ES2473274T3 - Péptidos con permeabilidad celular inhibidores de la ruta de transducción de señales de la JNK - Google Patents

Abstract

Utilización de cualquiera de los péptidos que incluyen la SEQ ID NO: 22 o que es la SEQ ID NO: 24, o de péptidos que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia con estos péptidos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno neuronal mediante la inhibición de la muerte celular neuronal en un sujeto, donde el sujeto sufre o está en riesgo de desarrollar un trastorno neuronal y donde el trastorno neuronal es un trastorno neurodegenerativo seleccionado de entre esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, esclerosis múltiple y enfermedad de Huntington.

Description

Péptidos con permeabilidad celular inhibidores de la ruta de transducción de señales de la JNK

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En general, esta invención se refiere a inhibidores de la proteína-quinasa y, de forma más específica, a inhibidores de la proteína-quinasa c-Jun amino terminal quinasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La quinasa c-Jun amino terminal (JNK) es un miembro del grupo activado por estrés de las proteínas quinasas mitogeno-activadas (MAP). Estas quinasas están implicadas en el control del crecimiento y de la diferenciación celular, y, en general, en la respuesta de las células a los estímulos ambientales. La ruta de transducción de señales de la JNK es activada en respuesta al estrés ambiental y mediante varios tipos de receptores de la superficie celular. Estos receptores pueden incluir los receptores de citoquinas, receptores de serpentinas y receptor de la tirosina-quinasa. En las células de mamíferos, la JNK está involucrada en procesos biológicos tales como la transformación oncogénica y en la mediación de respuestas adaptivas al estrés ambiental. La JNK se ha asociado también a la modulación de las respuestas inmunes, incluidas la maduración y diferenciación de las células inmunes, así como a la muerte celular programada en células identificadas como para ser destruidas por el sistema inmune.

La WO 98/49188 describe péptidos inhibidores de la proteína JNK1 para el tratamiento de trastornos neuronales, por ejemplo la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o daños debidos a isquemias/reperfusión.

La WO 01/27268 describe inhibidores de la proteína JNK1 para el tratamiento de la isquemia y reperfusión y para prevenir la muerte celular pancreática.

La WO 98/44106 describe el uso de polipéptidos IB1 para el tratamiento, entre otros, de la diabetes, la isquemia y o de enfermedades neurológicas como la enfermedad de Parkinson.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se base en parte en el descubrimiento de péptidos que son inhibidores eficaces de las proteínas JNK. Los péptidos mencionados aquí como inhibidores peptídicos de JNK disminuyen los efectos proliferativos en las células quot;aguas abajoquot; de la quinasa c-Jun amino terminal (JNK).

En consecuencia, la invención incluye el uso de péptidos inhibidores de JNK (“péptidos JNKI”), tal como se define en la reivindicación 1.

Los péptidos inhibidores de JNK pueden estar presentes como polímeros de L-aminoácidos. Alternativamente, los péptidos inhibidores pueden estar presentes como polímeros de D-aminoácidos

También se incluyen en la descripción composiciones farmacéuticas que incluyen los péptidos de unión a JNK así como anticuerpos que reconocen específicamente los péptidos de unión a JNK.

La invención también proporciona un método para inhibir la expresión de una JNK-quinasa en una célula.

En otro aspecto, la descripción proporciona un método para tratar una patofisiología asociada a la activación de JNK en un o más células. Por ejemplo, las células diana pueden ser células animales cultivadas, células humanas o microorganismos. El suministro se puede llevar a cabo in vivo mediante la administración de un péptido quimérico a un individuo en el cual se va a usar con fines de diagnóstico, prevención o terapéuticos. Las células diana pueden ser células in vivo, esto es células que componen los órganos o tejidos de animales

o humanos vivos, o microorganismos que se encuentran en animales o humanos vivos.

La descripción también proporciona un método para prevenir o tratar la pérdida de audición en un sujeto. El método incluye administrar al sujeto péptidos bioactivos con permeabilidad celular que previenen el daño a los estereocilios de las células ciliadas, la apoptosis de las células cicliadas o la apoptosis neuronal. Un péptido bioactivo con permeabilidad celular es, por ejemplo, un péptido inhibidor de JNK. Preferentemente, el péptido bioactivo con permeabilidad celular tiene las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15 o 16.

La pérdida de audición puede ser causada por un trauma acústico. Así, en un aspecto, el péptido se administra antes de que el sujeto esté expuesto a un trauma acústico. En otro aspecto, el péptido es administrado después de que el sujeto ha sido expuesto a un trauma acústico. El trauma acústico puede ser,

por ejemplo, de al menos 90 dB SPL. Alternativamente, la pérdida de audición está provocada por un tratamiento con antibióticos. Así, en un aspecto, el péptido se administra antes de que el sujeto esté expuesto a un antibiótico. En otro aspecto, el péptido se administra después de que el sujeto ha estado expuesto a un antibiótico. El antibiótico es, por ejemplo, un aminoglicósido.

La pérdida de audición puede ser causada por un agente quimioterapéutico. Así, en un aspecto, el péptido se administra antes de que el sujeto esté expuesto a un agente quimioterapéutico. En otro aspecto, el péptido se administra después de que el sujeto ha estado expuesto a un agente quimioterapéutico.

La descripción además proporciona un método para prevenir o tratar la muerte neuronal o lesiones cerebrales e un sujeto. El método incluye administrar al sujeto un péptido bioactivo con permeabilidad celular que previene el daño a las neuronas o la apoptosis neuronal. Un péptido bioactivo con permeabilidad celular es, por ejemplo, un péptido inhibidor de JNK (JNKI). Preferentemente, el péptido bioactivo con permeabilidad celular tiene las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 21-28.

La muerte neuronal o las lesiones cerebrales están provocadas por una isquemia cerebral. Así, en un aspecto, el péptido se administra antes de que el sujeto sufra un evento isquémico. En otro aspecto, el péptido se administra después de que el sujeto sufre un evento isquémico. El evento isquémico es, por ejemplo, agudo o crónico.

La muerte neuronal o las lesiones cerebrales están causadas por otros mecanismos excitotóxicos. Así, en un aspecto, el péptido se administra antes de que el sujeto experimente un mecanismo excitotóxico. En otro aspecto, el péptido se administra después de que el sujeto experimenta un mecanismo excitotóxico. El mecanismo excitotóxico puede ser, por ejemplo, un daño cerebral isquémico/hipóxico, daños cerebrales traumáticos, muerte neuronal derivada de ataques epilépticos y diversos trastornos neurodegenerativos, como la Enfermedad de Alzheimer.

La descripción también contempla un método para inhibir la muerte celular de los islotes pancreáticos, incluyendo el método poner en contacto una célula del islote pancreático con un péptido bioactivo con permeabilidad celular de forma que se inhiba tal muerte celular pancreática. Un péptido bioactivo con permeabilidad celular es, por ejemplo, un péptido inhibidor de JNK. Preferentemente, el péptido bioactivo con permeabilidad celular tiene las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 21-28. El método puede incluir además poner en contacto la célula con colagenasa.

Adicionalmebte, la descripción también contempla un método para inhibir la muerte celular de los islotes pancreáticos en un sujeto mediante la administración al sujeto de un péptido bioactivo con permeabilidad celular de forma que se inhiba tal muerte celular pancreática. Un péptido bioactivo con permeabilidad celular es, por ejemplo, un péptido inhibidor de JNK. Preferentemente, el péptido bioactivo con permeabilidad celular tiene las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 21-28. El método puede incluir además poner en contacto la célula con colagenasa. En una realización, el péptido bioactivo con permeabilidad celular se administra antes de que el sujeto esté expuesto a una citoquina pro-inflamatoria. En otra realización, el péptido bioactivo con permeabilidad celular se administra después de que el sujeto se haya expuesto a una citoquina pro-inflamatoria

En algunos aspectos, la administración de los péptidos puede realizarse mediante cualquier vía de administración seleccionada de entre administración intraauricular, intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral y en parche.

Entre las ventajas proporcionadas por la invención, una de ellas es que los péptidos inhibidores de JNK son pequeños y se pueden producir fácilmente en cantidades masivas y con gran pureza. Los péptidos inhibidores son también resistentes a la degradación intracelular y son escasamente inmunogénicos. En consecuencia, los péptidos se adaptan bien a aplicaciones in vitro e in vivo en las cuales se desea la inhibición de la expresión de JNK.

Salvo definido de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un especialista en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o pruebas de la presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, se describen a continuación los métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, regirá la presente descripción, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos y en ningún caso limitativos.

Otras características y ventajas de la invención se evidenciarán a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1A-C: diagramas que muestran alineaciones de regiones de dominios conservados de JBD en los factores de transcripción indicados.

Fig. 2: diagrama que muestra alineaciones de péptidos de fusión TAT-IB genéricos.

Fig. 3: histograma que describe la inhibición de la muerte de células-� por un dominio JBD de mínimo de 23 aminoácidos de longitud de IB1 en comparación con el dominio de JBD completo de 280 aminoácidos.

Fig. 4: es una ilustración que demuestra los efectos de los péptidos TAT, TAT-IB1 y TAT-IB2 sobre la fosforilación de las JNKs recombinantes. El panel A muestra la inhibición de la fosforilación de c-Jun, ATF2 y Elk1 por las JNKs recombinantes in vitro. El panel B muestra experimentos dosis-respuesta similares al Panel A.

Fig. 5: histograma que describe la inhibición de la fosforilación de L-TAT-IB por JNKs recombinantes. El panel A muestra la inhibición de L-TAT-IB de la fosforilación de c-Jun, ATF2 y Elk1 por las JNKs recombinantes in vitro en presencia de MKK4. El panel B muestra experimentos dosis-respuesta similares con MKK7.

Fig. 6: es una ilustración que demuestra la inhibición de la fosforilación de c-Jun por JNKs activadas.

Fig. 7: histograma que describe la inhibición a corto plazo de la muerte de células-� pancreáticas inducidas por IL-1� por los péptidos L-TAT-IB.

Fig. 8: histograma que describe la inhibición a corto plazo de la muerte de células-� pancreáticas inducidas por IL-1� por los péptidos D-TAT-IB.

Fig. 9: histograma que describe la inhibición a largo plazo o la muerte de células-� pancreáticas inducidas por IL-1� por los péptidos L-TAT-IB1 y D-TAT-IB1.

Fig. 10: histograma que describe la inhibición de la muerte de las células WiDr de cáncer de colón humano inducida por irradiación por los péptidos L-TAT-IB1 y D-TAT-IB1.

Fig. 11: es una ilustración de la modulación de la actividad de la quinasa JNK por los péptidos L-TAT, TAT-IB1 y D-TAT-IB1.

Fig. 12: gráficos que describen los efectos protectores de los péptidos TAT-IB1 en ratones. El panel A muestra el efecto de la irradiación sobre el peso. El panel B muestra el efecto de la irradiación sobre un estado de edema y eritema.

Fig. 13: describe el efecto protector de D-JNK1 sobre la pérdida de audición inducida por ruido. El panel A muestra una descripción esquemática del experimento, el panel B muestra un gráfico de la pérdida de audición, los paneles C y D describen un examen histológico de un oído contralateral (control) e inyectado con D-JNK1 respectivamente.

Fig. 14A y B: describen el efecto protector de D-JNK1 sobre la pérdida de audición inducida por antibióticos.

Fig. 15: gráfico de barras que describe un aumento de la recuperación de los islotes pancréaticos sometidos al tratamiento con D-JNK1 durante el procedimiento de aislamiento.

Fig. 16A: ilustración que demuestra la sensibilidad y especificidad de los péptidos inhibidores de la JNK (JNKI) de la presente invención con respecto a la activación y acción de la JNK. La Fig. 16A demuestra el efecto inhibidor de L-JNKI1 y D-JNKI1 sobre la activación y acción de JNK en ensayos de quinasa respectivamente con JNK1a1 y sustratos de GST-Jun y GST-Elk1.

Fig. 16B: ilustración que demuestra la sensibilidad y especificidad de los péptidos inhibidores de la JNK (JNKI) de la presente invención con respecto a la activación y acción de la JNK. La Fig. 16B demuestra el efecto inhibidor de la secuencia inhibidora mínima de JNK de 20 aminoácidos de JIP-IB1 (forma-L de JBD20) en experimentos dosis-respuesta utilizando condiciones similares a las de la Fig. 16A y con cantidades decrecientes de L-JBD20.

Fig. 16C: ilustración que demuestra la sensibilidad y especificidad de los péptidos inhibidores de la JNK (JNKI) de la presente invención con respecto a la activación y la acción de la JNK. La Fig. 16C demuestra la especificidad de los péptidos JNKI de la presente invención en el bloqueo de la activación de JNK por medio de ensayos de quinasa con distintas quinasas recombinantes.

Fig. 17A: ilustración que demuestra la activación de JNK inducida por N-metil-D-aspartato (NMDA) en neuronas no tratadas (0) y en neuronas expuestas a NMDA 100 μM durante 10 minutos (10') o durante 30 minutos (30').

Fig. 17B: ilustración que demuestra los efectos de los péptidos JNKI de la presente invención a nivel de la fosforilación de c-Jun y la cantidad de JNK después de su exposición a NMDA. En la Fig. 17B, se cargó 4 veces más proteína en los extractos nucleares (Nucl) que en los citoplásmicos (Cyt), las abreviaturas empleadas son: C: Control; N: NMDA; L: L-JNI1 + NMDA; D: D-JNKI1 + NMDA.

Fig. 17C: histograma que describe la cuantificación de la expresión de c-fos por PCR en tiempo real utilizando ARN extraído. La Fig. 17C ilustra la expresión de c-fos relatica a la actina.

Fig. 18: ilustraciones y un histograma que describen el período de neurotoxicidad y neuroprotección de NMDA por L-JNKI1, D-JNKI1 y dos péptidos de control, TAT-vacío (la secuencia de TAT sola, sin JBD20) y L-JNKI1-mut (donde 6 aminoácidos han sido mutados a alanina).

Fig. 18A-18E: una serie de micrográficos que describen neuronas teñidas con Hoechst 24 horas después del tratamiento con NMDA. Fig. 18F: histograma que describe la muerte neuronal 12, 24 y 48 horas después de su exposición a

NMDA (100 IM NMDA) tal como lo indica la actividad de LDH. Fig. 19: ilustraciones y un histograma que describen la isquemia transitoria en ratones. Fig. 19A: demuestra el efecto sobre el volumen infartado de un pretratamiento en el cual se

administró una inyección intracerebroventricular (icv) de D-JNKI1 (15,7 ng en 2 Il de solución de tampón fosfato (PBS)) a un sujeto 1 hora antes de la oclusión. Fig. 19B: demuestra el efecto sobre el volumen infartado cuando la inyección icv de D-JNKI1 se administra 1 hora antes de la oclusión o 3, 6 y 12 horas después de la oclusión.

Fig. 20: ilustraciones y un histograma que demuestran la protección por D-JNKI1 contra la isquemia focal permanente en ratas jóvenes (P14) que habían sido sometidas a perfusión 24 horas después de la oclusión.

Fig. 20A: una serie de ilustraciones que describe ejemplos de lesiones en una rata control (panel de la izquierda) y una rata tratada con D-JNKI1 6 horas después de la oclusión (panel de la derecha).

Fig. 20B: histograma que describe los volúmenes infartado, expresados en % de volumen hemisférico, después de la inyección intraperitoneal (i.p.) de D-JNKI1 -0,5 hora antes o +6 ó +12 horas después de la oclusión.

Fig. 20C: una serie de ilustraciones que describe los resultados de la inmunohistoquímica para una Pc-Jun en la que se fosforiló c-Jun en numerosas neuronas en la corteza peri-infartada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención en parte se basa en el descubrimiento de péptidos con permeabilidad celular que inhiben la ruta de señales de la quinasa c-Jun amino terminal (JNK) activada. Estos péptidos se denominan aquí péptidos inhibidores de la JNK. Adicionalmente, este descubrimiento proporciona métodos y composiciones farmacéuticas para tratar patofisiologías asociadas a la señalización de JNK.

Los péptidos inhibidores de la JNK fueron identificados mediante la inspección de alineaciones de secuencias entre los Dominios de Unión de kJNK en diversas proteínas de unión a insulina (IB). Los resultados de esta alineación se muestran en las Figs. 1A-1C. La Fig. 1A describe la región de más alta homología entre los JBDs de IB1, IB2, c-Jun y ATF2. El panel B describe la alineación de secuencias de aminoácidos de los JBDs de IB1 e IB2. Los residuos totalmente conservados se indican mediante asteriscos, mientras que los residuos cambiados a Ala en el vector GFP-JBD23Mut se indican mediante círculos en blanco. La Fig. 1C muestra las secuencias de aminoácidos de las proteínas quiméricas que incluyen un dominio de péptidos inhibidor de la JNK y un dominio de tráfico. En el ejemplo mostrado, el dominio de tráfico procede del polipéptido TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el péptido inhibidor de la JNK procede de un polipéptido IB1. Las secuencias de humanos, ratón y rata son idénticas en los Paneles B y C.

