ES2319454T3 - Peptidos con permeabilidad celular inhibidores de la ruta de transduccion de señales de la jnk. - Google Patents
Peptidos con permeabilidad celular inhibidores de la ruta de transduccion de señales de la jnk. Download PDFInfo
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Abstract
Utilización de cualquiera de los péptidos que incluyen cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre las SEQ ID NOs: 3-6 y 22, o seleccionándose cualquiera de las secuencias de aminoácidos de entre las SEQ ID NOs: 11-16 y 23-26, o de péptidos que son homólogos en al menos un 95% a estos péptidos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la pérdida de audición en un sujeto, caracterizada porque el péptido impide que se dañen los estereocilios de las células pilosas, la apoptosis de las células pilosas o la apoptosis neuronal.
Description
Péptidos con permeabilidad celular inhibidores
de la ruta de transducción de señales de la JNK.
En general, esta invención se refiere a
inhibidores de la proteína-quinasa y, de forma más
específica, a inhibidores de la proteína-quinasa
c-Jun amino terminal quinasa.
La quinasa c-Jun amino terminal
(JNK) es un miembro del grupo activado por estrés de las proteínas
quinasas mitogeno-activadas (MAP). Estas quinasas
están implicadas en el control del crecimiento y de la
diferenciación celular, y, en general, en la respuesta de las
células a los estímulos ambientales. La ruta de transducción de
señales de la JNK es activada en respuesta al estrés ambiental y
mediante varios tipos de receptores de la superficie celular. Estos
receptores pueden incluir los receptores de citoquinas, receptores
de serpentinas y receptor de la tirosina-quinasa.
En las células de mamíferos, la JNK está involucrada en procesos
biológicos tales como la transformación oncogénica y en la
mediación de respuestas adaptivas al estrés ambiental. La JNK se ha
asociado también a la modulación de las respuestas inmunes,
incluidas la maduración y diferenciación de las células inmunes,
así como a la muerte celular programada en células identificadas
como para ser destruidas por el sistema inmune.
Diversas publicaciones se refieren a la JNK y a
la ruta de transducción de señales de la JNK. Por ejemplo, la WO
98/49188 describe inhibidores de la ruta de transducción de señales
de la JNK, así como métodos para su utilización. En particular, la
WO 98/49188 identifica la proteína 1 interactuando con JNK
(JIP-1), un inhibidor de la proteína JNK1. Además,
revela métodos generales para tratar un estado patológico o métodos
para prevenir la aparición de un estado patológico en un paciente
mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz
de polipéptidos JIP-1. La WO 98/49188 no describe la
utilización de péptidos que contienen péptidos específicos IB1
(JIP-1) o IB2 y que adicionalmente contienen
secuencias TAT como moléculas transportadoras para el tratamiento
de la pérdida de audición.
De forma similar, la WO 01/27268 revela
inhibidores peptídicos con permeabilidad celular de la ruta de
transducción de señales de la JNK, que se unen a las proteínas JNK
e inhiben los efectos mediados por JNK en las células expresoras de
JNK. La WO 01/27268 no describe el tratamiento de la pérdida de
audición. De forma más particular, la WO 01/27268 no revela la
utilización de péptidos que contienen los péptidos específicos IB1 o
IB2 y que contienen adicionalmente secuencias TAT como moléculas
transportadoras para el tratamiento de la pérdida de audición.
Bonny y col. (Diabetes, Vol. 50, enero 2001)
describen secuencias peptídicas relacionadas con
JNKI-1. Sin embargo, en Bonny y col. (2001) se
relacionan exclusivamente con la apoptosis de las células \beta
pancréaticas inducida por IL-1\beta y no menciona
la pérdida de audición o enfermedad alguna relacionada con la
misma.
De forma similar, la WO 98/44106 muestra el
IB-1 y la utilización de polipéptidos relacionados
con IB-1 para el tratamiento de diversas
enfermedades. La WO 98/44106 no especifica el uso de las secuencias
específicas de IB1 o IB2 de acuerdo con la presente invención para
el tratamiento de la pérdida de audición.
Vivès y col. (The Journal of Biological
Chemistry, Vol. 272, No. 25, Publicación de 20 de junio, pp.
16010-16017, 1997), WO 94/04686, Bonny y col. (The
Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, No. 4, Publicación de 23
de enero, pp. 1843-1846, 1998) y Lee y col. (The
Journal of Biological Chemistry, Vol. 278, No. 5, Publicación de 23
de enero, pp. 2896-2902, 2003) tratan también de las
proteínas relacionadas con IB1 o JNK. Sin embargo, ninguno de estos
documentos describe el tratamiento de la pérdida de audición o
incluso la utilización de péptidos que contienen los péptidos
específicos IB1 o IB2 y contienen adicionalmente secuencias TAT como
moléculas transportadoras para el tratamiento de la pérdida de
audición.
La presente invención se base en parte en el
descubrimiento de péptidos que son inhibidores eficaces de las
proteínas JNK. Los péptidos mencionados aquí como inhibidores
peptídicos de JNK disminuyen los efectos proliferativos en las
células "aguas abajo" de la quinasa c-Jun amino
terminal (JNK).
En consecuencia, la invención incluye la
utilización de nuevos péptidos inhibidores de JNK ("péptidos
JNKI") incluyendo cualquiera de las secuencias de aminoácidos
seleccionadas de entre las SEQ ID NOs: 3-6 y 22, así
como péptidos quiméricos, seleccionándose cualquiera de las
secuencias de aminoácidos de entre las SEQ ID NOs:
11-16 y 23-26, que incluyen un
inhibidor peptídico de JNK ligado a un péptido de tráfico que se
puede utilizar para dirigir un péptido en el que está presente
hacia un lugar celular deseado, o la utilización de ácidos
nucleicos que codifican estos péptidos en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o la prevención de la pérdida de
audición en un sujeto, caracterizada porque el péptido impide que se
dañen los estereocilios de las células pilosas, la apoptosis de las
células pilosas o la apoptosis neuronal. La secuencia de tráfico se
puede utilizar para dirigir el transporte del péptido a través de la
membrana plasmática. Alternativa o adicionalmente, el péptido de
tráfico se puede utilizar para dirigir el péptido hacia un lugar
intracelular, tal como el núcleo.
Los péptidos inhibidores de JNK pueden estar
presentes como polímeros de L-aminoácidos.
Alternativamente, los péptidos pueden estar presentes como
polímeros de D-aminoácidos.
La pérdida de audición puede ser un trauma
acústico. Así, en un aspecto, el péptido debe ser administrado
antes de que el sujeto esté expuesto a un trauma acústico. En otro
aspecto, el péptido debe administrarse después de que el sujeto ha
sido expuesto a un trauma acústico. El trauma acústico puede ser,
por ejemplo, de al menos 90 dB SPL. Alternativamente, la pérdida de
audición está provocada por un tratamiento con antibióticos. Así,
en un aspecto, el péptido debe administrarse antes de que el sujeto
esté expuesto a un antibiótico. En otro aspecto, el péptido debe
administrarse después de que el sujeto ha estado expuesto a un
antibiótico. El antibiótico es, por ejemplo, un aminoglicósido.
La pérdida de audición puede ser causada por un
agente quimioterapéutico. Así, en un aspecto, el péptido debe
administrarse antes de que el sujeto esté expuesto a un agente
quimioterapéutico. En otro aspecto, el péptido debe administrarse
después de que el sujeto ha estado expuesto a un agente
quimioterapéutico.
La administración de los péptidos de la
invención puede realizarse mediante cualquier vía de administración
seleccionada de entre la administración intraauricular,
intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral y en parche.
Entre las ventajas proporcionadas por la
invención, una de ellas consiste en que los péptidos inhibidores de
JNK utilizados aquí son pequeños y se pueden producir fácilmente en
cantidades masivas y con una gran pureza. Los péptidos inhibidores
son también resistentes a la degradación intracelular y son
escasamente inmunogénicos. En consecuencia, los péptidos se adaptan
bien a aplicaciones in vitro e in vivo en las cuales
se desea la inhibición de la expresión de JNK.
Salvo definido de otro modo, todos los términos
técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado
que el entendido comúnmente por un especialista en la técnica a la
que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o pruebas de la
presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares
o equivalentes a los descritos aquí, se describen a continuación
los métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, regirá la
presente especificación, incluidas las definiciones. Además, los
materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden
ser limitativos.
Otras características y ventajas de la invención
se evidenciarán a partir de la siguiente descripción detallada y
reivindicaciones.
Fig. 1A-C: diagramas que
muestran alineaciones de regiones de dominios conservados de JBD en
los factores de transcripción indicados.
Fig. 2: diagrama que muestra alineaciones de
péptidos de fusión TAT-IB genéricos.
Fig. 3: histograma que describe la inhibición de
la muerte de células-\beta por un dominio JBD de
el mínimo de 23 aminoácidos de longitud de IB1 en comparación con
el dominio de JBD completo de 280 aminoácidos.
Fig. 4: es una ilustración que demuestra los
efectos de los péptidos TAT, TAT-IB1 y
TAT-IB2 sobre la fosforilación de las JNKs
recombinantes. El panel A muestra la inhibición de la fosforilación
de c-Jun, ATF2 y Elk1 por las JNKs recombinantes
in vitro. El panel B muestra experimentos
dosis-respuesta similares al Panel A.
Fig. 5: histograma que describe la inhibición de
la fosforilación de L-TAT-IB por
JNKs recombinantes. El panel A muestra la inhibición de
L-TAT-IB de la fosforilación de
c-Jun, ATF2 y Elk1 por las JNKs recombinantes in
vitro en presencia de MKK4. El panel B muestra experimentos
dosis-respuesta similares con MKK7.
Fig. 6: es una ilustración que demuestra la
inhibición de la fosforilación de c-Jun por JNKs
activadas.
Fig. 7: histograma que describe la inhibición a
corto plazo de la muerte de células-\beta
pancreáticas inducidas por IL-1\beta por los
péptidos L-TAT-IB.
Fig. 8: histograma que describe la inhibición a
corto plazo de la muerte de células-\beta
pancreáticas inducidas por IL-1\beta por los
péptidos D-TAT-IB.
Fig. 9: histograma que describe la inhibición a
largo plazo o la muerte de células-\beta
pancreáticas inducidas por IL-1\beta por los
péptidos L-TAT-IB1 y
D-TAT-IB1.
Fig. 10: histograma que describe la inhibición
de la muerte de las células WiDr de cáncer de colón humano inducida
por irradiación por los péptidos
L-TAT-IB1 y
D-TAT-IB1.
Fig. 11: es una ilustración de la modulación de
la actividad de la quinasa JNK por los péptidos
L-TAT, TAT-IB1 y
D-TAT-IB1.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Fig. 12: gráficos que describen los efectos
protectores de los péptidos TAT-IB1 en ratones. El
panel A muestra el efecto de la irradiación sobre el peso. El panel
B muestra el efecto de la irradiación sobre un estado de edema y
eritema.
Fig. 13: describe el efecto protector de
D-JNK1 sobre la pérdida de audición inducida por
ruido. El panel A muestra una descripción esquemática del
experimento, el panel B muestra un gráfico de la pérdida de
audición, los paneles C y D describen un examen histológico de un
oído contralateral (control) e inyectado con D-JNK1
respectivamente.
Fig. 14A y B: describen el efecto protector de
D-JNK1 sobre la pérdida de audición inducida por
antibióticos.
Fig. 15: gráfico de barras que describe un
aumento de la recuperación de los islotes pancréaticos sometidos al
tratamiento con D-JNK1 durante el procedimiento de
aislamiento.
Fig. 16A: ilustración que demuestra la
sensibilidad y especificidad de los péptidos inhibidores de la JNK
(JNKI) de la presente invención con respecto a la activación y
acción de la JNK. La Fig. 16A demuestra el efecto inhibidor de
L-JNKI1 y D-JNKI1 sobre la
activación y acción de JNK en ensayos de quinasa respectivamente
con JNK1\alpha1 y sustratos de GST-Jun y
GST-Elk1.
Fig. 16B: ilustración que demuestra la
sensibilidad y especificidad de los péptidos inhibidores de la JNK
(JNKI) de la presente invención con respecto a la activación y
acción de la JNK. La Fig. 16B demuestra el efecto inhibidor de la
secuencia inhibidora mínima de JNK de 20 aminoácidos de
JIP-IB1 (forma-L de JBD_{20}) en
experimentos dosis-respuesta utilizando condiciones
similares a las de la Fig. 16A y con cantidades decrecientes de
L-JBD_{20}.
Fig. 16C: ilustración que demuestra la
sensibilidad y especificidad de los péptidos inhibidores de la JNK
(JNKI) de la presente invención con respecto a la activación y la
acción de la JNK. La Fig. 16C demuestra la especificidad de los
péptidos JNKI de la presente invención en el bloqueo de la
activación de JNK por medio de ensayos de quinasa con distintas
quinasas recombinantes.
Fig. 17A: ilustración que demuestra la
activación de JNK inducida por
N-metil-D-aspartato
(NMDA) en neuronas no tratadas (0) y en neuronas expuestas a NMDA
100 \muM durante 10 minutos (10') o durante 30 minutos (30').
Fig. 17B: ilustración que demuestra los efectos
de los péptidos JNKI de la presente invención a nivel de la
fosforilación de c-Jun y la cantidad de JNK después
de su exposición a NMDA. En la Fig. 17B, se cargó 4 veces más
proteína en los extractos nucleares (Nucl) que en los citoplásmicos
(Cyt), las abreviaturas empleadas son: C: Control; N: NMDA; L:
L-JNI1 + NMDA; D: D-JNKI1 +
NMDA.
Fig. 17C: histograma que describe la
cuantificación de la expresión de c-fos por PCR en
tiempo real utilizando ARN extraído. La Fig. 17C ilustra la
expresión de c-fos relatica a la actina.
Fig. 18: ilustraciones y un histograma que
describen el período de neurotoxicidad y neuroprotección de NMDA
por L-JNKI1, D-JNKI1 y dos péptidos
de control, TAT-vacío (la secuencia de TAT sola, sin
JBD_{20}) y L-JNKI1-mut (donde 6
aminoácidos han sido mutados a alanina).
Fig. 18A-18E: una serie de
micrográficos que describen neuronas teñidas con Hoechst 24 horas
después del tratamiento con NMDA.
Fig. 18F: histograma que describe la muerte
neuronal 12, 24 y 48 horas después de su exposición a NMDA (100
\muM NMDA) tal como lo indica la actividad de LDH.
Fig. 19: ilustraciones y un histograma que
describen la isquemia transitoria en ratones.
Fig. 19A: demuestra el efecto sobre el volumen
infartado de un pretratamiento en el cual se administró una
inyección intracerebroventricular (icv) de D-JNKI1
(15,7 ng en 2 \mul de solución de tampón fosfato (PBS)) a un
sujeto 1 hora antes de la oclusión.
Fig. 19B: demuestra el efecto sobre el volumen
infartado cuando la inyección icv de D-JNKI1 se
administra 1 hora antes de la oclusión o 3, 6 y 12 horas después de
la oclusión.
Fig. 20: ilustraciones y un histograma que
demuestran la protección por D-JNKI1 contra la
isquemia focal permanente en ratas jóvenes (P14) que habían sido
sometidas a perfusión 24 horas después de la oclusión.
Fig. 20A: una serie de ilustraciones que
describe ejemplos de lesiones en una rata control (panel de la
izquierda) y una rata tratada con D-JNKI1 6 horas
después de la oclusión (panel de la derecha).
Fig. 20B: histograma que describe los volúmenes
infartado, expresados en % de volumen hemisférico, después de la
inyección intraperitoneal (i.p.) de D-JNKI1 -0,5
hora antes o +6 ó +12 horas después de la oclusión.
Fig. 20C: una serie de ilustraciones que
describe los resultados de la inmunohistoquímica para una
P-c-Jun en la que se fosforiló
c-Jun en numerosas neuronas en la corteza
peri-infartada.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La presente invención en parte se basa en el
descubrimiento de péptidos con permeabilidad celular que inhiben la
ruta de señales de la quinasa c-Jun amino terminal
(JNK) activada. Estos péptidos se denominan aquí péptidos
inhibidores de la JNK.
