ES2892340T3 - Conjugados de fármaco de molécula pequeña - Google Patents

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Willy Decurtins
Dario Neri
Jorg Scheuermann
Moreno Wichert
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Abstract

Un agente terapéutico dirigido que comprende un compuesto de fórmula (I): B - L - D (I), en la que: B es un resto de unión de bajo peso molecular para la anhidrasa carbónica IX (CAIX), en el que dicho resto de unión comprende un grupo terminal de fórmula (T2): **(Ver fórmula)** D es un resto de fármaco; y L es un grupo ligador que experimenta escisión in vivo para liberar dicho resto de fármaco en una forma activa, en el que dicho ligador L comprende un anillo de 1,2,3-triazol, en el que dicho resto de fármaco y resto de ligador están unidos a las posiciones 1 y 4 del anillo de triazol y la posición 5 del anillo de triazol también está opcionalmente sustituida.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de fármaco de molécula pequeña
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los conjugados de fármaco de moléculas pequeñas (SMDC) dirigidos para el tratamiento de enfermedades. En particular, la invención se refiere a SMDC formados por un ligando de bajo peso molecular para la unión a anhidrasa carbónica IX (CAIX), conjugado con un fármaco mediante un ligador escindible para la administración del fármaco a tejidos o células seleccionados como diana. En una realización, la presente invención se refiere a la aplicación de tales SMDC para la administración de fármacos que pueden destruir o inhibir células tumorales.
Antecedentes
El uso de agentes citotóxicos es la base del tratamiento de cáncer y otros estados patológicos. De manera ideal, los agentes citotóxicos deben acumularse en el sitio de enfermedad, evitando tejidos normales. En realidad, esto no ocurre. Muchos fármacos anticancerosos no se acumulan preferiblemente en tumores sólidos. De hecho, se ha demostrado en ratones que tienen tumores que solamente una mínima parte del fármaco inyectado alcanza la masa neoplásica en comparación con la cantidad de agente citotóxico que alcanza órganos saludables.
La administración dirigida de agentes citotóxicos muy potentes a tejidos enfermos es, por tanto, deseable para el tratamiento de cáncer y otros estados graves. Al unir un efector terapéutico a través de un ligador escindible a un ligando específico de un marcador de enfermedad, el efector se acumula y actúa preferiblemente en el sitio previsto de acción, aumentando por tanto la dosis aplicada de manera eficaz mientras se reducen los efectos secundarios. Hasta la fecha, se han considerado anticuerpos monoclonales como ligandos de elección y, de hecho, la investigación en el campo de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) ha conducido a la aprobación reciente de dos ADC para aplicaciones en oncología: brentuximab vedotina y trastuzumab emtansina.
Sin embargo, los anticuerpos son macromoléculas grandes y, por tanto, tienen a menudo dificultadas para penetrar en profundidad en los tumores sólidos. Además, pueden ser inmunogénicos y normalmente tiempos de circulación largos pueden conducir a liberación de fármaco prematura y efectos secundarios no deseados. Además, la producción de ADC es costosa, lo que refleja la necesidad de una fabricación de anticuerpos, fármacos y los conjugados resultantes de calidad clínica.
El uso de ligandos más pequeños como vehículos de administración tales como péptidos o moléculas similares a fármacos pequeños podría superar posiblemente algunos de los problemas mencionados anteriormente. Su tamaño reducido debería ayudar a la penetración de tejido, no deberían ser inmunogénicos y ser susceptibles a la síntesis orgánica clásica, reduciendo así los costes de fabricación. Se han demostrado las propiedades favorables de los conjugados de fármacos que utilizan ácido fólico o ligandos contra el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) como vehículos de administración y un conjugado de folato ha ingresado recientemente en estudios clínicos de fase III. Sin embargo, solo unos pocos conjugados de este tipo han sido identificados con éxito. Krall et. al., Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 52, 1384 describen la administración dirigida de agentes citotóxicos mediante ligandos de bajo peso molecular para el tratamiento del cáncer. El documento WO2006137092 describe el uso de inhibidores de la anhidrasa carbónica IX marcados con fluoróforos para el tratamiento de cánceres al inhibir la actividad de CAIX y, por de ese modo, revertir la acidificación del entorno extracelular del tumor. No hay ninguna sugerencia de usar los inhibidores de CAIX para seleccionar como diana los agentes citotóxicos. Otros inhibidores de CAIX para el tratamiento del cáncer se describen en los documentos WO2011098610 y WO2004048544.
Los presentes inventores han encontrado conjugados de fármaco de molécula pequeña que seleccionan como diana tumores que expresan anhidrasa carbónica IX (CAIX).
Sumario de la invención
Según el primer aspecto de la invención, por tanto, se proporciona un agente terapéutico dirigido que comprende un compuesto de fórmula:
B - L - D (I),
en la que:
B es un resto de unión de bajo peso molecular para la anhidrasa carbónica IX (CAIX), en el que dicho resto de unión comprende un grupo terminal de fórmula (T2):
Figure imgf000003_0001
D es un resto de fármaco; y
L es un grupo ligador que experimenta escisión in vivo para liberar dicho resto de fármaco en una forma activa, en el que dicho ligador L comprende un anillo de 1,2,3-triazol, en el que dicho resto de fármaco y resto de ligador están unidos a las posiciones 1 y 4 del anillo de triazol y la posición 5 del anillo de triazol también está opcionalmente sustituida.
El resto de unión B se une a la anhidrasa carbónica IX (CAIX). La unión a la anhidrasa carbónica es selectiva y específica, por lo que se acumula el resto de unión B in vivo en sitios, tales como tumores, donde la anhidrasa carbónica está presente en niveles elevados.
Adecuadamente, el compuesto de fórmula (I) tiene un peso molecular menor de aproximadamente 8.000, más adecuadamente menor de aproximadamente 5000 y lo más adecuadamente menor de aproximadamente 2000. Al contrario de los anticuerpos, las moléculas pequeñas pueden difundirse fuera de los vasos sanguíneos en cuestión de segundos. La distribución no se limita al espacio perivascular, sino que también implica una penetración profunda en los tejidos. Esto da como resultado un direccionamiento del fármaco más rápido, más profundo y más eficaz por parte de los agentes de la invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un agente terapéutico dirigido según el primer aspecto de la invención, para su uso en el tratamiento de un tumor sólido, preferiblemente para el tratamiento del carcinoma de células renales.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente terapéutico dirigido según el primer aspecto de la invención.
Cualquier característica descrita en el presente documento como adecuada, opcional o preferida en relación con cualquier aspecto de la invención puede igualmente ser adecuada, opcional o preferida en relación con cualquier otro aspecto de la invención.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra estructuras químicas de conjugados de ligando-ligador-colorante sintetizados para estudios de unión in vitro y de selección de diana in vivo;
la figura 2 muestra estructuras y síntesis de conjugados de fármaco de molécula pequeña según la presente invención;
la figura 3 muestra mediciones de fluorescencia de la captación de órgano de conjugado de ligando-ligador-colorante usando un ligando del tipo usado en los conjugados de la presente invención, en comparación con la captación en los mismos órganos de un conjugado no seleccionado como diana;
la figura 4 muestra mediciones de fluorescencia de la captación de órgano de conjugado de ligando-ligador-colorante usando un ligando del tipo usado en los conjugados de la presente invención a 1 hora, 2 horas y 4 horas tras la administración del conjugado;
la figura 5 muestra gráficos de pérdida de peso frente a tiempo para animales de prueba tratados con tres regímenes de dosificación diferentes de un conjugado de ligando-ligador-fármaco según la invención;
la figura 6 muestra gráficos de (a) volumen de tumor frente a tiempo para el crecimiento de xenoinjertos SKRC52 en ratones balb/c nu/nu tratados 5x en 5 días consecutivos con dos conjugados diferentes 7a y 8a según la invención y con dos conjugados de fármaco no seleccionados como diana correspondientes, y (b) cambio de peso corporal medido asociado con el tratamiento;
la figura 7 muestra gráficos de (a) volumen de tumor frente a tiempo para el crecimiento de xenoinjertos SKRC52 en ratones balb/c nu/nu tratados 5x en 5 días consecutivos con un conjugado adicional 9a según la invención y con conjugados de fármaco no seleccionados como diana correspondientes y con dos fármacos antitumorales convencionales, y (b) cambio de peso corporal medido asociado con los tratamientos;
la figura 8 muestra estabilidad hidrolítica de conjugados de fármaco 7a, 8a y 9a en PBS a pH 7,4 y 37 °C tal como se determina mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas/espectrometría de masas (7a y 8a) y cromatografía de líquidos de alta resolución (9a);
la figura 9 muestra estructuras de un ligando monovalente para CAIX y un conjugado de colorante del mismo; la figura 10 muestra estructuras de un ligando bivalente para CAIX y un conjugado de colorante del mismo;
la figura 11 muestra las estructuras de un conjugado de fármaco bivalente seleccionado como diana B7 según la presente invención y un control no seleccionado como diana B8;
la figura 12 muestra curvas de crecimiento tumoral de animales inyectados con 8 x 35 nmol de ligando no conjugado B2, conjugado de fármaco bivalente B7, conjugado de control b8 o vehículo como control. Los datos representan promedios ± errores estándar;
la figura 13 muestra una representación esquemática de un miembro de la biblioteca química de autoensamblaje codificada por ADN (ESAC) que se une a su proteína diana CAIX. La biblioteca presenta dos farmacofóros A y B y se forma por hibridación de dos sub-bibliotecas de cadenas sencillas sintetizadas individualmente A y B, lo que da como resultado una biblioteca combinatoria de A x B = 111.100 miembros;
la figura 14 muestra un diagrama de los resultados de resultados de secuenciación de ADN masivo (HTDS) de reacciones contra CAIX para la biblioteca ESAC. El plano x/y representa los códigos de barras de los miembros de la biblioteca de la sub-biblioteca A y sub-biblioteca B, y el eje z muestra los recuentos de secuencia normalizados a 100, nivel de corte 1000. Las condiciones de selección fueron recubrimiento de proteína de alta densidad (1,0 |im de CAIX) y cinco etapas de lavado;
la figura 15 muestra la estructura química de conjugado IRDye 750 no seleccionado como diana C6 usado para análisis de citometría de flujo y experimentos de obtención de imágenes in vivo;
la figura 16 muestra estructuras químicas y constantes de disociación medidas “fuera de ADN” por FP y SPR de conjugados monovalentes y bivalentes sintetizados con diferentes longitudes de ligador;
la figura 17 muestra la estructura química de conjugados IRDye 750 monovalentes y bivalentes seleccionados como diana C1c y C5c usados para análisis de citometría de flujo y experimentos de obtención de imágenes in vivo; la figura 18 muestra análisis de citometría de flujo de conjugados de IR-colorantes que se unen a células SKRC52 que expresan CAIX: (a) células no tratadas, (b) conjugado no seleccionado como diana C6, (c) conjugado monovalente seleccionado como diana C1c, (d) conjugado bivalente seleccionado como diana C5c;
la figura 19 muestra datos de captación comparativos para diferentes órganos en un ratón que tiene carcinoma renal de un ligando seleccionado como diana anti-CAIX radiomarcado frente a un ligando no seleccionado como diana radiomarcado;
la figura 20 muestra un esquema de reacción para la síntesis de un conjugado de fármaco citotóxico seleccionado como diana según la presente invención que tiene el fármaco auristatina unido a un resto de unión de molécula pequeña a través de un ligador peptídico que contiene valina-citrulina que puede escindirse mediante catepsina B; y la figura 21 muestra datos observados para tamaño tumoral de ratón frente a tiempo para tres regímenes de dosificación del conjugado de fármaco de la figura 20.
Descripción detallada de la invención
A menos que se define lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos habituales en la técnica, tal como en las técnicas de química de péptidos, cultivo celular, química de ácido nucleico y bioquímica. Se usan técnicas convencionales para métodos de biología molecular, genética y bioquímicos (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Biología molecular (1999) 4a ed., John Wiley & Sons, Inc.).
A menos que se declare lo contrario, las siguientes definiciones se aplican a términos químicos usados en conexión de compuestos de la invención y composiciones que contienen tales compuestos.
Alquilo se refiere a un radical hidrocarbilo saturado ramificado o no ramificado. De manera adecuada, el grupo alquilo comprende desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 30 átomos de carbono, por ejemplo desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 25 átomos de carbono.
Alquenilo se refiere a un radical hidrocarbilo ramificado o no ramificado que contiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono. De manera adecuada, el grupo alquenilo comprende desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 30 átomos de carbono, por ejemplo desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 25 átomos de carbono.
Alquinilo se refiere a un radical hidrocarbilo ramificado o no ramificado que contiene uno o más triples enlaces carbono-carbono. De manera adecuada, el grupo alquinilo comprende desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 30 átomos de carbono, por ejemplo desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 25 átomos de carbono.
Halógeno se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo, preferiblemente flúor o cloro. Cicloalquilo se refiere a un resto alicíclico, que tiene de manera adecuada 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono. El grupo puede ser un sistema de anillo en puente o policíclico. Más a menudo, los grupos cicloalquilo son monocíclicos. Este término incluye referencia a grupos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, norbornilo y biciclo[2.2.2]octilo. Arilo se refiere a un sistema de anillo aromático que comprende 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 átomos de anillo de carbono. Arilo puede ser un sistema de anillo policíclico, que tiene dos o más anillos, al menos uno de los cuales es aromático. Este término incluye referencia a grupos tales como fenilo, naftilo, fluorenilo, azulenilo y indenilo, antrilo.
El prefijo (hetero) en el presente documento significa que uno o más de los átomos de carbono del grupo pueden sustituirse por nitrógeno, oxígeno, fósforo, silicio o azufre. Los grupos heteroalquilo incluyen por ejemplo, grupos alquiloxilo y grupos alquitio. Los grupos heterocicloalquilo o heteroarilo en el presente documento pueden tener desde 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 átomos de anillo, al menos uno de los cuales se selecciona de nitrógeno, oxígeno, fósforo, silicio y azufre. En particular, un sistema de anillo o anillo de 3 a 10 miembros y más particularmente un anillo de 5 o 6 miembros, que puede ser saturado o insaturado. Por ejemplo, seleccionado de oxiranilo, azirinilo, 1,2-oxatiolanilo, imidazolilo, tienilo, furilo, tetrahidrofurilo, piranilo, tiopiranilo, tiantrenilo, isobenzofuranilo, benzofuranilo, cromenilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, imidazolilo, imidazolidinilo, bencimidazolilo, pirazolilo, pirazinilo, pirazolidinilo, tiazolilo, isotiazolilo, ditiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piperidilo, piperazinilo, piridazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, especialmente tiomorfolino, indolizinilo, 1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindolilo, 3H-indolilo, indolilo, bencimidazolilo, cumarilo, indazolilo, triazolilo, tetrazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, isoquinolilo, quinolilo, tetrahidroquinolilo, tetrahidroisoquinolilo, decahidroquinolilo, octahidroisoquinolilo, benzofuranilo, dibenzofuranilo, benzotiofenilo, dibenzotiofenilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalilo, quinazolinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, carbazolilo, [beta]-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, perimidinilo, fenantrolinilo, furazanilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, cromenilo, isocromanilo, cromanilo, 3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-ona y 3,4-dihidro-2H-isoquinolinilo.
Cuando un sustituyente en el presente documento es un péptido, el péptido comprende de manera adecuada desde 1 hasta 100 residuos de aminoácido, por ejemplo, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 30 residuos de aminoácido.
Cuando un sustituyente en el presente documento es un oligosacárido, el oligosacárido comprende de manera adecuada desde 1 hasta 100 residuos de sacárido, por ejemplo desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 30 residuos de sacárido.
“Sustituido” significa que uno o más, especialmente hasta 5, más especialmente 1, 2 o 3, de los átomos de hidrógeno en dicho resto se reemplazan independientemente entre sí por el número correspondiente de sustituyentes. El término “opcionalmente sustituido” tal como se usa en el presente documento incluye sustituido o no sustituido. Por supuesto, se entenderá que los sustituyentes están sólo en posiciones en las que son químicamente posibles, siendo el experto en la técnica capaz de decidir (o bien experimentalmente o bien teóricamente) sin esfuerzo inapropiado si es posible una sustitución particular. Por ejemplo, grupos amino o hidroxilo con hidrógeno libre pueden ser inestables si se unen a átomos de carbono con enlaces insaturados (por ejemplo, olefínicos). Además, se entenderá por supuesto que los sustituyentes descritos en el presente documento pueden sustituirse por sí mismos por cualquier sustituyente, sujeto a la restricción mencionada anteriormente a sustituciones apropiadas tal como reconoce el experto.
Los sustituyentes pueden incluir de manera adecuada átomos de halógeno y grupos halometilo tales como CF3 y CCh; grupos que contienen oxígeno tales como oxo, hidroxilo, carboxilo, carboxialquilo, alcoxilo, alcoílo, alcoiloxilo, ariloxilo, ariloílo y ariloiloxilo; grupos que contienen nitrógeno tales como amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, azida y nitro; grupos que contienen azufre tales como tiol, alquiltiol, sulfonilo y sulfóxido; grupos heterocíclicos que pueden sustituirse por sí mismos; grupos alquilo, que pueden sustituirse por sí mismos; y grupos arilo, que pueden sustituirse por sí mismos, tales como fenilo y fenilo sustituido. Alquilo incluye bencilo sustituido y no sustituido. Cuando se describen dos o más restos como que se seleccionan “cada uno independientemente” de una lista de átomos o grupos, esto significa que los restos pueden ser iguales o diferentes. La identidad de cada resto es por tanto independiente de las identidades del uno o más de otros restos.
Derivado. Un derivado incluye la modificación química de un compuesto. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen sin limitación el reemplazo de un hidrógeno por un grupo halo, un grupo alquilo, un grupo acilo o un grupo amino. Los derivados incluyen además ésteres que pueden experimentar hidrólisis para liberar el compuesto. Los derivados incluyen además sales del compuesto. La modificación puede aumentar o disminuir una o más interacciones de unión a hidrógeno, interacciones de carga, interacciones hidrófobas, interacciones de van der Waals y/o interacciones de dipolo.
Análogo. Este término abarca cualquier enantiómero, racemato y estereoisómero, así como todas las sales farmacéuticamente aceptables e hidratos de tales compuestos.
Diana
La presente invención selecciona como diana anhidrasa carbónica, en particular proteínas de anhidrasa carbónica IX (CAIX) que se expresan en tumores. CAIX se sobreexpresa en muchas formas diferentes de cáncer tales como glioblastoma, cáncer colorrectal y de mama como un marcador de hipoxia, mientras que es casi indetectable en tejidos adultos normales, representando por tanto una diana antitumoral muy atractiva. En carcinoma de células renales se expresa a menudo de manera constitutiva y está entre los marcadores de superficie celular mejor caracterizados de esta enfermedad.
Resto de unión
Se piensa que las anhidrasas carbónicas tienen un mecanismo catalítico que se basa en un sitio activo que contiene un ión de zinc coordinado. Se piensa que los inhibidores de la anhidrasa carbónica tales como acetazolamida y metazolamida que tienen grupos sulfonamido terminales actúan formando un aducto entre el ión de zinc y el nitrógeno terminal de la sulfonamida. Por consiguiente, los restos de unión en los conjugados según la presente invención tienen un grupo sulfonamida terminal (-SO2NH2). El grupo sulfonamida terminal está unido a un grupo tiadiazolilo. Por tanto, el ligando comprende el siguiente resto terminal (T1):
Figure imgf000006_0001
El resto del conjugado se une al grupo tiadiazolilo a través de un grupo amida, por lo que el resto de unión (ligando) comprende el siguiente resto terminal que tiene una estructura similar al resto terminal de acetazolamida (T2):
Figure imgf000006_0002
En otras realizaciones, el resto terminal anterior se modifica mediante metilación 4-N del grupo tiadiazol por lo que el resto de unión (ligando) comprende el siguiente resto terminal que tiene una estructura similar al resto terminal de metazolamida (T3):
Figure imgf000006_0003
Adecuadamente, el resto de unión tiene una afinidad de unión por CAIX de manera que la KD para la unión de un conjugado ligando-isotiocianato de fluoresceína, en el que el conjugado de colorante tiene la estructura tal como se muestra en la figura 1, a CAIX recombinante in vitro, tal como se determina mediante análisis de polarización de fluorescencia tal como se describe en el presente documento, es de menos de aproximadamente 50 nM, preferiblemente menos de aproximadamente 20 nM, más preferiblemente menos de aproximadamente 15 nM. Ligador
El ligador une el resto de unión al resto de fármaco. El ligador puede ser un resto bifuncional o multifuncional que puede usarse para unir uno o más restos de fármaco y restos de unión para formar el SMDC. En realizaciones, los conjugados de la presente invención tienen un ligador que une un resto de fármaco a un resto de unión (que puede ser univalente o multivalente).
Las cargas útiles citotóxicas deben permanecer unidas de manera estable al ligando mientras están en circulación, pero deben liberarse cuando el conjugado alcanza el sitio de la enfermedad.
Los mecanismos de liberación dependen de un enlace escindible u otra estructura escindible que está presente en el ligador. La estructura escindible puede ser similar a las específicas de anticuerpos u otras moléculas pequeñas unidas a cargas útiles citotóxicas. De hecho, la naturaleza del ligando es independiente a ese respecto. Por tanto, puede preverse una liberación dependiente del pH [Leamon, C.P. et al (2006) Bioconjugate Chem., 17, 1226; Casi, G. et al (2012) J. Am. Chem. Soc., 134, 5887], reductora [Bernardes, G.J. et al (2012) Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
51. 941; Yang, J. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 13872] y enzimática [Doronina S.O. et al (2008) Bioconjugate Chem, 19, 1960; Sutherland, M.S.K. (2006) J. Biol. Chem, 281, 10540]. En un entorno específico, cuando los grupos funcionales están presentes o bien en el ligando o bien en las cargas útiles (por ejemplo, tioles, alcoholes) que permiten la creación de un enlace escindible, puede establecerse una conexión sin ligador, liberando así cargas útiles intactas, lo que simplifica sustancialmente el análisis farmacocinético. En la siguiente tabla se muestra una lista no exhaustiva de restos que tienen enlaces escindibles y que pueden incorporarse en ligadores:
Ligador Estructura Mecanismo de liberación
amida
Figure imgf000007_0001
Proteólisis
éster
Figure imgf000007_0002
hidrólisis
carbamato
Figure imgf000007_0003
hidrólisis
hidrazona
Figure imgf000007_0004
hidrólisis
tiazolidina
Figure imgf000007_0005
hidrólisis
disulfuro
Figure imgf000007_0006
reducción
en las que los sustituyentes R y Rn en las fórmulas anteriores pueden seleccionarse adecuadamente de manera independiente de H, halógeno, (hetero)alquilo, (hetero)alquenilo, (hetero)alquinilo, (hetero)arilo, (hetero)arilalquilo, (hetero)cicloalquilo, (hetero)cicloalquilarilo, heterociclilalquilo sustituidos o no sustituidos, un péptido, un oligosacárido o un grupo esteroide. Adecuadamente, R y Rn se seleccionan independientemente de H, o alquilo o heteroalquilo C1-C7. Más adecuadamente, R y Rn se seleccionan independientemente de H, metilo o etilo.
De manera adecuada, el conjugado es estable a la hidrólisis. Es decir, menos de aproximadamente el 10 % del conjugado experimenta hidrólisis en PBS a pH 7,4 a 37 °C después de 24 horas, tal como se determina se determina mediante Hp Lc .
Por consiguiente, el ligador comprende adecuadamente como enlace escindible una unión disulfuro, ya que estas uniones son estables a la hidrólisis, mientras que proporcionan una cinética de liberación de fármaco adecuada en la diana in vivo, y pueden proporcionar una escisión sin trazas de restos de fármaco que incluyen un grupo tiol, tal como DM1.
De manera adecuada, el ligador puede ser polar o estar cargado para mejorar la solubilidad en agua del conjugado. Por ejemplo, el ligador puede comprender de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20, adecuadamente de desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10, residuos de uno o más oligómeros solubles en agua conocidos tales como péptidos, oligosacáridos, glicosaminoglicanos, poli(ácido acrílico) o sales del mismo, polietilenglicol, (met)acrilatos de polihidroxietilo, polisulfonatos. De manera adecuada, el ligador puede comprender un resto peptídico polar o cargado que comprende, por ejemplo, de desde 2 hasta 10 residuos de aminoácidos. Los aminoácidos pueden referirse a cualquier aminoácido natural o no natural. El ligador peptídico incluye de manera adecuada un grupo tiol libre, preferiblemente una cisteína C-terminal, para formar dicha unión disulfuro escindible con un grupo tiol en el resto de fármaco. Un ligador peptídico adecuado de este tipo es -Cys-Asp-Arg-Asp-.
El ligador está unido al ligando a través de un anillo de 1,2,3-triazol formado por 1,3-cicloadición de alquino y azida. Los restos de fármaco y de unión están adecuadamente unidos a las posiciones 3 y 5 del anillo de triazol. El anillo de triazol puede estar opcionalmente sustituido en la posición 4. Se cree que el triazol mejora la unión del ligando al CAIX. Por ejemplo, los restos de unión identificados anteriormente pueden unirse a través de un grupo triazol para formar el siguiente resto terminal del conjugado:
Figure imgf000008_0001
De manera más general, los conjugados según la presente invención pueden tener la siguiente fórmula:
Figure imgf000008_0002
en la que: Hy es un resto hidrófilo para mejorar la solubilidad del conjugado, por ejemplo, un oligómero hidrófilo tal como se definió anteriormente, tal como un grupo peptídico tal como se definió anteriormente. S-S representa el enlace disulfuro escindible entre el resto de fármaco D y el ligador.