La comparación de las secuencias entre los dominios de unión de JNK de IB1 [SEQ ID NO:17], IB2 [SEQ ID NO:18], c-Jun [SEQ ID NO:19] y ATF2 [SEQ ID NO:20] revelaron una secuencia de 8 aminoácidos parcialmente conservados (FIG. 1A). Una comparación de los JBDs de IB1 e IB2 reveló además dos bloques de siete y tres aminoácidos que están altamente conservados entre las dos secuencias. Estos dos bloques están contenidos en una secuencia peptídica de 23 aminoácidos en IB1 [SEQ ID NO:1] y 21 aminoácidos en IB2 [SEQ ID NO:2]. La secuencia inhibidora minima de JNK de 20 aminoácidos de JIP-IB1 (forma-L de JBD20 (SEQ ID NO:21)) se muestra en la Fig. 1C.

Los péptidos inhibidores de la JNK se pueden utilizar en cualquier situación donde se desea una inhibición de la actividad de JNK. Esto incluye aplicaciones in vitro, ex vivo e in vivo. Como las JNKs y todas sus isoformas participan en el desarrollo y establecimiento de estados patológicos o en rutas, los péptidos de JNK se pueden utilizar para prevenir o inhibir que se produzcan tales estados patológicos. Esto incluye la prevención y el tratamiento de enfermedades y la prevención y el tratamiento de condiciones secundarias a acciones terapéuticas. Por ejemplo, los péptidos pueden emplearse para tratar o prevenir, por ejemplo, la diabetes, radiación ionizante, respuestas autoinmunes (incluyendo enfermedades autoinmunes) daños isquémicos/reperfusión, hipertrofias cardiacas y cardiovasculares y algunos cánceres (por ejemplo transformación Bcr-Abl).

Los péptidos también pueden utilizarse para inhibir la expresión de genes cuya expresión aumenta en presencia de un polipéptido JNK activo. $Estos genes y productos génicos incluyen, por ejemplo, citoquinas pro-inflamatorias. Tales citoquinas se encuentran en todas las formas de enfermedades inflamatorias, autoinflamatorias, inmunes y autoinmunes, en enfermedades degenerativas, miopatías, cardiomiopatías y rechazo de injertos.

Los péptidos inhibidores de JNK aquí descritos también pueden emplearse para tratar o prevenir efectos asociados al estrés celular por cizalla tales como en estados patológicos inducidos por hipertensión arterial, incluyendo hipertrofia cardíaca y lesiones arterioescleróticas, así como en bifurcaciones de los vasos sanguíneos y similares, radiación ionizante tal como la empleada en la radioterapia y con luz UV, radicales

5 libres, agentes perjudiciales para el ADN, incluyendo medicamentos de quimioterapia, transformación oncogénica, daño celular neuronal y pancreático, pérdida de oído, isquemia y reperfusión, hipoxia así como hipotermia e hipertermia.

Los polinucleótidos proporcionados por la presente invención se pueden emplear para expresar péptidos recombinantes con fines analíticos, de caracterización o terapéuticos; como marcadores para los tejidos

10 donde se expresan preferentemente los correspondientes péptidos (tanto constitutivamente como a una etapa particular de la diferenciación tisular o del desarrollo o en un estado de enfermedad). Otros usos de los ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, como marcadores de peso molecular en análisis de electroforesis en gel de ácidos nucleicos.

Los péptidos inhibidores de la JNK aquí descritos se muestran en la Tabla 1. La tabla presenta el nombre del

15 péptido inhibidor de JNK, así como su número identificador de secuencia, su longitud y su secuencia de aminoácidos.

Tabla 1

Péptido, nombre

SEQ ID AA Secuencia

L-IB1

1 23 DTYRPKRPTT LNLFPQVPRS QDT

L-IB2

2 21 EEPHKHRPTT LRLTTLGAQD S

D-IB1

3 23 TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR YTD

D-IB2

4 21 SDQAGLTTR LTTPRHKHPE E

L-IB (genérico)

5 19 XRPTTLXLXX XXXXXQDS/TX

D-IB (genérico)

6 19 XS/TDQXXXXXX XLXLTTPRX

L-TAT

7 10 GRKKRRQRRR

D-TAT

8 10 RRRQRRKKRG

L-genérico-TAT

9 17 XXXXRKKRRQ RRRXXXX

D-genérico-TAT

10 17 XXXXRRRQRR KKRXXXX

L-TAT-IB1

11 35 GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT

L-TAT-IB2

12 33 GRKKRRQRRR PPEEPHKHRP TTLRLTTLGA QDS

L-TAT-IB (genérico)

13 42 XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLX LXXXXXXXQD S/TX

D-TAT-IB1

14 35 TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR YTDPPRRRQR RKKRG

D-TAT-IB2

15 33 SDQAGLTTLR LTTPRHKHPE EPPRRRQRRK KRG

D-TAT-IB (genérico)

16 42 XT/SDQXXXXXX XLXLTTPRXX XXXXXXRRRQ RRKKRXXXXX XX

IB1-largo

17 29 PGTGCGDTYR PKRPTTLNLF PQVPRSQDT

IB2-largo

18 27 IPSPSVEEPH KHRPTTLRLT TLGAQDS

c-Jun

19 29 GAYGYSNPKI LKQSMTLNLA DPVGNLKPH

ATF2

20 29 TNEDHLAVHK HKHEMTLKFG PARNDSVIV

L-JBD20

21 20 RPKRPTTLNL FPQVPRSQDT

D-JBD20

22 20 TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR

L-TAT-JNKI1 (i.e. L-TAT-JBD20)

23 32 GRKKRRQRRR PPRPKRPTTL NLFPQVPRSQ DT

D-TAT-JNKI1 (i.e. D-TAT-JBD20)

24 32 TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR PPRRRQR RKKRG

L-TAT-JNKI1 (genérico)

25 34 XXXXRKKRRQ RRRXXXXRPT TLXLXXXXXX XQDS/T

D-TAT-JNKI1 (genérico)

26 34 S/TDQXXXXXXX LXLTTPRXXX XRRRQRRKKR XXXX

L-JBD20-mut

27 20 RPKRPTAANA FPQVPRSQDT

D-JBD20-mut

28 20 TDQSRPVAPF ANAATPRKPR

PÉPTIDOS INHIBIDORES DE JNK

20 La descripción proporciona un péptido inhibidor de la JNK. No se presupone por el término “péptido” ninguna longitud particular. En algunas formas, el péptido inhibidor de JNK es inferior a 280 aminoácidos de longitud, por ejemplo inferior o igual a 150, 100, 75, 50, 35 ó 25 aminoácidos de longitud. En varias formas, el péptido inhibidor de unión a JNK incluye la secuencia de aminoácidos de una o más de las SEQ ID NOs: 1-6 y 21-22. En una opción, los péptidos inhibidores de la JNK se unen a JNK. En otra opción, los péptidos inhiben la

25 activación de al menos un factor de transcripción activado por JNK, por ejemplo c-Jun, ATF2 o Elk1.

Ejemplos de péptidos inhibidores de JNK incluyen un péptido que comprende (en su totalidad o en parte) la secuencia NH2-DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT-COOH [SEQ ID NO:1]. En otra realización, el péptido incluye la secuencia NH2-EEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS-COOH [SEQ ID NO:2]. Alternativamente, ejemplos de péptidos inhibidores de JNK comprenden un péptido que incluye (en su totalidad o en parte) la secuencia NH2-RPKRPTTLNL FPQVPRSQDT-COOH [SEQ ID NO:21].

Los péptidos inhibidores de JNK pueden ser polímeros de L-aminoácidos, de D-aminoácidos o una combinación de ambos. Por ejemplo, en varias realizaciones los péptidos son péptidos retro-inversos D. El término quot;isómero retro-inversoquot; se refiere a un isómero de un péptido lineal en el que la dirección de la secuencia está invertida, el término “isómero D-retro-inverso” se refiere a un isómero de un péptido lineal en el que la dirección de la secuencia está invertida y la quiralidad de cada residuo aminoácido está invertida. Véase, por ejemplo, Jameson y col., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady y col., Nature, 368, 692-693 (1994). El resultado neto de combinar los enantiómeros D y la síntesis inversa es que las posiciones de los grupos carbonilo y amino de cada enlace amida se intercambian, mientras que la posición de los grupos de la cadena lateral en cada carbono alfa se conserva. Salvo que se estipule específicamente de otro modo, se supone que toda secuencia dada de L-aminoácidos de la invención se puede convertir en un péptido retroinverso D mediante la síntesis de un reverso de la secuencia para la secuencia nativa de L-aminoácidos correspondiente.

Por ejemplo, un péptido retro-inverso D tiene la secuencia NH2-TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD-COOH [SEQ ID NO: 3] ó NH2-SDQAGLTILRLTTPRHKHPEE-COOH [SEQ ID NO: 4]. Alternativamente, un péptido retroinverso D incluye la secuencia NH2-TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR-COOH [SEQ ID NO:22]. Se ha descubierto inesperadamente que los péptidos retro-inversos D tienen múltiples propiedades útiles. Por ejemplo, los péptidos D-TAT y D-TAT-IB, así como D-TAT-JNKI, penetran en las células tan eficazmente como los péptidos L-TAT y L-TAT-IB y D-TAT-JNKI, y los péptidos D-TAT y D-TAT-IB y D-TAT-JNKI son más estables que los L-péptidos correspondientes. Además, mientras los D-TAT-IB1 son ~ 10-20 veces menos eficaces en la inhibición de JNK que los L-TAT-IB y L-TAT-JNKI, son ~ 50 veces más estables in vivo. Además, los péptidos JNKI D-retro-inversos son resistentes a las proteasas. Finalmente, tal como se expone más adelante, los péptidos D TAT-IB y D-TAT-JNKI protegen las células irradiadas ionizantes y tratadas con interleuquina-1 contra la apoptosis, y estos péptidos son útiles en el tratamiento de las neuronas, ya que la secuencia TAT contiene seis pares de aminoácidos que convierten la secuencia TAT en extremadamente sensible a las proteasas neuronales, implicadas en el procesamiento de péptidos en el sistema nervioso. Véase por ejemplo, Steiner y col., J. Biol. Chem. 267:23435 23438 (1992); Brugidou y col., Biochem. & Biophys. Res. Comm. 214:685-693 (1995).

Un péptido inhibidor de JNK incluye la secuencia de aminoácidos NH2-Xn-RPTTLXLXXXXXXXQDS/T-Xn-COOH [SEQ ID NO:5, y los residuos 17-42 de L-TAT-IB, SEQ ID NO:13, tal como se muestra en la Fig. 2]. Tal como se utiliza aquí, Xn puede ser de cero residuos de longitud o puede ser una extensión contigua de residuos de péptidos derivados de las SEQ ID NO: 1 y 21, preferentemente una extensión de entre 1 y 7 aminoácidos de longitud, o puede ser de 10, 20, 30 o más aminoácidos de longitud. El único residuo representado por S/T puede ser Ser o Thr en la secuencia genérica. En otra forma, el péptido inhibidor de JNK de la invención puede un péptido retro-inverso D que tiene la secuencia NH2-Xn-S/TDQXXXXXXXLXLTTPR-Xn-COOH [SEQ ID NO: 6], y los residuos 17-42 de L-TAT-IB, [SEQ ID NO:16, tal como se muestra en la Fig. 2.

Los péptidos inhibidores de JNK se pueden obtener o producir por medio de métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo por síntesis química, métodos de ingeniería genética tal como se expone a continuación. Por ejemplo, un péptido que corresponde a una parte de un péptido inhibidor de JNK incluyendo una región o dominio deseado, o que media la actividad deseada in vitro, se puede sintetizar utilizando un sintetizador peptídico.

Un péptido inhibidor de JNK candidato puede analizarse mediante un análisis de hidrofilicidad (véase por ejemplo, Hopp y Woods, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78:3824-3828), que se puede utilizar para identificar las regiones hidrofóbicas e hidrofílicas de los péptidos, ayudando así en el diseño de los sustratos para la manipulación experimental, tal como en los experimentos de unión, síntesis de anticuerpos. Se puede realizar también un análisis estructural secundario para identificar las regiones de un péptido inhibidor de JNK que asumen motivos estructurales específicos. Véase por ejemplo, Chou y Fasman, 1974. Biochem 13:222-223. La manipulación, traducción, predicción de estructura secundaria, perfiles de hidrofilicidad e hidrofobicidad, predicción y representación del marco abierto de lectura, así como la determinación de las homologías de secuencia se pueden llevar a cabo utilizando programas de software informático disponibles en la técnica. Otros métodos de análisis estructural incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X (véase por ejemplo, Engstrom, 1974. Biochem Exp Biol 11:7-13); la espectroscopía de masas y la cromatografía de gases (véase, por ejemplo, METHODS IN PROTEIN SCIENCE, 1997, J. Wiley and Sons, New York, NY) y la modelación por ordenador (véase, por ejemplo, Fletterick y Zoller, eds., 1986. Computer Graphics and Molecular Modeling, In: CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

La presente descripción se refiere además a ácidos nucleicos que codifican los péptidos de unión a JNK de la invención que tienen la forma de aminoácidos L, por ejemplo aquellos péptidos L indicados en la Tabla 1, así como los complementos de estas secuencias. Las fuentes apropiadas de ácidos nucleicos que codifican péptidos inhibidores de JNK incluyen el ácido nucleico IB1 humano (y las secuencias de proteínas codificadas) disponibles con los Nos. de Acceso al GenBank AFO74091 y AAD20443, respectivamente. Otras fuentes incluyen ácido nucleico IB1 de rata y se muestran secuencias de proteínas con los Nos. de Acceso al GenBank AF108959 y AAD22543 respectivamente. El ácido nucleico IB2 humano así como las secuencias de proteínas se muestran con el Nº. de Acceso al GenBank AF218778.

Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos inhibidores de JNK se pueden obtener mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, por amplificación PCR utilizando cebadores sintéticos hibridizables a los extremos 3'- y 5'- de la secuencia y/o mediante clonación a partir de un cADN o de una librería genómica utilizando una secuencia de oligonucleótidos específica para la secuencia genética dada).

Para la expresión recombinante de uno o más péptidos inhibidores de JNK, el ácido nucleico que contiene la totalidad o parte de la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido se puede insertar en un vector de expresión apropiado (es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia que codifica el péptido insertado). Los elementos reguladores pueden ser heterólogos (es decir, no el promotor genético nativo). Alternativamente, las señales transcripcionales y de traducción necesarias pueden ser suministradas también por el promotor nativo para los genes y/o sus regiones flanqueantes.

Se pueden utilizar diversos sistemas huésped-vector para expresar la(s) secuencia(s) de codificación delpéptido. Éstos incluyen, pero no se limitan a: (i) sistemas celulares de mamíferos que están infectados por el virus vaccinia, adenovirus y similares; (ii) sistemas celulares de insectos infectados por baculovirus y similares; (iii) levaduras que contiene vectores de levadura o (iv) bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN de plásmidos o ADN de cósmidos. Según el sistema huésped-vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de diversos elementos adecuados de transcripción y traducción.

Las secuencias promotoras/intensificadoras dentro de los vectores de expresión pueden utilizar secuencias reguladoras de plantas, animales, insectos u hongos, tal como se proporciona en la invención. Por ejemplo, los elementos promotores/ intensificadores se pueden utilizar a partir de levaduras y otros hongos (por ejemplo, el promotor GAL4, el promotor de alcohol-deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol-quinasa, el promotor de fosfatasa-alcalina). Alternativa o adicionalmente, pueden incluir regiones de control transcripcional de animales, por ejemplo (i) la región de control del gen de la insulina activa dentro de las células-�pancreáticas (véase, por ejemplo, Hanahan y col., 1985. Nature 315: 115-122); (ii) la región de control del gen de la inmunoglobulina activa dentro de las células linfoides (véase, por ejemplo, Grosschedl y col., 1984. Cell 38: 647-658); (iii) la región de control del gen de la albúmina activa dentro del hígado (véase, por ejemplo, Pinckert y col., 1987. Genes and Dev 1: 268-276; (iv) la región de control del gen de la proteína básica de la mielina activa dentro de las células de los oligodendrocitos cerebrales (véase, por ejemplo, Readhead y col., 1987. Cell 48: 703-712); y (v) la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropinas activa dentro del hipotálamo (véase, por ejemplo, Mason y col., 1986, Science 234: 13721378) y similares.

Los vectores de expresión o sus derivados incluyen, por ejemplo, virus humanos o animales (por ejemplo virus vaccinia o adenovirus); virus de insectos (por ejemplo baculovirus); vectores de levadura; vectores bacteriófagos (por ejemplo fago lambda); vectores de plásmidos y vectores de cósmidos.

