EA014330B1 - Пептидные ингибиторы пути трансдукции сигнала jnk, обладающие способностью проникать в клетку - Google Patents

Пептидные ингибиторы пути трансдукции сигнала jnk, обладающие способностью проникать в клетку Download PDF

Info

Publication number
EA014330B1
EA014330B1 EA200800680A EA200800680A EA014330B1 EA 014330 B1 EA014330 B1 EA 014330B1 EA 200800680 A EA200800680 A EA 200800680A EA 200800680 A EA200800680 A EA 200800680A EA 014330 B1 EA014330 B1 EA 014330B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
peptide
sequences
amino acid
inhibitory
Prior art date
Application number
EA200800680A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800680A1 (ru
Inventor
Кристоф Бонни
Original Assignee
Ксижен С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ксижен С.А. filed Critical Ксижен С.А.
Publication of EA200800680A1 publication Critical patent/EA200800680A1/ru
Publication of EA014330B1 publication Critical patent/EA014330B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16371—Demonstrated in vivo effect

Abstract

В изобретении описаны ингибиторы протеинкиназ и более конкретно ингибиторы протеинкиназы, такой как аминоконцевая киназа c-Jun. Кроме того, в изобретении описаны последовательности ингибиторов JNK, химерные пептиды, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, а также фармацевтические композиции, предназначенные для лечения патофизиологических состояний, ассоциированных с передачей сигнала JNK.

Description

Настоящее изобретение относится к ингибиторам протеинкиназ и более конкретно к ингибиторам протеинкиназы, представляющей собой аминоконцевую киназу с-1ип. Кроме того, настоящее изобретение относится к последовательностям ингибиторов 1ΝΚ, химерным пептидам, нуклеиновым кислотам, кодирующим их, а также фармацевтическим композициям, предназначенным для лечения патофизиологических состояний, ассоциированных с передачей сигнала 1ΝΚ.
Аминоконцевая киназа с-1ип (1ΝΚ) является представителем группы активируемых стрессом активируемых митогеном протеин-(МАР)-киназ. Эти киназы принимают участие в контроле роста и дифференцировке клеток и в более общем плане в ответе клеток на стимулы окружающей среды. Путь трансдукции сигнала 1ΝΚ активируется в ответ на связанный с окружающей средой стресс и при участии нескольких классов рецепторов на клеточной поверхности. Эти рецепторы могут представлять собой рецепторы цитокинов, рецепторы серпентина и рецепторы тирозинкиназ. В клетках млекопитающих 1ΝΚ принимает участие в биологических процессах, таких как онкогенная трансформация и опосредующие адаптивные ответы на связанный с окружающей средой стресс. 1ΝΚ ассоциирована с модулирующими иммунными ответами, включая созревание и дифференцировку иммунных клеток, а также участие в запрограммированной гибели клеток, выявленных иммунной системой в качестве мишеней для разрушения. Это уникальное свойство делает передачу сигнала 1ΝΚ перспективной мишенью при разработке средств, предназначенных для фармакологического вмешательства. С передачей сигнала 1ΝΚ связаны некоторые неврологические нарушения, прежде всего ишемический удар и болезнь Паркинсона.
Одним из путей борьбы с нарушениями, в значительной степени связанными с передачей сигнала 1ΝΚ, является создание ингибиторов пути передачи сигнала 1ΝΚ. К таким ингибиторам, уже известным в данной области, относятся, прежде всего, например, ингибиторы, находящиеся перед киназой в пути передачи сигнала (например, СЕР-1347), низкомолекулярные химические ингибиторы 1ΝΚ (БР600125 и АБ601245), которые непосредственно оказывают воздействие на киназную активность, например, в результате конкуренции с АТФ-связывающим доменом протеинкиназы, и пептидные ингибиторы взаимодействия между 1ΝΚ и ее субстратами (Ό-1ΝΚΙ и Ι-ЛР) (см., например, 1<иап е! а1., Сиггеп! Эгид Тагде!к СЫБ & №иго1од1са1 П1когбегк, т. 4, № 1, февраль 2005 г., с. 63-67, (5)).
Ингибитор СЕР-1347 (ΚΤ7515), находящийся перед киназой в пути передачи сигнала, представляет собой полусинтетический ингибитор семейства киназ смешанной линии дифференцировки. СЕР-1347 (ΚΤ7515) усиливает выживание нейронов в дозах, которые ингибируют активацию аминоконцевых киназ с-1ип (1ΝΚ) в первичных эмбриональных культурах и дифференцированных РС12-клетках после удаления из питательной среды и у мышей, обработанных 1-метил-4-фенилтетрагидропиридином (МФТП). Кроме того, СЕР-1347 (ΚΤ7515) может увеличивать продолжительность выживания культивируемых куриных эмбриональных ганглиев заднего корешка спинного мозга, симпатических, цилиарных и моторных нейронов (см., например, Вогакю е! а1., №игогероп. 9 (7), 11 мая 1998 г., с. 1435-1439).
Установлено, что низкомолекулярный химический ингибитор БР600125 снижает уровни фосфорилирования с-1ип, защищает допаминергические нейроны от апоптоза и частично восстанавливает уровень допамина при индуцированной МФТП болезни Паркинсона (БП) у мышей линии С57ВБ/6Ч (\Уапд е! а1., Ченго^а Кек., 48(2); февраль 2004 г., с. 195-202). Эти результаты свидетельствуют также о том, что путь 1ΝΚ представляет собой основной медиатор нейротоксического действия МФТП ш у1уо, и ингибирование 1ΝΚ может стать новой и эффективной стратегией лечения БП.
Другим примером низкомолекулярных химических ингибиторов является вышеуказанный ингибитор 1ΝΚ АБ601245. АБ601245 ингибирует путь передачи сигнала 1ΝΚ и увеличивает выживание клеток после церебральной ишемии. 1п у1уо АБ601245 обеспечивает выраженное защитное действие в отношении отложенной потери СА1-нейронов гиппокампа на модели кратковременной общей ишемии у песчанок. Это действие опосредуется ингибированием 1ΝΚ и, как следствие, экспрессией и фосфорилированием с-1ип (см., например, СагЬош е! а1., 1. Рйагтасо1. Ехр. Тйег., 310(1), июль 2004 г., с. 25-32, ЕриЬ 26 февраля 2004 г.).
К третьему классу ингибиторов пути передачи сигнала 1ΝΚ относятся указанные выше пептидные ингибиторы взаимодействия между 1ΝΚ и ее субстратами. В качестве отправной точки для конструирования таких пептидных ингибиторов 1ΝΚ можно использовать сравнительных анализ первичной структуры встречающихся в естественных условиях белков 1ΝΚ. Как правило, такие белки содержат 1ΝΚсвязывающие домены (1ΒΌ) и встречаются в различных инсулинсвязывающих (ΙΒ) белках, таких как ΙΒ1 или ΙΒ2. Примером такого сравнительного анализа первичной структуры последовательностей является, например, сравнительный анализ первичной структуры последовательностей ΙΝΚ-связывающих доменов ΙΒ1 [БЕР ΙΌ ΝΟ: 13], ΙΒ2 [БЕр ΙΌ ΝΟ: 14], с-1ип [БЕр ΙΌ ΝΟ: 15] и АТЕ2 [БЕр ΙΌ ΝΟ: 16] (см., например, фиг. 1Λ-Β). Такой сравнительный анализ первичной структуры последовательностей выявил частично консервативную состоящую из 8 аминокислот последовательность (см., например, фиг. 1А). Сравнение 1ΒΌ, встречающихся в ΙΒ1 и ΙΒ2, дополнительно подтвердило наличие двух высококонсервативных для двух последовательностей блоков, состоящих из 7 и 3 аминокислот.
Последовательности, сконструированные на основе такого сравнительного анализа первичной структуры, описаны, например, в XVΟ 01/27268. В частности, в XVΟ 01/27268 описаны низкомолекулярные слитые пептиды, проникающие в клетку, которые содержат так называемую ответственную за обес
- 1 014330 печение проникновения в клетки последовательность ТАТ, которую получают из основной обладающей способностью обеспечивать перенос последовательности белка ВИЧ-ТАТ и состоящей как минимум из 20 аминокислот ингибирующей последовательности ΙΒ1. Оба компонента ковалентно связывают друг с другом. Примеры (в настоящее время единственные) ингибиторов пути передачи сигнала ΜΑΡΚ-ΕΝΚ приведены в \УО 01/27268, и они представляют собой, например, Ь-ΙΝΚΠ (ΕΝΚ - пептид-ингибитор, состоящий из Ь-аминокислот) или устойчивые к протеазам Ό-.1ΝΚΙ1 -пептиды (1ΝΚ - пептид-ингибитор, состоящий из ненативных Э-аминокислот). Эти пептиды-ингибиторы 1ΝΚ (ΕΝΚΙ) являются специфическими для 1ΝΚ (ΙΝΚ1, ΕΝΚ2 и ΕΝΚ3). В отличие от указанных низкомолекулярных ингибиторов ингибирующие последовательности, описанные в \УО 01/27268, например 1ΝΚΙ1, более вероятно, ингибируют взаимосвязь между 1ΝΚ и ее субстратом. С помощью его обеспечивающей перенос последовательности, выведенной из ТАТ, слитый пептид эффективно транспортируется в клетку. Благодаря новым свойствам, полученным с помощью обеспечивающего перенос компонента, слитые белки активно транспортируются в клетку, где они сохраняют эффективность вплоть до протеолитического расщепления.
Однако пептиды, описанные в XVО 01/27268, еще легко доступны для фосфорилаз (киназ). Любая аминокислота пептида служит мишенью для киназ и, следовательно, может подвергаться фосфорилированию, что представляет собой важный фактор инактивации таких пептидов. Таким образом, первым объектом настоящего изобретения являются новые ингибирующие последовательности пути передачи сигнала ΕΝΚ, которые сохраняют функциональные свойства пептидов, описанных в νθ 01/27268, но обладают повышенной стабильностью в отношении фосфорилаз (киназ).
Кроме того, для получения ингибирующих последовательностей, описанных в νθ 01/27268, требуются дорогостоящая стадия выделения и очистки, особенно при получении в крупных масштабах (например, при промышленном получении). Таким образом, вторым объектом настоящего изобретения являются ингибирующие последовательности, которые можно получать с помощью более простого и эффективного с позиций стоимости процесса получения и выделения по сравнению с известным к настоящему времени в данной области.
Эти задачи решаются с помощью последовательности, ингибирующей ΕΝΚ, состоящей менее чем из 150 аминокислот, где ингибирующая ΕΝΚ последовательность содержит или состоит по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3 или 4, или ее варианта, фрагмента или производного.
Предпочтительно предлагаемая в изобретении последовательность, ингибирующая ΕΝΚ, связывается с ΕΝΚ и/или ингибирует активацию по меньшей мере одного активируемого 1ΝΚ фактора транскрипции, например с-1ип, или АТБ2 (см., например, 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 15 и 16 соответственно), или Е1к1.
Как правило, предлагаемые в настоящем изобретении последовательности, ингибирующие ΕΝΚ, содержат в целом менее 150 аминокислотных остатков, предпочтительно от 5 до 150 аминокислотных остатков, более предпочтительно от 10 до 100 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно от 10 до 75 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно от 15 до 50 аминокислотных остатков.
Предлагаемая в изобретении последовательность, ингибирующая ΕΝΚ, предпочтительно содержит или состоит по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО ΝΟ: 1, 2, 3 или 4, или ее варианта, фрагмента или производного. Более предпочтительно предлагаемая в изобретении последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, может содержать 1, 2, 3, 4 или даже большее количество копий аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО ΝΟ: 1, 2, 3 или 4, или ее варианта, фрагмента или производного. При наличии более одной копии предлагаемые в изобретении аминокислотные последовательности, представленные в 8Е0 ГО ΝΟ: 1, 2, 3 или 4, или их варианты, фрагменты или производные можно непосредственно связывать друг с другом без какой-либо линкерной последовательности или с помощью линкерной последовательности, которая содержит 1-10, предпочтительно 1-5 аминокислот. Аминокислоты, из которых состоит линкерная последовательность, предпочтительно выбирают из аминокислотных остатков глицина или пролина. Более предпочтительно указанные предлагаемые в изобретении аминокислотные последовательности, представленные в 8Е0 ГО ΝΟ: 1, 2, 3 или 4, или ее варианты, фрагменты или производные можно отделять друг от друга с помощью шарнира, состоящего из 2, 3 или большего количества остатков пролина.
Предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, как они определены выше, могут состоять из Ь-аминокислот, Э-аминокислот или их комбинации. Предпочтительно предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие ΕΝΚ, содержат по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 3, более предпочтительно по меньшей мере 6 и еще более предпочтительно по меньшей мере 10 Э- и/или Ь-аминокислот, где Ό- и/или Ь-аминокислоты могут входить в состав предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, в виде блока, не в виде блока или в виде другой структуры.
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие ΕΝΚ, могут состоять только из Ь-аминокислот. Предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие ΕΝΚ, могут также содержать или состоять по меньшей мере из одной нативной последовательности, ингибирующей ΕΝΚ, которая представлена в 8Е0 ГО ΝΟ: 1 или 3. В этом контексте понятие нативная или нативная(ые) последовательность(и), инги
- 2 014330 бирующая(ие) 1ΝΚ относится к неизмененным предлагаемым в изобретении последовательностям, ингибирующим 1ΝΚ, представленным в любой из 8 Ер ΙΌ N0: 1 или 3, которые полностью состоят из Ьаминокислот.
Таким образом, предлагаемая в изобретении последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, может содержать или состоять по меньшей мере из одной (нативной) аминокислотной последовательности ΝΗ2.\-.\.-НРТТЕ.\Е.\.\.\.\.\.\.\р1)-.\-С0011 |81Т) ΙΌ N0: 3]. В контексте настоящего описания X каждый обозначает аминокислотный остаток, предпочтительно выбранный из любого (нативного) аминокислотного остатка. Хп а обозначает один аминокислотный остаток, предпочтительно представляющий собой любой аминокислотный остаток кроме серина или треонина, где п обозначает 0 или 1. Кроме того, Хпь каждый может представлять собой любой аминокислотный остаток, где п обозначает число от 0 до 5, от 5 до 10, от 10 до 15, от 15 до 20, от 20 до 30 или более при условии, что если п обозначает 0 в Хпа, то Хпь не должен нести серин или треонин на С-конце, для того чтобы избегать присутствия серина или треонина в этом положении. Предпочтительно Хпь представляет собой состоящий из смежных пептидных остатков фрагмент, выведенный из 8ЕР ΙΌ N0: 1 или 3. Более предпочтительно предлагаемая в изобретении последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, может дополнительно содержать или состоять по меньшей мере из одной (нативной) аминокислотной последовательности ΝΗ2ВР1<ВРТТЕЖ-ЕРрУРВ8р0-С00Н |§Е0 ΙΌ Ν0: 1]. Хпа и Хпь обозначают либо Ό- или Ь-аминокислоты.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, могут частично или полностью состоять из Όаминокислот. Более предпочтительно эти предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, состоящие из Ό-аминокислот, представляют собой ненативные последовательности описанных выше (нативных) последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, в Ό-ретроинвертированной форме. Понятие ретроинвертированные последовательности относится к изомерам линейной пептидной последовательности, в которой направление последовательности изменено на противоположное и хиральность каждого аминокислотного остатка является инвертированной (см., например, 1аше8ои с1 а1., №11игс. 368, 1994, с. 744-746; Вгабу е1 а1., №!ше, 368, 1994, с. 692-693). Преимущество объединения Ό-энантиомеров и обратного синтеза состоит в том, что положения карбонильных и аминогрупп в каждой амидной связи меняются местами, при этом положение групп боковой цепи на каждом альфа-атоме углерода сохраняется. Если специально не указано иное, предполагается, что любая предлагаемая в настоящем изобретении Ь-аминокислотная последовательность или пептид могут быть превращены в Ό-ретроинвертированную последовательность или пептид путем синтеза обратных относительно нативной Ь-аминокислотной последовательности или пептида последовательности или пептида.
Предлагаемые в изобретении Ό-ретроинвертированные последовательности, как они определены выше, обладают рядом ценных свойств. Например, предлагаемые в изобретении Όретроинвертированные последовательности более эффективно проникают в клетку по сравнению с Ьаминокислотными последовательностями, предлагаемыми в настоящем изобретении, при этом предлагаемые в изобретении Ό-ретроинвертированные последовательности являются более стабильными по сравнению с соответствующими Ь-аминокислотными последовательностями.
Таким образом, предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, могут содержать или состоять по меньшей мере из одной Ό-ретроинвертированной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности Ν^^,,1 :-ОрХХХХХХХЕХЕТТРК.-Х||'|-Х||1-С00Н |§Е0 ΙΌ Ν0: 4]. В контексте настоящего описания Х, Хпа и Хпь имеют указанные выше значения (предпочтительно обозначают Ό-аминокислоты), где Хпь предпочтительно обозначает состоящий из смежных остатков фрагмент, полученный из 8ЕР ΙΌ Ν0: 2 или 4. Более предпочтительно предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, могут содержать или состоять по меньшей мере из одной Όретроинвертированной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности МН2-ОР§ВРУРРЕЕ^ТТРВКРК-С00Н |8ЕО ΙΌ Ν0: 2].
Предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, как они описаны выше, представлены в табл. 1 (8ЕР ΙΌ Ν0: 1-4). В таблице представлены обозначения предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, а также идентификационный номер последовательности, их длина и аминокислотная последовательность. Для сравнения представлены также известные из прототипа последовательности, которые описаны в \У0 01/27268 (8ЕР ΙΌ Ν0: 17-26). Эти известные из прототипа последовательности не относятся к предлагаемым в изобретении последовательностям, ингибирующим 1ΝΚ, или предлагаемым в изобретении химерным пептидам, и таким образом, они специально исключены из объема настоящего изобретения посредством письменного отказа от права на них.
- 3 014330
Таблица 1
Обоаначение последовательности/пептида 10 ΝΟ АК Поел е до в ател ь ность
Ь-1В1(5) 1 19 КРККРТТЬМЬ рро уркхю (ΝΗ2-ΚΡΚΚΡΤΤΕΝΕΡΡθνΡΚ8ΩΟ-σθΟΗ)
ϋ-ΙΒ1(5> 1 19 ОрБКРУрРРЕ ΝίΤΤΡΚΚΡΚ (ΝΗ,-ΟΩ8ΚΡνΩΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚΡΚ-ϋΟΟΗ)
Ь-1В (общая формула) (з) 3 18 ХКРТТЕХЬХХ хххххрох (МН7-Хг,ь-Х„*-КРТТ1.ХЕХХХХХХХОО-Х„ь-С0ОН)
ϋ-ΙΒ (общая формула) (з) 4 18 ΧϋΩΧΧΧΧΧΧΧ ЬХЬТТРКХ (ΝΗ2-ΧΛθΟΧΧΧΧΧΧΧΡΧΕΤΤΡΚ-Χ„’-ΧΛ€ΟΟΗ)
Ι.-ΤΑΤ 5 10 6ΚΚΚΚΚΩΚΚΚ (ΝΗ2-0 ΚΚΚΚΚΩΚΚΚ-СООН)
ϋ-ΤΑΤ 6 10 κκκωκκκκκο (ЫН2-ККШ)КККККС-СООН)
Ь-общая формула-ТАТ (з) 7 17 ΧΧΧΧΚΚΚΚΚΩ КККХХХХ (ΝΗ,-ΧΛΚΚΚΚΚΩΚΚΚ-ХЛСООН)
ϋ-обшая формула-ТАТ (з) 8 17 ХХХХКККС1КК кккхххх (МН2-Х„Ь-ККК9ККККК-Х„Ь-СООН)
Ь-ТАТ-1В1(з) 9 31 ОКККККрККК РРКРККРТТЬ ΝΕΡΡρνΡΚΒΩ ϋ (ΝΗ2- ΟΚΚΚΚΚΩΚΚΚΡΡΚΡΚΚΡΤΤΕΝΕΕΡΩνΡΚ8<)Ο- СООН)
Ь-ΤΑΤ-ΙΒ (общая формула) (я) 10 38 ΧΧΧΧΧΧΧΚΚΚ ΚΚΩΚΚΚΧΧΧΧ ХКРТТЬХЬХХ ΧΧΧΧΧΩΙ7Χ (ΝΗ^ΧΛΚΚΚΚΚΩΚΚΚ-ΧΛΧΛ кРТТЬХЕХХХХХХХОО-ХЛсООН)
0-ТАТ-1В1(з) 11 31 ООЗКРУОГ'ГЬ ЫЬТТРККРКР ΡΚΚΚΩΚΚΚΚΚ 6 (ΝΗ2- ΟΩ8ΚΡνΩΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚΡΚΡΡΚΚΚ()ΚΚΚΚΚα- СООН)
ϋ-ΤΑΤ-ΙΒ (общая формула) (з) 12 38 ΧϋΩΧΧΧΧΧΧΧ ΣΧΕΤΤΡΚΧΧΧ ХХКККрКККК ΚΧΧΧΧΧΧΧ (МН2-Х.ь-О0ХХХХХХХЕХЕТТРК-Х„а-Х?ККШЗККККК-ХАсООН)
ΙΒ1 -длинный 13 29 ΡΟΤΟΩΟϋΤΥΚ ΡΚΚΡΤΤίΝΕΓ Р9УРК80ОТ
1В2-ДЛИННЫЙ 14 27 1Р8Р8УЕЕРН КНКРТТЕКЬТ ΤΙΧ3ΑΩΟ8
е-Щп 15 29 ΟΑΥΟΥδΝΡΚΙ ΕΚ()8ΜΤΕΝΕΛ ОРУСЫЬКРН
АТР2 16 29 ТЫЕОНЬАУНК НКНЕМТЕКЕ6 ΡΑΚΝϋδνΐν
Ь-1В1 17 23 ϋΤΥΚΡΚΚΡΤΤ ΕΝ1.ΓΡ<2νΡΚ5 ΩΟΤ
ϋ-ΙΒ1 18 23 ΤΟΩ8Κ.Ρν(?ΡΓ ίΝΕΤΤΡΚΚΡΚ ΥΤϋ
Ь-ΙΒ (общая формула) 19 19 ХКРТТЕХЬХХ ХХХХХОШ/ТХ
Ο-ΙΒ (общая формула) 20 19 хз/τυΩχχχχχχ хьхеттркх
Ь-общая формула-ТАТ 21 17 ΧΧΧΧΚΚΚΚΚΩ КККХХХХ
ϋ-общая формула-ТАТ 22 17 ΧΧΧΧΚΚΚΩΚΚ КККХХХХ
Ь-ΤΑΤ-ΙΒ1 23 35 ΩΚΚΚΚΚΩΚΚΚ ΡΡϋΤΥΚΡΚΚΡ ттьмегроур κδουτ
Ε-ΤΛΤ-ΙΒ (общая формула) 24 42 ΧΧΧΧΧΧΧΚΚΚ ΚΚΩΚΚΚΧΧΧΧ ХХХХКРТТЬХ ЬХХХХХХХОР 5/ΤΧ
β-ΤΑΤ-ΕΒΙ 25 35 Τ0Ω5ΚΡν<}ΡΕ ЕЫЬТТРККРК ΥΤΟΡΡΚΚΚΩΚ κκκκο
Ρ-ΤΑΤ-ΙΒ (общая формула) 26 42 ΧΤ/δϋΩΧΧΧΧΧΧ ХЬХЬТТРКХХ ΧΧΧΧΧΧΚΚΚΩ ΚΚΚΚΚΧΧΧΧΧ XX
В табл. 1 примеры последовательностей, а также их общие формулы представлены в 8ЕС ΙΌ N0: 1, 2, 5, 6, 9 и 11 и 8ЕС ΙΌ N0: 3, 4, 7, 8, 10 и 12 соответственно.
Согласно следующему варианту осуществления изобретения предлагаемая в изобретении последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, содержит или состоит по меньшей мере из одного варианта, фрагмента и/или производного указанных выше предлагаемых в изобретении нативных или ненативных аминокислотных последовательностей, представленных в 8ЕС ΙΌ N0: 1, 2, 3 или 4. Предпочтительно эти варианты, фрагменты и/или производные сохраняют биологическую активность описанных выше предлагаемых в изобретении нативных или ненативных последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, прежде всего нативных или ненативных аминокислотных последовательностей, представленных в 8ЕС ΙΌ N0: 1, 2, 3 или 4, т.е. связывающихся с 1Ж и/или ингибирующих активацию по меньшей мере одного активируемого 1ЫК фактора транскрипции, например, с-Лт. ЛТР2 или Е1к1. Функциональную активность можно оценивать с помощью различных анализов, например, оценивая связывание пептида с его молекулоймишенью или с помощью биофизических методов, например, спектроскопии, компьютерного модулирования, структурного анализа и т.д. В частности, предлагаемая в изобретении последовательность, инги
- 4 014330 бирующая 1ΝΚ, или ее варианты, фрагменты и/или производные можно изучать с помощью анализа гидрофильности (см., например, Норр и \Уооб5. Ргос. Ναΐί. Асаб. 8οί. И8А 78, 1981, с. 3824-3828), который можно использовать для идентификации гидрофобных и гидрофильных пептидов, что позволяет создавать субстраты для экспериментальных исследований, таких как эксперименты по связыванию, или для синтеза антител. Для идентификации областей (предлагаемой в изобретении) последовательности, ингибирующей 1ΝΚ, или ее вариантов, фрагментов и/или производных можно осуществлять также анализ вторичной структуры, с помощью которого определяют специфические структурные мотивы (см., например, Скоп и Раятап, Вюсйет 13, 1974, с. 222-223). Для манипуляции, трансляции, предсказания вторичной структуры, определения профилей гидрофильности и гидрофобности, предсказания и создания открытых рамок считывания и определения гомологии последовательности можно использовать компьютерные пакеты программ, существующие в данной области. Можно применять также другие методы структурного анализа, включающие, например, рентгеновскую кристаллографию (см., например, Епд81гот, Вюсйет. Ехр. Вю1. 11, 1974, с. 7-13), масс-спектроскопию и газовую хроматографию (см., например, Ме11юб5 ίη Рго1еш 8с1епсе, изд-во 1. ^йеу апб 8оп§, №\ν Уогк, ΝΥ, 1997) и компьютерное моделирование (см., например, Сотрц1ег СгарЫск апб Мо1еси1аг МобеНпд, в: Сштеп! СоттишсаИопк ш Мо1еси1аг Вю1оду, под ред. ПеНепск и 2о11ег, изд-во Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу Рге§8, Со1б 8рпп§ НагЬог, ΝΥ, 1986).