De manera adecuada, el enlace disulfuro se forma entre un grupo -SH en el ligador, por ejemplo, el grupo -SH de un residuo de cisteína (preferiblemente cisteína terminal) del péptido y un grupo -SH presente en la forma activa del fármaco D, por ejemplo, el grupo terminal -SH de DM1. De esta manera, la escisión reductora del enlace disulfuro in vivo da como resultado una liberación sin trazas del fármaco en su forma activa.
Sp son grupos espaciadores, que pueden seleccionarse independientemente de alquileno o alquenileno C1-C6 lineal o ramificado o cíclico opcionalmente sustituido, que incluyen opcionalmente uno o más carbonos de carbonilo o átomos de O o S de éter o tioéter o átomos de N de amina en la cadena. El primer grupo Sp está adecuadamente unido al residuo peptídico mediante un carbonilo terminal que forma una unión amida con el grupo amino terminal del péptido, tal como se muestra, por ejemplo, en la fórmula 9a en la figura 2.
El triazol está opcionalmente sustituido en la posición 4 con el grupo R, por lo que el grupo R se selecciona de H o cualquiera de los grupos sustituyentes definidos en el presente documento, o R es (hetero)alquilo, (hetero)alquenilo, (hetero)alquinilo, (hetero)arilo, (hetero)arilalquilo, (hetero)cicloalquilo, (hetero)cicloalquilarilo, heterociclilalquilo sustituidos o no sustituidos, un péptido, un oligosacárido o un grupo esteroide. De manera adecuada, R se selecciona de H, halógeno, halometilo o alquilo o heteroalquilo C1-C7. Más adecuadamente, R se selecciona de H, metilo o etilo, y lo más adecuadamente R es H.
De manera alternativa o adicional a uno o más de los elementos ligadores descritos anteriormente, el ligador en los conjugados de la presente invención puede comprender una unidad peptídica escindible. La secuencia de unidades peptídicas se adapta específicamente para que se escinda enzimáticamente de manera selectiva del resto de fármaco por una o más proteasas presentes en la superficie celular o las regiones extracelulares del tejido diana. La longitud de la cadena de residuos de aminoácidos de la unidad peptídica oscila de manera adecuada entre la de un único aminoácido y aproximadamente ocho residuos de aminoácidos. Pueden diseñarse numerosas secuencias peptídicas escindibles específicas adecuadas para su uso en la presente invención y optimizar su selectividad para la escisión enzimática por una enzima asociada a un tumor particular, por ejemplo, una proteasa. Los péptidos escindibles para su uso en la presente invención incluyen aquellos que están optimizados con respecto a las proteasas MMP-1, 2 o 3, o catepsina B, C o D. Son especialmente adecuados los péptidos que contienen la secuencia Val-Cit, que son escindibles por catepsina B. La catepsina B es una cisteína proteasa ubicua. Es una enzima intracelular, excepto en condiciones patológicas, tales como tumores metastásicos o artritis reumatoide. Por tanto, los conjugados no internalizantes de la presente invención producidos con ligadores escindibles por catepsina B son estables en circulación hasta que se activan en tejido patológico.
En esta realización, el resto de ligador comprende además de manera adecuada, adyacente a la secuencia peptídica, una porción de ligador “autoinmolador”. Los ligadores autoinmoladores también se conocen como ligadores en cascada electrónicos. Estos ligadores experimentan eliminación y fragmentación tras la escisión enzimática del péptido para liberar el fármaco en forma activa, preferiblemente libre. El conjugado es estable extracelularmente en ausencia de una enzima capaz de escindir el ligador. Sin embargo, tras la exposición a una enzima adecuada, el ligador se escinde iniciando una reacción autoinmoladora espontánea que da como resultado la escisión del enlace que une covalentemente el resto autoinmolador al fármaco, para así efectuar la liberación del fármaco en su estado no derivatizado o forma farmacológicamente activa. En estas realizaciones, el ligador autoinmolador se acopla al resto de ligando a través de una secuencia peptídica escindible enzimáticamente que proporciona un sustrato para que una enzima escinda el enlace amida para iniciar la reacción autoinmoladora. De manera adecuada, el resto de fármaco se conecta al resto autoinmolador del ligador mediante un grupo funcional químicamente reactivo colgante del fármaco, tal como un grupo amina primaria o secundaria, hidroxilo, sulfhidrilo o carboxilo.
Ejemplos de ligadores autoinmoladores son PABC o PAB (para-aminobenciloxicarbonilo), que unen el resto de fármaco al ligando en el conjugado (Carl et al. (1981) J. Med. Chem. 24: 479-480; Chakravarty et al. (1983) J. Med. Chem. 26: 638-644). El enlace amida que une el extremo carboxilo de una unidad peptídica y el para-aminobencilo de PAB puede ser un sustrato y escindible mediante determinadas proteasas. La amina aromática se convierte en donante de electrones e inicia una cascada electrónica que conduce a la expulsión del grupo saliente, que libera el fármaco libre después de la eliminación del dióxido de carbono (de Groot, et al (2001) Journal of Organic Chemistry 66 (26): 8815-8830). Ligadores autoinmoladores adicionales se describen en el documento WO2005/082023.
En estas realizaciones, el ligador comprende además de manera adecuada una unidad espaciadora unida al resto de unión, por ejemplo, mediante un enlace amida, amina o tioéter. La unidad espaciadora tiene una longitud que permite, por ejemplo, que la enzima de escisión (por ejemplo, catepsina B) entre en contacto con la secuencia peptídica escindible y adecuadamente también la hidrólisis del enlace amida que acopla el péptido escindible al resto X autoinmolador. Las unidades espaciadoras pueden comprender, por ejemplo, un radical divalente tal como alquileno, arileno, un heteroarileno, unidades de repetición de alquiloxilo (por ejemplo, polietilenoxilo, PEG, polimetilenoxilo) y alquilamino (por ejemplo, polietilenamino), o éster de diácido y amidas que incluyen succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida.
En aún otras realizaciones, el ligador en los conjugados de la presente invención puede comprender un grupo glucuronilo que puede escindirse mediante la glucoronidasa presente en la superficie celular o la región extracelular del tejido diana. Se ha demostrado que la beta-glucuronidasa lisosomal se libera extracelularmente en altas concentraciones locales en áreas necróticas en cánceres humanos, y que esto proporciona una ruta hacia la quimioterapia dirigida (Bosslet, K. et al. Cancer Res. 58, 1195-1201 (1998)).
El número de restos de fármaco y ligador por resto de unión, es decir, el valor de carga del fármaco, es adecuadamente de desde 1 hasta aproximadamente 8, más adecuadamente 1 o 2, y lo más adecuadamente 1. Fármaco
En una realización, el fármaco es un agente citotóxico (distinto de un isótopo radiactivo) que inhibe o previene la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen agentes quimioterápicos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo análogos sintéticos y derivados de los mismos. El agente citotóxico puede seleccionarse del grupo que consiste en una auristatina, un agente de unión al surco menor del ADN, un agente alquilante del surco menor del ADN, un enediino, una lexitropsina, una duocarmicina, un taxano, una puromicina, una dolastatina, un maitansinoide y un alcaloide de la vinca o una combinación de dos o más de los mismos.
En una realización, el fármaco es un agente quimioterápico seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de la topoisomerasa, un agente alquilante (por ejemplo, mostazas nitrogenadas; etilenimas; sulfonatos de alquilo; triazenos; piperazinas; y nitrosureas), un antimetabolito (por ejemplo, mercaptopurina, tioguanina, 5-fluorouracilo), un antibiótico (por ejemplo, antraciclinas, dactinomicina, bleomicina, adriamicina, mitramicina, dactinomicina), un disruptor mitótico (por ejemplo, alcaloides vegetales, tales como vincristina y/o antagonistas de microtúbulos, tales como paclitaxel), un agente intercalante de ADN (por ejemplo, carboplatino y/o cisplatino), un inhibidor de la síntesis de ADN, un regulador de la transcripción de ADN-ARN, un inhibidor de enzimas, un regulador de un gen, un modificador de la respuesta hormonal, una citotoxina selectiva de hipoxia (por ejemplo, tirapazamina), un inhibidor del factor de crecimiento epidérmico, un agente antivascular (por ejemplo, ácido xantenona 5,6-dimetilxantenona-4-acético), un profármaco activado por radiación (por ejemplo, sales cuaternarias de nitroarilmetilo (NMQ)) o un fármaco biorreductor o una combinación de dos o más de los mismos.
El agente quimioterápico puede seleccionarse del grupo que consiste en erlotinib (TARCEVA®), bortezomib (VELCADE®), fulvestrant (FASLODEX®), sutent (SU11248), letrozol (FEMARA®), mesilato de imatinib (GLEEVEC®), PTK787/ZK 222584, oxaliplatino (Eloxatin®.), 5-FU (5-fluorouracilo), leucovorina, rapamicina (sirolimús, RAPAMUNE®.), lapatinib (GSK572016), lonafarnib (SCH 66336), sorafenib (BAY43-9006) y gefitinib (IRESSA)®), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen) o una combinación de dos o más de los mismos.
El agente quimioterápico puede ser un agente alquilante, como tiotepa, CYTOXAN® y/o ciclosfosfamida; un sulfonato de alquilo, tal como busulfano, improsulfano y/o piposulfano; una aziridina, tal como benzodopa, carbocuona, meturedopa y/o uredopa; etileniminas y/o metilamelaminas, tales como altretamina, trietilenmelamina, trietilenpbosforamida, trietilentiofosforamida y/o trimetilomelamina; acetogenina, tal como bulatacina y/o bulatacinona; camptotecina; briostatina; calistatina; criptoficinas; dolastatina; duocarmicina; eleuterobina; pancratistatin; sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida y/o mostaza uracilo; nitrosureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y/o ranimnustina; dinemicina; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; un cromóforo de neocarzinostatina; aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN®, doxorrubicina, tal como morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y/o desoxidoxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; agentes antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamide; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; depsipéptidos macrocíclicos tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2’,2’’-triclorotrietilamina; tricotecenos, tales como verracurina A, roridina A y/o anguidina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido; ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, tales como TAXOL®, paclitaxel, abraxano y/o TAXOTERE®, doxetaxel; cloranbucilo; GEMZAR®, gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido; ifosfamida, mitoxantrona, vincristina; NAVELBINE®, vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos, derivados o combinaciones farmacéuticamente aceptables dos o más de cualquiera de los anteriores.
El fármaco puede ser un disruptor de tubulina que incluye: taxanos, como paclitaxel y docetaxel, alcaloides de la vinca, discodermolida, epotilonas A y B, desoxiepotilona, criptoficinas, curacina A, combretastatina A-4-fosfato, BMS 247550, BMS 184476, BMS 188791; LEP, RPR 109881A, EPO 906, TXD 258, ZD 6126, vinflunina, LU 103793, dolastatina 10, E7010, T138067 y T900607, colchicina, fenstatina, chalconas, indanocina, T138067, oncocidina, vincristinina, vinilblastina, halichina, isohomohalicondrina B, ER-86526, pironetina, espongistatina 1, spiket P, criptoficina 1, LU103793 (cematodina o cemadotina), rizoxina, sarcodictina, eleuterobina, laulilamida, VP-16 y D-24851 y sales, ácidos, derivados o combinaciones farmacéuticamente aceptables de dos o más de cualquiera de los anteriores.
El fármaco puede ser un intercalador de ADN que incluye: acridinas, actinomicinas, antraciclinas, benzotiopiranoindazoles, pixantrona, crisnatol, brostalicina, CI-958, doxorrubicina (adriamicina), actinomicina D, daunorrubicina (daunomicina), bleomicina, idasalicina, ciclofanadicina. mitomicina C, bizelesina, etopósido, mitoxantrona, SN-38, carboplatino, cis-platino, actinomicina D, amsacrina, DACA, pirazoloacridina, irinotecán y topotecán y sales, ácidos, derivados o combinaciones farmacéuticamente aceptables de dos o más de cualquiera de los anteriores .
El fármaco puede ser un agente antihormonal que actúa para regular o inhibir la acción de las hormonas sobre tumores, tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos, que incluyen tamoxifeno, raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y/o toremifeno Fareston y sales, ácidos, derivados o combinaciones farmacéuticamente aceptables de dos o más de cualquiera de los anteriores. El fármaco puede ser un inhibidor de la aromatasa que inhibe la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol, AROMASIN®, exemestano, formestanie, fadrozol, RIVISOR®, vorozol, FEMARA®, letrozol y ARIMIDEX® y/o anastrozol y sales, ácidos, derivados o combinaciones farmacéuticamente aceptables de dos o más de cualquiera de los anteriores.
El fármaco puede ser un agente antiandrógenos, tal como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, goserelina y/o troxacitabina y sales, ácidos, derivados o combinaciones farmacéuticamente aceptables de dos o más de cualquiera de los anteriores.
El fármaco puede ser un inhibidor de la proteína cinasa, un inhibidor de la lípido cinasa o un agente antiangiogénico. En una realización preferida, el fármaco es un maitansinoide, en particular DM1, o un disruptor de tubulina. Preferiblemente, el fármaco en su forma activa comprende un grupo tiol, por lo que puede formarse un enlace disulfuro escindible a través del azufre del grupo tiol para unir el fármaco al resto de ligador en los conjugados de la invención.
El fármaco puede usarse en forma modificada o sin modificar. Pueden usarse combinaciones de fármacos en las que algunos no se modifican y algunos se modifican. Por ejemplo, el fármaco puede modificarse químicamente. Una forma de modificación química es la derivatización de un grupo carbonilo, tal como un aldehído.
Según una realización, el fármaco se modifica para permitir la incorporación del ligador. Por ejemplo, un fármaco que comprende un grupo hidroxilo puede convertirse en el correspondiente carbonato de 2-etanotiol o carbamato de 2-etanotiol, introduciendo de ese modo grupos tiol para la unión disulfuro tal como se comentó anteriormente.
El fármaco también puede ser una citocina (por ejemplo, una interleucina, un miembro de la superfamilia de TNF) o un interferón.
SMDC
El resto de fármaco del SMDC puede no escindirse del ligador hasta que el SMDC se una a su célula o tejido diana. Los SMDC descritos en el presente documento no se internalizan sustancialmente en una célula. Tal conjugado de fármaco “no internalizante” de este tipo tiene la propiedad de reaccionar en condiciones fisiológicas (a 37 °C y pH 7) in vivo o in vitro, con parejas de unión en la superficie celular (por ejemplo, antígenos de superficie celular) o en la matriz extracelular sin internalizarse en las células mediante un proceso de endocitosis activa (tal como endocitosis mediada por receptor/antígeno). Es posible que parte del resto de unión específico no internalizante pueda captarse intracelularmente por endocitosis en fase fluida. Sin embargo, la cantidad de endocitosis en fase fluida dependerá linealmente de la concentración y temperatura del resto de unión extracelular y, por tanto, puede distinguirse de la endocitosis mediada para distinguir los restos de unión no internalizantes y los conjugados según la presente invención.
El uso de compuestos no internalizantes proporciona ventajas. Por ejemplo, la eficiencia de la internalización es difícil de medir in vivo, permaneciendo así una “caja negra” para el desarrollo de fármacos. Además, es difícil asegurar que todas las células enfermas se seleccionan como diana por parte de los compuestos internalizantes, especialmente aquellas células que están más lejos de los vasos sanguíneos. Por el contrario, la escisión de los SMDC de la presente invención en el espacio extracelular permite que el fármaco se difunda a las células vecinas y las destruya. También se prevé que las células moribundas liberarán agentes de escisión (por ejemplo, cisteína o glutatión) que activarán una mayor cantidad del fármaco del SMDC dando como resultado la autoamplificación de los efectos tóxicos.
Por consiguiente, el ligador que se usa en el SMDC debe ser lo suficientemente estable en comparación con la velocidad de aclaramiento del compuesto de la sangre, pero lo suficientemente lábil en comparación con el tiempo de residencia del compuesto en el sitio diana. A partir de estas consideraciones, puede ser aceptable una semivida del conjugado en el intervalo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 50 horas, tal como de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 horas o de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 horas, especialmente cuando se seleccionan como diana tejidos o células vasculares. La semivida en el presente documento se refiere a la semivida del conjugado en suero de ratón in vitro a 37 °C tal como se determina mediante HPLC. Por tanto, ventajosamente, los SMDC descritos en el presente documento pueden tener labilidad y/o estabilidad mejoradas in vitro y/o in vivo lo que los hace particularmente adecuados para la liberación controlada de fármacos, especialmente en tejidos, células y tumores vasculares.
De manera adecuada, el SMDC muestra una alta afinidad por los tumores que expresan CAIX cuando se administra por vía sistémica. De manera adecuada, una razón de concentración de tumor con respecto a sangre de al menos aproximadamente 5:1, por ejemplo, al menos aproximadamente 10:1, se logra 1 hora después de la inyección de 3 nm del conjugado en ratones desnudos que tienen tumores SKRC52 subcutáneos.
De manera adecuada, el SMDC inhibe, retarda o previene el crecimiento de un tumor cuando se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Tratamiento
Los SMDC descritos en este documento pueden usarse para tratar enfermedades. El tratamiento puede ser terapéutico y/o profiláctico, con el objetivo de prevenir, reducir o detener un cambio o trastorno fisiológico no deseado. El tratamiento puede prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento.
La enfermedad tratada por el SMDC puede ser cualquier enfermedad que pueda beneficiarse del tratamiento. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo aquellos estados patológicos que predisponen al trastorno. Una enfermedad particular que es aplicable al tratamiento mediante la presente invención es la enfermedad neoplásica, tal como el cáncer, que puede tratarse mediante la administración dirigida de agentes citotóxicos. Los ejemplos no limitativos de cánceres que pueden tratarse incluyen tumores benignos y malignos; leucemia y neoplasias linfoides, incluyendo cáncer de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas, próstata o vejiga. La enfermedad puede ser una enfermedad neuronal, glial, astrocital, hipotalámica u otra enfermedad glandular, macrofágica, epitelial, estromal y blastocoélica; o una enfermedad inflamatoria, angiogénica o inmunológica. Una enfermedad a modo de ejemplo es un tumor maligno sólido.
El término “cáncer” y “canceroso” se usa en su sentido más amplio para referirse al estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Un tumor comprende una o más células cancerosas. Los ejemplos de cáncer incluyen carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias malignas linfoides. Los ejemplos adicionales de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (“NSCLC”), adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de pulmón escamoso, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello. Basándose en la evidencia establecida de la expresión de CAIX, se espera que la presente invención sea adecuada en particular para el tratamiento de glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de mama y, especialmente, carcinoma de células renales.
Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación de un SMDC dependerá de una serie de factores diferentes, tales como el tipo de enfermedad que va a tratarse, la gravedad y el curso de la enfermedad, si la molécula se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, los antecedentes clínicos del paciente y la respuesta a la proteína, y el juicio del médico responsable.
La molécula puede administrarse al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, puede usarse entre aproximadamente 1 ug/kg y 15 mg/kg de fármaco como una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica puede oscilar entre aproximadamente 1 ug/kg y 100 mg/kg o más. Una dosificación a modo de ejemplo de fármaco puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso del paciente.
Cuando se trata el cáncer, el efecto terapéutico que se observa puede ser una reducción del número de células cancerosas; una reducción del tamaño del tumor; inhibición o retardo de la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibición del crecimiento tumoral; y/o alivio de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer.
En modelos animales, la eficacia puede evaluarse mediante mediciones físicas del tumor durante el tratamiento y/o mediante la determinación de la remisión parcial y completa del cáncer. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia puede medirse, por ejemplo, evaluando el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) y/o determinando la tasa de respuesta (RR).
Composiciones farmacéuticas
Los SMDC descritos en el presente documento pueden estar en forma de composiciones farmacéuticas que pueden ser para uso en medicina humana o animal y normalmente comprenderán uno o más de un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica convencional. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además de, el portador, excipiente o diluyente cualquier/cualesquiera aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento, agente(s) solubilizante(s) adecuado(s).
En la composición farmacéutica pueden proporcionarse conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico. También pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión.
Puede haber diferentes requisitos de composición/formulación dependiendo de los diferentes sistemas de administración. A modo de ejemplo, la composición farmacéutica puede formularse para su administración usando una minibomba o por vía mucosa, por ejemplo, como pulverizador nasal o aerosol para inhalación o disolución ingerible, o por vía parenteral en la que la composición está formulada en forma inyectable para su administración, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Alternativamente, la formulación puede diseñarse para su administración mediante varias vías.
Si el agente va a administrarse por vía mucosa a través de la mucosa gastrointestinal, debería poder permanecer estable durante el tránsito a través del tracto gastrointestinal; por ejemplo, debería ser resistente a la degradación proteolítica, estable a pH ácido y resistente a los efectos detergentes de la bilis.
Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por inhalación, en forma de supositorio o pesario, por vía tópica en forma de loción, disolución, crema, pomada o polvo, mediante el uso de un parche cutáneo, por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos solos o mezclados con excipientes, o en forma de elixires, disoluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes o colorantes, o las composiciones farmacéuticas pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para la administración parenteral, las composiciones pueden usarse mejor en forma de una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o monosacáridos para hacer que la disolución sea isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas para chupar que pueden formularse de manera convencional.
El SMDC puede administrarse en forma de una sal activa o farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas por los expertos en la técnica y incluyen, por ejemplo, las mencionadas por Berge et al., en J.Pharm.Sci., 66, 1-19 (1977). Las sales incluyen sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato de ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato de ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato).
Las vías de administración pueden incluir una o más de las siguientes: oral (por ejemplo, como un comprimido, cápsula o como una disolución ingerible), tópica, mucosal (por ejemplo, como un pulverizador nasal o aerosol para inhalación), nasal, parenteral (por ejemplo, por una forma inyectable), gastrointestinal, intraespinal, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intrauterina, intraocular, intradérmica, intracraneal, intratraqueal, intravaginal, intracerebroventricular, intracerebral, subcutáneo, oftálmica (incluso intravítrea o intracameral), transdérmica, rectal, bucal, vaginal, sublingual.
Normalmente, un médico determinará la dosificación real que será más adecuada para un sujeto individual. El nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente en particular pueden variarse y dependerán de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese compuesto, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el modo y momento de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad del estado particular y el individuo que se somete a la terapia.
Las formulaciones pueden acondicionares en envases de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que requiere sólo la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua, para su administración. Las disoluciones y suspensiones para inyección extemporánea se preparan a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente. Las formulaciones de dosificación unitaria a modo de ejemplo contienen una dosis diaria o una subdosis diaria unitaria, o una fracción apropiada de la misma, del principio activo.
Terapia de combinación
Un SMDC puede combinarse en una formulación de combinación farmacéutica, o una pauta posológica como terapia de combinación, con un segundo compuesto que tiene propiedades terapéuticas. El segundo compuesto de la formulación de combinación farmacéutica o pauta posológica tiene preferiblemente actividades complementarias al SMDC de la combinación de modo que no se afecten adversamente entre sí.
El segundo compuesto puede seleccionarse del grupo que consiste en una proteína, anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, un fármaco, una toxina, una enzima, una nucleasa, una hormona, un inmunomodulador, un oligonucleótido antisentido, un ARNip, un compuesto de boro, un agente fotoactivo, un colorante y un radioisótopo o una combinación de dos o más de los mismos.
La terapia de combinación puede administrarse como una pauta simultánea o secuencial. Cuando se administra secuencialmente, la combinación puede administrarse en dos o más administraciones. La administración combinada incluye la coadministración, usando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en el que hay un periodo de tiempo mientras ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.
Tal como se indicó anteriormente, los SMDC de la invención logran razones tumor:órgano óptimas algún tiempo después de la administración, cuando el SMDC ha tenido la oportunidad de localizarse en el sitio de la enfermedad, mientras se produce su aclaramiento de la sangre y los órganos sanos. Por tanto, sería deseable proporcionar una liberación controlada de la carga útil tóxica del SMDC en un intervalo de tiempo controlado después de la administración. Esto puede lograrse administrando una cantidad eficaz de un agente de escisión para escindir el ligador L en un momento posterior después de la administración de SMDC, con el fin de desencadenar una liberación eficiente de la carga útil del fármaco cuando se han obtenido las razones tumor:sangre y tumor:órgano adecuadas. El intervalo de tiempo entre la administración del SMDC y la administración del agente de escisión puede ser, por ejemplo, de desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 12 horas, adecuadamente de desde aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 6 horas, más adecuadamente desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 2 horas.
Por tanto, los productos de combinación según la invención incluyen un producto que comprende un compuesto de fórmula (I) tal como se definió anteriormente y un agente de escisión para escindir el ligador L escindible, como una preparación combinada para administración secuencial en el tratamiento del cáncer.
De manera adecuada, o bien: (a) el ligador L comprende un enlace disulfuro y el agente de escisión comprende un agente reductor tal como cisteína, N-acetilcisteína, orditiotreitol; o bien (b) el ligador L comprende una unión amida y el agente de escisión comprende una hidrolasa tal como una proteasa; o bien (c) el ligador L comprende una unión éster y el agente de escisión comprende una hidrolasa tal como una esterasa.
El agente de escisión se administra en una cantidad eficaz para lograr la liberación deseada de la carga útil tóxica del SMDC in vivo. Por ejemplo, pueden usarse entre aproximadamente 1 ug/kg y 15 mg/kg de fármaco como una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosificación a modo de ejemplo de agente de escisión puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso del paciente. Los productos anteriores para administración combinada y métodos de tratamiento mediante administración secuencial de conjugado de fármaco y agente de escisión también son aplicables a conjugados de fármacoanticuerpo como a conjugados en los que el ligando es una entidad de bajo peso molecular. Por tanto, los productos de combinación y métodos en los que el SMDC es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) que comprende como resto de unión un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une selectivamente a CAIX están englobados dentro de estos aspectos de la invención.