Se puede seleccionar una cepa de célula huésped que module la expresión de las secuencias de interés insertadas o que modifique o procese péptidos expresados codificados por las secuencias de la manera específica deseada. Además, la expresión procedente de ciertos promotores puede ser intensificada en presencia de ciertos inductores en una cepa huésped seleccionada, facilitando así el control de la expresión de un péptido construido genéticamente. Además, distintas células huésped poseen mecanismos característicos y específicos para la modificación y el procesamiento traduccional y post-traduccional (por ejemplo glicosilación, fosforilación y similares) de los péptidos expresados. Por tanto, se pueden elegir líneas celulares o sistemas huésped apropiados para asegurar que se obtiene la modificación y el procesamiento deseados del péptido extraño. Por ejemplo, la expresión del péptido dentro de un sistema bacteriano se puede utilizar para producir un péptido de núcleo no glicosilado, mientras que la expresión dentro de las células de mamíferos asegura la glicosilación quot;nativaquot; de un péptido heterólogo.

Se describen también derivados, fragmentos, homólogos, análogos y variantes de los péptidos inhibidores de JNK de la invención tal como se definen anteriormente, así como los ácidos nucleicos que codifican estos péptidos. Para los ácidos nucleicos, los derivados, fragmentos y análogos proporcionados aquí, se definen como secuencias de al menos 6 ácidos nucleicos (contiguos) y que tienen una longitud suficiente para permitir la hibridación específica. Para los aminoácidos, los derivados, fragmentos y análogos proporcionados aquí se definen como secuencias de al menos 4 aminoácidos (contiguos), con una longitud suficiente para tener en cuenta el reconocimiento específico de un epítope.

La longitud de los fragmentos es inferior a la longitud del ácido nucleico o del polipéptido de longitud completa correspondiente del que procede el péptido inhibidor de JNK o el ácido nucleico que codifica el mismo. Los derivados y análogos pueden ser de longitud completa o de otra longitud cuando el derivado o análogo contiene un aminoácido o ácido nucleico modificado. Los derivados o análogos de los péptidos inhibidores de JNK incluyen, por ejemplo, moléculas que comprenden regiones que son sustancialmente homólogas a los péptidos, en varias realizaciones, con al menos un 95% aproximadamente, un 98% o incluso un 99% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico o cuando se comparan con una secuencia alineada en la que la alineación se lleva a cabo mediante un programa informático por homología conocido en la técnica. Por ejemplo la identidad de secuencia se puede medir utilizando un software de análisis de secuencias (Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705) con los parámetros por defecto aquí incluidos.

En el caso de secuencias de polipéptidos que son idénticas en menos de un 100% a una secuencia de referencia, las posiciones no idénticas son preferentemente, pero no forzosamente, sustituciones conservadoras para la secuencia de referencia. Las sustituciones conservadoras incluyen típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Así, se incluyen en la invención péptidos que tienen secuencias mutadas de modo tal que siguen siendo homólogos, por ejemplo en la secuencia, en la función y en el carácter antigénico, o en otra función, a una proteína que tiene la secuencia original correspondiente. Estas mutaciones pueden ser, por ejemplo, mutaciones que implican cambios de aminoácidos conservativos, por ejemplo cambios entre aminoácidos con propiedades moleculares muy similares. Por ejemplo, los intercambios dentro del grupo alifático alanina, valina, leucina e isoleucina se pueden considerar como conservativos. A veces, la sustitución de glicina por uno de estos se puede considerar también conservativa. Otros intercambios conservativos incluyen aquellos dentro del grupo alifático aspartato y glutamato; dentro del grupo amida asparagina y glutamina; dentro del grupo hidroxilo serina y treonina; dentro del grupo aromático fenilalanina, tirosina y triptófano; dentro del grupo básico lisina, arginina e histidina; y dentro del grupo que contiene azufre metionina y cisteína. A veces la sustitución dentro del grupo metionina y leucina se puede considerar también conservativa. Los grupos de sustitución conservativa preferentes son aspartato-glutamato; asparagina-glutamina; valina-leucina-isoleucina; alaninavalina; fenilalanina-tirosina y lisina-arginina.

Cuando se dice que un polipéptido particular tiene un identidad porcentual específica con respecto a un polipéptido de referencia de una longitud definida, la identidad porcentual tiene relación con el péptido de referencia. Así, un péptido que es idéntico en un 50% a un polipéptido de referencia que tiene una longitud de 100 aminoácidos puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es totalmente idéntico a una parte de 50 aminoácidos de longitud del polipéptido de referencia. Puede ser también un polipéptido de 100 aminoácidos de longitud que es idéntico en un 50% al polipéptido de referencia con respecto a su longitud total. Por supuesto, otros polipéptidos cumplirán con los mismos criterios.

La descripción abarca también las variantes alélicas de los polinucleótidos o péptidos revelados; es decir, las formas alternativas naturales del polinucléotido aislado que codifican también péptidos que son idénticos, homólogos o relacionados con aquel codificado por los polinucleótidos. Alternativamente, se pueden producir variantes no naturales mediante técnicas de mutagénesis o por síntesis directa.

La presente descripción proporciona también homólogos de especie de los polinucleótidos y péptidos descritos. quot;Variantequot; se refiere a un polinucléotido o a un polipéptido que es diferente del polinucléotido o polipéptido de la presente invención, pero que conserva las propiedades esenciales del mismo. En general, las variantes son globalmente muy similares y, en muchas regiones, idénticas al polinucléotido o al polipéptido de la presente invención. Las variantes pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, en las regiones no codificadoras o en ambas.

En algunas formas, las secuencias alteradas incluyen inserciones de tal modo que la secuencia general de aminoácidos se alarga mientras la proteína conserva sus propiedades de tráfico. Además, las secuencias alteradas pueden incluir deleciones internas aleatorias o diseñadas que acortan la secuencia global de aminoácidos mientras que la proteína conserva las propiedades de transporte.

Las secuencias alteradas pueden ser codificadas adicional o alternativamente por los polinucleótidos que se hibridizan bajo condiciones rigurosas con la hebra apropiada del polinucleótido natural que codifica un polipéptido o péptido del que procede el péptido inhibidor de JNK. El péptido variante se puede someter a ensayo en busca de la unión a JNK y de la modulación de la actividad mediada por JNK utilizando los ensayos aquí descritos. Las quot;condiciones rigurosasquot; dependen de la secuencia y serán distintas en distintas circunstancias. En general, las condiciones rigurosas se pueden seleccionar para que sean a temperatura inferior en aproximadamente 5ºC que el punto de fusión térmico (TM) para la secuencia específica a una intensidad iónica y pH definidos. La TM es la temperatura (bajo una intensidad iónica y pH definidos) a la que un 50% de la secuencia diana se hibridiza a una sonda perfectamente coincidente. Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal sea de al menos aproximadamente 0,02 molar a un pH de 7 y la temperatura sea al menos aproximadamente 60ºC. Como otros factores que pueden afectar a la rigurosidad de la hibridación (incluyendo, entre otros, la composición base y el tamaño de las hebras complementarias), la presencia de disolventes orgánicos y el alcance de desajuste de la base, la combinación de los parámetros es más importante que la medida absoluta de cualquiera de los mismos.

Una alta rigurosidad puede incluir, por ejemplo, el Paso 1: Se pretratan filtros que contienen ADN durante 8 horas a toda la noche a 65ºC en un tampón compuesto por 6X SSC, 50 mM de Tris-HCl (pH de 7,5), 1 mM EDTA, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02% y 500 Ig/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Paso 2: Se hibridizan los filtros durante 48 horas a 65ºC en la mezcla de prehibridación anterior a la que se añaden 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 x 106 cpm de sonda 32P-marcada. Paso 3: Se lavan los filtros durante 1 hora a 37ºC en una solución que contiene 2X SSC, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01% y BSA al 0,01%. Seguidamente se lavan con 0,1X SSC a 50ºC durante 45 minutos. Paso 4: Se autorradiografian los filtros. Se conocen bien en la técnica otras condiciones de alta rigurosidad que se pueden utilizar. Véase, por ejemplo, Ausubel y col., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.

Las condiciones de rigurosidad moderada pueden incluir lo siguiente: Paso 1: Se pretratan filtros que contienen ADN durante 6 horas a 55ºC en una solución que contiene 6X SSC, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5% y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Paso 2: Se hibridizan los filtros durante 18-20 horas a 55ºC en la misma solución con la adición de 5-20 x 106 cpm de sonda 32P-marcada. Paso 3: Se lavan los filtros a 37ºC durante 1 hora en una solución que contiene 2X SSC, SDS al 0,1%, luego se lavan dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una solución que contiene 1X SSC y SDS al 0,1%. Paso 4: Se secan los filtros y se exponen a la autorradiografía. Se conocen bien en la técnica otras condiciones de rigurosidad moderada que se pueden utilizar. Véase, por ejemplo, Ausubel y col., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.

La baja rigurosidad puede incluir: Paso 1: Se pretratan los filtros que contienen ADN durante 6 horas a 40ºC en una solución que contiene formamida al 35%, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH de 7,5), 5 mM EDTA, PVP al 0,1%, Ficoll al 0,1%, BSA al 1% y 500 Ig/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Paso 2: Se hibridizan los filtros durante 18-20 horas a 40ºC en la misma solución con la adición de PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, 100 Ig/ml de ADN de esperma de salmón, sulfato de dextrano al 10% (peso/ volumen) y 5-20 x 106 cpm de sonda 32P-marcada. Paso 3: Se lavan los filtros durante 1,5 horas a 55ºC en una solución que contiene 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH de 7,4), 5 mM de EDTA y SDS al 0,1%. La solución de lavado se sustituye por una solución fresca y se incuba durante 1,5 horas más a 60ºC. Paso 4: Se secan los filtros y se exponen a autorradiografía. Si es necesario, se lavan los filtros por tercera vez a 65-68ºC y se vuelven a exponer a la película. Se conocen bien en la técnica otras condiciones de baja rigurosidad que se pueden utilizar (por ejemplo, tal como se emplea para hibridaciones entre especies). Véase, por ejemplo, Ausubel y col., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOL IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.

Péptidos Quiméricos que incluyen Dominios Inhibidores de JNK y un Dominio de Tráfico

En otro aspecto, la descripción proporciona un péptido quimérico que incluye un primer y un segundo dominios. El primer dominio incluye una secuencia de tráfico, mientras que el segundo dominio incluye una secuencia inhibidora de JNK enlazada por un enlace covalente, por ejemplo un enlace peptídico, al primer dominio. El primero y segundo dominios pueden aparecer en cualquier orden en el péptido y el péptido puede incluir uno o más de cada dominio.

Una secuencia de tráfico es una secuencia de aminoácidos que dirige un péptido en el que está presente hacia un destino celular deseado. Así, la secuencia de tráfico puede dirigir el péptido a través de la membrana plasmática, por ejemplo desde fuera de la célula, por la membrana plasmática, y dentro del citoplasma. Alternativa o adicionalmente, la secuencia de tráfico puede dirigir el péptido hacia un lugar deseado dentro de la célula, por ejemplo hacia el núcleo, el ribosoma, el ER, un lisosoma o un peroxisoma.

En algunas realizaciones, el péptido de tráfico procede de una secuencia conocida de translocación de membrana. Por ejemplo, el péptido de tráfico puede incluir secuencias procedentes de la proteína TAT 1 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Esta proteína se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nº 5.804.604 y 5.674.980. El péptido inhibidor de JNK puede estar enlazado a algunos de los 86 aminoácidos totales que conforman la proteína TAT. Aquí, se puede utilizar un fragmento o una parte funcionalmente eficaz de una proteína TAT que posee menos de 86 aminoácidos que muestra captación en las células, y opcionalmente captación en el núcleo celular. Véase, por ejemplo, Vives y col., J. Biol. Chem., 272(25):16010-17 (1997). En una realización, el fragmento incluye un péptido que contiene los residuos 48-57 de TAT, por ejemplo, NH2-GRKKRRQRRR-COOH [SEQ ID NO:7] o una secuencia genérica de TAT NH2-Xn-RKKRRQRRR-Xn-COOH [SEQ ID NO:9]. Un péptido de TAT que incluye la región que media la entrada y captación en las células se puede definir por medio de técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Franked y col., Proc. Natl. Acad Sci., USA 86: 7397-7401 (1989).

La secuencia de TAT puede estar enlazada al extremo N-terminal o C-terminal de la secuencia inhibidora de JNK. Se puede añadir una bisagra de dos residuos prolina entre la TAT y el péptido inhibidor de JNK para crear el péptido de fusión total. Por ejemplo, los péptidos de fusión con L-aminoácidos utilizados aquí pueden ser el péptido L-TAT-IB1 [SEQ ID NO:11], el péptido L-TAT-IB2 [SEQ ID NO:12], o el péptido genérico L-TAT-IB [SEQ ID NO:13]. Alternativamente, los péptidos de fusión de L-aminoácidos pueden ser el péptido genérico L-TAT-JNKI [SEQ ID NO:25]. Los péptidos de fusión retro-inversos D pueden ser el péptido D-TAT-IB1 [SEQ ID NO:14], el péptido D-TAT-IB2 [SEQ ID NO:15] o el péptido genérico D-TAT-IB [SEQ ID NO:16]. Alternativamente, los péptidos de fusión retro-inversos D pueden incluir el péptido D-TAT-JNKI [SEQ ID NO:22] o el péptido genérico D-TAT-JNKI [SEQ ID NO:26]. El péptido de TAT puede ser un péptido retroinverso D que tiene la secuencia NH2-Xn-RRRQRRKKR-Xn-COOH [SEQ ID NO:10]. En la SEQ ID NOs: 5-6, 910, 13, 16 y 25-26, el número de residuos quot;Xquot; no se limita al que se describe y puede igualar cualquier número de residuos de aminoácidos, incluido cero, y puede variar tal como se ha descrito anteriormente.

La secuencia de tráfico puede ser una secuencia única (es decir continua) de aminoácidos presentes en la secuencia de TAT. Alternativamente, pueden ser secuencias de dos o más aminoácidos que están presentes en la proteína TAT, pero que en la proteína natural están separadas por otras secuencias de aminoácidos. Tal como se utiliza aquí, la proteína TAT incluye una secuencia de aminoácidos natural que es la misma que la de la proteína TAT natural, o su proteína equivalente funcional, o fragmentos funcionalmente equivalentes de la misma (péptidos). Estas proteínas equivalentes funcionales o fragmentos funcionalmente equivalentes poseen una actividad de captación en la célula y en el núcleo de la célula que es sustancialmente similar a la de la proteína TAT natural. La proteína TAT se puede obtener a partir de fuentes naturales o se puede producir utilizando técnicas de ingeniería genética o de síntesis química.

La secuencia de aminoácidos de la proteína TAT natural de VIH se puede modificar, por ejemplo, mediante adición, deleción y/o sustitución de al menos un aminoácido presente en la proteína TAT natural, para producir la proteína TAT modificada (también denominada aquí proteína TAT). La proteína TAT modificada o los análogos peptídicos de TAT con estabilidad aumentada o reducida se pueden producir por medio de técnicas conocidas. En algunas realizaciones, las proteínas TAT o los péptidos incluyen secuencias de aminoácidos que son sustancialmente similares, aunque no idénticas, a las de la proteína TAT natural o a partes de la misma. Además, se puede añadir colesterol u otros derivados lipídicos a la proteína TAT para producir una TAT modificada con una mayor solubilidad en la membrana.

Se pueden diseñar variantes de la proteína TAT para modular la localización intracelular de TAT - péptido inhibidor de JNK. Cuando se añaden de forma exógena, estas variantes se diseñan habitualmente para que se conserve la capacidad de TAT para penetrar en las células (es decir, la captación de la proteína TAT o del péptido variante en la célula es sustancialmente similar a la de la TAT natural del VIH). Por ejemplo, la alteración de la región básica que se considera importante para la localización nuclear (véase, por ejemplo, Dang y Lee, J. Biol. Chem. 264: 18019-18023 (1989); Hauber y col., J. Virol. 63: 1181-1187 (1989); Ruben y col., J. Virol. 63: 1-8 (1989)) puede resultar en una localización citoplásmica o en una localización parcialmente citoplásmica de TAT y, por tanto, del péptido inhibidor de JNK. Alternativamente, se puede introducir una secuencia para unir un elemento citoplásmico o cualquier otro componente o compartimento (por ejemplo retículo endoplásmico, mitocondria, el aparato de Bloom, vesículas lisosomales) en la TAT con el fin de conservar la TAT y el péptido inhibidor de JNK en el citoplasma o en cualquier otro compartimento para otorgar una regulación a la captación de TAT y del péptido inhibidor de JNK.

Otras fuentes para el péptido de tráfico incluyen, por ejemplo, VP22 (descrito, por ejemplo, en la WO 97/05265; Elliott y O'Hare, Cell 88: 223-233 (1997)) o proteínas no virales (Jackson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10691-10695 (1992)).

La secuencia inhibidora de JNK y la secuencia de tráfico pueden enlazarse mediante acoplamiento químico de cualquier manera adecuada conocida en la técnica. Numerosos métodos conocidos de reticulación química no son específicos, es decir que no dirigen el punto de acoplamiento hacia ningún lugar particular del polipéptido de transporte o la macromolécula de carga. En consecuencia, la utilización de agentes reticulantes no específicos puede atacar los lugares funcionales o bloquear estéricamente los lugares activos, transformando las proteínas conjugadas en biológicamente inactivas.