Таким образом, предлагаемая в изобретении последовательность, ингибирующая ΡΝΚ, может содержать или состоять по меньшей мере из одного варианта (нативных или ненативных) аминокислотных последовательностей, представленных в 8ЕО ГО N0: 1, 2, 3 или 4. В контексте настоящего описания понятие вариант (нативной или ненативной) аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕС ГО N0: 1, 2, 3 или 4 предпочтительно обозначает последовательность, выведенную из любой из последовательностей, представленных в 8ЕС ГО N0: 1, 2, 3 или 4, где вариант содержит изменения аминокислот в аминокислотных последовательностях, представленных в 8ЕС ГО N0: 1, 2, 3 или 4. Такие изменения, как правило, представляют собой 1-20, предпочтительно 1-10 и более предпочтительно 1-5 замен, добавлений и/или делеций аминокислот в последовательностях, представленных в 8ЕС ГО N0: 1, 2, 3 или 4, где последовательность варианта идентична любой из последовательностей, представленных в 8ЕС ГО N0: 1, 2, 3 или 4, по меньшей мере примерно на 30, 50, 70, 80, 90, 95, 98 или даже 99%.
Если предлагаемые в изобретении варианты (нативных или ненативных) аминокислотных последовательностей, представленных в 8ЕС ГО N0: 1, 2, 3 или 4, получают путем замены конкретных аминокислот, такие замены предпочтительно представляют собой консервативные аминокислотные замены. Консервативные аминокислотные замены могут включать синонимические аминокислотные остатки внутри группы, которые обладают в достаточной степени сходными физико-химическими свойствами, такие как замены на остатки из рассматриваемой группы, что должно сохранять биологическую активность молекулы (см., например, СгапИат К, 8с1епсе 185, 1974, с. 862-864). Специалистам в данной области должно быть очевидно, что аминокислоты можно встраивать и/или изымать путем делеции из указанных выше последовательностей без изменения их функции, в частности, если инсерции и/или делеции затрагивают лишь несколько аминокислот, например менее 20 и предпочтительно менее 10, и что недопустимо удалять или заменять аминокислоты, которые имеют решающее значение для функциональной активности. Кроме того, из вариантов, предлагаемых в изобретении, следует исключать замены, которые приводят к появлению дополнительных остатков треонина в положениях аминокислотной последовательности, которые доступны для фосфорилазы, предпочтительно киназы, для того, чтобы избегать инактивации предлагаемой в изобретении последовательности-ингибитора 1ЫК или предлагаемого в изобретении химерного пептида ш у1уо или ш уйго.
Предпочтительно синонимические аминокислотные остатки представляют собой остатки, которые отнесены к одной и той же группе и которые, как правило, можно заменять друг на друга путем консервативных аминокислотных замен, такие группы приведены в табл. 2.
- 5 014330
Таблица 2 Предпочтительные группы синонимических аминокислотных остатков
Аминокислота Синонимический остаток
8ег Зег, ТЬг, О1у, Ази
Агё Аг§, СНп, Вуз, СИи, Н1з
Беи Не, РЬе, Туг, Ме1, Уа1, Беи
Рго СИу, А1а, (ТЬг), Рго
ТЬг Рго, 8ег, А1а, СИу, Шз, СИп, ТЬг
А1а СИу, ТЬг, Рго, А1а
Уа1 Ме1, Туг, РЬе, Не, Беи, Уа1
О1у А1а, (ТЬг), Рго, 8ег, 01у
Не Ме1, Туг, РЬе, Уа1, Беи, Пе
РЬе Тгр, Μεί, Туг, Пе, Уа1, Беи, РЬе
Туг Тгр, Ме1, РЬе, Пе, Уа1, Беи, Туг
Суз 8ег, ТЬг, Суз
ΗΪ3 01и, Еуз, СИп, ТЬг, Аг§, Н1з
σΐη СИи, Буз, Азп, БПз, (ТЬг), Аг§, СНп
Азп Сг1п, Азр, Зег, Азп
Вуз СИи, СНп, Ηϊί, Аг§, Буз
Азр С1и, Азп, Азр
СИи Азр, Вуз, Азп, СИп, Н1з, Аг§, О1и
Ме1 РЬе, Пе, Уа1, Беи, Мег
Тгр Тгр
Конкретной формой варианта 8ЕО 1Б N0: 1, 2, 3 или 4, предлагаемого в изобретении, является фрагмент предлагаемых в изобретении (нативных или ненативных) аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 1Б N0: 1, 2, 3 или 4, который, как правило, изменяют путем по меньшей мере одной делеции по сравнению с 8Е0 1Б N0: 1, 2, 3 или 4. Предпочтительно фрагмент содержит по меньшей мере 4 смежных аминокислоты любой из 8Е0 1Б N0: 1, 2, 3 или 4, эта длина, как правило, является достаточной для специфического распознавания эпитопа любой из этих последовательностей. Еще более предпочтительно фрагмент содержит от 4 до 18, от 4 до 15 или наиболее предпочтительно от 4 до 10 смежных аминокислот любой из 8Е0 1Б N0: 1, 2, 3 или 4. Делецию аминокислот можно осуществлять в любом положении 8Е0 1Б N0: 1, 2, 3 или 4, предпочтительно на N или С-конце. В частности, в пептидах, имеющих последовательность, представленную в 8Е0 1Б N0: 2 (БОЕАРУОРЕЕНЕТТРЕКРЕ). можно изымать путем делеции на N и/или С-конце 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. Другими словами, предпочтительные укороченные версии 8Е0 1Б N0: 2 могут иметь последовательность ^§ЕРУ^РΕ^N^ТТРЕΚРЕ, ЗЕРУРРЕЕМЕТТРККРВ, ^ΤΥΡΒΕΤ^^'Τ^ΚΤΗ,
РУРРЕЕХЕТТРККРЕ или УОРЕЕХЕТ'Т'РЕКРЕ или соответственно IХБНЕ Р УОРЕТ I .ТТРЕ К Р, БРЗЕРУРРЕБМЕТТРЕК, ^^§ЕРУ^РΕ^N^ТТРЕ, БрЗЕРУрРЕЕИЕТТР, 1)С)8ЕР\Е)РЕЕ\ЕТТ или РЗЕРУРРЕЕИЕТТРЕКР, З Е Р УОРЕР N РТТРЕ К Р, ЗЕРУрРЕЬКЕТТРЕК, Е РУОРЕР N РТТРЕ К Р, ЕРУрРЕЕКЕТТРЕК или РУ^РΕ^N^ТТР. Чем короче применяемая пептидная последовательность, предлагаемая в изобретении, тем меньше ее неспецифическая клеточная токсичность. В определенных вариантах осуществления изобретения применяемые пептиды должны иметь максимально возможную короткую последовательность, которая еще сохраняет свою биологическую функцию, например, способность ингибировать 1ЫК.
Кроме того, предлагаемый в изобретении фрагмент (нативных или ненативных) аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 1Б N0: 1, 2, 3 или 4, можно обозначать как последовательность, которая идентична любой из последовательностей, представленных в 8Е0 1Б N0: 1, 2, 3 или 4, по меньшей мере примерно на 30, 50, 70, 80, 90, 95, 98 или даже на 99%.
Предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ЕК, могут также содержать или состоять по меньшей мере из одного производного (нативных или ненативных) аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 1Б N0: 1, 2, 3 или 4. В этом контексте понятие производное (нативных или ненативных) аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 1Б N0: 1, 2, 3 или 4, предпочтительно обозначает аминокислотную последовательность, выведенную из любой из последовательностей, представленных в 8Е0 ГБ N0: 1, 2, 3 или 4, где производное содержит по меньшей мере одну модифицированную Б- или Б-аминокислоту (образованную из не встречающихся(ейся) в естественных условиях аминокислот(ы)), предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10 и еще более предпочтительно от 1 до 5 модифицированных Б- или Б-аминокислот. Производные вариантов или фрагментов также подпадают под объем настоящего изобретения.
Любой из представленных в настоящем описании пептидов может иметь концевую модификацию либо на С-, либо на Оконце, либо на обоих концах. С-конец предпочтительно можно модифицировать с помощью амидной модификации, а N-конец можно модифицировать с помощью любой приемлемой ИНд-защитной группы, например, путем ацилирования.
В этом контексте понятие модифицированная аминокислота может означать любую аминокислоту, измененную, например, в результате различного гликозилирования в различных организмах, фосфо- 6 014330 рилирования или мечения конкретными аминокислотами. Такую метку, как правило, выбирают из группы меток, включающей:
(I) радиоактивные метки, т.е. радиоактивное фосфорилирование или радиоактивную метку, представляющую собой радиоактивную серу, водород, углерод, азот и т.д.;
(II) окрашивающие вещества (например, дигоксигенин и т.д.);
(III) флуоресцентную группу (например, флуоресцеин и т.д.);
(IV) хемолюминесцентные группы;
(V) группы для иммобилизации на твердой фазе (например, Ηίκ-метка, биотин, к1гер-метка, Падметка, антитела, антиген и т.д.); и (VI) комбинацию меток из двух или большего количество меток, указанных в подпунктах (ϊ)-(ν).
В контексте вышесказанного под аминокислотной последовательностью, последовательность которой идентична по меньшей мере, например, на 95% рассматриваемой аминокислотной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, понимают последовательность представленной аминокислотной последовательности, которая идентична рассматриваемой последовательности за исключением того, что представленная аминокислотная последовательность может нести вплоть до 5 аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот рассматриваемой аминокислотной последовательности. Другими словами для получения аминокислотной последовательности, последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична рассматриваемой аминокислотной последовательности, вплоть до 5% (5 из 100) аминокислотных остатков в представленной последовательности можно встраивать или заменять другими аминокислотами или изымать путем делеции.
Для последовательностей, не имеющих точного соответствия друг другу, можно определять % идентичности первой последовательности относительно второй последовательности. В целом, метод заключается в том, что эти две подлежащие сравнению последовательности подвергают сравнительному анализу, добиваясь максимальной корреляции между последовательностями. Эта процедура может включать встраивание брешей в одну или обе последовательности для повышения эффективности сравнительного анализа первичной структуры последовательностей. Далее % идентичности можно определять по всей длине каждой подлежащей сравнению последовательности (так называемый глобальный сравнительный анализ первичной структуры), что является наиболее приемлемым для последовательностей, имеющих одинаковую или близкую длину, или для более коротких участков определенной длины (так называемый локальный сравнительный анализ первичной структуры), что является наиболее приемлемым для последовательностей, имеющих разную длину.
Методы сравнения идентичности и гомологии двух или большего количества последовательностей хорошо известны в данной области. Так, например, для определения % идентичности двух полинуклеотидов и % идентичности и % гомологии двух полипептидных последовательностей можно использовать пакет программ анализа последовательностей группы компьютерной генетики Биотехнологического центра Университета Висконсина (νίίχοηκίη 8ес.|иепсе Лиа1у818 Раскаде, версия 9.1. Эеуегеих е! а1., Νυс1е1с Άαάδ Век. 12, 1984, с. 387-395), например, программы ВЕ8ТБГГ и СЛР. В программе ΒΕ8ΤΤΊΤ использован алгоритм локальной гомологии (8ιηί11ι и Vа1е^таи, 1. Μο1. Βίο1. 147, 1981, с. 195-197), и она позволяет находить одну характеризующуюся наиболее высоким уровнем сходства область в двух последовательностях. В данной области известны также другие программы, предназначенные для определения идентичности и/или сходства между последовательностями, например, семейство программ ВБА8Т (А11ксйи1 е! а1., 1. Μο1. Βίο1. 215, 1990, с. 403-410), которые доступны на домашней странице NСΒI на сайте в сети Интернет ικόί.η1ιη.ηί1ι.§ον и ЕА8ТА (Реат^и, МеБюёк Εиζутο1. 183, 1990, с. 63-98; Реагκοη и Ыртащ Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 85, 1988, с. 2444-2448).
Последовательности-ингибиторы 1ΝΚ, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать или создавать с помощью методов, хорошо известных в данной области, например, путем химического синтеза или генной инженерии, как будет описано ниже. Например, пептид, соответствующий части предлагаемой в изобретении последовательности, ингибирующей 1ΝΚ, которая включает требуемую область указанной последовательности, ингибирующей 1ΝΚ, или которая опосредует требуемую активность ίη νίίτο или ίη νίνο, можно синтезировать с помощью пептидного синтезатора.
Следующим объектом настоящего изобретения является химерный пептид, включающий по меньшей мере один первый домен и по меньшей мере один второй домен, где первый домен содержит транспортирующую последовательность, а второй домен содержит указанную выше предлагаемую в изобретении последовательность, ингибирующую 1ΝΚ.
Как правило, химерные пептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, состоят по меньшей мере из 25 аминокислотных остатков, например от 25 до 250 аминокислотных остатков, более предпочтительно от 25 до 200 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно от 25 до 150 аминокислотных остатков, от 25 до 100 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно от 25 до 50 аминокислотных остатков.
Первый домен предлагаемого в изобретении химерного пептида предпочтительно содержит транспортирующую последовательность, которую, как правило, выбирают из любой последовательности аминокислот, обеспечивающей перенос пептида (в котором она присутствует) к требуемой области клеточ
- 7 014330 ной локализации. Так, согласно настоящему изобретению транспортирующая последовательность, как правило, обеспечивает перенос пептида через плазматическую мембрану, например, из области, расположенной вне клетки, через плазматическую мембрану в цитоплазму. В другом или дополнительном варианте транспортирующая последовательность может обеспечивать перенос пептида к требуемой области внутри клетки, например ядру, рибосоме, эндоплазматическому ретикулуму (ЭР), лизосоме или пероксисоме, например, путем объединения двух компонентов (например, компонента, ответственного за клеточную проницаемость, и компонента, ответственного за ядерную локализацию) или с помощью одного компонента, который обладает, например, способностью осуществлять транспорт через клеточную мембрану и обеспечивать направленный перенос, например, внутриядерный транспорт. Транспортирующая последовательность может содержать также другой компонент, который обладает способностью связываться с цитоплазматическим компонентом или любым другим компонентом или компартментом клетки (например, с эндоплазматическим ретикулумом, митохондриями, аппаратом с неизвестной функцией (д1оот арратаШв), лизосомными пузырьками). Таким образом, транспортирующая последовательность первого домена и последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, второго домена может, например, быть локализована в цитоплазме или любом другом компартменте клетки. Это позволяет определять локализацию химерного пептида в клетке после его проникновения.
Предпочтительно аминокислотная последовательность транспортирующей последовательности (входящая в состав первого домена химерного пептида, предлагаемого в изобретении) состоит из 5-150 аминокислот, более предпочтительно из 5-100 и наиболее предпочтительно из 5-50, 5-30 или даже 5-15 аминокислот.
Более предпочтительно транспортирующая последовательность (входящая в состав первого домена химерного пептида, предлагаемого в изобретении) может представлять собой состоящий из смежных аминокислот фрагмент в первом домене. В другом варианте транспортирующая последовательность в первом домене может быть разделена на два или нескольких фрагментов, где все эти фрагменты представляют собой полную транспортирующую последовательность и могут быть отделены друг от друга 110, предпочтительно 1-5 аминокислотами при условии, что такая транспортирующая последовательность сохраняет свои описанные выше свойства носителя. Аминокислоты, разделяющие фрагменты транспортирующей последовательности, можно, например, выбирать из аминокислотных последовательностей, отличных от аминокислот транспортирующей последовательности. В другом варианте первый домен может содержать транспортирующую последовательность, которая состоит более чем из одного компонента, каждый компонент со своей собственной функцией в отношении транспорта своего груза, т.е. последовательности, ингибирующей 1ΝΚ. которая находится во втором домене, например, в определенный клеточный компартмент.
Транспортирующая последовательность, как она определена выше, может состоять из Ьаминокислот, Ό-аминокислот или их комбинации. Предпочтительно предлагаемые в изобретении транспортирующие последовательности содержат по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 3, более предпочтительно по меньшей мере 6 и еще более предпочтительно по меньшей мере 10 Ьаминокислот и/или Ό-аминокислот, где Ό- и/или Ь-аминокислоты могут входить в состав предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, в виде блока или не в виде блока, или в виде другой структуры.
Согласно одному из альтернативных вариантов осуществления изобретения транспортирующая последовательность предлагаемого в изобретении химерного пептида может состоять исключительно из Ьаминокислот. Более предпочтительно транспортирующая последовательность предлагаемого в изобретении химерного пептида содержит или состоит по меньшей мере из одной нативной транспортирующей последовательности, как она определена выше. В этом контексте понятие нативный относится к неизмененным транспортирующим последовательностям, полностью состоящим из Ь-аминокислот.
Согласно другому альтернативному варианту осуществления изобретения транспортирующая последовательность предлагаемого в изобретении химерного пептида может состоять исключительно из Όаминокислот. Более предпочтительно транспортирующая последовательность предлагаемого в изобретении химерного пептида может содержать Ό-ретроинвертированный пептид описанных выше последовательностей.
Транспортирующую последовательность первого домена химерного пептида, предлагаемого в изобретении, можно получать из встречающихся в естественных условиях источников или можно получать с помощью методов генной инженерии или химическим синтезом (см., например, БатЬтоок, 1., Етйвсй, Е.Е., Машайв, Т., Мо1еси1аг с1ошпд: А 1аЬота!оту тапиа1. 2-е изд., 1989, изд-во Со1б Бртшд НагЬог ЬаЬотаЮгу Ртевв, Со1б Бртшд НагЬог, Ν.Υ.).
Источниками транспортирующей последовательности первого домена, которые можно применять, являются, например, нативные белки, такие, например, как белок ТАТ (например, описанный в ИБ 5804604 и 5674980, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки), УР22 (описанный, например, в \УО 97/05265; ЕШой и О'Наге, Се11 88, 1997, с. 223-233), невирусные белки (1асквоп е! а1., Ргос. №11. Асаб. Бс1. ИБА 89, 1992, с. 10691-10695), транспортирующие последовательности, полученные из представителей Ап!еппареб1а (например, последовательность-носитель из Ап1еп
- 8 014330 пареЛа) или из основных пептидов, например, пептидов, состоящих из 5-15 аминокислот, предпочтительно 10-12 аминокислот и содержащих по меньшей мере 80%, более предпочтительно 85% или даже 90% основных аминокислот, таких, например, как аргинин, лизин и/или гистидин. Кроме того, в качестве указанных в настоящем описании транспортирующих последовательностей применяют варианты, фрагменты и производные одного из нативных белков. Касательно вариантов, фрагментов и производных можно использовать определения, которые указаны выше для последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ. Варианты, фрагменты, а также производные соответствуют изложенным выше определениям последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ. В частности, в контексте транспортирующей последовательности вариант или фрагмент, или производное можно определять как последовательность, идентичная последовательности нативных белков, применяемых в качестве указанных выше транспортирующих последовательностей, по меньшей мере примерно на 30, 50, 70, 80, 90, 95, 98 или даже 99%.
В предпочтительном варианте предлагаемого в изобретении химерного пептида транспортирующая последовательность первого домена содержит или состоит из последовательности, полученной из белка ТАТ человеческого вируса иммунодефицита (ВИЧ)1, в частности содержит некоторые или все 86 аминокислот, из которых состоит белок ТАТ.
Для предлагаемой в изобретении транспортирующей последовательности можно использовать частичные последовательности полноразмерного белка ТАТ, получая функционально эффективный фрагмент белка ТАТ, т.е. пептид ТАТ, который включает область, опосредующую проникновение и поглощение клетками. Представляет ли такая последовательность функционально эффективный фрагмент белка ТАТ, можно определять с помощью известных методов (см., например, Бгапкеб е1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1, И8А 86, 1989, с. 7397-7401). Так, транспортирующую последовательность первого домена предлагаемого в изобретении химерного пептида можно получать из функционально эффективного фрагмента или части последовательности белка ТАТ, которые содержат менее 86 аминокислот и которые поглощаются клетками и необязательно поглощаются ядрами клеток. Более предпочтительно предполагается, что частичные последовательности (фрагменты) ТАТ, которые можно использовать в качестве носителя для опосредования проникновения химерного пептида через клеточную мембрану, должны содержать основную часть (аминокислоты 48-57 или 49-57) полноразмерного ТАТ.
Согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагаемая в изобретении транспортирующая последовательность может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, которая содержит остатки ТАТ 48-57 или 49-57 и наиболее предпочтительно общую последовательность ТАТ ΝΗ2-Χιι Ι:-ΡΙ<Ι<ΡΡΟΡΡΡ-ΧιιΙ:-ί'ΌΘΗ |8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7], где Хпь имеет указанные выше значения. В другом варианте предлагаемая в изобретении транспортирующая последовательность может содержать или состоять из пептида, который содержит, например, аминокислотную последовательность XIЕ-С1ЕККЕ1Ю1Ш1ССОО11 |8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 5].
Согласно другому более предпочтительному варианту осуществления изобретения транспортирующая последовательность, предлагаемая в изобретении, может содержать Ό-ретроинвертированный пептид, который имеет указанные выше последовательности, т.е. Ό-ретроинвертированную последовательность общей последовательности ТАТ, имеющей последовательность ΝΗ2-Χη Ι-ΒΚΒΟΒΚΚΚΚ-ΧηΙСООН |8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8]. И в этом случае также Хпь имеет указанные выше значения (предпочтительно обозначает Ό-аминокислоты). Кроме того, количество остатков Хпь в любой из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7-8 не ограничено указанным и может варьироваться, как указано выше. Наиболее предпочтительно предлагаемая в изобретении транспортирующая последовательность может содержать Ό-ретроинвертированную последовательность ХН2-1Ш1Ю1ШККНС1-СС)О11 18ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 6].
Согласно другому варианту осуществления изобретения транспортирующая последовательность, предлагаемая в изобретении, может содержать или состоять из вариантов транспортирующих последовательностей, как они определены выше. Вариант транспортирующей последовательности предпочтительно обозначает последовательность, полученную из указанной выше транспортирующей последовательности, где вариант имеет модификацию, например, добавление, (внутреннюю) делецию (что приводит к образованию фрагмента) и/или замену по меньшей мере одной аминокислоты, присутствующей в транспортирующей последовательности, как она определена выше. Такая(ие) модификация(и), как правило, представляет(ют) собой 1-20, предпочтительно 1-10 и более предпочтительно 1-5 замен, добавлений и/или делеций аминокислот. Кроме того, для варианта предпочтительно характерна идентичность последовательности транспортирующей последовательности, как она определена выше, более предпочтительно любой из последовательностей, представленных в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5-8, по меньшей мере примерно на 30, 50, 70, 80, 90, 95, 98 или даже 99%.
Предпочтительно такая модификация транспортирующей последовательности приводит к получению транспортирующей последовательности с повышенной или пониженной стабильностью. Альтернативно этому варианты транспортирующей последовательности можно создавать для модуляции внутриклеточной локализации химерного пептида, предлагаемого в изобретении. При экзогенном введении указанных выше вариантов их, как правило, создают так, чтобы сохранялась способность транспортирующей последовательности проникать в клетки (т. е. поглощение клеткой варианта транспортирующей последовательности практически такое же, как у нативного белка применяемой транспортирующей по
- 9 014330 следовательности). Например, изменение основной области, которое, как предполагается, является важным для ядерной локализации (см., например, Ьапд и Ьее, 1. ΒίοΙ. Сйет. 264, 1989, с. 18019-18023; НаиЬет е! а1., 1. νίτοί. 63, 1989, с. 1181-1187; ВиЬеп е! а1., 1. νίτοί. 63, 1989, с. 1-8), может приводить к цитоплазматической локализации или частичной цитоплазматической локализации транспортирующей последовательности, и, как следствие, последовательности, ингибирующей 1ΝΚ, как компонента предлагаемого в изобретении химерного пептида. Помимо вышеуказанного, в вариант можно интродуцировать другие модификации, например, путем связи, например, холестерина или других липидных фрагментов, с транспортирующей последовательностью с получением транспортирующей последовательности, которая обладает повышенной растворимостью в мембране. Любые из вышеуказанных вариантов транспортирующих последовательностей, предлагаемых в изобретении, можно получать с помощью методов, которые, как правило, известны специалистам в данной области (см., например, 8атЬтоок 1., Егйвсй Е.Р., Машайв Т., Мо1еси1аг с1ошпд: А 1аЬога!огу тапиа1. 2-е изд., 1989, изд-во Со1Б 8рппд НагЬог ЬаЬота1оту, Со1Б 8рппд НагЬог, Ν.Υ.)
Второй домен химерного пептида, предлагаемого в изобретении, как правило, содержит предлагаемую в изобретении последовательность, ингибирующую ΡΝΚ, выбранную из любой из предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих ΡΝΚ, как они определены выше, включая варианты, фрагменты и/или производные этих предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ.