Sustituyentes
Los compuestos químicos descritos en el presente documento pueden comprender sustituyentes. En particular, los compuestos pueden contener uno o más sustituyentes hidroxilo, alquilo especialmente alquilo inferior (C-i-Ca), por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo y otros isómeros de pentilo, y nhexilo y otros isómeros de hexilo, alcoxilo especialmente alcoxilo inferior (C-rCa), por ejemplo metoxilo, etoxilo, propoxilo, alquinilo, por ejemplo etinilo, o halógeno (por ejemplo fluoro).
Síntesis química
Los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse mediante técnicas de síntesis química. Será evidente para los expertos en la técnica que puede ser necesario proteger y desproteger grupos funcionales sensibles durante la síntesis de un compuesto. Esto puede lograrse mediante técnicas convencionales, por ejemplo tal como se describe en “Protective Groups in Organic Synthesis” de T W Greene y P G M Wuts, John Wiley & Sons Inc. (1991), y de P.J.Kocienski, en “Protecting Groups”, Georg Thieme Verlag (1994).
Es posible durante algunas de las reacciones que cualquier estereocentro presente, en determinadas condiciones, pudiera epimerizarse, por ejemplo si se usa una base en una reacción con un sustrato que tiene un centro óptico que comprende un grupo sensible a bases. Debe ser posible para eludir posibles problemas tales como este mediante elección de secuencia de reacción, condiciones, reactivos, regímenes de protección/desprotección, tal como se conoce bien en la técnica.
Los compuestos y sales de la invención pueden separarse y purificarse mediante métodos convencionales.
Técnicas generales
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, biología celular, genética, inmunología y farmacología, conocidos para los expertos en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Gennaro, A. R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J. G., Limbird, L. E., y Gilman, A. G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D. M., y Blackwell, C. C., eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, vol. I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, vol. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al., eds. (1999) Short Protocols en Molecular Biology, 4a edición, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C. R., y Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2a ed., Springer Verlag.
La invención se describirá ahora adicionalmente mediante los ejemplos, que se pretende que sirvan para ayudar a un experto habitual en la técnica a llevar a cabo la invención.
Ejemplos
(A) Restos de unión monovalente
Se prepararon compuestos de referencia que tienen las fórmulas 1a-6c mostradas en la figura 1 para estudios de unión de conjugados de ligando-ligador-colorante a CAIX in vitro e in vivo. Se prepararon conjugados según la presente invención que tienen las fórmulas 7a, 8a y 9a tal como se muestra en la figura 2 según el esquema en la figura 2 y se estudiaron in vitro e in vivo tal como se describe a continuación.
También se prepararon conjugados de referencia 7b, 8b y 9b tal como se muestra en la figura 2 que tienen el fármaco y restos de ligador pero sin resto de unión según el esquema mostrado en la figura 2 para estudios comparativos.
Procedimientos químicos generales
Se registraron espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) de protones (1H) en un espectrómetro Bruker AV400 (400 MHz) o Bruker AVIII500 (500 MHz). Se registraron espectros de RMN de carbono (13C) en un espectrómetro Bruker AV400 (100 MHz) o en un espectrómetro Bruker AVIII500 (125 MHz). Se proporcionan desplazamientos químicos en ppm usando disolvente residual como patrón interno. Se notifican constantes de acoplamiento (J) en Hz con las siguientes abreviaturas usadas para indicar división: s = singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuarteto, m = multiplete. Se registraron espectros de espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) en un espectrómetro de masas Bruker Daltronics maXis ESI-QTOF. Se notifican valores de m/z calculados y exactos en Daltons.
Se realizaron cromatografía de líquidos de alta presión de fase inversa preparativa y analítica (RP-HPLC) en un instrumento Waters Alliance HT RP-HPLC con detector PDA UV, usando una columna Synergi 4 |im, Polar-RP 150 x 10 mm a una velocidad de flujo de 4 ml min_1 con gradientes lineales de disolventes A y B (A = agua Millipore con ácido trifluoroacético al 0,1 % [TFA], B = MeCN).
Se adquirieron disolventes anhidros para reacciones de Acros o Fluka. Se adquirió dimetilformamida de calidad peptídica (DMF) para la síntesis en fase sólida de ABCR. Todos los demás disolventes se usaron tal como se proporcionan por Fisher Chemicals, Merck o Aldrich en calidad analítica o HPLC. Se adquirió éster de N-hidroxisuccinimidilo IRDye750 (NHS) de Licor, éster de NHS Alexa546 de Invitrogen, (S)-1-clorometil-6-hidroxi-1,2-dihidrobeno[e]indol protegido con N-Boc (seco CBI) de Anthem Bioscience. Se adquirió DM1 de Concortis Biosystems. Todos los demás reactivos se adquirieron de Aldrich, Acros, ABCR o TCI y se usaron tal como se proporcionan. Todas las reacciones que usan condiciones anhidras se realizaron usando cristalería secada en horno bajo una atmósfera de argón. Salmuera se refiere a una disolución saturada de cloruro de sodio. Se adquirió sílice para cromatografía en columna ultrarrápida de Sigma.
Preparación de compuestos previamente descritos
Se prepararon los compuestos 6c y 11 - 17 según métodos descritos previamente tal como se resumen en la siguiente tabla.
Estructura Número Referencia
Figure imgf000016_0001
Síntesis química de nuevos compuestos
Conjugado de N1-(2-(2-(2-am¡noetoxi)etox¡)et¡l)-N4-(5-sulfamo¡l-1,3,4-t¡ad¡azol-2-¡l)succ¡nam¡da y fluoresceína 1a
Figure imgf000017_0001
Se disolvieron 25 (7,0 mg, 17 |imol) e isotiocianato de fluoresceína (FITC, 6,7 mg, 17 |imol) en dimetilformamida (DMF, 1 ml) y se le añadió diisopropiletilamina (DIPEA, 8 |il, 48 mmol). Se agitó la reacción durante 2 h a temperatura ambiente, se diluyó con MeOH (1 ml) y se purificó sobre HPLC de fase inversa (el 80 % de A / el 20 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante espectrometría de masas (EM) y se liofilizaron para dar el producto como un polvo amarillo (12 mg, 16 |imol, 95 %).
1H-RMN (400 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 8,31 (s, 1H), 7,91 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,92 (s, 2H), 6,79 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 3,85 (a, 2H), 3,75 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,72-3,65 (m, 4H), 3,58 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 3,38 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 2,85 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,66 (t, J = 6,8 Hz, 2H); 13C-RMN (125 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 180,8, 172,3 172,2, 171,3, 171,2, 169,0, 164,6, 161,4, 159,9, 152,4, 147,6, 141,8, 129,5, 127,0, 124,5, 116,7, 113,0, 110,3, 102,7, 70,1, 69,6, 68,9, 44,1, 39,0, 30,7, 29,8, se prevé que las señales del ligador PEG se solapen; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C33H34N7O11S3, 800,1473; encontrado 800,1470.
Conjugado de W1-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)-W4-(5-sulfamoil-1,3,4-tiadiazol-2-il)succinamida y Alexa546 - 1b
Figure imgf000017_0002
A 25 (212 |ig, 517 nmol) en DMF (2,1 |il) se le añadió éster de NHS Alexa546 (100 |ig, 86 nmol). Se añadieron DIPEA (2 |il, 12 |imol) y DMF (50 |il) y se agitó la mezcla durante 2 ha temperatura ambiente. Se diluyó la reacción con MeOH (50 |il) y se purificó sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto tal como se identifica a través de su espectro de UV/VIS característico (Xmáx = 550 nm), se liofilizaron y de disolvieron en 100 |il de PBS pH 7,4 para dar una disolución morado oscuro. Se determinaron su concentración y el rendimiento de reacción midiendo la absorbancia a 556 nm (8556 = 112,000 M'1 cirr1) de muestras de reserva diluidas 1:100 en PBS pH 7,4 (443 |iM, 44 nmol, 51 %).
HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C52H65Cl3NgO17S5, 1352,2162; encontrado 1352,2157.
Conjugado de W1-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)-W4-(5-sulfamoil-1,3,4-tiadiazol-2-il)succinamida e IRDye750 - 1c
Figure imgf000018_0001
A 25 (131 |ig, 320 nmol) en DMSO (13 |il) se le añadió éster de NHS IRDye750 (194 |ig, 163 nnmol) en DMSO (25 |il) seguido por DMF (100 |il) y DIPEA (10 |il, 60 |imol). Se agitó la disolución durante 6 h a temperatura ambiente y luego se purificó directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 40 % de A / el 60 % de B a lo largo de 30 min). Se identificaron fracciones que contenían conjugado de colorante a través de su espectro de UV/VIS característico (Xmáx = 750 nm), se agruparon, se liofilizaron y se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO, 100 |il) para dar una disolución de reserva verde oscuro. Su concentración y el rendimiento de reacción se determinaron midiendo la absorbancia a 750 nm (8750 = 260.000 M-1 cm-1) de muestras de reserva diluidas 1:200 en PBS pH 7,4 (1,02 mM, 102 nmol, 63 %).
HRMS: (m/z) [M Na]2- calculado para C61H77N8NaO-igS6, 720,1769; encontrado 720,1760.
Conjugado de (S)-N-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)-3-metil-2-(4-(4-sulfamoilfenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)butanamida y fluoresceína - 2a
Figure imgf000018_0002
Se disolvió 26 (20 mg, 36 |imol) en una mezcla de diclorometano (DCM, 0,5 ml) y TFA (0,5 ml) y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Se eliminaron los disolventes a presión reducida y se disolvió el residuo en DMF (0,5 ml). DIPEA (31 |il, 187 |imol) se añadió seguido por FITC (14 mg, 36 |imol). Se agitó la reacción durante 2 h a temperatura ambiente, se diluyó con MeOH (0,5 ml) y se purificó sobre HPLC de fase inversa (el 80 % de A / el 20 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto mediante EM y se liofilizaron para dar el producto como un polvo amarillo brillante (18 mg, 23 |imol, 64 %).1
1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 10,07 (s a, 1H), 8,86 (s, 1H), 8,75 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 8,28 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,10 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 7,39 (d, J =6,7 Hz, 2H), 7,74 (d, J =7,9 Hz, 1H), 7,18 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,66-6,54 (m, 6H), 5,07 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 3,68 (s a, 2H), 3,60-3,56 (m, 6H), 3,48 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,41-3,19 (m, 2H), 2,49-2,45 (m, 1H), 1,01 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,73 (d, J = 6,6 Hz, 3H); 13C-RMN (125 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 181,1, 169,0, 167,9, 160,2, 159,1, 158,8, 152,5, 147,3, 145,7, 143,6, 141,8, 134,3, 129,5, 126,8, 125,8, 124,6, 121,9, 117,0, 114,5, 113,2, 110,3, 102,7, 70,1, 70, 69,6, 69,2, 68,9, 44,2, 31,6, 19,2, 19,1; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C40H42N7O10S2, 844,2429; encontrado 844,2430.
Conjugado de (S)-W-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)-3-metil-2-(4-(4-sulfamoilfenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)butanamida e IRDye750 -2c
Figure imgf000019_0001
Se añadió 26 (178 |ig, 321 nmol) en DMSO (34 |il) a una mezcla de TFA (100 |il) y DCM (100 |il). Se agitó la reacción durante 1 h a temperatura ambiente y se eliminó el disolvente a presión reducida. A la disolución residual se le añadió éster de NHS IRDye750 (194 |ig, 163 nnmol) en DMSO (25 |il) seguido por DMF (100 |il) y DIPEA (10 |il, 60 |imol). Se agitó la disolución durante 6 ha temperatura ambiente y luego se purificó directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 40 % de A / el 60 % de B a lo largo de 30 min). Se identificaron fracciones que contenían conjugado de colorante a través de su espectro de UV/VIS característico (Xmáx = 750 nm), se agruparon, se liofilizaron y se disolvieron en DMSO (100 |il) para dar una disolución de reserva verde oscuro. Se determinó su concentración y el rendimiento de reacción midiendo la absorbancia a 750 nm (8750 = 260.000 M-1 cm-1) de muestras de reserva diluidas 1:200 en PBS pH 7,4 (662 |iM, 66 nmol, 40 %).
HRMS: (m/z) [M Na]2- calculado para C68H85NsNaO18S5, 742,2247; encontrado 742,2233.
Conjugado de 4-((4-((2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)amino)-6-cloro-1,3,5-triazin-2-il)amino)bencenosulfonamida y fluoresceína - 3a
Figure imgf000019_0002
Se disolvió 28 (7,5 mg, 14 |imol) en una mezcla de DCM (1 ml) y TFA (1 ml) y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se disolvió el residuo en DMF (1 ml). Se añadió FITC (5,4 mg, 14 |imol) seguido por DIPEA (23 |il, 139 |imol) y se agitó la reacción durante 3 ha temperatura ambiente. Se añadió MeOH (1 ml) y se purificó la mezcla de reacción en bruto sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo amarillo brillante (8,1 mg, 11 |imol, 76%).1
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, dos rotámeros) 8 [ppm] = 10,31 (s a, 1H), 10,23 (s a, 1H), 9,96 (s a, 2H), 8,21 (s a, 2H), 8,02 (s a, 1H), 7,86-7,77 (m, 2H), 7,69-7,64 (m, 3H), 7,16 (m, 2H), 7,10 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,61-6,48 (m, 6H), 3,61-3,38 (m, 12H); 13C-RMN (125 Mhz, DMSO-d6, dos rotámeros, se prevé que las señales del ligador PEG se solapen) 8 [ppm] = 181,1, 169,0, 168,5, 166,0, 160,2, 159,3, 159,0, 157,3, 152,4, 142,5, 141,9, 141,0, 139,6, 138,3, 129,5, 127,2, 127,0, 126,9, 124,5, 122,61, 120,0, 113,1, 110,5, 102,7, 70,1, 70,0, 69,1, 68,5, 68,9, 49,1, 44,1; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C36H34ClN8OgS2, 821,1573; encontrado 821,8567.
Conjugado de 4-((4-((2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)amino)-6-cloro-1,3,5-triazin-2-il)amino)bencenosulfonamida e IRDye750 - 3c
Figure imgf000020_0001
Se añadió 28 (174 |ig, 328 nmol) en DMSO (19 |il) a una mezcla de TFA (100 |il) y DCM (100 |il). Se agitó la reacción durante 1 h a temperatura ambiente y se eliminaron los disolventes volátiles a presión reducida. A la disolución residual, se le añadió éster de NHS IRDye750 (194 |ig, 163 nnmol) en DMSO (25 |il) seguido por DMF (100 |il) y DIPEA (10 |il, 60 |imol). Se agitó la disolución durante 6 h a temperatura ambiente y luego se purificó directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 40 % de A / el 60 % de B a lo largo de 30 min). Se identificaron fracciones que contenían conjugado de colorante a través de su espectro de UV/VIS característico (Xmáx = 750 nm), se agruparon, se liofilizaron y se disolvieron en DMSO (100 |il) para dar una disolución de reserva verde oscuro. Se determinó su concentración y el rendimiento de reacción midiendo la absorbancia a 750 nm (8750 = 260.000 M-1 cm-1) de muestras de reserva diluidas 1:100 en PBS pH 7,4 (510 |iM, 51 nmol, 31 %).
HRMS: (m/z) [M]3- calculado para C64H77ClNgO-i7S5, 479,4582; encontrado 479,4569.
Conjugado de (E)-A/-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)-3-((4-((4-sulfamoilfenil)diazenil)fenil)amino)propanamida e IRDye750 -4c
Figure imgf000020_0002
Se añadió 29 (188 |ig, 320 nmol) en DMSO (20 |il) a una mezcla de TFA (100 |il) y DCM (100 |il). Se agitó la reacción durante 1 h a temperatura ambiente y se eliminaron los disolventes volátiles a presión reducida. Al residuo, se le añadió éster de NHS IRDye750 (194 |ig, 163 nnmol) en DMSO (25 |il) seguido por DMF (100 |il) y DIPEA (10 |il, 60 |imol). Se agitó la disolución durante 6 ha temperatura ambiente y luego se purificó directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 40 % de A / el 60 % de B a lo largo de 30 min). Se identificaron fracciones que contenían conjugado de colorante a través de su espectro de UV/VIS característico (Xmáx = 750 nm), se agruparon, se liofilizaron y se disolvieron en DMSO (100 |il) para dar una disolución de reserva verde oscuro. Se determinaron su concentración y el rendimiento de reacción midiendo la absorbancia a 750 nm (8750 = 260.000 M-1 cm-1) de muestras de reserva diluidas 1:100 en PBS pH 7,4 (390 |iM, 39 nmol, 24 %).
HRMS: (m/z) [M Na]2- calculado para C70H85N8NaO18S5, 754,2247; encontrado 754,2248.
Conjugado de A/-(2-(2-(2-am¡noetox¡)etox¡)et¡l)-4-sulfamoilbenzam¡da y fluoresceína - 5a
Figure imgf000021_0001
Se disolvió 31 (5,0 mg, 12 |imol) en una mezcla de DCM (0,5 ml) y TFA (0,5 ml) y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Se eliminaron los disolventes a presión reducida y se disolvió el residuo en DMF (0,5 ml). Se añadió DIPEA (31 |il, 187 |imol) seguido por FITC (4,5 mg, 12 |imol). Se agitó la reacción durante 2 h a temperatura ambiente, se diluyó con MeOH (0,5 ml) y se purificó sobre HPLC de fase inversa (el 80 % de A / el 20 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto mediante EM y se liofilizaron para dar el producto como un polvo amarillo brillante (6,3 mg, 10 |imol, 83 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da, sólo SO2NH2 pero no NH y OH visible) 8 [ppm] = 8,74 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,00 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,90 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,74 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,17 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,65­ 6,54 (m, 6H), 3,68 (s a, 2H), 3,61-3,56 (m, 8H), 3,47-3,42 (m, 2H); 13C-RMN (125 MHz, DMSO-d6, se prevé que las señales del ligador PEG se solapen) 8 [ppm] = 181,05, 169,0, 165,8, 160,0, 159,1, 158,8, 152,3, 152,4, 147,5, 146,7, 141,8, 137,8, 129,5, 128,3, 127,0, 126,1, 124,6, 116,9, 113,1, 110,2, 102,7, 70,1, 70,0, 69,3, 68,9, 44,2; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C34H33N4O10S2, 721,1633; encontrado 720,1620.
Conjugado de A/-(2-(2-(2-aminoetox¡)etox¡)et¡l)-4-sulfamo¡lbenzam¡da e IRDye750 - 5c
Figure imgf000021_0002
Se añadió 31 (138 |ig, 320 nmol) en DMSO (29 |il) a una mezcla de TFA (100 |il) y DCM (100 |il). Se agitó la reacción durante 1 h a temperatura ambiente y se eliminaron los disolventes volátiles a presión reducida. A la disolución residual, se le añadió éster de NHS IRDye750 (194 |ig, 163 nnmol) en DMSO (25 |il) seguido por DMF (100 |il) y DIPEA (10 |il, 60 |imol). Se agitó la disolución durante 6 h a temperatura ambiente y luego se purificó directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 40 % de A / el 60 % de B a lo largo de 30 min). Se identificaron fracciones que contenían conjugado de colorante a través de su espectro de UV/VIS característico (Xmáx = 750 nm), se agruparon, se liofilizaron y se disolvieron en DMSO (100 |il) para dar una disolución de reserva verde oscuro. Se determinaron su concentración y el rendimiento de reacción midiendo la absorbancia a 750 nm (8750 = 260.000 M-1 cm'1) de muestras de reserva diluidas 1:200 en PBS pH 7,4 (1,23 mM, 123 nmol, 75 %).
HRMS: (m/z) [M 2H]2+ calculado para C62H78N5O18S5, 1340,3951; encontrado 1340,3932.
Conjugado de (2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)carbamato de terc-butilo y fluoresceína - 6a
Figure imgf000022_0001
Se disolvieron 19 (10 mg, 40 |imol) y FITC (16 mg, 41 |imol) en DMF (1 ml) y se añadió DIPEA (10 |il, 48 |imol). Se agitó la reacción durante 2 h a temperatura ambiente, se diluyó con MeOH (1 ml) y se purificó sobre HPLC de fase inversa (el 80 % de A / el 20 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el producto como un polvo amarillo (18 mg, 29 |imol, 72 %).
1H-RMN (500 MHz, DMSO-da) 8 [ppm] = 8,45 (a, 1H), 7,76 (a, 1H), 7,18 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,71-6-69 (m, 2H), 6,37­ 6,56 (m, 4H), 3,63-3,53 (m, 8H), 3,39 (t, J = 6,0, 2H), 3,07 (a, 2H), 1,35 (s, 9H); 13C-RMN (125 MHz, DMSOd6) 8 [ppm] = 180,9, 169,0, 159,9, 156,0, 152,4, 147,4, 141,8, 129,5, 129,7, 127,0, 124,5, 116,7, 113,0, 110,3, 110,2, 102,7, 78,1, 70,1, 70,0, 69,7, 68,9, 67,02, 44,0, 28,6; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C32H36N3O9S, 638,2167; encontrado 638,2160.
Conjugado de (2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)carbamato de terc-butilo y Alexa546 - 6b
Figure imgf000022_0002
A 19 (233 |ig, 943 nmol) en DMSO (6 |il) se le añadió éster de NHS Alexa546 (100 |ig, 86 nmol). Se añadieron DIPEA (2 |il, 12 |imol) y DMF (50 |il) y se agitó la mezcla durante 2 ha temperatura ambiente. Se diluyó la reacción con MeOH (50 |il) y se purificó sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto tal como se identifica a través de su espectro de UV/VIS característico (Xmáx = 550 nm), se liofilizaron y se disolvieron en 100 |il de PBS pH 7,4 para dar una disolución morado oscuro. Se determinaron su concentración y el rendimiento de reacción midiendo la absorbancia a 556 nm (8556 = 112,000 M'1 cirr1) de muestras de reserva diluidas 1:100 en PBS pH 7,4 (555 |iM, 56 nmol, 65 %).
HRMS: (m/z) [M 2H]+ calculado para Cs-i^yChNsO-^, 1190,2856; encontrado 1190,2859.
Carbonato de CBI seleccionado como diana AAZ - 7a
Figure imgf000023_0001
Se disolvieron ligador cargado seleccionado como diana AAZ 11a (7,8 mg, 8,6 |imol) y 12 (5,1 mg, 7,2 |imol) en MeOH desgasificado (0,5 ml) y se agitaron durante 6 ha temperatura ambiente. Se purificó la mezcla de reacción directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min), se agruparon fracciones que contenían el producto mediante EM y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo blanco (5,5 mg, 3,7 |imol, 47 %).
1H-RMN (500 MHz, DMSO-da) 8 [ppm] = 11,57 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 8,31 (s a, 3H), 8,20 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,03 (s a, 2H), 7,89 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,85 (s, 1H), 7,63 (t, J = 8,0, 1H), 7,53 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,21 (s a, 4H), 7,13 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,02 (s, 1H), 4,87 (t, J = 10,0 Hz, 1H), 4,63-4,52 (m, 5H), 4,45­ 4,40 (m, 1H), 4,29-4,26 (m, 6H), 4,10 (dd, J = 11,2, 3,1 Hz, 1H), 4,00 (dd, J = 11,2, 6,9 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,51­ 3,49 (m, 2H), 3,25-3,21 (m, 1H), 3,14-3,11 (m, 2H), 3,07-3,02 (m, 3H), 2,90 (s, 6H), 2,73-2,57 (m, 6H), 2,55-2,45 (m, 2H), 2,13 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 1,96-1,90 (m, 2H), 1,81-1,73 (m, 3H), 1,55-1,40 (m, 5H); HRMS: (m/z) [M 2H]2+ calculado para C60H78ClN17O-igS4, 751,7110; encontrado 751,7109.
Carbonato de CBI no seleccionado como diana - 7b
Figure imgf000023_0002
Se disolvieron carbonato activado 12 (5,0 mg, 7,1 |imol) y ligador cargado no seleccionado como diana 11b (10 mg, 14 |imol) en MeOH desgasificado (0,5 ml) y se agitaron durante 6 ha temperatura ambiente. Se purificó la mezcla de reacción directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min), fracciones que contenían el producto mediante EM se agruparon y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo blanco (4,1 mg, 3,1 |imol, 43 %).1
1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 11,57 (s, 1H), 8,37 (s, 1H), 8,21 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 8,17 (s a, 2H), 8,06 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,96 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,64 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,53 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 7,40-6,77 (a, 4H), 7,31 (s, 1H), 7,13 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,03 (s, 1H), 4,86 (t, J = 10,1 Hz, 1H), 4,63-4,41 (m, 7H), 4,30-4,21 (m, 5H), 4,10 (dd, J = 11,1, 2,8 Hz, 1H), 4,00 (dd, J = 11,2, 7,0 Hz, 1H), 3,85 (s, 3H), 3,54-3,52 (m, 2H), 3,22-2,98 (m, 6H), 2,92 (s, 6H), 2,75-2,66 (m, 2H), 2,59 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,54-2,47 (m, 2H), 2,24 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,13 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 1,82-1,70 (m, 5H), 1,53-1,41 (m, 5H); HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C58H75ClN13O1sS2, 1340,4477; encontrado 1340,4466.
Carbamato de CBI seleccionado como diana AAZ - 8a
Figure imgf000024_0001
Se disolvieron ligador cargado seleccionado como diana AAZ 11a (7,6 mg, 8,3 |imol) y carbamato activado 13 (2,7 mg, 3,8 |imol) en MeOH desgasificado (0,5 ml) y se agitaron durante 6 ha temperatura ambiente. Se purificó la mezcla de reacción directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min), se agruparon fracciones que contenían el producto mediante EM y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo blanco (2,0 mg, 1,3 |imol, 35 %).
