CN101263157B - Jnk信号转导通路的细胞通透肽抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白激酶抑制剂，更特别地，涉及蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的抑制剂。另外，本发明提供JNK抑制剂序列、嵌合肽、编码相同的核酸，以及用于治疗与JNK信号相关的病理生理异常的药用合成物。

Description

JNK信号转导通路的细胞通透肽抑制剂
技术领域
本发明涉及蛋白激酶抑制剂，更具体地说，涉及蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的抑制剂。另外，本发明提供JNK抑制剂序列、嵌合肽、编码相同的核酸，以及用于治疗与JNK信号相关的病理生理异常的药用合成物。
背景技术
氨基末端激酶是促分裂素原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP)激酶的应激活化组的成分之一。这些激酶用于控制细胞的成长和分化，更通常地，用于响应细胞的环境刺激。通过结合若干类别的细胞表面受体，激活JNK信号转导通路以响应环境应力。这些受体包括细胞因子受体、螺旋受体和受体酪氨酸激酶。在哺乳动物的细胞中，JNK用于生物处理，例如致癌性转化和调和适应响应环境压力。JNK也用于调制免疫响应，包括免疫细胞的熟化和分化，以及影响被免疫系统识别为破坏性的细胞中的程序性细胞死亡。JNK信号的唯一性使得其成为发展药用干预的希望目标。在一些神经系统疾病中，JNK信号特别地用于缺血性脑卒和帕金森病。治疗与JNK信号密切相关的疾病的一种方法是提供JNK信号通路的抑制剂。作为在先技术已知的这些抑制剂特别地包括：例如上游激酶抑制剂(例如，CEP-1347)、JNK的小化学抑制剂(SP600125和AS601245)、以及JNK与其基质(D-JNKI和I-JIP)之间的相互作用的肽抑制剂(例如，Kuan et al.，Current Drug Targets-CNS &Neurological Disorders，February 2005，vol.4，no.1，pp.63-67(5))，其中，通过例如与蛋白激酶的ATP-结合位点相竞争，JNK的小化学抑制剂可直接影响激酶的活性。
上游激酶抑制剂CEP-1347(KT7515)是混合系激酶家族的半合成抑制剂。CEP-1347(KT7515)可促进神经元的剂量存活，以抑制施用有1-甲基-4-苯基-四氢吡啶的老鼠体内的并在营养减少后的主要胚胎培养和分化的PC12细胞中的氨基末端激酶的活性。进一步地，CEP-1347(KT7515)可促进培养的鸡胚背根神经节、交感神经、睫状和运动神经(例如，Borasio et al.，Neuroreport.9(7)：1435-1439，May 11th 1998.)
发现小化学JNK抑制剂SP600125可降低磷酸化C-Jun的水平，以保护多巴胺能神经元，避免细胞凋亡，并部分存储C57BL/6N老鼠体内MPTP所致PD中的多巴胺的水平(Wang et al.，Neurosci Res.2004 Feb；48(2)；195-202)。这些结果进一步地指出JNK通路是在体内MPTP的神经中毒结果的主要介质，并且抑制JNK的活性可作为治疗PD的一种新的和有效的策略。
小化学抑制剂的进一步例子是前面所提到的JNK-抑制剂AS601245。AS601245抑制了JNK信号通路，并在脑缺血后，促进了细胞的存活。在体内，AS601245提供了显著的保护，以抵制短暂性全面缺血的沙土鼠的海马CA1区神经元的延迟损耗。通过JNK抑制，并因此通过c-Jun表达和磷化作用，以传递该影响(例如，Carboni et al.，J Pharmacol Exp Ther.2004 Jul；310(1)：25-32.Epub 2004Feb 26th)。
第三类的JNK信号通路的抑制剂代表前面所提到的JNK和其基质之间的相互作用的肽抑制剂。作为构建该抑制剂肽的起点，将使用本身的JNK蛋白的序列。特别地，这些蛋白包括JNK结合区(JBD)，并发生在各种不同的胰岛素结合(IB)蛋白，例如IB1或IB2。该示范性序列的结果是例如IB1[SEQID NO：13]，IB2[SEQ ID NO：14]、c-Jun[SEQ ID NO：15]和ATF2[SEQ ID NO：16]的JNK结合区之间的序列(例如，序列图1A-1C)。该序列揭示了部分地保留的8氨基酸序列(例如，图1A)。通过比较IB1和IB2的JBD，进一步揭示了7和3氨基酸的两块，其高度保留在这两个序列之间。
例如，WO 01/27268公开了在该序列基础上所构建的序列。特别地，WO01/27268公开了小细胞渗透合成的肽，其包括所谓的TAT细胞渗透序列，该TAT细胞渗透序列衍生自HIV-TAT蛋白的基础运输序列和IB1的最小的20氨基酸抑制序列。该两个成分共价地互相耦联。WO 01/27268公开的MAPK-JNK信号通路的示范性(目前仅有)抑制剂是例如LJNKI1(由L氨基酸所组成的JNK-抑制剂肽)或者耐酸性蛋白酶DJNKI1肽(由非本身的D氨基酸所组成的JNK抑制剂肽)。这些JNK-抑制剂(JNKI)肽特别是指JNK(JNK1，JNK2 andJNK3)。与上面所讨论的这些小的化合物抑制剂相反，WO 01/27268中的抑制剂序列，例如JNKI1抑制JNK与其基质之间的相互作用。通过其衍生自TAT的运输序列，可有效的将融合肽传送到细胞中。由于通过该运算成分所得到的新特性，可活性地将融合肽传送到细胞中，其中，融合肽将保持有效，知道蛋白水解降解。
然而，根据WO 01/27268，通过磷酸化酶(激酶)，仍然可容易地得到肽。作为对于激酶靶标的肽的任何氨基酸因此要进行磷酸化，其代表用于使得该肽失活的重要因素。因此，本发明的第一目的是提供新的抑制剂序列，以用于JNK信号通路，其可保持WO 01/27268所公开的肽的功能特性，并对于磷酸化酶(激酶)，提供增强的稳定性。
而且，根据WO 01/27268，抑制剂序列的分离和纯化步骤成本较高，特别是对于巨大数量的制备(例如，用于工业生产)。因此，本发明的第二目的是提供抑制剂序列，相对于现有技术，其能进行更容易和更低成本的生产和分离。
发明内容
通过具有长度少于150氨基酸的JNK抑制剂序列可实现这些目的，其中，如序列表中SEQ ID NO：1，2，3或4、相应的变体、片段或衍生物，JNK抑制剂序列包括至少一个氨基酸序列。
优选的，本发明的JNK抑制剂序列结合JNK和/或抑制至少一个有活性转录因子的JNK，例如c-Jun或ATF2(分别例如SEQ ID NO：15和16)或Elk1。
特别地，根据本发明，JNK抑制剂序列包括少于150氨基酸残基的总长度，优选的范围在5到15氨基酸残基，更优选的，10到100氨基酸残基，特别更优选的，10到75氨基酸残基，最优选的15到50氨基酸残基。
根据SEQ ID NO：1、2、3或4、或片段、衍生物或相应的变体，本发明的JNK抑制剂序列包括至少一个氨基酸序列。更优选的，根据SEQ ID NO：1、2、3或4、或变体、片段、或相应的衍生物，本发明的JNK序列可包括1个、2个、3个、4个或甚至更多的氨基酸序列复本。如果本发明中多于一个复本的话，那么根据SEQ ID NO：1、2、3或4、或变体、片段、或相应的衍生物，这些发明的氨基酸序列可直接地互相耦联，而不具有任何耦联体序列(linkersequence)或经过耦联体序列，该耦联体序列包括1到10，优选1到5个氨基酸。优选的，形成耦联体序列的氨基酸选自氨基乙酸或脯氨酸，作为氨基酸残基。更优选的，根据SEQ ID NO：1、2、3或4、或相应的片段、变体或衍生物，因此可通过2、3或更多的脯氨酸残基，将这些氨基酸序列隔离。
如上面所定义的，本发明的JNK抑制剂序列可包括L-氨基酸、D-氨基酸或两者的结合。优选的，本发明的JNK抑制剂序列包括至少1个，优选的至少3个，更优选的至少6个和特别更优选的至少10个D-和/或L-氨基酸，其中，在本发明的JNK抑制剂序列中，D-和/或L-氨基酸以区组(blockwise)、非区组或可替换的方式排列。
根据一优选实施例，本发明的JNK抑制剂序列可排它地包括L-氨基酸。然后，根据SEQ ID NO：1或3，本发明的JNK抑制剂序列可包括至少一个本身的JNK抑制剂序列。在本文中，根据完全地具有L-氨基酸的任何的SEQ IDNO：1or3，术语“本身的”或“本身的JNK抑制剂序列”是指非改变的发明的JNK抑制剂序列。
因此，本发明的JNK抑制剂序列可包括至少一个(本身的)氨基酸序列NH2-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH[SEQ ID NO：3]。作为在本文所使用，每一个X代表一个氨基酸残基，优选的，选自任意(本身的)氨基酸残基。Xn a代表一个氨基酸残基，优选的，选择任意氨基酸残基，除了丝氨酸或苏氨酸，其中n是0或1。而且，每一个Xn b可选自任意的氨基酸残基，其中n是0-5、5-10、10-15、15-20、20-30或更多，如果n是0，为了避免丝氨酸或苏氨酸在C-末端，那么Xn a、Xn b不能包括丝氨酸或苏氨酸。优选的，Xn b代表衍生自SEQ ID NO：1或3的肽残基的邻近的伸展。更优选的，本发明的JNK抑制剂序列进一步包括至少一个(本身的)氨基酸序列NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH[SEQ ID NO：1]。Xn a和Xn b代表D或L氨基酸。
根据另一优选实施例，本发明的JNK抑制剂序列可部分地或排它地包括D-氨基酸。更优选的，具有D-氨基酸的这些JNK抑制剂序列是上面(本身的)JNK抑制剂序列的非本身的D逆反序列。术语“逆反序列”是指线状肽序列的异构体，其中，序列的方向是相反的，并且每一个氨基酸残基的手性是相反的(see e.g.Jameson et al.，Nature，368，744-746(1994)；Brady et al.，Nature，368，692-693(1994))。结合的D-对映体和相反合成的优点是在每一个酰胺结合中，羰基和氨基组的位置是可调换的，同时在每一个阿尔法碳，侧链的位置是保留的。除非有特别的陈述，假定根据本发明，对于相应的本身的L-氨基酸序列或肽，通过合成序列或肽的逆反，可将任意特定的L-氨基酸序列或肽转换成D逆反序列或肽。
如上所定义的本发明的D逆反序列具有许多有用的特性。例如，根据本发明，D逆反序列可与L-氨基酸序列一样有效地进入细胞，然而，与相应的L-氨基酸序列相比，本发明的D-逆反序列更稳定。
因此，根据氨基酸序列NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-COOH[SEQ ID NO：4]，本发明的JNK抑制剂序列可包括至少一个D逆反序列。作为本文所使用，X，Xn a和Xn b如上所定义(优选的，代表D氨基酸)，其中，优选的Xn b代表衍生自SEQ ID NO：2or4的残基的邻近的伸展。更优选的，根据氨基酸序列NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH[SEQ ID NO：2]，本发明的JNK抑制剂序列可包括至少一个D逆反序列。
表1(SEQ ID NO：1-4)示出上面所公开的本发明的JNK抑制剂序列。该表示出本发明的JNK抑制剂序列的名称、以及它们的序列标识符数目、长度和氨基酸序列。另外，根据WO 01/27268(SEQ ID NO：17-26)，现有技术序列给出了相当的理由。这些现有技术序列并未在此公开，以作为本发明的JNK抑制剂序列或本发明的嵌合肽，并因此明确地排除在本发明权利要求的范围之内。
                        表1
  序列/肽名称   SEQID NO   AA   序列
  L-IB1(s)   1   19   RPKRPTTLNL FPQVPRSQD
  (NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
  D-IB1(s)   2   19   DQSRPVQPFL NLTTPRKPR(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH)
  L-IB(generic)(s)   3   18   XRPTTLXLXX XXXXXQDX(NH2-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH)
  D-IB(generic)(s)   4   18   XDQXXXXXXX LXLTTPRX(NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-COOH)
  L-TAT   5   10   GRKKRRQRRR(NH2-GRKKRRQRRR-COOH)
  D-TAT   6   10   RRRQRRKKRG(NH2-RRRQRRKKRG-COOH)
  L-generic-TAT(s)   7   17   XXXXRKKRRQ RRRXXXX(NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH)
  D-generic-TAT(s)   8   17   XXXXRRRQRR KKRXXXX(NH2-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH)
  L-TAT-IB1(s)   9   31   GRKKRRQRRR PPRPKRPTTL NLFPQVPRSQ D(NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
  L-TAT-IB(generic)(s)   10   38 XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XRPTTLXLXX XXXXXQDX(NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH)
