JP2019509298A - インビボでの切断可能連結部分によって抗マトリプターゼ抗体にコンジュゲートされた化学療法剤を用いる腫瘍細胞の標的化 - Google Patents

インビボでの切断可能連結部分によって抗マトリプターゼ抗体にコンジュゲートされた化学療法剤を用いる腫瘍細胞の標的化 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗マトリプターゼ抗体および抗マトリプターゼ抗体と細胞毒との免疫複合体、ならびにマトリプターゼを発現するがん細胞、例えば多発性骨髄腫および乳がんの細胞の増殖を死滅させるかまたは阻害するためのそれらの使用に関する。特に、抗マトリプターゼモノクローナル抗体ならびに抗がん剤、例えばアウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む免疫複合体が導入され、それはインビボで強力な抗腫瘍活性を有する。さらに重要なことに、動物における体重減少または毒性の他の証拠が認められず、これは遊離薬剤がコンジュゲートから循環中に有意に放出されなかったことを示す。本発明はまた、これらの新しい免疫複合体を含む組成物およびマトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療するためのそれらの使用を提供する。さらに、免疫調節剤、例えばサリドマイドまたはその類似体の投与と組み合わせた、抗マトリプターゼ抗体または抗マトリプターゼ抗体および細胞毒の免疫複合体の投与は、これらのがんのより有効な治療を提供する。【選択図】図１１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１０年１月７日に出願された米国仮特許出願第６１／２９３，０３０号明細書、および２００９年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／２６２，３７３号明細書の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下での優先権を順に主張する、２０１０年１１月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／５７２３５号明細書の国内段階移行である、２０１２年５月１８日に出願された米国特許出願第１３／５１０，８０１号明細書の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１２０下での一部継続出願である、米国特許出願第１５／０７５，００８号明細書に対する優先権を主張する。前述の参考文献のすべてが、ここでそれら全体が参照により援用される。
本発明は、抗がん剤およびモノクローナル抗体を含む新しい免疫複合体、ならびに、限定はされないが血液学的悪性腫瘍および上皮がんを含む、マトリプターゼを発現するがん細胞、例えば多発性骨髄腫および乳がんの細胞の増殖を死滅させるまたは阻害するような免疫複合体の使用に関する。したがって、本発明はまた、マトリプターゼを発現するがんを治療する新しい方法に関する。
マトリプターゼは、乳腺および前立腺腫瘍細胞を含む上皮由来の細胞によって発現されるＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼである。マトリプターゼは、保存された細胞外ドメインに加えて、Ｎ末端膜貫通ドメインおよび複数の細胞外ドメインによって特徴づけられる（Ｌｉｎ Ｃ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４（２６）：１８２３７−１８２４２．）。マトリプターゼは、二本鎖活性酵素になるため、タンパク質分解切断により活性化される必要がある酵素原である。正常な生理学的条件下で、プロテアーゼ活性を密に調節する、マトリプターゼに結合するＨＧＦアクチベーターインヒビターＩ（ＨＡＩ−１）と称される内因性阻害剤が過剰量で存在する（Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４：１８２３１−１８２３６；Ｏｂｅｒｓｔ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８：２６７７３−２６７７９．）。ＨＡＩ−１はまた、阻害機能を発揮する以外に、マトリプターゼの活性化、適切な発現および細胞内輸送における重要な役割を担う（Ｏｂｅｒｓｔ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８：２６７７３−２６７７９；Ｏｂｅｒｓｔ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００５，２８９：Ｃ４６２−Ｃ４７０．）。
マトリプターゼは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）およびプロテアーゼ活性化受容体をインビトロでタンパク分解性に活性化することが知られている（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５：３６７２０−３６７２５；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９：１４８９９−１４９０８．）。ＨＧＦおよびｕＰＡ双方は、それらの役割において細胞浸潤および転移ならびに細胞運動性に関与している（Ｔｒｕｓｏｌｉｎｏ，Ｌ．ａｎｄ Ｃｏｍｏｇｌｉｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２００２，２：２８９−３００；Ｓｉｄｅｎｉｕｓ，Ｎ．ａｎｄ Ｂｌａｓｉ，Ｆ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．，２００３，２２：２０５−２２２．）。ＨＧＦにおける同族受容体は、チロシンキナーゼ受容体Ｍｅｔである。ＨＧＦの結合時、Ｍｅｔは、複数のシグナル伝達経路、例えば、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＳｒｃおよびＳｔａｔ３を誘導し得、最終的に浸潤性増殖をもたらす。マトリプターゼの過剰発現と組み合わされる高レベルのＭｅｔは、乳がんを有する患者における予後不良に関連する。
乳がん、前立腺がんおよび卵巣がんを含む幾つかの固形上皮由来腫瘍におけるマトリプターゼレベルの試験が、過去数年にわたり実施されている（レビューについては、Ｕｈｌａｎｄ，Ｋ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２００７，６３（２４）：２９６８−７８を参照のこと）。乳がんを有する患者からの組織マイクロアレイによると、Ｍｅｔ、マトリプターゼおよびＨＡＩ−１の高レベル発現が患者の予後不良に関連することが示された（Ｋａｎｇ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００３，６３：１１０１−１１０５．）。前立腺腫瘍では、ＨＡＩ−１の発現減少を伴うマトリプターゼのレベル上昇は、腫瘍グレードの上昇に関連した（Ｓａｌｅｅｍ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．，２００６：１５，２１７−２２７．）。卵巣がんを有する患者でのステージＩＩＩの８２％およびステージＩＩＩ／ＶＩの５５％においてもマトリプターゼの過剰発現が見出された。
腫瘍の開始、進行および転移におけるマトリプターゼの有意な役割を考慮すると、このプロテアーゼに対する幾つかの阻害剤が、それらの抗がん活性について動物モデルにおいて検討されている。マトリプターゼ阻害剤エコチンによる腫瘍増殖および転移形成の減少は、ＰＣ−３前立腺がん異種移植モデルにおいて示されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，１１０５４−１１０６１．）。別のマトリプターゼ阻害剤ＣＶＳ−３９８３もまた、アンドロゲン非依存性前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍サイズを減少させた（Ｇａｌｋｉｎ，Ａ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，２００４，６１，２２８−２３５）。
モノメチルアウリスタチンＥ（「ＭＭＡＥ」）は、化学療法に基づく治療における有望な用途を示しているＦＤＡ承認合成抗新生物剤である。ＭＭＡＥは、強力な抗有糸分裂化合物であるが、単独で投与されるとき、高レベルの細胞傷害性を示し、スタンドアロン化合物としてのその臨床的価値を制限している。モノメチルアウリスタチンＦ（「ＭＭＡＦ」）は、デスメチル−アウリスタチンＦとしても知られ、ＭＭＡＥと同様に抗有糸分裂剤である実験合成抗新生物薬である。ＭＭＡＥと同様、ＭＭＡＦは、単独で投与されるとき、高レベルの細胞傷害性を示す。したがって、ＭＭＡＦおよびＭＭＡＥ結合免疫複合体を利用する、治療的に有効な抗体に基づく治療に対しては緊急的需要がある。
本発明は、前述の需要を満たすため、血液がん、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭＯＬ））、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および多発性骨髄腫（ＭＭ）などを治療するための新しい治療薬、ならびに様々な上皮がん、例えば、前立腺、乳房、脳、腎臓、肺、結腸、膀胱、皮膚、甲状腺、および卵巣腫瘍、および中皮腫などを治療するための新しい治療薬を提供する。
ＩＩ型膜結合セリンプロテアーゼのマトリプターゼは、多発性骨髄腫（ＭＭ）や他の血液および上皮がん細胞の細胞株中で発現される。本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を選択的に標的化するため、細胞毒、例えばアウリスタチンＭＭＡＥおよびＭＭＡＦにコンジュゲートされた抗マトリプターゼ抗体を提供する。マトリプターゼを発現するがん細胞を標的化するための強力な抗がん剤とコンジュゲートされた抗体は、様々な利点を有する。例えば、化学療法剤のマトリプターゼを過剰発現する腫瘍細胞への選択的送達の結果、正常組織に対する毒性は低下する。さらに、マトリプターゼのｍＲＮＡレベルが腎臓、肺、結腸、膀胱、膵臓、前立腺、皮膚、乳房、甲状腺および卵巣を含む他の臓器における腫瘍内に見出されていることから、これらの免疫複合体はこれらのがんを治療するのに有用である。
一実施形態では、本発明は、抗マトリプターゼ抗体および細胞毒の免疫複合体を提供する。一部の実施形態では、細胞毒は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、カリケアマイシン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、細胞毒は、ＭＭＡＥである。一部の実施形態では、細胞毒は、ＭＭＡＦである。一部の実施形態では、細胞毒は、抗マトリプターゼ抗体に共有結合される。一部の実施形態では、抗マトリプターゼ抗体は、Ｍ６９である。したがって、一部の実施形態では、免疫複合体は、Ｍ６９に共有結合されたＭＭＡＥである。他の実施形態では、免疫複合体は、Ｍ６９に共有結合されたＭＭＡＦである。
一実施形態では、本発明はまた、免疫複合体で用いるためのリンカーを提供する。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能連結部分を含む。一部の実施形態では、切断可能連結部分は、カプテシン（Ｃａｐｔｈｅｓｉｎ）Ｂによって切断可能なＶａｌ−Ｃｉｔ部分またはＰｈｙ−Ｌｙｓ部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、抗体の表面に直接的にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、リンカーは、リジン側鎖に共有結合される。一部の実施形態では、リンカーは、第１の連結成分および第２の連結成分を含む。一部の実施形態では、第１の連結成分は、トリアゾール部分を介して第２の連結成分に結合される。一部の実施形態では、第１の連結成分は、抗体の表面に結合される。一部の実施形態では、第２の連結成分は、切断可能連結部分を含む。一部の実施形態では、第２の連結成分は、治療薬を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧに基づく。一部の実施形態では、第１の連結成分は、ＰＥＧに基づく。一部の実施形態では、第２の連結成分は、ＰＥＧに基づく。一部の実施形態では、抗体は、抗マトリプターゼ抗体を含む。一部の実施形態では、抗マトリプターゼ抗体は、Ｍ６９を含む。一部の実施形態では、治療薬は、細胞毒を含む。一部の実施形態では、細胞毒は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、カリケアマイシン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、細胞毒は、ＭＭＡＥである。一部の実施形態では、細胞毒は、ＭＭＡＦである。
さらに、本発明によると、免疫調節剤のサリドマイドが骨髄腫細胞内でのマトリプターゼの活性化を顕著に誘導することが発見されている。したがって、本発明は、ＭＭおよび他のがんを治療するための、限定はされないがサリドマイドおよびその類似体を含む免疫調節剤の投与と組み合わせた活性マトリプターゼを標的化する免疫複合体の投与を提供する。サリドマイド類似体は、当該技術分野で公知であり、例えば、レナリドミド、ＣＣ−３０５２、ＣＣ−４０４７、ＣＣ−５１０３、ＩＭｉＤ３、ＥＭ１２、およびＥＮＭＤ０９９５を含む。
したがって、一態様では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、治療有効量の抗マトリプターゼ抗体を含む組成物をかかる治療を必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、抗マトリプターゼ抗体はＭ６９である。
別の態様では、本発明は、治療有効量の抗マトリプターゼ抗体を含有する組成物を、治療有効量のマトリプターゼを活性化する免疫調節剤と組み合わせて、かかる治療を必要とする対象に投与することにより、血液学的悪性腫瘍を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、抗マトリプターゼ抗体はＭ６９である。一部の実施形態では、免疫調節剤は、サリドマイドまたはその類似体である。