1H-RMN (500 MHz, DMSO-da, mezcla de 2 rotámeros) 8 [ppm] = 13,00 (s a, 1H), 12,39 (s a, 1H), 11,54 (s, 1H), 9,72 (s a, 1H), 8,32 (s, 2H), 8,24-8,18 (m, 3H), 8,14-8,10 (m, 1H), 8,03-7,97 (m, 2H), 7,92-7,86 (m, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,62­ 7,58 (m, 1H), 7,51-7,44 (m, 2H), 7,32-7,01 (m, 7H), 4,85 (t, J = 10,6 Hz, 1H), 4,61-4,47 (m, 4H), 4,43-4,38 (m, 1H), 4,30-4,19 (m, 5H), 4,11-4,08 (m, 1H), 3,99-3,89 (m, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,63-3,53 (m, 4H), 3,25-2,96 (m, 8H), 2,93 (s, 6H), 2,75-2,57 (m, 6H), 2,53-2,47 (m, 2H), 2,13 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,96-1,90 (m, 2H), 1,78-1,68 (m, 3H), 1,54-1,40 (m, 5H); HRMS: (m/z) [M 2H]2+ calculado para C61H81ClN18O-,8S4, 758,2268; encontrado 758,2267.
Carbamato de CBI no seleccionado como diana - 8b
Figure imgf000024_0002
Se disolvieron carbamato activado 13 (5,0 mg, 6,9 |imol) y ligador cargado no seleccionado como diana 11b (10 mg, 14 |imol) en MeOH desgasificado (0,5 ml) y se agitaron durante 6 h a temperatura ambiente. Se purificó la mezcla de reacción directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min), fracciones que contenían el producto mediante EM se agruparon y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo blanco (5,1 mg, 3,7 |imol, 54 %).1
1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6, mezcla de 2 rotámeros) 8 [ppm] = 12,4 (s a, 3H) 11,54 (s, 1H), 8,24-8,14 (m, 4H), 8,03-7,87 (m, 3H), 7,82 (s, 1H), 7,63-7,47 (m, 3H), 7,32-6,82 (m, 7H), 4,85 (t, J = 10,0 Hz, 1H), 4,62-4,53 (m, 3H), 4,50-4,44 (a m, 1H), 4,43-4,37 (a m, 1H), 4,30-4,20 (m, 5H), 4,11-4,07 (m, 1H), 3,99-3,87 (m, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,64­ 3,50 (m, 4H), 3,25-2,95 (m, 8H), 2,93 (s, 6H), 2,75-2,58 (m, 4H), 2,53-2,46 (m, 2H), 2,25 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,12 (t, J= 7,3 Hz, 2H), 1,84-1,68 (m, 5H), 1,56-1,38 (m, 5H); HRMS: (m/z) [M 2H]2+ calculado para CggHygClN-MO-^, 677,2433; encontrado 677,2430.
Conjugado de DM1 seleccionado como diana - 9a
Figure imgf000025_0001
Se disolvió CysAspArgAsp-ligador-AAZ 11a (40 mg, 40 |imol) en MeOH desgasificado (5 ml) y se añadió 2,2'-dipiridildisulfuro (13,2 mg, 60 |imol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 12 h y se añadió gota a gota a dietil éter helado (40 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación, se volvió a disolver en MeOH y se precipitó de nuevo con dietil éter helado (40 ml) y se secó a vacío para dar el disulfuro activado como un residuo blanco (20 mg, 20 |imol, 49 %). Se disolvió una alícuota del disulfuro activado (8 mg, 7,8 |imol) en DMF (500 |il) y se añadió tiol libre de DM1 (5,5 mg, 7,4 |imol). Se dejó la reacción en reposo a temperatura ambiente durante 48 h tras lo cual se recuperó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo blanquecino (9,0 mg, 5,5 |imol, 74 %).
HRMS: (m/z) [M 2H]2+ calculado para C65Hg4ClN-i7O23S4821,7634; encontrado 821,7633.
Conjugado de DM1 no seleccionado como diana - 9b
Figure imgf000025_0002
Se disolvió CysAspArgAsp-ligador-COOH 11b (21 mg, 28 |imol) en MeOH desgasificado (5 ml) y se redujo con TCEPHCl (16 mg, 56 |imol) durante 2 h a temperatura ambiente. Se añadió 2,2'-dipiridildisulfuro (25 mg, 114 |imol) y se agitó la mezcla durante 12 ha temperatura ambiente. Se precipitó la reacción en dietil éter helado (40 ml), se recogió el producto mediante centrifugación, se volvió a disolver en MeOH (5 ml) y se precipitó de nuevo con dietil éter helado (40 ml). Se secó el precipitado a vacío para dar el disulfuro activado como un residuo blanco (20 mg, 23 |imol, 83 %). Se disolvió una alícuota del disulfuro activado (10 mg, 12 |imol) en DMF (500 |il) y se añadió tiol libre de DM1 (8,6 mg, 12 |imol). Se dejó la reacción en reposo a temperatura ambiente durante 48 h tras lo cual se recuperó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo blanquecino (7,0 mg, 4,7 |imol, 40 %).
HRMS: (m/z) [M 2H]2+ calculado para C63H92ClN1aO22S2, 740,7799; encontrado 740,7792.
W-(5-sulfamoil-1,3,4-tiadiazol-2-il)hex-5-inamida -10
Figure imgf000025_0003
Se enfrió una disolución de acido 5-hex¡no¡co (1,4 ml, 12,9 mmol) y DMF (50 |il) en DCM (50 ml) en hielo y se añadió cloruro de oxalilo (1 ml, 11,7 mmol) gota a gota a lo largo de 15 min. Se dejó calentar la reacción hasta temperatura ambiente, se agitó hasta que cesó la evanescencia y luego se concentró a presión reducida. Se añadió el líquido amarillo gota a gota a una disolución de 23 (2,3 g, 12,9 mmol) y piridina (943 |il, 25,8 mmol) en DMF (15 ml) y se agitó la reacción durante 3 h a temperatura ambiente. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en columna (EtOAc) para dar el producto como un sólido blanquecino (2,8 g, 79 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 8 [ppm] = 2,81 (t, J = 2,6 Hz, 1H), 2,65 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,24 (td, J = 7,1, 2,6 Hz, 2H), 1,84-1,77 (m, 2H); 13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 171,5, 164,2, 160,9, 83,6, 71,8, 33,6, 23,1, 17,2; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C8H11N4O3S6, 275,0267; encontrado 275,0268.
CysAspArgAsp-ligador-acetazolamida - 11a
Figure imgf000026_0001
Se hinchó Fmoc-Cys(Trt) precargado comercialmente disponible en resina Tentagel (500 mg, 0,415 mmol, RAPP Polymere) en DMF (3 x 5 min x 5 ml), se eliminó el grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (1 x 1 min x 5 ml y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml). Se extendió el péptido con Fmoc- Asp(fBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH y Fmoc-Asp(fBu)-OH en el orden indicado y luego se tapó con 5-azido-valerato. Con este fin, se disolvieron el ácido azido o aminoácido protegido con Fmoc (3,0 eq), HBTU (3,0 eq), HOBt (3,0 eq) y DIPEA (6,0 eq) en DMF (5 ml), se dejó reposar la mezcla durante 1 min a temperatura ambiente y luego se hizo reaccionar con la resina durante 1 h con agitación suave. Tras lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml) se eliminó el grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes de que se iniciara la siguiente etapa de acoplamiento. Tras el acoplamiento de 5-azido-valerato, se preparó una disolución de CuI (0,3 eq), TBTA (0,3 eq) y alquino 10 (6 eq) en una mezcla de DMF (2,5 ml) y THF (2,5 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 2 ha temperatura ambiente. Tras lavar con DMF (3 x 1 min x 5 ml), disolución de EDTA ac. 50 mM (3 x 1 min x 5 ml), DMF (3 x 1 min x 5 ml) y DCM (3 x 1 min x 5 ml), se escindió el compuesto agitando la resina con una mezcla de TFA (4,5 ml), TIS (250 |il) y H2O (250 |il) durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con TFA (1 x 5 min x 5 ml) y se añadieron las disoluciones de lavado y escisión combinadas gota a gota a dietil éter helado (100 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se purificó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Tras la liofilización, se recogió el compuesto del título como un polvo blanco (135 mg, 0,14 mmol, 33 %).
1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 13,00 (s, 1H), 8,31 (s, 2H), 8,23-8,20 (m, 2H), 7,98 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,93 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,82 (a m, 1H), 7,53 (a m, 1H), 7,27-7,06 (a m, 4H), 4,59-4,51 (m, 2H), 4,40-4,36 (m, 1H), 4,27 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 4,21-4,20 (m, 1H), 3,06-3,04 (a m, 2H), 2,87-2,47 (m, 9H), 2,38 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 2,14 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,95-1,90 (m, 2H), 1,77-1,69 (m, 3H), 1,54-1,39 (m, 5H); 13C-RMN (125 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 172,7, 172,5, 172,3, 172,1, 171,7, 171,6, 171,5, 170,9, 164,7, 161,5, 157,2, 146,5, 122,3, 54,9, 52,7, 50,1, 49,9, 49,3, 40,9, 36,3, 36,2, 34,7, 29,6, 29,4, 35,9, 25,2, 24,8, 24,6, 22,5; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C30H47N14O13S3, 995,1966; encontrado 995,1964.
CysAspArgAsp-ligador-COOH - 11b
Figure imgf000026_0002
Se hinchó Fmoc-Cys(Trt) precargado comercialmente disponible en resina Tentagel (500 mg, 0,415 mmol, RAPP polymere) en DMF (3 x 5 min x 5 ml), se eliminó el grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (1 x 1 min x 5 ml y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml). Se extendió el péptido con Fmoc-Asp(OfBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH y Fmpc-Asp(OfBu)-OH en el orden indicado y luego se tapó con 5-azido-valerato. Con este fin, se disolvieron el ácido azido o aminoácido protegido con Fmoc (3,0 eq), HBTU (3,0 eq), HOBt (3,0 eq) y DIPEA (6,0 eq) en DMF (5 ml), se dejó reposar la mezcla durante 1 min a temperatura ambiente y luego se hizo reaccionar con la resina durante 1 h con agitación suave. Tras lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml) se eliminó el grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes de que se iniciara la siguiente etapa de acoplamiento. Tras el acoplamiento de 5-azido-valerato, se preparó una disolución de CuI (0,3 eq), TBTA (0,3 eq) y ácido 5-hexinoico (6 eq) en una mezcla de DMF (2,5 ml) y THF (2,5 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 2 ha temperatura ambiente. Tras lavar con DMF (3 x 1 min x 5 ml), disolución de EDTA ac. 50 mM (3 x 1 min x 5 ml), DMF (3 x 1 min x 5 ml) y DCM (3 x 1 min x 5 ml), se escindió el compuesto agitando la resina con una mezcla de TFA (4,4 ml), fenol (250 |il), agua (250 |il) y TIPS (100 |il) durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con TFA (1 x 5 min x 5 ml) y se añadieron las disoluciones de lavado y escisión combinadas gota a gota a dietil éter helado (100 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se purificó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Tras la liofilización, se recogió el compuesto del título como un polvo blanco (116 mg, 0,16 mmol, 43%).
1H-RMN (500 MHz, MeOH-d4) 8 [ppm] = 7,81 (s, 1H), 4,58-4,51 (m, 2H), 4,30-4,23 (m, 4H), 3,09 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,91-2,60 (m, 8H), 2,25 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,18 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,90-1,77 (m, 5H), 1,65-1,48 (m, 5H); 13C-RMN (125 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 174,6, 173,6, 172,7, 172,2, 172,0, 171,6, 171,4, 170,7, 157,1, 146,7, 122,3, 54,8, 52,7, 49,9, 49,8, 49,3, 40,8, 36,2, 34,7, 33,4, 33,1, 29,6, 25,8, 25,1, 24,8, 24,7, 22,5; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C28H46N10O12S, 745,2934; encontrado 745,2931.
Carbonato-disulfuro de piridilo de fármaco de CBI sec -12
Figure imgf000027_0001
Se disolvieron fármaco de CBI sec 14 (10 mg, 20 |imol, 1 eq), carbonato activado 16 (7,2 mg, 20 |imol, 1 eq) y N,N-dimetilaminopiridina (DMAP, 2,4 mg, 50 |imol, 2,5 eq) en DMF (2 ml) y se agitaron durante 5 h a temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla de reacción con MeOH (2 ml) y se purificó sobre HPLC (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo blanquecino (10,1 mg, 14,3 |imol, 72 %).
1H-RMN (400 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 8,45 (s a, 1H) 8,34 (s, 1H), 7,94-7,81 (m, 4H), 7,66 (dt, J = 6,9, 1,1 Hz, 1H), 7,59 (dt, J = 6,9, 1,0 Hz, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,26 (m, 1H), 7,06 (s, 1H), 6,99 (s, 1H), 4,70-4,61 (m, 2H), 4,58 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 4,33 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 4,24-4,20 (m, 1H), 4,00 (dd, J = 11,4, 3,3 Hz, 1H), 3,89 (s, 3H), 3,71 (dd, J = 11,3, 8,2 Hz, 1H), 3,60 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 3,25 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,06 (s, 6H); 13C-RMN (125 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 160,3, 159,3, 153,8, 150,0, 149,2, 146,9, 143,4, 141,2, 137,9, 132,9, 129,7, 128,7, 127,5, 125,1, 123,8, 122,9, 122,7, 121,6, 121,4, 120,6, 120,0, 110,6, 107,8, 106,7, 93,8, 66,3, 64,5, 56,6, 54,8, 46,3, 42,5, 42,0, 37,0; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C35H36ClN4O6S2, 707,1759; encontrado 707,1761.
Carbamato- disulfuro de piridilo de fármaco de CBI sec - 13
Figure imgf000027_0002
Se disolvieron fármaco de CBI sec 14 (10 mg, 20 |imol, 1,0 eq), carbamato activado 17 (12 mg, 92 |imol, 4,6 eq) y DMAP (10 mg, 100 |imol, 5,0 eq) en DMF (2 ml) y se agitaron durante 12 ha temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla de reacción con MeOH (2 ml) y se purificó sobre HPLC (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo blanquecino (9,5 mg, 13 |imol, 65 %).
1H-RMN (400 MHz, MeOD-d4, mezcla de dos rotámeros) 8 [ppm] = 8,42-8,23 (a m, 2H), 7,96-7,73 (m, 4H), 7,60-7,37 (m, 2H), 7,32 (s, 1H), 7,35-7,24 (m, 1H), 7,16-7,14 (m, 1H), 7,04-7,03 (2s, 1H), 4,74-4,65 (m, 2H), 4,31 (t, J = 4,7 Hz, 2H), 4,30-4,21 (m, 1H), 4,07-4,00 (m, 2H), 3,84-3,82 (2s, 3H), 3,87-3,62 (m, 2H), 3,60 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 3,36-3,11 (m, 5H), 3,05 (s, 6H); 13C-RMN (125 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 161,8, 161,7, 161,1, 160,8, 157,0 156,6, 151,5, 150,6, 149,1, 144,9, 142,9, 142,8, 139,1, 134,6, 131,3, 128,8, 126,3, 124,1, 123,8, 123,7, 123,6, 122,6, 122,2, 121,5, 121,5, 112,9, 112,6, 109,5, 108,0, 107,9, 95,5, 98,4, 66,2, 58,1, 56,4, 56,3, 47,8, 44,0, 43,6, 37,5, 37,4, 35,8, 35,7; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C36H39ClN5O5S2, 720,2076; encontrado 720,2074.
Fármaco de CBI sec -14
Figure imgf000028_0001
Se disolvió CBI sec protegido en N-Boc (50 mg, 150 |imol, 1,0 eq) en HCl 4 M en EtOAc seco (5 ml) y se agitaron durante 6 h a temperatura ambiente. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se disolvió el residuo en 3 ml de DMF y se enfrió en hielo. Se añadió EDCHCl (86 mg, 450 |imol, 3,0 eq) seguido por indol 18 (61 mg, 220 |imol, 1,3 eq), se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se dejó agitar durante 12 h. Se añadió MeOH (3 ml) y se purificó la mezcla de reacción en bruto sobre HPLC (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo amarillento (44,1 mg, 89,5 |imol, 60 %).
1H-RMN (400 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 8,10 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,61 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,37 (td, J = 6,8, 1,2 Hz, 1H), 7,23 (td, J = 6,8, 1,0 Hz, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,91 (s, 1H), 6,87 (s, 1H), 4,49-4,38 (m, 2H), 4,13 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,96-3,92 (m, 1H), 3,80 (dd, J = 11,2, 3,2 Hz, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,44-3,39 (m, 3H), 2,91 (s, 6H); 13C-RMN (100 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 173,0, 162,4, 155,8, 151,6, 144,9, 143,4, 134,6, 131,6, 130,9, 128,6, 124,6, 124,5, 123,5, 122,2, 117,0, 109,5, 107,9, 101,5, 95,5, 66,0, 58,1, 56,8, 56,3, 47,5, 43,9, 43,6; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C27H2gClNgO4, 494,1841; encontrado 494,1843.
N1-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)-N4-(5-sulfamoil-1,3,4-tiadiazol-2-il)succinamida - 25
Figure imgf000028_0002
Se hinchó 0-Bis-(aminoetil)etilenglicol precargado comercialmente disponible en resina de tritilo (500 mg, 0,3 mmol, Merck Millipore) en DMF ( 3 x 5 min x 5 ml). Se disolvieron ácido 4-oxo-4-((5-sulfamoil-1,3,4-tiadiazol-2-il)amino)butanoico (AAZSucc, 166 mg, 0,59 mmol) y HATU (228 mg, 0,60 mmol) en d Mf (5 ml) y se añadió DIPEA (200 |il, 1,2 mmol). Se hizo reaccionar la disolución inmediatamente con la resina durante 30 min a temperatura ambiente. Se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml), DCM (3 x 1 min x 5 ml) y se escindió con el 95 % de TFA / el 2,5 % de H2O / el 2,5 % de triisopropilsilano (TIS, 5 ml de volumen total) durante 1 h a temperatura ambiente y se lavó con TFA (1 x 1 min x 5 ml). Se vertieron disoluciones de lavado y escisión combinadas en Et2O frío (40 ml), se recogió el precipitado mediante centrifugación y se purificó sobre HPLc de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el producto como un polvo blanco (48 mg, 0,12 mmol, 39 %).1
1H-RMN (400 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 3,60 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,55 (m, 4H), 3,45 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,27 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,02 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,75 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 2,54 (t, J = 6,2 Hz, 2H); 13C-RMN (100 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 174,3, 173,0, 166,4, 163,1, 71,4, 71,3, 70,7, 67,9, 40,7, 40,3, 31,5, 30,9; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C12H23N6O6S2, 411,1115; encontrado 411,1116.
(2-(2-(2-(3-Metil-2-(4-(4-sulfamoilfenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)butanamido) etoxi)etoxi)etN)carbamato de (S)-terc-butilo -26
Figure imgf000029_0001
A una disolución de 27 (64 mg, 0,20 mmol) en DMF (2 ml) se le añadió NHS (25 mg, 0,22 mmol) y EDCHCl (42 mg, 0,22 mmol) y se agitó la mezcla durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió una disolución de 19 (54 mg, 0,22 mmol) y DIPEA (110 |il, 0,67 mmol) en DMF (1 ml) y se agitó la reacción durante 1 h a temperatura ambiente. Se eliminó el disolvente a presión reducida, se disolvió el residuo en DCM (5 ml) y se lavó la disolución con H2O (1 x 5 ml), salmuera (1 x 5 ml), se secó sobre Na2SO4 y se eliminó el disolvente a presión reducida. La purificación mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre sílice (EtOAc) dio el producto como un sólido blanco (63 mg, 0,11 mmol, 57%).
1H-RMN (400 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 8,75 (a m, 1H), 8,69 (s, 1H), 8,05 (d, J =6,6 Hz, 2H), 7,98 (d, J =6,6 Hz, 2H), 3,61-3,56 (m, 6H), 3,53-3,37 (m, 4H), 3,22 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 2,65-2,56 (m, 1H), 1,44 (s, 9H), 1,12 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,84 (d, J = 6,6 Hz, 3H); 13C-RMN (100 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 170,0, 158,5, 147,5, 144,5, 135,5, 128,0, 127,0, 122,3, 80,1, 71,7, 71,6, 71,3, 71,1, 70,3, 41,2, 40,7, 33,0, 28,8, 19,6, 19,2; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C24H38N6NaOyS, 577,2415; med. 577,2415.
Ácido (S)-3-metil-2-(4-(4-sulfamoilfenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)butanoico - 27
Figure imgf000029_0002
Se disolvieron etinilo-bencenosulfonamida (54 mg, 0,3 mmol), azido valina 20 (42 mg, 0,3 mmol) y tris-(benciltriazolilmetil)amina (TBTA, 0,3 mg, cat.) en una mezcla de fBuOH (3,7 ml), una disolución de CuSO40,04 M en PBS pH 7,4 (2,0 ml) y una disolución de ascorbato de sodio 0,1 M en PBS pH 7,4 (1,7 ml) y se agitaron durante 12 h a temperatura ambiente. Todos los disolventes se habían desgasificado previamente y purgado con Ar. Se vertió la reacción sobre 25 ml de H2O acidificada hasta pH 2,0 y se extrajo la mezcla con EtOAc (4 x 20 ml), se lavaron las fases orgánicas agrupadas con salmuera y se secaron sobre MgSO4. Se eliminó el disolvente a vacío y se purificó el residuo sobre sílice (el 20 % de MeOH en DCM con el 0,1 % de Et3N) para dar el producto como un sólido blanco (70 mg, 72 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 8,86 (s, 1H), 8,10 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,90 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,39 (s, 1H), 5,24 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 2,64-2,55 (m, 1H), 1,00 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,88 (d, J = 6,7 Hz); 13C-RMN (100 MHz, DMSOd6) 8 [ppm] = 169,6, 145,0, 143,2, 133,7, 126,3, 125,4, 122,6, 68,3, 30,4, 19,0, 18,3; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C-i3H-i5N4Na2O4S, 369,0604; encontrado 369,0609.
(2-(2-(2-((4-Cloro-6-((4-sulfamoilfenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)etoxi)etoxi)etil)carbamato de tere-butilo - 28
Figure imgf000029_0003
Se disolvieron 21 (160 mg, 0,64 mmol), 14 (204 mg, 0,64 mmol) y DIPEA (105 |il, 0,64 mmol) en DMF (5 ml) y se agitaron durante 3 h a temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla de reacción con H2O (15 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 10 ml). Se lavaron las fracciones orgánicas combinadas con disolución de LiCl ac. al 10 % p/v (1 x 10 ml), salmuera (1 x 10 ml) y se secaron sobre Na2SO4. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se purificó el residuo sobre sílice (EtOAc) para dar el producto como un sólido blanco (239 mg, 66 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da, mezcla de dos rotámeros) 8 [ppm] = 10,39-10,30 (m, 1H), 8,27 (s a, 1H), 7,93 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,85 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,74 (m, 2H), 7,25 (s, 1H), 7,23 (s, 1H), 6,74-6,73 (m, 1H), 3,57-3,32 (m, 10H), 3,05 (m, 2H), 1,37 (s, 9H); 13C-RMN (125 MHz, DMSO-d6, mezcla de dos rotámeros, se solapan varias señales) 8 [ppm] = 169,0, 168,5, 166,0, 165,9, 164,2, 163,7, 156,0, 142,6, 142,5, 138,3, 138,2, 127,1, 126,8, 120,0, 119,8, 78,1, 70,1, 70,0, 69,9, 69,6, 69,1, 68,8, 67,1, 39,0, 28,7; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C20H30ClNyNaO6S, 554,1559; encontrado 554,1555.
(E)-(2-(2-(2-(3-((4-((4-Sulfamoilfenil)diazenil)fenil)amino)propanamido)etoxi)etoxi)etil)carbamato de terc-butilo - 29
Figure imgf000030_0001
A 30 (20 mg, 57 pmol) disuelto en DMF (1 ml) se le añadió HOBt (8,7 mg, 57 pmol) seguido por EDCHCl (12,2 mg, 64 pmol). Tras agitar la reacción durante 1 h a temperatura ambiente se añadió una disolución de 19 (15,8 mg, 64 mmol) y DIPEA (20 pl, 122 pmol) en DMF (0,5 ml). Se agitó la mezcla durante 1 h a temperatura ambiente, se diluyó con MeOH (1,5 ml) y se purificó sobre HPLC de fase inversa (el 80 % de A / el 20 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el producto como un polvo naranja (26 mg, 45 mmol, 79 %).
1H-RMN (400 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 8,02 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,91 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,83 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 9 Hz, 2H), 3,60 (s, 4H), 3,58-3,49 (m, 6H), 3,40 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 3,23-3,20 (m, 2H), 2,56 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 1,45 (s, 9H); 13C-RMN (125 MHz, MeOD-d4) 8 [ppm] = 170,8, 156,1, 154,7, 153,2, 144,3, 143,3, 127,4, 126,3, 122,4, 112,2, 78,1, 70,0, 69,9, 69,6, 69,5, 39,1, 35,4, 28,7; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C26H38N6NaOyS, 601,2415; encontrado 601,2416.
Ácido (E)-3-((4-((4-sulfamoilfenil)diazenil)fenil)amino)propanoico - 30
Figure imgf000030_0002
Se disolvió sulfanilamida (85 mg, 0,49 mmol) en HCl ac. al 40 % (1,3 ml) y se enfrió hasta 0 °C. Se añadió una disolución de NaNO2 en agua (300 pl) gota a gota a lo largo de 5 min y se agitó la reacción en hielo durante 15 min. Se añadió lentamente la disolución amarillenta a una suspensión de 22 (129 mg, 0,37 mmol) en NaOH ac. 10 M (1 ml) y DMF (1 ml) y se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. Se acidificó la disolución rojo oscuro con HCl 6 N, se extrajo con EtOAc (6 x 10 ml), se secó sobre Na2SO4 y se eliminó el disolvente a presión reducida. La recristalización del residuo rojo oscuro dio el producto como un sólido rojo (32 mg, 25 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 7,95 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,88 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,44 (s, 2H), 9,94 (s a, 1H), 6,74 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 3,40 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,56 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 172,9, 154,1, 152,6, 143,8, 142,9, 126,8, 125,8, 121,9, 111,7, 38,4, 33,4; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C-i5H-iyN4O4S, 349,0965; encontrado 349,0967.