  D-TAT-IB1(s)   11   31   DQSRPVQPFL NLTTPRKPRP PRRRQRRKKR G(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH)
  D-TAT-IB(generic)(s)   12   38 XDQXXXXXXX LXLTTPRXXX XXRRRQRRKK RXXXXXXX(NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH)
  IB1-long   13   29   PGTGCGDTYR PKRPTTLNLF  PQVPRSQDT
  IB2-long   14   27   IPSPSVEEPH KHRPTTLRLT TLGAQDS
  c-Jun   15   29   GAYGYSNPKILKQSMTLNLA DPVGNLKPH
  ATF2   16   29   TNEDHLAVHK HKHEMTLKFG PARNDSVIV
  L-IB1   17   23   DTYRPKRPTT LNLFPQVPRS  QDT
  D-IB1   18   23   TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR YTD
  L-IB(generic)   19   19   XRPTTLXLXX XXXXXQDS/TX
  D-IB(generic)   20   19   XS/TDQXXXXXX XLXLTTPRX
  L-generic-TAT   21   17   XXXXRKKRRQ RRRXXXX
  D-generic-TAT   22   17   XXXXRRRQRR KKRXXXX
  L-TAT-IB 1   23   35 GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT
  L-TAT-IB(generic)   24   42   XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLXLXXXXXXXQD S/TX
  D-TAT-IB1   25   35 TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR YTDPPRRRQR RKKRG
  D-TAT-IB(generic)   26   42   XT/SDQXXXXXX XLXLTTPRXX XXXXXXRRRQRRKKRXXXXX XX
(在表1中，对于SEQ ID NO：1、2、5、6、9和11与SEQ ID NO：3、4、7、8、10和12，分别示出示范性序列及其通式)
根据另一优选实施例，根据SEQ ID NO：1、2、3或4，本发明的JNK抑制剂序列包括至少一个如上定义的本身的或非本身的氨基酸序列的相应的变体、片段和/或衍生物。优选的，这些变体、片段和/或衍生物保留了上面所公开的本身的或非本身的JNK抑制物序列的生物活性，特别地，根据SEQ IDNO：1、2、3或4，例如本身的或非本身的氨基酸序列结合JNK和/或抑制至少一个有活性的转录因子的JNK的活性，例如c-Jun、ATF2或Elk1。可通过各种测试，进行功能性测试，例如，对于肽的目标分子的结合测试，或通过生物物理方法，例如光谱、计算机建模、结构分析等等。特别地，通过亲水性分析(see e.g.Hopp and Woods，1981.Proc Natl Acad Sci USA 78：3824-3828)，可分析JNK抑制剂序列或相应的变体、片段和/或衍生物，该亲水性分析可用于识别肽的疏水和亲水区域，因此有助于实验操作或抗体合成的基质的设计，例如结合实验。也可执行二级结构分析，以标识(本发明)JNK抑制剂序列或其相应的变体、片段和/或衍生物，其假设了特定的结构基元(例如Chou and Fasman，1974，Biochem 13：222-223)。使用本领域中的计算机软件程序，可实现操作、翻译、二级结构预测、亲水和疏水面、开放阅读框架预测和绘图、以及序列同系性的确定。也可使用别的结构分析，包括例如X射线结晶学(例如Engstrom，1974.Biochem Exp Biol 11：7-13)、质谱分析和气相色谱法(例如METHODS IN PROTEIN SCIENCE，1997，J.Wileyand Sons，New York，NY)和计算机建模(例如Fletterick and Zoller，eds.，1986.Computer Graphics and Molecular Modeling，In：CURRENTCOMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)。
因此，根据SEQ ID NO：1、2、3或4，本发明的JNK抑制剂序列可包括至少一个(本身的或非本身的)氨基酸序列的相应的变体。在本发明中，优选的，“根据SEQ ID NO：1、2、3或4，(本身的或非本身的)氨基酸序列的相应的变体”衍生自根据SEQ ID NO：1、2、3或4的任意的序列，其中该变体包括根据SEQ ID NO：1、2、3或4的氨基酸序列的氨基酸变更。特别地，这些变更包括根据SEQ ID NO：1、2、3或4的1到20、优选的1到10、以及更优选的1到5的氨基酸的取代、加成和/或缺失，其中这些变体示出与至少大约30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％或甚至99％的根据SEQ ID NO：1、2、3或4的任意序列的序列一致性。
如果通过特定氨基酸的取代，可得到根据SEQ ID NO：1、2、3或4的本发明(本身的或非本身的)氨基酸序列的变体，那么优选的该取代包括保守氨基酸取代。保守氨基酸取代可包括一组中的同义氨基酸残基，该组具有充分的类似的物理化学性质，以便该组成员之间的取代将保留分子的生物活性(例如Grantham，R.(1974)，Science 185，862-864).对于本领域的技术人员是显然的，在上面所定义的序列中，也可插入和/或删除氨基酸，并且不会改变它们的功能，特别地，如果插入和/或删除仅仅涉及到少量的氨基酸，例如少于20，和优选的少于10，并且不会去除或取代对于功能性活性非常重要的氨基酸，而且，在本发明中的变体所要避免的取代是将导致另外的苏氨酸在氨基酸的位置，该位置对于磷酸化酶，优选的激酶，可进入，以便避免在生物体内或体外，本发明的JNK抑制剂序列或嵌合肽的失活。
优选的，表2所定义的同义氨基酸残基可分类为同组，并特别地可通过保守氨基酸取代，进行交换。
                  表2
           同义氨基酸序列的优选组
  氨基酸   同义残基
  SerArgLeuProThrAlaValGlyIlePheTyrCysHisGlnAsnLysAspGluMetTrp   Ser，Thr，Gly，AsnArg，Gln，Lys，Glu，HisIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuGly，Ala，(Thr)，ProPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrGly，Thr，Pro，AlaMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValAla，(Thr)，Pro，Ser，GlyMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IleTrp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrSer，Thr，CysGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlu，Lys，Asn，His，(Thr)，Arg，GlnGln，Asp，Ser，AsnGlu，Gln，His，Arg，LysGlu，Asn，AspAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluPhe，Ile，Val，Leu，MetTrp
根据本发明，SEQ ID NO：1、2、3或4的变体的特定形式是本发明根据序列表中SEQ ID NO：1、2、3或4所示的(本身或非本身的)氨基酸序列的片段，与SEQ ID NO：1、2、3或4相比较，特别地通过至少一删除，可对其进行变更。优选的，一片段包括任意SEQ ID NO：1、2、3或4的至少4个连续的氨基酸，特别地，长度要足够使得抗原特定识别于任意的这些序列。进一步更优选的，该片段包括任意SEQ ID NO：1、2、3或4的4到18、4到15、或最优4到10个连续的氨基酸。删除的氨基酸可发生在SEQ ID NO：1、2、3或4的任意位置，优选的N-或C-末端。特别地，通过1、2、3、4或5氨基酸，可在N-或C-末端删除SEQ ID NO：2(DQSRPVQPFLNLTTPRKPR)的肽。换句话说，SEQ ID NO：2的优选的较短的版本具有序列QSRPVQPFLNLTTPRKPR、SRPVQPFLNLTTPRKPR、RPVQPFLNLTTPRKPR、PVQPFLNLTTPRKPR、或VQPFLNLTTPRKPR或分别DQSRPVQPFLNLTTPRKP、DQSRPVQPFLNLTTPRK、DQSRPVQPFLNLTTPR、DQSRPVQPFLNLTTP、DQSRPVQPFLNLTT、或QSRPVQPFLNLTTPRKP、SRPVQPFLNLTTPRKP、SRPVQPFLNLTTPRK、RPVQPFLNLTTPRKP、RPVQPFLNLTTPRK或PVQPFLNLTTP。本发明所用的肽序列越短，其非特定性细胞毒性就越低。在一定的实施例中，所用的肽具有最短的序列可能，其仍然保留有生物功能，例如JNK抑制功能。
而且，根据序列表中SEQ ID NO：1、2、3或4所示的本发明的(本身或非本身的)氨基酸序列可定义为一序列，其共享至少大约30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％、或甚至99％的SEQ ID NO：1、2、3或4的的任意序列的序列一致。
本发明的JNK抑制剂序列进一步包括至少一个SEQ ID NO：1、2、3或4(本身或非本身的)氨基酸序列的衍生物。在本文中，“根据SEQ ID NO：1、2、3或4的(本身或非本身的)氨基酸序列的衍生物”优选的是衍生自根据SEQID NO：1、2、3或4的任意序列的氨基酸序列，其中该衍生物包括至少一个可修饰的L-或D-氨基酸(形成非天然的氨基酸)，优选的1到20、更优选的1到10、和甚至更优选的1到5个可修饰的L-或D-氨基酸。相应的变体或片段的衍生物也在本发明的范围之内。
在此所公开的任意的肽在它们的末端具有可修饰性，要么C-或N-末端，或者两者末端。优选的，通过氨基化合物，修饰C-末端，然而通过任意合适的NH2-保护基修饰N-末端，例如酰化产物。
关于“修饰的氨基酸”可以是任意的氨基酸，该氨基酸可例如通过各种不同的有机体中的糖基化、通过磷酸化、或通过标记特定的氨基酸，进行改变。特别地，该标记选自下面的标记组中：
(i)放射性标记，例如放射性磷酸化或使用硫、氢、碳、氮等等的放射性标记；
(ii)染色剂(例如digoxygenin等等)；
(iii)荧光组(例如荧光素等等)；
(iv)化学发光(chemoluminescent)组；
(v)用于固相上的固定化的组(例如His-tag、生物素、strep-tag、flag-tag、抗体、抗原等等)；和
(vi)(i)到(v)所涉及的两个或多个标记的组合。
在上文中，氨基酸序列具有一序列，该序列共享对于本发明的待模建氨基酸序列的至少95％的序列一致性，这意味着目标氨基酸序列的序列与待模建序列相一致，除了相对于待模建氨基酸序列的每100个氨基酸，目标氨基酸序列可包括多达5个氨基酸变体。换句话说，为了得到具有与待模建氨基酸序列至少95％相一致的序列的氨基酸序列，目标序列中的达5％(100中的5)氨基酸残基可由别的氨基酸插入或取代、或被删除。
对于不具有准确相应的序列，关于第二序列可确定第一序列的a％的一致性。一般地，相比较的这两个序列排列成序列之间最大的相关性。这可包括在一个或两个序列中插入“间隙”，以增强对准度。接着，在相比较的每一个序列的整个长度范围，可确定A％一致性(所谓的全局对准)，这特别适合于相同或类似长度的序列，或在较小的范围，即定义的长度(所谓局部对准)，这更适合于不同长度的序列。
用于比较两个或更多序列的一致性和同源性的方法也是本领域所熟知的。因此作为例子，在Wisconsin Sequence Analysis Package，version 9.1(Devereux et al.，1984，Nucleic Acids Res.12，387-395.)中可用的程序，例如程序BESTFIT和GAP可用于确定两个多核苷酸的％一致性，以及两个多肽序列之间的％一致性和％同源性。BESTFIT使用(Smith and Waterman(1981)，J.Mol.Biol.147，195-197.)的“局部同源算法”。别的用于确定序列之间的一致性和/或类似性的程序也是本领域熟知的，例如BLAST家族程序(Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215，403-410)，通过万维网站ncbi.nlm.nih.gov，即NCBI的主页可获得，以及FASTA(Pearson(1990)，Methods Enzymol.183，63-98；Pearson and Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85，2444-2448.).