別の態様では、本発明は、治療有効量の抗マトリプターゼ抗体と細胞毒との間の免疫複合体を含有する組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することにより、悪性細胞がマトリプターゼを発現する悪性腫瘍を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、細胞毒は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、およびアウリスタチンＰＥ、カリケアマイシン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、細胞毒は、ＭＭＡＥである。一部の実施形態では、細胞毒は、ＭＭＡＦである。一部の実施形態では、細胞毒は、抗マトリプターゼ抗体に共有結合される。一部の実施形態では、抗マトリプターゼ抗体はＭ６９である。したがって、一部の実施形態では、免疫複合体は、Ｍ６９に共有結合されたＭＭＡＥである。他の実施形態では、免疫複合体は、Ｍ６９に共有結合されたＭＭＡＦである。
別の態様では、本発明は、治療有効量の抗マトリプターゼ抗体と細胞毒との間の免疫複合体を含有する組成物を、治療有効量のマトリプターゼを活性化する免疫調節剤と組み合わせて、かかる治療を必要とする対象に投与することにより、悪性細胞がマトリプターゼを発現する悪性腫瘍を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、細胞毒は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、およびアウリスタチンＰＥ、カリケアマイシン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、細胞毒は、ＭＭＡＥである。一部の実施形態では、細胞毒は、ＭＭＡＦである。一部の実施形態では、細胞毒は、抗マトリプターゼ抗体に共有結合される。一部の実施形態では、抗マトリプターゼ抗体はＭ６９である。したがって、一部の実施形態では、免疫複合体は、Ｍ６９に共有結合されたＭＭＡＥである。他の実施形態では、免疫複合体は、Ｍ６９に共有結合されたＭＭＡＦである。一部の実施形態では、免疫調節剤は、サリドマイドまたはその類似体である。したがって、一部の実施形態では、該方法は、治療有効量のＭ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体のサリドマイドまたはサリドマイド類似体と組み合わせた投与を含む。他の実施形態では、該方法は、治療有効量のＭ６９−ＭＭＡＦ免疫複合体のサリドマイドまたはサリドマイド類似体と組み合わせた投与を含む。他の実施形態では、該方法は、治療有効量のＭ６９−アウリスタチンＰＥ免疫複合体のサリドマイドまたはサリドマイド類似体と組み合わせた投与を含む。
別の態様では、本発明は、抗マトリプターゼ抗体および細胞毒を含む、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体を提供する。
別の態様では、本発明は、上記の実施形態の何れかに従う、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体を含有する組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、哺乳動物からの造血細胞を含有する試験試料を抗マトリプターゼ抗体と接触させ、悪性腫瘍を示す、抗体とマトリプターゼとの間での複合体の形成を検出することにより、血液学的悪性腫瘍を診断する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、造血細胞を抗マトリプターゼ抗体または上記の実施形態の何れかに従う免疫複合体で治療することにより、マトリプターゼを発現する造血細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、上記の実施形態の何れかに従う免疫複合体を含有する哺乳動物組織または細胞におけるマトリプターゼの発現を検出するためのアッセイキットを提供する。
別の態様では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現する悪性腫瘍を治療するためのキットにおいて、上記の実施形態の何れかに従う免疫複合体を含むキットを提供する。
別の態様では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現する悪性腫瘍を治療するための、上記の実施形態の何れかに従う免疫複合体の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現する悪性腫瘍を治療するための薬剤の製造のための、上記の実施形態の何れかに従う免疫複合体の使用を提供する。
本発明のこれらや他の態様は、以下の図面および詳細な説明を参照することにより、より十分に理解されるであろう。
図１は、ヒトリンパ腫および骨髄腫細胞におけるマトリプターゼおよびＨＡＩ−１のウエスタン分析を表す。パネル（Ａ）における細胞株は、Ｈｓ４４５（レーン２）、ＨｕＴ７８（レーン３）、Ｆａｒａｇｅ（レーン４）、Ｒａｊｉ（レーン５）、Ｄａｕｄｉ（レーン６）、Ｎａｍａｌｗａ（レーン７）、Ｒａｍｏｓ（レーン８）、ＳＴ４８６（レーン９）、ＳＵ−ＤＨＬ−４（レーン１０）、ＳＵ−ＤＨＬ−６（レーン１１）、ＯＣＩ−ＬＹ−３（レーン１２）、ＲＰＭＩ−８２２６（レーン１３）を含む。パネル（Ｂ）における細胞株は、ＨＬ−６０（レーン２）、Ｒｅｈ（レーン３）、Ｊｕｒｋａｔ（レーン４）、ＳＵＰ−Ｔ１（レーン５）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（レーン６）、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（レーン７）、ＭＯＬＴ−３（レーン８）、ＭＯＬＴ−４（レーン９）、ＣＣＲＦ−ＳＢ（レーン１０）、ＲＳ４−１１（レーン１１）、ＴＨＰ−１（レーン１２）、Ｕ９３７（レーン１３）を含む。パネル（Ｃ）は、指定の３つのＭＭ細胞株におけるマトリプターゼのレベルの評価を示す。ＧＡＰＤＨは、内部対照としての役割を果たした。パネル（Ｄ）は、指定通りにマトリプターゼｍＡｂ Ｍ２４、ＨＡＩ−１ｍＡｂ Ｍ１９、および活性化マトリプターゼＭ６９で各々染色されたパラフィン包埋多発性骨髄腫の組織切片を示す。 図２は、ＭＭ細胞に対するＭ２４−ＤＯＸの細胞傷害性効果を図示する。２４ウェルプレート内のＭＭ細胞（１×１０５／ウェル）が、Ｍ２４−ＤＯＸの存在下または不在下で、様々な濃度で４８時間治療された。細胞数がＶｉ−Ｃｅｌｌカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって計数された。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。統計学的比較：＊、対照よりも有意に低い、ｐ＜０．０３６。プロット値は、３つの独立実験からの重複値を表す。 図３Ａ−Ｂは、Ｍ２４−ＤＯＸの細胞内への内部移行を表す。ＭＭ．１Ｓ細胞のＭ２４−ＤＯＸへの様々な時間での曝露後、細胞は固定され、染色された。免疫複合体は、蛍光顕微鏡により可視化された。ＤＡＰＩは、核染色に用いられた。 図４Ａ−Ｃは、正常な骨髄間葉細胞に対するＭ２４−ＤＯＸの低減された細胞傷害性を図示する。骨髄由来間葉系間質細胞（５×１０４／ウェル、２４ウェルプレート）が、Ｍ２４−ＤＯＸまたは遊離ＤＯＸで様々な濃度で４日間治療された。細胞数がＶｉ−Ｃｅｌｌカウンターによって測定された。（Ａ）は、Ｍ２４−ＤＯＸが間質細胞に対する細胞傷害性を欠いていることを示し；（Ｂ）は、心筋細胞に対する低減された細胞傷害性を示し；かつ（Ｃ）は、Ｍ２４−ＤＯＸとＤＯＸおよび対照との比較を示す。 図５は、サリドマイドによって誘導されるＭＭ細胞内でのマトリプターゼの活性化を図示する。ＭＭ細胞（ＭＭ．１Ｓ）は、２４時間適応の様々な濃度のサリドマイドで治療され、その後、ウエスタン分析により、酵素の活性型に特異的なモノクローナル抗体（Ｍ６９）を用いてマトリプターゼの活性化が検出された。プロテアーゼの潜在型についても、不活性型酵素に対するｍＡｂ（Ｍ２４）を用いて検出された。ＧＡＰＤＨは、対照としての役割を果たした。 図６Ａ−Ｂは、サリドマイドがＭＭ細胞をＭ６９−ＤＯＸに対して感作させるが、Ｍ２４−ＤＯＸに対して感作させない。（Ａ）ＭＭ細胞のＭ６９−ＤＯＸ単独による治療とＭ６９−ＤＯＸ／サリドマイド併用療法との比較；および（Ｂ）ＭＭ細胞のＭ２４−ＤＯＸ単独による治療とＭ２４−ＤＯＸ／サリドマイド併用療法との比較。 図７は、サリドマイドによって誘導されるＭＭ細胞内でのマトリプターゼの活性化を図示する。ＭＭ細胞（ＭＭ．１Ｓ）は、２４時間適応の様々な濃度のサリドマイドで治療され、その後、ウエスタン分析により、酵素の活性型に特異的なモノクローナル抗体（Ｍ６９）を用いてマトリプターゼの活性化が検出された。プロテアーゼの潜在型についても、不活性型酵素に対するｍＡｂ（Ｍ２４）を用いて検出された。ＧＡＰＤＨは、対照としての役割を果たした。 図８は、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ用量でのＭ６９−ＤＯＸによる治療を、２ｍｇ／ｋｇ用量でのＤＯＸおよび対照による治療と比較することで、活性マトリプターゼを標的化するＭ６９−ＤＯＸコンジュゲートがインビボで乳腺腫瘍増殖を阻害したことを図示する。 図９は、２ｍｇ／ｋｇ用量でのＤＯＸおよび対照による治療と比べての、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ用量でのＭ６９−ＤＯＸによる腫瘍重量の減少を図示する。 図１０は、対照と比べての、２０ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ用量でのＭ６９−ＤＯＸまたは２ｍｇ／ｋｇ用量でのＤＯＸによる治療中のマウスの平均重量を図示する。 図１１は、ＰＥＧ５−ＤＢＣＯを有するリジン側鎖を用いたＭＭＡＥとＭ６９との間のコンジュゲーションを図示する。 図１２は、図１１中に示される化学ステップを適用後の免疫複合体Ｍ６９−ＭＭＡＥのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を図示する。 図１３は、マトリプターゼ−ＭＭＡＥコンジュゲートが、重量減少または毒性の徴候を引き起こすことなく、ＴＮＢＣ ＭＤＡ−ＭＢ−４６８の増殖をいかに阻害するかを図示する。マウスは、１０００万個の腫瘍細胞が右側腹部に皮下接種された。腫瘍が触知可能であったとき（１００〜２００ｍｍ３）、マウスは２群（ｎ＝６）に無作為化され、免疫複合体が５ｍｇ（Ｍ６９−ＭＭＡＥ）／ｋｇ（四角形、下線）で腹腔内投与された場合の矢印により示される幾つかの時点に治療された。対照マウスは、生理食塩水（菱形、上線）を受けた。 図１４は、前立腺がん細胞および非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん細胞におけるマトリプターゼ陽性および陰性細胞に対するＭ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体のＩＣ５０を図示する。 図１５Ａ−Ｃは、トリプルネガティブ乳がん（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）（Ａ）非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん細胞（Ｈ３２２）（Ｂ）、および前立腺がん細胞（ＤＵ１４５）（Ｃ）に対するＭ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体のインビボ有効性を図示する。菱形は対照を表し、四角形を伴う線は５ｍｇ／ｍＬでのＭ６９−ＭＭＡＥを表し、（Ｂ）においては、三角形を伴う線は１ｍｇ／ｍＬでのＭ６９−ＭＭＡＥを表す。矢印は、免疫複合体で治療された時を示す。 図１６は、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞が、指定通りの様々な濃度でのＭ６９−ＭＭＡＥに、ｐＨ７．４（菱形）またはｐＨ６．５（四角形）のＨＣｌで酸性化された培地下で７２時間曝露されたことを図示する。生存度が、各々の培地を有する対照ウェル内の細胞の生存度の百分率として測定された。 図１７は、Ｔａｘｏｔｅｒｅ耐性および感受性前立腺がん細胞のＰＣ３Ｒ（菱形）またはＰＣ３（四角形）が、指定通りの様々な濃度でのＭ６９−ＭＭＡＥで治療されたことを図示する。生存度が、対照ウェル内の細胞の生存度の百分率として測定された。 図１８は、実施例１１〜１３で用いられるＡＤＣ構築物の全体設計を図示する。八角形はＤＢＣＯ単位を表し、矢印は銅を含まないクリックケミストリーを表す。 図１９は、実施例１１〜１３で用いられるアジド−ＰＥＧ４−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ構築物の化学合成を図示する。
マトリプターゼが主に正常な上皮および種々の上皮由来のがん細胞により産生される一方で、この膜結合プロテアーゼが血液学的悪性腫瘍の様々な細胞内にも存在することが、本発明により発見されている。本発明は、マトリプターゼに対する抗体を投与することにより血液学的悪性腫瘍を治療する方法を提供する。本発明は、抗マトリプターゼ抗体および細胞毒の免疫複合体、ならびに細胞がマトリプターゼを発現する悪性腫瘍を治療するために免疫複合体を用いる方法をさらに提供する。本発明の好ましい一実施形態では、アウリスタチン、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、またはアウリスタチンＰＥは、骨髄腫細胞を標的化するためのマトリプターゼに対するモノクローナル抗体とコンジュゲートされる。一部の実施形態では、該抗体はＭ６９である。したがって、一部の実施形態では、免疫複合体は、Ｍ６９−アウリスタチン、例えば、Ｍ６９−ＭＭＡＥ、Ｍ６９−ＭＭＡＦ、および／またはＭ６９−アウリスタチンＰＥである。
