CN110714016B - Jnk基因及其作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物和治疗靶点的应用 - Google Patents

Jnk基因及其作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物和治疗靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了JNK基因及其作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物和治疗靶点的应用。本发明首次从草鱼肠道中克隆得到完整的JNK基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现，JNK基因在患细菌性肠炎的草鱼肠道中表达水平显著上调，且干预JNK活性后能够使鱼肠道炎症因子表达水平恢复至正常水平，因此，JNK基因可作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物和治疗靶点，实现对鱼类细菌性肠炎的诊断和治疗。

Description

JNK基因及其作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物和治疗靶 点的应用
技术领域
本发明具体涉及JNK基因及其作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物和治疗靶点的应用。
背景技术
当前，我国水产养殖业正从粗放式养殖加快过渡到集约化和规模化养殖，但在蓬勃发展的同时，高密度养殖和过量残饵沉积等多重原因作用下使得水体环境不断恶化，造成各种水生动物疾病频发，严重危害水产养殖产业的健康可持续发展。鱼类肠道不仅是重要的消化和吸收器官，同时还是鱼类最大的免疫器官，鱼类肠道健康对于鱼体的整体健康起到非常重要的作用。细菌性肠炎是草鱼规模化养殖过程中频繁发生并具有严重危害的传染性疾病，与烂鳃病、赤皮病和病毒性出血病并称为草鱼“四大病”。患细菌性肠炎的草鱼通常会伴有肠道充血、发红、出血等症状，此外病鱼行动缓慢，失去食欲，腹部肿胀，严重危害草鱼的健康甚至导致鱼体大量死亡，造成巨大经济损失。
然而，在低等脊椎动物鱼类中，细菌性肠炎的发病机制尚不清楚，所以目前有关肠炎的诊断方法大多通过鱼体外部形态以及肠道切片的观察，这种诊断方法虽然简单有效，但往往在肠炎发生后期才能诊断出结果，时效性差，应用范围也有限。并且，长期以来，养殖户大多采用抗生素或化学药物预防和治疗鱼类细菌性肠炎，但效果不尽人意；而长期、过量使用化学药物、抗生素又使得鱼类自身肠黏膜免疫系统遭到破坏，抗病能力进一步下降，并且不可避免地造成环境污染。相比高等哺乳动物细菌性肠炎疾病的研究，目前在低等脊椎动物鱼类中，有关细菌性肠炎的发病机理及其治疗靶点的研究显得尤为缺乏。因此，开展鱼类细菌性肠炎的发病机理，开发诊断和治疗鱼类细菌性肠炎的基因靶点具有重要的科学意义和应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种JNK基因及其作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物和治疗靶点的应用。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase,JNK)是进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导的信号通路可被细胞因子、病原体、外界压力等多种因素激活，在炎症反应、细胞凋亡、应激反应等多种细胞调控方面起着至关重要的作用。但截至目前，尚未有实验结果表明JNK与鱼类细菌性肠炎相关，更未有相关的实验结果证实JNK可以作为鱼类细菌性肠炎诊断和治疗的靶点。本发明首次分离得到JNK基因完整的cDNA序列，且发现了JNK基因与鱼类细菌性肠炎存在相关性，JNK特异性抑制剂能够抑制草鱼肠道炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平，为鱼类细菌性肠炎提供了新的诊断分子标记物和治疗靶点。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
提供一种JNK基因，所述JNK基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种JNK基因作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物的应用。
上述的应用中，进一步的，所述鱼类为草鱼。
上述的应用中，进一步的，所述应用包括：检测鱼类肠道组织中JNK基因的表达水平，以JNK基因的表达水平为评价指标对鱼类细菌性肠炎进行评价。
上述的应用中，进一步的，采用检测试剂盒对鱼类肠道组织中JNK基因的表达水平进行检测；所述检测试剂盒包含根据JNK基因的cDNA序列设计的特异性引物；所述特异性引物为CiJNK-F2和CiJNK-R2；所述CiJNK-F2的序列如SEQ ID NO.4所示；所述CiJNK-R2的序列如SEQ ID NO.5所示。