(2-(2-(2-(4-Sulfamoilbenzamido)etoxi)etoxi)etil)carbamato de terc-butilo - 31
Figure imgf000031_0001
A una disolución de 4-carboxibencenosulfonamida (46 mg, 0,23 mmol) en MeCN (2 ml) se le añadió NHS (29 mg, 0,25 mmol) seguido por EDCHCl (48 mg, 0,25 mmol). Tras agitar durante 4 h a temperatura ambiente se añadió más EDC HCl (24 mg, 0,13 mmol) y se agitó la reacción durante 1 h adicional a temperatura ambiente. Se añadió una disolución de 19 (52 mg, 0,21 mmol) y DIPEA (140 |il, 0,85 mmol) en DMF (1 ml). Tras agitar durante 10 ha temperatura ambiente, se filtró la reacción a través de un lecho de sílice que eluye con EtOAc, se eliminó el disolvente a presión reducida y se purificó el residuo sobre sílice (EtOAc hasta el 10 % de MeOH en EtOAc) para dar el producto como un sólido blanco (61 mg, 0,14 mmol, 67 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 8 [ppm] = 8,71 (a m, 1H), 8,00 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,90 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,46 (s a, 2H), 6,76 (a m, 1H), 3,55-3,33 (m, 10H), 3,06-3,05 (m, 2H), 1,37 (s, 9H); 13C-RMN (125 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 165,8, 156,1, 146,7, 137,7, 128,3, 126,1, 78,1, 70,0, 69,9, 69,6, 69,2, 67,1, 39,1, 28,7; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C-ia^g^NaO/S, 454,1618; encontrado 454,1623.
Propagación de errores
Durante el análisis de datos se propagaron desviaciones estándar según la fórmula (1) tal como recomienda el National Institute of Standards and Technology.121
Figure imgf000031_0002
Donde f = f(xi, X2, ... xn), a es la desviación estándar de la función f y a es la desviación estándar de x¡.
Determinación de Kn de ligando mediante medición de polarización de fluorescencia
Se disolvieron ligandos marcados fluorescentemente (2 mg) en DMSO (100 |il) y se diluyeron 1:2000 en PBS pH 7,4 para determinar la concentración de reserva mediante medición de absorbancia a 495 nm (8495 = 72.000 M'1 cirr1). Se expresó CAIX recombinante tal como se describió previamente131, se dializó contra tampón de ensayo (tris(hidroximetil)aminometano 50 mM [TIRS] pH 7,4 que contiene ZnSO41 mM) a 4 °C durante la noche y se determinó la concentración de proteínas determinada mediante medición de absorbancia a 280 nm (8280 = 35.075 M’1 cirr1).
En un placa negra de 384 pocillos en tampón de ensayo (30 |il) se incubaron ligandos marcados fluorescentemente (5 nM de reservas de DMSO diluidas de manera apropiada, contenido de DMSO final ajustado al 0,001 %) con concentraciones crecientes de anhidrasa carbónica recombinante IX (de 4,6 |iM a 140 pM en etapas de 1:2) durante 1 h a temperatura ambiente. Se midió la polarización de fluorescencia (FP) en un lector de placas de modo múltiple Spectra Max Paradigm (Molecular Devices). Se realizaron experimentos por triplicado, se dividieron valores de FP medios entre la señal de superior-meseta y el valor de FP fraccional ajustado a la ecuación (2) usando KaleidaGraph 4.0 (Synergy Software).
Figure imgf000031_0003
Donde FP es la polarización de fluorescencia fraccional, [P]o la concentración de proteínas total, [L]o la concentración total del ligando marcado fluorescentemente y Kd la constante de disociación en nM.
Los valores medidos de Kd para complejos de fluoróforo-ligador-ligando fueron: 1a 12,± 61,0 nM; 2a 18,1 ± 1,3 nM; 3a 46,8 ± 1,2 nM; 5a 218 ± 9 nM. 4a no pudo determinarse debido a sus propiedades de extinción oscuras. El ejemplo de referencia 6a no se unió a CAIX. Por tanto, el ligando de acetazolamida (AAZ) de 1a parece ser el más prometedor.
Medición de polarización de fluorescencia competitiva de Kn
En un placa negra de 384 pocillos en tampón de ensayo (véase lo anterior, 40 |il) se incubaron sonda marcada fluorescentemente 1a (5 nM de reservas de DMSO diluidas de manera apropiada) y anhidrasa carbónica recombinante IX (25 nM) con concentraciones crecientes de ligando no marcado (de 2,5 |iM a 76 pM en etapas de 1:2) durante 1 h a temperatura ambiente. Se midió el FP en un lector de placas de modo múltiple Spectra Max Paradigm (Molecular Devices). Se realizaron experimentos por triplicado y se analizaron los datos tal como se describe por Wang y colaboradores.[4]
Se usó este método para determinar Kd para los conjugados de fármaco-ligador-ligando sin marcar preparados tal como se muestra en la figura 2. Los valores de Kd se proporcionan en un ajuste de grupos ± errores estándar. Se determinaron los siguientes valores de Kd: 7a 7,3 ± 0,5 nM; 8a 40,3 ± 2,6 nM; 9a 26,5 ± 2,5 nM. El Kd para 7b fue > 1 |iM. Por tanto, los conjugados seleccionados como diana 7a, 8a y 9a conservan la afinidad de unión para CAIX recombinante in vitro mientras que los controles no seleccionados como diana 7b, 8b y 9b no presentan una unión fuerte.
Cultivo celular
Se mantuvieron células SKRC52 y HEK en medio RPMI (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal al 10 % (FCS, Invitrogen) y antibiótico-antimicótico (AA, Invitrogen) a 37 °C y el 5 % de CO2. Se mantuvieron células A549 en medio F-12K (Invitrogen) complementado con FCS al 10 % (Invitrogen) y AA (Invitrogen) a 37 °C y el 5 % de CO2. Para el pase, se separaron células usando tripsina con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,05 % (Invitrogen) cuando se alcanza el 90 % de confluencia y vuelven a sembrarse a una dilución de 1:10.
Se analizó la expresión en la superficie celular de CAIX en diferentes líneas celulares usadas en este estudio mediante citometría de flujo usando aCAIX (un anticuerpo de conejo anti-CAIX humana policlonal de Santa Cruz Biotechnology). Se usó un anticuerpo anti-IgG de conejo marcado de manera adecuada para detección. Se encontró que las células SKRC52 expresan de manera constitutiva altos niveles de CAIX. En cambio, las células A549 expresan sólo niveles muy bajos de CAIX en condiciones normóxicas. Puesto que mantienen fuertes uniones a placas de cultivo, se usaron estas células como controles negativos en experimentos que requieren múltiples etapas de lavado de células unidas. Se encontró que las células HEK no expresan niveles detectables de CAIX en condiciones de cultivo normóxicas. Pueden separarse fácilmente de placas de cultivo con EDTA y se usaron, por tanto, como controles negativos en la mayoría experimentos de citometría de flujo.
Ensayo de citotoxicidad in vitro
Se sembraron células SKRC52 o A549 en placas de 96 pocillos en su medio de cultivo apropiado (100 |il) a una densidad de 5000 células por pocillo y se dejó que crecieran durante 24 h. Se reemplazó el medio con medio que contenía diferentes concentraciones de sustancia de prueba (100 |il, 300 nM -15 pM en 1:3 etapas de dilución) y las placas o bien:
(a) se incubaron durante 72 horas en presencia de la sustancia tóxica, o bien
(b) se incubaron durante 1 h en condiciones de cultivo convencionales, seguido por eliminación del medio que contiene la sustancia tóxica, lavando suavemente el medio recién preparado de células una vez y añadiendo medio nuevo (100 |il) e incubando durante 72 h en condiciones de cultivo.
Se añadió colorante de viabilidad celular MTS (20 |il, Promega), se incubaron las placas durante 1 h en condiciones de cultivo y se midió la absorbancia a 490 nm en un lector de placas de modo múltiple Spectra Max Paradigm (Molecular Devices). Se realizaron experimentos por triplicado y se calculó la viabilidad celular promedio como absorbancia corregida con fondo medido dividida entre la absorbancia de pocillos de control sin tratar. Se determinaron valores de CE50 ajustando datos a la ecuación logística de cuatro parámetros.
Los valores de CE50 encontrados para diversos conjugados y compuestos citotóxicos contra células SKRC52 que expresan CAIX fueron tal como sigue:
Condición (a): 1455 ±5 pM; 7a 21 ± 7 pM; 7b 96 ± 33 pM; DM14,3 ± 0,5 pM; DM1SMe 0,5 ± 0,0 pM; 9a 41 ± 9 pM; 9b 31 ± 6 pM.
Condición (b): 141,0 ± 0,1 nM; 7a 0,7 ± 0,1 nM; 7b 1,4 ± 0,3 nM; DM145 ± 10 nM; DM1SMe 5,8 ± 1,1 nM; 9a *; 9b *. Estos resultados muestran que los conjugados 7a y 9a según la invención liberan el resto de fármaco citotóxico en cantidades eficaces a lo largo de 72 horas en la condición (a). Sin embargo, los conjugados de DM1 9a y 9b no presentaron suficiente citotoxicidad para medición de valores de CE50 en el plazo de 1 hora de la condición (b) a concentraciones de hasta 300 nM,, lo que refleja la relativamente larga semivida de estos conjugados tal como se comenta adicionalmente a continuación.
Análisis de unión a ligando mediante citometría de flujo
Se separaron células de placas de cultivo usando una disolución de EDTA 50 mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4, se contaron y se suspendieron hasta una concentración final de 1,5 x 106 células ml-1 en una disolución al 1 % v/v de FCS en PBS pH 7,4. Se centrifugaron alícuotas de 3 x 105 células (200 |il) y se resuspendieron en disoluciones de ligandos marcados con IRDye750 (Licor) (30 nM) en una disolución al 1 % v/v de FCS en PBS pH 7,4 (200 |il) y se incubaron en hielo durante 1 h. Se lavaron las células una vez con 200 |il de disolución al 1 % v/v de FCS en PBS pH 7,4 (200 |il), se centrifugaron, se resuspendieron en disolución al 1 % v/v de FCS en PBS pH 7,4 (300 |il) y se analizaron en un citómetro de flujo FACS Canto (BD Bioscience). Se usó FlowJo versión 8.7 (Treestar) para el análisis de datos y visualización. Los resultados fueron los siguientes:
(1) análisis de citometría de flujo de la unión de conjugados de ligando-IRDye750 1c-6c (figura 1) a células SKRC52 que expresan CAIX.
Se separaron células con EDTA, se trataron con conjugado de colorante 30 nM durante 1 h a 0 °C, se lavaron y se analizaron. Sólo 1c se une con la fuerza suficiente para dar como resultado un desplazamiento de fluorescencia fuerte tras el lavado de las células. Dada su mayor Kd, los conjugados 2c-5c se disocian probablemente demasiado rápido como para detectarse. El conjugado 6c, que carece de un ligando para CAIX, sólo muestra algo de unión residual.
(2) Análisis de citometría de flujo de la unión de conjugados de ligando-IRDye750 1c-6c (figura 1) a células HEK negativas para CAIX.
Se separaron células con EDTA, se trataron con conjugado de colorante 30 nM durante 1 h a 0 °C, se lavaron y se analizaron. En ausencia de una interacción de unión específica, existe poca diferencia entre células tratadas con conjugados de CAIX ligando-colorante y células no tratadas.
(3) Análisis de citometría de flujo de la unión de conjugados de ligando-Alexa546 1b y 6b a (a) células SKRC52 que expresan CAIX y (b) células HEK que carecen de CAlX en su superficie celular.
Se separaron células con EDTA, se trataron con conjugado de colorante 30 nM durante 1 h a 0 °C, se lavaron y se analizaron. (a) Sólo el conjugado que porta un ligando para CAIX puede lograr un aumento en la intensidad de fluorescencia. El conjugado que carece del ligando no da lugar a un desplazamiento relativo a células no tratadas. (b) Tal como se espera en ausencia de un receptor de la superficie celular ninguno de los conjugados puede lograr un desplazamiento en la intensidad de fluorescencia hacia la derecha.
Análisis de internalización de ligando mediante citometría de flujo
Se sembraron células SKRC52 o A549 en placas de 6 pocillos en su medio de cultivo apropiado (2 ml) a una densidad de 1,5 x 105 células por pocillo y se dejó que crecieran durante 24 h en condiciones de cultivo. Se reemplazó el medio con medio que contenía sondas marcadas con IRDye750 (Licor) 1c o 6c (2 ml, 30 nM) y se incubaron las placas durante 1, 2 o 4 h en condiciones de cultivo convencionales. Tras lavar con PBS pH 7,4 (2 x 2 ml), se añadió tripsina-EDTA al 0,05 % (500 |il, Invitrogen) y se incubaron las placas en condiciones de cultivo convencionales durante 15 min. Se añadió medio (500 |il), se sedimentaron células y se resuspendieron en PBS pH 7,4 que contenía FCS al 1 % v/v (150 |il). Tras incubar durante 15 min en hielo, se marcaron las células durante 30 min en hielo con IgG de conejo anti-CAIX humana (1:100, Santa Cruz) en PBS pH 7,4 que contenía FCS al 1 % (150 |il), se lavaron con PBS pH 7,4 que contenía FCS al 1 % (2 x 150 |il) y se marcaron durante 30 min en hielo con conjugado de cabra anti-IgG de conejo con Alexa488 (1:100, Invitrogen) en PBS pH 7,4 que contenía FCS al 1 % (150 |il). Tras lavar con PBS pH 7,4 que contenía FCS al 1 % (2 x 150 |il), se sedimentaron las células y se resuspendieron en PBS pH 7,4 que contenía FCS al 1 % v/v y yoduro de propidio (300 |il, 1 |ig ml-1, Invitrogen) y analizaron en un citómetro de flujo FACS Canto (BD Bioscience). Se usó FlowJo versión 8.7 (Treestar) para el análisis de datos y visualización. Para inhibir los mecanismos de captación, se preincubaron células con medio que contiene NaN3 al 0,2 % durante 1 h y se mantuvo la concentración de NaN3 en la totalidad del experimento. Alternativamente, todas las etapas se realizaron a 0 °C o se añadió un exceso de AAZ (100 |iM) al medio de cultivo.
Se incubaron células SKRC52 positivas para CAIX unidas a placas de cultivo con medio que contenía 1c 30 nM durante 1 h a 37 °C. La separación con tripsina dio como resultado células con mayor intensidad de fluorescencia que las células tratadas con conjugado no de unión 6c o células no tratadas. b) Se tiñeron alícuotas de las mismas células que se habían tratado con 1c y se separaron con tripsina con un anticuerpo anti CAIX (aCAIX AB) seguido por un anticuerpo secundario marcado con Alexa488 (2° AB) a 0 °C tras lo cual el análisis de citometría de flujo dio un histograma superimponible a células tratadas con anticuerpo secundario únicamente. Se concluyó que el tratamiento con tripsina había eliminado toda la CAIX unida a la superficie y el desplazamiento de fluorescencia de células marcadas con 1c en a) debe proceder del conjugado internalizado. Las células separadas del soporte sólido usando EDTA y teñidas como antes dieron lugar a un desplazamiento 10x en la intensidad de fluorescencia hacia la derecha en comparación con el inicial, dando seguridad de que la detección de CAIX mediante FCAS funcionó en efecto.
Para respaldar adicionalmente la reivindicación de que se observaban procesos de captación activos, se decidió repetir el experimento en condiciones que inhibían la captación. Se trataron previamente células SKRC52 con medio que contenía NaN3 al 0,2 % p/v durante 1 h antes de la incubación con 1c 30 nM y NaN3 al 0,2 % p/v a 37 °C durante 1 h. Se sabe que NaN3 es un inhibidor de procesos de captación activos[1] y efectivamente la señal fluorescente se desplazó al nivel inicial. Se logró el mismo efecto cuando se incubaba con 1c en presencia de AAZ en exceso como un ligando competitivo o cuando se incubaba a 0 °C, lo cual también inhibe los procesos de captación activos.
Al ampliar el tiempo de incubación con 1c 30 nM a 37 °C desde 1 h hasta 2 h y 4 h no se observó una señal notablemente aumentada. Por tanto, se concluyó que aunque tiene lugar algo de internalización, es ineficiente a lo largo del tiempo.
Finalmente, se sometió a prueba la captación activa del conjugado 1c de unión a CAIX 1c en células A549 negativas para CAIX como antes. Puesto que no se observó desplazamiento en la intensidad de fluorescencia con respecto al nivel inicial, se concluyó que 1c no se llevó a células A549. Esto se espera en ausencia de un receptor de la superficie celular para 1c.
Análisis de internalización de ligando mediante microscopía confocal
Se sembraron células SKRC52 en placas de cámara de cubreobjetos de 4 pocillos (Sarstedt) a una densidad de 104 células por pocillo en medio RPMI (1 ml, Invitrogen) complementado con fCs al 10 %, AA y ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES, 10 mM) se dejó que crecieran durante 24 h en condiciones de cultivo convencionales. Se reemplazó el medio con medio que contenía 1b o 6b (30 nM), tras 1 h se añadió colorante nuclear Hoechst 33342 (Invitrogen) y se obtuvieron imágenes de colonias seleccionadas al azar en un microscopio confocal Axiovert 200M (Zeiss).
Determinación de la estabilidad mediante espectrometría de masas
Se disolvió carbamato o carbonato seleccionado como diana 7a o 8a (30 |ig) en PBS pH 7,4 (1,5 ml) y se incubaron a 37 °C con agitación suave. Se retiraron alícuotas (100 |il) a diferentes puntos de tiempo y se diluyeron 1:1 con un patrón interno de etodolac (TCI Chemicals) en MeOH (20 |ig ml-1). Se separaron moléculas pequeñas de sales usando una columna de preparación de muestras en línea Oasis WAX (Waters) en un módulo de separación Alliance HT (inyecciones de 50 |il, 0,3 ml min-1 HCOOH ac. al 0,1 % durante 3 min seguido por 0,3 ml min-1 de MeCN durante 7 min, Waters) y se analizaron mediante espectrometría de masas/espectrometría de masas (EM/EM) en un espectrómetro Quattro API (Waters) que monitoriza transiciones de monitorización de reacción múltiple (MRM) apropiadas para 8a, 8b y etodolac como patrón. Se realizaron mediciones por triplicado, se integraron los picos y se calculó la fracción de compuestos de prueba intactos como fracción de señal en el tiempo t dividida entre la señal en el tiempo cero. Puesto que las señales debidas a etodolac fueron constantes a lo largo del tiempo, se omitió una corrección adicional usando el patrón interno como referencia. Para mediciones de estabilidad en suero de ratón, se disolvieron compuestos en plasma de ratón recién descongelado (Invitrogen), se tomaron alícuotas a diferentes puntos de tiempo y se diluyeron con un volumen igual de MeCN. Tras agitar con vórtex de manera vigorosa durante 1 min, se centrifugó el precipitado de proteína y se analizó el sobrenadante como antes.
Las semividas de 7a y 8a en plasma de ratón a 37 °C tal como se determina mediante espectrometría de masas (EM/EM) fueron de 43 minutos y 61 minutos, respectivamente. Los errores fueron < 1 min.
Determinación de la estabilidad mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)
Se disolvió conjugado de DM1 seleccionado como diana 9a (230 |ig, 140 nmol) en PBS pH 7,4 (1 ml) y se incubó a 37 °C con agitación suave. Se retiraron alícuotas (100 |il) a diferentes puntos de tiempo y se diluyeron 1:1 con una disolución de patrón interno de etodolac (TCI Chemicals) en MeCN (20 |ig ml-1). Se añadió agua (600 |il) y se analizaron alícuotas de esta mezcla (50 |il) sobre una columna Syngergi RP Polar (150 x 4,6 mm, 4 |im, Phenomenex) en un módulo de separación Alliance HT (1 ml min-1 del 5 % de MeCN en TFA acuoso al 0,1 % al 100 % MeCN a lo largo de 20 min, Waters). Se detectaron analitos usando un detector de UV/VIS de matriz fotográfica Waters 2996 (Waters). Se realizaron las mediciones por triplicado, se integraron los picos y se calculó la fracción de compuestos de prueba intactos como fracción de señal en el tiempo t dividida entre la señal en el tiempo cero. Puesto que las señales debidas a etodolac fueron constantes a lo largo del tiempo se omitió una corrección adicional usando el patrón interno como referencia. Para mediciones de estabilidad en suero de ratón, se disolvieron compuestos en plasma de ratón recién descongelado (Invitrogen), se tomaron alícuotas a diferentes puntos de tiempo y se diluyeron con un volumen igual de MeCN. Tras agitar con vórtex de manera vigorosa durante 1 min, se centrifugó precipitado de proteína y se analizó el sobrenadante como antes.
Tal como se esperaba, el carbonato 7a (ti/2 = 15 h) fue menos estable en PBS a 37 °C que el carbamato 8a (ti/2 > 24 h). No se observó descomposición para el conjugado de DM1 9a en las mismas condiciones (figura 8). Se redujo la estabilidad de 7a y 8a en suero de ratón in vitro (ti/2 = 43 y 61 min respectivamente), pero se produjo en un intervalo de tiempo compatible con la acumulación preferencial de los conjugados de AAZ en el sitio de tumor. El conjugado de DM1 9a fue significativamente más estable en suero de ratón (ti/2 = 20 h).
Estudios con animales
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo según las leyes y regulaciones de bienestar animal suizas con el número de licencia 42/2012 concedido por Veterinaeramt des Kanton Zurich.
Implantación de tumores SKRC52 subcutáneos
Se hicieron crecer células SKRC52 hasta el 80 % de confluencia y se separaron con tripsina-EDTA al 0,05 % (Invitrogen). Se lavaron las células con PBS pH 7,4 una vez, se contaron y se resuspendieron en PBS hasta una concentración final de 6,7 x 107 células ml-1. Se anestesiaron ratones balb/c nu/nu atímicos, de 8-10 semanas de edad (Charles River) con isofluorano y se inyectaron alícuotas de 1 x 107 células (150 |il de suspensión) por vía subcutánea en la región lumbar.
Obtención de imágenes de IVIS
Se inyectó a ratones que tenían tumores SKRC52 subcutáneos (de 200 - 300 mm3 de tamaño) por vía intravenosa ligando de CAIX marcados con IRDye750 (Licor) 1c-6c (hasta 10 nmol) disueltos en DMSO al 5 % v/v en PBS pH 7,4 (150 |il). Se anestesiaron los ratones con isoflurano y se adquirieron imágenes de fluorescencia in vivo en un sistema de obtención de imágenes IVIS Spectrum (Xenogen, exposición 1 s, factor de agrupamiento 8, excitación a 745 nm, filtro de emisión a 800 nm, f número 2, campo de visión 13,1). Se tomaron imágenes tras 1 h, 2 h, 4 h, 8 h y 12 h y 24 h. Se administró alimento y agua a voluntad durante ese periodo.
Se obtuvieron imágenes en el infrarrojo cercano de SKRC52 de ratones que tienen xenoinjerto 1-12 h tras la inyección intravenosa de 3 nmol de conjugados de ligando-IRDye750 1c-5c y conjugado no seleccionado como diana 6c como control negativo (véase la figura 1 para la estructuras). Sólo el conjugado de AAZ 1c dio un buen contraste entre el tumor y el fondo y por tanto, se seleccionó como base para desarrollo adicional de un conjugado seleccionado como diana.
Ya 1 h después de la inyección intravenosa de 1 nmol de 1c el tumor podía verse claramente contra el fondo. La inyección de 3 nmol da una señal más fuerte y más duradera con buen contraste entre el tumor y el fondo en puntos de tiempo tempranos y, por tanto, se usó para estudios de obtención de imágenes adicionales. Una dosis de 10 nmol satura el detector de fluorescencia con los parámetros usados en puntos de tiempo tempranos pero conduce a una señal incluso más duradera.
Tras la administración de 2c el tumor era apenas visible; los demás conjugados no alcanzaron el tumor en niveles por encima de la fluorescencia de fondo. El conjugado no seleccionado como diana 6c tampoco alcance el tumor y también se elimina más rápido del animal que los conjugados de ligando-IRDye750.
Posteriormente los ratones se sacrificaron mediante luxación cervical. Se extrajeron el corazón, pulmón, riñón, hígado, bazo, una sección del intestino (100 - 150 mg), músculo esquelético (100 - 150 mg) y el tumor y se obtuvieron imágenes individualmente usando los parámetros anteriores. De manera cualitativa, pudo observarse una disminución en el rendimiento de selección como diana de 1c a 5c y muy poca acumulación de tumor u órgano del conjugado no seleccionado como diana 6c. Esto confirma que la afinidad de unión del ligando de selección como diana para CAIX es un determinante importante para la acumulación dentro del tumor y obtención de perfil in vitro de conjugados de colorante mediante FP y citometría de flujo tiene un valor predictivo para el rendimiento de selección como diana in vivo.