通过本领域熟知的方法，例如通过如下所讨论的化学合成或基因工程方法，可得到或生成根据本发明的JNK-抑制剂序列。例如，与本发明的JNK抑制剂序列的一部分相应的肽，其包括所述的JNK抑制剂序列的期望区域，或在生物体外体内或体外调解期望活性，通过使用多肽合成仪可合成该肽。
根据本发明的第二方面，提供一种嵌合肽，其包括至少一个第一域和至少一个第二域，其中第一域包括运输序列，同时第二域包括如上所定义的本发明的JNK抑制剂序列。
特别地，根据本发明的嵌合肽具有至少25个氨基酸残基的长度，例如25到250氨基酸残基，更优选的，25到200氨基酸残基，进一步更优选的25到150氨基酸残基，25到100，以及最优选的25到50氨基酸残基。
作为第一域，优选的，本发明的嵌合肽包括运输序列，其特别地选自任意的氨基酸的序列，该序列指引肽(该序列当前所位于的)进入期望的细胞目的地。因此，在此所使用的运输序列特别地指引该肽越过细胞膜，例如，从细胞外部，通过细胞膜，并进入细胞质。可选择的或附加的，通过例如结合两个成分(例如细胞渗透性成分核细胞核位置成分)或通过具有例如细胞膜运输和靶标例如细胞核内运输的性质的单一成分，该运输序列可指引该肽到细胞中期望的位置，例如细胞核、核糖体、内质网(ER)、溶酶体、或过氧化物酶体。该运输序列可附加地包括另外的成分，其可结合细胞质成分或任意别的细胞成分或细胞区室(例如内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体囊泡)。因此，例如，第一域的运输序列核第二域的JNK抑制剂序列可位于细胞质或细胞的任意区室中。这使得可确定在细胞中吸收后嵌合肽的位置。
优选的，运输序列(包括在本发明嵌合肽的第一域中)具有5到150氨基酸序列的长度，更优选的具有5到100的长度，以及最优选的5到50的长度、5到30的长度或甚至5到15氨基酸。
更优选的，该运输序列(包括在本发明的嵌合肽的第一域中)可作为第一域中连续的氨基酸序列的扩展。可选择的，第一域中的该运输序列可分裂成两个或更多的片段，其中所有的这些片段与整个运输序列类似，并以1到10，优选的1到5氨基酸，相互隔离，同时假定这些运输序列保留如上所公开的载体性质。将运输序列隔离开的这些氨基酸，例如可选自不同于运输序列的氨基酸序列。可选择的，第一域可包括具有多于一个成分的运输序列，每一成分具有其自身的运输功能，以将第二域的载物JNK抑制剂序列，传送到例如特定的细胞区室。
如上所定义的这些运输序列可包括L-氨基酸、D-氨基酸、或两者的组合。优选的，本发明的运输序列包括至少1，优选的至少3、更优选的至少6、以及甚至更优选的至少10L-氨基酸和/或D-氨基酸，其中，D-和/或L-氨基酸在本发明的JNK运输序列中以区组、非区组或可替换的方式排列。
根据一优选实施例，本发明的嵌合肽的运输序列可排它的包括L-氨基酸。更优选的，本发明的嵌合肽的运输序列包括至少一个如上所定义的“本身的”运输序列。在本文中，术语“本身的”是指非改变的运输序列，完全地包括有L-氨基酸。
根据本发明的另一可选择的实施例，本发明嵌合肽的运输序列可排它的包括D-氨基酸。更优选的，本发明嵌合肽的运输序列可包括如上所陈述的D逆反肽序列。
通过天然原料，可得到本发明嵌合肽的第一域的运输序列，或通过使用基因工程或化学合成(例如，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)Molecular cloning：A laboratory manual.2nd edition.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)以制成。
对于第一域的运输序列，可使用的天然原料包括：例如本身的蛋白质例如TAT蛋白质(例如U.S.专利号为5,804,604和5,674,980，在此全文引用这两篇文献)、VP22(例如WO 97/05265；Elliott and O’Hare，Cell 88：223-233(1997))、非病毒蛋白(Jackson et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10691-10695(1992))、运输序列，该运输序列衍生自触角足复合物(例如触角足复合物载体序列)或衍生自碱性肽，例如该肽具有5到15氨基酸、优选的10到12氨基酸并包括至少80％，更优选85％或甚至更优选90％碱性氨基酸，例如，精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。此外，在此所公开用作运输序列的一个本身的蛋白质的相应的变体、片段和衍生物。关于相应的变体、片段和衍生物，其是指如上对JNK抑制剂序列的定义。相应的变体、片段以及衍生物与如上对JNK抑制剂序列的定义相对应。特别地，在本文中的运输序列，相应的变体或片段或衍生物定义为一序列，其与一个本身的蛋白共享如上所定义的至少30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％、或甚至99％的序列一致性，该本身的蛋白用作为运输序列。
在本发明嵌合肽的一优选实施例中，第一域的运输序列包括衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)1TAT蛋白的序列，86个氨基酸的一些或全部组成TAT蛋白。
对于本发明的运输序列，全长的TAT蛋白的部分序列用于形成TAT蛋白的功能有效的片段，例如，TAT肽，其包括调解进入和吸收入细胞的区域。通过使用已知的技术(例如Franked et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：7397-7401(1989))，可确定该序列是否室TAT蛋白的功能有效的片段。因此，本发明的嵌合肽的第一域中的运输序列可衍生自TAT蛋白序列的功能有效的片段或部分，其具有氨基酸少于86，并且其示出可吸收入细胞，甚至可随意地吸收入细胞核。更优选的，TAT的部分序列(片段)可用作调解嵌合肽的渗透性，以越过细胞膜，该部分序列可包括全长TAT的碱性区域(氨基酸48到57或49到57)。
根据一更优选的实施例，本发明的运输序列可包括一氨基酸序列，其包括TAT残基48到57或49到57，以及最优选的一般的TAT序列NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH[SEQ ID NO：7]，其中，Xn b如上所定义。可选择的，本发明的运输序列可包括一肽，其包括例如氨基酸序列NH2-GRKKRRQRRR-COOH[SEQ ID NO：5]。
根据另一更优选的实施例，本发明的运输序列可包括如上所陈述序列的D逆反肽，例如一般TAT序列的D逆反序列，该一般TAT序列具有序列NH2-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH[SEQ ID NO：8]，同样在此，Xn b如上所定义(优选的代表D氨基酸)。而且，在任意的SEQ ID NO：7-8中，″Xn b″残基的数目不限于所描述的一个，并且可与上面描述的不一样。最优选的，本发明的运输序列可包括D逆反序列NH2-RRRQRRKKRG-COOH[SEQ ID NO：6]。
根据另一优选实施例，本发明的运输序列可包括如上所定义的运输序列相应的变体。优选的，“运输序列相应的变体”是衍生自如上所定义的运输序列的序列，其中该相应的变体包括修饰，例如，如上所定义的运输序列中的至少一个氨基酸的添加、(内部的)删除(导致形成片段)和/或取代。特别地，该修饰包括1到20，优选的1到10，以及最优选的1到5个氨基酸的取代、添加和/或删除。而且，优选的，该相应的变体示出与如上所定义的运输序列至少大约30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％或甚至99％的序列一致性，更优选的与任意的SEQ ID NO：5 to 8的序列一致性。
优选的，该运输序列的修饰导致了运输序列增加或降低稳定性。可选择的，运输序列的相应的变体可设计为调解本发明的嵌合肽的细胞内的位置。当外生地进行添加，特别地，设计如上所定义的该相应的变体，以便保留运输序列进入细胞的能力(例如，运输序列相应的变体吸收进入细胞充分地与用作运输序列的本身的蛋白相似)。例如，碱性区域的变更被认为对于细胞核的位置很重要(例如Dang and Lee，J.Biol.Chem.264：18019-18023(1989)；Hauber et al.，J.Virol.63：1181-1187(1989)；et al.，J.Virol.63：1-8(1989))，其可使得JNK抑制剂序列的运输序列的细胞质的位置或部分细胞质的位置，为本发明的嵌合肽的成分。另外，进一步的修饰可引入相应的变体，例如通过耦联，将例如胆固醇或别的类脂半族耦联到运输序列，以生成具有增强的膜溶解性的运输序列。特别地，通过使用本领域的技术人员熟知的技术(例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)Molecular cloning：A laboratory manual.2nd edition.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，可生成任意的如上所公开的本发明的运输序列相应的变体。
作为第二域，特别地，本发明的嵌合肽可包括本发明的JNK抑制剂序列，其选自如上所公开的任意的本发明的JNK抑制剂序列，包括这些抑制剂序列的相应的变体、片段和/或衍生物。
该两个域，例如本发明嵌合肽的第一和第二域可耦联在一起，以形成功能单元。本领域熟知的任意的耦联第一和第二域的技术都可使用。
根据一实施例，优选的，通过共价键，将本发明的嵌合肽的第一和第二域耦联在一起。在此所定义的共价键可以是例如肽结合，其可通过将本发明的嵌入蛋白表达为融合蛋白以获得。可以与如下所描述的标准的重组细胞DNA技术相类似或适当改变的方法，形成并使用融合蛋白。然而，也可经过侧链耦联两个域，或通过化学耦联体两个半分子耦联两个域。
在本发明的嵌合肽中，本发明的第一和/或第二域可出现一个或多个复本。如果两个域出现在单一的复本中，第一域可耦联到第二域的N-末端或C-末端。如果出现在多个复本中，第一和第二域可以任意可能的顺序排列。例如，第一域可以多个复本数目，出现在本发明的嵌合肽中，例如以2、3或更多复本，优选的其以连续的顺序排列。接着，第二域可出现在单一复本中，并发生在具有第一域的序列的N-或C-末端。可选择的，第二域可以多个复本数目出现，例如以2、3或更多的复本，并且第一域可以单一复本出现。根据两者可替换的，第一和第二域可发生在连续排列的任意位置。如下示出示范性的排列：例如第一域-第一域-第一域-第二域；第一域-第一域-第二域-第一域；第一域-第二域-第一域-第一域；或例如第二域-第一域-第一域-第一域。本领域的技术人员可理解的，这些例子仅作为示范性的目的，本发明并不限于该范围。因此，作为初始化定义，复本的数目和排列可以各不相同。
优选的，第一和第二域可以直接地互相耦联而不需要任意耦联体。可选择的，经过耦联体序列，它们可以互相耦联，该耦联体序列具有1到10，优选的1到5氨基酸。优选的，形成耦联体序列的氨基酸选自作为氨基酸残基的氨基乙酸或脯氨酸。更优选的，通过2、3或多个脯氨酸残基，第一和第二域可相互隔离，该脯氨酸残基位于第一和第二域之间。
如上所定义的本发明的嵌合肽，包括至少一个第一和至少一个第二域，并可包括L-氨基酸、D-氨基酸或两者的组合。因此，每一个域(以及耦联体所使用的)可包括L-氨基酸、D-氨基酸或两者的组合(例如D-TAT和L-IB1(s)或L-TAT和D-IB1(s)等等)。优选的，本发明的嵌合肽包括至少1，优选至少3，更优选至少6，以及进一步更优选至少10个L-氨基酸和/或D-氨基酸，其中，D-和/或L-氨基酸在本发明的嵌合肽中，以区组、非区组或可替换的方式排列。
根据一特定实施例，本发明的嵌合肽包括L-氨基酸嵌合肽，其依据一般的L-TAT-IB肽[NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH，SEQ IDNO：10]，其中，优选的，X、Xn a和Xn b如上所定义。更优选的，本发明的嵌合肽包括L-氨基酸嵌合肽
L-TAT-IB1[NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：9]。
根据本发明一可选择的特定的实施例，本发明的嵌合肽包括如上所公开的L-氨基酸嵌合肽的D-氨基酸嵌合肽。根据本发明的示范性的D逆反嵌合肽是例如，一般的D-TAT-IB肽[NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH，SEQ ID NO：12]。在此，优选的，X、Xna和Xnb如上所定义(优选的，代表D氨基酸)。更优选的，本发明的嵌合肽包括D-氨基酸嵌合肽，其依据TAT-IB1肽[NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH，SEQ ID NO：11]。然而，第一和第二域(代替PP)可包括-Xna-Xnb-，其如上所定义。特别地，SEQ ID NO：11的第二域，最终以-Xna-Xnb-代替(PP)，通过1、2、3、4或5个氨基酸，可在N-和/或C-末端将其删除。在另一优选实施例中，通过1或2氨基酸，可在其N-和/或C-末端删除SEQ ID NO：11的第一域。这些删除可与第二域的末端的氨基酸残基的删除相组合。因此，SEQ ID NO：11优选的变体是例如如下的序列，其在N-和/或C-末端，具有第二域的删除：
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG，或
VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG或、分别
DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、或
QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG或PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG。
优选的实施例，包括仅仅在第一域的末端删除：
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK、
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR、
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKR、
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKK。在第一和第二域中删除的组合的例子是：QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、或
VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR或、分别的、
DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、或
QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKR
或PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR、
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK、
SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG、
RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK、
PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK、或VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK
或、分别地，DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK、
DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKK、
DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK、
DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKK、DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKK、
或QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK、
SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK、
SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKK、
RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK、RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKK或
PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKK、QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR、
SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR、
RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR、
PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR、或VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR或、分别地，DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKR、
DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKR、
DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR、
DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRRKKR、DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRQRRKKR、
或QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKR、
SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG
或PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG或
SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG或
RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG或
PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、或
VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG或、分别地，DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、或
QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG或PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG、
QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG、或
VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG或、分别地，
DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RQRRKKRG、DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
或QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG、
RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG、RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG或
PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RQRRKKRG。再次，该肽越短，它们的(非特定的)细胞毒性就越弱。然而，肽必须保持它们的生物功能，例如，它们的细胞膜渗透性(第一域)和它们的JNK抑制剂功能(第二域)。
通过化学或生物化学的耦联体，可将如上所定义的本发明嵌合肽的第一和第二域互相耦联在一起，并以本领域熟知的任意合适的方式运载，例如通过建立第一和第二域之间的肽结合、通过将第一和第二域表达为融合蛋白、或通过将本发明嵌合肽的第一和第二域交联。
许多熟知的化学交联方法是非特定的，例如它们不把耦联点指向运输多肽或货体大分子上的任意特定位置。结果，非特定的交联剂的使用可攻击功能位或空间上阻滞活性位，使得结合蛋白生物性地失效。因此，优选的，使用该交联方法，其可允许第一和第二域更多特定的耦联。
增加耦联特定性的一种方法是在第一和第二域的其中之一或两者中，对于功能基团的直接化学耦联仅出现一次或几次，以交联在一起。例如，半胱氨酸仅仅其是具有硫醇的蛋白质氨基酸，并在许多蛋白质中仅出现几次。又例如，如果多肽没有包括赖氨酸残基，将为该多肽的氨基末端，选择特定用于伯胺的交联剂。以增加耦联特定性的这种方法的成功使用需要该多肽在分子的区域具有合适地少的和高度活性的残基，如果没有分子的生物活性的失效，这将发生变更。
当半胱氨酸残基出现在多肽序列的某些部分中，其中它们参与的交联反应另外将很可能妨碍生物活性，该半胱酸胺残基将被取代。当半胱酸胺残基被取代时，特别地，希望在多肽折叠中最小化由此造成的变体。当取代物与半胱氨酸在化学上和空间上类似时，在多肽折叠中的变体将最小化。由于这些原因，丝氨酸优选作为半胱氨酸的取代物。通过以下例子对其进行例证，将半胱氨酸引入多肽氨基酸序列中，用于交联。
当引入半胱氨酸时，优选在氨基或羧基末端或附近进行引入。可使用常规的方法用于该氨基酸序列的修饰，其中，通过化学合成或重组DNA表达，可生成该多肽。
经过耦联剂或连接剂，可实现第一和第二域的耦联。目前有许多可使用的分子间的交联剂(例如，Means and Feeney，CHEMICAL MODIFICATION OFPROTEINS，Holden-Day，1974，pp.39-43)。其中这些试剂是，例如珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)或N，N’-(1，3-亚甲苯基)双马来酰亚胺(两者都特用于巯基并且形成不可逆的联接)；N，N’-乙撑双(碘代乙酰胺)或别的具有6到11个碳亚甲桥的试剂(其相对特用于巯基)；1，5-二氟-2，4-二硝基苯(其与氨基团和酪氨酸基团形成不可逆的联接)。别的此用途的交联试剂包括：p，p’-二氟-m，m’-二硝基苯(其与氨基和酚基团形成不可逆的交联)；二甲氧苯丙胺(其特用于氨基团)；苯酚-1，4磺酰氯(其主要地与氨基团起反应)；六亚甲基二异氰酸或二异硫氰酸盐、或苯偶氮基对二异氰酸盐(其主要与氨基团起反应)；戊二醛(其主要与几个不同的侧链起反应)和去重氮联苯胺(其主要与酪氨酸和组氨酸起反应)。
交联剂可以是同双功能的，例如具有两个功能基团，它们经历相同的反应。优选的同双功能的交联剂是bismaleimidohexane(“BMH”)。BMH包括两个马来酰亚胺基团，其主要与巯基起反应-在中性条件下(pH 6.5-7.7)含有混合物。该两个马来酰亚胺基团通过碳氢化合物链耦联在一起。因此，BMH对于多肽的不可逆交联是很有用的，该多肽包括有半胱氨酸残基。
交联剂也可以是异双功能的。异双功能交联剂具有两个不同的基团，例如氨基反应基团和硫醇反应基团，其可将具有自由氨和硫醇的两个蛋白分别耦联在一起。
异双功能交联剂的例子是琥珀酰亚胺4-(N-甲基异马来酰亚胺)环己胺-1-羧酸酯(″SMCC″)、m-苯甲酰异马来酰亚胺-N-羟基丁二酰亚胺酯(″MBS″)、以及琥珀酰亚胺4-(p-苯基异马来酰亚胺)丁酸酯(″SMPB″)，其是MBS伸展链的相似体。这些交联剂的琥珀酰亚胺基团与伯胺反应，并且硫醇反应马来酰亚胺与半胱胺酸形成共价的结合。
交联剂在水中通常具有低溶解性。亲水基团例如磺酸酯可添加到交联剂中，以提高其水溶性。在这方面，Sulfo-MBS和Sulfo-SMCC是交联剂作水溶性修改后的例子，根据本发明可对其进行使用。
许多交联剂产生一个变体，即其在细胞条件下本质上是不可裂开的。然而，一些交联剂包括共价键例如二硫化物，其在细胞条件下是可裂开的。例如，Traut试剂、二硫代双(succinimidylpropionate)(″DSP″)、以及N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(″SPDP″)都是熟知的可裂的交联剂。可裂的交联剂的使用使得在进入目标细胞后，货体基团和载体多肽相分离。也可使用直接的二硫化物的联接。
包括如上讨论的许多交联剂都作为商业使用。对它们的详细介绍可通过商业的供应商获得。对于蛋白交联和共轭准备的通常参考文献是：Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC Press(1991)。
化学交联的包括间隔臂的使用。间隔臂提供分子内的柔性或调节共轭基团之间的分子内的距离，并因此有助于保持生物活性。间隔臂可以是多肽基团的形式，其包括间隔氨基酸，例如脯氨酸。可选择的，间隔臂可以是交联剂的一部分，例如在长链SPDP中(Pierce Chem.Co.，Rockford，IL.，cat.No.21651H)。
而且，如上所公开的一个嵌合肽的相应的变体/片段或衍生物在次也作了公开.对于片段和变体，通常是指如上对JNK抑制剂序列所作的定义。
特别地，在本文中，“嵌合肽相应的变体”优选的是一序列，其衍生自根据SEQ ID NO：9到12的任意序列，其中嵌合肽相应的变体包括本发明的根据SEQ ID NO：9到12的嵌合肽的氨基酸的变体。该变体特别地包括1到20、优选的1到10、以及更优选的1到5个根据SEQ ID NO：9到12的氨基酸的取代、添加和/或删除(产生的片段)其中，变体的本发明的嵌合肽示出与根据SEQ ID NO：9、10、11或12的任意序列的至少大约30％、50％、70％、80％、或95％、98％、或甚至99％的一致性。优选的，这些相应的变体保留了包含在本发明中的嵌合肽的第一和第二域的生物活性，例如，如上所公开的第一域的运输活性，以及抑制第二域的的活性，该活性用于结合JNK和/或抑制至少一个JNK激活的转录因子的活性。
因此，本发明的嵌合肽也可包括在前所公开的本发明的嵌合肽的片段，特别地是本发明的根据SEQ ID NO：9、10、11或12的嵌合肽序列。因此，在本文中，“本发明的嵌合肽的片段”优选的是一序列，其衍生自任意的根据SEQ ID NO：9、10、11或12的序列，其中该片段包括任意的SEQ ID NO：9、10、11或12的至少4个连续的氨基酸。该片段优选包括的长度是足够可使得从任意的这些序列中特定识别出抗原决定基，并将该序列运输入细胞、细胞核或进一步优选的位置。甚至更优选的，该片段包括任意的SEQ ID NO：9、10、11或12的4到18、4到15、或最优选的4到10个连续的氨基酸。本发明的嵌合肽的片段进一步可定义为一序列，其与根据SEQ ID NO：9、10、11或12的任意序列共享至少大约30％、50％、70％、80％、或95％、98％、或甚至99％的序列一致性。
最后，本发明的嵌合肽也包括在前所公开的本发明的嵌合肽的衍生物，特别地是根据SEQ ID NO：9、10、11或12的本发明的嵌合肽。
另外，本发明也涉及到核酸序列，其对如上多定义的本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽或它们的片段、变体或衍生物进行编码。优选的合适的对本发明的JNK抑制剂序列进行编码的核酸选自人类IB1核酸(GenBankAccession No.(AF074091)，rat IB1 nucleic acid(GenBank Accession No.AF 108959)，or human IB2(GenBank Accession No AF218778)。
通过本领域熟知的方法(例如，通过PCR扩增并使用可杂交到序列3’-和5’-末端的合成引物和/或从cDNA或基因组文库克隆并使用特用于给定的基因序列的低核苷酸序列)，可得到编码本发明的JNK抑制剂序列或嵌合肽的核酸。
另外，在此也公开了核酸序列，其可严格的条件下，与编码如上所定义的(本身的)本发明的JNK抑制剂序列或嵌合肽的合适的链杂交。优选的，该核酸序列包括至少6(连续的)核酸，其所具有的长度足够使得用于特定的杂交。更优选的，该核酸序列包括6到38、甚至更优选的6到30、以及最优选的6到20或6到10个(连续的)核酸。
“严格的条件”是序列依赖性，并且在不同的环境中各不相同。通常地，对于特定的序列并在定义的离子强度和PH，严格的条件可选择为低于热熔点(TM)大约5℃。该TM是指一温度(在定义的强度和PH下)，在该温度，50％的目标序列将与完美匹配的探针相杂交。特别地，严格条件所指的是在其中盐浓度至少为大约0.02摩尔、PH为7以及温度至少大约为60℃。由于别的因素可影响杂交的严格性(包括碱的成分和互补链的大小)，有机溶剂的出现、盐基失配的程度、以及参数的组合比任何一个绝对测量值更重要。
“高严格的条件”可包括如下，例如，步骤1：在缓冲液中65℃条件下，对包含有DNA的滤饼通宵预处理8小时，该缓冲液包括6*SSC、50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％聚蔗糖、0.02％BSA、以及500μg/ml变性的鲑鱼精液DNA。步骤2：在如上杂化前的混合物中65℃条件下，对滤饼进行杂化48小时，在其中加入100mg/ml变性的鲑鱼精液DNA和5-20*106cpm的32P标记探针。步骤3：在包含有2*SSC、0.01％PVP、0.01％聚蔗糖和0.01％BSA的溶液中37℃条件下，对滤饼清洗1小时。步骤4：对滤饼进行自动射线照相。可使用本领域熟知的别的高严格性条件(例如，Ausubel et al.，(eds.)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，NY；and Kriegler，1990，Gene Transfer andExpression，a Laboratory Manual，Stockton Press，NY)。
“中等严格性条件”可包括如下：步骤1：在包含有6*SSC、5*Denhardt’s溶液、0.5％SDS和100mg/ml变性的鲑鱼精液DNA的溶液中55℃条件下，对滤饼预处理6小时。步骤2：在相同溶液中添加5-20*106cpm的32P-标记探针并在55℃条件下，对滤饼杂化18-20小时。步骤3：在包含有2*SSC，0.1％SDS的溶液中并在37℃条件下，对滤饼清洗1小时，接着，在包含有1*SSC和0.1％SDS的溶液中并在60℃的条件下，对其进行30分钟的两次清洗。Step4：用吸墨纸将滤饼吸干并将其暴露进行放射自显影。可使用本领域熟知的别的中等严格条件(例如，Ausubel et al.，(eds.)，1993，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley and Sons，NY；and Kriegler，1990，GeneTransfer and Expression，a Laboratory Manual，Stockton Press，NY)。
最后，“低严格性条件”可包括：步骤1：在包含有35％甲酰胺、5X SSC、50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH 7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％聚蔗糖、1％BSA、以及500μg/ml变性的鲑鱼精液DNA的溶液中并在40℃条件下，对滤饼预处理6小时。步骤2：在相同溶液中添加0.02％PVP、0.02％聚蔗糖，0.2％BSA，100μg/ml鲑鱼精液DNA、10％(wt/vol)葡聚糖酶、以及5-20×106cpm的32P-标记探针并在40℃条件下，对滤饼杂化18-20小时。步骤3：在包含有2X SSC、25mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH 7.4)、5mM EDTA、以及0.1％SDS的溶液中并在55℃条件下，对滤饼清洗1.5小时。可用新的溶液将该清洗溶液取代，并在60℃条件下，对其进行额外的1.5小时的保温试验。步骤4：用吸墨纸将滤饼吸干并将其暴露进行放射自显影。如果必须的话，可在65-68℃条件下，对滤饼进行第三次清洗，并进行重暴露拍摄。可使用本领域熟知的别的低严格性条件(例如，用于交叉种类杂化)。例如，Ausubel et al.，(eds.)，1993，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley and Sons，NY；and Kriegler，1990，GENE TRANSFER ANDEXPRESSION，A LABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY。
本发明所提供的核酸序列可用于表达本发明的肽，例如本发明的JNK抑制剂序列或本发明的用于分析、表征或治疗使用的嵌合肽；以及用作组织标记，在其中择优地表达相应的(本发明的)肽(要么在结构上或在组织分化或发展的特定阶段或在疾病阶段)。别的核酸使用包括：例如核酸的凝胶电泳中的分子量标准。
根据本发明进一步的实施例，也提供表达载体，用于如上所定义的一个或多个本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的重组表达。术语“表达载体”在此用于标明环形或线型的DNA或RNA，其要么是双链或是单链。其进一步包括至少一个本发明的核酸，并被传送到宿主细胞或单细胞或多细胞宿主有机体。本发明的表达载体优选的包括本发明核酸，用于编码本发明的JNK抑制剂序列或片段或相应的变体，或本发明的嵌合肽、或片段或相应的变体。另外，根据本发明的表达载体包括用于支持表达的合适的成分，包括调整成分，例如来自病毒、细菌、植物、哺乳动物和别的真核生物源的强化因子/促进因子，以驱动宿主细胞中插入的多核苷酸的表达，例如绝缘体、边界元素、LCR(例如Blackwood and Kadonaga(1998)，Science 281，61-63中所描述的)或核基质/支架附着区(例如Li，Harju and Peterson，(1999)，Trends Genet.15，403-408中所描述的)。在一些实施例中，调整成分是异种的(例如，非本身的基因促进因子)。可选择的，通过用于基因和/或侧翼区的本身的促进因子，也可提供必需的转录和转运信号。
术语“促进因子”在此用于指DNA的一区域，其用于控制一个或多个本发明的核酸序列的转录，并可通过依赖于DNA的RNA聚合酶的结合位和别的DNA序列的出现，对其进行结构上的识别，以产生交互作用从而调整促进功能。促进促进因子的片段的功能表达是缩短的或截断的促进序列，其作为促进因子保留活性。通过本领域熟知的任意验定法，可测量促进因子的活性(例如Wood，de Wet，Dewji，and DeLuca，(1984)，Biochem Biophys.Res.Commun.124，592-596；Seliger and McElroy，(1960)，Arch.Biochem.Biophys.88，136-141)or commercially available from Promega)。
在本发明表达载体中所使用的“强化区域”特别地是指DNA的一区域，其用于增加一个或多个基因的转录。更特别地，在此所使用的术语“强化因子”是DNA调整成分，用于增强、扩大、改善或改良基因的表达，唯视要表达的基因，而无论其位置和方向。其也可以增强、扩大、改善或改良多于一个促进因子的表达。