Los péptidos inhibidores de la JNK fueron
identificados mediante la inspección de alineaciones de secuencias
entre los Dominios de Unión de kJNK en diversas proteínas de unión a
insulina (IB). Los resultados de esta alineación se muestran en las
Figs. 1A-1C. La Fig. 1A describe la región de más
alta homología entre los JBDs de IB1, IB2, c-Jun y
ATF2. El panel B describe la alineación de secuencias de aminoácidos
de los JBDs de IB1 e IB2. Los residuos totalmente conservados se
indican mediante asteriscos, mientras que los residuos cambiados a
Ala en el vector GFP-JBD_{23Mut} se indican
mediante círculos en blanco. La Fig. 1C muestra las secuencias de
aminoácidos de las proteínas quiméricas que incluyen un dominio de
péptidos inhibidor de la JNK y un dominio de tráfico. En el ejemplo
mostrado, el dominio de tráfico procede del polipéptido TAT del
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el péptido inhibidor
de la JNK procede de un polipéptido IB1. Las secuencias de humanos,
ratón y rata son idénticas en los Paneles B y C.
La comparación de las secuencias entre los
dominios de unión de JNK de IB1 [SEQ ID NO:17], IB2 [SEQ ID NO:18],
c-Jun [SEQ ID NO:19] y ATF2 [SEQ ID NO:20] revelaron
una secuencia de 8 aminoácidos parcialmente conservados (Fig. 1A).
Una comparación de los JBDs de IB1 e IB2 reveló además dos bloques
de siete y tres aminoácidos que están altamente conservados entre
las dos secuencias. Estos dos bloques están contenidos en una
secuencia peptídica de 23 aminoácidos en IB1 [SEQ ID NO:1] y 21
aminoácidos en IB2 [SEQ ID NO:2]. La secuencia inhibidora minima de
JNK de 20 aminoácidos de JIP-IB1
(forma-L de JBD_{20} (SEQ ID NO:21)) se muestra en
la Fig. 1C.
Los péptidos inhibidores de la JNK tal como se
mencionan anteriormente se pueden utilizar en aplicaciones in
vitro, ex vivo y son adecuados para aplicaciones in vivo.
Como las JNKs y todas sus isoformas participan en el desarrollo y
establecimiento de estados patológicos tales como la pérdida de
audición o en rutas, los péptidos de JNK, incluyendo cualquiera de
las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre las SEQ ID NOs.
3-6 y 22, o seleccionándose cualquiera de las
secuencias de aminoácidos entre las SEQ ID NOs:
11-16 y 23-26, se pueden utilizar
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la
prevención de la pérdida de audición en un sujeto.
Se presentan en la Tabla 1 los péptidos
inhibidores de la JNK revelados aquí. La tabla presenta el nombre
del péptido inhibidor de la JNK, así como su número identificador de
secuencia, su longitud y su secuencia de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto, la invención proporciona el uso
de un péptido inhibidor de la JNK que incluye cualquiera de las
secuencias de aminoácidos seleccionadas entre las SEQ ID NOs:
3-6 y 22, o un péptido que es al menos en un 5%
homólogo a estos péptidos, en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento o la prevención de la pérdida de audición en un
sujeto, caracterizado porque el péptido impide que se dañen los
estereocilios de las células pilosas, la apoptosis de las células
pilosas o la apoptosis neuronal. No se presupone por el término
"péptido" ninguna longitud particular. En algunas
realizaciones, el péptido inhibidor de JNK es inferior a 280
aminoácidos de longitud, por ejemplo, inferior o igual a 150, 100,
75, 50, 35 ó 25 aminoácidos de longitud. En varias realizaciones,
el péptido inhibidor de unión a JNK incluye la secuencia de
aminoácidos de una o más de las SEQ ID NOs: 3 y 22. En una
realización, los péptidos inhibidores de la JNK se pueden unir a
JNK. En otra realización, los péptidos pueden inhibir la activación
de al menos un factor de transcripción activado por JNK, por
ejemplo c-Jun, ATF2 o Elk1.
Ejemplos de péptidos inhibidores de JNK incluyen
un péptido que comprende (en su totalidad o en parte) la secuencia
NH_{2}-DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT-_{COOH}
[SEQ ID NO:1]. En otra realización, el péptido incluye la secuencia
NH_{2}-EEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS-_{COOH}
[SEQ ID NO:2]. Alternativamente, ejemplos de péptidos inhibidores
de JNK comprenden un péptido que incluye (en su totalidad o en
parte) la secuencia NH_{2}-RPKRPTTLNL
FPQVPRSQDT-_{COOH} [SEQ ID NO:21].
Los péptidos inhibidores de JNK pueden ser
polímeros de L-aminoácidos, de
D-aminoácidos o una combinación de ambos. Si los
péptidos inhibidores de JNK son D-aminoácidos, los
péptidos son péptidos retro-inversos D. El término
"isómero retro-inverso" se refiere a un isómero
de a un péptido lineal en el que la dirección de la secuencia está
invertida, el término "isómero
D-retro-inverso" se refiere a un
isómero de un péptido lineal en el que la dirección de la secuencia
está invertida y la quiralidad de cada residuo aminoácido está
invertida. Véase, por ejemplo, Jameson y col., Nature, 368,
744-746 (1994); Brady y col., Nature, 368,
692-693 (1994). El resultado neto de combinar los
enantiómeros D y la síntesis inversa es que las posiciones de los
grupos carbonilo y amino de cada enlace amida se intercambian,
mientras que la posición de los grupos de la cadena lateral en cada
carbono alfa se conserva. Salvo que se estipule específicamente de
otro modo, se supone que toda secuencia dada de
L-aminoácidos de la invención se puede convertir en
un péptido retro-inverso D mediante la síntesis de
un reverso de la secuencia para la secuencia nativa de
L-aminoácidos correspondiente.
Por ejemplo, un péptido
retro-inverso D tiene la secuencia
NH_{2}-TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD-_{COOH}
[SEQ ID NO:3] ó
NH_{2}-SDQAGLTILRLTTPRHKHPEE-_{COOH}
[SEQ ID NO:4]. Alternativamente, un péptido
retro-inverso D incluye la secuencia
NH_{2}-TDQSRPVQPF
LNLTTPRKPR-_{COOH} [SBQ ID NO:22]. Se ha
descubierto inesperadamente que los péptidos
retro-inversos D tienen múltiples propiedades
útiles. Por ejemplo, los péptidos D-TAT y
D-TAT-IB, así como
D-TAT-JNKI, penetran en las células
tan eficazmente como los péptidos L-TAT y
L-TAT-IB así como
D-TAT-JNKI, y los péptidos
D-TAT y D-TAT-IB,
así como D-TAT-JNKI, son más
estables que los L-péptidos correspondientes.
Además, mientras los D-TAT-IB1 son
\sim 10-20 veces menos eficaces en la inhibición
de JNK que los L-TAT-IB y
L-TAT-JNKI, son \sim 50 veces más
estables in vivo. Además, los péptidos JNKI
D-retro-inversos son resistentes a
las proteasas. Finalmente, tal como se expone más adelante, los
péptidos D TAT-IB y
D-TAT-JNKI protegen las células
irradiadas ionizantes y tratadas con interleuquina-1
contra la apoptosis, y estos péptidos son útiles en el tratamiento
de las neuronas, ya que la secuencia TAT contiene seis pares de
aminoácidos que convierten la secuencia TAT en extremadamente
sensible a las proteasas neuronales, implicadas en el procesamiento
de péptidos en el sistema nervioso. Véase por ejemplo, Steiner y
col., J. Biol. Chem. 267:23435 23438 (1992); Brugidou y col.,
Biochem. & Biophys. Res. Comm. 214:685-693
(1995).
Un péptido inhibidor de JNK tal como se utiliza
de acuerdo con la invención incluye la secuencia de aminoácidos
NH_{2}-X_{n}-RPTTLXLXXXXXXXQDS/T-X_{n}-COOH
[SEQ ID NO:5, y los residuos 17-42 de
L-TAT-IB, SEQ ID NO:13, tal como se
muestra en la Fig. 2. Tal como se utiliza aquí, X_{n} puede ser de
cero residuos de longitud o puede ser una extensión contigua de
residuos de péptidos derivados de las SEQ ID NOs:1 y 21,
preferentemente una extensión de entre 1 y 7 aminoácidos de
longitud, o puede ser de 10, 20, 30 o más aminoácidos de longitud.
El único residuo representado por S/T puede ser Ser o Thr en la
secuencia genérica. En otra realización, el péptido inhibidor de
JNK tal como se utiliza aquí puede un péptido
retro-inverso D que tiene la secuencia
NH_{2}-X_{n}-S/TDQXXXXXXXLXLTTPR-X_{n}-_{COOH}
[SEQ ID NO:6], y los residuos 17-42 de
L-TAT-IB, [SEQ ID NO:16, tal como
se muestra en la Fig. 2.
Los péptidos inhibidores de JNK se pueden
obtener o producir por medio de métodos bien conocidos en la
técnica, por ejemplo por síntesis química, métodos de ingeniería
genética tal como se expone a continuación. Por ejemplo, un péptido
que corresponde a una parte de un péptido inhibidor de JNK
incluyendo una región o dominio deseado, o que media la actividad
deseada in vitro, se puede sintetizar utilizando un
sintetizador peptídico.
Un péptido inhibidor de JNK candidato puede
analizarse mediante un análisis de hidrofilicidad (véase por
ejemplo, Hopp y Woods, 1981. Proc Natl Acad Sci USA
78:3824-3828), que se puede utilizar para
identificar las regiones hidrofóbicas e hidrofílicas de los
péptidos, ayudando así en el diseño de los sustratos para la
manipulación experimental, tal como en los experimentos de unión,
síntesis de anticuerpos. Se puede realizar también un análisis
estructural secundario para identificar las regiones de un péptido
inhibidor de JNK que asumen motivos estructurales específicos.
Véase por ejemplo, Chou y Fasman, 1974. Biochem
13:222-223. La manipulación, traducción, predicción
de estructura secundaria, perfiles de hidrofilicidad e
hidrofobicidad, predicción y representación del marco abierto de
lectura, así como la determinación de las homologías de secuencia se
pueden llevar a cabo utilizando programas de software informático
disponibles en la técnica. Se pueden emplear también otros métodos
de análisis estructural, incluyendo, por ejemplo, la cristalografía
de rayos X (véase por ejemplo, Engstrom, 1974. Biochem Exp Biol
11:7-13); la espectroscopía de masas y la
cromatografía de gases (véase, por ejemplo, METHODS IN PROTEIN
SCIENCE, 1997, J. Wiley and Sons, New York, NY) y la modelación por
ordenador (véase, por ejemplo, Fletterick y Zoller, eds., 1986.
Computer Graphics and Molecular Modeling, In: CURRENT
COMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY).
La presente invención se refiere además a ácidos
nucleicos que codifican los péptidos de unión a JNK de la invención
que tienen la forma de aminoácidos L, por ejemplo aquellos péptidos
L indicados en la Tabla 1, así como los complementos de estas
secuencias. Las fuentes apropiadas de ácidos nucleicos que codifican
péptidos inhibidores de JNK incluyen el ácido nucleico IB1 humano
(y las secuencias de proteínas codificadas) disponibles con los
Nos. de Acceso al GenBank AFO74091 y AAD20443, respectivamente.
Otras fuentes incluyen ácido nucleico IB1 de rata y se muestran
secuencias de proteínas con los Nos. de Acceso al GenBank AF108959 y
AAD22543 respectivamente. El ácido nucleico IB2 humano así como las
secuencias de proteínas se muestran con el Nº. de Acceso al GenBank
AF218778.
Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos
inhibidores de JNK se pueden obtener mediante cualquier método
conocido en la técnica (por ejemplo, por amplificación PCR
utilizando cebadores sintéticos hibridizables a los extremos 3'- y
5'- de la secuencia y/o mediante clonación a partir de un cADN o de
una librería genómica utilizando una secuencia de oligonucleótidos
específica para la secuencia genética dada).
Para la expresión recombinante de uno o más
péptidos inhibidores de JNK, el ácido nucleico que contiene la
totalidad o parte de la secuencia de nucleótidos que codifica el
péptido se puede insertar en un vector de expresión apropiado (es
decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la
transcripción y traducción de la secuencia que codifica el péptido
insertado). Los elementos reguladores pueden ser heterólogos (es
decir, no el promotor genético nativo). Alternativamente, las
señales transcripcionales y de traducción necesarias pueden ser
suministradas también por el promotor nativo para los genes y/o sus
regiones flanqueantes.
Se pueden utilizar diversos sistemas
huésped-vector para expresar la(s)
secuencia(s) de codificación del péptido. Éstos incluyen,
pero no se limitan a: (i) sistemas celulares de mamíferos que están
infectados por el virus vaccinia, adenovirus y similares;
(ii) sistemas celulares de insectos infectados por baculovirus y
similares; (iii) levaduras que contiene vectores de levadura o (iv)
bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN de plásmidos o
ADN de cósmidos. Según el sistema huésped-vector
utilizado, se puede utilizar cualquiera de diversos elementos
adecuados de transcripción y traducción.
Las secuencias promotoras/intensificadoras
dentro de los vectores de expresión pueden utilizar secuencias
reguladoras de plantas, animales, insectos u hongos, tal como se
define en la invención. Por ejemplo, los elementos
promotores/intensificadores se pueden utilizar a partir de levaduras
y otros hongos (por ejemplo, el promotor GAIA, el promotor de
alcohol-deshidrogenasa, el promotor de
fosfoglicerol-quinasa, el promotor de
fosfatasa-alcalina). Alternativa o adicionalmente,
pueden incluir regiones de control transcripcional de animales, por
ejemplo (i) la región de control del gen de la insulina activa
dentro de las células-\beta pancreáticas (véase,
por ejemplo, Hanahan y col., 1985. Nature 315:
115-122); (ii) la región de control del gen de la
inmunoglobulina activa dentro de las células linfoides (véase, por
ejemplo, Grosschedl y col., 1984. Cell 38:
647-658); (iii) la región de control del gen de la
albúmina activa dentro del hígado (véase, por ejemplo, Pinckert y
col., 1987. Genes and Dev 1: 268-276; (iv) la región
de control del gen de la proteína básica de la mielina activa
dentro de las células de los oligodendrocitos cerebrales (véase, por
ejemplo, Readhead y col., 1987. Cell 48: 703-712);
y (v) la región de control del gen de la hormona liberadora de
gonadotropinas activa dentro del hipotálamo (véase, por ejemplo,
Mason y col., 1986, Science 234: 1372-1378) y
similares.
Los vectores de expresión o sus derivados
incluyen, por ejemplo, virus humanos o animales (por ejemplo virus
vaccinia o adenovirus); virus de insectos (por ejemplo
baculovirus); vectores de levadura; vectores bacteriófagos (por
ejemplo fago lambda); vectores de plásmidos y vectores de
cósmidos.
Se puede seleccionar una cepa de célula huésped
que module la expresión de las secuencias de interés insertadas o
que modifique o procese péptidos expresados codificados por las
secuencias de la manera específica deseada. Además, la expresión
procedente de ciertos promotores puede ser intensificada en
presencia de ciertos inductores en una cepa huésped seleccionada,
facilitando así el control de la expresión de un péptido construido
genéticamente. Además, distintas células huésped poseen mecanismos
característicos y específicos para la modificación y el
procesamiento traduccional y post-traduccional (por
ejemplo glicosilación, fosforilación y similares) de los péptidos
expresados. Por tanto, se pueden elegir líneas celulares o sistemas
huésped apropiados para asegurar que se obtiene la modificación y
el procesamiento deseados del péptido extraño. Por ejemplo, la
expresión del péptido dentro de un sistema bacteriano se puede
utilizar para producir un péptido de núcleo no glicosilado,
mientras que la expresión dentro de las células de mamíferos asegura
la glicosilación "nativa" de un péptido heterólogo.
Se describen también aquí derivados, fragmentos,
homólogos, análogos y variantes de los péptidos inhibidores de JNK
de la invención tal como se definen anteriormente, así como los
ácidos nucleicos que codifican estos péptidos. Para los ácidos
nucleicos, los derivados, fragmentos y análogos proporcionados aquí,
se definen como secuencias de al menos 6 ácidos nucleicos
(contiguos) y que tienen una longitud suficiente para permitir la
hibridación específica. Para los aminoácidos, los derivados,
fragmentos y análogos proporcionados aquí se definen como
secuencias de al menos 4 aminoácidos (contiguos), con una longitud
suficiente para tener en cuenta el reconocimiento específico de
un
epítope.
epítope.