Оба домена, т.е. первый и второй домены предлагаемого в изобретении химерного пептида, могут быть связаны с получением функциональной единицы. Можно применять любой метод связывания первого и второго домена, известный в данной области.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения первый и второй домены химерного пептида, предлагаемого в изобретении, предпочтительно связывают с помощью ковалентной связи. В контексте настоящего описания ковалентная связь может представлять собой, например, пептидную связь, которую можно получать путем экспрессии предлагаемого в изобретении химерного белка в виде слитого белка. Слитые белки в контексте настоящего описания можно получать и применять путями, аналогичными или легко получаемыми на основе стандартных методов рекомбинантной ДНК, которые описаны ниже. Однако оба домена можно также связывать через боковые цепи или их можно связывать с помощью фрагмента, представляющего собой химический линкер.
Первый и/или второй домены предлагаемого в изобретении химерного пептида могут присутствовать в предлагаемом в изобретении химерном пептиде в виде одной или нескольких копий. Если оба домена присутствуют в виде одной копии, то первый домен можно связывать либо с Ν-концом, либо с Сконцом второго домена. При наличии нескольких копий первый и второй домены могут располагаться в любом возможном порядке. Например, первый домен может присутствовать в предлагаемом в изобретении химерном пептиде в виде нескольких копий, например в двух, трех или большем числе копий, которые предпочтительно расположены последовательно, а второй домен может присутствовать в виде одной копии на Ν- или С-конце последовательности, содержащей первый домен. В альтернативном варианте второй домен может присутствовать в виде нескольких копий, например, в двух, трех или большем числе копий, а первый домен может присутствовать в виде одной копии. В обоих вариантах первый и второй домены могут находиться в любом месте и могут располагаться последовательно. Ниже представлены примеры порядка расположения: например, первый домен - первый домен - первый домен - второй домен; первый домен - первый домен - второй домен - первый домен; первый домен - второй домен - первый домен - первый домен или, например, второй домен - первый домен - первый домен - первый домен. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, эти примеры даны только с целью иллюстрации и не ограничивают объем изобретения. Таким образом, число копий и их расположение может варьироваться, как указано ранее.
Предпочтительно первый и второй домены можно связывать друг с другом непосредственно без какого-либо линкера. В другом варианте их можно связывать друг с другом через линкерную последовательность, содержащую от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5 аминокислот. Аминокислоты, входящие в линкерную последовательность, предпочтительно выбирают из глицина или пролина в качестве аминокислотных остатков. Более предпочтительно первый и второй домены можно отделять друг от друга с помощью шарнира, состоящего из двух, трех или большего количества остатков пролина, между первым и вторым доменами.
Описанный выше химерный пептид, предлагаемый в изобретении, который содержит по меньшей мере один первый и по меньшей мере один второй домен, может состоять из Ь-аминокислот, Όаминокислот или их комбинации. Кроме того, каждый домен (а также используемые линкеры) могут состоять из Ь-аминокислот, Ό-аминокислот или их комбинации (например, Ό-ТАТ и Ь-1В1(в) или Ь-ТАТ и Ό-ΙΒ1(β) и т.д.). Предпочтительно предлагаемый в изобретении химерный пептид содержит по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 3, более предпочтительно по меньшей мере 6 и еще более предпочтительно по меньшей мере 10 Ь-аминокислот и/или Ό-аминокислот, где Ό- и/или Ьаминокислоты могут располагаться в химерном пептиде, предлагаемом в изобретении, в виде блока или не в виде блока или в виде другой структуры.
- 10 014330
Согласно конкретному варианту осуществления изобретения химерный пептид, предлагаемый в изобретении, содержит или состоит из Ь-аминокислотных химерных пептидов, имеющих общую формулу Ь-ТЛТ-ГВ-пептида. |\Н;-Х.' -КККККОККК-Х.' -Х.-КРТТЕХЕХХХХХХХОО-Х.' -СООН, БЕЕ) ГО N0: 10], где Х, Хп а и Хп ь предпочтительно имеют указанные выше значения. Более предпочтительно химерный пептид, предлагаемый в изобретении, содержит или состоит из Ь-аминокислотного химерного пептида Е-ТЛТ-1В1 | XI Е-С1ЕККЕЕ('Ж1ШРРЕРКЕРТТЕ\ЕЕРС)\РЕБЕ)1)-С001 Е БЕР ΤΌ N0: 9].
Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения химерный пептид, предлагаемый в изобретении, содержит или состоит из Ό-аминокислотных химерных пептидов описанных выше Ь-аминокислотных химерных пептидов. Примерами Ό-ретроинвертированных химерных пептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, например, являются пептиды Ό-ТЛТ-ТВ общей формулы [ΝΗ2Хп 1-1)Е)ХХХХХХХЕХЕТТРИ-Х.-Х..''-РИИОИИККИ-Х.-СОО! Е БЕР ΤΌ N0: 12]. При этом Х, Хпа и Хпь предпочтительно имеют указанные выше значения (предпочтительно обозначают Ό-аминокислоты). Более предпочтительно химерный пептид, предлагаемый в изобретении, содержит или состоит из Όаминокислотных химерных пептидов, описываемых формулой пептида ТАТ-ТВ1 [ΝΗ2ПРБВРУрРЕЬМЬТТРВКРВРРВККрВККККб-СООН, БЕР ΤΌ N0: 11]. Однако связывающая область первого и второго домена (вместо РР) может содержать -Хпа-Хпь-, которые имеют указанные выше значения. В частности, второй(ые) домен(ы), который(е) имеет(ют) последовательность, представленную в БЕр ΤΌ N0: 11, в том числе содержащую -Хпа-Хпь- вместо РР, могут иметь делецию на их N и/или Сконце 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения первый домен, который имеет последовательность, представленную в БЕр ΤΌ N0: 11, может иметь делецию на его N и/или С-конце 1 или 2 аминокислот. Эту(и) делецию(и) можно применять в сочетании с делецией(ями), описанной(ыми) для аминокислотных остатков на концах второго домена. Таким образом, предпочтительными вариантами БЕр ΤΌ N0: 11 являются, например, следующие последовательности с делециями второго домена на N и/или С-конце(ах):
Р8КРУрРРЬПЬТТРК.КРК-Х„а-Хпь-КВ.Е.фКККККО,8КРУрРРЬКЬТТРК.КРК.-Х„аХпМШ<ф1<ЕККЕС( КРУрРГЕЖТТРККРК-Х,,а-ХЛг<КПСКККККО, РУфРРЕЖТТГЖ.КРК-Хпа-ХЛКЕ1<фКГ<ККк6 или УфРРЕЖТТРККРК-Х„а-ХпьК.ККфКК.ККК.0, или соответственно ОфЗКРУфРРЬЖТТРККР-ХЛхЛ ККК.фЕ.КККК.О, Г)р8КР\Х)РРЕЖТТР1<К-Х„'1-Х?-1и<1<0Ы<КККС1, Оф81<РУфРЕЬМЫ'ТРГ<-Хпа-Хп[,-1<КК()КККККС1, Оф8КРУ<2РРЬЖТТР-Х„а-ХпьККНфККККВС, ОрЗКРУО'РРЕПЕТТ-Х.б-Х^-РКРфККККРС, или ф8КРУфРРЕЖТТРкКР-Хпа-Хпь-К1и<рККККК0, δΚΡνφΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚΡ-Χ,Λ Х„ь-к.ккфк.ккккс, 8КРУфРЕЕЖТТРКК-Хпа-ХпЬ-КККС)К.Й.К.КВ.С, КРУфРГЬЖТТРККР-Хпа-Х„ь-ККЯ(2КККККО, К.РУ<ЗРГЬЖТТРКК-Хпа-Х„ьК.КК.фК.К.ККК.0, или РУОРЕЕЖТТР-ХЛхЛкККрЕККККС.
Предпочтительными вариантами осуществления изобретения, в которых делеции затрагивают только конец(ы) первого домена, являются следующие последовательности:
ОЗКРУрРГЕЖТТРВКРК-ХЛхЛшЕКркК.ККК, ф81ЮУрРРЕЖТТРККРЯ-Хп а-ХЛкКК.<2КККК, (ЗЗКРУфРГЬЖТТРККРК-ХЛ Хгь-КК.фК.ККККС, ф8КРУфРГЕЖТТРкКРК-Хпа-ХЛКфК.К.КККС, рБКРУрРРЬЖТТРККРК-ХЛхЛккрккккк, ρΚΚΡνφΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚΡΚ-Χ/Х^’-КСКККК К, 08 КР У()Р ΡΕΝΕΤΤΡΚΚ РК-X „“-Χ,Λ КфКК К К.
Примерами последовательностей, полученных в результате комбинаций делеций первого и второго домена, являются:
- 11 014330
08КРУфРРЕЖТТР1<КРК-Хл а-ХЛЕЕК9КК.КК1<, 8ЕРУОРЕЕЖТТРККРЕ.-Хпа-ХПЧКЕ(ЖКККК, КРУфРРЬМЬТТРККРК-Хп’-Х?· КЯВ.ФККККВ., РУ9РГЬЖТТРЯКРК-Хп а-ХЛкЯЯ0КК.К К К или УрРРЬЧЬТТР1ЖРк-Хпа-ХЛкКк(Л<кККК, или соответственно Оф8КРУрРРЕЖ.ТТРККР-Хпа-ХЛк1<1иД<кКК1<3 Оф8ЕРУрРРЕЖТТРКХ-Х„аΧΛΚΕΡΡΚ.ΚΚΚΚ, Пр8КРУрРРЕЖТТРК-ХЛХ„ь-ККК(ЖКККК, Ο08ί<Ρν0ΙΨΕΝΕΤΤΡ-ΧΛχΛΗΜ<0ΚΚΚΚΚ. Ο08Κ.Ρν0ΡΡΕΝΕΤΤ-Χ,ΛΧΛ ΕΚΚφΕΚΚΚΚ. или Р8КРУОРРЕЖТТРККР-ХЛХЛККРОРГККК, δΚΡνΟΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚΡ-ΧΛχΛΚΡΚΟΚΚΚΚΚ, БЕРУрРРЕЖТТРК.К-ХЛхЛ ΚΚ,ΚφΚΒΚΚβ., ΝΡνρΡΡί,ΝΕΤΤΡΚΚΡ-Χ„ί1-Χ?-ΚΕΚ.ρΚΚΚΚΚ., ЕРУОРРЕЖТТРКК-ХЛхЛКЕКфЕКККК, или РУОРЕЕЖТГР-ХЛХД ΚΚΚφΚΚΚΚΚ, ρΞΚΡνρΡΓΕΝΕΤΤΡΡΚΡΚ-Χ,,’-Χ,ΛκΚΚρΚΚΚΚ, 8КРУОРРЕЖТТРККР1<-Хп’-ХЛЕ1<Е9Г<ККККС, КРУОРРЕМЕТТРККРК-ХГХп ь-КККрКККК, ΡνρΡΡΕΝΕΤτΡΚΚΡ>Χ/-χΛΗΚΗΟΚΚΚΚ, или УРРРЕЖТТРККРК-ХЛХДККГЩКККК, или соответственно ϋΡ8ΚΡνςΡΓΕΝΕΤΤΡΚΚΡ-ΧΛΧΛκΚΒ.9Β.ΚΚΚ, ООЗКРУфРРЕЖТТРКК-ХЛ Χ,ΛΚΕΕΟΚΕΚΚ, ϋΟ8ΚΡνρΡΡΕΝ1Ι,·|’ΤΡΙ<-Χ„ίι-Χηι’-ΚΚ.ΚρΚΚΚΚ, Ο98ΚΡν9ΡΡΕΝΕΤΤΡ-ΧΛχΛκΚ.Κ.ςΚ.Κ.ΚΚ, ПОЙЯРУрРЕЕЖТТ-ХЛхЛ ΕΚ.ΕφΚΚΚΚ, или рЗКРУфРРЕЖТТРККР-ХГ-Х^'КРРОКККК, 8кРУфРГЕЖТТРККР-Х|1а-Хп|’-кКК(ЖЕ.КК, ЯКРУфРЕЕЖТТРКК-ХЛхЛ ΡΕΚρΡΕΚΚ, КРУфРРЕЖТТРККР-ХЛхДяМ^КККК, ΚΡνφΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚХП“-ХП Ь-КККОК.ККК, или РУрРР[ЖТТР-ХЛХпь-ЯМ<ОКККК, 98КРУ9РРЕЖТТРЕКРК-ХЛХДККОКК.ККК., ЯЕРУфРГЕЖТТРККРК-ХЛ Χδ-ΕΕφΚΚΚΚΚ, КРУрРГЕЖТТРККРК-Хпа-Х?-ККрК.КККЕ,
- 12 014330
РУ0РРЕЫЕТТРХОР.-Х„а-Хпь-ХК0К.К.ККК, или УОРРЕЖТТРККРК.-Хпа-ХЛ Й.КСгККККК., или соответственно ϋφδΚΡνρΡΡΈΝΕΤΤΡΚΚΡ-ΧΛχΛ КК.ФККККЕЕ БрЗКРУрРРЕЖТТРЕК-ХЛХ^-ККрККККк, О08КРУ0РРЕЖТТРК-ХЛхЛкКрКЕ.ККК, ΟΟδΚΡνΟΡΡΕΝΕΤΤΡ-ΧΛΧΛ ΚΚρΚΚΚΚΙΕ 1Χ28ΚΡνί>ΡΚΙ.ΝΕ ΓΊ-Χπ!'-Χι1,’-ΚΚφΚβΚΚΕ, или С8КРУрРРЕМЕТТРККР-ХЛХпЬ-КК<ЖКККК, ΚΚΡνρΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚΡ-Χ,ΛΧΛ КК.ОКИКККС, 8ΚΡνφΡΡΕΝΕΤΊ ΡΚΚ-Χη,'-ΧηΙ1-ΚΚρΡ.ΧΚΚΚα, К.РУ0РРЕКЕТТРККР-Х„а-Х„ь-КК0К.К.ККЕ.О,К.РУ0РРЕКЕТТРВ.К-Х„а-ХпьХК9КККККС , или ΡνρΡΓΕΝΕΤΤΡ-Χη“-Χη”-ΚΚφΚΚΚΚΚΟ, 08Ρ.Ρν0ΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚΡΚ.-Χη 3-Χη'’-ΚΚ.9ΚΚΚΚΚΟ1 8ΚΡνρΡΡΕΝΕΤΤΡΚ.ΚΡΕ-Χ/χΛΚΚ(2Β.ΚΚΚΚσ, КРУ0РРЕМЕТТРХКРК-Х„а-Хпь-КК0ККККХО, Ρν^ΡΡΕΝΕΊΤΡΚΚΡΕ-Χ,ΛΧΛκ^ΕΚΚΚΚΌ, или УОРРЕЖТТРККРК-ХЛХЛ ККОКККККС, или соответственно БОЗКРУОРРЕКЕТТРККР-ХЛХЛ БЖрКККККО. Ο9δΚΡνρΡΓΕΝΕΤΤΡΚΚ-Χ,1!’-ΧΓ1,’-ΚΚρΚΚΚΚΚα, ΟΟδΚΡνςΡΡΕΝΕΊΤΡΚ-ΧΛχΛκΚ.ρΚΚΚΚΚ.Ο, Ο<28Ρ.Ρν9ΡΡΕΝΕΤΤΡ-ΧΛΧ„1’ΚΚΡΚΚΚΚΚΟ, ΠφδΚΡνρΡΡΕΝΕΤΤ-ΧΛχΛκκρκκκΚΚα, или 08ΡΡνρΡΕΕΝΓΠ ΤΡΚΚΡ-Χη1-Χηί>-ΚΚ0[<Π.ΚΚΚ.Ο, δΚΡνφΡΡΕΝΕΓΤΡΚΚΡ-ΧΛΧΛ ΚΚΟΚΧΚΚΚΩ, ΚΚΡνρΡΡΕΝΕτΤΡΚΚ-ΧΛχΛΚΡφΚΕΚΚΚΟ, КРУОРРЬНЕТТРККР-ХП’-ХЛККОКККККО, КРУрРРЕЫЕТТРК.К-Хпа-ХЛ 1ЖСКПККЕС, или ΡνρΡΡΕΝΕΤΤΡ-Χ„!,-Χ?-Κ.ΚφΡΚΚΚΕΟ: 08КРУрРРЕЖТТР1ЖРК-Хп а-ХЛК0Ш<ККВО, δΚΡνφΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚΡΚ-Χ,,3Х„Ь-1«ЖККККО, ΚΡνρΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚΡΚ-ΧΛχΛχΟΚΧΚΚΡΌ.
ΡνΟΡΡΕΝΕΤΤΡΚΚΡΚ-ΧΛχΛΚφΚΚΚΚΙΙΟ, или УфРГЕХЕТТРККРК.-Х,,а-ХЛ КфК.К.ККК.0, или соответственно ООЗКРУОРРЕЖТТРККР-ХАхЛ ΚΟΚΚΚΚΚΟ, ОрЗКРУфРРЕЖТТРКК-ХЛхЛкрХККККС, Ο08Κ.Ρν9ΡΡΕΝΕΤΤΡΚ.-Χηί-Χπ’’-Κ0ΚΚΚΚΚ.Ο, ОрЗКРУ0РРЕЖТТР-Хп а-Х?КфкйКККСЕ ΟφδΚΡνφΡΡΕΝΕΤΤ-Χη’-ΧΛχρΚΚΚΚΚΟ, или ОЗКРУфРГЕЖТТРККР-ХЛхЛкфКККККб, 8К.РУ0РРЕЖТТРКХР-Хпа-Хл'’ВСЖР.ККХС, δΚΡνφΡΓΕΝΕΤΤΡΚΚ-Χδ-ΧΛκρΕΡΚΚΚΌ, КРУфРРЕЖТТРХКРΧη3-ΧΛΚΩΚΚ.ΚΚΚ6, ХРУрРРЕЖТТРКК-ХЛхЛкрРККККО, или Ρν0ΡΡΕΝΕΤΤΡ-Χη 3-Χ„1’-Κ0ΚΚΚΚΚ.Ο.
И в этом случае, более короткие пептиды обладаю более низкой (неспецифической) токсичностью для клеток. Однако пептиды должны сохранять их биологическую функцию, т.е. способность проникать через клеточную мембрану (первый домен) и способность ингибировать 1КК (второй домен).
Первый и второй домены предлагаемого в изобретении химерного пептида, как он определен выше, можно связывать друг с другом с помощью химического или биохимического сшивания, которое осуществляют любым приемлемым путем, известным в данной области, например, создавая пептидную связь между первым и вторым доменами, например, путем экспрессии первого и второго домена в виде слитого белка, или, например, путем перекрестного сшивания первого и второго домена предлагаемого в изобретении химерного пептида.
Многие известные методы химического перекрестного сшивания являются неспецифическими, т. е. они не направляют точку сшивания в конкретный сайт транспортного полипептида или транспортируемой макромолекулы. В результате, неспецифические перекрестносшивающие агенты в случае их использования могут атаковать функциональные сайты или стерически блокировать активные сайты, приводя к тому, что слитые белки становятся биологически неактивными. Таким образом, предпочтительно применять такие методы введения перекрестных сшивок, которые позволяют осуществлять более специфическое сшивание первого и второго домена.
Специфичность сочетания можно повышать путем непосредственного химического сочетания с функциональной группой, встречающейся только один раз или лишь небольшое количество раз в одном
- 13 014330 или обоих первых и вторых доменах, которые подлежат перекрестному сшиванию. Примером является цистеин, который представляет собой единственную аминокислоту, содержащую тиольную группу, и который во многих белках встречается лишь небольшое количество раз. Также, например, если полипептид не содержит остатков лизина, то перекрестносшивающий реагент, обладающий специфичностью в отношении первичных аминов, будет обладать избирательным действием в отношении аминоконца указанного полипептида. Однако для успешного применения этого подхода с целью повышения специфичности сочетания необходимо, чтобы полипептид имел достаточно редко встречающиеся и реакционноспособные остатки в областях молекулы, которые можно изменять без потери биологической активности молекулы.
Остатки цистеина можно заменять, если они встречаются в таких частях последовательности полипептида, где в противном случае их участие в реакции перекрестного сшивания может влиять на биологическую активность. Если остаток цистеина заменяют, то, как правило, желательно минимизировать образующиеся изменения складчатости полипептида. Изменения складчатости полипептида минимальны, когда замена является химически и стерически близкой цистеину. Таким образом, для замены цистеина предпочтительно использовать серин. Как продемонстрировано ниже в примерах, остаток цистеина можно интродуцировать в аминокислотную последовательность полипептида с целью осуществления перекрестного сшивания.
При интродукции остатка цистеина предпочтительной является интродукция на амино- или карбоксильный конец или вблизи них. В настоящее время доступны приемлемые методы таких модификаций аминокислотных последовательностей, при которых представляющий интерес полипептид получают путем химического синтеза или посредством экспрессии рекомбинантной ДНК.
Сочетание первого и второго доменов можно осуществлять посредством связующего или конъюгирующего агента. Существует несколько агентов для межмолекулярного перекрестного сшивания, которые можно использовать (см., например, Меапв и Ееепеу, Сйеш1са1 МобШсайоп οΓ Рго!етв, изд-во Но1беп-Эау, 1974, с. 39-43). К этим реагентам относятся, например, №сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат (СПДП) или ^№-(1,3-фенилен)бис-малеимид (оба обладают высокой специфичностью в отношении сульфгидрильных групп и образуют необратимые связи); Ν,Ν'-этилен-бис(йодацетамид) или другой аналогичный реагент, имеющий 6-11 углеродных метиленовых мостиков (которые обладают относительной специфичностью в отношении сульфгидрильных групп); и 1,5-дифтор2,4-динитробензол (образующий необратимые связи между аминогруппами и тирозиновыми группами). К другим перекрестносшивающим реагентам, пригодным для этой цели, относятся: п,п'-дифтор-м,м'динитрофенилсульфон, который образует необратимые связи с аминогруппами и фенольными группами; диметиладипимидат (который является специфическим для аминогрупп); фенол-1,4-дисульфонилхлорид (который вступает в реакцию главным образом с аминогруппами); гексаметилендиизоцианат или диизотиоцианат, или азофенил-п-диизоцианат (который вступает в реакцию главным образом с аминогруппами); глутаровый альдегид (который вступает в реакцию с несколькими различными боковыми цепями) и дисдиазобензидин (который вступает в реакцию прежде всего с тирозином и гистидином).
Перекрестносшивающие реагенты могут быть гомобифункциональными, т.е. иметь две функциональные группы, участвующие в одной и той же реакции. Предпочтительным гомобифункциональным перекрестносшивающим реагентом является бисмалеимидогексан (БМГ). БМГ содержит две малеимидные функциональные группы, которые специфически взаимодействуют с содержащими сульфгидрил соединениями в мягких условиях (рН 6,5-7,7). Две малеимидные группы соединены углеводородной цепью. Таким образом, БМГ можно применять для необратимого перекрестного сшивания полипептидов, которые содержат остатки цистеина.
Перекрестносшивающие реагенты могут быть также гетеробифункциональными. Гетробифункциональные перекрестносшивающие реагенты имеют две различные функциональные группы, например реактивную аминогруппу и реактивную тиольную группу, которые должны перекрестно сшивать два белка, имеющие свободные амины и тиолы соответственно.
Примерами гетеробифункциональных перекрестносшивающих агентов являются сукцинимидил-4(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (СМЦК), сложный м-малеимидобензоил-Νгидроксисукцинимидиловый эфир (МБС) и сукцинимид-4-(п-малеимидофенил)бутират (СМФБ), представляющий собой аналог МБС с удлиненной цепью. Сукцинимидильная группа этих перекрестносшивающих линкеров взаимодействует с первичным амином и реактивная тиольная группа малеимида образует ковалентную связь с тиольной группой остатка цистеина.
Перекрестносшивающие реагенты часто обладают низкой растворимостью в воде. К перекрестносшивающему реагенту можно добавлять гидрофильный фрагмент, такой как сульфонатная группа, для повышения его растворимости в воде. В этой связи сульфо-МБС и сульфо-СМЦК являются примерами перекрестносшивающих реагентов, модифицированных с целью повышения растворимости в воде, которые можно применять согласно настоящему изобретению.
Многие перекрестносшивающие реагенты приводят к образованию конъюгата, который практически не расщепляется в условиях клеточного окружения. Поэтому некоторые перекрестносшивающие реагенты содержат ковалентную связь, такую как дисульфид, которая расщепляется в условиях клеточ
- 14 014330 ного окружения. Например, реагент Траута, дитио-бис-(сукцинимидилпропионат) (ДСП) и Νсукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (СПДП) представляют собой широко известные расщепляемые перекрестносшивающие линкеры. Использование расщепляемого перекрестносшивающего реагента позволяет транспортируемому фрагменту отделяться от транспортного полипептида после введения в клетку-мишень. Для этой цели можно применять также прямую дисульфидную связь.
В настоящее время поступают в продажу многочисленные перекрестносшивающие агенты, включая описанные выше. Подробные инструкции по их применению легко можно получить от коммерческих поставщиков. Общие сведения о перекрестном сшивании белков и получении конъюгатов приведены у \Уоп§. СйетЩгу о£ Рго1еш СопщдПюп алб Сгояя-Ьшкшд, изд-во СКС Ргевв (1991).
Химическое перекрестное сшивание можно осуществлять также с использованием спейсерных плечей. Спейсерные плечи обеспечивают внутримолекулярную гибкость или регулируют внутримолекулярные расстояния между конъюгированными фрагментами и тем самым могут помогать сохранять биологическую активность. Спейсерное плечо может представлять собой фрагмент полипептида, который содержит спейсерные аминокислоты, например, пролин. В альтернативном варианте спейсерное плечо может представлять собой часть перекрестносшивающего реагента, такого как СПДП с длинной цепью (фирма Р1егсе Сйет. Со., Рокфорд, шт. Иллинойс, каталожный номер 21651 Н).
Кроме того, настоящее изобретение относится также к вариантам, фрагментам или производным одного из описанных выше химерных пептидов. Применительно к фрагментам и вариантам, как правило, используют определение, приведенное выше для последовательности, ингибирующей ΡΝΚ.