如上所定义的用于本发明的表达载体的促进因子/强化因子序列可使用植物、动物、昆虫或真菌调整序列。例如，可使用来自酵母菌或别的真菌的促进因子/强化因子成分(例如，GAL4促进因子、醇脱氢酶促进因子、磷酸甘油激酶促进因子、碱性磷酸酶促进因子)。可选择的或另外的，它们包括动物转录控制区，例如，(i)胰腺细胞内激活的胰岛素基因控制区(例如，Hanahan，et al.，1985.Nature 315：115-122)；(ii)淋巴细胞内激活的免疫球蛋白基因控制区(例如Grosschedl，et al.，1984，Cell 38：647-658)；(iii)肝内激活的白蛋白基因控制区(例如，Pinckert，et al.，1987.Genes andDev 1：268-276)；(iv)脑少突神经胶质细胞内激活的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(例如，Readhead，et al.，1987，Cell 48：703-712)；以及(v)丘脑下部激活的促进性腺激素-释放荷尔蒙基因控制区(例如，Mason，et al.，1986，Science 234：1372-1378)，等等。
另外地，本发明的表达载体可包括扩增标记。改扩增标记可选自例如腺苷脱胺酶(ADA)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、多重抗药性基因(MDR)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-)冬氨酸酯抵抗(CAD)。对如上定义的蛋白进行编码的基因的扩增，例如感兴趣的蛋白(POI)和/或本发明的融合蛋白，使得增加了这些蛋白的表达水平，以高于细胞中载体的整合(Kaufman etal.(1985)，Mol.Cell Biol.5，1750-1759)。
示范性的表达载体或它们的适合于本发明的衍生物，特别地包：例如人类或动物的病毒(例如，牛痘病毒或腺病毒)；昆虫病毒(例如，杆状病毒)；酵母菌载体；噬菌体载体(例如，噬菌体)；质粒病毒载体和粘粒载体。
另外，本发明提供了许多宿主载体系统，其可用于表达对如上定义的本发明的核酸的序列进行编码的肽。这些包括但不限于：(i)哺乳动物细胞系统，其可被牛痘病毒、腺病毒等等所感染；(ii)昆虫细胞系统，其可被杆状病毒等等所感染；(iii)包含有酵母菌载体的酵母菌、或(iv)用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA实现转化的细菌。依赖于宿主载体系统的使用，可使用一些合适的转录和转运成分。
优选的，所选择的适合于该宿主载体系统的宿主细胞体是可以调节插入的感兴趣的序列的表达、或修饰或处理表达的肽，通过该序列以期望的特定方式对该肽进行编码。另外，在选择的受体菌中，出现特定的诱导剂可增强来自特定促进因子的表达；因此便于控制基因改造肽的表达。而且，不同的宿主细胞拥有特有的和特定的机制，从而对表达的肽进行转运和后转运处理，以及修饰(糖基化、磷酸化等等)。因此，选择合适的细胞系或宿主系统，以确保实现对外来肽的期望的修饰和处理。例如，在细菌系统内的肽表达可用于生成非糖基化的核心肽；然而，哺乳动物内的表达确保了异源肽的“本身的”糖基化。
本发明进一步提供抗体，以直接对抗本发明的JNK抑制剂序列和/或本发明的嵌合肽。而且，提供用于生产抗体的方法，以特用于根据本发明的JNK抑制剂序列或本发明的包含该抑制剂序列的嵌合肽。
根据本发明，可象使用免疫原一样，使用JNK抑制剂序列和/或本发明的嵌合肽，以及相应的片段、变体或衍生物，以生成抗体，从而免疫特定地结合这些肽成分。这些抗体包括：例如多克隆的、单克隆的、嵌入的、单链、Fab片段和Fab表达库。在一特定的实施例中，本发明提供抗体给如上定义的本发明的嵌合肽或JNK抑制剂序列。本领域熟知的各种生产过程可用于生产这些抗体。
作为例子，通过注射任意的如上定义的本发明的嵌合肽或JNK抑制剂序列，可对各种不同的宿主动物进行免疫，以生成多克隆抗体。因此，可使用各种佐剂，以增加免疫响应，其包括但不限于Freund’s佐剂(完全的或非完全的)、矿物凝胶(例如，氢氧化铝)、表面活性剂(例如，溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、二硝基酚等等)、CpG、聚合体、聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物、以及人类佐剂例如卡介苗和短小棒状杆菌。
对于制备导向如上所定义的本发明的嵌合肽或JNK抑制剂序列的单克隆抗体，可使用任意的通过连续的细胞系培养系统提供抗体分子生成的技术。这些技术包括但不限于：杂种瘤技术(例如Kohler and Milstein，1975.Nature 256：495-497)、三体瘤、人类B-cell杂种瘤技术(例如Kozbor，et al.，1983，Immunol Today 4：72)和EBV杂种瘤技术，以生成人类单克隆抗体(例如Cole，et al.，1985.In：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。在本发明的实施中可使用人类单克隆抗体，并且通过使用人类杂种瘤(see Cote，et al.，1983.Proc Natl Acad SciUSA 80：2026-2030)或通过在试管中使用Epste in Barr病毒转化人类B-细胞(例如Cole，et al.，1985.In：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)，转化人类B-细胞。
根据本发明，可使得有关的技术适合于制备本发明的JNK抑制剂序列和/或本发明的嵌合肽特异的单链抗体(U.S.专利号4,946,778)。另外，可使得有关的方法适合于构建Fab表达库(例如Huse et al.，1989.Science 246：1275-1281)，以使用如上所定义的这些JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的期望的特异性，快速和有效的识别单克隆Fab段。通过使用本领域熟知的技术(例如U.S.专利号5,225,539)，可将非人类抗体人类化。通过本领域熟知的技术，例如(i)通过抗体分子的胃蛋白酶消化，生成F(ab’)2段；(ii)通过降低F(ab’)2段的二硫键，生成Fab段；(iii)通过使用木瓜蛋白酶和还原剂，处理抗体分子，以生成Fab段；以及(iv)Fv段，制成关于JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的包含有个体基因型的抗体片段。
在本发明的一实施例中，筛选本发明的拥有期望特异性的抗体的方法包括但不限于：酶联免疫吸附测定(ELISA)和别的本领域熟知的免疫诱导技术。在一特定实施例中，通过生成杂种瘤，便于选择抗体，其中该抗体特异于本发明的JNK抑制剂序列和/或本发明的嵌合肽的一特定的抗原决定基(例如，在其中特别地包含有长度从5到20、优选的8到18和最优选的8到11个氨基酸的片段)，该杂种瘤结合本发明的拥有该抗原决定基的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的片段。在此也提供特异于如上所定义的抗原决定基的这些抗体。
本发明的抗体可用于本领域熟知的方法中，涉及到本发明的JNK抑制剂序列(和/或相应的嵌合肽)的定位和/或定量，例如，用于在合适的生理样本中测量肽的水平、用于诊断方法、或用于成像肽、等等。
本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽、和/或核酸可以药用合成物进行阐明，也附上其构成。除了这些材料中的一个外，这些成分可包括药用上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域熟知的别的材料。这些材料应该是无毒的，并且不能干扰活性成分的功效。载体或别的材料的准确性质取决于给药途径，例如，口的、静脉内的、皮肤的或皮下的、鼻的、肌肉的、腹膜内的或贴剂途径。
口服给药的药用合成物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包括固体载体例如凝胶或佐剂。液体药用合成物通常包括液体载体例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、葡萄糖或别的糖类溶液或乙二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内、皮肤或皮下注射、或痛处位置的注射，活性成分将是非肠道可接受的水溶液，其是不致热的，并且具有合适的PH值、等渗性和稳定性。使用例如等渗工具例如氯化钠注射液、林格注射液、以及乳酸林格注射液，本领域相关的技术可制备合适的溶液。如需要的话，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或别的添加剂。无论是否为多肽、肽或核酸分子、以及根据本发明的施用给个体的别的药用上有用的混合物，给药优选的以“预防疾病有效数量”或“治疗有效数量”(对于此例如此)，这足够示出对个体的益处。实际给药的数量、以及给药的速率和时间将取决于治疗的性质和严重程度。
治疗的处方例如剂量的决定等等是一般的医生或别的医学专家的职责，并且特别地考虑治疗的紊乱者、个体病人的条件、施用的位置、给药的方法和医生熟知的别的因子。如上所提到的这些技术和规约的例子可在“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，16th edition，Osol，A.(ed)，1980.”中获得。
可选择的，通过使用靶系统例如(靶)抗体或细胞特异性配体，靶向治疗可用于施用更特异于一定类型细胞的本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽和核酸。用于靶的抗体特别地更特异于与任意的如下定义的疾病相关的细胞的细胞表面蛋白。作为例子，这些抗体是指细胞表面抗体，例如，B cell关联表面蛋白例如MHC II级DR蛋白、CD18(LFA-1 beta链)、CD45RO、CD40或Bgp95、或细胞表面蛋白，其选自例如CD2、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD10、CD13、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD39、CD4、CD43、CD45、CD52、CD56、CD68、CD71、CD138等等。特别地，通过共价地结合本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽和核酸到特异于细胞表面蛋白的抗体、或通过结合到细胞特异配体，可准备靶构建。例如，蛋白可结合到该抗体或通过肽键或通过化学耦联、交联等等进行结合。接着，通过如下定义的任意的给药途径，例如腹膜内的、鼻的、静脉内的、口的或贴剂施用途径，以施用给病人的药用上有效的数量，执行靶构建，从而实施靶向治疗。优选的，例如，通过共价键的水解、通过肽酶或通过任意别的合适的方法，结合到如上所定义的靶抗体或细胞特异配体大的本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸可在生物体内或试管中释放。可选择的，如果本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸结合到小细胞特异配体，可不执行该配体的释放。如果出现在细胞表面，依据其运输序列的活性，本发明的嵌合肽可进入细胞。由于不同的原因期望靶；例如如果JNK抑制剂序列、嵌合肽和核酸有不可接受的毒性或如果其需要高剂量。
取代直接给药本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽，通过来自引入细胞的编码基因的表达，例如来自被给药的病毒载体，可生成本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽。特别地，该病毒载体编码本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽。该载体可靶向被治疗的特异细胞。而且，该载体可包括调控元件，并可依据定义的调控，通过目标细胞，可选择地或多或少导通该调控元件。该技术代表了病毒定向酶的药物前体治疗(virus-directed enzyme prodrugtherapy，VDEPT)技术的变化，其使用成熟蛋白取代它们的前体形式。
可选择地，通过使用抗体或病毒，可以前体形式，给药本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽。接着，通过在治疗的细胞中生成或靶向到其中的活化剂，可将本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽转化为激活形式。该方法的类型有时是熟知抗体定向酶的药物前体治疗(antibody-directed enzymeprodrug therapy，ADEPT)或病毒定向酶的药物前体治疗(virus-directedenzyme prodrug therapy，VDEPT)；前者涉及通过结合到细胞特异抗体，将活化剂靶向到细胞，同时后者涉及通过来自病毒载体中的编码DNA的表达，在载体中生成活化剂，例如JNK抑制剂序列或嵌合肽。(例如，EP-A-415731和WO 90/07936)。
本发明进一步包括本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽和/或核酸的使用，以制备药用合成物例如如上所定义的、以预防和/或治疗与实验对象体内的JNK活性相关的细胞增生紊乱(“JNK关联紊乱”)。特别地，该根据本发明所使用的药用合成物包括作为活性成分，例如(i)任意一个或多个本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽、和/或相应的变体、片段或衍生物；和/或(ii)核酸，其编码本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽和/或相应的变体或片段；和/或(iii)细胞，其包括有任意一个或多本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽、和/或相应的变体、片度或衍生物；和/或(iv)与载体和/或核酸转染的细胞，该载体和/或核酸编码本发明本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽和/或相应的变体或片段。
特别地，根据本发明的预防和/或治疗包括给药本发明如上定义的药用合成物。术语“调控”包括当JNK过渡表达时，抑制其表达。也包括例如通过使用任意一个或多个SEQ ID NO：1到4和/或9到12的肽，抑制c-jun、ATF2或NFAT4的磷酸化，其中该肽作为细胞中天然的c-jun、ATF2和NFAT4结合位的竞争抑制剂。术语“调控”也包括抑制转录因子的异数或同数复合体，该转录因子由c-jun、ATF2或NFAT4以及它们的相关的配体组成，例如由c-jun、AFT2和c-fos组成AP-1复合体。当细胞增生紊乱与JNK的过度表达相关时，该抑制的JNK抑制剂序列可引入到细胞。在一些例子中，“调控”可包括JNK表达的增加，例如通过使用IB-肽特异抗体，其屏蔽了IB-肽对JNK的结合，因此通过IB-关联肽，预防JNK抑制。
特别地可通过对实验对象给药(在体内)所述药用合成物的一定数量，以实现使用如上公开的本发明的药用合成物，预防和/或治疗实验对象，其中该实验对象可以是例如哺乳动物、人类、灵长类的动物、鼠、家鼠、狗、猫、牛、马或猪。术语“治疗有效”是指药用合成物的活性成分是数量足够的，以改善JNK关联紊乱。
如上所使用的术语“细胞增生紊乱”或“JNK关联紊乱”特别地是指体内或试管中恶性的和非恶性的细胞个数，其通常形态上和功能上不同于周围的组织，并且特别地通过JNK的异常水平所表征。“JNK的异常水平”是指实验对象的受治疗的局部的JNK的增加或降低水平，其相对于非紊乱的实验对象的类似的未被影响的局部所出现的。
例如，本发明的药用合成物可用于预防和/或治疗各种器官系统的恶性肿瘤，在其中通常示出JNK的活性，例如肺、乳房、淋巴、肠胃和生殖泌尿道、以及腺癌，其包括恶性肿瘤，例如多数结肠癌、肾脏癌、前列腺癌、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。也包括与致癌转变相关的白血病、病理生理异常，以及具有完全需要JNK活性的Bcr-Abl致癌转变的癌症。
本发明的药用合成物也应用于预防和/或治疗非恶性的或免疫关联的细胞增生疾病，例如牛皮癣、寻常性天疱疮、白塞氏综合症、急性呼吸困难综合症(ARDS)、心脏缺血性疾病、后透析综合症、风湿性关节炎、获得性免疫功能丧失综合症、血管炎、败血性休克、以及别的急性炎症类型和含类脂组织细胞增多症。特别地，在病因上与JNK激酶活性相联系的任意紊乱可认为是容易得到预防或治疗，例如与如上定义的细胞中的JNK活性相关的病理生理异常，例如再狭窄、听力损失、耳朵损伤、缺血、中风和/或与免疫细胞的成熟与分化相关的病理生理异常、再灌注损伤、组织缺氧、凋亡相关的疾病(例如，发生在病毒感染中(例如AIDS)、自体免疫疾病、神经紊乱疾病(例如中风、脑损伤、脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨丁顿舞蹈症、阿耳茨海默氏硬化和帕金森疾病)、心血管疾病、骨质疏松症和老化)，压力刺激响应、以及由于使用例如前炎症细胞因子治疗导致的次效应。本发明的药用合成物也可用于治疗或预防与糖尿病或细胞切应力相关联的影响，其中，病理状态的诱导因子包括：动脉高血压例如心脏肥大、动脉硬化损害和血管分叉等等、放射线治疗和紫外光(UV光)中所使用的电离辐射、自由基、DNA损伤剂例如化疗药物、缺血性/再灌注损伤、组织缺氧、和/或体温过低和体温过高。最终，在如上提到的疾病、病理生理异常的内容中，本发明的药用合成物可用于抑制基因的表达，这些基因的表达增加了活性多肽的出现。这些基因和基因产品特别地包括：例如促炎症细胞激素。发现这些激素的形式为发炎、自体发炎、免疫和自体免疫疾病、退化疾病、肌病、心脏病和移植排斥。
本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸序列进一步可用于任意的期望抑制JNK活性的情况，因为JNK和其所有的异构形式参与了病理状态的发展和建立或相应的途径。这些使用可包括在试管中、离体、以及在体内的应用。
因此，如上定义的本发明的核酸可用于本发明的一特定实施例中，以通过基因治疗，调控活化的JNK信号通路，优选的用于治疗如上定义的条件、疾病、和/或紊乱的其中之一。在本文中，基因治疗是指通过对实验对象给药本发明的一特定核酸所执行的治疗，例如如上定义的药用合成物，其中本发明的核酸排它地包括L-氨基酸。在本发明的该实施例中，核酸生成编码肽，该编码肽接着通过疾病或紊乱的调控功能，发挥其治疗效应。本领域中任意与基因治疗相关联的方法可用于本发明的实施中(例如Goldspiel，et al.，1993.Clin Pharm 12：488-505).
在一优选实施例中，用于基因治疗的本发明的核酸是表达载体的一部分，其在合适的宿主内，表达任意一个或多个本发明的IB关联肽，例如本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽、或相应的片段或衍生物。在一特定实施例中，该表达载体拥有促进因子，其可操作地链接到JNK抑制剂序列的编码区域。该促进因子可作如上定义，例如可诱导或构建、以及任选的组织特异。
在另一特定的实施例中，本发明的核酸分子可用于基因治疗，在其中，通过可在基因组内期望位置促进类似重组的区域，侧接本发明的核酸分子的编码序列(以及任意别的期望的相应序列)，以提供核酸的内染色体表达(例如Koller and Smithies，1989.Proc Natl Acad Sci USA 86：8932-8935).
将本发明的核酸发送到病人体内进行基因治疗，可以是直接的(例如，病人直接接受核酸或包含有核酸的载体)或间接的(例如，首先在试管中，用核酸转化细胞，接着再移植到病人体内)。这两种方法分别是熟知的体内或体外ex vivo基因治疗。在本发明的一特定实施例中，在体内直接地给药本发明的核酸，其中，其表达为生成编码产品。这可通过本领域熟知的任意方法实现，例如将核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分，并以同样的方式给药，使其进入分子内(例如，通过使用有缺陷的或减弱的逆转录病毒或别的病毒载体，进行传染；U.S.专利号为4,980,286)、直接注射naked DNA、使用微粒状轰击(例如“基因枪”、Biolistic、DuPont)、用脂质涂覆核酸、使用相关的细胞表面受体/转染剂、以脂质体、微粒状或微囊体胶囊、以链接到熟知的进入细胞核的肽对其进行给药、或通过链接到诱发受体介导的内吞作用的配体对其进行给药(例如，Wu and Wu，1987.J Biol Chem 262：4429-4432)，这可用于“标靶”细胞类型，该类型特别地表达感兴趣的受体等等。
关于在本发明的实施中使用的基因治疗的别的方法涉及到通过方法例如电转化、脂染、可用磷酸钙介导转染、病毒传染等等，将基因转运到试管中的组织培养系统中的细胞中。通常地，转运方法包括进入细胞的可选择标记的伴随物转运。接着，该细胞置于选择压力下(例如耐药性)，以便这些已吸收的细胞的隔离，并表达转运的基因。接着，这些细胞被施用给病人。在一特定实施例中，在得到的重组细胞的体内给药之前，通过本领域熟知的任意的方法，例如转染、电转化、显微注射、用病毒或包含有感兴趣的核酸序列的抗菌素传染、细胞融合、染色体介导基因转运、微细胞介导基因转运、质球融合、以及可确保受体细胞必要的发育核生理学功能不被转运破坏的类似的方法，将核酸引入到细胞中。例如，Loeffler and Behr，1993.Meth Enzymol217：599-618.选择的技术应该可将核酸稳定转运到细胞，以便细胞可表达该核酸。优选的，细胞的后代可遗传和表达转运的核酸。
在本发明的一优选实施例中，通过本领域熟知的各种技术，例如上皮细胞的注射(例如皮下地)、作为移植给病人的外皮的重组外皮细胞的应用、以及重组血液细胞的静脉内注射(例如，造血干细胞或前体细胞)，得到的重组细胞可施用给病人。预想要使用的细胞的总量取决于期望的效应、病人的状态等等，并可由本领域的技术人员决定。用于基因治疗的核酸所要引入的细胞可包括任意期望的、可用的细胞类型，并且可以是异基因的、异质的、同源的或自体的。细胞的类型包括但不限于：分化细胞例如上皮细胞、内皮细胞、角化细胞、纤维原细胞、肌细胞、肝细胞和血细胞，或者特定的胚胎心脏肌细胞中的各种干或前体细胞、肝干细胞(国际专利公开号WO 94/08598)、神经干细胞(Stemple and Anderson，1992，Cell 71：973-985)、造血干或前体细胞例如从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏等等得到的。在一优选实施例中，用于基因治疗的细胞是病人自体固有的。
根据进一步的实施例，本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽、关于本发明的JNK抑制剂序列或嵌合肽的核酸序列或抗体，可用于(试管中)测定(例如免疫测定)，以识别、预测或监控如上定义的各种条件、疾病、和/或紊乱，或监控相应的治疗。通过具有将源自病人的样本与关于本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸的抗体接触的方法并在一定条件下，可执行免疫测定，其中，在该一定条件下，可发生免疫专一的结合，并随后通过该抗体，可检测和测量任意免疫专一的结合的数量。在一特定的实施例中，特异于本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸的抗体可用于分析JNK或JNK抑制剂序列存在的病人的组织或血清样本，其中JNK的异常水平表示患病的情况。可使用的免疫测定包括但不限于：竞争和非竞争测定系统，其所使用的技术例如免疫印迹、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“三明治”免疫测定、免疫沉淀反应测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、荧光免疫测定、补体结合测定、免疫放射测定、以及蛋白质-A免疫测定等等。可选择的，通过对目标细胞施用本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽或关于本发明的JNK抑制剂序列或嵌合肽的抗体，可执行(试管中)测定，并通过本领域的技术人员熟知的生物物理方法，监控细胞的反应，其中，特别地该目标细胞选自例如培养的动物细胞、人类细胞或微生物体。在此所使用的目标细胞特别地可以是培养细胞(试管中)或体内细胞，例如构成活的动物活人的器官或组织的细胞，或在活的动物或人体中发现的微生物。
另外，本发明提供用于诊断或治疗用的工具，其包括一个或多个容器，其包含有本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸和/或关于本发明的JNK抑制剂序列或嵌合肽的抗体，例如反JNK抑制剂序列抗体、以及可选的，关于抗体的标识结合配体。因此，合并入抗体内的标识包括但不限于：化学发光的、酶的、荧光的、色度的或放射性的基团。在陵夷特定的实施例中，提供的用于诊断的工具，其包括一个或多个具有核酸的容器，该核酸编码本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽，或可选的，是本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的补体，另外也提供关于这些核酸的标识结合配体。在可选择的特定的实施例中，该工具包括位于一个或多个容器中的低核苷酸引物(例如，每个长度为6到20个核苷)，其可作为扩增引物，用于聚核酶链反应(PCR；例如Innis，et al.，1990.PCR PROTOCOLS，Academic Press，Inc.，San Diego，CA)、连接酶链反应、循环探针反应等等，以及本领域熟知的使用本发明的核酸的别的方法。可选的，该工具进一步包括预定纯化的本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽或对这些进行编码的核酸的数量，从而在测定中用于诊断、标化或控制。
本发明是通过几个具体实施例进行说明的，本领域技术人员应当明白，在不脱离本发明范围的情况下，还可以对本发明进行各种变换及等同替代。另外，针对特定情形或具体情况，可以对本发明做各种修改，而不脱离本发明的范围。因此，本发明不局限于所公开的具体实施例，而应当包括落入本发明权利要求范围内的全部实施方式。
在此所引用的各种出版物，在此全文引用。
除非另有定义，对于本领域的技术人员来说，在此所使用的所有技术和科学术语具有相同的意思。尽管与在此描述的类似或相同的方法和材料可用于本发明的实施或测试，下面将描述合适的方法和材料。所有的出版物、专利申请文件、专利和在此所提及的别的参考资料在此全文引用。在发生冲突时，本说明书包括定义是可控制的。另外，涉及的材料、方法和例子是仅作为例证并不是用于限制。本发明的各种优点、各个方面和创新特征，以及其中所示例的实施例的细节，将在以下的说明书和附图详细介绍中变得显而易见。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1A-C图表示出显示的转录因子中的保留的JBD域的排列。通过检测这些序列的排列可识别JNK抑制剂序列。图IA-1C示出示范性的这些排列的结果。图1A示出IB1、IB2、c-Jun和ATF2的JBD之间的最高的同源区域。表B示出用于对比的L-IB1和L-IB1的JBD的氨基酸序列。星号示出完全保留的残基，同时开圆示出GFP-JBD23Mut载体中转化为Ala的残基。图1C示出具有JNK抑制剂序列和运输序列的嵌入蛋白的氨基酸序列。在该例子中，运输序列衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)TAT多肽，以及JNK抑制剂序列衍生自IB1多肽。在表B和C中，人类、老鼠和家鼠的序列相同。
图2示出来自人类、老鼠和家鼠的通有的TAT-IB融合蛋白的序列。
图3示出永久的MCAO模型中防御病灶性大脑缺血的神经保护的评价结果。以不同的剂量确定保护的效率(见图3)。从图3可看出，至少11mg/kg、3mg/kg、0.3mg/kg和0.03mg/kg的剂量有助于大脑保护。可看出0.03mg/kg具有最好的保护。
图4示出短暂的MCAO模型中在防御病灶性大脑缺血的i.v.给药后，通过本发明的根据SEQ ID NO：11的嵌合肽的神经保护的评价。随后在成年老鼠中引起缺血，在再灌注后的48h使得该老鼠致死。制备连续的冰冻切片并计算梗塞量。如图4所示，本发明的嵌合肽提供有效的神经保护。
图5示出通过NMDA刺激后测量LDH释放，执行对神经培养的测定的结果。该结果清楚地示出本发明的嵌入D-JNK1肽(SEQ ID NO：11)的神经保护的效果，因为由于NMDA的暴露所引起的退化的改变被完全地抑制，并通过如上控制未出现显著的LDH释放示出。
图6示出在统一计量方法中，使用本发明的根据SEQ ID NO：9和11的融合肽，抑制HepG2细胞中内生植物JNK活性的结果。图6示出，特别在图6的表的中，根据SEQ ID NO：11的D-TAT-IB1(在此略写为D-JNKI)有效地抑制了JNK活性，甚至由于根据SEQ ID NO：9的L-TAT-IB1(在此略写为L-JNKI)。
图7示出防御听力永久丧失的D-TAT-IB1保护的保护效果。以最大冲击频率8kHz，持续20分钟(暂时的阈值下降，TTS，灰色部分)的噪音损伤(120dB，6kHz，持续30分钟)，并在噪音暴露后15天(永久阈值下降)，几内亚猪的听力阈值级别下降(dB声压级别)。要么在噪音损伤前30分钟，或噪音损伤后30分钟或4个小时，以透明质酸凝胶形式将D-TAT-IB1，设置几内亚猪的耳蜗圆窗膜；非治疗耳朵作为对照。在噪音损伤后20分钟，测量TTS；同时15天后确定永久听力丧失PTS(黑色部分)。图示出，如果在噪音暴露前防御性的使用D-TAT-IB1，而且在损伤后以时间依赖的方式给药，其不能在噪音损伤后充分地保护以防止永久听力丧失。对于损伤后30分钟和4小时进行D-TAT-IB1给药，治疗耳中的PTS显著低于非治疗对照耳中的PTS。
具体实施方式
例子
例1：JNK抑制剂序列的识别
通过已知的JBD之间的序列排列，识别对于与JNK进行有效的相互作用的重要的氨基酸序列。IB1[SEQ ID NO：13]、IB2[SEQ ID NO：14]、c-Jun[SEQ ID NO：15]和ATF2[SEQ ID NO：16]的JBD之间的序列比较定义了不牢固地保留的8个氨基酸序列(图1A)。因为IB1和IB2的JBD具有大约100个折叠，其与结合JNK中的c-Jun或ATF2一样有效(Dickens et al.Science 277：693(1997)，这详尽论述了IB1和IB2之间保留的残基对于授予最大的结合的重要性。IB1和IB2的JBD之间的比较定义出具有7个氨基酸和3个氨基酸的两个区组，并高度地保留在这两个序列之间。
这两个区组位于L-IB1[SEQ ID NO：1]中的19个氨基酸的肽序列中，并由于比较的原因在衍生自IB1[SEQ ID NO：17]的23aa肽序列中示出。图1B中示出这些序列，L-IB1中的长划线指出序列中的间隔，以便用L-IB1排列保留的残基。
例2：JNK抑制剂融合蛋白的制备
通过共价地将SEQ ID NO：1的C-末端链接到10氨基酸长度的载体肽的N-末端，可合成根据SEQ ID NO：9的本发明的JNK抑制剂融合蛋白，其中，该载体肽衍生自根据SEQ ID NO：5的HIV-TAT4g 57(Vives et al.，J Biol.Chem.272：16010(1997))，该链接是经过由两个脯氨酸残基构成的链接体。该链接体可使得产生最大的灵活性，并防止非期望的次级结构的变化。L-IB1(s)(SEQ ID NO：1)和L-TAT[SEQ ID NO：5]分别制备和指定这两个基本的结构。
因此，可合成根据SEQ ID NO：11的全D逆反肽。也可由D-IB1[SEQ IDNO：2]和D-TAT[SEQ ID NO：6]分别制备和指定这两个基本的结构。
通过经典的的FmockAll合成制成根据SEQ ID NOs：9，10，11和12的本发明的D和L融合肽，并进一步通过Mass光谱测定法分析。最后，通过HPLC对其进行纯化。为了确定脯氨酸链接体的影响，可制备两种类型的TAT肽，其中一个具有两个脯氨酸，另一个不具有。添加的这两个脯氨酸不可改变细胞内的TAT肽的进入或定位。图2给出显示保留的氨基酸残基的一般肽。
例3：JBD19产生的抑制细胞死亡
研究关于JNK生物活性的19aa长度的JBD的作用。该19aa序列链接到绿荧光蛋白的N-末端(GFP JBD19 construct)，并估计该结构关于IL1所诱导的胰腺细胞凋亡作用。前面示出凋亡模式，并通过使用JBD1-280转染，对其进行屏蔽，然而，ERK1/2或p38的特定的抑制剂不产生保护作用(例如上述的Ammendrup et al.)。
合成与JBD相应并具有19个氨基酸的保留序列的低核苷酸，以及在完全保留区域变异的序列，直接将该低核苷酸和序列插入到编码绿荧光蛋白(GFP，源自无性繁殖)的pEGFP-N1的EcoRI和SalI位置。在RPMI1640培养液中，培养生成TC-3细胞的胰岛素，该培养液中还具有10％Fetal Calf Serum，100μg/mL链霉素，100单位/mL青霉素和2mM谷氨酸盐。使用指示载体转染生成TC-3细胞的胰岛素，并添加IL-1(10ng/mL)到该细胞培养液中。在添加IL-1后48小时，使用逆荧光显微镜，计算凋亡细胞的数量。通过细胞质的“冒泡”特性，可将凋亡细胞区别于正常细胞，并在两天都计算凋亡细胞。
GFP是用作控制的绿荧光蛋白表达载体；JBD19是表达嵌入GFP的载体，该嵌入GFP链接到衍生自IB1的JBD的19aa序列。JBD19Mut是与GFP-JBD19一样的载体，但具有在图1B示出的4个保留的残基处变异的JBD；JBD1-280是链接到整个JBD(aa1-280)的GFP载体。The GFP-JBD19表达结构与整个JBD1-280一样有效地预防胰腺细胞apoptos诱导的IL-1。
作为附加控制，在完全地保留的IB1残基处变异的序列极大地降低了预防凋亡的能力。
例4：TAT-IB1肽的细胞引入
评估TAT的L-和D-光学异构的形式和本发明的TAT-IB1肽(“TAT-IB肽”)进入细胞的能力。通过与荧光素共轭的氨基乙酸的N-末端添加，标记L-TAT、D-TAT、本发明的L-TAT-IB1、以及D-TAT-IB1肽[分别地，SEQ ID NO：5，6，9和12]。将标记的肽(1μM)添加到TC-3细胞培养基，如例3所描述的。在预定的时间，用PBS冲洗细胞，并在冰甲醇-丙酮(1∶1)中保持5分钟，之后在荧光显微镜下对其进行检测。荧光素标识的BSA(1μM，12摩尔/摩尔BSA)用作控制。结果证明，将所有的如上荧光素标识的肽一次性的添加到培养液中，其可有效地和快速地(少于5分钟)进入细胞。相反地，荧光素标识的牛血清白蛋白(1μM BSA，12摩尔荧光素/摩尔BSA)没有进入细胞。
时间的研究指出在24小时周期后，用于L-光学异构的肽的荧光信号的强度降低70％。相比较，细胞内的D-TAT和本发明的D-TAT-IB1非常稳定。
一个星期后，来自这些全D-逆反肽的荧光信号仍然很强，并且在治疗的两星期后，该信号仅少许减弱。
例5：试管中抑制c-JUN、ATF2和Elk1磷酸化
在试管中研究肽对于它们的目标转录因子的JNK介导磷酸化的影响。使用。使用转录和转运兔网状细胞溶菌工具(Promega)，生成重组和非激活的JNK1、JNK2和JNK3，并将其与c-Jun、ATF2和Elk1，一起用于固相激酶测定，要么将这些材料单独使用或融合到谷胱甘肽-S-转移酶(GST)中，以作为基体。执行剂量响应研究，其中本发明的L-TAT或L-TAT-IB1肽(0-25μM)与重组JNK1、JNK2、或JNK3激酶在反应缓冲剂(20mM Tris-acetate，1mM EGTA，10mM p-nitrophenyl-phosphate(pNPP)，5mM焦磷酸钠，10mMp-glycerophosphate，1mM dithiothreitol)中混合20分钟。接着，通过添加10mM氯化镁和5pCi 33P--dATP and 1μg of either GST-Jun(aa 1-89)，GST-AFT2(aa l-96)or GST-ELK1(aa 307-428)，将发起激酶反应。可从Stratagene(La Jolla，CA)购得GST融合蛋白。
也可添加10μL得谷胱甘肽琼脂糖beads到该混合物中。接着，通过SDS-PAGE将反应生成物隔离到变性得10％聚丙烯酰胺凝胶上。干燥该凝胶，接着暴露于X射线胶片。以2.5μM剂量得本发明的TAT-IB肽，可观察到通过JNK，几乎完全抑制c-Jun，ATF2和Elk1的磷酸化。然而，一个显著的例外是未出现TAT-IB抑制Elk1的JNK3磷酸化。总之，本发明的TAT-IB1肽在抑制它们的目标转录因子的JNK家族的磷酸化方面，显示了很好的效果。如上对D-TAT、D-TAT-IB1和L-TAT-IB1肽(0-250μM剂量研究)通过重组JNK1、JNK2和JNK3抑制GST-Jun(aa 1-73)磷酸化的能力进行了分析。总之，D-TAT-IB1肽降低了c-Jun的JNK介导磷酸化，但其有效性水平大约少于L-TAT-IBl10到20个折叠。
例6：通过活性JNK，抑制c-JUN磷酸化
使用GST-Jun降低来自UV光照射的HeLa细胞或IL-1处理的PTC细胞的JNK，以评估L-TAT或L-TAT-IB1肽对压力刺激激活的JNK的作用。如上所述对PTC细胞进行培养。在DMEM培养液中培养HeLa细胞，该培养液添加有10％Fetal Calf Serum、100μg/mL链霉素、100单位/ml青霉素和2mM谷氨酸脂。在使用前1小时作细胞吸取准备，使用如上所述的IL-1激活PTC细胞，然而，通过UV-光(20J/m2)激活HeLa细胞。从对照组制备细胞提取物；在细胞溶解缓冲液(20mM Tris-acetate，1mM EGTA，1％Triton X-100，10mM P-硝基苯-磷酸盐，5mM焦磷酸钠，10mM P-甘油磷酸，1mM苏糖醇)中，通过刮取细胞培养基，制备UV光辐射的HeLa细胞和IL-1处理的TC-3细胞。通过离心机以15,000rpm和SS-34Beckman rotor，过虑5分钟，去除残余物。在室温使用1μg GST-jun(氨基酸1到89)和10μL谷胱苷肽琼脂糖珠(Sigma)，培养100μg提炼物1小时。在使用scraping缓冲液4次冲洗后，该珠再悬浮在同样的缓冲液中20分钟，该缓冲液添加有L-TAT或L-TAT-IB1肽(25μM)。接着通过添加10mM MgCl2和5pCi 33P--dATP，发起激酶反应，并在30℃，培养30分钟。
接着，通过SDS-PAGE，将反应生成物隔离到变性的10％聚丙烯酰胺凝胶上。干燥该凝胶，随后将其暴露于X摄像胶片(Kodak)。在这些实验中，通过激活的JNK，本发明的TAT-IB肽有效地防止了c-Jun的磷酸化。
例7：在体内通过TAT-IB肽抑制c-JUN磷酸化
为了确定本发明的细胞通透肽是否能在体内屏蔽JNK信号，我们使用不同的GAL4系统。如上所述培养的HeLa细胞，其与5×GAL-LUC指针载体和GAL-Jun表达结构一起共转染，该GAL-Jun表达结构具有耦联到GAL4 DNA结合区域的c-Jun(氨基酸1到89)的活性区域。通过直接表达上游的激酶MKK4和MKK7的载体的共转染，实现JNK的活性(例如Whitmarsh et al.，Science285：1573(1999))。简要地，按着制造商说明书的指示使用DOTAP(BoehringerMannheim)，在3.5-cm器皿中，使用质粒转染3×105细胞。由于实验涉及GAL-Jun，使用1μg指针质粒pFR-Luc和0.5μg表达质粒的MKK4或MKK7，转染20ng的质粒。转染后的3小时，改变细胞媒介，并添加TAT和TAT-IB1肽(1μM)。16小时后在蛋白质含量正常后，使用来自Promega的″双重通信系统″，测量荧光素酶的活性。在MKK4和MKK7调停JNK的活性后，添加TAT-IB1肽闭塞c-Jun的活性。因为HeLa细胞表达JNK1和JNK2的异构，但JNK3不行，因此，我们使用JNK3转染细胞。再次，TAT-IB(s)肽抑制c-Jun的JNK2介导活性。
例8：通过TAT-IB肽，抑制IL-1诱导的胰腺细胞死亡
我们研究本发明的L-TAT-IB肽对于促进IL-1引起的细胞凋亡的效果。使用1μM本发明的L-TAT-IB1肽并添加10ng/mL的IL-1，将TC-3细胞培养基培养30分钟。24小时后在此添加肽(1μM)。使用IL-1培养两天后，再使用亚丙基(染成红色细胞是死亡细胞)和Hoechst 33342(染成蓝色的细胞是具有完整质膜的细胞)核染色，计算凋亡的细胞。在IL-1存在的情况下培养TC-3细胞两天，添加本发明的TAT-IB肽抑制IL-1诱导的TC-3细胞的凋亡。
除了使用肽和IL-1培养细胞12天外，通过如上所述的对TC-3细胞的处理，检验长期抑制的IL-1诱导的细胞死亡。每天添加肽(1μM)并每两天添加IL-1(10ng/mL)。在这些条件下，本发明的TAT-IB1肽提供了很强的防御凋亡的保护。总之，这些实验证明了本发明的TAT-IB肽是生物活性分子，其可防止JNK信号对细胞死亡的作用。
例9：合成本发明全D逆反IB肽
本发明肽是反向合成的全D氨基酸肽，以防止天然的蛋白质水解(例如，全D逆反肽)。本发明的全D逆反肽所提供的肽，其功能特性相似于本身的肽，其中该合成的氨基酸的侧基与本身的肽的排列相对应，并保留有抗蛋白酶主链。
本发明的逆反肽是使用D氨基酸合成的相似体，其通过将该氨基酸结合到肽链中，以便逆反肽相似体中氨基酸的序列正好与选择的用于该模型的肽中氨基酸的序列相反。作为举例说明，如果天然产生的TAT蛋白(由L氨基酸形成)的序列为GRKKRRQRRR[SEQ ID NO：5]，那么该肽的逆反肽相似体(由D氨基酸形成)的序列为RRRQRRKKRG[SEQ ID NO：6]。用于合成D氨基酸链从而形成逆反肽的过程是本领域熟知的(例如Jameson et al.，Nature，368，744-746(1994)；Brady et al.，Nature，368，692-693(1994)；Guichardet al.，J.Med.Chem.39，2030-2039(1996))。特别地，通过经典的F-mock合成以生成该逆反肽，并进一步通过质谱进行分析。最后通过HPLC对其进行纯化。
因为本身的肽所固有的问题是由于天然蛋白酶类和固有的免疫原性所导致的降解，所以本发明的异构二价或异构多价混合物可包括期望的逆反肽的“逆反异构体”。因此，为了保护肽避免天然的蛋白水解应该增加特定的异构二价或异构多价混合物的有效性，两者都通过延长半衰期和降低主要在于有力地破坏该肽的免疫响应的程度。
例10：本发明的全D逆反IB肽的长期生物活性
如例5所示，由于为了保护本发明的D-TAT-IB肽避免由本身的蛋白酶类导致的降解，在与本身的L氨基酸相似体比较时，可预计本发明的具有肽偶联物的D-TAT-IB逆反的长期生物活性。
分析通过本发明的D-TAT-IB1抑制IL-1诱导的胰腺细胞死亡。使用单一添加指示肽(1μM)，并如上所述将TC-3细胞培养30分钟，接着再添加IL-1(10ng/ml)。
在使用IL-1培养两天后，通过使用亚丙基和Hoechst 33342核染色，计算凋亡的细胞。每次实验最少计算1000个细胞。标准平均误差(SEM)显示为n＝5。D-TAT-IB1肽降低IL-1诱导的凋亡与L-TAT-IB肽的程度类似。
也可分析通过D-TAT-IB1肽长期抑制IL-1P诱导的细胞死亡。使用单一添加指示肽(1μM)，并如上所述培养TC-3细胞30分钟，接着添加IL-1(10ng/ml)，然后每两天添加细胞因子。在使用IL-1培养15天后，通过使用亚丙基和Hoechst 33342核染色，计算凋亡的细胞。值得注意，单一添加的TAT-IB1肽不能给予长期保护。每次实验计算至少1000个细胞。结果，本发明的D-TAT-IB1而不是L-TAT-IB1可给予长期(15天)的保护。
例11：通过TAT-IB肽抑制辐射诱导的β胰腺细胞死亡