La longitud de los fragmentos es inferior a la
longitud del ácido nucleico o del polipéptido de longitud completa
correspondiente del que procede el péptido inhibidor de JNK o el
ácido nucleico que codifica el mismo. Los derivados y análogos
pueden ser de longitud completa o de otra longitud cuando el
derivado o análogo contiene un aminoácido o ácido nucleico
modificado. Los derivados o análogos de los péptidos inhibidores de
JNK incluyen, por ejemplo, moléculas que comprenden regiones que
son sustancialmente homólogas a los péptidos, en varias
realizaciones, con al menos un 95% aproximadamente, un 98% o incluso
un 99% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos de
tamaño idéntico o cuando se comparan con una secuencia alineada en
la que la alineación se lleva a cabo mediante un programa
informático por homología conocido en la técnica. Por ejemplo la
identidad de secuencia se puede medir utilizando un software de
análisis de secuencias (Sequence Analysis Software Package of the
Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology
Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705) con los
parámetros por defecto aquí incluidos.
En el caso de secuencias de polipéptidos que son
idénticas en menos de un 100% a una secuencia de referencia, las
posiciones no idénticas son preferentemente, pero no forzosamente,
sustituciones conservadoras para la secuencia de referencia. Las
sustituciones conservadoras incluyen típicamente sustituciones
dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina,
isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina
y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y
tirosina. Así, se incluyen en la invención péptidos que tienen
secuencias mutadas de modo tal que siguen siendo homólogos, por
ejemplo en la secuencia, en la función y en el carácter antigénico,
o en otra función, a una proteína que tiene la secuencia original
correspondiente. Estas mutaciones pueden ser, por ejemplo,
mutaciones que implican cambios de aminoácidos conservativos, por
ejemplo cambios entre aminoácidos con propiedades moleculares muy
similares. Por ejemplo, los intercambios dentro del grupo alifático
alanina, valina, leucina e isoleucina se pueden considerar como
conservativos. A veces, la sustitución de glicina por uno de estos
se puede considerar también conservativa. Otros intercambios
conservativos incluyen aquellos dentro del grupo alifático aspartato
y glutamato; dentro del grupo amida asparagina y glutamina; dentro
del grupo hidroxilo serina y treonina; dentro del grupo aromático
fenilalanina, tirosina y triptófano; dentro del grupo básico lisina,
arginina e histidina; y dentro del grupo que contiene azufre
metionina y cisteína. A veces la sustitución dentro del grupo
metionina y leucina se puede considerar también conservativa. Los
grupos de sustitución conservativa preferentes son
aspartato-glutamato;
asparagina-glutamina;
valina-leucina-isoleucina;
alanina-valina;
fenilalanina-tirosina y
lisina-arginina.
Cuando se dice que un polipéptido particular
tiene un identidad porcentual específica con respecto a un
polipéptido de referencia de una longitud definida, la identidad
porcentual tiene relación con el péptido de referencia. Así, un
péptido que es idéntico en un 50% a un polipéptido de referencia que
tiene una longitud de 100 aminoácidos puede ser un polipéptido de
50 aminoácidos que es totalmente idéntico a una parte de 50
aminoácidos de longitud del polipéptido de referencia. Puede ser
también un polipéptido de 100 aminoácidos de longitud que es
idéntico en un 50% al polipéptido de referencia con respecto a su
longitud total. Por supuesto, otros polipéptidos cumplirán con los
mismos criterios.
La invención abarca también las variantes
alélicas de los polinucleótidos o péptidos revelados; es decir, las
formas alternativas naturales del polinucléotido aislado que
codifican también péptidos que son idénticos, homólogos o
relacionados con aquel codificado por los polinucleótidos.
Alternativamente, se pueden producir variantes no naturales
mediante técnicas de mutagénesis o por síntesis directa.
La presente invención proporciona también
homólogos de especie de los polinucleótidos y péptidos revelados.
"Variante" se refiere a un polinucléotido o a un polipéptido
que es diferente del polinucléotido o polipéptido de la presente
invención, pero que conserva las propiedades esenciales del mismo.
En general, las variantes son globalmente muy similares y, en
muchas regiones, idénticas al polinucléotido o al polipéptido de la
presente invención. Las variantes pueden contener alteraciones en
las regiones de codificación, en las regiones no codificadoras o en
ambas.
En algunas realizaciones, las secuencias
alteradas incluyen inserciones de tal modo que la secuencia general
de aminoácidos se alarga mientras la proteína conserva sus
propiedades de tráfico. Además, las secuencias alteradas pueden
incluir deleciones internas aleatorias o diseñadas que acortan la
secuencia global de aminoácidos mientras que la proteína conserva
las propiedades de transporte.
Las secuencias alteradas pueden ser codificadas
adicional o alternativamente por los polinucleótidos que se
hibridizan bajo condiciones rigurosas con la hebra apropiada del
polinucleótido natural que codifica un polipéptido o péptido del
que procede el péptido inhibidor de JNK. El péptido variante se
puede someter a ensayo en busca de la unión a JNK y de la
modulación de la actividad mediada por JNK utilizando los ensayos
aquí descritos. Las "condiciones rigurosas" dependen de la
secuencia y serán distintas en distintas circunstancias. En general,
las condiciones rigurosas se pueden seleccionar para que sean a
temperatura inferior en aproximadamente 5ºC que el punto de fusión
térmico (T_{M}) para la secuencia específica a una intensidad
iónica y pH definidos. La T_{M} es la temperatura (bajo una
intensidad iónica y pH definidos) a la que un 50% de la secuencia
diana se hibridiza a una sonda perfectamente coincidente.
Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la
concentración de sal sea de al menos aproximadamente 0,02 molar a un
pH de 7 y la temperatura sea al menos aproximadamente 60ºC. Como
otros factores que pueden afectar a la rigurosidad de la hibridación
(incluyendo, entre otros, la composición base y el tamaño de las
hebras complementarias), la presencia de disolventes orgánicos y el
alcance de desajuste de la base, la combinación de los parámetros es
más importante que la medida absoluta de cualquiera de los
mismos.
Una alta rigurosidad puede incluir, por ejemplo,
el Paso 1: Se pretratan filtros que contienen ADN durante 8 horas a
toda la noche a 65ºC en un tampón compuesto por 6X SSC, 50 mM de
Tris-HCl (pH de 7,5), 1 mM EDTA, PVP al 0,02%,
Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02% y 500 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado. Paso 2: Se hibridizan los filtros durante
48 horas a 65ºC en la mezcla de prehibridación anterior a la que se
añaden 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y
5-20 x 10^{6} cpm de sonda
^{32}P-marcada. Paso 3: Se lavan los filtros
durante 1 hora a 37ºC en una solución que contiene 2X SSC, PVP al
0,01%, Ficoll al 0,01% y BSA al 0,01%. Seguidamente se lavan con
0,1X SSC a 50ºC durante 45 minutos. Paso 4: Se autorradiografian
los filtros. Se conocen bien en la técnica otras condiciones de alta
rigurosidad que se pueden utilizar. Véase, por ejemplo, Ausubel y
col., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John
Wiley and Sons, NY; y Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION,
A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.
Las condiciones de rigurosidad moderada pueden
incluir lo siguiente: Paso 1: Se pretratan filtros que contienen
ADN durante 6 horas a 55ºC en una solución que contiene 6X SSC, 5X
solución de Denhardt, SDS al 0,5% y 100 mg/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado. Paso 2: Se hibridizan los filtros durante
18-20 horas a 55ºC en la misma solución con la
adición de 5-20 x 10^{6} cpm de sonda
^{32}P-marcada. Paso 3: Se lavan los filtros a
37ºC durante 1 hora en una solución que contiene 2X SSC, SDS al
0,1%, luego se lavan dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una
solución que contiene 1X SSC y SDS al 0,1%. Paso 4: Se secan los
filtros y se exponen a la autorradiografía. Se conocen bien en la
técnica otras condiciones de rigurosidad moderada que se pueden
utilizar. Véase, por ejemplo, Ausubel y col., (eds.), 1993, CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; y
Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL,
Stockton Press, NY.
La baja rigurosidad puede incluir: Paso 1: Se
pretratan los filtros que contienen ADN durante 6 horas a 40ºC en
una solución que contiene formamida al 35%, 5X SSC, 50 mM
Tris-HCl (pH de 7,5), 5 mM EDTA, PVP al 0,1%,
Ficoll al 0,1%, BSA al 1% y 500 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado. Paso 2: Se hibridizan los filtros durante
18-20 horas a 40ºC en la misma solución con la
adición de PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, 100
\mug/ml de ADN de esperma de salmón, sulfato de dextrano al 10%
(peso/ volumen) y 5-20 x 10^{6} cpm de sonda
^{32}P-marcada. Paso 3: Se lavan los filtros
durante 1,5 horas a 55ºC en una solución que contiene 2X SSC, 25 mM
Tris-HCl (pH de 7,4), 5 mM de EDTA y SDS al 0,1%. La
solución de lavado se sustituye por una solución fresca y se incuba
durante 1,5 horas más a 60ºC. Paso 4: Se secan los filtros y se
exponen a autorradiografía. Si es necesario, se lavan los filtros
por tercera vez a 65-68ºC y se vuelven a exponer a
la película. Se conocen bien en la técnica otras condiciones de baja
rigurosidad que se pueden utilizar (por ejemplo, tal como se emplea
para hibridaciones entre especies). Véase, por ejemplo, Ausubel y
col., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOL IN MOLECULAR BIOLOGY, John
Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND
EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso
de péptidos quiméricos seleccionándose de entre cualquiera de las
secuencias de aminoácidos SEQ IDs 11-16 y
23-26, o un péptido que es al menos en un 95%
homólogo a estos péptidos, tal como se define anteriormente, que
incluye un primer y un segundo dominio, para el tratamiento o la
prevención de la pérdida de audición en un sujeto, caracterizado
porque el péptido impide que se dañen los estereocilios de las
células pilosas, la apoptosis de las células pilosas o la apoptosis
neuronal. El primer dominio incluye una secuencia de rastreo,
mientras que el segundo dominio incluye una secuencia inhibidora de
JNK enlazada por un enlace covalente, por ejemplo un enlace
peptídico, al primer dominio. El primero y segundo dominios pueden
aparecer en cualquier orden en el péptido y el péptido puede incluir
uno o más de cada dominio.
Una secuencia de tráfico es una secuencia de
aminoácidos que dirige un péptido en el que está presente hacia un
destino celular deseado. Así, la secuencia de tráfico puede dirigir
el péptido a través de la membrana plasmática, por ejemplo desde
fuera de la célula, por la membrana plasmática, y dentro del
citoplasma. Alternativa o adicionalmente, la secuencia de tráfico
puede dirigir el péptido hacia un lugar deseado dentro de la célula,
por ejemplo hacia el núcleo, el ribosoma, el ER , un lisosoma o un
peroxisoma.
En algunas realizaciones, el péptido de tráfico
procede de una secuencia conocida de translocación de membrana. Por
ejemplo, el péptido de tráfico puede incluir secuencias procedentes
de la proteína TAT 1 del virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH). Esta proteína se describe, por ejemplo, en las patentes de
Estados Unidos Nº 5.804.604 y 5.674.980. El péptido inhibidor de
JNK puede estar enlazado a algunos de los 86 aminoácidos totales
que conforman la proteína TAT. Aquí, se puede utilizar un fragmento
o una parte funcionalmente eficaz de una proteína TAT que posee
menos de 86 aminoácidos que muestra captación en las células, y
opcionalmente captación en el núcleo celular. Véase, por ejemplo,
Vives y col., J. Biol. Chem.,
272(25):16010-17 (1997). En una realización,
el fragmento incluye un péptido que contiene los residuos
48-57 de TAT, por ejemplo,
NH_{3}-GRKKRRQRRR-_{COOH} [SEQ
ID NO:7] o una secuencia genérica de TAT
NH_{3}-X_{n}-RKKRRQRRR-X_{n}-_{COOH}
[SEQ ID NO:9]. Un péptido de TAT que incluye la región que media la
entrada y captación en las células se puede definir por medio de
técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Franked y col., Proc. Natl.
Acad Sci., USA 86: 7397-7401 (1989).
La secuencia de TAT puede estar enlazada al
extremo N-terminal o C-terminal de
la secuencia inhibidora de JNK. Se puede añadir una bisagra de dos
residuos prolina entre la TAT y el péptido inhibidor de JNK para
crear el péptido de fusión total. Por ejemplo, los péptidos de
fusión con L-aminoácidos utilizados aquí pueden ser
el péptido L-TAT-IB1 [SEQ ID NO:11],
el péptido L-TAT-IB2 [SEQ ID NO:12],
o el péptido genérico L-TAT-IB [SEQ
ID NO:13]. Alternativamente, los péptidos de fusión de
L-aminoácidos pueden ser el péptido genérico
L-TAT-JNKI [SEQ ID NO:25]. Los
péptidos de fusión retro-inversos D pueden ser el
péptido D-TAT-IB1 [SEQ ID NO:14], el
péptido D-TAT-IB2 [SEQ ID NO:15] o
el péptido genérico D-TAT-IB [SEQ ID
NO:16]. Alternativamente, los péptidos de fusión
retro-inversos D pueden incluir el péptido
D-TAT-JNKI [SEQ ID NO:22] o el
péptido genérico D-TAT-JNKI [SEQ ID
NO:26]. El péptido de TAT puede ser un péptido
retro-inverso D que tiene la secuencia
NH_{2}-X_{n}-RRRQRRKKR-
X_{n}-_{COOH} [SEQ ID NO:10]. En la SEQ ID NOs: 5-6, 9-10, 13, 16 y 25-26, el número de residuos "X" no se limita al que se describe y puede igualar cualquier número de residuos de aminoácidos, incluido cero, y puede variar tal como se ha descrito anteriormente.
X_{n}-_{COOH} [SEQ ID NO:10]. En la SEQ ID NOs: 5-6, 9-10, 13, 16 y 25-26, el número de residuos "X" no se limita al que se describe y puede igualar cualquier número de residuos de aminoácidos, incluido cero, y puede variar tal como se ha descrito anteriormente.
La secuencia de tráfico puede ser una secuencia
única (es decir continua) de aminoácidos presentes en la secuencia
de TAT. Alternativamente, pueden ser secuencias de dos o más
aminoácidos que están presentes en la proteína TAT, pero que en la
proteína natural están separadas por otras secuencias de
aminoácidos. Tal como se utiliza aquí, la proteína TAT incluye una
secuencia de aminoácidos natural que es la misma que la de la
proteína TAT natural, o su proteína equivalente funcional, o
fragmentos funcionalmente equivalentes de la misma (péptidos).
Estas proteínas equivalentes funcionales o fragmentos funcionalmente
equivalentes poseen una actividad de captación en la célula y en el
núcleo de la célula que es sustancialmente similar a la de la
proteína TAT natural. La proteína TAT se puede obtener a partir de
fuentes naturales o se puede producir utilizando técnicas de
ingeniería genética o de síntesis
química.
química.
La secuencia de aminoácidos de la proteína TAT
natural de VIH se puede modificar, por ejemplo, mediante adición,
deleción y/o sustitución de al menos un aminoácido presente en la
proteína TAT natural, para producir la proteína TAT modificada
(también denominada aquí proteína TAT). La proteína TAT modificada o
los análogos peptídicos de TAT con estabilidad aumentada o reducida
se pueden producir por medio de técnicas conocidas. En algunas
realizaciones, las proteínas TAT o los péptidos incluyen secuencias
de aminoácidos que son sustancialmente similares, aunque no
idénticas, a las de la proteína TAT natural o a partes de la misma.
Además, se puede añadir colesterol u otros derivados lipídicos a la
proteína TAT para producir una TAT modificada con una mayor
solubilidad en la membrana.
Se pueden diseñar variantes de la proteína TAT
para modular la localización intracelular de TAT - péptido
inhibidor de JNK. Cuando se añaden de forma exógena, estas variantes
se diseñan habitualmente para que se conserve la capacidad de TAT
para penetrar en las células (es decir, la captación de la proteína
TAT o del péptido variante en la célula es sustancialmente similar
a la de la TAT natural del VIH). Por ejemplo, la alteración de la
región básica que se considera importante para la localización
nuclear (véase, por ejemplo, Dang y Lee, J. Biol. Chem. 264:
18019-18023 (1989); Hauber y col., J. Virol. 63:
1181-1187 (1989); Ruben y col., J. Virol. 63:
1-8 (1989)) puede resultar en una localización
citoplásmica o en una localización parcialmente citoplásmica de TAT
y, por tanto, del péptido inhibidor de JNK. Alternativamente, se
puede introducir una secuencia para unir un elemento citoplásmico o
cualquier otro componente o compartimento (por ejemplo retículo
endoplásmico, mitocondria, el aparato de Bloom, vesículas
lisosomales) en la TAT con el fin de conservar la TAT y el péptido
inhibidor de JNK en el citoplasma o en cualquier otro compartimento
para otorgar una regulación a la captación de TAT y del péptido
inhibidor de JNK.