したがって、第１の態様では、本発明は、治療有効量の抗マトリプターゼ抗体を含有する組成物をかかる治療を必要とする対象に投与することにより血液学的悪性腫瘍を治療する方法を提供する。
この態様の一実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、血液学的悪性腫瘍がマトリプターゼを発現する細胞を含むがんである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、血液学的悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫、および骨髄腫から選択される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、血液学的悪性腫瘍が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭＯＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および多発性骨髄腫から選択される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、血液学的悪性腫瘍が多発性骨髄腫である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、血液学的悪性腫瘍が悪性細胞がマトリプターゼを発現するがんである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体がモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、方法を提供する。一部の実施形態では、モノクローナル抗体はＭ６９である。さらなる実施形態では、抗マトリプターゼ抗体は、細胞傷害性化合物に共有結合される。さらなる実施形態では、細胞傷害性化合物は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、および／またはアウリスタチンＰＥを含むアウリスタチンである。したがって、一部の実施形態では、本発明は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、および／またはアウリスタチンＰＥにコンジュゲートされた抗マトリプターゼ抗体を治療有効量で投与することにより血液学的悪性腫瘍を治療する方法を提供し、さらなる実施形態では、抗マトリプターゼ抗体はＭ６９である。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体から選択される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、組成物が薬学的に許容できる担体をさらに含む、方法を提供する。
第２の態様では、本発明は、治療有効量の抗マトリプターゼ抗体を含有する組成物を治療有効量のマトリプターゼを活性化する免疫調節剤と組み合わせてかかる治療を必要とする対象に投与することにより血液学的悪性腫瘍を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、免疫調節剤は、サリドマイドまたはサリドマイド類似体である。
この態様の一実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍が多発性骨髄腫である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体が活性化マトリプターゼに特異的な抗体である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体がｍＡｂ Ｍ６９である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体が抗原結合断片である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体がモノクローナル抗体であり、かつ免疫調節剤がサリドマイドまたはサリドマイド類似体である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、免疫調節剤が、マトリプターゼが抗マトリプターゼ抗体を含む組成物の投与前に活性化されるのに十分な時間かけて対象に投与される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、組成物が薬学的に許容できる担体をさらに含む、方法を提供する。
第３の態様では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体と細胞毒との間の免疫複合体を含む組成物を治療有効量でかかる治療を必要とする対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
この態様の一実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、血液学的悪性腫瘍がマトリプターゼを発現する細胞を含むがんである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍ががんである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍がマトリプターゼ陽性悪性Ｂ細胞リンパ腫または上皮がんである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍が、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＬ）からなる群から選択されるマトリプターゼ陽性悪性Ｂ細胞リンパ腫である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍が、前立腺、乳房、脳、腎臓、肺、結腸、膀胱、および卵巣からなる群から選択される上皮がん、ならびに他の腫瘍タイプ、例えば、甲状腺腫瘍、皮膚腫瘍、および中皮腫である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭＯＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍が多発性骨髄腫である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体がモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、方法を提供する。一部の実施形態では、モノクローナル抗体はＭ６９である。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体が抗原結合断片である、方法を提供する。一部の実施形態では、抗原結合断片は、Ｍ６９の抗原結合断片である。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、細胞毒が、毒素、抗生物質、および放射性同位体を含む化合物から選択される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、細胞毒が、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アウリスタチン、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、およびアウリスタチンＰＥ、カリケアマイシン、およびリシンから選択される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、細胞毒がドキソルビシン（ＤＯＸ）である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、細胞毒がアウリスタチンである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、細胞毒がＭＭＡＥである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、細胞毒がＭＭＡＦである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、細胞毒がアウリスタチンＰＥである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍がドキソルビシンの治療に対して難治性のがんである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍がアウリスタチンの治療に対して難治性のがんである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍がＭＭＡＥの治療に対して難治性のがんである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍がＭＭＡＦの治療に対して難治性のがんである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍がアウリスタチンＰＥの治療に対して難治性のがんである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、免疫複合体がＭ２４−ＤＯＸまたはＭ６９−ＤＯＸである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、免疫複合体がＭ２４−アウリスタチンまたはＭ６９−アウリスタチンである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、免疫複合体がＭ２４−ＭＭＡＥまたはＭ６９−ＭＭＡＥである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、免疫複合体がＭ２４−ＭＭＡＦまたはＭ６９−ＭＭＡＦである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、免疫複合体がＭ２４−アウリスタチンＰＥまたはＭ６９−アウリスタチンＰＥである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、細胞毒が共有結合を介して抗マトリプターゼ抗体にカップリングされる、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、対象が哺乳動物患者である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、対象がヒトである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、組成物が薬学的に許容できる担体をさらに含む、方法を提供する。
第４の態様では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、治療有効量の抗マトリプターゼ抗体と細胞毒との間の免疫複合体を含む組成物を治療有効量のマトリプターゼを活性化する免疫調節剤と組み合わせて、かかる治療を必要とする対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
この態様の一実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、悪性腫瘍が多発性骨髄腫である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体が活性化マトリプターゼに特異的な抗体である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体がモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、方法を提供する。一部の実施形態では、モノクローナル抗体はＭ６９である。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体が抗原結合断片である、方法を提供する。一部の実施形態では、抗原結合断片は、Ｍ６９の抗原結合断片である。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体がｍＡｂ Ｍ６９であり、かつ細胞毒がドキソルビシン（ＤＯＸ）である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体がｍＡｂ Ｍ６９であり、かつ細胞毒がアウリスタチンである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体がｍＡｂ Ｍ６９であり、かつ細胞毒がＭＭＡＥである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体がｍＡｂ Ｍ６９であり、かつ細胞毒がＭＭＡＦである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、抗マトリプターゼ抗体がｍＡｂ Ｍ６９であり、かつ細胞毒がアウリスタチンＰＥである、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、免疫調節剤がサリドマイドまたはサリドマイド類似体である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、悪性細胞がマトリプターゼを発現するような悪性腫瘍を治療する方法において、免疫調節剤がマトリプターゼが免疫複合体を含む組成物の投与前に活性化されるような十分な時間かけて対象に投与される、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、（ａ）悪性腫瘍が多発性骨髄腫であり；（ｂ）免疫複合体が抗マトリプターゼ抗体およびＤＯＸを含み；かつ（ｃ）免疫調節剤がサリドマイドまたはサリドマイド類似体である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、（ａ）免疫複合体が抗マトリプターゼ抗体およびアウリスタチンを含み；かつ（ｂ）免疫調節剤がサリドマイドまたはサリドマイド類似体である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、（ａ）免疫複合体が抗マトリプターゼ抗体およびＭＭＡＥを含み；かつ（ｂ）免疫調節剤がサリドマイドまたはサリドマイド類似体である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、（ａ）免疫複合体が抗マトリプターゼ抗体およびＭＭＡＦを含み；かつ（ｂ）免疫調節剤がサリドマイドまたはサリドマイド類似体である、方法を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を治療する方法において、（ａ）免疫複合体が抗マトリプターゼ抗体およびアウリスタチンＰＥを含み；かつ（ｂ）免疫調節剤がサリドマイドまたはサリドマイド類似体である、方法を提供する。
第５の態様では、本発明は、抗マトリプターゼ抗体および細胞毒を含む、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体を提供する。
この態様の一実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体ががん細胞の表面上に発現される抗原を認識する、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体がモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、免疫複合体を提供する。一部の実施形態では、モノクローナル抗体はＭ６９である。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体が抗原結合断片である、免疫複合体を提供する。一部の実施形態では、抗原結合断片は、Ｍ６９の抗原結合断片である。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体がモノクローナル抗体であり、かつ細胞毒が、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アウリスタチン、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、およびアウリスタチンＰＥ、カリケアマイシン、およびリシンからなる群から選択される、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、複合体が抗マトリプターゼ抗体とＤＯＸ部分との間の共有結合を介して形成される、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体の１分子がＤＯＸの最大１５分子とカップリングされる、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体の１分子がＤＯＸの約５〜１０分子とカップリングされる、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体の１分子がＤＯＸの約７分子とカップリングされる、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、複合体が抗マトリプターゼ抗体とアウリスタチン部分との間の共有結合を介して形成される、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体の１分子がアウリスタチン、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、および／またはアウリスタチンＰＥの最大１０分子とカップリングされる、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体の１分子がアウリスタチン、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、および／またはアウリスタチンＰＥの約５〜１０分子とカップリングされる、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体の１分子がアウリスタチン、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、および／またはアウリスタチンＰＥの約３〜５分子とカップリングされる、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体の１分子がアウリスタチン、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、および／またはアウリスタチンＰＥの約３分子とカップリングされる、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体の１分子がアウリスタチン、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、および／またはアウリスタチンＰＥの約１〜３分子とカップリングされる、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、抗マトリプターゼ抗体の不在下で投与されるとき、細胞毒と比べて低下した心毒性を有するかまたは全く心毒性を有しない、免疫複合体を提供する。
この態様の別の実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、マトリプターゼを発現しない骨髄由来の間葉系間質細胞に対する有害作用を最小限有するかまたは全く有しない、免疫複合体を提供する。
別の態様では、本発明は、第５の態様における上記の実施形態の何れかに従い、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体を含む組成物を提供する。
この態様の一実施形態では、本発明は、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、薬学的に許容できる担体をさらに含む、免疫複合体を提供する。
別の態様では、本発明は、リンカーを含む免疫複合体を提供する。一部の実施形態では、該抗体は、抗マトリプターゼ抗体を含む。一部の実施形態では、抗マトリプターゼ抗体はＭ６９を含む。一部の実施形態では、リンカーを含む免疫複合体は、治療薬を含む。一部の実施形態では、治療薬は、本開示に従う任意の治療薬である。一部の実施形態では、治療薬はアウリスタチンを含む。一部の実施形態では、治療薬はＭＭＡＥを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、切断可能連結部分を含む。一部の実施形態では、切断可能連結部分は、Ｃｉｔ−Ｖａｌ連結部分を含む。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ連結部分を含む。一部の実施形態では、切断可能連結部分は、カプテシンＢにより切断可能である。
一部の実施形態では、リンカーは、抗体の表面にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、該抗体は、抗マトリプターゼ抗体を含む。一部の実施形態では、抗マトリプターゼ抗体はＭ６９を含む。一部の実施形態では、リンカーは、曝露されたアミノ酸残基に共有結合される。一部の実施形態では、曝露されたアミノ酸残基は、システインを含む。さらなる実施形態では、リンカーは、スルフヒドリル−マレイミドカップリングを介して、システインに共有結合される。一部の実施形態では、曝露されたアミノ酸残基は、リジンを含む。さらなる実施形態では、リンカーは、アシル化によって形成されるアミド結合を介して、リジンに共有結合される。
一部の実施形態では、リンカーは、第１の連結成分および第２の連結成分を含む。一部の実施形態では、第１の連結成分は、本開示の任意の態様に従い、抗体の表面にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、第１の連結成分は、第２の連結成分に連結される。一部の実施形態では、第１の連結成分は、クリックケミストリーを介して第２の連結成分に連結される。一部の実施形態では、第１の連結成分は、トリアゾール部分を介して第２の連結成分に連結される。一部の実施形態では、第２の連結成分は、本開示の任意の態様に従い、切断可能連結部分を含む。一部の実施形態では、第２の連結成分は、本開示の任意の態様に従い、治療薬を含む。一部の実施形態では、治療薬は、細胞毒を含む。一部の実施形態では、細胞毒は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、カリケアマイシン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、細胞毒はＭＭＡＥである。一部の実施形態では、細胞毒はＭＭＡＦである。
一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧを含有する。一部の実施形態では、第１の連結成分は、ＰＥＧを含有する。一部の実施形態では、第２の連結成分は、ＰＥＧを含有する。一部の実施形態では、第１の連結成分および第２の連結成分は、ＰＥＧを含有する。
別の態様では、本発明は、リジン側鎖を介して第１の連結成分に共有結合された抗マトリプターゼ抗体を含む免疫複合体を提供し、ここで第１の連結成分はＰＥＧを含有し、第１の連結成分はトリアゾール部分を介して第２の連結成分に結合され、第２の連結成分は切断可能連結部分および治療薬を有し、また第２の連結成分はＰＥＧを含有する。一部の実施形態では、抗マトリプターゼ抗体はＭ６９を含む。一部の実施形態では、第１の連結成分は、１〜１０の間のＰＥＧ単位を有する。一部の実施形態では、第２の連結成分は、１〜１０の間のＰＥＧ単位を有する。一部の実施形態では、切断可能連結部分は、Ｖａｌ−Ｃｉｔ部分を含む。一部の実施形態では、切断可能連結部分は、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ部分を含む。一部の実施形態では、治療薬は、細胞毒を含む。一部の実施形態では、細胞毒は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、カリケアマイシン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、細胞毒はＭＭＡＥである。一部の実施形態では、細胞毒はＭＭＡＦである。
別の態様では、本発明は、血液学的悪性腫瘍を診断する方法において、哺乳動物からの造血細胞を含有する試験試料を抗マトリプターゼ抗体と接触させるステップと、抗体とマトリプターゼとの間の複合体の形成を検出するステップと、を含み、複合体の形成は悪性腫瘍を示す、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、マトリプターゼを発現する造血細胞の増殖を阻害する方法において、上記の実施形態の何れかに従い、造血細胞を抗マトリプターゼ抗体または免疫複合体を用いて治療するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、哺乳動物組織または細胞におけるマトリプターゼの発現を検出するためのアッセイキットにおいて、上記の実施形態の何れかに従う免疫複合体を含むアッセイキットを提供する。
別の態様では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療するためのキットにおいて、上記の実施形態の何れかに従う免疫複合体を含むキットを提供する。
別の態様では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療するための、上記の実施形態の何れかに従う免疫複合体の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療するための薬剤の製造のための、上記の実施形態の何れかに従う免疫複合体の使用を提供する。
定義
本明細書で用いられるとき、用語「生体試料」は、対象、好ましくはヒト対象からの体液、細胞または組織を含む検体を指す。試料はまた、天然にまたは人工的方法（例えば外科的手段）により、前悪性病変の１つまたは複数の悪性細胞と接触状態になっている体液であり得る。
本明細書で用いられるとき、用語「マトリプターゼの発現」などは、マトリプターゼの１つまたは複数の形態を発現する１つ以上の細胞を含む任意の生体試料を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物、また最も好ましくはヒトを指す。
本明細書で用いられるとき、用語「抗体」は、完全なインタクトな抗体、ならびにＦａｂ断片およびＦ（ａｂ）、その断片を指す。完全なインタクトな抗体は、モノクローナル抗体、例えばマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を含む。
「抗体断片」は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号明細書および米国特許第４，３３１，６４７号明細書ならびにそれらに含まれる参考文献で開示のような公知の方法により調製され得る。抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲは、抗体が結合するエピトープに対して構造的に相補的な抗体の可変領域のセグメントであり、可変領域の残りよりも可変的である。ＣＤＲペプチドは、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。かかる遺伝子は、例えば抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を用いることにより調製される。
本明細書で用いられるとき、用語「免疫複合体」は、抗体成分と分子または治療薬もしくは診断薬とのコンジュゲートを指す。治療薬または診断薬は、放射性または非放射性標識を含み得る。免疫複合体を調製するのに用いられる抗体は、限定はされないが、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を含む。ここで好ましい免疫複合体は、マトリプターゼモノクローナル抗体と細胞毒との間のコンジュゲートであり、より好ましい免疫複合体は、マトリプターゼモノクローナル抗体およびＦＤＡ承認抗がん剤、例えば限定はされないが、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アウリスタチン、カリケアマイシン、またはリシンを含むものである。
本明細書で用いられるとき、用語「細胞毒」は、細胞の機能を阻害または阻止し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。該用語は、化学療法剤、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤、酵素およびその断片、例えば、核酸分解酵素、抗生物質、および毒素、例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素、例えばその断片および／または変異体、ならびに下記に開示される様々な抗腫瘍剤または抗がん剤を含むことが意図される。該用語はまた、１つ以上の放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、ならびにＬｕの放射性同位体）を含む化合物を包含する。
本明細書で用いられるとき、用語「ドキソルビシン」（または「ＤＯＸ」）は、（８Ｓ，１０Ｓ）−１０−（４−アミノ−５−ヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロテトラセン−５，１２−ジオンの系統的（ＩＵＰＡＣ）化学名を有するアントラサイクリン抗生物質を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「アウリスタチン」は、限定はされないが、抗有糸分裂剤モノメチルアウリスタチンＥ（「ＭＭＡＥ」）、デスメチル−アウリスタチンＦとしても公知のモノメチルアウリスタチンＦ（「ＭＭＡＦ」）、およびアウリスタチンＰＥを含む。ＭＭＡＥは、（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミドの系統的（ＩＵＰＡＣ）化学名を有する。ＭＭＡＦは、（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸の系統的（ＩＵＰＡＣ）化学名を有する。アウリスタチンＰＥは、２−［［（２Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタノイル］アミノ］−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（２−フェニルエチルアミノ）プロピル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミドの系統的（ＩＵＰＡＣ）化学名を有する。
本明細書で用いられるとき、用語「担体」は、治療薬または診断薬と会合し、その薬剤の標的化細胞への送達を促進する能力がある分子または高次構造を指す。担体は、脂質またはポリマー、例えば両親媒性脂質または炭水化物などの分子、または高次構造、例えば、ミセル、リポソーム、およびナノ粒子を含んでもよい。
本明細書に開示される免疫複合体または組成物は、公知の方法により製剤化され得、１つ以上の薬学的に好適な賦形剤、１つ以上の追加的成分、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
本明細書に開示される免疫複合体または組成物は、例えばボーラス注射または連続注入を介する静脈内投与のために製剤化され得る。注射用製剤は、添加される保存剤とともに、例えばアンプル内または複数回投与容器内に単位剤形で存在し得る。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態を取り得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの調合剤を含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に、好適な媒体、例えば滅菌パイロジェンフリー水との組成において粉末形態であり得る。
免疫複合体または組成物はまた、哺乳動物の皮下にまたはさらに他の非経口経路により投与されてもよい。さらに、投与は、連続注入または単回もしくは複数回ボーラスによってもよい。一般に、投与される免疫複合体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的医学的状態および以前の病歴のような要素に応じて変化することになる。
さらなる薬学的方法は、治療もしくは診断コンジュゲートまたはネイキッド抗体の作用の持続時間を制御するために用いてもよい。徐放性製剤は、免疫複合体またはネイキッド抗体を複合または吸着させるためのポリマーの使用を通じて調製され得る。
抗体製剤は、投与量が生理学的に重要である場合、「治療有効量」で投与されると言われる。薬剤は、その存在が、がん細胞の数における減少、腫瘍のサイズにおける減少、または腫瘍の増殖における阻害を含む、レシピエント哺乳動物の生理における検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に重要である。特に、抗体製剤は、その存在が抗腫瘍応答を引き起こすかまたは自己免疫病態の徴候および症状を軽減する場合、生理学的に重要である。生理学的に重要な効果であれば、レシピエント哺乳動物における体液性および／または細胞性免疫応答の誘起でもあり得る。
所与の治療において用いられる医薬組成物の実際の好ましい量が、用いられている特定の形態、調合される特定組成物、投与の特定部位への適用方法、患者の体重、一般健康、性別など、治療されている特定の指示など、および主治医または獣医師を含む当業者によって理解されるような他の要素に応じて変化することは理解されるであろう。所与の投与プロトコルにおける最適な投与率は、従来の用量決定試験を用いて当業者により容易に決定され得る。
免疫複合体の調製
本明細書に記載の免疫複合体は、抗体を脂質、炭水化物、タンパク質、または他の分子と連結する公知の方法により調製され得る。例えば、本明細書に記載の結合分子は、免疫複合体を形成するため、本明細書に記載の担体（例えば、脂質、ポリマー、リポソーム、ミセル、またはナノ粒子）の１つ以上とコンジュゲートされ得、また免疫複合体は、共有結合、非共有結合、またはその他の何れかにより、治療薬または診断薬に組み込み得る。さらに、本明細書に記載の結合分子の何れかはさらに、本明細書に記載の１つ以上の治療薬または診断薬、または追加的な担体とコンジュゲートされ得る。一般に、１つの治療薬または診断薬が各結合分子に付着されてもよいが、２つ以上の治療薬または診断薬が同じ結合分子に付着され得る。さらに、治療薬は同じである必要はなく、異なる治療薬であり得る。
例えば、抗体およびＤＯＸの免疫複合体を合成するため、ＤＯＸをまず４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）と反応させ、マトリプターゼに対する抗体を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）と反応させ、その後、これら２つの中間体をカップリングしてもよい。免疫複合体を調製するのに用いてもよい追加的なリンカーは、下記の「リンカー（切断可能および切断不能な）」という表題のセクションにて考察される。
治療方法
本発明は、マトリプターゼ抗体または免疫複合体またはマトリプターゼ抗体もしくは免疫複合体を含む組成物のマトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療するための一次組成物としての使用を包含する。悪性腫瘍は、限定はされないが、固形腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｂ細胞悪性腫瘍および／またはＴ細胞悪性腫瘍を含む。固形腫瘍は、メラノーマ、がんおよび肉腫からなる群から選択され、がんは、腎がん、肺がん、腸管がん、胃がんおよびメラノーマからなる群から選択される。Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫の無痛性形態、Ｂ細胞リンパ腫の侵襲性形態、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、および多発性骨髄腫、Ｂ細胞障害および他の疾患からなる群から選択される。特に、本明細書に記載の組成物は、様々な自己免疫ならびにＢ細胞リンパ腫の無痛性形態、Ｂ細胞リンパ腫の侵襲性形態、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、およびワルデンストレームマクログロブリン血症を治療するために特に有用である。該治療方法は、抗体または免疫複合体を含む組成物を治療有効量でかかる治療を必要とする哺乳動物に投与するステップを含む。
抗体
マトリプターゼに対する抗体（「抗マトリプターゼ抗体」）は、当該技術分野で公知であり、また例えば、Ｌｉｎ Ｃ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４（２６）：１８２３７−１８２４２に開示された方法により作製され得る。マトリプターゼに対する抗体は、潜在型マトリプターゼに特異的な抗体および活性化マトリプターゼに特異的な抗体、ならびに潜在型および活性化マトリプターゼの双方を認識する抗体を含む。
本発明の抗体およびその免疫原性部分は、上記病態の何れかを予防または治療するための治療的に有効な濃度で投与される。この目標を達成するため、抗体は、当該技術分野で公知の種々の許容できる賦形剤を用いて製剤化されてもよい。典型的には、該抗体は、好ましくは注射により静脈内または腹腔内の何れかに投与される。この投与を達成するための方法は、当業者に公知である。組成物はまた、局所的または経口的に投与されるか、または粘膜を透過可能であってもよい。
患者への投与前、補助成分が抗体に添加されてもよい。液体製剤が好ましい。例えば、これらの補助成分は、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、または増量剤を含んでもよい。好ましくは、炭水化物は、糖または糖アルコール、例えば単糖、二糖または多糖、または水溶性グルカンを含む。糖またはグルカンは、フルクトース、ブドウ糖、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、α−およびβ−シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物を含み得る。
加えて、抗体は、その循環半減期を延長するため、ポリマーへの共有結合的コンジュゲーションにより化学修飾され得る。好ましいポリマー、およびそれらをペプチドに付着させるための方法は、米国特許第４，７６６，１０６号明細書；米国特許第４，１７９，３３７号明細書；米国特許第４，４９５，２８５号明細書；および米国特許第４，６０９，５４６号明細書において公知である。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた、本発明で有用である。それらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などを含む。
本発明の抗マトリプターゼ抗体は、キメラまたはヒト化抗体を含んでもよい。キメラおよびヒト化抗体の双方は、ヒトにて天然に産生される抗体変異体に対する類似性を高めるように化学修飾されており、結果的に免疫原性が低減される、元は非ヒト種から誘導される抗体を含む。キメラおよびヒト化抗体の双方は、典型的には組換え的に作製され、哺乳動物細胞培養液中で、例えばＣＨＯ細胞により発現される。かかる技術は、当業者に公知である。キメラ抗マトリプターゼ抗体とヒト化抗マトリプターゼ抗体との間の主な差異は、キメラ抗マトリプターゼ抗体が、典型的にはモノクローナル抗体のＦｃ領域とヒトＦｃ領域との置換を含む一方で、ヒト化抗体が、相補性決定領域（ＣＤＲ）が元のｍＡｂから「スワップインされる（ｓｗａｐｐｅｄ ｉｎ）」ことを除いてヒト免疫グロブリンと同一である（典型的にはヒト抗体「スキャフォールド」と称される）ことである。
循環半減期を延長するための別の薬剤送達系は、リポソームである。リポソーム送達系を調製する方法は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２：４７３４−９（１９８２）；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７−５０８（１９８０）；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１４３−７（１９８７）；およびＬａｎｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１：２１１−２２（１９９９）において考察されている。他の薬剤送達系は、当該技術分野で公知である。
リンカー（切断可能および切断不能）
本開示の抗マトリプターゼ抗体、例えばＭ６９は、治療薬または診断薬、例えば、ＤＯＸ、アウリスタチン（限定はされないが、ＭＭＡＥ／ＭＭＡＦを含む）に共有結合され、ひいては免疫複合体を形成してもよい。免疫複合体のリンカーに基づく技術の概要については、Ｊａｉｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ＡＤＣ Ｌｉｎｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２０１５ Ｎｏｖ；３２（１１）：３５２６−４０（ここでその全体が参照により援用される）に見出される。かかる免疫複合体中の共有結合は、切断可能連結部分、例えばリソソーム内部のカテプシンＢによって切断可能なＶａｌ−Ｃｉｔリンカーを含んでもよい。市販のＶａｌ−Ｃｉｔリンカーは、下記の実施例１０で用いるため、修飾された。他の切断可能連結部分は、カテスピン（Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）Ｂによってやはり切断可能なＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーを含んでもよい。最も簡単な切断可能連結部分の一部が、還元的（すなわち細胞内）環境下で切断可能なジスルフィド（Ｓ−Ｓ）橋を含む。しかし、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーなどの切断可能連結部分は、例えば、無差別な切断を受け得るジスルフィド架橋よりも高い特異性をもたらし、ひいては優れた選択肢を提示するが、任意のかかる切断可能連結部分は、本発明の範囲内で検討されるべきである。本発明に適し得る切断可能連結部分の概要が、Ｌｅｒｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１２ Ｊａｎ １５；２０（２）：５７１−８２（ここでその全体が参照により援用される）に提示される。あるいは、リンカーは、切断不能であってもよい。切断不能なリンカーは、切断可能なリンカーよりも多様であり、細胞内環境下で切断に抵抗性を示す任意の連結部分を含んでもよい。例えば、時として 興味深い具体的な切断不能なリンカーは、ＦＤＡ承認免疫複合体トラスツズマブエムタンシン（商品名Ｋａｄｃｙｌａ）中に見出されるＳＭＣＣリンカーを含み、Ｍ６９−ＤＯＸ免疫複合体を調製するため、下記の実施例２においても探索される。
