma proteína de fusão do transativador compreendendo um repressor de lac I procariótico e um domínio da proteína ativadora transcricional eucariótica; e (b) um segundo polinucleotídico que codifica para um polipeptídeo de frataxina, em que o referido segundo polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor do switch de gene. No sistema Lac, um óperon lac é inativado na ausência de lactose, ou análogos sintéticos, tais como isopropil-b-D-tioglicosídeo.

[0246]Os sistemas de switch de gene adicionais incluem aqueles descritos a seguir: US7,091,038; W02004078924; EP1266015; US20010044151;

US20020110861; US20020119521; US20040033600; US20040197861;

US20040235097; US20060020146; US20040049437; US20040096942;

US20050228016; US20050266457; US20060100416; W02001/70816;

W02002/29075; W02002/066612; W02002/066613; W02002/066614;

W02002/066615; W02005/108617; US6.258.603; US20050209283;

US20050228016; US20060020146; EP0965644; US 7,304,162; US7,304,161; MX234742; KR10-0563143; AU765306; AU2002-248500; e AU2002-306550.

D.Combinação dos Sistemas de Switch de Gene [0247]A presente invenção fornece composições de ácido nucleico, células modificadas e biorreatores compreendendo dois ou mais sistemas de switch de gene que compreendem diferentes complexos de fator de transcrição ligante-dependentes

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81/127 que são ativados por uma quantidade eficaz de um ou mais ligantes, em que dois ou mais sistemas de switch de gene compreendem um primeiro switch de gene e um segundo switch de gene, ambos os quais induzem seletivamente a expressão de um ou mais polipeptídeos de interleucina, mediante ligação a um ou mais ligantes. Dentro do escopo da presente invenção estão quaisquer números e/ou combinações de sistemas de switch de gene.

[0248]Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição de ácido nucleico que compreende um sistema de switch de gene que compreende:

i. um primeiro cassete de expressão gênica que compreende um polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo híbrido que compreende:

1. um domínio de transativação, que ativa um promotor operacionalmente associado a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de frataxina; e

2. um domínio parceiro de heterodímero, ii. um segundo cassete de expressão gênica que compreende um polinucleotídeo que codifica um segundo polipeptídeo híbrido que compreende:

1. um domínio de ligação ao DNA, que reconhece um promotor regulado por fator operacionalmente associado a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da frataxina; e

2. um domínio de ligação do ligante; e iii. um terceiro cassete de expressão gênica compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de frataxina, o referido terceiro cassete de expressão gênica compreendendo:

1. um promotor induzível, que é ativado pelo domínio de transativação do segundo polipeptídeo híbrido; e,

2. um polinucleotídeo que codifica o referido polipeptídeo da frataxina.

[0249]Em certas modalidades, a combinação de dois ou mais sistemas de switch de gene pode ser (1) um sistema de expressão gênica baseado no receptor de

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82/127 ecdisona de switch duple e (2) um switch de gene baseado em receptor de ecdisona de switch único. Em outras modalidades, a combinação pode ser (1) um switch de gene baseado em receptor de ecdisona de switch único ou duplo e (2) um switch de gene baseado em rapamicina. Alternativamente, a combinação de sistemas de switch de gene pode ser dois sistemas de switch de gene baseados em rapamicina idênticos divulgados acima. Quaisquer combinações possíveis dos sistemas de switch de gene estão dentro do âmbito da invenção. Exemplos de sistemas de ecdisona de switch duplo podem ser encontrados, por exemplo, em WO 2002/29075 e US 2002/0110861.

E.Outros Switches Gênicos [0250]Em outro aspecto da invenção, os cassetes de expressão gênica da invenção incorporam um sistema de switch cumato, que funciona por meio do repressor CymR que liga as sequências de operador cumato com alta afinidade. (SparQ™ Cumate Switch, System Biosciences, Inc.). A repressão é atenuada pela adição de cumato, uma molécula pequena não tóxica que se liga ao CymR. Este sistema tem uma indutibilidade dinâmica, pode ser finamente ajustado e é reversível e induzível.

[0251 ]Em outro aspecto da invenção, os cassetes de expressão gênica da invenção incorporam um riboswitch, que é um segmento regulador de uma molécula de RNA mensageiro que se liga a um efetor, resultando em uma mudança na produção das proteínas codificadas pelo mRNA. Um mRNA que contém um riboswitch está diretamente envolvido na regulação de sua própria atividade em resposta às concentrações de sua molécula efetora. Efetores podem ser metabolites derivados de cofatores de purina/pirimidina, aminoácidos, vitamina ou outras moléculas pequenas. Esses efetores atuam como ligantes para o sensor do riboswitch ou aptâmero. Breaker, RR. Mol Cell. (2011) 43(6):867-79.

[0252]Em outro aspecto da invenção, os cassetes de expressão gênica da invenção incorporam o sistema de switch de gene baseado em biotina, em que a

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83/127 proteína repressora bacteriana TetR é fundida à estreptavidina, que interage com o sinal de biotinilação sintético AVITAG que é fundido a VP16 para ativar a expressão gênica. A biotinilação do peptídeo AVITAG é regulada por uma biotina ligase bacteriana BirA permitindo, assim, a responsividade do ligante. Weber et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 104, 2643-2648; Weber et al. (2009) Metabolic Engineering, 11 (2):117-124.

[0253]Sistemas adicionais de switch de gene que podem ser usados como parte da presente invenção são bem conhecidos na técnica incluindo, sem limitação, aqueles descritos em Auslander e Fussenegger, Trends in Biotechnology (2012), 31 (3):155-168, incorporado a este documento por referência.

Ligantes do Switch de Gene [0254]Conforme usado neste documento, o termo ligante, conforme aplicado aos switches gênicos (por exemplo, switches gênicos baseados em EcR), descreve moléculas pequenas e solúveis com a capacidade de ativar um switch de gene para estimular a expressão de um polipeptídeo codificado nele. O ligante para um complexo de fator de transcrição ligante-dependente da invenção se liga ao complexo de proteína que compreende um ou mais dentre domínio de ligação do ligante, domínio de parceiro heterodímero, domínio de ligação ao DNA e domínio de transativação. A escolha do ligante para ativar o complexo do fator de transcrição ligante-dependente depende do tipo do switch de gene utilizado.

[0255]Exemplos de ligantes incluem, sem limitação, um eedisteroide, tal como eedisona, 20-hidroxiecdisona, ponasterona A, muristerona A, e similares, ácido 9-cisretinoico, análogos sintéticos do ácido retinoico, Ν,Ν'-diacil-hidrazinas, tais como aqueles divulgados na Patente U.S. n. 6,013,836; 5,117,057; 5,530,028; e 5,378,726 e Pedido Publicado U.S. n. 2005/0209283 e 2006/0020146; oxadiazolinas, conforme descrito no Pedido Publicado U.S. n. 2004/0171651; dibenzoilalquil cianohidrazinas, tais como aquelas divulgadas no Pedido Europeu n. 461,809; N-alquil-N,N'-diaroilPetição 870190059402, de 26/06/2019, pág. 88/175

84/127 hidrazinas, tais como aquelas divulgadas na Patente U.S. n. 5,225,443; N-acil-Nalquilcarbonil-hidrazinas, tais como aquelas divulgadas no Pedido Europeu n. 234,994; N-aroil-N-alquil-N'-aroil-hidrazinas, tais como aquelas divulgadas na Patente U.S. n. 4,985,461; amidocetonas, tais como aquelas descritas no Pedido Publicado U.S. n. 2004/0049037; cada um dos quais está incorporado neste documento por referência e outros materiais similares, incluindo 3,5-di-terc-butil-4-hidroxi-N-isobutilbenzamida, 8-O-acetil-harpagida, oxiesterois, 22(R) hidroxicolesterol, 24(S) hidroxicolesterol, 25-epoxicolesterol, T0901317, 5-alfa-6-alfa-epoxicolesterol-3sulfato (ECHS), 7-cetocolesterol-3-sulfato, farnesol, ácidos biliares, ésteres de 1,1bifosfonato, hormônio juvenil III, e similares. Exemplos de ligantes de diacil-hidrazina úteis na presente invenção incluem RG-115819 (N-(1 -etil-2,2-dimetil-propil)-N'-(2metil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido 3,5-dimetil-benzoico), RG-115932 (N-(1terc-butil-butil)-N'-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetilbenzoico), e RG-115830 (N-(1-terc-butil-butil)-N'-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazidade ácido 3,5-dimetil-benzoico). Ver, por exemplo, Pedido de Patente U.S. n. de série 12/155,111, publicado como US 2009/0163592, e Pedido PCT n. PCT/US2008/006757, ambos os quais estão incorporados integralmente neste documento por referência.

[0256]Por exemplo, um ligante para o switch de gene baseado no receptor de ecdisona pode ser selecionado a partir de quaisquer ligantes adequados. A ecdisona de ocorrência natural e/ou os análogos de ecdisona (por exemplo, 20-hidroxiecdisona, muristerona A, ponasterona A, ponasterona B, ponasterona C, 26-iodoponasterona A, inokosterona ou 26-mesilinokosterona) e indutores não esteroides podem ser usados como um ligante para o switch de gene da presente invenção. A Patente U.S. n. 6,379,945 B1, descreve um receptor de esteroide de inseto isolado de Heliothis virescens (HEcR) que é capaz de atuar como um switch de gene responsive a indutores esteroides e certos indutores não esteroides. Indutores não esteroides têm

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85/127 uma vantagem distinta sobre os esteroides, neste e em muitos outros sistemas que são responsivos a ambos os indutores, esteroides e não esteroides, por várias razões, incluindo, por exemplo: custo de fabricação mais baixo, estabilidade metabólica, ausência de insetos, plantas ou mamíferos e aceitabilidade ambiental. A Patente U.S. n. 6,379,945 B1 descreve a utilidade de duas dibenzoil-hidrazinas, 1,2-dibenzoil-1 terc-butil-hidrazina e tebufenozida (N-(4-etilbenzoil)-N'-(3,5-dimetilbenzoil)-N'-tercbutil-hidrazina) como ligantes para um switch de gene com base em ecdisona. Também incluídas na presente invenção como um ligante estão outras dibenzoilhidrazinas, tais como aquelas divulgadas na Patente U.S. n. 5,117,057 B1. Uso de tebufenozida como um ligante químico para o receptor de ecdisona de Drosophila melanogaster também é divulgado na Patente U.S. n. 6,147,282. Além disso, exemplos não limitantes de ligantes de ecdisona são 3,5-di-terc-butil-4-hidroxi-Nisobutil-benzamida, 8-O-acetil-harpagida, uma 1,2-diacil hidrazina, uma hidrazina N'substituída-N,N'-dissubstituída, uma dibenzoilalquil cianohidrazina, uma Nsubstituída-N-alquil-N,N-diaroil hidrazina, uma N-substituída-N-acil-N-alquil, carbonil hidrazina ou uma N-aroil-N'-alquil-N'-aroil hidrazina. (Ver Patente U.S. n. 6,723,531).

[0257]Em uma modalidade, o ligante para um sistema de switch de gene baseado em ecdisona é um ligante de diacil-hidrazina ou ligante de diacil-hidrazina quiral. O ligante usado no sistema de switch de gene pode ser compostos da Fórmula

Formula I

Fórmula I em que

A é alcóxi, arilalquilóxi ou arilóxi;

B é aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído; e

R¹ e R² são, independentemente, alquil opcionalmente substituído, arilalquil,

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86/127 hidroxialquil, haloalquil, cicloalquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, heterociclo opcionalmente substituído, aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído;

ou sais farmaceuticamente aceitáveis, hidrates, formas cristalinas ou formas amorfas destes.

[0258]Em outra modalidade, o ligante pode ser compostos enriquecidos enantiomericamente da Fórmula II

Formula II

Fórmula II em que

A é alcóxi, arilalquilóxi, arilóxi, arilalquil, aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído;

B é aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído; e

R¹ e R² são, independentemente, alquil opcionalmente substituído, arilalquil, hidroxialquil, haloalquil, cicloalquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, heterociclo opcionalmente substituído, aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído;

com a ressalva de que R¹ não é igual a R²;

em que a configuração absoluta no átomo de carbono assimétrico que porta R¹ e R² é predominantemente S;

ou sais farmaceuticamente aceitáveis, hidrates, formas cristalinas ou formas amorfas destes.

[0259]Em certas modalidades, o ligante pode ser compostos enriquecidos enantiomericamente da Fórmula III

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Formula III

Fórmula III em que

A é alcóxi, arilalquilóxi, arilóxi, arilalquil, aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído;

B é aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído; e

R¹ e R² são, independentemente, alquil opcionalmente substituído, arilalquil, hidroxialquil, haloalquil, cicloalquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, heterociclo opcionalmente substituído, aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído;

com a ressalva de que R¹ não é igual a R²;

em que a configuração absoluta no átomo de carbono assimétrico que porta R¹ e R² é predominantemente fí;

ou sais farmaceuticamente aceitáveis, hidrates, formas cristalinas ou formas amorfas destes.