Otras fuentes para el péptido de tráfico
incluyen, por ejemplo, VP22 (descrito, por ejemplo, en la WO
97/05265; Elliott y O'Hare, Cell 88: 223-233
(1997)) o proteínas no virales (Jackson y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 10691-10695 (1992)).
La secuencia inhibidora de JNK y la secuencia de
tráfico pueden enlazarse mediante acoplamiento químico de cualquier
manera adecuada conocida en la técnica. Numerosos métodos conocidos
de reticulación química no son específicos, es decir que no dirigen
el punto de acoplamiento hacia ningún lugar particular del
polipéptido de transporte o la macromolécula de carga. En
consecuencia, la utilización de agentes reticulantes no específicos
puede atacar los lugares funcionales o bloquear estéricamente los
lugares activos, transformando las proteínas conjugadas en
biológicamente inactivas.
Una forma de aumentar la especificidad de
acoplamiento consiste en dirigir el acoplamiento químico hacia un
grupo funcional que aparece solamente una vez o pocas veces en uno
de los polipéptidos o en los dos que hayan de ser reticulados. Por
ejemplo, en muchas proteínas, la cisteína, que es el único
aminoácido proteico que contiene un grupo tiol, aparece sólo pocas
veces. Asimismo, por ejemplo, si un polipéptido no contiene residuos
de lisina, un reactivo reticulante específico de amina primaria
será selectivo con el extremo amino de aquel polipéptido. La
utilización con éxito de esta aproximación para aumentar la
especificidad de acoplamiento requiere que el polipéptido tenga los
residuos adecuadamente raros y reactivos en zonas de la molécula que
se pueden alterar sin pérdida de la actividad biológica de la
misma.
Los residuos de cisteína se pueden sustituir
cuando aparecen en partes de una secuencia de polipéptidos donde su
participación en una reacción de reticulación de otro modo
interferiría probablemente en la actividad biológica. Cuando se
sustituye un residuo de cisteína, normalmente es deseable minimizar
los cambios resultantes en la multiplicación de polipéptidos. Los
cambios en la multiplicación de polipéptidos se minimizan cuando la
sustitución es química y estéricamente similar a la cisteína. Por
estas razones, se prefiere la serina como sustitución para la
cisteína. Tal como se demuestra en los ejemplos a continuación, se
puede introducir un residuo de cisteína en una secuencia de
aminoácidos polipeptídicos con propósitos de reticulación. Cuando se
introduce un residuo de cisteína, se prefiere la introducción en o
cerca del extremo amino o carboxi. Se dispone de métodos
convencionales para estas modificaciones de la secuencia de
aminoácidos, para que el polipéptido de interés se produzca
mediante síntesis química o por expresión de ADN recombinante.
El acoplamiento de los dos constituyentes se
puede llevar a cabo mediante un agente de acoplamiento o
conjugación. Existen diversos reactivos de reticulación
intermolecular que se pueden utilizar. Véase, por ejemplo, Means y
Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS,
Holden-Day, 1974, pp. 39-43. Entre
estos reactivos se encuentran, por ejemplo,
J-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato
(SPDP) o N,N-(1,3-fenilen)bismaleimida
(siendo ambos altamente específicos de los grupos sulfhidrilo y
formando enlaces irreversibles);
N,N-etilen-bis(yodoacetamida)
u otro reactivo que tenga de 6 a 11 puentes de carbono metilénicos
(que son relativamente específicos de los grupos sulfhidrilo); y
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno
(que forma enlaces irreversibles con los grupos amino y tirosina).
Otros reactivos de reticulación útiles para este propósito incluyen:
p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodifenilsulfona
(que forma reticulaciones irreversibles con grupos amino y
fenólicos); dimetil-adipimidato (que es específico
de los grupos amino);
fenol-1,4-disulfonilcloruro (que
reacciona principalmente con los grupos amino);
hexametilen-diisocianato o diisotiocianato, o
azofenil-p-diisocianato (que
reacciona principalmente con los grupos amino); glutaraldehído (que
reacciona con varias cadenas laterales diferentes) y
disdiazobencidina (que reacciona esencialmente con la tirosina e
histidina).
Los reactivos de reticulación pueden ser
homobifuncionales, es decir con dos grupos funcionales que
experimentan la misma reacción. Un reactivo de reticulación
homobifuncional preferente es el bismaleimidohexano ("BMH").
El BMH contiene dos grupos maleimida funcionales que reaccionan
específicamente con compuestos que contienen sulfhidrilo bajo
condiciones suaves (pH de 6,5-7,7). Los dos grupos
maleimida están unidos por una cadena hidrocarburo. Por tanto, el
BMH sirve para la reticulación irreversible de polipéptidos que
contienen residuos de cisteína.
Los reactivos de reticulación pueden ser también
heterobifuncionales. Los agentes de reticulación heterobifuncionales
tienen dos grupos funcionales diferentes, por ejemplo un grupo
amino-reactivo y un grupo
tiol-reactivo, que reticularán dos proteínas que
tienen aminas y tioles libres, respectivamente. Ejemplos de agentes
de reticulación heterobifuncionales son
succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
("SMCC"),
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
éster ("MBS"), y
succinimida-4-(p-maleimidofenil)butirato
("SMPB"), análogo de cadena alargada de MBS. El grupo
succinimidilo de estos reticulantes reacciona con una amina primaria
y la maleimida tiol-reactiva forma un enlace
covalente con el tiol de un residuo de cisteína.
Los reactivos de reticulación a menudo tienen
baja solubilidad en agua. Una parte hidrofílica, tal como un grupo
sulfonato, se puede añadir al reactivo de reticulación para mejorar
su solubilidad en agua. El sulfo-MBS y
sulfo-SMCC son ejemplos de reactivos de reticulación
modificados para su solubilidad en agua.
Numerosos reactivos de reticulación producen un
conjugado que es esencialmente no segmentable en condiciones
celulares. Sin embargo, algunos reactivos de reticulación contienen
un enlace covalente, tal como un disulfuro, que es segmentable en
condiciones celulares. Por ejemplo, el reactivo de Traut,
ditio-bis(succinimidilpropionato)
("DSP") y
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato
("SPDP") son reticulantes segmentables bien conocidos. La
utilización de un reactivo de reticulación segmentable permite que
la parte de carga se separe del polipéptido de transporte después
de su suministro a la célula diana. El enlace directo a disulfuro
puede ser también útil.
Numerosos reactivos de reticulación, incluidos
los expuestos anteriormente, son comerciales. Las instrucciones
detalladas para su uso son proporcionadas fácilmente por los
suministradores comerciales. Una referencia general sobre la
reticulación de proteínas y preparación de conjugados es: Wong,
CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING,
CRC Press (1991).
La reticulación química puede incluir el uso de
brazos espaciadores. Los brazos espaciadores proporcionan
flexibilidad intramolecular o ajustan las distancias
intramoleculares entre las partes conjugadas y ayudan así a
conservar la actividad biológica. Un brazo espaciador puede tener la
forma de una parte polipeptídica que incluye aminoácidos
espaciadores, por ejemplo, prolina. Alternativamente, un brazo
espaciador puede formar parte del reactivo de reticulación, tal
como en "SPDP de larga cadena" (Pierce Chem. Co., Rockford,
IL., cat. No. 21651 H).
Alternativamente, el péptido quimérico se puede
producir como un péptido de fusión que incluye la secuencia de
tráfico y la secuencia inhibidora de JNK que se pueden expresar
adecuadamente en células huésped apropiadas conocidas. Los péptidos
de fusión tal como se describen aquí pueden formarse y utilizarse de
manera análoga o fácilmente adaptable a partir de técnicas de ADN
recombinante estándar, tal como se ha descrito anteriormente, así
como por ELISA y otras técnicas inmunológicamente mediadas conocidas
en la técnica. En una realización específica, la selección de
anticuerpos que son específicos de un dominio particular de un
péptido inhibidor de JNK se facilita mediante la generación de
hibridomas que se unen al fragmento de un péptido inhibidor de JNK
que posee un dominio como éste. Se proporcionan asimismo aquí
anticuerpos que son específicos de un dominio dentro de un péptido
inhibidor de JNK, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos del
mismo.
Los anticuerpos anti-péptido
inhibidor de JNK se pueden utilizar en métodos conocidos en la
técnica en relación a la localización y/o cuantificación de un
péptido inhibidor de JNK (por ejemplo, para su uso en niveles de
medición del péptido en muestras fisiológicas apropiadas, para su
uso en métodos de diagnóstico, para su uso en la formación de
imágenes del péptido y similares). En una determinada realización,
los anticuerpos para los péptidos inhibidores de JNK, o derivados,
fragmentos, análogos u homólogos de los mismos, que contienen el
dominio de unión derivado del anticuerpo, se utilizan como
compuestos farmacológicamente activos (en adelante "Productos
Terapéuticos").
Se incluye también en la invención la
utilización de los péptidos de la invención para la preparación de
un medicamento para prevenir o tratar la pérdida de audición
mediante la administración a un sujeto de un Producto Terapéutico,
es decir de un péptido bioactivo permeable de la invención tal como
se ha definido anteriormente, donde el péptido impide que se dañen
los estereocilios de las células pilosas, la apoptosis de las
células pilosas o la apoptosis neuronal. Preferentemente, el
Producto Terapéutico es el péptido que incluye la SEQ ID NO: 3, 4,
5, 6 y 22 o es la SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 23, 24, 25 ó
26.
La exposición a ruidos fuertes provoca la
pérdida de la audición inducida por ruido (NIHL) debido a un daño
del órgano de Corti. La NIHL depende tanto del nivel de ruido como
de la duración de la exposición. La pérdida de audición puede ser
temporal (TTS) si un mecanismo reparador puede rehabilitar el órgano
de Corti. Sin embargo, se vuelve permanente (PTS) cuando mueren las
células pilosas o las neuronas. Los correlatos estructurales del
trauma acústico son de dos tipos: (1) leve daño en la sinapsis y/o
en los estereocilios de las células pilosas que se puede reparar y
explica la TTS y su recuperación, y (2) grave daño que causa la
apoptosis de las células pilosas y neuronales que no se puede
reparar y explica la PTS.
El Producto Terapéutico debe ser administrado al
sujeto antes de su exposición a un trauma acústico, antibiótico o
agente quimioterapéutico. Alternativamente, el Producto Terapéutico
debe ser administrado después de que el sujeto haya estado expuesto
a un trauma acústico, antibiótico o agente quimioterapéutico.
Un trauma acústico es un ruido suficiente para
dañar el Corti. Por ejemplo, un trauma acústico es de al menos 70
dB SPL, de al menos 90 dB SPL o de al menos 100 dB SPL, de al menos
120 dB SPL o de al menos 130 dB SPL.
Los antibióticos incluyen, por ejemplo,
penicilinas tales como la penicilina G, penicilina V, ampicilina,
amoxicilina, dicloxacilina y oxacilina; cefalosporinas tales como
cefalexina (Keflex), cefaclor (Ceclor) y cefixima (Suprax);
aminoglicósidos tales como tobramicina y estreptomicina; macrólidos
tales como eritromicina, azitromicina (Zithromax) y claritromicina;
sulfonamidas tales como trimetoprim-sulfametoxazol o
tetracilinas tales como tetraciclina o doxiciclina.
El Producto Terapéutico puede incluir, por
ejemplo: (i) uno o más de cualquiera de los péptidos inhibidores de
JNK de la invención, que incluyen cualquiera de las secuencias de
aminoácidos seleccionadas entre las SEQ ID NOs: 3-6
y 22, seleccionándose cualquiera de las secuencias de aminoácidos de
entre las SEQ ID NOs. 11-16 y
23-26, o un péptido que sea al menos en un 95%
homólogo a estos péptidos, y derivados, fragmentos, análogos y
homólogos de los mismos; y (ii) ácidos nucleicos que codifican estos
péptidos inhibidores de JNK, y derivados, fragmentos, análogos y
homólogos de los mismos.
El término "terapéuticamente eficaz"
significa que la cantidad de péptido inhibidor, por ejemplo, que se
emplea es suficiente para mejorar el trastorno asociado a JNK, es
decir la pérdida de audición que no esté abarcada por la presente
invención. El término "tratamiento" incluye la administración
de un reactivo que modula la actividad de la quinasa JNK tal como
se ha definido anteriormente. El término "modular" incluye la
supresión de la expresión de la JNK cuando está sobreexpresada.
Incluye asimismo la supresión de la fosforilación de
c-jun, ATF2 o NFAT4, por ejemplo mediante la
utilización de un péptido que incluye las secuencias de aminoácidos
de SEQ ID NOs: 3-6 y 22 o es la SEQ ID NOs:
11-16 y 23-26, como inhibidor
competitivo del lugar de unión natural de c-jun
ATF2 y NFAT4 en una célula. Por tanto, incluye también la supresión
de los complejos hetero- y homo-méricos de los
factores de transcripción compuestos por c-jun, ATF2
o NFAT4 y sus asociados relacionados, por ejemplo el complejo
AP-1 que está compuesto de c-jun,
AFT2 y c-fos.
En algunos casos, "modular" puede incluir
aumentar la expresión de JNK, por ejemplo utilizando un anticuerpo
específico del péptido IB que bloquea la unión de un péptido IB a
JNK, impidiendo así la inhibición de JNK por el péptido asociado a
IB. Los péptidos, péptidos de fusión y ácidos nucleicos inhibidores
de JNK de la invención se pueden formular en composiciones
farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender, además de una
de las sustancias mencionadas anteriormente, excipientes, soportes,
tampones, estabilizantes farmacéuticamente aceptables u otros
materiales bien conocidos por los especialistas en la técnica. Estos
materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir en la
eficacia del ingrediente activo. La naturaleza exacta del soporte o
de otro material puede depender de la vía de administración, por
ejemplo vía oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal,
intramuscular, intraperitoneal, intraauricular o parche.
Las composiciones farmacéuticas para la
administración oral pueden tener forma de tableta, cápsula, polvo o
líquido. Una tableta puede incluir un soporte sólido tal como una
gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas
incluyen en general un soporte líquido como agua, petróleo, aceites
animales o vegetales, un aceite mineral o un aceite sintético. Se
puede incluir una solución salina fisiológica, dextrosa u otra
solución de sacáridos o glicoles, tales como etilenglicol,
propilenglicol o polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, cutánea o
subcutánea, o para una inyección local en el lugar del padecimiento,
el ingrediente activo tendrá la forma de una solución acuosa
parenteralmente aceptable libre de pirógenos y con un pH,
isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos especialistas en la
materia pueden preparar fácilmente soluciones adecuadas mediante,
por ejemplo, vehículos isotónicos tales como la Inyección de Cloruro
de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactato. Se
pueden incluir, según se necesiten, conservantes, estabilizantes,
tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.
Cuando se deba proporcionar a un individuo un
polipéptido, un péptido o una molécula ácido nucleico de acuerdo
con la presente invención, la administración se realiza
preferentemente en una "cantidad profilácticamente eficaz" o
en una "cantidad terapéuticamente eficaz" (según sea el caso,
aunque la profilaxis se pueda considerar como terapia) suficiente
que beneficie al individuo. La cantidad real administrada, así como
la velocidad y la duración de la administración, dependerán de la
naturaleza y la gravedad de lo que se esté tratando. La
prescripción del tratamiento, por ejemplo las decisiones sobre la
dosificación, etc., es responsabilidad del médico generalista y
demás médicos, y tiene en cuenta típicamente el trastorno a tratar,
el estado del paciente particular, el lugar de suministro, el
método de administración y demás factores conocidos por los
médicos. Los ejemplos de técnicas y protocolos mencionados
anteriormente pueden encontrarse en REMINGTON's PHARMACEUTICAL
SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980.
Alternativamente, se pueden utilizar terapias
diana para suministrar el agente activo de forma más específica a
ciertos tipos de células, mediante la utilización de sistemas diana
tales como ligandos específicos de anticuerpos o células. El
direccionamiento puede ser deseable por varias razones; por ejemplo
cuando el agente es inaceptablemente tóxico o si necesitara de otro
modo una dosificación demasiado alta, o si no pudiera de otro modo
entrar en las células diana.