本開示のリンカー（および前記リンカーに結合される治療薬）は、抗体に直接的にコンジュゲート、すなわち免疫グロブリンに共有結合されてもよい。共有結合は、可変ドメインとは対照的に、理想的には定常ドメインの１つの中に位置する、免疫グロブリン骨格を含むアミノ酸の１つに直接的に生じてもよい。かかるアミノ酸は、天然起源（例えば、天然起源のリジンまたはシステイン残基）であってもよく、または免疫グロブリンは、最小の立体障害を有する最適な結合部位を結合相手のリンカーに提供するため、人為的突然変異（例えば、非天然起源のリジンまたはシステイン残基）であってもよい。あるいは、リンカーは、翻訳後修飾免疫グロブリン上に見出される化学的部分に結合（例えば、Ｎ−グリカンに結合）され得る。
免疫複合体の大部分では、抗体骨格中に位置するシステイン残基へのリンカーの直接的結合が用いられる。これらのリンカーは、「マレイミド型リンカー」として公知であり、マレイミドとシステイン（Ｃｙｓ）中に見出されるスルフヒドリル側鎖との反応性を利用する。マレイミドリンカーの２つの最も一般的なタイプは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）およびマレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｍｃｃ）リンカーを含む。マレイミドリンカーの下側は、免疫複合体からの薬剤−リンカーの中途欠損をもたらすレトロマイケル反応を含む、血漿中での化学的不安定性を示していた。直接コンジュゲーションの異なるタイプ、および下記の実施例１０で用いられるものは、リンカーがアジド官能基の代わりに活性化カルボキシル基からなる場合の、リンカーと抗体との間にアミド結合をもたらす、アシル化によるリジン（Ｌｙｓ）側鎖のε−アミノ側鎖に対する直接コンジュゲーションである。
リンカーおよび治療薬は、本明細書に記載のような２段階コンジュゲーション技術を用いて抗体にコンジュゲートされてもよい。この２段階コンジュゲーション技術では、「クリックケミストリー」、特に銅を含まないクリックケミストリーを利用してもよい。抗体コンジュゲーションにおけるクリックケミストリーの使用は、幾つかの固有の利点、例えば、反応モニタリングおよびＡＤＲ判定において形成するクリック環系のＵＶに基づく検出をもたらし得る。リンカーは、最初に２つの異なる連結成分、例えば（必ずではないが）、免疫グロブリン骨格中に位置するリジン側鎖にコンジュゲート（すなわちアシル化）するアシル化剤（例えば、カルボン酸、ハロゲン化アシル、または無水物など）を有し、さらに歪んだアルキン（例えばＤＢＣＯ）を有する第１の連結成分、およびアジド（Ｎ３）基および治療薬を有する第２の連結成分からなってもよく、それにより、第１の成分および第２の成分が互いに近接範囲内に入るとき、歪んだアルキンが（トリアゾール部分を形成する）アジド基と反応し、第１の連結成分を第２の連結成分に連結する。第１の連結部分または第２の連結部分の何れかは、歪んだアルキン基および／またはアジド基を含んでもよく、またその逆の場合を含んでもよい；すなわち、第１の連結部分は歪んだアルキンを、かつ第２の連結部分はアジド基を含んでもよく、または第１の連結部分はアジド基を含んでもよく、かつ第２の連結部分は歪んだアルキンを含んでもよい。したがって、本開示のリンカーは、「クリックケミストリー」を通じて結合されるとき、トリアゾール部分、例えば図１１中に図示されるようにＤＢＣＯとＮ３との反応中に形成されるようなトリアゾール部分を含んでもよい。
したがって、一部の実施形態では、免疫複合体の全体構造は、ｍＡｂ−第１の連結成分−第２の連結成分−治療薬を含むことになり、ここで第１の連結成分は、第２の連結成分に（クリックケミストリーによって形成される）トリアゾール部分を介してコンジュゲートされており、かつ第１の連結成分は、免疫グロブリン骨格中に位置するアミノ酸残基（例えば、システインまたは好ましくは本明細書に記載のようなリジン）にコンジュゲートされている。かかる実施形態では、切断可能連結部分の第１の連結成分および／または第２の連結成分の何れか、例えばＶａｌ−Ｃｉｔリンカーへの組み込みは可能であり、図１１に示される。理想的にいえば、切断可能連結部分は、第２の連結成分（すなわち、治療薬、例えばＭＭＡＥおよび／またはＭＭＡＦを有する連結成分）中に位置することになる。
本開示の免疫複合体中のリンカーは、ＰＥＧに基づくリンカーであってもよい。例えば、図１１に示されるように、一部の実施形態では、第１の連結成分および第２の連結成分の双方（ひいてはリンカー全体）は、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）リピートを有する。ＰＥＧに基づくリンカーは、ＰＥＧを有しないリンカーを上回る様々な利点を提供し得る。例えば、ＰＥＧに基づくリンカーは、より大きい可動性を提供し得ることから、例えば、リンカーが抗原結合ドメイン（例えば超可変領域）に極めて接近したアミノ酸残基にコンジュゲートされる場合、リンカー／治療薬が抗原／受容体の表面要素と結合または相互作用する見込みが減少することになり、故に免疫複合体全体がより治療的に有効になる。加えて、リンカーが（例えば、ＤＢＣＯおよびＮ３を用いる）クリックケミストリーを通じて作製されるような実施形態では、理論によって拘束されることを望まないが、連結成分中でのＰＥＧの使用は、トリアゾール部分中に見出される四環系構造と任意の曝露された芳香族側鎖、特にトリプトファン側鎖との間の非特異的相互作用（ｐｉ−ｐｉ相互作用）を阻止するためのスペーサーとして役立ち得る。本開示のＰＥＧに基づくリンカーは、第１の連結成分および第２の連結成分を用いるような実施形態において、第１の連結成分および第２の連結成分の各々につき、全部で１〜２０の間の何れかのＰＥＧ単位、例えば１〜１０のＰＥＧ単位のリピートを含んでもよい。より典型的には、第１の連結成分および第２の連結成分の各々につき３〜７のＰＥＧ単位である。例として、下記の実施例１０は、第１の連結成分に対して５つのＰＥＧ単位および第２の連結成分に対して４つのＰＥＧ単位を有するＭ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体を示す。
アウリスタチン、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ
ＭＭＡＥを含むアウリスタチンは、非常に強力な細胞毒のクラスを表す。理論によって拘束されることを望まないが、ＭＭＡＥのようなアウリスタチンが、適切な細胞分裂にとって重要である、チューブリンの重合を遮断することにより細胞分裂を阻害すると考えられる。したがって、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、およびアウリスタチンＰＥなどの化合物は、有糸分裂を阻害するための「抗有糸分裂剤」として分類される。かかる細胞毒の効力は顕著である。ＭＭＡＥは、例えばＤＯＸよりも１００〜１０００倍強力であるが、ＤＯＸは本発明における使用に適する。ＭＭＡＥは、この強力な毒性にもかかわらず、単独での薬剤としての投与に適さない。しかし、細胞傷害性ペイロードは、マトリプターゼ抗体、例えばＭ６９などの抗体にカップリングされるとき、特定の悪性細胞に対して特異的であることができる。
前述のように、本発明の抗体および組成物は、好ましくは、ヒト患者を治療し、上で規定された病態の何れかを予防または治療するため、用いられる。好ましい投与経路は、非経口である。非経口投与では、本発明の組成物は、薬学的に許容できる非経口媒体と併せて、単位用量の注射可能な形態、例えば溶液、懸濁液または乳濁液で製剤化されることになる。かかる媒体は、本質的に非毒性であり、治療用でない。かかる媒体の例として、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、およびハンクス溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルなどの非水性媒体もまた用いてもよい。
本明細書に開示される抗マトリプターゼ免疫複合体、例えばｍＡｂ−アウリスタチンおよびｍＡｂ−Ｄｏｘコンジュゲートは、抗がん剤を開発する、詳細にはがん細胞を標的化するための例を表す。抗マトリプターゼｍＡｂは、特定タイプの腫瘍とより良好に機能することになる抗チューブリン化合物などの他のタイプの細胞毒に連結され得るか、または任意のタイプの薬剤、例えば、ペプチド、ｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ、および重篤な副作用故にがん治療においてほとんど有望でない非常に有毒な化合物の標的化送達のため、リポソームまたはナノ粒子にカップリングされ得る。
以下の非限定例が、本発明の特定の態様をさらに例示する。
実施例１
多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫細胞におけるマトリプターゼの発現
ヒト造血悪性腫瘍の２４の細胞株パネルを、マトリプターゼおよびその内因性阻害剤ＨＧＦアクチベーターインヒビター１すなわちＨＡＩ−１に対するウエスタンブロッティングにより分析した（図１）。細胞可溶化物を、２４の造血がん細胞（レーン２〜１４）およびＴ−４７Ｄ乳がん細胞（レーン１）から調製した。等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。マトリプターゼおよびＨＡＩ−１のレベルは、指定通りに抗マトリプターゼｍＡｂおよび抗ＨＡＩ−１ ｍＡｂを用いるイムノブロット分析により評価した（図１Ａおよび１Ｂ）。
マトリプターゼがＢ細胞リンパ腫の大部分および多発性骨髄腫細胞において発現され、これはプロテアーゼがこれらのがんにおける重要なマーカーであることを示した。それに対し、リンパ腫および骨髄腫におけるＨＡＩ−１レベルは、がんにおける場合よりもはるかに低いように思われ、ＨＡＩ−１の発現は、高悪性度のリンパ腫において低下することが多い（表１）。
多発性骨髄腫細胞におけるマトリプターゼの発現をさらに検証するため、パラフィン包埋ＭＭ標本の６つの症例を試験した。マトリプターゼは４つの症例において陽性であり、それらの中の２つがＨＡＩ−１陽性であり、残りの２つが陰性であった（図１Ｄ）。
多発性骨髄腫の細胞株中でのマトリプターゼのレベルを評価した（図１Ｃ）。３つ全部のＭＭ細胞がプロテアーゼを生成した。
実施例２
ＤＯＸ−免疫複合体の調製
マトリプターゼに対するモノクローナル抗体（Ｍ２４またはＭ６９、ＣＹ Ｌｉｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．から入手；Ｌｉｎ Ｃ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４（２６）：１８２３７−１８２４２；Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，２８５（４１）：３１７５５−３１７６２）を、幾つかのマイナーな変更を伴う、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用いることにより、ＤＯＸ（Ｓｉｇｍａ）にコンジュゲートした。簡潔に述べると、ＤＯＸを、クロスリンカーＳＭＣＣ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル）と１：３〜１：１．５（ＤＯＸ：ＳＭＣＣ）の間のモル比（ＭＲ）で、常に硬化しながら室温で１時間反応させた。約２００ｍｇのＭ２４ ｍＡｂをＳＰＤＰ（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸スクシンイミジル）と室温で１時間反応させ、その後、遠心フィルター装置（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてリン酸緩衝液を交換した。あるいは、ｍＡｂは、セファデックスＧ５０を用いるゲル濾過により、遊離ＳＰＤＰから分離することができる。次に、ＤＯＸマレイミド誘導体をチオール化Ｍ２４またはＭ６９ ｍＡｂに室温で３時間コンジュゲートし、その後、リン酸緩衝液で透析し、遊離ＤＯＸを除去した。セファデックスＧ５０を用いるゲル濾過は、調製規模が１ｇより多いタンパク質である場合に非カップリングＤＯＸを除去するためにも用いることができる。ＤＯＸに対するタンパク質のモル比は、蛍光およびタンパク質濃縮によりＤＯＸを測定することによって判定する。
ＤＯＸがＵＶ励起により蛍光を発することから、ＤＯＸの抗体へのカップリングは、免疫複合体により生成される蛍光に基づき、測定した。約１μｇ／ｍｌでのＭ２４−ＤＯＸは、２５ｎＭのＤＯＸの場合と同じ蛍光強度を有する。それ故、ｍＡＢの１分子がＤＯＸのほぼ７分子とカップリングされる。
Figure 2019509298
略称：ＡＭＬ、急性骨髄性白血病；ＡＬＬ、急性リンパ性白血病；ＢＬ、バーキットリンパ腫；ＤＬＢＬ，びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；ＥＢＶ、エプスタイン・バーウイルス；ＨＬ、ホジキンリンパ腫；ＬＬ、リンパ性白血病；ＭＭ、多発性骨髄腫；ＳＭＲＶ、リスザルレトロウイルス
実施例３
多発性骨髄腫細胞に対するＭ２４−ＤＯＸの細胞傷害性