В частности, в контексте настоящего изобретения понятие вариант химерного пептида предпочтительно обозначает последовательность, выведенную из любой из последовательностей, представленных в 8ЕО ΙΌ N0: 9-12, где химерный вариант несет изменения аминокислотных последовательностей предлагаемых в изобретении химерных пептидов, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 9-12. Такие изменения, как правило, представляют собой 1-20, предпочтительно 1-10 и более предпочтительно 1-5 замен, добавлений и/или делеций (приводящих к образованию фрагментов) аминокислот, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 9-12, где последовательность измененного предлагаемого в изобретении химерного пептида идентична любой из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 9, 10, 11 или 12, по меньшей мере примерно на 30, 50, 70, 80 или 95, 98 или даже 99%. Предпочтительно указанные варианты сохраняют биологическую активность первого и второго домена, присущую предлагаемому в изобретении химерному пептиду, т.е. указанную выше транспортирующую активность первого домена и активность второго домена в отношении связывания 1М< и/или ингибирования активации по меньшей мере одного активируемого 1М< фактора транскрипции.
Таким образом, предлагаемый в изобретении химерный пептид представляет собой также фрагменты описанных выше предлагаемых в изобретении химерных пептидов, прежде всего последовательности предлагаемых в изобретении химерных пептидов, которые представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 9, 10, 11 или 12. Таким образом, в контексте настоящего изобретения понятие фрагмент предлагаемого в изобретении химерного пептида предпочтительно обозначает последовательность, выведенную из любой из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 9, 10, 11 или 12, где фрагмент содержит по меньшей мере 4 смежные аминокислоты любой из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 9, 10, 11 или 12. Указанный фрагмент предпочтительно имеет длину, достаточную для специфического распознавания эпитопа любой из указанных последовательностей и для транспорта последовательности в клетки, ядра или другую предпочтительную область. Еще более предпочтительно фрагмент содержит от 4 до 18, от 4 до 15 или наиболее предпочтительно от 4 до 10 смежных аминокислот любой из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 9, 10, 11 или 12. Фрагменты предлагаемого в изобретении химерного пептида можно определять также как последовательность, идентичную любой из последовательностей, представленных в 8Е0 ΙΌ N0: 9, 10, 11 или 12, по меньшей мере примерно на 30, 50, 70, 80 или 95, 98 или даже 99%.
И, наконец, предлагаемый в изобретении химерный пептид представляет собой также производные описанных выше предлагаемых в изобретении химерных пептидов, прежде всего предлагаемых в изобретении химерных пептидов, последовательности которых представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 9, 10, 11 или 12.
Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие .ШК, предлагаемые в изобретении химерные пептиды или их фрагменты, варианты или производные, как они определены выше. Предпочтительную пригодную нуклеиновую кислоту, которая кодирует предлагаемую в изобретении последовательность, ингибирующую .ШК, выбирают из нуклеиновой кислоты человеческого ΙΒ1 (ОепВалк, регистрационный № АР074091), нуклеиновой кислоты крысиного ΙΒ1 (ОепВапк, регистрационный № АР 108959) или человеческого ΙΒ2 (ОепВалк, регистрационный № АР218778).
Нуклеиновые кислоты, которые кодируют предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие .ШК, или химерные пептиды можно получать с помощью любого метода, известного в данной области (например, с помощью ПЦР-амплификации с использованием синтетических праймеров, которые гибридизуются с 3'- и 5'-концами последовательности, и/или путем клонирования ДНК или геномной библиотеки с использованием олигонуклеотидных последовательностей, специфических для данной
- 15 014330 генной последовательности).
Кроме того, представленные в настоящем описании нуклеотидные последовательности представляют собой последовательности, которые гибридизуются также в строгих условиях с соответствующей цепью, кодирующей (нативную) предлагаемую в изобретении последовательность, ингибирующую ΓΝΚ, или химерный пептид, как они определены выше. Предпочтительно указанные нуклеотидные последовательности содержат по меньшей мере 6 (смежных) нуклеиновых кислот, которые имеют длину, достаточную для осуществления специфической гибридизации. Более предпочтительно такие нуклеотидные последовательности содержат от 6 до 38, еще более предпочтительно от 6 до 30 и наиболее предпочтительно от 6 до 20 или от 6 до 10 (смежных) нуклеиновых кислот.
Строгие условия зависят от последовательности и отличаются в различных ситуациях. Как правило, строгие условия можно выбирать из условий, включающих применение температуры примерно на 5°С более низкой, чем температура плавления (Тпл) конкретной последовательности при определенной ионной силе и значении рН. Тпл представляет собой температуру (при определенной ионной силе и значения рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с полностью совместимым зондом. Как правило, строгие условия представляют собой условия, при которых концентрация соли составляет по меньшей мере примерно 0,02М при рН 7 и температура составляет по меньшей мере примерно 60°С. Поскольку другие факторы могут влиять на строгость гибридизации (в том числе среди прочего состав оснований и размер комплементарных цепей), присутствие органических растворителей и уровень ошибочного спаривания оснований, то комбинация параметров является более важной, чем абсолютный уровень любого из них.
Очень строгие условия могут представлять собой, например, следующие условия.
Стадия 1: содержащие ДНК фильтры предварительно обрабатывают в течение промежутка времени от 8 ч до всей ночи при 65°С в буфере, содержащем 6х88С, 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 1 мМ ЭДТК, 0,02% ПВП, 0,02% Фиколла, 0,02% БСА и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося.
Стадия 2: фильтры гибридизуют в течение 48 ч при 65°С в вышеуказанной смеси для предварительной гибридизации, в которую добавляют 100 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и меченный с помощью 32Р зонд (5-20х 106 срт (импульсы в минуту)).
Стадия 3: фильтры отмывают в течение 1 ч при 37°С в растворе, содержащем 2х88С, 0,01% ПВП, 0,01% Фиколла и 0,01% БСА. Затем осуществляют отмывку в 0,1х88С при 50°С в течение 45 мин.
Стадия 4: фильтры оценивают с помощью авторадиографии. Можно использовать другие очень строгие условия, известные в данной области (см., например, Сиггеп! Рго!осо1§ ш Мо1еси1аг Вю1о§у, под ред. Аи8иЬе1 е! а1., изд-во 1оЬп ^11еу апб 8оп5, ΝΥ, 1993; и КпеДег 1990, Сепе ТгапГег апб Ехрюкаоп, а ЬаЬогаФгу Мапиа1, изд-во 8!оск!оп Ргекк, ΝΥ).
Условия умеренной строгости могут представлять собой следующие условия.
Стадия 1: содержащие ДНК фильтры предварительно обрабатывают в течение 6 ч при 55°С в растворе, содержащем 6х88С, 5х раствор Денхардта, 0,5% ДСН и 100 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося.
Стадия 2: фильтры гибридизуют в течение 18-20 ч при 55°С в таком же растворе, в который добавляют меченный с помощью 32Р зонд (5-20 х106 срт).
Стадия 3: фильтры отмывают при 37°С в течение 1 ч в растворе, содержащем 2х88С, 0,1% ДСН, затем отмывают дважды в течение 30 мин при 60° С в растворе, содержащем 1х88С и 0,1% ДСН.
Стадия 4: фильтры промокают досуха и экспонируют для авторадиографии.
Можно использовать другие условия умеренной строгости, известные в данной области (см., например, Сиггеп! РгоЮсоГ ш Мо1еси1аг Вю1оду, под ред. Аи8иЬе1 е! а1., изд-во 1оЬп \УПеу апб 8оп5, ΝΥ, 1993; и Кг1ед1ег, Сепе ТгапзГег апб Ехрюккюп, а ЬаЬога!огу Мапиа1, изд-во 81оск1оп Ргекк, ΝΥ, 1990).
И, наконец, расслабленные условия могут представлять собой следующее.
Стадия 1: содержащие ДНК фильтры предварительно обрабатывают в течение 6 ч при 40°С в растворе, содержащем 35% формамида, 5х88С, 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 5 мМ ЭДТК, 0,1% ПВП, 0,1% Фиколла, 1% БСА и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося.
Стадия 2: фильтры гибридизуют в течение 18-20 ч при 40°С в таком же растворе, в который добавляют 0,02% ПВП, 0,02% Фиколла, 0,2% БСА, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, 10% мас./об. сульфата декстрана и меченный с помощью 32Р зонд (5-20 х 106 срт).
Стадия 3: фильтры отмывают в течение 1,5 ч при 55°С в растворе, содержащем 2х88С, 25 мМ ТрисНС1 (рН 7,4), 5 мМ ЭДТК и 0,1 % ДСН. Раствор для отмывки заменяют свежим раствором и инкубируют еще в течение 1,5 ч при 60°С.
Стадия 4: фильтры промокают досуха и экспонируют для авторадиографии. При необходимости фильтры отмывают в третий раз при 65-68°С и повторно экспонируют на пленку. Другие расслабленные условия, которые можно применять, хорошо известны в данной области (например, представляют собой условия, который применяют для межвидовой гибридизации) (см., например, Сиггеп! Рго!осо1§ ш Мо1еси1аг Вю1оду, под ред. Аи8иЬе1 е! а1., изд-во 1ойп ^11еу апб 8оп5, ΝΥ, 1993; и КпеДег Сепе ТгапГег апб Ехрю^юи а ЬаЬогаФгу Мапиа1, изд-во 81оск1оп Ргекк, ΝΥ, 1990).
- 16 014330
Нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для экспрессии предлагаемых в изобретении пептидов, т. е. предлагаемой в изобретении последовательности, ингибирующей ΊΝΚ, предлагаемого в изобретении химерного пептида, с целью анализа, характеризации и терапевтического применения; в качестве маркеров для тканей, в которых соответствующие (предлагаемые в изобретении) пептиды предпочтительно экспрессируются (либо конститутивно, либо на определенной стадии дифференцировки или развития ткани, либо в состояниях заболевания). Другие варианты применения нуклеиновых кислот включают, например, применение в качестве маркеров молекулярной массы в основанном на использовании гель-электрофореза в анализе нуклеиновых кислот.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения являются также экспрессионные векторы, предназначенные для рекомбинантной экспрессии одной или нескольких предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих ΊΝΚ, и/или химерных пептидов, как они определены выше. Понятие экспрессионный вектор в контексте настоящего описания относится либо к кольцевой, либо линейной ДНК или РНК, которая являться либо двухцепочечной, либо одноцепочечной. Он содержит также по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту для трансформации клетки-хозяина или одноклеточного или многоклеточного организма-хозяина. Предлагаемый в изобретении экспрессионный вектор предпочтительно содержит предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту, которая кодирует предлагаемую в изобретении последовательность, ингибирующую ΊΝΚ, или ее фрагмент, или вариант либо предлагаемый в изобретении химерный пептид, или его фрагмент, или вариант. Кроме того, экспрессионный вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно содержит соответствующие элементы, предназначенные для поддержания экспрессии, включая различные регуляторные элементы, такие как энхансеры/промоторы вирусов, бактерий, растений, млекопитающих и других эукариотических организмов, которые обеспечивают экспрессию встраиваемого полинуклеотида в клетке-хозяине, такие как изоляторы, связывающие элементы, ЬСВ (например, описанные у Β^^οοά и 1<;·ιάοη;·ΐβ;·ι. Заенсе 281, 1988, с. 61-63) или области прикрепления к матрице/носителю (например, описанные у Ь1, Наци и Ре!^™^ Тгеибк Сене!. 15, 1999, с. 403-408). В некоторых вариантах осуществления изобретения регуляторные элементы являются гетерологичными (т. е. ненативный промотор гена). В других вариантах необходимые сигналы транскрипции и трансляции могут обеспечиваться нативным для генов и/или фланкирующих областей промотором.
Понятие промотор в контексте настоящего описания относится к области ДНК, функциями которой является контроль транскрипции одной или нескольких предлагаемых в изобретении нуклеотидных последовательностей, который структурно идентифицируют по присутствию сайта связывания ДНКзависимой РНК-полимеразы и других последовательностей ДНК, которые связаны с регуляторной промоторной функцией. Функциональный усиливающий экспрессию фрагмент промотора представляет собой укороченную или процессированную промоторную последовательность, которая сохраняет активность в качестве промотора. Активность промотора можно оценивать с помощью любого анализа, известного в данной области (см., например, νοο6, бе Vе!, Ое\\)| и ОеЬиса, ВюсНет ВюрНук. Век. Сотпит. 124, 1984, с. 592-596; 8еНдег и МсЕ1гоу, АгсН. ВюсНет. ВюрНук. 88, 1960, с. 136-141) или набора, поступающего в продажу под названием Рготеда®.
Понятие энхансерная область в контексте настоящего описания касательно предлагаемого в изобретении экспрессионного вектора, как правило, относится к области ДНК, функцией которой является повышение транскрипции одного или нескольких генов. Более конкретно понятие энхансер в контексте настоящего описания означает регуляторный элемент ДНК, который усиливает, увеличивает, усовершенствует или улучшает экспрессию гена вне зависимости от его локализации и ориентации относительно гена, подлежащего экспрессии, и который может усиливать, увеличивать, совершенствовать или улучшать экспрессию более чем одного промотора.
В качестве промоторных/энхансерных последовательностей, как они определены выше касательно предлагаемого в изобретении экспрессионного вектора, можно применять регуляторные последовательности растений, животных, насекомых или грибов. Например, можно использовать промоторные/энхансерные элементы из дрожжей и других грибов (например, промотор САЬ4, промотор алкогольдегидрогеназы, промотор фосфоглицеринкиназы, промотор щелочной фосфатазы). В другом или дополнительном варианте они могут включать контролирующие транскрипцию области животного происхождения, например, (I) контролирующую область гена инсулина из панкреатических β-клеток (см., например, Ηηηηΐιηη е! а1., №!иге 315, 1985, с. 115-122); (II) контролирующую область гена иммуноглобулина, активную в лимфоидных клетках (см., например, Сгоккс11еб1 е! а1., Се11 38, 1984, с. 647-658); (III) контролирующую область гена альбумина, активную в печени (см., например, Ртскей е! а1., Сенек аиб Эеу 1, 1987, с. 268-276); (IV) контролирующую область гена основного белка миелина, активную в олигодендроцитах головного мозга (см., например, ВеабНеаб е! а1., 1 Се11 48, 1987, с. 703-712); и (V) контролирующую область гена гонадотропин-рилизинг гормона, активную в гипоталамусе (см., например, Μакοи е! а1., З^еше 234, 1986, с. 1372-1378) и т.п.
Кроме того, предлагаемый в изобретении экспрессионный вектор может содержать маркер амплификации. Указанный маркер амплификации можно выбирать из группы, включающей, например, адено
- 17 014330 зиндеаминазу (АОА), дигидрофолатредуктазу (ОНРК), ген, обусловливающий устойчивость ко многим лекарствам (МОК), орнитиндекарбоксилазу (ОЭС) и ген, обусловливающий устойчивость к Ν(фосфонацетил)-Ь-аспартату (САО). Амплификация генов, кодирующих вышеуказанные белки, т.е. представляющие интерес белки (ПИБ), и/или слитого белка, предлагаемого в изобретении, позволяет повышать уровень экспрессии этих белков при интеграции вектора в клетку (КаиРтап с1 а1., Мо1. Се11 ΒίοΙ. 5, 1985, с. 1750-1759).
Примерами экспрессионных векторов или их производных, которые можно применять в настоящем изобретении, являются, в частности, например, вирусы человека или животных (например, вирус коровьей оспы или аденовирус); вирусы насекомых (например, бакуловирусы); векторы на основе дрожжей; векторы на основе бактериофагов (например, фага лямбда); плазмидные векторы и космидные векторы.
В настоящем изобретении предложены также различные системы хозяин-вектор, которые можно применять для экспрессии предлагаемых в изобретении нуклеиновых кислот, которые кодируют последовательности пептидов, как они определены выше. К ним относятся (но не ограничиваясь ими): (I) системы на основе клеток млекопитающих, которые заражают вирусом коровьей оспы, аденовирусом и т.п.; (II) системы на основе клеток насекомых, зараженных бакуловирусом и т.п.; (III) дрожжи, содержащие векторы на основе дрожжей, или (IV) бактерии, трансформированные бактериофагом, ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК. В зависимости от применяемой системы хозяин-вектор можно использовать любые из многочисленных пригодных транскрипционных и трансляционных элементов.
Предпочтительно можно выбирать линию клеток-хозяев, пригодную для такой системы хозяинвектор, которая модулирует экспрессию встроенных представляющих интерес последовательностей или модифицирует или процессирует экспрессируемые пептиды, кодируемые последовательностями, конкретным требуемым образом. Кроме того, экспрессию в выбранной линии-хозяине под контролем определенных промоторов можно усиливать в присутствии определенных индукторов; облегчая тем самым контроль экспрессии созданного с помощью генной инженерии пептида. Кроме того, в различных клетках-хозяевах экспрессируемый пептид может подвергаться характерным и специфическим механизмам трансляционного и посттрансляционного процессинга и модификации (например, гликозилированию, фосфорилированию и т.п.). Таким образом, можно выбирать соответствующие линии клеток или систем хозяев для гарантии достижения требуемой модификации и процессинга чужеродного пептида. Например, экспрессию пептида в бактериальной системе можно использовать для получения негликозилированного корового пептида; в то время как экспрессия в клетках млекопитающих обеспечивает нативное гликозилирование гетерологичного пептида.
Настоящее изобретение относится также к антителам к предлагаемым в изобретении последовательностям, ингибирующим 1ΝΚ, и/или предлагаемым в изобретении химерным пептидам. Кроме того, предложены эффективные способы получения антител, специфических в отношении последовательностей, ингибирующих ΡΝΚ, предлагаемых в настоящем изобретении, или предлагаемых в изобретении химерных пептидов, которые содержат такую ингибирующую последовательность.
Согласно изобретению последовательности, ингибирующие ΡΝΚ, и/или предлагаемые в изобретении химерные пептиды, а также их фрагменты, варианты или производные можно использовать в качестве иммуногенов для производства антител, которые иммуноспецифически связываются с указанными пептидными компонентами. Такие антитела включают, например, поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные антитела, РаЬ-фрагменты и экспрессионные библиотеки РаЬ-фрагментов. Конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения являются антитела к предлагаемым в изобретении химерным пептидам или к последовательностям, ингибирующим ΡΝΚ, как они определены выше. В данной области известны различные методики, которые можно применять для получения указанных предлагаемых в изобретении антител.
Например, различных животных-хозяев можно иммунизировать для получения поликлональных антител путем инъекции любого предлагаемого в изобретении химерного пептида или последовательности, ингибирующей ΡΝΚ, как они определены выше. При этом в терапии можно использовать различные адъюванты, повышая тем самым иммунологический ответ, к которым относятся (но не ограничиваясь ими) адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели (например, гидроксид алюминия), поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, динитрофенол и т.д.), СрС, полимеры, Плюроники и применяемые для человека адъюванта, такие как бацилла Кальмета-Герена и СогупеЬас1егшт рагуит.
Для получения моноклональных антител к предлагаемому в изобретении химерному пептиду или последовательности, ингибирующей РЫК, как они определены выше, можно использовать любые методики, которые обеспечивают получение молекул антител в непрерывной культуре клеточной линии. Такие методики представляют собой (но не ограничиваясь ими) метод на основе гибридом (см. КоЫег и М11я1ет, №11иге 256, 1975, с. 495-497); метод на основе триом; метод на основе В-клеточных гибридом (см. КохЬог е1 а1., Iттиηο1 Тобау 4, 1983, с. 72) и метод на основе ΕΒV-(вирус Эпштейна-Барра)гибридомы, которые предназначены для получения человеческих моноклональных антител (см. Со1е е1 а1., 1985. В: Мопос1опа1 АпДЬоФея апб Сапсег Тйегару, А1ап К. Ыяя, Шс., с. 77-96). Человеческие моноклональные антитела можно применять для воплощения на практике настоящего изобретения и их мож
- 18 014330 но получать с помощью человеческих гибридом (см. Со!е е! а1., Ргос. ИаИ. Асаб. Бс1. ИБА 80, 1983, с. 2026-2030) или путем трансформации человеческих В-клеток вирусом Эпштейна-Барра ш νίΙΐΌ (см. Со1е е! а1., Мопос1опа1 АпйЬоб1ев апб Сапсег ТЕегару, изд-во А1ап К. Ывв, 1пс. 1985, с. 77-96).
Согласно изобретению методики можно адаптировать для получения одноцепочечных антител, специфических в отношении предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, и/или предлагаемых в изобретении химерных пептидов (см., например, ИБ 4946778). Кроме того, можно адаптировать методы конструирования экспрессионных библиотек ЕаЬ-фрагментов (см., например, Ниве е! а1., Баепсе 246, 1989, с. 1275-1281), позволяющие быстро и эффективно идентифицировать моноклональные ЕаЬ-фрагменты с требуемой специфичностью в отношении указанных предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, и/или предлагаемых в изобретении химерных пептидов, как они определены выше. Антитела из организмов кроме человека можно гуманизировать с помощью методик, хорошо известных в данной области (см., например, ИБ 5225539). Фрагменты антител, содержащие идиотипы к последовательностям, ингибирующим 1ΝΚ, и/или предлагаемому в изобретении химерному пептиду, которые можно получать с помощью известных методик, включают, например, (I) Е(аЬ')2-фрагмент, получаемый путем расщепления пепсином молекулы антитела; (II) ЕаЬ-фрагмент, создаваемый восстановлением пептидных мостиков Е(аЬ')2-фрагмента; (III) ЕаЬ-фрагмент, создаваемый обработкой молекулы антитела папаином и восстановителем, и (IV) Εν-фрагменты.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используют методы скрининга предлагаемых в изобретении антител, обладающие требуемой специфичностью, к которым относятся (но не ограничиваясь ими) твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫБА) и другие иммунологические анализы, известные в данной области. В конкретном варианте осуществления изобретения селекция антител, специфических в отношении конкретного эпитопа предлагаемой в изобретении последовательности, ингибирующей 1ΝΚ, и/или предлагаемого в изобретении химерного пептида (например, их фрагмента, состоящего, как правило, из 5-20, предпочтительно 8-18 и наиболее предпочтительно 8-11 аминокислот), облегчается созданием гибридом, которые связываются с фрагментом предлагаемой в изобретении последовательности, ингибирующей 1ΝΚ, и/или предлагаемого в изобретении химерного пептида, которые несут указанный эпитоп. Под объем изобретения подпадают также указанные антитела, специфические в отношении эпитопа, как они описаны выше.
Предлагаемые в изобретении антитела можно применять в методах, известных в данной области, для локализации и количественной оценки предлагаемой в изобретении последовательности, ингибирующей 1ΝΚ (и/или соответственно химерного пептида, предлагаемого в изобретении), например, для оценки уровней пептида в соответствующих физиологических образцах, для применения в диагностических методах или для применения для визуализации пептида и т.п.
Предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, химерные пептиды и/или нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, можно приготавливать в виде фармацевтических композиций, которые также подпадают под объем изобретения. Эти композиции могут содержать помимо одной из указанных субстанций фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные специалистам в данной области. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны влиять на эффективность действующего вещества. Точная природа носителя или другого материала может зависеть от пути введения, например орального, внутривенного, кожного или подкожного, назального, внутримышечного, внутрибрюшинного пути или нанесения с помощью бляшки.
Фармацевтические композиции для орального введения могут иметь форму таблетки, капсулы, порошка или жидкости. Таблетка может включать твердый носитель, такой как желатин или адъювант. Жидкие фармацевтические композиции, как правило, включают жидкий носитель, такой как вода, вазелин, животные или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. В их состав могут входить физиологический соляной раствор, декстроза или другой раствор сахарида или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.
Для внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъекции в область поражения действующее вещество должно находиться в форме приемлемого для парентерального введения водного раствора, который не содержит пирогены и имеет приемлемые значение рН, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области легко могут приготавливать приемлемые растворы с использованием, например, изотонических наполнителей, таких как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, лактированный раствор Рингера для инъекций. При необходимости можно включать консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Вне зависимости от того, применяют ли полипептид, пептид или молекулу нуклеиновой кислоты, другое фармацевтически приемлемое соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, которое вводят индивидууму, введение предпочтительно осуществлять в профилактически эффективном количестве или в терапевтически эффективном количестве (в качестве одного из возможных вариантов), которое является достаточным для оказания благоприятного действия на индивидуума. Фактическое вводимое количество, скорость и временные особенности введения должны зависеть от природы и серьезности состояния, подлежащего лечению.
Решение о схеме лечение, например, касающееся доз и т.д., находится в компетенции обычных
- 19 014330 практикующих врачей и других лечащих врачей и, как правило, учитывает нарушение, подлежащее лечению, состояние каждого пациента, место введения и метод введения и другие факторы, известные практикующим специалистам в данной области. Примеры методов и упомянутых протоколов приведены в справочнике Кешшдоп'в Р11агтасеиРса1 §с1епсев, 16-ое изд., под ред. Ово1 А., 1980.
