ES2910941T3 - Ligandos de proteína de activación de fibroblastos para aplicaciones de administración dirigida - Google Patents

Ligandos de proteína de activación de fibroblastos para aplicaciones de administración dirigida Download PDF

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Abstract

Compuesto que tiene una de las siguientes estructuras, sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo: **(Ver fórmula)** .

Description

DESCRIPCIÓN
Ligandos de proteína de activación de fibroblastos para aplicaciones de administración dirigida
Introducción
Campo
La presente invención se refiere a ligandos de proteína de activación de fibroblastos (FAP) para la administración activa de diversas cargas activas (por ejemplo, fármacos citotóxicos, radionúclidos, fluoróforos, proteínas e inmunomoduladores) en el sitio de la enfermedad. En particular, la presente invención se refiere al desarrollo de ligandos de FAP para aplicaciones de direccionamiento, en particular métodos diagnósticos y/o métodos para terapia o cirugía en relación con una enfermedad o un trastorno, tal como cáncer, inflamación u otra enfermedad caracterizada por sobreexpresión de FAP.
Antecedentes de la invención
La quimioterapia todavía se aplica ampliamente para el tratamiento de pacientes con cáncer y de otras enfermedades. Los agentes quimioterápicos antineoplásicos convencionales actúan sobre los mecanismos básicos de supervivencia celular y no pueden distinguir entre células sanas y células malignas. Además, esos fármacos no se acumulan de manera eficiente en el sitio de la enfermedad tras la administración sistémica. El mecanismo inespecífico de acciones y la localización ineficiente en el sitio tumoral representan efectos secundarios insostenibles y una escasa eficacia terapéutica de la quimioterapia convencional.
El desarrollo de fármacos dirigidos, que pueden localizarse de manera selectiva en el sitio de la enfermedad después de la administración sistémica, es altamente deseable. Una estrategia para generar tales fármacos está representada por la conjugación química de una carga activa terapéutica, como fármacos citotóxicos o radionúclidos, con un ligando específico de un marcador de una enfermedad. Los anticuerpos monoclonales, péptidos y ligandos pequeños específicos de enfermedad se han considerado como ligandos de elección para el desarrollo de medicamentos dirigidos. El uso de ligandos pequeños para aplicaciones de direccionamiento presenta varias ventajas en comparación con moléculas más grandes como péptidos y anticuerpos: penetración tumoral más rápida y eficiente, menor inmunogenicidad y menores costes de fabricación.
Los ligandos orgánicos pequeños específicos de antígeno prostático específico de membrana, receptor de folato y anhidrasa carbónica IX han mostrado excelentes perfiles de biodistribución en modelos preclínicos de cáncer y en pacientes. Estos ligandos se han conjugado con fármacos citotóxicos y con radionúclidos para generar productos de conjugado molécula pequeña-fármaco y conjugado molécula pequeña-radionúclido (SMDC y SMRC) para el tratamiento de cáncer. 177-Lutecio-PSMA-617 representa un ejemplo de un SMRC de fase tardía que está investigándose en la actualidad en un ensayo en fase III para el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración metastásico (CPRCm) (ensayo VISION).
La proteína de activación de fibroblastos (FAP) es una gelatinasa unida a membrana que fomenta el crecimiento y la progresión tumorales y se sobreexpresa en fibroblastos asociados al cáncer. FAP representa una diana ideal para el desarrollo de SMDC y SMRC dirigidos debido a su baja expresión en órganos normales.
Los documentos WO2019154886 y WO2019154859 describen compuestos heterocíclicos como inhibidores de proteína de activación de fibroblastos alfa usados para tratar diferentes tipos de cáncer. El documento WO2019118932 describe compuestos cíclicos que contienen N sustituidos como inhibidores de proteína de activación de fibroblastos alfa usados para tratar diferentes estados patológicos. El documento WO2019083990 describe la obtención de imágenes y el direccionamiento radioterápico de compuestos de proteína de activación de fibroblastos alfa (FAP-alfa) como inhibidores de FAP-alfa usados para obtener imágenes de la enfermedad asociada con FAP-alfa y para tratar enfermedades proliferativas, y menciona que los derivados de 4-isoquinolinoílo y 8-quinolinoílo descritos en el mismo se caracterizan por una muy baja afinidad por FAP. El documento WO2013107820 describe derivados de pirrolidina sustituidos usados en el tratamiento de trastornos proliferativos tales como cánceres y enfermedades indicadas por remodelación tisular o inflamación crónica tales como la artrosis. El documento WO2005087235 describe derivados de pirrolidina como inhibidores de dipeptidil peptidasa IV para tratar la diabetes de tipo II. El documento WO2018111989 describe conjugados que comprenden inhibidor de proteína de activación de fibroblastos (FAP), ligador bivalente y, por ejemplo, colorante en el infrarrojo cercano (NIR), útiles para eliminar fibroblastos asociados al cáncer, obtener imágenes de una población de células in vitro y tratar el cáncer.
Tsutsumi et al. (J Med Chem 1994) describen la preparación y la actividad inhibidora in vitro de prolil endopeptidasa (PEP) de una serie de compuestos a-ceto-heterocíclicos. Hu et al. (Bioorg Med Chem Lett 2005) describen la relación estructura-actividad de diversos derivados N-alquil-Gly-boro-Pro contra FAP y otras dos dipeptidil peptidasas. Edosada et al. (J Biol Chem 2006) describen la especificidad de sustrato dipeptídico de FAP y el desarrollo de un inhibidor selectivo de FAP, Ac-Gly-BoroPro. Gilmore et al. (Biochem Biophys Res Commun 2006) describen el diseño, la síntesis y pruebas cinéticas de una serie de difenilfosfonatos de prolina dipeptídicos contra DPP-IV y FAP. Tran et al. (Bioorg Med Chem Lett 2007) describen la relación estructura-actividad de diversos derivados N-acil-Gly-boroPro, N-acil-Sar-boroPro y boroPro bloqueado en N contra FAP. Tsai et al. (J Med Chem 2010) describen estudios de relación estructura-actividad que dieron como resultado varios inhibidores de FAP con excelente selectividad sobre DPP-IV, DPP-II, DPP8 y DPP9. Ryabtsova et al. (Bioorg Med Chem Lett 2012) describen la síntesis y la evaluación de las propiedades de inhibición de fAp de una serie de glicil-(2-ciano)pirrolidinas N-aciladas. Poplawski et al. (J Med Chem 2013) describen N-(piridin-4-carbonil)-D-Ala-boroPro como inhibidor de FAP potente y selectivo. Jansen et al. (ACS Med Chem Lett 2013) describen inhibidores de FAP basados en el armazón N-(4-quinolinoil)-Gly-(2-cianopirrolidina). Jansen et al. (Med Chem Commun 2014) la relación estructura-actividad de inhibidores de FAP basados en el armazón linagliptina. Jansen et al. (Med Chem Commun 2014) describen inhibidores de FAP basados en xantina con baja potencia micromolar. Jansen et al. (J Med Chem 2014) describen la relación estructura-actividad de inhibidores de FAP basados en el armazón N-4-quinolinoil-Gly-(2S)-cianoPro. Jackson et al. (Neoplasia 2015) describen el desarrollo de un inhibidor seudopeptídico de FAP. Meletta et al. (Molecules 2015) describen el uso de un inhibidor de FAP basado en ácido borónico como trazadores para obtención de imágenes no invasivos de placas ateroscleróticas. Dvoráková et al. (J Med Chem 2017) describen la preparación de un conjugado polimérico que contiene un inhibidor específico de FAP para aplicaciones de direccionamiento. Loktev et al. (J Nucl Med 2018) describen el desarrollo de un radiotrazador yodado y uno acoplado con DOTA basados en un inhibidor enzimático específico de FAP. Lindner et al. (J Nucl Med 2018) describen la modificación y optimización de inhibidores de FAP para su uso como trazadores tratanósticos. Giesel et al. (J Nucl Med 2019) describen el rendimiento de obtención de imágenes clínicas de trazadores para TEP basados en quinolina que actúan como inhibidores de FAP.
Problemas que van a resolverse mediante la invención
La presente invención tiene como objetivo el problema de proporcionar grupos de unión (ligandos) de proteína de activación de fibroblastos (FAP) mejorados adecuados para aplicaciones de direccionamiento. Los grupos de unión deben ser adecuados para la inhibición de FAP y/o la administración dirigida de una carga activa, tal como un agente terapéutico o diagnóstico, a un sitio afectado por o en riesgo de verse afectado por una enfermedad o un trastorno caracterizado por la sobreexpresión de FAP. Preferiblemente, el grupo de unión debe formar un complejo estable con FAP, mostrar una afinidad aumentada, una actividad inhibidora aumentada, una tasa de disociación a partir del complejo más lenta y/o una residencia prolongada en un sitio de la enfermedad.
Sumario de la invención
El contenido para el cual se busca protección es tal como se define por las reivindicaciones. Cualquier referencia a “realizaciones de restos B y/o C y/o L” que no se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones sirve simplemente con propósitos explicativos y no forma parte de la invención.
Los presentes inventores han hallado novedosos ligandos orgánicos de proteína de activación de fibroblastos (FAP) adecuados para aplicaciones de direccionamiento. Los compuestos según la presente invención (también denominados ligandos o grupos de unión) se definen en las reivindicaciones adjuntas, y comprenden un pequeño resto de unión A que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000003_0001
Un compuesto según la presente invención puede estar representado por la siguiente fórmula general I,
Figure imgf000003_0002
Fórmula I
sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que A es un resto de unión; B es un enlace covalente o un resto que comprende una cadena de átomos que une covalentemente los restos A y C; y C es un resto de carga activa.
La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona además dicho compuesto o dicha composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia o un método diagnóstico practicado sobre el cuerpo humano o animal; así como un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia o un método diagnóstico practicado sobre el cuerpo humano o animal que comprende administrar una cantidad terapéutica o diagnósticamente eficaz de dicho compuesto o dicha composición farmacéutica a un sujeto que lo necesita.
La presente invención proporciona además dicho compuesto o dicha composición farmacéutica para su uso en un método para la terapia o profilaxis de un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno; así como un método para la terapia o profilaxis de tratamiento de una enfermedad o un trastorno que comprende administrar una cantidad terapéutica o diagnósticamente eficaz de dicho compuesto o dicha composición farmacéutica a un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer dicha enfermedad o dicho trastorno.
La presente invención proporciona además dicho compuesto o dicha composición farmacéutica para su uso en un método para la cirugía guiada practicada sobre un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno; así como un método para la cirugía guiada que comprende administrar una cantidad terapéutica o diagnósticamente eficaz de dicho compuesto o dicha composición farmacéutica a un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno.
La presente invención proporciona además dicho compuesto o dicha composición farmacéutica para su uso en un método para el diagnóstico de una enfermedad o un trastorno, practicándose el método sobre el cuerpo humano o animal e implicando una técnica de obtención de imágenes de medicina nuclear, tal como tomografía por emisión de positrones (TEP); así como un método para el diagnóstico de una enfermedad o un trastorno, practicándose el método sobre el cuerpo humano o animal e implicando una técnica de obtención de imágenes de medicina nuclear, tal como tomografía por emisión de positrones (TEP), y que comprende administrar una cantidad terapéutica o diagnósticamente eficaz de dicho compuesto o dicha composición farmacéutica a un sujeto que lo necesita.
La presente invención proporciona además dicho compuesto o dicha composición farmacéutica para su uso en un método para la administración dirigida de un agente terapéutico o diagnóstico a un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno; así como un método para la administración dirigida de una cantidad terapéutica o diagnósticamente eficaz de dicho compuesto o dicha composición farmacéutica a un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno.
Preferiblemente, la enfermedad o el trastorno anteriormente mencionado se caracteriza por la sobreexpresión de FAP y se selecciona independientemente de cáncer, inflamación, ateroesclerosis, fibrosis, remodelación tisular y trastorno queloide, preferiblemente en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de intestino delgado, cáncer de colon, cáncer de colon resistente a múltiples fármacos, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer colorrectal metastásico, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer hepatocelular, cáncer de esófago, cáncer de hipofaringe, cáncer de nasofaringe, cáncer de laringe, células de mieloma, cáncer de vejiga, colangiocarcinoma, carcinoma renal de células claras, tumor neuroendocrino, osteomalacia oncogénica, sarcoma, COPD (carcinoma de origen primario desconocido), cáncer de timo, tumores desmoides, glioma, astrocitoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de riñón y cáncer de próstata. Más preferiblemente, la enfermedad o el trastorno se selecciona de melanoma y carcinoma de células renales.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: estructura química y perfiles de CL/EM de los compuestos (A) ESV6-fluo (26) y (B) Haberkorn-fluo (23). Figura 2: control de calidad de hFAP recombinante: A) SDS-PAGE; B) cromatografía de exclusión molecular (Superdex 200 Increase 10/300 GL).
Figura 3: experimento de coelución en PD-10 de los compuestos ESV6-fluo (26) y Haberkorn-fluo (23) y hFAP. Se forma un complejo estable entre hFAP y los ligandos pequeños ESV6-fluo y Haberkorn-fluo.
Figura 4: determinación de la afinidad de ligandos orgánicos pequeños para la proteína de activación de fibroblastos humana (hFAP) mediante polarización por fluorescencia. ESV6-fluo (26) muestra una mayor afinidad por hFAP (Kd de 0,78 nM) en comparación con el ligando previamente descrito, Haberkorn-fluo (23) (Kd de 0,89 nM).
Figura 5: experimento de inhibición de hFAP en presencia de ligandos orgánicos pequeños. El ligando ESV6 (P3) muestra una menor CI50 (20,2 nM) en comparación con el ligando previamente descrito, el ligando Haberkorn (H6) (24,6 nM).
Figura 6: mediciones de la tasa de disociación de ESV6-fluo (26) y Haberkorn-fluo (23) a partir de hFAP. ESV6-fluo se disocia (coeficiente de regresión = -0,093564) con un ritmo más lento en comparación con Haberkorn-fluo (coeficiente de regresión = -0,075112).
Figura 7: evaluación del rendimiento de direccionamiento de conjugados con IRDye750 en obtención de imágenes por fluorescencia en el infrarrojo cercano de ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos de melanoma SK-MEL-187 después de la administración intravenosa (dosis de 150 nmol/kg). (A) Imágenes de animales vivos en diversos puntos de tiempo (5 min, 20 min y 1 h después de la inyección). (B) Se presentan imágenes de órganos ex vivo a las 2 h. El compuesto ESV6-IRDye750 (18), un derivado del ligando de alta afinidad de FAP “ESV6”, muestra una mayor razón de captación de tumor con respecto a hígado, tumor con respecto a riñón y tumor con respecto a intestino en comparación con HABERKORN-IRDye750 (17). QCOOH-IRDye750 (16) (control no dirigido) no se localiza en lesiones SK-MEL-187 in vivo.
Figura 8: (A) Evaluación de la actividad terapéutica de ESV6-ValCit-MMAE (21) y HABERKORN-ValCit-MMAE (20) en ratones que portan ratones tumores SK-MEL-187. Los puntos de datos representan el volumen tumoral medio EEM (n = 3 por grupo). Las flechas indican infección IV de los diferentes tratamientos. ESV6-ValCit-MMAE, un derivado de conjugado de fármaco del ligando de alta afinidad de FAP “ESV6”, muestra un efecto antitumoral más potente en comparación con HABERKORN-ValCit-MMAE. (B) Tolerabilidad de los diferentes tratamientos tal como se evalúa mediante la evaluación de los cambios (%) en peso corporal de los animales durante el experimento. ESV6-ValCit-MMAE muestra una menor toxicidad aguda en comparación con HABERKORN-ValCit-MMAE.
Figura 9: experimento de inhibición de hFAP en presencia de diferentes ligandos orgánicos pequeños. El compuesto P4 del ejemplo 2 muestra una menor CI50 (16,83 nM, mayor inhibición) en comparación con el compuesto 24 (33,46 nM, menor inhibición).
Figura 10: determinación de la afinidad de ligandos orgánicos pequeños para la proteína de activación de fibroblastos humana y murina mediante polarización por fluorescencia (PF). (A) El conjugado 15 muestra una mayor afinidad por hFAP (Kd = 0,68 nM) en comparación con el conjugado 25 (Kd = 1,02 nM). (B) El conjugado 15 muestra una mayor afinidad por mFAP (Kd = 11,61 nM) en comparación con el conjugado 25 (Kd = 30,94 nM). El conjugado 15 presenta propiedades de unión a hFAP superiores y una mejor reactividad cruzada con el antígeno murino en comparación con el conjugado 25. (C) Estructuras de los conjugados 15 y 25.
Figura 11: experimento de coelución en PD-10 del conjugado de ligando de molécula pequeña 15 con hFAP (A) y mFAP (B). Se forma un complejo estable entre ambas proteínas y el conjugado de ligando pequeño 15, lo que permite una coelución de las dos moléculas juntas.
Figura 12: evaluación de la acumulación selectiva de conjugado 15 (10 nM) en células tumorales SK-RC-52.hFAP, HT-1080.hFAP y de tipo natural a través de microscopía confocal y análisis de FACS. (A) Las imágenes de SK-RC-52.hFAP incubadas con el compuesto en diferentes puntos de tiempo (t = 0 y 1 h) muestran acumulación de conjugado 15 sobre la membrana celular. (B) Las imágenes de SK-RC-52 de tipo natural después de la incubación con el compuesto no muestran acumulación sobre la membrana celular (control negativo). (C) El análisis de FACS en SK-RC-52 de tipo natural (pico gris oscuro) y SK-RC-52.hFAP (pico gris claro) muestra unión celular específica de FAP del conjugado 15 (10 nM). (D) Las imágenes de HT-1080.hFAP incubadas con el compuesto en diferentes puntos de tiempo (t = 0 y 1 h) muestran acumulación de conjugado 15 sobre la membrana celular y en el interior del citosol. (E) Las imágenes de HT-1080 de tipo natural después de la incubación con el compuesto no muestran acumulación sobre la membrana celular ni en el citosol (control negativo). (F) El análisis de FACS en HT-1080 de tipo natural (pico gris oscuro) y HT-1080.hFAP (pico gris claro) muestra unión celular específica de FAP del conjugado 15 (10 nM).
Figura 13: evaluación del rendimiento de direccionamiento del conjugado 15 en ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos de carcinoma de células renales SK-RC-52.hFAP después de la administración intravenosa (40 nmol). Se presentan imágenes de órganos ex vivo 1 h después de la administración. El compuesto se localiza de manera rápida y homogénea en el sitio tumoral in vivo 1 hora después de la inyección intravenosa, con una alta selectividad de tumor con respecto a órganos.
Figura 14: perfil de radioHPLC de compuestos radiactivos. (A) Perfil de radioHPLC del conjugado 9 después del marcaje con 177Lu (t.r. 11 min). (B) Perfil de radioHPLC de 177Lu libre (2 min). Después del radiomarcaje, el conjugado 9 aparece como un único pico con un >99% de conversión.
Figura 15: experimento de biodistribución de conjugado 9 (que incluye una carga activa radiactiva, 177Lu) en BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos de carcinoma de células renales SK-RC-52.hFAP. (A) % de DI/g en tumores y órganos sanos y análisis de la razón de tumor con respecto a órganos en diferentes puntos de tiempo (10 min, 1 h, 3 h y 6 h) después de la administración intravenosa de conjugado 9 (dosis = 50 nmol/kg; 0,5-2 MBq). (B) % de DI/g en tumores y órganos sanos y análisis de la razón de tumor con respecto a órganos 3 h después de la administración intravenosa de 177Lu-conjugado 9 a diferentes dosis (125 nmol/kg, 250 nmol/kg, 500 nmol/kg y 1000 nmol/kg; 0,5-2 MBq). Puede observarse una respuesta dependiente de la dosis, y puede alcanzarse una saturación de la diana entre 250 nmol/kg y 500 nmol/kg. (C) % de DI/g en tumores y órganos sanos 3 h después de la administración intravenosa de disolución de 177Lu (control negativo; 1 MBq) y análisis de la razón de tumor con respecto a órganos.
Figura 16: evaluación del rendimiento de direccionamiento de IRDye750-conjugado 18 en obtención de imágenes por fluorescencia en el infrarrojo cercano de ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos SK-MEL-187 (costado derecho) y SK-RC-52.hFAP (costado izquierdo) después de la administración intravenosa (dosis de 150 nmol/kg). (A) Imágenes de animales vivos antes de la inyección (t = 0) y 30 minutos después de la inyección intravenosa. (B) Se presentan imágenes ex vivo de órganos a los 60 minutos. El compuesto ESV6-IRDye750 (18) se acumula tanto en tumores SK-RC-52.hFAP como en SK-MEL-187, presentando una mayor acumulación en tumores SK-RC-52.hFAP debido a una mayor expresión de FAP en comparación con SK-MEL-187.
Figura 17: experimento de inhibición de hFAP en presencia de diferentes ligandos orgánicos pequeños. El conjugado 28 muestra una menor propiedad de inhibición de FAP en comparación con el ejemplo 2, P4. El conjugado 29, que incluye un elemento estructural de L-alanina entre la sección de cabeza de cianopirrolidina y el anillo de piridina, no inhibe la actividad proteolítica de FAP a las concentraciones sometidas a prueba en el ensayo. Figura 18: evaluación del rendimiento de direccionamiento de IRDye750-conjugado 18 en obtención de imágenes por fluorescencia en el infrarrojo cercano de ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos HT-1080.hFAP y SK-RC-52.wt después de la administración intravenosa (dosis de 150 nmol/kg). Se presentan imágenes de órganos ex vivo a la 1 h. El compuesto ESV6-IRDye750 (18) se acumula de manera selectiva en el tumor HT-1080.hFAP que presenta expresión de FAP y no se acumula en SK-RC-52.wt.
Figura 19: (A) Evaluación del rendimiento de direccionamiento de conjugado 30 en ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos SK-RC-52.hFAP (costado derecho) y SK-RC-52.wt (costado izquierdo) después de la administración intravenosa (40 nmol). Se presentan imágenes de órganos ex vivo 1 h después de la administración. El compuesto se localiza de manera rápida, homogénea y selectiva in vivo en el tumor que presenta expresión de FAP 1 hora después de la inyección intravenosa, con una excelente selectividad de tumor con respecto a órganos. (B) Estructura de ESV6-Alexa Fluor 488 (30).
Figura 20: (A) Evaluación del rendimiento de direccionamiento de conjugado 30 en ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos HT-1080.hFAP (costado derecho) y SK-RC-52.wt (costado izquierdo) después de la administración intravenosa (40 nmol). Se presentan imágenes de órganos ex vivo 1 h después de la administración. El compuesto se localiza de manera rápida, homogénea y selectiva in vivo en el tumor que presenta expresión de FAP 1 hora después de la inyección intravenosa, con una excelente selectividad de tumor con respecto a órganos. (B) Estructura de ESV6-Alexa Fluor 488 (30).
Figura 21: (A) Evaluación de la actividad terapéutica de ESV6-ValCit-MMAE (21) y QCOH-ValCit-MMAE (19) en ratones que portan tumores SK-RC-52.hFAP. Los puntos de datos representan el volumen tumoral medio EEM (n = 4 por grupo). Los compuestos se administraron por vía intravenosa (inyección en la vena de la cola) comenzando en el día 8, durante 6 días consecutivos. ESV6-ValCit-MMAE (21), un derivado de conjugado de fármaco del ligando de alta afinidad de FAP “ESV6”, muestra un efecto antitumoral más potente en comparación con QCOOH-ValCit-MMAE (19), una versión no dirigida de la molécula. (B) Tolerabilidad de los diferentes tratamientos tal como se evalúa mediante la evaluación de los cambios (%) en peso corporal de los animales durante el experimento. (C) Estructuras de ESV6-ValCit-MMAE (21) y QCOOH-ValCit-MMAE (19).
Figura 22: (A) Evaluación de la actividad terapéutica de ESV6-ValCit-MMAE (21), L19-IL2 y su combinación en ratones que portan tumores SK-RC-52.hFAP. Los puntos de datos representan el volumen tumoral medio EEM (n = 4 por grupo). ESV6-ValCit-MMAE se administró por vía intravenosa (inyección en la vena de la cola) los días 8, 10, 12. L19-IL2 se administró por vía intravenosa (inyección en la vena de la cola) los días 9, 11, 13. ESV6-ValCit-MMAE combinado con L19-IL2 muestra un efecto antitumoral muy potente (4/4 con remisión tumoral completa) en comparación con L19-2 solo. (B) Tolerabilidad de los diferentes tratamientos tal como se evalúa mediante la evaluación de los cambios (%) en peso corporal de los animales durante el experimento.
Figura 23: experimento de biodistribución cuantitativa de conjugado molécula pequeña-fármaco ESV6-ValCit-MMAE (21) en ratones BALB/C nu/nu que portan SK-RC-52.hFAP en el costado derecho y SK-RC-52.wt en el costado izquierdo. El compuesto se acumula de manera selectiva en tumores SK-RC-52 positivos para FAP, (es decir, el 18% de DI/g en el sitio tumoral, 6 horas después de la administración intravenosa). En cambio, ESV6-ValCit-MMAE no se acumula en tumores SK-RC-52 de tipo natural negativos para FAP. La captación del conjugado en órganos sanos es insignificante (menor del 1% de DI/g).
Figura 24: estudio de estabilidad del conjugado 27 (que incluye una carga activa, 69Ga) en suero de ratón. Los perfiles de HPLC y CL/EM de la muestra procesada a las 0 y 6 horas después de la incubación muestran un único pico con la masa correcta (masa esperada: 1028,30. EM(ES+) m/z 514,3 (M+2H))
Figura 25: Estructura, perfil cromatográfico y análisis por CL/EM del conjugado 15. EM(ES+) m/z 1348,36 (M+1H)+.
Figura 26: Estructura, perfil cromatográfico y análisis por CL/EM de ESV6-ValCit-MMAE (21). EM(ES+) m/z 1118,05 (M+2H)2+.
Figura 27: Estructura, perfil cromatográfico y análisis por CL/EM de ESV6-DOTAGA (8). EM(ES+) m/z 960,39 (M+H)+.
Figura 28: Estructura, perfil cromatográfico y análisis por CL/EM del ejemplo 2, P4. EM(ES+) m/z 460,21 (M+H)+.
Descripción detallada de la invención
Los presentes inventores han identificado grupos de unión de molécula pequeña de proteína de activación de fibroblastos (FAP) que son adecuados para aplicaciones de direccionamiento. Los grupos de unión según la invención proporcionan alta inhibición de FAP, alta afinidad por FAP y/o son adecuados para la administración dirigida de una carga activa, tal como un agente terapéutico o diagnóstico, a un sitio afectado por o en riesgo de verse afectado por una enfermedad o un trastorno caracterizado por la sobreexpresión de FAP. Los grupos de unión según la presente invención forman un complejo estable con FAP, muestran una afinidad aumentada, una actividad inhibidora aumentada, una tasa de disociación a partir del complejo más lenta y/o una residencia prolongada en un sitio de la enfermedad. Los grupos de unión según la invención pueden tener además una razón de captación de tumor con respecto a hígado, tumor con respecto a riñón y/o tumor con respecto a intestino aumentada; un efecto antitumoral más potente (por ejemplo, medido por un aumento en el volumen tumoral medio) y/o una menor toxicidad (por ejemplo, tal como se evalúa mediante la evaluación de los cambios (%) en peso corporal). Los grupos de unión según la invención pueden tener además una afinidad alta o mejorada por la proteína de activación de fibroblastos humana y murina y/o reactividad cruzada con el antígeno murino. Los grupos de unión según la invención logran preferiblemente una unión celular específica de FAP; acumulación selectiva de FAP sobre la membrana celular; acumulación selectiva de FAP en el interior del citosol. Además, los grupos de unión según la invención pueden localizarse de manera preferible, rápida y homogénea en el sitio tumoral in vivo con una alta selectividad de tumor con respecto a órganos, en particular para melanoma y/o carcinoma de células renales. Los grupos de unión según la invención que comprenden una carga activa radiactiva (por ejemplo, 177Lu) logran preferiblemente una respuesta dependiente de la dosis, con una saturación de la diana alcanzada entre 250 nmol/kg y 500 nmol/kg, alcanzada y/o mantenida hasta 12 h, más preferiblemente de 1 a 9 h, aún más preferiblemente de 3 a 6 h después de la administración intravenosa.
Tal como se explicó anteriormente, la presente invención proporciona un compuesto, sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el compuesto comprende un resto A que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000007_0001
Tal como se explicó anteriormente, un compuesto según la presente invención puede estar representado por la fórmula I:
Figure imgf000007_0002
Fórmula I
En la misma, B es un enlace covalente o un resto que comprende una cadena de átomos que une covalentemente A y C; y C puede ser un átomo, una molécula o una partícula y/o es un agente terapéutico o diagnóstico.
Por consiguiente, un compuesto según la presente invención puede comprender un resto que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000008_0001
en la que B es un enlace covalente o un resto que comprende una cadena de átomos unidos covalentemente.
Resto A
Sin desear estar vinculados por una teoría, se contempla que estos sorprendentes efectos técnicos están asociados con la estructura particular del pequeño resto de unión A en el que el anillo de quinolina está sustituido en la posición 8 con un grupo que contiene nitrógeno, tal como un grupo amino o amido:
Figure imgf000008_0002
Previamente se ha mostrado que la mayor afinidad por proteína diana de un compuesto da como resultado una residencia tumoral más prolongada in vivo (Wichert et al., Nature Chemistry 7, 241-249 (2015)). Los compuestos de la presente invención tienen una afinidad aumentada, una tasa de disociación más lenta con respecto a FAP en comparación con los compuestos de la técnica anterior y, por tanto, también se considera que tienen una residencia prolongada en el sitio de la enfermedad a un nivel terapéutica o diagnósticamente relevante, preferiblemente más allá de 1 h, más preferiblemente más allá de 6 h tras la inyección. Preferiblemente, el mayor enriquecimiento se logra después de 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h o 6 h; y/o el enriquecimiento en el sitio de la enfermedad se mantiene en un nivel terapéutica o diagnósticamente relevante, a lo largo de un periodo de o al menos durante 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h o 6 h, más preferiblemente más allá de 6 h tras la inyección.
Preferiblemente, el resto de unión A tiene la siguiente estructura A1; más preferiblemente la siguiente estructura A2, en las que m es 0, 1,2, 3, 4 ó 5, preferiblemente 1:
Figure imgf000008_0003
Resto B
El resto B es un enlace covalente o un resto que comprende una cadena de átomos que une covalentemente A y la carga activa C, por ejemplo, a través de uno o más enlaces covalentes. El resto B puede ser un resto escindible o no escindible, bifuncional o multifuncional, que puede usarse para unir uno o más restos de carga activa y/o grupo de unión para formar el conjugado dirigido de la invención. En algunas realizaciones, la estructura del compuesto comprende, independientemente, más de un resto A, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 restos A; y/o más de un resto C, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 restos C, por molécula. Preferiblemente, la estructura del compuesto comprende 2 restos A y 1 resto C; o 1 resto A y 2 restos C, por molécula.
Cuando están presentes unidades de ligador escindibles dentro del resto B, los mecanismos de liberación pueden ser idénticos a los específicos de anticuerpos unidos a cargas activas citotóxicas. De hecho, la naturaleza de los restos de unión es independiente a ese respecto. Por tanto, se prevé la liberación dependiente del pH [Leamon, C.P. et al (2006) Bioconjugate Chem., 17, 1226; Casi, G. et al (2012) J. Am. Chem. Soc., 134, 5887], reductora [Bernardes, G.J. et al (2012) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 51.941; Yang, J. et al (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 13872] y enzimática [Doronina S.O. et al (2008) Bioconjugate Chem, 19, 1960; Sutherland, M.S.K. (2006) J. Biol. Chem, 281, 10540]. En una situación específica, cuando están presentes grupos funcionales o bien en el resto de unión o bien en las cargas activas (por ejemplo, tioles, alcoholes), puede establecerse una conexión sin ligador, liberando de ese modo cargas activas intactas, lo que simplifica sustancialmente el análisis farmacocinético.
El resto B puede comprender o consistir en una unidad mostrada en la tabla 1 a continuación, en la que los sustituyentes R y Rn mostrados en las fórmulas pueden seleccionarse de manera adecuada e independiente de H, halógeno, (hetero)alquilo, (hetero)alquenilo, (hetero)alquinilo, (hetero)arilo, (hetero)arilalquilo, (hetero)cicloalquilo, (hetero)cicloalquilarilo, heterociclilalquilo sustituidos o no sustituidos, un péptido, un oligosacárido o un grupo esteroideo. Preferiblemente, cada uno de R, Ri , R2 y R3 se selecciona independientemente de H, OH, SH, n H2, halógeno, ciano, carboxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo, cada uno de los cuales está sustituido o no sustituido. De manera adecuada, R y Rn se seleccionan independientemente de H, o alquilo o heteroalquilo C1-C7. De manera más adecuada, R y Rn se seleccionan independientemente de H, metilo o etilo.
Tabla 1
Figure imgf000009_0001
El resto B, la(s) unidad(es) BL y/o la(s) unidad(es) BS pueden comprender de manera adecuada, como enlace escindible, un enlace disulfuro puesto que estos enlaces son estables frente a la hidrólisis, al tiempo que proporcionan una cinética de liberación de fármaco adecuada en la diana in vivo, y pueden proporcionar una escisión sin trazador de los restos de fármaco que incluyen un grupo tiol.
El resto B, la(s) unidad(es) Bl y/o la(s) unidad(es) Bs pueden ser polares o estar cargados con el fin de mejorar la solubilidad en agua del conjugado. Por ejemplo, el ligador puede comprender desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20, de manera adecuada desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10, residuos de uno o más oligómeros solubles en agua conocidos tales como péptidos, oligosacáridos, glicosaminoglicanos, poli(ácido acrílico) o sales del mismo, polietilenglicol, poli((met)acrilatos de hidroxietilo), polisulfonatos, etc. De manera adecuada, el ligador puede comprender un resto peptídico polar o cargado que comprende, por ejemplo, desde 2 hasta 10 residuos de aminoácido. Los aminoácidos pueden referirse a cualquier aminoácido natural o no natural. El ligador peptídico incluye de manera adecuada un grupo tiol libre, preferiblemente una cisteína N-terminal, para formar dicho enlace disulfuro escindible con un grupo tiol en el resto de fármaco. Puede ser adecuado cualquier péptido que contiene L- o D-aminoácidos; ligadores peptídicos de este tipo particularmente adecuados son Asp-Arg-Asp-Cys y/o Asp-Lys-Asp-Cys.
En estas y otras realizaciones, el resto B, la(s) unidad(es) Bl y/o la(s) unidad(es) Bs pueden comprender una unidad peptídica escindible o no escindible que se diseña específicamente de modo que se escindirá de manera selectiva y enzimática a partir del resto de fármaco mediante una o más proteasas en la superficie celular o en las regiones extracelulares del tejido diana. La longitud de cadena de residuos de aminoácido de la unidad peptídica oscila de manera adecuada entre la de un único aminoácido y aproximadamente ocho residuos de aminoácido. Pueden diseñarse numerosas secuencias de péptido escindible específicas adecuadas para su uso en la presente invención y optimizarse en cuanto a su selectividad para la escisión enzimática mediante una enzima asociada a tumor particular, por ejemplo, una proteasa. Los péptidos escindibles para su uso en la presente invención incluyen aquellos que se optimizan hacia las proteasas MMP-1, 2 ó 3, o catepsina B, C o D. Son especialmente adecuados péptidos escindibles mediante catepsina B. La catepsina B es una cisteína proteasa ubicua. Es una enzima intracelular, excepto en estados patológicos, tales como tumores metastásicos o artritis reumatoide. Un ejemplo de un péptido escindible por catepsina B es el que contiene la secuencia Val-Cit.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el resto B y, en particular, la(s) unidad(es) Bl, comprenden además de manera adecuada un resto autoinmolable que puede estar presente o no después del ligador. Los ligadores autoinmolables también se conocen como ligadores de cascada electrónica. Estos ligadores experimentan una eliminación y fragmentación tras la escisión enzimática del péptido para liberar el fármaco en forma activa, preferiblemente libre. El conjugado es estable a nivel extracelular en ausencia de una enzima que pueda escindir el ligador. Sin embargo, tras la exposición a una enzima adecuada, el ligador se escinde iniciando una reacción autoinmolable espontánea que da como resultado la escisión del enlace que une covalentemente el resto autoinmolable y el fármaco, para efectuar de ese modo la liberación del fármaco en su forma no derivatizada o farmacológicamente activa. En estas realizaciones, el ligador autoinmolable se acopla con el resto de unión a través de una secuencia de péptido enzimáticamente escindible que proporciona un sustrato para que una enzima escinda el enlace amida para iniciar la reacción autoinmolable. De manera adecuada, el resto de fármaco está conectado al resto autoinmolable del ligador a través de un grupo funcional químicamente reactivo que sobresale del fármaco, tal como un grupo amina primaria o secundaria, hidroxilo, sulfhidrilo o carboxilo.
Ejemplos de ligadores autoinmolables son PABC o PAB (para-aminobenciloxicarbonilo), que une el resto de fármaco al resto de unión en el conjugado (Carl et al (1981) J. Med. Chem. 24: 479-480; Chakravarty et al (1983) J. Med. Chem. 26: 638-644). El enlace amida que une el extremo carboxi-terminal de una unidad peptídica y el paraaminobencilo de PAB puede ser un sustrato y ser escindible por determinadas proteasas. La amina aromática se convierte en electrodonadora e inicia una cascada electrónica que conduce a la expulsión del grupo saliente, que libera el fármaco libre después de la eliminación de dióxido de carbono (de Groot, et al (2001) Journal of Organic Chemistry 66 (26): 8815-8830). En el documento WO2005/082023 se describen ligadores autoinmolables adicionales.
En aún otras realizaciones, el ligador comprende un grupo glucuronilo que es escindible por la glucuronidasa presente en la superficie celular o en la región extracelular del tejido diana. Se ha mostrado que la betaglucuronidasa lisosómica se libera de manera extracelular a altas concentraciones locales en áreas necróticas en cánceres humanos, y que esto proporciona una vía para la quimioterapia dirigida (Bosslet, K. et al. Cancer Res. 58, 1195-1201 (1998)).
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el resto B comprende además de manera adecuada una unidad espaciadora. Una unidad espaciadora puede ser la unidad BS , que puede estar unida al resto de unión A, por ejemplo, a través de un enlace amida, amina o tioéter. La unidad espaciadora tiene una longitud que permite, por ejemplo, que la secuencia de péptido escindible entre en contacto con la enzima de escisión (por ejemplo, catepsina B) y, de manera adecuada, también la hidrólisis del enlace amida que acopla el péptido escindible con el resto autoinmolable X. Las unidades espaciadoras pueden comprender, por ejemplo, un radical divalente tal como alquileno, arileno, un heteroarileno, unidades de repetición de alquiloxilo (por ejemplo, polietilenoxilo, PEG, polimetilenoxilo) y alquilamino (por ejemplo, polietilenamino), o éster de diácido y amidas incluyendo succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida.
En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, * representa un punto de unión al resto A o un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto A comprende menos átomos que la de •, según sea el caso; y • representa un punto de unión un punto de unión al resto C o un punto de unión al resto C para el cual la trayectoria más corta hacia el resto C comprende menos átomos que la de *, según sea el caso. Lo mismo también se aplica para casos en los que está presente un resto reactivo L en lugar del resto de carga activa C. Todas las siguientes notaciones tienen el significado de un punto de unión de un determinado grupo o átomo (por ejemplo, R) a un resto adicional:
Figure imgf000011_0001
Si la estructura de relevancia es un monómero u oligómero peptídico, cada * representa un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto A comprende menos átomos que la de •; y cada • representa un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto C comprende menos átomos que la de *, con la condición de que cuando n es > 1 y se indica un punto de unión respectivo en uno cualquiera de Ra, Rb y Rc, entonces puede estar independientemente en una o más de las unidades monoméricas peptídicas, preferiblemente en la unidad monomérica peptídica más distante del otro punto de unión indicado en la estructura respectiva.
En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, los términos “péptido”, “dipéptido”, “tripéptido”, “tetrapéptido”, etc., se refieren a monómeros u oligómeros peptídicos que tienen una estructura principal formada por aminoácidos proteinogénicos y/o no proteinogénicos. Tal como se usa en el presente documento, los términos “aminoacilo” o “aminoácido” se refieren generalmente a cualquier aminoácido proteinogénico o no proteinogénico. Preferiblemente, en cualquiera de las realizaciones dadas a conocer en el presente documento, los residuos de cadena lateral de un aminoácido proteinogénico o no proteinogénico están representados por cualquiera de Ra, Rb y Rc, cada uno de los cuales se selecciona de la siguiente lista:
Figure imgf000011_0002
Figure imgf000012_0001
en las que cada uno de R, R1, R2 y R3 se selecciona independientemente de H, OH, SH, NH2, halógeno, ciano, carboxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo, cada uno de los cuales está sustituido o no sustituido;
cada X se selecciona independientemente de NH, NR, S, O y CH2, preferiblemente NH; y
cada n y m es independientemente un número entero preferiblemente seleccionado de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y20.
Preferiblemente, en cualquiera de las realizaciones dadas a conocer en el presente documento, los residuos de cadena lateral de un aminoácido proteinogénico o no proteinogénico están representado por cualquiera de Ra, Rb y Rc,
cada uno de los cuales puede formar parte de un anillo de 3, 4, 5, 6 ó 7 miembros. Por ejemplo, la posición alfa, beta y/o gamma de la cadena lateral de dicho aminoácido proteinogénico o no proteinogénico puede formar parte de una estructura cíclica seleccionada de un anillo de azetidina, un anillo de pirrolidina y un anillo de piperidina, tal como en los siguientes aminoácidos (prolina e hidroxiprolina):
Figure imgf000012_0002
o
cada uno de los cuales puede formar parte independientemente de una estructura insaturada (es decir, en la que está ausente el átomo de H geminal al grupo Ra, Rb y Rc respectivo), por ejemplo:
Figure imgf000012_0003
Pueden seleccionarse aminoácidos no proteinogénicos preferibles adicionales de la siguiente lista:
Figure imgf000012_0004
En las reivindicaciones adjuntas se muestran realizaciones particularmente preferidas para el resto B, así como el compuesto según la presente invención.
Preferiblemente, B está representado por cualquiera de las siguientes fórmulas generales II-V, en las que:
Figure imgf000013_0001
Fórmula IV Fórmula V
cada x es un número entero independientemente seleccionado del intervalo de 0 a 100, preferiblemente de 0 a 50, más preferiblemente de 0 a 30, aún más preferiblemente seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20;
cada y es un número entero independientemente seleccionado del intervalo de 0 a 30, preferiblemente seleccionado de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20;
cada z es un número entero independientemente seleccionado del intervalo de 0 a 5, preferiblemente seleccionado de seleccionado de 0, 1, 2, 3 y 4; y
* representa un punto de unión al resto A; y
• representa un punto de unión al resto C, en las que:
(a) Bs y/o Bl es un grupo que comprende o que consiste en una unidad estructural independientemente seleccionada del grupo que consiste en alquileno, cicloalquileno, arilalquileno, heteroarilalquileno, heteroalquileno, heterocicloalquileno, alquenileno, cicloalquenileno, arilalquenileno, heteroarilalquenileno, heteroalquenileno, heterocicloalenquileno, alquinileno, heteroalquinileno, arileno, heteroarileno, aminoacilo, oxialquileno, aminoalquileno, éster de diácido, dialquilsiloxano, amida, tioamida, tioéter, tioéster, éster, carbamato, hidrazona, tiazolidina, carbamato de metilenalcoxilo, disulfuro, vinileno, imina, imidamida, fosforamida, sacárido, éster fosfato, fosforamida, carbamato, dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, cada uno de los cuales está sustituido o no sustituido; y/o (b) BS y/o BL es un grupo que comprende o que consiste en una unidad estructural independientemente seleccionada del grupo que consiste en:
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
en las que cada uno de R, R1, R2 y R3 se selecciona independientemente de H, OH, SH, NH2, halógeno, ciano, carboxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo, cada uno de los cuales está sustituido o no sustituido;
cada uno de R4 y R5 se selecciona independientemente de alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo, cada uno de los cuales está sustituido o no sustituido;
cada uno de Ra, Rb y Rc se selecciona independientemente de residuos de cadena lateral de un aminoácido proteinogénico o no proteinogénico, cada uno de los cuales puede estar adicionalmente sustituido;
cada X se selecciona independientemente de NH, NR, S, O y CH2, preferiblemente NH;
cada uno de n y m es independientemente un número entero desde 0 hasta 100, preferiblemente desde 0 hasta 50, más preferiblemente desde 0 hasta 30, aún más preferiblemente seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y20; y
en las que cada * representa un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto A comprende menos átomos que la de •; y cada • representa un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto C comprende menos átomos que la de *; y/o
(c) uno o más BL independientemente comprende o consiste en una o más de las siguientes unidades estructurales:
Figure imgf000018_0001
cada * representa un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto A comprende menos átomos que la de •; y cada • representa un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto C comprende menos átomos que la de *, con la condición de que cuando n es > 1 y se indica un punto de unión respectivo en uno cualquiera de Ra, Rb y Rc, entonces puede estar presente independientemente en una o más de las unidades monoméricas peptídicas, preferiblemente en la unidad monomérica peptídica más distante del otro punto de unión indicado en la estructura respectiva; y/o
(d) uno o más de BL y BS se selecciona independientemente de las siguientes estructuras:
Figure imgf000018_0002
en las que cada * representa un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto A comprende menos átomos que la de •; y cada • representa un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto C comprende menos átomos que la de *; y/o
(e) y es 1, 2 ó 3; y/o al menos un BL comprende además un grupo de ligador escindible independientemente seleccionado de las siguientes estructuras:
Figure imgf000018_0003
Figure imgf000019_0001
cada * representa un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto A comprende menos átomos que la de •; y cada • representa un punto de unión para el cual la trayectoria más corta hacia el resto C comprende menos átomos que la de *.
Preferiblemente, B puede definirse tal como anteriormente y/o tener la siguiente estructura:
Figure imgf000019_0002
en la que B’s y B”s se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000019_0003
cada Bl se selecciona independientemente del grupo que consiste en:
Figure imgf000019_0004
Figure imgf000020_0001
cada n es 0, 1,2, 3, 4 ó 5;
cada m es 0, 1,2, 3, 4 ó 5;
cada x ’ es 0, 1 ó 2;
cada x” es 0, 1 ó 2;
cada y es 0, 1 ó 2; y
z es 1 ó 2,
en las que R, R1, R2, R3, Ra, Rb, Rc, X, * y son tal como se definieron anteriormente.
Más preferiblemente, el compuesto según la invención tiene una estructura representada por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Resto C
El resto C en la presente invención representa una carga activa, que puede ser generalmente cualquier átomo (incluyendo H), molécula o partícula. Preferiblemente, el resto C no es un átomo de hidrógeno.
La carga activa puede ser un agente quelante para radiomarcaje. De manera adecuada, no se libera el radionúclido. Los expertos en la técnica conocen bien los agentes quelantes y, por ejemplo, incluyen agentes quelantes tales como azufre coloidal, ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N’,N”,N” -tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododececano,N-(ácido glutárico)-N’,N”,N’’’-triacético (DOTAGA), ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,N’,N”-triacético (NOTA), ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-N,N’,N”,N’’’-tetraacético (TETA), o cualquiera de las estructuras de agente quelante preferidas enumeradas en las reivindicaciones adjuntas.
La carga activa puede ser un grupo radiactivo que comprende o que consiste en un radioisótopo, incluyendo isótopos tales como 223Ra, 89Sr, 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111In, 97Ru, 62Cu 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 123I, 124I, 125I, 131I, 18F, 211At, 225Ac, 89Sr, 225Ac, 117mSn y 169E.
Preferiblemente, se usan emisores de positrones, tales como 18F y 124I, o emisores de radiación gamma, tales como 99mTc, 111In y 123I, para aplicaciones diagnósticas (por ejemplo, para TEP), aunque se usan preferiblemente emisores de radiación beta, tales como 89Sr, 131I y 177Lu, para aplicaciones terapéuticas. También pueden usarse emisores de radiación alfa, tales como 211At, 225Ac y 223Ra, para terapia. En una realización preferida, el radioisótopo es 89Sr o 223Ra. En una realización preferida adicional, el radioisótopo es 68Ga.
La carga activa puede ser un quelato de un isótopo radiactivo, preferiblemente de un isótopo enumerado anteriormente, con un agente quelante, preferiblemente un agente quelante enumerado anteriormente o cualquiera de las estructuras de agente quelante preferidas enumeradas en la reivindicación adjunta 9 (a); o un grupo seleccionado de las estructuras enumeradas en la reivindicación 9 (c).
La carga activa puede ser un grupo fluoróforo, preferiblemente seleccionado de un colorante de xanteno, colorante de acridina, colorante de oxazina, colorante de cianina, colorante de estirilo, colorante de cumarina, colorante de porfina, complejo metal-ligando fluorescente, proteína fluorescente, nanocristales, colorante de perileno, colorante de boro-dipirrometeno y colorante de ftalocianina, más preferiblemente seleccionado de las estructuras enumeradas en la reivindicación 9 (d).
La carga activa puede ser un agente citotóxico y/o citostático. Tales agentes pueden inhibir o impedir la función de células y/o provocar la destrucción de células. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen isótopos radiactivos, agentes quimioterápicos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo análogos sintéticos y derivados de los mismos. El agente citotóxico puede seleccionarse del grupo que consiste en una auristatina, un agente de unión al surco menor del ADN, un agente alquilante del surco menor del ADN, una enediína, una lexitropsina, una duocarmicina, un taxano, una puromicina, una dolastatina, un maitansinoide y un alcaloide de la vinca, o una combinación de dos o más de los mismos. Los restos de carga activa citotóxicos y/o citostáticos se enumeran en la reivindicación 9 (e).
En una realización, la carga activa es un agente quimioterápico seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de topoisomerasa, un agente alquilante (por ejemplo, mostazas de nitrógeno; etilenimas; alquilsulfonatos; triazenos; piperazinas; y nitrosoureas), un antimetabolito (por ejemplo, mercaptopurina, tioguanina, 5-fluorouracilo), un antibiótico (por ejemplo, antraciclinas, dactinomicina, bleomicina, adriamicina, mitramicina, dactinomicina), un interruptor mitótico (por ejemplo, alcaloides vegetales, tales como vincristina, y/o antagonistas de microtúbulos, tales como paclitaxel), un agente de metilación del ADN, un agente de intercalación del ADN (por ejemplo, carboplatino y/o cisplatino, daunomicina y/o doxorubicina y/o bleomicina y/o talidomida), un inhibidor de la síntesis de a Dn , un regulador de la transcripción de ADN-ARN, un inhibidor enzimático, un regulador génico, un modificador de la respuesta hormonal, una citotoxina selectiva de hipoxia (por ejemplo, tirapazamina), un inhibidor del factor de crecimiento epidérmico, un agente antivascular (por ejemplo, xantenona, ácido 5,6-dimetilxantenona-4-acético), un profármaco activado por radiación (por ejemplo, sales de nitroarilmetilo cuaternario (NMQ)) o un fármaco biorreductor, o una combinación de dos o más de los mismos. En algunas realizaciones, la carga activa (es decir, el resto C) no se deriva de una antraciclina, preferiblemente no se deriva de PNU 159682.
El agente quimioterápico puede seleccionarse del grupo que consiste en erlotinib (TARCEVA®), bortezomib (VELCADE®), fulvestrant (FASLODEX®), sutent (SU11248), letrozol (FEMARA®), mesilato de imatinib (GLEEVEC®), PTK787/ZK 222584, oxaliplatino (Eloxatin®.), 5-FU (5-fluorouracilo), leucovorina, rapamicina (sirolimús, RAPAMUNE®), lapatinib (GSK572016), lonafarnib (SCH 66336), sorafenib (BAY43-9006) y gefitinib (IRESSA®), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), o una combinación de dos o más de los mismos.
El agente quimioterápico puede ser un agente alquilante, tal como tiotepa, CYTOXAN® y/o ciclosfosfamida; un alquilsulfonato, tal como busulfán, improsulfán y/o piposulfán; una aziridina, tal como benzodopa, carbocuona, meturedopa y/o uredopa; etileniminas y/o metilamelaminas, tal como altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y/o trimetilomelamina; acetogenina, tal como bulatacina y/o bulatacinona; camptotecina; briostatina; calistatina; criptoficinas; dolastatina; duocarmicina; eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiína; espongistatina; mostazas de nitrógeno, tales como mostaza de clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida y/o uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y/o ranimnustina; dinemicina; bisfosfonatos, tales como clodronato;
una esperamicina; un cromóforo de neocarcinostatina; aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN®, doxorubicina, tal como morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y/o desoxidoxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diacicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucida; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; depsipéptidos macrocíclicos, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; razoxana; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triacicuona; 2,2',2”-triclorotrietilamina; tricotecenos, tales como verracurina A, roridina A y/o anguidina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido; ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, tales como TAXOL®, paclitaxel, abraxano y/o TAXOTERE®, docetaxel; clorambucilo; GEMZAR®, gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE®, vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; Xeloda; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos, derivados o combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores.
La carga activa puede ser un interruptor de tubulina, incluyendo, pero sin limitarse a: taxanos, tales como paclitaxel y docetaxel, alcaloides de la vinca, discodermolida, epotilonas A y B, desoxiepotilona, criptoficinas, curacina A, combretastatina A-4-fosfato, BMS 247550, BMS 184476, BMS 188791; LEP, RPR 109881A, EPO 906, TXD 258, ZD 6126, vinflunina, LU 103793, dolastatina 10, E7010, T138067 y T900607, colquicina, fenstatina, chalconas, indanocina, T138067, oncocidina, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vinflunina, halicondrina B, isohomohalicondrina B, ER-86526, pironetina, espongistatina 1, spiket P, criptoficina 1, LU103793 (cematodina o cemadotina), rizoxina, sarcodictiína, eleuterobina, laulilamida, VP-16 y D-24851, y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos, derivados o combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores.
La carga activa puede ser un agente de intercalación del ADN, incluyendo, pero sin limitarse a: acridinas, actinomicinas, antraciclinas, benzotiopiranoindazoles, pixantrona, crisnatol, brostalicina, CI-958, doxorubicina (adriamicina), actinomicina D, daunorubicina (daunomicina), bleomicina, idarubicina, mitoxantrona, ciclofosfamida, melfalán, mitomicina C, bizelesina, etopósido, mitoxantrona, SN-38, carboplatino, cisplatino, actinomicina D, amsacrina, DACA, pirazoloacridina, irinotecán y topotecán, y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos, derivados o combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores.
La carga activa puede ser un agente antihormonal que actúa para regular o inhibir la acción hormonal en tumores, tal como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos, incluyendo, pero sin limitarse a, tamoxifeno, raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y/o farestona toremifeno, y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos, derivados o combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores. La carga activa puede ser un inhibidor de aromatasa que inhibe la aromatasa enzimática, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tal como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol, AROMASIN®, exemestano, formestano, fadrozol, RIVISOR®, vorozol, FEMARA®, letrozol y ARIMIDAX® y/o anastrozol, y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos, derivados o combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores.
La carga activa puede ser un antiandrógeno tal como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, goserelina y/o troxacitabina, y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos, derivados o combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores.
La carga activa puede ser una proteína o un anticuerpo. Preferiblemente, la carga activa es una citocina (por ejemplo, una interleucina tal como IL2, IL10, IL12, IL15; un miembro de la superfamilia de TNF; o un interferón tal como interferón gamma).
Puede usarse cualquier carga activa en forma modificada o no modificada. Pueden usarse combinaciones de cargas activas en las que algunas no están modificadas y algunas están modificadas. Por ejemplo, la carga activa puede estar químicamente modificada. Una forma de modificación química es la derivatización de un grupo carbonilo, tal como un aldehído.
En una realización preferida, el resto C es una auristatina (es decir, que tiene una estructura derivada de un miembro de la familia de compuestos de auristatina) o un derivado de auristatina. Más preferiblemente, el resto C tiene una estructura según la siguiente fórmula:
Figure imgf000026_0001
en la que:
R1d es independientemente H o alquilo C1-C6; preferiblemente H o CH3;
R2d es independientemente alquilo C1-C6; preferiblemente CH3 o iPr;
R3d es independientemente H o alquilo C1-C6; preferiblemente H o CH3;
R4d es independientemente H, alquilo C1-C6, COO(alquilo C1-C6), CON(H o alquilo C1-C6), arilo C3-C10 o heteroarilo C3-C10; preferiblemente H, CH3, COOH, Co Oc H3 o tiazolilo;
R5d es independientemente H, OH, alquilo C1-C6; preferiblemente H u OH; y
R6d es independientemente arilo C3-C10 o heteroarilo C3-C10; preferiblemente fenilo o piridilo opcionalmente sustituidos.
Más preferiblemente, el resto C se deriva de MMAE o MMAF.
En una realización preferida, el resto C tiene una estructura según la siguiente fórmula:
Figure imgf000026_0002
en la que:
n es 0, 1,2, 3, 4 ó 5; preferiblemente 1;
R1e es independientemente H, COOH, aril-COOH o heteroaril-COOH; preferiblemente COOH;
R2e es independientemente H, COOH, aril-COOH o heteroaril-COOH; preferiblemente COOH;
cada R3e es independientemente H, COOH, aril-COOH o heteroaril-COOH; preferiblemente COOH;
R4e es independientemente H, COOH, aril-COOH o heteroaril-COOH; preferiblemente COOH; y
X es O, NH o S; preferiblemente O.
En una realización preferida, el resto C tiene una estructura según la siguiente fórmula:
Figure imgf000026_0003
en la que:
n es 0, 1,2, 3, 4 ó 5; preferiblemente 1
R1f es independientemente H, COOH, aril-COOH o heteroaril-COOH; preferiblemente COOH;
R2f es independientemente H, COOH, aril-COOH o heteroaril-COOH; preferiblemente COOH;
R3f es independientemente H, COOH, aril-COOH o heteroaril-COOH; preferiblemente COOH; y
X es O, NH o S; preferiblemente O
En las reivindicaciones adjuntas se muestran realizaciones particularmente preferidas para el resto C, así como el compuesto según la presente invención.
Los compuestos preferidos son aquellos que tienen una estructura según la reivindicación adjunta 1 o la tabla 3, sus diastereoisómeros individuales, hidratos, solvatos, formas cristalinas, tautómeros individuales o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Aspectos adicionales
En un aspecto, en el presente documento se da a conocer un compuesto de fórmula general I tal como se definió anteriormente, sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que: A es un resto de unión que tiene la estructura tal como se definió anteriormente; B es un enlace covalente o un resto que comprende una cadena de átomos que une covalentemente los restos A y C; y C es un resto de carga activa.
En un aspecto adicional, B está representado por cualquiera de las fórmulas generales II-V tal como se definieron anteriormente, en las que cada Bs representa independientemente un grupo espaciador; cada Bl representa independientemente un grupo de ligador escindible o no escindible; cada x es un número entero independientemente seleccionado del intervalo de 0 a 100, preferiblemente de 0 a 50, más preferiblemente de 0 a 30, aún más preferiblemente seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20; cada y es un número entero independientemente seleccionado del intervalo de 0 a 30, preferiblemente seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20; cada z es un número entero independientemente seleccionado del intervalo de 0 a 5, preferiblemente seleccionado de seleccionado de 0, 1, 2, 3 y 4; y * representa un punto de unión al resto A; y • representa un punto de unión al resto C.
En un aspecto adicional según cualquiera de los aspectos anteriores, el resto de unión tiene la estructura A1 tal como se definió anteriormente.
En un aspecto adicional según cualquiera de los aspectos anteriores, Bs y/o Bl es un grupo que comprende o que consiste en una unidad estructural independientemente seleccionada del grupo que consiste en alquileno, cicloalquileno, arilalquileno, heteroarilalquileno, heteroalquileno, heterocicloalquileno, alquenileno, cicloalquenileno, arilalquenileno, heteroarilalquenileno, heteroalquenileno, heterocicloalenquileno, alquinileno, heteroalquinileno, arileno, heteroarileno, aminoacilo, oxialquileno, aminoalquileno, éster de diácido, dialquilsiloxano, amida, tioamida, tioéter, tioéster, éster, carbamato, hidrazona, tiazolidina, carbamato de metilenalcoxilo, disulfuro, vinileno, imina, imidamida, fosforamida, sacárido, éster de fosfato, fosforamida, carbamato, dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, cada uno de los cuales está sustituido o no sustituido.
En un aspecto adicional según cualquiera de los aspectos anteriores, Bs y/o Bl es un grupo definido como en la reivindicación adjunta 5 (b). En un aspecto preferido según cualquiera de los aspectos anteriores, uno o más Bl se definen como en la reivindicación adjunta 5 (c). En un aspecto preferido según cualquiera de los aspectos anteriores, uno o más de Bl y Bs se definen como en la reivindicación adjunta 5 (d). En un aspecto preferido según cualquiera de los aspectos anteriores, y es 1, 2 ó 3; y/o al menos un Bl se define como en la reivindicación adjunta 5 (e). En un aspecto preferido según cualquiera de los aspectos anteriores, B se define como en la reivindicación adjunta 6. En un aspecto adicional según cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto se define como en la reivindicación adjunta 7.
En un aspecto adicional según cualquiera de los aspectos anteriores, el resto C es tal como se define en la reivindicación adjunta 8 y/o 9.
En un aspecto adicional según cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto tiene una estructura seleccionada de las siguientes: conjugado 1; conjugado 2; conjugado 3; conjugado 4; conjugado 5; conjugado 6; conjugado 7; conjugado 8; conjugado 9; conjugado 10; conjugado 11; conjugado 12; conjugado 13; conjugado 14; conjugado 15; y ESV6-fluo.
También se da a conocer una composición farmacéutica que comprende el compuesto según cualquiera de los aspectos anteriores y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal composición farmacéutica también se da a conocer para su uso en: (a) un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia o un método diagnóstico practicado sobre el cuerpo humano o animal; o (b) un método para la terapia o profilaxis de un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno; o (c) un método para la cirugía guiada practicada sobre un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno; o (d) un método para el diagnóstico de una enfermedad o un trastorno, practicándose el método sobre el cuerpo humano o animal e implicando una técnica de obtención de imágenes de medicina nuclear, tal como tomografía por emisión de positrones (TEP) o tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT); o (e) un método para la administración dirigida de un agente terapéutico o diagnóstico a un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno, en la que, en cada uno de los puntos (b)-(e) anteriores, dicha enfermedad o dicho trastorno se selecciona independientemente de cáncer, inflamación, ateroesclerosis, fibrosis, remodelación tisular y trastorno queloide, preferiblemente en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de intestino delgado, cáncer de colon, cáncer de colon resistente a múltiples fármacos, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer colorrectal metastásico, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer hepatocelular, cáncer de esófago, cáncer de hipofaringe, cáncer de nasofaringe, cáncer de laringe, células de mieloma, cáncer de vejiga, colangiocarcinoma, carcinoma renal de células claras, tumor neuroendocrino, osteomalacia oncogénica, sarcoma, COPD (carcinoma de origen primario desconocido), cáncer de timo, tumores desmoides, glioma, astrocitoma, cáncer de cuello uterino y cáncer de próstata; preferiblemente en la que el compuesto tiene una residencia prolongada en el sitio de la enfermedad a un nivel terapéutica o diagnósticamente relevante, preferiblemente más allá de 1 h, más preferiblemente más allá de 6 h tras la inyección.
Tratamiento
Los compuestos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar una enfermedad. El tratamiento puede ser tratamiento terapéutico y/o profiláctico, siendo el objetivo prevenir, reducir o detener un trastorno o cambio fisiológico no deseado. El tratamiento puede prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe el tratamiento.
La enfermedad que se trata mediante el compuesto puede ser cualquier enfermedad que pueda beneficiarse del tratamiento. Esta incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos, incluyendo aquellos estados patológicos que predisponen al trastorno.
El término “cáncer” y “canceroso” se usa en su sentido más amplio para referirse a una condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular desregulado. Un tumor comprende una o más células cancerosas.
Cuando se trata un cáncer, el efecto terapéutico que se observa puede ser una reducción en el número de células cancerosas; una reducción en el tamaño tumoral; inhibición o retardo de la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibición del crecimiento tumoral; y/o alivio de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer.
En modelos animales, la eficacia puede evaluarse mediante mediciones físicas del tumor durante el tratamiento y/o determinando la remisión parcial y completa del cáncer. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia puede medirse, por ejemplo, evaluando el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) y/o determinando la tasa de respuesta (RR).
En las reivindicaciones adjuntas se muestran realizaciones particularmente preferidas para los métodos de tratamiento relacionados con la presente invención.
En el presente documento también se dan a conocer métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal, por ejemplo, mediante cirugía o terapia, o un método diagnóstico practicado sobre el cuerpo humano o animal, implicando los métodos una etapa de administrar una cantidad terapéutica o diagnósticamente eficaz de un compuesto o una composición farmacéutica tal como se describe en el presente documento a un sujeto que lo necesita. Más específicamente, en el presente documento se dan a conocer métodos para el tratamiento, por ejemplo, mediante terapia o profilaxis, de un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno; o mediante cirugía guiada practicada sobre un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno; un método para el diagnóstico de una enfermedad o un trastorno, por ejemplo, un método diagnóstico practicado sobre el cuerpo humano o animal y/o que implica una técnica de obtención de imágenes de medicina nuclear, tal como tomografía por emisión de positrones (TEP) o tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT); un método para la administración dirigida de un agente terapéutico o diagnóstico a un sujeto que padece o que tiene riesgo de padecer una enfermedad o un trastorno. En los métodos anteriormente mencionados, dicha enfermedad o dicho trastorno puede seleccionarse independientemente de cáncer, inflamación, ateroesclerosis, fibrosis, remodelación tisular y trastorno queloide, preferiblemente en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de intestino delgado, cáncer de colon, cáncer de colon resistente a múltiples fármacos, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer colorrectal metastásico, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer hepatocelular, cáncer de esófago, cáncer de hipofaringe, cáncer de nasofaringe, cáncer de laringe, células de mieloma, cáncer de vejiga, colangiocarcinoma, carcinoma renal de células claras, tumor neuroendocrino, osteomalacia oncogénica, sarcoma, COPD (carcinoma de origen primario desconocido), cáncer de timo, tumores desmoides, glioma, astrocitoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de riñón y cáncer de próstata. Cuando se usa en los métodos dados a conocer en el presente documento, el compuesto tiene una residencia prolongada en el sitio de la enfermedad a un nivel terapéutica o diagnósticamente relevante, preferiblemente más allá de 1 h, más preferiblemente más allá de 6 h tras la inyección.
Composiciones farmacéuticas
Los compuestos descritos en el presente documento pueden estar en forma de composiciones farmacéuticas que pueden ser para uso en seres humanos o animales en medicina humana y veterinaria, y comprenderán normalmente uno cualquiera o más de un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En la técnica farmacéutica se conocen bien los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede realizarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica convencional. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además del, portador, excipiente o diluyente cualquier grupo de unión, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante adecuado.
Pueden proporcionarse conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes aromatizantes en la composición farmacéutica. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres del ácido phidroxibenzoico. También pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión.
Puede haber diferentes requisitos de composición/formulación dependiendo de los diferentes sistemas de administración. A modo de ejemplo, la composición farmacéutica puede formularse para su administración usando una minibomba o por vía mucosa, por ejemplo, como un pulverizador o aerosol nasal para inhalación o una disolución ingerible, o por vía parenteral, en la que la composición se formula como una forma inyectable, para la administración mediante, por ejemplo, una vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Alternativamente, la formulación puede diseñarse para su administración a través de varias vías.
Si el agente va a administrarse por vía mucosa a través de la mucosa gastrointestinal, debe poder permanecer estable durante el tránsito a través del tracto gastrointestinal; por ejemplo, debe ser resistente frente a la degradación proteolítica, estable al pH ácido y resistente frente a los efectos detergentes de la bilis.
Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante inhalación, en forma de un supositorio u óvulo vaginal, por vía tópica en forma de una loción, una disolución, una crema, una pomada o polvo de pulverización, mediante el uso de un parche cutáneo, por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos, o bien solos o bien en mezcla conjunta con excipientes, o en forma de elixires, disoluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes o colorantes, o las composiciones farmacéuticas pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para la administración parenteral, las composiciones pueden usarse mejor en forma de una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o monosacáridos para hacer que la disolución sea isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas que pueden formularse de manera convencional.
El compuesto de la presente invención puede administrarse en forma de una sal farmacéuticamente aceptable o activa. Los expertos en la técnica conocen bien las sales farmacéuticamente aceptables y, por ejemplo, incluyen las mencionadas por Berge et al, en J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977). Las sales incluyen, pero no se limitan a, las sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Las vías de administración (suministro) pueden incluir, pero no se limitan a, una o más de oral (por ejemplo, como comprimido, cápsula o disolución ingerible), tópica, mucosa (por ejemplo, como pulverizador o aerosol nasal para inhalación), nasal, parenteral (por ejemplo, mediante una forma inyectable), gastrointestinal, intraespinal, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intrauterina, intraocular, intradérmica, intracraneal, intratraqueal, intravaginal, intracerebroventricular, intracerebral, subcutánea, oftálmica (incluyendo intravítrea o intracameral), transdérmica, rectal, bucal, vaginal, epidural, sublingual.
Normalmente, un médico determinará la dosificación real que será más adecuada para un sujeto individual. Pueden variarse el nivel específico de dosis y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente particular y dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese compuesto, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el modo y el momento de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad del estado particular y el individuo que se somete a la terapia.
Las formulaciones pueden envasarse en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en una condición secada por congelación (liofilizada) que sólo requiere la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua, para su administración. Las disoluciones y suspensiones para inyección extemporáneas se preparan a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles de la clase previamente descrita. Las formulaciones de dosificación unitaria a modo de ejemplo contienen una dosis diaria o una subdosis diaria unitaria, o una fracción apropiada de las mismas, del principio activo.
Compuestos precursores
En un aspecto de la invención, en el presente documento se da a conocer un compuesto, sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal del mismo, en el que el compuesto (compuesto precursor) comprende un resto A y un resto reactivo L que puede reaccionar y formar un enlace covalente con una pareja de conjugación. Tras la conjugación (es decir, reacción y formación de un enlace covalente), este compuesto precursor se une a esta pareja de conjugación, que a su vez se une a un resto de carga activa C. La pareja de conjugación puede ser un átomo, una molécula, una partícula, un agente terapéutico y/o un agente diagnóstico. Preferiblemente, la conjugación es un agente terapéutico y/o agente diagnóstico, y puede corresponder a los restos de carga activa ya descritos con detalle anteriormente con respecto a los conjugados según la invención.
Preferiblemente, el compuesto precursor comprende un resto que tiene la estructura:
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en la que B es un enlace covalente o un resto que comprende una cadena de átomos unidos covalentemente.
El compuesto precursor puede estar representado por la siguiente fórmula VI:
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Fórmula VI
en la que B es un enlace covalente o un resto que comprende una cadena de átomos que une covalentemente A y L.
El resto Atiene preferiblemente la estructura A1 o A2, en las que m es 0, 1,2, 3, 4 ó 5.
El resto B tiene preferiblemente la misma estructura tal como se describió con detalle anteriormente con respecto a los conjugados según la invención.
Preferiblemente, el resto L puede formar, tras la reacción, un grupo de unión de amida, éster, carbamato, hidrazona, tiazolidina, carbamato de metilenalcoxilo, disulfuro, alquileno, cicloalquileno, arilalquileno, heteroarilalquileno, heteroalquileno, heterocicloalquileno, alquenileno, cicloalquenileno, arilalquenileno, heteroarilalquenileno, heteroalquenileno, heterocicloalenquileno, alquinileno, heteroalquinileno, arileno, heteroarileno, aminoacilo, oxialquileno, aminoalquileno, éster de diácido, dialquilsiloxano, amida, tioamida, tioéter, tioéster, éster, carbamato, hidrazona, tiazolidina, carbamato de metilenalcoxilo, disulfuro, vinileno, imina, imidamida, fosforamida, sacárido, éster de fosfato, fosforamida, carbamato, dipéptido, tripéptido o tetrapéptido. Tal como apreciará un experto en la técnica, existen múltiples posibilidades de cómo proporcionar un grupo reactivo que pueda reaccionar con una pareja de conjugación para formar un grupo de unión según la lista anteriormente mencionada, y todas ellas están abarcadas por la presente divulgación.
El resto B puede ser un resto escindible o no escindible, bifuncional o multifuncional, que puede usarse para unir uno o más restos reactivos y/o de grupo de unión para formar el precursor de conjugado de la invención. En algunas realizaciones, la estructura del compuesto comprende, independientemente, más de un resto A, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 restos A; y/o más de un resto L, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 restos L, por molécula. Preferiblemente, la estructura del compuesto comprende 2 restos A y 1 resto L; o 1 resto A y 2 restos L, por molécula.
El resto L se selecciona preferiblemente de: H, NH2, N3, COOH, SH, Hal,
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en las que cada n es, independientemente, 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; cada m es, independientemente, 0, 1,2, 3, 4 ó 5; cada Hal es F, Cl, Br o I; y cada R4 se selecciona independientemente de carboxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo, en los que cada uno de los anteriores está sustituido o no sustituido, halógeno y ciano.
Los compuestos preferidos son aquellos que tienen una estructura según la tabla 3, sus diastereoisómeros individuales, hidratos, solvatos, formas cristalinas, tautómeros individuales o sales de los mismos.
Métodos para preparar un conjugado
En un aspecto de la invención, en el presente documento se da a conocer un método para preparar un conjugado que comprende la etapa de conjugar un compuesto precursor tal como se describió anteriormente con una pareja de conjugación. Preferiblemente, el compuesto precursor se conjuga con la pareja de conjugación al reaccionar con la misma para formar un enlace covalente. Preferiblemente, el conjugado obtenido de ese modo es un compuesto conjugado tal como se describe en otras partes en la presente memoria descriptiva.
La pareja de conjugación puede ser un átomo, una molécula, una partícula, un agente terapéutico y/o un agente diagnóstico. Preferiblemente, la conjugación es un agente terapéutico y/o agente diagnóstico, y puede corresponder a los restos de carga activa ya descritos con detalle anteriormente con respecto a los conjugados según la invención.
Preferiblemente, el método comprende además formular el conjugado como una composición farmacéutica o como una composición diagnóstica. Las composiciones farmacéuticas o diagnósticas pueden ser para uso en seres humanos o animales en medicina humana y veterinaria y comprenderán normalmente uno cualquiera o más de un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En la técnica farmacéutica se conocen bien los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico, y se describen, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede realizarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica convencional. Las composiciones farmacéuticas o diagnósticas pueden comprender como, o además del, portador, excipiente o diluyente cualquier grupo de unión, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante adecuado. Todos los detalles y aspectos de formulación dados a conocer anteriormente en la sección “Composiciones farmacéuticas” también se aplican completamente en ese caso.
Técnicas generales
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, biología celular, genética, inmunología y farmacología conocidos por el experto en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo,, Gennaro, A. R., ed. (1990) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J. G., Limbird, L. E., and Gilman, A. G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D. M., and Blackwell, C. C., eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, vol. I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, vol. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4a edición, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C. R., and Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2a ed., Springer Verlag.
Síntesis química
Los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse mediante técnicas de síntesis química. Resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden ser necesarios grupos funcionales sensibles para su protección y desprotección durante la síntesis de un compuesto. Esto puede conseguirse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, tal como se describe en “Protective Groups in Organic Synthesis” de T W Greene y P G M Wuts, John Wiley and Sons Inc. (1991), y en “Protecting Groups”, Georg Thieme Verlag (1994) por P. J. Kocienski.
Durante algunas de reacciones, es posible que pudiera epimerizarse cualquier estereocentro presente en determinadas condiciones, por ejemplo, si se usa una base en una reacción con un sustrato que tiene un centro óptico que comprende un grupo sensible a bases. Debe ser posible superar problemas potenciales tales como este mediante la elección de una secuencia de reacción, las condiciones, los reactivos, los regímenes de protección/desprotección, etc., tal como se conoce bien en la técnica.
Definiciones
Anticuerpo. El término “anticuerpo” se usa en su sentido más amplio y cubre anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dímeros, multímeros, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos chapados, fragmentos de anticuerpo e inmunoproteínas pequeñas (SIP) (véase Int. J. Cancer (2002) 102, 75-85). Un anticuerpo es una proteína generada por el sistema inmunitario que puede reconocer y unirse a un antígeno específico. Un antígeno diana tiene generalmente numerosos sitios de unión, también denominados epítopos, reconocidos por las CDR en múltiples anticuerpos. Cada anticuerpo que se une específicamente a un epítopo diferente tiene una estructura diferente. Por tanto, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente. Un anticuerpo incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molécula que contiene un sitio de unión a antígeno que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno de una diana de interés o a parte de la misma. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo, tal como IgG, IgE, IgM, IgD e IgA, de cualquier clase, tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, o subclase de las mismas. El anticuerpo puede ser o puede derivarse de ratón, ser humano, conejo o de otra especie.
Fragmentos de anticuerpo. El término “fragmento de anticuerpo” se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región variable o de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; anticuerpos con un solo dominio, incluyendo dAc, anticuerpos Vhh de camélido y anticuerpos IgNAR de peces cartilaginosos. Los anticuerpos y sus fragmentos pueden reemplazarse por moléculas de unión basadas en armazones alternativos distintos de inmunoglobulina, aptómeros peptídicos, aptómeros de ácido nucleico, polipéptidos estructurados que comprenden bucles polipeptídicos subtendidos sobre una estructura principal no peptídica, receptores naturales o dominios de los mismos.
Derivado. Un derivado incluye la modificación química de un compuesto. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen el reemplazo de un hidrógeno por un grupo halo, un grupo alquilo, un grupo acilo o un grupo amino, y similares. La modificación puede aumentar o disminuir una o más interacciones por enlaces de hidrógeno, interacciones por carga, interacciones hidrófobas, interacciones por fuerzas de van der Waals y/o interacciones dipolares.
Análogo. Este término abarca cualquiera enantiómero, racemato y estereoisómero, así como todas las sales farmacéuticamente aceptables e hidratos de tales compuestos.
A menos que se indique lo contrario, las siguientes definiciones se aplica a los términos químicos usados en relación con los compuestos de la invención y las composiciones que contienen tales compuestos.
Alquilo se refiere a un radical hidrocarbilo saturado ramificado o no ramificado. De manera adecuada, el grupo alquilo comprende desde 1 hasta 100, preferiblemente desde 3 hasta 30, átomos de carbono, más preferiblemente desde 5 hasta 25 átomos de carbono. Preferiblemente, alquilo se refiere a metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo.
Alquenilo se refiere a un radical hidrocarbilo ramificado o no ramificado que contiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono. De manera adecuada, el grupo alquenilo comprende desde 2 hasta 30 átomos de carbono, preferiblemente desde 5 hasta aproximadamente 25 átomos de carbono.
Alquinilo se refiere a un radical hidrocarbilo ramificado o no ramificado que contiene uno o más triples enlaces carbono-carbono. De manera adecuada, el grupo alquinilo comprende desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 30 átomos de carbono, por ejemplo, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 25 átomos de carbono.
Halógeno se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo, preferiblemente flúor o cloro.
Cicloalquilo se refiere a un resto alicíclico, que tiene de manera adecuada 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono. El grupo puede ser un sistema de anillos en puente o policíclico. Más frecuentemente, los grupos cicloalquilo son monocíclicos. Este término incluye la referencia a grupos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, norbornilo, biciclo[2.2.2]octilo, y similares.
Arilo se refiere a un sistema de anillos carbocíclico aromático, que comprende de manera adecuada 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 átomos de carbono de anillo. Arilo puede ser un sistema de anillos policíclico, que tiene dos o más anillos, al menos uno de los cuales es aromático. Este término incluye la referencia a grupos tales como fenilo, naftilo, fluorenilo, azulenilo, indenilo, antrilo, y similares.
El prefijo (hetero) en el presente documento significa que uno o más de los átomos de carbono del grupo pueden estar sustituidos con nitrógeno, oxígeno, fósforo, silicio o azufre. Los grupos heteroalquilo incluyen, por ejemplo, grupos alquiloxilo y grupos alquitio. Los grupos heterocicloalquilo o heteroarilo en el presente documento pueden tener 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 átomos de anillo, al menos uno de los cuales se selecciona de nitrógeno, oxígeno, fósforo, silicio y azufre. En particular, un anillo o sistema de anillos de 3 a 10 miembros y más particularmente un anillo de 5 ó 6 miembros, que puede estar saturado o insaturado. Por ejemplo, se selecciona de oxiranilo, azirinilo, 1,2-oxatiolanilo, imidazolilo, tienilo, furilo, tetrahidrofurilo, piranilo, tiopiranilo, tiantrenilo, isobenzofuranilo, benzofuranilo, cromenilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, imidazolilo, imidazolidinilo, bencimidazolilo, pirazolilo, pirazinilo, pirazolidinilo, tiazolilo, isotiazolilo, ditiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piperidilo, piperazinilo, piridazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, especialmente tiomorfolino, indolizinilo, 1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindolilo, 3H-indolilo, indolilo, bencimidazolilo, cumarilo, indazolilo, triazolilo, tetrazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, isoquinolilo, quinolilo, tetrahidroquinolilo, tetrahidroisoquinolilo, decahidroquinolilo, octahidroisoquinolilo, benzofuranilo, dibenzofuranilo, benzotiofenilo, dibenzotiofenilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalilo, quinazolinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, carbazolilo, [beta]-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, perimidinilo, fenantrolinilo, furazanilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, cromenilo, isocromanilo, cromanilo, 3,4-dihidro-2H-isoquinolin-1-ona, 3,4-dihidro-2H-isoquinolinilo, y similares.
“Sustituido” significa que uno o más, especialmente hasta 5, más especialmente 1, 2 ó 3, de los átomos de hidrógeno en dicho resto se reemplazan independientemente unos de otros por el número correspondiente de sustituyentes. El término “opcionalmente sustituido”, tal como se usa en el presente documento, incluye sustituido o no sustituido. Por supuesto, se entenderá que los sustituyentes sólo se encuentran en posiciones en las que son químicamente posibles, pudiendo el experto en la técnica decidir (ya sea de manera experimental o teórica) sin esfuerzos inapropiados si es posible una sustitución particular. Por ejemplo, los grupos amino o hidroxilo con hidrógeno libre pueden ser inestables si se unen a átomos de carbono con enlaces insaturados (por ejemplo, olefinícos). Preferiblemente, el término “sustituido” significa que uno o más, especialmente hasta 5, más especialmente 1, 2 ó 3, de los átomos de hidrógeno en dicho resto se reemplazan independientemente unos de otros por el número correspondiente de sustituyentes seleccionados de OH, Sh , NH2, halógeno, ciano, carboxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo. De manera adicional, los sustituyentes descritos en el presente documento pueden estar sustituidos a su vez con cualquier sustituyente, sujetos a la restricción anteriormente mencionada de las sustituciones apropiadas tal como reconoce el experto en la técnica. Preferiblemente, cualquiera de los sustituyentes anteriormente mencionados puede estar adicionalmente sustituido con cualquiera de los sustituyentes anteriormente mencionados, cada uno de los cuales puede estar adicionalmente sustituido con cualquiera de los sustituyentes anteriormente mencionados.
Los sustituyentes pueden incluir de manera adecuada átomos de halógeno y grupos halometilo tales como CF3 y CCh; grupos que contienen oxígeno tales como oxo, hidroxilo, carboxilo, carboxialquilo, alcoxilo, alcoílo, alcoiloxilo, ariloxilo, ariloílo y ariloiloxilo; grupos que contienen nitrógeno tales como amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, azida y nitro; grupos que contienen azufre tales como tiol, alquiltiol, sulfonilo y sulfóxido; grupos heterocíclicos que pueden estar sustituidos a su vez; grupos alquilo que pueden estar sustituidos a su vez; y grupos arilo que pueden estar sustituidos a su vez, tales como fenilo y fenilo sustituido. Alquilo incluye bencilo sustituido y no sustituido. Cuando se describen dos o más restos como seleccionado “cada uno independientemente” de una lista de átomos o grupos, esto significa que los restos pueden ser iguales o diferentes. Por tanto, la identidad de cada resto es independiente de las identidades del uno o más otros restos.
Para facilidad de referencia, los números y las estructuras de algunos compuestos dados a conocer en el presente documento se resumen en las reivindicaciones adjuntas y las siguientes tablas 3 y 4. En caso de duda, prevalecen los números y las estructuras a continuación.
Tabla 3
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Tabla 4
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M a t e r i a l e s y m é t o d o s
P r o c e d i m i e n t o s y o b s e r v a c i o n e s g e n e r a l e s
L o s r e n d i m i e n t o s s e r e f ie r e n a c o m p u e s t o s c r o m a t o g r á f i c a m e n t e p u r i f ic a d o s .
L o s e s p e c t r o s d e r e s o n a n c i a m a g n é t i c a n u c l e a r ( R M N ) d e p r o t ó n ( 1H ) s e r e g i s t r a r o n e n u n e s p e c t r ó m e t r o B r u k e r AV400 (400 MHz). Los desplazamientos se proporcionan en ppm usando el disolvente residual como patrón interno. Las constantes de acoplamiento (J) se notifican en Hz, usando las siguientes abreviaturas para indicar el desdoblamiento: s = singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuartete, m = multiplete.
Los espectros de espectrometría de masas (CL-ESI-EM) se registraron en un sistema de EM de cuadrupolo único de la serie Agilent 6100 combinado con un sistema de CL de la serie Agilent 1200, usando una columna InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 4,6 mm * 56 mm a una velocidad de flujo de 2 ml min-1 con gradientes lineales de disolventes A y B (A = agua Millipore con ácido fórmico [FA] al 0,1%, B = MeCN con ácido fórmico [FA] al 0,1%). Los espectros de espectrometría de masas de alta resolución (EMAR) y cromatografía de líquidos de ultraalta resolución (UPLC) de fase inversa analítica se registraron en un dispositivo Waters Xevo G2-XS QTOF acoplado con un sistema Waters Acquity UPLC H-Class con detector PDA UV, usando una columna ACQUITY UPLC Be H C18, 130 A, 1,7 |im, 2,1 mm * 50 mm a una velocidad de flujo de 0,6 ml min'1 con gradientes lineales de disolventes A y B (A = agua Millipore con FA al 0,1%, B = MeCN con FA al 0,1%).
Se realizó cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) preparativa en un sistema de la serie Agilent 1200, usando una columna semipreparativa Phenomenex Gemini® 5 |im NX-C18, 110 A, 150 mm * 10 mm a una velocidad de flujo de 5 ml min-1 con gradientes lineales de disolventes A y B (A = agua Millipore con ácido trifluoroacético [TFA] al 0,1%, B = MeCN con ácido trifluoroacético [TFA] al 0,1%).
Ejemplo comparativo 1: síntesis de (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-6-(3-(4-(3’,6’-dihidroxi-3-oxo-3H-espiro[isobenzofuran-1,9’-xanten]-5-carbonil)piperazin-1-il)propoxi)quinolin-4-carboxamida (“HABERKORN-FLUO", 23)
Etapa 1: ácido 6-hidroxi-4-quinolin-carboxílico (H1)
Se calentó una disolución de ácido 6-metoxiquinolin-carboxílico (250 mg, 1,08 mmol, 1,0 eq) en HBr al 48% en peso en H2O (5 ml) a 130°C durante 2 h, luego se concentró a vacío para obtener el producto como un polvo naranja (292 mg, 1,08 mmol, rendimiento cuant.). EM (ES+) m/z 271 (M+H)+.
Etapa 2: 1-Boc-4-(3-hidroxipropil)piperazina (H2)
Se añadió K2CO3 anhidro (815 mg, 5,91 mmol, 1,1 eq) a una disolución de 1-Boc-piperazina (1,0 g, 5,37 mmol, 1,0 eq) en THF seco (15 ml) seguido de 3-bromo-1-propanol (530 |il, 5,91 mmol, 1,1 eq) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 72 h. Se eliminaron los compuestos volátiles a presión reducida, se diluyó el residuo con agua, se extrajo con EtOAc (dos veces) y se secaron las fases orgánicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía ultrarrápida (DCM/MeOH desde 98:2 hasta 90:10) para dar el compuesto del título como un aceite incoloro (1,2 g, 4,91 mmol, rendimiento del 91%). EM (ES+) m/z 245 (M+H)+.
Etapa 3: 6-(3-(4-(terc-butoxicarbonil)piperazin-1-il)propoxi)quinolin-4-carboxilato de 3-(4-(tercbutoxicarbonil)piperazin-1-il)propilo (H3)
Se trató una disolución con agitación de H1 (100 mg, 0,37 mmol, 1,0 eq), H2 (180 mg, 0,74 mmol, 2,0 eq) y trifenilfosfina (193 mg, 0,74 mmol, 2,0 eq) en THF seco (25 ml) con azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD; 145 |il, 0,74 mmol, 2,0 eq). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 1 h, luego se concentró a vacío y se purificó directamente mediante cromatografía ultrarrápida (DCM/MeOH desde 95:5 hasta 90:10) para dar el compuesto del título como un polvo blanco (100 mg, 0,156 mmol, rendimiento del 42%). EM (ES+) m/z 642 (M+H)+.
Figure imgf000042_0001
Esquema 1. Ruta de síntesis para la preparación del compuesto del ejemplo comparativo 1 “HABERKORN-FLUO” (23)
Etapa 4: ácido 6-(3-(4-terc-butoxicarbonilpiperazin-1-il)propoxi)quinolin-4-carboxílico (H4)
A una disolución con agitación de H3 (100 mg, 0,156 mmol, 1,0 eq) en THF (5 ml), se le añadió una disolución de LiOH (13 mg, 0,312 mmol, 2,0 eq) en H2O (2 ml) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 2 h. Se diluyó la mezcla con agua, se extrajo con EtOAc, se lavó con NH4Cl s.s., se secó sobre Na2SO4 y se filtró para obtener el producto como un polvo blanco (60 mg, 0,144 mmol, rendimiento del 92%). EM (ES+) m/z 416 (M+H)+. Etapa 5: éster 4-[3-[[4-[[[2-[(2S)-2-ciano-4,4-difluoro-1-pirrolidinil]-2-oxoetil]amino]carbonil]-6-quinolinil]oxi]propil]-1,1-dimetiletílico del ácido 1-piperazinacarboxílico (H5)
A una disolución con agitación de H4 (15 mg, 0,036 mmol, 1,0 eq), se le añadieron HATU (20 mg, 0,054 mmol, 1,5 eq) y HOBt (7,3 mg, 0,054 mmol, 1,5 eq) en DCM (3 ml), una disolución de (S)-1-(2-aminoacetil)-4,4-difluoropirrolidin-2-carbonitrilo (10 mg, 0,054 mmol, 1,5 eq) en DMF (1,0 ml) y DIPEA (25 |J, 0,144 mmol, 4 eq) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 9 h. Se evaporó la mezcla a vacío, se disolvió en DMSO y se purificó mediante RP-HPLC para dar el producto como un sólido blanco (6,0 mg, 0,01 mmol, rendimiento del 28%). EM (ES+) m/z 587 (M+H)+.
Etapa 6: (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-6-(3-(piperazin-1-il)propoxi)quinolin-4-carboxamida (H6)
Se calentó una disolución con agitación de H5 (5,0 mg, 8,0 |imol, 1,0 eq) y ácido 4-metilbencenosulfónico monohidratado (6,8 mg, 40 |imol, 5,0 eq) en MeCN (3 ml) a 55°C durante 2 h. Se concentró la mezcla a vacío y se usó el producto como tal en la etapa posterior. Polvo blanco (8,0 mg, 8,0 |imol, rendimiento cuant.). EM (ES+) m/z 487 (M+H)+.
Etapa 7: (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-6-(3-(4-(3',6'-dihidroxi-3-oxo-3H-espiro[isobenzofuran-1,9'-xanten]-5-carbonil)piperazin-1-il)propoxi)quinolin-4-carboxamida (“HABERKORN-FLUO”, 23)
A una disolución con agitación de H6 (4,5 mg, 4,0 |imol, 1,0 eq.) y TEA (1,1 |il, 8,0 |imol, 2,0 eq) en DMF (1 ml) se le añadió NHS-fluoresceína (2,8 mg, 6,0 |imol, 1,5 eq) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 9 h. Se purificó directamente la mezcla mediante RP-HPLC para dar el producto como un polvo naranja (0,9 mg, 1,0 |imol, rendimiento del 26%). EM (ES+) m/z 845 (M+H)+ (ejemplo comparativo 1B; véase la figura 1B).
Ejemplo 2: síntesis de (S)-N1-(4-((2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)-N4-(2-(2-(2-(3-(3’,6’-dihidroxi-3-oxo-3H-espiro[isobenzofuran-1,9’-xanten]-5-il)tioureido)etoxi)etoxi)etil)succinimida (“ESV6-FLUO", 26)
Etapa 1: éster 12-[(3',6'-dihidroxi-3-oxoespiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanten]-6-il)amino]-12-tioxo-1,1-dimetiletílico del ácido 5,8-dioxa-2,11-diazadodecanoico (P1)
A una disolución con agitación de N-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etil}carbamato de terc-butilo (173 |il, 0,731 mmol, 1,5 eq) en THF (20 ml), se le añadió fluoresceína-5-isotiocianato (190 mg, 0,487 mmol, 1,0 eq) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 12 h. Se concentró la mezcla a vacío y se purificó directamente el producto en bruto mediante cromatografía ultrarrápida (DCM/EtOAc desde 9:1 hasta 8:2) para dar el compuesto como un polvo naranja (200 mg, 0,314 mmol, rendimiento del 64%). EM (ES+) m/z 638 (M+H)+.
Etapa 2: N-[2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etil]-N-(3',6'-dihidroxi-3-oxoespiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanten]-5-il)-tiourea (P2)
A una disolución con agitación de P1 (150 mg, 0,235 mmol, 1,0 eq) en DCM (10 ml) enfriada hasta 0°C, se le añadió HCl 4 M en Et2O (5 ml). Se agitó la reacción, se calentó lentamente hasta temperatura ambiente durante 2 h, luego se concentró a vacío y se evaporó conjuntamente con Et2O varias veces hasta que se obtuvo un polvo naranja (135 mg, 0,235 mmol, rendimiento cuant.). EM (ES+) m/z 538 (M+H)+.
Figure imgf000044_0001
Esquema 2. Ruta de síntesis para la preparación de ESV6-FLUO (26)
Etapa 3: (S)-8-amino-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)quinolin-4-carboxamida (P3)
Se disolvieron ácido 8-amino-quinolin-4-carboxílico comercialmente disponible (19,0 mg, 100 |imol, 1,0 eq), DIPEA (70,0 |il, 400 |imol, 4,0 eq) y HATU (38,0 mg, 100 |imol, 1,0 eq) en una mezcla 1:1 de DCM/DMF (2 ml). Después de 15 min, se añadió una disolución de trifluoroacetato de (S)-1-(2-aminoacetil)-4,4-difluoropirrolidin-2-carbonitrilo (30,3 mg, 100 |imol, 1,0 eq) en DCM. Se agitó la mezcla de reacción durante 1 h a temperatura ambiente, se lavó con agua, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró para obtener un producto en bruto marrón como un aceite pegajoso. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (DCM/MeOH desde 91:1 hasta 90:10) para producir el producto puro como un aceite pardusco (24,8 mg, 68,9 |imol, rendimiento del 69%). EM (ES+) m/z 360 (M+H)+.
Etapa 4: ácido (S)-4-((4-((2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanoico (P4)
Se añadieron trietilamina (20,8 |il, 150 |imol, 2,0 eq) y 4-dimetilaminopiridina (0,91 mg, 10,0 |imol, 0,1 eq) a una disolución enfriada (0°C) de P3 (26,8 mg, 70,0 |imol, 1,0 eq) en DCM, seguido de una adición gota a gota de anhídrido succínico (15,0 mg, 150 |imol, 2,0 eq). Se permitió que la mezcla de reacción se calentara hasta temperatura ambiente. Se colocó la mezcla de reacción en un baño de aceite a 40°C precalentado hasta que se observó la conversión completa. Se evaporó el disolvente y se purificó el residuo mediante RP-HPLC para producir el producto puro como un polvo blanco (9,42 mg, 20,0 |mol, rendimiento del 28%). EM (ES+) m/z 460 (M+H)+. La figura 28 muestra la estructura, el perfil cromatográfico y el análisis por CL/EM del ejemplo 2, P4. EM(ES+) m/z 460,21 (M+H)+.
Etapa 5: (S)-N1-(4-((2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbarnoil)quinolin-8-il)-N4-(2-(2-(2-(3-(3’,6’-dihidroxi-3-oxo-3H-espiro[isobenzofuran-1,9’-xanten]-5-il)tioureido)etoxi)etoxi)etil)succinamida (“ESV6-FLUO”, 26)
Se llevaron P2 (22,0 mg, 40,0 |mol, 2,0 eq) y HATU (15,6 mg, 40,0 |mol, 2,0 eq) a una mezcla 1:1 de DCM/DMF (2 ml) y DIPEA (7,20 |l, 40,0 |mol, 2,0 eq). Se agitó la mezcla resultante durante 15 min a temperatura ambiente. Se añadió P4 (9,42 mg, 20,0 |mol, 1,0 eq) en DCM y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se evaporó el disolvente y se purificó el residuo mediante RP-HPLC preparativa para conseguir el producto puro como un sólido amarillo (2,50 mg, 10,0 |mol, rendimiento del 25%). EM (ES+) m/z 979 (M+H)+ (figura 1A).
A continuación, se enumeran conjugados adicionales según la presente invención.
Conjugado 1: ácido (2S,5R,8R,11R)-2-(((1-(6-(((S)-1-(((R)-1-((4-((5R,8S,11R,12S)-11-((R)-sec-butil)-12-(2-((R)-2-((1S,2S)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-6-oxohexil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)metil)-5,11-bis(carboximetil)-16-((4-((2-((R)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-8-(3-guanidinopropil)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanoico
Figure imgf000045_0001
Conjugado 2: ácido (2S,5R,8R,11R)-8-(4-aminobutil)-2-(((1-(6-(((S)-1-(((R)-1-((4-((5R,8S,11R,12S)-11-((R)-sec-butil)-12-(2-((R)-2-((1S,2S)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-6-oxohexil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)metil)-5,11-bis(carboximetil)-16-((4-((2-((R)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanoico
Figure imgf000045_0002
Conjugado 3: ácido (2S,5R,8R,11R)-2-(((1-(6-(((S)-1-(((R)-1-((4-((5R,8S,11R,12S)-11-((R)-sec-butil)-12-(2-((R)-2-((1S,2S)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,8-diisopropil-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradecil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-6-oxohexil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)metil)-5,11-bis(carboximetil)-16-((4-((2-((R)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-8-(3-guanidinopropil)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanoico
Figure imgf000046_0001
Conjugado 4: N6-(4-((3-((3-(((2R)-1-(((14R,16R,33R,2S,4S,10E,12Z,14S)-86-doro-14-hidroxi-85,14-dimetoxi-33,2,7,10-tetrametil-12,6-dioxo-7-aza-1(6,4)-oxazinan-3(2,3)-oxiran-8(1,3)-bencenociclotetradecafan-10,12-dien-4-il)oxi)-1-oxopropan-2-il)(metil)amino)-3-oxopropil)tio)-2,5-dioxopirrolidin-1-il)metil)ddohexano-1-carbonil)-N2-(4-((4-((2-((R)-2-dano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanoil)-D-aspartil-D-arginil-D-aspartil-D-lisina
Figure imgf000046_0002
Conjugado 5: ácido (2R,5R,8R,11R)-5,11-bis(carboximetil)-16-((4-((2-((R)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-2-((1-(14-((4-(4,7-dimetil-3,8,11-trioxo-11-((2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-piran[4’,3’:4,5]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il)oxi)-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il)-2,9-dioxa-4,7-diazaundecil)fenil)carbamoil)-15-metil-3,12-dioxo-7,10-dioxa-4,13-diazahexadecil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)-8-(3-guanidinopropil)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanoico
Figure imgf000046_0003
Conjugado 6: ácido (10R,13R,16R,19R)-1-((3aR,4R,5S, 10bR)-4-acetoxi-3a-etil-9-((3S,5S,7S,9S)-5-etil-5-hidroxi-9-(metoxicarbonil)-1,4,5,6,7,8,9,10-octahidro-2H-3,7-metano[1]azaddoundedno[5,4-£>]indol-9-il)-5-hidroxi-8-metoxi-6-metil-3a,3a1,4,5,5a,6,11,12-octahidro-1H-indolizino[8,1-cd]carbazol-5-il)-10-carboxi-13-(carboximetil)-19-(4-((4-((2 ((R)-2-c¡ano-4,4-d¡fluorop¡rrol¡d¡n-1-¡l)-2-oxoet¡l)carbamoil)qu¡nol¡n-8-¡l)am¡no)-4-oxobutanam¡do)-16-(3-guanidinopropil)-1,4,12,l5,18-pentaoxo-5-oxa-8,9-ditia-2,3,11,14,17-pentaazahenicosan-21-oico
Figure imgf000047_0001
Conjugado 7: ác¡do 2,2’,2”-(10-(2-((2-(3-(((2S,5R,8R,11R)-8-(4-am¡nobut¡l)-2-carbox¡-5,11-b¡s(carbox¡met¡l)-16-((4-((2-((R)-2-c¡ano-4,4-d¡fluorop¡rrol¡d¡n-1-¡l)-2-oxoet¡l)carbamo¡l)qu¡nol¡n-8-¡l)am¡no)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadec¡l)t¡o)-2,5-d¡oxop¡rrol¡d¡n-1-¡l)et¡l)am¡no)-2-oxoet¡l)-1,4,7,10-tetraazac¡dododecano-1,4,7-tr¡¡l)tr¡acét¡co
Figure imgf000047_0002
Conjugado______8: ác¡do 2,2’,2”-(10-(1-carbox¡-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-dano-4,4-d¡fluorop¡rrol¡d¡n-1-¡l)-2-oxoet¡l)carbamo¡l)qu¡nol¡n-8-¡l)am¡no)-4-oxobutanam¡do)et¡l)am¡no)-4-oxobut¡l)-1,4,7,10-tetraazac¡dododecano-1,4,7-tr¡¡l)tr¡acét¡co
Figure imgf000047_0003
Conjugado______& ác¡do 2,2’,2”-(10-(1-carbox¡-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-dano-4,4-d¡fluorop¡rrol¡d¡n-1-¡l)-2-oxoet¡l)carbamo¡l)qu¡nol¡n-8-¡l)am¡no)-4-oxobutanam¡do)et¡l)am¡no)-4-oxobut¡l)-1,4,7,10-tetraazac¡dododecano-1,4,7-tr¡¡l)tr¡acét¡co marcado con 177-Lutec¡o
Figure imgf000047_0004
Conjugado_____ 10:
oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanamido)etil)amino)-4-oxobutil)-1,4,7,10-tetraazacidododecano-1,4,7-triil)triacético marcado con 225-Actinio
Figure imgf000048_0001
Conjugado_____ 11 ácido 2,2’,2”-(10-(1-carboxi-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanamido)etil)amino)-4-oxobutil)-1,4,7,10-tetraazacidododecano-1,4,7-triil)triacético marcado con 64-Cobre
Figure imgf000048_0002
Conjugado_______ 12 ácido (S)-3-((S)-2-amino-6-(4-((4-((2-((R)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanamido)hexanamido)-4-(((R)-1-carboxi-2-mercaptoetil)amino)-4-oxobutanoico marcado con 68-Galio
Figure imgf000048_0003
Conjugado_______ 13: ácido (S)-3-((S)-2-amino-6-(4-((4-((2-((R)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanamido)hexanamido)-4-(((R)-1-carboxi-2-mercaptoetil)amino)-4-oxobutanoico
Figure imgf000048_0004
Conjugado_______ _4: ácido (S)-3-((S)-2-amino-6-(4-((4-((2-((R)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanamido)hexanamido)-4-(((R)-1-carboxi-2-mercaptoetil)amino)-4-oxobutanoico marcado con 99m-Tecnecio
Figure imgf000049_0001
Conjugado 15: ácido (2R,5S,8S,11S)-8-(4-aminobutil)-5,11-bis(carboximetil)-16-((4-((2-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-2-(((1-(3’,6’-dihidroxi-3-oxo-3H-espiro[isobenzofuran-1,9’-xanten]-5-il)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)metil)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanoico
Figure imgf000049_0002
Ejemplo 3: caracterización del grupo de unión marcado con fluoresceína “ESV6-FLUO” (26)
Expresión de FAP humana
Secuencia de aminoácidos de proteína de activación de fibroblastos humana (hFAP) con etiqueta polihistidina: LRPSR VH NSEENTM RA LTLK D IL N G T FSY K T FFPN W ISG Q E Y L H Q SA D N N IV L Y N IE TG Q SY T IL S N R T M K SV N A SN Y G L SPD R Q FV Y L E SD Y SK L W R Y SY T A T Y Y IY D L SN G E FV R G N E L PR PIQ Y L C W SPVG SK LAY V YQ NN IYLK Q R PG D PPFQ IT FN G R E N K IFN G IPD W V Y EE E M L A T K Y A L W W SPN G K FL A Y A E FN D TD IPV IA Y SY Y G D E Q Y PR T IN IPY PK A G A K N PV V R IFIID T T Y PA Y V G PQ E V PV PA M I A SSD Y Y FSW L TW V T D E R V C L Q W LK R V Q N V SV L SIC D FR E D W Q T W D C PK T Q E H IEE SR TG W A G G FFV ST PV FSY D A ISY Y K IFSD K D G Y K H 1H Y IK D TV E N A IQ ITSG K W E A IN IFR V T Q D SL FY SSN EF
EEY PG R RN IY RISIG SY PPSK K C V T C H L R K ER C Q Y Y T A SFSD Y A K Y Y A LY C Y G PG IPIST LH D G R T D Q EIK ILEENK ELENALK NIQ LPK EEIK K LEVDEITLW YK M ILPPQ FDRSK K YPLLIQ VYG G PCSQ S V R SV FA V N W ISY L A SK E G M V IA L V D G R G T A FQ G D K L L Y A V Y R K L G V Y E V E D Q IT A V R K FIE M G FID EK RIAIW G W SY G G Y V S SL A L A SG T G L FK C G IA V A PV S SW E Y Y A S V YTE R FM G L PTK D D N LE H Y K N ST V M A R A E Y F R N V D Y L L 1H G T A D D N V H F Q N SA Q IA K A L V N A Q V D FQ A M W Y SD Q N H G L
SG LSTNH LYTH M T H FL K Q C FSL SD H H H H H H
Se clonó la proteína de activación de fibroblastos humana (hFAP; UniProtKB - Q12884 (SEPR_HUMAN) aminoácidos 25-760) en pCDNA3.1(+) con una secuencia de secreción en su extremo 5’ y una etiqueta 6x polihistidina en su extremo 3’ y se expresó en células CHO mediante expresión génica transitoria. Se ensambló la mezcla de transfección de la siguiente manera: 0,625 |ag de ADN plasmídico, 2,5 |ag de polietilenimina (PEI) para 106 células, con una densidad celular de 4 x 106 células/ml. Se incubaron las células durante 6 días a 37°C, el 5% de CO2, 120 rpm. Se recogieron las células mediante centrifugación (4500 rpm, 30 min, 4°C), y se añadió 1 ml (volumen seco) de resina de purificación de etiqueta His completa al sobrenadante filtrado y se incubó durante 2 horas, 120 rpm a temperatura ambiente. Se lavó la resina con 800 ml de tampón de lavado (imidazol 10 mM, PBS/NaCl 250 mM) y se eluyó hFAP con imidazol 250 mM, PBS/NaCl 250 mM. Se comprobaron las fracciones de elución (1,5 ml) en un espectrofotómetro para determinar la absorbancia a 280 nm. Se agruparon las fracciones enriquecidas en hFAP y se dializaron frente a tampón HEPES (HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, pH=7,4).
Se analizaron las muestras de hFAP recombinante mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión molecular (véase la figura 2: A) SDS-PAGE; B) cromatografía de exclusión molecular (Superdex 200 Increase 10/300 GL)), y se confirmó la actividad de la enzima en ensayos de inhibición (véase la sección “Ensayo de CI50 para la enzima FAP humana in vitro").
Medición de afinidad por FAP humana mediante polarización por fluorescencia (figura 4)
Se realizaron mediciones de polarización por fluorescencia en placas de 384 pocillos (sin unión, ps, fondo f, negro, volumen alto, 30 |il de volumen final). Se diluyó en serie una disolución madre de FAP humana (4 |iM) con tampón (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,4), mientras se mantenía constante la concentración final de los grupos de unión a 10 nM. Se llevaron a cabo las mediciones después de incubar durante 30 min a 37°C en la oscuridad mediante polarización por fluorescencia (figura 4). ESV6-fluo muestra una mayor afinidad por hFAP (Kd de 0,78 nM) en comparación con el ligando previamente descrito, Haberkorn-fluo (Kd de 0,89 nM).
Ensayo de Ckn para la enzima FAP humana in vitro (figura 5)
Se midió la actividad enzimática de FAP humana en el sustrato Z-Gly-Pro-AMC a temperatura ambiente en un lector de placas de microtitulación, monitorizando la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm. La mezcla de reacción contenía sustrato 20 |iM, FAP humana 20 nM, tampón de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,4) e inhibidor (que oscilaba entre 10' 6 y 10' 11 M) en un volumen total de 30 |il. El valor de CI50 se define como la concentración de inhibidor requerida para reducir la actividad enzimática en un 50% después de una incubación previa de 30 min con la enzima a 37°C antes de la adición del sustrato.
Se prepararon disoluciones madre de inhibidor (200 mM) en DMSO. Inmediatamente antes del comienzo del experimento, se diluyeron adicionalmente las disoluciones madre hasta 10' 6 M en el tampón de ensayo, a partir de las cuales se prepararon diluciones en serie 1:2. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
La figura 5 muestra los resultados del experimento de inhibición de hFAP en presencia de ligandos orgánicos pequeños. El ligando ESV6 muestra una menor CI50 (20,2 nM) en comparación con el ligando previamente descrito, el ligando Haberkorn (24,6 nM).
Experimentos de coelución cromatográfica de complejos ligando-proteína (figura 3)
Se equilibró previamente una columna PD-10 con tampón de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,4) antes de la carga del complejo. Se incubaron FAP humana (2 |iM) y grupos de unión marcados con fluoresceína (6 |iM) durante 30 min a 37°C en la oscuridad. Se cargó la mezcla y se enjuagó la columna usando el tampón de ensayo. Se recogió la fracción no retenida en placas de 96 pocillos y se midió la fluorescencia inmediatamente en un lector de placas de microtitulación TECAn , monitorizando la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. Se estimaron las cantidades de proteína midiendo la absorbancia a 280 nm usando un espectrofotómetro Nanodrop 2000/2000c.
La figura 3 muestra los resultados del experimento de coelución en PD-10 de ligandos de molécula pequeña ESV6-fluo y Haberkorn-fluo y hFAP. Se forma un complejo estable entre hFAP y los ligandos pequeños ESV6-fluo y Haberkorn-fluo.
Medición de la tasa de disociación (figura 6)
Se realizaron mediciones de polarización por fluorescencia para determinar los valores de k f en placas de 384 pocillos (sin unión, ps, fondo f, negro, volumen alto, 30 |il de volumen final). Se llevaron a cabo las mediciones después de la incubación previa de grupos de unión marcados con fluoresceína 2,0 nM con FAP humana a una concentración constante de 1,0 |iM a 37°C en la oscuridad. Se indujo la disociación del compuesto marcado con fluoresceína mediante la adición de un gran exceso de los grupos de unión libres de fluoresceína correspondientes (compuesto P3 obtenido en la etapa 3 del ejemplo 2 y compuesto H6 obtenido en la etapa 6 del ejemplo comparativo 1, respectivamente, cada uno a una concentración final de 20 |iM).
La figura 6 muestra los resultados de las mediciones de la tasa de disociación de ESV6-fluo y Haberkorn-fluo a partir de hFAP. ESV6-fluo se disocia (coeficiente de regresión =-0,093564) con un ritmo más lento en comparación con Haberkorn-fluo (coeficiente de regresión = -0,075112).
El compuesto del ejemplo comparativo 1 en la presente solicitud (“HABERKORN-FLUO”) puede considerarse representativo para la divulgación de la técnica anterior y, en particular, para la estructura del ligando FAPI-04 descrita en la técnica anterior (documentos WO 2019/154886 y WO 2019/154859). Los resultados anteriores muestran que los compuestos según la presente invención no sólo forman un complejo estable con hFAP, sino que también muestran sorprendentemente una afinidad significativamente aumentada (menor KD), una actividad inhibidora aumentada (menor CI5o) y una tasa de disociación más lenta en comparación con la técnica anterior. Ejemplo 4: experimentos comparativos en modelos tumorales
PARTE 1 - Preparación de conjugados
Síntesis de (8-aminoquinolin-4-carbonil)glicinato de terc-butilo
Figure imgf000051_0001
Esquema 3. Ruta de síntesis para la preparación de (8-aminoquinolin-4-carbonil)glicinato de terc-butilo
Se añadió gota a gota DIPEA (185 |al, 1,063 mmol, 4 eq) a una disolución con agitación de clorhidrato de glicinato de terc-butilo (89 mg, 0,532 mmol, 2,0 eq), ácido 8-aminoquinolin-4-carboxílico (50 mg, 0,266 mmol, 0,1 eq) y HATU (111 mg, 0,292 mmol, 1,1 eq) en 300 |al de DMF y 3 ml de DCM. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 h. Se concentró la mezcla a vacío y se purificó directamente el material en bruto mediante cromatografía ultrarrápida (DMC/MeOH desde el 100% hasta 9,5:0,5) para producir (8-aminoquinolin-4-carbonil)glicinato de terc-butilo como un aceite marrón (70 mg, 0,232 mmol, 87,5%). EM(ES+) m/z 302,14 (M+H)+ Síntesis de ácido 4-((4-((2-(terc-butoxi)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanoico
Figure imgf000051_0002
Esquema 4. Ruta de síntesis para la preparación de ácido 4-((4-((2-terc-butoxi)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin8-8il)amino)-4-oxobutanoico
Se añadió 4-dimetilaminopiridina (14 mg, 0,116 mmol, 0,5 eq) a una disolución con agitación de (8-aminoquinolin-4-carbonil)glicinato de terc-butilo (70 mg, 0,232 mmol, 1,0 eq) y dihidrofuran-2,5-diona (232 mg, 2,324 mmol, 10,0 eq) en THF (3 ml). Se calentó la reacción a 50°C durante 6 h. Se concentró la mezcla a vacío, se diluyó en DCM y se lavó con agua. Se concentró la fase orgánica a vacío y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (DMC/MeOH desde 9:1 hasta 7:3) para dar el compuesto como un aceite marrón (50 mg, 0,125 mmol, 83,3%). EM(ES+) m/z 402,16 (M+H)+
Síntesis de Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc sobre resina
Figure imgf000051_0003
Esquema 5. Ruta de síntesis para la preparación de Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc sobre resina
Se hinchó Fmoc-Cys(Trt) precargado disponible comercialmente sobre resina Tentagel (500 mg, 0,415 mmol, RAPP Polymere) en DMF (3 x 5 min x 5 ml), se retiró el grupo Fmoc con piperidina al 20% en DMF (1 x 1 min x 5 ml y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml). Se extendió el péptido con Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(NHBoc)-OH y Fmoc-Asp(tBu)-OH en el orden indicado. Para este propósito, se disolvieron el aminoácido protegido con Fmoc (2,0 eq), HbTu (2,0 eq), HOBt (2,0 eq) y DIPEA (4,0 eq) en DMF (5 ml). Se permitió que la mezcla reposara durante 10 min a 0°C y luego se hizo reaccionar con la resina durante 1 h con agitación suave. Después de lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml), se retiró el grupo Fmoc con piperidina al 20% en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml). A las etapas de desprotección le siguieron etapas de lavado con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes del acoplamiento con el siguiente aminoácido.
Síntesis de ácido (2R,5S,8S,11R)-8-(4-aminobutil)-5,11-bis(carboximetil)-16-((4-((carboximetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-2-(mercaptometil)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanoico
Figure imgf000052_0001
Esquema 6. Ruta de síntesis para la preparación de ácido (2R,5S,8S,11R)-8-(4-aminobutil)-5,11-bis(carboximetil)-16-((4-((carboximetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-2-(mercaptometil)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanoico (SH-Cys-Asp-Lys-Asp-QCOOH)
Se hinchó Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc sobre resina (50 mg, 0,025 mmol) en DMF (3 x 5 min x 5 ml). Se extendió el péptido con ácido 4-((4-((2-(terc-butoxi)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanoico (20 mg, 0,05 mmol, 2,0 eq), HATU (19 mg, 0,05 mmol, 2,0 eq) y DIPEA (17 |l, 0,1 mmol, 4,0 eq) y se dejó reaccionar durante 1 h con agitación suave. Después de lavar con DMf (6 x 1 min x 5 ml), se escindió el compuesto agitando la resina con una mezcla de TfA (15%), TIS (2,5%) y H2O (2,5%) en DCM durante 4 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con metanol (2 x 5 ml) y se concentraron a vacío las disoluciones de escisión y lavado combinadas. Se purificó el producto en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (2,4 mg, 0,003 mmol, 12%). EM(ES+) m/z 807,45 (M+H)+
Síntesis de ácido (2R,5S,8S,11 S)-8-(4-aminobutil)-5,11-bis(carboximetil)-16-(4-(3-((4-((2-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-6-il)oxi)propil)piperazin-1-il)-2-(mercaptometil)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanoico
Figure imgf000052_0002
Esquema 7. Ruta de síntesis para la preparación de ácido (2R,5S,8S,11S)-8-(4-aminobutil)-5,11-bis(carboximetil)-16-(4-(3-((4-((2-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-6-il)oxi)propil)piperazin-1-il)-2-(mercaptometil)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanoico (SH-Cys-Asp-Lys-Asp-HK)
Se hinchó Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc sobre resina (60 mg, 0,03 mmol) en DMF (3 x 5 min x 5 ml). Se extendió el péptido con ácido (S)-4-(4-(3-((4-((2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-6-il)oxi)propil)piperazin-1-il)-4-oxobutanoico (17,5 mg, 0,03 mmol, 1,0 eq), HATU (22 mg, 0,06 mmol, 2,0 eq) y DIPEA (200 |l, 1,2 mmol, 40 eq) y se dejó reaccionar durante 1 h con agitación suave. Después de lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml), se escindió el compuesto agitando la resina con una mezcla de TFA (15%), TIS (2,5%) y H2O (2,5%) en DCM durante 4 ha temperatura ambiente. Se lavó la resina con metanol (2 x 5 ml) y se concentraron a vacío las disoluciones de escisión y lavado combinadas. Se purificó el producto en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (1 mg, 0,95 |mol, 0,3%). EM(ES+) m/z 1048,39 (M+H)+
Síntesis de ácido (2R,5S,8S,11S)-8-(4-am¡nobut¡l)-5,11-b¡s(carbox¡met¡l)-16-((4-((2-((S)-2-c¡ano-4,4-d¡fluorop¡rrol¡d¡n-1 -¡l)-2-oxoet¡l)carbamo¡l)qu¡nol¡n-8-¡l)am¡no)-2-(mercaptomet¡l)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecano¡co
Figure imgf000053_0001
Esquema 8. Ruta de síntesis para la preparación de ácido (2R,5S,8S,11S)-8-(4-aminobutil)-5,11-bis(carboximetil)-16-((4-((2-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-2-(mercaptometil)-4,7,10,13,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanoico (SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6)
Se h¡nchó Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc sobre res¡na (80 mg, 0,04 mmol) en DMF (3 x 5 m¡n x 5 ml). Se extend¡ó el pépt¡do con ác¡do (S)-4-((4-((2-(2-c¡ano-4,4-d¡fluorop¡rrol¡d¡n-1-¡l)-2-oxoet¡l)carbamo¡l)qu¡nol¡n-8-¡l)am¡no)-4-oxobutano¡co (37 mg, 0,08 mmol, 2 eq), Ha TU (30 mg, 0,08 mmol, 2,0 eq) y DIPEA (28 |l, 0,16 mmol, 4,0 eq) y se dejó reacc¡onar durante 1 h con ag¡tac¡ón suave. Después de lavar con DMF (6 x 1 m¡n x 5 ml), se esc¡nd¡ó el compuesto ag¡tando la res¡na con una mezcla de TFA (15%), TIS (2,5%) y H2O (2,5%) en DCM durante 4 ha temperatura amb¡ente. Se lavó la res¡na con metanol (2 x 5 ml) y se concentraron a vacío las d¡soluc¡ones de esc¡s¡ón y lavado comb¡nadas. Se pur¡f¡có el producto en bruto med¡ante HPLC de fase ¡nversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en aceton¡tr¡lo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 m¡n) y se l¡of¡l¡zó, para obtener un sól¡do blanco (1 mg, 0,95 |mol, 0,3%). EM(ES+) m/z 921,29 (M+H)+
Síntes¡s de “QCOOH-IRDye750”
Se d¡solv¡ó SH-Cys-Asp-Lys-Asp-QCOOH (140 ig, 0,174 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (800 |l). Se añad¡ó IRDye750-male¡m¡da (200 ig , 0,174 |mol, 1,0 eq) como d¡soluc¡ón en DMF seca (200 |l). Se ag¡tó la reacc¡ón durante 3 h. Se pur¡f¡có el mater¡al en bruto med¡ante HPLC de fase ¡nversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en aceton¡tr¡lo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 m¡n) y se l¡of¡l¡zó, para obtener un sól¡do verde (0,06 |mol, 40%). EM(ES+) m/z 978 (M+2H)2+
Figure imgf000053_0002
Conjugado 16: estructura de “QCOOH-IRDye750”.
Síntes¡s de “HABERKORN-IRDye750”
Se d¡solv¡ó SH-Cys-Asp-Lys-Asp-HK (181 ig, 0,174 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (800 |l). Se añad¡ó IRDye750-male¡m¡da (200 ig, 0,174 |mol, 1,0 eq) como d¡soluc¡ón en DMF seca (200 |l). Se ag¡tó la reacc¡ón durante 3 h. Se pur¡f¡có el material en bruto med¡ante HPLC de fase ¡nversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en aceton¡tr¡lo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 m¡n) y se l¡of¡l¡zó, para obtener un sól¡do verde (0,06 |mol, 40%). EM(ES+) m/z 1099,8 (M+2H)2+
Figure imgf000054_0001
Conjugado 17: estructura de “HABERKORN-IRDye750”.
Síntesis de ESV6-IRDye750
Se disolvió SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (160 ig, 0,174 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (800 |l). Se añadió IRDye750-maleimida (200 ig, 0,174 |mol, 1,0 eq) como disolución en DMF seca (200 |l). Se agitó la reacción durante 3 h. Se purificó el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido verde (0,08 |mol, 50%). EM(ES+) m/z 1036,3 (M+2H)2+ 15
Figure imgf000054_0002
Conjugado 18: estructura de ESV6-IRDye750.
Síntesis de “QCOOH-ValCit-MMAE”
Se disolvió SH-Cys-Asp-Lys-Asp-QCOOH (612 ig, 0,760 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |l). Se añadió MC-ValCit-PAB-MMAE (1000 ig, 0,760 |mol, 1,0 eq) como disolución en DMF seca (160 |l). Se agitó la reacción durante 3 h. Se purificó el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (322 ig , 20%). EM(ES+) m/z 2124,03 (M+H)+
Figure imgf000055_0001
Conjugado 19: estructura de “QCOOH-ValCit-MMAE”.
Síntesis de “HABERKORN-ValCit-MMAE”
Se disolvió SH-Cys-Asp-Lys-Asp-HK (795 |ag, 0,760 |amol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |al). Se añadió MC-ValCit-PAB-MMAE (1000 |ag, 0,760 |amol, 1,0 eq) como disolución en DMF seca (160 |al). Se agitó la reacción durante 3 h. Se purificó el material en bruto mediante Hp LC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (322 |ag, 20%). EM(ES+) m/z 2364,18 (M+H)+
Figure imgf000055_0002
Conjugado 20: estructura de “HABERKORN-ValCit-MMAE”.
Síntesis de “ESV6-ValCit-MMAE”
Se disolvió SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (700 |ag, 0,760 |amol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |al). Se añadió MC-ValCit-PAB-MMAE (1000 |ag, 0,760 |amol, 1,0 eq) como disolución en DMF seca (160 |al). Se agitó la reacción durante 3 h. Se purificó el material en bruto mediante Hp LC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (322 |ag, 20%). EM(ES+) m/z 2236,07 (M+H)+
Figure imgf000055_0003
Conjugado 21: estructura de “ESV6-ValCit-MMAE”.
La figura 26 muestra la estructura, el perfil cromatográfico y el análisis por CL/EM de ESV6-ValCit-MMAE (21).
EM(ES+) m/z 1118,05 (M+2H)2+.
PARTE 2 - Experimentos con animales
Preparación de células tumorales
Tras la descongelación, se mantuvieron las células tumorales SK-MEL-187 en cultivo en medio RPMI complementado con suero bovino fetal (10%, FBS) y antibiótico-antimicótico (1%, AA) a 37°C y el 5% de CO2. Para los pases, se desprendieron las células usando tripsina-EDTA al 0,05% cuando se alcanzó el 90% de confluencia y volvieron a sembrarse a una dilución de 1:4.
Experimentos de IVIS
Se implantaron tumores xenoinjertados SK-MEL-187 en ratones BALB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad) tal como se describió anteriormente y se permitió que crecieran hasta un volumen promedio de 0,1 ml. A ratones que portaban tumores SK-MEL-187 subcutáneos se les inyectó por vía intravenosa ESV6-IRDye750, HABERKORN-IRDye750 o QCOOH-IRDye750 (150 nmol/kg, como disoluciones 30 |iM preparadas en PBS estéril, pH 7,4). Se anestesiaron los ratones con isoflurano y se adquirieron imágenes por fluorescencia en un sistema de obtención de imágenes espectrales IVIS (Xenogen, exposición de 1 s, factor de agrupación de píxeles de 8, excitación a 745 nm, filtro de emisión a 800 nm, número f de 2, campo de visión de 13,1). Se tomaron imágenes 5 min, 20 min y 1 h después de la inyección. Se proporcionó pienso y agua a voluntad durante ese periodo. Posteriormente se sacrificaron los ratones mediante asfixia con CO2 (punto de tiempo de 2 h). Se recogieron sangre, corazón, pulmón, riñones, hígado, bazo, estómago, una sección del intestino y el tumor SK-MEL-187 y se obtuvieron imágenes individualmente usando los parámetros anteriormente mencionados (figura 7).
Específicamente, la figura 7 muestra la evaluación del rendimiento de direccionamiento de conjugados con IRDye750 en obtención de imágenes por fluorescencia en el infrarrojo cercano de ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos de melanoma SK-MEL-187 después de la administración intravenosa (dosis de 150 nmol/kg): (A) imágenes de animales vivos en diversos puntos de tiempo (5 min, 20 min y 1 h después de la inyección); (B) se presentan imágenes de órganos ex vivo a las 2 h. El compuesto ESV6-IRDye750, un derivado del ligando de alta afinidad de FAP “ESV6”, muestra una mayor razón de captación de tumor con respecto a hígado, tumor con respecto a riñón y tumor con respecto a intestino en comparación con HABERKORN-IRDye750. QCOOH-IRDye750 (control no dirigido) no se localiza en lesiones SK-MEL-187 in vivo.
Experimentos de terapia
Se implantaron tumores xenoinjertados SK-MEL-187 en ratones BALB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad) tal como se describió anteriormente y se permitió que crecieran hasta un volumen promedio de 0,1 ml. se asignaron aleatoriamente los ratones en grupos de terapia de 3 animales. Se inyectaron HABERKORN-ValCit-MMAE (250 nmol/kg) y ESV6-ValCit-MMAE (250 nmol/kg) diariamente como disolución en PBS estéril con el 1% de DMSO durante 7 días consecutivos. Se midieron los tumores con un compás calibrador electrónico y se pesaron los animales diariamente. Se calculó el volumen tumoral (mm3) con la fórmula (lado largo, mm) x (largo corto, mm) x (lado corto, mm) x 0,5 (figura 8). Se usó el software Prism 6 (GraphPad Software) para el análisis de datos (ANOVA bilateral regular seguido de la prueba de Bonferroni).
Específicamente, la figura 8 muestra la evaluación de la actividad terapéutica de ESV6-ValCit-MMAE y HABERKORN-ValCit-MMAE en ratones que portan tumores SK-MEL-187. Los puntos de datos representan el volumen tumoral medio EEM (n = 3 por grupo). (A) Las flechas indican infección IV de los diferentes tratamientos. ESV6-ValCit-MMAE, un derivado de conjugado de fármaco del ligando de alta afinidad de FAP “ESV6”, muestra un efecto antitumoral más potente en comparación con HABERKORN-ValCit-MMAE. (B) Se muestra la tolerabilidad de los diferentes tratamientos, tal como se evalúa mediante la evaluación de los cambios (%) en peso corporal de los animales durante el experimento. ESV6-ValCit-MMAE muestra una menor toxicidad aguda en comparación con HABERKORN-ValCit-MMAE.
Ejemplo 5: preparación de conjugados para radiomarcaje
Síntesis de “HABERKORN-DOTA”
Se disolvieron (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-6-(3-(piperazin-1-il)propoxi)quinolin-4-carboxamida (15 mg, 0,030 mol, 1,0 eq), HATU (13 mg, 0,039 mmol, 1,1 eq) y 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetato de tri-ferc-butilo (19 mg, 0,039 mmol, 1,1 eq) en DCM/DMF (800 |il/50 |il). Se añadió gota a gota DIPEA (18 |il, 0,101 mmol, 3 eq) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 1 h. Se trató el producto en bruto con TFA (40%) durante la noche y se purificó mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (4 mg, 15%). EM(ES+) m/z 873,4 (M+H)+
Figure imgf000057_0001
Conjugado 22: estructura de “HABERKORN-DOTA”.
Síntesis de “ESV6-DOTA” (8)
Se disolvió ácido (S)-4-((4-((2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanoico (15 mg, 0,032 mmol, 1,0 eq) en DMSO seco (400 |l). Se añadieron diciclohexilcarbodiimida (9 mg, 0,042 mmol, 1,3 eq) y N-hidroxisuccinimida (4,5 mg, 0,039 mmol, 1,3 eq) y se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, protegida de la luz. Se añadieron 100 | l de disolución de PBS que contenía ácido 2,2’,2”-(10-(4-((2-aminoetil)amino)-1-carboxi-4-oxobutil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético (20 mg, 0,039 mmol, 1,2 eq) y se agitó la reacción durante 2 h. Se purificó el producto en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (2,4 mg, 8%). EM(ES+) m/z 960,39 (M+H)+
Figure imgf000057_0002
Conjugado 8: estructura de “ESV6-DOTA”.
La figura 27 muestra la estructura, el perfil cromatográfico y el análisis por CL/EM de ESV6-DOTAGA (8). EM(ES+) m/z 960,39 (M+H)+.
Ejemplo 6: experimento comparativo entre el compuesto P4 y el compuesto 24
PARTE 1 - Preparación del compuesto 24
Síntesis de ácido 7-(fenilamino)quinolin-4-carboxílico
Figure imgf000057_0003
Esquema 9. Ruta de síntesis para la preparación de ácido 7-(fenilamino)quinolin-4-carboxílico
Se añadió ácido 7-bromoquinolin-4-carboxílico (30 mg, 0,119 mmol, 1,0 eq) a una disolución con agitación de anilina (111 mg, 1,19 mmol, 198 |l, 10,0 eq) en tolueno (1 ml) y dioxano (500 |l) en un vial a presión. Se desgasificó la disolución durante 5 minutos (ciclos de argón-vacío) y luego se añadieron paladaciclo de BrettPhos (10 mg, 0,0119 mmol, 0,1 eq) y terc-butóxido de potasio (53 mg, 0,476 mmol, 4,0 eq) y se calentó la reacción hasta 110°C durante 4 h y se comprobó mediante CL/EM. Se absorbió el producto en bruto sobre sílice y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (DMC/MeOH desde 9:1 hasta 2:8) para dar el compuesto como un aceite naranja (31 mg, 0,119 mmol, 100%). EM(ES+) m/z 265,09 (M+H)+
Síntesis de (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1 -il)-2-oxoetil)-7-(fenilamino)quinolin-4-carboxamida (compuesto 24)
Figure imgf000058_0001
Esquema 10. Ruta de síntesis para la preparación de (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-7-(fenilamino)quinolin-4-carboxamida (compuesto 24)
Se añadieron ácido 7-(fenilamino)quinolin-4-carboxílico (31 mg, 0,119 mmol, 1,0 eq), (S)-4,4-difluoro-1-glicilpirrolidin-2-carbonitrilo (24 mg, 0,129 mmol, 1,1 eq) y HATU (89 mg, 0,234 mmol, 2 eq) a una disolución de DMF (200 ^l) y diclorometano (1 ml). Se añadió gota a gota DIPEA (45 mg, 0,352 mmol, 61 ^l, 3 eq) y se agitó la reacción durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se evaporó el DCM y se purificó el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido amarillo (3,5 mg, 0,008 mmol, 6,9%). EM(ES+) m/z 436,15 (M+1H)1+
PARTE 2 - Experimentos in vitro
Ensayo de inhibición in vitro de hFAP
Se midió la actividad enzimática de FAP humana sobre el sustrato Z-Gly-Pro-AMC en presencia de diferentes ligandos orgánicos pequeños (compuesto P4 del ejemplo 2; compuesto 24) a temperatura ambiente en un lector de placas de microtitulación, monitorizando la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm. La mezcla de reacción contenía sustrato 20 .^M, FAP humana 20 nM (constante), tampón de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,4) e inhibidor (dilución en serie desde 10-6 hasta 10-11 M, 1:2) en un volumen total de 20 l^. El valor de CI50 se define como la concentración de inhibidor requerida para reducir la actividad enzimática en un 50% después de la adición del sustrato).
La figura 9 muestra que el compuesto P4 del ejemplo 2 muestra una menor CI50 (16,83 nM, mayor inhibición) en comparación con el compuesto 24 (33,46 nM, menor inhibición).
Ejemplo 7: síntesis de los conjugados 15 y 25 y su caracterización
PARTE 1 - Preparación de conjugados
Síntesis del conjugado 15
Figure imgf000058_0002
Esquema 11. estructura del conjugado 15.
Se disolvió SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (2 mg, 2,171 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (800 |l). Se añadió fluoresceína-5-maleimida (1,8 mg, 4,343 |mol, 2,0 eq) como disolución en DMSO seco (200 |l). Se agitó la reacción durante 3 h. Se purificó el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido amarillo (420 nmol, 19,3%). EM(ES+) m/z 1348,36 (M+1H)1+
La figura 25 muestra la estructura, el perfil cromatográfico y el análisis por CL/EM del conjugado 15. EM(ES+) m/z 1348,36 (M+1H)+.
Síntesis del conjugado 25
Figure imgf000059_0001
Esquema 12. estructura del conjugado 25.
Se disolvió SH-Cys-Asp-Lys-Asp-HK (1 mg, 0,954 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (800 |l). Se añadió fluoresceína-5-maleimida (817 ig, 1,909 |mol, 2,0 eq) como disolución en DMSO seco (200 |l). Se agitó la reacción durante 3 h. Se purificó el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido amarillo (373 nmol, 39,1%). EM(ES+) m/z 1476,47 (M+1H)1+
PARTE 2 - Experimentos in vitro
Medición de afinidad por FAP humana y murina mediante polarización por fluorescencia (PF)
Se realizaron experimentos de polarización por fluorescencia en placas de 384 pocillos (sin unión, ps, fondo f, negro, volumen alto, 30 | l de volumen final). Se diluyeron en serie disoluciones madre de FAP humana (4 |M) y FAP murina (5 |M) con tampón (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,4), mientras se mantenía constante la concentración final de los grupos de unión a 10 nM. Se midió la anisotropía de fluorescencia en un lector de placas de microtitulación TECAN. Se realizaron los experimentos por triplicado y se ajustaron los valores medios de anisotropía usando Prism 7.
La figura 10A muestra que el conjugado 15 tiene una mayor afinidad por hFAP (KD = 0,68 nM) en comparación con el conjugado 25 (KD= 1,02 nM). La figura 10B muestra que el conjugado 15 tiene una mayor afinidad por mFAP (KD = 11,61 nM) en comparación con el conjugado 25 (KD = 30,94 nM). El conjugado 15 presenta propiedades de unión a hFAP superiores y una mejor reactividad cruzada con el antígeno murino en comparación con el conjugado 25.
Experimentos de coelución cromatográfica de complejos ligando-proteína
Se equilibró previamente una columna PD-10 con tampón de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,4) antes de la carga del complejo. Se incubó una mezcla de diferentes proteínas (hFAP = 2 |M, mFAP = 5 |M) y conjugado 15 (100 nM) y se cargaron en una columna. Se enjuagó la mezcla usando el tampón de ensayo. Se recogió la fracción no retenida en placas de 96 pocillos y se midió la intensidad de fluorescencia inmediatamente en un lector de placas de microtitulación TECAN, monitorizando la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. Se estimó la concentración de las proteínas midiendo la absorbancia a 280 nM usando un espectrofotómetro Nanodrop 2000/2000c.
La figura 11 muestra los resultados del experimento de coelución en PD-10 de conjugado de ligando de molécula pequeña 15 con hFAP (A) y mFAP (B). Se forma un complejo estable entre ambas proteínas y el conjugado de ligando pequeño 15, lo que permite una coelución de las dos moléculas juntas.
PARTE 3 - Experimentos con animales
Cultivos celulares
Tras la descongelación, se mantuvieron las células SK-RC-52.hFAP y SK-RC-52 en cultivo en medio RPMI complementado con suero bovino fetal (10%, FBS) y antibiótico-antimicótico (1%, AA) a 37°C y el 5% de CO2. Para los pases, se desprendieron las células usando tripsina-EDTA al 0,05% cuando se alcanzó el 90% de confluencia y volvieron a sembrarse a una dilución de 1:4.
Tras la descongelación, se mantuvieron las células HT-1080.hFAP y HT-1080 en cultivo en medio DMEM complementado con suero bovino fetal (10%, FBS) y antibiótico-antimicótico (1%, AA) a 37°C y el 5% de CO2. Para los pases, se desprendieron las células usando tripsina-EDTA al 0,05% cuando se alcanzó el 90% de confluencia y volvieron a sembrarse a una dilución de 1:4.
Análisis por microscopía confocal de SK-RC-52.hFAP, SK-RC-52, HT-1080.hFAP y HT-1080
Se sembraron células SK-RC-52.hFAP y SK-RC-52 en placas con cámara de cubreobjetos de 4 pocillos a una densidad de 104 células por pocillo en medio RPMI (1 ml) complementado con FCS al 10%, AA y He PeS (10 mM) y se permitió que crecieran durante 24 horas en condiciones de cultivo convencionales. Se usó el colorante nuclear Hoechst 33342 para teñir las estructuras nucleares.
Se reemplazó el medio de cultivo por medio nuevo que contenía conjugado 15 (100 nM). Se obtuvieron imágenes de colonias seleccionadas aleatoriamente en un microscopio confocal SP8 equipado con un dispositivo AOBS (Leica Microsystems).
Se sembraron células HT-1080.hFAP y HT-1080 en placas con cámara de cubreobjetos de 4 pocillos a una densidad de 104 células por pocillo en medio DMEM (1 ml) complementado con FCS al 10%, AA y HEPES (10 mM) y se permitió que crecieran durante 24 horas en condiciones de cultivo convencionales. Se usó el colorante nuclear Hoechst 33342 para teñir las estructuras nucleares.
Se reemplazó el medio de cultivo por medio nuevo que contenía conjugado 15 (100 nM). Se obtuvieron imágenes de colonias seleccionadas aleatoriamente en un microscopio confocal SP8 equipado con un dispositivo AOBS (Leica Microsystems).
La figura 12 muestra la evaluación de la acumulación selectiva de conjugado 15 (10 nM) en células tumorales SK-RC-52.hFAP, HT-1080.hFAP y de tipo natural a través de microscopía confocal y análisis de FACS. (A) Las imágenes de SK-RC-52.hFAP incubadas con el compuesto en diferentes puntos de tiempo (t = 0 y 1 h) muestran acumulación de conjugado 15 sobre la membrana celular. (B) Las imágenes de SK-RC-52 de tipo natural después de la incubación con el compuesto no muestran acumulación sobre la membrana celular (control negativo). (C) El análisis de FACS en SK-RC-52 de tipo natural (pico gris oscuro) y SK-RC-52.hFAP (pico gris claro) muestra unión celular específica de FAP del conjugado 15 (10 nM). (D) Las imágenes de HT-1080.hFAP incubadas con el compuesto en diferentes puntos de tiempo (t = 0 y 1 h) muestran acumulación de conjugado 15 sobre la membrana celular y en el interior del citosol. (E) Las imágenes de HT-1080 de tipo natural después de la incubación con el compuesto no muestran acumulación sobre la membrana celular ni en el citosol (control negativo).
Análisis de FACS
Se desprendieron SK-RC-52.hFAP, SK-RC-52.wt, HT-1080.wt y HT-1080.hFAP de las placas de cultivo usando Accutase, se contaron y se suspendieron hasta una concentración final de 1,5 * 106 células/ml en una disolución al 1% v/v de FCS en PBS, pH 7,4. Se centrifugaron alícuotas de 3 * 105 células (200 |il) y se resuspendieron en disoluciones de conjugado 15 (15 nM) en una disolución al 1% v/v de FCS en PBS, pH 7,4 (200 |il) y se incubaron en hielo durante 1 h. Se lavaron las células una vez con 200 |il de disolución al 1% v/v de FCS en PBS, pH 7,4 (200 |il), se centrifugaron, se resuspendieron en una disolución al 1% v/v de FCS en PBS, pH 7,4 (300 |il) y se analizaron en un citómetro CytoFLEX (Beckman Coulter). Se procesaron los datos sin procesar con el softWare FlowJo 10.4.
Los resultados se muestran en la figura 12F: el análisis de FACS en HT-1080 de tipo natural (pico gris oscuro) y HT-1080.hFAP (pico gris claro) muestra unión celular específica de FAP del conjugado 15 (10 nM).
Estudios con animales
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo según las regulaciones y leyes suizas sobre el bienestar animal y bajo el número de licencia ZH04/2018 concedida por Veterinaramt des Kantons Zürich.
Implantación de tumores SK-RC-52.hFAP subcutáneos
Se hicieron crecer células SK-RC-52.hFAP hasta el 80% de confluencia y se desprendieron con tripsina-EDTA al 0,05%. Se resuspendieron las células en medio HBSS hasta una concentración final de 5 x 107 células/ml. Se inyectaron por vía subcutánea alícuotas de 5 x 106 células (100 | l de suspensión) en el costado derecho de ratones bAlB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad).
Experimento ex vivo
A ratones que portaban tumor SK-RC-52.hFAP subcutáneo se les inyectó por vía intravenosa conjugado 15 (40 nmol en PBS estéril, pH 7,4). Se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO21 h después de la inyección intravenosa y se extirparon los órganos y tumores, se ultracongelaron en medio OCT y se almacenaron a -80°C. Se realizaron cortes criótomos (7 |m) y se tiñeron los núcleos con medio de montaje de fluorescencia (Dako Omnis, Agilent). Se obtuvieron imágenes usando un microscopio Axioskop2 mot plus (Zeiss) y se analizaron mediante el software ImageJ 1.53.
La figura 13 muestra los resultados de la evaluación del rendimiento de direccionamiento de conjugado 15 en ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos de carcinoma de células renales SK-RC-52.hFAP después de la administración intravenosa (40 nmol). Se presentan imágenes de órganos ex vivo 1 h después de la administración. El compuesto se localiza de manera rápida y homogénea en el sitio tumoral in vivo 1 hora después de la inyección intravenosa, con una alta selectividad de tumor con respecto a órganos.
Ejemplo 8: síntesis y caracterización del conjugado 9
PARTE 1 - Preparación del conjugado
Síntesis del conjugado 9 (ácido 2,2’,2”-(10-(1-carboxi-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanamido)etil)amino)-4-oxobutil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético marcado con 177-Lutecio)
Figure imgf000061_0001
Esquema 13. estructura del conjugado 9
Se disolvió el conjugado 8 en tampón acetato (1 M, pH=4) hasta una concentración final de 1 ig /|l. Se diluyó la disolución madre de conjugado 8 (25 ig en 25 |l) con 250 | l de tampón acetato (1 M, pH=4). Se añadió disolución de 177LuCl3 (250 |l, 25 MBq) y se calentó la mezcla a 95°C durante 15 minutos. Se diluyó la mezcla de marcaje mediante la adición de PBS estéril (1975 |l, pH=7,4) y se monitorizó la eficiencia de marcaje mediante radio-HPLC (5-10 |l, 0,5 - 1 MBq, TFA al 0,1% en agua como disolvente A y TFA al 0,1% en acetonitrilo como disolvente B, programa: 0-8 min, el 20%-65% de disolvente B y velocidad de flujo de 1 ml/min). Se logró la conversión cuantitativa en el conjugado 9 (eficiencia de radiomarcaje > 99%, figura 14).
La figura 14A muestra un perfil de radioHPLC del conjugado 9 después del marcaje con 177Lu (t.r. 11 min). La figura 14B muestra un perfil de radioHPLC de 177Lu libre (2 min). Después del radiomarcaje, el conjugado 9 aparece como un único pico con un >99% de conversión.
PARTE 2 - Experimentos con animales
Experimento de radiomarcaje y biodistribución en SK-RC-52.hFAP
Se implantaron células tumorales SK-RC-52.hFAP en ratones BALB/c nu/nu hembra tal como se describió en el ejemplo 7 y se permitió que crecieran durante tres semanas hasta un volumen promedio de 250 mm3. Se aleatorizaron los ratones (n = 4 por grupo) y se les inyectó por vía intravenosa preparaciones radiomarcadas de conjugado 9 (50, 125, 250, 500 ó 1000 nmol/kg; 0,5-2 MBq). Se sacrificaron los ratones 10 minutos, 1 h, 3 h y 6 h después de la inyección mediante asfixia con CO2 y se extrajeron los órganos, se pesaron y se midió la radiactividad con un contador y Packard Cobra. Los valores se expresan como % de Dl/g ± DE (figura 15). Se proporcionó pienso y agua a voluntad durante ese periodo.
La figura 15 muestra los resultados del experimento de biodistribución de conjugado 9 (que incluye una carga activa radiactiva, 177Lu) en BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos de carcinoma de células renales SK-Rc -52. hFAP. (A) % de DI/g en tumores y órganos sanos y análisis de la razón de tumor con respecto a órganos en diferentes puntos de tiempo (10 min, 1 h, 3 h y 6 h) después de la administración intravenosa de conjugado 9 (dosis = 50 nmol/kg; 0,5­ 2 MBq). (B) % de DI/g en tumores y órganos sanos y análisis de la razón de tumor con respecto a órganos 3 h después de la administración intravenosa de 177Lu-conjugado 9 a diferentes dosis (125 nmol/kg, 250 nmol/kg, 500 nmol/kg y 1000 nmol/kg; 0,5-2 MBq). Puede observarse una respuesta dependiente de la dosis, y puede alcanzarse una saturación de la diana entre 250 nmol/kg y 500 nmol/kg. (C) % de DI/g en tumores y órganos sanos 3 h después de la administración intravenosa de disolución de 177Lu (control negativo; 1 MBq) y análisis de la razón de tumor con respecto a órganos.
Ejemplo 9: síntesis de los compuestos 27-32
Síntesis de ácido 2,2’,2”-(10-(1-carboxi-4-((2-(4-((4-((2-((R)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanamido)etil)amino)-4-oxobutil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético marcado con 69-Galio, conjugado 27
Figure imgf000062_0001
Se disolvió el conjugado 8 en tampón acetato (1 M, pH=4) hasta una concentración final de 1 ig /|l.
Se diluyó la disolución madre de conjugado 8 (100 ig en 100 |l) con 250 | l de tampón acetato (1 M, pH=4). Se añadió disolución de GaCl3 (183 ig en 183 | l de HCl) y se calentó la mezcla a 90°C durante 15 minutos. Se comprobó la reacción mediante Cl/e M. EM(ES+) m/z 1027,30 (M+H)+
Síntesis de (6-metoxiquinolin-4-carbonil)glicinato de metilo
Figure imgf000062_0002
Esquema 14. Ruta de síntesis para la preparación de (6-metoxiquinolin-4-carbonil)glicinato de metilo
Se disolvieron ácido 6-metoxiquinolin-4-carboxílico (200 mg, 0,985 mmol, 1,0 eq), HBTU (400 mg, 1,03 mmol, 1,05 eq), HOBt (167 mg, 1,05 mmol, 1,15 eq) y clorhidrato de glicinato de metilo (107 mg, 1,08 mmol, 1,1 eq) en 5 ml de DMF y se agitaron a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota DIPEA (613 |l, 4,42 mmol, 4,5 eq) y se comprobó la reacción mediante CL/EM hasta la competición. Se purificó directamente el producto en bruto mediante cromatografía (DCM:MeOH de 100:0 a 80:20 en 10 min) para proporcionar un sólido amarillo pálido (40 mg, 0,145 mmol, 14,7%). EM(ES+) m/z 275,1 (M+1H).
Síntesis de (6-metoxiquinolin-4-carbonil)glicinato
Figure imgf000063_0001
Esquema 15. Ruta de síntesis para la preparación de (6-metoxiquinolin-4-carbonil)glicinato
Se disolvió (6-metoxiquinolin-4-carbonil)glicinato de metilo (30 mg, 0,109 mmol, 1,0 eq) en 2 ml de THF/H2O (1:1) de una disolución de LiOH 1 M y se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. Cuando se completó, se extinguió la base con HCl 1 M hasta que se alcanzó un pH ligeramente ácido y se liofilizó el producto en bruto, para obtener un sólido blanco (rendimiento cuantitativo). EM(ES+) m/z 261,08 (M+1H)1+
Síntesis de (S)-N-(2-(2-cianopirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-6-metoxiquinolin-4-carboxamida, conjugado 28
Figure imgf000063_0002
Esquema 16. Ruta de síntesis para la preparación de (S)-N-(2-(2-cianopirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-6-metoxiquinolin-4-carboxamida
Se disolvieron (6-metoxiquinolin-4-carbonil)glicinato (28 mg, 0,109 mmol, 1,0 eq), (S)-pirrolidin-2-carbonitrilo (16 mg, 0,120 mmol, 1,1 eq) y HATU (62 mg, 0,164 mmol, 1,5 eq) en 2 ml de DMF y se agitó la suspensión a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota DIPEA (47 ^l, 2,62 mmol, 24 eq) y se comprobó la reacción mediante CL/EM hasta la competición. Se purificó directamente el producto en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido amarillo (2 mg, 5,91 i^mol, 5,4%). EM(ES+) m/z 339,14 (M+1H)1+
Síntesis de ((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)carbamato de terc-butilo
Figure imgf000063_0003
Esquema 17. Ruta de síntesis para la preparación de ((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)carbamato de terc-butilo
Se disolvieron (S)-4,4-difluoro-pirrolidin-2-carbonitrilo (50 mg, 0,379 mmol, 1 eq), (terc-butoxicarbonil)-L-alanina (154 mg, 0,75 mmol, 2,0 eq) y HATU (288 mg, 0,75 mmol, 2 eq) en 4 ml de DMF y se agitó la suspensión a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota DIPEA (335 ^l, 1,893 mmol, 5 eq) y se comprobó la reacción mediante CL/EM hasta la competición. Se eliminó la DMF a vacío y se diluyó el producto en bruto en DCM. Se lavó la fase orgánica con agua y HCl 1 M y luego se secó, para obtener una espuma blanca (115 mg, 0,379 mmol, rendimiento cuantitativo). EM(ES+) m/z 304,14 (M+1H)1+
Síntesis de (S)-1-(L-alanil)-4,4-difluoropirrolidin-2-carbonitrilo
Figure imgf000064_0001
Esquema 18. Ruta de síntesis para la preparación de (S)-1-(L-alanil)-4,4-difluoropirrolidin-2-carbonitrilo
Se disolvió ((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)carbamato de terc-butilo (115 mg, 0,379 mmol, 1 eq), en 2 ml de DCM y se añadió gota a gota TFA (203 |l, 7 eq) y se agitó la reacción a temperatura ambiente y se comprobó mediante CL/EM hasta la competición. Se diluyó el producto en bruto en DCM y se extrajo el producto con HCl 1 M. Luego se extinguió la fase acuosa ácida con NaOH 1 M y se extrajo el producto con DCM y se secó, para proporcionar un aceite amarillo pálido (30 mg, 0,147 mmol, 38,7%). EM(ES+) m/z 204,07 (M+1H)1+ Síntesis de ((4-(((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)piridin-2-il)metil)carbamato de terc-butilo
Figure imgf000064_0002
Esquema 19. Ruta de síntesis para la preparación de ((4-(((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)piridin-2-il)metil)carbamato de terc-butilo
Se disolvieron (S)-1-(L-alanil)-4,4-difluoropirrolidin-2-carbonitrilo (30 mg, 0,147 mmol, 1 eq), ácido 2-(((terc-butoxicarbonil)amino)metil)isonicotínico (74 mg, 0,295 mmol, 2,0 eq) y HATU (112 mg, 0,295 mmol, 2 eq) en 1 ml de DMF y se agitó la suspensión a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota DIPEA (102 |l, 0,590 mmol, 4 eq) y se comprobó la reacción mediante CL/EM hasta la competición. Se eliminó la DMF a vacío y se diluyó el producto en bruto en DCM y se purificó mediante cromatografía (DCM:MeOH de 99:1 a 70:30 en 15 min) para proporcionar un sólido amarillo (15 mg. 0,034 mmol, 19,7%). EM(ES+) m/z 438,19 (M+1H)1+
Síntesis de 2-(aminometil)-N-((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)isonicotinamida
Figure imgf000064_0003
Esquema 20. Ruta de síntesis para la preparación de 2-(aminometil)-N-((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)isonicotinamida
Se disolvió ((4-(((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)piridin-2-il)metil)carbamato de terc-butilo (15 mg, 0,034 mmol, 1,0 eq), en 400 | l de DCM y se añadió gota a gota TFA (200 |l, 20% de volumen). Se agitó la reacción a temperatura ambiente y se comprobó mediante CL/EM hasta la competición. Se secó el producto en bruto y se liofilizó en 500 | l de una disolución 1:1 de agua:acetonitrilo, para obtener un polvo amarillo (4 mg, 11,86 |mol, 34,8%). EM(ES+) m/z 338,14 (M+1H)1+
Síntesis de ácido 4-(((4-(((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)piridin-2-il)metil)amino)-4-oxobutanoico, conjugado 29
Figure imgf000065_0001
Esquema 21. Ruta de síntesis para la preparación de ácido 4-(((4-(((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)carbamoil)piridin-2-il)metil)amino)-4-oxobutanoico
Se disolvió 2-(aminometil)-N-((S)-1-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)isonicotinamida (4 mg, 11,86 |mol, 1,0 eq) en 500 | l de THF. Se añadieron DMAP (6 mg, 48 |mol, 4,0 eq) y anhídrido succínico (3,5 mg, 35,6 |mol, 3,0 eq) y se agitó la reacción a temperatura ambiente y se comprobó mediante CL/EM hasta la competición. Se purificó directamente el producto en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido amarillo (1,3 mg, 2,97 |mol, 25%). EM(ES+) m/z 438,15 (M+1H)1+
Síntesis de ESV6-Alexa Fluor 488, conjugado 30
Figure imgf000065_0002
Se disolvió SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (293 ig, 0,32 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (300 |l). Se añadió Alexa Fluor™ 488 C5-maleimida (200 ig, 0,29 |mol, 0,9 eq) como disolución en DMSO seco (200 |l). Se agitó la reacción durante 3 h.
Se purificó el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido naranja (70 nmol, 21,9%). EM(ES+) m/z 1619,39 (M+1H)1+
Síntesis de ESV6-ValCit-PNU 159682, conjugado 31
Figure imgf000066_0001
Se disolvió SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV-6 (2 mg, 2,17 |mol, 1,2 eq) en PBS, pH 7,4 (750 |l). Se añadió MA-PEG4-VC-PAB-DMAE-PNU 159682 (2,5 mg, 1,75 |mol, 1,0 eq) como disolución en DMF seca (250 |l). Se agitó la reacción durante 3 h.
Se purificó el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (3 mg, 73%). EM(ES+) m/z 2348,88 (M+H)+ Síntesis de QCOOH-ValCit-PNU 159682, conjugado 32
Figure imgf000066_0002
Se disolvió SH-Cys-Asp-Lys-Asp-QCOOH (1,6 mg, 2,17 |mol, 1,2 eq) en PBS, pH 7,4 (750 |l). Se añadió MA-PEG4-VC-PAB-DMAE-PNU 159682 (2,5 mg, 1,75 |mol, 1,0 eq) como disolución en DMF seca (250 |l). Se agitó la reacción durante 3 h.
Se purificó el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (2,8 mg, 73%).
Ejemplo 10: caracterización y pruebas biológicas de los compuestos 18, 19, 21, P4, 27, 28, 29, 30
Materiales y métodos
Ensayo de inhibición in vitro de hFAP
Se midió la actividad enzimática de FAP humana sobre el sustrato Z-Gly-Pro-AMC a temperatura ambiente en un lector de placas de microtitulación, monitorizando la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm. La mezcla de reacción contenía sustrato 20 |M, FAP humana 20 nM (constante), tampón de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,4) y compuesto sometido a prueba (dilución en serie desde 10-6 gasta 10-11 M, 1:2) en un volumen total de 20 |l. El valor de CI50 se define como la concentración de inhibidor requerida para reducir la actividad enzimática en un 50% después de la adición del sustrato.
Cultivos celulares
Tras la descongelación, se mantuvieron las células SK-MEL-187, SK-RC-52.hFAP y SK-RC-52.wt en cultivo en medio RPMI complementado con suero bovino fetal (10%, FBS) y antibiótico-antimicótico (1%, AA) a 37°C y el 5% de CO2. Para los pases, se desprendieron las células usando tripsina-EDTA al 0,05% cuando se alcanzó el 90% de confluencia y volvieron a sembrarse a una dilución de 1:4.
Tras la descongelación, se mantuvieron las células HT-1080.hFAP y HT-1080.wt en cultivo en medio DMEM complementado con suero bovino fetal (10%, FBS) y antibiótico-antimicótico (1%, AA) a 37°C y el 5% de CO2. Para los pases, se desprendieron las células usando tripsina-EDTA al 0,05% cuando se alcanzó el 90% de confluencia y volvieron a sembrarse a una dilución de 1:4.
Estudios con animales
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo según las regulaciones y leyes suizas sobre el bienestar animal y bajo el número de licencia ZH04/2018 concedida por Veterinaramt des Kantons Zürich.
Implantación de tumores SK-RC-52.hFAP y HT-1080.hFAP subcutáneos
Se hicieron crecer células SK-RC-52.hFAP, HT-1080.hFAP, SK-RC-52.wt hasta el 80% de confluencia y se desprendieron con tripsina-EDTA al 0,05%. Se resuspendieron las células en medio HBSS hasta una concentración final de 5 * 107 células/ml. Se inyectaron por vía subcutánea alícuotas de 5 * 106 células (100 |il de suspensión) en el costado de ratones BALB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad). Se hicieron crecer células SK-MEL-187 hasta el 80% de confluencia y se desprendieron con tripsina-EDTA al 0,05%. Se resuspendieron las células en una mezcla 1:1 de HBSS:Matrigel hasta una concentración final de 10 * 107 células/ml. Se inyectaron por vía subcutánea alícuotas de 5 * 106 células (200 |il de suspensión) en el costado de ratones BALB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad).
Experimentos de IVIS
En un primer experimento, se implantaron tumores xenoinjertados HT-1080.hFAP en el costado derecho de ratones BALB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad) tal como se describió anteriormente y se permitió que crecieran hasta un volumen promedio de 0,1 ml. Se implantaron tumores xenoinjertados SK-RC-52.wt en el costado derecho de ratones BALB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad) tal como se describió anteriormente y se permitió que crecieran hasta un volumen promedio de 0,1 ml.
A los ratones se les inyectó por vía intravenosa ESV6-IRDye750 (18, 150 nmol/kg, como disoluciones 30 |iM preparadas en PBS estéril, pH 7,4). Se sacrificaron los ratones mediante asfixia con CO2 (punto de tiempo 1 h) y se adquirieron imágenes de fluorescencia de todos los órganos recogidos (sangre, corazón, músculo, pulmón, riñones, hígado, bazo, estómago, una sección del intestino, tumor SK-RC-52.wt y HT-1080.hFAP) en un sistema de obtención de imágenes espectrales IVIS (Xenogen, exposición de 1 s, factor de agrupación de píxeles de 8, excitación a 745 nm, filtro de emisión a 800 nm, número f de 2, campo de visión de 13,1).
En un experimento diferente, se implantaron tumores xenoinjertados SK-MEL-187 en el costado derecho de ratones BALB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad) tal como se describió anteriormente y se permitió que crecieran hasta un volumen promedio de 0,1 ml. Se implantaron tumores xenoinjertados SK-RC-52.hFAP en el costado izquierdo de ratones BALB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad) tal como se describió anteriormente y se permitió que crecieran hasta un volumen promedio de 0,1 ml. A los ratones se les inyectó por vía intravenosa ESV6-IRDye750 (18, 150 nmol/kg, como disoluciones 30 |iM preparadas en PBS estéril, pH 7,4). Se sacrificaron los ratones mediante asfixia con CO2 (punto de tiempo 1 h) y se adquirieron imágenes de fluorescencia de todos los órganos recogidos (sangre, corazón, músculo, pulmón, riñones, hígado, bazo, estómago, una sección del intestino, tumor SK-MEL-187 y SK-RC-52.hFAP) en un sistema de obtención de imágenes espectrales IVIS (Xenogen, exposición de 1 s, factor de agrupación de píxeles de 8, excitación a 745 nm, filtro de emisión a 800 nm, número f de 2, campo de visión de 13,1).
Experimentos ex vivo
A ratones que portaban tumores SK-RC-52.hFAP o HT-1080.hFAP subcutáneos en el costado derecho y tumor SK-RC-52.wt en el costado izquierdo se les inyectó por vía intravenosa conjugado 30 (40 nmol en PBS estéril, pH 7,4). Se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO2 1 h después de la inyección intravenosa y se extirparon los órganos y tumores, se ultracongelaron en medio OCT (Thermo Scientific) y se almacenaron a -80°C. Se realizaron cortes criótomos (7 |im) y se tiñeron los núcleos con medio de montaje de fluorescencia (Dako Omnis, Agilent). Se obtuvieron imágenes usando un microscopio Axioskop2 mot plus (Zeiss) y se analizaron mediante el software ImageJ 1.53.
Experimentos de terapia
Se implantaron tumores xenoinjertados SK-RC-52.hFAP en ratones BALB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad) tal como se describió anteriormente y se permitió que crecieran hasta un volumen promedio de 0,1 ml.
Se asignaron aleatoriamente los ratones en 8 grupos de terapia de 4 animales cada uno (5 grupos de agente único, 2 grupos de combinación y grupo de vehículo). Se inyectaron ESV6-ValCit-MMAE (21, 500 nmol/kg), QCOOH-ValCit-MMAE (19, 500 nmol/kg) como disolución en PBS estéril con el 2% de DMSO. Se diluyó L19-IL2 a 330 |ig/ml en el tampón de formulación apropiado y se administró por vía intravenosa a la dosis de 2,5 mg/kg.
Los ratones en los grupos de agente único recibieron inyecciones diarias de ESV6-ValCit-MMAE, QCOOH-ValCit-MMAE o L19-IL2.
Los ratones en los grupos de combinación recibieron inyecciones diarias de ESV6-ValCit-MMAE el día 8, 10 y 12 después de la implantación tumoral y de L19-IL2 el día 9, 11 y 13 después de la implantación tumoral.
Se midieron los tumores con un compás calibrador electrónico y se pesaron los animales diariamente. Se calculó el volumen tumoral (mm3) con la fórmula (lado largo, mm) x (lado corto, mm) x (lado corto, mm) x 0,5.
Se usó el software Prism 6 (GraphPad Software) para el análisis de datos (ANOVA bilateral regular seguido de la prueba de Bonferroni).
Experimento de biodistribución
Se implantaron tumores xenoinjertados SK-RC-52.hFAP (costado derecho) y SK-RC-52.wt (costado izquierdo) en ratones BALB/C nu/nu atímicos hembra (6-8 semanas de edad) tal como se describió anteriormente y se permitió que crecieran hasta un volumen promedio de 0,1 ml.
A los ratones se les inyectó ESV6-ValCit-MMAE (21, 250 nmol/kg) y se sacrificaron mediante asfixia con CO26 h después de la inyección intravenosa y se extirparon los órganos y tumores y se conservaron a -80°C. Se cortaron los órganos congelados con un bisturí (50 mg) y se suspendieron en 600 |il de acetonitrilo/agua 95:5 (TFA al 0,1%). Se añadió una disolución de D8-MMAE en acetonitrilo/agua 3:97 (FA al 0,1%; patrón interno, 50 |il, 50 nM). Se lisaron mecánicamente las muestras con un dispositivo Tissue Lyser II (Qiagen, 30 Hz de agitación, 15 minutos). A las muestras de plasma (50 |il) se les añadió una disolución de D8-MMAE en acetonitrilo/agua 3:97 (FA al 0,1%; patrón interno, 50 |il, 50 nM) y se precipitaron las proteínas mediante la adición de 600 |il de acetonitrilo/agua 95:5 (TFA al 0,1%). Se sedimentaron las proteínas tanto a partir de las muestras de órganos como a partir de las de plasma mediante centrifugación y se secaron los sobrenadantes con una centrífuga de vacío. Se resuspendieron los remanentes sólidos en 1 ml de acetonitrilo/agua 3:97 (TFA al 0,1%) y se limpiaron las disoluciones a través de una primera etapa de purificación en columnas HBL Oasis y una segunda purificación en columnas C18 Macro Spin. Se resuspendieron los eluatos secados purificados en 150 |il de acetonitrilo/agua 3:97 (FA al 0,1%) y se analizaron mediante EM. Todas las muestras se analizaron mediante espectrometría de masas en tándem con cromatografía de líquidos (CL-EM/EM) usando un espectrómetro de masas Q Exactive equipado con un dispositivo EASY-nLC 1000 (ambos de Thermo Fisher Scientific). Se resolvieron los analitos con una columna analítica Acclaim PepMap RSLC C18, 50 |im x 150 mm, 2 |im (Thermo Fisher Scientific) a una velocidad de flujo de 0,3 |il/min ejecutando un gradiente lineal desde el 3% hasta el 50% de ACN a lo largo de 60 min. Todos los tampones contenían ácido fórmico al 0,1%. Se registraron los espectros de masas en modo de barrido SIM con una resolución de 70000 y un tiempo máximo de inyección de 100 ms. Se registraron los espectros de EM/EM a una resolución de 35000 y un tiempo máximo de inyección de 250 ms. Se centraron las 4 ventanas SIM en los iones con doble y triple carga de ESV6-ValCit-MMAE, 1119,0435 m/z y 746,3648 m/z, respectivamente.
Luego se analizaron los archivos sin procesar con el software Skyline. Se usaron las áreas de MS1 de los dos iones para la cuantificación.
Estabilidad en suero de ratón
Se realizaron adiciones conocidas de disolución de marcaje de conjugado 27 (100 |il, 200 |iM) a 100 |il de suero de ratón y se incubaron a temperatura ambiente. Justo después de la adición y después de 10 min, 1 h, 3 h y 6 h, se precipitaron las proteínas mediante la adición de 100 |il de metanol y se centrifugaron las muestras a 16300 rpm durante 10 minutos. Se recogió el sobrenadante y se comprobó con HPLC analítica (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se evaluó la identidad del pico mediante CL/EM.
Resultados
La figura 16 muestra los resultados de la evaluación del rendimiento de direccionamiento de IRDye750-conjugado 18 en obtención de imágenes por fluorescencia en el infrarrojo cercano de ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos SK-MEL-187 (costado derecho) y SK-RC-52.hFAP (costado izquierdo) después de la administración intravenosa (dosis de 150 nmol/kg): (A) imágenes de animales vivos antes de la inyección y 30 minutos después de la inyección intravenosa; (B) se presentan imágenes de órganos ex vivo a la 1 h. El compuesto ESV6-IRDye750 (18) se acumula tanto en tumores SK-RC-52.hFAP como en SK-MEL-187, presentando una mayor acumulación en tumores SK-RC-52.hFAP debido a una mayor expresión de FAP en comparación con SK-MEL-187.
La figura 17 muestra el experimento de inhibición de hFAP en presencia de diferentes ligandos orgánicos pequeños. El conjugado 28 muestra una menor propiedad de inhibición de FAP en comparación con el ejemplo 2, P4. El conjugado 29, que incluye un elemento estructural de L-alanina entre la sección de cabeza de cianopirrolidina y el anillo de piridina, no inhibe la actividad proteolítica de FAP a las concentraciones sometidas a prueba en el ensayo. La figura 18 muestra los resultados de la evaluación del rendimiento de direccionamiento de IRDye750-conjugado 18 en obtención de imágenes por fluorescencia en el infrarrojo cercano de ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos HT-1080.hFAP y SK-RC-52.wt después de la administración intravenosa (dosis de 150 nmol/kg). Se presentan imágenes de órganos ex vivo a la 1 h. El compuesto ESV6-IRDye750 (18) se acumula de manera selectiva en el tumor HT-1080.hFAP que presenta expresión de FAP y no se acumula en SK-RC-52.wt.
La figura 19 muestra los resultados de la evaluación del rendimiento de direccionamiento de conjugado 30 en ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos SK-RC-52.hFAP (costado derecho) y SK-RC-52.wt (costado izquierdo) después de la administración intravenosa (40 nmol). Se presentan imágenes de órganos ex vivo 1 h después de la administración. El compuesto se localiza de manera rápida, homogénea y selectiva in vivo en el tumor que presenta expresión de FAP 1 hora después de la inyección intravenosa, con una excelente selectividad de tumor con respecto a órganos. (B) Muestra la estructura de ESV6-Alexa Fluor 488 (30).
La figura 20 muestra los resultados de la evaluación del rendimiento de direccionamiento de conjugado 30 en ratones BALB/C nu/nu que portan xenoinjertos HT-1080.hFAP (costado derecho) y SK-RC-52.wt (costado izquierdo) después de la administración intravenosa (40 nmol). Se presentan imágenes de órganos ex vivo 1 h después de la administración (A). El compuesto se localiza de manera rápida, homogénea y selectiva in vivo en el tumor que presenta expresión de FAP 1 hora después de la inyección intravenosa, con una excelente selectividad de tumor con respecto a órganos. (B) Muestra la estructura de ESV6-Alexa Fluor 488 (30).
La figura 21 muestra los resultados de evaluación de la actividad terapéutica de ESV6-ValCit-MMAE (21) y QCOH-ValCit-MMAE (19) en ratones que portan tumores SK-RC-52.hFAP (A). Los puntos de datos representan el volumen tumoral medio EEM (n = 4 por grupo). Los compuestos se administraron por vía intravenosa (inyección en la vena de la cola) comenzando en el día 8, durante 6 días consecutivos. ESV6-ValCit-MMAE (21), un derivado de conjugado de fármaco del ligando de alta afinidad de FAP “ESV6”, muestra un efecto antitumoral más potente en comparación con QCOOH-ValCit-MMAE (19), una versión no dirigida de la molécula. (B) Muestra la tolerabilidad de los diferentes tratamientos tal como se evalúa mediante la evaluación de los cambios (%) en peso corporal de los animales durante el experimento. (C) Estructuras de ESV6-ValCit-MMAE (21) y QCOOH-ValCit-MMAE (19).
La figura 22 muestra los resultados de la evaluación de la actividad terapéutica de ESV6-ValCit-MMAE (21), L19-IL2 y su combinación en ratones que portan tumores SK-RC-52.hFAP (A). Los puntos de datos representan el volumen tumoral medio EEM (n = 4 por grupo). ESV6-ValCit-MMAE se administró por vía intravenosa (inyección en la vena de la cola) los días 8, 10, 12. L19-IL2 se administró por vía intravenosa (inyección en la vena de la cola) los días 9, 11, 13. ESV6-ValCit-MMAE combinado con L19-IL2 muestra un efecto antitumoral muy potente (4/4 con remisión tumoral completa) en comparación con L19-2 solo. (B) Muestra la tolerabilidad de los diferentes tratamientos tal como se evalúa mediante la evaluación de los cambios (%) en peso corporal de los animales durante el experimento.
La figura 23 muestra los resultados del experimento de biodistribución cuantitativa de conjugado molécula pequeñafármaco ESV6-ValCit-MMAE (21) en ratones BALB/C/nu-/nu que portan SK-RC-52.hFAP en el costado derecho y SK-RC-52.wt en el costado izquierdo. El compuesto se acumula de manera selectiva en tumores SK-RC-52 positivos para FAP (es decir, 18% de DI/g en el sitio tumoral, 6 horas después de la administración intravenosa). En cambio, ESV6-ValCit-MMAE no se acumula en tumores SK-RC-52 de tipo natural negativos para FAP. La captación del conjugado en órganos sanos es insignificante (menor del 1% de DI/g).
La figura 24 muestra los resultados del estudio de estabilidad de conjugado 27 (que incluye una carga activa, 69Ga) en suero de ratón. Los perfiles de HPLC y CL/EM de la muestra procesada a las 0 y 6 horas después de la incubación muestran un único pico con la masa correcta (masa esperada: 1028,30. EM(ES+) m/z 514,3 (M+2H)). Ejemplo 11: Síntesis de conjugados adicionales
Síntesis del conjugado 39
Figure imgf000070_0001
Se disuelve ácido (S)-4-((4-((2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanoico (15 mg, 0,032 mmol, 1,0 eq) en DMSO seco (400 |l). Se añaden diciclohexilcarbodiimida (9 mg, 0,042 mmol, 1,3 eq) y N-hidroxisuccinimida (4,5 mg, 0,039 mmol, 1,3 eq) y se agita la reacción durante la noche a temperatura ambiente, protegida de la luz. Se añaden 100 | l de disolución de PBS que contenía ácido 2,2’-(7-(4-((2-aminoetil)amino)-1-carboxi-4-oxobutil)-1,4,7-triazonano-1,4-diil)diacético (16,2 mg, 0,039 mmol, 1,2 eq) y se agita la reacción durante 2 h. Se purifica el producto en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido blanco. EM(ES+) m/z 858,35 (M+H)+
Síntesis del conjugado 40
Figure imgf000070_0002
Se añade una disolución de conjugado 39 (1 ml, 150 |M) en tampón acetato de sodio (0,1 M, pH 4) a un vial independiente que contiene una disolución de (Al15 *8 *20F)2+ recién preparada (obtenida tal como se describió previamente en la bibliografía, Cleeren et al., Bioconjugate. Chem. 2016J. Se calienta el vial cerrado a temperaturas de 95°C durante 12 min. Se confirma la formación del complejo mediante análisis por radio-HPLC y radio-CCF.
Síntesis del conjugado 41
Figure imgf000071_0001
Se disuelve SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (2 mg, 2,171 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (800 |l). Se añade maleimido-NOTA (3,0 mg, 4,343 |mol, 2,0 eq) como disolución en DMSO seco (200 |l). Se agita la reacción durante 3 h. Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido amarillo. EM(ES+) m/z 1345,48 (M+1H)1+.
Síntesis del conjugado 43a
Figure imgf000071_0002
Se hincha Fmoc-Lys(NeBoc) precargado disponible comercialmente sobre resina Tentagel (300 mg, 0,18 mmol, RAPP Polymere) en Dm F (3 x 5 min x 5 ml), se retira el grupo Fmoc con piperidina al 20% en Dm F (1 x 1 min x 5 ml y 2 x 10 min x 5 ml) y se lava la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml). Se extiende el péptido con Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH y ácido (S)-4-((4-((2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanoico en el orden indicado. Para este propósito, se disuelven el aminoácido protegido con Fmoc (2,0 eq), HBTU (2,0 eq), HOBt (2,0 eq) y DIPEA (4,0 eq) en DMF (5 ml). Se permite que la mezcla repose durante 10 min a 0°C y luego se hace reaccionar con la resina durante 1 h con agitación suave. Después de lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml), se retira el grupo Fmoc con piperidina al 20% en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml). A las etapas de desprotección le siguen etapas de lavado con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes del acoplamiento con el siguiente aminoácido. Se escinde el péptido de la resina con una mezcla de TFA al 20% en DCM a temperatura ambiente durante 1 h. Se elimina el disolvente a presión reducida y se precipita el producto en bruto en dietil éter frío, se centrifuga, se disuelve en agua/ACN y se purifica mediante HPLC (t Fa al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 5:5 en 15 min) y se liofiliza, para obtener un sólido blanco. Se hace reaccionar el compuesto con 6-(trimetil- -azaneil)nicotinato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2,0 eq) en acetonitrilo seco (2 ml) durante la noche. Se hace reaccionar el compuesto en bruto con [18F]TBAF (2,0 eq), TBAHCO3 (2,0 eq) en una mezcla de tBuOH:MeOH (5:2) a 50°C durante 10 minutos para proporcionar el compuesto final. EM(ES+) m/z 967,33 (M+1H)1+
Síntesis de Cys(STrt)-Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc sobre resina
Figure imgf000072_0001
Esquema 22. Ruta de síntesis para la preparación de Cys(STrt)-Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc sobre resina
Se hinchó Fmoc-Cys(Trt) precargado disponible comercialmente sobre resina Tentagel (500 mg, 0,415 mmol, RAPP Polymere) en DMF (3 x 5 min x 5 ml), se retiró el grupo Fmoc con piperidina al 20% en DMF (1 x 1 min x 5 ml y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml). Se extendió el péptido con Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(NHBoc)-OH y Fmoc-Asp(tBu)-OH en el orden indicado. Para este propósito, se disolvieron el aminoácido protegido con Fmoc (2,0 eq), h Bt U (2,0 eq), HOBt (2,0 eq) y DIPEA (4,0 eq) en DMF (5 ml). Se permitió que la mezcla reposara durante 10 min a 0°C y luego se hizo reaccionar con la resina durante 1 h con agitación suave. Después de lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml), se retiró el grupo Fmoc con piperidina al 20% en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml). A las etapas de desprotección le siguieron etapas de lavado con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes del acoplamiento con el siguiente aminoácido.
Síntesis de ácido (2R,5R,8S,11S,14S)-11-(4-aminobutil)-8-(carboximetil)-14-(4-((4-((2-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanamido)-2,5-bis(mercaptometil)-4,7,10,13-tetraoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanodioico (SH-Cys-SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESv6, P7)
Figure imgf000072_0002
Esquema 23. Ruta de síntesis para la preparación de ácido (2R,5R,8S,11S,14S)-11-(4-aminobutil)-8-(carboximetil)-14-(4-((4-((2-((S)-2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanamido)-2,5-bis(mercaptometil)-4,7,10,13-tetraoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecanodioico (SH-Cys-SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6, P7)
Se hinchó Cys(STrt)-Cys(STrt)-Asp(OtBu)-Lys(NHBoc)-Asp(OtBu)-NHFmoc sobre resina (80 mg, 0,04 mmol) en DMF (3 x 5 min x 5 ml). Se extendió el péptido con ácido (S)-4-((4-((2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanoico (37 mg, 0,08 mmol, 2 eq), Ha TU (30 mg, 0,08 mmol, 2,0 eq) y DIPEA (28 |l, 0,16 mmol, 4,0 eq) y se dejó reaccionar durante 1 h con agitación suave. Después de lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml), se escindió el compuesto agitando la resina con una mezcla de TFA (15%), TIS (2,5%) y H2O (2,5%) en DCM durante 4 ha temperatura ambiente. Se lavó la resina con metanol (2 x 5 ml) y se concentraron a vacío las disoluciones de escisión y lavado combinadas. Se purificó el producto en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (8 mg, 0,95 |mol, 2,4%). EM(ES+) m/z 1024,28 (M+H)+
Síntesis de ESV6-ValCit-MMAE-bis (44)
Figure imgf000073_0001
Se disuelve SH-Cys-SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (P7, 1,2 mg, 1,175 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |l). Se añade MC-ValCit-PAB-MMAE (4,6 mg, 3,525 |mol, 3,0 eq) como disolución en DMF seca (160 |l). Se agita la reacción durante 3 h.
Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido blanco.
EM(ES+) m/z 3656,9 (M+H)+
Síntesis de ESV6_2-ValCit-MMAE-bis (45)
Figure imgf000074_0001
Se disuelve SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (P7, 1 mg, 1,09 ^mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 ^l). Se añaden MC-ValCit-PAB-MMAE (1,4 mg, 1,09 ^mol, 1,0 eq) y OSu-Glu-ValCit-PAB-MMAE (1,4 mg, 1,09 ^mol, 1,0 eq) como disolución en DMF seca (160 ^l). Se agita la reacción durante 3 h. Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido blanco.
EM(ES+) m/z 3456,8 (M+H)+
Síntesis de (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-8-(hex-5-inamido)quinolin-4-carboxamida (P8)
Figure imgf000074_0002
Esquema 24. Ruta de síntesis para la preparación de (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-8-(hex-5-inamido)quinolin-4-carboxamida (P8)
Se disolvió ácido 5-hexinoico (94 mg, 0,84 mmol, 1,5 eq) en 1,5 ml de DCM y 20 ^l de DMF en un matraz de fondo redondo de 25 ml. Se enfrió la mezcla hasta 0°C y se añadió gota a gota cloruro de oxalilo (107 mg, 0,84 mmol, 1,5 eq). Se retiró el baño de hielo y se agitó la reacción durante 15 minutos. Luego se añadió la mezcla a una disolución enfriada del ejemplo 2-P4 en DMF. Después de 30 minutos, se diluyó el producto en bruto con NaHCO3 acuoso, se extrajo con DCM, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (DCM/MeOH de 100:0 a 90:10 en 10 min) para proporcionar un aceite amarillo (78 mg.
0,267 mmol, 34%). EM(ES+) m/z 454,16 (M+1H)1+
Síntesis de (S)-8-(4-(1-(5-((2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)amino)-5-oxopentil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)butanamido)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)quinolin-4-carboxamida (P9)
Figure imgf000075_0001
Esquema 25. Ruta de síntesis para la preparación de (S)-8-(4-(1-(5-((2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)amino)-5-oxopentil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)butanamido)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)quinolin-4-carboxamida (P9)
Se hinchó Amino-PEG2 precargado disponible comercialmente sobre resina Tentagel (300 mg, 0,2 mmol, Novabiochem) en DMF (3 x 5 min x 5 ml). Se extendió la resina con ácido 5-azidovaleriánico (2,0 eq), HBTU (2,0 eq), HOBt (2,0 eq) y DIPEA (4,0 eq) en DMF (5 ml). Se permitió que la mezcla reposara durante 10 min a 0°C y luego se hizo reaccionar con la resina durante 1 h con agitación suave. Se disolvieron (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-8-(hex-5-inamido)quinolin-4-carboxamida (78 mg, 0,17 mmol, 0,86 eq), Cul (4 mg, 0,02 mmol, 0,1 eq) y TBTA (34 mg, 0,06 mmol, 0,3 eq) en 5 ml de una mezcla 1:1 de DMF/THF.
Se escindió el péptido de la resina con una mezcla de TFA al 20% en DCM a temperatura ambiente durante 1 h. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se precipitó el producto en bruto en dietil éter frío, se centrifugó, se disolvió en agua/ACN y se purificó mediante HpLC (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 5:5 en 15 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (30 mg, 21%). EM(ES+) m/z 727,8 (M+H)+
Síntesis del conjugado 46
Figure imgf000075_0002
Se disolvió (S)-8-(4-(1-(5-((2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)amino)-5-oxopentil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)butanamido)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)quinolin-4-carboxamida (1 mg, 1,4 |amol, 1,0 eq) en THF (200 |al) y se añadió gota a gota DIPEA seca (400 ^g, 3,3 |amol, 2,4 eq). Se añadió isómero I de FITC (0,8 mg, 2,1 |amol, 1,5 eq) como disolución en DMSO a la concentración de 1 mg en 20 |al, se agitó la reacción durante 3 h, se protegió de la luz y se purificó directamente el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un polvo amarillo (1,1 mg, 70,4%). EM(ES+) m/z 1116,4 (M+H)+
Síntesis de (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-8-(hex-5-inamido)quinolin-4-carboxamida (P10)
Figure imgf000076_0001
Esquema 26. Ruta de síntesis para la preparación de (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-8-(hex-5-inamido)quinolin-4-carboxamida (P10)
Figure imgf000076_0002
S e h i n c h ó F m o c - C y s ( T r t ) p r e c a r g a d o d i s p o n i b l e c o m e r c i a l m e n t e s o b r e r e s i n a T e n t a g e l ( 300 m g , 0 , 18 m m o l , R A P P P o l y m e r e ) e n D M F ( 3 * 5 m i n * 5 m l) , s e r e t i r ó e l g r u p o F m o c c o n p i p e r i d i n a a l 20 % e n D M F (1 * 1 m i n * 5 m l y 2 * 10 m i n * 5 m l) y s e l a v ó la r e s i n a c o n D M F (6 * 1 m i n * 5 m l) . S e e x t e n d i ó e l p é p t i d o c o n F m o c - A s p ( t B u ) - O H , F m o c -L y s ( N H B o c ) - O H , F m o c - A s p ( t B u ) - O H , F m o c - N 3 - L y s , F m o c - A s p ( t B u ) - O H y á c i d o ( S ) - 4 -( ( 4 -( ( 2 -( 2 - c i a n o - 4 , 4 -d i f l u o r o p i r r o l i d i n - 1 - i l ) - 2 - o x o e t i l ) c a r b a m o i l ) q u i n o l i n - 8 - i l ) a m i n o ) - 4 - o x o b u t a n o i c o e n e l o r d e n i n d i c a d o . P a r a e s t e p r o p ó s i t o , s e d i s o l v i e r o n e l a m i n o á c i d o p r o t e g i d o c o n F m o c ( 2 , 0 e q ) , H B T U ( 2 , 0 e q ) , H O B t ( 2 , 0 e q ) y D I P E A ( 4 , 0 e q ) e n D M F ( 5 m l) . S e p e r m i t i ó q u e la m e z c l a r e p o s a r a d u r a n t e 10 m i n a 0 ° C y l u e g o s e h i z o r e a c c i o n a r c o n la r e s i n a d u r a n t e 1 h c o n a g i t a c i ó n s u a v e . D e s p u é s d e l a v a r c o n D M F ( 6 * 1 m i n * 5 m l ) , s e r e t i r ó e l g r u p o F m o c c o n piperidina al 20% en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml). A las etapas de desprotección le siguieron etapas de lavado con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes del acoplamiento con el siguiente aminoácido. Se disolvieron (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-8-(hex-5-inamido)quinolin-4-carboxamida (174 mg, 0,35 mmol, 2 eq), CuI (4 mg, 0,02 mmol, 0,1 eq) y TBTA (28 mg, 0,05 mmol, 0,3 eq) en 5 ml de una mezcla 1:1 de d Mf/THF. Se escindió el péptido de la resina con una mezcla de TFA al 20% en dCm a temperatura ambiente durante 1 h. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se precipitó el producto en bruto en dietil éter frío, se centrifugó, se disolvió en agua/ACN y se purificó mediante HPLC (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 5:5 en 15 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (18 mg, 6%). EM(ES+) m/z 1687,7 (M+H)+
Síntesis del conjugado 47
Figure imgf000077_0001
Se disuelve péptido Bi-ESV6 (P11, 1 mg, 0,59 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |l). Se añade maleimidofluoresceína (0,76 mg, 1,77 |mol, 3,0 eq) como disolución en DMF seca (160 |l). Se agita la reacción durante 3 h. Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido amarillo.
EM(ES+) m/z 2114,7 (M+H)+
Síntesis del conjugado 48
Figure imgf000078_0001
Se disuelve péptido BÍ-ESV6 (P11, 1 mg, 0,59 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (300 |l). Se añade Alexa Fluor™ 488 C5-maleimida (200 ig, 0,29 |mol, 0,5 eq) como disolución en DMSO seco (200 |l). Se agita la reacción durante 3 h. Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido naranja.
EM(ES+) m/z 2385. 8 (M+1H)1+
Síntesis del conjugado 49
Figure imgf000078_0002
Se disuelve péptido Bi-ESV6 (P11, 1 mg, 0,59 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |l). Se añade MC-ValCit-PAB-MMAE (1 mg, 0,76 |mol, 1,3 eq) como disolución en DMF seca (160 |l). Se agita la reacción durante 3 h.
Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido blanco.
EM(ES+) m/z 3003,5 (M+H)+
Síntesis del conjugado 50
Figure imgf000079_0001
Se disuelve péptido BÍ-ESV6 (P11, 1 mg, 0,59 |mol, 3,3 eq) en PBS, pH 7,4 (300 |l). Se añade IRDye750 (200|g, 0,174 |mol, 1,0 eq) como disolución en DMSO seco (200 |l). Se agita la reacción durante 3 h.
Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido naranja.
EM(ES+) m/z 2838,0 (M+1H)1+
Síntesis del conjugado 51
Figure imgf000079_0002
Se disuelve péptido Bi-ESV6 (P11, 1 mg, 0,59 |mol, 1 eq) en PBS, pH 7,4 (300 |l). Se añade maleimida-DOTA (465 ig, 0,59 |mol, 1,0 eq) como disolución en DMSO seco (200 |l). Se agita la reacción durante 3 h.
Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido naranja.
EM(ES+) m/z 2213,9 (M+1H)1+
Síntesis de péptido AlbuTag-ESV6 (P12)
Figure imgf000080_0001
Se hinchó Fmoc-Cys(Trt) precargado disponible comercialmente sobre resina Tentagel (300 mg, 0,18 mmol, RAPP Polymere) en DMF (3 x 5 min x 5 ml), se retiró el grupo Fmoc con piperidina al 20% en Dm F (1 x 1 min x 5 ml y 2 x 10 min x 5 ml) y se lavó la resina con DMF (6 x 1 min x 5 ml). Se extendió el péptido con Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(NHBoc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-N3-Lys, Fmoc-a(tBu)-Asp-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH y ácido 4-(4-yodofenil)butanoico en el orden indicado. Para este propósito, se disolvieron el aminoácido protegido con Fmoc (2,0 eq), HBTU (2,0 eq), HOBt (2,0 eq) y DIPEA (4,0 eq) en DMF (5 ml). Se permitió que la mezcla reposara durante 10 min a 0°C y luego se hizo reaccionar con la resina durante 1 h con agitación suave. Después de lavar con DMF (6 x 1 min x 5 ml), se retiró el grupo Fmoc con piperidina al 20% en DMF (1 x 1 min x 5 min y 2 x 10 min x 5 ml). A las etapas de desprotección le siguieron etapas de lavado con DMF (6 x 1 min x 5 ml) antes del acoplamiento con el siguiente aminoácido. Se disolvieron (S)-N-(2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-8-(hex-5-inamido)quinolin-4-carboxamida (174 mg, 0,35 mmol, 2 eq), Cul (4 mg, 0,02 mmol, 0,1 eq) y TBTA (28 mg, 0,05 mmol, 0,3 eq) en 5 ml de una mezcla 1:1 de DMF/THF. Se escindió el péptido de la resina con una mezcla de TFA al 20% en DCM a temperatura ambiente durante 1 h. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se precipitó el producto en bruto en dietil éter frío, se centrifugó, se disolvió en agua/ACN y se purificó mediante HPLC (t Fa al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 5:5 en 15 min) y se liofilizó, para obtener un sólido blanco (6 mg, 2%). EM(ES+) m/z 1646,6 (M+H)+
Síntesis del conjugado 52
Figure imgf000081_0001
Se disuelve péptido AlbuTag-ESV6 (P12, 1 mg, 0,61 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |l). Se añade maleimidofluoresceína (0,78 mg, 1,82 |mol, 3,0 eq) como disolución en DMF seca (160 |l). Se agita la reacción durante 3 h. Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido amarillo.
EM(ES+) m/z 2073,6 (M+H)+
Síntesis del conjugado 53
Se disolvió péptido AlbuTag-ESV6 (P12, 1 mg, 0,61 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (300 |l). Se añadió Alexa Fluor™ 488 C5-maleimida (400 ig, 0,58 |mol, 0,95 eq) como disolución en DMSO seco (200 |l). Se agitó la reacción durante 3 h.
Se purificó el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido naranja (180 nmol, 30%). EM(ES+) m/z 2345,7 (M+1H)1+ Síntesis del conjugado 54
Figure imgf000082_0001
Se disuelve péptido AlbuTag-ESV6 (P12, 1 mg, 0,61 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |l). Se añade MC-ValCit-PAB-MMAE (1 mg, 0,76 |mol, 1,25 eq) como disolución en DMF seca (160 |l). Se agita la reacción durante 3 h. Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido blanco.
EM(ES+) m/z 2963,8 (M+H)+
Síntesis del conjugado 55
Figure imgf000082_0002
Se disolvió péptido AlbuTag-ESV6 (P12, 1 mg, 0,61 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (300 |l). Se añadió IRDye750 (400|g, 0,384 |mol, 0,58 eq) como disolución en DMSO seco (200 |l). Se agitó la reacción durante 3 h.
Se purificó el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofilizó, para obtener un sólido naranja (55 nmol, 9%). EM(ES+) m/z 2797,9 (M+1H)1+ Síntesis del conjugado 56
Figure imgf000083_0001
Se disuelve péptido AlbuTag-ESV6 (P12, 1 mg, 0,61 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (300 |l). Se añade maleimida-DOTA (480 ig, 0,61 |mol, 1,0 eq) como disolución en DMSO seco (200 |l). Se agita la reacción durante 3 h.
Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido naranja.
EM(ES+) m/z 2172,7 (M+1H)1+
Síntesis de Bi-ESV6 (P13)
Figure imgf000083_0002
Se hincha resina de cloruro de 2-cloro-tritilo comercialmente disponible (300 mg) en DMF (3 * 5 min * 5 ml). Se extiende la resina con NHFmoc-azido-lisina (1 mmol), HBTU (1,0 eq), HOBt (1,0 eq) y DIPEA (2,0 eq) en DMF (5 ml). Se permite que la mezcla repose durante 10 min a 0°C y luego se hace reaccionar con la resina durante 1 h con agitación suave. Luego se lava la resina con metanol. Se extiende la resina con ácido (S)-4-((4-((2-(2-ciano-4,4 difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanoico (1 mmol), HOBt (1,0 eq) y DIPEA (2,0 eq) en DMF (5 ml). Se disuelven (S)-N-(2-(2-c¡ano-4,4-d¡fluorop¡rrol¡d¡n-1-¡l)-2-oxoet¡l)-8-(hex-5-¡nam¡do)qu¡nol¡n-4-carboxamida (78 mg, 0,17 mmol, 0,86 eq), CuI (4 mg, 0,02 mmol, 0,1 eq) y TBTA (34 mg, 0,06 mmol, 0,3 eq) en 5 ml de una mezcla 1:1 de DMF/THF. Se esc¡nde el pépt¡do de la res¡na con una mezcla de HFIP al 50% en DCM a temperatura amb¡ente durante 1 h. Se el¡m¡na el d¡solvente a pres¡ón reduc¡da y se prec¡p¡ta el producto en bruto en d¡et¡l éter frío, se centrifuga, se d¡suelve en agua/ACN y se pur¡f¡ca med¡ante HPLC (t Fa al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en aceton¡tr¡lo de 9,5:0,5 a 5:5 en 15 m¡n) y se l¡of¡l¡za, para obtener un sól¡do blanco. EM(ES+) m/z 1111,1 (M+H)+
Síntes¡s de DOTA-GA-B¡-ESV6 (57)
Figure imgf000084_0001
Se d¡suelve B¡-ESV6 (P13, 45 mg, 40,5 |mol, 1,0 eq) en DMSO seco (400 |l). Se añaden d¡c¡dohex¡lcarbod¡¡m¡da (10,9 mg, 52,7|mol, 1,3 eq) y N-h¡drox¡succ¡n¡m¡da (14 mg, 122 |mol, 3 eq) y se ag¡tó la reacc¡ón durante la noche a temperatura amb¡ente, proteg¡da de la luz.
Se añaden 100 | l de d¡soluc¡ón de PBS que contenía ác¡do 2,2’,2”-(10-(4-((2-am¡noet¡l)am¡no)-1-carbox¡-4-oxobut¡l)-1,4,7,10-tetraazac¡clododecano-1,4,7-tr¡¡l)tr¡acét¡co (25 mg, 48,6 |mol, 1,2 eq) y se ag¡tó la reacc¡ón durante 2 h. Se pur¡f¡ca el producto en bruto med¡ante HPLC de fase ¡nversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en aceton¡tr¡lo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 m¡n) y se l¡of¡l¡za, para obtener un sól¡do blanco.
EM(ES+) m/z 1624,8 (M+H)+
Proced¡m¡ento general para la síntes¡s de MC-am¡noác¡dos(OtBu)
Figure imgf000084_0002
Esquema 27. Ruta de síntesis general para la preparación de MC-aminoácidos(OtBu)
El proced¡m¡ento general anterior puede real¡zarse tal como se describe a cont¡nuac¡ón, por ejemplo, para AA = gl¡c¡na.
Se d¡suelve ác¡do 6-male¡m¡dohexano¡co (1,0 eq) en CH2Cl2 seco (1 ml/mmol) bajo una atmósfera de argón y se enfrió la d¡soluc¡ón hasta 0°C. Posteriormente se añaden EDC HCl (1,1 eq), DlpEA (2,3 eq) y e1HCl de H-AA-OtBu deseado (1,1 eq). Se ag¡ta la reacc¡ón a temperatura amb¡ente hasta su f¡nal¡zac¡ón. Se d¡luye la mezcla con AcOEt, se lava con KHSO4 acuoso 1 M, d¡soluc¡ón saturada de NaHCO3 y salmuera. Se seca la fase orgán¡ca y se concentra para proporcionar el producto deseado como un polvo blanco.
Procedimiento general para la síntesis de MC-aminoácidos
Figure imgf000085_0001
Esquema 28. Ruta de síntesis general para la preparación de MC-aminoácidos
El procedimiento general anterior puede realizarse tal como se describe a continuación, por ejemplo, correspondiendo R a AA = glicina.
Se disuelve el MC-aminoácido-OtBu deseado (1,0 eq) en CH2Cl2 seco (0,3 ml/mmol) bajo una atmósfera de argón. Se añade TFA (22,0 eq) y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. Se concentra la disolución y se precipita con hexano, proporcionando el producto como un polvo blanco.
Síntesis de (2S)-2-((4-(hidroximetil)fenil)carbamoil)-1A4-pirrolidin-1-carboxilato de (9H-fluoren-9-il)metilo
Figure imgf000085_0002
Esquema 29. Ruta de síntesis para la preparación de (2S)-2-((4-(hidroximetil)fenil)carbamoil)-1A4-pirmlidin-1-carboxilato de (9H-fluoren-9-il)metilo
Se disolvieron Fmoc-Pro-OH (312 mg; 0,92 mmol; 1,0 eq) y HATU (393 mg; 1,01 mmol; 1,1 eq) en DMF seca (4 ml) bajo una atmósfera de argón y se enfrió la disolución hasta 0°C. Se añadió gota a gota DIPEA (505 ^l; 2,76 mmol; 3,0 eq) y se agitó la mezcla a la misma temperatura durante 15 minutos. Se añadió alcohol 4-aminobencílico (226 mg, 1,84 mmol, 2 eq.) como una disolución en DMF seca. Se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla de reacción con AcOEt y se lavó con KHSO4 acuoso 1 M, NaHCO3 saturado y salmuera. Se secaron las fases orgánicas agrupadas y se concentraron a vacío. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (DCM/MeOH de 99:1 a 95:5 en 10 min) para proporcionar el producto como un polvo blanco (274 mg; 0,66 mmol; rendimiento del 66%). EM(ES+) m/z 443,19 (M+1H)1+
Síntesis de (S)-N-(4-(hidroximetil)fenil)pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000085_0003
Esquema 30. Ruta de síntesis para la preparación de (S)-N-(4-(hidroximetil)fenil)pirrolidin-2-carboxamida
Se disuelve (2S)-2-((4-(hidroximetil)fenil)carbamoil)-1A4-pirrolidin-1-carboxilato de (9H-fluoren-9-il)metilo (274 mg; 0,66 mmol) en DMF seca (30 ml) bajo una atmósfera de argón y se enfría hasta 0°C. Se añade piperidina (325 l^; 3,29 mmol) y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora. Se concentra la disolución a alto vacío, se disuelve en AcOEt (100 ml), se lava con NaHCO3 acuoso y salmuera. Se seca la fase orgánica y se concentra a vacío. Se purifica el material en bruto mediante cromatografía (DCM/MeOH de 99:1 a 90:10 con t Ea al 0,5%), para proporcionar el producto como un aceite marrón.
EM(ES+) m/z 221,12 (M+1H)1+
Procedimiento general para la síntesis de MC-AA-Pro-PAB
Figure imgf000086_0001
Esquema 31. Ruta de síntesis general para la preparación de MC-AA-Pro-PAB
Se disuelve el MC-aminoácido deseado (1,1 eq) en DMF seca (0,5 ml/mmol) bajo una atmósfera de argón y se enfría la disolución hasta 0°C. Posteriormente se añaden HATU (1,1 eq), (S)-N-(4-(hidroximetil)fenil)pirrolidin-2-carboxamida (1,0 eq) y DIPEA (1,5 eq). Se permite que la reacción alcance lentamente temperatura ambiente y se agita durante la noche. Se diluye la mezcla con AcOEt y se lava con KHSO41 M y salmuera. Se seca la fase orgánica y se concentra a vacío y se purifica el producto en bruto mediante cromatografía (DCM/MeOH 93:7) para proporcionar el MC-AA-Pro-PAB deseado.
Procedimiento general para la síntesis de MC-AA-Pro-PAB-PNP
Figure imgf000086_0002
Esquema 32. Ruta de síntesis general para la preparación de MC-AA-Pro-PAB-PNP
Se añade una disolución de cloroformiato de 4-nitrofenilo (2,2 eq) en CH2Cl2 seco (1 ml/mmol) bajo una atmósfera de argón a una suspensión del MC-AA-Pro-PAB deseado (1,0 eq) en CH2Cl2 seco (1 ml/mmol) y piridina (1,5 eq). Después de la finalización, se elimina el disolvente a vacío y se filtra la mezcla en bruto a través de un lecho de sílice eluyendo con AcOEt para dar MC-AA-Pro-PAB-PNP.
Procedimiento general para la síntesis de MC-AA-Pro-PAB-MMAE
Figure imgf000086_0003
Se disuelve monometil-auristatina E (MMAE-TFA 1,1 eq) en DMF seca (200 ^l) bajo una atmósfera de nitrógeno. Posteriormente se añaden MC-AA-Pro-PAB-PNP (1,0 eq), HOAt (0,5 eq) y DlPEA (5,0 eq). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 48 horas y se concentra a vacío. Se diluye el producto en bruto con 200 ^l de una mezcla 1:1 de agua/ metanol y se purifica mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) para obtener los productos deseados como sólidos blancos.
Procedimiento general para la síntesis de ESV6-AA-Pro-MMAE (58)
Figure imgf000087_0001
Se disuelve SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (P7, 700 ig, 0,760 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |l). Se añade MC-AA-Pro-PAB-MMAE (1,0 eq) como disolución en DMF seca (160 |l). Se agita la reacción durante 3 h.
Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido blanco.
El AA usado, la m/z y el rendimiento de los derivados se enumeran en la tabla a continuación.
Figure imgf000087_0003
Procedimiento general para la síntesis de Py-S-S-MMAE
Figure imgf000087_0002
Esquema 33. Ruta de síntesis general para la preparación de Py-S-S-MMAE
Se disuelve monometil-auristatina E (MMAE-TFA 1,1 eq) en DMF seca (200 |l) bajo una atmósfera de nitrógeno. Posteriormente se añaden carbonato de (2-(piridin-2-ildisulfaneil)etilo) y 4-nitrofenilo diversamente sustituido (1,0 eq), HOAt (0,5 eq) y DIPEA (5,0 eq). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 48 horas y se concentra a vacío. Se diluye el producto en bruto con 200 | l de una mezcla 1:1 de agua/ metanol y se purifica mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) para obtener los productos deseados como sólidos blancos.
Procedimiento general para la síntesis de ESV6-S-S-MMAE (59)
Figure imgf000088_0001
Se disuelve SH-Cys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (P7, 700 ig , 0,760 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |l). Se añade el Py-S-S-MMAE deseado (1,0 eq) como disolución en DMF seca (160 |l). Se agita la reacción durante 3 h.
Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido blanco.
El grupo R usado, la m/z y el rendimiento de los derivados se enumeran en la tabla a continuación.
Figure imgf000088_0004
Síntesis de péptido PenCys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (P14)
Figure imgf000088_0002
Se hincha resina de cloruro de 2-cloro-tritilo comercialmente disponible (300 mg) en DMF (3 * 5 min * 5 ml). Se extiende la resina con Fmoc-PenCys(Trt), Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(NHBoc)-OH y Fmoc-Asp(tBu)-OH en el orden indicado. Para este propósito, se disuelven el aminoácido protegido con Fmoc (2,0 eq), HBTU (2,0 eq), HOBt (2,0 eq) y DIPEA (4,0 eq) en Dm F (5 ml). Se extiende la resina con ácido (S)-4-((4-((2-(2-ciano-4,4-difluoropirrolidin-1-il)-2-oxoetil)carbamoil)quinolin-8-il)amino)-4-oxobutanoico (1 mmol), HBTU (2,0 eq) y DIPEA (2,0 eq) en DMF (5 ml). Se escinde el péptido de la resina con una mezcla de HFIP al 50% en DCM a temperatura ambiente durante 1 h. Se elimina el disolvente a presión reducida y se precipita el producto en bruto en dietil éter frío, se centrifuga, se disuelve en agua/ACN y se purifica mediante HPLC (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 5:5 en 15 min) y se liofiliza, para obtener un sólido blanco. EM(ES+) m/z949,3 (M+H)+
Procedimiento general para la síntesis de PenESV6-S-S-MMAE (60)
Figure imgf000088_0003
Se disuelve PenCys-Asp-Lys-Asp-ESV6 (700 ig, 0,760 |mol, 1,0 eq) en PBS, pH 7,4 (840 |l). Se añade el Py-S-S-MMAE deseado (1,0 eq) como disolución en DMF seca (160 |l). Se agita la reacción durante 3 h.
Se purifica el material en bruto mediante HPLC de fase inversa (TFA al 0,1% en agua/TFA al 0,1% en acetonitrilo de 9,5:0,5 a 2:8 en 20 min) y se liofiliza, para obtener un sólido blanco.
El grupo R usado y la m/z de los derivados se enumeran en la tabla a continuación.

Claims (5)

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. C o m p u e s t o q u e t i e n e u n a d e l a s s i g u i e n t e s e s t r u c t u r a s , s u s d i a s t e r e o i s ó m e r o s i n d i v i d u a l e s , s u s h i d r a t o s , s u s s o l v a t o s , s u s f o r m a s c r i s t a l i n a s , s u s t a u t ó m e r o s i n d i v i d u a l e s o u n a s a l f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e d e l m i s m o :
Figure imgf000095_0001
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Figure imgf000114_0001
Figure imgf000115_0001
2. C o m p u e s t o s e g ú n la r e i v i n d i c a c i ó n 1, e n e l q u e la e s t r u c t u r a s e s e l e c c i o n a d e a q u e l l a s c o n l o s n ú m e r o s 1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11, 12 , 13 , 14 , 15 , 18 , 21 , 2 6 , 27 , 30 , 3 1 , 34 a , 35 , 36 , 37 a , 38 , 39 , 40 , 4 1, 42 , 43 , 4 3 a , 44 , 45 , 47 , 48 , 49 , 50 , 5 1 , 5 2 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 a , 58 b , 58 c , 58 d , 58 e , 58 f , 59 a , 60 a , 64 , 65 , 66 , 67 y 68.
3. C o m p u e s t o s e g ú n la r e i v i n d i c a c i ó n 1, e n e l q u e la e s t r u c t u r a s e s e l e c c i o n a d e a q u e l l a s c o n l o s n ú m e r o s 2 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11, 12 , 13 , 14 , 15 , 18 , 21, 26 , 27 , 30 , 31, 34 a , 35 , 36 , 37 a , 38 , 39 , 40 , 41, 42 , 43 , 43 a , 44 , 45 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51, 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 a , 58 b , 58 c , 58 d , 58 e , 58 f , 59 a , 60 a , 64 , 65 , 66 , 67 y 68.
4. C o m p u e s t o s e g ú n la r e i v i n d i c a c i ó n 1, e n e l q u e la e s t r u c t u r a s e s e l e c c i o n a d e a q u e l l a s c o n l o s n ú m e r o s 8, 9 , 10 , 11, 12 , 13 , 14 , 15 , 18 , 21 , 26 , 27 , 30 , 35 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 a , 58 a , 58 b , 58 c , 59 a , 60 a , 64 , 65 , 66 , 67 y 68.
5. C o m p u e s t o s e g ú n la r e i v i n d i c a c i ó n 1, e n e l q u e la e s t r u c t u r a s e s e l e c c i o n a d e a q u e l l a s c o n l o s n ú m e r o s 1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8, 9 , 10 , 11, 12 , 13 , 14 , 15 y 26.
6 . C o m p u e s t o s e g ú n la r e i v i n d i c a c i ó n 1 , q u e t i e n e la e s t r u c t u r a 8.
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