Análisis de biodistribución
Se inyectó a ratones (grupos de 3 por punto de tiempo y compuesto) que tenían tumores SKRC52 subcutáneos (de 200 - 300 mm3 de tamaño) por vía intravenosa sondas marcadas con IRDye750 (Licor) 1c o 6c (3 nmol) disueltas en DMSO al 5 % v/v en PBS pH 7,4 (150 |il). Tras 1 h, 2 h o 4 h se sacrificaron los animales, se extrajeron los órganos como antes, se cortaron en pequeños trozos, se pesaron y se suspendieron en tampón de homogeneización de órgano 1:1 p/v que contenía EDTA (40 mM), proteinasa K (6 mg/ml), Triton X-100 (1,6 |il/ml) y cantidades traza de ADNasa 1 en PBS pH 7,4 (100 |il por 100 mg de tejido). Se homogeneizó la suspensión en un homogeneizador de órganos TissueLyser (Quiagen, 25 Hz, 10 min), se incubó durante 2 h a temperatura ambiente y se transfirieron 100 |il del homogeneizado a una placa de 96 pocillos. Se punteó una serie de dilución estándar de 1c en tampón de homogeneización (750 nM - 47 nM, 25 - 1,5 % de ID g_1 en etapas de 1:2) a lo largo de las muestras de órgano por triplicado. Se registraron imágenes fluorescentes de las placas en un sistema de obtención de imágenes IVIS Spectrum (Xenogen, parámetros como antes) y se analizaron usando software Living Image versión 4.3.1 (Caliper Life Science) usando las herramientas integradas en la región de interés (ROI). Se dedujeron las concentraciones de colorante en muestras de órgano en % de dosis inyectada por gramo de tejido (% de ID g_1) a partir de las intensidades de fluorescencia que se originan del pocilio correspondiente mediante comparación con las series de dilución estándar.
Los resultados se muestran gráficamente en las figuras 3 y 4. La figura 3 muestra acumulaciones en órganos que se notifican en unidades de porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% de ID g-1). a) 1 h después de la administración intravenosa de 3 nmol de 1c (azul) y 6c (rojo) b) 2 h después de la administración intravenosa de 3 nmol de 1c (azul) y 6c (rojo) c) 4 h después de la administración intravenosa de 3 nmol de 1c (azul) y 6c (rojo) d) curva de calibración (promedio de triplicados) para la conversión de intensidad de fluorescencia en % de ID g-1. Las barras de error indican desviaciones estándar. Todos los puntos de datos son promedios de tres ratones.
La acumulación de 1c en el tumor fue rápida y eficaz con el 13,4 ± 3,0 % de dosis inyectada por gramo de tejido (% de ID g-1) después de sólo 1 h (figura 2b, figuras de apoyo 10 y 11). Este resultado se compara de manera favorable con trabajo previo en la selección como diana basada en anticuerpos de tumores que expresan CAIX, en donde sólo pudieron detectarse valores de captación de tumor notablemente inferiores (un máximo del 2,4 ± 0,2 % de ID g-1).[27] En este caso, el conjugado de colorante 1c, sin embargo, se disoció progresivamente del tumor (ti/2 de residencia “ 1 h), lo que sugiere que una mejora de la afinidad de unión a CAIX puede contribuir además a un rendimiento de selección como diana de tumores eficaz.
Se observó una razón de tumor con respecto a sangre de 13,8:1 1 h después de la inyección intravenosa de 1c y mejoró adicionalmente hasta 79,2:1 después de 4 h. Las razones de tumor con respecto a órgano para órganos excretores oscilaron entre 0,2:1 para el hígado y 1,4:1 para los riñones después de 1 h pero se observó un alto nivel de selectividad para otros órganos (por ejemplo, 27,6:1 para tumor con respecto a corazón después de 1 h). Puesto que AAZ es un ligando de CA con amplia selectividad de isoforma, los patrones de captación diferencial observados están influidos probablemente de manera fuerte por niveles de expresión de CA relativos en diferentes tejidos y la accesibilidad del antígeno (por ejemplo, puede esperarse que CAII intracelular sea inaccesible a las moléculas cargadas). De manera importante, la selección como diana de tumores fue claramente dependiente del resto de unión a CAIX, tal como se reveló por la acumulación de tumor 22 veces mayor a 1 h del conjugado de colorante seleccionado como diana basado en AAZ 1c en comparación con el colorante no seleccionado como diana 6c. Suponiendo que 6c es un buen modelo para la distribución de tejido de agentes anticancerígenos “desnudos” (es decir, no seleccionados como diana), esta comparación resalta el posible impacto de la administración de fármacos basada en ligandos de dosis terapéuticamente relevantes de fármacos en masas neoplásicas.
La figura 4 muestra el análisis de biodistribución de 1c en ratones balb/c nu/nu que tienen tumores SKRC52 subcutáneos incluyendo valores de estómago y sangre 1, 2 y 4 h después de administrar 3 nmol del conjugado de colorante por vía intravenosa. Se notifican las acumulaciones en órganos en unidades de % de ID g-1. Las barras de error indican desviaciones estándar. Los datos mostrados son promedios de tres ratones.
Análisis de la penetración de tumor
Se inyectó a ratones que tenían tumores SKRC52 subcutáneos (de 200 - 300 mm3 de tamaño) por vía intravenosa sondas marcadas con Alexa546 (Invitrogen) 1b o 6b (50 nmol) disueltas en PBS pH 7,4 (150 |il). Tras 1 h, 2 h o 4 h a los animales se les inyectó una disolución de Hoechst 33342 (Invitrogen, 5,4 mM) en solución salina (150 |il) y se sacrificaron después de 5 min. Se extrajeron los órganos como antes y se ultracongelaron en medio criogénico Neg-50 (Thermo Scientific) usando nitrógeno líquido. Tras calentar hasta -20 °C, se cortaron muestras en secciones de 10 |im de ancho y se obtuvieron imágenes directamente en un microscopio de fluorescencia Axioskop 2 (Zeiss). Se encontró que, aunque el conjugado ya ha empezado a penetrar en el tumor después de 30 min, la tinción del tumor con 1b es inicialmente la más alta en zonas bien perfundidas. A continuación, la tinción se vuelve más homogénea. Después de 2 h, la tinción se vuelve más débil a medida que el conjugado empieza a eliminarse del tumor. No puede detectarse fluorescencia debido a 6b dentro del tumor, lo cual es según la carencia de acumulación macroscópica observada con 6c.
El análisis microscópico de órganos mostró una fuerte fluorescencia debido a 1b dentro del tumor y el intestino. Lo último se debe probablemente a excreción hepatobiliar del conjugado de colorante. Una capa observada de fluorescencia en el estómago se corresponde más probablemente a células epiteliales de la mucosa gástrica, que expresan CAIX en condiciones normales. El riñón y el hígado también mostraron algo de fluorescencia como resultado de la secreción del conjugado a través de estos órganos.
Dosificación
La estimación de la dosis de terapia recomendada de a) 7a y b) 8a en ratones desnudos se realizó estudiando diferentes dosificaciones usando un esquema de cinco inyecciones en cinco días consecutivos en comparación con vehículo (DMSO al 5 % en PBS pH 7,4). Los regímenes de dosificación fueron de 0,4 nmol/día, 1,3 nmol/día, 4,0 nmol/día y 13,3 nmol/día. Se usó un ratón para cada régimen. Cuando el animal no perdió más del 5 % de su peso corporal inicial a lo largo de 15 días después de la inyección inicial, se supuso que la dosis se toleraba bien.
El estudio mostró que 7a se toleraba hasta 4,0 nmol/día, pero se toleraba escasamente a 13,3 nmol/día. El estudio mostró además que 8a se toleraba bien hasta e incluyendo 13,3 nmol/día.
La estimación de la dosis de terapia recomendada y esquema de conjugado de DM1 9a se estudió en ratones desnudos que tenían tumores SKRC52. Se usó un ratón para someter a prueba cada pauta posológica. Se administraron inyecciones cada día empezando el día 0 en DMSO al 5 % en PBS pH 7,4 (150 |il). Los resultados se muestran en la figura 5. Se toleraron seis dosis de 60 nmol de 9a con sólo mínima pérdida de peso. Puesto que los animales en este estudio pesaron en promedio un 18 % menos que los usados en el estudio de terapia, se usó una dosis de 70 nmol por inyección para el experimento de terapia. El número de inyecciones también aumentó desde 6 hasta 7 en 7 días consecutivos.
Experimentos de terapia
Se implantaron tumores de xenoinjerto SKRC52 en ratones balb/c nu/nu (Charles River) tal como se describe anteriormente. Después de 14 días, los ratones se asignaron aleatoriamente en grupos de terapia de 5 o 6 animales y empezó el tratamiento. Se administraron 5 dosis de 4 nmol de 7a,b, 8a,b o 7 dosis de 70 nmol de 9a,b cada una en PBS pH 7,4 (150 |il) que contiene DMSO al 5 % en 5 o 7 días consecutivos y se trató un grupo con vehículo (DMSO al 5 % en PBS pH 7,4). En el caso de 7-9b se añadió una cantidad equimolar de AAZ a la disolución de inyección para controlar una posible actividad antitumoral de inhibidores de CAIX. Se administraron sorafenib y sunitnib a una dosis convencional de 30 mg/kg tal como se describió previamente.[5] Se pesaron los animales y se midieron los tamaños de tumor cada día y se calculó el volumen de tumor según la fórmula (lado largo) x (lado corto)2 x 0,5. Se sacrificaron los animales cuando el peso corporal disminuyó en más del 15 % en relación con el primer día de terapia o cuando los tumores alcanzaron un volumen de >2000 mm3. Se usó Prism 6 (GraphPad Software) para el análisis de datos (ANOVA de dos factores regular con la prueba de Bonferroni).
Se muestran los resultados en las figuras 6 y 7. Las barras de error dan errores estándar. Los resultados terapéuticos obtenidos con los conjugados de duocarmicina-AAZ sólo indicaron un modesto efecto de inhibición del crecimiento tumoral (figura 6a). No obstante, el carbonato seleccionado como diana 7a dio lugar a un retardo del crecimiento tumoral estadísticamente significativo en comparación con ratones que sólo recibieron vehículo (p < 0,0001) y ratones que recibieron conjugado no seleccionado como diana 7b más cantidades equimolares de AAZ (p < 0,05). Los constructos basados en carbamato 8a y 8b no condujeron a ningún retardo en el crecimiento tumoral. Parece razonable que la baja afinidad de 8a hacia el antígeno (Kd = 40,3 ± 2,6 nM frente a Kd = 7,3 ± 0,5 nM para 7a) y activación extracelular ineficaz pueden haber sido parcialmente responsables de este efecto. El tratamiento pudo realizarse con una pérdida de peso menor del 15 % de peso corporal (figura 6b).
Para el conjugado de DM1 9a, se observó un potente efecto antitumoral a dosis, que dieron sólo toxicidad mínima (es decir, sin pérdida de peso corporal detectable dando 7 x 70 nmol de conjugado de DM1 9a en 7 días consecutivos). Durante el periodo de tratamiento, los tumores se encogieron y continuaron reduciéndose en volumen durante 7 días adicionales. Sólo 20 días después del inicio del tratamiento, los tumores empezaron a volver a crecer, como consecuencia de que los ratones no habían recibido ningún tratamiento farmacológico adicional. De manera importante, ni sorafenib ni sunitinib, que representan los agentes quimioterápicos más comúnmente usados para el tratamiento de cáncer de riñón, presentaron ningún efecto antitumoral detectable, en línea con informes previos en diferentes modelos de cáncer de riñón. Estos hallazgos sugieren que la administración dirigida de potentes agentes citotóxicos puede proporcionar una ventaja terapéutica en comparación con las normas asistenciales habituales. DM1 puede ser una carga útil particularmente adecuada para el desarrollo de citotóxicos seleccionados como diana, puesto que la presencia de por ejemplo, un resto éster en su estructura puede facilitar su detoxificación en órganos relacionados con el aclaramiento, evitando por tanto tejidos sanos.
(B) Restos de unión bivalentes
Se realizó un estudio comparativo del rendimiento de selección como diana de tumores de ligandos monovalentes y bivalentes a anhidrasa carbónica IX (CAIX) en carcinoma de células renales tal como sigue.
Síntesis de ligandos de selección como diana marcados mediante fluorescencia
Se sintetizaron derivado de acetazolamida monovalente (AAZ) B1 y derivado de AAZ bivalente B2 que tienen las estructuras mostradas en las figuras 9 y 10 usando química de péptidos en fase sólida de Fmoc convencional. Estos restos de unión se marcaron mediante fluorescencia con IRDye 750 para proporcionar ligandos monovalentes y bivalentes marcados mediante fluorescencia B3 y B4. Los métodos de síntesis fueron tal como sigue.
Síntesis de AAZTL - B1
Se hinchó resina de carbonato de p-nitrofenilo Wang y poliestireno comercialmente disponible (250 mg, 0,15 mmol) en DMF (5 ml durante 5 min) y se hizo reaccionar con una disolución de 2,2'-(etano-1,2-diilbis(oxi))dietanoamina (250 |il), DIPEA (500 |il) y DMAP (2,5 mg) en DMF (4,5 ml) durante 12 h a temperatura ambiente con agitación. Se lavó la resina con DMF (3 x 5 ml durante 1 min), MeOH (3 x 5 ml durante 1 min) y de nuevo DMF (3 x 5 ml durante 1 min). Se preparó una disolución de ácido 5-azido valérico (65 mg, 0,45 mmol), HATU (171 mg, 0,45 mmol) y DIPEA (148 pl, 0,9 mmol) y se hizo reaccionar inmediatamente con la resina durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Tras lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml) se preparó una disolución de CuI (2,9 mg, 0,015 mmol), TBTA (8 mg, 0,015 mmol) y alquino 10 (123 mg, 0,45 mmol) en una mezcla de DMF (1 ml) y THF (1 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 24 h a temperatura ambiente. Tras lavar con DMF (3 x 1 min x 5 ml), se escindió disolución de EDTA ac. 50 mM (3 x 1 min x 5 ml), DMF (3 x 1 min x 5 ml) y DCM (3 x 1 min x 5 ml), el compuesto agitando la resina con una mezcla de TFA (2,2 ml), TIS (50 pl), H2O (50 pl), m-cresol (100 pl) y tioanisol (100 pl) durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con TFA (1 x 5 min x 2,5 ml) y se añadieron las disoluciones de lavado y escisión combinadas gota a gota a dietil éter helado (100 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se purificó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Tras la liofilización, se recogió el compuesto del título como un polvo blanco (78 mg, 0,14 mmol, 95 %).
1H-RMN (500 MHz, DMSO-da) 8 [ppm] = 13,01 (s, 1H), 8,32 (s, 2H), 7,89-7,82 (m, 5H), 4,28 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,58­ 3,50 (m, 6H), 3,38 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 3,18 (m, 2H), 3,00 (m, 2H), 2,65 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,59 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,09 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,94 (m, 2H), 1,75 (m, 2H), 1,42 (m, 2H); 13C-RMN (125 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 172,5, 172,4, 164,8, 161,5, 146,4, 122,4, 70,1, 69,8, 69,6, 67,1, 49,4, 39,1, 38,8, 35,0, 35,7, 29,8, 24,8, 24,6, 22,6; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C19H34N9O6S2548,2068; encontrado 548,2071.
Síntesis de B2
Se hinchó resina de carbonato de p-nitrofenilo Wang y poliestireno comercialmente disponible (500 mg, 0,3 mmol) en DMF (5 ml durante 5 min) y se hizo reaccionar con una disolución de 2,2'-(etano-1,2-diilbis(oxi))dietanoamina (500 pl), DIPEA (500 pl) y DMAP (5 mg) en DMF (4 ml) durante 12 h a temperatura ambiente con agitación. Se lavó la resina con DMF (3 x 5 ml durante 1 min), MeOH (3 x 5 ml durante 1 min) y de nuevo DMF (3 x 5 ml durante 1 min). Se preparó una disolución de Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (532 mg, 0,9 mmol), HBt U (341 mg, 0,9 mmol), HOBt (138 mg, 0,9 mmol) y DIPEA (298 pl, 1,8 mmol) y se hizo reaccionar inmediatamente con la resina durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Tras lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml) se eliminó el grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes de que se iniciara la siguiente etapa de acoplamiento. En lo siguiente, se extendió el péptido con Fmoc-Asp(OtBu)-OH dos veces seguido por 5-azido-valerato. Con este fin, se preparó una disolución de ácido (1,2 mmol), HATU (465 mg, 1,2 mmol) y DIPEA (397 pl, 2,4 mmol) en DMF (5 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Se siguió cada acoplamiento por una etapa de lavado con DMF (6 x 1 min x 5 ml) y desprotección con Fmoc tal como se describió anteriormente. Tras el acoplamiento de la azida, se preparó una disolución de CuI (76 mg, 0,12 mmol), TBTA (21 mg, 0,12 mmol) y alquino 10 (329 mg, 1,2 mmol) en una mezcla de DMF (2,5 ml) y THF (2,5 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 48 h a temperatura ambiente. Tras lavar con DMF (3 x 1 min x 5 ml), disolución de EDTA ac. 50 mM (3 x 1 min x 5 ml), DMF (3 x 1 min x 5 ml) y DCM (3 x 1 min x 5 ml), se escindió el compuesto agitando la resina con una mezcla de TFA (4,4 ml), TIS (100 pl), H2O (100 pl), m-cresol (200 pl) y tioanisol (200 pl) durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con TFA (1 x 5 min x 5 ml) y se añadieron las disoluciones de lavado y escisión combinadas gota a gota a dietil éter helado (100 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación, se disolvió en MeCN ac. y se liofilizó para dar el compuesto del título como un polvo blanquecino (468 mg, 0,3 mmol, cuant.).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 13,09 (s, 2H), 8,37 (s, 4H), 8,29-8,26 (m, 3H), 8,14 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,91 (s, 2H), 7,80-7,78 (m, 3H), 7,71 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,65 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 4,60-4,48 (m, se solapa con el pico de H2O amplio), 4,33 (t, J = 7,0 Hz, se solapa con el pico de H2O amplio), 4,19-4,13 (m, se solapa con el pico de H2O amplio), 3,64-3,59 (m, 6H), 3,44 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,27-3,23 (m, 2H), 3,05-3,00 (m, 4H), 2,77-2,48 (m, se solapa con el pico del disolvente), 2,20 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 2,04-1,96 (m, 4H), 1,86-1,78 (m, 4H), 1,74-1,63 (a m, 1H), 1,61­ 1,16 (a m, 9H); HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C54H83N22O23S41535,4879; encontrado 1535,4868.
Síntesis de B3
A éster de NHS IRDye750 (100 pg, 84 nmol) en DMSO (10 pl) y DMF (100 pl) se le añadió derivado de acetazolamida B1 (200 pg, 366 nmol) en DMSO (20 pl) y DIPEA (2 pl, 12 pmol). Se dejó reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 h y luego se purificó directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 40 % de A / el 60 % de B a lo largo de 30 min). Se identificaron fracciones que contenían conjugado de colorante a través de su espectro de UV/VIS característico (Xmáx = 750 nm), se agruparon, se liofilizaron y se disolvieron en DMSO (50 pl) para dar una disolución de reserva verde oscuro. Se determinaron su concentración y el rendimiento de reacción midiendo la absorbancia a 750 nm (8750 = 260.000 M'1 cirr1) de muestras de reserva diluidas 1:200 en PBS pH 7,4 (640 pM, 32 nmol, 38 %).
HRMS: (m/z) [M 4H]+ calculado para C68H92N11O19S61558,4890; encontrado 1558,4844.
Síntesis de B4
A éster de NHS IRDye750 (100 |ig, 84 nmol) en DMSO (10 |il) y DMF (100 |il) se le añadió B2 (200 |ig, 130 nmol) en DMSO (20 |il) y DIPEA (2 |il, 12 |imol). Se dejó reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 h y luego se purificó directamente sobre HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 40 % de A / el 60 % de B a lo largo de 30 min). Se identificaron fracciones que contenían conjugado de colorante a través de su espectro de UV/VIS característico (Zmáx = 750 nm), se agruparon, se liofilizaron y se disolvieron en DMSO (50 |il) para dar una disolución de reserva verde oscuro. Se determinaron su concentración y el rendimiento de reacción midiendo la absorbancia a 750 nm (8750 = 260.000 M-1 cm-1) de muestras de reserva diluidas 1:200 en PBS pH 7,4 (287 |iM, 14 nmol, 17 %).
HRMS: (m/z) [M 4H]+ calculado para C103H141N24O36S82545,7700; encontrado 2545,7703.
Rendimiento de unión mediante resonancia de plasmón superficial
Los experimentos de unión de derivados de AAZ monovalentes y bivalentes a CAIX usando resonancia de plasmón superficial indicaron una rápida asociación para ambos compuestos (ka = 1,48x10® M-1s-1 y kai = 1,28x10® M-1s-1, ka2 = 1,36x10® RU-1 respectivamente). Aunque el ligando monovalente B1 se disoció completamente de la superficie recubierta con CAIX en el plazo de segundos (kd = 0,015 s-1, Kd = 10,5 nM), el compuesto bivalente B2 no presentó disociación aparente y sólo podía eliminarse con tratamiento con ácido fuerte (figura 1 b).
Rendimiento de unión mediante citometría de flujo
Se realizó citometría de flujo tal como se describió anteriormente con conjugados de colorante en el infrarrojo cercano monovalentes y bivalentes B3 y B4 y conjugados de control negativo que carecen del ligando en células SKRC52 positivas para CAIX y células HEK negativas para CAIX5. Los resultados indicaron una unión clara dependiente del ligando y el receptor a células. El desplazamiento en la intensidad de fluorescencia para el conjugado bivalente B4 era más pronunciado que el observado para B3 monovalente, que es coherente con los resultados obtenidos de SPR.
Investigación in vivo del rendimiento de selección como diana
Estudios adicionales sometieron a prueba la capacidad de conjugados de colorante en el infrarrojo cercano B3 y B4 de localizar xenoinjertos de SKRC52 que expresan CAIX in vivo. Ambos conjugados de colorante se acumularon fuertemente en el tumor, tal como se reveló mediante obtención de imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano de animales completos y mediante análisis de los órganos extraídos. Aunque el perfil de aclaramiento inicial fue comparable para ambas moléculas seleccionadas como diana, el conjugado bivalente B4 presentó una residencia significativamente más larga en el tumor. Veinticuatro horas después de la inyección, la señal de fluorescencia integrada en el tumor del conjugado bivalente B4 era del 40 %, mientras que el conjugado monovalente B3 había disminuido hasta el 14 % de su valor inicial (p = 0,002; prueba de la t de dos caras no apareada; figura complementaria 4).
Para obtener un mejor entendimiento de la captación tumoral absoluta de conjugado de colorante monovalente B3 en comparación con B4 bivalente y selectividad de tumor frente a órgano, se extrajeron los órganos, se homogeneizaron los tejidos y se midió la intensidad de fluorescencia por gramo. La comparación con una serie de dilución estándar de IRDye750 en órgano homogeneizado permitió la medición de niveles de captación absolutos en órganos, como porcentaje de dosis inyectada por gramo (% de ID g-1). El conjugado de colorante bivalente B4 presentó una acumulación absoluta mayor >3 veces en tumores en comparación con B3 monovalente a las 24 h (5,3 ± 0,® frente a 1,4 ± 0,® % de ID g-1). Por tanto, el compuesto B4 se compara muy favorablemente con los anticuerpos monoclonales recientemente descritos contra CAIX. Aunque la captación en el corazón, bazo, músculo y circulación en sangre con relación al tumor era baja (tumor: órgano > 30), se observaron razones de tumor con respecto a órgano ligeramente inferiores para los riñones y el estómago para ambos conjugados. De manera interesante, las razones de tumor:hígado y tumor:intestino fueron menores para B3 monovalente que para B4 bivalente mientras que B4 presentó una razón de tumor:pulmón mayor que B3.
Síntesis de conjugados de fármaco
Se prepararon conjugados de fármaco seleccionados y no seleccionados como diana B7 y B8 que tenían las estructuras mostradas en la figura 10 tal como sigue. El compuesto B7 es un conjugado bivalente según la presente invención y tiene el mismo grupo funcional de selección como diana bivalente que B2 y B4. B8 es un ejemplo de referencia que tiene un grupo funcional similar pero sin ligandos de selección como diana de AAZ.
Síntesis de B7
Se disolvieron ligador seleccionado como diana bivalente B11 (20 mg, 13 |imol), TCEP.HCl (7,® mg, 27 |imol) y DIPEA (2 |il) en DMF desgasificada (500 |il). Tras 1 h, se añadió 2,2'-dipiridildisulfuro (11,7 mg, 53 |imol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 12 h, se diluyó con NMP (500 |il) y se añadió gota a gota a dietil éter helado (40 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación, se volvió a disolver en DMF (200 pl) y NMP (200 pl) y se precipitó de nuevo con dietil éter helado (40 ml) y se secó a vacío para dar el disulfuro activado como un residuo blanco (18 mg, 11 pmol, 85 %). Se disolvió una alícuota del disulfuro activado (15 mg, 9 pmol) en DMF (400 pl) y se añadió tiol libre de DM1 (7 mg, 9 pmol). Se dejó la reacción en reposo a temperatura ambiente durante 48 h tras lo cual se recuperó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo blanquecino (9,5 mg, 4 pmol, 47 %).
1H-RMN (500 MHz, DMSO-da) 8 [ppm] = 12,98 (s, 2H), 8,31 (s, 4H), 8,22-8,15 (m, 4H), 8,07 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,85 (s, 2H), 7,69-7,59 (m, 2H), 7,12 (s, 1H), 6,89 (s, 1H), 6,61-6,52 (m, 3H), 5,92 (s a, 1H), 5,57-5,52 (m, 1H), 5,30-5,29 (m, 1H), 4,52-4,43 (m, 5H), 4,39-4,34 (m, 1H), 4,27 (t, J = 6,9 Hz, 4H), 4,19-4,16 (m, 1H), 4,08-4,03 (m, 1H), 3,92­ 3,90 (m, 3H), 3,53-2,41 (m, se solapa con el pico del disolvente), 2,13-2,12 (m, 4H), 2,04-2,01 (m, 1H), 1,97-1,91 (m, 4H), 1,79-1,73 (m, 4H), 1,67-1,54 (m, 4H), 1,51-1,10 (m, 21H), 0,77 (s, 3H);
HRMS: (m/z) [M 2H]2+ calculado para C86H-i19ClN24O33S61122,3270; encontrado 1122,3279.