В другом варианте прицельную терапию можно использовать для введения предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, химерных пептидов и нуклеиновых кислот, предлагаемых в изобретении, более специфично в определенный тип клеток с помощью обеспечивающих направленный перенос систем, таких как антитело (против клетки-мишени) или специфические для клетки лиганды. Антитела против клетки-мишени, как правило, являются специфическими для поверхностных клеточных белков клеток, ассоциированных с любым из указанных ниже заболеваний. Например, эти антитела могут представлять собой антитела против антител клеточной поверхности, таких, например, как ассоциированные с поверхностью В-клеток белки, такие как белок ΌΚ ГКГ класса ΙΙ, СО 18 (бетацепь ЬРА-1), СР45КО, СЭ40 или Вдр95, или белков клеточной поверхности, выбранных, например, из СЭ2, СЭ3, СЭ4, СЭ5, СЭ7, СЭ8, СЭ9, СР 10, СР13, СР16, СР19, СР20, СР21, СР22, СР23, СР24, СР25, СР30, СР33, СР34, СР38, СР39, СР4, СР43, СР45, СР52, СР56, СР68, СР71, СР138 и т.д. Обеспечивающие направленный перенос конструкции, как правило, можно получать путем ковалентного связывания предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, химерных пептидов и нуклеиновых кислот с антителом, специфическим для белка клеточной поверхности, или путем связывания со специфическим для клетки лигандом. Белки, например, можно связывать с таким антителом или присоединять к нему с помощью пептидной связи или путем химического сочетания, перекрестного сшивания и т.д. Затем можно осуществлять прицельную терапию путем введения пациенту обеспечивающей направленный перенос конструкции в фармацевтически эффективном количестве с помощью указанных ниже путей введения, например внутрибрюшинного, назального, внутривенного, орального, или с помощью бляшек. Предпочтительно предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, химерные пептиды или нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, присоединенные к антителам против клеток-мишеней или специфическим для клеток лигандам, как они определены выше, можно высвобождать ΐη νίΐτο или ΐη νίνο, например, в результате гидролиза ковалентной связи, под действием пептидаз или с помощью любого другого приемлемого метода. В другом варианте, если последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, химерные пептиды или нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, присоединяют к небольшому специфическому для клетки лиганду, то можно не осуществлять высвобождение лиганда. При нахождении на клеточной поверхности предлагаемые в изобретении химерные пептиды могут проникать в клетку благодаря активности входящей в их состав транспортирующей последовательности. Направленный перенос может требоваться по разным причинам; например, если предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, химерные пептиды и нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, обладают неприемлемой токсичностью, или если существуют другие показания к применению слишком высокой дозы.
Вместо непосредственного введения предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, и/или химерных пептидов, предлагаемых в изобретении, их можно получать в клеткахмишениях путем экспрессии кодирующего гена, интродуцированного в клетки, например, путем введения вирусного вектора. Вирусный вектор, как правило, кодирует предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, и/или химерные пептиды, предлагаемые в изобретении. Можно обеспечивать направленный перенос вектора к специфическим клеткам, подлежащим лечению. Кроме того, вектор может содержать регуляторные элементы, которые включаются более или менее избирательно клетками-мишенями при определенной регуляции. Эта методика является вариантом УЭЕРТ-метода (νίги8-61гес1е6 епхуше ргобгид Легару) (опосредуемая вирусом терапия с использованием пролекарства на основе фермента), в которой применяют зрелые белки вместо их предшественников.
В другом варианте предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, и/или химерные пептиды можно вводить в форме предшественников с помощью антитела или вируса. Предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, и/или химерные пептиды можно затем превращать в активную форму с помощью активирующего агента, который продуцируется в клетках, подлежащих лечению, или направленно переносится к ним. Такой тип лечения иногда называют ЛЭЕРТ (апОЬо6у-61гес1е6 епхуте ргобгид (Негару) (опосредуемая антителом терапия с использованием пролекарства на основе фермента) или УЭЕРТ (опосредуемая вирусом терапия с использованием пролекарства на основе фермента); в первом случае обеспечивают направленный перенос активирующего агента в клетки путем конъюгации со специфическим для клетки антителом, а в последнем случае получают активирующий агент, например последовательность, ингибирующую 1ΝΚ, или химерный пептид, в векторе путем экспрессии кодирующей ДНК в вирусном векторе (см., например, ЕР-А-415731 и АО 90/07936).
Настоящее изобретение относится также к применению предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих 1ΝΚ, предлагаемых в изобретении химерных пептидов и/или предлагаемых в изобретении нуклеотидных последовательностей для приготовления фармацевтических композиций, например, как они определены выше, предназначенных для предупреждения и/или лечения связанных с пролиферацией клеток нарушений, ассоциированных с активацией 1ΝΚ у индивидуума (ассоциирован
- 20 014330 ное с 1ΝΚ нарушение). Как правило, такая фармацевтическая композиция, применяемая согласно настоящему изобретению, содержит в качестве активного компонента, например: (I) любую(ые) одну или несколько предлагаемую(ых) в изобретении последовательность(ей), ингибирующую(их) ΕΝΚ, и/или предлагаемые в изобретении химерные пептиды и/или их варианты, фрагменты или производные; и/или (II) нуклеиновые кислоты, кодирующие предлагаемую в изобретении последовательность, ингибирующую ΕΝΚ, и/или предлагаемый в изобретении химерный пептид и/или их варианты или фрагменты, и/или (III) клетки, содержащие любую(ые) одну или несколько предлагаемую(ых) в изобретении последовательностей), ингибирующую (их) ΕΝΚ, и/или предлагаемые в изобретении химерные пептиды и/или их варианты, фрагменты или производные, и/или (IV) клетки, трансфектированные вектором и/или нуклеиновыми кислотами, которые кодируют предлагаемую в изобретении последовательность, ингибирующую ΕΝΚ, и/или предлагаемый в изобретении химерный пептид и/или их варианты или фрагменты.
Предупреждение и/или лечение согласно настоящему изобретению, как правило, предусматривает введение предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции, как она определена выше. Понятие модулировать относится к подавлению экспрессии 1ΝΚ в случае ее сверхэкспрессии. Оно относится также к подавлению фосфорилирования с-)ип, ΑΤΕ2 или ΝΕΑΤ4, например, с помощью пептида, представленного в любой одной или в нескольких 8ЕО Ш N0: 1-4 и/или 9-12, в качестве конкурентного ингибитора встречающихся в естественных условиях в клетке сайтов связывания с-)ип, ΆΤΕ2 и ΝΕΆΤ4. Понятие модулировать относится также к подавлению гетеро- и гомомерных комплексов факторов транскрипции с-)ип. ΑΤΕ2 или ΝΕΑΤ4 и родственных партнеров, таких, например, как АР-1-комплекс, включающий с-щп, ΑΕΤ2 и с-Γοδ. Когда связанное с пролиферацией клеток заболевание ассоциировано со сверхэкспрессией ΕΝΚ, такие супрессорные последовательности, ингибирующие ΕΝΚ, можно интродуцировать в клетку. В некоторых случаях понятие модулировать может включать повышение уровня экспрессии ΕΝΚ, например, при использовании специфического для ГВ-пептида антитела, которое блокирует связывание Ш-пептида с ΕΝΚ, предупреждая тем самым ингибирование ΕΝΚ родственным ΣΒ пептидом.
Профилактику и/или лечение индивидуума с помощью предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции, как она описана выше, можно, как правило, осуществлять путем введения (ΐπ νίνο) индивидууму фармацевтической композиции в определенном (терапевтически эффективном) количестве, где индивидуум может представлять собой, например, любое млекопитающее, например, человека, примата, мышь, крысу, собаку, кошку, корову, лошадь или свинью. Понятие терапевтически эффективный означает, что количество активного компонента фармацевтической композиции является достаточным для облегчения ассоциированного с ΕΝΚ нарушения.
Понятие связанное с пролиферацией клеток нарушение или ассоциированное с ΕΝΚ нарушение в контексте настоящего описания, как правило, означает популяции злокачественных, а также доброкачественных клеток т νίνο и ш νίίτο, которые часто отличаются морфологически и функционально от клеток окружающей ткани и которые, как правило, характеризуются аномальными уровнями ΕΝΚ. Понятие аномальный уровень ΕΝΚ подразумевает повышенный или пониженный уровень ΕΝΚ в какой-либо области индивидуума, подлежащего лечению, относительно уровня, присутствующего в аналогичной непораженной области организма пациента, у которого отсутствует нарушение.
Например, предлагаемые в изобретении фармацевтические композиции можно применять для предупреждения и/или лечения злокачественных заболеваний систем различных органов, в которых часто выявляется активация ΕΝΚ, например легкого, молочной железы, лимфатической системы, желудочнокишечного тракта и мочеполового пути, а также аденокарцином, включая злокачественные, такие как большинство видов рака ободочной кишки, почечно-клеточная карцинома, рак предстательной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак тонкого кишечника и рак пищевода. Нарушения включают также лейкозы, заболевания или патофизиологические состояния, ассоциированные с онкогенной трансформацией, а также виды рака, связанные с онкогенной трансформацией Всг-АЫ, для чего точно требуется активация 1ΝΚ.
Предлагаемые в изобретении фармацевтические композиции можно применять также для предупреждения и/или лечения доброкачественных или иммунологических связанных с пролиферацией клеток заболеваний, таких как псориаз, обыкновенная пузырчатка, синдром Бехчета, острый респираторный дистресс-синдром (ΑΚΠδ), ишемическое заболевание сердца, синдром, связанный с состоянием после диализа, ревматоидный артрит, синдром приобретенного иммунодефицита, васкулит, септический шок и другие типы острого воспаления и липидный гистоцитоз. Наиболее предпочтительными являются иммунопатологические нарушения. В сущности, любое нарушение, которое по этиологии связано с киназной активностью ΕΝΚ, рассматривается как чувствительное к предупреждению или лечению, например, нарушения или патофизиологические состояния, ассоциированные с активацией ΕΝΚ в клетке или клетках, как указано выше, например, рестеноз, потеря слуха, ушная травма, ишемия, удар, и/или нарушения или патофизиологические состояния, ассоциированные с созреванием и дифференцировкой иммуноцитов, повреждения, связанные с реперфузией, гипоксия, связанные с апоптозом заболевания (например, встречающиеся при вирусных инфекциях (например, СПИД), аутоиммунные заболевания, нейродегенератиные нарушения (например, удар, травма головного мозга, повреждение спинного мозг, амиотро
- 21 014330 фический боковой склероз (АЬ8), болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона), сердечно-сосудистое заболевание, остеопороз и старение), ответ на вызывающие стресс стимулы, и вторичные эффекты, связанные с лечением, например, провоспалительными цитокинами. Предлагаемые в изобретении фармацевтические композиции можно применять также для лечения или предупреждения воздействий, связанных с диабетом или нарушающим клетки стрессом, например, при патологических состояниях, индуцированных артериальной гипертензией, включая сердечную гипертрофию и связанные с артериосклерозом повреждения, и при бифуракции кровеносных сосудов и т.п., связанных с ионизирующей радиацией, применяемой при лучевой терапии, ультрафиолетовым светом (УФ-свет), связанных со свободными радикалами, повреждающими ДНК агентами, включая химиотерапевтические лекарственные средства, связанные с повреждениями при ишемии/реперфузии, связанными с гипоксией; и/или гипо- и гипертермией. И, наконец, касательно вышеуказанных заболеваний, нарушений или патофизиологических состояний предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно применять для ингибирования экспрессии генов, экспрессия которых повышается в присутствии активного полипептида ΕΝΚ. Эти гены и генные продукты, как правило, включают, например, провоспалительные цитокины. Указанные цитокины обнаружены при всех формах воспалительных, аутогенных воспалительных, иммунных и аутоиммунных заболеваний, дегенеративных заболеваний, при миопатиях, кардиомиопатиях и отторжении трансплантата.
Предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, предлагаемые в изобретении химерные пептиды или предлагаемые в изобретении нуклеотидные последовательности можно применять также в любой ситуации, при которой требуется ингибирование активности 1ΝΚ, поскольку ΕΝΚ и все их изоформы принимают участие в развитии и создании патологических состояний, или в их пути. Такое применение может включать использование ш νίΐτο, ех νίνο и ш νίνο.
Таким образом, предлагаемые в изобретении нуклеиновые кислоты, как они определены выше, можно применять в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения для модуляции активируемых 1ΝΚ путей передачи сигналов с использованием генной терапии, предпочтительно для лечения одного из состояний, заболеваний и/или нарушений, как они определены выше. В этом контексте понятие генная терапия относится к терапии, которую осуществляют путем введения индивидууму специфической предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты, например, в виде фармацевтической композиции, как она определена выше, где предлагаемая(ые) в изобретении нуклеиновая(ые) кислота(ы) кодирует(ю) исключительно Ь-аминокислоты. В этом варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота продуцирует кодируемый(ые) пептид(ы), который(ые) затем служит(ат) для проявления терапевтического действия путем модуляции функции заболевания или нарушения. Любой из относящихся к генной терапии методов, доступных в данной области, можно применять для воплощения на практике настоящего изобретения (см., например, Сο1ά5ρ^е1 е! а1., С11п Рйагт 12, 1993, с. 488-505).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении нуклеиновая кислота, которую применяют для генной терапии, является частью экспрессионного вектора, который экспрессирует один или несколько предлагаемых в изобретении родственных ΙΒ-пептидов, т.е. предлагаемую в изобретении последовательность, ингибирующую 1ΝΚ, и/или предлагаемый в изобретении химерный пептид или их фрагменты или производные, в приемлемом хозяине. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный экспрессионный вектор несет промотор, функционально связанный с кодирующей(ими) областью(ями) последовательности, ингибирующей ΕΝΚ. Промотор может представлять собой указанный выше промотор, например индуцибельный или конститутивный промотор, и необязательно тканеспецифический промотор.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения для генной терапии используют предлагаемую в изобретении молекулу нуклеиновой кислоты, в которой кодирующие последовательности предлагаемой в изобретении молекулы нуклеиновой кислоты (и любых других требуемых ее последовательностей) фланкированы областями, которые усиливают гомологичную рекомбинацию в требуемом сайте в геноме, что требуется для внутрихромосомной экспрессии нуклеиновых кислот (см., например, ΚοΙΚγ и 8тйЫев, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 86, 1989, с. 8932-8935).
Введение предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты пациенту при применении генной терапии может быть либо непосредственным (т.е. пациента непосредственно обрабатывают нуклеиновой кислотой или вектором, содержащим нуклеиновую кислоту), либо косвенным (т.е. клетки сначала трансформируют нуклеиновой кислотой ш νίΐτο, затем трансплантируют пациенту). Эти два подхода называют соответственно как генная терапия ш νίνο или ех νίνο. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновую кислоту вводят непосредственно ш νίνο, после чего происходит ее экспрессия с образованием кодируемого продукта. Для этой цели можно использовать любой из многочисленных методов, известных в данной области, в том числе, например, конструирование нуклеиновой кислоты в виде части соответствующего экспрессионного вектора нуклеиновой кислоты и введение его так, чтобы он стал внутриклеточным (например, путем заражения с использованием дефектного или ослабленного ретровирусного или другого вирусного вектора; см. И8 4980286); непосредственную инъекцию оголенной ДНК; применение бомбардировки микрочастицами (например, СепеСип (генная пушка); Вюйвйс, фирма ΟπΡοπΙ); нанесение нуклеиновых кислот с помощью липидов; применение ассо
- 22 014330 циированных с клеточной поверхностью рецепторов/трансфектирующих агентов; капсулирование в липосомах, микрочастицах или микрокапсулах; введение вместе с пептидом, для которого известно, что он обладает способностью проникать в ядро; или их введение вместе с лигандом, предрасположенным к опосредуемому рецептором эндоцитозу (см., например, Аи и Ан. 1 Вю1. Скет., 262, 1987, с. 4429-4432), который можно применять для мечения клеточный типов, которые специфически экспрессируют представляющие интерес рецепторы и т.д.
Другой подход генной терапии, который можно применять для воплощения на практике настоящего изобретения, включает перенос гена в клетки ίη νίΐΐΌ в культуре ткани с помощью таких методов, как электропорация, липофекция, опосредуемая фосфатом кальция трансфекция, вирусное заражение или т.п. Как правило, метод переноса включает сопутствующий перенос в клетки селектируемого маркера. Затем клетки помещают под давление отбора (например, такого фактора, как устойчивость к антибиотикам) так, чтобы облегчать выделение клеток, которые получили и экспрессируют перенесенный ген. Затем эти клетки вводят пациенту. В конкретном варианте осуществления изобретения перед введением ίη νί\Ό полученной рекомбинантной клетки нуклеиновую кислоту интродуцируют в клетку с помощью любого метода, известного в данной области, включая, например, трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, заражение вирусным вектором или вектором на основе бактериофага, содержащим представляющие интерес нуклеотидные последовательности, слияние клеток, опосредуемый хромосомой перенос гена, опосредуемый микроячейкой перенос гена, слияние сферопластов и аналогичные методы, которые гарантируют, что при переносе не будет нарушено развитие и физиологические функции клетокреципиентов (см., например, Ьоей1ег и Векг, Ме!к Епхуток 217, 1993, с. 599-618). Выбранная методика должна обеспечивать стабильный перенос нуклеиновой кислоты в клетку, такой, чтобы при этом нуклеиновая кислота экспрессировалась клеткой. Предпочтительно перенесенная нуклеиновая кислота передается по наследству и может экспрессироваться в потомстве клетки.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения образовавшиеся рекомбинантные клетки можно вводить пациенту с помощью различных методов, известных в данной области, включая, например, инъекцию эпителиальных клеток (например, подкожно), обработку пациента рекомбинантными кожными клетками в качестве кожного трансплантата и внутривенную инъекцию рекомбинантных клеток крови (например, гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников). Общее количество клеток, которое следует применять, зависит от требуемого действия, состояния пациента и т. п. и его может определять специалист в данной области. Клетки, в которые можно интродуцировать нуклеиновую кислоту при осуществлении генной терапии, относятся к любому требуемому доступному типу клеток, и они могут быть ксеногенными, гетерогенными, сингенными или автогенными. Типы клеток включают (но не ограничиваясь ими) дифференцированные клетки, такие как эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты, фибробласты, мышечные клетки, гепатоциты и кровяные клетки, или различные стволовые клетки или клетки-предшественники, в частности, эмбриональные клетки сердечной мышцы, стволовые клетки печени (опубликованная международная заявка на патент АО 94/08598), нервные стволовые клетки (§1етр1е и АпБегвоп, Се11 71, 1992, с. 973-985), гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, например, получаемые из костного мозга, клетки крови пуповины, периферической крови, печени эмбриона и т.п. В предпочтительном варианте осуществления изобретения применяемые для генной терапии клетки являются аутологичными для пациента.
Согласно другому варианту осуществления изобретения предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие ΊΝΚ, предлагаемые в изобретении химерные пептиды, предлагаемые в изобретении нуклеотидные последовательности или антитела к предлагаемым в изобретении последовательностям, ингибирующим ΊΝΚ, или к предлагаемым в изобретении химерным пептидам можно применять для анализов (ίη νίίΐΌ) (например, имуноанализов) для выявления, прогнозирования, диагностики или мониторинга указанных выше различных состояний, заболеваний и/или нарушений или мониторинга их лечения. Иммуноанализ можно осуществлять с помощью метода, предусматривающего контакт образца, полученного из организма пациента, с антителом к предлагаемой в изобретении последовательности, ингибирующей ΊΝΚ, предлагаемому в изобретении химерному пептиду или предлагаемой в изобретении нуклеотидной последовательности в условиях, при которых может происходить иммуноспецифическое связывание, и последующее выявление или оценку количества любого характеризующегося иммуноспецифическим связыванием антитела. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело, специфическое в отношении предлагаемой в изобретении последовательности, ингибирующей ίΝΚ, предлагаемого в изобретении химерного пептида или предлагаемой в изобретении нуклеотидной последовательности, можно применять для анализа образца ткани или сыворотки из организма пациента в отношении присутствия ΊΝΚ или последовательности, ингибирующей ΡΝΚ; при этом аномальный уровень ίΝΚ свидетельствует о наличии болезненного состояния. Иммуноанализы, которые можно использовать, включают (но не ограничиваясь ими) конкурентные или неконкурентные системы анализов, основанные на применении таких методик, как Вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализы (РИА), твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), сэндвич-иммуноанализы, анализы на основе иммунопреципитации, реакции с использованием преципитина, реакции, основанные на диффузии преципитина в геле, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, флуоресцентные иммуноанализы, анализы фикса
- 23 014330 ции комплемента, иммунорадиометрические анализы и иммуноанализы на белке и т. д. В альтернативном варианте можно осуществлять анализы (ίη νίΧτο) путем введения предлагаемых в изобретении последовательностей, ингибирующих ΊΝΚ, предлагаемых в изобретении химерных полипептидов, предлагаемых в изобретении нуклеотидных последовательностей или антител к предлагаемым в изобретении последовательностям, ингибирующим ΊΝΚ, или предлагаемым в изобретении химерным пептидам в клеткимишени, которые, как правило, выбирают, например, из культивируемых клеток животных, человеческих клеток или микроорганизмов, и оценивая ответ клетки с помощью биофизических методов, как правило, известных специалистам в данной области. Клетки-мишени, которые обычно применяют для этой цели, могут представлять собой культивируемые клетки (ίη νί!το) или клетки ίη νίνο, т.е. клетки, из которых состоят органы или ткани живых животных или людей, или микроорганизмов, присутствующих в живых животных или людях.
Настоящее изобретение относится также к наборам для диагностического или терапевтического применения, в которые входит один или несколько контейнеров, содержащих предлагаемые в изобретении последовательности, ингибирующие ΊΝΚ, предлагаемые в изобретении химерные пептиды, предлагаемые в изобретении нуклеотидные последовательности и/или антитела к предлагаемым в изобретении последовательностям, ингибирующим ΊΝΚ, или к предлагаемым в изобретении химерным пептидам, например, антитело к последовательности, ингибирующей ΊΝΚ, и необязательно меченый связывающийся с антителом компонент. Метка, которую включают в антитело, может представлять собой (но не ограничиваясь ими) хемилюминесцентный, ферментный, флуоресцентный, колориметрический или радиоактивный фрагмент. Другим конкретным вариантом осуществления изобретения являются также наборы для применения в диагностике, включающие один или несколько контейнеров, которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие или в другом варианте комплементарные предлагаемой в изобретении последовательности, ингибирующей 1ΝΚ, и/или предлагаемому в изобретении химерному пептиду, необязательно меченый связывающийся с этими нуклеиновыми кислотами компонент. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения в состав набора может входить в один или несколько контейнеров пара олигонуклеотидных праймеров (например, каждый длиной 6-30 нуклеотидов), которые могут действовать в качестве праймеров амплификации для полимеразной цепной реакции (ПЦР; см., например, [шик е! а1., РСВ Р^ο!οсο1к, изд-во Асабеиис Ргекк, Шс., 8аи ^^едο, СА, 1990), лигазной цепной реакции, циклической реакции с зондом и т.п. или при применении других методов, известных в данной области, в которых применяют предлагаемые в изобретении нуклеиновые кислоты. Набор необязательно может включать также предварительно определенное количество очищенной предлагаемой в изобретении последовательности, ингибирующей ΊΝΚ, предлагаемого в изобретении химерного пептида или кодирующих их нуклеиновых кислот, для применения в качестве диагностического агента, стандарта или контроля в анализах.
Объем настоящего изобретения не ограничен приведенными конкретными вариантами его осуществления. Так, различные модификации изобретения помимо представленных в настоящем описании, должны стать очевидны специалистам в данной области после ознакомления с приведенным выше описанием и прилагаемыми чертежами. Такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.
Различные публикации, процитированные в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки во всей их полноте.
Если не указано иное, то все технические и научные понятия, использованные в настоящем описании, имеют обычные значения, известные обычному специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя для воплощения на практике или оценки настоящего изобретения можно применять методы и материалы, аналогичные или эквивалентные представленным в настоящем описании, приемлемые методы и материалы будут описаны ниже. Все публикации, заявки на патент и другие упомянутые в настоящем описании ссылки включены в него в качестве ссылок во всей их полноте. В случае расхождения следует опираться на настоящее описание, включая определения. Кроме того, материалы, методы и примеры приведены только с целью иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения. Другие особенности и преимущества изобретения станут очевидными после ознакомления с приведенным подробным описанием и формулой изобретения.