En lugar de administrar estos agentes
directamente, podrían ser producidos en las células diana mediante
la expresión de un gen codificador introducido en las células, por
ejemplo en un vector viral (una variante de la técnica VDEPT -
véase a continuación). El vector podría ser direccionado hacia las
células específicas a tratar o podría contener elementos
reguladores que se conectan de forma más o menos selectiva por las
células diana.
Alternativamente, el agente podría administrarse
en forma de un precursor para la conversión en una forma activa por
un agente activador producido en, o direccionado hacia, las células
a tratar. Este tipo de aproximación se conoce a veces como ADEPT o
VDEPT; el primero implicando el direccionamiento del agente
activador hacia las células mediante la conjugación a un anticuerpo
celular específico, mientras que el último implica la producción
del agente activador, por ejemplo un péptido inhibidor de JNK, en un
vector mediante la expresión procedente del ADN de codificación en
un vector viral (véase por ejemplo, la
EP-A-415731 y WO 90/07936).
En una realización específica de la presente
invención, los ácidos nucleicos que incluyen una secuencia que
codifica un péptido inhibidor de JNK incluyendo cualquiera de las
secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre las SEQ ID NOs:
3-6 y 22, o siendo cualquiera de las secuencias de
aminoácidos seleccionadas de entre las SEQ ID NOs:
11-16 y 23-26, en un péptido que sea
al menos en un 95% aproximadamente homólogo a estos péptidos, o
derivados funcionales del mismo, se pueden administrar con una
composición farmacéutica para modular las rutas de señales
activadas de la JNK por medio de una terapia genética. En
realizaciones más específicas, uno o más ácidos nucleicos que
codifican un péptido inhibidor de JNK tal como se ha definido
anteriormente se pueden administrar por medio de una terapia
genética. La terapia genética se refiere a una terapia que se lleva
a cabo mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico
específico. En esta realización de la presente invención, el ácido
nucleico produce su(s) péptido(s)
codificado(s), que sirve(n) luego para ejercer un
efecto terapéutico mediante su función moduladora de la enfermedad o
trastorno, es decir la pérdida de audición. Cualquiera de las
metodologías relacionadas con la terapia genética disponibles en la
técnica se puede utilizar con este propósito. Véase, por ejemplo,
Goldspiel y col., 1993. Clin. Pharm. 12:488-505.
El Producto Terapéutico puede comprender además
un ácido nucleico que es parte de un vector de expresión que
expresa uno o más de cualquiera de los péptidos asociados a IB, los
péptidos asociados a JBD_{20} o fragmentos, derivados o análogos
de los mismos, tal como se ha definido anteriormente, dentro de un
huésped adecuado. Un ácido nucleico como este puede poseer un
promotor que esté ligado de forma operable a la(s)
region(es) de codificación de un péptido inhibidor de JNK.
El promotor puede ser inducible o constitutivo y opcionalmente,
específico del tejido. La molécula de ácido nucleico puede
comprender además secuencias de codificación (y cualquier otra
secuencia deseada) que estén flanqueadas de regiones que favorecen
la recombinación homóloga en un lugar deseado dentro del genoma,
previendo así la expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos.
Véase, por ejemplo, Koller y Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:8932-8935.
El suministro de este ácido nucleico del
Producto Terapéutico a un paciente puede ser directo (es decir, se
expone directamente el paciente al ácido nucleico o al vector que
contiene el ácido nucleico) o indirectamente (es decir, las células
se transforman primero con el ácido nucleico in vitro, luego
se transplantan en el paciente). Estas dos aproximaciones se
conocen, respectivamente, como terapia in vivo o ex
vivo. Este ácido nucleico se puede administrar directamente
in vivo, donde se expresa para producir el producto
codificado. Esto se puede llevar a cabo mediante cualquiera de
numerosos métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo,
la construcción del ácido nucleico como parte de un vector apropiado
de expresión del ácido nucleico y la administración del mismo de
manera tal que se convierta en intracelular (por ejemplo, mediante
infección utilizando un vector retroviral defectivo o atenuado u
otro vector viral; véase la patente de Estados Unidos Nº
4.980.286); inyectando directamente ADN desnudo; utilizando
bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un ``Gene Gun®;
Biolistic, DuPont); recubriendo los ácidos nucleicos con lípidos;
utilizando agentes transfectantes/receptores en la superficie
celular asociada; encapsulación en liposomas, micropartículas, o
microcápsulas; administrándolo en un enlace a un péptido conocido
por penetrar en el núcleo; o administrándolo en un enlace a un
ligando predispuesto a la endocitosis mediada por receptor (véase,
por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem.
262:4429-4432), que se puede utilizar para
"enfocar" tipos de células que expresan específicamente los
receptores de interés, etc.
Una aproximación ilustrativa adicional a la
terapia genética puede incluir la transferencia de un gen en células
en un cultivo de tejido in vitro por medio de métodos tales
como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato
de calcio, infección viral o similares. En general, el método de
transferencia incluye la transferencia concomitante de un marcador
de selección a las células. Las células se colocan entonces bajo
una presión de selección (por ejemplo resistencia a los
antibióticos) para facilitar el aislamiento de aquellas células que
han recogido, y están expresando, el gen transferido. Aquellas
células se pueden suministrar a un paciente. En una realización
específica, antes de la administración in vivo de la célula
recombinante resultante, se introduce el ácido nucleico en una
célula mediante cualquier método conocido en la técnica,
incluyendo, por ejemplo, transfección, electroporación,
microinyección, infección con un vector viral o con bacteriofágos
que contienen secuencias de ácido nucleico de interés, fusión
celular, transferencia de genes mediada por cromosomas,
transferencia de genes mediada por microcélulas, fusión de
esferoplastos y metodologías similares, que aseguran que las
funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células
receptoras no son interrumpidas por la transferencia. Véase, por
ejemplo, Loeffler and Behr, 1993. Meth. Enzymol.
217:599-618. La técnica elegida debe prever la
transferencia estable del ácido nucleico a la célula para que el
ácido nucleico pueda ser expresado por la célula. Típicamente, el
ácido nucleico transferido puede ser heredado y expresado por la
progenie celular.
Aquellas células recombinantes resultantes
pueden ser suministradas a un paciente mediante diversos métodos
conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la inyección de
células epiteliales (por ejemplo, de forma subcutánea), aplicación
de células recombinantes de la piel como injerto de piel en el
paciente e inyección intravenosa de células sanguíneas
recombinantes (por ejemplo, células hematopoyéticas del vástago/del
progenitor). La cantidad total de células que se prevén para su uso
dependen del efecto deseado, estado del paciente y similares, y
pueden ser determinadas por un especialista en la técnica.
Las células en las cuales se puede introducir un
ácido nucleico con el propósito ilustrativo anterior de la terapia
genética pueden abarcar cualquier tipo celular deseado, disponible,
y pueden ser xenogénicas, heterogéneas, singeneicas u autogénicas.
Los tipos de células pueden incluir células diferenciadas, tales
como células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos,
fibroblastos, células musculares, hepatocitos, y células sanguíneas,
o varias células del vástago/del progenitor, en particular células
musculares cardiacas embrionales, células de vástago del hígado
(publicación de la patente internacional WO 94/08598), células de
vástago neurales (Stemple y Anderson, 1992, Cell 71:
973-985), células hematopoyéticas del vástago o del
progenitor, por ejemplo, tal como se obtienen de la médula ósea,
sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal y
similares. Las células utilizadas para la terapia genética pueden
ser además autólogas del paciente.
\newpage
Los péptidos de la presente invención se pueden
utilizar en ensayos (por ejemplo, inmunoensayos) para detectar,
pronosticar, diagnosticar o comprobar los estados, enfermedades y
trastornos mencionados anteriormente caracterizados por niveles
aberrantes de JNK o por un péptido inhibidor de JNK, o para
controlar el tratamiento del mismo. "Nivel aberrante"
significa un incremento o reducción del nivel en una muestra con
respecto al que está presente en una muestra análoga procedente de
una parte no afectada del cuerpo, o de un sujeto que no tiene
trastorno alguno. El inmunoensayo se puede llevar a cabo mediante
un método que comprende poner en contacto una muestra procedente de
un paciente con un anticuerpo en condiciones tales que pueda tener
lugar la unión inmunoespecífica, y posteriormente la detección o
medida de la cantidad de toda unión inmunoespecífica por el
anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo específico de un péptido
inhibidor de JNK se puede utilizar para analizar una muestra de
tejido o de suero de un paciente en busca de la presencia de JNK o
de un péptido inhibidor de JNK; siendo un nivel aberrante de JNK o
de un péptido inhibidor de JNK indicativo de un estado de
enfermedad. Los inmunoensayos que se pueden utilizar incluyen
sistemas de ensayos competitivos y no competitivos, empleando
técnicas tales como Western Blots, radioinmunoensayos (RIA), ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayos tipo
"sandwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de
precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos
de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, inmunoensayos
fluorescentes, ensayos de fijación del complemento, ensayos
inmunorradiométricos, e inmunoensayos de la proteína A, etc.
La presente invención no debe ser limitada en su
alcance por las realizaciones específicas descritas aquí.
Efectivamente, varias modificaciones de la invención además de las
que están descritas aquí se evidenciarán a los especialistas en la
técnica a partir de la descripción anterior y de las figuras
adjuntas.
Se identificaron las secuencias de aminoácidos
importantes para la interacción eficaz con JNK por las alineaciones
de las secuencias entre los JBDs conocidos. La comparación de
secuencias entre los JBDs de IB1 [SEQ ID NO:17], IB2 [SEQ ID
NO:18], c-Jun [SEQ ID NO:19] y ATF2 [SEQ ID NO:20]
definió una secuencia de 8 aminoácidos débilmente conservada (Fig.
1A). Como los JBDs de IB1 e IB2 son aproximadamente 100 veces más
eficaces que c-Jun o ATF2 en la unión a JNK
(Dickens y col., Science 277: 693 (1997), se pensó que los residuos
conservados entre IB1 e IB2 deberían ser importantes para conferir
la máxima unión. La comparación entre los JBDs de IB1 e IB2 definió
dos bloques de siete y tres aminoácidos altamente conservados entre
las dos secuencias. Estos dos bloques están incluidos en una
secuencia peptídica de 23 aminoácidos en IB1 [SEQ ID NO: 1] y de 21
aminoácidos en IB2 [SEQ ID NO: 2]. Estas secuencias se muestran en
la Fig. 1B, las rayas en la secuencia IB2 indican un espacio en la
secuencia con el fin de alinear los residuos conservados.
Los péptidos inhibidores de JNK (JNKI) de la
presente invención se obtuvieron uniendo el motivo de unión de
JIP-1/IB1 a la JNK de 20 aminoácidos, denominado
aquí JBD_{20}, a una proteína de tráfico, por ejemplo la
secuencia transportadora
HIV-TAT_{48-57} de 10
aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron proteínas de fusión inhibidoras
de JNK enlazando de forma covalente el extremo
C-terminal de JBD_{23} o la secuencia de 21
aminoácidos procedente del JBD de IB2 (JBD_{21}) o el extremo
C-terminal de la secuencia de aminoácidos
JBD_{20} a un péptido transportador de 10 aminoácidos de longitud
N-terminal procedente de
VIH-TAT_{48-57} (Vives y col., J.
Biol. Chem. 272: 16010 (1997)) a través de un espaciador compuesto
de dos residuos de prolina. Este espaciador se utilizó para permitir
la máxima flexibilidad e impedir cambios estructurales secundarios
no deseados. Como se muestra en la Fig. 1C, estas preparaciones se
designaron L-TAT [SEQ ID NO:7],
L-TAT-IB1 [SEQ ID NO: 11],
L-TAT-IB2 [SEQ ID NO: 12] y
L-TAT-JNKI1 [SEQ ID NO:21],
respectivamente. Todos los péptidos de fusión TAT de los péptidos
retro-inversos D se sintetizaron también y se
designaron D-TAT [SEQ ID NO: 8],
D-TAT-IB1 [SEQ ID NO: 14] y
D-TAT-JNKI1 [SEQ ID NO: 22]
respectivamente. Todos los péptidos D y L se produjeron mediante
síntesis simulada F clásica y se analizaron después por
Espectrometría de Masas. Se purificaron finalmente por HPLC. Para
determinar los efectos del espaciador de prolina, se produjeron dos
tipos de péptido TAT, uno con y uno sin dos prolinas. No parece que
la adición de las dos prolinas modifique la entrada o la
localización del péptido TAT en las células interiores.
Los péptidos genéricos que muestran los residuos
de aminoácidos conservados se muestran en la Fig. 2. Una "X"
indica cualquier aminoácido. El número de X en un péptido
determinado no se limita al que se describe y puede variar (es
decir, X puede representar cualquier número de residuos de
aminoácidos, incluyendo cero). Véase arriba para una descripción
más detallada de las secuencias genéricas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudiaron entonces los efectos de la
secuencia de JBD de 23 aminoácidos de longitud de IB1 sobre las
actividades biológicas de la JNK. La secuencia de 23 aminoácidos
estaba enlazada en el N-terminal a la Proteína
Fluorescente Verde (constructo GFP-JBD_{23}), y
se evaluó el efecto de este constructo sobre la apoptosis de
células-\beta pancreáticas inducida por
IL-1\beta. Véase la Fig. 3. Se demostró
previamente que este modo de apoptosis había sido bloqueado por la
transfección con JBD_{1-280}, mientras que los
inhibidores específicos de ERK1/2 o p38 no se protegieron. Véase
Ammendrup y col, más arriba.
Los oligonucleótidos correspondientes a la
secuencia de 23 aminoácidos (JBD_{23}; Fig. 1B) y una secuencia
mutada en las regiones totalmente conservadas (JBD_{23mut}) fueron
sintetizados e insertados direccionalmente en los sitios EcoRI y
SalI del vector pEGFP-N1 que codifica la Proteína
Fluorescente Verde (GFP) (de Clontech). Se cultivaron células
\betaTC-3 productoras de insulina en un medio RPMI
1640 complementado con Suero de Ternera Fetal al 10%, 100 \mug/ml
de estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina y 2 mM de
glutamina. Las células \betaTC-3 productoras de
insulina fueron transfectadas con los vectores indicados y se añadió
IL-1\beta (10 ng/ml) al medio de cultivo celular.
El número de células apoptóticas se contó 48 horas después de la
adición de IL-1\beta utilizando un microscopio de
fluorescencia invertido. Se distinguieron las células apoptóticas
de las células normales por la "formación de ampollas"
características en el citoplasma y se contaron después de dos
días.
Tal como se indica en la Fig. 3, GFP es el
vector de expresión de la Proteína Fluorescente Verde utilizado
como control; JBD23 es el vector que expresa una GFP quimérica
enlazada a la secuencia de 23 aminoácidos procedente del JBD de
IB1; JBD23Mut es el mismo vector que GFP-JBD23, pero
con un JBD mutado en cuatro residuos conservados mostrados en la
Fig 1B; y JBD280 es el vector de GFP enlazado al JBD entero
(aminoácidos 1-280). La construcción que expresa
GFP-JBD_{23} impidió la apoptosis de células
\beta pancreáticas inducida por IL-1\beta tan
eficazmente como el JBD_{1-280} entero (Fig. 3,
7BD23/IL-1 comparado con
JBD280/IL-1). Como controles adicionales, las
secuencias mutadas en los residuos de IB1 totalmente conservados
tenían una capacidad muy reducida de impedir la apoptosis (Fig. 3,
JBD23Mut/IL-1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la capacidad de las formas L- y
D-enantioméricas de los péptidos TAT,
TAT-IB1 y TAT-IB2 ("péptidos
TAT-IB") para penetrar en las células.
Los péptidos L-TAT,
D-TAT, L-TAT-IB1,
L-TAT-IB2 y
D-TAT-IB1 [SEQ ID NOs: 7, 8, 11, 12
y 14, respectivamente] fueron marcados por adición
N-terminal de un residuo de glicina conjugado a
fluoresceína. Los péptidos marcados (1 \muM) se añadieron a los
cultivos de células \betaTC-3, que se mantuvieron
tal como se describe en el Ejemplo 3. En ciertos momentos
predeterminados, se lavaron las células con PBS y se fijaron durante
cinco minutos en metanol-acetona (1:1) helado antes
de ser examinadas bajo microscopio de fluorescencia. Se utilizó
como control BSA marcado con fluoresceína (1 \muM, 12 mol/mol de
BSA). Los resultados demostraron que todos los péptidos marcados
con fluoresceína anteriores habían penetrado eficaz y rápidamente
(menos de cinco minutos) en las células una vez añadidos al medio
de cultivo. A la inversa, la seroalbúmina bovina marcada con
fluoresceína (1 \muM de BSA, 12 mol de fluoresceína/mol de BSA)
no penetró en las células.