Una forma de aumentar la especificidad de acoplamiento consiste en dirigir el acoplamiento químico hacia un grupo funcional que aparece solamente una vez o pocas veces en uno de los polipéptidos o en los dos que hayan de ser reticulados. Por ejemplo, en muchas proteínas, la cisteína, que es el único aminoácido proteico que contiene un grupo tiol, aparece sólo pocas veces. Asimismo, por ejemplo, si un polipéptido no contiene residuos de lisina, un reactivo reticulante específico de amina primaria será selectivo con el extremo amino de aquel polipéptido. La utilización con éxito de esta aproximación para aumentar la especificidad de acoplamiento requiere que el polipéptido tenga los residuos adecuadamente raros y reactivos en zonas de la molécula que se pueden alterar sin pérdida de la actividad biológica de la misma.

Los residuos de cisteína se pueden sustituir cuando aparecen en partes de una secuencia de polipéptidos donde su participación en una reacción de reticulación de otro modo interferiría probablemente en la actividad biológica. Cuando se sustituye un residuo de cisteína, normalmente es deseable minimizar los cambios resultantes en la multiplicación de polipéptidos. Los cambios en la multiplicación de polipéptidos se minimizan cuando la sustitución es química y estéricamente similar a la cisteína. Por estas razones, se prefiere la serina como sustitución para la cisteína. Tal como se demuestra en los ejemplos a continuación, se puede introducir un residuo de cisteína en una secuencia de aminoácidos polipeptídicos con propósitos de reticulación. Cuando se introduce un residuo de cisteína, se prefiere la introducción en o cerca del extremo amino o carboxi. Se dispone de métodos convencionales para estas modificaciones de la secuencia de aminoácidos, para que el polipéptido de interés se produzca mediante síntesis química o por expresión de ADN recombinante.

El acoplamiento de los dos constituyentes se puede llevar a cabo mediante un agente de acoplamiento o conjugación. Existen diversos reactivos de reticulación intermolecular que se pueden utilizar. Véase, por ejemplo, Means y Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43. Entre estos reactivos se encuentran, por ejemplo, J-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) o N,N’-(1,3fenilen)bismaleimida (siendo ambos altamente específicos de los grupos sulfhidrilo y formando enlaces irreversibles); N,N’-etilen-bis(yodoacetamida) u otro reactivo que tenga de 6 a 11 puentes de carbono metilénicos (que son relativamente específicos de los grupos sulfhidrilo); y 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (que forma enlaces irreversibles con los grupos amino y tirosina). Otros reactivos de reticulación útiles para este propósito incluyen: p,p'-difluor-m,m'-dinitrodifenilsulfona (que forma reticulaciones irreversibles con grupos amino y fenólicos); dimetil-adipimidato (que es específico de los grupos amino); fenol-1,4disulfonilcloruro (que reacciona principalmente con los grupos amino); hexametilen-diisocianato o diisotiocianato, o azofenil-p-diisocianato (que reacciona principalmente con los grupos amino); glutaraldehído (que reacciona con varias cadenas laterales diferentes) y disdiazobencidina (que reacciona esencialmente con la tirosina e histidina).

Los reactivos de reticulación pueden ser homobifuncionales, es decir con dos grupos funcionales que experimentan la misma reacción. Un reactivo de reticulación homobifuncional preferente es el bismaleimidohexano (quot;BMHquot;). El BMH contiene dos grupos maleimida funcionales que reaccionan específicamente con compuestos que contienen sulfhidrilo bajo condiciones suaves (pH de 6,5-7,7). Los dos grupos maleimida están unidos por una cadena hidrocarburo. Por tanto, el BMH sirve para la reticulación irreversible de polipéptidos que contienen residuos de cisteína.

Los reactivos de reticulación pueden ser también heterobifuncionales. Los agentes de reticulación heterobifuncionales tienen dos grupos funcionales diferentes, por ejemplo un grupo amino-reactivo y un grupo tiol-reactivo, que reticularán dos proteínas que tienen aminas y tioles libres, respectivamente. Ejemplos de agentes de reticulación heterobifuncionales son succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (quot;SMCCquot;), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (quot;MBS), y succinimida-4-(p-maleimidofenil)butirato (quot;SMPBquot;), análogo de cadena alargada de MBS. El grupo succinimidilo de estos reticulantes reacciona con una amina primaria y la maleimida tiol-reactiva forma un enlace covalente con el tiol de un residuo de cisteína.

Los reactivos de reticulación a menudo tienen baja solubilidad en agua. Una parte hidrofílica, tal como un grupo sulfonato, se puede añadir al reactivo de reticulación para mejorar su solubilidad en agua. El sulfo-MBS y sulfo-SMCC son ejemplos de reactivos de reticulación modificados para su solubilidad en agua.

Numerosos reactivos de reticulación producen un conjugado que es esencialmente no segmentable en condiciones celulares. Sin embargo, algunos reactivos de reticulación contienen un enlace covalente, tal como un disulfuro, que es segmentable en condiciones celulares. Por ejemplo, el reactivo de Traut, ditiobis(succinimidilpropionato) (quot;DSPquot;) y N-succinimidil 3-(2-piridilditio)-propionato (quot;SPDPquot;) son reticulantes segmentables bien conocidos. La utilización de un reactivo de reticulación segmentable permite que la parte de carga se separe del polipéptido de transporte después de su suministro a la célula diana. El enlace directo a disulfuro puede ser también útil.

Numerosos reactivos de reticulación, incluidos los expuestos anteriormente, son comerciales. Las instrucciones detalladas para su uso son proporcionadas fácilmente por los suministradores comerciales. Una referencia general sobre la reticulación de proteínas y preparación de conjugados es: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING, CRC Press (1991).

La reticulación química puede incluir el uso de brazos espaciadores. Los brazos espaciadores proporcionan flexibilidad intramolecular o ajustan las distancias intramoleculares entre las partes conjugadas y ayudan así a conservar la actividad biológica. Un brazo espaciador puede tener la forma de una parte polipeptídica que incluye aminoácidos espaciadores, por ejemplo, prolina. Alternativamente, un brazo espaciador puede formar parte del reactivo de reticulación, tal como en quot;SPDP de larga cadenaquot; (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H).

Alternativamente, el péptido quimérico se puede producir como un péptido de fusión que incluye la secuencia de tráfico y la secuencia inhibidora de JNK que se pueden expresar adecuadamente en células huésped apropiadas conocidas. Los péptidos de fusión tal como se describen aquí pueden formarse y utilizarse de manera análoga o fácilmente adaptable a partir de técnicas de ADN recombinante estándar, tal como se ha descrito anteriormente.

Producción de anticuerpos específicos para los péptidos inhibidores de JNK

Los péptidos inhibidores, incluyendo péptidos quiméricos que incluyen los péptidos inhibidores de JNK (por ejemplo aquellos que incluyen las secuencias de aminoácidos mostradas en la Tabla 1), así como péptidos, o derivados o fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, se pueden emplear como inmunógenos para generar anticuerpos que se unen inmuno-específicamente a estos componentes peptídicos. Tales anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos de cadena simple, fragmentos Fab y una librería de expresión de Fab. En una opción específica, se describen anticuerpo para los péptidos humanos. En otra opción específica, se utilizan fragmentos de los péptidos inhibidores de JNK como inmunógenos para la producción de anticuerpos. Para la producción de anticuerpo policlonales o monoclonales de los inhibidores peptídicos de JNK o de sus derivados, fragmentos, análogos u homólogos se pueden emplear diversos procedimientos conocidos en la técnica.

Para la producción de anticuerpos policlonales pueden inmunizarse diversas huéspedes animales por inyección con el péptido nativo o con una variante sintética del mismo o con un derivado del mismo. Para incrementar la respuesta inmunológica pueden emplearse diferentes adyuvantes, incluyendo éstos, sin limitarse a, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales (por ejemplo hidróxido de aluminio), sustancias tensioactivas (por ejemplo lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, dinitrofenol, etc.), así como adyuvantes humanos tales como Bacille Calmette-Guerin y Corynebacterium parvum.

Para preparar anticuerpos monoclonales dirigidos a un péptido inhibidor de JNK, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos, se puede utilizar cualquier técnica que permita producir moléculas de anticuerpo mediante cultivo continuo de líneas celulares. Estas técnicas incluyen, de forma no exclusiva, la técnica de hibridoma (véase Kohler y Milstein 1975. Nature 256: 495-497); la técnica de trioma; la técnica de hibridoma de células B humanas (véase Kozbor y col., 1983, Immunol Today 4: 72) y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase Cole y col., 1985. En: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). En la práctica de la presente invención se pueden utilizar anticuerpos monoclonales humanos, que se pueden producir mediante el uso de hibridomas humanos (véase Cote y col., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando células B humanas con virus de Epstein Barr in vitro (véase Cole y col., 1985. En: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Se pueden adaptar técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple específicos para un péptido inhibidor de JNK (véase, por ejemplo, la Patente US Nº 4.946.778). Además, se pueden adaptar métodos para construir librerías de expresión Fab (véase, por ejemplo, Huse y col., 1989, Science 246: 1275-1281) para posibilitar una identificación rápida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para un péptido inhibidor de JNK o derivados, fragmentos, análogos u homólogos del mismo. También es posible “humanizar” anticuerpos no humanos mediante técnicas bien conocidas (véase, por ejemplo, la Patente US 5.225.539). Se pueden producir fragmentos de anticuerpo que contienen los idiotipos de un péptidos inhibidor de JNK mediante técnicas conocidas, incluyendo, por ejemplo, (i) un fragmento F(ab’)2 producido mediante digestión de pepsina de una molécula anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado por la reducción de los puentes de disulfuro en un fragmento F(ab’)2; (iii) un fragmento Fab generado por tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor; y (iv) fragmentos Fv.

En una opción, los métodos que pueden utilizarse para el quot;screeningquot; de anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, de forma no exclusiva, ensayos con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA) y otras técnicas de mediación inmunológica conocidas en la técnica. En una opción específica, la selección de anticuerpos específicos de un dominio particular de un péptido inhibidor de JNK se facilita mediante la generación de hibridomas que se unen a un fragmento de un péptido inhibidor de JNK que presenta tal dominio. Aquí también están previstos anticuerpos que son específicos para un dominio dentro de un péptido inhibidor de JNK, o un derivado, fragmentos, análogos u homólogos del mismo.

Los anticuerpos anti-péptido inhibidor de JNK se pueden utilizar en métodos conocidos en la técnica referentes a la localización y/o cuantificación de un péptido inhibidor de JNK (por ejemplo para medir los niveles del péptido dentro de muestras fisiológicas apropiadas, para su uso en métodos diagnósticos para su uso en generar imágenes del péptido y similares). En un opción dada, los anticuerpos para los péptidos inhibidores de JNK, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos que contienen el dominio de unión derivado del anticuerpo se emplean como compuestos activos farmacéuticos (en adelante “Productos Terapéuticos”).

MÉTODOS PARA TRATAR O PREVENIR TRASTORNOS

Trastornos asociados a una actividad de JNK no deseada

También se describen métodos para el tratamiento de trastornos proliferativos asociados a la activación de JNK en un sujeto mediante la administración de un compuesto activo terapéutico biológicamente activo (en adelante “Productos Terapéuticos”).

El término “trastorno celular proliferativo” se refiere tanto a las poblaciones celulares malignas como no malignas que a menudo aparecen diferenciándose morfológica y funcionalmente del tejido que las rodea. Por ejemplo, el método puede ser útil para el tratamiento tumoral de los diversos sistemas orgánicos donde con frecuencia se ha demostrado la activación de JNK, tales como en el pulmón, mama, linfoide, tracto gastrointestinal y genito-urinario, así como adenocarcinomas que incluyen tumores, como la mayoría de los cánceres de colon, el carcinoma celular renal, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer del intestino delgado y cáncer de esófago. También se incluyen cánceres con transformaciones oncogénicas Bcr-Abl que claramente requieren la activación de JNK.

El método también es útil en el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares o inmunológicas no malignas tales como psoriasis, pénfigo vulgar, síndrome de Behcet, síndrome de distrés respiratorio (ARDS), enfermedad isquémica del corazón, síndrome post-diálisis, leucemia, artritis reumatoide, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, vasculitis, shock séptico y otros tipos de inflamación aguda, e histiocitosis lipídica. Los trastornos inmunopatológicos son especialmente preferentes. Esencialmente cualquier trastorno relacionado etiológicamente con la actividad de la quinasa JNK se considera susceptible de tratamiento

Pérdida de audición

También se describen métodos para prevenir o tratar la pérdida de audición mediante la administración a un sujeto de un Producto Terapéutico, es decir de un péptido bioactivo con permeabilidad celular donde el péptido impide que se dañen los estereocilios de las células pilosas, la apoptosis de las células pilosas o la apoptosis neuronal. Preferentemente, el Producto Terapéutico es el péptido de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ó 28.

La exposición a ruidos fuertes provoca la pérdida de la audición inducida por ruido (NIHL) debido a un daño del órgano de Corti. La NIHL depende tanto del nivel de ruido como de la duración de la exposición. La pérdida de audición puede ser temporal (TTS) si un mecanismo reparador puede rehabilitar el órgano de Corti. Sin embargo, se vuelve permanente (PTS) cuando mueren las células pilosas o las neuronas. Los correlatos estructurales del trauma acústico son de dos tipos: (1) leve daño en la sinapsis y/o en los estereocilios de las células pilosas que se puede reparar y explica la TTS y su recuperación, y (2) grave daño que causa la apoptosis de las células pilosas y neuronales que no se puede reparar y explica la PTS.

El Producto Terapéutico se administra al sujeto antes de su exposición a un trauma acústico, antibiótico o agente quimioterapéutico. Alternativamente, el Producto Terapéutico se administra después de que el sujeto haya estado expuesto a un trauma acústico, antibiótico o agente quimioterapéutico.

Un trauma acústico es un ruido suficiente para dañar el Corti. Por ejemplo, un trauma acústico es de al menos 70 dB SPL, de al menos 90 dB SPL o de al menos 100 dB SPL, de al menos 120 dB SPL o de al menos 130 dB SPL.

Los antibióticos incluyen, por ejemplo, penicilinas tales como la penicilina G, penicilina V, ampicilina, amoxicilina, dicloxacilina y oxacilina; cefalosporinas tales como cefalexina (Keflex), cefaclor (Ceclor) y cefixima (Suprax); aminoglicósidos tales como tobramicina y estreptomicina; macrólidos tales como eritromicina, azitromicina (Zithromax) y claritromicina; sulfonamidas tales como trimetoprim-sulfametoxazol o tetracilinas tales como tetraciclina o doxiciclina.

Trastornos neuronales

También se describen métodos para el tratamiento o la prevención de trastornos relacionados con la muerte celular neuronal mediante la administración a una célula o a un sujeto de una composición de un péptido biactivo con permeabilidad celular donde el péptido previene daños neuronales o la apoptosis neuronal. La composición es, por ejemplo, el péptido que incluye la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 21

26.

Preferentemente, la función de la composición es inhibir la muerte de células neuronales inducida por estrés excitotóxico u oxidativo. Una célula neuronal es cualquier célula derivada del sistema nervioso central o periférico, por ejemplo neuronas, neuritas y dendritas. La célula entra en contacto in vivo, ex vivo o in vitro. El sujeto es, por ejemplo, un mamífero, tal como humanos, primates, ratones, ratas, perros, gatos, vacas, caballos, cerdos.

La muerte celular neuronal se mide por métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la muerte celular se determina por microscopía o empleando indicadores químicos, tales como Calceína-am (Molecular Probes).

La excitotoxicidad es el principal mecanismo subyacente de la muerte neuronal en apoplejías, el daño cerebral anóxico y traumático es excitoxicidad. La excitotoxicidad es provocada por la activación excesiva de los receptores glutamato ionotrópicos, en particular del receptor subtipo N-metil-D-aspartato, que lleva aquí a un rápido influjo de Ca2+ que provoca la muerte celular. Veáse por ejemplo Dirnagl y col., Trends en Neurosci.

22: 391- 97 (1999); Zipfel y col., J. of Neurotrauma 17: 857- 69 (2000).

Los métodos son útiles para aliviar los síntomas de diversos trastornos neuronales. El trastorno neuronal es agudo o crónico. Los trastornos neuronales incluyen aquellos asociados a eventos excitotóxicos, tales como apoplejía isquémica, isquemia cerebral, daño cerebral hipóxico/isquémico, daño cerebral traumático, muerte celular debida a ataques epilépticos y muerte neuronal asociada a diversos trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la Enfermedad de Huntington.

La muerte neuronal en la isquemia cerebral está asociada a mecanismos excitotóxicos. La isquemia cerebral (por ejemplo la isquemia cerebral global y focal) se debe a una apoplejía, una herida en la cabeza o a un paro cardíaco. La isquemia cerebral global resulta de un paro cardíaco o de una oclusión bilateral de la arteria carótida. La isquemia cerebral focal resulta de una reducción del flujo sanguíneo cerebral tras una oclusión arterial cerebral. La isquemia cerebral focal resulta en una muerte neuronal necrótica debido a una cascada patogénica compleja de eventos que incluyen el agotamiento energético, excitotoxicidad y depolarización peri-infarto, así como un mecanismo retrasado que implica la apoptosis y la inflamación. La isquemia cerebral focal además puede dividirse en isquemia focal trombótica o embólica. Se produce un ataque trombótico cuando las arteria cerebrales se bloquean debido a un coágulo de sangre formado dentro del cerebro. El ataque embólico también está causado por una arteria bloqueada, pero en el ataque embólico el coágulo se forma en algún lugar que no es el cerebro propiamente dicho.