免疫複合体の細胞傷害性効果を評価するため、ＭＭ細胞を様々な濃度のコンジュゲートされたＤＯＸで４８時間処理した。免疫複合体は、細胞増殖を用量依存的様式で阻害した。免疫複合体のＥＣ５０は、５μｇ／ｍｌ（タンパク質）であった。この細胞傷害性効果は、２００ｎＭの遊離ＤＯＸでの処理の場合でも認められた。５μｇ／ｍｌのＭ２４−ＤＯＸの濃度が蛍光強度に基づくと２５０ｎＭの遊離ＤＯＸに等しいことから、それ故、コンジュゲートされたＤＯＸの効力は、遊離薬剤と類似する。細胞の非修飾抗体への曝露は、細胞増殖に対する効果を有せず、Ｍ２４−ＤＯＸに誘導される細胞傷害性効果がＤＯＸ活性を通じて媒介されることを示した。ＯＰＭ−２およびＲＰＭＩ−８２２６を含む２つの他のＭＭ細胞株もまた、２４ウェルプレート内のＭＭ細胞（１×１０５／ウェル）がＭ２４−ＤＯＸの存在下または不在下で異なる濃度で４８時間治療された場合の図２で示される通り、Ｍ２４−ＤＯＸの細胞傷害性活性について試験した。細胞数は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって計数した。
細胞の両タイプもまた、ＭＭ．１Ｓの応答と同様に薬剤に応答した。
実施例４
Ｍ２４−ＤＯＸの核局在化
ＤＯＸの免疫複合体のＭＭ．１Ｓ細胞への内部移行を実証するため、蛍光顕微鏡を用いて、様々な期間での細胞の薬剤への曝露後のＭ２４−ＤＯＸの細胞内局在化を追跡した。様々な期間でのＭＭ．１Ｓ細胞のＭ２４−ＤＯＸへの曝露後、細胞を固定し、染色した。免疫複合体を蛍光顕微鏡により可視化した。ＤＡＰＩを核染色に用いた。
Ｍ２４−ＤＯＸ曝露の３分後、微量の核蛍光を少数の細胞内で検出した。蛍光染色細胞の数と核内局在化シグナルの強度は、３０分より長いインキュベーション時間とともに有意に増加した（図３Ａ）。より高い拡大率を有する写真は、薬剤に６０分以上曝露された細胞の核の腫脹を呈し、典型的なＤＯＸ誘導性のアポトーシスを示した（図３Ｂ）。これらのデータは、免疫複合体が、抗原への結合後、迅速に内部移行され、処理の１０分後、ＤＯＸの有意な核局在化が認められたことを示す。
実施例５
骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のＭ２４−ＤＯＸに対する耐容性
マトリプターゼの発現が欠如するヒト骨髄由来ＭＳＣを、骨髄由来間葉系間質細胞（５×１０４／ウェル、２４ウェルプレート）が異なる濃度のＭ２４−ＤＯＸまたは遊離ＤＯＸで４日間処理された場合の図４で示される通り、Ｍ２４−ＤＯＸの細胞傷害性選択性を判定するための対照として用いた。細胞数は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌカウンターによって測定した。
ＭＳＣは、２０μｇ／ｍｌ相当の高い濃度の免疫複合体に対して非感受性を示した一方で、遊離ＤＯＸは、５ｎＭで細胞増殖を有意に阻害することができた。マトリプターゼの発現は、主正常組織内の上皮細胞に制限された。心筋細胞内でのこのプロテアーゼの不在は、Ｍ２４−ＤＯＸ有意に低下した心毒性を呈することを示す。
実施例６
活性マトリプターゼの標的化
ＤＯＸはまた、酵素の活性のある２本の鎖に特異的に結合する別のマトリプターゼｍＡｂ（Ｍ６９）とコンジュゲートした。活性マトリプターゼレベルが大部分の乳腺腫瘍に見出された一方、プロテアーゼの活性型は乳腺の正常組織内でかろうじて検出可能である（図５）。これらのデータは、Ｍ６９−ＤＯＸと称されるＭ６９とのＤＯＸコンジュゲートが、正常組織への毒性と関連して、活性化マトリプターゼを発現する腫瘍を標的化する中でさらなる選択性をもたらす。上皮組織がマトリプターゼを発現するとき、Ｍ２４−ＤＯＸの健常組織への毒性が懸念される。例えば、がん細胞内のルイスＹ抗原を標的化する、ＢＲ９６と称される以前のＤＯＸコンジュゲートは、かなりの胃腸（ＧＩ）毒性が原因で第ＩＩ相試験において失活した（Ｔｏｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９９，１７：４７８−４８４）。上皮組織内でのマトリプターゼの潜在型の発現と対照的に、このプロテアーゼの活性型のレベルは、免疫組織化学によりほぼ検出不能である。したがって、Ｍ６９−ＤＯＸは、上皮に対する毒性はあまりない。
実施例７
サリドマイドによるＭ６９−ＤＯＸの増強された細胞傷害性効果
サリドマイドは、多発性骨髄腫治療において治療的であり、サリドマイドおよびデキサメタゾンの組み合わせは、多発性骨髄腫を有する患者を治療するための最も一般的な治療計画の１つであり、応答速度は最大６０〜７０％である（Ｄｅｎｚ，Ｕ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，２００６，４２：１５９１−１６００；Ｇｉｅｓｅｌｅｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２００８，９９：１００１−１００７）。サリドマイドなどの現行のＭＭ治療薬と組み合わせたＤＯＸコンジュゲート双方の有効性を試験した。Ｍ６９−ＤＯＸ単独は、Ｍ２４−ＤＯＸほどに大して強力でなかった。意外にも、Ｍ６９−ＤＯＸ治療による細胞増殖の阻害がサリドマイドにより有意に増強された一方で、Ｍ２４−ＤＯＸの阻害活性は改変されなかった（図６Ａ〜Ｂ）。サリドマイド単独がＭＭ細胞増殖に対する効果を有しなかったことから、サリドマイドと組み合わされたＭ６９−ＤＯＸによるこの増強された阻害は、相乗的であるように思われた（図６Ａ）。したがって、これらの試験では、サリドマイドが増強された増殖の阻害をもたらしたことが示される。
実施例８
ＭＭ細胞内でサリドマイドによって誘導されるマトリプターゼ活性化
サリドマイドおよびＭ６９−ＤＯＸコンジュゲートとともに生じた細胞傷害性における増加を試験するため、活性化マトリプターゼの発現に対するサリドマイドの効果を測定した。ＭＭ細胞内でのマトリプターゼの活性化は、５０μＭのサリドマイドでの２４時間治療後、著しく増強された（図８）。サリドマイドは、少なくとも部分的にはＶＧＥＦ産生の阻害を通じて、ＭＭと骨髄間質細胞との間の相互作用に干渉することにより血管新生抑制活性を発揮することが知られている。サリドマイドは、ＭＭ細胞の細胞増殖に対する効果をほとんど有しないように思われる一方（図７Ａ〜Ｂ）、マトリプターゼを活性化するその能力は重要な新規の知見であり、これは、Ｍ６９−ＤＯＸコンジュゲートにより活性マトリプターゼ陽性骨髄腫細胞を標的化することによる、ＭＭ細胞のサリドマイド治療に対する応答を利用するための新規な手法を示唆する。
実施例９
活性マトリプターゼをインビボで標的化するＭ６９−ＤＯＸによる乳腺腫瘍増殖の阻害
Ｍ６９−ＤＯＸがインビボで腫瘍増殖を抑制する有効性を評価するため、ヒト乳房異種移植腫瘍モデルを用いた。乳腺腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ４６８）を有するＮＯＤ／重症複合免疫不全マウスを、２０または１０ｍｇ／ｋｇの何れかのＭ６９−ＤＯＸで週２回治療するとともに、２ｍｇ／ｋｇのＤＯＸで治療した。未治療対照群におけるマウスの腫瘍サイズは３週目に著しく増加し、何れかの用量のＭ６９−ＤＯＸで治療し、ＤＯＸで治療したマウスにおける腫瘍増殖は、全治療経過の間に有意に消失した（図８）。単一のｍＡｂがＤＯＸの７つの分子と付着し、Ｍ６９−ＤＯＸの１０ｍｇ／ｋｇでの用量は、投与したＤＯＸの０．０３５ｍｇ／ｋｇに等しい。これらの結果は、乳腺腫瘍をインビボで治療するために活性化マトリプターゼを標的化するＤＯＸコンジュゲートの強力な効力および有効性を実証する。
Ｍ６９−ＤＯＸで治療したマウスにおける腫瘍塊の重量減少。治療経過の終了時、腫瘍塊を実験マウスから収集し、秤量した。何れかの用量のＭ６９−ＤＯＸで治療し、ならびにＤＯＸで治療した群からの腫瘍の平均重量は、未治療対照群からの場合の約５０％に減少した（図９）。Ｍ６９−ＤＯＸによる腫瘍重量における有意な減少により、活性化マトリプターゼを発現する腫瘍細胞へのＤＯＸの部位特異的送達の有効性がさらに確認される。
Ｍ６９−ＤＯＸ治療による最小毒性
Ｍ６９−ＤＯＸまたはＤＯＸの何れかで治療したマウスの平均重量は、未治療対照群からの場合と比べて減少が顕著でなく（１５％未満の減少）、これはかかる用量でのＭ６９−ＤＯＸが十分な耐容性を示したことを示す（図１０）。Ｍ６９−ＤＯＸの２０ｍｇ／ｋｇでの用量は注目すべき毒性をもたらさず、これは薬剤用量が最大耐容用量に達するように漸増され得ることを示す。
実施例１０
コンジュゲート：Ｍ６９−ＭＭＡＥを形成するためのＭＭＡＥのＭ６９ ｍＡｂへの放出可能リンカーを介したカップリング
本明細書に記載の通り、免疫複合体を形成するため、ＭＭＡＥをＭ６９にカップリングさせた。放出可能リンカー技術は、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００２，１３：８５５−８６９；Ｂｌｏｏｄ ２００３，１０２：１４５８−１４６５；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００３，２１：７７８−７８４（これらのすべてはここでそれら全体が参照により援用される）に記載の、オリジナルなカテプシンＢ切断可能リンカーであるＳｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓのバリン−シトルリン−ＰＡＢＡリンカーに基づいた。バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコールカルバメートリンカーは、（ｉ）２段階のペグ化、（ｉｉ）銅を含まないクリックケミストリーを介したコンジュゲーション、および（ｉｉｉ）システインスルフヒドリル−マレイミドカップリングに代わるｍＡｂのアシル化リジン側鎖により修飾した。ＡＤＣアセンブリの全体設計を図１８に示す。アジド−ＰＥＧ４−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ構築物の化学合成は、図１９に示す通りであった。本設計により、このリンカープラットフォームが、ＤＢＣＯおよびＮ３を用いる銅を含まないクリックケミストリーを用いて改善され、重要な薬剤負荷段階を非常に穏やかな条件下、化学量論的に制御された様式で実施することができた。システイン残基の一時的に還元された水硫基を用いる代わりに、リジン側鎖を用いて、リンカー−薬剤リガンドを抗体の表面上にコンジュゲートした（図１１）。この手法がシステイン間のジスルフィド橋に影響しないことから、抗マトリプターゼ抗体は、コンジュゲーション手順の間に構造的にインタクトな状態を維持し、ミスフォールド／解離した抗体鎖による活性低下を伴う課題を排除する。さらに、リジン側鎖は、ｍＡｂの表面上で容易に利用可能であることから、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド橋を還元する必要がなく、ｍＡｂの構造的不安定化およびマレイミドコンジュゲーション後の酸化時の不適正なジスルフィド結合形成に関する課題を排除した。適切な分析方法（ＨＲ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析）により、免疫複合体の直近のバッチが工業標準を満たしていることが示された（図１１）。極めて疎水性の薬剤分子であっても使用を促進するクリックケミストリーの両前駆物質上のコンジュゲートの薬剤−リンカー部分においてＰＥＧスペーサーを用いることにより、さらなる進歩が達成された。ＰＥＧ鎖は、ｍＡｂと薬剤とを分離しておく程に十分に長いことで、非特異的な薬剤および抗体相互作用の確率を低減し、またリンカーのＰＥＧ５−ＰＥＧ４立体配置が、銅を含まないクリックケミストリーによりもたらされる四環系の疎水性を補償した。選択した細胞傷害性化合物は、モノメチルアウリスタチンＥ、すなわちＭＭＡＥであった。ＰＥＧ化リンカーの可動性および長さは、ＭＭＡＥを切断および放出するため、カテプシンＢに高度な接近性をもたらす。コンジュゲーション反応は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により監視し、各ｍＡｂ分子への３．５の薬剤の連結に対応する７０００Ｄａの平均分子量の増加を示した。
Ｍ６９−ＭＭＡＥの細胞傷害性効力を実証するため、トリプルネガティブ乳がんＭＤＡ−ＭＢ４６８に対する免疫複合体のインビトロでの細胞傷害性の有効性を評価した。乳がん細胞は、ＭＭＡＥ連結免疫複合体に対して感受性を示し、ＩＣ５０は３．４μｇ／ｍｌであった。各Ｍ６９分子が平均で３．５分子のＭＭＡＥを含有したとき（図１１）、コンジュゲート中でのＭＭＡＥに対する感受性は１．６ｎＭであった。この実験はまた、免疫複合体が内部移行され、毒素が細胞内に放出されることを実証した。
実施例１１
Ｍ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体のインビトロ細胞傷害性
実施例１０に記載のようなＭ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体のインビトロ細胞傷害性を評価するため、ＴＮＢＣ（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢＴ５４９）、前立腺（ＤＵ１４５およびＰＣ３）、膵臓（ＰＡＮＣ１およびＭｉａＰａｃａｌ）、ＮＳＣＬ（Ｈ３２２およびＨ１２９９）、卵巣（ＯＶＣＡＲ５）、胃（ＡＧＳ）、およびマントル細胞リンパ腫（Ｍｉｎｏ、Ｊｅｋｏ、ＭａｖｅｒおよびＺ１３８）がんなどの腫瘍細胞を、指定通りの様々な濃度でのＭ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体に曝露した。免疫複合体への持続的曝露の７２時間後、以下のようなＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイにより細胞傷害性を評価した。つまり、ＭＴＳ比色分析（Ｐｒｏｍｅｇａ製ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６）を製造業者のプロトコルに従って実施した。がん細胞を９６ウェルプレートに８０００細胞／ウェルで蒔き、段階的滴定でＭ６９−ＭＭＡＥに３７℃で７２時間曝露した。未治療対照ウェルに関して、パーセント生存度を免疫複合体濃度に対してプロットした。各試験の結果は、５通りの測定の平均である。これらの細胞に対するＭ６９−ＭＭＡＥのＩＣ５０の値を下の表２にまとめた。指定腫瘍細胞に対するＭ６９−ＭＭＡＥのＩＣ５０は、上記のように９６ウェルプレートを用いるＭＴＳ比色分析法により測定した。ＩＣ５０値は、ＡＤＣが３．５ＭＭＡＥ／ｍＡｂの化学量論比を有することを考慮して、ＡＤＣの平均（μｇ／ｍＬ）±標準偏差およびＭＭＡＥ濃度に相当するｎＭとして表した。