Un estudio de medición indicó que la intensidad
de la señal fluorescente para los péptidos
L-enantioméricos se redujo en un 70% después de un
período de 24 horas. Después de 48 horas había pocas señales o
ninguna señal. Por contraste, D-TAT y
D-TAT-IB1 eran extremadamente
estables dentro de las células. Las señales fluorescentes
procedentes de todos estos péptidos retro-inversos D
seguían siendo muy fuertes 1 semana más tarde, y la señal había
disminuido sólo apenas a las 2 semanas después del tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigaron in vitro los efectos de
los péptidos sobre la fosforilación mediada por las JNKs de sus
factores de transcripción diana. Se produjeron JNK1, JNK2 y JNK3
recombinantes y no activados por medio de un kit de TRANSCRIPCIÓN Y
TRADUCCIÓN de lisados de reticulocitos de conejo (Promega) y se
utilizaron en ensayos de quinasa en fase sólida con
c-Jun, ATF2 y Elk1, solos o fundidos a
glutation-S-transferasa (GST), como
sustrato. Se realizaron estudios dosis-respuesta
donde los péptidos L-TAT,
L-TAT-IB1 o
L-TAT-IB2 (0-25
\muM) se mezclaron con las quinasas JNK1, JNK2 o JNK3
recombinantes en el tampón de reacción (20 mM
Tris-acetato, 1 mM EGTA, 10 mM
p-nitrofenil-fosfato (pNPP), 5 mM pirofosfato
de sodio, 10 mM p-glicerofosfato, 1 mM de
ditiotreitol) durante 20 minutos. Las reacciones de las quinasas se
iniciaron entonces mediante la adición de 10 mM MgCl_{2} y 5
\muCi de ^{33}P-\gamma-dATP y
1 \mug de GST-Jun (aminoácidos
1-89), GST-AFT2 (aminoácidos
1-96) o GST-ELK1 (aminoácidos
307-428). Las proteínas de fusión con GST se
compraron a Stratagene (La Jolla, CA). Se añadieron también a la
mezcla diez \mul de perlas de glutatión-agarosa.
Los productos de reacción se separaron entonces por
SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10%
desnaturalizante. Se secaron los geles y se expusieron
posteriormente a películas de rayos X (Kodak). Se observó una
inhibición casi completa de la fosforilación de
c-Jun, ATF2 y Elk1 por las JNKs a dosis de péptidos
TAT-IB tan bajas como de 2,5 \muM. Sin embargo,
la excepción notable fue la ausencia de inhibición por
TAT-IB de la fosforilación por JNK3 de Elk1. En
general, el péptido TAT-IB1 apareció ligeramente
superior a TAT-IB2 en la inhibición de la
fosforilación de la familia de JNK de sus factores de transcripción
diana (Véase la Fig. 4A).
La capacidad de los péptidos
D-TAT, D-TAT-IB1 y
L-TAT-IB1 (estudio con dosificación
de 0-250 \muM) para inhibir la fosforilación de
GST-Jun (aminoácidos 1-73) por JNK1,
JNK2 y JNK3 recombinantes se analizó tal como se ha descrito
anteriormente. En general, el péptido
D-TAT-IB1 redujo la fosforilación
mediada por JNK de c-Jun, pero a niveles
aproximadamente 10-20 veces menos eficaces que
L-TAT-IB1 (Véase la Fig. 4B).
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron los efectos de los péptidos
L-TAT, L-TAT-IB1 ó
L-TAT-IB2 sobre las JNK activadas
por estímulos estresantes utilizando GST-Jun para
reducir las JNK procedentes de células HeLa irradiadas con luz UV o
células \betaTC tratadas con IL-1\beta. Se
cultivaron células \betaTC tal como se ha descrito anteriormente.
Se cultivaron las células HeLa en un medio DMEM complementado con
Suero de Ternera Fetal al 10%, 100 \mug/ml de estreptomicina, 100
unidades/ml de penicilina y 2 mM de glutamina. Una hora antes de
utilizarlas para la preparación del extracto celular, se activaron
las células \betaTC con IL-1\beta tal como se ha
descrito anteriormente, mientras que las células HeLa fueron
activadas con luz UV (20 J/m^{2}). Se prepararon extractos
celulares a partir de células HeLa irradiadas con luz UV, de
control, y células \betaTC-3 tratadas con
IL-1\beta extrayendo los cultivos celulares en un
tampón de lisis (20 mM Tris-acetato, 1 mM EGTA,
Triton-X-100 al 1%, 10 mM
p-nitrofenil-fosfato, 5 mM pirofosfato de
sodio, 10 mM \beta-glicerofosfato, 1 mM
ditiotretiol). Se eliminaron los restos por centrifugación durante
cinco minutos a 15.000 rpm en un rotor SS-34
Beckman. Se incubaron cien \mug de extractos durante una hora a
temperatura ambiente con un \mug de GST-Jun
(aminoácidos 1-89) y 10 \mul de perlas de
glutatión-agarosa (Sigma). Después de cuatro lavados
con el tampón de extracción, se resuspendieron las perlas en el
mismo tampón complementado con los péptidos L-TAT,
L-TAT-IB1 o
L-TAT-IB2 (25 \muM) durante 20
minutos. Las reacciones de las quinasas se iniciaron entonces
mediante la adición de 10 mM MgCl_{2} y 5 \muCi de
^{33}P-\gamma-dATP y se
incubaron durante 30 minutos a 30ºC. Los productos de reacción se
separaron entonces por SDS-PAGE en un gel de
poliacrilamida al 10% desnaturalizante. Se secaron los geles y se
expusieron posteriormente a películas de rayos X (Kodak). En estos
experimentos, los péptidos TAT-IB impidieron
eficazmente la fosforilación de c-Jun por las JNK
activadas (Véase la Fig. 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si los péptidos con
permeabilidad celular podrían bloquear la señalización de JNK in
vivo, utilizamos un sistema GAL4 heterólogo. Células HeLa
cultivadas tal como se ha descrito anteriormente fueron
cotransfectadas con el vector reporter 5xGAL-LUC
junto con el constructo de expresión de GAL-Jun
(Stratagene), que comprende el dominio de activación de
c-Jun (aminoácidos 1-89) enlazado al
dominio de unión a ADN GAL4. La activación de JNK se obtuvo
mediante la cotransfección de los vectores que expresan las quinasas
directamente "aguas arriba" MKK4 y MKK7 (véase, Whitmarsh y
col., Science 285: 1573 (1999)). Brevemente, 3 x 10^{5} células
fueron transfectadas con los plásmidos en placas de 3,5 cm
utilizando DOTAP (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Para los experimentos que implicaban
GAL-Jun, 20 ng del plásmido fueron transfectados
con 1 \mug del plásmido reporter pFR-Luc
(Stratagene) y 0,5 \mug de los plásmidos de expresión MKK4 o
MKK7. Tres horas después de la transfección, se cambiaron los medios
celulares y se añadieron (1 \muM) los péptidos TAT,
TAT-IB1 y TAT-IB2. Se midieron las
actividades de luciferasa 16 horas más tarde por medio del
"Sistema del Doble Reporter" de Promega después de la
normalización del contenido proteico. Como se muestra en la Fig. 5,
la adición de los dos péptidos TAT-IB1 y
TAT-IB2 bloqueó la activación de
c-Jun después de la activación mediada por MKK4 y
MKK7 de JNK. Debido a que las células HeLa expresan las isoformas
tanto de JNK1 como de JNK2 pero no de JNK3, transfectamos células
con JNK3. De nuevo, los dos péptidos TAT-IB
inhibieron la activación mediada por JNK2 de
c-Jun.
\vskip1.000000\baselineskip
Investigamos los efectos de los péptidos
L-TAT-IB sobre la promoción de la
apoptosis de células-\beta pancreáticas provocada
por IL-1\beta. Se incubaron los cultivos celulares
de \betaTC-3 durante 30 minutos con 1 \muM de
los péptidos L-TAT-IB1 o
L-TAT-IB2 seguido de 10 ng/ml de
IL-1\beta. Se realizó una segunda adición del
péptido (1 \muM) 24 horas más tarde. Se contaron las células
apoptóticas después de dos días de incubación con
IL-1\beta utilizando una tinción nuclear con
yoduro de propidio (las células de color rojo son células muertas)
y Hoechst 33342 (las células de color azul son células con su
membrana plasmática intacta). Como se muestra en la Fig. 5, la
adición de los péptidos TAT-IB inhibió la apoptosis
inducida por IL-1\beta de las células
\betaTC-3 cultivadas dos días en presencia de
IL-1\beta.
La inhibición a largo plazo de la muerte celular
inducida por IL-1\beta se estudió mediante el
tratamiento de células \betaTC-3 tal como se ha
descrito anteriormente, excepto que la incubación de las células con
los péptidos e IL-1\beta se mantuvo durante 12
días. Se añadieron péptidos adicionales (1 \muM) cada día y se
añadieron cada 2 días IL-1\beta (10 ng/ml). El
péptido TAT-IB1 confiere en estas condiciones una
fuerte protección contra la apoptosis. Tomados conjuntamente, estos
experimentos establecen que los péptidos TAT-IB son
moléculas biológicamente activas capaces de prevenir los efectos de
la señalización de JNK sobre el destino celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos de la invención pueden ser péptidos
con aminoácidos D totales sintetizados al revés para prevenir la
proteolisis natural (es decir, péptidos
retro-inversos D totales). Un péptido
retro-inverso D total de la invención proporciona
un péptido con propiedades funcionales similares al péptido nativo
donde los grupos laterales del componente aminoácido corresponden a
la alineación del péptido nativo, pero que conservan una columna
resistente a las proteasas.
Los péptidos retro-inversos de
la invención son análogos sintetizados utilizando aminoácidos D
mediante la unión de los aminoácidos en una cadena peptídica de
modo tal que la secuencia de aminoácidos en el análogo de péptido
retro-inverso sea exactamente la contraria a la
secuencia en el péptido seleccionado que sirve de modelo. Para
ilustrarlo, si la proteína TAT natural (formada por
L-aminoácidos) tiene la secuencia GRKKRRQRRR [SEQ
ID NO:7], el análogo de péptido retro-inverso de
este péptido (formado por D-aminoácidos) tendrá la
secuencia RRRQRRKKRG [SEQ ID NO:8]. Son conocidos en la técnica los
procedimientos para sintetizar una cadena de
D-aminoácidos para formar los péptidos
retro-inversos. Véase, por ejemplo, Jameson y col.,
Nature, 368, 744-746 (1994); Brady y col., Nature,
368, 692-693 (1994)); Guichard y col., J. Med. Chem.
39, 2030-2039 (1996). De forma específica, los
retro-péptidos se produjeron por medio de la
síntesis simulada F clásica y se analizaron después por
Espectrometría de Masas. Se purificaron finalmente por HPLC.
Debido a que un problema inherente a los
péptidos nativos es la degradación por las proteasas naturales y la
inmunogenicidad inherente, los compuestos heterobivalentes o
heteromultivalentes de esta invención se prepararán para incluir el
"isómero retro-inverso" del péptido deseado. La
protección del péptido contra la proteolisis natural, por tanto,
tendría que aumentar la eficacia del compuesto heterobivalente o
heteromultivalente específico, tanto prolongando la vida media como
disminuyendo el alcance de la respuesta inmune destinada a destruir
activamente los péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad biológica a largo plazo se prevé
para D-TAT-IB
retro-inverso que contiene el heteroconjugado
peptídico cuando se compara con el análogo de
L-aminoácido nativo debido a la protección del
péptido D-TAT-IB contra la
degradación por proteasas nativas, tal como se muestra en el Ejemplo
5.
Se analizó la inhibición de la muerte de
células-\beta pancreáticas inducida por
IL-1\beta por el péptido
D-TAT-IB1. Tal como se muestra en la
Fig. 10, se incubaron las células \betaTC-3 tal
como se ha descrito anteriormente durante 30 minutos con una sola
adición de los péptidos indicados (1 \muM), luego se añadió
IL-1\beta (10 ng/ml). Se contaron entonces las
células apoptóticas después de dos días de incubación con
IL-1\beta utilizando una tinción nuclear con
yoduro de propidio y Hoechst 33342. Se contó un mínimo de 1.000
células en cada experimento. Se indica el Error Estándar de las
Medias (SEM), n=5. El péptido
D-TAT-IB1 redujo la apoptosis
inducida por IL-1 hasta un punto similar a los
péptidos L-TAT-IB (comparar la Fig.
5 y la Fig. 10).
Se analizó también la inhibición a largo plazo
de la muerte celular inducida por IL-1\beta por el
péptido D-TAT-IB1. Se incubaron las
células \betaTC-3 tal como se hizo anteriormente
durante 30 minutos con una sola adición de los péptidos indicados
(1 \muM), luego se añadió IL-1\beta (10 ng/ml),
seguido de la adición de la citoquina cada dos días. Se contaron
entonces las células apoptóticas después de 15 días de incubación
con IL-1\beta utilizando una tinción nuclear con
yoduro de propidio y Hoechst 33342. Observen que una sola adición
del péptido L-TAT-IB1 no confiere
una protección a largo plazo. Se contó un mínimo de 1.000 células
en cada experimento. Se indica el Error Estándar de las Medias
(SEM), n=5. Se muestran los resultados en la Fig. 9. El péptido
D-TAT-IB1, pero no
L-TAT-IB1, fue capaz de conferir una
protección a largo plazo (15 días).
\vskip1.000000\baselineskip
Se activa también JNK por radiación ionizante.
Para determinar si los péptidos TAT-IB
proporcionaban protección contra el daño a JNK inducido por
radiación, se irradiaron (30 Gy) células "WiDr" en presencia o
ausencia de los péptidos D-TAT,
L-TAT-IB1 o
D-TAT-IB1 (1 \muM añadido 30
minutos antes de la irradiación), tal como se indica en la Fig. 10.
No se irradiaron las células control (CTRL). Se analizaron las
células 48 horas más tarde por medio de tinción PI y Hoechst 33342,
tal como se ha descrito anteriormente. Se indica el SEM, n=3. Ambos
péptidos L-TAT-IB1 y
D-TAT-IB1 fueron capaces de impedir
la apoptosis inducida por irradiación en esta línea celular de
cáncer de colón humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar los efectos radioprotectores de
los péptidos TAT-IB, se irradiaron ratones C57 B1/6
(de 2 a 3 meses de edad) con un rayo 250R de Phillips RT a una
velocidad de dosificación de 0,74 Gy/min (filtro de Cu de 0,5 mm,
17 mA). Treinta minutos antes de la irradiación, se inyectaron i.p.
los animales con los péptidos TAT,
L-TAT-IB1 y
D-TAT-IB1 (30 \mul de una solución
de 1 mM). Brevemente, se irradiaron los ratones como sigue: se
colocaron los ratones en pequeñas cajas de plástico con la cabeza
fuera de la caja. Se colocaron los animales de espaldas bajo el
irradiador y se les fijó el cuello en un pequeño túnel de plástico
para mantener la cabeza en una posición correcta. Se protegió el
cuerpo con plomo. Antes de la irradiación, se mantuvieron los
ratones con comida en gránulos estándar para ratones, sin embargo
después de la irradiación los ratones fueron alimentados con una
comida semilíquida que se renovó cada día.
La reacción de la mucosa labial fue registrada
entonces por 2 observadores independientes de acuerdo con un
sistema de registro desarrollado por Parkins y col. (Parkins y col.,
Radiotherapy & Oncology, 1: 165-173, 1983), en
el que se registró el estado eritematoso así como la presencia de
edema, descamación y exudación. Además, se pesaron los animales
antes de cada registro de su estado eritematoso/edematoso.
La Fig. 12A ilustra el peso de los ratones
después de la irradiación. Los valores se indican según el peso
inicial de los ratones que fue establecido en 100. CTRL: ratones
control inyectados con 30 \mul de una solución salina. n=2 para
cada uno de los valores indicados, se indican los S.D. Los valores x
son días.
La Fig. 12B ilustra el registro de eritema/edema
después de la irradiación. Se cuantificó el estado edematoso y
eritematoso del labio ventral de los mismos ratones como en la Fig.
12A. n=2 para cada valor registrado. Los valores x son días.