Los métodos aquí descritos conducen a una reducción de la severidad o a aliviar uno o más síntomas de un trastorno neuronal tal como los mencionados aquí. Los trastornos neuronales son diagnosticados o monitorizados habitualmente por un médico empleando metodologías estándar.

Los péptidos JNKI de la descripción, tal como se indica en los ejemplos, han demostrado proporcionar altos niveles de neuroprotección y, además, el nivel de protección permanece alto incluso cuando el péptido JNKI se administra 6-12 horas después de la aparición de la isquemia. Mientras que con varios compuestos administrados hasta 9 horas tras la isquemia se ha demostrado un 30-50% de neuroprotección (véase por ejemplo Fink y col., J. Cereb. Blood Flow Metab., 18:1071-76 (1998); Williams y col., Neuroreport, 13:821-24 (2002)), los péptidos JNKI de la presente invención han demostrado proporcionar protección cuando se administran 12 horas después del evento isquémico, como se indica en los ejemplos posteriores.

La mayoría de los pacientes que están sufriendo o han sufrido un evento excitotóxico, tal como un ataque isquémico, buscan ayuda médica en las 3 a 6 horas siguientes al evento excitotóxico. El periodo de tiempo para tratar o prevenir el daño excitotóxico, tal como aquel que se produce por un evento isquémico, es importante, ya que la activación de la maquinaria que lleva a la muerte celular puede llevar varias horas tras el evento citotóxico. Por tanto, la terapia a se puede administrar al sujeto antes de que experimente el evento citotóxico. Alternativamente, la terapia puede administrarse después de que el sujeto sufra el evento citotóxico.

Inhibición de la muerte celular de los isletes pancreáticos

También se describen métodos para inhibir el daño o la muerte celular o para prevenir el daño celular aberrante, tal como la muerte celular inducida por estrés oxidativo (esto es la muerte celular apoptótica) mediante la administración a un sujeto de una terapia bioactiva, administrando a la célula o al sujeto una composición (Producto Terapéutico) que contiene un péptido bioactivo que previene el daño o la muerte celular. La célula es, por ejemplo, una célula pancreática. Preferentemente, el Producto Terapéutico es el péptido de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 21-26. Opcionalmente, a la célula o al sujeto también se le administra colagenasa.

El péptido se administra tanto antes como después de que el sujeto se haya expuesto a una citoquina proinflamatoria, tal como las interleuquinas.

El sujeto puede ser, por ejemplo, cualquier mamífero, tal como humano, primate, caballo, rata, pero, gato, vaca, caballo, cerdo.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS

El Producto Terapéutico incluye, por ejemplo: (i) uno o más de los péptidos inhibidores de JNK y derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos; (ii) anticuerpos dirigidos contra los péptidos inhibidores de JNK; iii) ácidos nucleicos que codifican un péptido inhibidor de JNK, y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos; iv) secuencias de ácidos nucleicos antisentido que codifican un péptido inhibidor y v) moduladores (como inhibidores, agonistas y antagonistas).

El término quot;terapéuticamente eficazquot; significa que la cantidad de péptido inhibidor, por ejemplo, que se emplea es suficiente para mejorar el trastorno asociado a JNK.

El término “tratamiento” incluye la administración de un reactivo que modula la actividad de la quinasa JNK. El término quot;modularquot; incluye la supresión de la expresión de JNK cuando está sobreexpresada. Incluye asimismo la supresión de la fosforilación de c-jun, ATF2 o NFAT4, por ejemplo mediante la utilización de un péptido de una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-6 y 21-22 y la SEQ ID NO: 11-16 y 23-26, como inhibidor competitivo del lugar de unión natural de c-jun ATF2 y NFAT4 en una célula. Por tanto, incluye también la supresión de los complejos hetero- y homo-méricos de los factores de transcripción compuestos por c-jun, ATF2 o NFAT4 y sus asociados relacionados, por ejemplo el complejo AP-1 que está compuesto de c-jun, AFT2 y c-fos. Cuando un trastorno celular proliferativo se asocia a la sobre-expresión de JNK, tales péptidos inhibidores supresivos de pueden introducir en una célula. En algunos casos, “modular” puede incluir aumentar la expresión de JNK, por ejemplo utilizando un anticuerpo específico del péptido IB que bloquea la unión de un péptido IB a JNK, impidiendo así la inhibición de JNK por el péptido asociado a IB. Los inhibidores de JNK, péptidos, péptidos de fusión y ácidos nucleicos de la invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender, además de una de las sustancias mencionadas anteriormente, excipientes, soportes, tampones, estabilizantes farmacéuticamente aceptables u otros materiales bien conocidos por los especialistas en la técnica. Estos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir en la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza exacta del soporte o de otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo vía oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraperitoneal, intraauricular o parche.

Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden tener forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta puede incluir un soporte sólido tal como una gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen en general un soporte líquido como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, un aceite mineral o un aceite sintético. Se puede incluir una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o para una inyección local en el lugar del padecimiento, el ingrediente activo tendrá la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos y con un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos especialistas en la materia pueden preparar fácilmente soluciones adecuadas mediante, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como la Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactato. Se pueden incluir, según se necesiten, conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.

Cuando se deba proporcionar a un individuo un polipéptido, un péptido o una molécula de ácido nucleico u otro compuesto farmacológicamente útil de acuerdo con la presente descripción, la administración se realiza preferentemente en una quot;cantidad profilácticamente eficazquot; o en una quot;cantidad terapéuticamente eficazquot; (según sea el caso, aunque la profilaxis se pueda considerar como terapia) suficiente que beneficie al individuo. La cantidad real administrada, así como la velocidad y la duración de la administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se esté tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo las decisiones sobre la dosificación, etc., es responsabilidad del médico generalista y demás médicos, y tiene en cuenta típicamente el trastorno a tratar, el estado del paciente particular, el lugar de suministro, el método de administración y demás factores conocidos por los médicos. Los ejemplos de técnicas y protocolos mencionados anteriormente pueden encontrarse en REMINGTON's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980.

Alternativamente, se pueden utilizar terapias diana para suministrar el agente activo de forma más específica a ciertos tipos de células, mediante la utilización de sistemas diana tales como ligandos específicos de anticuerpos o células. El direccionamiento puede ser deseable por varias razones; por ejemplo cuando el agente es inaceptablemente tóxico o si necesitara de otro modo una dosificación demasiado alta, o si no pudiera de otro modo entrar en las células diana.

En lugar de administrar estos agentes directamente, podrían ser producidos en las células diana mediante la expresión de un gen codificador introducido en las células, por ejemplo en un vector viral (una variante de la técnica VDEPT - véase a continuación). El vector podría ser direccionado hacia las células específicas a tratar o podría contener elementos reguladores que se conectan de forma más o menos selectiva por las células diana.

Alternativamente, el agente podría administrarse en forma de un precursor para la conversión en una forma activa por un agente activador producido en, o direccionado hacia, las células a tratar. Este tipo de aproximación se conoce a veces como ADEPT o VDEPT; el primero implicando el direccionamiento del agente activador hacia las células mediante la conjugación a un anticuerpo celular específico, mientras que el último implica la producción del agente activador, por ejemplo un péptido inhibidor de JNK, en un vector mediante la expresión procedente del ADN de codificación en un vector viral (véase por ejemplo, la EP-A415731 y WO 90/07936).

En una opción específica, los ácidos nucleicos que incluyen una secuencia que codifica un péptido inhibidor de JNK, o derivados funcionales del mismo se administran para modular las rutas de señales activadas de la JNK por medio de una terapia genética. En realizaciones más específicas, uno o más ácidos nucleicos que codifican un péptido inhibidor de JNK, o derivados funcionales del mismo, se administran por medio de una terapia genética. La terapia genética se refiere a una terapia que se lleva a cabo mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico específico. En esta realización de la presente invención, el ácido nucleico produce su(s) péptido(s) codificado(s), que sirve(n) luego para ejercer un efecto terapéutico mediante su función moduladora de la enfermedad o trastorno, es decir la pérdida de audición. Cualquiera de las metodologías relacionadas con la terapia genética disponibles en la técnica se puede utilizar. Véase, por ejemplo, Goldspiel y col., 1993. Clin. Pharm. 12:488-505.

En una opción preferente, el Producto Terapéutico comprende un ácido nucleico que es parte de un vector de expresión que expresa uno o más de los péptidos asociados a IB, los péptidos asociados a JBD20, o fragmentos, derivados o análogos de los mismos, en un huésped adecuado. En una opción específica, tal ácido nucleico posee un promotor que esté ligado de forma operable a la(s) region(es) de codificación de un péptido inhibidor de JNK. El promotor puede ser inducible o constitutivo y, opcionalmente, específico del tejido. En otra opción específica, se emplea una molécula de ácido nucleico donde secuencias de codificación (y cualquier otra secuencia deseada) están flanqueadas por regiones que favorecen la recombinación homóloga en un lugar deseado dentro del genoma, previendo así la expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, Koller y Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935.

El suministro de este ácido nucleico del Producto Terapéutico a un paciente puede ser directo (es decir, se expone directamente el paciente al ácido nucleico o al vector que contiene el ácido nucleico) o indirectamente (es decir, las células se transforman primero con el ácido nucleico in vitro, luego se trasplantan en el paciente). Estas dos aproximaciones se conocen, respectivamente, como terapia in vivo o ex vivo. En una opción específica, un ácido nucleico se administra directamente in vivo, donde se expresa para producir el producto codificado. Esto se puede llevar a cabo mediante cualquiera de numerosos métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la construcción del ácido nucleico como parte de un vector apropiado de expresión del ácido nucleico y la administración del mismo de manera tal que se convierta en intracelular (por ejemplo, mediante infección utilizando un vector retroviral defectivo o atenuado u otro vector viral; véase la patente de Estados Unidos Nº 4.980.286); inyectando directamente ADN desnudo; utilizando bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un “Gene Gun®; Biolistic, DuPont); recubriendo los ácidos nucleicos con lípidos; utilizando agentes transfectantes / receptores en la superficie celular asociada; encapsulación en liposomas, micropartículas, o microcápsulas; administrándolo en un enlace a un péptido conocido por penetrar en el núcleo; o administrándolo en un enlace a un ligando predispuesto a la endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), que se puede utilizar para “enfocar” tipos de células que expresan específicamente los receptores de interés, etc.

Una aproximación adicional a la terapia genética implica la transferencia de un gen en células en un cultivo de tejido in vitro por medio de métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio, infección viral o similares. En general, el método de transferencia incluye la transferencia concomitante de un marcador de selección a las células. Las células se colocan entonces bajo una presión de selección (por ejemplo resistencia a los antibióticos) para facilitar el aislamiento de aquellas células que han recogido, y están expresando, el gen transferido. Aquellas células se pueden suministrar a un paciente. En una opción específica, antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante, se introduce el ácido nucleico en una célula mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o con bacteriofágos que contienen secuencias de ácido nucleico de interés, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos y metodologías similares, que aseguran que las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células receptoras no son interrumpidas por la transferencia. Véase, por ejemplo, Loeffler and Behr, 1993. Meth. Enzymol. 217:599-618. La técnica elegida debe prever la transferencia estable del ácido nucleico a la célula para que el ácido nucleico pueda ser expresado por la célula. Preferentemente, el ácido nucleico transferido puede ser heredado y expresado por la progenie celular.

En opciones preferentes, las células recombinantes resultantes pueden ser suministradas a un paciente mediante diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la inyección de células epiteliales (por ejemplo, de forma subcutánea), aplicación de células recombinantes de la piel como injerto de piel en el paciente e inyección intravenosa de células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células hematopoyéticas del vástago/del progenitor). La cantidad total de células que se prevén para su uso dependen del efecto deseado, estado del paciente y similares, y pueden ser determinadas por un especialista en la técnica.

Las células en las cuales se puede introducir un ácido nucleico con el propósito de la terapia génica pueden abarcar cualquier tipo celular deseado, disponible, y pueden ser xenogénicas, heterogéneas, singeneicas u autogénicas. Los tipos de células pueden incluir células diferenciadas, tales como células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos, y células sanguíneas, o varias células del vástago/del progenitor, en particular células musculares cardiacas embrionales, células de vástago del hígado (publicación de la patente internacional WO 94/08598), células de vástago neurales (Stemple y Anderson, 1992, Cell 71: 973-985), células hematopoyéticas del vástago o del progenitor, por ejemplo, tal como se obtienen de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal y similares. En una forma preferente, las células utilizadas para la terapia genética son autólogas del paciente.

INMUNOENSAYOS

Los péptidos y anticuerpos se pueden utilizar en ensayos (por ejemplo, inmunoensayos) para detectar, pronosticar, diagnosticar o comprobar los estados, enfermedades y trastornos mencionados anteriormente caracterizados por niveles aberrantes de JNK o por un péptido inhibidor de JNK, o para controlar el tratamiento del mismo. quot;Nivel aberrantequot; significa un incremento o reducción del nivel en una muestra con respecto al que está presente en una muestra análoga procedente de una parte no afectada del cuerpo, o de un sujeto que no tiene trastorno alguno. El inmunoensayo se puede llevar a cabo mediante un método que comprende poner en contacto una muestra procedente de un paciente con un anticuerpo en condiciones tales que pueda tener lugar la unión inmunoespecífica, y posteriormente la detección o medida de la cantidad de toda unión inmunoespecífica por el anticuerpo. En una opción específica, un anticuerpo específico de un péptido inhibidor de JNK se puede utilizar para analizar una muestra de tejido o de suero de un paciente en busca de la presencia de JNK o de un péptido inhibidor de JNK; siendo un nivel aberrante de JNK o de un péptido inhibidor de JNK indicativo de un estado de enfermedad. Los inmunoensayos que se pueden utilizar incluyen sistemas de ensayos competitivos y no competitivos, empleando técnicas tales como Western Blots, radioinmunoensayos (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayos tipo “sandwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, inmunoensayos fluorescentes, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, e inmunoensayos de la proteína A, etc.

KITS

La presente descripción proporciona adicionalmente kits para fines diagnósticos o terapéuticos que incluyen uno o más recipientes que contienen un anticuerpo anti peéptido inhibidor de JNK y, opcionalmente, un compañero de unión marcado para el anticuerpo. El marcador incorporado al anticuerpo puede incluir, de forma no exclusiva, una fracción quimioluminiscente, enzimática, fluorescente, colorimétrica o radiactiva. En otra opción específica, también se proporcionan kits para uso diagnóstico que comprenden uno o más recipientes que contienen ácidos nucleicos que codifican una secuencia inhibidora de JNK o alternativamente que son complementarios de ésta, y opcionalmente un compañero de unión marcado para estos ácidos nucleicos. En una opción específica alternativa, el kit puede comprender, en uno o más recipientes, un par de cebadores de oligonucleótido (por ejemplo, cada uno con una longitud de 6-30 nucleótidos) que pueden actuar como cebadores de amplificación para una reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véase, por ejemplo, Innis y col., 1990, PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CA), reacción en cadena de la ligasa, reacción de sonda cíclica y similares, u otros métodos conocidos en la técnica. Opcionalmente, el kit también puede incluir una cantidad determinada de un péptido inhibidor de JNK purificado, o ácidos nucleicos del mismo, para su uso como diagnóstico, patrón o control en los ensayos.

El alcance de la presente invención no se limita a las realizaciones específicas aquí descritas. De hecho, a partir de la anterior descripción y las figuras adjuntas, para los expertos en la técnica serán evidentes diversas modificaciones de la invención además de las aquí descritas.

EJEMPLOS ESPECÍFICOS

Ejemplo 1: Identificación de Péptidos Inhibidores de JNK

Se identificaron las secuencias de aminoácidos importantes para la interacción eficaz con JNK por las alineaciones de las secuencias entre los JBDs conocidos. La comparación de secuencias entre los JBDs de IB1 [SEQ ID NO:17], IB2 [SEQ ID NO:18], c-Jun [SEQ ID NO:19] y ATF2 [SEQ ID NO:20] definió una secuencia de 8 aminoácidos débilmente conservada (FIG. 1A). Como los JBDs de IB1 e IB2 son aproximadamente 100 veces más eficaces que c-Jun o ATF2 en la unión a JNK (Dickens y col., Science 277: 693 (1997), se pensó que los residuos conservados entre IB1 e IB2 deberían ser importantes para conferir la máxima unión. La comparación entre los JBDs de IB1 e IB2 definió dos bloques de siete y tres aminoácidos altamente conservados entre las dos secuencias. Estos dos bloques están incluidos en una secuencia peptídica de 23 aminoácidos en IB1 [SEQ ID NO: 1] y de 21 aminoácidos en IB2 [SEQ ID NO: 2]. Estas secuencias se muestran en la FIG. 1B, las rayas en la secuencia IB2 indican un espacio en la secuencia con el fin de alinear los residuos conservados.