[0260]Em uma modalidade, um ligante pode ser N-(1 -terc-butil-butil)-N'-(2-etil3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico tendo um excesso enantiomérico de pelo menos 95% ou um sal farmaceuticamente aceitável, hidrato, forma cristalina ou forma amorfa deste.

[0261 ]Os ligantes de diacil-hidrazina da Fórmula I e ligantes de diacil-hidrazina quiral da Fórmula II ou III, quando usados com um sistema de switch de gene baseado em ecdisona, fornecem os meios para regulação temporal externa da expressão de um polipeptídeo de frataxina da presente invenção. Ver Pedido U.S. n. 12/155,111, publicado como US 2009/0163592, depositado em 29 de maio de 2008, que está totalmente incorporado por referência neste documento.

[0262]Os ligantes usados na presente invenção podem formar sais. O termo

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88/127 sal(is), como usado neste documento, denota sais ácidos e/ou básicos formados com ácidos e bases inorgânicos e/ou orgânicos. Além disso, quando um composto da Fórmula I, II ou III contiver uma fração básica e uma fração ácida, os zwitterions (sais internos) poderão ser formados e estarão incluídos dentro do termo sal(is), como usado neste documento. Sais farmaceuticamente aceitáveis (isto é, não tóxicos, fisiologicamente aceitáveis) são usados, embora outros sais também sejam úteis, por exemplo, em etapas de isolamento ou purificação que podem ser empregadas durante a preparação. Os sais dos compostos da Fórmula I, II ou III podem ser formados, por exemplo, pela reação de um composto com uma quantidade de ácido ou base, tal como uma quantidade equivalente, em um meio, tal como um em que o sal precipite ou em um meio aquoso seguido por liofilização.

[0263]Os ligantes que contêm uma fração básica podem formar sais com uma variedade de ácidos orgânicos e inorgânicos. Sais de adição ácidos exemplares incluem acetates (tais como aqueles formados com ácido acético ou ácido trihaloacético, por exemplo, ácido trifluoroacético), adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, benzenossulfonatos, bissulfatos, boratos, butiratos, citratos, canforatos, canforsulfonatos, ciclopentanopropionatos, digluconatos, dodecilsulfatos, etanossulfonatos, fumaratos, glucoheptanoatos, glicerofosfatos, hemissulfatos, heptanoatos, hexanoatos, cloridratos (formados com ácido clorídrico), bromidratos (formados com brometo de hidrogênio), hidroiodetos, 2-hidroxietanossulfonatos, lactatos, maleatos (formados com ácido maleico), metanossulfonatos (formados com ácido metanossulfônico), 2-naftalenossulfonatos, nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfates, 3-fenilpropionatos, fosfates, picrates, pivalates, propionates, salicilatos, succinates, sulfates (tais como aqueles formados com ácido sulfúrico), sulfonates (tais como aqueles mencionados neste documento), tartaratos, tiocianatos, toluenossulfonatos, tais como tosilatos, undecanoatos, e similares.

[0264]Os ligantes que contêm uma fração ácida podem formar sais com uma

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89/127 variedade de bases orgânicas e inorgânicas. Sais básicos exemplares incluem sais de amônio, sais de metal alcalino, tais como sais de sódio, lítio e potássio, sais de metal alcalino-terroso, tais como, sais de cálcio e magnésio, sais com bases orgânicos (por exemplo, aminas orgânicas), tais como benzatinas, diciclohexilaminas, hidrabaminas (formadas com N,N-bis(dehidroabietil)etilenodiamina), N-metil-Dglucaminas, N-metil-D-glucamidas, t-butil aminas, e sais com aminoácidos, tais como arginina, lisina e similares.

[0265]Exemplos não limitantes dos ligantes para o sistema de expressão de gene induzível que utiliza o domínio de ligação FK506 são FK506, Ciclosporina A, ou Rapamicina. FK506, rapamicina, e seus análogos são divulgados na Patente U.S. n. 6,649,595 B2 e 6,187,757. Ver também Patente U.S. n. 7,276,498 e 7,273,874.

[0266]Os ligantes descritos neste documento podem ser administrados sozinhos ou como parte de uma composição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas estão na forma de soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas, pomadas, elixires ou composições injetáveis.

[0267]Certas modalidades da invenção serão descritas agora com referência a exemplos específicos que são fornecidos unicamente para ilustrar a invenção e não devem ser interpretados como sendo limitantes de nenhuma forma.

EXEMPLOS [0268]Certos aspectos da invenção serão agora descritos, mas não devem ser interpretados como limitantes da invenção.

Materiais e Métodos usados nos Exemplos

A.Desenho de Matriz e Desenho dos Experimentos [0269]O ciclo de desenho inicial de Frataxina foi realizado em três fases.

Primeiro, as partes foram selecionadas com base em dados históricos e consideração de especialistas e precedência na literatura para o tipo celular alvo in vivo (DRGs). Em

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90/127 segundo lugar, a matriz fatorial completa foi formulada. O terceiro desenho experimental ideal D foi realizado no fatorial completo. Isso resultou em um subconjunto da matriz que descobre a variância máxima e leva mais rapidamente ao desenvolvimento de um modelo preditivo.

[0270]Uma matriz de expressão constitutiva de ~80 construtos, com variações no promotor e elementos reguladores 573' foi projetada e analisada usando algoritmos do Desenho de Experimento para reduzir o número de construtos necessários para testar adequadamente os níveis de expressão alta e média de FXN (potencialmente representando níveis superfisiológicos e fisiológicos, respectivamente). O promotor de 1.255 bp essencial mínimo de FXN, conforme descrito em Greene et al. (2005), foi incluído na matriz para fornecer níveis potencialmente fisiológicos de expressão de FXN. Outros promotores constitutivos incluíram EF1a, UBC e PGK1. Cinquenta construtos foram gerados a partir da matriz original de 80.

[0271 ]A matriz foi reduzida a 50 vetores com controles de expressão positivo e superfisiológico adicionais incluídos na triagem de expressão: CAG-FXN-hGHpA e CMV-5U2-FXN-hGHpA. O promotor CMV, conhecido por ser um promotor muito forte, não foi incluído na matriz uma vez que é conhecido por ser silenciado ao longo do tempo in vivo (McCown et al. (1996) Brain Res. 713:99-107; Klein et al. (1998) Exp. Neurol. 150:183-194; Paterna etal. (2000) Gene Ther. 7, 1304-1311; Tenenbaum et al. (2004) J. Gene Med. 6 (Complemento 1), S212-S222). O construto CAG-FXNhGHpA com o promotor CAG (híbrido de beta-actina de galinha), também urn forte promotor, foi incluído como um comparador. O promotor CAG também contém o potenciador precoce de CMV e o primeiro éxon e o primeiro intron do gene da betaactina de galinha, e o aceptor de 5' splice do gene da beta-globina de coelho. Este promotor híbrido, e outras variações dele, são rotineiramente usados em aplicações de terapia gênica com AAV (por exemplo, Flotte et al. (2011) Hum. Gene Ther.

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22:1239-1247; Maclachlan etal. (2011) Mol. Ther. 19:326-334; Perdomini etal. (2014) Nature Med. 20:542-547).

[0272]Os 50 vetores e controles da matriz foram construídos usando técnicas de clonagem padrão. Os vetores e controles da matriz foram gerados em uma estrutura principal de AAV, onde o cassete de expressão foi inserido entre as duas sequências de repetição terminal invertida de AAV (ITR) que são essenciais para empacotar o genoma no serotipo do capsídeo de AAV selecionado. Os construtos também incluíram sequências de “volume” que variam de 1.001 bp a 2.500 bp para trazer o tamanho do genoma para ~4,2 kb que é ideal para o empacotamento do capsídeo. Os construtos tiveram a sequência completamente verificada usando tecnologias de sequenciamento de nova geração, incluindo o kit de preparação de DNA Nextra XT da Illumina com alguma modificações. Um subconjunto destes é apresentado neste documento e está listado na Tabela 1.

B.Procedimentos, Ensaios e Análise da Transfecção [0273]No dia 0, células SY5Y congeladas (European Collection of Cell Cultures, ECACC operado por Public Health England), Sigma Cat # 94030304; Lote # 13C014) foram semeadas em um balão original e incubadas a 37^QC, 5% CO2, umidade de saturação. Separadamente, fibroblastos de FA congelados (Coriell; Cat #GM03816) foram semeados em um balão original e incubados a 37^QC, a 5% CO2, umidade de saturação.

[0274]No dia 3, quando as SY5Y e fibroblastos estavam a 75% de confluência, os meios de cada balão foram aspirados, e as células foram lavadas uma vez com 10 mL de DPBS (Gibco, sem cálcio, magnésio, Cat#14190), antes de ressuspendê-las em 3 mL de Tripsina-EDTA (0,25%, Gibco Cat# 25200) e incubando-as por 3 minutos em RT. 5 mL de meio foram adicionados para neutralizar a tripsina em cada balão. As células foram coletadas de cada um dos balões T75 em tubos Falcon de 15 mL e centrifugadas a 1000 rpm em uma centrífuga de mesa Sorval por 5 minutos em RT.

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Os sobrenadantes foram descartados e as células foram ressuspensas em 2 mL de meio fresco. As células foram agitadas gentilmente para quebrar quaisquer aglomerados. As células foram então divididas em 1:2 e 1 mL das suspensões celulares foram adicionadas a 4 balões T75 cada.

C.Transfecção [0275]No dia 0, 4,0 x10⁴ células SY5Y e fibroblastos de FA vivas foram plaqueadas em 0,4 mL/poço de quatro placas tratadas com a cultura de tecido de 48 poços. As células foram coletadas por aspiração e descarte do meio, lavando cada balão uma vez com 10 mL de DPBS, aspirando e descartando o DPBS, ressuspendendo as células em 3 mL de Tripsina-EDTA e incubando-as por 3 minutos em RT. 5 mL de meio foram então adicionados para neutralizar a tripsina em cada balão e as células foram coletadas em tubos Falcon de 15 mL e centrifugadas a 1000 rpm em uma centrífuga de mesa Sorval por 5 minutos em RT. Os sobrenadantes foram descartados e as células foram ressuspensas em 2 mL de meio fresco com fibroblastos e as células de cada um dos 2 tipos celulares foram agrupadas (fibroblastos separadamente das SY5Y). As células foram agitadas gentilmente para quebrar quaisquer aglomerados.

[0276]As células foram contadas, adicionando-se 10 pL de suspensão celular a 90 pL de azul tripano diluído e misturadas gentilmente antes de introduzir as células em um hemacitômetro para contar as células. Obtivemos como vivas/mortas: 6,5 x 10⁶ células/mL de SY5Y e 1,8 χ 10⁶ células/mL de fibroblastos de FA, em que a viabilidade: 83/85 = 97,6% para SY5Y e 82/85 = 96,5% para fibroblastos de FA.

[0277]Em seguida, 4,0 x10⁴ células SY5Y e fibroblastos de FA foram plaqueados em cada um dos poços das placas de 48 poços contendo 0,4 mL de meio

DMEM/F12 fresco (Gibco, Cat# 11320-033, complementado com soro bovino fetal (FBS) inativado por calor a 10% (Atlanta Bio, Cat# S11550H). As placas foram agitadas de lado a lado e para frente e para trás para distribuir uniformemente as

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93/127 células. As placas foram incubadas durante a noite a 37^QC, a 5% de CO2, umidade de saturação.

[0278]Para fibroblastos de FA, no Dia 1, as células foram observadas para confluência e aparência geral. Foram preparados complexos de DNA:TransfeX (1:1) para fibroblastos de FA. Um tubo para cada plasmídeo foi marcado e havia 3 tubos para cada um dos plasmídeos. O TransfeX, DNA plasmidial, e Meio com Soro Reduzido Opti-MEM I (Gibco, Cat #31985-062, com L-Glutamina, w/HEPES, w/2,4g/L NaBicarb) foram aquecidos até a temperatura ambiente e agitados suavemente até misturar. 50 μΙ_ de Meio com Soro Reduzido Opti-MEM I foram pipetados em tubos de microcentrífuga estéreis. Volumes apropriados de DNA plasmidial (0,75 pg de DNA) foram adicionados por tubo e misturados completamente através de pipetagem suave. Em seguida, 0,75 pl_ de TransfeX Reagent (ATCC, Cat # ACS-4005) foi adicionado à mistura de DNA diluída em cada um dos tubos. Os complexos de TransfeX:DNA foram completamente misturados por pipetagem, seguido de sacudidelas dos tubos. Os complexos de TransfeX:DNA foram incubados em temperatura ambiente por 15 minutos. Os tubos foram centrifugados (rotação curta) para forçar todo 0 líquido para 0 fundo dos tubos Eppendorf. Para adicionar os complexos de transfecção aos fibroblastos de FA, os complexos foram distribuídos para as células através da adição dos complexos, em gotas, a diferentes áreas dos poços (50 μΙ_ de mistura a cada um dos três poços em triplicatas). Os recipientes de cultura foram suavemente agitados para trás e para frente e de lado a lado para distribuir uniformemente os complexos TransfeX:DNA e incubados por ~72 horas.