Síntesis de B8
Se disolvieron ligador no seleccionado como diana bivalente B12 (20 mg, 17 pmol), TCEP.HCl (19 mg, 68 pmol) y DIPEA (10 pl) en DMF desgasificada (1 ml). Tras 1 h, se añadió 2,2'-dipiridildisulfuro (22 mg, 100 pmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 12 h, se diluyó con NMP (500 pl) y se añadió gota a gota a dietil éter helado (40 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación, se volvió a disolver en DMF (200 pl) y NMP (200 pl) y se precipitó de nuevo con dietil éter helado (40 ml) y se secó a vacío para dar el disulfuro activado como un residuo blanco (45 mg, producto productos secundarios). Se disolvió una alícuota del residuo (15 mg) en DMF (400 pl) y se añadió tiol libre de DM1 (7 mg, 9 pmol). Se dejó la reacción en reposo a temperatura ambiente durante 48 h tras lo cual se recuperó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Se agruparon fracciones que contenían el producto deseado mediante EM y se liofilizaron para dar el compuesto del título como un polvo blanquecino (7,4 mg, 3,9 pmol, 42 %).
1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 8,22-8,09 (m, 5H), 7,83 (s, 2H), 7,64-7,58 (m, 2H), 7,12 (s, 1H), 6,89 (s, 1H), 6,61-6,52 (m, 3H), 5,93 (s, 1H), 5,55 (dd, J = 9,1, 14,8 Hz, 1H), 5,32-5,28 (m, 1H), 4,56-4,43 (m, 6H), 4,27 (t, J = 6,85 Hz, 4H), 4,20-4,17 (m, 1H), 4,05 (t, J = 12,2 Hz, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,49-2,41 (m, se solapa con el pico del disolvente), 2,25 (t, J = 7,4 Hz, 4H), 2,15 (m, 4H), 2,04-2,02 (a m, 1H), 1,80-1,73 (m, 8H), 1,62-1,10 m, 24H), 0,77 (s, 3H); HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C82Hn6ClN16O31S21919,7117; encontrado 1919,7098.
Síntesis de B9
Figure imgf000040_0001
Se hinchó resina de carbonato de p-nitrofenilo Wang y poliestireno comercialmente disponible (250 mg, 0,15 mmol) se hinchó en DMF (5 ml durante 5 min) y se hizo reaccionar con una disolución de 2,2'-(etano-1,2-diilbis(oxi))dietanoamina (250 pl), DIPEA (500 pl) y DMAP (2,5 mg) en DMF (4,5 ml) durante 12 h a temperatura ambiente con agitación. Se lavó la resina con DMF (3 x 5 ml durante 1 min), MeOH (3 x 5 ml durante 1 min) y de nuevo DMF (3 x 5 ml durante 1 min). Se preparó una disolución de ácido 5-azido valérico (65 mg, 0,45 mmol), HATU (171 mg, 0,45 mmol) y DIPEA (148 pl, 0,9 mmol) y se hizo reaccionar inmediatamente con la resina durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Tras lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml) se preparó una disolución de CuI (2,9 mg, 0,015 mmol), TBTA (8 mg, 0,015 mmol) y ácido 5-hexinoico (51 mg, 50 pl, 0,45 mmol) en una mezcla de DMF (1 ml) y THF (1 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 24 h a temperatura ambiente. Tras lavar con DMF (3 x 1 min x 5 ml), disolución de EDTA ac. 50 mM (3 x 1 min x 5 ml), DMF (3 x 1 min x 5 ml) y DCM (3 x 1 min x 5 ml), se escindió el compuesto agitando la resina con una mezcla de TFA (2,2 ml), TIS (50 pl), H2O (50 pl), m-cresol (100 pl) y tioanisol (100 pl) durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con TFA (1 x 5 min x 2,5 ml) y se añadieron las disoluciones de lavado y escisión combinadas gota a gota a dietil éter helado (100 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se purificó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Tras la liofilización, se recogió el compuesto del título como un polvo blanco (21 mg, 54 pmol, 36 %).1
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 7,90-7,86 (m, 5H), 4,29 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,60-3,51 (m, 6H), 3,40 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 3,20 (q, J = 5,8 Hz, 2H), 3,00-2,96 (m, 2H), 2,62 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,26 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,10 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,85-1,74 (m, 4H), 1,46-1,42 (m, 2H); 13C-RMN (125 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 174,8, 172,4, 146,7, 122,3, 70,1, 69,8, 69,5, 67,2, 49,4, 39,0, 38,9, 35,0, 33,6, 29,8, 24,9, 24,8, 22,7; HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C17H32N5O5386,2398; encontrado 386,2403.
Síntesis de B10
Figure imgf000041_0001
Se hinchó resina de carbonato de p-nitrofenilo Wang y poliestireno comercialmente disponible (500 mg, 0,3 mmol) se hinchó en DMF (5 ml durante 5 min) y se hizo reaccionar con una disolución de 2,2'-(etano-1,2-diilbis(oxi))dietanoamina (500 pl), DIPEA (500 pl) y DMAP (5 mg) en DMF (4 ml) durante 12 h a temperatura ambiente con agitación. Se lavó la resina con DMF (3 x 5 ml durante 1 min), MeOH (3 x 5 ml durante 1 min) y de nuevo DMF (3 x 5 ml durante 1 min). Se preparó una disolución de Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (532 mg, 0,9 mmol), HBTU (341 mg, 0,9 mmol), HOBt (138 mg, 0,9 mmol) y DIPEA (298 pl, 1,8 mmol) y se hizo reaccionar inmediatamente con la resina durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Tras lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml) se eliminó el grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes de que se iniciara la siguiente etapa de acoplamiento. En lo siguiente, se extendió el péptido con Fmoc-Asp(OtBu)-OH dos veces seguido por 5-azido-valerato. Con este fin, se preparó una disolución de ácido (1,2 mmol), HATU (465 mg, 1,2 mmol) y DIPEA (397 pl, 2,4 mmol) en DMF (5 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Se siguió cada acoplamiento por una etapa de lavado con DMF (6 x 1 min x 5 ml) y desprotección con Fmoc tal como se describió anteriormente. Tras el acoplamiento de la azida, se preparó una disolución de CuI (76 mg, 0,12 mmol), TBTA (21 mg, 0,12 mmol) y ácido 5-hexionico (440 pl, l , 2 mmol) en una mezcla de DMF (2,5 ml) y THF (2,5 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 48 h a temperatura ambiente. Tras lavar con DMF (3 x 1 min x 5 ml), disolución de EDTA ac. 50 mM (3 x 1 min x 5 ml), DMF (3 x 1 min x 5 ml) y DCM (3 x 1 min x 5 ml), se escindió el compuesto agitando la resina con una mezcla de TFA (4,4 ml), TIS (100 pl), H2O (100 pl), m-cresol (200 pl) y tioanisol (200 pl) durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con TFA (1 x 5 min x 5 ml) y se añadieron las disoluciones de lavado y escisión combinadas gota a gota a dietil éter helado (100 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se purificó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Tras la liofilización, se recogió el compuesto del título como un polvo blanco (64 mg, 53 pmol 17 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 8,25-8,22 (m, 3H), 8,09 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,85 (s, 2H), 7,78-7,73 (a m, 3H), 7,66 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,59 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 4,55-4,44 (m, 4H), 4,29 (t, J = 7,0 Hz, 4H), 4,14-4,09 (m, 2H), 3,60-3,55 (m, 6H), 3,40 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,22-3,19 (m, 2H), 3,01-2,92 (m, 4H), 2,73-2,44 (m, se solapa con el pico del disolvente), 2,26 (t, J = 7,4 Hz, 4H), 2,15 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 1,85-1,74 (m, 7H), 1,70-1,60 (a m, 1H), 1,55-1,14 (a m, 9H); HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C50H79N14O211211,5539; encontrado 1211,5515.
Síntesis de B11
Figure imgf000041_0002
Se hinchó Fmoc-Cys(Trt) precargado comercialmente disponible en resina Tentagel (500 mg, 0,415 mmol, RAPP polymere) en DMF (3 x 5 min x 5 ml), se eliminó el grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (1 x 1 min x 5 ml y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml). Se preparó una disolución de Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (736 mg, 1,25 mmol), HBTU (472 mg, 1,25 mmol), HOBt (191 mg, 1,25 mmol) y DIPEA (412 pl, 2,5 mmol) y se hizo reaccionar inmediatamente con la resina durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Tras lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml) se eliminó el grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes de que se iniciara la siguiente etapa de acoplamiento. En lo siguiente, se extendió el péptido con Fmoc-Asp(OtBu)-OH dos veces seguido por 5-azido-valerato. Con este fin, se preparó una disolución de ácido (1,7 mmol), HATU (643 mg, 1,7 mmol) y DIPEA (549 |il, 3,3 mmol) en DMF (5 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Se siguió cada acoplamiento por una etapa de lavado con DMF (6 x 1 min x 5 ml) y desprotección con Fmoc tal como se describió anteriormente. Tras el acoplamiento de la azida, se preparó una disolución de CuI (106 mg, 0,17 mmol), TBTA (29 mg, 0,17 mmol) y alquino 10 (455 mg, 1,7 mmol) en una mezcla de DMF (2,5 ml) y THF (2,5 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 48 h a temperatura ambiente. Tras lavar con DMF (3 x 1 min x 5 ml), disolución de EDTA ac. 50 mM (3 x 1 min x 5 ml), DMF (3 x 1 min x 5 ml) y DCM (3 x 1 min x 5 ml), se escindió el compuesto agitando la resina con una mezcla de TFA (4,4 ml), TIS (100 |il), H2O (100 |il), m-cresol (200 |il) y tioanisol (200 |il) durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con TFA (1 x 5 min x 5 ml) y se añadieron las disoluciones de lavado y escisión combinadas gota a gota a dietil éter helado (100 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se purificó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Tras la liofilización, se recogió el compuesto del título como un polvo blanco (68 mg, 45 |imol, 10 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 13,01 (s, 2H), 8,32 (s, 4H), 8,21 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 8,09 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,87 (s, 2H), 7,74 (d, J = 7,84 Hz, 1H), 7,61 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 4,55-4,45 (m, se solapa con el pico de agua amplio), 4,40-4,34 (m, se solapa con el pico de agua amplio), 4,29 (t, J = 7,0 Hz, se solapa con el pico de agua amplio), 4,24-4,22 (m, se solapa con el pico de agua amplio), 3,07-2,94 (a m, 2H), 2,90-2,41 (m, se solapa con el pico del disolvente), 2,15 (t, J = 7,1 Hz, 4H), 1,99-1,92 (m, 4H), 1,82-1,74 (m, 4H), 1,71-1,24 (a m, 10H); HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C51H74N21O23S51508,3864; encontrado 1508,3861.
Síntesis de B12
Figure imgf000042_0001
Se hinchó Fmoc-Cys(Trt) precargado comercialmente disponible en resina Tentagel (500 mg, 0,415 mmol, RAPP polymere) en DMF (3 x 5 min x 5 ml), se eliminó el grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (1 x 1 min x 5 ml y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml). Se preparó una disolución de Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (736 mg, 1,25 mmol), HBTU (472 mg, 1,25 mmol), HOBt (191 mg, 1,25 mmol) y DIPEA (412 |il, 2,5 mmol) y se hizo reaccionar inmediatamente con la resina durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Tras lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml) se eliminó el grupo Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes de que se iniciara la siguiente etapa de acoplamiento. En lo siguiente, se extendió el péptido con Fmoc-Asp(OtBu)-OH dos veces seguido por 5-azido-valerato. Con este fin, se preparó una disolución de ácido (1,7 mmol), HATU (643 mg, 1,7 mmol) y DIPEA (549 |il, 3,3 mmol) en DMF (5 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Se siguió cada acoplamiento por una etapa de lavado con DMF (6 x 1 min x 5 ml) y desprotección con Fmoc tal como se describió anteriormente. Tras el acoplamiento de la azida, se preparó una disolución de CuI (106 mg, 0,17 mmol), TBTA (29 mg, 0,17 mmol y ácido 5-hexionico (609 |il, 1,7 mmol) en una mezcla de DMF (2,5 ml) y THF (2,5 ml) y se hizo reaccionar con la resina durante 48 h a temperatura ambiente. Tras lavar con DMF (3 x 1 min x 5 ml), disolución de EDTA ac. 50 mM (3 x 1 min x 5 ml), DMF (3 x 1 min x 5 ml) y DCM (3 x 1 min x 5 ml), se escindió el compuesto agitando la resina con una mezcla de TFA (4,4 ml), TIS (100 |il), H2O (100 |il), m-cresol (200 |il) y tioanisol (200 |il) durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con TFA (1 x 5 min x 5 ml) y se añadieron las disoluciones de lavado y escisión combinadas gota a gota a dietil éter helado (100 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se purificó el producto mediante HPLC de fase inversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 20 min). Tras la liofilización, se recogió el compuesto del título como un polvo blanco (147 mg, 0,12 mmol, 30 %).1
1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) 8 [ppm] = 8,22-8,19 (m, 3H), 8,08 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,83 (s, 2H), 7,72 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,59-7,56 (m, 1H), 4,56-4,43 (m, 3H), 4,37-4,34 (m, 1H), 4,27-4,20 (m, 4H), 3,03-2,92 (m, 2H), 2,87-2,39 (m, se solapa con el pico del disolvente), 2,25 (t, J = 7,35 Hz, 4H), 2,13 (t, J = 7,0 Hz, 4H), 1,83­ 1,21 (a m, 16H); HRMS: (m/z) [M H]+ calculado para C47H70N13O21S 1184,4524; encontrado 1184,4508.
Propiedades de conjugados de fármaco
Tanto el fármaco seleccionado como diana B7 como no seleccionado como diana B8 fueron igualmente tóxicos in vitro. Si se internalizaran conjugados de manera dependiente del receptor y se activaran a nivel intracelular, se esperaría que el conjugado seleccionado como diana B7 se acumulase en células que expresan CAIX y fuera más tóxico que el fármaco no seleccionado como diana B8. Este no parece ser el caso. Por tanto, los presentes han planteado la hipótesis de que el conjugado se acumularía en el sitio tumoral, donde los agentes reductores (por ejemplo, glutatión liberado de células moribundas) escindirían el enlace disulfuro en el espacio extracelular y conducirían a liberación de fármaco. Entonces DM1 se difundiría en células adyacentes para actuar sobre su diana intracelular.
Se llevó a cabo un estudio de hallazgo con dosis preliminares con el conjugado B7. Incluso una dosis tan baja como 6 nmol en 8 días consecutivos condujo a una reducción del volumen tumoral sustancial. Cinco dosis de 48 nmol en el plazo de seis días erradicaron completamente el tumor pero mostraron algo de toxicidad. Finalmente, se usó un programa terapéutico de 35 nmol en 8 días consecutivos, que era bien tolerado en ratones que tenían un tumor SKRC52 (figura 11). El 12° día tras el inicio del tratamiento, dos ratones carecían de tumores y el volumen tumoral promedio para todos los ratones había descendido desde un volumen tumoral inicial de 200 mm3 hasta por debajo de 50 mm3. Los dos ratones con regresión completa y uno del estudio de aumento de la dosis carecían de tumores 90 días después del inicio de la terapia y, por tanto, se consideraron curados. Los tumores restantes volvieron a crecer. De manera importante, los conjugados de control que carecen del ligando de selección como diana, o grupo funcional bivalente B2 sin la carga útil no tuvieron un efecto antitumoral estadísticamente significativo.
(C) Restos de unión mediante examen de una biblioteca codificada por ADN
Las tecnologías químicas para el descubrimiento de aglutinantes proteicos de alta afinidad proporcionan técnicas para ir más allá de los ligandos que se producen de manera natural para aplicaciones que seleccionan enfermedades como diana. Pueden construirse y examinarse bibliotecas químicas combinatorias de tamaño sin precedentes etiquetando moléculas orgánicas con fragmentos de ADN, que sirven como códigos de barras de identificación amplificables [grupo Liu; grupo Neri]. Pueden sintetizarse bibliotecas químicas codificadas por ADN, postuladas en primer lugar por Lerner y Brenner [REF], con uno o dos conjuntos de moléculas presentadas en las extremidades de hebras de ADN complementarias, produciendo bibliotecas químicas de uno o dos farmacóforos, respectivamente.
Los presentes inventores han estudiado una biblioteca química de autoensamblaje codificada por ADN (ESAC) novedosa, que contiene 111.100 moléculas pequeñas con el fin de identificar un nuevo resto de unión bivalente para CAIX.
Síntesis de biblioteca química de autoensamblaje codificada por ADN (ESAC)
Se sintetizó una biblioteca ESAC de dos farmacóforos de 111.100 compuestos usando una estrategia química novedosa que permite la identificación basada en secuencias y cuantificación de miembros de biblioteca. Se construyó la biblioteca química de autoensamblaje codificada (ESAC) hibridando dos sub-bibliotecas de cadenas sencillas purificadas y sintetizadas individualmente A y B. Los compuestos químicos que portan un ácido carboxílico, anhídrido, éster de N-hidroxisuccinimida o grupos isotiocianato se acoplaron al grupo amino primario en el extremo 5' (sub-biblioteca A) o extremo 3' (sub-biblioteca B) de oligonucleótidos modificados para producir la biblioteca tal como se muestra en la figura 13.
Síntesis de la sub-biblioteca A.
La síntesis de la sub-biblioteca codificada por ADN A de 550 compuestos la ha descrito Dumelin, C.E., Scheuermann, J., Melkko, S. & Neri, D. en Bioconjugate chemistry 17, 366-370 (2006). En resumen, se hicieron reaccionar oligonucleótidos de 48 meros (IBA GmbH) que portan un grupo amino libre en el extremo 5' (o-diéster de fosfato de aminohexilo) con elementos estructurales que contienen isotiocianato, cloruro de sulfonilo o ácido carboxílico activado para dar los correspondientes conjugados de amina, sulfonamida y tiourea. Las secuencias de oligonucleótido siguieron el patrón 5'-GGA GCT TCT GAA TTC TGT GTG CTG XXX XXX CGA GTC CCA TGG CGC AGC-3', en donde XXX XXX representa la secuencia codificante (6 nucleótidos) que identifica inequívocamente cada miembro de biblioteca individual.
Síntesis de la sub-biblioteca B.
Se construyó la sub-biblioteca B usando oligonucleótidos modificados en 3'-amino de 41 meros, que se acoplaron elementos estructurales de cloruro de sulfonilo, anhídrido de ácido carboxílico, ácido carboxílico y aminoácido protegido con Fmoc activado para dar los correspondientes conjugados de amida o sulfonamida. Todos los compuestos de biblioteca se acoplaron inicialmente al mismo oligonucleótido de la secuencia 5'-CAT GGG ACT CG ddd ddd CAG CAC ACA GAA Tt C AGA AGC TCC-3' (IBA GmbH), que se diseñó para ser complementaria a los oligonucleótidos de la sub-biblioteca A y contenía una región espaciadora abásica de 6 nucleótidos (d, desoxiabásica), que permite formación de dúplex prolífica con la región codificante de la sub-biblioteca.
Conjugación de ácidos carboxílicos y aminoácidos protegidos con Fmoc con oligonucleótido de la sub-biblioteca B con 3’-amino modificado:
Se añadieron ácidos carboxílicos o aminoácidos protegidos con Fmoc en dimetilsulfóxido (DMSO, 12,5 |il, 100 mM), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) en DMSO (12 |il, 100 mM), W-hidroxisulfosuccinimida (S-NHS) en DMSO/ H2O 2:1, (10 |il, 333 mM) a DMSO (215 |il) y se dejaron en reposo a 30 °C durante 30 min. Posteriormente, se añadió una mezcla de oligonucleótido de la sub-biblioteca B con amino modificado en H2O (5 |il, 5 nmol) y clorhidrato de trietilamina en H2O (TEA ■ HCl, 50 |il 500 mM, pH 10,0) y se mantuvo la reacción a 30 °C durante 12 h. Se extinguieron reacciones de conjugación de ácido carboxílico con clorhidrato de tris(hidroxilmetil)aminometano en H2O (Tris ■ HCl, 20 |il, 500 mM, pH 8,1) a 30 °C durante 1 h. Se extinguieron reacciones de conjugación de aminoácidos protegidos con Fmoc y se desprotegieron con Tris en H2O (5 |il, 1 M) y TEA (5 |il) a 30 °C durante 1 h. Tras la extinción y desprotección, se precipitó el conjugado del compuesto de ADN con EtOH antes de la purificación mediante HPLC. Se secaron a vacío durante la noche los conjugados de oligonucleótido-compuesto separados y recogidos, se volvieron a disolver en H2O (100 |il), y se analizaron mediante ESI-CL-EM31.
Conjugación de cloruros de sulfonilo con oligonucleótido de la sub-biblioteca B con 3-amino modificado:
Se mezclaron cloruros de sulfonilo en acetonitrilo (MeCN, 25 |il, 100 mM) con hidrogenocarbonato de sodio en H2O (25 |il, 1 M, pH 9,0), MeCN (100 |il), H2O (95 |il) y se hicieron reaccionar posteriormente con oligonucleótido de la sub-biblioteca B con amino modificado en H2O (5 |il, 5 nmol) a 30 °C durante 12 h. Se extinguió la reacción con Tris ■ HCl (20 |il, 500 mM, pH 8,1) a 30 °C durante 1 h. Tras la extinción, se precipitó el conjugado del compuesto de ADN con EtOH antes de la purificación mediante HPLC. Se secaron a vacío durante la noche los conjugados de oligonucleótido-compuesto separados y recogidos, se volvieron a disolver en H2O (100 |il), y se analizaron mediante ESI-CL-EM. Se secaron a vacío los conjugados de oligonucleótido-compuesto separados y recogidos durante la noche, se volvieron a disolver en H2O (100 |il), y se analizaron mediante ESI-CL-EM.
Conjugación de anhídridos de ácido carboxílico con oligonucleótido de la sub-biblioteca B con 3’-amino modificado:
Se mezclaron anhídridos de ácido carboxílico en DMSO (25 |il, 100 mM) con hidrogenofosfato de sodio en H2O (25 |il, 500 mM, pH 7,1), DMSO (195 |il), H2O (35 |il) y se hicieron reaccionar posteriormente con oligonucleótido de la sub-biblioteca B con amino modificado en H2O (5 |il, 5 nmol) durante la noche a 30 °C. Se extinguió la reacción con Tris ■ HCl (20 |il, 500 mM, pH 8,1) a 30 °C durante 1 h. Tras la extinción, se precipitó el conjugado del compuesto de ADN con EtOH antes de la purificación mediante HPLC31. Se secaron a vacío durante la noche los conjugados de oligonucleótido-compuesto separados y recogidos, se volvieron a disolver en H2O (100 |il), y se analizaron mediante ESI-CL-EM.
Para marcar inequívocamente miembros de biblioteca en la sub-biblioteca B, se extendieron conjugados de oligonucleótido-compuesto individuales con una secuencia identificadora única. Con este fin, se usaron 202 oligonucleótidos de código de 39 meros de secuencia 5'-CCT GCA TCG AAT GGA TCC GTG XXX XXX XX GCA GCT GCG C-3' (IBA GmbH), donde XXX XXX XX denota una región de código de 8 dígitos. Se ligaron los 202 conjugados de oligonucleótido-compuesto purificados por HPLC con estos oligonucleótidos codificantes con la ayuda de un oligonucleótido adaptador quimérico (ADN/ARN) (5'-CGA GTC CCA TGG CGC AGC TGC-3', en negrita: porciones de ARN), que es complementario a ambos, los conjugados de oligonucleótido-compuesto de la sub-biblioteca B y los oligonucleótidos de código de la sub-biblioteca B. Finalmente, se eliminó el oligonucleótido adaptador mediante tratamiento con ARNasa H (New England Biolabs).
Protocolo de ligación: se mezclaron conjugado de oligonucleótido-compuesto de la sub-biblioteca B en H2O (50 |il, 2 |iM), oligonucleótido de código de la sub-biblioteca B en H2O (10 |il, 15 |iM), oligonucleótido adaptador de ARN/AND quimérico de la sub-biblioteca B en H2O (10 |il, 30 |iM), tampón de reacción de ligación 10x (10 |il, New England Biolabs) y H2O (19,5 |il) y se calentaron hasta 90 °C durante 2 min antes de que se dejara enfriar la mezcla hasta 22 °C. Se añadió ligasa de ADN T4 (0,5 |il, New England Biolabs) y se realizó ligación a 16 °C durante 10 horas antes de inactivar la ligasa a 70 °C durante 15 min.
Hibridación de biblioteca y transferencia de código a la hebra de la sub-biblioteca A.
Para obtener la biblioteca final, se hibridaron en primer lugar las sub-bibliotecas A y B, dando como resultado una colección de dúplex combinatoria, en donde cada miembro de la sub-biblioteca A podía emparejarse con cada miembro de la sub-biblioteca B. Para la identificación inequívoca de cualquier combinación de farmacóforo dual mediante secuenciación de alto rendimiento, la información de codificación para A y B ha de proporcionarse en la misma hebra de ADN. Esto se logró mediante una extensión de la hebra de la sub-biblioteca A asistida por polimerasa Klenow de los heterodúplex A/B, que transfirió la información de codificación de la hebra de la sub­ biblioteca B a la hebra de la sub-biblioteca A. Protocolo de hibridación y codificación de Klenow: se mezclaron la sub-biblioteca A en H2O (115 |il, mezcla equimolar de todos los miembros de biblioteca, concentración total 864 nM), y sub-biblioteca B en H2O (100 |il, mezcla equimolar de todos los miembros de biblioteca, concentración total 1 |iM), tampón de reacción NEB210x (100 |il, New England Biolabs) y H2O (685 |il) y se calentaron hasta 90 °C durante 2 min, luego se enfriaron hasta 22 °C. Se purificó la biblioteca hibridada con columnas de eliminación de nucleótidos (Qiagen, elución con 6 x 140 |il de tampón EB de Qiagen en seis columnas separadas). Para la codificación de Klenow, se mezclaron biblioteca ESAC hibridada y purificada en tampón EB (800 |il), tampón de reacción NEB210x (100 |il, New England Biolabs), mezcla de disolución de desoxinucleótidos (dNTP) (100 |il, 500 |iM, concentración final 50 |iM, New England Biolabs) y fragmento Klenow (10 |il, New England Biolabs) y se incubaron a 37 °C durante 30 min.