作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种JNK基因作为鱼类细菌性肠炎治疗靶点的应用。
上述的应用中，进一步的，所述鱼类为草鱼。
上述的应用中，进一步的，所述应用包括：以JNK基因为治疗靶点，制备用于治疗鱼类细菌性肠炎的药物；所述药物中含有用于干扰JNK基因表达或抑制JNK活性的物质。
上述的应用中，进一步的，所述用于抑制JNK活性的物质为JNK特异性抑制剂；所述JNK特异性抑制剂为SP600125。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明从草鱼肠道中首次克隆了JNK基因完整的cDNA序列，为后续设计定量引物开发检测JNK表达水平的检测试剂盒提供支撑，同时也将为进一步在基于此序列开展RNAi、基因敲除实验奠定基础。
(2)本发明发现，草鱼肠道JNK在注射细菌MDP 6小时后表达水平即显著上调，揭示了JNK基因与草鱼细菌性肠炎具有很好的相关性，因此，JNK基因可作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物，并以其表达水平对鱼类细菌性肠炎进行有效的诊断，能够大大提高鱼类细菌性肠炎的诊断的敏感性和特异性。
(3)本发明JNK基因作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物的应用中，采用检测试剂盒检测鱼类肠道组织中JNK基因的表达水平，以JNK基因的表达水平为评价指标对鱼类细菌性肠炎进行评价。该检测试剂盒中包含根据JNK基因的cDNA序列设计的特异性引物，以此检测试剂盒进行荧光定量PCR技术检测，能够准确、快速检测JNK基因的表达水平，实现对鱼类细菌性肠炎进行检测，方法简单、可靠，时效性较好，能够弥补传统鱼类肠炎诊断方法的不足。
(4)本发明发现，以JNK基因为靶点，在注射特异性抑制剂后24小时后，鱼肠道炎症因子表达水平就能够恢复到未受细菌MDP感染时的水平，揭示了以JNK基因作为鱼类细菌性肠炎治疗靶点具有良好的效果。
(5)本发明以JNK基因作为鱼类细菌性肠炎治疗靶点的应用中，以JNK基因为治疗靶点，制备用于治疗鱼类细菌性肠炎的药物，该药物中含有用于干扰JNK基因表达或抑制JNK活性的物质，该药物通过干扰JNK基因的表达或抑制JNK的活性对鱼类细菌性肠炎进行治疗。本发明中采用JNK基因特异性抑制剂作为治疗药物，能够显著抑制鱼肠道炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平，对草鱼肠炎具有很好的治疗效果。相较于现有的抗生素或其他化学药物，本发明的鱼类细菌性肠炎治疗药物具有更好的特异性，可大大减少用量，降低因过量使用抗病药物导致的鱼类自身肠黏膜免疫系统破坏、抗病能力下降的风险，并且能够减少对水体环境造成的污染。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例2中JNK基因在细菌MDP刺激下的表达水平。
图2为本发明实施例3中在干预JNK活性后肠道炎症因子的表达水平。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售。
实施例1
JNK基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
JNK基因的克隆方法，具体如下：
(1)草鱼肠道总RNA提取：
取健康的鲜活草鱼(平均体重30g左右)，用消毒的镊子和剪刀解剖草鱼，分离草鱼肠道组织样品。肠道样品总RNA使用RNAiso(Takara)试剂提取，具体步骤如下：取100mg草鱼肠道组织于液氮预冷的研钵中，将组织磨成粉末之后，转移到装有1mL RNAiso的离心管中，吹打、混匀；加入200μL氯仿，剧烈震荡40s，室温放置5min；4℃，12,000×g离心15min，吸取上清0.5mL转移至新管；加入0.5mL的异丙醇，混匀；4℃，12,000×g离心10min，弃上清；用1mL 75％乙醇清洗RNA沉淀；弃上清，加入30μL DEPC水溶解RNA；用1.2％琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白定量仪分别检测RNA的完整性和浓度。
(2)草鱼肠道cDNA文库构建：
草鱼肠道cDNA文库构建使用PrimeScriptTM1st Strand cDNASynthesis Kit(Takara)，具体步骤如下：在Microtube管中制备cDNA反转录反应液，包括1μL Oligo dTPrimer(50μM)，1μg草鱼肠道总RNA，1μL dNTP Mixture(10mM each)，加RNase Free H2O将总体积补至10μL；65℃保温5min后，冰上迅速。在上述Microtube管中配制下列反转录反应液：10μL上述变性后反应液，4μL 5×PrimeScript Buffer，0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)，4.5μL RNase Free H2O和1μL PrimeScript RTase(200U/μL)；反应体系轻弹混匀，稍离心；42℃，60min；95℃，5min使反转录酶失活；冰上冷却，-20℃保存。
(3)草鱼JNK基因cDNA序列克隆：
根据草鱼肠道转录组数据库中筛选到的序列信息，设计一对包含草鱼JNK基因的开放阅读框的特异性引物CiJNK-F1和CiJNK-R1，如下所示：
CiJNK-F1：5'-TCCTTTTATGAATCTGCTCTT-3'(SEQ ID NO.2)；
CiJNK-R1：5'-AAAAACTCTTACCTCCATTCT-3'(SEQ ID NO.3)。
以构建好的cDNA文库为模板，以CiJNK-F1和CiJNK-R1为引物进行PCR反应。
PCR反应体系为：37.75μL ddH2O,0.25μL Ex Taq DNAPolymerase(5U/μL,TaKaRa),5μL 10×Ex PCR Buffer(Mg2+Plus),4μL dNTP mixture(2.5mM each),1μL正反引物(10μM),和1μL cDNA模板。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s、55℃30s、72℃90s(35个循环)；72℃10min；4℃保存。
PCR反应结束后用1.5％琼脂糖凝胶检测产物，产物经纯化后与pMD-19T(TaKaRa)载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，菌落PCR检测后选取阳性克隆送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。测序结果表明，PCR扩增出草鱼JNK基因的cDNA序列全长1545bp，编码384个氨基酸(序列如SEQ ID NO.1所示)。
实施例2
采用细菌MDP(胞壁酰二肽)诱导草鱼产生肠炎，考察JNK基因的表达水平。具体方法如下：
(1)样品收集：
取健康的鲜活草鱼(平均体重30g左右)，平均分为2组。实验组草鱼采用腹腔注射100μL MDP溶液(10μg/mL,Invitrogen)，对照组每条鱼注射等体积的PBS缓冲液。注射后的草鱼立即放回养殖桶，同时每组随机取样3条作为0h的样品。在注射后3、6、12、24、48和72小时随机取每组的3条草鱼，用消毒的镊子和剪刀解剖鱼体并取出肠道组织，样品置于液氮中保存用于总RNA的提取。
(2)总RNA提取：提取方法同实施例1。
(3)cDNA文库构建：
草鱼肠道cDNA文库构建使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa)，具体步骤如下：1、去除基因组DNA反应：在Microtube管中配制反应液，包括2.0μL5×gDNA Eraser Buffer，1.0μL gDNAEraser，1μg草鱼肠道总RNA，加RNase Free H2O将总体积补至10μL；42℃，2min，4℃结束。2、反转录反应：在上述Microtube管中配制反转录反应液，包括步骤1中10μL反应液，4μL 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)，1.0μLPrimeScript RT Enzyme Mix 1，4.0μL RNase Free H2O和1μL RT Primer Mix；反应体系轻弹混匀，稍离心；37℃，15min；85℃，5s使反转录酶失活；冰上冷却，-20℃保存。
(4)JNK基因转录水平的检测：根据克隆获得的草鱼JNK基因cDNA序列信息设计的一对检测JNK基因表达水平的特异性引物CiJNK-F2和CiJNK-R2，CiJNK-F2和CiJNK-R2如下所示：
CiJNK-F2：5'-TCCTTTTATGAATCTGCTCTT-3'(SEQ ID NO.4)；
CiJNK-R2：5'-TTTCTCACGCTTATTCCTG-3'(SEQ ID NO.5)。
以步骤(3)中构建的cDNA为模板，以CiJNK-F2和CiJNK-R2为引物进行荧光定量PCR反应，并以草鱼看家基因β-actin的转录水平作为内参对照。
PCR反应体系为：5.68μL ddH2O,8.0μL TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseHPlus)(2×,TaKaRa),0.32μL ROX Reference Dye II(50×),4μL dNTP mixture(2.5mMeach),0.5μL正反引物(10μM),和1μL cDNA模板。
PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃10s、55℃10s、72℃10s(45个循环)。
荧光定量PCR反应结束后，根据收集到的目的基因与内参基因的CT值，运用2-ΔΔCT方法计算相对表达量，结果如图1所示。
图1为本发明实施例2中JNK基因在细菌MDP刺激下的表达水平。由图1可知，本发明利用实时荧光定量PCR技术检测发现，草鱼肠道JNK基因在注射细菌MDP 6小时后表达水平即显著上调，揭示了JNK基因与草鱼细菌性肠炎具有很好的相关性，JNK基因可作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物，利用JNK基因的表达水平的检测方法可对草鱼细菌性肠炎进行有效的诊断。
实施例3
采用JNK特异性抑制剂对JNK活性进行干预，考察草鱼肠道炎症因子的表达水平。
本实施例中采用的JNK特异性抑制剂为SP600125，考察的草鱼肠道炎症因子为IL-6、IL-8和TNF-α。
具体方法如下：
(1)样品收集：取健康的鲜活草鱼(平均体重30g左右)，平均分为3组。实验组1草鱼采用腹腔注射100μL MDP溶液(10μg/mL,Invitrogen)，实验组2草鱼注射等体积的MDP溶液(10μg/mL,Invitrogen)和JNK特异性抑制剂SP600125(100μM,Sigma)，对照组每条鱼注射等体积的PBS缓冲液。注射后的草鱼立即放回养殖桶，在注射后24小时随机取每组的3条草鱼，用消毒的镊子和剪刀解剖鱼体并取出肠道组织，样品置于液氮中保存用于总RNA的提取。
(2)总RNA提取：提取方法同实施例1。
(3)cDNA文库构建：构建方法同实施例2。
(4)肠道炎症因子表达水平检测：根据NCBI中已公布的IL-6、IL-8和TNF-α基因的cDNA序列信息，分别设计检测IL-6、IL-8和TNF-α基因表达水平的荧光定量PCR特异性引物：
检测IL-6的引物：
CiIL-6-F：5'-CAGCAGAATGGGGGAGTTATC-3'(SEQ ID NO.6)；
CiIL-6-R：5'-CTCGCAGAGTCTTGACATCCTT-3'(SEQ ID NO.7)；
检测IL-8的引物：
CiIL-8-F：5'-ATGAGTCTTAGAGGTCTGGGT-3'(SEQ ID NO.8)；
CiIL-8-R：5'-ACAGTGAGGGCTAGGAGGG-3'(SEQ ID NO.9)；
检测TNF-α的引物：
CiTNF-α-F：5'-CGCTGCTGTCTGCTTCAC-3'(SEQ ID NO.10)；
CiTNF-α-R：5'-CCTGGTCCTGGTTCACTC-3'(SEQ ID NO.11)。
以构建好的cDNA文库为模板，分别以上述其中一组引物进行荧光定量PCR反应，以草鱼看家基因β-actin的转录水平作为内参对照。PCR反应体系和反应程序参照实施例2步骤(4)中的荧光定量PCR反应。荧光定量PCR反应结束后，根据收集到的目的基因与内参基因的C T值，运用2-ΔΔCT方法计算相对表达量，结果如图2所示。
图2为本发明实施例3中在干预JNK活性后肠道炎症因子的表达水平。由图2的结果可知，本发明利用JNK特异性抑制剂SP600125干预JNK活性后，由细菌MDP诱导的草鱼肠道炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α表达水平在24小时候显著下降，且恢复到未感染细菌MDP前的正常水平，证明了JNK基因可以作为草鱼细菌性肠炎的治疗靶点，以JNK基因为治疗靶点，采用JNK特异性抑制剂能够对草鱼细菌性肠炎进行治疗，JNK特异性抑制剂SP600125可应用于制备用于治疗草鱼细菌性肠炎的药物。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 长沙学院
<120> JNK基因及其作为鱼类细菌性肠炎诊断分子标记物和治疗靶点的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1545
<212> DNA
<213> 草鱼(Ctenopharyngodon idella)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1545)
<223> 草鱼JNK基因cDNA
<400> 1
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 根据实验要求而设计，作为检测JNK基因表达水平的反向引物CiJNK-R2
<400> 5
tttctcacgc ttattcctg 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 根据实验要求而设计，作为检测IL-6基因表达水平的正向引物CiIL-6-F
<400> 6
cagcagaatg ggggagttat c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 根据实验要求而设计，作为检测IL-6基因表达水平的反向引物CiIL-6-R
<400> 7
ctcgcagagt cttgacatcc tt 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 根据实验要求而设计，作为检测IL-8基因表达水平的正向引物CiIL-8-F
<400> 8
atgagtctta gaggtctggg t 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 根据实验要求而设计，作为检测IL-8基因表达水平的反向引物CiIL-8-R
<400> 9
acagtgaggg ctaggaggg 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 根据实验要求而设计，作为检测TNF-α基因表达水平的正向引物CiTNF-α-F
<400> 10
cgctgctgtc tgcttcac 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 根据实验要求而设计，作为检测TNF-α基因表达水平的反向引物CiTNF-α-R
<400> 11
cctggtcctg gttcactc 18

Claims (2)

1.检测JNK基因表达水平的特异性引物在制备草鱼细菌性肠炎检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述特异性引物为CiJNK-F2和CiJNK-R2；所述CiJNK-F2的序列如SEQ ID NO.4所示；所述CiJNK-R2的序列如SEQ ID NO.5所示；所述JNK基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.JNK特异性抑制剂在制备用于治疗草鱼细菌性肠炎的药物中的应用，其特征在于，所述JNK特异性抑制剂为SP600125；所述JNK基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101757605A (zh) * 2008-10-30 2010-06-30 天津生机集团股份有限公司 一种防治鱼类细菌性肠炎的药物
CN102112148A (zh) * 2008-05-30 2011-06-29 希根有限责任公司 Jnk信号转导通路的细胞可渗透性肽抑制剂用于治疗慢性或非慢性炎性消化病的应用
WO2018048942A1 (en) * 2016-09-07 2018-03-15 Pharmakea, Inc. Uses of a lysyl oxidase-like 2 inhibitor

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102112148A (zh) * 2008-05-30 2011-06-29 希根有限责任公司 Jnk信号转导通路的细胞可渗透性肽抑制剂用于治疗慢性或非慢性炎性消化病的应用
CN101757605A (zh) * 2008-10-30 2010-06-30 天津生机集团股份有限公司 一种防治鱼类细菌性肠炎的药物
WO2018048942A1 (en) * 2016-09-07 2018-03-15 Pharmakea, Inc. Uses of a lysyl oxidase-like 2 inhibitor

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MH491998.1，Ctenopharyngodon idella mitogen-activated protein kinase 8 (MAPK8) mRNA, complete cds;Qu,F;《GenBank》;20181031;"ORIGIN"部分 *
Mitogen-activated protein kinase 8;Q9DGD9;《UniProt》;20030430;全文 *
Qu,F.MH491998.1，Ctenopharyngodon idella mitogen-activated protein kinase 8 (MAPK8) mRNA, complete cds.《GenBank》.2018, *
Two novel MKKs (MKK4 and MKK7) from Ctenopharyngodon idella are involved in the intestinal immune response to bacterial muramyl dipeptide challenge;Fufa Qu;《Developmental and Comparative Immunology》;20190108;第93卷;第103-114页 *
丝裂原活化蛋白激酶在炎症性肠炎中的功能及信号转导;潘娜;《中国兽医杂志》;20161231;第52卷(第11期);第82页左栏第2段、第82页右栏第1段 *
浅谈草鱼细菌性肠炎的治疗与预防;谭正江;《科学养鱼》;20160131;第62-63页 *

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