Описание чертежей
На чертежах показано на фиг. 1А-В - диаграмма, на которой представлены результаты сравнительного анализа первичной структуры областей консервативных доменов ШЭ указанных факторов транскрипции. Последовательности, ингибирующие 1ΝΚ, были идентифицированы при оценке структуры этих сравниваемых последовательностей. Результаты сравнительного анализа первичной структуры в качестве примера представлены на фиг. 1А-1В. На фиг. 1А показана область наиболее высокой гомологии между ХВО, присутствующими в ХВ1, ХВ2, с-ίιιη и АТЕ2. На панели Б с целью сравнения представлены аминокислотные последовательности ХВО Ь-ХВ1(к) и Ь-ЕЕ Полностью консервативные остатки обозначены звездочками, а остатки с заменой на А1а в векторе СЕР-ХВО23Ми! обозначены незакрашенными окружностями. На фиг. 1В показаны аминокислотные последовательности химерных белков, включающие последовательность, ингиби
- 24 014330 рующую 1ЫК, и транспортирующую последовательность. В этом примере представленную транспортирующую последовательность выводят из белка ТАТ вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), а последовательность, ингибирующую 1ЫК, выводят из полипептида ΙΒ1(β). Человеческая, мышиная и крысиная последовательности на панелях Б и В являются идентичными;
на фиг. 2 - диаграмма, на которой представлены последовательности общих слитых пептидов ТАТΙΒ, выведенных из человеческих, мышиных и крысиных последовательностей;
на фиг. 3 - результаты оценки нейрозащитного действия от очаговой церебральной ишемии, полученные на перманентной МСАО-модели. Определение эффективности защитного действия осуществляли при использовании различных доз (см. фиг. 3). Как видно из фиг. 3, дозы, составляющие по меньшей мере 11, 3, 0,3 и 0,03 мг/кг, обеспечивали защиту головного мозга. Наиболее высокий уровень защиты обнаружен при использовании дозы 0,03 мг/кг;
на фиг. 4 - результаты оценки нейрозащитного действия предлагаемого в изобретении химерного пептида, последовательность которого представлена в 8ЕО ΙΌ N0: 11, после ί.ν.-введения в отношении очаговой церебральной ишемии на кратковременной МСАО-модели. После создания ишемии у взрослых мышей умерщвляли через 48 ч после реперфузии. Получали серийные криостатические срезы и оценивали объем инфаркта. Как видно из фиг. 4, предлагаемый в изобретении химерный пептид обеспечивал эффективное нейрозащитное действие;
на фиг. 5 - результаты анализа на культуре нейронов по оценке высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) после стимуляции с помощью N-метил-^-аспартата АМБА). Результаты четко демонстрируют нейрозащитное действие предлагаемого в изобретении химерного Б-1ЫКП-пептида (8Е0 Ш N0: 11), поскольку дегенеративные изменения, обусловленные обработкой ХМЛА, полностью ингибировались, что видно по отсутствию значительного превышения высвобождения ЛДГ по сравнению с контролем;
на фиг. 6 - результаты ингибирования эндогенной 1ЫК-активности в клетках линии НерО2 при использовании предлагаемых в изобретении слитых пептидов, последовательности которых представлены в 8Е0 Ш N0: 9 и 11, при применении метода анализа в одной лунке. Как видно на фиг. 6, в частности на панели г на фиг. 6, Б-ТАТ-ИЦв), последовательность которого представлена в 8Е0 Ш N0: 11 (сокращенно обозначен как Б-.ШК!) эффективно ингибирует активность РНК, даже лучше, чем Ь-ТАТΙΒ1(β), последовательность которого представлена в 8Е0 Ш N0: 9 (сокращенно обозначен как Ь-РНИ);
на фиг. 7 - защитное действие Б-ТАТ-ЕЦв) в отношении перманентной потери слуха. Представлены данные об изменении в уровне слухового порога (уровень звукового давления в дБ) на морских свинках после шумовой травмы (120 дБ при 6 кГц в течение 30 мин) при максимальной действующей частоте 8 кГц при оценке в течение 20 мин (временный сдвиг порога, ТТЗ, окраска серым цветом) и в течение 15 дней после шумовой обработки (перманентный сдвиг порога, РТЗ). Морским свинкам наносили Ό-ТАТΙΒ1(β), в виде геля на основе гиалуроновой кислоты, на мембрану круглого окна улитки (внутреннего уха) либо за 30 мин до, либо через 30 мин или 4 ч после шумовой травмы; в качестве контроля использовали необработанные уши. ТТЗ оценивали через 20 мин после шумовой травмы, а РТЗ (окраска черным цветом), соответствующий перманентной потере слуха, определяли через 15 дней. Как видно из представленных данных, Б-ТАТ-ΙΒΓβ) не только обеспечивал заметную защиту от потери слуха, вызванного шумовой травмой, при превентивном применении до шумовой обработки, но также и в зависимости от времени при применении после травмы. РТЗ в обработанных ушах был значительно ниже при применении Б-ТАТ-ΙΒΓβ) через 30 мин и 4 ч после травмы по сравнению с необработанными контрольными ушами.
Примеры
Пример 1. Идентификация последовательностей, ингибирующих 1ЫК.
Аминокислотные последовательности, важные для эффективного взаимодействия с РНК, идентифицировали путем сравнительного анализа последовательностей известных ΡΒΌ. Сравнение последовательностей ΡΒΌ, присутствующих в ΙΒ1 |8Е0 Ш N0: 13], ΙΒ2 |8Е0 Ш N0: 14], с-1ии |8Е0 Ш N0: 15] и АТЕ2 |8Е0 Ш N0: 16], выявило состоящую из 8 аминокислот последовательность с определенным уровнем консервативности (фиг. 1А). Поскольку ΡΒΌ из ΙΒ1 и ΙΒ2 примерно в 100 раз превышают по эффективности с-Лш или АТЕ2 в отношении связывания 1ЖК (Бюкепв е1 а1. Зсгеисе 277, 1997, с. 693), логично предположить, что консервативные для ΙΒ1 и ΙΒ2 остатки могут быть важны с позиций обеспечения максимального связывания. Сравнение ΡΒΌ, присутствующих в ΙΒ1 и ΙΒ2, позволило выявить два блока, состоящие из 7 и 3 аминокислот, которые являются высококонсервативными для двух последовательностей.
Эти два блока входят в последовательность пептида, состоящего из 19 аминокислот, в Γ-ΙΒ1(β) |8Е0 1Б N0: 1], и показаны также с целью сравнения в состоящей из 23 аминокислот (ак) пептидной последовательности, выведенной из ΙΒ1 |8Е0 Ш N0: 17]. Эти последовательности показаны на фиг. 1Б, пунктирной линией в Г-ШРпоследовательности обозначена брешь в последовательности, введенная для выравнивания консервативных остатков при сравнении с Ь-ШЦв).
Пример 2. Получение слитых белков, содержащих ингибитор РЫК.
Предлагаемые в изобретении слитые белки-ингибиторы РНК, последовательность которых представлена в 8Е0 Ш N0: 9, синтезировали путем ковалентного связывания С-конца 8Е0 Ш N0: 1 с N
- 25 014330 концом состоящего из 10 аминокислот пептида-носителя, выведенного из ΗΙΥ-ΤΑΤ4§ 57 (У1уев е1 а1., Р В1о1. Сйет. 272, 1997, с. 16010), который представлен в 8ЕО ΙΌ N0: 5, через линкер, состоящий из двух остатков пролина. Этот линкер применяли в связи с тем, что он обеспечивает максимальную гибкость и предупреждает нежелательные изменения вторичной структуры. Получали также основные конструкции, которые обозначали как Ь4В1(5) (8Е0 ΙΌ N0: 1) и Ь-ΤΑΤ |8Εβ ΙΌ N0: 5] соответственно.
ПолностьюГО-ретроинвертированные пептиды, представленные в 8Е0 ГО N0: 11, синтезировали аналогичным образом. Получали также основные конструкции, которые обозначали как Э-ГВЦя) |8Εβ ГО N0: 2] и Ό-ΤΑΤ |8Εβ ГО N0: 6] соответственно.
Все предлагаемые в изобретении Ό- и Ь-слитые пептиды, представленные в 8Е0 ГО N0: 9, 10, 11 и 12, получали путем классического Ртоск-синтеза и дополнительно анализировали с помощью массспектрометрии. Их окончательно очищали с помощью ЖХВР. Для выяснения действия пролинового линкера получали два типа ТАТ-пептидов, один, дополненный двумя остатками пролина, а второй без них. Добавление двух остатков пролина не приводило к заметной модификации проникновения или локализации ТАТ-пептида внутри клетки. Общие пептиды, в которых обнаружены консервативные аминокислотные остатки, представлены на фиг. 2.
Пример 3. Ингибирование гибели клеток с помощью 1ВЭ19.
Изучали воздействие состоящей из 19 ак ДВЭ-последовательности, присутствующей в ГВ1(5), на биологическую активность Ж Состоящую из 19 ак последовательность связывали через вконец с зеленым флуоресцентным белком (конструкция ОРР 1ВЭ19) и оценивали воздействие этой конструкции на апоптоз панкреатических β-клеток, индуцированный ГО-1. Ранее установлено, что такой механизм апоптоза блокируется трансфекцией ΙβΌι-280, при этом не происходит защита специфическими ингибиторами ЕКК1/2 или р38 (см. Аттепбгцр е1 а1., выше).
Синтезировали олигонуклеотиды, соответствующие 1ВЭ19 и содержащие области, которые кодируют консервативную состоящую из 19 аминокислот последовательность, а также последовательность, несущую мутацию в полностью консервативных областях, и непосредственно встраивали в сайты ЕсоК! и БаИ вектора рЕОРР-№, который кодирует зеленый флуоресцентный белок (ОРР) (фирма С1оп1ес11). Продуцирующие инсулин клетки вТС-3 культивировали в среде КРМ! 1640, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина и 2 мМ глутамином. Продуцирующие инсулин клетки вТС-3 трансфектировали указанными векторами и Ι>-1 β (10 нг/мл) и добавляли в среду для культуры клеток. Подсчитывали количество находящиеся в состоянии апоптоза клеток через 48 ч после добавления ΙΩ-1β с помощью инвертного флуоресцентного микроскопа. Находящиеся в состоянии апоптоза клетки отличались от здоровых клеток характерным вспучиванием цитоплазмы и их подсчитывали через 2 дня.
ОРР представляет собой экспрессионный вектор зеленого флуоресцентного белка, который применяют в качестве контроля; 1ВЭ19 представляет собой вектор, экспрессирующий химерный ОРР, связанный с состоящей из 19 ак последовательностью, выведенной из ХВЭ ГВ1; 1ВЭ19Ми1 представляет собой такой же вектор, что и ОРР-1ВЭ19, но в котором ХВЭ несет мутации 4 консервативных остатков, показанных на фиг. 1Б; и 1ВЭ1-280 представляет собой вектор ОРР, связанный с полным 1ВЭ (ак 1-280). Экспрессионная конструкция СРР-1ВЭ19 препятствовала индуцируемому Ι>-1β апоптозу панкреатических β-клеток с такой же эффективностью, что и полный 1ВЭ|-280.
Применяемые в качестве дополнительных контролей последовательности, несущие мутации полностью консервативных остатков ГВ1(5), обладали существенно меньшей способностью препятствовать апоптозу.
Пример 4. Импорт в клетку пептидов ΤΑΤ-ΙΡ1(8).
Оценивали способность Ь- и Ό-энантиомерных форм ТАТ и предлагаемых в изобретении пептидов ΤΑΤ-ΙΡ1(5) ('ΠΑΤ-Ε^μ^ε) проникать в клетки. Ь-ТАТ, Ό-ΤΑΤ, предлагаемые в изобретении ЬΤΑΤ-Ε1(δ)- и предлагаемые в изобретении Ό-ΤΑΤ-Е 1(я)-пептиды |8Εβ ΙΌ N0: 5, 6, 9 и 12 соответственно] метили, добавляя на вконец остаток глицина, конъюгированный с флуоресцеином. Меченые пептиды (1 мкМ) добавляли в культуры клеток βТС-3, которые поддерживали в условиях, описанных в примере 3. В предварительно определенные моменты времени клетки промывали ЗФР и фиксировали в течение 5 мин в охлажденном на льду метаноле-ацетоне (1:1) перед оценкой с помощью флуоресцентного микроскопа. Меченный флуоресциеном БСА (1 мкМ, 12 моль/моль БСА) применяли в качестве контроля. Полученные результаты свидетельствуют о том, что все указанные выше меченные флуоресцеином пептиды эффективно и быстро (менее чем в течение 5 мин) проникали в клетки при их добавлении в культуральную среду. И, наоборот, меченный флуоресцеином бычий сывороточный альбумин (1 мкМ БСА, 12 молей флуоресцеина/моль БСА) не проникал в клетки.
Изучение в зависимости от времени показало, что интенсивность флуоресцентного сигнала при использовании Ь-энантиомерных форм пептидов снижалась на 70% через 24 ч. Через 48 ч обнаружен небольшой сигнал или отсутствие сигнала. В противоположность этому, Ό-ΤΑΤ и предлагаемые в изобретении Ό-ΤΑΤ-Ε1(δ) обладали очень высокой стабильностью в клетках.
Флуоресцентные сигналы этих полностьюГО-ретроинвертированных пептидов оказались еще очень
- 26 014330 сильными спустя 1 неделю, и сигнал лишь слегка снижался ко 2 неделе после обработки.
Пример 5. Ш νίΙΐΌ ингибирование фосфорилирования с-ΐυΝ. АТР2 и Е1к1.
В опытах 1п νίΙΐΌ оценивали воздействие пептидов на ΡΝΚ-опосредуемое фосфорилирование их факторов транскрипции-мишеней. Рекомбинантные и не активированные ΡΝΚ1, ΡΝΚ2 и ΡΝΚ3 получали с помощью набора для транскрипции и трансляции лизатов кроличьих ретикулоцитов (ТКАN8СКIРТIОN ΛΝΩ ТКАМЗЕАТЮМ гаЬЬй гейси1осу!е 1уяа!е кй) (фирма Рготеда) и применяли для твердофазных анализов киназ с-Рип, АТР2 и Е1к1 либо индивидуально, либо после слияния с глутатион-8-трансферазой (О8Т) в качестве субстратов. Осуществляли опыты по оценке зависимости ответа от дозы, смешивая предлагаемые в изобретении пептиды Ь-ТАТ или Ь-ТАТ-РВЦя) (0-25 мкМ) с рекомбинантными киназами ΡΝΚ1, ΡΝΚ2 или ΡΝΚ3 в реакционном буфере (20 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭГТК (этиленгликолевая тетраацетиловая кислота), 10 мМ п-нитрофенилфосфат (пНФФ), 5 мМ пирофосфат натрия, 10 мМ пглицерофосфат, 1 мМ дитиотреитол) в течение 20 мин. Затем инициировали киназные реакции, добавляя 10 мМ МдС12 и 5 пКи 33Р-у-дАТФ и 1 мкг либо О8Т-Рип (ак 1-89), либо О8Т-АРТ2 (ак 1-96), либо О8ТЕЬК1 (ак 307-428). Слитые с О8Т белки получали от фирмы 81га1адепе (Ла-Джолла, шт. Калифорния).
В смесь добавляли 10 мкл покрытых глутатионом агарозных гранул. Продукты реакции затем разделяли с помощью ДСН-ПААГ, в которых применяли денатурирующий 10% полиакриламидный гель. Гели сушили и затем экспонировали на рентгеновскую пленку (фирма Кобак). Практически полное ингибирование фосфорилирования с-Лт, АТР2 и Е1к1 с помощью ΣΝΕ обнаружено при использовании предлагаемых в изобретении пептидов ТАТ-РВ(я) в дозах порядка 2,5 мкМ. Однако важным исключением было отсутствие ингибирования пептидом ТАТ-РВ(5) фосфорилирования Е1к1 с помощью ΣΝΕ3. В целом, для заявляемого в изобретении пептида ТАТ-РВЦя) обнаружена очень высокая эффективность в отношении ингибирования фосфорилирования семейством 1ΝΙ< их факторов транскрипции-мишеней. Способность Ό-ТАТ, предлагаемого в изобретении пептида О-ТАТЛВ1(8) и предлагаемого в изобретении пептида Ь-ТАТЛВЦя) (изучены дозы 0-250 мкМ) ингибировать фосфорилирование О8Т-Рип (ак 173) рекомбинантными Р№К1, 1ΝΙ<2 и РИК3 анализировали с помощью описанного выше метода. В целом, пептид О-ТАТЛВЦя) снижал опосредуемое ΣΝΕ фосфорилирование сЛип, но примерно в 10-20 раз менее эффективно по сравнению с пептидом Ь-ТАТЛВЦя).
Пример 6. Ингибирование фосфорилирования с-ΡϋΝ активированными ΣΝΕ.
Воздействие пептидов Ь-ТАТ или предлагаемого в изобретении Ь-ТАТ-РВЦя) на ΣΝΕ, которые активировали вызывающими стресс стимулами, оценивали, используя О8Т-Рип для оценки выделения 1ΝΙ< из облученных УФ-светом клеток линии НеЬа или обработанных РЬ-1 β клеток линии РТС. РТС-клетки культивировали согласно описанному выше методу. НеЬа-клетки культивировали в среде ОМЕМ, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина и 2 мМ глутамином. За 1 ч до получения клеточного экстракта РТС-клетки активировали ЬС-1 β, как описано выше, а НеЬа-клетки активировали УФ-светом (20 Дж/м2). Клеточные экстракты получали из контрольных, облученных УФ-светом НеЬа-клеток и обработанных ЬС-1 β вТС-3-клеток путем расщепления клеточных культур в лизирующем буфере (20 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭГТК, 1% ТгПоп Х-100, 10 мМ пнитрофенилфосфат, 5 мМ пирофосфат натрия, 10 мМ п-глицерофосфат, 1 мМ дитиотреитол). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием в течение 5 мин при 15000 об/мин на роторе типа 88-34 Весктап. 100 мкг экстрактов инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с 1 мкг ОЗТ-Рип (аминокислоты 1-89) и 10 мкл покрытых глутатионом агарозных гранул (фирма 81дта). После четырех отмывок буфером для расщепления гранулы ресуспендировали в этом же буфере, дополненном пептидами Ь-ТАТ или предлагаемым в изобретении пептидом Ь-ТАТ-ГВЦя) (25 мкМ), в течение 20 мин. Затем киназные реакции инициировали, добавляя 10 мМ МдС12 и 5 пКи 33Р-у-дАТФ, и инкубировали в течение 30 мин при 30°С.
Продукты реакции затем разделяли с помощью ДСН-ПААГ, в которых применяли денатурирующий 10%-ный полиакриламидный гель. Гели сушили и затем экспонировали на рентгеновскую пленку (фирма Кобак). В этих экспериментах установлено, что предлагаемые в изобретении пептиды ТАТЛВ(8) эффективно предупреждали фосфорилирование сЛип активированными ΣΝΕ.
Пример 7. ΣΠ у1уо ингибирование фосфорилирования с-ΡυΝ предлагаемыми в изобретении пептидами ТАТ4В(я).
Для выяснения вопроса о том, могут ли предлагаемые в изобретении обладающие способностью проникать в клетку пептиды блокировать передачу сигнала ΣΝΕ ш у1уо, при создании изобретения использовали гетерологичную систему ОАЬ4. НеЬа-клетки, которые культивировали с помощью описанного выше метода, совместно трансфектировали репортерным вектором 5хОАЬ-ЬиС в сочетании с экспрессионной конструкцией ОАЬЛип (фирма 8йа1адепе), которая содержит домен активации сЛип (аминокислоты 1-89), сшитый с ДНК-связывающим доменом ОАЬ4. Для активации ΣΝΙ< использовали совместную трансфекцию векторами, экспрессирующими находящиеся непосредственно в обратном направлении киназы МКК4 и МКК7 (см., \νΐιίΙιη;·ΐΓ51ι е1 а1., 8с1епсе 285, 1999, с. 1573). В целом, метод состоял в следующем: 3х105 клеток трансфектировали плазмидами в 3,5-сантиметровых чашках с использованием ЭОТАР (фирма Воейппдег МаппНенп) согласно инструкциям производителя. Для экспериментов с ис
- 27 014330 пользованием СЛЬ-Лт 20 мкг плазмиды трансфектировали 1 мкг репортерной плазмиды рРК-Ьис (фирма 81га1адепе) и 0,5 мкг экспрессионной плазмиды либо МКК4, либо МКК7. Через 3 ч после трансфекции клеточные среды заменяли и добавляли пептиды ТАТ и ТАТ-1В1(в) (1 мкМ). Люциферазную активность оценивали через 16 ч с помощью системы 'ГОиа1 Керопег 8увйт (фирмы Рготеда) после стандартизации содержания белка. Добавление пептида ТАТ-ГВ1(в) блокировало активацию с-1ип после опосредуемой МКК4 и МКК7 активации 1ΝΙ4. Поскольку в клетках линии НеЬа происходит экспрессия изоформ 1ΝΙ41 и ΙΝΙ42, но отсутствует экспрессия 1ΝΙ43. при создании изобретения клетки трансфектировали 1ΝΙ43. И в этом случае пептид ТАТ-ГВ(в) ингибировал опосредуемую 1ЫК2 активацию с-Л1п.
Пример 8. Ингибирование пептидами ТАТ-1В индуцируемой 1Ь-1 β гибели панкреатических βклеток.
При создании изобретения анализировали воздействие предлагаемых в изобретении пептидов ЬТАТ-ГВ(в) на развитие апоптоза β-клеток, вызванного обработкой 1Ь-1. Культуры вТС-3-клеток инкубировали в течение 30 мин с 1 мкМ предлагаемыми в изобретении пептидами Ь-ТАТ-1В1(в) с последующим введением 10 нг/мл 1Ь-1. Второе введение пептида (1 мкМ) осуществляли через 24 ч. Количество находящихся в состоянии апоптоза клеток подсчитывали после инкубации в течение 2 дней с ΙΌ-1β с использованием для окрашивания ядер йодида пропидия (клетки, окрашенные в красный цвет, представляют собой погибшие клетки) и НоесйЧ 33342 (клетки, окрашенные в синий цвет, представляют собой клетки с неповрежденной плазматической мембраной). Добавление предлагаемых в изобретении пептидов ТАТ-ГВ(в) ингибировало индуцированный 1Ь-1 апоптоз βΤΟ-3-клеток, культивируемых в присутствии 1Ь-1 β в течение 2 дней.
Продолжительное ингибирование индуцируемой 1Ь-1 гибели клеток оценивали путем обработки βΤΟ-3-клеток аналогично описанному выше, за исключением того, что инкубацию клеток пептидами и ΙΌ-1β осуществляли в течение 12 дней. Каждый день вносили дополнительную порцию пептидов (1 мкМ) и каждые два дня вносили дополнительную порцию 1Ш-1 β (10 нг/мл). Предлагаемые в изобретении пептиды ТАТ-ГВ1(в) в этих условиях обладали выраженным защитным действием от апоптоза. Эти эксперименты в сравнении друг с другом четко демонстрируют, что предлагаемые в изобретении пептиды ТАТ-ГВ(в) представляют собой биологически активные молекулы, обладающие способностью предупреждать воздействия передачи сигнала 1ΝΙ4 на гибель клеток.
Пример 9. Синтез предлагаемых в изобретении полностью-Э-ретроинвертированных пептидов 1В(в).
Пептиды, предлагаемые в изобретении, могут представлять собой пептиды, состоящие из полностью-О-аминокислот, которые подвергали обращенному синтезу для предупреждения естественного протеолиза (т.е. полностью-Э-ретроинвертированные пептиды). Полностью-Э-ретроинвертированный пептид, предлагаемый в изобретении, представляет собой пептид с аналогичными нативному пептиду функциями, в котором боковые группы входящих в его состав аминокислот должны соответствовать по линеаризованной структуре нативному пептиду, но сохранять устойчивый к протеазам каркас.
Ретроинвертированные пептиды, предлагаемые в изобретении, синтезировали аналогично с помощью Ό-аминокислот путем присоединения аминокислот в пептидной цепи так, чтобы последовательность аминокислот в ретроинвертированном пептидном аналоге была точно противоположна последовательности выбранного пептида, который служит в качестве модели. Например, если встречающийся в естественных условиях белок ТАТ (состоящий из Б-аминокислот) имеет последовательность СКККККОККК [8Е0 ГО ΝΟ: 5], то ретроинвертированный пепидный аналог этого пептида (состоящий из Ό-аминокислот) должен иметь последовательность КККОКККККС |8ЕЦ ГО ΝΟ: 6]. Процедуры синтеза цепи Ό-аминокислот для получения ретроинвертированных пептидов известны в данной области (см., например, Линевой е! а1., Ыа1иге, 368, 1994, с. 744-746; Вгабу е! а1., Майте, 368, 1994, с. 692-693; бшсйагб е! а1., 1. Меб. Сйет. 39, 1996, с. 2030-2039). В частности, ретропептиды можно получать с помощью классического Р-тоск-синтеза и затем анализировать с помощью масс-спектрометриии. Их окончательно очищают с помощью ЖХВР.
Поскольку особенностью нативных пептидов является их чувствительность к расщеплению встречающимися в естественных условиях протеазами и им свойственна иммуногенность, то гетеробивалентые или гетеромультивалентые соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, следует получать таким образом, чтобы они представляли собой ретроинвертированный изомер требуемого пептида. Таким образом, защита пептида от естественного протеолиза должна повышать эффективность гетеробивалентного или гетеромультивалентного соединения как в результате удлинения времени полужизни, так и снижения степени иммунного ответа, направленного на активное разрушение пептидов.
Пример 10. Продолжительная биологическая активность предлагаемых в изобретении полностьюΌ-ретроинвертированных пептидов 1В(в).
Данные о продолжительной биологической активности, предсказанной для предлагаемого в изобретении содержащего ретроинвертированный пептид О-ТАТ-1В(в) гетероконъюгата при сравнении с нативным Б-аминокислотным аналогом, что обусловлено защитой предлагаемого в изобретении пептида О-ТАТ-!В(в) от расщепления нативными протеазами, представлены на фиг. 5.
- 28 014330
Анализировали ингибирование индуцируемой Ι>-1β гибели панкреатических β-клеток предлагаемым в изобретении пептидом Э-ТАТЧВЦб). Клетки линии вТС-3 инкубировали согласно описанному выше методу в течение 30 мин с однократным добавлением указанного пептида (1 мкМ), после чего добавляли Ι>-1 (10 нг/мл).
Затем после инкубации в течение 2 дней с Ι>-1 β подсчитывали количество клеток, находящихся на стадии апоптоза, с помощью окрашивания ядер йодидом пропидия и Ноес1151 33342. В каждом эксперименте осуществляли подсчет минимум 1000 клеток. Представлены среднеквадратичные отклонения средних значений (СКО) при п=5. Установлено, что пептид П-ТАТ-ГВ1 снижал индуцированный Е-1 апоптоз в такой же степени, что и пептиды Ь-ТАТ-ГВ.
Анализировали также продолжительное ингибирование индуцируемой Ι>-1β гибели клеток с помощью пептида Ό-ТАТ-ЕЕ Клетки линии вТС-3 инкубировали с помощью указанного выше метода в течение 30 мин с однократным добавлением указанных пептидов (1 мкМ), после чего добавляли Ι>-1β (10 нг/мл), а затем добавляли цитокин каждые два дня. Затем после инкубации в течение 15 дней с Ι>-1 подсчитывали количество клеток, находящихся на стадии апоптоза, с помощью окрашивания ядер йодидом пропидия и Ноес1151 33342. Следует отметить, что однократное добавление пептида ТАТ-ΙΕ1 не обеспечивает продолжительную защиту. В каждом эксперименте осуществляли подсчет минимум 1000 клеток. В результате установлено, что предлагаемый в изобретении Э-ТАТ-ЕЦб), в отличие от не предлагаемого в изобретении Ь-ТАТ-ЕЦб), обладал способностью обеспечивать продолжительную защиту (15 дней).
Пример 11. Ингибирование пептидами ТАТ-Е(к) индуцированной облучением гибели панкреатических β-клеток.