Los péptidos inhibidores de JNK (JNKI) de la presente invención se obtuvieron uniendo el motivo de unión de JIP-1/IB1 a la JNK de 20 aminoácidos, denominado aquí JBD20, a una proteína de tráfico, por ejemplo la secuencia transportadora HIV-TAT48-57 de 10 aminoácidos.

Ejemplo 2: Preparación de Proteínas de Fusión Inhibidoras de JNK

Se sintetizaron proteínas de fusión inhibidoras de JNK enlazando de forma covalente el extremo C-terminal de JBD23 o la secuencia de 21 aminoácidos procedente del JBD de IB2 (JBD21) o el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos JBD20 a un péptido transportador de 10 aminoácidos de longitud N-terminal procedente de VIH-TAT48-57 (Vives y col., J. Biol. Chem. 272: 16010 (1997)) a través de un espaciador compuesto de dos residuos de prolina. Este espaciador se utilizó para permitir la máxima flexibilidad e impedir cambios estructurales secundarios no deseados. Como se muestra en la FIG. 1C, estas preparaciones se designaron L-TAT [SEQ ID NO:7], L-TAT-IB1 [SEQ ID NO: 11], L-TAT-IB2 [SEQ ID NO: 12] y L-TAT-JNKI1 [SEQ ID NO:21], respectivamente. Todos los péptidos de fusión TAT de los péptidos retroinversos D se sintetizaron también y se designaron D-TAT [SEQ ID NO: 8], D-TAT-IB1 [SEQ ID NO: 14] y D-TAT-JNKI1 [SEQ ID NO: 22] respectivamente. Todos los péptidos D y L se produjeron mediante síntesis simulada F clásica y se analizaron después por Espectrometría de Masas. Se purificaron finalmente por HPLC. Para determinar los efectos del espaciador de prolina, se produjeron dos tipos de péptido TAT, uno con y uno sin dos prolinas. No parece que la adición de las dos prolinas modifique la entrada o la localización del péptido TAT en las células interiores.

Los péptidos genéricos que muestran los residuos de aminoácidos conservados se muestran en la FIG. 2. Una quot;Xquot; indica cualquier aminoácido. El número de X en un péptido determinado no se limita al que se describe y puede variar (es decir, X puede representar cualquier número de residuos de aminoácidos, incluyendo cero). Véase arriba para una descripción más detallada de las secuencias genéricas.

Ejemplo 3: Inhibición de la Muerte de Células-1 por JBD23

Se estudiaron entonces los efectos de la secuencia de JBD de 23 aminoácidos de longitud de IB1 sobre las actividades biológicas de la JNK. La secuencia de 23 aminoácidos estaba enlazada en el N-terminal a la Proteína Fluorescente Verde (constructo GFP-JBD23), y se evaluó el efecto de este constructo sobre la apoptosis de células-� pancreáticas inducida por IL-1 �. Véase la FIG. 3. Se demostró previamente que este modo de apoptosis había sido bloqueado por la transfección con JBD1-280, mientras que los inhibidores específicos de ERK1/2 o p38 no se protegieron. Véase Ammendrup y col, más arriba.

Los oligonucleótidos correspondientes a la secuencia de 23 aminoácidos (JBD23; FIG. 1B) y una secuencia mutada en las regiones totalmente conservadas (JBD23mut) fueron sintetizados e insertados direccionalmente en los sitios EcoRI y Sall del vector pEGFP-N1 que codifica la Proteína Fluorescente Verde (GFP) (de Clontech). Se cultivaron células �TC-3 productoras de insulina en un medio RPMI 1640 complementado con Suero de Ternera Fetal al 10%, 100 Ig/ml de estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina y 2 mM de glutamina. Las células �TC-3 productoras de insulina fueron transfectadas con los vectores indicados y se añadió IL-1� (10 ng/ml) al medio de cultivo celular. El número de células apoptóticas se contó 48 horas después de la adición de IL-1� utilizando un microscopio de fluorescencia invertido. Se distinguieron las células apoptóticas de las células normales por la quot;formación de ampollasquot; características en el citoplasma y se contaron después de dos días.

Tal como se indica en la FIG. 3, GFP es el vector de expresión de la Proteína Fluorescente Verde utilizado como control; JBD23 es el vector que expresa una GFP quimérica enlazada a la secuencia de 23 aminoácidos procedente del JBD de IB1; JBD23Mut es el mismo vector que GFP-JBD23, pero con un JBD mutado en cuatro residuos conservados mostrados en la FIG 1B; y JBD280 es el vector de GFP enlazado al JBD entero (aminoácidos 1-280). La construcción que expresa GFP-JBD23 impidió la apoptosis de células �pancreáticas inducida por IL-1� tan eficazmente como el JBD1-280 entero (FIG. 3, 7BD23/IL-1 comparado con JBD280/IL-1). Como controles adicionales, las secuencias mutadas en los residuos de IB1 totalmente conservados tenían una capacidad muy reducida de impedir la apoptosis (FIG. 3, JBD23Mut/IL-1).

Ejemplo 4: Importación Celular de los Péptidos TAT-IB1 y TAT-IB2

Se evaluó la capacidad de las formas L- y D-enantioméricas de los péptidos TAT, TAT-IB1 y TAT-IB2 (quot;péptidos TAT-IBquot;) para penetrar en las células.

Los péptidos L-TAT, D-TAT, L-TAT-IB1, L-TAT-IB2 y D-TAT-IB1 [SEQ ID NOs: 7, 8, 11, 12 y 14, respectivamente] fueron marcados por adición N-terminal de un residuo de glicina conjugado a fluoresceína. Los péptidos marcados (1 IM) se añadieron a los cultivos de células �TC-3, que se mantuvieron tal como se describe en el Ejemplo 3. En ciertos momentos predeterminados, se lavaron las células con PBS y se fijaron durante cinco minutos en metanol-acetona (1:1) helado antes de ser examinadas bajo microscopio de fluorescencia. Se utilizó como control BSA marcado con fluoresceína (1 IM, 12 mol/mol de BSA). Los resultados demostraron que todos los péptidos marcados con fluoresceína anteriores habían penetrado eficaz y rápidamente (menos de cinco minutos) en las células una vez añadidos al medio de cultivo. A la inversa, la seroalbúmina bovina marcada con fluoresceína (1 IM de BSA, 12 mol de fluoresceína/mol de BSA) no penetró en las células.

Un estudio temporal indicó que la intensidad de la señal fluorescente para los péptidos L-enantioméricos se redujo en un 70% después de un período de 24 horas. Después de 48 horas había pocas señales o ninguna señal. Por contraste, D-TAT y D-TAT-IB1 eran extremadamente estables dentro de las células. Las señales fluorescentes procedentes de todos estos péptidos retro-inversos D seguían siendo muy fuertes 1 semana más tarde, y la señal había disminuido sólo apenas a las 2 semanas después del tratamiento.

Ejemplo 5: Inhibición in vitro de la Fosforilación de c-JUN, ATF2 y Elk1

Se investigaron in vitro los efectos de los péptidos sobre la fosforilación mediada por las JNKs de sus factores de transcripción diana. Se produjeron JNK1, JNK2 y JNK3 recombinantes y no activados por medio de un kitde TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN de lisados de reticulocitos de conejo (Promega) y se utilizaron en ensayos de quinasa en fase sólida con c-Jun, ATF2 y Elk1, solos o fundidos a glutation-S-transferasa (GST), como sustrato. Se realizaron estudios dosis-respuesta donde los péptidos L-TAT, L-TAT-IB1 o L-TAT-IB2 (025 IM) se mezclaron con las quinasas JNK1, JNK2 o JNK3 recombinantes en el tampón de reacción (20 mM Tris-acetato, 1 mM EGTA, 10 mM p-nitrofenil-fosfato (pNPP), 5 mM pirofosfato de sodio, 10 mM pglicerofosfato, 1 mM de ditiotreitol) durante 20 minutos. Las reacciones de las quinasas se iniciaron entonces mediante la adición de 10 mM MgCl2 y 5 ICi de 33P-y-dATP y 1 Ig de GST-Jun (aminoácidos 1-89), GST-AFT2 (aminoácidos 1-96) o GST-ELK1 (aminoácidos 307-428). Las proteínas de fusión con GST se compraron a Stratagene (La Jolla, CA). Se añadieron también a la mezcla diez Il de perlas de glutatiónagarosa. Los productos de reacción se separaron entonces por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10% desnaturalizante. Se secaron los geles y se expusieron posteriormente a películas de rayos X (Kodak). Se observó una inhibición casi completa de la fosforilación de c-Jun, ATF2 y Elk1 por las JNKs a dosis de péptidos TAT-IB tan bajas como de 2,5 IM. Sin embargo, la excepción notable fue la ausencia de inhibición por TAT-IB de la fosforilación por JNK3 de Elk1. En general, el péptido TAT-IB1 apareció ligeramente superior a TAT-IB2 en la inhibición de la fosforilación de la familia de JNK de sus factores de transcripción diana (Véase la FIG. 4A).

La capacidad de los péptidos D-TAT, D-TAT-IB1 y L-TAT-IB1 (estudio con dosificación de 0-250 IM) para inhibir la fosforilación de GST-Jun (aminoácidos 1-73) por JNK1, JNK2 y JNK3 recombinantes se analizó tal como se ha descrito anteriormente. En general, el péptido D-TAT-IB1 redujo la fosforilación mediada por JNK de c-Jun, pero a niveles aproximadamente 10-20 veces menos eficaces que L-TAT-IB1 (Véase la FIG. 4B).

Ejemplo 6: Inhibición de la Fosforilación de c-JUN por JNK Activado

Se evaluaron los efectos de los péptidos L-TAT, L-TAT-IB1 ó L-TAT-IB2 sobre las JNK activadas por estímulos estresantes utilizando GST-Jun para reducir las JNK procedentes de células HeLa irradiadas con luz UV o células �TC tratadas con IL-1�. Se cultivaron células �TC tal como se ha descrito anteriormente. Se cultivaron las células HeLa en un medio DMEM complementado con Suero de Ternera Fetal al 10%, 100 Ig/ml de estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina y 2 mM de glutamina. Una hora antes de utilizarlas para la preparación del extracto celular, se activaron las células �TC con IL-1� tal como se ha descrito anteriormente, mientras que las células HeLa fueron activadas con luz UV (20 J/m2). Se preparon extractos celulares a partir de células HeLa irradiadas con luz UV, de control, y células �TC-3 tratadas con IL-1� extrayendo los cultivos celulares en un tampón de lisis (20 mM Tris-acetato, 1mM EGTA, Triton-X-100 al 1%, 10 mM p-nitrofenil-fosfato, 5 mM pirofosfato de sodio, 10 mM �-glicerofosfato, 1 mM ditiotretiol). Se eliminaron los restos por centrifugación durante cinco minutos a 15.000 rpm en un rotor SS-34 Beckman. Se incubaron cien Ig de extractos durante una hora a temperatura ambiente con un Ig de GST-Jun (aminoácidos 1-89) y 10 Il de perlas de glutatión-agarosa (Sigma). Después de cuatro lavados con el tampón de extracción, se resuspendieron las perlas en el mismo tampón complementado con los péptidos L-TAT, L-TAT-IB1 o L-TAT-IB2 (25 IM) durante 20 minutos. Las reacciones de las quinasas se iniciaron entonces mediante la adición de 10 mM MgCl2 y 5 ICi de 33P-y-dATP y se incubaron durante 30 minutos a 30ºC. Los productos de reacción se separaron entonces por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10% desnaturalizante. Se secaron los geles y se expusieron posteriormente a películas de rayos X (Kodak). En estos experimentos, los péptidos TAT-IB impidieron eficazmente la fosforilación de c-Jun por las JNK activadas (Véase la FIG. 6).

Ejemplo 7: Inhibición in vivo de la Fosforilación de c-JUN por los Péptidos TAT-IB

Para determinar si los péptidos con permeabilidad celular podrían bloquear la señalización de JNK in vivo, utilizamos un sistema GAL4 heterólogo. Células HeLa cultivadas tal como se ha descrito anteriormente fueron cotransfectadas con el vector reporter 5xGAL-LUC junto con el constructo de expresión de GAL-Jun (Stratagene), que comprende el dominio de activación de c-Jun (aminoácidos 1-89) enlazado al dominio de unión a ADN GAL4. La activación de JNK se obtuvo mediante la cotransfección de los vectores que expresan las quinasas directamente quot;aguas arribaquot; MKK4 y MKK7 (véase, Whitmarsh y col., Science 285: 1573 (1999)). Brevemente, 3 x 105 células fueron transfectadas con los plásmidos en placas de 3,5 cm utilizando DOTAP (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para los experimentos que implicaban GAL-Jun, 20 ng del plásmido fueron transfectados con 1 Ig del plásmido reporter pFR-Luc (Stratagene) y 0,5 Ig de los plásmidos de expresión MKK4 o MKK7. Tres horas después de la transfección, se cambiaron los medios celulares y se añadieron (1 IM) los péptidos TAT, TAT-IB1 y TAT-IB2. Se midieron las actividades de luciferasa 16 horas más tarde por medio del quot;Sistema del Doble Reporterquot; de Promega después de la normalización del contenido proteico. Como se muestra en la FIG. 5, la adición de los dos péptidos TAT-IB1 y TAT-IB2 bloqueó la activación de c-Jun después de la activación mediada por MKK4 y MKK7 de JNK. Debido a que las células HeLa expresan las isoformas tanto de JNK1 como de JNK2 pero no de JNK3, transfectamos células con JNK3. De nuevo, los dos péptidos TAT-IB inhibieron la activación mediada por JNK2 de c-Jun.

Ejemplo 8: Inhibición de la Muerte de Células-1 Pancreáticas Inducida por IL-11 por los Péptidos TAT-IB

Investigamos los efectos de los péptidos L-TAT-IB sobre la promoción de la apoptosis de célulaspancreáticas provocada por IL-1�. Se incubaron los cultivos celulares de �TC-3 durante 30 minutos con 1 IM de los péptidos L-TAT-IB1 o L-TAT-IB2 seguido de 10 ng/ml de IL-1 �. Se realizó una segunda adición del péptido (1 IM) 24 horas más tarde. Se contaron las células apoptóticas después de dos días de incubación con IL-1� utilizando una tinción nuclear con yoduro de propidio (las células de color rojo son células muertas) y Hoechst 33342 (las células de color azul son células con su membrana plasmática intacta). Como se muestra en la FIG. 5, la adición de los péptidos TAT-IB inhibió la apoptosis inducida por IL-1� de las células

�TC-3 cultivadas dos días en presencia de IL-1 �.

La inhibición a largo plazo de la muerte celular inducida por IL-1� se estudió mediante el tratamiento de células �TC-3 tal como se ha descrito anteriormente, excepto que la incubación de las células con los péptidos e IL-1� se mantuvo durante 12 días. Se añadieron péptidos adicionales (1 IM) cada día y se añadieron cada 2 días IL-1 (10 ng/ml). El péptido TAT-IB1 confiere en estas condiciones una fuerte protección contra la apoptosis. Tomados conjuntamente, estos experimentos establecen que los péptidos TAT-IB son moléculas biológicamente activas capaces de prevenir los efectos de la señalización de JNK sobre el destino celular.

Ejemplo 9: Síntesis de un Péptido Retro-Inverso D Total

Los péptidos de la invención pueden ser péptidos con aminoácidos D totales sintetizados al revés para prevenir la proteolisis natural (es decir, péptidos retro-inversos D totales). Un péptido retro-inverso D total de la invención proporciona un péptido con propiedades funcionales similares al péptido nativo donde los grupos laterales del componente aminoácido corresponden a la alineación del péptido nativo, pero que conservan una columna resistente a las proteasas.

Los péptidos retro-inversos de la invención son análogos sintetizados utilizando aminoácidos D mediante la unión de los aminoácidos en una cadena peptídica de modo tal que la secuencia de aminoácidos en el análogo de péptido retro-inverso sea exactamente la contraria a la secuencia en el péptido seleccionado que sirve de modelo. Para ilustrarlo, si la proteína TAT natural (formada por L-aminoácidos) tiene la secuencia GRKKRRQRRR [SEQ ID NO:7], el análogo de péptido retro-inverso de este péptido (formado por Daminoácidos) tendrá la secuencia RRRQRRKKRG [SEQ ID NO:8]. Son conocidos en la técnica los procedimientos para sintetizar una cadena de D-aminoácidos para formar los péptidos retro-inversos. Véase, por ejemplo, Jameson y col., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady y col., Nature, 368, 692-693 (1994)); Guichard y col., J. Med. Chem. 39, 2030-2039 (1996). De forma específica, los retro-péptidos se produjeron por medio de la síntesis simulada F clásica y se analizaron después por Espectrometría de Masas. Se purificaron finalmente por HPLC.