通过电离辐射也可激活JNK。为了确定本发明的TAT-IB肽是否提供保护以防御辐射诱导的JNK破坏，在D-TAT、本发明的L-TAT-IB1或D-TAT-IB1肽(辐射前30分钟添加1μM)存在或未存在的情况下，对″WiDr″细胞进行辐射(30Gy)。不辐射控制细胞(CTRL)。48小时后，通过如上所述的PI和Hoechst3342染色，分析细胞。显示SEM为N＝3。本发明的L-TAT-IB1和D-TAT-IB1肽可防止人类结肠癌中辐射诱导的凋亡。
例12：通过本发明的TAT-IB肽实现对电离辐射的辐射防护
为了确定本发明的TAT-IB肽辐射防护效果，使用Phillips RT 250R-ray并以0.74Gy/min的剂量率(17mA，0.5mmCu过滤器)，对C57B1/6老鼠(年龄为2到3个月)进行辐射。辐射前30分钟，使用TAT、本发明的L-TAT-IB1或D-TAT-IB1肽(3011mM溶液)，对该老鼠进行注射。简要地，对老鼠作如下辐射：将老鼠置于小塑料盒子中并且头部置于该盒子外。该老鼠仰卧在辐射器下，以及它们的颈部固定在小的塑料管道中，以确保其头部在正确的位置。用铅保护其身体。
在辐射前，以标准的颗粒老鼠固型食物喂养老鼠，然而辐射后，以半流体食物喂养老鼠，并每天更新食物。
接着，根据Parkins等等(Parkins et al，Radiotherapy & Oncology，1：165-173，1983)开发的评分系统，由两个独立的观察者，对唇粘膜反应进行评分，其中引用红斑状态，以及水肿、脱皮和渗汗的出现。另外，在每次记录它们的红斑/水肿状态之前，对老鼠进行称重。
实验结果显示本发明的TAT-IB肽可防止与电离辐射相关的重量减少和红斑/水肿。
例13：通过本发明的L-TAT-IB1抑制JNK转录因子
使用AP-1双倍标记探针，执行凝胶阻滞测定(5’-CGC TTG ATG AGT CAGCCG GAA-3’(SEQ ID NO：27)。作为示例，可使用5ng/mlTNF-α对HeLa细胞核提取物处理1小时，或不作处理。在TNF-处理前分钟，添加核本发明的L-TAT-IB1的肽。使出仅部分凝胶具有特异的AP-1DNA复合体(使用非标记特异和非特异竞争者，并通过竞争实验得到证明)。
在TNF-α存在的情况下，本发明的L-TAT-IB1肽降低了AP-1DNA结合复合体的形成。
例14：评估永久MCAO模型中防御病灶性大脑缺血的神经保护-确定不同剂 量的保护效果(图3)
在12天龄的小鼠中诱导病灶性大脑缺血。在诱导室中使用2％异氟烷麻醉小鼠，在操作的过程中，在2％异氟烷下使用面具维持麻醉。通过电凝大脑中动脉(MCA)的主干，诱导MCAO。正面放置小鼠，并在耳和眼之间作斜皮切割。在切除颞肌后，从额缝中去除颅骨，直至颧弓之下。在MCA分叉进入额支和顶支之前，正好暴露在鼻腔裂缝上的左MCA永久地电凝在大脑下静脉。接着，闭合头盖皮肤切口。然后，将小鼠置于培养箱中并保持温度为37℃，直到其苏醒，最后再转移到其母亲处。
6小时后，腹膜内注射本发明的根据SEQ ID NO：11的嵌入D-TAT-IB1肽。凝固后24小时，使用水合氯醛麻醉小鼠，并在PBS中，使用4％多聚甲醛，灌注通过升主动脉。接着，移除脑髓并在相同的固定液中保持2小时，并将梯度为30％的蔗糖置于PBS中，保持温度4℃持续15小时。在异戊烷中(-40℃)冻结脑髓并以-20℃存储。收集50μm冠状恒温箱切片于载玻片上。使用甲酚紫染色该切片。分析每第十个切片，并使用Neuroleucida程序，计算器官损害的体积。在对照组A中，平均的器官损害的体积是21.47mm3，所有的实验组与对照组相比具有较低的平均值。在组A和组C、E和F之间观察到显著的统计差分(单侧t检验：分别为p＝0.030，p＝0.002，p＝0.001)。图4示出结果。
结果，这些数据支持结论，即以剂量11mg/kg、3mg/kg、0.3mg/kg和0.03mg/kg给药，本发明的根据SEQ ID NO：11的嵌入D-TAT-IB1肽可保护大脑。将1mg/kg、0.003mg/kg和0,0003mg/kg的结果与空白组对比后，提出总样本未足够大以产生显著的差异。观察到剂量0.03mg/kg有最好的保护。
例15：在短暂MCAO模型中，在iv给药后，通过本发明的嵌合肽防御病灶性大脑缺血的神经保护的评估(图4)
成年大鼠中短暂的局部缺血。使用雄性ICR-CD1老鼠(6周龄；18-37g；Harlan)，通过将纤维从颈外动脉引入到颈内动脉，并进一步引入到大脑后动脉，以引起局部性缺血，因此闭塞中大脑动脉。通过激光多普勒血流计，测量局部的脑血流量，其中，在再灌注10分钟后，用探针固定在头骨上遍及整个局部缺血区。测量直肠温度并保持在37℃。再灌注后48小时致死老鼠。使用配备有Neurolucida程序(MicroBrightField)的计算机显微镜系统可扫描20μm厚的连续的冰冻切片，并可使用Neurolucida程序计算(不可见的)局部性缺血区域的体积以及整个大脑的体积。
XG-102 0.3＝0.3mg/kg，XG-102 1＝1mg/kg，XG-102 5＝5mg/kg
如下示出，在成年大鼠模型中，再灌注6小时后，使用安慰剂和XG-1020.3、1、3mg/kg iv给药后，梗塞的体积大小(mm3)：
梗塞            moyenne         écart type
对照n＝5        72              17
XG102 0.3n＝5   16              4
XG102 1n＝1     16
XG102 3n＝5     15              5
例16：在NMDA刺激后，通过测量LDH释放，测定神经元培养基(图5)
在姊妹培养基中，可评估D-TAT-IB(通用的)/D-JNKI1肽(SEQ ID NO：12)的神经保护效果，其中，在连续的暴露于100μM NMDA之前，使用指示浓度的肽或MK-801预处理该培养基30分钟。NMDA处理12小时后，在使用5M的D-TAT-IB(通用的)/D-JNKI1预处理的培养基中，由于NMDA的暴露，并通过上述对照组(图5)中未出现显著的LDH释放示出退变被完全抑制。形态上的外观、数目和神经元的分布并不能区别于对照组。
皮质神经元培养基。从两天龄小鼠的大脑切下小片皮质，并使用200单位的木瓜蛋白酶在34℃将其培养30分钟，接着，将神经元以密度大约为1×106细胞/细胞培养板，放置在细胞培养板上，使用100μg/ml多聚赖氨酸预先涂附该培养板。该放置媒介由B27/神经基质构成(Life Technologies，Gaithersburg，MD)并附加有0.5mM谷氨酸脂、100U/ml青霉素、和100ug/ml链霉素。
乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒测定。使用Cytotox96非放射性细胞毒测定(Promega，WI)，测量在NMDA给药12、24和48小时后释放到培养基池中的LDH(图5)。
例17：使用统一计量的方法，在HepG2细胞中抑制内源JNK活性(图6)
实验的前一天，以3000细胞/细胞培养井，培养HepG2细胞。接着，将增加浓度的白细胞介素-1β[IL-1αv)]或肿瘤坏死因子α[TNFα(·)]，(a)添加到激活的JNK中30分钟。在20mM Hepes、0.5％Tween pH 7.4以及AlphaScreen处理的JNK中，使细胞溶解。(b)通过10ng/ml IL-1β诱导用于JNK活性的Z’，并以384细胞培养井/细胞培养板(n＝96)对其进行测量。(c)使用化学JNK抑制剂，抑制内源的IL-1β诱导的JNK活性[staurosporin(°)和SP600125(·)]。(d)根据SEQ ID NO：9的肽抑制剂L-TAT-IB1(在此简称为L-JNKi(v))、根据SEQ ID NO：11的D-TAT-IB1(在此简称为D-JNKi(◆))、以及JBDs(·)(相当于不具有TAT序列的L-JNKI)对于IL-1β决定的JNK活性的影响。所有板代表3个独立的实验(n＝3)。
方法：透明显示屏激酶测定
原理：AlphaScreen是一种非放射的磁珠技术，用于在酶标板格式中研究生物分子的相互作用。ALPHA表示放大的发光邻近均质测定。其涉及生物的相互作用，该相互作用使得施体和受体以非常接近的形式形成珠，接着，产生复叠的化学反应以生成放大的信号。接着以680nm进行激光刺激，施体珠中的光敏剂(苯二甲蓝染料)将周围的氧转换成激发单重态。在其4μsec的半衰期内，单重氧分子可溶液中扩散200nm，并且如果受体珠在其中并非常接近时，单重氧将与受体珠中的二甲基噻吩衍生物发生反应，这将以370nm生成化合光，该化合光进一步激发相同受体珠中的荧光团。随后，该激发的荧光团以520-620nm发光。未出现受体珠的情况下，单重氧降为基态并不产生信号。
首先在激酶缓冲剂(20mM Tris-HCl pH 7.6，10mM MgCl2，1mM DTT，100μM Na3VO4，0.0 1％Tween-20)中，稀释激酶试剂(B-GST-cJun，反P-cJun抗体和活性JNK3)，接着添加到细胞培养井中(15μl)。然后，在具有10μM ATP并在23℃条件下，反应持续1小时；通过添加10μl珠混合物(蛋白A受体20μg/ml和Streptavidin施体20μg/ml)，执行检测；接着在检测缓冲液中稀释(20mM Tris-HCl pH 7.4，20mM NaCl，80mM EDTA，0.3％BSA)；然后，在黑暗中23℃条件下，再培养1小时。为了测量JNK内源活性，除了通过细胞溶解产物取代激活的JNK3，进行如上所述的激酶测定；在细胞溶解后，添加反应激酶合成物。以相同的浓度使用B-GST-cjun和P-cJun抗体，但是以50μM而不是10μM使用ATP。在Fusion或En Vision设备上，直接分析AlphaScreen信号。
例18：治疗噪音损伤
要么在噪音损伤前30分钟(120dB，6kHz，持续30分钟)或在之后的30分钟或4小时，将2微升凝胶形式的2.6％的缓冲透明质酸中的D-TAT-IB1用于3组几内亚猪(每组6头猪)的耳蜗圆窗膜。非治疗的耳朵作为对照。在噪音损伤后20分钟(暂时性的听力阈值下降，TTS)和损伤后的15天(永久性的听力阈值下降，PTS)，通过脑干听觉反应测量评估听力阈值的下降。相比较非治疗的耳朵，给药D-TAT-IB1防止永久性的听力丧失，即使在暴露于过度噪音后使用。在噪音损伤后越早给药D-TAT-IB1，保护效果就越强。因此，在噪音损伤中，D-TAT-IB1是非常有效的耳保护混合物。
从前述本发明特定实施例的详细描述中，对独特的细胞通透生物活性嵌合肽和JNK抑制序列作了显而易见的描述。本发明是通过几个具体实施例进行说明的，本领域技术人员应当明白，在不脱离本发明范围的情况下，还可以对本发明进行各种变换及等同替代。另外，针对特定情形或具体情况，可以对本发明做各种修改，而不脱离本发明的范围。因此，本发明不局限于所公开的具体实施例，而应当包括落入本发明权利要求范围内的全部实施方式。
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Claims (10)

1.一种JNK抑制肽，其由根据SEQ ID NO：2的D氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的JNK抑制肽，其特征在于，所述JNK抑制肽与JNK相结合。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的JNK抑制肽，其特征在于，当JNK表达细胞中存在所述JNK抑制肽时，所述JNK抑制肽抑制至少一个JNK标靶转录因子的活性。
4.根据权利要求1所述的JNK抑制肽，其特征在于，所述JNK标靶转录因子选自c-Jun、ATF2和Elkl。
5.根据权利要求1所述的JNK抑制肽，其特征在于，当JNK表达细胞中存在所述JNK抑制肽时，所述JNK抑制肽改变JNK的作用。
6.一种嵌合肽，其由根据SEQ ID NO：11的D氨基酸序列组成。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1至5中任一项所述的JNK抑制肽，或权利要求6所述的嵌合肽，以及药用上可接受的载体。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的JNK抑制肽或根据权利要求6所述的嵌合肽的用于制备治疗病理生理异常的药物组合物的应用，所述病理生理异常选自听力损失、耳朵损伤、缺血和通过放射线治疗和紫外光中所使用的电离辐射诱导的病理状态。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述药物组合物通过选自以下的给药途径给予：腹膜内、鼻、静脉内、口和贴剂递送。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至5中任一项所述的JNK抑制肽，和/或权利要求6所述的嵌合肽。 
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