ΓΝΚ активировали также ионизирующим излучением. Для решения вопроса о том, могут ли предлагаемые в изобретении пептиды ТАТ-Е(к) обеспечивать защиту от индуцируемого облучением повреждения 1ΝΚ, клетки линии ХУЮг облучали (30 Гр) в присутствии Ό-ТАТ, предлагаемого в изобретении, или без него, Ь-ТАТ-Е1(8) или предлагаемыми в изобретении пептидами О-ТАТ-Е1(А) (1 мкМ вносили за 30 мин до облучения). Контрольные клетки (СТКЕ) не облучали. Клетки анализировали через 48 ч с помощью окрашивания ИП (йодид пропидия) и Ноес1151 3342 согласно описанному выше методу. Представлены среднеквадратичные отклонения средних значений (СКО) при п=3. Предлагаемые в изобретении пептиды Ь-ТАТ-Е1(8) и О-ТАТ-Е» оба обладали способностью предупреждать индуцируемый облучением апоптоз этой человеческой линии клеток рака ободочной кишки.
Пример 12. Радиационная защита от ионизирующего излучения с помощью предлагаемых в изобретении пептидов ТАТ-Е(А).
Для выявления способности предлагаемых в изобретении пептидов ТАТ-Е(к) осуществлять радиационную защиту мышей линии С57В1/6 (возрастом 2-3 месяца) облучали рентгеновскими лучами (Влучи) с помощью устройства РЫШрк ВТ 250 в дозе 0,74 Гр/мин (17 мА, 0,5 мм Си-фильтр). За 30 мин до облучения животным вводили внутрибрюшинно (1.р.) следующие пептиды: либо ТАТ, либо предлагаемые в изобретении Ь-ТАТ-ЕЦк), либо предлагаемые в изобретении О-ТАТ-Е1(А) (30 мкл 1 мМ раствора). В целом, метод состоял в следующем: для облучения мышей их помещали в небольшие пластиковые боксы, при этом голова оставалась вне бокса. Перед облучением животных клали на спину и фиксировали шею с помощью небольшой пластмассовой трубки для поддержания головы в правильном положении. Тело защищали свинцом.
Перед облучением мышей содержали на стандартном пеллетированном корме для мышей, однако после облучения мышей содержали на полужидком корме, который заменяли каждый день.
Затем оценивали реакцию слизистой оболочки губ в двух независимых анализах, используя балльную систему, разработанную Рагкшк с соавторами (Ратктк е! а1., Вабюйегару & 0псо1оду, 1, 1983, с. 165173), в которой оценивали статус эритемы, а также наличие отека, шелушения и экссудата. Кроме того, животных взвешивали перед каждой оценки статуса эритемы/отека.
Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что предлагаемые в изобретении пептиды ТАТ-Е(к) могут обеспечивать защиту от связанных с ионизирующим излучением потери веса и эритемы/отека.
Пример 13. Подавление факторов транскрипции 1ΝΚ с помощью предлагаемых в изобретении пептидов Ь-ТАТ-Е1(8).
Анализы по удерживанию в геле осуществляли с использованием несущего двойную метку зонда АР-1 (5'-ССС ТТС АТС АСТ САС ССС САА-3' (8Εβ ΙΌ Ν0: 27)). Ядерные экстракты клеток линии НеЬа обрабатывали в течение 1 ч 5 нг/мл Т№-а или соответственно не обрабатывали. ТАТ и предлагаемые в изобретении пептиды Ь-ТАТ-Е1(8) добавляли за 30 мин до ΊΝΕ-α. Выявлена только часть геля, несущая специфический комплекс АР-1-ДНК (что продемонстрировано с помощью конкурентных экспериментов с немечеными специфичными и неспецифичными конкурентами).
Предлагаемые в изобретении пептиды Ь-ТАТ-Е1(8) снижают образование получаемого посредством связывания АР-1 и ДНК комплекса в присутствии ΈΝΕ-ο.
Пример 14. Оценка нейрозащитного действия от очаговой церебральной ишемии на перманентной
- 29 014330
МСАО-модели - определение эффективности защиты при использовании различных доз (см. фиг. 3).
Очаговую церебральную ишемию индуцировали у 12-дневных крыс. Крысят анестезировали в камере для индукции с использованием 2%-го изофлурана и в процессе операции поддерживали анестезию с использованием маски с 2%-ным изофлураном. МСАО индуцировали путем электрокоагуляции основной ветви средней церебральной артерии (МСА). Крыс помещали на правый бок и делали продольный разрез кожи между глазом и ухом. После иссечения височной мышцы черепную кость удаляли из фронтального шва до уровня ниже скуловой дуги. Левую МСА, обнаженную непосредственно после ее появления над носовой щелью, постоянно подвергали электрокоагуляции на уровне нижней церебральной вены перед бифуркацией МСА на фронтальную и теменную ветви. Затем закрывали разрез на коже черепа. Затем крысят помещали в инкубатор, в котором поддерживали температуру 37°С до их пробуждения и после этого их переносили к матери.
Через 6 ч путем внутрибрюшинной инъекции вводили предлагаемый в изобретении химерный ΌТАТЧВЦв), последовательность которого представлена в БЕО ГО ΝΟ: 11. Через 24 ч после коагуляции крыс анестезировали гидратом хлораля и осуществляли перфузию через восходящую аорту 4% параформальдегидом и ЗФР. Затем удаляли головной мозг и выдерживали 2 ч в таком же растворе для фиксации и выдерживали в градиенте 30% сахарозы в ЗФР в течение 15 ч при 4°С. Головной мозг замораживали в изопентане (-40°С) и хранили при -20°С. Собирали на стеклянные предметные стекла криостатические фронтальные срезы. Срезы окрашивали крезиловым фиолетовым. Анализировали каждые 10 срезов и общий объем повреждений рассчитывали с помощью программы №иго1еис1ба. В контрольной группе А средний объем повреждения составлял 21,47 мм3. Во всех опытных группах обнаружено более низкое среднее значение по сравнению с контрольной группой. Статистически значимое различие обнаружено между группой А и группами В, Д и Е (однонаправленный 1-критерий, р=0,030, р=0,002, р=0,001 соответственно). Результаты представлены на фиг. 4.
Таким образом, эти данные подтверждают заключение о том, что предлагаемый в изобретении химерный пептид Ό-ТАТ-ГВ 1(в), последовательность которого представлена в БЕО ГО ΝΟ: 11, при введении в дозе 11, 3, 0,3 и 0,03 мг/кг принимает участие в церебральной защите. Результаты, полученные при использовании дозы 1, 0,003 и 0,0003 мг/кг, по сравнению с группой, обработанной физиологическим раствором, позволяют предположить, что общая выборка не является достаточно большой для получения значимого различия. Наиболее эффективная защита обнаружена при использовании дозы 0,03 мг/кг.
Пример 15. Оценка нейрозащитного действия с помощью предлагаемых в изобретении химерных пептидов после внутривенного (ίν) введения в отношении очаговой церебральной ишемии при использовании кратковременной МСАО-модели (см. фиг. 4).
Создание кратковременной модели ишемии на взрослых мышах. На самцах мышей линии ТСК-СБ]. (6-недельные; 18-37 г; Наг1ап) провоцировали ишемию путем интродукции филамента из общей сонной артерии во внутреннюю сонную артерию и продвижения в артериальный круг, тем самым, закупоривая среднюю церебральную артерию. С помощью лазерной Доплеровской флуориметрии с использованием зонда, фиксированного на черепе, осуществляли измерение регионального церебрального потока крови через область ишемии в течение периода времени до 10 мин после реперфузии. Оценивали ректальную температуру и поддерживали на уровне 37°С. Мышей умерщвляли через 48 ч после реперфузии. Получали серийные криостатические срезы толщиной 20 мкм с использованием системы компьютермикроскоп, снабженной программой беиго1ис1ба (фирма М|сгоВгщ111Е|е1б) и рассчитывали объемы области ишемии и всего головного мозга (окрашено в темный цвет) с помощью программы №игоехр1огег.
ХС-102 0,3=0,3 мг/кг, ХС-102 1=1 мг/кг, ХС-102 5=5 мг/кг
Данные об объеме области инфаркта (мм3) после болюсной ίν-инъекции плацебо и ХС-102 0,3, 1,3 мг/кг через 6 ч после реперфузии (30-минутная фиксация) на модели взрослых мышей представлены ниже.
Инфаркт Среднее значение Стандартное отклонение
Контроль 11=5 72 17
ХС102 0,3 п=5 16 4
ХОЮ2 1 п=1 16
ХОЮ2 3 п=5 15 5
Пример 16. Анализ культур нейронов по уровню ЛДГ, выделившейся после стимуляции бМЭА (см. фиг. 5).
Нейрозащитное действие пептида Ό-ТАТЧВ (общийХвУ-ЗЫХП (БЕО ГО ΝΟ: 12) оценивали на сестринских культурах, предварительно обработанных в течение 30 мин указанными концентрациями пептидов или МЕ-801 перед непрерывной обработкой 100 мкМ бМЭА. После 12-часовой обработки бМЭА в культурах, предварительно обработанных 5 мкМ Ό-ТАТ-Ш (общийХвУ-ЗЫХП, дегенеративные изменения, связанные с обработкой бМЭА, полностью ингибировались, что видно по отсутствию заметного превышения высвобождения по сравнению с контролем (фиг. 5). Морфологические характеристики, количество и распределение нейронов не отличалось от контроля.
- 30 014330
Культура коровых нейронов. Отсекали небольшие кусочки коры головного мозга двухдневных крысят, инкубировали с 200 ед. папаина в течение 30 мин при 34°С и затем помещали нейроны, исходя из плотности 1х106 клеток/планшет в чашки, предварительно сенсибилизированные 100 мкг/мл поли-Όлизина. Среда для чашек Петри представляла собой В27/№игоЬа5а1 (фирма Ьйе ^011-10108105, Геттисберг, шт. Мэдисон), дополненную 0,5 мМ глутамином, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
Анализ цитотоксичности лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Оценивали количество ЛДГ, высвободившееся в среду для сбора через 12, 24 и 48 ч после введения ΝΜΌΑ, с помощью набора для нерадиоактивного анализа цитотоксичности типа С'уЮЮх 96 (фирма Рготеда, шт. Висконсин) (см. фиг. 5).
Пример 17. Ингибирование эндогенной активности ΓΝΚ в клетках линии НерС2 с использованием подхода все в одной лунке (см. фиг. 6).
Клетки линии НерС2 высевали из расчета 3000 клеток/лунку за 1 день до эксперимента. Затем добавляли для активации ΓΝΚ в течение 30 мин возрастающие концентрации либо интерлейкина-1в [IЬ1 β(ν)], либо фактора некроза опухоли α [ΤΝΕα(·)] (панель а). Клетки лизировали в 20 мМ Нерек, 0,5% Твин, рН 7,4 и процессировали для осуществления А1рЕа8сгееп-анализа 1ΝΚ. Панель б: Ζ' для активности ΓΝΚ, индуцированной с помощью 10 нг/мл [И-1 β и оцененной в 384 лунках/планшет (п=96). Панель в: ингибирование эндогенной индуцированной ]>-1β активности ΓΝΚ химическими ингибиторами ΓΝΚ [стауроспорин (°) и 8Р600125 (·)]. Панель г: воздействие пептидных ингибиторов Ε-ΤΑΤ-!Β1(5) (8Εβ Ю Ν0: 9) [сокращенное обозначение в контексте настоящего описания Ε-ΓΝΚί (ν) и Ω-ΤΑΤ-[Β1(5) (8Εβ Ю Ν0: 11) (сокращенное обозначение в контексте настоящего описания Ό-ΓΝΚί (♦)) и ΙΒΌδ (·) (соответствует Ε-ΓΝΕΊ без ТАТ- последовательности)] на зависящую от Е-1а активность ΓΝΚ. Данные на всех панелях представляют собой результаты, полученные в 3 независимых экспериментах (п=3).
Методы: А1рЕа8сгееп-анализ киназной активности.
Принцип: А1рЕа8сгееп представляет собой нерадиоактивный метод анализа, основанный на использовании гранул, который применяют для изучения биомолекулярных взаимодействий в формате микропланшета. ЛЕРНА представляет собой сокращение названия АтрИПеД Еиттексепсе Ргох1тйу Нотодепои8 Аззау (гомогенный анализ усиленной люминесценции в ближней области). Он основан на биологическом взаимодействии, которое приводит к тому, что гранулы-доноры и гранулы-акцепторы оказываются близко расположенными друг к другу, после чего в результате каскада химических реакций возникает усиленный сигнал. Под действием создаваемого лазером света с длиной волны возбуждения 680 нм фотодетектор (фталоцианин), присутствующий в грануле-доноре, переводит находящийся в окружающей среде кислород в возбужденное синглетное состояние. В течение промежутка времени, составляющего 4 мкс, что соответствует ее времени полужизни, синглетная молекула кислорода может продиффундировать в растворе на расстояние, составляющее примерно 200 нм, и если в этой близкой области находится гранула-акцептор, то синглетная молекула кислорода вступает во взаимодействие с тиоксеновым производным, присутствующим в грануле-акцепторе, вызывая хемилюминесценцию при длине волны 370 нм, которая затем активирует флуорофоры, содержащиеся в этой же гранулеакцепторе. После этого возбужденные флуорофоры испускают свет при длине волны 520-620 нм. При отсутствии гранулы-акцептора синглетная молекула кислорода возвращается в основное состояние и сигнала при этом не возникает.
Реагенты для оценки киназной активности (Β-Οδ^^υ^ антитело к Р-с1ип и активная ΓΝΚ3) сначала разбавляли в киназном буфере (20 мМ Трис-НС1, рН 7,6, 10 мМ МдС12, 1 мМ ДТТ, 100 мкМ NазV04, 0,01% Твин 20) и добавляли в лунки (15 мкл). Затем реакционные смеси инкубировали вместе с 10 мкМ АТФ в течение 1 ч при 23°С. Обнаружение проводили путем добавления 10 мкл смеси гранул (акцептор протеин А, 20 мкг/мл и донор - стрептавидин 20 мкг/мл), разбавляли в буфере для обнаружения (20 мМ Трис-НС1, рН 7,4, 20 мМ №С1, 80 мМ ЭДТК, 0,3 % БСА), после чего осуществляли еще одну инкубацию в течение 1 ч при 23°С в темноте. Для измерения эндогенной активности ΓΝΚ анализы киназной активности проводили согласно описанному выше методу за исключением того, что активную ΓΝΚ3 заменяли на клеточные лизаты и компоненты, входящие в реакционную смесь для киназы, добавляли после лизиса клеток. Β-βδΤ-Οιιΐ'ΐ и антитело к Р-с1ип применяли в тех же самых концентрациях, в то время как АТФ применяли в концентрации 50 мкМ вместо 10 мкМ. А1рЕа8сгееп-сигнал анализировали непосредственно с помощью прибора типа Еикюп или Еп V^5^οπ.
Пример 18. Лечение шумовой травмы.
^-ΤΑΤ-[Β1(5) наносили на мембрану круглого окна улитки 3 групп морских свинок (по 6 животных в каждой группе) в виде 2 мкл геля на основе 2,6%-ной забуференной гиалуроновой кислоты (Ну1ите4, фирма Сепхуте Согр.) в концентрации 100 мкМ либо за 30 мин до шумовой травмы (120 дБ при 6 кГц в течение 30 мин) или через 30 мин или через 4 ч после травмы. В качестве контроля служили необработанные уши. Изменения в уровне слухового порога оценивали путем измерения ответа слухового ствола головного мозга через 20 мин после шумовой травмы (временный сдвиг порога, ΤΤ8) и через 15 дней после травмы (перманентный сдвиг порога, РΤ8). Введение ^-ΤΑΤ-[Β1(5) защищало от перманентной потери слуха даже при введении после избыточного шумового воздействия по сравнению с необработанными ушами. Защитное действие было тем сильнее, чем раньше начинали введение ^-ΤΑΤ-[Β1(5)
- 31 014330 после шумовой травмы. Таким образом, Ό-ΤΑΤ-ΙΒ1(δ) представляет собой очень эффективный защищающий уши агент в случае шумовой травмы.
Из приведенного выше подробного описания конкретных вариантов осуществления изобретения должно быть очевидно, что в изобретении представлены уникальные обладающие способностью проникать в клетку биологически активные химерные пептиды и последовательности, ингибирующие 1ΝΚ. Хотя в настоящем описании подробно описаны конкретные варианты осуществления изобретения, они были даны в качестве примера только для целей иллюстрации и не направлены на ограничение объема приведенной ниже формулы изобретения. В частности, подразумевается, что в изобретение могут быть внесены различные замены, изменения и модификации без отклонения от сущности и объема изобретения, которые определяются формулой изобретения.

Claims (18)

1. Последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, которая содержит менее 150 аминокислот, где последовательность-ингибитор содержит или состоит по меньшей мере из одной аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 или 4, где последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, не включает последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18, 20, 25 или 26.
2. Последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, по п.1, где последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, содержит от 5 до 150 аминокислотных остатков, более предпочтительно от 10 до 100 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно от 10 до 75 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно от 15 до 50 аминокислотных остатков.
3. Последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, по одному из пп.1, 2, где последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, связывается с аминоконцевой киназой сЛип (1ΝΚ).
4. Последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, по одному из пп.1-3, где последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, ингибирует активацию по меньшей мере одного являющегося мишенью для 1ΝΚ фактора транскрипции, когда последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, присутствует в экспрессирующей 1ΝΚ клетке.
5. Последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, по одному из пп.1-4, где являющийся мишенью для 1ΝΚ фактор транскрипции выбран из группы, включающей сЛип, АТР2 и Е1к1.
6. Последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, по одному из пп.1-5, где последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, изменяет действие 1ΝΚ, когда пептид присутствует в клетке, экспрессирующей 1ΝΚ.
7. Химерный пептид, содержащий по меньшей мере один первый домен и по меньшей мере один второй домен, которые связаны ковалентной связью, где первый домен содержит транспортирующую последовательность, а второй домен содержит последовательность, ингибирующую 1ΝΚ по любому из пп.1-6.
8. Пептид по п.7, в котором транспортирующая последовательность содержит аминокислотную последовательность полипептида ТАТ вируса иммунодефицита человека.
9. Пептид по одному из пп.7, 8, в котором транспортирующая последовательность содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5, 6, 7 или 8.
10. Пептид по одному из пп.7-9, в котором транспортирующие последовательности усиливают поглощение пептида клеткой.
11. Пептид по одному из пп.7-9, где транспортирующая последовательность обеспечивает ядерную локализацию пептида.
12. Пептид по одному из пп.7-11, в котором последовательность, ингибирующая 1ΝΚ, включает аминокислотную последовательность, представленную в любой из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11 или 12.
13. Пептид по п.12, где пептид содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11.
14. Антитело, которое иммуноспецифически связывается с последовательностью, ингибирующей 1ΝΚ, по одному из пп.1-6, или с химерным пептидом по одному из пп.7-13.
15. Фармацевтическая композиция, которая содержит последовательность, ингибирующую 1ΝΚ, по одному из пп.1-6 или химерный пептид по одному из пп.7-13 и фармацевтически приемлемый носитель.
16. Применение последовательности, ингибирующей 1ΝΚ, по одному из пп.1-6 или химерного пептида по одному из пп.9-13 для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения патофизиологического состояния, выбранного из группы, включающей злокачественные заболевания легкого, молочной железы, лимфатической системы, желудочно-кишечного тракта и мочеполового пути, а также аденокарциномы, включая злокачественные, такие как различные типы рака ободочной кишки, почечно-клеточная карцинома, рак предстательной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак тонкого кишечника и рак пищевода, а также лейкозы и рак, связанный с онкогенной трансформацией Всг-АЬ1, псориаза, обыкновенной пузырчатки, синдрома Бехчета, острого респираторного дистресссиндрома (АКО8), ишемического заболевания сердца, синдрома, связанного с состоянием после диализа, ревматоидного артрита, синдрома приобретенного иммунодефицита, васкулита, септического шока, рестеноза, потери слуха, ушной травмы, ишемии, инсульта, повреждения, связанного с реперфузией, гипоксии, вторичных эффектов, связанных с лечением, провоспалительными цитокинами, сердечной гипер- 32 014330 трофии и связанных с артериосклерозом повреждений, патологических состояний, индуцированных ионизирующей радиацией, применяемой при лучевой терапии, ультрафиолетовым светом (УФ-свет), патологических состояний, индуцированных повреждающими ДНК агентами, включая химиотерапевтические лекарственные средства, гипо- и гипертермии, воспалительных, аутогенных воспалительных, иммунных и аутоиммунных заболеваний, дегенеративных заболеваний, миопатий, кардиомиопатий и отторжения трансплантата.
17. Применение по п.16, в котором фармацевтическую композицию следует применять с помощью пути введения, выбранного из группы, включающей внутрибрюшинное, назальное, внутривенное, оральное введение и введение с помощью бляшки.
18. Набор, который содержит последовательность, ингибирующую 1ΝΚ, по одному из пп.1-6, и/или химерный пептид по одному из пп.7-13, и/или антитело по п.14.
Пептидные последовательности, человеческая, мышиная и крысиная
EA200800680A 2005-09-12 2006-09-12 Пептидные ингибиторы пути трансдукции сигнала jnk, обладающие способностью проникать в клетку EA014330B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2005/009782 WO2007031098A1 (en) 2005-09-12 2005-09-12 Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
PCT/EP2006/008882 WO2007031280A2 (en) 2005-09-12 2006-09-12 Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800680A1 EA200800680A1 (ru) 2008-12-30
EA014330B1 true EA014330B1 (ru) 2010-10-29

Family

ID=35686501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800680A EA014330B1 (ru) 2005-09-12 2006-09-12 Пептидные ингибиторы пути трансдукции сигнала jnk, обладающие способностью проникать в клетку

Country Status (25)

Country Link
US (5) US8748395B2 (ru)
EP (3) EP2418217B1 (ru)
JP (3) JP5386169B2 (ru)
KR (1) KR101305533B1 (ru)
CN (1) CN101263157B (ru)
AU (1) AU2006291541B2 (ru)
BR (1) BRPI0616824B8 (ru)
CA (1) CA2621337C (ru)
CY (2) CY1112924T1 (ru)
DK (2) DK2418217T3 (ru)
EA (1) EA014330B1 (ru)
ES (2) ES2388076T3 (ru)
HK (3) HK1118841A1 (ru)
HR (2) HRP20120598T1 (ru)
HU (1) HUE029132T2 (ru)
IL (2) IL189133A (ru)
ME (2) ME02000B (ru)
NO (1) NO342272B1 (ru)
PL (2) PL1928903T3 (ru)
PT (1) PT1928903E (ru)
RS (2) RS54701B1 (ru)
SI (2) SI2418217T1 (ru)
UA (1) UA98101C2 (ru)
WO (2) WO2007031098A1 (ru)
ZA (1) ZA200800848B (ru)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040082509A1 (en) 1999-10-12 2004-04-29 Christophe Bonny Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US8183339B1 (en) 1999-10-12 2012-05-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
WO2007031098A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
US8080517B2 (en) 2005-09-12 2011-12-20 Xigen Sa Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
WO2008034161A1 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Phylogica Limited Neuroprotective peptide inhibitors of ap-1 signaling and uses therefor
US8822409B2 (en) 2007-06-20 2014-09-02 Phylogica Limited Compositions and uses thereof for the treatment of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and clinical disorders associated with therewith
US11969501B2 (en) 2008-04-21 2024-04-30 Dompé Farmaceutici S.P.A. Auris formulations for treating otic diseases and conditions
RU2499592C2 (ru) 2008-04-21 2013-11-27 Отономи, Инк. Фармацевтическая композиция для лечения ушных заболеваний
MY161021A (en) 2008-05-14 2017-03-31 Otonomy Inc Controlled release corticosteroid and methods for the treatment of otic disorders
US8648119B2 (en) 2008-05-23 2014-02-11 Otonomy, Inc. Controlled release immunomodulator compositions and methods for the treatment of otic disorders
WO2009143864A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory digestive diseases
WO2009143865A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
US8846770B2 (en) 2008-06-18 2014-09-30 Otonomy, Inc. Controlled release aural pressure modulator compositions and methods for the treatment of OTIC disorders
WO2010011466A2 (en) 2008-06-27 2010-01-28 Otonomy, Inc. Controlled-release cns modulating compositions and methods for the treatment of otic disorders
US8349353B2 (en) 2008-06-27 2013-01-08 Otonomy, Inc. Controlled release cytotoxic agent compositions and methods for the treatment of otic disorders
GB2461961A (en) * 2008-07-14 2010-01-27 Otonomy Inc Sterile anti-apoptotic agent for treatment of ear diseases
US8399018B2 (en) 2008-07-21 2013-03-19 Otonomy, Inc. Controlled release ion channel modulator compositions and methods for the treatment of otic disorders
US8496957B2 (en) 2008-07-21 2013-07-30 Otonomy, Inc Controlled release auris sensory cell modulator compositions and methods for the treatment of otic disorders
JP5421366B2 (ja) 2008-07-21 2014-02-19 オトノミ―，インク． 制御放出性の耳の構造体調節および生来の免疫システム調節化合物および耳の障害の処置のための方法
US8784870B2 (en) 2008-07-21 2014-07-22 Otonomy, Inc. Controlled release compositions for modulating free-radical induced damage and methods of use thereof
US8318817B2 (en) 2008-07-21 2012-11-27 Otonomy, Inc. Controlled release antimicrobial compositions and methods for the treatment of otic disorders
WO2010048095A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 House Ear Institute Treatment and/or prevention of inner ear conditions by modulation of a metabotropic glutamate receptor
WO2010072228A1 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Xigen S.A. Novel transporter constructs and transporter cargo conjugate molecules
US20120101046A1 (en) 2009-03-30 2012-04-26 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Prophylactic or therapeutic agent for retinal disease and method for prophylaxis or therapy of retinal disease using jnk (c-jun amino-terminal kinase) - inhibitory peptide, and use of the peptide
US20120077753A1 (en) * 2009-06-25 2012-03-29 Laxman Gangwani Jnk inhibitors for use in treating spinal muscular atrophy
WO2011160653A1 (en) * 2010-06-21 2011-12-29 Xigen S.A. Novel jnk inhibitor molecules
US9150618B2 (en) 2010-10-14 2015-10-06 Xigen Inflammation Ltd. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory eye diseases
JP2015500213A (ja) * 2011-11-30 2015-01-05 ザイジェン インフラメーション リミテッド 眼乾燥症候群を処置するためのｊｎｋシグナル伝達経路の細胞透過性ペプチド阻害剤の使用
WO2013091670A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Xigen S.A. Novel jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
WO2014206426A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Xigen Inflammation Ltd. New use for jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
WO2016055160A2 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2015197097A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 Xigen Inflammation Ltd. New use for jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
WO2014206427A1 (en) * 2013-06-26 2014-12-31 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2015197193A2 (en) * 2014-06-26 2015-12-30 Xigen Inflammation Ltd. New use for jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
WO2015197098A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
CA2903275A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
MX2016002408A (es) 2013-08-27 2016-10-28 Otonomy Inc Metodos para el tratamiento de trastornos oticos pediatricos.