これらのがん細胞は、免疫複合体に対して感受性を示し、コンジュゲートのＩＣ５０は範囲が１桁台前半〜１０の位のμｇ／ｍｌであった。胃がん細胞ＡＧＳがＭＭＡＥコンジュゲートに対して非常に感受性が高く、ＩＣ５０がわずか１．５μｇ／ｍＬであった一方で、マントル細胞リンパ腫細胞Ｍａｖｅｒは、ＩＣ５０に達するのにより高濃度（３０μｇ／ｍＬ）のコンジュゲートを必要とした。約３分子のＭＭＡＥが各ｍＡｂに付着されるとき、ＩＣ５０値は、指定通りの保有されるＭＭＡＥ濃度として表した。コンジュゲートの選択的細胞傷害性を実証するため、ＢＴ５４９およびＨ１２９９などのマトリプターゼ陰性細胞のＩＣ５０についても得た（図１４）。マトリプターゼ陽性および陰性細胞のＩＣ５０の比は、１８〜４８の範囲でかなり顕著であり（Ｈ１２９９対Ｈ３２２、およびＢＴ５４９対ＭＤＡ−ＭＢ２３１）、これはＭ６９−ＭＭＡＥの選択性の度合いに応じて、最小化された副作用の利益が得られるものであることを示唆した。
Figure 2019509298
実施例１２
Ｍ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体を含むインビボ異種移植試験
実施例１０に記載のようなＭ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体を用いてパイロット異種移植試験を実施した。マウスコンジュゲートを１０ｍｇ／ｋｇで週３回腹腔内投与したヌードマウスにおける毒性試験（Ｎ＝６）を、キメラＭ６９−ＭＭＡＥコンジュゲートを試験する前に実施した。体重減少または毒性の徴候がなく、これは構築物が安定であり、正常組織を標的にしなかったことを示す。この情報に基づき、ヒトトリプルネガティブ乳腺腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を有するマウスを、Ｍ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体で治療した。図１３は、重要なことにコンジュゲートがこのトリプルネガティブ乳がんに対して強力な抗がん活性を有する一方、動物において体重減少または毒性の他の証拠が認められなかったことを示し、これは遊離薬剤がコンジュゲートから循環中に有意に放出されなかったことを示す。これがマウスにおけるマウス抗体であることから、マトリプターゼに対する抗体応答であれば想定されないことになる。図１４は、対照マウスおよびＭ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体で治療されたマウスにおける中央値腫瘍体積（ｍｍ３単位）の結果を示し、腫瘍サイズにおける有意な増加が、Ｍ６９−ＭＭＡＥで治療されたマウスと比べて対照群において認められた。
これらの結果に基づき、さらなるインビボ異種移植試験が認められた。これらのさらなる異種移植試験は、様々なタイプのがんに対するＭ６９−ＭＭＡＥのインビボ有効性を評価するために実施した。ＴＮＢＣ（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、前立腺がん細胞（ＤＵ１４５）、およびＮＳＣＬがん細胞（Ｈ３２２）を、トリプシン溶液を用いて対数増殖期にて収集し、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ懸濁液１００μｌ中の生細胞（７×１０６個）を、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μｌと混合し、動物の右側腹部に皮下注射した。一旦腫瘍が触知可能であると、マウスを各々、マウス６匹の治療群に無作為化した。動物は、５ｍｇ／ｋｇのＭ６９−ＭＭＡＥまたは１ｍｇ／ｋｇのＭ６９−ＭＭＡＥの腹腔内注射を週２回受けた。腫瘍サイズは、デジタルノギスで測定し、式４／３π×長さ×幅２を用いて算出した。結果は、Ｍ６９−ＭＭＡＥの治療によるトリプルネガティブ乳腺腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ４６８およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の有効な退縮を示した（図１５Ａ）。ＮＳＣＬおよび前立腺がんマウス双方の腫瘍増殖についても、媒体対照の１つと比べて大きく寛解した（図１５Ｂ、Ｃ）。Ｍ６９−ＭＭＡＥの抗腫瘍活性は、わずか１ｍｇ／ｋｇの用量で有効なままである（図１５Ｂ）。意外にも、動物における体重減少または毒性の他の証拠が認められず、これは遊離薬剤がコンジュゲートから循環中に有意に放出されなかったことを示す（図１５Ａ）。
実施例１３
前立腺がん細胞は酸性細胞外ｐＨ下でＭ６９−ＭＭＡＥに対する感受性がより高い
マトリプターゼの活性化がアシドーシスにより誘導される。したがって、活性化マトリプターゼを発現するがん細胞は、抗原レベルの増加に起因する酸性条件下で、実施例１０に記載のようなＭ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体の細胞傷害性効果に対する感受性がより高い。これは、ＤＵ１４５およびＰＣ３前立腺がん細胞双方がｐＨ６．５のＨＣｌ酸性培地下で免疫複合体に対する感受性が高くなるという実験により証明された。ＩＣ５０は、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞において各々、８から１μｇ／ｍｌ、および６．８から２μｇ／ｍＬ未満に有意に低下した（図１６）。培地の炭酸緩衝化によりＣＯ２インキュベーター内で１時間後にｐＨが漸増したことから、酸性条件への曝露は約３０分間だけ維持した。
腫瘍微小環境は、「ワールブルグ効果」とも称される現象の、酸素化条件と無関係にがん細胞の高いグリコール活性から生じる乳酸の蓄積に起因する酸性細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）によって特徴づけられる。蓄積された証拠によると、高い乳酸レベルが腫瘍の浸潤性および転移性進行ならびに腫瘍再発における主な駆動力であることが示される。したがって、Ｍ６９−ＭＭＡＥは、強力な毒素の、酸性環境下で活性化マトリプターゼを発現するがん細胞、例えば前立腺がん細胞への選択的送達を可能にする。
実施例１４
Ｔａｘａｔｅｒｅ抵抗性前立腺がん細胞（ＰＣ３Ｒ）はＭ６９−ＭＭＡＥに対する感受性を示す
化学療法抵抗性がん細胞に対する実施例１０に記載のようなＭ６９−ＭＭＡＥ免疫複合体のインビトロ有効性を判定するため、ｔａｘｔｅｒｅ抵抗性細胞をコンジュゲートで治療した。ＰＣ３Ｒ細胞は、有糸分裂阻害に対する抵抗性に反して、親ＰＣ細胞のＭＭＡＥコンジュゲートに対する感受性と同様であった（図１７）。これは、Ｍ６９−ＭＭＡＥが化学療法抵抗性前立腺がんを有する患者にとっていかに有効な治療であるかを強調する。
極めて多数の様々な修飾が本発明の範囲および精神から逸脱することなくなされ得ることは当業者によって理解されるであろう。したがって、本明細書に記載の本発明の様々な実施形態があくまで例示的であり、本発明の範囲を限定することが意図されないことは理解されるべきである。本明細書に引用されるすべての参考文献は、それら全体が参照により援用される。

Claims (25)

  1. 抗マトリプターゼ抗体またはその抗原結合断片、および細胞毒を含む、マトリプターゼを発現するがん細胞を選択的に標的化する免疫複合体において、前記細胞毒がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、およびアウリスタチンＰＥからなる群から選択されることを特徴とする免疫複合体。
  2. 請求項１に記載の免疫複合体において、前記抗マトリプターゼ抗体がＭ６９モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含むことを特徴とする免疫複合体。
  3. 請求項１乃至２の何れか一項に記載の免疫複合体において、リンカーをさらに含むことを特徴とする免疫複合体。
  4. 請求項３に記載の免疫複合体において、前記リンカーが切断可能連結部分を含むことを特徴とする免疫複合体。
  5. 請求項４に記載の免疫複合体において、前記切断可能連結部分が、カプテシン（Ｃａｐｔｈｅｓｉｎ）Ｂによって切断可能なＶａｌ−Ｃｉｔ連結部分またはＰｈｙ−Ｌｙｓ連結部分を含むことを特徴とする免疫複合体。
  6. 請求項３乃至５の何れか一項に記載の免疫複合体において、前記リンカーが前記抗マトリプターゼ抗体上のリジン残基に共有結合されることを特徴とする免疫複合体。
  7. 請求項３乃至６の何れか一項に記載の免疫複合体において、前記リンカーがＰＥＧを有することを特徴とする免疫複合体。
  8. 請求項１乃至２の何れか一項に記載の免疫複合体において、リンカーをさらに含み、かつ前記リンカーが第１の連結成分および第２の連結成分を含むことを特徴とする免疫複合体。
  9. 請求項８に記載の免疫複合体において、前記第１の連結成分が前記抗マトリプターゼ抗体上のリジン残基に共有結合されることを特徴とする免疫複合体。
  10. 請求項８乃至９の何れか一項に記載の免疫複合体において、前記第１の連結成分が前記第２の連結成分にトリアゾール部分を介して結合されることを特徴とする免疫複合体。
  11. 請求項８乃至１０の何れか一項に記載の免疫複合体において、前記第２の連結成分が切断可能連結部分を含むことを特徴とする免疫複合体。
  12. 請求項１１に記載の免疫複合体において、前記切断可能連結部分が、カプテシンＢによって切断可能なＶａｌ−Ｃｉｔ連結部分またはＰｈｙ−Ｌｙｓ連結部分を含むことを特徴とする免疫複合体。
  13. 請求項８乃至１２の何れか一項に記載の免疫複合体において、前記第１の連結成分がＰＥＧを有することを特徴とする免疫複合体。
  14. 請求項８乃至１３の何れか一項に記載の免疫複合体において、前記第２の連結成分がＰＥＧを有することを特徴とする免疫複合体。
  15. 請求項８乃至１４の何れか一項に記載の免疫複合体において、前記細胞毒が前記第２の連結成分に結合されることを特徴とする免疫複合体。
  16. マトリプターゼを発現する細胞を含む悪性腫瘍を治療する方法において、請求項１乃至１５の何れか一項に記載の免疫複合体を含む組成物を治療有効量でかかる治療を必要とする対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
  17. 請求項１６に記載の方法において、前記悪性腫瘍が血液学的悪性腫瘍を含むことを特徴とする方法。
  18. 請求項１７に記載の方法において、前記血液学的悪性腫瘍が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭＯＬ））、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および多発性骨髄腫（ＭＭ）からなる群から選択されることを特徴とする方法。
  19. 請求項１６に記載の方法において、前記悪性腫瘍が上皮悪性腫瘍を含むことを特徴とする方法。
  20. 請求項１９に記載の方法において、前記上皮悪性腫瘍が、前立腺腫瘍、乳腺腫瘍、脳腫瘍、腎腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、膀胱腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、および中皮腫からなる群から選択されることを特徴とする方法。
  21. 請求項１６乃至２０の何れか一項に記載の方法において、マトリプターゼを活性化する免疫調節剤を治療有効量で同時投与するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
  22. 請求項２１に記載の方法において、前記免疫調節剤がサリドマイドまたはサリドマイド類似体を含むことを特徴とする方法。
  23. 細胞毒にリンカーを介して共有結合される、抗マトリプターゼ抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体において、前記細胞毒が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、およびアウリスタチンＰＥからなる群から選択され、かつ前記リンカーが、
    前記抗マトリプターゼ抗体またはその抗原結合部分の上に位置するリジン残基を介して、前記抗マトリプターゼ抗体またはその抗原結合部分に結合された第１の連結成分；および
    切断可能連結部分を含む第２の連結成分において、トリアゾール部分を介して前記第１の連結成分に、かつ前記切断可能連結部分を介して前記細胞毒に結合されている、第２の連結成分を含み、
    ここで前記切断可能連結部分は、カプテシンＢによって切断可能なＶａｌ−Ｃｉｔ連結部分またはＰｈｙ−Ｌｙｓ連結部分を含み、
    ここで前記第１の連結成分は、前記抗マトリプターゼ抗体またはその抗原結合部分の上の前記リジン残基と前記トリアゾール部分との間の前記アミド結合間に約３〜約７の間のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）単位を含み、かつ
    ここで前記第２の連結成分は、前記トリアゾール部分と前記切断可能連結部分との間に約３〜約７の間のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）単位を含む、ことを特徴とする免疫複合体。
  24. 請求項２３に記載の免疫複合体において、前記抗マトリプターゼ抗体またはその抗原結合部分がＭ６９またはその抗原結合部分を含むことを特徴とする免疫複合体。
  25. 請求項２４に記載の免疫複合体において、前記細胞毒がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含むことを特徴とする免疫複合体。
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