Debido a que un problema inherente a los péptidos nativos es la degradación por las proteasas naturales y la inmunogenicidad inherente, los compuestos heterobivalentes o heteromultivalentes de esta invención se prepararán para incluir el quot;isómero retro-inversoquot; del péptido deseado. La protección del péptido contra la proteolisis natural, por tanto, tendría que aumentar la eficacia del compuesto heterobivalente o heteromultivalente específico, tanto prolongando la vida media como disminuyendo el alcance de la respuesta inmune destinada a destruir activamente los péptidos.

Ejemplo 10: Actividad Biológica a Largo Plazo de los Péptidos IB Retro-Inversos D Totales

La actividad biológica a largo plazo se prevé para D-TAT-IB retro-inverso que contiene el heteroconjugado peptídico cuando se compara con el análogo de L-aminoácido nativo debido a la protección del péptido DTAT-IB contra la degradación por proteasas nativas, tal como se muestra en el Ejemplo 5.

Se analizó la inhibición de la muerte de células-pancreáticas inducida por IL-1� por el péptido D-TAT-IB1. Tal como se muestra en la FIG. 10, se incubaron las células �TC-3 tal como se ha descrito anteriormente durante 30 minutos con una sola adición de los péptidos indicados (1 IM), luego se añadió IL-1� (10 ng/ml). Se contaron entonces las células apoptóticas después de dos días de incubación con IL-1� utilizando una tinción nuclear con yoduro de propidio y Hoechst 33342. Se contó un mínimo de 1.000 células en cada experimento. Se indica el Error Estándar de las Medias (SEM), n=5. El péptido D-TAT-IB1 redujo la apoptosis inducida por IL-1 hasta un punto similar a los péptidos L-TAT-IB (comparar la FIG. 5 y la FIG. 10).

Se analizó también la inhibición a largo plazo de la muerte celular inducida por IL-1� por el péptido D-TAT-IB1. Se incubaron las células �TC-3 tal como se hizo anteriormente durante 30 minutos con una sola adición de los péptidos indicados (1 IM), luego se añadió IL-1� (10 ng/ml), seguido de la adición de la citoquina cada dos días. Se contaron entonces las células apoptóticas después de 15 días de incubación con IL-1 utilizando una tinción nuclear con yoduro de propidio y Hoechst 33342. Observen que una sola adición del péptido L-TAT-IB1 no confiere una protección a largo plazo. Se contó un mínimo de 1.000 células en cada experimento. Se indica el Error Estándar de las Medias (SEM), n=5. Se muestran los resultados en la FIG. 9. El péptido D-TAT-IB1, pero no L-TAT-IB1, fue capaz de conferir una protección a largo plazo (15 días).

Ejemplo 11: Inhibición de la Muerte de Células-1 Pancreáticas Inducida por Irradiación por los Péptidos TAT-IB

Se activa también JNK por radiación ionizante. Para determinar si los péptidos TAT-IB proporcionaban protección contra el daño a JNK inducido por radiación, se irradiaron (30 Gy) células quot;WiDrquot; en presencia o ausencia de los péptidos D-TAT, L-TAT-IB1 o D-TAT-IB1 (1 IM añadido 30 minutos antes de la irradiación), tal como se indica en la FIG. 10. No se irradiaron las células control (CTRL). Se analizaron las células 48 horas más tarde por medio de tinción PI y Hoechst 33342, tal como se ha descrito anteriormente. Se indica el SEM, n=3. Ambos péptidos L-TAT-IB1 y D-TAT-IB1 fueron capaces de impedir la apoptosis inducida por irradiación en esta línea celular de cáncer de colón humano.

Ejemplo 12: Radioprotección contra la Radiación Ionizante por los Péptidos TAT-IB

Para determinar los efectos radioprotectores de los péptidos TAT-IB, se irradiaron ratones C57 B1/6 (de 2 a 3 meses de edad) con un rayo 250R de Phillips RT a una velocidad de dosificación de 0,74 Gy/min (filtro de Cu de 0,5 mm, 17 mA). Treinta minutos antes de la irradiación, se inyectaron i.p. los animales con los péptidos TAT, L-TAT-IB1 y D-TAT-IB1 (30 Il de una solución de 1 mM). Brevemente, se irradiaron los ratones como sigue: se colocaron los ratones en pequeñas cajas de plástico con la cabeza fuera de la caja. Se colocaron los animales de espaldas bajo el irradiador y se les fijó el cuello en un pequeño túnel de plástico para mantener la cabeza en una posición correcta. Se protegió el cuerpo con plomo. Antes de la irradiación, se mantuvieron los ratones con comida en gránulos estándar para ratones, sin embargo después de la irradiación los ratones fueron alimentados con una comida semilíquida que se renovó cada día.

La reacción de la mucosa labial fue registrada entonces por 2 observadores independientes de acuerdo con un sistema de registro desarrollado por Parkins y col. (Parkins y col., Radiotherapy & Oncology, 1: 165-173, 1983), en el que se registró el estado eritematoso así como la presencia de edema, descamación y exudación. Además, se pesaron los animales antes de cada registro de su estado eritematoso/edematoso.

La FIG. 12A ilustra el peso de los ratones después de la irradiación. Los valores se indican según el peso inicial de los ratones que fue establecido en 100. CTRL: ratones control inyectados con 30 Il de una solución salina. n=2 para cada uno de los valores indicados, se indican los S.D. Los valores x son días.

La FIG. 12B ilustra el registro de eritema/edema después de la irradiación. Se cuantificó el estado edematoso y eritematoso del labio ventral de los mismos ratones como en la FIG. 12A. n=2 para cada valor registrado. Los valores x son días.

Los resultados de estos experimentos indican que los Péptidos TAT-IB pueden proteger contra la pérdida de peso y contra el eritema/edema asociados a la radiación ionizante.

Ejemplo 13: Supresión de los Factores de Transcripción de JNK por los Péptidos L-TAT-IB1

Se llevaron a cabo ensayos de retardo en gel con una sonda de doble marcado de AP-1 (5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3'). Los extractos nucleares de células HeLa que fueron tratados o no durante una hora con 5 ng/ml de TNF-a, son tal como se indican. Los péptidos TAT y L-TAT-IB1 se añadieron 30 minutos antes de TNF-a. Se muestra solamente la parte del gel con el complejo ADN AP-1 específico (tal como lo demuestran los experimentos de competición con competidores no específicos y específicos no marcados). Los péptidos L-TAT-IB1 reducen la formación del complejo de unión de AP-1 a ADN en presencia de TNF-a (Véase la FIG. 11).

Ejemplo 14: Protección por los Péptidos D-TAT-IB Contra la Pérdida de Audición Inducida por Ruido

Se inyectó una solución de D-JNKI (1 IM, 1 μl/h) en el oído interno derecho de una cobaya tal como se muestra en la Fig. 13, panel A, mientras que se inyectó solamente una solución salina en el oído izquierdo. La cobaya se expuso entonces a un trauma acústico (120 dB, 30 minutos) y se llevó a cabo el registro de la sensibilidad de audición tres días después (Fig. 13, panel B), así como el examen histológico del oído interno (Fig. 13, panel C y D). Como se muestra en la Fig. 13, las estructuras ciliadas del oído tratado con JNKI están totalmente protegidas contra la destrucción inducida por ruido, tal como se estima a partir del examen histológico, por contraste con el oído no tratado en el cual ha desaparecido la mayor parte de las estructuras ciliadas. Además, parece que se ha conservado la sensibilidad al ruido del oído tratado con D-JNK1 (Fig. 13, panel B).

Ejemplo 15: Protección por los Péptidos D-TAT-IB Contra la Pérdida de Audición Inducida por Antibióticos

Se trataron los oídos internos de pollos con estreptomicina en presencia/ ausencia de D-JNKI. Se realizaron entonces experimentos TUNEL para detectar la apoptosis (núcleos verdes). Como se muestra en la Fig. 14, la D-JNKI protege totalmente los oídos internos contra la apoptosis inducida por la estreptomicina. Por tanto, la D-JNK-I es útil en la prevención de estados de pérdida de audición sostenidos debidos a una terapia con antibióticos.

Ejemplo 16: Protección por los Péptidos D-TAT-IB Contra la Destrucción de Islotes Pancreáticos Inducida por Citoquinas Proinflamatorias

Se trataron células de los islotes pancreáticos con D-JNK1 (1 mM durante una hora antes de su exposición a la interleuquina 1B (10 ng/ml)). Como se muestra en la Fig. 15, los islotes tratados con D-JNK1 resisten la destrucción inducida por IL-1B. Esto indica que el tratamiento con D-JNK1 ayuda a conservar los islotes injertados.

Ejemplo 17: Aumento de la Recuperación de Células de los Islotes Pancreáticos por los Péptidos D-TAT-IB

Se añadió D-JNK-I junto con colagenasa durante el aislamiento de las células de los islotes. Esto resultó en una producción incrementada de islotes después de 3 días en el cultivo, tal como se mide mediante el aumento de lactato-deshidrogenasa. Véase la FIG. 15.

Ejemplo 18: Métodos Generales Utilizados para Ensayar los Efectos de los Péptidos JNKI sobre la Activación de JNK y la Acción Relacionada con JNK

Cultivo Neuronal General: Pequeños trozos de corteza cerebral de crías de dos días de rata adulta se disecaron e incubaron con 200 unidades de papaína durante 30 minutos a 34ºC. Luego, se colocaron en placas las neuronas a densidades de aproximadamente 1 x 106 células/placa en cubetas que habían sido pre-recubiertas con 100 Ig/ml de poli-D-lisina. Se cultivaron las células utilizando un medio de cultivo B27/Neurobasal (Life Technologies) complementado con 0,5 m de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 Ig/ml de estreptomicina.

Ensayo de citotoxicidad mediante lactato-deshidrogenasa (LDH): La cantidad de LDH liberada en el medio de cultivo se midió utilizando el kit de ensayo de citotoxicidad no radioactivo Cytotox 96 (Promega).

Captación de GST-c-Jun y ensayo de quinasa: Se prepararon extractos celulares mediante raspado de células en un tampón de lisis (20 mM Tris-acetato, 1mM EGTA, Triton-X-100 al 1%, 10 mM p-nitrofenilfosfato, 5 mM pirofosfato de sodio, 10 mM �-glicerofosfato, 1 mM ditiotretiol). Se incubaron muestras de 25 Ig durante 1 hora a temperatura ambiente con 1 Ig de GST-c-Jun (residuos de aminoácidos 1-89) y 10 Il de perlas de glutatión-agarosa (Sigma). Se lavaron las perlas cuatro veces y se resuspendieron en el tampón de lisis descrito anteriormente. Se realizaron entonces los ensayos de quinasa in vitro utilizando JNK1a1 recombinante y 0,5 Ig de un sustrato seleccionado de entre el grupo compuesto por proteínas de fusión con GST (por ejemplo, proteínas de fusión GST-Jun y GST-Elk1), caseína e histona (Sigma). Se iniciaron las reacciones con 10 mM MgCl2 y 10 IM ATP en presencia de 5 ICi33P-ATP, y se incubaron durante 30minutos a 30ºC. Los productos de reacción se separaron por SDS-PAGE, se secaron los geles y después se expusieron a películas de rayos X (Kodak).

Western Blot: Se obtuvieron extractos proteicos totales mediante raspado de células en el tampón de lisis (descrito anteriormente), separando las proteínas en un gel de poliacrilamida SDS al 12%. Las proteínas separadas se trasladaron entonces a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Los anticuerpos utilizados en el Western Blot descritos aquí se obtuvieron de Alexis.

Separación de núcleos del citoplasma: Para aislar los núcleos para el análisis Western Blot (véase la FIG. 17B), se lisaron neuronas durante 15 minutos en el tampón de lisis y después se centrifugaron las muestras a 300 g durante 10 minutos a 4ºC. Los gránulos nucleares se reconstituyeron en el tampón de lisis y luego se sonicaron.

RT-PCR en tiempo real: Se realizó la RT-PCR utilizando iniciadores específicos en un aparato ciclador de luz (Roche). Se utilizó la transcripción de actina como control para normalizar la cantidad y calidad de los ARN que se extrajeron por medio del método de Chomczynski. Véase Chomczynski y col., Anal. Biochem., 162:156-59 (1987). Las secuencias de los cebadores utilizados fueron como sigue:

c-Fos: Directa: 5’-GCTGACAGATACACTCCAAG-3’ Inversa: 5’-CCTAGATGATGCCGGAAACA-3’

Actina: Directa: 5’-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3’ Inversa: 5’-ATTGTAGAAGGTGTGGTGCCA-5’

Inmunohistoquímica de P-c-jun: P-c-jun, tal como se utiliza aquí, se refiere a formas fosforiladas de c-jun. Se enfocó P-c-jun con un anticuerpo policlonal de conejo (500x en PBS) (Tecnología de Señalización Celular). El complejo de anticuerpos resultante se visualizó con 3,3-diaminobenzidina como sustrato.

Isquemia transitoria en ratones adultos: En ratones machos ICR-CD1 (con una edad de aproximadamente 6 semanas y un peso en el rango de aproximadamente 18 a 37 g) (Harlan, Inc.) se provocó la isquemia mediante la introducción de un filamento desde la arteria carótida en la arteria carótida interna y haciendo avanzar el filamento en el círculo arterial, ocluyendo así la arteria cerebral media. Véase, por ejemplo, Huang y col., Science, 265:1883-85 (1994); Hara y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94:2007-12 (1997). Se midió el flujo de sangre cerebral regional por flujometría láser-Doppler con una sonda fijada en el cráneo hasta la isquemia y hasta 10 minutos después de la reperfusión. Se midió la temperatura rectal y se mantuvo a 37ºC. Se sacrificaron los animales 48 horas después de la reperfusión. Se cortaron series de secciones criostáticas de 20 IM de espesor utilizando un sistema de microscopio por ordenador provisto del programa Neurolucida (Microbrightfield, Inc.) y se calcularon los volúmenes de la zona isquémica y de todo el cerebro (a ciegas) con el programa Neuroexplorer. La presión sanguínea sistólica y diastólica se midió con un catéter arterial en tres ratones más desde 10 minutos antes de la inyección de D-JNKI1 hasta 30 minutos después. Estas mediciones de la presión sanguínea mostraron que las inyecciones no habían afectado a la presión sanguínea (es decir, un cambio inferior al 10%). Se siguieron en todos los experimentos las directrices de la Swiss Federal Veterinary Office.

Isquemia focal permanente en ratas jóvenes (P14): Se obtuvo la oclusión de la arteria cerebral por electrocoagulación de la arteria cerebral media en una posición cercana a su origen en su unión con la rama olfatoria. Las ratas (Wistar), que pesaban entre aproximadamente 27 y 35 g, fueron sacrificadas 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media. Las ratas fueron sacrificadas mediante una sobredosis de hidrato de cloral y fueron perfundidas a través del ventrículo izquierdo con fijador de Zamboni. Los cerebros fueron postfijados durante 2 horas en la misma solución utilizada para la perfusión y luego los cerebros fueron infiltrados durante toda la noche en sacarosa al 30% para la crioprotección. Se dibujaron (colorearon) los contornos de cada zona isquémica con un sistema de microscopio por ordenador. La zona de la lesión isquémica y de todo el cerebro se dibujó a partir de series de secciones de crióstato de 50 Im teñidas con violeta de cresilo utilizando el programa Neurolucida y se calcularon los volúmenes de cada una por medio del programa Neuroexplorer, tal como se ha descrito anteriormente.

Estadísticas: Los datos procedentes de ambos modelos de isquemia (es decir, transitoria y permanente) se transformaron logaritmicamente para satisfacer el criterio Gaussiano. Los datos se analizaron mediante ANOVA global (p lt; 0,0001 para ambos modelos) seguido de ensayos-t no pareados de cola única.

Ejemplo 19: Sensibilidad y Especificidad de los Péptidos JNKI con respecto a la acción de JNK

Los péptidos JNKI1 utilizados en estos experimentos son destinados a bloquear el acceso de JNK a c-Jun y a otros sustratos mediante un mecanismo competitivo directo. Véase por ejemplo, Bonny y col., Diabetes, 50:77-82 (2001); Barr y col., J. Biol. Chem., 277:10987-97 (2002), incorporados aquí como referencia.

El efecto inhibidor de L-JNKI1 y D-JNKI1 sobre la activación y acción de JNK se sometió a prueba utilizando ensayos de qquinasa, tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 18. Se muestran los resultados de estos experimentos en las FIG. 16A-16C. El efecto inhibidor de L-JNKI1 y D-JNKI1 sobre la activación y acción de JNK se muestra por su capacidad para impedir la fosforilación in vitro de las dianas conocidas c-Jun y Elk1 de JNK utilizando JNK1a1 (Véase la FIG. 16A). Los términos “P-Jun” y “P-Elk1” tal como se utilizan aquí se refieren a las formas radioetiquetadas (es decir, fosforiladas con 33P-ATP) de los sustratos GST-Jun y GST-Elk1, respectivamente. La FIG. 16B demuestra el efecto inhibidor de la secuencia inhibidora mínima de JNK de 20 aminoácidos de JIP-IB1 (forma-L de JBD20) (SEQ ID NO:21)) en experimentos dosisrespuesta, utilizando condiciones similares a las utilizadas para someter a prueba el efecto de L-JNKI1 y D-JNKI1 y mediante cantidades decrecientes de L-JBD20. La FIG. 16B ilustra que el péptido L-JBD20 (SEQ ID NO:21) solo (es decir, sin la secuencia TAT) puede inhibir la acción de JNK. Se demostró también que JBD20 inhibía otras dianas de JNK, incluidas ATF2, IRS-1, MADD, bc1-x1. En cada uno de estos casos, la IC50 fue de aproximadamente 1 IM (datos no mostrados). La secuencia TAT en estos experimentos no estaba ligada a JBD20 debido a que, a una concentración superior a 50 IM, la secuencia TAT provoca una precipitación no específica de las proteínas en los extractos. Por debajo de 50 IM, TAT no influye en las propiedades inhibidoras de los péptidos JBD20.