Los resultados de estos experimentos indican que
los Péptidos TAT-IB pueden proteger contra la
pérdida de peso y contra el eritema/edema asociados a la radiación
ionizante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo ensayos de retardo en gel con
una sonda de doble marcado de AP-1
(5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG
GAA-3'). Los extractos nucleares de células HeLa que
fueron tratados o no durante una hora con 5 ng/ml de
TNF-\alpha, son tal como se indican. Los péptidos
TAT y L-TAT-IB1 se añadieron 30
minutos antes de TNF-\alpha. Se muestra solamente
la parte del gel con el complejo ADN AP-1 específico
(tal como lo demuestran los experimentos de competición con
competidores no específicos y específicos no marcados). Los péptidos
L-TAT-IB1 reducen la formación del
complejo de unión de AP-1 a ADN en presencia de
TNF-\alpha (Véase la Fig. 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectó una solución de
D-JNKI (1 \muM, 1 \mul/h) en el oído interno
derecho de una cobaya tal como se muestra en la Fig. 13, panel A,
mientras que se inyectó solamente una solución salina en el oído
izquierdo. La cobaya se expuso entonces a un trauma acústico (120
dB, 30 minutos) y se llevó a cabo el registro de la sensibilidad de
audición tres días después (Fig. 13, panel B), así como el examen
histológico del oído interno (Fig. 13, panel C y D). Como se
muestra en la Fig. 13, las estructuras ciliadas del oído tratado con
JNKI están totalmente protegidas contra la destrucción inducida por
ruido, tal como se estima a partir del examen histológico, por
contraste con el oído no tratado en el cual ha desaparecido la mayor
parte de las estructuras ciliadas. Además, parece que se ha
conservado la sensibilidad al ruido del oído tratado con
D-JNK1 (Fig. 13, panel B).
\vskip1.000000\baselineskip
Se trataron los oídos internos de pollos con
estreptomicina en presencia/ausencia de D-JNKI. Se
realizaron entonces experimentos TUNEL para detectar la apoptosis
(núcleos verdes). Como se muestra en la Fig. 14, la
D-JNKI protege totalmente los oídos internos contra
la apoptosis inducida por la estreptomicina. Por tanto, la
D-JNK-I es útil en la prevención de
estados de pérdida de audición sostenidos debidos a una terapia con
antibióticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trataron células de los islotes pancreáticos
con D-JNK1 (1 mM durante una hora antes de su
exposición a la interleuquina 1B (10 ng/ml)). Como se muestra en la
Fig. 15, los islotes tratados con D-JNK1 resisten la
destrucción inducida por IL-1B. Esto indica que el
tratamiento con D-JNK1 ayuda a conservar los islotes
injertados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió
D-JNK-I junto con colagenasa durante
el aislamiento de las células de los islotes. Esto resultó en una
producción incrementada de islotes después de 3 días en el cultivo,
tal como se mide mediante el aumento de
lactato-deshidrogenasa. Véase la Fig. 15.
\vskip1.000000\baselineskip
Cultivo Neuronal General: Pequeños trozos
de corteza cerebral de crías de dos días de rata adulta se disecaron
e incubaron con 200 unidades de papaína durante 30 minutos a 34ºC.
Luego, se colocaron en placas las neuronas a densidades de
aproximadamente 1 x 10^{6} células/placa en cubetas que habían
sido prerrecubiertas con 100 \mug/ml de
poli-D-lisina. Se cultivaron las
células utilizando un medio de cultivo B27/Neurobasal (Life
Technologies) complementado con 0,5 m de glutamina, 100 U/ml de
penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina.
Ensayo de citotoxicidad mediante
lactato-deshidrogenasa (LDH): La cantidad de LDH
liberada en el medio de cultivo se midió utilizando el kit de
ensayo de citotoxicidad no radioactivo Cytotox 96 (Promega).
Captación de
GST-c-Jun y ensayo de quinasa:
Se prepararon extractos celulares mediante raspado de células en un
tampón de lisis (20 mM Tris-acetato, 1 mM EGTA,
Triton-X-100 al 1%, 10 mM
p-nitrofenil-fosfato, 5 mM pirofosfato de
sodio, 10 mM \beta-glicerofosfato, 1 mM
ditiotretiol). Se incubaron muestras de 25 \mug durante 1 hora a
temperatura ambiente con 1 \mug de
GST-c-Jun (residuos de aminoácidos
1-89) y 10 \mul de perlas de
glutatión-agarosa (Sigma). Se lavaron las perlas
cuatro veces y se resuspendieron en el tampón de lisis descrito
anteriormente. Se realizaron entonces los ensayos de quinasa in
vitro utilizando JNK1\alpha1 recombinante y 0,5 \mug de un
sustrato seleccionado de entre el grupo compuesto por proteínas de
fusión con GST (por ejemplo, proteínas de fusión
GST-Jun y GST-E1k1), caseína e
histona (Sigma). Se iniciaron las reacciones con 10 mM MgCl_{2} y
10 \muM ATP en presencia de 5 \muCi^{33}P-ATP,
y se incubaron durante 30 minutos a 30ºC. Los productos de reacción
se separaron por SDS-PAGE, se secaron los geles y
después se expusieron a películas de rayos X (Kodak).
Western Blot: Se obtuvieron extractos
proteicos totales mediante raspado de células en el tampón de lisis
(descrito anteriormente), separando las proteínas en un gel de
poliacrilamida SDS al 12%. Las proteínas separadas se trasladaron
entonces a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Los
anticuerpos utilizados en el Western Blot descritos aquí se
obtuvieron de Alexis.
Separación de núcleos del citoplasma:
Para aislar los núcleos para el análisis Western Blot (véase la Fig.
17B), se lisaron neuronas durante 15 minutos en el tampón de lisis
y después se centrifugaron las muestras a 300 g durante 10 minutos
a 4ºC. Los gránulos nucleares se reconstituyeron en el tampón de
lisis y luego se sonicaron.
RT-PCR en tiempo real: Se
realizó la RT-PCR utilizando iniciadores específicos
en un aparato ciclador de luz (Roche). Se utilizó la transcripción
de actina como control para normalizar la cantidad y calidad de los
ARN que se extrajeron por medio del método de Chomczynski. Véase
Chomczynski y col., Anal. Biochem., 162:156-59
(1987). Las secuencias de los cebadores utilizados fueron como
sigue:
\newpage
c-Fos: | Directa: | 5'-GCTGACAGATACACTCCAAG-3' |
Inversa: | 5'-CCTAGATGATGCCGGAAACA-3' | |
Actina: | Directa: | 5'-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3' |
Inversa: | 5'-ATTGTAGAAGGTGTGGTGCCA-5' |
Inmunohistoquímica de
P-c-jun:
P-c-jun, tal como se utiliza aquí,
se refiere a formas fosforiladas de c-jun. Se
enfocó P-c-jun con un anticuerpo
policlonal de conejo (500x en PBS) (Tecnología de Señalización
Celular). El complejo de anticuerpos resultante se visualizó con
3,3-diaminobenzidina como sustrato.
Isquemia transitoria en ratones adultos:
En ratones machos ICR-CD1 (con una edad de
aproximadamente 6 semanas y un peso en el rango de aproximadamente
18 a 37 g) (Harlan, Inc.) se provocó la isquemia mediante la
introducción de un filamento desde la arteria carótida en la
arteria carótida interna y haciendo avanzar el filamento en el
círculo arterial, ocluyendo así la arteria cerebral media. Véase,
por ejemplo, Huang y col., Science, 265:1883-85
(1994); Hara y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
94:2007-12 (1997). Se midió el flujo de sangre
cerebral regional por flujometría láser-Doppler con
una sonda fijada en el cráneo hasta la isquemia y hasta 10 minutos
después de la reperfusión. Se midió la temperatura rectal y se
mantuvo a 37ºC. Se sacrificaron los animales 48 horas después de la
reperfusión. Se cortaron series de secciones criostáticas de 20
\muM de espesor utilizando un sistema de microscopio por
ordenador provisto del programa Neurolucida (Microbrightfield, Inc.)
y se calcularon los volúmenes de la zona isquémica y de todo el
cerebro (a ciegas) con el programa Neuroexplorer. La presión
sanguínea sistólica y diastólica se midió con un catéter arterial en
tres ratones más desde 10 minutos antes de la inyección de
D-JNKI1 hasta 30 minutos después. Estas mediciones
de la presión sanguínea mostraron que las inyecciones no habían
afectado a la presión sanguínea (es decir, un cambio inferior al
10%). Se siguieron en todos los experimentos las directrices de la
Swiss Federal Veterinary Office.
Isquemia focal permanente en ratas jóvenes
(P14): Se obtuvo la oclusión de la arteria cerebral por
electrocoagulación de la arteria cerebral media en una posición
cercana a su origen en su unión con la rama olfatoria. Las ratas
(Wistar), que pesaban entre aproximadamente 27 y 35 g, fueron
sacrificadas 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral
media. Las ratas fueron sacrificadas mediante una sobredosis de
hidrato de cloral y fueron perfundidas a través del ventrículo
izquierdo con fijador de Zamboni. Los cerebros fueron postfijados
durante 2 horas en la misma solución utilizada para la perfusión y
luego los cerebros fueron infiltrados durante toda la noche en
sacarosa al 30% para la crioprotección. Se dibujaron (colorearon)
los contornos de cada zona isquémica con un sistema de microscopio
por ordenador. La zona de la lesión isquémica y de todo el cerebro
se dibujó a partir de series de secciones de crióstato de 50 \mum
teñidas con violeta de cresilo utilizando el programa Neurolucida y
se calcularon los volúmenes de cada una por medio del programa
Neuroexplorer, tal como se ha descrito anteriormente.
Estadísticas: Los datos procedentes de
ambos modelos de isquemia (es decir, transitoria y permanente) se
transformaron logaritmicamente para satisfacer el criterio
Gaussiano. Los datos se analizaron mediante ANOVA global (p <
0,0001 para ambos modelos) seguido de ensayos-t no
pareados de cola única.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos JNKI1 utilizados en estos
experimentos son destinados a bloquear el acceso de JNK a
c-Jun y a otros sustratos mediante un mecanismo
competitivo directo. Véase por ejemplo, Bonny y col., Diabetes,
50:77-82 (2001); Barr y col., J. Biol. Chem.,
277:10987-97 (2002).
El efecto inhibidor de L-JNKI1 y
D-JNKI1 sobre la activación y acción de JNK se
sometió a prueba utilizando ensayos de quinasa, tal como se ha
descrito anteriormente en el Ejemplo 18. Se muestran los resultados
de estos experimentos en las Fig. 16A-16C. El
efecto inhibidor de L-JNKI1 y
D-JNKI1 sobre la activación y acción de JNK se
muestra por su capacidad para impedir la fosforilación in
vitro de las dianas conocidas c-Jun y Elk1 de
JNK utilizando JNK1\alpha1 (Véase la Fig. 16A). Los términos
"P-Jun" y "P-Elk1" tal
como se utilizan aquí se refieren a las formas radioetiquetadas (es
decir, fosforiladas con ^{33}P-ATP) de los
sustratos GST-Jun y GST-Elk1,
respectivamente. La Fig. 16B demuestra el efecto inhibidor de la
secuencia inhibidora mínima de JNK de 20 aminoácidos de
JIP-IB1 (forma-L de JBD_{20}) (SEQ
ID NO:21)) en experimentos dosis-respuesta,
utilizando condiciones similares a las utilizadas para someter a
prueba el efecto de L-JNKI1 y
D-JNKI1 y mediante cantidades decrecientes de
L-JBD_{20}. La Fig. 16B ilustra que el péptido
L-JBD_{20} (SEQ ID NO:21) solo (es decir, sin la
secuencia TAT) puede inhibir la acción de JNK. Se demostró también
que JBD_{20} inhibía otras dianas de JNK, incluidas ATF2,
IRS-1, MADD, bc1-x1. En cada uno de
estos casos, la IC_{50} fue de aproximadamente 1 \muM (datos no
mostrados). La secuencia TAT en estos experimentos no estaba ligada
a JBD_{20} debido a que, a una concentración superior a 50
\muM, la secuencia TAT provoca una precipitación no específica de
las proteínas en los extractos. Por debajo de 50 \muM, TAT no
influye en las propiedades inhibidoras de los péptidos
JBD_{20}.
Se realizaron experimentos in vitro para
determinar la especificidad de los péptidos JNKI en el bloqueo de
la activación de JNK. En particular, se sometió a prueba el efecto
de estos péptidos sobre la actividad de 40 quinasas diferentes (10
\muM péptidos, 10 \muM ATP) hacia sus sustratos respectivos. La
lista completa de los sustratos utilizados en estos experimentos se
puede encontrar en
http://www.upstate.com/img/pdf/KinaseProfiler.pdf. Tal como se
esperaba, los péptidos JNKI tenían un efecto sobre las JNKs y las
quinasas MKK4 y MKK7, conteniendo todos dominios de unión a JNK.
Los péptidos (las formas tanto L-JNKI1 como
D-JNKI1) dejaron completamente de dificultar las
actividades de todas las otras quinasas. Experimentos adicionales
demostraron que 500 \muM de los péptidos JBD_{20} no
dificultaron la actividad de 6 quinasas particulares: ERK2, p38,
pKC, p34, caK y pKA (Fig. 16C). Los sustratos de estas quinasas son
ERK2:ERK1; p38:ATF2; p34, pKC, pKA:histona y caK:caseína. Este
nivel de especificidad está muy por encima de los niveles logrados
con otros pequeños inhibidores químicos de la
Jun-N-terminal quinasa, demostrando
así la selectividad extremadamente alta de los péptidos JNKI de la
invención. Para informarse sobre otros pequeños inhibidores químicos
de la Jun-N-terminal quinasa (JNK),
véase Bennett y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),
98:13681-86 (2001).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una serie de experimentos para
analizar los efectos de los péptidos JNKI de la invención sobre
distintas dianas de JNK dentro de las neuronas. La activación de JNK
en las neuronas corticales tratadas con
N-metil-D-aspartato
(NMDA) en cultivo se estimó mediante la realización de ensayos de
quinasa sobre la JNK captada utilizando
GST-c-Jun, por medio de los métodos
descritos anteriormente (Véase por ejemplo, Ko y col., J.
Neurochem. 71:1390-1395 (1998); Coffey y col., J.
Neurosci. 20:7602-7613 (2000)). Los resultados de
estos experimentos se muestran en las Fig.
17-18.
La Fig. 17A muestra la actividad de JNK en
neuronas no tratadas ("0"), después de una exposición de 10
minutos a 100 \muM de NMDA (10') o después de una exposición de
30 minutos a 100 \muM de NMDA. Las dos bandas a la derecha de la
Fig. 17C demuestran que la activación de JNK no cambió esencialmente
por D-JNKI1. El incremento de la actividad de JNK
apareció en su máximo (es decir, 2,2 veces más) después de 30
minutos del tratamiento con NMDA (Fig. 17A). Este aumento de la
actividad de JNK se trasladó a una fosforilación elevada de
c-Jun (Fig. 17B). La adición de los péptidos
penetrantes de células L-JNKI1 y
D-JNKI1 demostró impedir completamente el
incremento en P-c-Jun después de 5
horas de exposición a 100 \muM de NMDA, a pesar de un nivel normal
de activación de JNK. La adición de L-JNKI1 y
D-JNKI1 llevó el nivel de
P-c-Jun por debajo incluso del nivel
de P-c-Jun en el control.
La transcripción inducida por NMDA del gen
c-fos bajo la influencia de JNK a través del factor
de transcripción Elkl también fue totalmente impedida por la
adición de L-JNKI y D-JNKI1 (Fig.
17C). La expresión de c-fos fue cuantificada por
PCR en tiempo real (ciclador de luz) utilizando ARN extraído por los
métodos descritos anteriormente en el Ejemplo 18. Los datos en la
Fig. 17C se presentan como expresión de c-fos con
respecto a la actina (n=4). Para una descripción de la inducción de
la expresión de c-fos a través de la fosforilación
de TCF/Elk-1 mediada por JNK, véase Cavigeli y col.,
EMBOJ., 14:5957-5964 (1995).
La duración de la neurotoxicidad y la
neuroprotección de NMDA por L-JNKI1 y
D-JNKI1, así como los dos péptidos de control,
TAT-vacío (es decir, la secuencia TAT sola, sin la
secuencia JBD_{20}) y L-JNKI1_{mut} (que tiene
seis aminoácidos mutados en alanina, tal como se describe en Bonny y
col., Diabetes 50:77-82 (2001)). Las micrografías
de la Fig. 18 muestran neuronas teñidas con Hoechst 24 horas después
del tratamiento. La adición de los péptidos L-JNKI
y D-JNKI1 protegió completamente las neuronas contra
los efectos excitotóxicos de NMDA (Fig. 18) o cainato (datos no
mostrados), mientras que la adición de los péptidos control no tuvo
ningún efecto neuroprotector. 12 horas después del tratamiento,
ambos péptidos L-JNKI1 y D-JNKI1
demostraron inhibir la muerte neuronal, mientras que los péptidos
TAT-vacíos no tuvieron ningún efecto (Fig. 18).