Clonación, expresión y biotinilación de CAIX.
Se clonó CAIX humana etiquetada con His6 recombinante y se expresó tal como se describe por J.K. Ahlskog et al. en British Journal of Cancer 101, 645-657 (2009). La proteína se biotiniló químicamente con NHS-biotina EZ-Link (Thermo Scientific) para examen de afinidad según instrucciones del proveedor.
Examen de afinidad de la biblioteca ESAC frente a CAIX.
Se realizaron selecciones de afinidad usando un procesador de partículas magnéticas KingFisher (Thermo Scientific). Se resuspendieron perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (0,1 mg) en PBS (100 |il, NaPi 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) y se incubaron posteriormente con CAIX biotinilada (100 |il, concentración de 0,1 |iM o 1,0 |iM) durante 30 min con mezclado suave continuo. Se lavaron perlas recubiertas con CAIX tres veces con PBST (200 |il, NaPi 50 mM, NaCl 100 mM, Tween 20 al 0,05 % v/v, pH 7,4) que se complementó con biotina (100 |iM) con el fin de bloquear sitios de unión restantes en estreptavidina, y se incubaron posteriormente con la biblioteca ESAC (100 |il, concentración total de 100 nM, en PBST) durante 1 h con mezclado suave continuo. Tras retirar miembros de biblioteca no unidos lavando cinco veces con PBST (200 |il), se resuspendieron perlas que portan miembros de biblioteca unidos en tampón EB (100 |il, kit de purificación mediante PCR QIAquick, Qiagen) y se separaron los conjugados de ADN-compuesto de las perlas mediante desnaturalización térmica de estreptavidina y CAIX (95 °C durante 5 min). Se amplificó el ADN de los miembros de biblioteca eluidos mediante PCR, introduciendo al mismo tiempo códigos de barras de ADN específicos de la selección adicionales, y se sometió a secuenciación de ADN de alto rendimiento Illumina®.
En múltiples experimentos de selección, se encontró que el par de farmacofóros A-493/B-202 estaba muy enriquecido (figura 14), en comparación con la biblioteca no seleccionada y con los demás miembros de biblioteca tras selección de CAIX (enriquecimiento de >200 veces):
Figure imgf000045_0001
Estudios de unión in vitro
Se conjugaron en primer lugar A-493 y B-202 con ácidos nucleicos bloqueados con amino modificado complementarios de 8 meros marcados fluorescentemente (LNA™), se dejó que formaran una estructura de heterodúplex y se sometieron a mediciones de afinidad de polarización de fluorescencia frente a CAIX. Se realizaron mediciones de polarización de fluorescencia (FP) incubando sonda marcada fluorescentemente 5 nM y anhidrasa carbónica humana recombinante IX con concentraciones crecientes durante 1 h a 22 °C. Se midió la FP en un lector de placas de modo múltiple Spectra Max Paradigm (Molecular Devices). En LNA™, la combinación A-493/B-202 reveló una constante de disociación de 14,6 ± 0,7 nM, mientras que B-202 (acetazolamida) solo tuvo una Kd de 34,9 ± 0,9 nM.
Síntesis de ligandos de CAIX con y sin fluoróforos
A continuación, se sintetizaron compuestos químicos unidos que tenían restos de unión con y sin fluoróforos que tenían las estructuras mostradas en la figura 16 usando procedimientos de acoplamiento en fase sólida convencionales usando diversos espaciadores, que contienen un sitio de modificación para una conjugación de fluoróforo opcional. Se realizaron síntesis representativas (compuestos C5a y C5c) tal como sigue.
N-[4.4-b¡s(4-h¡drox¡fen¡l)pentano¡ll-B-aspart¡l- B-aspart¡l-N-(2-[2-(2-am¡noetox¡)etox¡let¡l}-6-(4-(4-oxo-4-[(5-sulfamo¡l-1.3.4-t¡ad¡azol-2-¡l)am¡nolbut¡l}-1H-1.2.3-tr¡azol-1-¡l)-L-norleuc¡nam¡da (C5a)
En pr¡mer lugar se h¡nchó O-b¡s-(am¡noet¡l)et¡lengl¡col precargado comerc¡almente d¡spon¡ble en res¡na de tr¡t¡lo (200 mg. 0.12 mmol) en DCM (3 x 5 m¡n x 2 ml) y luego en DMF (3 x 5 m¡n x 2 ml). Se d¡solv¡eron az¡dol¡s¡na proteg¡da con Fmoc (142 mg. 0.36 mmol). HBTU (137 mg. 0.36 mmol). HOBt-^O (55 mg. 0.36 mmol) y DIPEA (119 |il. 0.72 mmol) en DMF (2 ml). se dejó reposar la mezcla a 22 °C durante 15 m¡n y luego se h¡c¡eron reacc¡onar con la res¡na durante 1 h con ag¡tac¡ón suave. Tras lavar con DMF (6 x 1 m¡n x 2 ml) se el¡m¡nó el grupo Fmoc con p¡per¡d¡na al 20 % en DMF (1 x 2 m¡n x 2 ml y 2 x 10 m¡n x 2 ml) y se lavó la res¡na con DMF (6 x 1 m¡n x 2 ml) antes de que se extend¡era el pépt¡do 2x con éster a-terc-butíl¡co de ác¡do N-a-Fmoc-L-aspárt¡co (148 mg. 0.36 mmol) y ác¡do 4.4-b¡s(4-h¡drox¡fen¡l)valér¡co (103 mg. 0.36 mmol) en el orden ¡nd¡cado usando las m¡smas cond¡c¡ones de acoplam¡ento (HBTU/HOBtH2O/DIPEA) y desprotecc¡ón de Fmoc (el 20 % de p¡per¡d¡na en DMF) menc¡onadas anter¡ormente. Después de la últ¡ma etapa de acoplam¡ento de pépt¡dos. se preparó una d¡soluc¡ón de Cul (2.3 mg.
0.01 mmol). TBTA (6.4 mg. 0.01 mmol) y alqu¡no 10 (99 mg. 0.36 mmol) en una mezcla de DMF (1 ml) y THF (1 ml) y se h¡zo reacc¡onar con la res¡na a 22 °C durante 2 h. Tras lavar con DMF (6 x 1 m¡n x 2 ml). se esc¡nd¡ó el compuesto ag¡tando la res¡na con una mezcla de TFA (4.5 ml). TIPS (250 |il) y H2O (250 |il) a 22 °C durante 2 h. Se lavó la res¡na con TFA (1 x 5m¡n x 2 ml) y se añad¡eron las d¡soluc¡ones de lavado y esc¡s¡ón comb¡nadas gota a gota a d¡et¡l éter helado (50 ml). Se recog¡ó el prec¡p¡tado med¡ante centr¡fugac¡ón y se pur¡f¡có el producto med¡ante HPLC de fase ¡nversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 20 % de A / el 80 % de B a lo largo de 30 m¡n). Tras la l¡of¡l¡zac¡ón. se recog¡ó el compuesto del título como un polvo blanco (49 mg. 46 |imol. el 38 % de rend¡m¡ento).
1H-RMN (500 MHz. DMSO-d6): 813.01 (s, 1H). 9.19 (a. s. 2H). 8.33 (s. 2H). 8.19 (d, J = 8.0. 1H). 8.09 (d. J = 7.9.
1H) 7.91 (d. J = 8.1. 1H). 7.88 (t. J = 6.0. 1H). 7.84 (s, 1H). 7.79 (a. s. 3H). 6.92 (d. J = 8.4. 4H). 6.64 (d. J = 8.4. 4H).
4.54 - 4.44 (m, 2H). 4.24 (t. J = 7.2. 2H). 4.17 (td, J = 8.3. 5.5. 1H). 3.58 (t. J = 5.3. 2H). 3.56 - 3.50 (m.4H). 3.38 (t. J = 6.1. 2H). 3.24 - 3.15 (m, 2H). 2.97 (sext, J = 5.6. 2H). 2.65 (t. J = 7.5. 2H). 2.64 - 2.55 (m. 4H). 2.51 - 2.41 (m, 2H).
2.17 (t. J = 8.2. 2H) 1.94 (quin, J = 7.5. 2H). 1.88 - 1.82 (m. 2H). 1.75 (quin, J = 7.5. 2H). 1.66 - 1.60 (m, 1H). 1.53 -1.46 (m, 1H). 1.45 (s, 3H). 1.28 - 1.17 (m, 2H). 13C-RMN (125 MHz. DMSO-d6): 8172.84. 172.79. 172.30. 172.04.
171.62. 169.19. 169.09. 164.33. 161.09. 154.96. 146.06. 139.65. 139.58. 127.81. 121.84. 114.68. 69.68. 69.46.
68.85. 66.70. 52.34. 49.08. 48.70. 43.86. 38.70. 38.53. 37.14. 36.95. 36.75. 34.27. 31.36. 31.27. 29.44. 27.39. 24.42.
24.23. 22.28. HRMS (ESI): m/z calculado para C45H63N12O15S2 [M H]+: 1075.3972; encontrado: 1075.3966.
N-[4.4-b¡s(4-h¡drox¡fen¡l)pentano¡ll-B-aspart¡l-B-aspart¡l-N-[2-(2-(2-[(5-(4-[(6E)-6-((2E)-2-[3.3-d¡met¡l-5-sulfo-1-(4-sulfobut¡l)-1.3-d¡h¡dro-2H-¡ndol-2-¡l¡denlet¡lo¡deno)-2-((E)-2-[3.3-d¡met¡l-5-sulfo-1-(4-sulfobut¡l)-3H-¡ndol¡o-2-¡lleten¡l)c¡clohex-1-en-1-¡llfen¡l)pentano¡l)am¡noletox¡)etox¡)et¡ll-6-(4-(4-oxo-4-[(5-sulfamo¡l-1.3.4-t¡ad¡azol-2-¡l)am¡nolbut¡l)-1H-1.2.3-tr¡azol-1-¡l)-L-norleuc¡nam¡da (C5c)
A C5a (161 |ig. 150 nmol) en DMSO (16.1 |il) se le añad¡ó éster de NHS IRDye® 750 (99 |ig. 83 nmol) en DMSO (10 |il) segu¡do por DMF (100 |il) y DIPEA (2 |il. 12 |imol). Se ag¡tó la d¡soluc¡ón a 22 °C durante 2 h y luego se ext¡ngu¡ó con h¡drogenocarbonato de sod¡o (100 |il. 100 mM. pH 8.0) antes de pur¡f¡car sobre HPLC de fase ¡nversa (el 95 % de A / el 5 % de B con respecto al 40 % de A / el 60 % de B a lo largo de 30 m¡n). Se ¡dent¡f¡caron fracc¡ones que contenían conjugado de colorante a través de su espectro de UV/VIS característ¡co (Xmáx = 756 nm). se agruparon. se l¡of¡l¡zaron y se d¡solv¡eron en DMSO (50 |il) para dar una d¡soluc¡ón de reserva verde oscuro. Se determ¡nó su concentrac¡ón y el rend¡m¡ento de reacc¡ón m¡d¡endo la absorbanc¡a a 756 nm (8756 = 260'000 M'1 cirr1) de muestras de reserva d¡lu¡das 1:200 en PBS (pH 7.4): 1.00 mM. 50 nmol. 60 % de rend¡m¡ento. HRMS (MALDI/ESI dual): m/z calculado para C94H121N14O28S6 [M+]: 2085.6793; encontrado: 2085.6793.
Las af¡n¡dades de un¡ón de los compuestos de síntes¡s de la f¡gura 16 se caracter¡zaron entonces med¡ante polar¡zac¡ón de fluorescenc¡a y med¡ante resonanc¡a de plasmón superf¡c¡al. tal como s¡gue.
Determ¡nac¡ón de af¡n¡dad de l¡gandos de CAIX med¡ante med¡c¡ones de polar¡zac¡ón de fluorescenc¡a (FP).
Se ¡ncubaron l¡gandos marcados con fluoresceína (5 nM d¡lu¡do con PBS de reservas de DMSO. conten¡do de DMSO f¡nal ajustado al 0.001 %) a 22 °C durante 1 h en una placa negra de 384 poc¡llos (Gre¡ner. s¡n un¡ón) en PBS (pH 7.4) con concentrac¡ones crec¡entes de CAIX hasta un volumen f¡nal de 60 |il. Se m¡d¡ó la an¡sotropía de fluorescenc¡a en un lector de placas de modo múlt¡ple Spectra Max Parad¡gm (Molecular Dev¡ces). Se real¡zaron exper¡mentos por tr¡pl¡cado y se ajustaron los valores de an¡sotropía med¡os a la s¡gu¡ente ecuac¡ón usando Kale¡daGraph 4.1.3 (Synergy Software).
Figure imgf000046_0001
en donde A es la an¡sotropía. [P]q la concentrac¡ón de proteínas total. [L]q la concentrac¡ón total del l¡gando marcado fluorescentemente y Kd la constante de disociación.
Determinación de afinidad de ligandos de CAIX mediante mediciones de resonancia de plasmón superficial (SPR) s. Se llevaron a cabo experimentos de resonancia de plasmón superficial a temperatura ambiente (25 °C) usando un instrumento Biacore™ T200 y chips CM5 (GE Healthcare). Para todas las mediciones, se usó un tampón PBS (pH 7,4) que contenía DMSO (5 % v/v) y tensioactivo P20 (0,05 % v/v, GE Healthcare). Se inmovilizó la proteína cA iX sobre el chip a aproximadamente 3.000 unidades de respuesta usando EDC • HCl y NHS tal como describe el fabricante del instrumento. Se usaron diluciones en serie de compuestos no marcados (de 0,08 nM a 620 nM en etapas de 1/2) como analitos. Después de cada ciclo, se regeneró la superficie del sensor mediante un tratamiento corto con DMSO (50 % v/v) en H2O. Los sensorgramas se corrigieron con disolvente y se analizó la cinética de unión con el software de evaluación Biacore™ T200 (versión 2.0) usando un modo de unión Langmuir 1:1.
Los mejores aglutinantes presentaron un resto de Asp-Asp en el ligador (C5a y C5b) y un valor de Kd de 0,2 ± 0,1 nM mediante polarización de fluorescencia en disolución. Las mediciones de SPR dieron constantes de disociación ligeramente mayores. El mejor aglutinante parecía ser uno con el ligador más largo.
Las propiedades de unión del mejor conjugado de A-493/B-202 se estudiaron además en células de cáncer de riñón humano SK-RC-52 mediante clasificación celular activada por fluorescencia. Con estos fines, se reemplazó el resto de fluoresceína con un colorante fluorescente en el infrarrojo cercano (IRDye® 750). Se usaron compuestos que carecían del resto B o ambos restos A/B como controles en el experimento.
Cultivo celular.
Se mantuvieron células SK-RC-52 y HEK en medio RPMI (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal (10 % v/v, FCS, Life Technologies) y antibiótico-antimicótico (AA, Life Technologies) a 37 °C y el 5 % de CO2. Para el pase, se separaron células usando tripsina-EDTA al 0,05 % (Life Technologies) cuando se alcanza el 90 % de confluencia y se volvieron a sembrar a una dilución de 1 :10.
Análisis de unión a ligando mediante citometría de flujo.
Se separaron células de placas de cultivo usando disolución de EDTA (50 mM) en PBS (pH 7,4), se contaron y se suspendieron hasta una concentración final de 1,5 x 106 células ml-1 en una disolución de FCS (1 % v/v) / PBS (pH 7,4). Se centrifugaron alícuotas de 3 x 105 células (200 |il) y se resuspendieron en disoluciones de ligandos marcados con IRDye® 750 (Licor) (30 nM) en FCS (1 % v/v) en PBS (200 |il, pH 7,4) y se incubaron a 4 °C durante 1 h. Se lavaron las células una vez con 200 |il de FCS (1 % v/v)/ PBS (pH 7,4), se centrifugaron, se resuspendieron en una disolución de yoduro de propidio (30 |iM, Sigma-Aldrich) en FCS (1 % v/v) / PBS (300 |il, pH 7,4) y se analizaron en un citómetro de flujo FACS Canto (BD Bioscience). Se usó FlowJo versión 8.7 (Treestar) para análisis de datos y visualización.
Estos experimentos mostraron que el compuesto marcado con IRDye 750 C5c (figura 17) tiñó células con más fuerza que el correspondiente control de acetazolamida marcado con IRDye 750 C1a (figura 17). Estos resultados se muestran en la figura 18.
Estudios de unión in vivo
Para experimentos de obtención de imágenes IVIS, a ratones que tenían tumores SK-RC-52 subcutáneos se les inyectó por vía intravenosa 3 nmol de ligandos de CAIX marcados con IRDye® 750 C1c, C5c y C6 (figuras 15,17) disueltos en DMSO al 5 % v/v en PBS pH 7,4 (150 |il). Se anestesiaron los ratones con isoflurano y se adquirieron imágenes de fluorescencia en un sistema de obtención de imágenes IVIS Spectrum (Xenogen, exposición 1 s, factor de agrupamiento 8, excitación a 745 nm, filtro de emisión a 800 nm, f número 2, campo de visión 13,1). Se administró alimento y agua a voluntad entre mediciones. Posteriormente los ratones se sacrificaron mediante luxación cervical. Se extrajeron el corazón, pulmón, riñón, hígado, bazo, una sección del intestino, músculo esquelético y el tumor y se obtuvieron imágenes individualmente usando los parámetros anteriores.
El colorante no seleccionado como diana C6 no se ubicó preferiblemente en el tumor en ningún momento, en total analogía con agentes quimioterápicos convencionales. El derivado de acetazolamida C1c presentó una rápida acumulación preferencial en el tumor, pero se disoció gradualmente de la masa neoplásica a lo largo del tiempo. En cambio, el ligando A-493/B-202 bidentado de alta afinidad C5c presentó una selección como diana de tumores duradera y selectiva. La eficacia de la selección como diana de tumores de C5c y C1c (el 18 % y el 3,7 % de dosis inyectada por gramo de a las 24 h, respectivamente) se comparó favorablemente con los datos de biodistribución obtenidos en el mismo modelo animal usando dos anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad en formato de IgG.
Preparación de un ligando radiomarcado que tiene propiedad de unión a CAIX
Un ligando anti-CAIX que tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000048_0001
se radiomarcó con tecnecio 99m tal como sigue. Se mezclaron 50 |il de ligando (1,2 mM) en PBS desgasificado pH 7,4 con 50 |il de disolución recién preparada de SnCl2 (4 mg/ml) en agua MQ desgasificada, 100 |il de glucoheptonato de Na (200 mg/ml) recién preparado en agua MQ desgasificada, y 600 |il de TBS pH 7,4. Se desgasificó la disolución durante al menos 5 min haciendo burbujear nitrógeno. Se añadieron 200 |il de eluato generador 99mTc (aproximadamente 200 MBq) a la disolución, que luego se calentó hasta 90 °C durante 20 min y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente.
Evaluación de la biodistribución de ligando anti-CAIX radiomarcado
Se evaluó el rendimiento de la biodistribución del ligando marcado con tecnecio 99m en ratones tal como sigue. A ratones balb/c nu/nu se les inyectó por vía subcutánea 107 células de carcinoma de células renales SKRC52. Se dejó que los tumores SKRC52 establecidos crecieran hasta un tamaño promedio de 500 mm3 antes de recibir inyecciones intravenosas del ligando radiomarcado. También se radiomarcó un ligando no seleccionado como diana / irrelevante con tecnecio 99m y se usó como control negativo.
Seis horas después de la inyección, se sacrificaron los ratones, se extirparon órganos individuales y se analizaron para determinar la captación de ligando radiomarcado.
Los resultados expresados como dosis inyectada por gramo de tejido se muestran en la figura 19. Puede observarse que el ligando de CAIX se ubicaba fuertemente en el tumor en comparación con el ligando no seleccionado como diana.
Síntesis de un fármaco de auristatina conjugado con un resto de unión a CAIX de molécula pequeña que tiene un ligador peptídico que puede escindirse mediante catepsina B
Se muestran el esquema de reacción y la estructura del conjugado de fármaco de este ejemplo según la presente invención en la figura 19.
Se preparó el péptido AAZ-triazol-AspArgAspCys-COOH (1) tal como se describió previamente (Krall et. al., Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 4231). Se añadió una disolución de 1 (4,5 mg, 5 |imol) en PBS desgasificado pH 7,4 (1 ml) a maleimidocaproílo - valina citrulina - para-amino carbamato de bencilo de monometil auristatina E comercialmente disponible (MC-VC-PAB-MMAE (2), 6,5 mg, 4,9 |imol) y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 5 min. MMAE es el resto tóxico. MC-VC-PAB es el ligador que puede escindirse.
Se purificó la mezcla sobre HPLC (Synergi RP Polar, MeCN al 5 % en TFA ac. al 0,1 % hasta el 80 % a lo largo de 20 min) y se identificaron fracciones que contenían el producto mediante espectrometría de masas de baja resolución. Tras la liofilización, se recogió el producto como un polvo blanco (7,5 mg, 3,4 |imol, 68 %). HRMS: (m/z) [M 2H+] C98H153N25O28S3, 1112,0234; encontrado 1112,0237.
Evaluación de la actividad antitumoral del conjugado de auristatina con resto de unión a CAIX y ligador peptídico que puede escindirse de catepsina B.
Se evaluó la actividad antitumoral del conjugado de fármaco según la presente invención tal como se muestra en la figura 19 tal como sigue. Los resultados se muestran gráficamente en la figura 20.
A ratones balb/c nu/nu se les inyectó por vía subcutánea 107 células de carcinoma de células renales SKRC52. Se permitió que los tumores SKRC52 establecidos crecieran hasta un tamaño promedio de 700 mm3 antes de recibir inyecciones intravenosas del SMDC a las siguientes dosis y esquemas: 50 nm en el día 1 únicamente; 25 nm cada uno en el día 1 y día 2; y 10 nm cada uno en los días 1, 2, 3, 4 y 5. Se registraron los volúmenes tumorales cada día con la ayuda de un calibrador digital. Se observó una actividad antitumoral significativa incluso a la dosis más baja de 10 nmoles.
La figura 20 muestra que se observó una fuerte actividad antitumoral del SMDC en el modelo de carcinoma de células renales SKRC52 establecido en ratones desnudos. Se observó la regresión de tumores con el tamaño de 700 mm3 con diferentes dosis y regímenes de tratamiento.
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Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un agente terapéutico dirigido que comprende un compuesto de fórmula (I):
    B -L -D (I),
    en la que:
    B es un resto de unión de bajo peso molecular para la anhidrasa carbónica IX (CAIX), en el que dicho resto de unión comprende un grupo terminal de fórmula (T2):
    Figure imgf000050_0001
    D es un resto de fármaco; y
    L es un grupo ligador que experimenta escisión in vivo para liberar dicho resto de fármaco en una forma activa, en el que dicho ligador L comprende un anillo de 1,2,3-triazol, en el que dicho resto de fármaco y resto de ligador están unidos a las posiciones 1 y 4 del anillo de triazol y la posición 5 del anillo de triazol también está opcionalmente sustituida.
  2. 2. Un agente terapéutico dirigido según la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es sustancialmente estable a la hidrólisis en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C.
  3. 3. Un agente terapéutico dirigido según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho compuesto tiene una semivida en suero de ratón a 37 °C tal como se determina mediante HPLC de desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 50 horas, preferiblemente desde aproximadamente 10 horas hasta aproximadamente 50 horas.
  4. 4. Un agente terapéutico dirigido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el triazol está sustituido en la posición 4 por un grupo R seleccionado de H, halógeno, halometilo o alquilo o heteroalquilo C1-C7, preferiblemente en el que R es H, metilo o etilo, y lo más preferiblemente en el que R es H.
  5. 5. Un agente terapéutico dirigido según cualquier reivindicación anterior, en el que el resto de unión-resto de ligador comprende un grupo terminal de fórmula:
    Figure imgf000050_0002
  6. 6. Un agente terapéutico dirigido según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho ligador comprende un resto polar o cargado para mejorar la solubilidad en agua del conjugado.
  7. 7. Un agente terapéutico dirigido según la reivindicación 6, en el que dicho resto polar o cargado es un oligómero que comprende de 2 a 10 monómeros seleccionados de aminoácidos naturales y no naturales, sacáridos, ácido (met)acrílico y sales del mismo, (met)acrilato de hidroxietilo y etilenglicol.
  8. 8. Un agente terapéutico dirigido según la reivindicación 7, en el que dicho resto polar o cargado es un oligómero de aminoácido Cys-Asp-Arg-Asp.
  9. 9. Un agente terapéutico dirigido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho fármaco en forma activa es un compuesto químico antineoplásico.
  10. 10. Un agente terapéutico dirigido según la reivindicación 9, en el que dicho fármaco es un disruptor de tubulina.
  11. 11. Un agente terapéutico dirigido según cualquier reivindicación anterior que tiene la fórmula (II):
    Figure imgf000051_0001
    en la que MMAE es un grupo de fármacos de fórmula:
    Figure imgf000051_0002
  12. 12. Un agente terapéutico dirigido según cualquier reivindicación anterior, para su uso en el tratamiento de un tumor sólido que expresa anhidrasa carbónica IX, por ejemplo, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal o cáncer de mama, en particular carcinoma de células renales.
  13. 13. Una composición farmacéutica que comprende un agente terapéutico dirigido según cualquier reivindicación anterior.
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