Se realizaron experimentos in vitro para determinar la especificidad de los péptidos JNKI en el bloqueo de la activación de JNK. En particular, se sometió a prueba el efecto de estos péptidos sobre la actividad de 40 quinasas diferentes (10 IM péptidos, 10 IM ATP) hacia sus sustratos respectivos. La lista completa de los sustratos utilizados en estos experimentos se puede encontrar en http://www.upstate.com/img/pdf/KinaseProfiler.pdf. Tal como se esperaba, los péptidos JNKI tenían un efecto sobre las JNKs y las quinasas MKK4 y MKK7, conteniendo todos dominios de unión a JNK. Los péptidos (las formas tanto L-JNKI1 como D-JNKI1) dejaron completamente de dificultar las actividades de todas las otras quinasas. Experimentos adicionales demostraron que 500 IM de los péptidos JBD20 no dificultaron la actividad de 6 quinasas particulares: ERK2, p38, pKC, p34, caK y pKA (FIG. 16C). Los sustratos de estas quinasas son ERK2:ERK1; p38:ATF2; p34, pKC, pKA:histona y caK:caseína. Este nivel de especificidad está muy por encima de los niveles logrados con otros pequeños inhibidores químicos de la Jun-N-terminal quinasa, demostrando así la selectividad extremadamente alta de los péptidos JNKI de la invención. Para informarse sobre otros pequeños inhibidores químicos de la Jun-N-terminal quinasa (JNK), véase Bennett y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 98:13681-86 (2001).

Ejemplo 20: Efectos de los Péptidos JNKI sobre dianas de JNK dentro de Neuronas Corticales Tratadas con NMDA

Se llevó a cabo una serie de experimentos para analizar los efectos de los péptidos JNKI de la invención sobre distintas dianas de JNK dentro de las neuronas. La activación de JNK en las neuronas corticales tratadas con N-metil-D-aspartato (NMDA) en cultivo se estimó mediante la realización de ensayos de quinasa sobre la JNK captada utilizando GST-c-Jun, por medio de los métodos descritos anteriormente (Véase por ejemplo, Ko y col., J. Neurochem. 71:1390-1395 (1998); Coffey y col., J. Neurosci. 20:7602-7613 (2000)). Los resultados de estos experimentos se muestran en las FIG. 17-18.

La FIG. 17A muestra la actividad de JNK en neuronas no tratadas (“0”), después de una exposición de 10 minutos a 100 IM de NMDA (10’) o después de una exposición de 30 minutos a 100 IM de NMDA. Las dos bandas a la derecha de la FIG. 17C demuestran que la activación de JNK no cambió esencialmente por D-JNKI1. El incremento de la actividad de JNK apareció en su máximo (es decir, 2,2 veces más) después de 30 minutos del tratamiento con NMDA (FIG. 17A). Este aumento de la actividad de JNK se trasladó a una fosforilación elevada de c-Jun (FIG. 17B). La adición de los péptidos penetrantes de células L-JNKI1 y D-JNKI1 demostró impedir completamente el incremento en P-c-Jun después de 5 horas de exposición a 100 IM de NMDA, a pesar de un nivel normal de activación de JNK. La adición de L-JNKI1 y D-JNKI1 llevó el nivel de P-c-Jun por debajo incluso del nivel de P-c-Jun en el control.

La transcripción inducida por NMDA del gen c-fos bajo la influencia de JNK a través del factor de transcripción Elkl también fue totalmente impedida por la adición de L-JNKI y D-JNKI1 (FIG. 17C). La expresión de c-fos fue cuantificada por PCR en tiempo real (ciclador de luz) utilizando ARN extraído por los métodos descritos anteriormente en el Ejemplo 18. Los datos en la FIG. 17C se presentan como expresión de c-fos con respecto a la actina (n=4). Para una descripción de la inducción de la expresión de c-fos a través de la fosforilación de TCF/Elk-1 mediada por JNK, véase Cavigeli y col., EMBOJ., 14:5957-5964 (1995).

La duración de la neurotoxicidad y la neuroprotección de NMDA por L-JNKI1 y D-JNKI1, así como los dos péptidos de control, TAT-vacío (es decir, la secuencia TAT sola, sin la secuencia JBD20) y L-JNKI1mut (que tiene seis aminoácidos mutados en alanina, tal como se describe en Bonny y col., Diabetes 50:77-82 (2001)). Las micrografías de la FIG. 18 muestran neuronas teñidas con Hoechst 24 horas después del tratamiento. La adición de los péptidos L-JNKI y D-JNKI1 protegió completamente las neuronas contra los efectos excitotóxicos de NMDA (FIG. 18) o cainato (datos no mostrados), mientras que la adición de los péptidos control no tuvo ningún efecto neuroprotector. 12 horas después del tratamiento, ambos péptidos L-JNKI1 y D-JNKI1 demostraron inhibir la muerte neuronal, mientras que los péptidos TAT-vacíos no tuvieron ningún efecto (FIG. 18).

Tal como se observa en la FIG. 18, la forma D de los péptidos penetrantes en las células de la invención, es decir D-JNKI1, era superior en las neuronas protectoras durante períodos prolongados de tiempo, es decir 12 horas, 24 horas y 48 horas después de la exposición a 100 IM de NMDA. Estas micrografías indican que 24 horas después del tratamiento, D-JNKI1 seguía proporcionando una neuroprotección total, ya que los cultivos control y los cultivos tratados con D-JNKI1 y NMDA eran comparables. La forma L de JNKI1 ya no protegía más las neuronas 24 horas después del tratamiento, supuestamente debido a que las formas L de los péptidos son generalmente mas propensas a la degradación. Los péptidos TAT-vacíos no afectaron a la muerte celular en ninguna de las condiciones. El histograma de la FIG. 18 describe el nivel de muerte neuronal 12, 24 y 48 horas después de la exposición a 100 IM de NMDA, tal como lo indica la actividad de LDH en el caldo de cultivo de la placa Petri. Los valores de absorbancia, que representan la concentración de LDH, han sido convertidos en valores porcentuales de muerte neuronal dividiendo los valores de absorbancia por la absorbancia media para un LDH total. La absorbancia media para un LDH total se obtuvo a partir del caldo de cultivo más neuronas lisadas.

Ejemplo 21: Suministro in vivo de Péptidos JNKI con permeabilidad celular

Para someter a prueba la factibilidad de utilización de los péptidos con permeabilidad celular en aplicaciones in vivo, se evaluó su capacidad para penetrar en el cerebro utilizando L-JNKI1 y D-JNKI1 etiquetados con FITC. Para más información sobre el suministro in vivo de una proteína biológicamente activa en un ratón, véase Schwarze y col., Science, 285:1569-72 (1999), incorporado como referencia. Estos experimentos mostraron que ambos L-JNKI1 y D-JNKI1 etiquetados con FITC eran capaces de atravesar la barrera sangrecerebro y penetrar en las neuronas de ratones y ratas adultas de varias edades. Ambos L-JNKI1 y D-JNKI1 etiquetados con FITC eran capaces de penetrar en las neuronas tras 1 hora de su inyección intraperitoneal (datos no mostrados).

Ejemplo 22: Neuroprotección por los Péptidos JNKI contra la Isquemia Cerebral Focal Transitoria y Permanente

En un modelo de isquemia suave en ratones, la arteria cerebral media izquierda fue ocluida durante 30 minutos, seguido de 48 horas de reperfusión. El grupo control tratado con un vehículo recibió solamente una inyección de una solución de tampón fosfato (PBS). En el grupo control tratado con el vehículo, esta oclusión resultó sistemáticamente en una infartación mayor que contenía células severamente picnóticas, que se encontraban predominantemente en la corteza y el estrato en todos los cerebros, y en 7 de los cerebros, estas células se encontraban también en el hipocampo. El volumen medio infartado era de 67,4 mm3 (n=12) en aquellos sujetos del grupo control tratado con vehículo.

Para evaluar la eficacia y la “ventana terapéutica” del tratamiento (es decir, el período de tiempo después de la lesión durante el cual el tratamiento con los péptidos de la invención sigue siendo eficaz), se trataron los sujetos con una inyección intracerebroventricular (icv) de D-JNKI1 (15,7 ng en 2 Il de PBS). La FIG. 19A muestra secciones teñidas con violeta de cresilo que representan ejemplos típicos del infarto resultante (barra, 1 mm). La FIG 19B describe los volúmenes infartados después de la inyección icv de D-JNKI1 en distintos momentos antes (-1 hora) o después (+3,6 ó 12 horas) de la oclusión de la arteria cerebral media. En la FIG. 19B, un asterisco (*) indica que el resultado es estadísticamente distinto del control (tal como lo indica la prueba-t).

El pretratamiento 1 hora antes de la oclusión de la arteria cerebral media con una inyección icv de D-JNKI1 redujo el volumen de infarto medido 48 horas después de la reperfusión en un 88%, hasta un volumen de 7,8 mm3 (FIG. 19A-19B). La administración del péptido D-JNKI1 3 ó 6 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media seguía siendo muy protectiva, ya que el volumen medio infartado en los sujetos inyectados 3 horas después de la oclusión se redujo a 5,8 mm3 (una reducción del 91% en comparación con animales no tratados), y el volumen medio infartado en sujetos inyectados 6 horas después de la oclusión se redujo a 4,8 mm3 (una reducción del 93% en comparación con animales no tratados). Por contraste, la inyección del péptido D-JNKI1 12 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media no fue notablemente protectiva.

La consecución de una isquemia completa seguida de una reperfusión se confirmó en todos los animales mediante la comprobación del flujo sanguíneo cerebral regional en la zona de la arteria cerebral media izquierda.

Se evaluaron también las capacidades protectivas de D-JNKI1 contra la isquemia focal permanente en ratas

5 jóvenes (P14). Se preparó una zona isquémica en la corteza cerebral de ratas P14 mediante una oclusión permanente de la arteria cerebral media, induciendo así una zona de degeneración masiva limitada a la corteza parietotemporal. Como los volúmenes del cerebro en las ratas P14 eran variables, las lesiones se expresaron como porcentaje del volumen del hemisferio cerebral. Se inyectó de forma intraperitoneal D-JNKI1 a una concentración de 11 mg/kg, lo que corresponde aproximadamente a 340 Ig. Se administró D

10 JNKI1 30 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media, o 6 ó 12 horas después de la oclusión. Las ratas se fijaron 24 horas después de la oclusión. En cada uno de estos momentos (es decir, administración a los 30 minutos, +6 horas o +12 horas), la D-JNKI1 causó reducciones mayores y estadísticamente significativas en el volumen infartado en comparación con los animales control (FIG. 20A20B). La administración de D-JNKI1 30 minutos antes de la oclusión llevó a una reducción del volumen

15 infartado del 68%, mientras que la administración del péptido 6 y 12 horas después de la oclusión condujo a reducciones en el volumen infartado del 78% y 49%, respectivamente.

Se realizó un análisis de inmunohistoquímica para determinar la activación del factor de transcripción de c-Jun, una diana principal de JNK, en cerebros de crías de ratas con isquemia permanente. La fosforilación de c-Jun fue evidente en muchas neuronas en la corteza peri-infartada (FIG. 5C, barra= 200 IM). Por contraste,

20 en los cerebros tratados con el péptido D-JNKI1, la corteza peri-infartada fue negativa y se detectaron solamente unas pocas neuronas positivas en el límite de la región infartada.

Ejemplo 22: Evaluación en cuanto al Comportamiento de los Efectos Secundarios Potenciales de los Péptidos JNKI

Típicamente, la alta toxicidad de otros compuestos neuroprotectores ha limitado mucho su uso clínico (Véase

25 Gladstone y col., Stroke, 33:2123-36 (2002)), incorporado como referencia. La capacidad de los ratones para mantenerse en giro horizontal Rotarod se utilizó como criterio para los posibles efectos secundarios de distintas dosis de D-JNKI1 y de una dosis terapéutica de MK-801 (1 mg/kg, dosis terapéutica estándar). En particular, la función motora de los ratones se evaluó utilizando la prueba Rotarod 3 horas, 24 horas, 6 días y 12 días después de ambas inyecciones i.p. (11 y 110 mg/kg) e icv de D-JNKI1 (2 Il que contenían 15,7 ng ó

30 157 ng de D-JNKI1). La inyección i.p. de MK-801 (1 mg/kg) se utilizó como compuesto control durante este procedimiento de evaluación.

Los ratones fueron adiestrados el día anterior y por la mañana del día experimental, con el fin de reducir la variabilidad entre los sujetos. Las sesiones tanto de adiestramiento como de prueba fueron idénticas para los ratones control e inyectados. La función motora de cada ratón se examinó inmediatamente antes de la

35 inyección y 1, 6 y 12 días después de la inyección. Se colocaron los ratones en el Rotarol que estaba programado para una aceleración uniforme de 4 a 40 rpm. Se registró el estado latente de caída de cada ratón sometido a prueba. Los resultados de esta evaluación por métodos con Rotarod se presentan en la Tabla 2 como latencia mediana a la caída (medida en segundos).

Tabla 2 40 Efecto de D-JNKI1 sobre la Coordinación Motora

Latencia Mediana a la Caída (ver)

Dosis

-1 hora + 3 horas 1 día 6 días 12 días

PBS MK-801 D-JNKI1

2 Il icv 1 mg/kg i.p. 11 mg/kg i.p. 110 mg/kg i.p. 15,7 ng icv 157 ng icv 2 Il PBS icv 234 226 204 276 210 260 234 202 Incapaz 221 266 342 200 202 238 174 372 447 302 253 238 268 233 287 416 345 338 268 246 292 418 325 285 335 246

Como se puede observar en la Tabla 2, se descubrió que la coordinación motora estaba intacta con ambas dosis de D-JNKI1 por i.p. e icv (es decir, tanto la dosis de 2,8 Il/kg, que proporcionó una neuroprotección del 90%, como la dosis 10 veces más alta). Por contraste, MK-801 condujo a un deterioro dramático de la 45 coordinación motora, ya que los ratones eran incapaces de mantenerse en la rueda (Véase por ejemplo, Tabla 2; Dawson y col., Brain Res. 892:344:350 (2001) (que describen resultados similares para otros neuroprotectores), y una dosis 10 veces más alta de MK-801 mató a todos los ratones. Se descubrió que los efectos secundarios de una dosis más baja de MK-801 habían desaparecido esencialmente después de 24 horas. A los 6 y 15 días después del tratamiento con D-JNKI1, no se encontró ninguna señal de deterioro

50 motor y los resultados reproducibles en el Rotarod fueron mejores que en los ratones control.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Utilización de cualquiera de los péptidos que incluyen la SEQ ID NO: 22 o que es la SEQ ID NO: 24,

   o de péptidos que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia con estos péptidos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno neuronal

   5 mediante la inhibición de la muerte celular neuronal en un sujeto, donde el sujeto sufre o está en riesgo de desarrollar un trastorno neuronal y donde el trastorno neuronal es un trastorno neurodegenerativo seleccionado de entre esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, esclerosis múltiple y enfermedad de Huntington.
2. 2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido se administra mediante una vía

   10 de administración seleccionada de entre el grupo consistente en intraauricular, intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral o mediante parches.

   6HFXHQFLDV3HSW¯GLFDV+XPDQDVGH5DWµQ\GH5DWD

   6HFXHQFLDV*HQ«ULFDV+XPDQDVGH5DWµQ\GH5DWD

   Efectos del Constructo GFP-JBD23 sobre la Apoptosis de Células-1 Pancreáticas

   CÉLULAS APOPTÓTICAS (%)

   Efectos de los Péptidos TAT-IB sobre la Fosforilación Mediada por JNK

   Efectos de los Péptidos TAT-IB sobre la Fosforilación Mediada por JNK

   Inhibición de la Fosforilación de L-TAT-IB por JNKs Recombinantes

   Inhibición In Vivo de la Fosforilación de c-Jun por los Péptidos TAT-IB

   Supresión de la Fosforilación del Factor de Transcripción JNK por los Péptidos L-TAT-IB1

   Radioprotección contra la Radiación Ionizante por los Péptidos TAT-IB1

   Peso Edema + Eritema

   LDH (unidades relativas)

   Volumen de la lesión (mm3) LESIÓN (% del hemisferio)