Tal como se observa en la Fig. 18, la forma D de
los péptidos penetrantes en las células de la invención, es decir
D-JNKI1, era superior en las neuronas protectoras
durante períodos prolongados de tiempo, es decir 12 horas, 24 horas
y 48 horas después de la exposición a 100 \muM de NMDA. Estas
micrografías indican que 24 horas después del tratamiento,
D-JNKI1 seguía proporcionando una neuroprotección
total, ya que los cultivos control y los cultivos tratados con
D-JNKI1 y NMDA eran comparables. La forma L de JNKI1
ya no protegía más las neuronas 24 horas después del tratamiento,
supuestamente debido a que las formas L de los péptidos son
generalmente mas propensas a la degradación. Los péptidos
TAT-vacíos no afectaron a la muerte celular en
ninguna de las condiciones. El histograma de la Fig. 18 describe el
nivel de muerte neuronal 12, 24 y 48 horas después de la exposición
a 100 \muM de NMDA, tal como lo indica la actividad de LDH en el
caldo de cultivo de la placa Petri. Los valores de absorbancia, que
representan la concentración de LDH, han sido convertidos en
valores porcentuales de muerte neuronal dividiendo los valores de
absorbancia por la absorbancia media para un LDH total. La
absorbancia media para un LDH total se obtuvo a partir del caldo de
cultivo más neuronas lisadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para someter a prueba la factibilidad de
utilización de los péptidos con permeabilidad celular en
aplicaciones in vivo, se evaluó su capacidad para penetrar
en el cerebro utilizando L-JNKI1 y
D-JNKI1 etiquetados con FITC. Para más información
sobre el suministro in vivo de una proteína biológicamente
activa en un ratón, véase Schwarze y col., Science,
285:1569-72 (1999). Estos experimentos mostraron que
ambos L-JNKI1 y D-JNKI1 etiquetados
con FITC eran capaces de atravesar la barrera
sangre-cerebro y penetrar en las neuronas de ratones
y ratas adultas de varias edades. Ambos L-JNKI1 y
D-JNKI1 etiquetados con FITC eran capaces de
penetrar en las neuronas tras 1 hora de su inyección
intraperitoneal (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En un modelo de isquemia suave en ratones, la
arteria cerebral media izquierda fue ocluida durante 30 minutos,
seguido de 48 horas de reperfusión. El grupo control tratado con un
vehículo recibió solamente una inyección de una solución de tampón
fosfato (PBS). En el grupo control tratado con el vehículo, esta
oclusión resultó sistemáticamente en una infartación mayor que
contenía células severamente picnóticas, que se encontraban
predominantemente en la corteza y el estrato en todos los cerebros,
y en 7 de los cerebros, estas células se encontraban también en el
hipocampo. El volumen medio infartado era de 67,4 mm^{3} (n=12) en
aquellos sujetos del grupo control tratado con
vehículo.
vehículo.
Para evaluar la eficacia y la "ventana
terapéutica" del tratamiento (es decir, el período de tiempo
después de la lesión durante el cual el tratamiento con los
péptidos de la invención sigue siendo eficaz), se trataron los
sujetos con una inyección intracerebroventricular (icv) de
D-JNKI1 (15,7 ng en 2 \mul de PBS). La Fig. 19A
muestra secciones teñidas con violeta de cresilo que representan
ejemplos típicos del infarto resultante (barra, 1 mm). La Fig 19B
describe los volúmenes infartados después de la inyección icv de
D-JNKI1 en distintos momentos antes (-1 hora) o
después (+3,6 ó 12 horas) de la oclusión de la arteria cerebral
media. En la Fig. 19B, un asterisco (*) indica que el resultado es
estadísticamente distinto del control (tal como lo indica la
prueba-t).
El pretratamiento 1 hora antes de la oclusión de
la arteria cerebral media con una inyección icv de
D-JNKI1 redujo el volumen de infarto medido 48
horas después de la reperfusión en un 88%, hasta un volumen de 7,8
mm^{3} (Fig. 19A-19B). La administración del
péptido D-JNKI1 3 ó 6 horas después de la oclusión
de la arteria cerebral media seguía siendo muy protectiva, ya que
el volumen medio infartado en los sujetos inyectados 3 horas
después de la oclusión se redujo a 5,8 mm^{3} (una reducción del
91% en comparación con animales no tratados), y el volumen medio
infartado en sujetos inyectados 6 horas después de la oclusión se
redujo a 4,8 mm^{3} (una reducción del 93% en comparación con
animales no tratados). Por contraste, la inyección del péptido
D-JNKI1 12 horas después de la oclusión de la
arteria cerebral media no fue notablemente protectiva. La
consecución de una isquemia completa seguida de una reperfusión se
confirmó en todos los animales mediante la comprobación del flujo
sanguíneo cerebral regional en la zona de la arteria cerebral media
izquierda.
Se evaluaron también las capacidades protectivas
de D-JNKI1 contra la isquemia focal permanente en
ratas jóvenes (P14). Se preparó una zona isquémica en la corteza
cerebral de ratas P14 mediante una oclusión permanente de la
arteria cerebral media, induciendo así una zona de degeneración
masiva limitada a la corteza parietotemporal. Como los volúmenes
del cerebro en las ratas P14 eran variables, las lesiones se
expresaron como porcentaje del volumen del hemisferio cerebral. Se
inyectó de forma intraperitoneal D-JNKI1 a una
concentración de 11 mg/kg, lo que corresponde aproximadamente a 340
\mug. Se administró D-JNKI1 30 minutos antes de la
oclusión de la arteria cerebral media, o 6 ó 12 horas después de la
oclusión. Las ratas se fijaron 24 horas después de la oclusión. En
cada uno de estos momentos (es decir, administración a los 30
minutos, +6 horas o +12 horas), la D-JNKI1 causó
reducciones mayores y estadísticamente significativas en el volumen
infartado en comparación con los animales control (Fig.
20A-20B). La administración de
D-JNKI1 30 minutos antes de la oclusión llevó a una
reducción del volumen infartado del 68%, mientras que la
administración del péptido 6 y 12 horas después de la oclusión
condujo a reducciones en el volumen infartado del 78% y 49%,
respectivamente.
Se realizó un análisis de inmunohistoquímica
para determinar la activación del factor de transcripción de
c-Jun, una diana principal de JNK, en cerebros de
crías de ratas con isquemia permanente. La fosforilación de
c-Jun fue evidente en muchas neuronas en la corteza
peri-infartada (Fig. 5C, barra = 200 \muM). Por
contraste, en los cerebros tratados con el péptido
D-JNKI1, la corteza peri-infartada
fue negativa y se detectaron solamente unas pocas neuronas
positivas en el límite de la región infartada.
\vskip1.000000\baselineskip
Típicamente, la alta toxicidad de otros
compuestos neuroprotectores ha limitado mucho su uso clínico (Véase
Gladstone y col., Stroke, 33:2123-36 (2002)). La
capacidad de los ratones para mantenerse en giro horizontal Rotarod
se utilizó como criterio para los posibles efectos secundarios de
distintas dosis de D-JNKI1 y de una dosis
terapéutica de MK-801 (1 mg/kg, dosis terapéutica
estándar). En particular, la función motora de los ratones se
evaluó utilizando la prueba Rotarod 3 horas, 24 horas, 6 días y 12
días después de ambas inyecciones i.p. (11 y 110 mg/kg) e icv de
D-JNKI1 (2 \mul que contenían 15,7 ng ó 157 ng de
D-JNKI1). La inyección i.p. de
MK-801 (1 mg/kg) se utilizó como compuesto control
durante este procedimiento de evaluación.
Los ratones fueron adiestrados el día anterior y
por la mañana del día experimental, con el fin de reducir la
variabilidad entre los sujetos. Las sesiones tanto de adiestramiento
como de prueba fueron idénticas para los ratones control e
inyectados. La función motora de cada ratón se examinó
inmediatamente antes de la inyección y 1, 6 y 12 días después de la
inyección. Se colocaron los ratones en el Rotarol que estaba
programado para una aceleración uniforme de 4 a 40 rpm. Se registró
el estado latente de caída de cada ratón sometido a prueba. Los
resultados de esta evaluación por métodos con Rotarod se presentan
en la Tabla 2 como latencia mediana a la caída (medida en
segundos).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se puede observar en la Tabla 2, se
descubrió que la coordinación motora estaba intacta con ambas dosis
de D-JNKI1 por i.p. e icv (es decir, tanto la dosis
de 2,8 \mul/kg, que proporcionó una neuroprotección del 90%, como
la dosis 10 veces más alta). Por contraste, MK-801
condujo a un deterioro dramático de la coordinación motora, ya que
los ratones eran incapaces de mantenerse en la rueda (Véase por
ejemplo, Tabla 2; Dawson y col., Brain Res. 892:344:350 (2001) (que
describen resultados similares para otros neuroprotectores), y una
dosis 10 veces más alta de MK-801 mató a todos los
ratones. Se descubrió que los efectos secundarios de una dosis más
baja de MK-801 habían desaparecido esencialmente
después de 24 horas. A los 6 y 15 días después del tratamiento con
D-JNKI1, no se encontró ninguna señal de deterioro
motor y los resultados reproducibles en el Rotarod fueron mejores
que en los ratones control.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Xiagen, S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Inhibidores peptídicos con
permeabilidad celular de la ruta de transducción de señales de la
JNK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> UO01P005WOEPT1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 06019172
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
13-09-2006
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 10/165.250
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
07-06-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenIn Versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
L-IB1 inhibidor de la JNK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
L-IB2 inhibidor de la JNK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
D-IB1 inhibidor de la JNK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
D-IB2 inhibidor de la JNK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
L-IB (genérico) inhibidor de la JNK
(XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
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\hskip1cm/sustituir="Val"
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\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
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\hskip1cm/sustituir="His"
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\hskip1cm/sustituir="Lys"
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\hskip1cm/sustituir="Phe"
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\hskip1cm/sustituir="Trp"
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\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
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\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Thr"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
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\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
D-IB (genérico) inhibidor de la JNK
(XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Thr"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
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\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
que contiene la secuencia de TAT, L-TAT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
retro-inverso que contiene la secuencia de TAT,
D-TAT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
que contiene la secuencia genérica de TAT,
L-genérica-TAT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
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\hskip1cm/sustituir="Xaa"
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
que contiene la secuencia genérica de TAT,
D-genérica-TAT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
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\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
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\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Proteína de fusión inhibidora de JNK,
L-TAT-IB1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Proteína de fusión inhibidora de JNK,
L-TAT-IB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Proteína de fusión inhibidora de JNK,
L-TAT-IB (genérica)
(XXXXXXXRKK
RRQRRRXXXXXXXXRPTTLXLXXXXXXX-QDS/TX)
RRQRRRXXXXXXXXRPTTLXLXXXXXXX-QDS/TX)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (41)..(41)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Thr"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Proteína de fusión inhibidora de JNK,
D-TAT-IB1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Proteína de fusión inhibidora de JNK,
D-TAT-IB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Proteína de fusión inhibidora de JNK,
D-TAT-IB (genérica)
(XT/SDQXXXXX
XXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX)
XXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Ser"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (36)..(92)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: JBD de
IB1, IB1-largo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: JBD de
IB2, IB2-largo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: JBD de
c-Jun, c-Jun
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: JBD de
ATF2, ATF2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
inhibidor de JNK, L-JBD20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
inhibidor de JNK, D-JBD20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Proteína de fusión inhibidora de JNK,
L-TAT-JNKI1 (es decir,
L-TAT-JBD20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Proteína de fusión inhibidora de JNK,
D-TAT-JNKI1 (es decir,
D-TAT-JBD20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Proteína de fusión inhibidora de JNK,
L-TAT-JNKI1 (genérica)
(XXXXRKK
RRQRRRXXXXRPTTLXLXXXXXXXQDS/T)
RRQRRRXXXXRPTTLXLXXXXXXXQDS/T)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Thr"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Proteína de fusión inhibidora de JNK,
D-TAT-JNKI1 (genérica)
(S/TDQXXXXX
XXLXLTTPRXXXXRRRQRRKKRXXXX)
XXLXLTTPRXXXXRRRQRRKKRXXXX)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Thr"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /sustituir="Arg"
\hskip1cm/sustituir="Asx"
\hskip1cm/sustituir="Cys"
\hskip1cm/sustituir="Glx"
\hskip1cm/sustituir="Gly"
\hskip1cm/sustituir="His"
\hskip1cm/sustituir="Ile"
\hskip1cm/sustituir="Leu"
\hskip1cm/sustituir="Lys"
\hskip1cm/sustituir="Met"
\hskip1cm/sustituir="Phe"
\hskip1cm/sustituir="Pro"
\hskip1cm/sustituir="Ser"
\hskip1cm/sustituir="Thr"
\hskip1cm/sustituir="Trp"
\hskip1cm/sustituir="Tyr"
\hskip1cm/sustituir="Val"
\hskip1cm/sustituir="Xaa"
\hskip1cm/sustituir=""
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
inhibidor de JNK, L-JBD20-mut
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Péptido
inhibidor de JNK, D-JBD20-mut
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: Sonda
de doble marcado de AP-1 (véase página 45 de la
descripción)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcttgatga gtcagccgga a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Iniciador "directo" c-Fos por
RT-PCR (véase página 48 de la descripción)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgacagat acactccaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia:
Icebador "inverso" c-Fos por
RT-PCR (véase página 48 de la descripción)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctagatgat gccggaaaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: cebador
"directo" actina por RT-PCR (véase página 48 de
la descripción)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacggctccg gcatgtgcaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: cebador
"inverso" actina por RT-PCR (véase página 48 de
la descripción)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgtagaag gtgtggtgcc a
\hfill21
Claims (11)
1. Utilización de cualquiera de los péptidos que
incluyen cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas
de entre las SEQ ID NOs: 3-6 y 22, o seleccionándose
cualquiera de las secuencias de aminoácidos de entre las SEQ ID
NOs: 11-16 y 23-26, o de péptidos
que son homólogos en al menos un 95% a estos péptidos, en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de
la pérdida de audición en un sujeto, caracterizada porque el
péptido impide que se dañen los estereocilios de las células
pilosas, la apoptosis de las células pilosas o la apoptosis
neuronal.
2. Utilización de un ácido nucleico que codifica
cualquiera de los péptidos que tienen L-aminoácidos
y que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, o
seleccionándose cualquiera de las secuencias de aminoácidos de
entre las SEQ ID NOs: 11-13, 23 y 25, o que codifica
péptidos que son homólogos en al menos un 95% a estos péptidos, en
la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención
de la pérdida de audición en un sujeto, caracterizada porque
el péptido impide que se dañen los estereocilios de las células
pilosas, la apoptosis de las células pilosas o la apoptosis
neuronal.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque el péptido o el ácido nucleico utilizado
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la
prevención de la pérdida de audición debe administrarse antes de la
exposición del sujeto a un trauma acústico.
4. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque el péptido o el ácido nucleico utilizado
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la
prevención de la pérdida de audición se administra después de la
exposición del sujeto a un trauma acústico.
5. Utilización según la reivindicación 3 ó 4,
caracterizada porque el trauma acústico es un ruido de al
menos 90 dB SPL.
6. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque el péptido o el ácido nucleico utilizado
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la
prevención de la pérdida de audición se administra antes de la
exposición del sujeto a un antibiótico.
7. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque el péptido o el ácido nucleico utilizado
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la
prevención de la pérdida de audición se administra después de la
exposición del sujeto a un antibiótico.
8. Utilización según la reivindicación 6 ó 7,
caracterizada porque el antibiótico es un aminoglicósido.
9. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque el péptido o el ácido nucleico utilizado
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la
prevención de la pérdida de audición se administra antes de la
exposición del sujeto a un agente quimioterapéutico.
10. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque el péptido o el ácido nucleico utilizado
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la
prevención de la pérdida de audición se administra después de la
exposición del sujeto a un agente quimioterapéutico.
11. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 10, caracterizada porque el péptido o el
ácido nucleico se administra por cualquier vía de administración
seleccionada de entre el grupo consistente en la administración
intraauricular, intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral y
parche.
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