[0279]Para as células SY5Y, no Dia 1, os complexos de DNA:Fugene 6 (1:3) foram preparados. Um tubo para cada plasmídeo foi marcado e havia 3 tubos para cada um dos plasmídeos. O FuGene 6, DNA plasmidial e Meio com Soro Reduzido

Opti-MEM I foram aquecidos à temperatura ambiente e agitados suavemente até misturar. 50 μΙ_ de Meio com Soro Reduzido Opti-MEM I foram pipetados em tubos de

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94/127 microcentrífuga estéreis. Em seguida, 2,25 μΙ_ de Fugene 6 Reagent (Promega, Cat # 2692) foram adicionados aos meios em cada um dos tubos e incubados por 5 minutos. Volumes apropriados de DNA plasmidial (0,75 pg de DNA) foram adicionados por tubo e misturados completamente através de pipetagem suave. Os complexos de transfecção de reagente/meios/DNA foram completamente misturados através de pipetagem seguida de sacudidelas dos tubos. Os complexos foram incubados em temperatura ambiente por 15 minutos. Os tubos foram centrifugados (rotação curta) para forçar todo o líquido para o fundo dos tubos Eppendorf. Para adicionar os complexos de transfecção às células SY5Y, os complexos foram distribuídos para as células através da adição dos complexos, em gotas, a diferentes áreas dos poços (50 μΙ_ de mistura a cada um dos três poços em triplicatas). Os recipientes de cultura foram suavemente agitados para trás e para frente e de lado a lado para distribuir uniformemente os complexos e incubados por ~72 horas.

[0280]No Dia 4, o sinal de fluorescência de GFP foi verificado (visualmente) e as células foram lisadas em tampão de lise celular (para cada 10 mL de tampão de lise celular: 200 uL (potenciador de extração celular 50X) + 2 mL (tampão de extração celular 5X) + 7,8 mL (água Dl, Gibco, Cat # A12873) + 1 comprimido de inibidor de Protease/EDTA (Roche, Cat # 04693159001). Resumidamente, os sobrenadantes de cada um dos poços das quatro placas de 48 poços foram aspirados e as células foram lavadas duas vezes com PBS resfriado 1X (todas as etapas do procedimento realizadas em gelo). O tampão de lise resfriado foi adicionado a 150 pL/poço. As células em cada poço foram raspadas para garantir a lise celular usando a parte inferior de uma ponteira P1000. As placas com células no tampão de lise foram incubadas a 4^QC em um agitador por 30 minutos. Os Usados celulares foram coletados por pipetagem para cima e para baixo sem formar espuma e adicionando-se a um tubo de microcentrífuga. Os Usados foram centrifugados a 4^Q C, 18.000 rpm por 20 min. Os Usados celulares foram então transferidos para um novo tubo de

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95/127 microcentrífuga e armazenados a -800C até estarem prontos para uso no ELISA de Frataxina (ver abaixo).

[0281 ]No Dia 5, as concentrações de proteína total dos Usados celulares de SY5Y e de fibroblastos de FA transfectados com a matriz FXN foram determinadas usando o Protocolo de ensaio Micro BCA Assay (Pierce, Cat # 23235; Lote # PK 207908) de acordo com as instruções do fabricante.

[0282]No Dia 6, os teores de FXN nas amostra de SY5Y e fibroblasto de FA transferidas da matriz FXN foram determinados usando o ELISA de FXN (FRATAXIN Human Simple Step ELISA, Abeam ab176112) de acordo com a recomendação do fabricante com a exceção de que todas as amostras e Padrões foram diluídos em PBS 1X. Resumidamente, os reagentes, os padrões de trabalho e as amostras foram preparados de acordo com as instruções do fabricante do Abeam Kit. Todos os materials e reagentes foram equilibrados à temperatura ambiente antes do uso. Todos os padrões, controles e amostras foram executados em duplicatas.

[0283]Uma alíquota de 50 pL de cada amostra ou padrões foi adicionada aos poços apropriados. Os Usados de células SY5Y foram diluídos em 1:150 e os fibroblastos de FA foram diluídos em 1:50 com base nos dados de concentração de proteína total obtidos do ensaio micro BCA (Pierce, Cat # 23235; Lote # PK 207908) de acordo com as instruções do fabricante. Uma alíquota de 50 pL do coquetel de anticorpos (anticorpo de captura 1X mais anticorpo detector 1X fornecido no kit de ELISA de Frataxina e preparados de acordo com as instruções do fabricante) foi para cada poço. A placa foi vedada e incubada por 1 hora em temperatura ambiente em um agitador de placa definido para 400 rpm. Cada poço foi lavado com 3 x 350 pL com tampão de lavagem PT 1X (tampão fornecido no kit de ELISA de Frataxina e preparado de acordo com as instruções do fabricante) por aspiração ou decantação dos poços, distribuindo, em seguida, 350 pL de tampão de lavagem PT 1X em cada poço. Após a última lavagem, a placa foi invertida e submetida ao blot contra toalhas

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96/127 de papel limpas para remover o excesso de líquido. 100 pl_ de substrato TMB foram adicionados a cada poço e incubados por 10 minutos no escuro em um agitador de placa definido para 400 rpm. 100 μΙ_ de solução de parada foram então adicionados a cada poço. A placa foi agitada em um agitador de placa por 1 minuto para misturar. OD a 450 nm de cada poço foi registrado como uma leitura de parâmetro.

[0284]Plasmídeos: Descrição do construto na Tabela 1. Todos os construtos contêm um agente de volume que varia de 1001 a 3000 bp para garantir o tamanho ideal de empacotamento do genoma para o AAV.

Tabela 1. Construtos selecionados

nQ/nome	Composição*
Promotor	Reg 5'	Reg 3'
CMV	CMV (SEQ ID NO:13)	5U2 (SEQ ID NO:4)	hGHpA (SEQ ID NO:5)
012	UBC (SEQ ID NO:3)	FTH1-5'UTR (SEQ ID NO:14)	SV40 precoce (SEQ ID NO:8)
017	UBC (SEQ ID NO:3)	FTH1-5'UTR (SEQ ID NO:14)	SV40 tardio (SEQ ID NO:9)
020	UBC (SEQ ID NO:3)	GAPDH (SEQ ID NO:15)	Outro
021	UBC (SEQ ID NO:3)	RPL6-5'Splice (SEQ ID NO:16)	Outro
023	UBC (SEQ ID NO:3)	GAPDH (SEQ ID NO:15)	elemento regulador 3’ sintético (SEQ ID NO:7)
024	UBC (SEQ ID NO:3)	5U2 (SEQ ID NO:4)	elemento regulador 3’ sintético

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97/127

nQ/nome	Composição*
Promotor	Reg 5'	Reg 3'
			(SEQ ID NO:7)
025	UBC (SEQ ID NO:3)	RPL6-5'Splice (SEQ ID NO:16)	elemento regulador 3’ sintético (SEQ ID NO:7)
026	UBC (SEQ ID NO:3)	5U2 (SEQ ID NO:4)	hGHpA (SEQ ID NO:5)
034	PGK1 (SEQ ID NO:17)	GAPDH (SEQ ID NO:15)	SV40 tardio (SEQ ID NO:9)
GFP	CMV (SEQ ID NO:13)	n/a	desconhecido
Simulação

D. Fabricação do Vetor AAV5 [0285]As partículas virais, incluindo, mas não se limitando a, vírus, vetores, virions, veículos de distribuição de genes, rAAVs, capsídeos e capsídeos vazios, úteis na prática da presente invenção, podem ser construídas usando métodos bem conhecidos na técnica de biologia molecular. Os vetores virais que portam transgenes podem ser montados a partir de polinucleotídeos que codificam o transgene, elementos reguladores adequados e elementos necessários para a produção de proteínas virais que medeiam a transdução celular.

[0286]A Substância Biológica, AAV5.hFXN é um vírus adeno-associado recombinante (rAAV) contendo cDNA de hFXN WT. O inserto de gene (por exemplo, “transgene”) codifica um precursor da proteína frataxina humana, cuja expressão se destina a aumentar a quantidade de frataxina mitocondrial nos sujeitos tratados. O

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98/127 cDNA de hFXN no vetor foi quimicamente sintetizado de novo para corresponder à sequência do mRNA da frataxina humana normal descrito na Sequência de Referência: NM_000144.4 (na internet na URL ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000144).

[0287]Descrição do construto 026: Os principais elementos do vetor de DNA de fita única AAV5 recombinante são mostrados na Figura 21. Os elementos do vetor são descritos em mais detalhes na Tabela 3.

Tabela 3: Descrição dos Elementos do Vetor de DNA de Fita Única.

Bases do nucleotídeo	Identificador do elemento	Descrição
1 - 141	ITR	repetição terminal invertida de AAV2
142 - 191	não mostrado	Sítios da enzima de restrição
192 - 762	Promotor UBC	Promotor da Ubiquitina C Humana (UBC)
763 - 784	não mostrado	Sítios da enzima de restrição
785 - 964	5U2	Elemento regulador 5’ sintético
965 - 970	não mostrado	Sítio da enzima de restrição
971 - 1609	hFXN GOI	cDNA de FXN humano
1610-1635	não mostrado	Sítios da enzima de restrição
1636 - 2262	hGH-Poli A	Hormônio de Crescimento Humano Poli A
2263 - 2283	não mostrado	Sítios da enzima de restrição
2284 - 4533	Peptídeo de ligação de ITR	Peptídeo de ligação sintético
4534 - 4451	não mostrado	Sítio da enzima de restrição
4452 - 4691	ITR	repetição terminal invertida de AAV2

[0288]Um exemplo representativo de uma sequência nucleotídica do plasmídeo rAAV5.hFXN (SEQ ID NO: 20) é mostrado na Fig. 20. As modalidades da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a homólogos funcionais da

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99/127 sequência nucleotídica do plasmídeo rAAV5.hFXN (SEQ ID NQ:20).

[0289]Um exemplo representativo de um vetor contendo um inserto de gene é uma sequência nucleotídica da sequência nucleotídica (SEQ ID NO:19) mostrada na Fig. 19. A sequência representa o plasmídeo pAAV5.hFXN a partir do início da ITR esquerda até a extremidade da ITR direita. As modalidades da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a homólogos funcionais da sequência nucleotídica (SEQ ID NO:19).

Formulação Farmacêutica [0290]Q produto biológico, o vetor rAAV5.hFXN é formulado em uma solução tamponada e estéril adequada para injeção intratecal. As composições exemplares são mostradas na Tabela 4 e Tabela 5.

Tabela 4: Composição Exemplar do Produto do Vetor AA5.hFXN

Componente	Concentração	Função
AAVõ.hFXN	5 x 1013 vg/mL	Ingrediente ativo
NaCI	7,01 gm/L	Diluente do vetor ativo que imita as principais espécies químicas iônicas, concentrações e pH (7,3) do líquido cefalorraquidiano
KCI	0,208 gm/L
CaCI2	0,233 gm/L
MgCI2	0,029 gm/L
Na2HPO4	1,10 gm/L
NaH2PO4	0,329 gm/L
H20	qs 1,0 L

Tabela 5: Composição Exemplar do Produto do Vetor AA5.hFXN

Componente	Concentração	Função
AAVõ.hFXN	2,5 x 1011 vg/mL	Ingrediente ativo
NaCI	0,154M	pH (7,4)
Na2HPO4	0,056M

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100/127

KH2PO4

0,0106 M

Tabela 7: Composição Exemplar do Produto do Vetor AA5.hFXN

Componente	Concentração	Função
AAVõ.hFXN	5 x 1013 vg/mL	Ingrediente ativo
NaCI	0,337M	pH (7,0)
KCI	0,027 M
Na2HPO4	0,015M
KH2PO4	0,0015M

Exemplo 1 (A) Triagem da Série 1 [0291 ]As transfecções ocorreram em placas de 48 poços em duplicatas. Para cada construto, as células dos dois poços foram agrupadas, analisadas para os níveis de proteína total (BCA) e então analisadas para os níveis de FXN por ELISA. Os níveis de FXN foram normalizados para o teor de proteína total e as barras de erro representam duplicatas do ensaio ELISA. Mostrados nas Fig. 1 e Fig. 2, respectivamente, estão os níveis de expressão de FXN em células SY5Y não diferenciadas e fibroblastos de pacientes com FA com construtos empregando o promotor UBC. O Painel A da Fig. 1 e Fig. 2 mostra pg de FXN/ng de proteína total. O Painel B da Fig. 1 e Fig. 2 mostra a quantidade de FXN em relação à simulação. Com apenas exceção mínima, os promotores UBC (SEQ ID NO:3) e EF1 a (SEQ ID NO:18) forneceram maiores níveis de expressão de FXN em SY5Y e em fibroblastos de pacientes com FA (Fig. 2).