US9926354B2 (en) 2014-01-09 2018-03-27 University Of South Florida Amyloid precursor protein (APP) based Ã#-secretase inhibitor peptides, and methods of use
JP2017513870A (ja) * 2014-04-23 2017-06-01 オーリス メディカル エージーＡｕｒｉｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｇ 耳鳴りの治療と予防のための方法及び組成物
WO2015200768A2 (en) * 2014-06-26 2015-12-30 Auris Medical Ag Pharmacologic treatments of menière's disease
EP3234110B1 (en) 2014-12-18 2024-02-28 President and Fellows of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED ß CELLS AND USES THEREOF
US10456475B2 (en) 2015-02-03 2019-10-29 Kennsaw State University Research and Service Foundation, Inc. Cell penetrating protein adaptor molecules and their application in research and medicine
US10435446B2 (en) 2015-06-03 2019-10-08 Kennesaw State University Research and Service Foundation Inc. Cell penetrating protein adaptor molecules and their application in research and medicine
US10654894B2 (en) 2016-02-03 2020-05-19 Keenesaw State University Research And Service Foundation, Inc. Methods for delivering cargo into a cell by using signal molecules as cell penetration agents
WO2018029336A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for determining whether a subject was administered with an activator of the ppar beta/delta pathway.
US11040004B2 (en) 2016-09-16 2021-06-22 Otonomy, Inc. Otic gel formulations for treating otitis externa
EP3618807A4 (en) * 2017-05-03 2021-01-20 Jian Zuo COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HEARING LOSS
IT202000011176A1 (it) 2020-05-15 2021-11-15 Univ Degli Studi Milano Peptidi inibitori di jnk3
WO2022020114A2 (en) 2020-07-10 2022-01-27 Ting Therapeutics Llc Methods for the prevention and treatment of hearing loss

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001027268A2 (en) * 1999-10-12 2001-04-19 University Of Lausanne Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1195304B (it) 1981-12-22 1988-10-12 Anic Spa Metodo per la preparazione di gem-diammino derivati n-monoacilati
US4631211A (en) * 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
US4698327A (en) * 1985-04-25 1987-10-06 Eli Lilly And Company Novel glycopeptide derivatives
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
IT1190389B (it) * 1985-09-19 1988-02-16 Eniricerche Spa Esapeptidi ad attivita' ipotensiva
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5169933A (en) * 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
IT1227907B (it) 1988-12-23 1991-05-14 Eniricerche S P A Milano Sclav Procedimento per la sintesi di peptidi retro-inversi e nuovi intermediin tale procedimento
EP0832980B1 (en) 1989-01-23 2002-06-19 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
GB8919607D0 (en) 1989-08-30 1989-10-11 Wellcome Found Novel entities for cancer therapy
US5804604A (en) 1989-12-21 1998-09-08 Biogen, Inc. Tat-derived transport polypeptides and fusion proteins
US5670617A (en) * 1989-12-21 1997-09-23 Biogen Inc Nucleic acid conjugates of tat-derived transport polypeptides
US6316003B1 (en) * 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
US5840313A (en) * 1990-09-27 1998-11-24 Syntello Vaccine Development Kb Peptides for use in vaccination and induction of neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus
WO1992018138A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The General Hospital Corporation Mammalian gap-43 compositions and methods of use
US5350835A (en) * 1991-11-05 1994-09-27 Board Of Regents, University Of Texas Cellular nucleic acid binding protein and uses thereof in regulating gene expression and in the treatment of aids
US5994108A (en) * 1991-11-05 1999-11-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Mutant TAR virus and transdominant tat mutants as pharmacological agents
EP0632722A4 (en) 1992-03-20 1997-07-30 Baylor College Medicine DNA TRANSPORTATION SYSTEM AND INSTRUCTIONS FOR USE.
WO1993019768A1 (en) * 1992-04-03 1993-10-14 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system
EP0673385A4 (en) 1992-08-13 1995-11-29 Gen Hospital Corp HUMAN GAP-43 COMPOSITIONS AND METHODS FOR THEIR USE.
DE656950T1 (de) 1992-08-21 1996-03-14 Biogen Inc Tat-derivate transport polypeptide.
ATE258188T1 (de) 1992-08-27 2004-02-15 Deakin Res Ltd Retro-, inverso-, und retro-inverso synthetische peptidanaloge
US5545551A (en) * 1992-08-28 1996-08-13 Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of pur protein
WO1994008598A1 (en) 1992-10-09 1994-04-28 Advanced Tissue Sciences, Inc. Liver reserve cells
EP0693939A1 (de) 1993-04-14 1996-01-31 Roche Diagnostics GmbH Nukleinsäure-transferpeptide und deren verwendung zur einschleusung von nukleinsäuren in eukaryontische zellen
EP0679716A4 (en) 1993-11-12 1999-06-09 Kenichi Matsubara GENE SIGNATURE.
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5807746A (en) 1994-06-13 1998-09-15 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
WO1996034093A1 (en) 1995-04-25 1996-10-31 Baxter International Inc. Composition containing collagenase and chymopapain for isolating hepatocytes and pancreatic islet cells
ATE365808T1 (de) 1995-07-28 2007-07-15 Marie Curie Cancer Care Transportproteine und deren verwendungen
WO1997010836A1 (en) 1995-09-21 1997-03-27 Innapharma, Inc. Peptides and peptidomimetics inhibiting the oncogenic action of p21 ras
IE80466B1 (en) * 1995-11-10 1998-07-29 Elan Corp Plc Peptides which enhance transport across tissues and methods of identifying and using the same
US5877282A (en) 1996-09-20 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Peptide inhibitors of nuclear protein translocation having nuclear localization sequences and methods of use thereof
US6187817B1 (en) * 1996-10-03 2001-02-13 Southern Illinois University School Of Medicine Therapeutic use of d-methionine to reduce the toxicity of platinum-containing anti-tumor compounds
US6361938B1 (en) 1996-11-08 2002-03-26 Elan Corporation, Plc Peptides which enhance transport across tissues and methods of identifying and using the same
WO1998023781A1 (en) 1996-11-26 1998-06-04 Johns Hopkins University Ligand detection system and methods of use thereof
US5989814A (en) * 1997-04-01 1999-11-23 Reagents Of The University Of California Screening methods in eucaryotic cells
US5880261A (en) * 1997-04-03 1999-03-09 Waeber; Gerard Transcription factor Islet-Brain 1 (IB1)
AU6972798A (en) 1997-04-18 1998-11-13 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Inhibition of hiv-1 replication by a tat rna-binding domain peptide analog
US6043083A (en) 1997-04-28 2000-03-28 Davis; Roger J. Inhibitors of the JNK signal transduction pathway and methods of use
EP1019071A4 (en) 1997-05-15 2003-07-30 Cytogen Corp Arbitrary peptides which transport receptors of the gastro-intestinal tract bind and process with it
US20040152084A1 (en) 2003-01-31 2004-08-05 Slattum Paul M. Compounds and processes for single-pot attachment of a label to nucleic acid
EP0975370B9 (en) * 1997-05-21 2004-11-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Composition and method for enhancing transport across biological membranes
FR2767323B1 (fr) 1997-08-12 2001-01-05 Synt Em Peptides lineaires derives de peptides antibiotiques, leur preparation et leur utilisation pour vectoriser des substances actives
EP0897002A3 (en) 1997-08-14 2001-10-04 Smithkline Beecham Plc U62317, a protein having a JNK-binding domain
AU9402898A (en) 1997-09-26 1999-04-23 Washington University Cell death agonists
US6420031B1 (en) 1997-11-03 2002-07-16 The Trustees Of Princeton University Highly transparent non-metallic cathodes
PL340412A1 (en) 1997-10-20 2001-01-29 Hoffmann La Roche Bicyclic kinase inhibitors
US6270956B1 (en) * 1997-12-11 2001-08-07 The Salk Institute For Biological Studies Transcriptional coactivator that interacts with Tat protein and regulates its binding to TAR RNA, methods for modulating Tat transactivation, and uses therefor
EP0947524A1 (en) 1998-03-30 1999-10-06 Upither B.V. Novel peptides for the treatment of autoimmune diseases
US6248558B1 (en) 1998-03-31 2001-06-19 Vanderbilt University Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity
EP1082310A4 (en) 1998-04-29 2001-09-12 Univ Georgetown METHODS RELATING TO THE IDENTIFICATION AND USE OF COMPOUNDS THAT BIND TO HLA MOLECULES AS AGONISTS OR ANTAGONISTS TO HLA
JP2002514430A (ja) * 1998-05-13 2002-05-21 インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド ヒト・アポトーシス関連タンパク質
US6811992B1 (en) 1998-05-14 2004-11-02 Ya Fang Liu Method for identifying MLK inhibitors for the treatment of neurological conditions
WO1999058561A1 (fr) 1998-05-14 1999-11-18 Pasteur Merieux Serums & Vaccins Mimotopes du virus de l'hepatite c
WO1999066061A1 (fr) * 1998-06-18 1999-12-23 Dnavec Research, Inc. Phage de transfert d'acide nucleique
US6348185B1 (en) * 1998-06-20 2002-02-19 Washington University School Of Medicine Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy
US6589503B1 (en) 1998-06-20 2003-07-08 Washington University Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy
CN1330675A (zh) 1998-08-28 2002-01-09 格莱风科学公司 精确长度的聚酰胺链、其制备方法和其与蛋白质的缀合物
EP1126855B1 (en) * 1998-09-25 2007-05-09 Cephalon, Inc. Use of fused pyrrolocarbazoles for preventing/treating damage to sensory hair cells and cochlear neurons
US6656474B1 (en) 1999-01-15 2003-12-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of using a neurotrophin and its analogues for the treatment of gastrointestinal hypomotility disorders
US6673908B1 (en) 1999-02-22 2004-01-06 Nuvelo, Inc. Tumor necrosis factor receptor 2
EP1181306A4 (en) 1999-05-28 2003-06-18 Apoptosis Technology Inc COMPOUNDS AND METHODS FOR REGULATING APOPTOSIS, AND METHODS OF MAKING AND SCREENING REGULATORY COMPOUNDS FOR APOPTOSIS
US7510824B2 (en) * 1999-06-02 2009-03-31 Nono Inc. Method of screening peptides useful in treating traumatic injury to the brain or spinal cord
AU5316900A (en) * 1999-06-03 2000-12-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of c-jun n-terminal kinases (jnk)
DK1102785T3 (da) * 1999-06-07 2013-05-13 Arrowhead Res Corp Sammensætninger til lægemiddeltilførsel ved anvendelse af pH-følsomme molekyler
US6669951B2 (en) 1999-08-24 2003-12-30 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
US6593292B1 (en) 1999-08-24 2003-07-15 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
US20030104622A1 (en) * 1999-09-01 2003-06-05 Robbins Paul D. Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
US6881825B1 (en) * 1999-09-01 2005-04-19 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Identication of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and virues
US20040082509A1 (en) 1999-10-12 2004-04-29 Christophe Bonny Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US20030108539A1 (en) 2000-02-14 2003-06-12 Christophe Bonny Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US8183339B1 (en) 1999-10-12 2012-05-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US6866843B2 (en) 1999-12-06 2005-03-15 Viacell, Inc. Method of transplanting in a mammal and treating diabetes mellitus by administering a pseudo-islet like aggregate differentiated from a nestin-positive pancreatic stem cell
US6586403B1 (en) * 2000-07-20 2003-07-01 Salpep Biotechnology, Inc. Treating allergic reactions and inflammatory responses with tri-and dipeptides
US6897231B2 (en) * 2000-07-31 2005-05-24 Signal Pharmaceuticals, Inc. Indazole derivatives as JNK inhibitors and compositions and methods related thereto
JP4387669B2 (ja) * 2000-10-13 2009-12-16 ザイジェン エス．アー． 新規なトランスポーターペプチド配列による生物学的エフェクターの細胞内送達
US7033597B2 (en) 2000-10-13 2006-04-25 Université de Lausanne Intracellular delivery of biological effectors
WO2002032437A1 (en) 2000-10-17 2002-04-25 Diatranz Limited Preparation and xenotransplantation or porcine islets
US7199124B2 (en) 2001-02-02 2007-04-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited JNK inhibitor
US20030077826A1 (en) 2001-02-02 2003-04-24 Lena Edelman Chimeric molecules containing a module able to target specific cells and a module regulating the apoptogenic function of the permeability transition pore complex (PTPC)
US20030091640A1 (en) 2001-02-08 2003-05-15 Srinivasan Ramanathan Enhanced oral and transcompartmental delivery of therapeutic or diagnostic agents
AU2002306500C1 (en) 2001-02-16 2006-09-28 Cellgate, Inc. Transporters comprising spaced arginine moieties
DE60215626T2 (de) 2001-04-06 2007-08-30 Thomas Jefferson University Antagonist für die multimerisierung von hiv-1 vif-protein
DE10117281A1 (de) 2001-04-06 2002-10-24 Inst Molekulare Biotechnologie Peptid zur Diagnose und Therapie der Alzheimer-Demenz
WO2003008553A2 (en) 2001-07-17 2003-01-30 Incyte Genomics, Inc. Proteins associated with cell growth, differentiation, and death
NZ531378A (en) * 2001-09-19 2006-11-30 Aventis Pharma S Indolizines as kinase protein inhibitors suitable for treating solid tumours
CA2471762C (en) * 2002-01-09 2010-08-17 University Of Lausanne Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
WO2003075917A1 (en) 2002-03-08 2003-09-18 Signal Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating, preventing or managing proliferative disorders and cancers
SE0201863D0 (en) 2002-06-18 2002-06-18 Cepep Ab Cell penetrating peptides
WO2004022580A2 (en) 2002-09-09 2004-03-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bh3 peptides and method of use thereof
WO2004026406A1 (en) * 2002-09-20 2004-04-01 Alcon, Inc. Use of cytokine synthesis inhibitors for the treatment of dry eye disorders
EP1408114B1 (de) 2002-10-11 2007-01-03 Imvision GmbH Moduläre Antigen-Transporter Moleküle (MAT-Moleküle) zur Modulierung von Immunreaktionen, zugehörige Konstrukte, Verfahren und Verwendungen
WO2004037196A2 (en) 2002-10-24 2004-05-06 Sangstat Medical Corporation Cytomodulating peptides and methods for treating neurological disorders
EP1578365A4 (en) 2002-11-14 2009-09-23 Arbor Vita Corp MOLECULAR INTERACTIONS IN NEURONS
BR0316256A (pt) 2002-11-18 2005-10-04 Celgene Corp Métodos de inibir a produção de tnf-alfa e a atividade de pde4, de tratar ou prevenir uma doença ou um distúrbio, de controlar os nìveis de camp em uma célula e de produzir um composto, composição farmacêutica e composto
US20050019366A1 (en) 2002-12-31 2005-01-27 Zeldis Jerome B. Drug-coated stents and methods of use therefor
US7166692B2 (en) 2003-03-04 2007-01-23 Canbrex Bio Science Walkersville, Inc. Intracellular delivery of small molecules, proteins, and nucleic acids
JP4787150B2 (ja) * 2003-03-06 2011-10-05 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 Ｊｎｋ阻害剤
US20080090770A1 (en) 2003-04-11 2008-04-17 Belmares Michael P Modulation of Muc1 Mediated Signal Transduction
DK2351844T3 (da) * 2003-04-29 2014-09-22 Sarepta Therapeutics Inc Præparater til forøgelse af transport- og antisense-effektivitet af nukleinsyreanalog i celler
EP1732581A4 (en) 2003-06-20 2008-06-04 Univ California San Diego POLYPEPTIDE TRANSDUCTION AND FUSOGENIC PEPTIDES
KR100685345B1 (ko) 2004-03-27 2007-02-22 학교법인조선대학교 세포사 유도 펩타이드
BRPI0509755A (pt) 2004-04-08 2007-10-16 Applied Research Systems composição compreendendo um inibidor de jnk e ciclosporina
JP2008510766A (ja) 2004-08-27 2008-04-10 ゲーペーツェー ビオテック アーゲー ピリミジン誘導体
US20060094753A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Alcon, Inc. Use of inhibitors of Jun N-terminal kinases for the treatment of glaucomatous retinopathy and ocular diseases
EP1656951A1 (en) 2004-11-12 2006-05-17 Xigen S.A. Conjugates with enhanced cell uptake activity
EP1676574A3 (en) 2004-12-30 2006-07-26 Johnson &amp; Johnson Vision Care, Inc. Methods for promoting survival of transplanted tissues and cells
US20060223807A1 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 University Of Massachusetts Medical School, A Massachusetts Corporation Therapeutic methods for type I diabetes
US20070015779A1 (en) 2005-04-29 2007-01-18 John Griffin Compositions and treatments for inhibiting kinase and/or hmg-coa reductase
US20060258706A1 (en) * 2005-04-29 2006-11-16 Manohar Saindane Solid forms of a JNK inhibitor
US20070003531A1 (en) * 2005-06-30 2007-01-04 University Of Connecticut Methods for improving immunotherapy by enhancing survival of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes
US8080517B2 (en) * 2005-09-12 2011-12-20 Xigen Sa Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
WO2007031098A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
US10045953B2 (en) * 2006-07-06 2018-08-14 Case Western Reserve University Ceramide composition and method of use
US20080051410A1 (en) 2006-08-02 2008-02-28 Northwestern University Protein Kinase Targeted Therapeutics
JP5325783B2 (ja) 2006-09-08 2013-10-23 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ベンゾトリアゾールキナーゼモジュレーター
WO2008034161A1 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Phylogica Limited Neuroprotective peptide inhibitors of ap-1 signaling and uses therefor
GB0702259D0 (en) 2007-02-06 2007-03-14 Eisai London Res Lab Ltd 7-azaindole derivatives
EP2285364B1 (en) 2008-05-07 2015-01-21 The Regents of The University of California Therapeutic replenishment and enrichment of ocular surface lubrication
WO2009143865A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2009143864A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Xigen S.A. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory digestive diseases
US20100183633A1 (en) 2008-12-04 2010-07-22 University Of Massachusetts Interleukin 6 and tumor necrosis factor alpha as biomarkers of jnk inhibition
US20120101046A1 (en) 2009-03-30 2012-04-26 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Prophylactic or therapeutic agent for retinal disease and method for prophylaxis or therapy of retinal disease using jnk (c-jun amino-terminal kinase) - inhibitory peptide, and use of the peptide
WO2011160653A1 (en) 2010-06-21 2011-12-29 Xigen S.A. Novel jnk inhibitor molecules
US9150618B2 (en) 2010-10-14 2015-10-06 Xigen Inflammation Ltd. Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory eye diseases
PL2627346T3 (pl) 2010-10-14 2016-11-30 Przechodzące przez komórkę peptydowe inhibitory szlaku przekazywania sygnałów przez JNK do zastosowania w leczeniu zapalenia błony naczyniowej oka
US8471027B2 (en) 2011-04-06 2013-06-25 Hoffmann-La Roche Inc. Adamantyl compounds
WO2013091670A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Xigen S.A. Novel jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
WO2014206426A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Xigen Inflammation Ltd. New use for jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001027268A2 (en) * 1999-10-12 2001-04-19 University Of Lausanne Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARR R.K. ET AL.: "IDENTIFICATION OF THE CRITICAL FEATURES OF A SMALL PEPTIDE INHIBITOR OF JNK ACTIVITY", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, THE AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, INC., US, vol. 277, no. 13, 29 March 2002 (2002-03-29), pages 10987-10997, XP001155759, ISSN: 0021-9258, table 1 *
BONNY CHRISTOPHE ET AL.: "Targeting the JNK pathway as a therapeutic protective strategy for nervous system diseases", REVIEWS IN THE NEUROSCIENCES. 2005, vol, 16, no. 1, 2005, pages 57-67, XP009061133, ISSN: 0334-1763, the whole document *
BONNY S. ET AL.: "Cell-permeable peptide inhibitors of JNK: novel blockers of beta-cell death", DIABETES, NEW YORK, NY, US, vol. 50, no. 1, January 2001 (2001-01), pages 77-82, XP002274267, ISSN: 0012-1797, the whole document *
BORSELLO TIZIANA ET AL.: "A peptide inhibitor of c-Jun N-terminal kinase protects against excitotoxicity and cerebral ischemia", NATURE MEDICINE. SEP 2003, vol. 9, no. 9, September 2003 (2003-09), pages 1180-1186, XP002366119, ISSN: 1078-8956, the whole document *
BORSELLO TIZIANA ET AL.: "Use of cell-permeable peptides to prevent neuronal degeneration", TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE. MAY 2004, vol. 10, no. 5, May 2004 (2004-05), pages 239-244, XP002366120, ISSN: 1471-4914, the whole document *
DATABASE UniProt, 28 February 2003 (2003-02-28), XP002366175, retrieved from EBI, Database accession no. Q9WVI9, abstract *
VIVES E. ET AL.: "A TRUNCATED HIV-1 TAT PROTEIN BASIC DOMAIN RAPIDLY TRANSLOCATES THROUGH THE PLASMA MEMBRANE AND ACCUMULATES IN THE CELL NUCLEUS", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM, US, vol. 272, no. 25, 1997, pages 16010-16017, XP002931299, ISSN: 0021-9258, figure 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
HUE029132T2 (en) 2017-02-28
IL189133A0 (en) 2008-08-07
AU2006291541B2 (en) 2012-04-12
JP5386169B2 (ja) 2014-01-15
EP1928903B1 (en) 2012-05-30
US8748395B2 (en) 2014-06-10
SI2418217T1 (sl) 2016-06-30
HRP20120598T1 (hr) 2012-08-31
RS52379B (en) 2012-12-31
KR101305533B1 (ko) 2013-09-06
CA2621337A1 (en) 2007-03-22
EP2418217A1 (en) 2012-02-15
WO2007031280A3 (en) 2007-05-24
EA200800680A1 (ru) 2008-12-30
ES2567708T3 (es) 2016-04-26
US20090305968A1 (en) 2009-12-10
ME02000B (me) 2015-05-20
IL237984A0 (en) 2015-05-31
KR20080052586A (ko) 2008-06-11
US9290538B2 (en) 2016-03-22
NO342272B1 (no) 2018-04-30
ME02426B (me) 2016-09-20
CA2621337C (en) 2014-09-23
SI1928903T1 (sl) 2012-09-28
IL189133A (en) 2015-04-30
JP5727393B2 (ja) 2015-06-03
PL2418217T3 (pl) 2017-03-31
EP3012266A1 (en) 2016-04-27
ES2388076T3 (es) 2012-10-08
UA98101C2 (ru) 2012-04-25
AU2006291541A1 (en) 2007-03-22
CN101263157A (zh) 2008-09-10
US20200062805A1 (en) 2020-02-27
DK2418217T3 (en) 2016-03-21
JP2015034171A (ja) 2015-02-19
CN101263157B (zh) 2012-11-07
US20160264630A1 (en) 2016-09-15
BRPI0616824B1 (pt) 2020-10-27
CY1117351T1 (el) 2017-04-26
BRPI0616824B8 (pt) 2021-05-25
JP2009507502A (ja) 2009-02-26
WO2007031098A1 (en) 2007-03-22
DK1928903T3 (da) 2012-08-20
HK1118841A1 (en) 2009-02-20
NO20081664L (no) 2008-04-04
US20170320917A1 (en) 2017-11-09
PL1928903T3 (pl) 2012-10-31
ZA200800848B (en) 2009-05-27
PL2418217T4 (pl) 2017-11-30
HK1223948A1 (zh) 2017-08-11
CY1112924T1 (el) 2016-04-13
WO2007031280A2 (en) 2007-03-22
JP2012095657A (ja) 2012-05-24
EP1928903A2 (en) 2008-06-11
BRPI0616824A2 (pt) 2011-07-05
US20140200187A1 (en) 2014-07-17
PT1928903E (pt) 2012-07-02
EP2418217B1 (en) 2016-01-27
HRP20160379T1 (hr) 2016-05-20
RS54701B1 (en) 2016-08-31
HK1163712A1 (zh) 2012-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014330B1 (ru) Пептидные ингибиторы пути трансдукции сигнала jnk, обладающие способностью проникать в клетку
EP1895005B1 (en) Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US8080517B2 (en) Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US8278413B2 (en) Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
ES2473274T3 (es) Péptidos con permeabilidad celular inhibidores de la ruta de transducción de señales de la JNK
AU2012203529B2 (en) Cell-Permeable Peptide Inhibitors of the JNK Signal Transduction Pathway
JP2005287418A (ja) 細胞殺傷性と細胞死防御性とを併せもつペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment