KR20220154111A - 표적 전달 적용들을 위한 섬유아세포 활성화 단백질 리간드들 - Google Patents
표적 전달 적용들을 위한 섬유아세포 활성화 단백질 리간드들 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220154111A KR20220154111A KR1020227031463A KR20227031463A KR20220154111A KR 20220154111 A KR20220154111 A KR 20220154111A KR 1020227031463 A KR1020227031463 A KR 1020227031463A KR 20227031463 A KR20227031463 A KR 20227031463A KR 20220154111 A KR20220154111 A KR 20220154111A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- moiety
- cancer
- compound
- conjugate
- group
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
- C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/545—Heterocyclic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/0497—Organic compounds conjugates with a carrier being an organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
Abstract
본 발명은 질병의 부위에서 다양한 페이로드들(예를 들어, 세포독성 약물들, 방사성 핵종들, 형광단들, 단백질들 및 면역 조절제들)의 능동 전달을 위한 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)의 리간드들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암, 염증 또는 FAP의 과발현으로 특징지어지는 다른 질병과 같은 질병 또는 장애와 관련된 치료 또는 수술을 위한 약물 표적화 적용들을 위한 FAP 리간드들의 개발에 관한 것이다.
Description
본 발명은 질병의 부위에 다양한 페이로드(payload)들(예를 들어 세포독성 약물들, 방사성 핵종(radionuclide)들, 형광단(fluorophore)들, 단백질들 및 면역 조절제(immunomodulator)들)의 능동 전달을 위한 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)의 리간드들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암, 염증 또는 FAP의 과발현으로 특징지어지는 다른 질병과 같은 질병 또는 장애와 관련된 진단 방법들 및/또는 치유 또는 수술을 위한 방법들의 개발에 관한 것이다.
화학 요법은 여전히 암 환자들 및 다른 질병들의 치료를 위해 널리 적용되고 있다. 종래의 항암 화학 요법제들은 세포 생존의 기본적인 기전들에 근거하여 작용하며, 건강한 세포들과 악성 세포들을 구별하지 못할 수 있다. 또한, 이들 약물들은 전신 투여에 따라 질병의 부위에 대해 효과적으로 축적되지 않는다. 종양 부위에서의 작용의 비특이적 기전과 비효과적인 국소화는 지속 불가능한 부작용들을 처리하며, 종래의 화학 요법의 치료 효능을 극히 저하시킨다.
전신 투여 후에 질병의 부위에 선택적으로 국소화될 수 있는 표적 약물들의 개발이 매우 바람직하다. 이러한 약물들을 생성하기 위한 전략은 질병의 마커에 특이적인 리간드에 대한 세포독성 약물들 또는 방사성 핵종들과 같은 치료 페이로드(payload)의 화학적 접합으로 대표된다. 질병 특이적인 단일클론 항체들, 펩티드들 및 작은 리간드들이 표적 약물 제품들의 개발을 위해 선택되는 리간드들로서 간주되어 왔다. 약물 표적화 적용들을 위한 작은 리간드들의 이용은 펩티드들 및 항체들과 같은 보다 큰 분자들에 비해 보다 신속하고 효과적인 종양 투과, 보다 낮은 면역원성 및 보다 낮은 제조비용과 같은 몇 가지 이점들을 가진다.
전립선 특이 막 항원, 엽산 수용체 및 탄산 탈수 효소 IX에 특이적인 작은 유기 리간드들은 암의 임상전 모델들 및 환자들에서 뛰어난 생물학적 분배 프로파일들 보였다. 이들 리간드들은 암의 치료를 위한 저분자 약물 접합체 및 저분자 방사성 접합체 제품들(SMDC들 및 SMRC들)을 생성하도록 세포독성 약물들에 접합되었고, 방사성 핵종들에 접합되었다. 177-루테늄-PSMA-617은 전이성 거세 저항성 전립선암(mCRPC) 환자들의 치료를 위한 III상 시험(비전(VISION) 시험)에서 현재 조사되고 있는 후기 단계 SMRC의 실험예를 나타낸다.
섬유아세포 활성화 단백질(FAP)은 종양 성장과 진행을 증진시키는 막 결합성 젤라틴 분해효소이며, 암과 연관된 섬유아세포들에서 과발현된다. FAP는 정상 조직들에서 이의 낮은 발현으로 인해 표적 SMDC들 및 SMRC들의 개발을 위한 이상적인 표적으로 대표된다.
WO 제2019/154886호 및 WO 제2019/154859호에는 다른 암 유형들을 치료하는 데 이용되는 섬유아세포 활성화 단백질-알파 억제제들로서 헤테로사이클릭 화합물들이 기재되어 있다. WO 제2019/118932호에는 다른 병리학적 상태들을 치료하는 데 이용되는 섬유아세포 활성화 단백질-알파 억제제들로서 치환된 N을 포함하는 사이클릭 화합물들이 기재되어 있다. WO 제2019/083990호에는 방사선 치료 약물 표적화 섬유아세포 활성화 단백질-알파(FAP-alpha)와 연관된 질병들을 영상화하고, 증식성 질병들을 치료하기 위해 이용되는 FAP-알파 억제제들로서 FAP-알파 화합물들의 영상화 및 방사선 치료가 기재되어 있으며, 여기에 설명된 4-이소퀴놀리노일(isoquinolinoyl) 및 8-퀴놀리노일(quinolinoyl) 유도체들이 매우 낮은 FAP-친화도로 특징지어지는 점에 주목하고 있다. WO 제2013/107820호에는 암과 같은 증식 질환들 및 골관절염과 같은 조직 재형성 또는 만성 염증으로 나타나는 질병들의 치료에 사용되는 치환된 피르롤리딘(pyrrolidine) 유도체들이 기재되어 있다. WO 제2005/087235호에는 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 디펩티딜 펩티다아제(dipeptidyl peptidase) IV 억제제들로서 피르롤리딘 유도체들이 기재되어 있다. WO 제2018/111989호에는 암 연관 섬유아세포들을 제거하고, 생체외 세포들의 집단을 영상화하며, 암을 치료하기 위해 유용한 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 억제제, 이가의 링커(linker) 및 예를 들어, 근적외선(NIR) 염색을 포함하는 접합체들이 기재되어 있다.
Tsutsumi 등("J Med Chem"(1994))에는 일련의 a-케토 헤테로사이클릭 화합물들의 제조 및 생체외의 피롤릴 엔도펩티다아제(prolyl endopeptidase：PEP) 억제 활성이 기재되어 있다. Hu 등("Bioorg Med Chem Lett"(2005))에는 FAP 및 다른 두 종류의 디펩티딜 펩티다아제들에 대한 다양한 N-알킬 글리(alkyl Gly)-보로(boro)-프로(Pro) 유도체들의 구조-활성 관계가 기재되어 있다. Edosada 등("J Biol Chem"(2006))에는 FAP의 디펩티드 구조 특이성 및 Ac-글리(Gly)-보토프로(BoroPro) FAP 선택 억제제의 개발이 기재되어 있다. Gilmore 등("Biochem Biophys Res Commun"(2006))에는 DPP-IV 및 FAP에 대한 일련의 디펩티드 프롤린 디페닐 포스포네이트(dipeptide proline diphenyl phosphonate)들의 설계, 합성 및 역학 시험이 기재되어 있다. Tran 등("Bioorg Med Chem Lett"(2007))에는 FAP에 대한 다양한 N-아실(acyl)-Gly-, N0-아실-사르(Sar)- 및 N-블록(blocked)-보로프로(boroPro) 유도체들의 구조-활성 관계가 기재되어 있다. Tsai 등("J Med Chem"(2010))에는 DPP-IV, DPP-II, DPP8 및 DPP9에 대해 뛰어난 선택성을 가지는 수많은 FAP 억제제들을 이끌어내는 구조-활성 관계 연구들이 기재되어 있다. Ryabtsova 등("Bioorg Med Chem Lett"(2012))에는 일련의 N-아실화 글리실(acylated glycyl)-(2-시아노(cyano))피르롤리딘(pyrrolidine)들의 합성 및 FAP 억제 성질들의 평가가 기재되어 있다. Poplawski 등("J Med Chem"(2013))에는 잠재적 및 선택적 FAP 억제제로서 N-(피리딘(pyridine)-4-카르보닐(carbonyl))-D-알라(Ala)-보로프로(boroPro)가 기재되어 있다. Jansen 등("ACS Med Chem Lett"(2013))에는 N-(4-퀴놀리노일(quinolinoyl))-글리(Gly)-(2-시아노피르롤리딘(cyanopyrrolidine)) 스캐폴드에 기반하는 FAP 억제제들이 기재되어 있다. Jansen 등("Med Chem Commun"(2014))에는 리나클립틴(linagliptin) 스캐폴드에 기초한 FAP 억제제들의 구조-활성 관계가 기재되어 있다. Jansen 등("Med Chem Commun"(2014))에는 낮은 마이크로몰의 역가를 가지는 잔틴(xanthine)을 기반으로 하는 FAP 억제제들이 기재되어 있다. Jansen 등("J Med Chem"(2014))에는 N-4-퀴놀리노일(quinolinoyl)-글리(Gly)-(2S)-시아노프로(cyanoPro) 스캐폴드에 기초한 FAP 억제제들의 구조-활성 관계가 기재되어 있다. Jackson 등("Neoplasia"(2015))에는 FAP의 슈도펩티드(pseudopeptide) 억제제의 개발이 기재되어 있다. Meletta 등("Molecules"(2015))에는 죽상 경화판들의 비침습성 영상화 추적자들로서 보론산 기반의 FAP 억제제의 사용이 기재되어 있다. Dvorakova 등("J Med Chem"(2017))에는 약물 표적화 적용들을 위해 FAP-특이 억제제를 포함하는 중합체 접합체의 제조가 기재되어 있다. Loktev 등("J Nucl Med"(2018))에는 FAP-특이 효소 억제제에 기초한 요오드화 DOTA-결합 방사성 추적자들의 개발이 기재되어 있다. Lindner 등("J Nucl Med"(2018))에는 테라노스틱 추적자(theranostic tracer)들로서의 사용을 위한 FAP 억제제들의 변경 및 최적화가 기재되어 있다. Giesel 등("J Nucl Med"(2019))에는 FAP 억제제들로서 작용하는 퀴놀린 기반의 PET 추적자들의 임상 영상화 수행이 기재되어 있다.
본 발명은 표적으로 하는 적용들에 적합한 섬유아세포 활성화 단백질(fibroblast activation protein：FAP)의 개선된 결합체들(리간드들)을 제공하는 과제를 목적으로 한다. 상기 결합체들은 FAP의 억제 및/또는 FAP의 과발현에 의해 특징지어지는 질병 또는 장애로 고통 받거나 위험이 있는 부위에 치료제 또는 진단제와 같은 페이로드(payload)의 표적 전달에 적합할 수 있어야 한다. 바람직하게는, 상기 결합체는 FAP와 안정한 복합체를 형성해야 하며, 증가된 친화도, 증가된 억제 활성, 상기 복합체로부터의 해의 보다 느린 속도 및/또는 질병 부위에서 연장된 체류를 나타내어야 한다.
본 발명자들은 약물 표적화(targeting) 적용들을 위해 적합한 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)의 새로운 유기 리간드들을 발견하였다. 본 발명에 따른 화합물들(리간드들 또는 결합체들로도 호칭됨)은 다음의 구조를 가지는 작은 결합 모이어티 A를 포함한다.
본 발명에 따른 화합물은 다음의 일반 화학식 I로 나타내어질 수 있다.
[화학식 I]
이의 개개의 부분입체 이성질체(diastereoisomer)들, 이의 수화물(hydrate)들, 이의 용매화물(solvate)들, 이의 결정 형태들, 이의 개개의 호변체(tautomer)들 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 여기서 A는 결합 모이어티이고; B는 공유 결합 또는 상기 모이어티 A 및 모이어티 C에 공유 결합으로 부착되는 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이며; C는 페이로드 모이어티이다.
본 발명은 또한 상기 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제(excipient)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 인체 또는 동물체에 대해 수행되는 수술 또는 치료 또는 진단 방법에 의한 인체 또는 동물체의 치료를 위한 방법에서의 사용을 위해 상기 화합물 또는 약학 조성물을 더 제공할 뿐만 아니라, 필요로 하는 대상에 상기 화합물 또는 약학 조성물의 치료적 또는 진단적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 인체 또는 동물체에 대해 수행되는 수술 또는 치료 또는 진단 방법에 의한 인체 또는 동물체의 치료를 위한 방법을 더 제공한다.
본 발명은 질병 또는 장애로 고통 받고 있거나 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상의 치유 또는 예방을 위한 방법에서의 사용을 위해 상기 화합물 또는 약학 조성물을 더 제공할 뿐만 아니라, 질병 또는 장애로 고통 받고 있거나 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 상기 화합물 또는 약학 조성물의 치료적 또는 진단적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 질병이나 장애의 치료 치유 또는 예방을 위한 방법을 더 제공한다.
본 발명은 질병 또는 장애로 고통 받고 있거나 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 대해 수행되는 가이드 수술(guided surgery)을 위한 방법에서의 사용을 위해 상기 화합물 또는 약학 조성물을 더 제공할 뿐만 아니라, 질병 또는 장애로 고통 받고 있거나 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 상기 화합물 또는 약학 조성물의 치료적 또는 진단적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 가이드 수술을 위한 방법을 더 제공한다.
본 발명은 질병 또는 장애의 진단을 위한 방법에서의 사용을 위해 상기 화합물 또는 약학 조성물을 더 제공할 뿐만 아니라, 상기 방법은 인체 또는 동물체에 대해 수행되고, 양전자 방출 단층촬영(Positron Emission Tomography：PET)과 같은 핵의학 영상화 기술을 수반하며, 질병 또는 장애의 진단을 위한 방법을 더 제공하고, 상기 방법은 인체 또는 동물체에 대해 수행되고, 양전자 방출 단층촬영(PET)과 같은 핵의학 영상화 기술을 수반하며, 필요로 하는 대상에 상기 화합물 또는 약학 조성물의 치료적 또는 진단적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 질병 또는 장애로 고통 받고 있거나 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 대한 치료제 또는 진단제의 표적 전달을 위한 방법에서의 사용을 위해 상기 화합물 또는 약학 조성물을 더 제공할 뿐만 아니라, 질병 또는 장애로 고통 받고 있거나 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 상기 화합물 또는 약학 조성물의 치료적 또는 진단적 유효량의 표적 전달을 위한 방법을 더 제공한다.
바람직하게는, 앞서 언급한 질병 또는 장애는 FAP의 과발현으로 특징지어지고, 암, 염증, 죽상경화증, 섬유증, 조직 재형성 및 켈로이드 장애로부터 독립적으로 선택되며, 바람직하게는 상기 암은 유방암, 췌장암, 소장암, 결장암, 다약제 내성 결장암, 직장암, 대장암, 전이성 대장암, 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 난소암, 간세포암, 식도암, 하인두암, 비인두암, 후두암, 골수종 세포들, 방광암, 담관암, 투명 세포 신장 암종, 신경내분비 종양, 종양성 골연화증, 육종, 원발 부위 불명암(CUP), 흉선암, 섬유성 종양들, 신경 교종, 성상 세포종, 자궁경부암, 피부암, 신장암, 그리고 전립선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 질병 또는 장애는 흑색종 및 신장 세포 암종으로부터 선택된다.
도 1은 화합물(A) ESV6-플루오(26) 및 화합물(B) 하베르코른-플루오(23)의 화학적 구조 및 LC/MS 프로파일들이다.
도 2는 재조합 hFAP에서 (A) SDS-PAGE 및 (B) 사이즈 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스 200 증가 10/300 GL)의 품질 관리를 나타낸다.
도 3은 화합물 ESV6-플루오(26)와 화합물 하베르코른-플루오(23) 및 hFAP의 공동 용리 PD-10 실험을 나타낸다. 안정한 복합체가 hFAP 및 작은 리간드들인 ESV6-플루오 및 하베르코른-플루오 사이에 형성된다.
도 4는 형광 분극에 의한 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)에 대한 작은 유기 리간드들의 친화도 결정을 나타낸다. ESV6-플루오(26)는 앞서 설명한 리간드인 하베르코른-플루오(23)(0.89nM의 K D)에 비하여 hFAP(0.78nM의 K D)에 대해 보다 높은 친화도를 나타낸다.
도 5는 작은 유기 리간드들의 존재에서의 hFAP 억제 실험을 나타낸다. ESV6 리간드(P3)는 앞서 설명한 리간드인 하베르코른 리간드(H6)(24.6nM)에 비하여 보다 낮은 IC50(20.2nM)을 나타낸다.
도 6은 hFAP로부터의 ESV6-플루오(26) 및 하베르코른-플루오(23)의 해리 속도 측정을 나타낸다. ESV6-플루오는 하베르코른-플루오(회귀 계수＝-0.075112)에 비하여 보다 느린 속도로 해리된다(회귀 계수＝-0.093564).
도 7은 정맥 투여(150nmol/㎏의 도스) 후의 SK-MEL-187 흑색종 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들의 근적외선 형광 영상화에서 IRDye 750 접합체들의 약물 표적화 성능의 평가를 나타낸다. (A)는 다양한 시점들(주사 후의 5분, 20분 및 1시간)에서 살아있는 동물들의 영상들이다. (B)는 2시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 높은 친화도의 FAP 리간드 "ESV6"의 유도체인 화합물 ESV6-IRDye750(18)은 HABERKORN-IRDye750(17)에 비하여 보다 높은 종양-대-간, 종양-대-신장 및 종양-대-장 흡수 비율을 나타낸다. QCOOH-IRDye750(16)(표적화되지 않은 대조군)은 SK-MEL-187 병변들에 생체내로 국소화되지 않는다.
도 8의 (A)는 SK-MEL-187 종양이 있는 마우스들에서 ESV6-ValCit-MMAE(21) 및 HABERKORN-ValCit-MMAE(20)의 치료 활성의 평가를 나타낸다. 데이터 포인트들은 평균 종양 부피±SEM을 나타낸다(그룹 당 n＝3). 화살표들은 IV 감염의 다른 치료들을 나타낸다. 높은 친화도의 FAP 리간드 "ESV6"의 약물 접합체 유도체인 ESV6-ValCit-MMAE는 HABERKORN-ValCit-MMAE와 비교할 경우에 보다 강한 효능의 항종양 효과를 나타낸다. (B)는 실험 동안에 동물들의 체중의 변화들(%)로 평가될 경우에 상이한 치료들의 내성을 나타낸다. ESV6-ValCit-MMAE는 HABERKORN-ValCit-MMAE와 비교할 경우에 보다 낮은 급성 독성을 나타낸다.
도 9는 다른 작은 유기 리간드들의 존재에서의 hFAP 억제 실험을 나타낸다. 실험예 2로부터의 화합물 P4는 화합물 24(33.46nM, 보다 낮은 억제)와 비교할 경우에 보다 낮은 IC50(16.83nM, 보다 높은 억제)을 나타낸다.
도 10은 형광 분극(FP)에 의한 인간 및 쥐의 섬유아세포 활성화 단백질의 작은 유기 리간드들의 친화도 결정을 나타낸다. (A)에서 접합체 15는 접합체 25(KD＝1.02nM)에 비하여 hFAP(KD＝0.68 nM)에 대해 보다 높은 친화도를 보여준다. (B)에서 접합체 15는 접합체 25(KD＝30.94nM)에 비하여 mFAP(KD＝11.61nM)에 대해 보다 높은 친화도를 보여준다. 접합체 15는 접합체 25에 비하여 hFAP에 대해 보다 우수한 결합 성질들 및 쥐 항원에 대한 보다 나은 교차 반응성을 나타낸다. (C)는 접합체 15 및 접합체 25의 구조들을 나타낸다.
도 11은 hFAP(A) 및 mFAP(B)로의 저분자 리간드 접합체 15의 공동 용리 PD-10 실험을 나타낸다. 안정한 복합체가 두 단백질들 및 작은 리간드 접합체 15 사이에 형성되며, 두 분자들의 공동 용리를 함께 가능하게 한다.
도 12는 공초점 현미경 및 FACS 분석을 통한 SK-RC-52.hFAP, HT-1080.hFAP 및 야생형 종양 세포들에 대한 접합체 15(10nM)의 선택적 축적의 평가를 나타낸다. (A)에서 다른 시점들(t＝0 및 1시간)에서 상기 화합물로 배양된 SK-RC-52.hFAP의 영상들은 세포막 위의 접합체 15의 축적을 보여준다. (B)에서 상기 화합물로의 배양 후의 SK-RC-52 야생형의 영상들은 세포막 위의 축적을 보여주지 않는다(음성 대조군). (C)에서 SK-RC-52 야생형(짙은 회색의 피크) 및 SK-RC-52.hFAP(옅은 회색의 피크)에 대한 FACS 분석은 접합체 15(10nM)의 FAP 특이 세포 결합을 보여준다. (D)에서 다른 시점들(t＝0 및 1시간)에서 상기 화합물로 배양된 HT-1080.hFAP의 영상들은 세포막 위 및 시토졸 내부의 접합체 15의 축적을 보여준다. (E)에서 상기 화합물로의 배양 후의 HT-1080 야생형의 영상들은 세포막 위 및 시토졸 내의 축적을 보여주지 않는다(음성 대조군). (F)에서 야생형(짙은 회색의 피크) 및 HT-1080.hFAP(옅은 회색의 피크)에 대한 FACS 분석은 접합체 15(10nM)의 FAP 특이 세포 결합을 보여준다.
도 13은 정맥 투여(40nmol) 후에 SK-RC-52.hFAP 신장 세포 암종 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서의 접합체 15의 약물 표적화 수행의 평가를 나타낸다. 투여의 1시간 후의 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물은 높은 종양-대-기관 선택성으로 정맥 주사의 1시간 후에 생체내로 종양 부위에서 신속하고 균일하게 국소화된다.
도 14는 방사성 화합물들의 RadioHPLC 프로파일을 나타낸다. (A)에서 177Lu(r.t. 11분)로 표지된 접합체 9의 RadioHPLC 프로파일이 나타난다. (B)에서 177Lu(2분)이 없는 RadioHPLC 프로파일이 나타난다. 방사선 표지 후, 접합체 9는 ＞99%의 전환으로 단일 피크로서 나타난다.
도 15는 SK-RC-52.hFAP 신장 세포 암종 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu에서 접합체 9(177Lu 방사성 페이로드를 포함)의 생물학적 분배 실험을 나타낸다. (A)에서 접합체 9의 정맥 투여(도스＝50nmol/㎏; 0.5MBq-2MBq) 후의 다른 시점들(10분, 1시간, 3시간 및 6시간)에서 종양들과 건강한 기관들 및 종양-대-기관 비율 분석의 % ID/g가 나타난다. (B)에서 다른 도스들(125nmol/㎏, 250nmol/㎏, 500nmol/㎏ 및 1000nmol/㎏; 0.5MBq-2MBq)로 177Lu 접합체 9의 정맥 투여 후의 종양들과 건강한 기관들 및 종양-대-기관 비율 분석의 % ID/g가 나타난다. 투여 의존적 반응이 관찰될 수 있고, 표적 포화는 250nmol/㎏ 내지 500nmol/㎏ 사이에 도달될 수 있다. (C)에서 177Lu 용액의 정맥 투여(음성 대조군; 1MBq) 후의 3시간에서 종양들과 건강한 기관들 및 종양-대-기관 비율 분석의 % ID/g가 나타난다.
도 16은 정맥 투여(150nmol/㎏의 도스) 후의 SK-MEL-187(우측 옆구리) 및 SK-RC-52.hFAP(좌측 옆구리) 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들의 근적외선 형광 영상화에서 IRDye 750 접합체 18의 약물 표적화 수행의 평가를 나타낸다. (A)에서 주사 전(t＝0) 및 정맥 주사 후의 30분에서 살아있는 동물들의 영상들이 나타난다. (B)에서 60분에서 생체외의 조직 영상이 제시된다. 화합물 ESV6-IRDye750(18)은 SK-RC-52.hFAP 및 SK-MEL-187 종양들 모두에 대해 축적되며, SK-MEL-187에 비하여 보다 높은 FAP 발현으로 인해 SK-RC-52.hFAP 종양들에서 보다 높은 축적을 제시한다.
도 17은 다른 작은 유기 리간드들의 존재에서 hFAP 억제 실험을 나타낸다. 접합체 28은 실험예 2인 P4에 비하여 보다 낮은 FAP 억제 성질을 보여준다. 시아노피르롤리딘 머리부 및 피리딘 고리 사이의 L-알라닌 기본 구성물을 포함하는 접합체 29는 분석에서는 시험된 농도들에서 FAP 단백질 분해 활성을 억제하지 않는다.
도 18은 정맥 투여(150nmol/㎏의 도스) 후의 HT-1080.hFAP 및 SK-RC-52.wt 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들의 근적외선 형광 영상화에서 IRDye 750 접합체 18의 약물 표적화 수행의 평가를 나타낸다. 1시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물 ESV6-IRDye750(18)은 FAP 발현을 제시하는 HT-1080.hFAP 종양에 대해 선택적으로 축적되며 SK-RC-52.wt. 내에 축적되지 않는다.
도 19는 정맥 투여(40nmol) 후의 SK-RC-52.hFAP(우측 옆구리) 및 SK-RC-52.wt(좌측 옆구리) 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서 접합체 30의 약물 표적화 수행의 평가를 나타낸다. 도 19a에는 투여 후의 1시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물은 정맥 주사 후의 1시간에 FAP 발현을 제시하는 종양에서 뛰어난 종양-대-기관 선택성으로 생체내의 신속하고, 균일하며 선택적으로 국소화된다. 도 19b는 ESV6-Alexa Fluor 488(30)의 구조가 나타낸다.
도 20은 정맥 투여(40nmol)에 HT-1080.hFAP(우측 옆구리) 및 SK-RC-52.wt(좌측 옆구리) 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서 접합체 30의 약물 표적화 수행의 평가를 나타낸다. 도 20a에는 투여 후의 1시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물은 정맥 주사 후의 1시간에 FAP 발현을 제시하는 종양에서 뛰어난 종양-대-기관 선택성으로 생체내의 신속하고, 균일하며 선택적으로 국소화된다. 도 20b는 ESV6-알렉사 플로어 488(30)의 구조를 나타낸다.
도 21의 (A)는 SK-RC-52.hFAP 종양이 있는 마우스들에서 ESV6-ValCit-MMAE(21) 및 QCOH-ValCit-MMAE(19)의 치료 활성의 평가를 나타낸다. 데이터 포인트들은 평균 종양 부피±SEM(그룹 당 n＝4)를 나타낸다. 화합물들은 8일에서 출발하여 연속적으로 6일 동안에 정맥으로 투여되었다(꼬리 정맥 주사). 높은 친화도의 FAP 리간드 "ESV6"의 약물 접합체 유도체인 ESV6-ValCit-MMAE(21)은 분자의 표적화되지 않은 버전인 QCOOH-ValCit-MMAE(19)와 비교하여 보다 강한 효능의 항종양 효과를 나타낸다. (B)는 실험 동안의 동물들의 체중의 변화들(%)의 평가에 의해 분석된 바와 같은 상이한 치료들의 내성을 나타낸다. (C)는 ESV6-ValCit-MMAE(21) 및 QCOOH-ValCit-MMAE(19)의 구조들을 나타낸다.
도 22의 (A)는 SK-RC-52.hFAP 종양이 있는 마우스들에서 ESV6-ValCit-MMAE(21), L19-IL2 및 이들의 결합의 치료 활성의 평가를 나타낸다. 데이터 포인트들은 평균 종양 부피±SEM(그룹 당 n＝4)을 나타낸다. ESV6-ValCit-MMAE은 8일, 10일, 12일에 정맥으로 투여되었다(꼬리 정맥 주사). L19-IL2는 9일, 11일, 13일에 정맥으로 투여되었다(꼬리 정맥 주사). L19-IL2와 결합된 ESV6-ValCit-MMAE는 L19-2 단독의 경우에 비하여 매우 강한 효능의 항종양 효과(4/4의 완전한 종양 퇴화)를 나타낸다. (B)는 실험 동안의 동물들의 체중의 변화들(%)의 평가에 의해 분석된 바와 같은 상이한 치료들의 내성을 나타낸다.
도 23은 우측 옆구리에 SK-RC-52.hFAP가 있고, 좌측 옆구리에 SK-RC-52.wt이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서 저분자 약물 접합체 ESV6-ValCit-MMAE(21)의 정량적 생물학적 분배 실험을 나타낸다. 화합물은 FAP-양성 SK-RC-52 종양들 내에 선택적으로 축적된다(즉, 정맥 투여 후의 6시간에 종양 부위에서 18% ID/g). 이에 비하여, 상기 ESV6-ValCit-MMAE는 FAP-음성 SK-RC-52 야생형 종양들 내에 축적되지 않는다. 건강한 조직 내의 상기 접합체의 흡수는 무시할 수 있다(1% ID/g 보다 낮음).
도 24는 마우스 혈청에서의 접합체 27(69Ga 페이로드를 포함)의 안정성 연구를 나타낸다. 배양 후의 0시간 및 7시간의 시간에서 처리된 샘플의 HPLC 및 LC/MS 프로파일들은 정확한 집단(예측 집단：1028.30)으로 단일의 피크를 보여준다. MS(ES+) m/z 514.3(M+2H)).
도 25는 접합체 15의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 나타낸다. MS(ES+) m/z 1348.36(M+1H)+.
도 26은 ESV6-ValCit-MMAE(21)의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 나타낸다. MS(ES+) m/z 1118.05(M+2H)2+.
도 27은 ESV6-DOTAGA(8)의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 나타낸다. MS(ES+) m/z 960.39(M+H)+.
도 28은 실험예 2인 P4의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 나타낸다. MS(ES+) m/z 460.21(M+H)+.
도 2는 재조합 hFAP에서 (A) SDS-PAGE 및 (B) 사이즈 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스 200 증가 10/300 GL)의 품질 관리를 나타낸다.
도 3은 화합물 ESV6-플루오(26)와 화합물 하베르코른-플루오(23) 및 hFAP의 공동 용리 PD-10 실험을 나타낸다. 안정한 복합체가 hFAP 및 작은 리간드들인 ESV6-플루오 및 하베르코른-플루오 사이에 형성된다.
도 4는 형광 분극에 의한 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)에 대한 작은 유기 리간드들의 친화도 결정을 나타낸다. ESV6-플루오(26)는 앞서 설명한 리간드인 하베르코른-플루오(23)(0.89nM의 K D)에 비하여 hFAP(0.78nM의 K D)에 대해 보다 높은 친화도를 나타낸다.
도 5는 작은 유기 리간드들의 존재에서의 hFAP 억제 실험을 나타낸다. ESV6 리간드(P3)는 앞서 설명한 리간드인 하베르코른 리간드(H6)(24.6nM)에 비하여 보다 낮은 IC50(20.2nM)을 나타낸다.
도 6은 hFAP로부터의 ESV6-플루오(26) 및 하베르코른-플루오(23)의 해리 속도 측정을 나타낸다. ESV6-플루오는 하베르코른-플루오(회귀 계수＝-0.075112)에 비하여 보다 느린 속도로 해리된다(회귀 계수＝-0.093564).
도 7은 정맥 투여(150nmol/㎏의 도스) 후의 SK-MEL-187 흑색종 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들의 근적외선 형광 영상화에서 IRDye 750 접합체들의 약물 표적화 성능의 평가를 나타낸다. (A)는 다양한 시점들(주사 후의 5분, 20분 및 1시간)에서 살아있는 동물들의 영상들이다. (B)는 2시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 높은 친화도의 FAP 리간드 "ESV6"의 유도체인 화합물 ESV6-IRDye750(18)은 HABERKORN-IRDye750(17)에 비하여 보다 높은 종양-대-간, 종양-대-신장 및 종양-대-장 흡수 비율을 나타낸다. QCOOH-IRDye750(16)(표적화되지 않은 대조군)은 SK-MEL-187 병변들에 생체내로 국소화되지 않는다.
도 8의 (A)는 SK-MEL-187 종양이 있는 마우스들에서 ESV6-ValCit-MMAE(21) 및 HABERKORN-ValCit-MMAE(20)의 치료 활성의 평가를 나타낸다. 데이터 포인트들은 평균 종양 부피±SEM을 나타낸다(그룹 당 n＝3). 화살표들은 IV 감염의 다른 치료들을 나타낸다. 높은 친화도의 FAP 리간드 "ESV6"의 약물 접합체 유도체인 ESV6-ValCit-MMAE는 HABERKORN-ValCit-MMAE와 비교할 경우에 보다 강한 효능의 항종양 효과를 나타낸다. (B)는 실험 동안에 동물들의 체중의 변화들(%)로 평가될 경우에 상이한 치료들의 내성을 나타낸다. ESV6-ValCit-MMAE는 HABERKORN-ValCit-MMAE와 비교할 경우에 보다 낮은 급성 독성을 나타낸다.
도 9는 다른 작은 유기 리간드들의 존재에서의 hFAP 억제 실험을 나타낸다. 실험예 2로부터의 화합물 P4는 화합물 24(33.46nM, 보다 낮은 억제)와 비교할 경우에 보다 낮은 IC50(16.83nM, 보다 높은 억제)을 나타낸다.
도 10은 형광 분극(FP)에 의한 인간 및 쥐의 섬유아세포 활성화 단백질의 작은 유기 리간드들의 친화도 결정을 나타낸다. (A)에서 접합체 15는 접합체 25(KD＝1.02nM)에 비하여 hFAP(KD＝0.68 nM)에 대해 보다 높은 친화도를 보여준다. (B)에서 접합체 15는 접합체 25(KD＝30.94nM)에 비하여 mFAP(KD＝11.61nM)에 대해 보다 높은 친화도를 보여준다. 접합체 15는 접합체 25에 비하여 hFAP에 대해 보다 우수한 결합 성질들 및 쥐 항원에 대한 보다 나은 교차 반응성을 나타낸다. (C)는 접합체 15 및 접합체 25의 구조들을 나타낸다.
도 11은 hFAP(A) 및 mFAP(B)로의 저분자 리간드 접합체 15의 공동 용리 PD-10 실험을 나타낸다. 안정한 복합체가 두 단백질들 및 작은 리간드 접합체 15 사이에 형성되며, 두 분자들의 공동 용리를 함께 가능하게 한다.
도 12는 공초점 현미경 및 FACS 분석을 통한 SK-RC-52.hFAP, HT-1080.hFAP 및 야생형 종양 세포들에 대한 접합체 15(10nM)의 선택적 축적의 평가를 나타낸다. (A)에서 다른 시점들(t＝0 및 1시간)에서 상기 화합물로 배양된 SK-RC-52.hFAP의 영상들은 세포막 위의 접합체 15의 축적을 보여준다. (B)에서 상기 화합물로의 배양 후의 SK-RC-52 야생형의 영상들은 세포막 위의 축적을 보여주지 않는다(음성 대조군). (C)에서 SK-RC-52 야생형(짙은 회색의 피크) 및 SK-RC-52.hFAP(옅은 회색의 피크)에 대한 FACS 분석은 접합체 15(10nM)의 FAP 특이 세포 결합을 보여준다. (D)에서 다른 시점들(t＝0 및 1시간)에서 상기 화합물로 배양된 HT-1080.hFAP의 영상들은 세포막 위 및 시토졸 내부의 접합체 15의 축적을 보여준다. (E)에서 상기 화합물로의 배양 후의 HT-1080 야생형의 영상들은 세포막 위 및 시토졸 내의 축적을 보여주지 않는다(음성 대조군). (F)에서 야생형(짙은 회색의 피크) 및 HT-1080.hFAP(옅은 회색의 피크)에 대한 FACS 분석은 접합체 15(10nM)의 FAP 특이 세포 결합을 보여준다.
도 13은 정맥 투여(40nmol) 후에 SK-RC-52.hFAP 신장 세포 암종 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서의 접합체 15의 약물 표적화 수행의 평가를 나타낸다. 투여의 1시간 후의 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물은 높은 종양-대-기관 선택성으로 정맥 주사의 1시간 후에 생체내로 종양 부위에서 신속하고 균일하게 국소화된다.
도 14는 방사성 화합물들의 RadioHPLC 프로파일을 나타낸다. (A)에서 177Lu(r.t. 11분)로 표지된 접합체 9의 RadioHPLC 프로파일이 나타난다. (B)에서 177Lu(2분)이 없는 RadioHPLC 프로파일이 나타난다. 방사선 표지 후, 접합체 9는 ＞99%의 전환으로 단일 피크로서 나타난다.
도 15는 SK-RC-52.hFAP 신장 세포 암종 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu에서 접합체 9(177Lu 방사성 페이로드를 포함)의 생물학적 분배 실험을 나타낸다. (A)에서 접합체 9의 정맥 투여(도스＝50nmol/㎏; 0.5MBq-2MBq) 후의 다른 시점들(10분, 1시간, 3시간 및 6시간)에서 종양들과 건강한 기관들 및 종양-대-기관 비율 분석의 % ID/g가 나타난다. (B)에서 다른 도스들(125nmol/㎏, 250nmol/㎏, 500nmol/㎏ 및 1000nmol/㎏; 0.5MBq-2MBq)로 177Lu 접합체 9의 정맥 투여 후의 종양들과 건강한 기관들 및 종양-대-기관 비율 분석의 % ID/g가 나타난다. 투여 의존적 반응이 관찰될 수 있고, 표적 포화는 250nmol/㎏ 내지 500nmol/㎏ 사이에 도달될 수 있다. (C)에서 177Lu 용액의 정맥 투여(음성 대조군; 1MBq) 후의 3시간에서 종양들과 건강한 기관들 및 종양-대-기관 비율 분석의 % ID/g가 나타난다.
도 16은 정맥 투여(150nmol/㎏의 도스) 후의 SK-MEL-187(우측 옆구리) 및 SK-RC-52.hFAP(좌측 옆구리) 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들의 근적외선 형광 영상화에서 IRDye 750 접합체 18의 약물 표적화 수행의 평가를 나타낸다. (A)에서 주사 전(t＝0) 및 정맥 주사 후의 30분에서 살아있는 동물들의 영상들이 나타난다. (B)에서 60분에서 생체외의 조직 영상이 제시된다. 화합물 ESV6-IRDye750(18)은 SK-RC-52.hFAP 및 SK-MEL-187 종양들 모두에 대해 축적되며, SK-MEL-187에 비하여 보다 높은 FAP 발현으로 인해 SK-RC-52.hFAP 종양들에서 보다 높은 축적을 제시한다.
도 17은 다른 작은 유기 리간드들의 존재에서 hFAP 억제 실험을 나타낸다. 접합체 28은 실험예 2인 P4에 비하여 보다 낮은 FAP 억제 성질을 보여준다. 시아노피르롤리딘 머리부 및 피리딘 고리 사이의 L-알라닌 기본 구성물을 포함하는 접합체 29는 분석에서는 시험된 농도들에서 FAP 단백질 분해 활성을 억제하지 않는다.
도 18은 정맥 투여(150nmol/㎏의 도스) 후의 HT-1080.hFAP 및 SK-RC-52.wt 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들의 근적외선 형광 영상화에서 IRDye 750 접합체 18의 약물 표적화 수행의 평가를 나타낸다. 1시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물 ESV6-IRDye750(18)은 FAP 발현을 제시하는 HT-1080.hFAP 종양에 대해 선택적으로 축적되며 SK-RC-52.wt. 내에 축적되지 않는다.
도 19는 정맥 투여(40nmol) 후의 SK-RC-52.hFAP(우측 옆구리) 및 SK-RC-52.wt(좌측 옆구리) 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서 접합체 30의 약물 표적화 수행의 평가를 나타낸다. 도 19a에는 투여 후의 1시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물은 정맥 주사 후의 1시간에 FAP 발현을 제시하는 종양에서 뛰어난 종양-대-기관 선택성으로 생체내의 신속하고, 균일하며 선택적으로 국소화된다. 도 19b는 ESV6-Alexa Fluor 488(30)의 구조가 나타낸다.
도 20은 정맥 투여(40nmol)에 HT-1080.hFAP(우측 옆구리) 및 SK-RC-52.wt(좌측 옆구리) 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서 접합체 30의 약물 표적화 수행의 평가를 나타낸다. 도 20a에는 투여 후의 1시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물은 정맥 주사 후의 1시간에 FAP 발현을 제시하는 종양에서 뛰어난 종양-대-기관 선택성으로 생체내의 신속하고, 균일하며 선택적으로 국소화된다. 도 20b는 ESV6-알렉사 플로어 488(30)의 구조를 나타낸다.
도 21의 (A)는 SK-RC-52.hFAP 종양이 있는 마우스들에서 ESV6-ValCit-MMAE(21) 및 QCOH-ValCit-MMAE(19)의 치료 활성의 평가를 나타낸다. 데이터 포인트들은 평균 종양 부피±SEM(그룹 당 n＝4)를 나타낸다. 화합물들은 8일에서 출발하여 연속적으로 6일 동안에 정맥으로 투여되었다(꼬리 정맥 주사). 높은 친화도의 FAP 리간드 "ESV6"의 약물 접합체 유도체인 ESV6-ValCit-MMAE(21)은 분자의 표적화되지 않은 버전인 QCOOH-ValCit-MMAE(19)와 비교하여 보다 강한 효능의 항종양 효과를 나타낸다. (B)는 실험 동안의 동물들의 체중의 변화들(%)의 평가에 의해 분석된 바와 같은 상이한 치료들의 내성을 나타낸다. (C)는 ESV6-ValCit-MMAE(21) 및 QCOOH-ValCit-MMAE(19)의 구조들을 나타낸다.
도 22의 (A)는 SK-RC-52.hFAP 종양이 있는 마우스들에서 ESV6-ValCit-MMAE(21), L19-IL2 및 이들의 결합의 치료 활성의 평가를 나타낸다. 데이터 포인트들은 평균 종양 부피±SEM(그룹 당 n＝4)을 나타낸다. ESV6-ValCit-MMAE은 8일, 10일, 12일에 정맥으로 투여되었다(꼬리 정맥 주사). L19-IL2는 9일, 11일, 13일에 정맥으로 투여되었다(꼬리 정맥 주사). L19-IL2와 결합된 ESV6-ValCit-MMAE는 L19-2 단독의 경우에 비하여 매우 강한 효능의 항종양 효과(4/4의 완전한 종양 퇴화)를 나타낸다. (B)는 실험 동안의 동물들의 체중의 변화들(%)의 평가에 의해 분석된 바와 같은 상이한 치료들의 내성을 나타낸다.
도 23은 우측 옆구리에 SK-RC-52.hFAP가 있고, 좌측 옆구리에 SK-RC-52.wt이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서 저분자 약물 접합체 ESV6-ValCit-MMAE(21)의 정량적 생물학적 분배 실험을 나타낸다. 화합물은 FAP-양성 SK-RC-52 종양들 내에 선택적으로 축적된다(즉, 정맥 투여 후의 6시간에 종양 부위에서 18% ID/g). 이에 비하여, 상기 ESV6-ValCit-MMAE는 FAP-음성 SK-RC-52 야생형 종양들 내에 축적되지 않는다. 건강한 조직 내의 상기 접합체의 흡수는 무시할 수 있다(1% ID/g 보다 낮음).
도 24는 마우스 혈청에서의 접합체 27(69Ga 페이로드를 포함)의 안정성 연구를 나타낸다. 배양 후의 0시간 및 7시간의 시간에서 처리된 샘플의 HPLC 및 LC/MS 프로파일들은 정확한 집단(예측 집단：1028.30)으로 단일의 피크를 보여준다. MS(ES+) m/z 514.3(M+2H)).
도 25는 접합체 15의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 나타낸다. MS(ES+) m/z 1348.36(M+1H)+.
도 26은 ESV6-ValCit-MMAE(21)의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 나타낸다. MS(ES+) m/z 1118.05(M+2H)2+.
도 27은 ESV6-DOTAGA(8)의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 나타낸다. MS(ES+) m/z 960.39(M+H)+.
도 28은 실험예 2인 P4의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 나타낸다. MS(ES+) m/z 460.21(M+H)+.
본 발명자들은 약물 표적화(targeting) 적용들을 위해 적합한 섬유아세포 활성화 단백질(fibroblast activation protein：FAP)의 저분자 결합체(binder)들을 확인하였다. 본 발명에 따른 결합체들은 FAP의 높은 억제, FAP에 대한 높은 친화도를 제공하거나 및/또는 FAP의 과발현으로 특징지어지는 질병 또는 장애로 고통 받거나 위험이 있는 부위에 치료제 또는 진단제와 같은 페이로드(payload)의 표적 전달을 위해 적합하다. 본 발명에 따른 결합체들은 FAP와 안정한 복합체를 형성하고, 증가된 친화도, 증가된 억제 활성, 상기 복합체로부터 보다 느린 해리의 속도 및/또는 질병 부위에서의 연장된 체류를 나타낸다. 본 발명에 따른 결합체들은 또한 증가된 종양-대-간, 종양-대-신장 및/또는 종양-대-장 흡수 비율; 보다 강한 효능의 항종양 효과(예를 들어, 평균 종양 체적 증가로 측정됨) 및/또는 보다 낮은 독성(예를 들어, 체중의 변화(%)의 평가에 의해 분석됨)을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 결합체들은 또한 인간 및 쥐의 섬유아세포 활성화 단백질에 대해 높거나 개선된 친화도 및/또는 쥐의 항원에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 결합체들은 바람직하게는 FAP-특이 세포 결합; 세포막 상의 FAP-선택 축적; 시토졸(cytosol) 내부의 FAP-선택 축적을 구현한다. 또한, 본 발명에 따른 결합체들은 바람직하게는, 특히 흑색종 및/또는 신장 세포 암종에 대한 높은 종양-대-기관 선택성으로 생체내의 종양 부위에서 신속하고 균일하게 국소화될 수 있다. 본 발명에 따른 방사성 페이로드(예를 들어, 177Lu)를 포함하는 결합체들은 바람직하게는 250nmol/㎏ 내지 500nmol/㎏에 이르는 표적 포화로 투여 의존적 반응을 구현하거나 및/또는 정맥 투여 후에 12시간까지, 보다 바람직하게는 1시간 내지 9시간까지, 더욱 보다 바람직하게는 3시간 내지 6시간까지 유지한다.
상술한 바와 같은 본 발명은 화합물, 이의 개개의 부분입체 이성질체(diastereoisomer)들, 이의 수화물들, 이의 용매화물들, 이의 결정 형태들, 이의 개개의 호변체(tautomer)들 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 여기서 상기 화합물은 다음의 구조를 가지는 모이어티(moiety) A를 포함한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 화학식 I로 나타낼 수 있다.
[화학식 I]
여기서, B는 공유 결합 또는 A를 C에 공유 결합으로 부착시키는 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이며; C는 원자, 분자 또는 입자일 수 있거나 및/또는 치료제 또는 진단제일 수 있다.
이에 따라, 본 발명에 따른 화합물은 다음의 구조를 가지는 모이어티를 포함할 수 있다.
여기서, B는 공유 결합 또는 원자들과 공유 결합으로 결합된 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이다.
모이어티 A
어떠한 이론에 의해서도 제한되지 않고, 이들 놀라운 기술적 효과들이 작은 결합 모이어티 A의 특정한 구조와 연관되는 점이 고려되며, 여기서 퀴놀린(quinoline) 고리가 아미노(amino) 또는 아미도(amido) 기와 같은 질소를 함유하는 기에 의해 8 위치에서 치환된다.
화합물의 보다 높은 표적 단백질 친화도가 생체내의 보다 긴 종양 체류를 가져오는 점은 앞서 보였다(Wichert 등의 "Nature Chemistry 7"(241-249(2015)). 본 발명의 화합물들은 종래 기술의 화합물들과 비교할 경우에 증가된 친화도, 보다 느린 해리 속도를 가지며, 이에 따라 바람직하게는 주사 이후에 1시간을 넘는, 보다 바람직하게는 6시간을 넘는 치료적 또는 진단적 관련 레벨로 질병 부위에서 연장된 체류를 가지는 것으로 여겨진다. 바람직하게는, 가장 높은 농축이 5분, 10분, 20분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 또는 6시간 후에 구현되거나 및/또는 상기 질병 부위 내의 농축은 주사 이후에 적어도 5분, 10분, 20분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 또는 6시간 동안, 보다 바람직하게는 6시간을 넘는 기간에 걸쳐 치료적 또는 진단적 관련 레벨로 유지된다.
바람직하게는, 상기 결합 모이어티 A는 다음의 구조 A1, 보다 바람직하게는 다음의 구조 A2를 가지며, 여기서 m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5, 바람직하게는 1이다.
모이어티 B
모이어티 B는 공유 결합 또는 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 공유 결합(들)을 통해 A를 페이로드 C에 공유 결합으로 부착시키는 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이다. 상기 모이어티 B는 본 발명의 표적 접합체(targeted conjugate)를 형성하도록 하나 또는 그 이상의 페이로드 및/또는 결합체 모이어티들과 결합시키는 데 사용될 수 있는 분열될 수 있거나, 분열되지 않을 수 있는 이작용기(bifunctional) 또는 다작용기(multifunctional) 모이어티가 될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 화합물의 구조는 분자 당 하나 이상의 모이어티들 A, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 모이어티들 A 및/또는 하나 이상의 모이어티들 C, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 모이어티들 C를 독립적으로 포함한다. 바람직하게는, 상기 구조의 화합물은 분자 당 2의 모이어티들 A 및 1의 모이어티 C, 또는 1의 모이어티 A 및 2의 모이어티들 C를 포함한다.
분열될 수 있는 링커 단위(linker unit)들이 모이어티 B 내에 존재할 때, 방출 기전들은 세포독성 페이로드들에 결합되는 항체들에 특이적인 경우들과 유사할 수 있다. 실제로, 상기 결합 모이어티들의 성질은 이러한 관점에서 독립적이다. 이에 따라, pH-의존성[Leamon, C.P. 등의 "Bioconjugate Chem."(17, 1226(2006)); Casi, G. 등의 "J. Am. Chem. Soc."(134, 5887(2012))], 환원성[Bernardes, G. J. 등의 "Angew. Chem. Int. Ed. Engl."(51. 941(2012)); Yang, J. 등의 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA"(103, 13872(2006))] 그리고 효소 방출[Doronina S.O. 등의 "Bioconjugate Chem"(19, 1960(2008)); Sutherland, M.S.K.의 (2006) "J. Biol. Chem"(281, 10540(2006))]이 상정될 수 있다. 특정 설정에서, 작용기들이 상기 결합 모이어티 또는 페이로드들(예를 들어, 티올(thiol)들, 알코올들) 내에 존재할 때에 링커가 없는 연결이 구현될 수 있고, 이에 따라 온전한 페이로드들이 방출될 수 있으며, 이는 약동학적 분석을 실질적으로 간단하게 한다.
모이어티 B는 다음의 표 1에 도시한 단위를 포함하거나 구성될 수 있으며, 여기서 상기 화학식에 나타낸 치환기들인 R 및 Rn은 H, 할로겐, 치환되거나 치환되지 않은 (헤테로)알킬[(hetero)alkyl], (헤테로)알케닐[(hetero)alkenyl], (헤테로)알키닐[(hetero)alkynyl], (헤테로)아릴[(hetero)aryl], (헤테로)아릴알킬[(hetero)arylalkyl], (헤테로)시클로알킬[(hetero)cycloalkyl], (헤테로)시클로알킬아릴[(hetero)cycloalkylaryl], 헤테로시클릴알킬(heterocyclylalkyl), 펩티드, 올리고당(oligosaccharide) 또는 스테로이드(steroid)기로부터 독립적으로 적합하게 선택될 수 있다. 바람직하게는, 각각의 R, R1, R2 및 R3은 H, OH, SH, NH2, 할로겐, 시아노(cyano), 카르복시(carboxy), 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되며, 각기 치환되거나 치환되지 않는다. 적합하게는, R 및 Rn은 H, 또는 C1-C7 알킬 또는 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택된다. 보다 적합하게는, R 및 Rn은 H, 메틸 또는 에틸로부터 독립적으로 선택된다.
| 링커 | 구조 | 방출 기전 |
| 아미드 |
 |
단백질 분해 |
 |
||
| 에스테르 |
 |
가수 분해 |
| 카르바메이트 |
 |
가수 분해 |
| 히드라진 |
 |
가수 분해 |
| 티아졸리딘 |
 |
가수 분해 |
| 메틸렌 알콕시 카르바메이트 |
 |
가수 분해 |
| 이황화물 |
 |
환원 |
모이어티 B, 단위(들) BL 및/또는 단위(들) BS는 이황화물 결합(disulfide linkage)들이 생체내로 표적에 적절한 약물 방출 동역학을 부여하면서, 가수 분해에 안정하기 때문에 분열될 수 있는 결합으로서 이황화물 결합을 적합하게 포함할 수 있으며, 티올기를 포함하는 약물 모이어티들의 흔적 없는 분열을 제공할 수 있다.
모이어티 B, 단위(들) BL 및/또는 단위(들) BS는 상기 접합체의 수용성을 증진시키기 위해 극성이 될 수 있거나 대전될 수 있다. 예를 들면, 상기 링커는, 펩티드들, 올리고당(oligosaccharide)들, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)들, 폴리아크릴산(polyacrylic acid)이나 이의 염들, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리하이드록실 (메트)아크릴레이트[polyhydroxyethyl (meth)acrylate]들, 폴리술포네이트(polysulfonate)들 등과 같은 하나 또는 그 이상의 알려진 수용성 올리고머(oligomer)들의 약 1 내지 약 20, 적합하게는 약 2 내지 약 10의 잔기들을 포함할 수 있다. 적합하게는, 상기 링커는, 예를 들어, 2 내지 10의 아미노산 잔기들을 포함하는 극성이거나 대전된 펩티드 모이어티를 포함할 수 있다. 아미노산들은 임의의 천연 또는 비천연의 아미노산으로 지칭될 수 있다. 상기 펩티드 링커는 상기 약물 모이어티에 대해 티올기로 상기 분열될 수 있는 이황화물 결합을 형성하기 위해 유리 티올기, 바람직하게는 N-말단 시스테인을 적절하게 포함한다. L- 또는 D-아미노산을 함유하는 임의의 펩티드가 적합할 수 있으며, 특히 Asp-Arg-Asp-Cys 및/또는 Asp-Lys-Asp-Cys의 유형인 펩티드 링커들이 적합하다.
이들 및 다른 실시예들에서, 모이어티 B, 단위(들) BL 및/또는 단위(들) BS는 표적 조직의 세포 표면 또는 세포 밖의 영역들 상에 하나 또는 그 이상의 프로테아제(protease)들에 의해 선택적으로 효소로 분열되도록 특별히 적합하게 조정된 분열될 수 있거나 분열될 수 없는 펩티드 단위를 포함할 수 있다. 상기 펩티드 단위의 아미노산 잔기 사슬 길이는 단일의 아미노산으로부터 여덟의 아미노산 잔기들까지 적합하게 배치된다. 본 발명에서의 사용에 적합한 수많은 특이적인 분열될 수 있는 펩티드 서열들이 설계될 수 있으며, 특정한 종양 연관 효소, 예를 들어, 프로테아제에 의한 효소 분열을 위해 이들의 선택성이 최적화될 수 있다. 본 발명에서의 사용을 위해 분열될 수 있는 펩티드들은 프로테아제 MMP-1, 프로테아제 2 또는 프로테아제 3, 혹은 카텝신(cathepsin) B, 카텝신 C 또는 카텝신 D를 지향하여 최적화되는 것들을 포함할 수 있다. 카텝신 B에 의해 분열될 수 있는 펩티드들이 특별하게 적합하다. 카텝신 B는 흔히 볼 수 있는 시스테인 프로테아제이다. 이는 전이성 종양들 또는 류머티스성 관절염과 같은 생리적 상태들 내를 제외하면 세포내 효소이다. 카텝신 B에 의해 분열될 수 있는 펩티드에 대한 예는 서열 Val-Cit를 포함하는 것이다.
앞서의 실시예들 중의 임의의 것에서, 상기 모이어티 B와 특히 단위(들) BL은 또한 자가-희생(self-immolative) 모이어티를 더 포함하거나, 상기 링커 후에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 상기 자가-희생 링커들은 전자 캐스케이드 링커(electronic cascade linker)들로도 알려져 있다. 이들 링커들은 약물을 활성으로, 바람직하게는 유리 형태로 방출하기 위해 상기 펩티드의 효소 분열에 따라 소거 및 분절을 겪는다. 상기 접합체는 상기 링커를 분열시킬 수 있는 효소의 부존재에서 세포 외에서 안정하다. 그러나 적합한 효소에 대한 노출에 따라, 상기 링커는 분열되어 상기 자가-희생 모이어티를 상기 약물에 공유 결합으로 결합시키는 결합의 분열을 가져오는 자발적인 자가-희생 반응을 개시하며, 이에 따라 이의 유도체가 되지 않거나 약리학적 활성 형태로 상기 약물의 효과적인 방출을 가져온다. 이들 실시예들에서, 상기 자가-희생 링커는 자가-희생 반응을 개시하는 아미드 결합을 분열시키도록 효소에 대해 기질을 제공하는 효소로 분열될 수 있는 펩티드 서열을 통해 상기 결합 모이어티에 연결된다. 적합하게는, 상기 약물 모이어티는 일차 또는 이차 아민, 히드록실(hydroxyl), 술프하이드릴(sulfhydryl) 또는 카르복실기(carboxyl group)와 같은 약물로부터 계류되는 화학적으로 반응성인 작용기를 통해 상기 링커의 자가-희생 모이어티에 연결된다.
자가-희생 링커들의 예들은 상기 약물 모이어티를 상기 접합체 내의 상기 결합 모이어티에 부착시키는 PABC 또는 파라-아미노벤질록시카르보닐(para-aminobenzyloxycarbonyl：PAB)이다(Carl 등의 "J. Med. Chem."(24：479-480(1981)); Chakravarty 등의 "J. Med. Chem."(26：638-644(1983)). 펩티드 단위의 카르복시 말단과 상기 PAB의 파라-아미노벤질을 연결시키는 아미드 결합은 기질이 될 수 있고, 특정 프로테아제들에 의해 분열될 수 있다. 방향족 아민이 전자를 공여하게 되고, 이탈기의 배제를 야기하는 전자 캐스케이드를 개시하며, 이산화탄소의 소거 후에 유리 약물을 방출한다(de Groot 등의 "Journal of Organic Chemistry"(66(26)：8815-8830(2001)). 다른 자가-희생 링커들은 WO 제2005/082023호에 기재되어 있다.
다른 실시예들에서, 상기 링커는 표적 조직의 세포 표면 또는 세포 밖의 영역 상에 존재하는 글루쿠로니다아제(glucoronidase)에 의해 분열될 수 있는 글루쿠로닐기(glucuronyl group)를 포함한다. 리소좀 베타-글루쿠로니다아제는 인간의 암들 내의 괴저 영역들 내의 높은 국소 농도들에서 세포 외로 유리되며, 이는 표적 화학 요법에 대한 루트를 제공하는 것으로 나타났다(Bosslet, K. 등의 "Cancer Res."(58, 1195-1201(1998)).
앞서의 실시예들 중의 임의의 것에서, 상기 모이어티 B는 스페이서 단위(spacer unit)를 적절하게 더 포함한다. 스페이서 단위는 상기 단위 BS가 될 수 있으며, 이는, 예를 들면, 아미드, 아민 또는 티오에테르 결합을 통해 상기 결합 모이어티 A에 연결될 수 있다. 상기 스페이서 단위는 예를 들어, 상기 분열될 수 있는 펩티드 서열이 상기 분열시키는 효소(예를 들어, 카텝신 B)에 의해 접촉되게 하고, 적절하게 상기 분열될 수 있는 펩티드를 상기 자가-희생 모이어티 X에 결합시키는 아미드 결합의 가수 분해를 가능하게 하는 길이이다. 스페이서 단위들은, 예를 들면, 알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 알킬록시의 반복되는 단위들(예를 들어, 폴리에틸레녹시(polyethylenoxy), PEG, 폴리메틸레녹시(polymethyleneoxy)) 그리고 알킬아미노(예를 들어, 폴리에틸렌아미노(polyethyleneamino)), 또는 이산성 에스테르(diacid ester)와 같은 이가의 라디칼, 숙신산염(succinate), 숙신아미드(succinamide), 디글리콜레이트(diglycolate), 멜로네이트(malonate) 및 카프로아미드(caproamide)를 포함하는 아미드들을 포함할 수 있다.
여기에 설명되는 실시예들 중의 임의의 것에서, *는 경우에 따라 모이어티 A에 대한 부착점 또는 모이어티 A에 대한 최단 경로가 ㆍ에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내며, ㆍ는 경우에 따라 모이어티 C에 대한 부착점 또는 모이어티 C에 대한 최단 경로가 *에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타낸다. 페이로드 모이어티 C 보다는 반응성 모이어티 L이 존재하는 경우들에 대해서도 동일하게 적용된다. 다음의 표기들은 모두 추가적인 모이어티에 대한 특정한 기 또는 원자(예를 들어, R)의 부착점의 의미를 가진다.
관련된 구조가 펩티드 모노- 또는 올리고머일 경우, n이 ＞1이고, 각각의 부착점이 Ra, Rb 및 Rc 중에서 임의의 하나를 나타낼 때에 상기 펩티드 단량체 단위(monomeric unit)들 중에서 하나 또는 그 이상 내에, 바람직하게는 상기 각각의 구조 내에 나타낸 다른 부착점으로부터 가장 먼 하나의 펩티드 단량체 단위 내에 존재할 수 있는 조건 하에서, 각 *는 모이어티 A에 대한 최단 경로가 ㆍ에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내며, 각 ㆍ는 모이어티 C에 대한 최단 경로가 *에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타낸다.
여기에 설명되는 실시예들 중의 임의의 것에서, "펩티드(peptide)", "디펩티드(dipeptide)", "트리펩티드(tripeptide)", "테트라펩티드(tetrapeptide)" 등의 용어들은 단백질 생성(proteinogenic) 및/또는 비-단백질 생성 아미노산들에 의해 형성되는 골격을 가지는 펩티드 모노- 또는 올리고머들을 지칭한다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "아미노아실(aminoacyl)" 또는 "아미노산(amino acid)"과 같은 용어들은 대체로 임의의 단백질 생성 또는 비-단백질 생성 아미노산을 지칭한다. 바람직하게는, 여기에 개시되는 실시예들 중의 임의의 것에서, 상기 단백질 생성 또는 비-단백질 생성 아미노산의 곁사슬 잔기들은 각기 다음의 목록으로부터 선택되는 Ra, Rb 및 Rc 중에서 임의의 것으로 나타난다.
여기서, 각각의 R, R1, R2 및 R3은 각기 치환되거나 치환되지 않은, H, OH, SH, NH2, 할로겐, 시아노(cyano), 카르복시(carboxy), 알킬(alkyl), 시클로알킬(cycloalkyl), 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)로부터 독립적으로 선택되며;
각 X는 NH, NR, S, O 및 CH2로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 NH이며;
각 n 및 m은 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다.
바람직하게는, 여기에 개시되는 실시예들 중의 임의의 것에서, 단백질 생성 또는 비-단백질 생성 아미노산의 곁사슬 잔기들은 Ra, Rb 및 Rc 중에서 임의의 것으로 나타나며,
각기 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-원자의 고리의 일부가 될 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질 생성 또는 비-단백질 생성 아미노산의 곁사슬 알파, 베타 및/또는 감마 위치는 다음의 아미노산들(프롤린(proline) 및 하이드록시프롤린(hydroxyproline)) 내에서와 같은 아제티딘(azetidine) 고리, 피르롤리딘(pyrrolidine) 고리 및 피페리딘(piperidine) 고리로부터 선택된 구리형 구조의 일부가 될 수 있거나,
각기 독립적으로 포화되지 않은 구조(즉, 각각의 기인 Ra, Rb 및 Rc에 대한 H 원자 제미널(geminal)이 존재하지 않음)의 일부, 예를 들어,
가 될 수 있다.
보다 바람직한 비-단백질 생성 아미노산들은 다음의 목록으로부터 선택될 수 있다.
상기 모이어티 B뿐만 아니라 본 발명에 따른 화합물에 대한 특히 바람직한 실시예들은 특허 청구 범위에 나탄난다.
바람직하게는, B는 다음의 일반 화학식 II-화학식 V 중에서 임의의 것으로 나타나며,
[화학식 II]
[화학식 III]
[화학식 IV]
[화학식 V]
여기서, 각 x는 0 내지 100, 바람직하게는 0 내지 50, 보다 바람직하게는 0 내지 30의 범위로부터 독립적으로 선택되는 정수이고, 더욱 보다 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 선택되는 정수이며,
각 y는 0 내지 30의 범위로부터 독립적으로 선택되는 정수이고, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 선택되는 정수이며,
각 z는 0 내지 5의 범위로부터 독립적으로 선택되는 정수이고, 바람직하게는 0, 1, 2, 3 및 4로부터 선택되는 정수이며,
*는 모이어티 A에 대한 부착점을 나타내고,
ㆍ는 모이어티 C에 대한 부착점을 나타내며,
(a) BS 및/또는 BL은 각기 치환되거나 치환되지 않은, 알킬렌(alkylene), 시클로알킬렌(cycloalkylene), 아릴알킬렌(arylalkylene), 헤테로아릴알킬렌(heteroarylalkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 헤테로시클로알킬렌(heterocycloalkylene), 알케닐렌(alkenylene), 시클로알케닐렌(cycloalkenylene), 아릴알케닐렌(arylalkenylene), 헤테로아릴알케닐렌(heteroarylalkenylene), 헤테로알케닐렌(heteroalkenylene), 헤테로시클로알케닐렌(heterocycloalenkylene), 알키닐렌(alkynylene), 헤테로알키닐렌(heteroalkynylene), 아릴렌(arylene), 헤테로아릴렌(heteroarylene), 아미노아실(aminoacyl), 옥시알킬렌(oxyalkylene), 아미노알킬렌(aminoalkylene), 이산성 에스테르(diacid ester), 디알킬실록산(dialkylsiloxane), 아미드(amide), 티오아미드(thioamide), 티오에테르(thioether), 티오에스테르(thioester), 에스테르(ester), 카르바메이트(carbamate), 히드라존(hydrazone), 티아졸리딘(thiazolidine), 메틸렌 알콕시 카르바메이트(methylene alkoxy carbamate), 이황화물(disulfide), 비닐렌(vinylene), 이민(imine), 이미다미드(imidamide), 포스포아미드(phosphoramide), 당류(saccharide), 포스페이트 에스테르(phosphate ester), 포스포아미드 카르바메이트(phosphoramide carbamate), 디펩티드(dipeptide), 트리펩티드(tripeptide) 및 테트라펩티드(tetrapeptide)로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 구조 단위를 포함하거나 구성되는 기이고 및/또는
(b) BS 및/또는 BL은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 구조 단위를 포함하거나 구성되는 기이며,
여기서, 각각의 R, R1, R2 및 R3은 각기 치환되거나 치환되지 않은, H, OH, SH, NH2, 할로겐, 시아노, 카르복실, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고,
각각의 R4 및 R5는 각기 치환되거나 치환되지 않은, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되며,
각각의 Ra, Rb 및 Rc는 각기 더 치환될 수 있는, 단백질 생성 또는 비-단백질 생성 아미노산의 곁사슬 잔기들로부터 독립적으로 선택되고,
각 X는 NH, NR, S, O 및 CH2로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 NH이며,
각각의 n 및 m은 0 내지 100, 바람직하게는 0 내지 50, 보다 바람직하게는 0 내지 30에서 독립적으로 선택되는 정수이고, 더욱 보다 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 독립적으로 선택되며,
여기서, 각 *는 모이어티 A에 대한 최단 경로가 ㆍ에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내며, 각 ㆍ는 모이어티 C에 대한 최단 경로가 *에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내고 및/또는
(c) 하나 또는 그 이상의 BL은 다음의 구조 단위들 중에서 하나 또는 그 이상을 독립적으로 포함하거나 구성되며,
여기서, 각각의 상기 구조들에서, n은 1, 2, 3 또는 4이고,
n이 ＞1이고, 각각의 부착점이 Ra, Rb 및 Rc 중에서 임의의 하나를 나타낼 때, 상기 펩티드 단량체 단위들 중에서 하나 또는 그 이상 내에, 바람직하게는 상기 각각의 구조 내에 나타낸 다른 부착점으로부터 가장 먼 하나의 펩티드 단량체 단위 내에 존재할 수 있는 조건 하에서, 각 *는 모이어티 A에 대한 최단 경로가 ㆍ에 대한 경우보타 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내며, 각 ㆍ는 모이어티 C에 대한 최단 경로가 *에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내고 및/또는
(d) BL 및 BS 중에서 하나 또는 그 이상은 다음의 구조들로부터 독립적으로 선택되며,
*-Val-Ala-ㆍ; *-Val-Lys-ㆍ; *-Val-Arg-ㆍ
여기서, 각 *는 모이어티 A에 대한 최단 경로가 ㆍ에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내며, 각 ㆍ는 모이어티 C에 대한 최단 경로가 *에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내고 및/또는
(e) y는 1, 2 또는 3이고 및/또는 적어도 하나의 BL은 다음의 구조들로부터 독립적으로 선택되는 분열될 수 있는 링커기(linker group)를 더 포함하며,
각 *는 모이어티 A에 대한 최단 경로가 ㆍ에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내고, 각 ㆍ는 모이어티 C에 대한 최단 경로가 *에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타낸다.
바람직하게는, B는 위에서 정의된 바와 같을 수 있고 및/또는 다음의 구조를 가질 수 있다.
여기서, B's 및 B''s는 각기 다음으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되며,
각 BL은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
각 n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며,
각 m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고,
각 x'는 0, 1 또는 2이며,
각 x''는 0, 1 또는 2이고,
각 y는 0, 1 또는 2이며,
z는 1 또는 2이고,
여기서, R, R1, R2, R3, Ra, Rb, Rc, X, * 및 ㆍ은 위에서 정의된 바와 같다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물은 다음의 화학식들 중에서 하나에 의해 나타나는 구조를 가진다.
모이어티 C
본 발명에서 모이어티 C는 페이로드를 나타내며, 대체로 임의의 원자(H를 포함), 분자 또는 입자가 될 수 있다. 바람직하게는, 모이어티 C는 수소 원자가 아다.
상기 페이로드는 방사성 표지를 위한 킬레이터(chelator)가 될 수 있다. 적합하게는, 방사성 핵종(radionuclide)은 방출되지 않는다. 킬레이터들은 해당 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 황 콜로이드(sulfur colloid), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid：DTPA), 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid：EDTA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(tetraazacyclododecane)-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(tetraacetic acid：DOTA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(tetraazacyclododececane),N-(글루타르산(glutaric acid))-N',N'',N'''-트리아세트산(triacetic acid：DOTAGA), 1,4,7-트리아자시클로노난(triazacyclononane)-N,N',N''-트리아세트산(triacetic acid：NOTA), 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸(tetraazacyclotetradecane)-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(tetraacetic acid：TETA), 또는 특허 청구 범위에 기재된 바람직한 킬레이터 구조들 중에서 임의의 것과 같은 킬레이터들을 포함한다.
상기 페이로드는 223Ra, 89Sr, 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 123I, 124I, 125I, 131I, 18F, 211At, 225Ac, 89Sr, 225Ac, 117mSn 및 169E와 같은 동위원소들을 포함하는 방사성 동위원소를 포함하거나 구성되는 방사성 기가될 수 있다. 바람직하게는, 18F 및 124I와 같은 양전자 방사체들, 또는 99mTc, 111In 및 123I와 같은 감마 방사체들이 진단적 적용들(예를 들어, PET에 대한)을 위해 사용되는 반면, 89Sr, 131I 및 177Lu와 같은 베타 방사체들은 바람직하게는 치료적 적용들을 위해 사용된다. 또한, 211At, 225Ac 및 223Ra와 같은 알파 방사체들이 치료법을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 방사성 동위원소는 89Sr 또는 223Ra이다. 바람직한 다른 실시예에서, 상기 방사성 동위원소는 68Ga이다.
상기 페이로드는 방사성 동위원소, 바람직하게는 킬레이트제(chelating agent), 바람직하게는 앞서 열거된 킬레이트제나 청구항 제9항의 (a)에 기재된 바람직한 킬레이터 구조들 중에서 임의의 것, 또는 청구항 제9항의 (c)에 기재된 구조들로부터 선택되는 기를 가지는 앞서 열거된 동위원소의 킬레이트가 될 수 있다.
상기 페이로드는 바람직하게는 크산텐(xanthene) 염료, 아크리딘(acridine) 염료, 옥사진(oxazine) 염료, 시아닌(cyanine) 염료, 스티릴(styryl) 염료, 코우마린(coumarine) 염료, 포르핀(porphine) 염료, 형광 금속-리간드 복합체(fluorescent metal-ligand complex), 형광 단백질, 나노결정들, 페릴렌(perylene) 염료, 보론-디피르로메텐(boron-dipyrromethene) 염료 및 프탈로시아닌(phtalocyanine) 염료로부터 선택되고, 바람직하게는 보론-디피르로메텐 염료 및 프탈로시아닌 염료로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 청구항 제9항의 (d)에 기재된 구조들로부터 선택되는 형광단기(fluorophore group)가 될 수 있다.
상기 페이로드는 세포독성 및/또는 세포증식 억제제(cytostatic agent)가 될 수 있다. 이러한 제제들은 세포들의 기능을 억제하거나 방지할 수 있고 및/또는 세포들의 파괴를 야기할 수 있다. 세포 독성제(cytotoxic agent)들의 예들은 방사성 동위원소들, 화학 요법제(chemotherapeutic agent)들, 그리고 저분자 독소들이나 이의 합성 유사체들 및 유도체들을 포함하여 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소로 활성인 독소들과 같은 독소들을 포함한다. 세포 독성제는 아우리스타틴(auristatin), DNA 소홈(minor groove) 결합제, DNA 소홈 알킬화제(alkylating agent), 에네다인(enediyne), 렉시트롭신(lexitropsin), 듀오카마이신(duocarmycin), 탁산(taxane), 푸로마이신(puromycin), 돌라스타틴(dolastatin), 마이탄시노이드(maytansinoid), 그리고 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 또는 이들의 둘 또는 그 이상의 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 세포독성 및/또는 세포증식 억제 페이로드 모이어티들은 청구항 제9항의 (e)에 기재되어 있다.
일 실시예에서, 상기 페이로드는 토포이소머라아제(topoisomerase) 억제제, 알킬화제(예를 들어, 질소 머스터드(nitrogen mustard)들, 에틸렌이메(ethylenime)들, 알킬술포네이트(alkylsulfonate)들, 트리아젠(triazenes)들, 피페라진(piperazine)들 및 니트로수레아(nitrosurea)들), 대사 길항물질(antimetabolite)(예를 들어, 메르캅토푸린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 5-플루오로우라실(fluorouracil)), 항체들(예를 들어, 안트라시클린(anthracycline)들, 닥티노마이신(dactinomycin), 벨로오마이신(bleomycin), 아드리아마이신(adriamycin), 미트라마이신(mithramycin), 닥티노마이신(dactinomycin)), 유사분열 교란물질(mitotic disrupter)(예를 들어, 빈크리스틴(vincristine)과 같은 식물 알카로이드들 및/또는 파실리탁셀(paclitaxel)과 같은 미소관 길항제(antagonist)들), DNA 메틸화제(methylating agent), DNA 삽입제(예를 들어, 카르보플라틴(carboplatin) 및/또는 시스플라틴(cisplatin), 다우노마이신(daunomycin) 및/또는 독소루비신(doxorubicin) 및/또는 벨로마이신 및/또는 탈리도미드(thalidomide)), DNA 합성 억제제, DNA-RNA 전사 조절인자(transcription regulator), 효소 억제제, 조절 유전자, 호르몬 반응 조절물질(hormone response modifier), 저산소증 선택성 세포독소(hypoxia-selective cytotoxin)(예를 들어, 트리아파자민(tirapazamine)), 표피 성장 인자(epidermal growth factor) 억제제, 항혈관제(anti-vascular agent)(예를 들어, 크산테논(xanthenone) 5,6-디메틸크산테논(dimethylxanthenone)-4-아세트산(acetic acid)), 방사선 활성화 프로드러그(prodrug)(예를 들어, 니트로아릴메틸 사차(nitroarylmethyl quaternary：NMQ) 염들)나 생물환원 약물(bioreductive drug), 또는 이들의 둘 또는 그 이상의 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화학 요법제이다. 일부 실시예들에서, 상기 페이로드(즉, 모이어티 C)는 안트라실린으로부터 유도되지 않으며, 바람직하게는 PNU 159682로부터 유도되지 않는다.
상기 화학 요법제는 에를로티닙(Erlotinib)(타르세바(TARCEVA)®), 보르테조밉(Bortezomib)(벨카데(VELCADE)®), 풀베스트란트(Fulvestrant)(파슬로덱스(FASLODEX)®), 수텐트(Sutent)(SU11248), 레트로졸(Letrozole)(페마라(FEMARA)®), 이마티닙 메슬레이트(Imatinib mesylate)(글리벡(GLEEVEC)®), PTK787/ZK 222584, 옥살리플라틴(Oxaliplatin)(엘록사틴(Eloxatin)®), 5-FU(5-풀루오로루아실(fluorouracil)), 류코보린(Leucovorin), 라파마이신(Rapamycin)(시롤리무스(Sirolimus), 라파문(RAPAMUNE)®), 라파티닙(Lapatinib)(GSK572016), 로나파르닙(Lonafarnib)(SCH 66336), 소라페닙(Sorafenib)(BAY43-9006), 제피티닙(Gefitinib)(이레사(IRESSA)®), AG1478, AG1571(SU 5271; 수젠(Sugen)), 또는 이들의 둘 또는 그 이상의 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
상기 화학 요법제는 티오테파(thiotepa), 시톡산(CYTOXAN)® 및/또는 시클로스포스파미드(cyclosphosphamide)와 같은 알킬화제; 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan) 및/또는 피포술판(piposulfan)과 같은 알킬 술포네이트; 벤조도파(benzodopa), 카르보귀온(carboquone), 메투레도파(meturedopa) 및/또는 우레도파(uredopa)와 같은 아지리딘; 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌프보스포아미드(triethylenepbosphoramide), 트리에틸렌티오포스포아미드(triethylenethiophosphoramide) 및/또는 트리메틸로멜라민(trimethylomelamine)과 같은 에틸렌이민(ethylenimine)들 및/또는 메틸아멜라민(methylamelamine)들; 불라타신(bullatacin) 및/또는 불라타시논(bullatacinone)과 같은 아세토게닌(acetogenin); 캄프토테신(camptothecin); 브리오스타틴(bryostatin); 칼리스타틴(callystatin); 크립토피신스(cryptophycins); 돌라스타틴(dolastatin); 듀오카르마이신(duocarmycin); 엘류테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴(pancratistatin); 사르코딕타인(sarcodictyin); 스폰기스타틴(spongistatin); 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 클로로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드(mechlorethamine oxide hydrochloride), 멜팔란(melphalan), 노벰비친(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide) 및/또는 우라실 머스터드(uracil mustard)와 같은 질소 머스터드들; 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine) 및/또는 라님누스틴(ranimnustine)과 같은 니트로우레아(nitrosurea)들; 디네미신(dynemicin); 클로드로네이트(clodronate)와 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate)들; 에스페라미신(esperamicin); 네오카르지노스타틴 크로모포르(neocarzinostatin chromophore); 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신(actinomycin), 아우트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 카바비신(carabicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이시니스(chromomycinis), 닥시노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조(diazo)-5-옥소(oxo)-L-노를류신(norleucine), 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®. 모르폴리노-독소루비신(morpholino-doxorubicin), 시아노모르폴리노-독소루비신(cyanomorpholino-doxorubicin), 2-피르롤리노(pyrrolino)-독소루비신(doxorubicin) 및/또는 데옥시독소루비신(deoxydoxorubicin)과 같은 독소루비신, 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin) C와 같은 미토마이신들, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycin), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 푸로마이신(puromycin), 퀘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 메토트렉세이트(methotrexate) 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질(anti-metabolite)들; 데놉테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate)와 같은 폴산(folic acid) 유사체들; 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine)과 같은 퓨린(purine) 유사체들; 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine)과 같은 피리미딘(pyrimidine) 유사체들; 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스톨락톤(testolactone)과 같은 안드로겐(androgen)들; 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토탄(mitotane), 트릴로스탄(trilostane)과 같은 항아드레날(anti-adrenal)들; 프롤리닉산(frolinic acid)과 같은 폴산 보충물(folic acid replenisher); 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside); 아미놀레불리닉산(aminolevulinic acid); 에닐루라실(eniluracil); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트락세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아지퀴온(diaziquone); 엘포르미틴(elformithine); 엘리프티늄 아세테이트(elliptinium acetate); 에포틸론(epothilone); 에토글루시드(etoglucid); 갈륨 나이트레이트(gallium nitrate); 하이드록시우레아(hydroxyurea); 렌티난(lentinan); 로니다이닌(lonidainine); 마이탄신(maytansine) 및 안사미토신(ansamitocin)과 같은 매크로시클릭 뎁시펩티드(macrocyclic depsipeptide)들; 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피단몰(mopidanmol); 니트라에린(nitraerine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 로속산트론(losoxantrone); 포도필리닉산(podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드(ethylhydrazide); 프로카르바진(procarbazine); 라족산(razoxane); 리족신(rhizoxin); 시조피란(sizofiran); 스피오게르마늄(spirogermanium); 테누아조익산(tenuazonic acid); 트리아지퀴온(triaziquone); 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민(trichlorotriethylamine); 베르라구린(verracurin) A, 로리딘(roridin) A 및/또는 안구이딘(anguidine)과 같은 트리코테센(trichothecene)들; 우레탄(urethan); 빈데신(vindesine); 다카르바진(dacarbazine); 만노머스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미톨락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노시드(arabinoside); 시클로포스파미드(cyclophosphamide); 티오테파(thiotepa); 탁솔(TAXOL)®. 파슬리탁셀(paclitaxel), 아브락산(abraxane) 및/또는 탁소테르(TAXOTERE)®와 같은 탁소이드(taxoid)들; 독세탁셀(doxetaxel); 클로란부실(chloranbucil); 겜잘(GEMZAR)®; 겜시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌(thioguanine); 메르캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 시스플라틴(cisplatin) 및 카르보플라틴(carboplatin)과 같은 플라티늄(platinum) 유사체들; 빈블라스틴(vinblastine); 플라티늄; 에토포시드(etoposide); 이포스파미드(ifosfamide); 미톡산트론(mitoxantrone); 빈크리스틴(vincristine); 나벨린(NAVELBINE)®, 비노렐빈(vinorelbine); 노반트론(novantrone); 테니포시드(teniposide); 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로미틴(difluoromethylomithine：DMFO); 레티논산(retinoic acid)과 같은 레티노이드(retinoid)들; 카페시타빈(capecitabine), 그리고 약학적으로 허용 가능한 염들, 산들, 유도체들, 또는 앞서 기재된 것들 중에서 임의의 것의 둘 또는 그 이상의 결합이 될 수 있다.
상기 페이로드는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 파슬리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)과 같은 탁산(taxane)들, 빈카 알카로이드(vinca alkaloid)들, 디스코데르몰리드(discodermolide), 에포틸론(epothilone) A 및 에포틸론 B, 데속시에포틸론(desoxyepothilone), 크립토피신(cryptophycin), 쿠라신(curacin) A, 콤브레타스타틴(combretastatin) A-4-포스페이트(phosphate), BMS 247550, BMS 184476, BMS 188791; LEP, RPR 109881A, EPO 906, TXD 258, ZD 6126, 빈플루닌(vinflunine), LU 103793, 돌라스타틴(dolastatin) 10, E7010, T138067 및 T900607, 콜치신(colchicine), 펜스타틴(phenstatin), 칼콘(chalcone)들, 인다노신(indanocine), T138067, 온코시딘(oncocidin), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈플루닌(vinflunine), 할리콘드린(halichondrin) B, 이소호모할리콘드린(isohomohalichondrin) B, ER-86526, 피로네틴(pironetin), 스폰지스타틴(spongistatin) 1, 스피케트(spiket) P, 크립토피신(cryptophycin) 1, LU103793(케마토딘(cematodin) 또는 케마도틴(cemadotin)), 리족신(rhizoxin), 사르코딕타인(sarcodictyin), 엘류테오빈(eleutherobin), 라울릴아미드(laulilamide), VP-16 및 D-24851, 그리고 약학적으로 허용 가능한 염들, 산들, 유도체들 또는 앞서 기재된 것들 중에서 임의의 것의 둘 또는 그 이상의 결합을 포함하는 튜뷸린(tubulin) 교란물질이 될 수 있다.
상기 페이로드는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아크리딘(acridine)들, 아크티노마이신(actinomycin)들, 안트라시클린(anthracycline)들, 벤조티오피라노인다졸(benzothiopyranoindazole)들, 픽산트론(pixantrone), 크리스나톨(crisnatol), 브로스탈리신(brostallicin), CI-958, 독소루비신(doxorubicin)(아드리아마이신(adriamycin)), 아크티노마이신(actinomycin) D, 다우노루비신(daunorubicin)(다우노마이신(daunomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 미토마이신((mitomycin) C, 비젤레신(bizelesin), 에토포시드(etoposide), 미톡산트론(mitoxantrone), SN-38, 카르보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cis-platin), 액티노마이신(actinomycin) D, 암사크린(amsacrine), DACA, 피라졸로아크리딘(pyrazoloacridine), 이리노테칸(irinotecan) 및 토포테칸(topotecan), 그리고 약학적으로 허용 가능한 염들, 산들, 유도체들 또는 앞서 기재된 것들 중에서 임의의 것의 둘 또는 그 이상의 결합을 포함하는 DNA 삽입제(intercalator)가 될 수 있다.
상기 페이로드는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 4-하이드로옥시타목시펜(hydroxytamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone) 및/또는 파레스톤 토레미펜(fareston toremifene), 그리고 약학적으로 허용 가능한 염들, 산들, 유도체들 또는 앞서 기재된 것들 중에서 임의의 것의 둘 또는 그 이상의 결합을 포함하는 항에스트로겐(anti-estrogen)들 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제들과 같은 종양들에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항호르몬제(anti-hormonal agent)가 될 수 있다. 상기 페이로드는, 예를 들면, 4(5)-이미다졸(imidazole)들, 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 아로마신(AROMASIN)®. 엑세메스탄(exemestane), 포르메스타니에(formestanie), 파드로졸(fadrozole), 리비소르(RIVISOR)®, 보로졸(vorozole), 페마라(FEMARA)®, 레트로졸(letrozole), 아리미덱스(ARIMIDEX)® 및/또는 아나스트로졸(anastrozole), 그리고 약학적으로 허용 가능한 염들, 산들, 유도체들 또는 앞서 기재된 것들 중에서 임의의 것의 둘 또는 그 이상의 결합과 같은 부신 내의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타아제(enzyme aromatase)를 억제하는 아로마타아제 억제제가 될 수 있다.
상기 페이로드는 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 류프롤리드(leuprolide), 고세렐린(goserelin) 및/또는 트록사시타빈(troxacitabine), 그리고 약학적으로 허용 가능한 염들, 산들, 유도체들 또는 앞서 기재된 것들 중에서 임의의 것의 둘 또는 그 이상의 결합과 같은 항안드로겐(anti-androgen)이 될 수 있다.
상기 페이로드는 단백질 또는 항체가 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 페이로드는 시토카인(cytokine)(예를 들어, IL2, IL10, IL12, IL15와 같은 인터류킨(interleukin); TNF 슈퍼패밀리의 구성체; 또는 인터페론 감마와 같은 인터페론)이다.
임의의 페이로드가 변형되지 않거나 변형된 형태로 사용될 수 있다. 일부는 변형되지 않고, 일부는 변형된 페이로드들의 결합들이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 페이로드는 화학적으로 변형될 수 있다. 화학적 변형 중의 하나의 형태는 알데히드(aldehyde)와 같은 카르보닐기의 유도체화(derivatisation)이다.
바람직한 실시예에서, 모이어티 C는 아우리스타틴(auristatin)(즉, 아우리스타틴 화합물 패밀리 구성체로부터 유로되는 구조를 가짐) 또는 아우리스타틴 유도체이다. 보다 바람직하게는, 모이어티 C는 다음 화학식에 따른 구조를 가진다.
여기서,
R1d는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬, 바람직하게는 H 또는 CH3이고,
R2d는 독립적으로 C1-C6 알킬, 바람직하게는 CH3 또는 iPr이며,
R3d는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬, 바람직하게는 H 또는 CH3이고,
R4d는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, COO(C1-C6 알킬), CON(H 또는 C1-C6 알킬), C1-C10 아릴 또는 C3-C10 헤테로아릴, 바람직하게는 H, CH3, COOH, COOCH3 또는 티아졸릴이며,
R5d는 독립적으로 H, OH, C1-C6 알킬, 바람직하게는 H 또는 OH이고,
R6d는 독립적으로 C3-C10 아릴 또는 C3-C10 헤테로아릴, 바람직하게는 선택적으로 치환된 페닐 또는 피리딜이다.
보다 바람직하게는, 모이어티 C는 MMAE 또는 MMAF로부터 유도된다.
바람직한 실시예에서, 모이어티 C는 다음 화학식에 따른 구조를 가진다.
여기서,
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5, 바람직하게는 1이며,
R1e는 독립적으로 H, COOH, 아릴-COOH 또는 헤테로아릴-COOH, 바람직하게는 COOH이고,
R2e는 독립적으로 H, COOH, 아릴-COOH 또는 헤테로아릴-COOH, 바람직하게는 COOH이며,
각 R3e는 독립적으로 H, COOH, 아릴-COOH 또는 헤테로아릴-COOH, 바람직하게는 COOH이고,
R4e는 독립적으로 H, COOH, 아릴-COOH 또는 헤테로아릴-COOH, 바람직하게는 COOH이며,
X는 O, NH 또는 S, 바람직하게는 O이다.
바람직한 실시예에서, 모이어티 C는 다음 화학식에 따른 구조를 가진다.
여기서,
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5, 바람직하게는 1이며,
R1f는 독립적으로 H, COOH, 아릴-COOH 또는 헤테로아릴-COOH, 바람직하게는 COOH이고,
R2f는 독립적으로 H, COOH, 아릴-COOH 또는 헤테로아릴-COOH, 바람직하게는 COOH이며,
R3f는 독립적으로 H, COOH, 아릴-COOH 또는 헤테로아릴-COOH, 바람직하게는 COOH이고,
X는 O, NH 또는 S, 바람직하게는 O이다.
상기 모이어티 C뿐만 아니라 본 발명에 따른 화합물에 대한 특히 바람직한 실시예들이 특허 청구 범위에 기재된다.
바람직한 화합물들은 표 2 또는 표 3에 따른 구조를 가지는 것들, 이들의 개개의 부분입체 이성질체들, 수화물들, 용매화물들, 결정 형태들, 개개의 호변체들 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염들이다.
다른 측면들
일 측면에서, 앞서 정의된 바와 같은 일반 화학식 I의 화합물, 이의 개개의 부분입체 이성질체들, 이의 수화물들, 이의 용매화물들, 이의 결정 형태들, 이의 개개의 호변체들 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염들이 여기에 개시되며, 여기서 A는 앞서 정의된 바와 같은 구조를 가지는 결합 모이어티이고, B는 공유 결합이거나 상기 모이어티들 A 및 C에 공유 결합으로 부착되는 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이며, C는 페이로드 모이어티이다.
다른 측면에서, B는 앞서 정의한 바와 같은 일반 화학식 II-화학식 V 중에서 임의의 것으로 나타나며, 여기서 각 BS는 독립적으로 스페이서기를 나타내고, 각 BL은 독립적으로 분열될 수 있거나 분열될 수 없는 링커기를 나타내며, 각 x는 0 내지 100, 바람직하게는 0 내지 50, 보다 바람직하게는 0 내지 30의 범위로 선택되고, 더욱 보다 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20로부터 독립적으로 선택되는 정수이며, 각 y는 0 내지 30의 범위로부터 선택되고, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 독립적으로 선택되는 정수이며, 각 z는 0 내지 5의 범위로부터 선택되고, 바람직하게는 0, 1, 2, 3 및 4로부터 독립적으로 선택되는 정수이며, *는 모이어티 A에 대한 부착점을 나타내고, ㆍ는 모이어티 C에 대한 부착점을 나타낸다.
앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 다른 하나의 측면에서, 상기 결합 모이어티는 앞서 정의한 바와 같은 구조 A1을 가진다.
앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 다른 하나의 측면에서, BS 및/또는 BL은 각기 치환되거나 치환되지 않은, 알킬렌, 시클로알킬렌, 아릴알킬렌, 헤테로아릴알킬렌, 헤테로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 알케닐렌, 시클로알케닐렌, 알리알케닐렌, 헤테로아릴알케닐렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로시클로알케닐렌, 알키닐렌, 헤테로알키닐렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아미노아실, 옥시알킬렌, 아미노알킬렌, 이산성 에스테르, 디알킬실록산, 아미드, 티오아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 에스테르, 카르바메이트, 히드라존, 티아졸리딘, 메틸렌 알콕시 카르바메이트, 이황화물, 비닐렌, 이민, 이미다미드, 포스포아미드, 당류, 포스파테에스테르, 포스포아미드, 카르바메이트, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 구조 단위를 포함하거나 구성되는 기이다.
앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 다른 하나의 측면에서, BS 및/또는 BL은 청구항 제5항의 (b)에 정의된 바와 같은 기이다. 앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 바람직한 일 측면에서, 하나 또는 그 이상의 BL은 청구항 제5항의 (c)에 정의된 바와 같다. 앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 바람직한 일 측면에서, BL 및 BS의 하나 또는 그 이상은 청구항 제5항의 (d)에 정의된 바와 같다. 앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 바람직한 일 측면에서, y는 1, 2 또는 3이고; 및/또는 적어도 하나의 BL은 청구항 제5항의 (e)에 정의된 바와 같다. 앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 바람직한 일 측면에서, B는 청구항 제1항에 정의된 바와 같다.
앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 다른 하나의 측면에서, 화합물은 청구항 제7항에 정의된 바와 같다.
앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 다른 하나의 측면에서, 상기 모이어티 C는 청구항 제8항 및/또는 청구항 제9항에 정의된 바와 같다.
앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 다른 하나의 측면에서, 상기 화합물은 접합체 1; 접합체 2; 접합체 3; 접합체 4; 접합체 5; 접합체 6; 접합체 7; 접합체 8; 접합체 9; 접합체 10; 접합체 11; 접합체 12; 접합체 13; 접합체 14; 접합체 15; 및 ESV6-플루오(fluo)로부터 선택되는 구조를 가진다.
또한, 앞서의 측면들 중에서 임의의 것에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제(excipient)를 포함하는 약학 조성물(pharmaceutical composition)이 개시된다. 또한, 이러한 약학 조성물은 (a) 인체 또는 동물체에 수행되는 수술 또는 치료 또는 진단 방법에 의해 상기 인체 또는 동물체의 치료를 위한 방법에 사용되거나, (b) 질병 또는 장애로 고통 받거나 상기 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상의 치료 또는 예방을 위한 방법에 사용되거나, (c) 질병 또는 장애로 고통 받거나 상기 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 수행되는 가이드 수술을 위한 방법에 사용되거나, (d) 질병 또는 장애의 진단을 위한 방법에서, 인체 또는 동물체에 수행되고, 양전자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(Single Photon Emission Computed Tomography：SPECT)과 같은 핵의학 영상화 기술을 수분하는 방법에 사용되거나, (e) 질병 또는 장애로 고통 받거나 상기 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 대한 치료제 또는 진단제의 표적 전달을 위한 방법에 사용되며, 각각의 앞서의 (b)-(e)에서, 상기 질병 또는 장애는 암, 염증, 죽상경화증(atherosclerosis), 섬유증(fibrosis), 조직 재형성 및 켈로이드 장애(tissue remodelling and keloid disorder)로부터 독립적으로 선택되며, 바람직하게는 여기서 상기 암은 유방암(breast cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 소장암(small intestine cancer), 결장암(colon cancer), 다약제 내성 결장암(multi-drug resistant colon cancer), 직장암(rectal cancer), 대장암(colorectal cancer), 전이성 대장암(metastatic colorectal cancer), 폐암(lung cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 두경부암(head and neck cancer), 난소암(ovarian cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 식도암(oesophageal cancer), 하인두암(hypopharynx cancer), 비인두암(nasopharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 골수종 세포(myeloma cell)들, 방광암(bladder cancer), 담관암(cholangiocarcinoma), 투명세포 신장 암종(clear cell renal carcinoma), 신경내분비 종양(neuroendocrine tumour), 종양성 골연화증(oncogenic osteomalacia), 육종(sarcoma), 원발 부위 불명암(carcinoma of unknown primary：CUP), 흉선암(thymus cancer), 섬유성 종양(desmoid tumour)들, 신경 교종(glioma), 성상 세포종(astrocytoma), 자궁경부암(cervix cancer), 그리고 전립선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 여기서 상기 화합물은 치료적 또는 진단적 관련 레벨로 상기 질병 부위에 주사 이후에 바람직하게는 1시간을 넘는, 보다 바람직하게는 6시간을 넘는 연장된 체류를 가진다
치료
여기에 설명되는 화합물들은 질병을 치료하는 데 사용된다. 치료는 원하지 않는 생리학적 변화 또는 장애를 방지하거나, 감소시키거나, 중단시키는 것을 목표로 하는 치료적 및/또는 예방적 치료가 될 수 있다. 상기 치료는 치료를 받지 않을 경우에 예상되는 생존 기간의 경우에 비하여 생존 기간을 연장시킬 수 있다.
상기 화합물에 의해 치료되는 질병은 치료로부터 편익을 가질 수 있는 임의의 질병이 될 수 있다. 이는 장애에 취약한 이들의 병리학적 상태들을 포함하는 만성 또는 급성 장애들 또는 질병들을 포함한다.
"암(cancer)" 및 "암성(cancerous)"이라는 표현들은 통상적으로 조절되지 않은 세포 성장에 의해 특징지어지는 포유동물들에서의 생리학적 상태를 의미하는 것으로 그 가장 넓은 의미로 사용된다. 종양은 하나 또는 그 이상의 암성 세포들을 포함한다.
암을 치료할 때, 관찰되는 치료적 효과는 암 세포들의 숫자의 감소, 종양 크기의 감소, 주변 기관들 내로의 암 세포 침윤의 억제 또는 지연 및/또는 상기 암과 연관된 증상들 중에서 하나 또는 그 이상의 경감이 될 수 있다.
동물 모델들에서, 효능은 치료 동안에 상기 종양의 물리적인 측정에 의해서 및/또는 상기 암의 부분적 및 전체적인 완화를 결정함에 의해 평가될 수 있다. 암 치료법에 대해, 효능은, 예를 들면, 무작위로부터 객관적 진행까지의 기간(time to disease progression：TTP)을 평가함에 의해서 및/또는 반응률(response rate：RR)을 결정함에 의해서 측정될 수 있다.
본 발명과 관련된 치료의 방법들에 대한 특히 바람직한 실시예들이 특허 청구 범위에 기재되어 있다.
또한, 예를 들어, 인체 또는 동물체에 수행되는 수술 또는 치료 또는 진단 방법에 의해 상기 인체 또는 동물체의 치료를 위한 방법들이 여기에 개시되며, 상기 방법들은 필요로 하는 대상에 여기에 개시되는 바와 같은 화합물 또는 약학 조성물의 치료적 또는 진단적 유효량을 투여하는 단계를 수반한다. 보다 상세하게는, 예를 들어, 치료 또는 예방에 의한 질병 또는 장애로 고통 받거나 상기 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상의 치료, 또는 질병 또는 장애로 고통 받거나 상기 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 수행되는 가이드 수술에 의한 치료의 방법들; 예를 들어, 인체 또는 동물체에 수행되는 진단 방법 및/또는 양전자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)과 같은 핵의학 영상화 기술을 수반하는 질병 또는 장애의 진단을 위한 방법들; 질병 또는 장애로 고통 받거나 상기 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 치료제 또는 진단제의 표적 전달을 위한 방법이 여기에 개시된다. 상술한 방법들에서, 상기 질병 또는 장애는 암, 염증, 죽상경화증, 섬유증, 조직 재형성 및 켈로이드 장애로부터 독립적으로 선택될 수 있으며, 바람직하게는 여기서 상기 암은 유방암, 췌장암, 소장암, 결장암, 다약제 내성 결장암, 직장암, 대장암, 전이성 대장암, 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 난소암, 간세포암, 식도암, 하인두암, 비인두암, 후두암, 골수종 세포들, 방광암, 담관암, 투명세포 신장 암종, 신경내분비 종양, 종양성 골연화증, 육종, 원발 부위 불명암(CUP), 흉선암, 섬유성 종양들, 신경 교종, 성상 세포종, 자궁경부암, 피부암, 신장암 및 전립선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 여기에 개시되는 방법들에 사용될 때, 상기 화합물은 주사 이후에 치료적 또는 진단적 관련 레벨로 상기 질병 부위에 바람직하게는 1시간을 넘는, 보다 바람직하게는 6시간을 넘는 연장된 체류를 가진다.
약학 조성물들
여기에 설명되는 화합물들은 인간 의학 및 수의학에서 인간 또는 동물 용도가 될 수 있는 약학 조성물들의 형태가 될 수 있고, 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 희석제, 운반체, 또는 부형제 중에서 임의의 하나 또는 그 이상을 포함할 것이다. 치료적 용도를 위해 허용 가능한 운반체들 또는 희석제들은 약학 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences"(Mack Publishing Co., A. R. Gennaro edit. 1985)에 기재되어 있다. 약학적 운반체, 부형제 또는 희석제의 선택은 투여의 의도되는 루트 및 표준 약학 진료에 관하여 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물들은 상기 운반체, 부형제 또는 희석제로서나 이들에 추가하여, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(lubricant)(들), 서스펜션화제(suspending agent)(들), 코팅제(coating agent)(들), 가용화제(solubilising agent)(들)을 포함할 수 있다.
보존제(preservative)들, 안정화제(stabiliser)들, 염료들 및 심지어 향미제(flavouring agent)들이 상기 약학 조성물에 제공될 수 있다. 보존제들의 예들은 벤조산나트륨(sodium benzoate), 소르빈산(sorbic acid) 및 p-하이드록시벤조산(hydroxybenzoic acid)의 에스테르들을 포함한다. 항산화제(antioxidant)들 및 서스펜션화제들도 사용될 수 있다.
다른 전달 시스템들에 따라 다른 조성물/제형 요구 사항들이 존재할 수 있다. 예로서, 상기 약학 조성물은 미니-펌프(mini-pump)를 이용하거나, 예를 들면, 흡입을 위한 비강 스프레이나 에어로졸 또는 섭취 가능한 용액으로서 점막 루트에 의하거나, 상기 조성물이, 예를 들면, 정맥 내, 근육 내 또는 피하의 루트에 의해 전달을 위해 주사 가능한 형태로 조제되는 비경구로 투여되도록 조제될 수 있다. 선택적으로는, 상기 제형은 수많은 루트들로 투여되도록 설계될 수 있다.
상기 제제가 위장 점막을 통해 점막으로 투여되어야 할 경우, 위장관을 통한 통과 동안에 안정하게 남아 있을 수 있어야 한다. 예를 들면, 단백질 분해에 대해 견뎌야 하고, 산성 pH에서 안정해야 하며, 담즙의 정화 작용에 견뎌야 한다.
적절할 경우, 상기 약학 조성물들은 좌약이나 질 좌약의 형태로 흡입에 의해, 피부 패치의 사용에 의해 국소적으로 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포제의 형태로, 전분 또는 락토오스(lactose)와 같은 부형제들을 함유하는 정제들의 형태로 경구로, 단독으로나 부형제들과의 혼합물로서 캡슐들이나 질 좌제들로, 또는 향미제들이나 착색제들을 함유하는 엘릭서(elixir)들, 용액들 또는 서스펜션(suspension)들의 형태로 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물들은 비경구로, 예를 들면, 정맥 내로, 근육 내로 또는 피하로 주사될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 상기 조성물들은 혈액과 등장인 용액을 만들기 위해 다른 기질들, 예를 들면, 충분한 염들 또는 단당류들을 함유할 수 있는 멸균 수성 용액의 형태로 최적으로 사용될 수 있다. 구강 또는 설하 투여를 위해, 상기 조성물들은 종래의 방식으로 조제될 수 있는 정제들 또는 로젠지(lozenge)들의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능하거나 활성인 염의 형태로 투여될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염들은 해당 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, Berge 등의 "J. Pharm. Sci."(66, 1-19 (1977))에 의해 언급된 것들을 포함한다. 염들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 황산염, 구연산염, 아세트산염, 옥살산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 질산염, 중황산염, 인산염, 산성 인산, 아이소니코틴산염(isonicotinate), 젖산염, 살리실산염(salicylate), 산성 구연산염, 주석산염(tartrate), 올레산염(oleate), 타닌산염(tannate), 판토텐산염(pantothenate), 중주석산염, 아스코르브산염(ascorbate), 숙신산염(succinate), 말레인산염(maleate), 겐티신산염(gentisinate), 푸마르산염(fumarate), 글루콘산염(gluconate), 글루카론산염(glucaronate), 당산염(saccharate), 포름산염(formate), 벤조산염(benzoate), 글루타민산염(glutamate), 메탄술폰산염(methanesulfonate), 에탄술폰산염(ethanesulfonate), 벤조술폰산염(benzenesulfonate), p-톨루엔술폰산염(toluenesulfonate), 그리고 파모산염(pamoate)(즉, 1,1'-메틸렌(methylene)-비스(bis)-(2-하이드록시(hydroxy)-3-나프토에이트(naphthoate)) 염들을 포함한다.
투여(전달)를 위한 루트들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 하나 또는 그 이상의 경구(예를 들어, 정제, 캡슐로서나 섭취 가능한 용액으로서), 국소, 점막(예를 들어, 흡입을 위한 비강 스프레이나 또는 에어로졸로서), 비강, 비경구(예를 들어, 주사 가능한 형태로), gastrointestinal, intraspinal, intraperitoneal, 근육 내, 정맥 내, intrauterine, intraocular, intradermal, intracranial, intratracheal, intravaginal, intracerebroventricular, intracerebral, 피하, ophthalmic(including intravitreal 또는 intracameral), transdermal, rectal, buccal, vaginal, epidural, sublingual. 중에서 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
통상적으로, 내과 의사는 개개의 대상에 대해 가장 적합하게 되는 실제 투약을 결정할 것이다. 임의의 특정한 환자에 대한 투약의 특정 도스 레벨 및 빈도는 변화될 수 있으며, 채용되는 특정 화합물의 활성, 상기 화합물의 대사 안정성과 작용의 기간, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식품, 투여의 모드와 시간, 배출의 속도, 약물 조합, 특정한 상태의 중증도, 그리고 개별적인 진행 중인 치료법을 포함하는 다양한 인자들에 따를 것이다.
상기 제형들은 단위 도스 또는 다중의 도스 용기들, 예를 들면, 밀봉된 앰플(ampoule)들 및 바이알(vial)들 내에 포장될 수 있으며, 투여를 위해 멸균 액상 운반체, 예를 들면 물만의 첨가를 요구하는 동결 건조(냉동 건조) 상태로 저장될 수 있다. 임시 처방의 주사 용액들 및 서스펜션들은 앞서 기재된 종류의 멸균 분말들, 과립들 및 정제들로부터 제조된다. 예시적인 단위 투여 제형들은 활성 성분의 일일 도스, 또는 일일 단위 하위 도스, 또는 이의 적절한 일부를 포함한다.
전구체 화합물들
본 발명의 일 측면에서, 화합물, 이의 개개의 부분입체 이성질체들, 이의 수화물들, 이의 용매화물들, 이의 결정 형태들, 이의 개개의 호변체들 또는 이의 염이 여기에 개시되며, 여기서 상기 화합물(전구체 화합물)은 모이어티 A 및 접합 파트너(conjugation partner)와 반응하고 공유 결합을 형성할 수 있는 모이어티 L을 포함한다. 접합(즉, 반응하고, 공유 결합을 형성함)에 따라, 전자의 전구체 화합물이 전자의 접합 파트너와 결합되고, 순차적으로 페이로드 모이어티 C가 된다. 상기 접합 파트너는 원자, 분자, 입자, 치료제 및/또는 진단제가 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 접합은 치료제 및/또는 진단제이며, 본 발명에 따른 접합체들에 관하여 이미 알서 상세하게 설명한 상기 페이로드 모이어티들에 상응할 수 있다.
바람직하게는, 상기 전구체 화합물은 다음의 구조를 가지는 모이어티를 포함한다.
여기서, B는 공유 결합이거나, 원자들에 공유 결합으로 결합된 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이다.
상기 전구체 화합물은 다음의 화학식 VI로 나타내어질 수 있다.
[화학식 VI]
여기서, B는 공유 결합이거나, A를 L에 공유 결합으로 부착시키는 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이다.
모이어티 A는 바람직하게는 구조 A1 또는 A2를 가지며, 여기서 m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
모이어티 B는 바람직하게는 본 발명에 따른 접합체들에 관하여 앞서 상세하게 설명한 바와 동일한 구조를 가진다.
모이어티 L은, 바람직하게는 반응에 따라, 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 히드라존, 티아졸리딘, 메틸렌 알콕시 카르바메이트, 이황화물, 알킬렌, 시클로알킬렌, 아릴알킬렌, 헤테로아릴알킬렌, 헤테로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 알케닐렌, 시클로알케닐렌, 아릴알케닐렌, 헤테로아릴알케닐렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로시클로알케닐렌, 알키닐렌, 헤테로알키닐렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아미노아실, 옥시알킬렌, 아미노알킬렌, 이산성 에스테르, 디알킬실록산, 아미드, 티오아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 에스테르, 카르바메이트, 히드라존, 티아졸리딘, 메틸렌 알콕시 카르바메이트, 이황화물, 비닐렌, 이민, 이미다미드, 포스포아미드, 당류, 포스페이트 에스테르, 포스포아미드, 카르바메이트, 디펩티드, 트리펩티드 또는 테트라펩티드 연결기(linking group)를 형성할 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자에게 이해될 수 있는 바와 같이, 앞서 언급한 표에 따른 연결기를 형성하기 위해 접합 파트너와 반응할 수 있는 반응기를 어떻게 제공할 것인가에 대한 여러 가능성들이 존재하며, 모두 본 발명에 포함된다.
상기 모이어티 B는 본 발명의 접합체 전구체를 형성하도록 하나 또는 그 이상의 반응성 및/또는 결합체 모이어티들을 연결하는 데 사용될 수 있는 분열될 수 있거나 분열될 수 없는 이작용기(bifunctional) 또는 다작용기(multifunctional) 모이어티가 될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 화합물의 구조는 분자 당 하나 이상의 모이어티들 A, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 모이어티들 A 및/또는 하나 이상의 모이어티들 L, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 모이어티들 L을 독립적으로 포함한다. 바람직하게는, 상기 화합물의 구조는 분자 당 2의 모이어티들 A 및 1의 모이어티 L, 또는 1의 모이어티 A 및 2의 모이어티들 L을 포함한다.
모이어티 L은 바람직하게는 H, NH2, N3, COOH, SH, Hal 및 다음으로부터 선택된다.
여기서, 각 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, 각 m은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며, 각 Hal은 F, Cl, Br 또는 I이고, 각 R4는 독립적으로 각기 할로겐 및 시아노로 치환되거나 치환되지 않은 카르복시, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택된다.
바람직한 화합물들은 표 3에 따른 구조를 가지는 것들, 이들의 개개의 부분입체 이성질체들, 수화물들, 용매화물들, 결정 형태들, 개개의 호변체들 또는 이의 염들이다.
접합체를 제조하기 위한 방법들
본 발명의 일 측면에서, 앞서 설명한 바와 같은 전구체 화합물을 접합 파트너와 접합시키는 단계를 포함하는 접합체를 제조하기 위한 방법이 여기에 개시된다. 바람직하게는, 상기 전구체 화합물은 공유 결합을 형성하도록 상기 접합 파트너와 반응하여 접합된다. 바람직하게는, 이에 따라 얻어진 접합체는 본 명세서에서 여러 경우들에 설명되는 바와 같은 접합체 화합물이다.
상기 접합 파트너는 원자, 분자, 입자, 치료제 및/또는 진단제가 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 접합 파트너는 치료제 및/또는 진단제이며, 본 발명에 따른 접합체들에 관하여 앞서 이미 상세하게 설명한 페이로드 모이어티들에 상응할 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 상기 접합체를 약학 조성물로서나 진단 조성물로서 조제하는 단계를 더 포함한다. 상기 약학 또는 진단 조성물들은 인간 의학 및 수의학에서 인간 또는 동물을 위해 사용될 수 있으며, 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 희석제, 운반체, 또는 부형제 중에서 임의의 하나 또는 그 이상을 포함할 것이다. 치료적 용도를 위해 허용 가능한 운반체들 또는 희석제들은 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences"(Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985))에 기재되어 있다. 상기 운반체, 부형제 또는 희석제의 선택은 투여의 의도되는 루트 및 표준 약학 진료에 관해 선택될 수 있다. 상기 약학 또는 진단 조성물들은 상기 운반체, 부형제 또는 희석제로서나 이들에 추가하여 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 서스펜션화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)을 포함할 수 있다. 앞서의 "약학 조성물들" 부문에 개시된 모든 제형 세부 사항들 및 측면들도 완전히 적용된다.
일반적인 기술들
본 발명의 수행은 달리 나타내지 않는 한은 해당 기술 분야의 숙련자에게 알려진 종래의 화학, 생화학, 분자 생물학, 세포 생물학, 유전학, 면역학 및 약리학을 채용한다. 이러한 기술들은 문헌들에 자세하게 설명되어 있다. 예를 들면, Gennaro, A. R.의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"(18th ed., Mack Publishing Co.(1990)); Hardman, J. G., Limbird, L. E. 및 Gilman, A. G.의 "The Pharmacological Basis of Therapeutics"(10th ed., McGraw-Hill Co.(2001)); Colowick, S. 등의 "Methods In Enzymology"(Academic Press, Inc.); Weir, D. M. 및 Blackwell, C. C.의 "Handbook of Experimental Immunology"(Vols. I-IV, Blackwell Scientific Publications(1986)); Maniatis, T. 등의 (1989) "Molecular Cloning：A Laboratory Manual"(2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)); Ausubel, F. M. 등의 "Short Protocols in Molecular Biology"(4th edition, John Wiley & Sons(1999)); Ream 등의 "Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course"(Academic Press(1998)); Newton, C. R. 및 Graham, A. 등의 "PCR(Introduction to Biotechniques Series)"(2nd ed., Springer Verlag(1997))를 참조하기 바란다.
화학적 합성
여기에 기재되는 화합물들은 화학 합성 기술들에 의해 제조될 수 있다.
해당 기술 분야의 숙련자에게는 민감한 작용기들이 화합물의 합성 동안에 보호되거나 탈보호될 필요가 있을 수 있는 점을 이해할 것이다. 이는, 예를 들면, T. W. Greene 및 P G M Wuts의 "Protective Groups in Organic Synthesis"(John Wiley and Sons Inc.(1991)), 그리고 P. J. Kocienski의 "Protecting Groups"(Georg Thieme Verlag(1994))에 기재되어 있는 바와 같은 종래의 기술로 구현될 수 있다.
반응들 중의 일부 동안에 임의의 입체 중심이 특정 조건들 하에서, 예를 들면, 염기가 염기에 민감한 기를 포함하는 광학 중심을 가지는 기질과의 반응에 사용되는 경우에 이성질체화될 수 있는 가능성이 있다. 해당 기술 분야에 잘 알려진 반응 순서, 조건들, 시약들, 보호/탈보호 요법들 등의 선택에 의한 것으로 잠재적인 문제점들을 회피할 가능성이 있어야 한다.
정의
항체："항체(antibody)"라는 용어는 그 가장 넓은 의미로 사용되며, 단일클론 항체들, 다클론 항체들, 이합체(dimer)들, 다합체(multimer)들, 다중 특이 항체들(예를 들어, 이중 특이 항체들), 덧댐 항체들, 항체 단편(fragment)들 및 작은 면역 단백질(SIP)들을 포괄한다("Int. J. Cancer"(102, 75-85(2002) 참조). 항체는 특정 항원을 인식하고, 결합될 수 있는 면역 시스템에 의해 생성되는 단백질이다. 표적 항원은 대체로 다중의 항체들에 대한 CDR들에 의해 인식되는 에피토프(epitope)들로도 호칭되는 수많은 결합 부위들을 가진다. 다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 각 항체는 다른 구조를 가진다. 이에 따라, 하나의 항원이 하나 이상의 대응되는 항체를 가질 수 있다. 항체는 전장(full-length) 면역글로불린(immunoglobulin) 분자, 즉 관심의 대상인 표적의 항원 또는 이의 일부에 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자의 전장 면역글로불린 분자 또는 면역 활성 부분을 포함한다. 상기 항체들은 IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA와 같은 임의의 유형, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2와 같은 임의의 클래스, 또는 이의 서브 클래스가 될 수 있다. 상기 항체는 쥐, 인간, 토끼 또는 다른 종들이거나 이들로부터 유래될 수 있다.
항체 단편들："항체 단편(antibody fragment)"이라는 용어는 전장 항체의 일부, 일반적으로 항원 결합 또는 이의 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편들; 이중체(diabody)들; 선형 항체들; dAbs, 카멜리드(camelid) VHH 항체들 및 연골어류의 IgNAR 항체들을 포함하는 단일 도메인 항체들을 포함한다. 항체들 및 이들의 단편들은 선택적인 비-면역글로불린 스캐폴드(scaffold)들, 펩티드 앱타머(aptamer)들, 핵산 앱타머들, 비-펩티드 골격에 대향되는 폴리펩티드 루프들을 포함하는 구조화 폴리펩티드들, 천연 수용체들 또는 이들의 도메인들을 기반으로 하는 결합 분자들에 의해 대체될 수 있다.
유도체：유도체는 화합물의 화학적 변형을 포함한다. 이러한 변형들의 예들은 할로기, 알킬기, 아실기, 아미노기 및 이들과 유사한 것에 의한 수소의 대체를 포함한다. 상기 변형은 하나 또는 그 이상의 수소 결합 상호작용들, 전하 상호작용들, 소수성 상호작용들, 반 데르 발스 상호작용들 및/또는 쌍극자 상호작용들을 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
유사체：이러한 용어는 임의의 거울상 이성질체(enantiomer)들, 라세미체(racemate)들 및 입체 이성질체(stereoisomer)들 뿐만 아니라 이러한 화합물들의 모든 약학적으로 허용 가능한 염들 및 수화물들을 포괄한다.
달리 기재되지 않는 한, 다음의 정의들은 본 발명의 화합물들 및 이러한 화합물들을 포함하는 조성물들의 연결에 사용되는 화학적 표현에 적용된다.
알킬은 분기되거나 분기되지 않은 포화 하이드로카르빌(hydrocarbyl) 라디칼을 지칭한다. 적합하게는, 알킬기는 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 30의 탄소 원자들, 보다 바람직하게는 5 내지 25의 탄소 원자들을 포함한다. 바람직하게는, 알킬은 메틸, 에킬, 프로필, 부틸, 펜틸, 또는 헥실을 지칭한다.
알케닐은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 결합들을 포함하는 분기되거나 분기되지 않은 라디칼을 지칭한다. 적합하게는, 알케닐기는 2 내지 30의 탄소 원자들, 바람직하게는 5 내지 25의 탄소 원자들을 포함한다.
알키닐은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 삼중 결합들을 포함하는 분기되거나 분기되지 않은 하이드로카르빌 라디칼을 지칭한다. 적합하게는, 알키닐기는 약 3 내지 약 30의 탄소 원자들, 예를 들면 약 5 내지 약 25의 탄소 원자들을 포함한다.
할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 불소 또는 염소를 지칭한다.
시클로알킬은 적합하게는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 탄소 원자들을 가지는 알리시클릭(alicyclic) 모이어티를 지칭한다. 이러한 기는 가교된 또는 폴리시클릭 고리 시스템이 될 수 있다. 보다 흔하게는 시클로알킬기들은 모노시클릭이다. 이러한 용어는 시클로프로필(cyclopropyl), 시클로부틸(cyclobutyl), 시클로펜틸(cyclopentyl), 시클로헥실(cyclohexyl), 노르보르닐(norbornyl), 비시클로(bicyclo)[2.2.2]옥틸(octyl) 및 이들과 유사한 것과 같은 기들에 대한 언급을 포함한다.
아릴은 적합하게는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 고리 탄소 원자들을 포함하는 방향족 카르보시클릭 고리 시스템을 지칭한다. 아릴은 적어도 하나가 방향족인 둘 또는 그 이상의 고리들을 가지는 폴리시클릭 고리 시스템이 될 수 있다. 이러한 용어는 페닐(phenyl), 나프틸(naphthyl), 플루오레닐(fluorenyl), 아줄레닐(azulenyl), 인데닐(indenyl), 안트릴(anthryl) 및 이들과 유사한 것과 같은 기들에 대한 언급을 포함한다.
헤테로(hetero)라는 접두어는 여기서 이러한 기의 탄소 원자들 중의 하나 또는 그 이상이 질소, 산소, 인, 실리콘 또는 황으로 치환될 수 있는 것을 의미한다. 헤테로알킬기들은, 예를 들면, 알킬록시기(alkyloxy group)들 및 알킬티오기(alkythio group)들을 포함한다. 헤테시클로알킬기 또는 헤테로아릴기는 여기서 적어도 하나가 질소, 산소, 인, 실리콘 및 황으로부터 선택되는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 또는 16의 고리 원자들을 포함할 수 있다. 특히, 3- 내지 10-원자의 고리 또는 고리 시스템 및 보다 상세하게는 포화되거나 불포화될 수 있는 5- 또는 6-원자의 고리를 포함한다. 예를 들면, 옥시라닐(oxiranyl), 아지리닐(azirinyl), 1,2-옥사티올라닐(oxathiolanyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 티에닐(thienyl), 푸릴(furyl), 테트라하이드로푸릴(tetrahydrofuryl), 피라닐(pyranyl), 티오피라닐(thiopyranyl), 티안트레닐(thianthrenyl), 이소벤조푸라닐(isobenzofuranyl), 벤조푸라닐(benzofuranyl), 크로메닐(chromenyl), 2H-피프롤릴(pyrrolyl), 피르롤릴(pyrrolyl), 피르롤리닐(pyrrolinyl), 피프롤리디닐(pyrrolidinyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이미다졸리디닐(imidazolidinyl), 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 티아졸릴(thiazolyl), 이소티아졸릴(isothiazolyl), 디티아졸릴(dithiazolyl), 옥사졸릴(oxazolyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), 피리딜(pyridyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피페리딜(piperidyl), 피페라지닐(piperazinyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 모르폴리닐(morpholinyl), 티오모르폴리닐(thiomorpholinyl), 특히 티오모르폴리노(thiomorpholino), 인돌리지닐(indolizinyl), 1,3-디옥소(dioxo)-1,3-디하이드로(dihydro)-이소인돌릴(isoindolyl), 3H-인돌릴(indolyl), 인돌릴(indolyl), 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl), 쿠마릴(cumaryl), 인다졸릴(indazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 테트라졸릴(tetrazolyl), 푸리닐(purinyl), 4H-퀴놀리지닐(quinolizinyl), 이소퀴놀릴(isoquinolyl), 퀴놀릴(quinolyl), 테트라하이드로퀴놀릴(tetrahydroquinolyl), 테트라하이드로이소퀴놀릴(tetrahydroisoquinolyl), 데카하이드로퀴놀릴(decahydroquinolyl), 옥타하이드로이소퀴놀릴(octahydroisoquinolyl), 벤조푸라닐(benzofuranyl), 디벤조푸라닐(dibenzofuranyl), 벤조티오페닐(benzothiophenyl), 디벤조티오페닐(dibenzothiophenyl), 프탈라지닐(phthalazinyl), 나프티리디닐(naphthyridinyl), 퀴녹살릴(quinoxalyl), 퀴나졸리닐(quinazolinyl), 신놀리닐(cinnolinyl), 프테리디닐(pteridinyl), 카르바졸릴(carbazolyl), [베타(beta)]-카르볼리닐(carbolinyl), 페난트리디닐(phenanthridinyl), 아크리디닐(acridinyl), 페리미디닐(perimidinyl), 페난트롤리닐(phenanthrolinyl), 푸라자닐(furazanyl), 페나지닐(phenazinyl), 페노티아지닐(phenothiazinyl), 페녹사지닐(phenoxazinyl), 크로메닐(chromenyl), 이소크로마닐(isochromanyl), 크로마닐(chromanyl), 3,4-디하이드로(dihydro)-2H-이소퀴놀린(isoquinolin)-1-온(one), 3,4-디하이드로(dihydro)-2H-이소퀴놀리닐(isoquinolinyl), 그리고 이들과 유사한 것들로부터 선택될 수 있다.
"치환된"은 상기 모이어티 내의 수소 원자들의 하나 또는 그 이상, 구체적으로는 5까지, 보다 구체적으로는 1, 2 또는 3이 대응되는 숫자의 치환기들로 서로 독립적으로 대체되는 것을 의미한다. 여기에 사용되는 바와 같은 "선택적으로 치환된"이라는 용어는 치환된 또는 치환되지 않은 것을 포함한다. 물론, 치환기들이 특정한 치환이 가능한 지에 대한 부당한 노력 없이 해당 기술 분야의 숙련자가 결정할(실험적으로 또는 이론적으로) 수 있는 화학적으로 가능한 위치들에 있는 것만으로 이해될 수 있다. 예를 들면, 유리 수소를 가지는 아미노기 또는 하이드록시기는 불포화(예를 들어, 올레핀) 결합들을 가지는 탄소 원자들에 결합될 경우에 불안정할 수 있다. 바람직하게는, "치환된"이라는 용어는 상기 모이어티 내의 수소 원자들의 하나 또는 그 이상, 구체적으로는 5까지, 보다 구체적으로는 1, 2 또는 3이 OH, SH, NH2, 할로겐, 시아노, 카르복시, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되는 대응되는 숫자의 치환기들로 서로 독립적으로 대체되는 것을 의미한다. 또한, 여기에 설명되는 치환기들은 해당 기술 분야의 숙련자에게 이해되는 바와 같은 적절한 치환들에 대한 앞서 언급한 제한에 종속하여 임의의 치환기로 자체적으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 앞서 언급한 치환기들 중에서 임의의 것은 앞서 언급한 치환기들 중에서 임의의 것으로 더 치환될 수 있으며, 이들 각각은 앞서 언급한 치환기들 중에서 임의의 것에 의해 더 치환될 수 있다.
치환기들은 적합하게는 CF3 및 CCl3과 같은 할로겐 원자들 및 할로메틸기들; 옥소, 하이드록시, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시, 알코일, 알코일록시, 아릴록시, 아릴로일 및 아릴로일록시와 같은 산소를 함유하는 기들; 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 시아노, 아지드 및 니트로와 같은 질소를 함유하는 기들; 티올, 알킬티올, 술포닐 및 술폭시드와 같은 황을 함유하는 기들; 자체적으로 치환될 수 있는 헤테로시클릭기들; 자체적으로 치환될 수 있는 알킬기들; 그리고 페닐 및 치환된 페닐과 같이 자체적으로 치환될 수 있는 아릴기들을 포함할 수 있다. 알킬은 치환된 및 치환되지 않은 벤질을 포함한다.
둘 또는 그 이상의 모이어티들이 원자들 또는 기들의 목록으로부터 "각기 독립적으로" 선택되는 것으로 기재되는 경우, 이는 상기 모이어티들이 동일할 수 있거나 다를 수 있는 것을 의미한다. 각 모이어티의 식별은 이에 따라 하나 또는 그 이상의 다른 모이어티들의 식별들에 의존한다.
참조의 편의를 위해, 여기에 개시되는 일부 화합물들의 숫자들과 구조들이 다음의 표 2, 표 3 및 표 4에 요약된다. 의심스러울 경우에는, 상기 숫자들과 구조들은 조절된다.
| # | 구조 | ||
| 1 |
 |
||
| 2 |
 |
||
| 3 |
 |
||
| 4 |
 |
||
| 5 |
 |
||
| 6 |
 |
||
| 7 |
 |
||
| 8 |
 |
||
| 9 |
 |
||
| 10 |
 |
||
| 11 |
 |
||
| 12 |
 |
||
| 13 |
 |
||
| 14 |
 |
||
| 15 |
 |
||
| 18 |
 |
||
| 21 |
 |
||
| 26 |
 |
||
| 27 |
 |
||
| 30 |
 |
||
| 31 |
 |
||
| 34 |
 |
||
| 34a |
 |
||
| 35 |
 |
||
| 36 |
 |
||
| 37 |
 |
||
| 37a |
 |
||
| 38 |
 |
||
| 39 |
 |
||
| 40 |
 |
||
| 41 |
 |
||
| 42 |
 |
||
| 43 |
 |
||
| 43a |
 |
||
| 44 |
 |
||
| 45 |
 |
||
| 46 |
 |
||
| 47 |
 |
||
| 48 |
 |
||
| 49 |
 |
||
| 50 |
 |
||
| 51 |
 |
||
| 52 |
 |
||
| 53 |
 |
||
| 54 |
 |
||
| 55 |
 |
||
| 56 |
 |
||
| 57 |
 |
||
| 58 |
 |
||
| AA로부터 유래된 R | |||
| 58a | 글리신 | ||
| 58b | 알라닌 | ||
| 58c | 발린 | ||
| 58d | 이소류신 | ||
| 58e | 프롤린 | ||
| 58f | 아르기닌 | ||
| 59 |
 |
||
| R | R' | ||
| 59a | H | H | |
| 59b | CH3 | H | |
| 59c | CH3 | CH3 | |
| 60 |
 |
||
| R | R' | ||
| 60a | H | H | |
| 60b | CH3 | H | |
| 60c | CH3 | CH3 | |
| 62 |
 |
||
| 63 |
 |
||
| 63a |
 |
||
| 64 |
 |
||
| 65 |
 |
||
| 66 |
 |
||
| 67 |
 |
||
| 68 |
 |
||
| 69 |
 |
||
| 69a |
 |
||
| # | 구조 |
| P3 |
 |
| P4 |
 |
| P5 |
 |
| P6 |
 |
| P7 |
 |
| P8 |
 |
| P9 |
 |
| P10 |
 |
| P11 |
 |
| P12 |
 |
| P13 |
 |
| P14 |
 |
| P15 |
 |
| # | 구조 |
| H6 |
 |
| 16 |
 |
| 17 |
 |
| 19 |
 |
| 20 |
 |
| 22 |
 |
| 23 |
 |
| 24 |
 |
| 25 |
 |
| 28 |
 |
| 29 |
 |
| 32 |
 |
| 33 |
 |
물질들 및 방법들
일반적 사항들 및 절차들
수율들은 크로마토그래피로 정제된 화합물들에 대해 언급된다.
양성자(1H) 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼들은 브루커(Bruker) AV400(400㎒) 분광계 상에 기록되었다. 변위들은 내부 기준으로서 잔여 용매를 이용하여 ppm으로 주어진다. 결합 상수(coupling constant)(J)들은 분리를 나타내는 데 사용되는 다음의 약어들로 ㎐로 기재된다. s＝단일항(singlet), d＝이중항(doublet), t＝삼중항(triplet), q＝사중항(quartet), m＝다중항(multiplet).
질량 분석(LC-ESI-MS) 스펙트럼들은 용제 A 및 용제 B(A＝0.1% 포름산[FA]이 있는 밀리포아(Millipore) 물, B＝MeCN과 0.1% 포름산[FA]이 있는 MeCN)의 선형 구배들로 2㎖/분의 유량으로 4.6㎜ x 56㎜ 인피니티랩 포로쉘(InfinityLab Poroshell) 120 EC-C18 칼럼을 이용하여 애질런트(Agilent) 1200 시리즈 LC 시스템과 결합된 애질런트 6100 시리즈 단일 사중극자(Series Single Quadrupole) MS 시스템 상에 기록되었다.
고해상도 질량 분석(HRMS) 스펙트럼들 및 분석 역상 초고성능 액상 크로마토그래피(Reversed-Phase Ultra Performance Liquid Chromatography：UPLC)는 용제 A 및 용제 B(A＝0.1% FA가 있는 밀리포아 물, B＝0.1% FA가 있는 MeCN)의 선형 구배들로 0.6㎖/분의 유량으로 130Å, 1.7㎛, 2.1㎜ x 50㎜ 액퀴티(ACQUITY) UPLC BEH C18 칼럼을 이용하여 PDA UV 검출기가 있는 워터스 액퀴티(Waters Acquity) UPLC H-클래스 시스템에 결합된 워터스 제보(Waters Xevo) G2-XS QTOF 상에 기록되었다.
예비 역상 고압 액상 크로마토그래피(RP-HPLC)가 용제 A 및 용제 B(A＝0.1% 트리플루오로아세트산[TFA]이 있는 밀리포아 물, B＝0.1% 트리플루오로아세트산[TFA]이 있는 MeCN)의 선형 구배들로 5㎖/분의 유량으로 110Å, 150㎜ x 10㎜을 페노메넥스 제미니(Phenomenex Gemini)® 5㎛ NX-C18 반분취 칼럼 이용하여 애질런트 1200 시리즈 시스템 상에서 수행되었다.
비교예 1：(S)-N-(2-(2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))-6-(3-(4-(3',6'-디하이드록시(dihydroxy)-3-옥소(oxo)-3H-스피로(spiro)[이소벤조푸란(isobenzofuran)-1,9'-크산텐(xanthene)]-5-카르보닐(carbonyl))피페라진(piperazin)-1-일(yl))프로폭시(propoxy))퀴놀린(quinoline)-4-카르복사미드(carboxamide)("HABERKORN-FLUO", 23)의 합성
단계 1：6-하이드록시(hydroxy)-4-퀴놀린카르복실산(quinolinecarboxylic acid)(H1)
H2O(5㎖) 중의 HBr 48wt.% 내의 6-메톡시퀴놀린(methoxyquinoline)-카르복실산(carboxylic acid)(250㎎, 1.08mmol, 1.0eq)의 용액이 130℃에서 2시간 동안 가열되었고, 이후에 오렌지색의 분말(292㎎, 1.08mmol, Quant. 수율)로서의 생성물을 얻도록 진공 하에서 농축되었다. MS(ES+) m/z 271(M+H)+.
단계 2：1-Boc-4-(3-하이드록시프로필(hydroxypropyl))피레라진(piperazine)(H2)
무수 K2CO3(815㎎, 5.91mmol, 1.1eq)이 3-브로모-1-프로판올(530㎖, 5.91mmol, 1.1eq)이 수반되어 건조 THF(15㎖) 내의 1-Boc-피페라진(1.0g, 5.37mmol, 1.0eq)의 용액에 첨가되었고, 반응 혼합물은 실온에서 72시간 동안 교반되었다. 휘발 물질들이 감소된 압력 하에서 제거되었고, 잔여물은 물로 희석되었으며, EtOAc로 추출되었고(두 번), 결합된 유기 층들은 Na2SO4 상부에서 건조되었으며, 여과되었고, 농축되었다. 원료는 무색의 오일(1.2g, 4.91mmol, 91% 수율)로서 상기 표제 화합물을 얻도록 속성 크로마토그래피(flash chromatography)(98：2 내지 90：10의 DCM/MeOH)로 정제되었다. MS(ES+) m/z 245 (M+H)+.
단계 3：3-(4-(삼차부톡시카르보닐(tert-butoxycarbonyl))피페라진(piperazin)-1-일(yl))프로필(propyl) 6-(3-(4-(삼차부톡시카르보닐(tert-butoxycarbonyl))피페라진(piperazin)-1-일(yl))프로폭시(propoxy))퀴놀린(quinoline)-4-카르복실세이트(carboxylate)(H3)
건조 THF(25㎖) 내의 H1(100㎎, 0.37mmol, 1.0eq), H2(180㎎, 0.74mmol, 2.0eq) 및 트리페닐포스핀(triphenylphosphine)(193㎎, 0.74mmol, 2.0eq)의 교반된 용액이 디이소프로필 아조디카르복실레이트(diisopropyl azodicarboxylate：DIAD; 145㎖, 0.74mmol, 2.0eq)로 처리되었다. 반응물은 실온에서 1시간 동안 교반되었고, 이후에 진공 하에서 농축되었으며, 백색의 분말(100㎎, 0.156mmol, 42% 수율)로서 상기 표제 화합물을 얻도록 속성 크로마토그래피(95：5 내지 90：10의 DCM/MeOH)에 의해 직접적으로 정제되었다. MS(ES+) m/z 642(M+H)+.
계획 1：비교예 1의 화합물 "HABERKORN-FLUO"(23)의 제조를 위한 합성 루트
단계 4：6-(3-(4-삼차부톡시카르보닐피페라진(tert-butoxycarbonylpiperazin)-1-일(yl))프로폭시(propoxy))퀴놀린(quinoline)-4-카르복실산(carboxylic acid)(H4)
THF(5㎖) 내의 H3(100㎎, 0.156mmol, 1.0eq)의 교반된 용액에 H2O(2㎖) 내의 LiOH(13㎎, 0.312mmol, 2.0eq)의 용액이 첨가되었고, 반응물은 실온에서 2시간 동안 교반되었다. 혼합물은 물로 희석되었고, EtOAc로 추출되었으며, NH4Cl s.s.로 세척되었고, Na2SO4 상부에서 건조되었으며, 백색의 분말(60㎎, 0.144mmol, 92% 수율)로서 생성물을 얻도록 여과되었다. MS(ES+) m/z 416(M+H)+.
단계 5：1-피페라진카르복실산(piperazinecarboxylic acid), 4-[3-[[4-[[[2-[(2S)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로(difluoro)-1-피르롤리디닐(pyrrolidinyl)]-2-옥소에틸(oxoethyl)]아미노(amino)]카르보닐(carbonyl)]-6-퀴놀리닐(quinolinyl)]옥시(oxy)]프로필(propyl)]-1,1-디메틸에틸 에스테르(dimethylethyl ester)(H5)
DCM(3㎖) 내의 H4(15㎎, 0.036mmol, 1.0eq), HATU(20㎎, 0.054mmol, 1.5eq) 및 HOBt(7.3㎎, 0.054mmol, 1.5eq)의 교반된 용액에 DMF(1.0㎖) 및 DIPEA(25㎖, 0.144mmol, 4eq) 내의 (S)-1-(2-아미노아세틸(aminoacetyl))-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidine)-2-카르보니트릴(carbonitrile)(10㎎, 0.054mmol, 1.5eq)의 용액이 첨가되었고, 반응물은 실온에서 9시간 동안 교반되었다. 혼합물은 진공 하에서 증발되었고, DMSO 내에 용해되었으며, 백색의 고체(6.0㎎, 0.01mmol, 28% 수율)로서 생성물을 얻도록 RP-HPLC로 정제되었다. MS(ES+) m/z 587(M+H)+.
단계 6：(S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))-6-(3-(피페라진(piperazin)-1-일(yl))프로폭시(propoxy))퀴놀린(quinoline)-4-카르복사미드(carboxamide)(H6)
MeCN(3㎖) 내의 H5(5.0㎎, 8.0μmol, 1.0eq) 및 4-메틸벤젠술폰산 단일 수화물(6.8㎎, 40μmol, 5.0eq)의 교반된 용액이 55℃에서 2시간 동안 가열되었다. 상기 혼합물은 진공 하에서 농축되었고, 다음과 같은 생성물이 후속 단계에서 사용되었다. 백색의 고체(8.0㎎, 8.0μmol, 정량(Quant.) 수율). MS(ES+) m/z 487(M+H)+.
단계 7：(S)-N-(2-(2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))-6-(3-(4-(3',6'-디하이드록시(dihydroxy)-3-옥소(oxo)-3H-스피로(spiro)[이소벤조푸란(isobenzofuran)-1,9'-크란센(xanthene)]-5-카르보닐(carbonyl))피페라진(piperazin)-1-일(yl))프로폭시(propoxy))퀴놀린(quinoline)-4-카르복사미드(carboxamide)("HABERKORN-FLUO", 23)
DMF(1㎖) 내의 H6(4.5㎎, 4.0μmol, 1.0eq.) 및 TEA(1.1㎖, 8.0μmol, 2.0eq)의 교반된 용액에 NHS-플루오레세인(fluorescein)(2.8㎎, 6.0μmol, 1.5eq)이 첨가되었고, 반응물은 실온에서 9시간 동안 교반되었다. 혼합물은 오렌지색의 분말(0.9㎎, 1.0μmol, 26% 수율)로서 생성물을 얻도록 직접 RP-HPLC로 정제되었다. MS(ES+) m/z 845(M+H)+(비교예 1B; 도 1의 (B) 참조).
실험예 2：(S)-N1-(4-((2-(2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbamoyl))퀴놀린(quinolin)-8-일(yl))-N4-(2-(2-(2-(3-(3',6'-디하이드록시(dihydroxy)-3-옥소(oxo)-3H-스피로(spiro)[이소벤조푸란(isobenzofuran)-1,9'-크세텐(xanthen)]-5-일(yl))티오우레이도(thioureido))에톡시(ethoxy))에톡시(ethoxy))에틸(ethyl))숙신이미드(succinimide)("ESV6-FLUO", 26)의 합성
단계 1：5,8-디옥사(dioxa)-2,11-디아자도데칸산(diazadodecanoic acid), 12-[(3',6'-디하이드록시(dihydroxy)-3-옥소스피로(oxospiro)[이소벤조푸란isobenzofuran]-1(3H), 9'-[9H]크세텐(xanthen)]-6-일(yl))아미노(amino)]-12-티옥소thioxo)-1,1-디메틸에텔 에스테르(dimethylethyl ester)(P1)
THF(20㎖) 내의 삼차부틸N-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸}카르바메이트(173㎖, 0.731mmol, 1.5eq)의 교반된 용액에, 플루오레세인-5-이소티오시아네이트(190㎎, 0.487mmol, 1.0eq)가 첨가되었고, 반응물은 실온에서 12시간 동안 교반되었다. 혼합물은 진공 하에서 농축되었고, 원료는 오렌지색의 분말(200㎎, 0.314mmol, 64% 수율)로서 화합물을 얻도록 속성 크로마토그래피(9：1 내지 8：2의 DCM/EtOAc)로 직접 정제되었다. MS(ES+) m/z 638(M+H)+.
단계 2：티오우레아(thiourea), N-[2-[2-(2-아미노에톡시(aminoethoxy))에톡시(ethoxy)]에틸(ethyl)]-N'-(3',6'-디하이드록시(dihydroxy)-3-옥소스피로(oxospiro)[이조벤조푸란(isobenzofuran)-1(3),9'-[9]크세텐(xanthen)]-5-일(yl))(P2)
0℃까지 냉각된 DCM(10㎖) 내의 P1(150㎎, 0.235mmol, 1.0eq)의 교반된 용액에 Et2O(5㎖) 내의 HCl 4M이 첨가되었다. 반응물은 교반되었고, 실온까지 2시간 동안 서서히 데워졌으며, 이후에 진공 하에서 농축되었고, 오렌지색의 분말이 얻어졌을 때까지 Et2O로 수 회 상호 증발되었다(135㎎, 0.235mmol, 정량 수율). MS(ES+) m/z 538(M+H)+.
계획 2：ESV6-FLUO(26)의 제조를 위한 합성 루트
단계 3：(S)-8-아미노(amino)-N-(2-(2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))퀴놀린(quinoline)-4-카르복사미드(carboxamide)(P3)
상업적으로 입수 가능한 8-아미노-퀴놀린-4-카르복실산(19.0㎎, 100μmol, 1.0eq), DIPEA(70.0㎕, 400μmol, 4.0eq) 및 HATU(38.0㎎, 100μmol, 1.0eq)가 1：1 DCM/DMF 혼합물(2㎖) 내에 용해되었다. 15분 후에 DCM 내의 (S)-1-(2-아미노아세틸)-4,4-디플루오로피르롤리딘-2-카르보니트릴 트리플루오로아세테이트(30.3㎎, 100μmol, 1.0eq)의 용액이 첨가되었다. 반응 혼합물은 1시간 동안 실온에서 교반되었고, 무롤 세척되었으며, Na2SO4 상부에서 건조되었고, 여과되었으며, 끈적끈적한 오일로서 갈색의 원료를 얻도록 농축되었다. 잔여물은 갈색을 띤 오일(24.8㎎, 68.9μmol, 69% 수율)로서 순수한 생성물을 산출하도록 속성 크로마토그래피(91：1 내지 90：10의 DCM/MeOH)로 정제되었다. MS(ES+) m/z 360(M+H)+.
단계 4：(S)-4-((4-((2-(2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbamoyl))퀴놀린(quinolin)-8-일(yl))아미노(amino))-4-옥소부탄산(oxobutanoic acid)(P4)
트리에틸아민(20.8㎕, 150μmol, 2.0eq) 및 4-디메틸아미노피리딘(0.91㎎, 10.0μmol, 0.1eq)이 DCM 내의 P3(26.8㎎, 70.0μmol, 1.0eq)의 냉각된 용액(0℃)에 첨가되었고, 숙신산 무수물(15.0㎎, 150μmol, 2.0eq)의 방울씩의 첨가가 수반되었다. 반응 혼합물은 실온까지 데워지도록 두어졌다. 상기 반응 혼합물은 전체 전환이 관찰되었을 때까지 예열된 40℃ 오일 배스 내에 놓여졌다. 용매가 증발되었고, 잔여물은 백색의 분말(9.42㎎, 20.0μmol, 28% 수율)로서 생성물을 산출하도록 RP-HPLC로 정제되었다. MS(ES+) m/z 460(M+H)+. 도 28은 실험예 2의 P4의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 도시한다. MS(ES+) m/z 460.21(M+H)+.
단계 5：(S)-N1-(4-((2-(2-시아노cyano-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbamoyl))퀴놀린(quinolin)-8-일(yl))-N4-(2-(2-(2-(3-(3',6'-디하이드록시(dihydroxy)-3-옥소(oxo)-3H-스피로(spiro)[이소벤조푸란(isobenzofuran)-1,9'-크세텐(xanthen)]-5-일(yl))티오우레이도(thioureido))에톡시(ethoxy))에톡시(ethoxy))에틸(ethyl))숙신아미드(succinamide)("ESV6-FLUO", 26)
P2(22.0㎎, 40.0μmol, 2.0eq) 및 HATU(15.6㎎, 40.0μmol, 2.0eq)가 1：1 DCM/DMF 혼합물(2㎖) 및 DIPEA(7.20㎕, 40.0μmol, 2.0eq) 내에 취해졌다. 결과적인 혼합물은 15분 동안 실온에서 교반되었다. DCM 내의 P4(9.42㎎, 20.0μmol, 1.0eq)가 첨가되었고, 반응 혼합물은 실온에서 하룻밤 동안 교반되었다. 용매는 증발되었고, 잔여물은 황색의 고체(2.50㎎, 10.0μmol, 25% 수율)로서 순수한 생성물을 얻도록 예비 RP-HPLC에 의해 정제되었다. MS(ES+) m/z 979(M+H)+(도 1의 (A)).
본 발명에 따른 다른 접합체들이 다음에 열거된다.
접합체 1：(2S,5R,8R,11R)-2-(((1-(6-(((S)-1-(((R)-1-((4-((5R, 8S,11R,12S)-11-((R)-이차부틸)-12-(2-((R)-2-((1S,2S)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-5,8-디이소프로필-4,10-디메틸-3,6,9-트리옥소-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데실)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-6-옥소헥실)-2,5-디옥소피르롤리딘-3-일)티오)메틸)-5,11-비스(카르복시메틸)-16-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-8-(3-구아니디노프로필)-4,7,10,13,16-펜타옥소-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산
접합체 2：(2S,5R,8R,11R)-8-(4-아미노부틸)-2-(((1-(6-(((S)-1-(((R)-1-((4-((5R,8S,11R,12S)-11-((R)-이차부틸)-12-(2-((R)-2-((1S,2S)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-5,8-디이소프로필-4,10-디메틸-3,6,9-트리옥소-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데실)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-6-옥소헥실)-2,5-디옥소피르롤리딘-3-일)티오)메틸)-5,11-비스(카르복시메틸)-16-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4,7,10,13,16-펜타옥소-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산
접합체 3：(2S,5R,8R,11R)-2-(((1-(6-(((S)-1-(((R)-1-((4-((5R, 8S,11R,12S)-11-((R)-이차부틸)-12-(2-((R)-2-((1S,2S)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피르롤리돈-1-일)-2-옥소에틸)-5,8-디이소프로필-4,10-디메틸-3,6,9-트리옥소-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데실)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-6-옥소헥실)-2,5-디옥소피르롤리딘-3-일)티오)메틸)-5,11-비스(카르복시메틸)-16-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-8-(3-구아니디노프로필)-4,7,10,13,16-펜타옥소-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산
접합체 4：N6-(4-((3-((3-(((2R)-1-(((14R,16R,33R,2S,4S,10E,12Z,14S)-86-클로로-14-하이드록시-85,14-디메톡시-33,2,7,10-테트라메틸-12,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤제나시클로테트라데카판-10,12-디엔-4-일)옥시)-1-옥소프로판-2-일)(메틸)아미노)-3-옥소프로필)티오)-2,5-디옥소피르롤리딘-1-일)메틸)시클로헥산-1-카르보닐)-N2-(4-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부타노일)-D-아스파르틸-D-아르기닐-D-아스파르틸-D-리신
접합체 5：(2R,5R,8R,11R)-5,11-비스(카르복시메틸)-16-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-2-((1-(14-((4-(4,7-디메틸-3,8,11-트리옥소-11-((2S,4S)-2,5,12-트리하이드록시-7-메톡시-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타하이드로-1H-피라노[4',3'：4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사하이드로테트라센-2-일)-2,9-디옥사-4,7-디아자운데실)페닐)카르바모일)-15-메틸-3,12-디옥소-7,10-디옥사-4,13-디아자헥사데실)-2,5-디옥소피르롤리딘-3-일)티오)-8-(3-구아디노프로필)-4,7,10,13,16-펜타옥소-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산
접합체 6：(10R,13R,16R,19R)-1-((3aR,4R,5S,10bR)-4-아세톡시-3a-에틸-9-((3S,5S,7S,9S)-5-에틸-5-하이드록시-9-(메톡시카르보닐)-1,4,5,6,7,8,9,10-옥타하이드로-2H-3,7-메타노[1]아자시클로운데시노[5,4-b]인돌-9-일)-5-하이드록시-8-메톡시-6-메틸-3a,3a1,4,5,5a,6,11,12-옥타하이드로-1H-인돌이지노[8,1-cd]카르바졸-5-일)-10-카르복시-13-(카르복시메틸)-19-(4-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄아미도)-16-(3-구아디노프로필)-1,4,12,15,18-펜타옥소-5-옥사-8,9-디티아-2,3,11,14,17-펜타아자헤니코산-21-오익산
접합체 7：2,2',2''-(10-(2-((2-(3-(((2S,5R,8R,11R)-8-(4-아미노부틸)-2-카르복시-5,11-비스(카르복시메틸)-16-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4,7,10,13,16-펜타옥소-3,6,9,12-테트라아자헥사데실)티오)-2,5-디옥소피르롤리딘-1-일)에틸)아미노)-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산
접합체 8：2,2',2''-(10-(1-카르복시-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄아미도)에틸)아미노)-4-옥소부틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산
접합체 9：177-루테튬으로 표지된 2, 2', 2''-(10-(1-카르복시-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄아미도)에틸)아미노)-4-옥소부틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산
접합체 10：225-악티늄으로 표지된 2, 2', 2''-(10-(1-카르복시-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄아미도)에틸)아미노)-4-옥소부틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산
접합체 11：64-구리로 표지된 2, 2', 2''-(10-(1-카르복시-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄아미도)에틸)아미노)-4-옥소부틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산
접합체 12：68-갈륨으로 표지된 (S)-3-((S)-2-아미노-6-(4-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄아미도)헥산아미도)-4-(((R)-1-카르복시-2-메르캅토에틸)아미노)-4-옥소부탄산
접합체 13：(S)-3-((S)-2-아미노-6-(4-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄아미도)헥산아미도)-4-(((R)-1-카르복시-2-메르캅토에틸)아미노)-4-옥소부탄산
접합체 14：99m-테크네튬으로 표지된 (S)-3-((S)-2-아미노-6-(4-((4-((2-((R)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄아미도)헥산아미도)-4-(((R)-1-카르복시-2-메르캅토에틸)아미노)-4-옥소부탄산
접합체 15：(2R,5S,8S,11S)-8-(4-아미노부틸)-5,11-비스(카르복시메틸)-16-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-2-(((1-(3',6'-디하이드록시-3-옥소-3H-스피로[이소벤조푸란-1,9'-크세텐]-5-일)-2,5-디디옥소피르롤리딘-3-일)티오)메틸)-4,7,10,13,16-펜타옥소-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산
실험예 3：플루오레세인 표지 결합체 "ESV6-FLUO"(26)의 특성화
인간 FAP의 발현
폴리히스티딘 표지된 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)의 아미노산 서열：
LRPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDHHHHHH
인산 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP; UniProtKB-Q12884(SEPR_HUMAN) 아미노산 25-760)이 이의 5'-에서의 분비 서열 및 이의 3'-말단에서의 6x 폴리히스티딘-표지로 pCDNA3.1(+) 내에서 복제되었고, 일과성 유전자 발현에 의해 CHO 세포들 내에서 발현되었다. 형질주입 혼합체는 다음과 같이 모아졌다. 106의 세포들에 대해 4 x 106 세포들/㎖의 세포 밀도로 0.625㎍의 플라스미드(plasmid) DNA, 2.5㎍의 폴리에틸렌이민(PEI). 세포들은 6일 동안 37℃에서, 5% CO2, 120rpm으로 배양되었다. 세포들은 원심분리(4500rpm, 30분, 4℃)에 의해 수확되었고, 1㎖(건조 부피)의 완전한 His-표지 정제 레진(resin)이 여과된 상청액(supernatant)에 첨가되었으며, 2시간 동안 120rpm으로 실온에서 배양되었다. 레진은 800㎖의 물-완충액(이미다졸 10mM, PBS/NaCl 250mM)으로 세척되었고, hFAP가 250mM 이미다졸 PBS/NaCl 250mM으로 용리되었다. 용리 부분들(1.5㎖)은 280㎚에서 흡수도에 대해 분광 광도계(spectrophotometer) 상에서 점검되었다. hFAP가 풍부한 일부들이 모아졌고, HEPES-완충액(50mM HEPES, 100mM NaCl, pH＝7.4)에 대해 투석되었다.
재조합 hFAP의 샘플들이 SDS-PAGE 및 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)(도 2의 (A)：SDS-PAGE, (B)：사이즈 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex) 200 인크리스(Increase) 10/300 GL) 참조)로 분석되었으며, 효소의 활성이 억제-분석에서 확인되었다("생체 외의 인간 FAP 효소 IC50 분석" 부문 참조).
형광 분극에 의한 인간 FAP에 대한 친화도 측정(도 4)
형광 분극 측정들이 384-웰(well) 플레이트들(비결합, ps, f-바닥, 흑색, 높은 부피, 30㎕의 최종 부피) 내에서 수행되었다. 결합체들의 최종 농도가 10nM로 유지되면서 인간 FAP(4μM)의 저장 용액은 완충액(50mM 트리스(Tris), 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH＝7.4)으로 연속하여 희석되었다. 측정들은 37℃에서 30분 동안 어둠속에서의 배양 후에 형광 분극에 의해 수행되었다(도 4). ESV6-플루오(fluo)는 앞서 설명한 리간드인 하베르코른-플루오(Haberkorn-fluo)(0.89nM의 KD)에 비하여 hFAP에 대해 보다 높은 친화도(0.78nM의 KD)를 나타낸다.
생체 외의 인간 FAP 효소 IC
50
분석(도 5)
Z-Gly-Pro-AMC 기질 상의 인간 FAP의 효소 활성은 360㎚의 여기 파장 및 465㎚의 방출 파장에서 형광을 추적 관찰하면서 마이크로티터(microtiter) 플레이트 판독기 상에서 실온에서 측정되었다. 반응 혼합물은 30㎕의 전체 부피 내에 20μM 기질, 20nM 인간 FAP, 분석 완충액(50mM 트리스, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH＝7.4) 및 억제제(10-6M 내지 10-11M 사이의 범위)를 포함하였다. IC50 값은 기질의 첨가 이전에 37℃에서 효소로 30분의 전배양(preincubation) 후에 50%로 효소 활성을 감소시키는 것이 요구되는 억제제의 농도로 정의된다.
억제제 저장 용액들(200mM)이 DMSO 내에 제조되었다. 실험의 개시 바로 이전에, 상기 저장물들은 1：2 연속 희석물들이 제조되는 분석 완충액 내에서 10-6M까지 더 희석되었다. 모든 측정들은 세 번 이루어졌다.
도 5는 작은 유기 리간드들의 존재에서의 hFAP 억제 실험을 도시한다. ESV6 리간드(P3)는 앞서 설명한 리간드인 하베르코른 리간드(H6)(24.6nM)에 비하여 보다 낮은 IC50(20.2nM)을 나타낸다.
리간드-단백질 복합체들의 크로마토그래피 공동 용리 실험들(도 3)
PD-10 칼럼이 복합체의 로딩 이전에 분석 완충액(50mM 트리스, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH＝7.4)으로 미리 평형화되었다. 인간 FAP(2μM) 및 플루오레세인-표지 결합체들(6μM)이 30분 동안 37℃에서 어둠속에서 배양되었다. 혼합물이 적재되었고, 상기 칼럼은 분석 완충액을 사용하여 세정되었다. 통과 액은 96-웰 플레이트들 내에 수집되었고, 485㎚의 여기 파장 및 535㎚의 방출 파장에서 형광을 추적 관찰하면서 형광이 TECAN 마이크로티터 플레이트 판독기 상에서 즉시 측정되었다. 단백질 양들은 나노드롭(Nanodrop) 2000/2000c 분광 광도계를 이용하여 280nM에서 흡수도를 측정하여 산정되었다.
도 3은 저분자 리간드들인 ESV6-플루오와 하베르코른-플루오 및 hFAP의 공동 용리 PD-10 실험을 도시한다. 안정한 복합체가 hFAP 및 작은 리간드들인 ESV6-플루오와 하베르코른-플루오 사이에 형성된다.
해리 속도 측정(도 6)
koff 값들을 결정하는 형광 분극 측정들이 384-웰 플레이트들(비결합, ps, f-바닥, 흑색, 높은 부피, 30㎕의 최종 부피) 내에서 수행되었다. 측정들은 37℃에서 어둠속에서 1.0μM의 일정한 농도로 인간 FAP로 2.0nM 플루오레세인-표지 결합체들의 전배양 후에 수행되었다. 상기 플루오레세인-표지 화합물의 해리는 대응되는 플루오레세인이 없는 결합체들(각기 실험예 2의 단계 3에서 얻어진 화합물 P3 및 비교예 1의 단계 6에서 얻어진 화합물 H6, 각기 20μM의 최종 농도)을 과도하게 첨가하여 유도되었다.
도 6은 hFAP로부터의 ESV6-플루오 및 하베르코른-플루오의 해리 속도 측정들의 결과들을 도시한다. ESV6-플루오는 하베르코른-플루오(회귀 계수(regression coefficient)＝-0.075112)에 비하여 보다 느린 속도로 해리된다(회귀 계수＝-0.093564).
본 발명의 비교예 1의 화합물("하베르코른-플루오(HABERKORN-FLUO)")은 종래 기술의 개시 사항, 특히 종래 기술(WO 제2019/154886호 및 WO 제2019/154859호)에 기재되어 있는 리간드 FAPI-04의 구조를 대표하는 것으로 간주될 수 있다. 위의 결과들은 본 발명에 따른 화합물들이 hFAP와 안정한 복합체를 형성할 뿐만 아니라 놀랍게도 종래 기술과 비교할 경우에 상당히 증가된 친화도(보다 낮은 KD), 증가된 억제 활성(보다 낮은 IC50), 그리고 보다 느린 해리의 속도를 나타내는 것을 보여준다.
실험예 4：종양 모델들에서의 비교 실험들
파트 1-접합체들의 제조
삼차부틸(tert-butyl)(8-아미노퀴놀린(aminoquinoline)-4-카르보닐(carbonyl))글리시네이트(glycinate)의 합성
계획 3：삼차부틸(8-아미노퀴놀린-4-카르보닐)글리시네이트의 제조 합성을 위한 합성 루트
DIPEA(185㎕, 1.063mmol, 4eq)가 300㎕의 DMF 및 3㎖의 DCM 내의 삼차부틸 글리시네이트 하이드로클로라이드(89㎎, 0.532mmol, 2.0eq), 8-아미노퀴놀린-4-카르복실산(50㎎, 0.266mmol, 0.1eq) 및 HATU(111㎎, 0.292mmol, 1.1eq)의 교반된 용액에 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 1시간 동안 교반되었다. 혼합물은 진공 하에서 농축되었고, 원료 물질은 갈색의 오일(70㎎, 0.232mmol, 87.5%)로서 삼차부틸(8-아미노퀴놀린-4-카르보닐)글리시네이트를 산출하도록 속성 크로마토그래피(100% 내지 9.5：0.5의 DMC/MeOH)에 의해 직접 정제되었다. MS(ES+) m/z 302.14(M+H)+
4-((4-((2-(삼차부톡시(tert-butoxy))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbamoyl))퀴놀린(quinolin)-8-일(yl))아미노(amino))-4-옥소부탄산(oxobutanoic acid)의 합성
계획 4：4-((4-((2-(삼차부톡시)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산의 제조를 위한 합성 루트
4-디메틸아미노피리딘(14㎎, 0.116mmol, 0.5eq)이 THF(3㎖) 내의 삼차부틸(8-아미노퀴놀린-4-카르보닐)글리시네이트(70㎎, 0.232mmol, 1.0eq) 및 디하이드로푸란-2, 5-디온(232㎎, 2.324mmol, 10.0eq)의 교반된 용액 내에 첨가되었다. 반응물은 50℃에서 6시간 동안 가열되었다. 혼합물은 진공 하에서 농축되었고, DCM 내에서 희석되었으며, 물로 세척되었다. 유기 상이 진공 하에서 농축되었고, 갈색의 오일(50㎎, 0.125mmol, 83.3%)로서 화합물을 얻도록 속성 크로마토그래피(9：1 내지 7：3의 DMC/MeOH)로 정제되었다. MS(ES+) m/z 402.16(M+H)+
온-레진(on-resin) Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc의 합성
계획 5：온-레진 Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc의 제조를 위한 합성 루트
상업적으로 입수 가능한 텐타겔(Tentagel) 레진 상의 전-적재된(pre-loaded) Fmoc-Cys(Trt)(500㎎, 0.415mmol, RAPP 폴리메레(Polymere))가 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창되었고, Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페리딘(1 x 1분 x 5㎖ 및 2 x 10분 x 5㎖)으로 제거되었으며, 상기 레진은 DMF(6 x 1분 x 5㎖)으로 세척되었다. 펩티드는 Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(NHBoc)-OH 및 Fmoc-Asp(tBu)-OH으로 나타낸 순서로 신장되었다. 이러한 목적을 위해, Fmoc 보호 아미노산(2.0eq), HBTU(2.0eq), HOBt(2.0eq) 및 DIPEA(4.0eq)가 DMF(5㎖) 내에 용해되었다. 혼합물은 0℃에서 10분 동안 두어졌고, 이후에 부드러운 요동 하에서 상기 레진과 1시간 동안 반응되었다. DMF(6 x 1분 x 5㎖)로의 세척 후에 상기 Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페리딘(1 x 1분 x 5㎖ 및 2 x 10분 x 5 ㎖)으로 제거되었다. 탈보호 단계들이 이후의 아미노산과의 결합 이전에 DMF(6 x 1분 x 5㎖)로의 세척 단계들에 수반되었다.
(2R,5S,8S,11R)-8-(4-아미노부틸(aminobutyl))-5,11-비스(bis)(카르복시메틸(carboxymethyl))-16-((4-((카르복시메틸(carboxymethyl))카르바모일(carbamoyl))퀴놀린(quinolin)-8-일(yl))아미노(amino))-2-(메르캅토메틸(mercaptomethyl))-4,7,10,13,16-펜타옥소(pentaoxo)-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산(tetraazahexadecanoic acid)의 합성
계획 6：(2R,5S,8S,11R)-8-(4-아미노부틸)-5,11-비스(카르복시메틸)-16-((4-((카르복시메틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-2-(메르캅토메틸)-4,7,10,13,16-펜타옥소-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산(SH-Cys-Asp-Lys-Asp-QCOOH)의 제조를 위한 합성 루트
온-레진 Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc(50㎎, 0.025mmol)가 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창되었다. 펩티드는 4-((4-((2-(삼차부톡시)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산(20㎎, 0.05mmol, 2.0eq), HATU(19㎎, 0.05mmol, 2.0eq) 및 DIPEA(17㎕, 0.1mmol, 4.0eq)로 신장되었고, 부드러운 요동 하에서 반응하도록 1시간 동안 두어졌다. DMF(6 x 1분 x 5㎖)로의 세척 후, 화합물은 DCM 내의 TFA(15%), TIS(2.5%) 및 H2O(2.5%)의 혼합물로 상기 레진을 4시간 동안 실온에서 요동시켜 분열되었다. 상기 레진은 메탄올(2 x 5㎖)로 세척되었고, 결합된 분열 및 세척 용액들은 진공 하에서 농축되었다. 원료 생성물은 역상 HPLC(20분 이내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%, TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 백색의 고체(2.4㎎, 0.003mmol, 12%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 807.45(M+H)+
(2R,5S,8S,11S)-8-(4-아미노부틸(aminobutyl))-5,11-비스(bis)(카르복시메틸(carboxymethyl))-16-(4-(3-((4-((2-((S)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbamoyl))퀴놀린(quinolin)-6-일(yl))옥시(oxy))프로필(propyl))피페라진(piperazin)-1-일(yl))-2-(메르캅토메틸(mercaptomethyl))-4,7,10,13,16-펜타옥소(pentaoxo)-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산(tetraazahexadecanoic acid)의 합성
계획 7：(2R, 5S, 8S, 11S)-8-(4-아미노부틸)-5,11-비스(카르복시메틸)-16-(4-(3-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린)-6-일)옥시)프로필)피페라진-1-일)-2-(메르캅토메틸)-4,7,10,13,16-펜타옥소-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산(SH-Cys-Asp-Lys-Asp-HK)의 제조를 위한 합성 루트
온-레진 Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc(60㎎, 0.03mmol)가 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창되었다. 펩티드는 (S)-4-(4-(3-((4-((2-(2-cyano-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-yl)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-6-일)옥시)프로필)피페라진-1-일)-4-옥소부탄산(17.5㎎, 0.03mmol, 1.0eq), HATU(22㎎, 0.06mmol, 2.0eq) 및 DIPEA(200㎕, 1.2mmol, 40eq)로 신장되었으며, 부드러운 요동 하에서 반응되도록 1시간 동안 두어졌다. DMF(6 x 1분 x 5㎖)으로의 세척 후, 화합물은 DCM 내의 TFA(15%), TIS(2.5%) 및 H2O(2.5%)의 혼합물로 4시간 동안 실온에서 상기 레진을 요동시켜 분열되었다. 상기 레진은 메탄올(2 x 5㎖)로 세척되었고, 결합된 분열 및 세척 용액들은 진공 하에서 농축되었다. 원료 생성물은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)에 의해 정제되었고, 백색의 고체(1㎎, 0.95μmol, 0.3%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 1048.39(M+H)+
(2R, 5S, 8S, 11S)-8-(4-아미노부틸(aminobutyl))-5, 11-비스(bis)(카르복시메틸(carboxymethyl))-16-((4-((2-((S)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbamoyl))퀴놀린(quinolin)-8-일(yl))아미노(amino))-2-(메르캅토메틸(mercaptomethyl))-4,7,10,13,16-펜타옥소(pentaoxo)-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산(tetraazahexadecanoic acid)의 합성
계획 8：(2R,5S,8S,11S)-8-(4-아미노부틸(aminobutyl))-5,11-비스(bis)(카르복시메틸(carboxymethyl))-16-((4-((2-((S)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbamoyl))퀴놀린(quinolin)-8-일(yl))아미노(amino))-2-(메르캅토메틸(mercaptomethyl))-4,7,10,13,16-펜타옥소(pentaoxo)-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸산(tetraazahexadecanoic acid)(SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6)의 제조를 위한 합성 루트
온-레진 Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc(80㎎, 0.04mmol)가 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창되었다. 펩티드는 (S)-4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산(37㎎, 0.08mmol, 2eq), HATU(30㎎, 0.08mmol, 2.0eq) 및 DIPEA(28㎕, 0.16mmol, 4.0eq)으로 신장되었고, 부드러운 요동 하에서 1시간 동안 반응되도록 두어졌다. DMF(6 x 1분 x 5㎖)로의 세척 후, 화합물은 DCM 내의 TFA(15%), TIS(2.5%) 및 H2O(2.5%)의 혼합물로 상기 레진을 4시간 동안 실온에서 요동시켜 분열되었다. 상기 레진은 메탄올(2 x 5㎖)로 세척되었고, 결합된 분열 및 세척 용액들은 진공 하에서 농축되었다. 원료 생성물은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 백색의 고체(1㎎, 0.95μmol, 0.3%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 921.29(M+H)+
"QCOOH-IRDye750"의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-QCOOH(140㎍, 0.174μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(800㎕) 내에 용해되었다. IRDye750 말레이미드(200㎍, 0.174μmol, 1.0eq)가 건조 DMF 용액(200㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 이내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 녹색의 고체(0.06μmol, 40%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 978(M+2H)2+
접합체 16："QCOOH-IRDye750"의 구조
"HABERKORN-IRDye750"의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-HK(181㎍, 0.174μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(800㎕) 내에 용해되었다. IRDye750 말레이미드(200㎍, 0.174μmol, 1.0eq)가 건조 DMF 용액(200㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 이내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)에 의해 정제되었고, 녹색의 고체(0.06μmol, 40%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 1099.8(M+2H)2+
접합체 17："HABERKORN-IRDye750"의 구조
ESV6-IRDye750의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6(160㎍, 0.174μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(800㎕) 내에 용해되었다. IRDye750 말레이미드(200㎍, 0.174μmol, 1.0eq)가 건조 DMF 용액(200㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 이내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 녹색의 고체(0.08μmol, 50%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 1036.3(M+2H)2+
접합체 18：ESV6-IRDye750의 구조
"QCOOH-ValCit-MMAE"의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-QCOOH(612㎍, 0.760μmol, 1.0eq)가as dissolved in PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해되었다. MC-ValCit-PAB-MMAE(1000㎍, 0.760μmol, 1.0eq)가 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)에 의해 정제되었고, 백색의 고체(322㎍, 20%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 2124.03(M+H)+
접합체 19："QCOOH-ValCit-MMAE"의 구조
"HABERKORN-ValCit-MMAE"의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-HK(795㎍, 0.760μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해되었다. MC-ValCit-PAB-MMAE(1000㎍, 0.760μmol, 1.0eq)이 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 이내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 백색의 고체(322㎍, 20%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 2364.18(M+H)+
접합체 20："HABERKORN-ValCit-MMAE"의 구조
"ESV6-ValCit-MMAE"의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6(700㎍, 0.760μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해되었다. MC-ValCit-PAB-MMAE(1000㎍, 0.760μmol, 1.0eq)가 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 이내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 백색의 고체(322㎍, 20%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 2236.07(M+H)+
접합체 21："ESV6-ValCit-MMAE"의 구조
도 26은 ESV6-ValCit-MMAE(21)의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 도시한다. MS(ES+) m/z 1118.05(M+2H)2+.
파트 2-동물 실험들
종양 세포 제조
해동에 따라, SK-MEL-187 종양 세포들이 37℃ 및 5% CO2에서 소 태아 혈청(10%, FBS) 및 안티바이오틱-안티미코틱(Antibiotic-Antimycotic)(1%, AA)으로 보강된 RPMI 배지 내에 배양되게 유지되었다. 패시징(passing)을 위해, 세포들은 90% 융합에 도달되었을 때에 트립신(Trypsin)-EDTA 0.05%를 이용하여 분리되었고, 1：4의 희석으로 재파종되었다.
IVIS 실험들
SK-MEL-187 이종 이식된 종양들이 상술한 바와 같이 암컷 무흉선(athymic) BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령) 내로 이식되었고, 0.1㎖의 평균 부피까지 성장하도록 두어졌다. 피하 SK-MEL-187 종양들이 있는 마우스들은 ESV6-IRDye750, HABERKORN-IRDye750 또는 QCOOH-IRDye750(150nmol/㎏, 멸균 PBS 내에 제조된 30μM 용액들로서, pH 7.4)이 정맥으로 주사되었다. 마우스들은 이소푸란으로 마취되었고, 형광 영상들이 IVIS 스펙트럼 영상화 시스템(제노겐(Xenogen), 노출 1s, 비닝 계수(binning factor) 8, 745㎚의 여기, 800㎚의 방출 필터, f수 2, 시야 13.1) 상에서 획득되었다. 영상들은 주사 후의 5분, 20분 및 1시간에 얻어졌다. 음식과 물이 이러한 기간 동안에 임의로 주어졌다. 마우스들은 이후에 CO2 질식(asphyxiation)으로 희생되었다(2시간의 시점). 혈액, 심장, 폐, 신장, 간, 지라, 위장, 장의 분절 및 상기 SK-MEL-187 종양이 수집되었고, 앞서 언급한 파라미터들을 이용하여 개별적으로 영상화되었다(도 7).
상세하게는, 도 7은 정맥 투여(150nmol/㎏의 도스) 후의 SK-MEL-187 흑색종 이종 이식편(xenograft)들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들의 근적외선 형광 영상화에서 IRDye 750 접합체들의 약물 표적화 성능의 평가를 도시한다. 도 7의 (A)는 다양한 시점들(주사 후의 5분, 20분 및 1시간)에서 살아있는 동물들의 영상들이며, 도 7의 (B)에는 2시간에서 생체 외의 조직 영상들이 제시된다. 높은 친화도의 FAP 리간드 "ESV6"의 유도체인 화합물 ESV6-IRDye750(18)은 HABERKORN-IRDye750에 비하여 보다 높은 종양-대-간, 종양-대-신장 및 종양-대-장 흡수 비율을 나타낸다. QCOOH-IRDye750(표적화되지 않은 대조군)은 SK-MEL-187 병변들에 생체 내로 국소화되지 않는다.
치료법 실험들
SK-MEL-187 이종 이식 종양들이 전술한 바와 같이 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령) 내로 이식되었고, 0.1㎖의 평균 부피까지 성장하도록 두어졌다. 마우스들은 3의 동물들의 치료 그룹들에 무작위로 할당되었다. HABERKORN-ValCit-MMAE(250nmol/㎏) 및 ESV6-ValCit-MMAE(250nmol/㎏)가 연속되는 7일 동안에 1%의 DMSO를 포함하는 멸균 PBS 용액으로서 매일 주사되었다. 종양들은 전자 캘리퍼(electronic caliper)로 측정되었고, 동물들은 매일 계량되었다. 종양 부피(㎣)는 (긴 측면, ㎜) x (짧은 측면, ㎜) x (짧은 측면, ㎜) x 0.5로의 식으로 계산되었다(도 8). 프리즘(Prism) 6 소프트웨어(그래프패드(GraphPad) 소프트웨어)가 데이터 분석을 위해 이용되었다(본페로니 테스트(Bonferroni test)가 수반되는 정규 이원 분산 분석(two-way ANOVA)).
상세하게는, 도 8은 SK-MEL-187 종양이 있는 마우스들에서 ESV6-ValCit-MMAE 및 HABERKORN-ValCit-MMAE의 치료 활성의 평가를 도시한다. 데이터 포인트들은 평균 종양 부피±SEM을 나타낸다(그룹 당 n＝3). 도 8의 (A)에서 화살표들은 IV 감염의 다른 치료들을 나타낸다. 높은 친화도의 FAP 리간드 "ESV6"의 약물 접합체 유도체인 ESV6-ValCit-MMAE는 HABERKORN-ValCit-MMAE와 비교할 경우에 보다 강한 효능의 항종양 효과를 나타낸다. 도 8의 (B)는 실험 동안에 동물들의 체중의 변화들(%)로 평가될 경우에 상이한 치료들의 내성을 나타낸다. ESV6-ValCit-MMAE는 HABERKORN-ValCit-MMAE와 비교할 경우에 보다 낮은 급성 독성을 나타낸다.
실험예 5：방사선 표지를 위한 접합체들의 제조
"HABERKORN-DOTA"의 합성
(S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-6-(3-(피페라진-1-일)프로폭시)퀴놀린-4-카르복사미드(15㎎, 0.030mol, 1.0eq), HATU(13㎎, 0.039mmol, 1.1eq) 및 삼차부틸-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세테이트(19㎎, 0.039mmol, 1.1eq)가 DCM/MDF(800㎕/50㎕) 내에 용해되었다. DIPEA(18㎕, 0.101mmol, 3eq)이 방울씩 첨가되었고, 반응물은 실온에서 1시간 동안 교반되었다. 원료 생성물은 TFA(40%)로 하룻밤 동안 처리되었고, 역상 HPLC(20분 이내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었으며, 백색의 고체(4㎎, 15%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 873.4(M+H)+
접합체 22："HABERKORN-DOTA"의 구조
"ESV6-DOTA"(8)의 합성
(S)-4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산(15㎎, 0.032mmol, 1.0eq)이 건조 DMSO(400㎕) 내에 용해되었다. 디시클로헥실카르보디이미드(9㎎, 0.042mmol, 1.3eq) 및 N-하이드록시숙신이미드(4.5㎎, 0.039mmol, 1.3eq)가 첨가되었고, 반응물은 실온에서 하룻밤 동안 교반되었으며, 광으로부터 보호되었다. 2,2',2"-(10-(4-((2-아미노에틸)아미노)-1-카르복시-4-옥소부틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산을 포함하는 100㎕의 PBS 용액(20㎎, 0.039mmol, 1.2eq)이 첨가되었고, 반응물은 2시간 동안 교반되었다. 원료 생성물은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)으로 정제되었고, 백색의 고체(2.4㎎, 8%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 960.39(M+H)+
접합체 8："ESV6-DOTA"의 구조
도 27은 ESV6-DOTAGA(8)의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 나타낸다. MS(ES+) m/z 960.39(M+H)+.
실험예 6：화합물 P4 및 화합물 24 사이의 비교 실험
PART 1-화합물 24의 제조
7-(페닐아미노(phenylamino))퀴놀린(quinoline)-4-카르복실산(carboxylic acid)의 합성
계획 9：7-(페닐아미노)퀴놀린-4-카르복실산의 제조를 위한 합성 루트
7-브로모퀴놀린-4-카르복실산(30㎎, 0.119mmol, 1.0eq)이 압력 바이알 내에서 톨루엔(1㎖) 및 디옥산(500㎕) 내의 아닐린(111㎎, 1.19mmol, 198㎕, 10.0eq)의 교반된 용액에 첨가되었다. 용액은 5분 동안 가스가 제거되었고(아르곤-진공 사이클들), 이후에 브레트포스 팔라다시클(BrettPhos Palladacycle)(10㎎, 0.0119mmol, 0.1eq) 및 백금 삼차부톡시드(53㎎, 0.476mmol, 4.0eq)가 첨가되었으며, 반응물은 데워졌고, 110℃에서 4시간 동안 LC/MS를 통해 점검되었다. 원료는 실리카 상에 흡수되었고, 오렌지색의 오일(31mg, 0.119mmol, 100%)로서 화합물을 얻도록 속성 크로마토그래피(DMC/MeOH 9：1 내지 2：8)로 정제되었다. MS(ES+) m/z 265.09(M+H)+
(S)-N-(2-(2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))-7-(페닐아미노(phenylamino))퀴놀린(quinoline)-4-카르복사미드(carboxamide)(화합물 24)의 합성
계획 10：(S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-7-(페닐아미노)퀴놀린-4-카르복사미드(화합물 24)의 제조를 위한 합성 루트
7-(페닐아미노)퀴놀린-4-카르복실산(31㎎, 0.119mmol, 1.0eq), (S)-4,4-디플루오로-1-글리실피르롤리딘-2-카르보니트릴(24㎎, 0.129mmol, 1.1eq) 및 HATU(89㎎, 0.234mmol, 2eq)가 용액 DMF(200㎕) 및 디클로로메탄(1㎖) 내에 첨가되었다. DIPEA(45㎎, 0.352mmol, 61㎕, 3eq)가 방울씩 첨가되었고, 반응물은 15분 동안 실온에서 교반되었다. DCM은 증발되었고, 원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 황색의 고체(3.5㎎, 0.008mmol, 6.9%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 436.15(M+1H)1+
파트 2-생체외의 실험들
hFAP에 대한 생체외의 억제 분석
다른 작은 유기 리간드들(실험예 2로부터의 화합물 P4; 화합물 24)의 존재에서 Z-Gly-Pro-AMC 기질 상의 인간 FAP의 효소 활성이 360㎚의 여기 파장 및 465360㎚의 방출 파장에서 형광을 추적 관찰하면서 마이크로티터 플레이트 판독기 상에서 실온에서 측정되었다. 반응 혼합물은 20㎕의 전체 부피 내에 20μM 기질, 20nM 인간 FAP(일정함), 분석 완충액(50mM 트리스, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH＝7.4) 및 억제제(10-6M 내지 10-11M의 연속 희석, 1：2)를 포함하였다. IC50 값은 상기 기질의 첨가 후에 상기 효소 활성을 50%로 감소시키기 위해 요구되는 억제제의 농도로 정의된다.
도 9는 실험예 2로부터의 화합물 P4는 화합물 24(33.46nM, 보다 낮은 억제)와 비교할 경우에 보다 낮은 IC50(16.83nM, 보다 높은 억제)을 나타내는 것을 보여준다.
실험예 7：접합체 15 및 접합체 25의 합성과 이들의 특성화
파트 1-접합체들의 제조
접합체 15의 합성
계획 11：접합체 15의 구조
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6(2㎎, 2.171μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(800㎕) 내에 용해되었다. 플루오레세인-5-말레이미드(1.8㎎, 4.343μmol, 2.0eq)가 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)으로 정제되었고, 황색의 고체(420nmol, 19.3%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 1348.36(M+1H)1+
도 25는 접합체 15의 구조, 크로마토그래피 프로파일 및 LC/MS 분석을 도시한. MS(ES+) m/z 1348.36(M+1H)+.
접합체 25의 합성
계획 12：접합체 25의 구조
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-HK(1㎎, 0.954μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(800㎕) 내에 용해되었다. 플루오레세인-5-말레이미드(817㎍g, 1.909μmol, 2.0eq)가 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 황색의 고체(373nmol, 39.1%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 1476.47(M+1H)1+
PART 2-생체외의 실험들
형광 분극(FP)에 의한 인간 및 쥐 FAP에 대한 친화도 측정
형광 분극 실험들이 384-웰 플레이트들(비결합, ps, f-바닥, 흑색, 높은 부피, 30㎕의 최종 부피) 내에서 수행되었다. 결합체들의 최종 농도를 10nM로 일정하게 유지시키면서 인간 FAP(4μM) 및 쥐 FAP(5μM)의 저장 용액들은 완충액(50mM 트리스, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH＝7.4)로 연속적으로 희석되었다. 형광 이방성(fluorescence anisotropy)이 TECAN 마이크로티터 플레이트 판독기 상에서 측정되었다. 실험들은 세 번 수행되었고, 평균 이방성 값들은 프리즘(Prism) 7을 이용하여 적정되었다.
도 10의 (A)는 접합체 15가 접합체 25(KD＝1.02nM)에 비하여 hFAP(KD＝0.68 nM)에 대해 보다 높은 친화도를 가지는 것을 보여준다. 도 10의 (B)는 접합체 15가 접합체 25(KD＝30.94nM)에 비하여 mFAP(KD＝11.61nM)에 대해 보다 높은 친화도를 가지는 것을 보여준다. 접합체 15는 접합체 25에 비하여 hFAP에 대해 보다 우수한 결합 성질들 및 쥐 항원에 대한 보다 나은 교차 반응성을 나타낸다.
리간드-단백질 복합체들의 크로마토그래피 공동 용리 실험들
PD-10 칼럼이 상기 복합체의 적재 이전에 분석 완충액(50mM 트리스, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH＝7.4)로 미리 평형화되었다. 다른 단백질들(hFAP＝2μM, mFAP＝5μM) 및 접합체 15(100nM)의 혼합물들이 배양되었고, 상기 칼럼 상에 적재되었다. 상기 혼합물은 상기 분석 완충액을 이용하여 세정되었다. 통과 액은 96-웰 플레이트들 내에 수집되었고, 형광 강도는 485㎚의 여기 파장 및 535㎚의 방출 파장에서 형광을 추적 관찰하면서 TECAN 마이크로티터 플레이트 판독기 상에서 즉시 측정되었다. 상기 단백질들의 농도는 나노드롭 2000/2000c 분광 광도계를 이용하여 280nM에서의 흡수도를 측정하여 산정되었다.
도 11은 hFAP(A) 및 mFAP(B)로의 저분자 리간드 접합체 15의 공동 용리 PD-10 실험을 도시한다. 안정한 복합체가 두 단백질들 및 작은 리간드 접합체 15 사이에 형성되며, 두 분자들의 공동 용리를 함께 가능하게 한다.
파트 3-동물 실험들
세포 배양들
해동에 따라, SK-RC-52.hFAP 및 SK-RC-52 세포들이 37℃ 및 5% CO2에서 소 태아 혈청(10%, FBS) 및 안티바이오틱-안티미코틱(Antibiotic-Antimycotic)(1%, AA)으로 보강된 RPMI 배지 내에서의 배양으로 유지되었다. 패시징을 위해, 세포들은 90% 융합에 도달할 때에 트립신-EDTA 0.05%를 이용하여 탈착되었고, 1：4의 희석으로 재파종되었다.
해동에 따라, HT-1080.hFAP 및 HT-1080 세포들이 37℃ 및 5% CO2에서 소 태아 혈청(10%, FBS) 및 안티바이오틱-안티미코틱(1%, AA)으로 보강된 DMEM 배지 내에서의 배양으로 유지되었다. 패시징을 위해, 세포들은 90% 융합에 도달할 때에 트립신-EDTA 0.05%를 이용하여 탈착되었고, 1：4의 희석으로 재파종되었다.
SK-RC-52.hFAP, SK-RC-52, HT-1080.hFAP 및 HT-1080에 대한 공초점 현미경 분석
SK-RC-52.hFAP 및 SK-RC-52 세포들이 10% FCS, AA 및 HEPES(10mM)으로 보강된 RPMI 배지(1㎖) 내에 웰 당 104 세포들의 밀도로 4-웰 커버 슬립 챔버 플레이트들 내로 파종되었고, 표준 배양 조건들 하에서 24시간 동안 성장하도록 두어졌다. 훼이스트(Hoechst) 33342 핵 염료가 핵 구조물들을 염색하는 데 사용되었다.
상기 배양 배지는 접합체 15(100nM)를 포함하는 신선 배지 대체되었다. 무작위로 선택된 집단들이 AOBS 장치를 구비한 SP8 공초점 현미경(레이카 마이크로시스템스(Leica Microsystems)) 상에서 영상화되었다.
HT-1080.hFAP 및 HT-1080 세포들이 10% FCS, AA 및 HEPES(10mM)로 보강된 DMEM 배지(1㎖) 내에 웰 당 104 세포들의 밀도로 4-웰 커버 슬립 챔버 내로 파종되었고, 표준 배양 조건들 하에서 24시간 동안 성장하도록 두어졌다. 훼이스트 33342 핵 염료가 핵 구조물들을 염색하는 데 사용되었다.
상기 배양 배지는 접합체 15(100nM)를 포함하는 신선 배지로 대체되었다. 무작위로 선택된 집단들이 AOBS 장치를 구비한 SP8 공초점 현미경(레이카 마이크로시스템스) 상에서 영상화되었다.
도 12는 공초점 현미경 및 FACS 분석을 통한 SK-RC-52.hFAP, HT-1080.hFAP 및 야생형 종양 세포들에 대한 접합체 15(10nM)의 선택적 축적의 평가를 도시한다. 도 12의 (A)는 다른 시점들(t＝0 및 1시간)에서 상기 화합물로 배양된 SK-RC-52.hFAP의 영상들은 세포막 위의 접합체 15의 축적을 보여준다. 도 12의 (B)는 상기 화합물로의 배양 후의 SK-RC-52 야생형의 영상들은 세포막 위의 축적을 보여주지 않는다(음성 대조군). 도 12의 (C)는 SK-RC-52 야생형(짙은 회색의 피크) 및 SK-RC-52.hFAP(옅은 회색의 피크)에 대한 FACS 분석은 접합체 15(10nM)의 FAP 특이 세포 결합을 보여준다. 도 12의 (D)는 다른 시점들(t＝0 및 1시간)에서 상기 화합물로 배양된 HT-1080.hFAP의 영상들은 세포막 위 및 시토졸 내부의 접합체 15의 축적을 보여준다. 도 12의 (E)는 상기 화합물로의 배양 후의 HT-1080 야생형의 영상들은 세포막 위 및 시토졸 내의 축적을 보여주지 않는다(음성 대조군).
FACS 분석
SK-RC-52.hFAP, SK-RC-52.wt, HT-1080.wt 및 HT-1080.hFAP가 아쿠타스(Accutase)를 이용하여 배양 플레이트들로부터 분리되었고, 계수되었으며, PBS pH 7.4 내의 FCS의 1% v/v 용액 내에 1.5 x 106 세포들/㎖의 최종 농도로 현탁되었다. 3 x 105 세포들(200㎕)의 부분 표본들이 스핀 다운되었고, PBS pH 7.4(200㎕) 내의 FCS의 1% v/v 용액 내에 접합체 15(15nM)의 용액들에 재현탁되었으며, 얼음 위에서 1시간 동안 배양되었다. 세포들은 PBS pH 7.4(200㎕) 내의 FCS의 200㎕ 1% v/v 용액으로 한 번 세척되었고, 스핀 다운되었으며, PBS pH 7.4(300㎕) 내의 FCS의 1% v/v 용액에 재현탁되었고, 시토플렉스(CytoFLEX) 사이토미터(cytometer) 상에서 분석되었다. 가공되지 않은 데이터는 플로우조(FlowJo) 10.4 소프트웨어로 처리되었다.
결과들이 도 12의 (F)에 도시된다. HT-1080 야생형(짙은 회색의 피크) 및 HT-1080.hFAP(옅은 회색의 피크)에 대한 FACS 분석은 접합체 15(10nM)의 FAP 특이 세포 결합을 보여준다.
동물 연구들
모든 동물 실험들은 취리히의 수의학 법원에 의해 인가된 면허 번호 ZH04/2018 하에서 스위스의 동물 보호 법령들과 규정들에 따라 수행되었다.
피하 SK-RC-52.hFAP 종양들의 이식
SK-RC-52.hFAP 세포들은 80% 융합까지 성장되었고, 트립신-EDTA 0.05%로 분리되었다. 세포들은 5 x 107 세포들/㎖의 최종 농도까지 HBSS 배지 내에 재현탁되었다. 5 x 106 세포들의 부분 표본(100㎕의 서스펜션)들이 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령)의 우측 옆구리에 피하로 주사되었다.
생체외의 실험
피하 SK-RC-52.hFAP 종양이 있는 마우스들에 접합체 15(멸균 PBS 내의 40nmol, pH 7.4)가 정맥으로 주사되었다. 동물들은 정맥 주사 후의 1시간에 CO2 질식으로 희생되었고, 조직들과 종양이 절제되었으며, OCT 배지 내에 순간 빙결되었고, -80℃에서 저장되었다. 크라이오스탯(cryostat) 섹션들(7㎛)이 절단되었고, 핵들은 형광 봉입 배지(Fluorescence Mounting Medium)(다코 옴니스(Dako Omnis), 애질런트)로 염색되었다. 영상들은 액시오스콥2 모드 플러스(Axioskop2 mot plus) 현미경(자이스(Zeiss))을 이용하여 얻어졌으며, 이미지제이(ImageJ) 1.53 소프트웨어에 의해 분석되었다.
도 13은 정맥 투여(40nmol) 후에 SK-RC-52.hFAP 신장 세포 암종 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서의 접합체 15의 약물 표적화 수행의 평가를 도시한다. 투여의 1시간 후의 생체 외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물은 높은 종양-대-기관 선택성으로 정맥 주사의 1시간 후에 생체내로 종양 부위에서 신속하고 균일하게 국소화된다.
실험예 8：접합체 9의 합성 및 특성화
파트 1-접합체의 합성
177-루테튬으로 표지된 접합체 9(2,2',2''-(10-(1-카르복시(carboxy)-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbamoyl))퀴놀린quinolin-8-yl)amino)-4-옥소부탄아미도(oxobutanamido))에틸(ethyl))아미노(amino))-4-옥소부틸(oxobutyl))-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(tetraazacyclododecane)-1,4,7-트리일(triyl))트리아세트산(triacetic acid)의 합성
계획 13：접합체 9의 구조
상기 접합체 8이 1㎍/㎕의 최종 농도까지 아세트산염 완충액(1M, pH＝4) 내에 용해되었다. 접합체 8의 저장 용액(25㎕ 중의 25㎍)은 250㎕의 아세트산염 완충액(1M, pH＝4)으로 희석되었다. 177LuCl3 용액(250㎕, 25 MBq)이 첨가되었고, 혼합물은 95℃에서 15분 동안 가열되었다. 표지되는 혼합물은 멸균 PBS(1975㎕, pH＝7.4)의 첨가에 의해 희석되었고, 표지 효율은 방사성-HPLC(5㎕-10㎕, 0.5MBq-1MBq, 용매 A로서 물중의 0.1% TFA 및 용매 B로서 아세토니트릴 중의 0.1% TFA. 프로그램：0분-8분, 20%-65% 용매 B 및 1㎖/min의 유량)를 통해 추적 관찰되었다. 접합체 9에 대해 정량적 전환이 이루어졌다(방사성 표지 효율＞99%, 도 14).
도 14의 (A)는 177Lu(r.t. 11분)로 표지된 접합체 9의 RadioHPLC 프로파일을 도시한다. 도 14의 (B)는 177Lu(2분)이 없는 RadioHPLC 프로파일을 도시한다. 방사성 표지 후, 접합체 9는 ＞99%의 전환으로 단일 피크로서 나타난다.
파트 2-동물 실험들
SK-RC-52.hFAP에서의 방사성 표지 및 생물학적 분배 실험
SK-RC-52.hFAP 종양 세포들이 실험예 7에서 설명한 바와 같이 암컷 BALB/c nu/nu 마우스들 내로 이식되었고, 3주 동안 250㎣의 평균 부피로 성장되도록 두어졌다. 마우스들은 무작위화 되었고(그룹 당 n＝4), 방사성 표지된 접합체 9의 제형들(50nmol/㎏, 125nmol/㎏, 250nmol/㎏, 500nmol/㎏ 또는 1000nmol/㎏; 0.5MBq-2MBq)이 정맥으로 주사되었다. 마우스들은 주사 후의 10분, 1시간, 3시간 및 6시간에 by CO2 질식으로 희생되었고, 조직들이 추출되었으며, 계량되었고, 패커드 코브라(Packard Cobra) γ-카운터로 방사성 활성이 측정되었다. 값들은 %ID/g±SD로 표현된다(도 15). 음식과 물은 이러한 기간 동안에 임의로 주어졌다.
도 15는 SK-RC-52.hFAP 신장 세포 암종 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu에서 접합체 9(177Lu 방사성 페이로드를 포함)의 생물학적 분배 실험을 도시한다. 도 15의 (A)는 접합체 9의 정맥 투여(도스＝50nmol/㎏; 0.5MBq-2MBq) 후의 다른 시점들(10분, 1시간, 3시간 및 6시간)에서 종양들과 건강한 기관들 및 종양-대-기관 비율 분석의 % ID/g를 나타낸다. 도 15의 (B)는 다른 도스들(125nmol/㎏, 250nmol/㎏, 500nmol/㎏ 및 1000nmol/㎏; 0.5MBq-2MBq)로 177Lu 접합체 9의 정맥 투여 후의 종양들과 건강한 기관들 및 종양-대-기관 비율 분석의 % ID/g를 나타낸다. 투여 의존적 반응이 관찰될 수 있고, 표적 포화는 250nmol/㎏ 내지 500nmol/㎏ 사이에 도달될 수 있다. 도 15의 (C)는 177Lu 용액의 정맥 투여(음성 대조군; 1MBq) 후의 3시간에서 종양들과 건강한 기관들 및 종양-대-기관 비율 분석의 % ID/g를 나타낸다.
실험예 9：화합물 27-화합물 32의 합성
69-갈륨으로 표지된 2,2',2''-(10-(1-카르복시(carboxy)-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbamoyl))퀴놀린(quinolin)-8-일(yl))아미노(amino))-4-옥소부탄아미도(oxobutanamido))에틸(ethyl))아미노(amino))-4-옥소부틸(oxobutyl))-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(tetraazacyclododecane)-1,4,7-트리일(triyl))트리아세트산(triacetic acid), 접합체 27의 합성
접합체 8은 1㎍/㎕의 최종 농도까지 아세트산염 완충액(1M, pH＝4) 내에 용해되었다.
접합체 8의 저장 용액(100㎕ 내의 100㎍)은 250㎕의 아세트산염 완충액(1M, pH＝4)으로 희석되었다. GaCl3 용액(183㎕의 HCl 내의 183㎍)이 첨가되었고, 혼합물은 90℃에서 15분 동안 가열되었다. 반응물은 LC/MS를 통해 점검되었다. MS(ES+) m/z 1027.30(M+H)+
메틸(methyl)(6-메톡시퀴놀린(methoxyquinoline)-4-카르보닐(carbonyl))글리시네이트(glycinate)의 합성
계획 14：메틸(6-메톡시퀴놀린-4-카르보닐)글리시네이트의 제조를 위한 합성 루트
6-메톡시퀴놀린-4-카르복실산(200㎎, 0.985mmol, 1.0eq), HBTU(400㎎, 1.03mmol, 1.05eq), HOBt(167㎎, 1.05mmol, 1.15eq) 및 메틸 글리시네이트 하이드로클로라이드(107㎎, 1.08mmol, 1.1eq)가 5㎖의 DMF 내에 용해되었고, 실온에서 교반되었다. DIPEA(613㎕, 4.42mmol, 4.5eq)가 방울씩 첨가되었고, 반응은 완료될 때까지 LC/MS를 통해 점검되었다. 원료는 옅은 황색의 고체(40㎎, 0.145mmol, 14.7%)를 수득하도록 크로마토그래피(10분 내의 DCM：MeOH 100：0 내지 80：20)를 통해 직접 정제되었다. MS(ES+) m/z 275.1(M+1H).
(6-메톡시퀴놀린(methoxyquinoline)-4-카르보닐(carbonyl))글리시네이트(glycinate)의 합성
계획 15：(6-메톡시퀴놀린-4-카르보닐)글리시네이트의 제조를 위한 합성 루트
메틸(6-메톡시퀴놀린-4-카르보닐)글리시네이트(30㎎, 0.109mmol, 1.0eq)가 1M LiOH 용액의 2㎖ THF/H2O(1：1) 내에 용해되었고, 실온에서 6시간 동안 교반되었다. 완료되었을 때, 약간 산성의 pH에 도달되었을 때까지 HCl 1M으로 염기성이 소멸되었고, 백색의 고체(정량적 수율)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 261.08(M+1H)1+
(S)-N-(2-(2-시아노피르롤리딘(cyanopyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))-6-메톡시퀴놀린(methoxyquinoline)-4-카르복사미드(carboxamide), 접합체 28의 합성
계획 16：(S)-N-(2-(2-시아노피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-6-메톡시퀴놀린-4-카르복사미드의 제조를 위한 합성 루트
(6-메톡시퀴놀린-4-카르보닐)글리시네이트(28㎎, 0.109mmol, 1.0eq), (S)-피르롤리딘-2-카르보니트릴(16㎎, 0,120mmol, 1.1eq) 및 HATU(62㎎, 0.164mmol, 1.5eq)이 2㎖의 DMF 내에 용해되었고, 서스펜션은 실온에서 교반되었다. DIPEA(47㎕, 2.62mmol, 24eq)가 방울씩 첨가되었고, 반응은 완료까지 LC/MS를 통해 점검되었다. 원료는 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)을 통해 직접 정제되었고, 황색의 고체(2㎎, 5.91μmol, 5.4%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 339.14(M+1H)1+
삼차부틸(tert-butyl)((S)-1-((S)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-1-옥소프로판(oxopropan)-2-일(yl))카르바메이트(carbamate)의 합성
계획 17：삼차부틸((S)-1-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-1-옥소프로판-2-일)카르바메이트의 제조를 위한 합성 루트
(S)-4,4-디플루오로-피르롤리딘-2-카르보니트릴(50㎎, 0,379mmol, 1eq), (삼차부톡시카르보닐-L-알라닌(154㎎, 0.75mmol, 2.0eq) 및 HATU(288㎎, 0.75mmol, 2eq)가 4㎖의 DMF 내에 용해되었고, 서스펜션은 실온에서 교반되었다. DIPEA(335㎕, 1.893mmol, 5eq)가 방울씩 첨가되었고, 반응은 완료될 때까지 LC/MS를 통해 점검되었다. DMF가 진공 하에서 제거되었고, 원료는 DCM 내에 희석되었다. 유기 상이 물 및 1M HCl으로 세척되었고, 이후에 백색의 거품(115㎎, 0.379mmol, 정량적 수율)을 얻도록 건조되었다. MS(ES+) m/z 304.14(M+1H)1+
(S)-1-(L-알라닐)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidine)-2-카르보니트릴(carbonitrile)의 합성
계획 18：(S)-1-(L-알라닐)-4,4-디플루오로피르롤리딘-2-카르보니트릴의 제조를 위한 합성 루트
삼차부틸((S)-1-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-1-옥소프로판-2-일)카르바메이트(115㎎, 0,379mmol, 1eq)가 2㎖의 DCM 내에 용해되었고, TFA(203㎕, 7eq)가 방울씩 첨가되었고, 반응물은 실온에서 교반되었으며, 완료까지 LC/MS를 통해 점검되었다. 원료는 DCM 내에서 희석되었고, 생성물은 HCl 1M으로 추출되었다. 산성의 수상(water phase)은 이후에 NaOH 1M으로 소거되었고, 생성물은 DCM으로 추출되었으며, 옅은 황색의 고체(30㎎, 0.147mmol, 38.7%)를 수득하도록 건조되었다. MS(ES+) m/z 204.07(M+1H)1+
삼차부틸(tert-butyl)((4-(((S)-1-((S)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-1-옥소프로판(oxopropan)-2-일(yl))카르바모일(carbamoyl))피리딘(pyridin)-2-일(yl))메틸(methyl))카르바메이트(carbamate)의 합성
계획 19：삼차부틸((4-(((S)-1-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-1-옥소프로판-2-일)카르바모일)피리딘-2-일)메틸)카르바메이트의 제조를 위한 합성 루트
(S)-1-(L-알라닐)-4,4-디플루오로피르롤리딘-2-카르보니트릴(30㎎, 0,147mmol, 1eq), 2-(((삼차부톡시카르보닐)아미노)메틸)이소니코틴산(74㎎, 0.295mmol, 2.0eq) 및 HATU(112㎎, 0.295mmol, 2eq)가 1㎖의 DMF 내에 용해되었고, 서스펜션은 실온에서 교반되었다. DIPEA(102㎕, 0.590mmol, 4eq)가 방울씩 첨가되었고, 반응은 완료될 때까지 LC/MS를 통해 점검되었다. DMF가 진공 하에서 제거되었고, 원료는 DCM 내에서 희석되었으며, 황색의 고체(15㎎. 0.034 mmol, 19.7%)를 얻도록 크로마토그래피(15분 내의 DCM：MeOH 99：1 내지 70：30)를 통해 정제되었다. MS(ES+) m/z 438.19(M+1H)1+
2-(아미노메틸(aminomethyl))-N-((S)-1-((S)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-1-옥소프로판(oxopropan)-2-일(yl))이소니코틴아미드(isonicotinamide)의 합성
계획 20：2-(아미노메틸)-N-((S)-1-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-1-옥소프로판-2-일)이소니코틴아미드의 제조를 위한 합성 루트
삼차부틸((4-(((S)-1-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-1-옥소프로판-2-일)카르바모일)피리딘-2-일)메틸)카르바메이트(15㎎, 0.034mmol, 1.0eq)가 400㎕의 DCM 내에 용해되었고, TFA(200㎕, 20%의 부피)가 방울씩 첨가되었다. 반응물은 실온에서 교반되었고, 완료까지 LC/MS를 통해 점검되었다. 원료는 건조되었고, 황색의 분말(4㎎, 11.86μmol, 34.8%)을 제공하도록 물：아세토니트릴의 500㎕의 1：1 용액 내에 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 338.14(M+1H)1+
4-(((4-(((S)-1-((S)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-1-옥소프로판(oxopropan)-2-일(yl))카르바모일(carbamoyl))피리딘(pyridin)-2-일(yl))메틸(methyl))아미노(amino))-4-옥소부탄산(oxobutanoic acid), 접합체 29의 합성
계획 21：4-(((4-(((S)-1-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-1-옥소프로판-2-일)카르바모일)피리딘-2-일)메틸)아미노)-4-옥소부탄산의 제조를 위한 합성 루트
2-(아미노메틸)-N-((S)-1-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-1-옥소프로판-2-일)이소니코틴아미드(4㎎, 11.86μmol, 1.0eq)가 500㎕의 THF 내에 용해되었다. DMAP(6㎎, 48μmol, 4.0eq) 및 숙신 무수물(3.5㎎, 35.6μmol, 3.0eq)이 첨가되었고, 반응물은 실온에서 교반되었으며, 완료까지 LC/MS를 통해 점검되었다. 원료는 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)을 통해 직접 정제되었고, 황색의 고체(1.3㎎, 2.97μmol, 25%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 438.15(M+1H)1+
ESV6-알렉사 플루오르 488, 접합체 30의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6(293㎍, 0.32μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(300㎕) 내에 용해되었고, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)TM 488 C5 말레이미드(200㎍, 0.29μmol, 0.9eq)가 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 오렌지색의 고체(70nmol, 21.9%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 1619.39(M+1H)1+
ESV6-ValCit-PNU 159682 접합체 31의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV-6(2㎎, 2.17μmol, 1.2eq)이 PBS pH 7.4(750㎕) 내에 용해되었다. MA-PEG4-VC-PAB-DMAE-PNU 159682(2.5㎎, 1.75μmol, 1.0eq)가 건조 DMF 용액(250㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 백색의 고체(3㎎, 73%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 2348.88(M+H)+
QCOOH-ValCit-PNU 159682 접합체 32의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-QCOOH(1.6㎎, 2.17μmol, 1.2eq)가 PBS pH 7.4(750㎕) 내에 용해되었다. MA-PEG4-VC-PAB-DMAE-PNU 159682(2.5㎎, 1.75μmol, 1.0eq)가 건조 DMF 용액(250㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 백색의 고체(2.8㎎, 73%)를 얻도록 냉동 건조되었다.
실험예 10：화합물 18, 화합물 19, 화합물 21, 화합물 P4, 화합물 27, 화합물 28, 화합물 29 및 화합물 30의 특성화 및 생물학적 시험
물질들 및 방법들
hFAP에 대한 생체외의 억제 분석
Z-Gly-Pro-AMC 기질Z-Gly-Pro-AMC 기질에 대한 인간 FAP의 효소 활성이 360㎚의 여기 파장 및 465㎚의 방출 파장에서 형광을 추적 관찰하면서 실온에서 마이크로티터 플레이트 판독기 상에서 측정되었다. 반응 혼합물은 20㎕의 전체 부피 내에 20μM 기질, 20nM 인간 FAP(일정함), 분석 완충액(50mM 트리스, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH＝7.4) 및 테스트된 화합물(10-6 내지 10-11M의 연속 희석, 1：2)을 포함하였다. IC50 값은 상기 기질의 첨가 후의 효소 활성을 50% 감소시키기 위해 요구되는 억제제의 농도로 정의된다.
세포 배양들
해동에 따라, SK-MEL-187, SK-RC-52.hFAP 및 SK-RC-52.wt 세포들은 37℃ 및 5% CO2에서 소 태아 혈청(10%, FBS) 및 안티바이오틱-안티미코틱(1%, AA)으로 보강된 RPMI 배지 내의 배양으로 유지되었다. 패시징을 위해, 세포들은 90% 융합에 도달할 때에 트립신-EDTA 0.05%를 이용하여 분리되었고, 1：4의 희석으로 재파종되었다.
해동에 따라, HT-1080.hFAP 및 HT-1080.wt 세포들은 37℃ 및 5% CO2에서 소 태아 혈청(10%, FBS) 및 안티바이오틱-안티미코틱(1%, AA)으로 보강된 DMEM 배지 내의 배양으로 유지되었다. 패시징을 위해, 세포들은 90% 융합에 도달할 때에 트립신-EDTA 0.05%를 이용하여 분리되었고, 1：4의 희석으로 재파종되었다.
동물 연구들
모든 동물 실험들은 취리히의 수의학 법원에 의해 인가된 면허 번호 ZH04/2018 하에서 스위스의 동물 보호 법령들과 규정들에 따라 수행되었다.
피하 SK-RC-52.hFAP 및 HT-1080.hFAP 종양들의 이식
SK-RC-52.hFAP, HT-1080.hFAP, SK-RC-52.wt 세포들이 80% 융합까지 성장되었고, 트립신-EDTA 0.05%로 분리되었다. 세포들은 5 x 107 세포들/㎖의 최종 농도까지 HBSS 배지 내에 재현탁되었다. 5 x 106세포들의 부분 표본(100㎕의 서스펜션)들이 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령)의 옆구리에 피하로 주사되었다. SK-MEL-187 세포들은 80% 융합까지 성장되었고, 트립신-EDTA 0.05%로 떼어졌다. 세포들은 10 x 107세포들/㎖의 최종 농도까지 HBSS：마트리겔(Matrigel)의 1：1 혼합물 내에 재현탁되었다. 5 x 106 세포들의 부분 표본(200㎕의 서스펜션)들이 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령)의 옆구리에 피하로 주사되었다.
IVIS 실험들
첫 번째 실험에서, HT-1080.hFAP 이종 이식 종양들이 상술한 바와 같이 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령)의 우측 옆구리 내로 이식되었고, 0.1㎖의 평균 부피까지 성장하도록 두어졌다. SK-RC-52.wt 이종 이식 종양들이 전술한 바와 같이 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령)의 우측 옆구리 내로 이식되었고, 0.1㎖의 평균 부피까지 성장하도록 두어졌다.
마우스들은 ESV6-IRDye750(18, 150nmol/㎏, 멸균 PBS 내에 제조된 30μM 용액들로서, pH 7.4)이 정맥으로 투여되었다. 마우스들은 CO2 질식(1시간의 시점)에 의해 희생되었고, 모든 수집된 기관들(혈액, 심장, 근육, 폐, 신장, 간, 지라, 위장, 장의 분절, SK-RC-52.wt 종양 및 HT-1080.hFAP)의 형광 영상들이 IVIS 스펙트럼 영상화 시스템(제노겐, 노출 1s, 비닝 계수 8, 745㎚에서의 여기, 800㎚에서의 방출 필터, f수 2, 시야 13.1) 상에서 수득되었다.
다른 실험에서, SK-MEL-187 이종 이식 종양들이 상술한 바와 같이 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령)의 우측 옆구리 내로 이식되었고, 0.1㎖의 평균 부피까지 성장하도록 두어졌다. SK-RC-52.hFAP 이종 이식 종양들이 상술한 바와 같이 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령)의 좌측 옆구리 내로 이식되었고, 0.1㎖의 평균 부피까지 성장하도록 두어졌다. 마우스들은 ESV6-IRDye750(18, 150nmol/㎏, 멸균 PBS 내에 제조된 30μM 용액들로서, pH 7.4)이 정맥으로 투여되었다. 마우스들은 CO2 질식(1시간의 시점)에 의해 희생되었고, 모든 수집된 기관들(혈액, 심장, 근육, 폐, 신장, 간, 지라, 위장, 장의 분절, SK-MEL-187 종양 및 SK-RC-52.hFAP)의 형광 영상들이 IVIS 스펙트럼 영상화 시스템(제노겐, 노출 1s, 비닝 계수 8, 745㎚에서의 여기, 800㎚에서의 방출 필터, f수 2, 시야 13.1) 상에서 얻어졌다.
생체외의 실험들
우측 옆구리 상의 피하 SK-RC-52.hFAP 또는 HT-1080.hFAP 종양들 및 좌측 옆구리 상의 SK-RC-52.wt 종양이 있는 마우스들에 접합체 30(멸균 PBS 내의 40nmol, pH 7.4)이 정맥으로 주사되었다. 동물들은 정맥 주사 후의 1시간에 CO2 질식으로 희생되었고, 조직들과 종양이 절제되었으며, OCT 배지(서모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 내에 순간 빙결되었고, -80℃에서 저장되었다. 크라이오스탯 섹션들(7㎛)이 절단되었고, 핵들은 형광 봉입 배지(다코 옴니스, 애질런트)로 염색되었다. 영상들은 액시오스콥2 모드 플러스 현미경(자이스)을 이용하여 얻어졌으며, 이미지제이 1.53 소프트웨어에 의해 분석되었다.
치료법 실험들
SK-RC-52.hFAP 이종 이식 종양들이 상술한 바와 같이 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령) 내로 이식되었고, 0.1㎖의 평균 부피까지 성장하도록 두어졌다.
마우스들은 각기 4의 동물들의 8개의 치료법 그룹들(5개의 단일 제제 그룹들, 2개의 결합 그룹들 및 운반체 그룹)로 무작위로 할당되었다. ESV6-ValCit-MMAE(21, 500nmol/㎏), QCOOH-ValCit-MMAE(19, 500nmol/㎏)이 2%의 DMSO를 포함하는 멸균 PBS 용액으로 주사되었다. L19-IL2는 적절한 조제 완충액 내에 330㎍/㎖으로 희석되었고, 2.5㎎/㎏의 도스로 정맥으로 투여되었다.
단일 제제 그룹 내의 마우스들은 매일 ESV6-ValCit-MMAE, QCOOH-ValCit-MMAE 또는 L19-IL2를 수용하였다.
결합 그룹들 내의 마우스들은 종양 이식 후의 8일, 10일 및 12일에 ESV6-ValCit-MMAE와 종양 이식 후의 9일, 11일 및 13일에 L19-IL2를 수용하였다.
종양들은 전자 캘리퍼로 측정되었고, 동물들은 매일 계량되었다. 종양 부피(㎣)는 (긴 측면, ㎜) x (짧은 측면, ㎜) x (짧은 측면, ㎜) x 0.5로의 식으로 계산되었다.
프리즘 6 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어)가 데이터 분석을 위해 이용되었다(본페로니 테스트가 수반되는 정규 이원 분산 분석).
생물학적 분배 실험
SK-RC-52.hFAP(우측 옆구리) 및 SK-RC-52.wt(좌측 옆구리) 이종 이식 종양들이 상술한 바와 같이 암컷 무흉선 BALB/C nu/nu 마우스들(6주-8주의 연령) 내로 이식되었고, 0.1㎖의 평균 부피까지 성장하도록 두어졌다.
마우스들에 ESV6-ValCit-MMAE(21, 250nmol/㎏)가 주사되었고, 정맥 주사 후의 6시간에 CO2 질식으로 희생되었으며, 조직들과 종양들이 절제되었고, -80℃에서 보존되었다. 동결된 조직들은 스캘펄(scalpel)로 절단되었고(50㎎), 600㎕의 95：5 아세토니트릴/물(0.1% TFA) 내에 현탁되었다. 3：97 아세토니트릴/물(0.1% FA; 내부 표준, 50㎕, 50nM) 내의 D8-MMAE의 용액이 첨가되었다. 샘플들은 티슈 라이저(Tissue Lyser) II(퀴아젠(Qiagen), 30㎐ 요동, 15분)로 기계적으로 용해되었다. 혈장 샘플들(50㎕)이 3：97 아세토니트릴/물(0.1% FA; 내부 표준, 50㎕, 50nM) 내의 D8-MMAE의 용액과 함께 첨가되었고, 단백질들이 600㎕의 95：5 아세토니트릴/물(0.1% TFA)의 첨가에 의해 침전되었다. 조직들과 혈장들 모두로부터의 단백질들 샘플들은 원심 분리에 의해 펠릿으로 되었고, 상청액들은 진공 원심 분리에 의해 건조되었다. 고상의 잔여물들은 1㎖의 3：97 아세토니트릴/물(0.1% TFA) 내에 재현탁되었고, 용액들은 칼럼들 상의 제1 정제 및 C18 매크로 스핀(Macro Spin) 칼럼들 상의 제2 정제를 통해 세정되었다. 정제되고 건조된 용리물들은 150㎕의 3：97 아세토니트릴/물(0.1% FA) 내에 재현탁되었고, MS로 분석되었다. 모든 샘플들은 EASY-nLC 1000으로 적정된 Q 엑스액티브(Exactive) 질량 분광계(모두 서모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 이용하여 액상 크로마토그래피-직렬 질량 분석(LC-MS/MS)으로 분석되었다. 피분석물(analyte)들은 60분에 걸쳐 3% 내지 50% ACN의 선형 구배로 진행하여 0.3㎕/분의 유량으로 아클라임 펩맵((Acclaim PepMap) RSLC C18, 50㎛ x 150㎜, 2㎛ 분석 칼럼(서모 피셔 사이언티픽))으로 용해되었다. 모든 완충액들은 0.1% 포름산을 포함하였다. MS 스펙트럼들은 70000의 해상도 및 100ms의 최대 주사 시간으로 SIM 스캔 모드로 기록되었다. MS/MS는 35000의 해상도 및 250ms의 최대 주사 시간으로 기록되었다. 4 SIM 윈도우들은 각기 ESV6-ValCit-MMAE, 1119.0435m/z 및 746.3648 m/z의 이중으로 및 삼중으로 대전된 이온들을 중심으로 하였다.
가공되지 않은 파일들은 이후에 스카이라인(Skyline) 소프트웨어로 분석되었다. 두 이온들의 MS1 면적들이 정량화를 위해 이용되었다.
마우스 혈청 안정성
접합체 27(100㎕, 200μM)의 표지 용액이 100㎕의 마우스 혈청 내로 섞였고, 실온에서 배양되었다. 첨가 직후 및 10분, 1시간, 3시간 및 6시간 후, 단백질들이 100㎕의 메탄올을 첨가하여 침전되었고, 샘플들은 16300rpm으로 10분 동안 원심 분리되었다. 상청액이 수집되었고, 분석 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 점건되었으며, 피크의 확인은 LC/MS를 통해 평가되었다.
결과들
도 16은 정맥 투여(150nmol/㎏의 도스) 후의 SK-MEL-187(우측 옆구리) 및 SK-RC-52.hFAP(좌측 옆구리) 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들의 근적외선 형광 영상화에서 IRDye 750 접합체 18의 약물 표적화 수행의 평가를 도시한다. 도 16의 (A)는 주사 전(t＝0) 및 정맥 주사 후의 30분에서 살아있는 동물들의 영상들을 나타내며, 도 16의 (B)에는 60분에서 생체외의 조직 영상이 제시된다. 화합물 ESV6-IRDye750(18)은 SK-RC-52.hFAP 및 SK-MEL-187 종양들 모두에 대해 축적되며, SK-MEL-187에 비하여 보다 높은 FAP 발현으로 인해 SK-RC-52.hFAP 종양들에서 보다 높은 축적을 제시한다.
도 17은 다른 작은 유기 리간드들의 존재에서 hFAP 억제 실험을 도시한다. 접합체 28은 실험예 2인 P4에 비하여 보다 낮은 FAP 억제 성질을 보여준다. 시아노피르롤리딘 머리부 및 피리딘 고리 사이의 L-알라닌 기본 구성물을 포함하는 접합체 29는 분석에서는 시험된 농도들에서 FAP 단백질 분해 활성을 억제하지 않는다.
도 18은 정맥 투여(150nmol/㎏의 도스) 후의 HT-1080.hFAP 및 SK-RC-52.wt 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들의 근적외선 형광 영상화에서 IRDye 750 접합체 18의 약물 표적화 수행의 평가를 도시한다. 1시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물 ESV6-IRDye750(18)은 FAP 발현을 제시하는 HT-1080.hFAP 종양에 대해 선택적으로 축적되며 SK-RC-52.wt. 내에 축적되지 않는다.
도 19는 정맥 투여(40nmol) 후의 SK-RC-52.hFAP(우측 옆구리) 및 SK-RC-52.wt(좌측 옆구리) 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서 접합체 30의 약물 표적화 수행의 평가를 도시한다. 도 19a에는 투여 후의 1시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물은 정맥 주사 후의 1시간에 FAP 발현을 제시하는 종양에서 뛰어난 종양-대-기관 선택성으로 생체내의 신속하고, 균일하며 선택적으로 국소화된다. 도 19b에는 ESV6-Alexa Fluor 488(30)의 구조가 나타난다.
도 20은 정맥 투여(40nmol)에 HT-1080.hFAP(우측 옆구리) 및 SK-RC-52.wt(좌측 옆구리) 이종 이식편들이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서 접합체 30의 약물 표적화 수행의 평가를 도시한다. 도 20a에는 투여 후의 1시간에서 생체외의 조직 영상들이 제시된다. 화합물은 정맥 주사 후의 1시간에 FAP 발현을 제시하는 종양에서 뛰어난 종양-대-기관 선택성으로 생체내의 신속하고, 균일하며 선택적으로 국소화된다. 도 20b는 ESV6-알렉사 플로어(Alexa Fluor) 488(30)의 구조를 나타난다.
도 21의 (A)는 SK-RC-52.hFAP 종양이 있는 마우스들에서 ESV6-ValCit-MMAE(21) 및 QCOH-ValCit-MMAE(19)의 치료 활성의 평가를 도시한다. 데이터 포인트들은 평균 종양 부피±SEM(그룹 당 n＝4)를 나타낸다. 화합물들은 8일에서 출발하여 연속적으로 6일 동안에 정맥으로 투여되었다(꼬리 정맥 주사). 높은 친화도의 FAP 리간드 "ESV6"의 약물 접합체 유도체인 ESV6-ValCit-MMAE(21)은 분자의 표적화되지 않은 버전인 QCOOH-ValCit-MMAE(19)와 비교하여 보다 강한 효능의 항종양 효과를 나타낸다. 도 21의 (B)는 실험 동안의 동물들의 체중의 변화들(%)의 평가에 의해 분석된 바와 같은 상이한 치료들의 내성을 나타낸다. 도 21의 (C)는 ESV6-ValCit-MMAE(21) 및 QCOOH-ValCit-MMAE(19)의 구조들을 나타낸다.
도 22의 (A)는 SK-RC-52.hFAP 종양이 있는 마우스들에서 ESV6-ValCit-MMAE(21), L19-IL2 및 이들의 결합의 치료 활성의 평가를 도시한다. 데이터 포인트들은 평균 종양 부피±SEM(그룹 당 n＝4)을 나타낸다. ESV6-ValCit-MMAE은 8일, 10일, 12일에 정맥으로 투여되었다(꼬리 정맥 주사). L19-IL2는 9일, 11일, 13일에 정맥으로 투여되었다(꼬리 정맥 주사). L19-IL2와 결합된 ESV6-ValCit-MMAE는 L19-2 단독의 경우에 비하여 매우 강한 효능의 항종양 효과(4/4의 완전한 종양 퇴화)를 나타낸다. 도 22의 (B)는 실험 동안의 동물들의 체중의 변화들(%)의 평가에 의해 분석된 바와 같은 상이한 치료들의 내성을 나타낸다.
도 23은 우측 옆구리에 SK-RC-52.hFAP가 있고, 좌측 옆구리에 SK-RC-52.wt이 있는 BALB/C nu/nu 마우스들에서 저분자 약물 접합체 ESV6-ValCit-MMAE(21)의 정량적 생물학적 분배 실험을 도시한다. 화합물은 FAP-양성 SK-RC-52 종양들 내에 선택적으로 축적된다(즉, 정맥 투여 후의 6시간에 종양 부위에서 18% ID/g). 이에 비하여, 상기 ESV6-ValCit-MMAE는 FAP-음성 SK-RC-52 야생형 종양들 내에 축적되지 않는다. 건강한 조직 내의 상기 접합체의 흡수는 무시할 수 있다(1% ID/g 보다 낮음).
도 24는 마우스 혈청에서의 접합체 27(69Ga 페이로드를 포함)의 안정성 연구를 도시한다. 배양 후의 0시간 및 7시간의 시간에서 처리된 샘플의 HPLC 및 LC/MS 프로파일들은 정확한 집단(예측 집단：1028.30)으로 단일의 피크를 보여준다. MS(ES+) m/z 514.3(M+2H)).
실험예 11：다른 접합체들의 합성
접합체 39의 합성
(S)-4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산(15mg, 0.032mmol, 1.0eq)이 건조 DMSO(400㎕) 내에 용해되었다. 디클로로헥실카르보디이미드(9mg, 0.042mmol, 1.3eq) 및 N-하이드록시숙신이미드(4.5㎎, 0.039mmol, 1.3eq)가 첨가되었고, 반응물은 하룻밤 동안 실온에서 교반되었고, 광으로부터 보호되었다. 2, 2'-(7-(4-((2-아미노에틸)아미노)-1-카르복시-4-옥소부틸)-1,4,7-트리아조난-1,4-디일)디아세트산(16.2㎎, 0.039mmol, 1.2eq)을 포함하는 100㎕의 PBS 용액이 첨가되었고, 상기 반응물은 2시간 동안 교반되었다. 원료 생성물은 역상 HPLC(20분 애의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 858.35(M+H)+
접합체 40의 합성
아세트산나트륨 완충액(0.1M, pH 4) 내의 접합체 39의 용액(1㎖, 150μM)이 신선하게 제조된(Al18F)2+ 용액(앞서의 문헌인 Cleeren 등의 "Bioconjugate. Chem."(2016)에서 위에 기재된 바와 같이 얻어짐)을 포함하는 별도의 바이알에 첨가된다. 폐쇄된 바이알은 95℃의 온도에서 12분 동안 가열된다. 복합체의 형성은 방사성-HPLC 및 방사성-TLC 분석에 의해 확인된다.
접합체 41의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6(2㎎, 2.171μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(800㎕) 내에 용해된다. 말레이미도-NOTA(3.0㎎, 4.343μmol, 2.0eq)가 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되고, 황색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다. MS(ES+) m/z 1345.48(M+1H)1+.
접합체 43a의 합성
상업적으로 입수 가능한 텐타겔 레진(300㎎, 0.18mmol, RAPP 폴리메레) 상에 전-적재된 Fmoc-Lys(NeBoc)가 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창되고, Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페라진(1 x 1분 x 5㎖ 및 2 x 10분 x 5㎖)으로 제거되며, 상기 레진은 DMF(6 x 1분 x 5㎖)으로 세척된다. 펩티드는 나타내는 순서대로 Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH 및 (S)-4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산으로 신장된다. 이러한 목적을 위해, Fmoc 보호된 아미노산(2.0eq), HBTU(2.0eq), HOBt(2.0eq) 및 DIPEA(4.0eq)가 DMF(5㎖) 내에 용해된다. 혼합물은 10분 동안 0℃에서 두어지며, 이후에 부드러운 요동 하에서 상기 레진과 1시간 동안 반응된다. DMF(6 x 1분 x 5㎖)로의 세척 후에 상기 Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페라진(1 x 1분 x 5㎖ 및 2 x 10분 x 5㎖)으로 제거된다. 탈보호 단계들이 후속하여 아미노산과 결합되기 이전에 DMF(6 x 1분 x 5㎖)로의 세척 단계들에 수반된다. 상기 펩티드는 DCM 내의 20%의 혼합물로 상기 레진으로부터 실온에서 1시간 동안 분열된다. 용매는 감소된 압력 하에서 제거되고, 원료는 차가운 디에틸에테르 내에 침전되며, 원심 분리되고, 물/ACN 내에 용해되며, HPLC(15분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 5：5)에 의해 정제되고, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다. 상기 화합물은 건조 아세토니트릴(2㎖) 내의 2, 3, 5, 6-테트라플루오로페닐-6-(트리메틸-λ4-아자네일)니코티네이트(2.0eq)과 하룻밤 동안 반응된다. 원료 화합물은 최종 화합물을 수득하도록 tBuOH：MeOH(5：2)의 혼합물 내의 [18F] TBAF(2.0eq), TBAHCO3(2.0eq)와 50℃에서 10분 동안 반응된다. MS(ES+) m/z 967.33(M+1H)1+
온-레진 Cys(STrt)-Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc의 합성
계획 22： 온-레진 Cys(STrt)-Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc의 제조를 위한 합성 루트
상업적으로 입수 가능한 텐타겔 레진(500㎎, 0.415mmol, RAPP 폴리메레) 상에 전-적재된 Fmoc-Cys(Trt)가 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창되었고, Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페라진(1 x 1분 x 5㎖ 및 2 x 10분 x 5㎖)으로 제거되었으며, 상기 레진은 DMF(6 x 1분 x 5㎖)으로 세척되었다. 펩티드는 나타내는 순서대로 Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(NHBoc)-OH 및 Fmoc-Asp(tBu)-OH로 신장되었다. 이러한 목적을 위해, Fmoc 탈보호된 아미노산(2.0eq), HBTU(2.0eq), HOBt(2.0eq) 및 DIPEA(4.0eq)가 DMF(5㎖) 내에 용해되었다. 혼합물은 0℃에서 10분 동안 두어졌고, 이후에 부드러운 요동 하에서 상기 레진과 1시간 동안 반응되었다. DMF(6 x 1분 x 5㎖)으로의 세척 후에 상기 Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페라진(1 x 1분 x 5㎖ 및 2 x 10분 x 5㎖)으로 제거되었다. 탈보호 단계들이 후속하여 아미노산과 결함하기 이전에 DMF(6 x 1분 x 5㎖)로 세척하는 단계들에 수반되었다.
(2R,5R,8S,11S,14S)-11-(4-아미노부틸(aminobutyl))-8-(카르복시메틸(carboxymethyl))-14-(4-((4-((2-((S)-2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbamoyl)퀴놀린(quinolin)-8-일(yl))아미노(amino))-4-옥소부탄아미도(oxobutanamido))-2,5-비스(bis)(메르캅토메틸(mercaptomethyl))-4,7,10,13-테트라옥소(tetraoxo)-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸2산(tetraazahexadecanedioic acid)(SH-Cys-SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6, P7)의 합성
계획 23：(2R,5R,8S,11S,14S)-11-(4-아미노부틸)-8-(카르복시메틸)-14-(4-((4-((2-((S)-2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄아미도)-2,5-비스(메르캅토메틸)-4,7,10,13-테트라옥소-3,6,9,12-테트라아자헥사데칸2산(SH-Cys-SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6, P7)의 제조를 위한 합성 루트
온-레진 Cys(STrt)-Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc(80㎎, 0.04mmol)가 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창되었다. 펩티드는 (S)-4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산(37㎎, 0.08mmol, 2eq), HATU(30㎎, 0.08mmol, 2.0eq) 및 DIPEA(28㎕, 0.16mmol, 4.0eq)로 신장되었고, 부드러운 요동 하에서 1시간 동안 반응되도록 두어졌다. DMF(6 x 1분 x 5㎖)로의 세척 후, 화합물은 상기 레진을 DCM 내의 TFA(15%), TIS(2.5%) 및 H2O(2.5%)의 혼합물 4시간 동안 실온에서 요동시켜 분열되었다. 상기 레진은 메탄올(2 x 5㎖)로 세척되었고, 결합된 분열 및 세척 용액들은 진공 하에서 농축되었다. 원료 생성물은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 백색의 고체(8㎎, 0.95μmol, 2.4%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 1024.28(M+H)+
ESV6-ValCit-MMAE-bis(44)의 합성
SH-Cys-SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6(P7, 1.2㎎, 1.175μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해된다. MC-ValCit-PAB-MMAE(4.6㎎, 3.525μmol, 3.0eq)가 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되며, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
MS(ES+) m/z 3656.9(M+H)+
ESV6_2-ValCit-MMAE-bis(45)의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6(P7, 1㎎, 1.09μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해된다. MC-ValCit-PAB-MMAE(1.4㎎, 1.09μmol, 1.0eq) 및 OSu-Glu-ValCit-PAB-MMAE(1.4㎎, 1.09μmol, 1.0eq)가 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되며, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
MS(ES+) m/z 3456.8(M+H)+
(S)-N-(2-(2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))-8-(헥스(hex)-5-인아미도(ynamido))퀴놀린(quinoline)-4-카르복사미드(carboxamide)(P8)의 합성
계획 24：(S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-8-(헥스-5-인아미도)퀴놀린-4-카르복사미드(P8)의 제조를 위한 합성 루트
5-헥시논산(hexynoic acid)(94㎎, 0.84mmol, 1.5eq)이 25㎖ 둥근 바닥 플라스크 내에서 1.5㎖의 DCM 및 20㎕의 DMF 내에 용해되었다. 혼합물은 0℃까지 냉각되었고, 옥살릴 클로라이드(oxalyl chloride)(107㎎, 0.84mmol, 1.5eq)가 방울씩 첨가되었다. 아이스 배스는 제거되었고, 반응물은 15분 동안 교반되었다. 혼합물은 이후에 DMF 내의 실험예 2-P4의 냉각된 용액에 첨가되었다. 30분 후, 원료는 수성 NaHCO3으로 희석되었고, DCM으로 추출되었으며, Na2SO4 무수물 상부에서 건조되었고, 여과되었으며, 농축되었다. 상기 원료는 황색의 고체(78㎎. 0.267mmol, 34%)를 수득하도록 크로마토그래피(10분 내의 DCM/MeOH 100：0 내지 90：10)에 의해 정제되었다. MS(ES+) m/z 454.16(M+1H)1+
(S)-8-(4-(1-(5-((2-(2-(2-아미노에톡시(aminoethoxy))에톡시(ethoxy))에틸(ethyl))아미노(amino))-5-옥소펜틸(oxopentyl))-1H-1,2,3-트리아졸(triazol)-4-일(yl))부탄아미도(butanamido))-N-(2-(2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))퀴놀린(quinoline)-4-카르복사미드(carboxamide)(P9)의 합성
계획 25：(S)-8-(4-(1-(5-((2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아미노)-5-옥소펜틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)부탄아미도)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카르복사미드(P9)의 제조를 위한 합성 루트
상업적으로 입수 가능한 텐타겔 레진(300㎎, 0.2mmol, 노바바이오켐(Novabiochem)) 상에 전-적재된 아미노(Amino)-PEG2가 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창되었다. 상기 레진은 DMF(5㎖) 내의 5-아지도발레리안산(azidovalerianic acid)(2.0eq), HBTU(2.0eq), HOBt(2.0eq) 및 DIPEA(4.0eq)로 신장되었다. 혼합물은 0℃에서 10분 동안 두어졌고, 부드러운 요동 하에서 1시간 동안 상기 레빈과 반응되었다. (S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-8-(헥스-5-인아미도)퀴놀린-4-카르복사미드(78㎎, 0.17mmol, 0.86eq), CuI(4㎎, 0.02mmol, 0.1eq) 및 TBTA(34㎎, 0.06mmol, 0.3eq)가 5㎖의 혼합물 1：1 DMF/THF 내에 용해되었다.
펩티드는 실온에서 1시간 동안 DCM 내의 20% TFA의 혼합물로 상기 레진으로부터 분열되었다. 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고, 원료는 차가운 디에틸에테르 내에 침전되었으며, 원심 분리되었고, 물/ACN 내에 용해되었으며, HPLC(15분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 5：5)에 의해 정제되었고, 백색의 고체(30㎎, 21%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 727.8(M+H)+
접합체 46의 합성
(S)-8-(4-(1-(5-((2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아미노)-5-옥소펜틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)부탄아미도)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카르복사미드(1㎎, 1.4μmol, 1.0eq)가 THF(200㎕) 내에 용해되었고, 건조 DIPEA(400㎍, 3.3μmol, 2.4eq)가 방울씩 첨가되었다. FITC 이성질체 I(0.8㎎, 2.1μmol, 1.5eq)가 20㎕ 중의 1㎎의 농도로 DMSO 용액으로 첨가되었고, 반응물은 3시간 동안 교반되었으며, 광으로부터 보호되었고, 원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)으로 직접 정제되었으며, 황색의 분말(1.1㎎, 70.4%)을 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 1116.4(M+H)+
(S)-N-(2-(2-사이노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))-8-(헥스(hex)-5-인아미도(ynamido))퀴놀린(quinoline)-4-카르복사미드(carboxamide)(P10)의 합성
계획 26：(S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-8-(헥스-5-인아미도)퀴놀린-4-카르복사미드(P10)의 제조를 위한 합성 루트
(S)-4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산(50㎎, 0.11mmol, 1eq), 프로파르글라민(propargylamine)(7㎎, 0.13mmol, 1.2eq) 및 HATU(49㎎, 0.13mmol, 1.2eq)가 2㎖의 DCM 내에 용해되었고, 100㎕의 DMF.DIPEA(56㎎, 0.44mmol, 4eq)가 방울씩 첨가되었으며, 반응물은 30분 동안 실온에서 교반되었다. 물이 첨가되었고, 유기 상이 분리되었으며, 이후에 DCM으로 세 번 추출되었다. 원료는 황산나트륨 상부에서 건조되었고, 여과되었으며 증발되었다. 상기 원료는 짙은 오일(32㎎. 0.0638mmol, 58%)을 수득하도록 크로마토그래피(10분 내의 DCM/MeOH 100：0 내지 95：5)에 의해 정제되었다. MS(ES+) m/z 495.47(M+1H)1+
Bi-ESV6-펩티드(P11)의 합성
상업적으로 입수 가능한 텐타겔 레진(300㎎, 0.18mmol, RAPP 폴리메레) 상에 전-적재된 Fmoc-Cys(Trt)가 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창되었고, Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페리딘(1 x 1분 x 5㎖ 및 2 x 10분 x 5㎖)으로 제거되었으며, 상기 레진은 DMF(6 x 1분 x 5㎖)으로 세척되었다. 펩티드는 나타내는 순서대로 Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(NHBoc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-N3-Lys, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 (S)-4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산으로 신장되었다. 이러한 목적을 위해, Fmoc 보호된 아미노산(2.0eq), HBTU(2.0eq), HOBt(2.0eq) 및 DIPEA(4.0eq)가 DMF(5㎖) 내에 용해되었다. 혼합물은 0℃에서 10분 동안 두어졌고, 이후에 부드러운 교반 하에서 1시간 동안 상기 레진과 반응되었다. DMF(6 x 1분 x 5㎖)로의 세척 후에 상기 Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페리딘(1 x 1분 x 5㎖ 및 2 x 10분 x 5㎖)로 제거되었다. 탈호보 단계들이 후속하여 아미노산과 결합 이전에 DMF(6 x 1분 x 5㎖)로의 세척 단계들에 수반되었다. (S)-N-(2-(2-시아노-4, 4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-8-(헥스-5-인아미도)퀴놀린-4-카르복사미드(174㎎, 0.35mmol, 2eq), CuI(4㎎, 0.02mmol, 0.1eq) 및 TBTA(28㎎, 0.05mmol, 0.3eq)가 5㎖의 혼합물 1：1 DMF/THF 내에 용해되었다. 펩티드는 실온에서 1시간 동안 DCM 내의 20% TFA의 혼합물로 상기 레진으로부터 분열되었다. 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고, 원료는 차가운 디에틸에테르 내에 침전되었으며, 원심 분리되었고, 물/ACN 내에 용해되었으며, HPLC(15분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 5：5)에 의해 정제되었고, 백색의 고체(18㎎, 6%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 1687.7(M+H)+
접합체 47의 합성
Bi-ESV6-펩티드(P11, 1㎎, 0.59μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해되었다. 말레이미도-플루오레세인(0.76㎎, 1.77μmol, 3.0eq)이 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 황색의 고체를 얻도록 냉동 건조되었다.
MS(ES+) m/z 2114.7(M+H)+
접합체 48의 합성
Bi-ESV6-펩티드(P11, 1㎎, 0.59μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(300㎕) 내에 용해되었다. 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)TM 488 C5 말레이미드(200㎍, 0.29μmol, 0.5eq)가 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 오렌지색의 고체를 얻도록 냉동 건조되었다.
MS(ES+) m/z 2385. 8(M+1H)1+
접합체 49의 합성
Bi-ESV6-펩티드(P11, 1㎎, 0.59μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해된다. MC-ValCit-PAB-MMAE(1㎎, 0.76μmol, 1.3eq)가 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)으로 정제되고, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
MS(ES+) m/z 3003.5(M+H)+
접합체 50의 합성
Bi-ESV6-펩티드(P11, 1㎎, 0.59μmol, 3.3eq)가 PBS pH 7.4(300㎕) 내에 용해된다. IRDye750(200㎍, 0.174μmol, 1.0eq)이 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)으로 정제되고, 오렌지색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
MS(ES+) m/z 2838.0(M+1H)1+
접합체 51의 합성
Bi-ESV6-펩티드(P11, 1㎎, 0.59μmol, 1eq)가 PBS pH 7.4(300㎕) 내에 용해된다. 말레이미드-DOTA(465㎍, 0.59μmol, 1.0eq)가 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되고, 오렌지색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
MS(ES+) m/z 2213.9(M+1H)1+
AlbuTag-ESV6-펩티드(P12)의 합성
상업적으로 입수 가능한 텐타겔 레진(300㎎, 0.18mmol, RAPP 폴리메레) 상에 전-적재된 Fmoc-Cys(Trt)가 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창되었고, Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페라진(1 x 1분 x 5㎖ 및 2 x 10분 x 5㎖)으로 제거되었으며, 상기 레진은 DMF(6 x 1분 x 5㎖)으로 세척되었다. 펩티드는 나타내는 순서대로 Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(NHBoc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-N3-Lys, Fmoc-a(tBu)-Asp-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH 및 4-(4-아이오도페닐)부탄산으로 신장되었다. 이러한 목적을 위해, Fmoc 보호된 아미노산(2.0eq), HBTU(2.0eq), HOBt(2.0eq) 및 DIPEA(4.0eq)가 DMF(5㎖) 내에 용해되었다. 혼합물은 0℃에서 10분 동안 두어졌고, 이후에 부드러운 요동 하에서 1시간 동안 상기 레진과 반응되었다. DMF(6 x 1분 x 5㎖)로의 세척 후에 상기 Fmoc 기는 DMF 내의 20% 피페라진(1 x 1분 x 5㎖ 및 2 x 10분 x 5㎖)으로 제거되었다. 탈호보 단계들이 후속하여 아미노산과 결합되기 이전에 DMF(6 x 1분 x 5㎖)으로 세척하는 단계들에 수반되었다. (S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-8-(헥스-5-인아미도)퀴놀린-4-카르복사미드(174㎎, 0.35mmol, 2eq), CuI(4㎎, 0.02mmol, 0.1eq) 및 TBTA(28㎎, 0.05mmol, 0.3eq)가 5㎖의 혼합물 1：1 DMF/THF 내에 용해되었다. 펩티드는 실온에서 1시간 동안 DCM 내의 20% TFA의 혼합물로 상기 레진으로부터 분열되었다. 용매는 감소된 압력 하에서 제거되었고, 원료는 차가운 디에틸에테르 내에 침전되었으며, 원심 분리되었고, 물/ACN 내에 용해되었으며, HPLC(15분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 5：5)에 의해 정제되었고, 백색의 고체(6㎎, 2%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 1646.6(M+H)+
접합체 52의 합성
AlbuTag-ESV6-펩티드(P12, 1㎎, 0.61μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해된다. 말레이미도-플루오레세인(0.78㎎, 1.82μmol, 3.0eq)이 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)으로 정제되며, 황색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
MS(ES+) m/z 2073.6(M+H)+
접합체 53의 합성
AlbuTag-ESV6-펩티드(P12, 1㎎, 0.61μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(300㎕) 내에 용해되었다. 알렉사 플루오르TM 488 C5 말레이미드(400㎍, 0.58μmol, 0.95eq)가 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)으로 정제되었고, 오렌지색의 고체(180nmol, 30%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 2345. 7(M+1H)1+
접합체 54의 합성
AlbuTag-ESV6-펩티드(P12, 1㎎, 0.61μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해된다. MC-ValCit-PAB-MMAE(1㎎, 0.76μmol, 1.25eq)가 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)으로 정제되며, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
MS(ES+) m/z 2963.8(M+H)+
접합체 55의 합성
AlbuTag-ESV6-펩티드(P12, 1㎎, 0.61μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(300㎕) 내에 용해되었다. IRDye750(400㎍, 0.384μmol, 0.58eq)이 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가되었다. 반응물은 3시간 동안 교반되었다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되었고, 오렌지색의 고체(55nmol, 9%)를 얻도록 냉동 건조되었다. MS(ES+) m/z 2797.9(M+1H)1+
접합체 56의 합성
AlbuTag-ESV6-펩티드(P12, 1㎎, 0.61μmol, 1.0eq)가 PBS pH 7.4(300㎕) 내에 용해된다. 말레이미드-DOTA(480㎍, 0.61μmol, 1.0eq)가 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되고, 오렌지색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
MS(ES+) m/z 2172.7(M+1H)1+
Bi-ESV6(P13)의 합성
상업적으로 입수 가능한 2-클로로(chlro)-트리틸클로라이드(trityl chloride) 레진(300㎎)이 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창된다. 상기 레진은 DMF(5㎖) 내의 NHFmoc-아지도(azido)-리신(lysine)(1mmol), HBTU(1.0eq), HOBt(1.0eq) 및 DIPEA(2.0eq)으로 신장된다. 혼합물은 0℃에서 10분 동안 두어지고, 이후에 부드러운 요동 하에서 상기 레진과 반응된다. 상기 레진은 이후에 메탄올로 세척된다. 상기 레진은 DMF(5㎖) 내의 (S)-4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산(1mmol), HOBt(1.0eq) 및 DIPEA(2.0eq)으로 신장된다. (S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)-8-(헥스-5-인아미도)퀴놀린-4-카르복사미드(78㎎, 0.17mmol, 0.86eq), CuI(4㎎, 0.02mmol, 0.1eq) 및 TBTA(34㎎, 0.06mmol, 0.3eq)가 5㎖의 혼합물 1：1 DMF/THF 내에 용해된다. 펩티드는 실온에서 1시간 동안 DCM 내의 50% HFIP의 혼합물로 상기 레진으로부터 분열된다. 용매는 감소된 압력 하에서 제거되며, 원료는 차가운 디에틸에테르 내에 침전되고, 원심 분리되며, 물/ACN 내에 용해되고, HPLC(15분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 5：5)에 의해 정제되며, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다. MS(ES+) m/z 1111.1(M+H)+
DOTA-GA-Bi-ESV6(57)의 합성
Bi-ESV6(P13, 45㎎, 40.5μmol, 1.0eq)이 건조 DMSO(400㎕) 내에 용해된다. 디시클로헥실카르보디이미드(10.9㎎, 52.7μmol, 1.3eq) 및 N-하이드록시숙신이미드(14㎎, 122μmol, 3eq)가 첨가되고, 반응물은 실온에서 하룻밤 동안 교반되며, 광으로부터 보호된다.
2,2',2"-(10-(4-((2-아미노에틸)아미노)-1-카르복시-4-옥소부틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산(25㎎, 48.6μmol, 1.2eq)를 포함하는 100㎕의 PBS 용액이 첨가되고, 반응물은 2시간 동안 교반된다.
원료 생성물은 역상 HPLC(20분 이내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되고, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
MS(ES+) m/z 1624.8(M+H)+
MC-아미노산들(OtBu)의 합성을 위한 일반 절차
계획 27：MC-아미노산들(OtBu)의 제조를 위한 일반 합성 루트
위의 일반 절차는, 예를 들어, AA＝글리신에 대해 다음에 설명하는 바와 같이 수행될 수 있다.
6-말레이미도헥사노익산(1.0eq)이 아르곤 분위기 하에서 건조 CH2Cl2(1㎖/mmol) 내에 용해되며, 용액은 0℃까지 냉각된다. EDC·HCl(1.1eq), DIPEA(2.3eq) 및 원하는 H-AA-OtBu·HCl(1.1eq)이 연속적으로 첨가된다. 반응물은 실온에서 완료될 때까지 교반된다. 혼합물은 AcOEt로 희석되고, 수성 KHSO4 1M, 포화 NaHCO3 용액 및 브라인(brine)으로 세척된다. 유기 상이 건조되고, 백색의 분말로서 원하는 생성물을 수득하도록 농축된다.
MC-아미노산들의 합성을 위한 일반 절차
계획 28：MC-아미노산들의 제조를 위한 일반 합성 루트
위의 일반 절차는, 예를 들어, AA＝글리신에 대응되는 R에 대해 다음에 설명하는 바와 같이 수행될 수 있다.
원하는 MC-아미노산-OtBu(1.0eq)가 아르곤 분위기 하에서 건조 CH2Cl2(0,3㎖/mmol) 내에 용해된다. TFA(22.0eq)가 첨가되고, 혼합물은 실온에서 2시간 동안 교반된다. 용액은 농축되고, 헥산으로 침전되며, 백색의 분말로서 생성물을 수득한다.
(9H-플루오렌(fluoren)-9-일(yl))메틸(methyl)-(2S)-2-((4-(하이드록시메틸(hydroxymethyl))페닐(phenyl))카르바모일(carbamoyl))-1λ
4
-피르롤리딘(pyrrolidine)-1-키르복실레이트(carboxylate)의 합성
계획 29：(9H-플루오렌-9-일)메틸-(2S)-2-((4-(하이드록시메틸)페닐)카르바모일)-1λ4-피르롤리딘-1-키르복실레이트의 제조를 위한 합성 루트
Fmoc-Pro-OH(312㎎; 0.92mmol; 1.0eq) 및 HATU(393㎎; 1.01mmol; 1.1eq)가 아르곤 분위기 하에서 건조 DMF(4㎖) 내에 용해되었고, 용액은 0℃까지 냉각되었다. DIPEA(505㎕; 2.76mmol; 3.0eq)가 방울씩 첨가되었고, 혼합물은 동일한 온도에서 15분 동안 교반되었다. 4-아미노벤질 알코올(226㎎, 1.84mmol, 2eq.)이 건조 DMF 내의 용액으로 첨가되었다. 혼합물은 실온에서 하룻밤 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 AcOEt로 희석되고, 수성 1M KHSO4, 포화 NaHCO3 및 브라인으로 세척되었다. 모아진 유기 상들은 건조되었고, 진공 하에서 농축되었다. 원료는 백색의 분말(274㎎; 0.66mmol; 66% 수율)로서 생성물을 수득하도록 크로마토그래피(10분 내의 DCM/MeOH 99：1 내지 95：5)에 의해 정제되었다. MS(ES+) m/z 443.19(M+1H)1+
(S)-N-(4-(하이드록시메틸(hydroxymethyl))페닐(phenyl))ㅍ르롤리딘(pyrrolidine)-2-카르복사미드(carboxamide)의 합성
계획 30：(S)-N-(4-(하이드록시메틸)페닐)피르롤리딘-2-카르복사미드의 제조를 위한 합성 루트
(9H-플루오렌-9-일)메틸-(2S)-2-((4-(하이드록시메틸)페닐)카르바모일)-1λ4-피르롤리딘-1-카르복사미드(274㎎; 0.66mmol)가 아르곤 분위기 하에서 건조 DMF(30㎖) 내에 용해되고, 0℃까지 냉각된다. 피페라진(325㎕; 3.29mmol)이 첨가되고, 혼합물은 실온에서 1시간 동안 교반된다. 용액은 고진공 하에서 농축되며, AcOEt(100㎖) 내에 용해되고, 수성 NaHCO3 및 브라인으로 세척된다. 유기 상은 건조되고, 진공 하에서 농축된다. 원료 물질은 갈색 오일로서 생성물을 수득하도록 크로마토그래피(0.5% TEA를 구비하여 DCM/MeOH 99：1 내지 90：10)를 통해 정제된다.
MS(ES+) m/z 221.12(M+1H)1+
MC-AA-Pro-PAB의 합성을 위한 일반 절차
계획 31：MC-AA-Pro-PAB의 제조를 위한 일반 합성 루트
원하는 MC-아미노산(1.1eq)이 아르곤 분위기 하에서 건조 DMF(0.5㎖/mmol) 내에 용해되고, 용액은 0℃까지 냉각된다. HATU(1.1eq), (S)-N-(4-(하이드록시메틸)페닐)피르롤리딘-2-카르복사미드(1.0eq) 및 DIPEA(1.5eq)가 연속하여 첨가된다. 반응물은 서서히 실온에 이르도록 두어지며, 하룻밤 동안 교반된다. 혼합물은 AcOEt로 희석되고, 1M KHSO4 및 브라인으로 세척된다. 유기 상은 건조되고, 진공 하에서 농축되며, 원료는 MC-AA-Pro-PAB를 수득하도록 크로마토그래피(DCM/MeOH 93：7)를 통해 정제된다.
MC-AA-Pro-PAB-PNP의 합성을 위한 일반 절차
계획 32：MC-AA-Pro-PAB-PNP의 제조를 위한 일반 합성 루트
건조 CH2Cl2(1㎖/mmol) 내의 4-니트로페닐 클로로포르메이트(2.2eq)의 용액이 아르곤 분위기 하에서 원하는 건조 CH2Cl2(1㎖/mmol) 및 피리딘(1.5eq) 내의 원하는 MC-AA-Pro-PAB(1.0eq)의 서스펜션에 첨가된다. 용매가 진공 하에서 완전히 제거된 후에 원료 혼합물은 MC-AA-Pro-PAB-PNP를 얻도록 AcOEt로 용리시키는 실리카의 패드 상부에서 여과된다.
MC-AA-Pro-PAB-MMAE의 합성을 위한 일반 절차
모노메틸 아우리스타틴(monomethyl auristatin) E(MMAE·TFA 1.1eq)가 질소 분위기 하에서 건조 DMF(200㎕) 내에 용해된다. MC-AA-Pro-PAB-PNP(1.0eq), HOAt(0.5eq) 및 DIPEA(5.0eq)가 연속적으로 첨가된다. 혼합물은 실온에서 48시간 동안 교반되고, 진공 하에서 농축된다. 원료는 200㎕의 혼합물 1：1 물/메탄올로 희석되고, 백색의 고체들로서 원하는 생성물들을 얻도록 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)를 통해 정제된다.
ESV6-AA-Pro-MMAE(58)의 합성을 위한 일반 절차
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6(P7, 700㎍, 0.760μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해된다. MC-AA-Pro-PAB-MMAE(1.0eq)가 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1%, TFA/아세토니트릴 0.1%, TFA 9.5：0.5 내지 2：8)으로 정제되고, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
사용된 AA, 유도체들의 m/z 및 수율은 다음의 표에 열거된다.
Py-S-S-MMAE의 합성을 위한 일반 절차
계획 33：Py-S-S-MMAE의 제조를 위한 일반 합성 루트
모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE·TFA 1.1eq)가 질소 분위기 하에서 건조 DMF(200㎕) 내에 용해된다. 다양하게 치환된 4-니트로페닐 (2-(피리딘-2-일디술파네일)에틸)카르보네이트(1.0eq), HOAt(0.5eq) 및 DIPEA(5.0eq)가 연속하여 첨가된다. 혼합물은 실온에서 48시간 동안 교반되고, 진공 하에서 농축된다. 원료는 200㎕의 혼합물 1：1 물/메탄올로 희석되고, 백색의 고체들로서 원하는 생성물을 얻도록 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)을 통해 정제된다.
ESV6-S-S-MMAE(59)의 합성을 위한 일반 절차
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6(P7, 700㎍, 0.760μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해된다. 원하는 Py-S-S-MMAE(1.0eq)가 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되고, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
사용된 R 기, 유도체들의 m/z 및 수율은 다음의 표에 열거된다.
PenCys-Asp-Lys-Asp-ESV6 펩티드(P14)의 합성
상업적으로 입수 가능한 2-클로로-트리틸클로라이드 레진(300㎎)이 DMF(3 x 5분 x 5㎖) 내에서 팽창된다. 상기 레진은 나타내는 순서로 Fmoc-PenCys(Trt), Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(NHBoc)-OH 및 Fmoc-Asp(tBu)-OH로 신장된다. 이러한 목적을 위해, Fmoc 보호된 아미노산(2.0eq), HBTU(2.0eq), HOBt(2.0eq) 및 DIPEA(4.0eq)가 DMF(5㎖) 내에 용해된다. 상기 레진은 DMF(5㎖) 내의 (S)-4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산(1mmol), HBTU(2.0eq) 및 DIPEA(2.0eq)으로 신장된다. 펩티드는 실온에서 1시간 동안 DCM 내의 50% HFIP의 혼합물로 상기 레진으로부터 분열된다. 용매는 감소된 압력 하에서 제거되며, 원료는 차가운 디에틸에테르 내에 침전되고, 원심 분리되며, 물/ACN 내에 용해되고, HPLC(15분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%, TFA 9.5：0.5 내지 5：5)을 통해 정제되며, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다. MS(ES+) m/z 949.3(M+H)+
PenESV6-S-S-MMAE(60)의 합성을 위한 일반 과정
PenCys-Asp-Lys-Asp-ESV6(700㎍, 0.760μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(840㎕) 내에 용해된다. 원하는 Py-S-S-MMAE(1.0eq)가 건조 DMF 용액(160㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다.
원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1%TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되며, 백색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다.
사용된 R 기와 유도체들의 m/z는 다음의 표에 열거된다.
(S)-N
1
-(4-((2-(2-시아노(cyano)-4,4-디플루오로피르롤리딘(difluoropyrrolidin)-1-일(yl))-2-옥소에틸(oxoethyl))카르바모일(carbomoyl))퀴놀린(quinolin)-8-일(yl))-N
4
-(2-(2,5-디옥소(dioxo)-2,5-디하이드로(dihydro)-1H-피르롤(pyrrol)-1-일(yl))에틸(ethyl))숙신이미드(succinimide)(P15)의 합성
계획 34：(S)-N1-(4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)-N4-(2-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피르롤-1-일)에틸)숙신이미드(P15)의 제조를 위한 합성 경로
(S)-4-((4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)아미노)-4-옥소부탄산(65㎎, 0.14mmol, 1eq), HATU(54㎎, 0.14mmol, 1eq) 및 1-(2-아미노에틸)말레이미드 HCl(25㎎, 0.14mmol, 1eq)가 1.5㎖의 DCM 및 500㎕의 DMF 내에 용해되었다. DIPEA(54㎎, 0.43mmol, 3eq)가 방울씩 첨가되었고, 반응물은 30분 동안 실온에서 교반되었다. 물이 첨가되었고, 유기층이 분리되었으며, 이후에 DCM으로 세 번 추출되었다. 원료는 황산나트륨 상부에서 건조되었고, 여과되었으며, 증발되었다. 상기 원료는 황색의 오일(50㎎. 0.0868mmol, 62%)을 수득하도록 크로마토그래피(10분 내의 DCM/MeOH 100：0 내지 95：5)를 통해 정제되었다. MS(ES+) m/z 582.6 (M+1H)1+
접합체 66의 합성
SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6(2㎎, 2.171μmol, 1.0eq)이 PBS pH 7.4(800㎕) 내에 용해된다. 말레이미도-NODAGA(3.3㎎, 4.343μmol, 2.0eq)이 건조 DMSO 용액(200㎕)으로 첨가된다. 반응물은 3시간 동안 교반된다. 원료 물질은 역상 HPLC(20분 내의 물 0.1% TFA/아세토니트릴 0.1% TFA 9.5：0.5 내지 2：8)로 정제되고, 황색의 고체를 얻도록 냉동 건조된다. MS(ES+) m/z 1346.36(M+1H)1+
단백질-OncoFAP의 일반 합성
단백질은 시스테인 잔기 당 TCEP-HCl의 30 당량을 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 환원된다. 생성물은 FPLC를 통해 정제되고, 상기 생성물들을 포함하는 부분들은 합체된다.
환원된 단백질은 이후에 부드럽게 흔들면서 1시간 동안 실온에서 시스테인 잔지 당 20 당량으로 (S)-N1-(4-((2-(2-시아노-4,4-디플루오로피르롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)카르바모일)퀴놀린-8-일)-N4-(2-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피르롤-1-일)에틸)숙신아미드와 반응된다.
상기 생성물은 이후에 FPLC를 통해 정제되며, 동일성을 확인하기 위해 LC/MS로 분석된다.
설명된 프로토콜은 단백질들, 효소들, 표적들, 항체들, 면역시토카인(immunocytokine)들, 전-염증 단백질들 및 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기들을 포함하는 펩티드들을 기능화하는 데 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 접합체들의 다른 예들은, 다음에 예시하는 바와 같이, FAP 약물 표적화제(targeting agent)에 결합된 단백질(예를 들어, 접합체 63, 접합체 63a), 그리고 다중 FAP 약물 표적화제들에 결합된 단백질(예를 들어, 69, 69a)이다. 볼은 일반 단백질 구조를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> Philochem AG
<120> Fibroblast Activation Protein Ligands for Targeted Delivery Applications
<130> 233 766
<150> EP20202856.9
<151> 2020-10-20
<150> EP20172953.0
<151> 2020-05-05
<150> EP20157036.3
<151> 2020-02-12
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide linker
<400> 1
Asp Arg Asp Cys
1
<210> 2
<211> 741
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> polyhistidine-tagged human Fibroblast Activating Protein (hFAP)
<400> 2
Leu Arg Pro Ser Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe
20 25 30
Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp
35 40 45
Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile
50 55 60
Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu
65 70 75 80
Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu
85 90 95
Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn
100 105 110
Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu
115 120 125
Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn
130 135 140
Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe
145 150 155 160
Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr
165 170 175
Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn
180 185 190
Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val
195 200 205
Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn
210 215 220
Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe
225 230 235 240
Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro
245 250 255
Val Pro Ala Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr
260 265 270
Trp Val Thr Asp Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln
275 280 285
Asn Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr
290 295 300
Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly
305 310 315 320
Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala
325 330 335
Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile
340 345 350
His Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly
355 360 365
Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe
370 375 380
Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr
385 390 395 400
Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys
405 410 415
His Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp
420 425 430
Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile
435 440 445
Ser Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu
450 455 460
Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys
465 470 475 480
Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys
485 490 495
Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu
500 505 510
Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe
515 520 525
Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile
530 535 540
Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu
545 550 555 560
Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile
565 570 575
Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg
580 585 590
Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala
595 600 605
Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro
610 615 620
Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met
625 630 635 640
Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr
645 650 655
Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile
660 665 670
His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile
675 680 685
Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr
690 695 700
Ser Asp Gln Asn His Gly Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr
705 710 715 720
Thr His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp His
725 730 735
His His His His His
740
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> compound in claim 7
<220>
<221> BINDING
<222> 1
<223> binding moiety A
<220>
<221> BINDING
<222> 4
<223> Cit-PAB-(moiety C)
<400> 3
Gly Gly Gly Val
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> compound in claim 7
<220>
<221> BINDING
<222> 1
<223> binding moiety A
<220>
<221> BINDING
<222> 4
<223> Cit-PAB-(N(Me)(CH2)2N(Me)C(O))-(moiety C)
<400> 4
Gly Gly Gly Val
1
Claims (32)
- 화합물, 이의 개개의 부분입체 이성질체(diastereoisomer)들, 이의 수화물(hydrate)들, 이의 용매화물(solvate)들, 이의 결정 형태들, 이의 개개의 호변체(tautomer)들 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 화합물은 다음의 구조를 가지는 모이어티(moiety) A를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 화합물은 다음의 구조를 가지는 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
여기서, B는 공유 결합 또는 공유 결합으로 결합된 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이다. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화합물은 다음의 화학식 I로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 화합물.
[화학식 I]
여기서, B는 공유 결합 또는 A를 C에 공유 결합으로 부착시키는 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이며,
C는 원자, 분자 또는 입자이거나 및/또는 치료제 또는 진단제이다. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모이어티 A는 다음의 구조 A1 또는 A2를 가지며, 여기서 m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, B는 다음의 일반 화학식 II 내지 화학식 V 중에서 임의의 것으로 나타나는 것을 특징으로 하는 화합물.
[화학식 II]
[화학식 III]
[화학식 IV]
[화학식 V]
여기서, 각 x는 0 내지 100, 바람직하게는 0 내지 50, 보다 바람직하게는 0 내지 30의 범위로부터 독립적으로 선택되는 정수이고, 더욱 보다 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 선택되는 정수이며;
각 y는 0 내지 30의 범위로부터 독립적으로 선택되는 정수이고, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 선택되는 정수이며;
각 z는 0 내지 5의 범위로부터 독립적으로 선택되는 정수이고, 바람직하게는 0, 1, 2, 3 및 4로부터 선택되는 정수이며;
*는 모이어티 A에 대한 부착점을 나타내고;
ㆍ는 모이어티 C에 대한 부착점을 나타내며,
여기서, (a) BS 및/또는 BL은 각기 치환되거나 치환되지 않은, 알킬렌(alkylene), 시클로알킬렌(cycloalkylene), 아릴알킬렌(arylalkylene), 헤테로아릴알킬렌(heteroarylalkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 헤테로시클로알킬렌(heterocycloalkylene), 알케닐렌(alkenylene), 시클로알케닐렌(cycloalkenylene), 아릴알케닐렌(arylalkenylene), 헤테로아릴알케닐렌(heteroarylalkenylene), 헤테로알케닐렌(heteroalkenylene), 헤테로시클로알케닐렌(heterocycloalenkylene), 알키닐렌(alkynylene), 헤테로알키닐렌(heteroalkynylene), 아릴렌(arylene), 헤테로아릴렌(heteroarylene), 아미노아실(aminoacyl), 옥시알킬렌(oxyalkylene), 아미노알킬렌(aminoalkylene), 이산성 에스테르(diacid ester), 디알킬실록산(dialkylsiloxane), 아미드(amide), 티오아미드(thioamide), 티오에테르(thioether), 티오에스테르(thioester), 에스테르(ester), 카르바메이트(carbamate), 히드라존(hydrazone), 티아졸리딘(thiazolidine), 메틸렌 알콕시 카르바메이트(methylene alkoxy carbamate), 이황화물(disulfide), 비닐렌(vinylene), 이민(imine), 이미다미드(imidamide), 포스포아미드(phosphoramide), 당류(saccharide), 포스페이트 에스테르(phosphate ester), 포스포아미드 카르바메이트(phosphoramide carbamate), 디펩티드(dipeptide), 트리펩티드(tripeptide) 및 테트라펩티드(tetrapeptide)로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 구조 단위를 포함하거나 구성되는 기이고;
(b) BS 및/또는 BL은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 구조 단위를 포함하거나 구성되는 기이며;
여기서, 각각의 R, R1, R2 및 R3은 각기 치환되거나 치환되지 않은, H, OH, SH, NH2, 할로겐, 시아노, 카르복실, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R4 및 R5는 각기 치환되거나 치환되지 않은, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되며;
각각의 Ra, Rb 및 Rc는 각기 더 치환될 수 있는, 단백질 생성 또는 비-단백질 생성 아미노산의 곁사슬 잔기들로부터 독립적으로 선택되고;
각 X는 NH, NR, S, O 및 CH2로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 NH이며;
각각의 n 및 m은 0 내지 100, 바람직하게는 0 내지 50, 보다 바람직하게는 0 내지 30에서 독립적으로 선택되는 정수이고, 더욱 보다 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 독립적으로 선택되며;
여기서, 각 *는 모이어티 A에 대한 최단 경로가 ㆍ에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내며; 각 ㆍ는 모이어티 C에 대한 최단 경로가 *에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내고;
(c) 하나 또는 그 이상의 BL은 다음의 구조 단위들 중에서 하나 또는 그 이상을 독립적으로 포함하거나 구성되며：
여기서, 각각의 상기 구조들에서, n은 1, 2, 3 또는 4이고;
n이 ＞1이고, 각각의 부착점이 Ra, Rb 및 Rc 중에서 임의의 하나를 나타낼 때, 상기 펩티드 단량체 단위(monomeric unit)들 중에서 하나 또는 그 이상 내에, 바람직하게는 상기 각각의 구조 내에 나타낸 다른 부착점으로부터 가장 먼 하나의 펩티드 단량체 단위 내에 존재할 수 있는 조건 하에서, 각 *는 모이어티 A에 대한 최단 경로가 ㆍ에 대한 경우보타 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내며; 각 ㆍ는 모이어티 C에 대한 최단 경로가 *에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내고;
(d) BL 및 BS 중에서 하나 또는 그 이상은 다음의 구조들로부터 독립적으로 선택되며：
*-Val-Ala-ㆍ; *-Val-Lys-ㆍ; *-Val-Arg-ㆍ,
여기서, 각 *는 모이어티 A에 대한 최단 경로가 ㆍ에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내고; 각 ㆍ는 모이어티 C에 대한 최단 경로가 *에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내고; 및/또는
(e) y는 1, 2 또는 3이고; 및/또는 적어도 하나의 BL은 다음의 구조들로부터 독립적으로 선택되는 분열될 수 있는 링커기(linker group)를 더 포함하며;
각 *는 모이어티 A에 대한 최단 경로가 ㆍ에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타내고; 각 ㆍ는 모이어티 C에 대한 최단 경로가 *에 대한 경우보다 적은 원자들을 포함하는 부착점을 나타낸다. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, B는 다음의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
여기서, B's 및 B''s는 각기 다음으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되며;
각 BL은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
각 n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
각 m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
각 x'는 0, 1 또는 2이며;
각 x''는 0, 1 또는 2이고;
각 y는 0, 1 또는 2이며;
z는 1 또는 2이고,
여기서, R, R1, R2, R3, Ra, Rb, Rc, X, * 및 ㆍ은 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따라 정의된다. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 화학식들 중에서 하나에 의해 나타나는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모이어티 C는 (a) 방사성 표지에 적합한 킬레이트제(chelating agent) 기; (b) 방사성 동위원소를 포함하는 방사성 기; (c) 킬레이트제와 방사성 동위원소의 킬레이트; (d) 형광단기(fluorophore group); (e) 세포독성 및/또는 세포증식 억제제(cytostatic agent); (f) 면역 조절제(immunomodulator agent); 또는 (g) 단백질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제8항에 있어서,
(a) 상기 방사성 표지에 적합한 킬레이트제 기는 황 콜로이드(sulfur colloid), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid：DTPA), 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid：EDTA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(tetraazacyclododecane)-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(tetraacetic acid：DOTA), 1,4,7-트리아자시클로노난(triazacyclononane)-N,N',N''-트리아세트산(triacetic acid：NOTA), 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸(tetraazacyclotetradecane)-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(tetraacetic acid：TETA), 이미노디아세트산(iminodiacetic acid)이나 비스(카르복시메틸이미다졸)글리신[bis(carboxymethylimidazole)glycine], 6-히드라지노피리딘(hydrazinopyridine)-3-카르복시산(carboxylic acid：HYNIC)으로부터 선택되며;
(b) 상기 방사성 동위원소를 포함하는 방사성 기는 223Ra, 89Sr, 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 123I, 124I, 125I, 131I, 18F, 211At, 225Ac, 89Sr, 225Ac, 117mSn 및 169Er로부터 선택되며;
(c) 상기 방사성 동위원소의 킬레이트는 (b) 열거된 동위원소 및/또는 (a)에 열거된 킬레이트제의 킬레이트이거나; 모이어티 C는 다음의 구조들 중에서 임의의 것으로부터 선택되는 기이고;
(d) 상기 형광단기는 크산텐(xanthene) 염료, 아크리딘(acridine) 염료, 옥사진(oxazine) 염료, 시아닌(cyanine) 염료, 스티릴(styryl) 염료, 코우마린(coumarine) 염료, 포르핀(porphine) 염료, 형광 금속-리간드 복합체(fluorescent metal-ligand complex), 형광 단백질, 나노결정들, 페릴렌(perylene) 염료, 보론-디피르로메텐(boron-dipyrromethene) 염료 및 프탈로시아닌(phtalocyanine) 염료로부터 선택되거나, 바람직하게는 다음의 구조들로부터 선택되며;
(e) 상기 세포독성 및/또는 세포증식 억제제는 토포이소머라아제(topoisomerase) 억제제들, 알킬화제(alkylating agent)들, 대사 길항물질(antimetabolite)들, 항체들, 유사분열 교란물질(mitotic disrupter)들, DNA 삽입제(intercalating agent)들, DNA 합성 억제제들, DNA-RNA 전사 조절인자(transcription regulator), 효소 억제제들, 조절 유전자들, 호르몬 반응 조절물질(hormone response modifier)들, 저산소증 선택성 세포독소(hypoxia-selective cytotoxin)들, 표피 성장 인자(epidermal growth factor) 억제제들, 항혈관제(anti-vascular agent)들, 그리고 이들의 둘 또는 그 이상의 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화학 요법제이고, 바람직하게는 다음의 구조들로부터 선택되며;
(f) 상기 면역 조절제는 CD3, CD25, TLR들, STING, 4-1BBL, 4-1BB, PD-1, mTor, PDL-1, NKG-2D IMiD들의 리간드들과 같은 면역 시스템을 조절할 수 있는 것으로 알려진 분자들로부터 선택되며, 여기서 리간드들은 작용제(agonist) 및/또는 길항제(antagonist)가 될 수 있거나;
(g) 상기 단백질은 IL2, IL10, IL12, IL15, TNF, 인터페론 감마(Interferon Gamma)와 같은 시토카인(cytokine)들로부터 선택되거나, 항체이다. - 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모이어티 B는 하나 또는 그 이상의 모이어티들 C 및/또는 모이어티들 A를 결합시키는 이작용기 또는 다작용기 모이어티이다.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 모이어티들 A, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 모이어티들 A를 독립적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 모이어티들 C, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 모이어티들 C를 독립적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 표 2 또는 표 3에 따른 구조를 가지는 화합물, 이의 개개의 부분입체 이성질체들, 이의 수화물들, 이의 용매화물들, 이의 결정 형태들, 이의 개개의 호변체들 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제14항에 따른 약학 조성물에 있어서,
(a) 인체 또는 동물체에 수행되는 수술 또는 치료 또는 진단 방법에 의해 상기 인체 또는 동물체의 치료를 위한 방법에 사용되거나;
(b) 질병 또는 장애로 고통 받거나 상기 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상의 치료 또는 예방을 위한 방법에 사용되거나;
(c) 질병 또는 장애로 고통 받거나 상기 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 수행되는 가이드 수술을 위한 방법에 사용되거나;
(d) 질병 또는 장애의 진단을 위한 방법에서, 인체 또는 동물체에 수행되고, 양전자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)과 같은 핵의학 영상화 기술을 수분하는 방법에 사용되거나;
(e) 질병 또는 장애로 고통 받거나 상기 질병 또는 장애의 위험이 있는 대상에 대한 치료제 또는 진단제의 표적 전달을 위한 방법에 사용되며,
각각의 상기 (b)-상기 (e)에서, 상기 질병 또는 장애는 암, 염증, 죽상경화증, 섬유증, 조직 재형성 및 켈로이드 장애로부터 독립적으로 선택되며, 바람직하게는 상기 암은 유방암, 췌장암, 소장암, 결장암, 다약제 내성 결장암, 직장암, 대장암, 전이성 대장암, 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 난소암, 간세포암, 식도암, 하인두암, 비인두암, 후두암, 골수종 세포들, 방광암, 담관암, 투명세포 신장 암종, 신경내분비 종양, 종양성 골연화증, 육종, 원발 부위 불명암(CUP), 흉선암, 섬유성 종양들, 신경 교종, 성상 세포증, 자궁경부암, 피부암, 신장암 및 전립선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 약학 조성물. - 제14항에 따른 사용들 중에서 임의의 것에 사용되기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제14항에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 화합물은 치료적 또는 진단적 관련 레벨로 상기 질병 부위에 주사 후에 바람직하게는 1시간을 넘는, 보다 바람직하게는 6시간을 넘는 연장된 체류를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 약학 조성물.
- 화합물, 이의 개개의 부분입체 이성질체들, 이의 수화물들, 이의 용매화물들, 이의 결정 형태들, 이의 개개의 호변체들 또는 이의 염으로서, 상기 화합물은,
다음의 구조를 가지는 모이어티 A를 포함하며,
접합 파트너(conjugation partner)와 반응하고 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 모이어티 L을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물. - 제17항에 있어서, 다음의 구조를 가지는 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
여기서, B는 공유 결합이거나, 원자들에 공유 결합으로 결합된 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이다. - 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 화합물은 다음의 화학식 VI로 나타나는 것을 특징으로 하는 화합물.
[화학식 VI]
여기서, B는 공유 결합이거나, A를 L에 공유결합으로 부착하는 원자들의 사슬을 포함하는 모이어티이다. - 제1항에 있어서, 모이어티 A는 다음의 구조 A1 또는 A2를 가지며, 여기서 m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, L은, 반응에 따라, 아미드, 에스테르, 카르바메이트, 하드라존, 티아졸리딘, 메틸렌 알콕시 카르바메이트, 이황화물, 알킬렌, 시클로알킬렌, 아릴알킬렌, 헤테로아릴알킬렌, 헤테로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 알케닐렌, 시클로알케닐렌, 아릴알케닐렌, 헤테로아릴알케닐렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로시클로알케닐렌, 알키닐렌, 헤테로알키닐렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아미노아실, 옥시알킬렌, 아미노알킬렌, 이산성 에스테르, 디알킬실록산, 아미드, 티오아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 에스테르, 카르바메이트, 히드라존, 티아졸리딘, 메틸렌 알콕시 카르바메이드, 이황화물, 비닐렌, 이민, 이미다미드, 포스포아미드, 당류, 포스페이트 에스테르, 포스포아미드, 카르바메이트, 디펩티드, 트리펩티드 또는 테트라펩티드 연결기(linking group)를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 모이어티 B는 제5항, 제6항 또는 제7항에 따라 정의되는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 모이어티 B는 하나 또는 그 이상의 모이어티들 L 및/또는 모이어티들 A를 결합시키는 이작용기 또는 다작용기 모이어티인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 모이어티들 A, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 모이어티들 A를 독립적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 모이어티들 L, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 모이어티들 L을 독립적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 모이어티 L은 H, NH2, N3, COOH, SH, Hal,
로부터 선택되며,
여기서, 각 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
각 m은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
각 Hal은 F, Cl, Br 또는 I이고;
각 R4는 각기 치환되거나 치환되지 않은, 카르복시, 알킬, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로, 할로겐, 그리고 시아노로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물. - 표 3에 따른 구조를 가지는 화합물, 이의 개개의 부분입체 이성질체들, 이의 수화물들, 이의 용매화물들, 이의 결정 형태들, 이의 개개의 호변체들 또는 이의 염.
- 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 접합 파트너를 접합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체를 제조하기 위한 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 화합물은 공유 결합을 형성하도록 상기 접합 파트너와 반응하여 접합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 접합체는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합 파트너는 치료제 또는 진단제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 조성물 또는 진단 조성물로서 상기 접합체를 조제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20157036.3 | 2020-02-12 | ||
| EP20157036 | 2020-02-12 | ||
| EP20172953 | 2020-05-05 | ||
| EP20172953.0 | 2020-05-05 | ||
| EP20202856.9 | 2020-10-20 | ||
| EP20202856 | 2020-10-20 | ||
| PCT/EP2021/053494 WO2021160825A1 (en) | 2020-02-12 | 2021-02-12 | Fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220154111A true KR20220154111A (ko) | 2022-11-21 |
Family
ID=83225945
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020227031463A KR20220154111A (ko) | 2020-02-12 | 2021-02-12 | 표적 전달 적용들을 위한 섬유아세포 활성화 단백질 리간드들 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2023514275A (ko) |
| KR (1) | KR20220154111A (ko) |
| CN (1) | CN115335370A (ko) |
| AU (1) | AU2021220663A1 (ko) |
| BR (1) | BR112022016049A2 (ko) |
| CA (1) | CA3171025A1 (ko) |
| IL (1) | IL295571A (ko) |
| MX (1) | MX2022009931A (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116925041A (zh) * | 2023-06-12 | 2023-10-24 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 靶向成纤维细胞激活蛋白的氟标记放射性药物前体、放射性标记化合物及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2018386298B2 (en) * | 2017-12-15 | 2023-09-07 | Praxis Biotech LLC | Inhibitors of fibroblast activation protein |
| EP3749663A1 (en) * | 2018-02-06 | 2020-12-16 | Universität Heidelberg | Fap inhibitor |
-
2021
- 2021-02-12 IL IL295571A patent/IL295571A/en unknown
- 2021-02-12 BR BR112022016049A patent/BR112022016049A2/pt unknown
- 2021-02-12 AU AU2021220663A patent/AU2021220663A1/en active Pending
- 2021-02-12 CN CN202180022488.6A patent/CN115335370A/zh active Pending
- 2021-02-12 MX MX2022009931A patent/MX2022009931A/es unknown
- 2021-02-12 CA CA3171025A patent/CA3171025A1/en active Pending
- 2021-02-12 JP JP2022549170A patent/JP2023514275A/ja active Pending
- 2021-02-12 KR KR1020227031463A patent/KR20220154111A/ko unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3171025A1 (en) | 2021-08-19 |
| BR112022016049A2 (pt) | 2022-11-16 |
| MX2022009931A (es) | 2022-09-12 |
| AU2021220663A1 (en) | 2022-10-06 |
| JP2023514275A (ja) | 2023-04-05 |
| CN115335370A (zh) | 2022-11-11 |
| IL295571A (en) | 2022-10-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3891138B1 (en) | Fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications | |
| US20230109312A1 (en) | Novel linkers for antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods of use | |
| RU2714933C2 (ru) | Конъюгаты var2csa-лекарственное средство | |
| ES2892340T3 (es) | Conjugados de fármaco de molécula pequeña | |
| EP4043452A1 (en) | Bivalent fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications | |
| KR20230145162A (ko) | 표적 전달 이용을 위한 2가 섬유모세포 활성화 단백질 리간드 | |
| US20190375837A1 (en) | Immunocytokine combination therapy | |
| AU2022204711B2 (en) | Peptidic linkers and cryptophycin conjugates, useful in therapy, and their preparation | |
| AU2018368520A1 (en) | Ligand-drug-conjugates as substrates for selective cleavage by the exopeptidase activity of Cathepsin B | |
| KR20220154111A (ko) | 표적 전달 적용들을 위한 섬유아세포 활성화 단백질 리간드들 | |
| WO2023144379A1 (en) | High-affinity ligands of fibroblast activation protein for targeted delivery applications | |
| US20230147962A1 (en) | Fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications | |
| US20240148916A1 (en) | Bivalent fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications | |
| CA3198066A1 (en) | Reactive conjugates | |
| CN116917278A (zh) | 用于靶向递送应用的二价成纤维细胞活化蛋白配体 | |
| WO2024052333A1 (en) | Multivalent fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications | |
| JP2019509298A (ja) | インビボでの切断可能連結部分によって抗マトリプターゼ抗体にコンジュゲートされた化学療法剤を用いる腫瘍細胞の標的化 | |
| EA046139B1 (ru) | Конъюгаты лиганда-лекарственного средства в качестве субстратов для селективного расщепления под действием экзопептидазной активности катепсина b |