(B) Triagem da Série 2 [0292]As transfecções foram realizadas em placas de 48 poços em triplicatas, com DNA/preparação de lipídios separados para cada poço. Mostrados nas Fig. 3 e

Fig. 4 estão os resultados da triagem da Série 2. A expressão de FXN de construtos

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101/127 do promotor UBC e EF1 a (mais dois construtos do promotor FXN mínimo não incluídos na primeira triagem) foi avaliada e os resultados agrupados por elementos reguladores 5'.

(C)Triagem da Série 3 [0293]Com base nos resultados combinados das triagens primária (Série 1) e secundária (Série 2), 14 construtos de FXN foram selecionados para desenvolvimento posterior. Os resultados da segunda execução da corrida da triagem Terciária (Série 3) são mostrados abaixo nas Fig. 5 e Fig. 6 para ambos os tipos celulares.

Exemplo 2 [0294]Para demonstrar o sítio de expressão da frataxina nas células, fibroblastos de macaco verde africano (COS-7) ou fibroblastos murines (NC6) foram cultivados em lamínulas de vidro em condições de cultura padrão. O meio de cultura foi removido e as células foram fixadas com 1 ml de formalina/salina tamponada com fosfato (PBS) a 3,7% em temperatura ambiente por 10 min. As células foram lavadas três vezes por 10 minutos com 2 ml de PBS e, em seguida, foram tratadas com solução de bloqueio (1 ml de soro bovino fetal a 2%/Triton X-100 a 0,2%/PBS) por 1 hora em temperatura ambiente. Após uma incubação durante a noite a 40°C com anticorpo contra frataxina anti-humana (diluição de 1:500 em solução de bloqueio, Abeam #ab11038), as células foram lavadas três vezes por 10 minutos com PBS-T (Tween 20 a 0,2%/PBS). As células foram então incubadas no escuro com 250 ul de anticorpo de detecção secundário (Alexa Fluor 488 Gt anti-Ms IgG, Thermo Fisher #A-11017) na diluição de 1:500 em tampão de bloqueio por 1 hora em temperatura ambiente. Após três lavagens de 10 minutos com PBS-T, as lamínulas contendo as células foram colocadas viradas para baixo em lâminas de microscópio com uma gota de VectAshield Hard Set com contracoloração nuclear, DAPI (Vetor #H1500) e analisadas por microscopia confocal. Na Fig. 7, Painel A, núcleos foram corados com DAPI. No Painel B, as mitocôndrias foram coradas com MitoTracker. O Painel C

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102/127 mostra coloração com frataxina anti-humana. A co-localização fundida é mostrada no Painel D e demonstra que a Frataxina está sendo expressa nas mitocôndrias das células COS (Fig. 7) e células NC6 (Fig. 8).

Exemplo 3 [0295]Para demonstrar que a frataxina humana é expressa e processada corretamente nas células, realizou-se o seguinte experimento. Células-tronco pluripotentes induzíveis (iPSCs) derivadas de pacientes com FA podem ser diferenciadas em tipos celulares de cardiomiócitos e neuronais, tipos celulares específicos que são afetados em pacientes com FA, e mantêm os níveis de frataxina reduzidos e instabilidade de repetição tripla (Liu etal. (2011) Stem Cell Rev. 7(3):703713; Polak et al. (2012) J. Vis. Exp. 60:3416; Du et al. (2012) J. Biol. Chem. 287(35):29861-29872). As células neuronais são referidas como FA-iPSCs. Os neurônios de FA (3816) do Dia 21 foram transduzidos com frataxina AAV5-humana (026) a 500.000 cópias de genoma/célula. Os neurônios foram coletados no tampão de lise passiva (Promega #E1941) com inibidores da proteinase nos dias 5, 7, 10 e 14 após a transdução. A proteína total das células foi isolada usando sonicação. A concentração de proteína foi calculada usando o método de Bradford. 30ug total de proteína por faixa foi separada por SDS-PAGE (Thermo Fisher #NW04120BOX, 412% NuPage). A frataxina humana foi detectada com um anticorpo de frataxina antihumana (Abeam # ab11038) usando técnicas de Western blot padrão. Marcadores de peso molecular foram introduzidos para confirmar o tamanho da proteína frataxina madura (14,2 kDa). O Painel A da Fig. 9 mostra neurônios do dia 21 coletados nos dias 5 e 7 após a transdução (FA+) juntamente com células não transduzidas (FA) e IPSCs derivados de pacientes normais, que serviram como células controle (Ctrl). O Painel B da Fig. 9 mostra neurônios do dia 21 coletados nos dias 10 e 14 após a transdução (FA+) juntamente com células não transduzidas (FA) e IPSCs derivados de pacientes normais, que serviram como células controle (Ctrl). Os resultados

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103/127 mostram que a frataxina humana é expressa e corretamente processada nas células transduzidas de FA-AAV5.

[0296]A Fig. 10 mostra um esquema dos usos da terapia com células-tronco (adaptado de Stem Cell Therapy: A Panacea or Perturbed Claim! (30 de dezembro de 2014)(fonte: stemcells.uct.ac.za).

Exemplo 4 [0297]iPSCs do dia 8 foram transfectadas com 2 pg de DNA do construto de DNA de frataxina humana, 024 ou 026, usando o sistema de eletroporação BioRad Gene Pulser Xcell. A expressão da proteína frataxina foi determinada após 4 dias de tratamento (iPSCs do dia 12) usando o ensaio Frataxin Protein Quantity Dipstick Assay (AbCam #ab109881) e é expressa como sinal de anticorpo contra frataxina/mg de proteína total. As vezes de aumento na expressão de frataxina foram calculadas pela divisão da concentração/sinal de frataxina média em células tratadas pela concentração/sinal de frataxina em células controle simuladas (tratadas com GFP). A Fig. 11 mostra que 024 e 026 apresentaram uma concentração/sinal de frataxina média maior que 3 vezes e 3,5 vezes, respectivamente.

Exemplo 5 [0298]iPSCs do dia 8 foram transduzidas com frataxina AAV5-humana (AAV5hFXN) 024 e 026 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3,75 x 10⁵ de genomas do vetor (vg)/célula. A expressão da proteína frataxina foi determinada após 4 dias de tratamento (iPSCs do dia 12) usando o ensaio Frataxin Protein Quantity Dipstick Assay (AbCam #ab109881) e é expressa como sinal de anticorpo contra frataxina/mg de proteína total. As vezes de aumento na expressão de frataxina foram calculadas pela divisão da concentração/sinal de frataxina média em células tratadas pela concentração/sinal de frataxina em células controle simuladas (tratadas com GFP). A Fig. 12 mostra que 024 e 026 apresentaram uma concentração/sinal de frataxina média maior que 2.5 vezes e 3,5 vezes, respectivamente.

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104/127

Exemplo 6 [0299]O vetor de frataxina AAV5-humana foi injetado diretamente no cerebelo (CB) de quatro camundongos normais do tipo selvagem (WT) numa dose de 7 x 10⁹ vg em 3 μΙ. Em 4 semanas após a injeção, o cerebelo foi coletado de camundongos tratados, bem como dois camundongos não tratados. Os lisados teciduais foram analisados para a expressão de frataxina humana usando o Human Frataxin Simple Step ELISA (Abeam # 176112) e normalizados para pg de frataxina/mg de proteína total. A Fig. 13 mostra que mais de 30 ng e 70 ng de frataxina foram detectados para os lisados cerebelares 024 e 026, respectivamente. Nenhuma expressão de frataxina humana foi detectada nos animais não tratados (dados não mostrados).

Exemplo 7 [0300]0 vetor de frataxina AAV5-humana foi administrado por injeção intracerebroventricularem quatro camundongos normais do tipo selvagem (WT) numa dose de 7 x 10⁹ vg em 3 μΙ. Em 4 semanas após a injeção, o cerebelo (CB), o hipocampo (HPC) e o córtex anterior (ACX) foram coletados de camundongos tratados, bem como de dois camundongos não tratados. Os lisados teciduais foram analisados para a expressão de frataxina humana usando o Human Frataxin Simple Step ELISA (Abeam # 176112) e normalizados para pg de frataxina/mg de proteína total. Nenhuma expressão de frataxina humana foi detectada nos animais não tratados (dados não mostrados). A Fig. 14 mostra que o acúmulo de frataxina foi maior no hipocampo em 024 e 026, no entanto, 026 mostrou mais que 8 vezes mais frataxina no hipocampo do que 024.

Exemplo 8

Estudo clínico da terapia gênica com vetor AAV5.hFXN [0301 ]O vetor AAV5.hFXN é formulado em uma solução estéril contendo excipientes compendiais padrão. O vetor é administrado por injeção intratecal (IT). A dose total é de 5 x 10¹³ vg a 5 x 10¹⁴ vg em um volume máximo de 10 mL, que é

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105/127 aproximadamente 5% do volume do líquido cefalorraquidiano (LCR) médio em humanos de aproximadamente 200 mL (Vide D. Agamanolis 2013, Neuropathology: An illustrated interactive course for medical students and residents. Capítulo 14: Cerebrospinal Fluid.; Brown et al., “Molecular Mechanisms of Cerebrospinal Fluid Production. Neuroscience.” 2004, 129(4): 957-970.).

[0302]Um estudo de dose crescente único de Fase 1,3+3 avalia a segurança de AAV5.hFXN em pacientes adultos com FA. Uma dose única da formulação farmacêutica de AAV5.hFXN é administrada intratecalmente em coortes sucessivas de 3 sujeitos cada. Três doses crescentes de AAV5.hFXN são administradas, com uma revisão da segurança por um DSMB independente antes do registro do próximo nível de dose mais alto. Avaliações de segurança e neurológicas são realizadas periodicamente por 24 meses após a dose. Avaliações funcionais são realizadas.

[0303]É usado um Sistema de Cateter Intratecal Medtronic Modelo 8781 ASCENDA™ que pode distribuir drogas parenterais ao espaço intratecal. Os componentes do Sistema de Cateter incluem uma bomba Medtronic e o sistema de cateter - o cateter é implantado em um procedimento cirúrgico estéril realizado sob anestesia geral ou regional. O Sistema de Cateter é inserido no nível lombar, onde metade da dose a ser administrada é injetada e, em seguida, o cateter é rosqueado ao nível da cisterna magna usando imagens guiadas, onde a metade restante da dose é injetada.

[0304]Três doses opcionais são estudadas. A baixa dose testada no ensaio clínico é de 5 x 10¹³ vg. A dose intermediária é de 1,5 x 10¹⁴ vg. A alta dose é 5 x 10¹⁴ vg. Doses exemplares não limitantes são mostradas na Tabela 6.

Tabela 6

Dose de Vetor Total	Dose Total - Base de Volume do	Dose Total - Base de Peso
(vg)	LCR (vg/mL)	Cerebral (vg/g)
5,0 x 1013	2,5 x 1011	3,7 x 101°

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106/127

1,5 x 1014	7,5 x 1011	1,11 x 1011
5,0 x 1014	2,5 x 1012	3,7 x 1011

[0305]0s dados de eficácia são coletados em 1, 3, 6 e 12 meses após a administração da droga em estudo. A eficácia é avaliada em sujeitos usando imagens do tensor de difusão e vários desfechos funcionais (incluindo, entre outros, FARS total e FARS Neuro; avaliação de um teste de caminhada de 25 pés; avaliação em um sistema GAITRite Walkway; avaliação usando um sistema de equilíbrio Biodex SD; avaliação usando o teste 9-hole peg). As imagens do tensor de difusão podem ser medidas, por exemplo, pela relaxometria T2 do núcleo dentado e dos níveis de DRG e/ou NAA e níveis de ferro por geração de imagens por ressonância magnética (MRS).

Exemplo 9

Tratamento da Ataxia de Friedrich com Administração Intracerebelar da Terapia Gênica com Vetor AAV5.hFXN [0306]Uma Dose de Vetor Total de 5,0 x 10¹³(vg) da formulação farmacêutica com vetor AAV5.hFXN (2,5 x 10¹³ vg/mL com 1X PBS num pH de 7,4) é administrada a um paciente de 30 anos de idade com ataxia de Friedreich. O vetor distribui o gene hFXN no sistema nervoso central do paciente com ataxia de Friedrich. A formulação farmacêutica é administrada como uma injeção intracerebelar em bolus único. A taxa de injeção é controlada por uma bomba Medtronic SynchroMed®EL de 18 mL. A Dose de Vetor Total de 5,0 x 10¹³(vg) é administrada a uma taxa de 0,001 mL/min e numa concentração de 2,5 x 10¹³ vg/mL. Volume total = 2 mL.

[0307]Uma função melhorada em relação à progressão da doença natural é observada. Os aumentos em relação à base de referência na pontuação FARS total e FARS Neuro melhoram ao longo do tempo e alcançam significância estatística em 6 meses após o procedimento. Análises integradas do FARS total e FARS Neuro do paciente, teste de caminhada de 25 pés, Sistema GAITRite Walkway, Sistema de Equilíbrio Biodex SD, pontuações do teste 9-hole peg demonstram melhora

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107/127 estatisticamente significativa nas habilidades motoras grosseiras e finas tão cedo quanto 6 meses após a terapia gênica. Um benefício significativo do tratamento visto nas habilidades motoras geralmente continua a melhorar com o tempo. Após a cirurgia, o paciente demonstra, geralmente, aumentos contínuos em seu FARS total e FARS Neuro, teste de caminhada de 25 pés, Sistema GAITRite Walkway, Sistema de Equilíbrio Biodex SD, pontuações do teste 9-hole peg. Avaliações de segurança e neurológicas são realizadas periodicamente por 24 meses após a dose. Avaliações funcionais são realizadas. Em conclusão, a presente divulgação usando vetores virais AAV para transferir genes hFXN para tratar a Ataxia de Friedrich é prática e eficaz.

Exemplo 10

Tratamento da Ataxia de Friedrich com Administração Intracerebelar da Terapia Gênica com Vetor AAV5.hFXN [0308]Uma Dose de Vetor Total de 5,0 x 10¹⁴(vg) da formulação farmacêutica com vetor AAV5.hFXN (2,5 x 10¹⁴ vg/mL com 1X PBS num pH de 7,4) é administrada a um paciente de 30 anos de idade com ataxia de Friedreich. O vetor distribui o gene hFXN no sistema nervoso central do paciente com ataxia de Friedrich. A formulação farmacêutica é administrada como uma injeção intracerebelar em bolus único. A taxa de injeção é controlada por uma bomba Medtronic SynchroMed®EL de 18 mL. A Dose de Vetor Total de 5,0 x 10¹⁴(vg) é administrada a uma taxa de 0,01 mL/min e numa concentração de 2,5 x 10¹⁴ vg/mL. Volume total = 2 mL.

[0309]Uma função melhorada em relação à progressão da doença natural é observada. Os aumentos em relação à base de referência na pontuação FARS total e FARS Neuro melhoram ao longo do tempo e alcançam significância estatística em 6 meses após o procedimento. Análises integradas do FARS total e FARS Neuro do paciente, teste de caminhada de 25 pés, Sistema GAITRite Walkway, Sistema de Equilíbrio Biodex SD, pontuações do teste 9-hole peg demonstram melhora estatisticamente significativa nas habilidades motoras grosseiras e finas tão cedo

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108/127 quanto 6 meses após a terapia gênica. Um benefício significativo do tratamento visto nas habilidades motoras geralmente continua a melhorar com o tempo. Após a cirurgia, o paciente demonstra, geralmente, aumentos contínuos em seu FARS total e FARS Neuro, teste de caminhada de 25 pés, Sistema GAITRite Walkway, Sistema de Equilíbrio Biodex SD, pontuações do teste 9-hole peg. Avaliações de segurança e neurológicas são realizadas periodicamente por 24 meses após a dose. Avaliações funcionais são realizadas. Em conclusão, a presente divulgação usando vetores virais AAV para transferir genes hFXN para tratar a Ataxia de Friedrich é prática e eficaz.

Exemplo 11

Tratamento da Ataxia de Friedrich com Administração Intracerebroventricular da Terapia Gênica com Vetor AAV5.hFXN [0310]Uma Dose de Vetor Total de 3,5 x 10¹² vg da formulação farmacêutica com vetor AAV5.hFXN (7 x 10¹² vg/mL com DPBS num pH de 7,0) é administrada a um paciente de 25 anos de idade com ataxia de Friedreich. O vetor distribui o gene hFXN no sistema nervoso central do paciente com ataxia de Friedrich. A formulação farmacêutica é administrada como uma injeção intracerebroventricular em bolus único ao espaço do LCR do paciente. A taxa de injeção é controlada por uma bomba Medtronic SynchroMed®EL de 18 mL. A Dose de Vetor Total de 3,5 x 10¹² vg é administrada a uma taxa de 0,001 mL/min e numa concentração de 7 x 10¹² vg/mL. Volume total = 0,5 mL.

[0311]Uma função melhorada em relação à progressão da doença natural é observada. Os aumentos em relação à base de referência na pontuação FARS total e FARS Neuro melhoram ao longo do tempo e alcançam significância estatística em 6 meses após o procedimento. Análises integradas do FARS total e FARS Neuro do paciente, teste de caminhada de 25 pés, Sistema GAITRite Walkway, Sistema de Equilíbrio Biodex SD, pontuações do teste 9-hole peg demonstram melhora estatisticamente significativa nas habilidades motoras grosseiras e finas tão cedo

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109/127 quanto 6 meses após a terapia gênica. Um benefício significativo do tratamento visto nas habilidades motoras geralmente continua a melhorar com o tempo. Após a cirurgia, o paciente demonstra, geralmente, aumentos contínuos em seu FARS total e FARS Neuro, teste de caminhada de 25 pés, Sistema GAITRite Walkway, Sistema de Equilíbrio Biodex SD, pontuações do teste 9-hole peg. Avaliações de segurança e neurológicas são realizadas periodicamente por 24 meses após a dose. Avaliações funcionais são realizadas. Em conclusão, a presente divulgação usando vetores virais AAV para transferir genes hFXN para tratar a Ataxia de Friedrich é prática e eficaz.

Exemplo 12

Tratamento da Ataxia de Friedrich com Administração Intratecal da Terapia Gênica com Vetor AAV5.hFXN [0312]Uma Dose de Vetor Total de 5,0 x 10¹⁴(vg) da formulação farmacêutica com vetor AAV5.hFXN (2,5 x 10¹⁴ vg/mL com 1X PBS num pH de 7,4) é administrada a um paciente de 30 anos de idade com ataxia de Friedreich. O vetor distribui o gene hFXN no sistema nervoso central do paciente com ataxia de Friedrich. A formulação farmacêutica é administrada como uma injeção intratecal em bolus único ao espaço do LCR do paciente. Metade da dose é administrada à lombar do paciente, e metade da dose é administrada à cisterna magna do paciente. Um Sistema de Cateter Intratecal Medtronic Modelo 8781 ASCENDA™ com segmento espinhal de 66 cm é implantado em um procedimento cirúrgico estéril realizado sob anestesia geral ou regional. O Sistema de Cateter é inserido no nível lombar, onde metade da dose a ser administrada é injetada e, em seguida, o cateter é rosqueado ao nível da cisterna magna usando imagens guiadas, onde a metade restante da dose é injetada. A taxa de injeção é controlada por uma bomba Medtronic SynchroMed®EL de 18 mL. A Dose de Vetor Total de 5,0 x 10¹⁴(vg) é administrada a uma taxa de 0,01 mL/min e numa concentração de 2,5 x 10¹⁴ vg/mL. Volume total = 2 mL (1mL Lombar + 1mL cisterna magna).

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110/127 [0313]Uma função melhorada em relação à progressão da doença natural é observada. Os aumentos em relação à base de referência na pontuação FARS total e FARS Neuro melhoram ao longo do tempo e alcançam significância estatística em 6 meses após o procedimento. Análises integradas do FARS total e FARS Neuro do paciente, teste de caminhada de 25 pés, Sistema GAITRite Walkway, Sistema de Equilíbrio Biodex SD, pontuações do teste 9-hole peg demonstram melhora estatisticamente significativa nas habilidades motoras grosseiras e finas tão cedo quanto 6 meses após a terapia gênica. Um benefício significativo do tratamento visto nas habilidades motoras geralmente continua a melhorar com o tempo. Após a cirurgia, o paciente demonstra, geralmente, aumentos contínuos em seu FARS total e FARS Neuro, teste de caminhada de 25 pés, Sistema GAITRite Walkway, Sistema de Equilíbrio Biodex SD, pontuações do teste 9-hole peg. Avaliações de segurança e neurológicas são realizadas periodicamente por 24 meses após a dose. Avaliações funcionais são realizadas. Em conclusão, a presente divulgação usando vetores virais AAV para transferir genes hFXN para tratar a Ataxia de Friedrich é prática e eficaz.

Exemplo 13

Modelo de Camundongo Deficiente para Frataxina Sarsero [0314]É feita referência a JP Sarsero et al., “Human BAC-mediated rescue of the Friedreich ataxia knockout mutation in transgenic mice,” Mamm. Genome, male de 2004;15(5):370-82. O FVB;B6.Tg(FXN); modelo de camundongo FXN (#018299, The Jackson Laboratories) é hemizigoto para o transgene FXN*500GAA humane e homozigoto para o alelo nocaute da frataxina. Portanto, o camundongo é nulo para a frataxina murina e contém o gene da frataxina humana (com 500 repetições GAA no primeiro intron) inserido no Cromossomo 5. O modelo expressa um baixo nível da frataxina humana (-10%) que resgata a letalidade em camundongos e é semelhante à redução de frataxina em humanos, mas não gera nenhum fenótipo de doença característico de FA.

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A. Métodos [0315]Os camundongos foram anestesiados com isoflurano e colocados no aparelho estereotáxico (51725D Digital Just for Mice Stereotaxic Instrument, Stoelting, Wood Dale, IL). Uma incisão foi feita sagitalmente sobre o meio do crânio e a pele circundante foi empurrada para trás para ampliar a abertura. Os furos do buril foram perfurados no crânio usando uma broca de Dremel e uma broca dentária em orientação estereotáxica. Os camundongos receberam injeções intracerebelares bilaterais de 2 pL de AAV5-FXN-026 numa concentração de 7x10¹² de genomas do vetor/mL (N= 7) ou AAV5-GFP (controle) numa concentração de 4x10¹² de genomas do vetor/mL (N=3) usando uma seringa Hamilton de 10 pL com uma agulha de extremidade cega de calibre 27/capilar de vidro. O vírus foi injetado a 2,5 pL/min usando um método de distribuição aprimorado por convenção. A incisão cirúrgica foi fechada com suturas de nylon (Ethilon®). Alternativamente, os camundongos receberam injeções intracerebroventriculares bilaterais de 2 pL de AAV5-FXN-026 numa concentração de 7x10¹² vg/mL (N=7) ou AAV5-GFP (controle) numa concentração de 4x10¹² vg/mL (N=3) usando uma seringa Hamilton de 10 pL. Em 4 semanas após a injeção, os cerebelos foram coletados. O tecido cerebelar de dois camundongos controle não tratados também foi coletado. Os lisados teciduais foram analisados para a expressão de frataxina humana usando o Human Frataxin Simple Step ELISA (Abeam # 176112), um ensaio que detecta especificamente a frataxina humana.

B. Resultados [0316]Após diferentes vias de administração do vetor AAV5-FXN-026, a expressão da proteína frataxina nos tecidos específicos foi avaliada conforme mostrado na Figura 21. O nível detectável da proteína frataxina endógena no cerebelo foi o resultado da expressão a partir do transgene da frataxina humana incorporado que resgata o fenótipo nulo da frataxina murina. Após a administração

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112/127 intraparenquimal (IPc) no cerebelo, observou-se uma expressão aproximadamente 7 vezes maior da proteína frataxina em relação aos níveis de controle no cerebelo. Após a administração intracerebroventricular (ICV), houve uma expressão da proteína frataxina 4 vezes maior em relação aos níveis de controle no cerebelo.

C. Conclusões [0317]O AAV5-FXN-026 aumentou a expressão de frataxina no cerebelo de camundongos deficientes em frataxina em aproximadamente 4 vezes através da administração ICV e aproximadamente 7 vezes após a injeção IPc. O aumento da expressão em relação aos níveis de controle da proteína frataxina humana de AAV5-FXN-026 em um modelo de camundongo de FA fornece evidências de que os elementos promotor/reguladores no construto de DNA em AAV5-FXN-026 são funcionais no complexo ambiente in vivo. Assumindo um nível de 10% de expressão de frataxina normal neste modelo de camundongo, o nível de frataxina exógena alcançada após a transdução seria de 40-70% do normal e em um intervalo que é assintomático em humanos.

Exemplo 14

Estudo de Comparação da Via de Administração em Porcos [0318]A biodistribuição do artigo de teste, AAV5-FXN-026, foi estudada em suínos usando vários locais e dispositivos de distribuição. Cinco grupos de tratamento de três suínos Yucatan foram submetidos a um procedimento cirúrgico no qual o(s) local(is) de dosagem (lombar, lombar e cisterna magna, ou núcleo dentado) foram acessados. O artigo de teste foi administrado no Dia 0 através de uma agulha espinhal na lombar (Grupo 2), um cateter Medtronic ASCENDA™ na lombar e cisterna magna (Grupo 3), um cateter Alcyone Pulsar na lombar e cisterna magna (Grupo 4), uma agulha espinhal no núcleo dentado (Grupo 5), ou uma cânula Alcyone MEMS (AMC™) no núcleo dentado (Grupo 6). O artigo de teste foi administrado em um nível de dose de 3 x 10¹³ (Grupos 2 a 4) ou 3 x 10¹² (Grupos 5 e 6) de genomas virais (vg) e um

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113/127 volume de dose de 2,2 a 2,3 ou 0,12 a 0,146 mL, respectivamente. Um animal serviu como o controle e não foi submetido a procedimento cirúrgico ou tratamento (Grupo 1). Os animais foram mantidos por um período de recuperação de 28±1 dia.

[0319]Observações para morbidade, mortalidade, lesão e disponibilidade de alimentos e água foram realizadas duas vezes ao dia para todos os animais. Observações clínicas foram realizadas para todos os animais diariamente nos Dias 1 a 7 e semanalmente posteriormente. Os pesos corporais foram medidos e registrados para todos os animais semanalmente, começando durante a Semana -1. Exames físicos foram realizados para todos os animais antes do teste. Na conclusão do estudo, os exames de necropsia foram realizados e os tecidos selecionados foram analisados para concentrações do artigo de teste por análise por qPCR.

[0320]0s resultados da biodistribuição foram variáveis dentro e entre cada grupo. Os níveis de AAV5-FXN-026 na área do núcleo dentado do cerebelo foram maiores nos animais que receberam infusão direta no cerebelo (Grupos 5 e 6).

A. Procedimento Cirúrgico [0321 ]O artigo de teste foi administrado no Dia 0 através de agulha espinhal na lombar (Grupo 2, 2,2 mL a 3 x 10¹³ vg), um cateter Medtronic ASCENDA na lombar e cisterna magna (Grupo 3, 2,2 mL a 3 x 10¹³ vg), um cateter Alcyone Pulsar na lombar e cisterna magna (Grupo 4, 2,2 a 2,3 mL a 3 x 10¹³ a 3,14 x 10¹³ vg), uma agulha espinhal no núcleo dentado (Grupo 5, 0,12 mL a 3 x 10¹³ vg), ou uma cânula Alcyone MEMS (AMC™) no núcleo dentado (Grupo 6, 0,13 a 0,146 mL a 2,71 x 10¹² a 3,04 x 10¹² vg). Um animal serviu como o controle e não foi submetido a procedimento cirúrgico ou tratamento (Grupo 1). Os animais foram mantidos por um período de recuperação de 28±1 dia.

(a). Grupo 2 - Injeção Lombar (Agulha Espinhal) [0322]Cada animal foi colocado em repouso ventral. Uma incisão foi feita na pele próxima à cauda até L2-L3. Uma agulha espinhal 14G foi avançada para o espaço

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114/127 intratecal em L2-L3. A colocação foi verificada por imagens fluoroscópicas e/ou técnicas de gotas penduradas, bem como refluxo retrógrado do líquido cefalorraquidiano (LCR). Uma imagem fluoroscópica da colocação da agulha foi gerada e a colocação do cateter foi verificada com uma injeção de contraste de Omnipaque-300. A agulha foi lavada com 1,5 mL de solução salina. O artigo de teste (2,2 mL) foi coletado em uma seringa 3 cc e dosado durante 48 a 72 segundos. Um tempo de permanência de pelo menos 1 minuto foi permitido após a conclusão da injeção. A agulha foi removida e a incisão foi fechada de forma padrão usando qualquer combinação de suturas absorvíveis, grampos de pele, ou cola de pele.

(b). Grupo 3 - Injeção Lombar e na Cisterna Magna (Medtronic ASCENDA ™, Cateter Modelo 8780) [0323]Cada animal foi colocado em repouso ventral. Uma incisão foi feita na pele próxima à cauda até L3-L4. Uma agulha introdutora 16G foi avançada no espaço intratecal em L3-L4.

[0324]A colocação foi verificada por imagens fluoroscópicas e/ou técnicas de gotas penduradas, bem como o fluxo retrógrado do LCR. Uma imagem fluoroscópica da colocação da agulha foi gerada e a colocação do cateter foi verificada com uma injeção de contraste de Omnipaque-300. O cateter Medtronic ASCENDA™ foi avançado em orientação fluoroscópica com o alvo da região da cisterna magna. A agulha introdutora foi retirada do espaço intratecal e o cateter foi lavado com 1,5 mL de solução salina. O artigo de teste (2,2 mL) foi coletado em uma seringa 3 cc. Uma metade do volume total do artigo de teste (1,1 mL) foi dosada na cisterna magna durante 30 segundos e lavada com 1 mL de solução salina. O cateter foi reposicionado na região lombar superior (L1) em orientação fluoroscópica, e a segunda metade do volume total do artigo de teste (1,1 mL) foi dosada durante 30 a 45 segundos e lavada com 1 mL de solução salina. O cateter foi então removido e a incisão foi fechada de forma padrão usando qualquer combinação de suturas absorvíveis, grampos de pele,

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115/127 ou cola de pele.

(c) . Grupo 4 - Injeção Lombar e na Cisterna Magna (Cateter Alcyone Pulsar) [0325]Cada animal foi colocado em repouso ventral. Uma incisão foi feita na pele próxima à cauda até L3-L4. Uma agulha introdutora 16G foi avançada no espaço intratecal em L2-L3 ou L3-L4. A colocação foi verificada por imagens fluoroscópicas e/ou técnicas de gotas penduradas, bem como o fluxo retrógrado do LCR. Uma imagem fluoroscópica da colocação da agulha foi gerada e a colocação do cateter foi verificada com uma injeção de contraste de Omnipaque-300. O cateter Alcylone Pulsar foi avançado em orientação fluoroscópica para a região da cisterna magna. A agulha introdutora foi retirada do espaço intratecal e o cateter foi lavado com 1,5 mL de solução salina. O artigo de teste (2,2 mL) foi coletado em uma seringa 3 cc. Uma porção do volume total do artigo de teste (1,1 a 1,4 mL) foi dosada na cisterna magna durante 20 a 29 segundos e lavada com 1 mL de solução salina. O cateter foi reposicionado para L1 em orientação fluoroscópica, e a segunda metade do volume total do artigo de teste (0,9 a 1,1 mL) foi dosada durante 19 a 71 segundos e lavada com 1 mL de solução salina. O cateter foi então removido e a incisão foi fechada de forma padrão usando qualquer combinação de suturas absorvíveis, grampos de pele, ou cola de pele.

(d) . Grupo 5 - Injeção no Núcleo Dentado (Agulha Espinhal 22Ga) [0326]Cada animal foi colocado em repouso ventral. Uma incisão dorsal na linha média foi feita na superfície dorsal do crânio, estendendo-se para a região cervical. A base do crânio foi exposta e um marcador fiducial de ressonância magnética (IRM) foi colocado no osso occipital esquerdo e vedado no lugar com cera óssea. A incisão na pele foi temporariamente fechada com sutura, e o animal foi transportado para o scanner de IRM para geração de imagens coronais e sagitais do cerebelo. Uma vez que a IRM foi coletada, foi feito o upload deste para Osirix MD para fins de direcionamento. O animal foi colocado em uma estrutura imobilizadora para a

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116/127 cabeça e a incisão foi reaberta. Uma craniotomia no lado direito do crânio foi realizada com um buril. Com base nas coordenadas estereotáxicas de Osirix, uma agulha espinhal 22G de 3,50 polegadas (Agulha Espinhal BD com ponto de Quincke) foi inserida no cerebelo direito na área do núcleo dentado. Uma imagem fluoroscópica da colocação da agulha foi gerada e a colocação da agulha foi verificada com uma injeção de contraste de Omnipaque-300. O artigo de teste (0,15 mL) foi introduzido em um conjunto de extensão microbore, e uma bolha de separação de ar de 30 pL foi colocada. O restante da extensão microbore foi preenchido com solução salina estéril. O artigo de teste (0,12 mL) foi infundido a uma taxa de 10 pL/min durante aproximadamente 12 minutos. Um tempo de permanência de pelo menos 1 minuto foi permitido após a conclusão da dose. Cera óssea foi colocada no buraco do buril. A incisão foi fechada de forma padrão usando qualquer combinação de suturas absorvíveis, grampos de pele, ou cola de pele.

(e). Grupo 6 - Injeção no Núcleo Dentado (Cânula Alcyone MEMS (AMC™)) [0327]Cada animal foi colocado em repouso ventral. Uma incisão dorsal na linha média foi feita na superfície dorsal do crânio, estendendo-se para a região cervical. A base do crânio foi exposta e um marcador fiducial de IRM foi colocado no lado esquerdo do crânio. A incisão na pele foi temporariamente fechada com sutura, e o animal foi transportado para o scanner de IRM para geração de imagens coronais e sagitais do cerebelo. Uma vez que a IRM foi coletada, foi feito o upload deste para Osirix MD para fins de direcionamento. O animal foi colocado em uma estrutura imobilizadora para a cabeça e a incisão foi reaberta. Uma craniotomia no lado direito do crânio foi realizada com um buril. Com base nas coordenadas estereotáxicas do Osirix, a cânula Alcyone MEMS foi inserida no cerebelo direito na área do núcleo dentado. Uma imagem fluoroscópica da colocação da ponta do cateter foi gerada. O artigo de teste (0,13 a 0,146 mL) foi infundido a uma taxa de 10 pL/min durante 13 a 14 minutos e 40 segundos. Cera óssea foi colocada no buraco do buril. A incisão foi

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117/127 fechada de forma padrão usando qualquer combinação de suturas absorvíveis, grampos de pele, ou cola de pele.

B. Avaliações de Biodistribuição (qPCR) [0328]Amostras de tecido (100 a 200 mg por órgão) foram coletadas do cérebro, gânglios da raiz dorsal ((DRG) (cervical, lombar e torácico)), rim (esquerdo), medula espinhal (cervical, lombar e torácica), baço e fígado (lobo lateral esquerdo) de todos os animais sobreviventes para análise das concentrações do artigo de teste. Para tecidos cerebrais, as amostras foram retiradas dos hemisférios direito e esquerdo, mantendo a lateralidade e usando uma perfuração circular de 8 mm; foram coletadas amostras da região do córtex cerebelar (para incluir a camada de células de Purkinje), núcleo dentado, hipocampo e córtex motor. Os tecidos da medula espinhal foram coletados com uma perfuração circular de 8 mm de 4 a 6 mm de segmentos axiais na área do corno ventral para incluir tanto a massa branca quanto a cinza. DRG foram coletados como pares consistindo nos gânglios esquerdo e direito correlacionados aos segmentos da medula espinhal coletados. Um número suficiente de pares de DRG de cada região espinhal especificada foram coletados para obter de 100 a 200 mg de tecido.

[0329]A Figura 22 mostra cópias de DNA por pg de tecido do cerebelo. A Figura 23 mostra cópias de DNA por pg de tecido de outras áreas cerebrais. A Figura 24 mostra cópias de DNA por pg de tecido de tecidos espinhais. A Figura 25 mostra cópias de DNA por pg de tecido de tecidos sistêmicos. A administração intratecal e intracraniana de AAV5-FXN-026 foi bem tolerada em porcos Yucatan machos pesando de 51,0 a 55,2 kg. Os resultados da biodistribuição foram variáveis dentro e entre cada grupo. Os níveis de AAV5-FXN-026 na área do núcleo dentado do cerebelo foram maiores nos animais que receberam a infusão picada no cerebelo (Grupos 5 e 6). Em geral, as injeções com uma agulha espinhal 22Ga resultaram em altos níveis de AAV5-FXN-026 cerebelar. A administração intratecal, seja por um bolus lombar

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118/127 único (Grupo 2), por dosagem nas regiões intermediária/inferior e lombar com um cateter Medtronic ASCENDA (Grupo 3) ou por dosagem nas regiões cervical/cisterna magna e lombar com um cateter Alcyone Pulsar, resultou em níveis detectáveis de AAV5-FXN-026. O Alcyone Pulsar foi capaz de avançar para o nível de C1 ou da cisterna magna.

Exemplo 15

Estudo de Tolerância e Biodistribuição Intracerebelar em Porcos [0330]Uma injeção direta no núcleo dentado dos porcos avaliou a biodistribuição de AAV5-FXN-026. Dois grupos de tratamento de três ou seis suínos machos por grupo foram submetidos a um procedimento cirúrgico no qual uma única infusão do artigo de teste foi administrada no núcleo dentado do cerebelo após uma craniotomia do crânio. Os animais tratados foram administrados com o artigo de teste no Dia 0 em um nível de dose de 1 x 10¹² genomas virais (vg) (56 μΙ_) (dose baixa) ou 3 x 10¹² vg (167 μΙ_) (dose alta). Um grupo adicional de um animal macho serviu como o controle e não recebeu artigo de teste, nem foi submetido ao procedimento cirúrgico; este animal foi sacrificado no Dia 0 para fornecer os tecidos controle. Os animais foram mantidos por um período de recuperação de 28 ± 1 dia ou 60 ± 4 dias.

[0331]Observações para morbidade, mortalidade, lesão e disponibilidade de alimentos e água foram realizadas duas vezes ao dia para todos os animais. As observações clínicas foram realizadas diariamente nos Dias 1 a 7 e, em seguida, semanalmente depois disso. Os pesos corporais foram medidos e registrados, começando na Semana -1 e semanalmente durante o estudo. Exames físicos foram realizados antes do teste. Amostras de sangue para avaliações de patologia clínica foram coletadas de todos os animais antes do teste. Amostras de sangue foram coletadas para possível determinação futura das concentrações no sangue total do anticorpo para AAV5 de todos os animais antes do teste e antes de cada necropsia. Amostras do líquido cefalorraquidiano (LCR) foram coletadas para possível

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119/127 determinação da concentração no LCR do anticorpo para AAV5 antes do teste para os Grupos 2 e 3 e para todos os animais em cada necropsia. Na conclusão do estudo, cada animal foi sacrificado e um exame de necropsia foi realizado. Sangue e os tecidos selecionados foram coletados para qPCR e análise da proteína frataxina para todos os animais. Além disso, a análise por western blot foi realizada para o animal do Grupo 1 e um dos animais do Grupo 3.

[0332]Os resultados deste estudo encontraram uma distribuição extensa e persistente de AAV5-FXN-026 em todo o cérebro e na medula espinhal após uma única infusão no cerebelo. Cópias do genoma do vetor no cerebelo no Dia 28 vs 60 (vg DNA/pg DNA tecidual) são mostradas na Figura 26. Cópias do genoma do vetor no cérebro no Dia 28 vs 60 (vg DNA/pg DNA tecidual) são mostradas na Figura 27. Cópias do genoma do vetor na medula espinhal e DRG no Dia 28 vs 60 (vg DNA/pg DNA tecidual) são mostradas na Figura 28. Em 28 dias, os níveis mais elevados do genoma do vetor foram encontrados no cerebelo, no córtex motor e nos gânglios da raiz dorsal. Em 60 dias, o AAV5-FXN-026 ainda estava presente nesses tecidos, embora os níveis tivessem diminuído em relação aos 28 dias. Esses resultados demonstram uma afinidade do capsídeo de AAV5 pelos tratos do neurônio motor no SNC. Os níveis de AAV5-FXN-026 no sangue foram de indetectáveis na maioria dos animais no dia 28 para detectáveis em todos os animais no Dia 60, consistente com a depuração do vetor do SNC.

[0333]Analisando a expressão da proteína frataxina, amostras de tecido do córtex cerebelar, núcleo dentado, hipocampo e córtex motor foram coletadas. Os níveis de frataxina por ELISA são mostrados na Figura 29. Animais com dose baixa mostraram aumentos variáveis em relação aos níveis de controle basais de frataxina. No Dia 28 após a dose, os níveis de frataxina aumentaram entre 1,5 (córtex cerebelar) e 6,4 (hipocampo) vezes nos tecidos de controle de tecidos com baixa dose. Animais com dose alta, em 28 e 60 dias após a dose, mostraram que os níveis de frataxina

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120/127 aumentaram aproximadamente 2 (córtex motor) e 9 (núcleo dentado) vezes sobre os níveis observados nos tecidos de controle, não tratados. Esses resultados demonstram um aumento persistente da produção da proteína frataxina 60 dias após o tratamento com alta dose de AAV5-FXN-026.

[0334]Em geral, este estudo demonstrou que a infusão direta do artigo de teste em doses de 1x10¹²e 3x10¹² vg ao cerebelo resultou em uma biodistribuição extensa e persistente do capsídeo de AAV5 com uma afinidade para os tratos do neurônio motor.

Exemplo 16

Estudo Piloto de Tolerância e Biodistribuição Intracerebelar de 28 Dias em Prim atas [0335]Este estudo avaliou a tolerância e a biodistribuição de um vetor de frataxina humana AAV5, AAV5-hFXN (026), após a administração intracerebelar em macacos cynomolgus (Macaca fascicu laris).

[0336]Este estudo foi baseado nas diretrizes atuais International Council on Harmonization (ICH) Harmonized Tripartite Guidelines e nos procedimentos geralmente aceitos com o United States Department of Agriculture’s (USDA) Animal Welfare Act (9 CFR, Partes 1,2, e 3) e no Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy Press, Washington, D.C., 2011. (Vide “Guidance on non-clinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals,” ICH M3(R2), 11 de junho de 2009 e “Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals,” ICH S6 (R1), 16 de julho de 1997, (Adendo datado em 12 de junho de 2011)).

[0337]Dois grupos de tratamento de três macacos cynomolgus machos por grupo foram submetidos a um procedimento cirúrgico no qual uma infusão unilateral ou bilateral do artigo de teste foi administrada no núcleo dentado do cerebelo após

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121/127 uma craniotomia do crânio. Os animais tratados foram administrados com o artigo no Dia 1 a um nível de dose de 1,2 x 10¹² (30 μΙ_) ou 2,4 x 10¹² (30 pL/hemisfério) de genomas virais (vg) por animal. Um grupo adicional de dois animais machos serviu como o controle e recebeu uma infusão bilateral do artigo de controle, solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4. Os animais foram mantidos até o Dia 29 ± 1 dia de necropsia.

[0338]Observações para morbidade, mortalidade, lesão e disponibilidade de alimentos e água foram realizadas duas vezes ao dia para todos os animais. As observações clínicas foram realizadas diariamente começando no Dia 1. Batería de avaliações observacionais funcionais (FOB) e exames neurológicos foram realizados antes da dosagem (Dia 1), 24 e 48 horas após a dose, e 7, 14 e 28 dias após a dose. Os pesos corporais foram medidos e registrados semanalmente, começando no Dia -1. Amostras de sangue para avaliações de patologia clínica foram coletadas de todos os animais antes do teste e antes da necropsia. Na conclusão do estudo, os exames de necropsia foram realizados e os tecidos foram examinados microscopicamente. Sangue e tecidos selecionados foram coletados para análise por qPCR e por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) para a proteína frataxina.

[0339]Os resultados demonstraram uma afinidade do capsídeo de AAV5 para os tratos do neurônio motor no SNC. Após a análise do tecido cerebral para expressão da proteína frataxina por ELISA, 28 dias após a dose, os níveis de frataxina aumentaram entre aproximadamente 2 (córtex cerebelar) e 14 (núcleo dentado) vezes nos animais tratados com o artigo de teste em relação aos níveis observados nos tecidos dos animais controle. A administração do artigo de teste foi associada à infiltração de células mononucleares meníngeas dentro das meninges com agrupamento ocasional ao redor de pequenos vasos meníngeos (perivascular). Além disso, infiltrados mononucleares perivasculares mínimos também foram observados

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122/127 dentro do parênquima cerebral. A infiltração de células mononucleares é uma resposta tecidual não adversa esperada ao capsídeo viral.

[0340]Em resumo, os resultados deste estudo demonstraram que, após a infusão direta do artigo de teste AAV5-hFXN (026) nas doses de 1,2 x 10¹² vg e 2,4 x 10¹² vg ao cerebelo, uma biodistribuição extensa e persistente do capsídeo de AAV5 com uma afinidade pelos tratos do neurônio motor foi observada. A expressão de frataxina foi evidente no núcleo dentado e nas regiões do córtex do cerebelo, onde aumentos consistentes nos níveis de frataxina tecidual em relação aos tecidos de controle foram observados. Em 28 dias, os níveis mais elevados do genoma do vetor foram encontrados no núcleo dentado e no córtex cerebelar. Esses resultados demonstraram uma afinidade do capsídeo de AAV5 pelos tratos do neurônio motor no SNC. Estes resultados demonstraram ainda que a injeção intracerebelar do artigo de teste nas doses até 2,4 x 10¹²vg são bem toleradas e bem distribuídas em todo o SNC.

Preparação do Artigo de Teste e do Controle [0341 ]O artigo de teste, AAV5-hFXN (026), foi formulado em uma concentração de 4 x 10¹³ GC/mL e foi aquecida entre a temperatura ambiente e a temperatura corporal antes da dosagem. O artigo de controle foi PBS, pH 7,4.

Aquisição dos Animais [0342]Um total de nove macacos cynomolgus machos (Macaca fascicularis) (aproximadamente 3 anos de 10 meses a 4 anos 5 meses de idade no momento da transferência)

Randomização, Atribuição para o Estudo e Manutenção [0343]Usando um procedimento de randomização padrão, por peso, oito animais machos (pesando 3,4 kg a 4,9 kg na randomização) foram atribuídos ao estudo, conforme identificado na Tabela 8. Os animais foram mantidos até o Dia 29 ± dia de necropsia.

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Tabela 8 Atribuições aos grupos
Grupo Número	Via de administração	Tratamento	Dose (vg)	Número de animais machos
1	Injeção intracerebelar bilateral	PBS, pH 7,4	0	2
2	Injeção intracerebelar unilateral	AAV5-hFXN (026)	1,2 x 1012	3
3	Injeção intracerebelar bilateral	AAV5-hFXN (026)	2,4 x 1012	3

Procedimento Cirúrgico [0344]O controle e o artigo de teste foram administrados através de infusão intracerebelar unilateral (Grupo 2) ou bilateral (Grupos 1 e 3) na área do núcleo dentado. Os grupos tratados (Grupos 2 e 3) foram administrados com o artigo no Dia 1 em um nível de dose de 1,2 x 10¹² (30 μΙ) ou 2,4 x 10¹² (30 μΙ/hemisfério) de genomas virais (vg) por animal. O grupo controle (Grupo 1) recebeu uma infusão bilateral do artigo de controle, solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4. Os animais foram mantidos até o Dia 29 ± 1 dia de necropsia.

[0345]Após a indução da anestesia, o escalpo foi raspado e o animal foi montado em uma estrutura estereotáxica compatível com imagem por ressonância magnética (IRM). Uma IRM de base de referência foi dada para estabelecer os alvos e o animal foi então transportado para o conjunto cirúrgico. Uma incisão foi feita e a pele foi refletida. Uma craniotomia foi realizada com um fio K e uma broca canulada no(s) local(is) de injeção apropriado(s). Com base nas coordenadas estereotáxicas, uma agulha cega (calibre 22; 3,5 polegadas; B&D; número de referência 405181) foi inserida no cerebelo direito (e esquerdo, para administração bilateral) na área do núcleo dentado. A colocação da agulha foi confirmada através de fluoroscopia e injeção de contraste. O conector da agulha foi lavado com solução salina estéril antes de anexar a linha de dosagem. O controle ou artigo de teste (30 μΙ_ por infusão) foi introduzido no conjunto de extensão microbore com 30 μΙ_ de uma bolha de separação

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124/127 de ar. O restante da extensão microbore foi preenchido com solução salina estéril. Ο controle ou artigo de teste foi infundido a 10 pL/minuto durante 9 minutos para considerar o espaço vazio na agulha. A agulha foi deixada no lugar por pelo menos 2 minutos após a conclusão da infusão. Após a remoção da agulha, cera óssea foi colocada no orifício de perfuração e a incisão foi fechada de forma padrão usando qualquer combinação de suturas absorvíveis, grampos de pele, ou cola de pele.

Observações Clínicas Detalhadas [0346]Um exame clínico detalhado de cada animal foi realizado diariamente durante o estudo. Ocasionalmente, observações clínicas foram registradas em intervalos não programados. As observações incluíam, mas não se limitaram a, avaliação da pele, pelo, olhos, orelhas, nariz, cavidade oral, tórax, abdômen, genitália externa, membros e pés, efeitos respiratórios e circulatórios, efeitos autonômicos, tais como salivação, e efeitos no sistema nervoso, incluindo tremores, convulsões, reatividade ao manuseio e comportamento incomum.

Avaliações de Biodistribuição (Tecido, Sangue e Formulações) [0347]Amostras de sangue e tecido (aproximadamente 100 a 200 mg por amostra foram coletadas do cérebro (oito amostras por animal), medula óssea, coração, fígado, linfonodo cervical e rim. Para tecidos cerebrais, amostras foram coletadas dos hemisférios direito e esquerdo, mantendo a lateralidade. As amostras foram coletadas da região do córtex cerebelar (e incluíam a camada de células de Purkinje), área do cerebelo do núcleo dentado, hipocampo e córtex motor. Uma secção de cada tecido foi coletada usando uma biópsia por perfuração de 8 mm e colocada em tubos de microcentrífuga de 2 mL rotulados, congelada em nitrogênio líquido e, em seguida, colocada em gelo seco até ser armazenada congelada a -60 a -90°C antes da análise por qPCR.

[0348]Em cada dia da cirurgia, uma amostra (aproximadamente 100 pL) do artigo de teste foi injetada através da agulha e a amostra foi coletada, colocada em

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125/127 gelo seco e armazenada a -60 a -90°C antes da análise ou qPCR para a concentração do artigo de teste (vg/mL).

Coleta de Tecido para Análise da Proteína Frataxina [0349]Amostras das regiões do cérebro coletadas para análise por qPCR (pelo menos 50 mg) foram coletadas para análise por ELISA da proteína frataxina. As amostras foram retiradas dos hemisférios direito e esquerdo, mantendo a lateralidade e usando uma perfuração circular de 5 mm.

Análise por Western Blot para Localização de Frataxina em Mitocôndria [0350]Duas amostras do córtex cerebelar adicionais (aproximadamente 100 a 300 mg) foram retiradas de um Grupo 1 (número do animal 701) e todos os animais do Grupo 3 para potencial análise por western blot.

[0351]Exames neurológicos foram realizados por um veterinário da equipe nos Dias 1,2, 3, 7, 14 e 28. A resposta do nervo craniano, a sensação periférica e as respostas posturais/comportamentais foram avaliadas. Após o exame, todas as respostas/reflexos do nervo craniano e a resposta à dor superficial foram consideradas como estando dentro dos limites normais. Não houveram efeitos observados relacionados ao artigo de teste entre os parâmetros de patologia clínica no Dia 27 em macacos cynomolgus administrados com AAV5-hFXN (026) através de injeção intracerebelar no Dia 1 nas doses de 1,2 x 10¹² vg ou 2,4 x 10¹² vg.

[0352]Não houveram efeitos relacionados ao artigo nos parâmetros hematológicos em nenhum nível de dose. Todas as diferenças evidentes entre os parâmetros hematológicos não foram consideradas relacionadas ao artigo de teste devido a sua magnitude insignificante, falta de um padrão sensível à dose e/ou relação com os valores esperados para variação biológica e relacionada ao procedimento.

[0353]Não houveram efeitos relacionados ao artigo de teste nos tempos de coagulação (isto é, TTPA e tempos de protrombina) ou concentração de fibrinogênio em nenhum nível de dose. Todas as diferenças evidentes entre os parâmetros de

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126/127 coagulação não foram consideradas relacionadas ao artigo de teste devido a sua magnitude insignificante, falta de um padrão sensível à dose e/ou relação com os valores esperados para variação biológica e relacionada ao procedimento.

[0354]Não houveram efeitos relacionados ao artigo de teste nos parâmetros de química clínica em nenhum nível de dose. Todas as diferenças evidentes entre os parâmetros de química clínica não foram consideradas relacionadas ao artigo de teste devido a sua magnitude insignificante, falta de um padrão sensível à dose e/ou relação com os valores esperados para variação biológica e relacionada ao procedimento.

[0355]Não houveram achados macroscópicos relacionados ao artigo de teste; todos os tecidos de todos os animais foram considerados dentro dos limites normais.

[0356]Os achados microscópicos relacionados a AAV5-hFXN (026) foram limitados à presença de pequenas quantidades de infiltrados mononucleares nos animais que receberam 2,4 x 10¹²vg (injeções bilaterais) e 1,2 x 10¹²vg (injeção unilateral, direita). Infiltrados mononucleares não foram observados nos animais controle simultaneamente.

[0357]Na maioria dos animais, as células mononucleares meníngeas foram caracterizadas por acúmulo extensos focal a localmente de pequenas quantidades de células mononucleares dentro das meninges com agrupamento ocasional ao redor de pequenos vasos meníngeos (perivascular). Além disso, infiltrados mononucleares perivasculares mínimos também foram observados dentro do parênquima cerebral em uma pequena quantidade de animais (nas seções do córtex cerebelar direito e córtex motor direito de um animal a 1,2 x 10¹² vg, e no córtex cerebelar direito ou córtex motor esquerdo de animais únicos que receberam 2,4 x 10¹² vg). Os infiltrados mononucleares foram associados a e/ou apresentaram maior coloração/imunorreatividade a IBA-1. A infiltração de células mononucleares é uma descoberta esperada e é considerada como uma resposta tecidual não adversa ao capsídeo viral.

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Resultados e Discussão

Análise da Proteína Frataxina [0358]Amostras de tecido do córtex cerebelar, núcleo dentado, hipocampo e córtex motor foram coletadas e submetidas à análise dos níveis de frataxina (FIG. 30) por meio de ELISA. Os resultados desta análise encontraram níveis basais de frataxina nos animais controle com veículo. Os níveis de frataxina são discutidos como aumentos relativos nos níveis basais observados no animal controle. Os animais no Grupo 2 receberam uma única injeção no córtex cerebelar direito e os animais no Grupo 3 receberam injeções bilaterais. No Dia 28 após a dose, os níveis de frataxina foram observados por aumentar entre 1,2 e 6,6 (córtex cerebelar) e 2,7 a 14,5 (núcleo dentado) vezes em relação aos níveis observados nos tecidos controle. Em 28 dias após a dose, os níveis de frataxina foram aproximadamente equivalentes no hipocampo e no córtex motor. Esses resultados, embora variáveis, demonstram um aumento consistente de mais de 28 dias da produção da proteína frataxina após o tratamento com o artigo em teste tanto como uma injeção única quanto como uma injeção bilateral no núcleo dentado cerebelar e no córtex cerebelar.

Claims (56)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 .Polinucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de frataxina humana tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO:1 operacionalmente ligada a uma 5’UTR, em que a 5’ UTR é 5U2, FTH1, GAPDH, ou RPL6-5’Splice.
2. 2. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO:1.
3. 3. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:1.
4. 4. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:1.
5. 5. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:1.
6. 6. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO:1.
7. 7. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.
8. 8. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de frataxina humana está operacionalmente ligada a pelo menos um

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   2/7 elemento de controle, em que o elemento de controle é um promotor, um elemento regulador 3’, ou combinações destes.
9. 9. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzível.
10. 10. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um switch (interruptor) de gene que regula a expressão do referido promotor induzível.
11. 11 .Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido switch de gene é um switch de gene baseado no receptor de ecdisona (EcR).
12. 12. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido switch de gene baseado no receptor de ecdisona (EcR) é um switch de gene RHEOSWITCH THERAPEUTIC SYSTEM® (RTS®).
13. 13. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido promotor é um promotor CMV, um promotor UBC, um promotor EF1 a, um promotor PGK1 ou um promotor de frataxina mínimo.
14. 14. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido elemento regulador 3’ é uma sequência precoce de SV40, uma sequência tardia de SV40, um elemento regulador 3’ sintético tendo uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:7, ou uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano.
15. 15. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, e os referidos elementos de controle compreendem um promotor UBC, uma sequência 5U2 e uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano.
16. 16. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo

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    3/7 fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, e os referidos elementos de controle compreendem um promotor UBC, uma sequência 5U2 e um elemento regulador 3’ tendo uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:7.
17. 17. Vetor viral CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16.
18. 18. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido vetor é um vetor viral adeno-associado.
19. 19. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido vetor viral adeno-associado é AAV5.
20. 20. Vírion recombinante que compreende um vetor viral, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido vetor compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica a frataxina humana operacionalmente ligada a uma 5’UTR, em que a referida 5’UTR é 5U2, FTH1, GAPDH, ou RPL6-5’Splice, e os elementos de controle que direcionam a transcrição e tradução.
21. 21 .Vírion, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido vetor é um vetor viral adeno-associado.
22. 22. Vírion, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido vetor viral adeno-associado é AAV5.
23. 23. Vírion, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.
24. 24. Vírion, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que os referidos elementos de controle são um promotor, um elemento regulador 3’ ou combinações destes.
25. 25. Vírion, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzível.

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26. 26. Virion, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um switch de gene que regula a expressão do referido promotor induzível.
27. 27. Vírion, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido switch de gene é um switch de gene baseado no receptor de ecdisona (EcR).
28. 28. Vírion, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido switch de gene baseado no receptor de ecdisona (EcR) é um switch de gene RHEOSWITCH THERAPEUTIC SYSTEM® (RTS®).
29. 29. Virion, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido promotor é um promotor CMV, um promotor UBC, um promotor EF1a, um promotor PGK1 ou um promotor de frataxina mínimo.
30. 30. Vírion, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido elemento regulador 3’ é uma sequência precoce de SV40, uma sequência tardia de SV40, um elemento regulador 3’ sintético tendo uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:7, ou uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano.
31. 31 .Vírion, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, em que o referido promotor é um promotor UBC, e os referidos elementos reguladores são uma sequência 5U2 e uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano.
32. 32.Vírion, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, em que o referido promotor é um promotor UBC, e os referidos elementos reguladores são uma sequência 5U2 e um elemento regulador 3’ tendo uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:7.

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33. 33. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:

    (a) um vetor viral, em que o referido vetor compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica a frataxina humana operacionalmente ligada a uma 5’UTR selecionada do grupo consistindo em 5U2, FTH1, GAPDH e RPL6-5’Splice, e elementos de controle que direcionam a transcrição e tradução; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
34. 34. Composição, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido vetor é um vetor viral adeno-associado.
35. 35. Composição, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido vetor viral adeno-associado é AAV5.
36. 36. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 35, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.
37. 37. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 36, CARACTERIZADA pelo fato de que os referidos elementos de controle são um promotor, um elemento regulador 3’ ou combinações destes.
38. 38. Composição, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzível.
39. 39. Composição, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um switch de gene que regula a expressão do referido promotor induzível.
40. 40. Composição, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido switch de gene é um switch de gene baseado no receptor de ecdisona (EcR).
41. 41 .Composição, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido switch de gene baseado no receptor de ecdisona (EcR) é um switch de gene RHEOSWITCH THERAPEUTIC SYSTEM® (RTS®).

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    6/7
42. 42. Composição, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido promotor é um promotor CMV, um promotor UBC, um promotor EF1 a, um promotor PGK1 ou um promotor de frataxina mínimo.
43. 43. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 38, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido elemento regulador 3’ é uma sequência precoce de SV40, uma sequência tardia de SV40, um elemento regulador 3’ sintético tendo uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:7, ou uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano.
44. 44. Composição, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, em que o referido promotor é um promotor UBC, e os referidos elementos reguladores são uma sequência 5U2 e uma sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento humano.
45. 45. Composição, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, em que o referido promotor é um promotor UBC, e os referidos elementos reguladores são uma sequência 5U2 e um elemento regulador 3’ tendo uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:7.
46. 46. Método para tratar a Ataxia de Friedreich em um sujeito em necessidade, sendo o referido método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração, ao referido sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, de acordo com a reivindicação 33, em que a referida molécula de ácido nucleico é expressa pelas células do referido sujeito em um nível suficiente para melhorar pelo menos um sintoma da Ataxia de Friedreich no referido sujeito.
47. 47. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido pelo menos um sintoma da Ataxia de Friedreich é a perda de coordenação nos braços e/ou pernas; fadiga, comprometimento da visão, perda

    Petição 870190059402, de 26/06/2019, pág. 138/175

    7/7 auditiva, fala arrastada, escoliose acentuada, diabetes mellitus, cardiomiopatia hipertrófica ou arritmia cardíaca.
48. 48. Método, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida frataxina é expressa na mitocôndria.
49. 49. Método, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida frataxina é expressa no cerebelo.
50. 50. Método, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida frataxina é expressa no hipocampo.
51. 51 .Método, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida frataxina é expressa no córtex anterior.
52. 52. Método, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida frataxina é expressa no gânglio da raiz dorsal.
53. 53. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida frataxina é expressa no referido sujeito em um nível superior a 25% dos níveis normais de frataxina.
54. 54. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida frataxina é expressa no referido sujeito em um nível superior a 30% dos níveis normais de frataxina.
55. 55. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida frataxina é expressa no referido sujeito em um nível superior a 40% dos níveis normais de frataxina.
56. 56. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida frataxina é expressa no referido sujeito em um nível superior a 50% dos níveis normais de frataxina.