JP2023514275A - 標的化された送達の用途のための線維芽細胞活性化タンパク質リガンド - Google Patents

標的化された送達の用途のための線維芽細胞活性化タンパク質リガンド Download PDF

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Abstract

本発明は、疾患の部位での様々なペイロード（例えば、細胞傷害性薬物、放射性核種、フルオロフォア、タンパク質および免疫モジュレーター）の能動的送達のための線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）のリガンドに関する。特に、本発明は、標的化の用途、特に、がん、炎症またはＦＡＰの過剰発現によって特徴付けられる別の疾患などの疾患または障害に関連する診断法および／または治療もしくは外科手術の方法のためのＦＡＰリガンドの開発に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、疾患の部位での様々なペイロード（例えば細胞傷害性薬物、放射性核種、フルオロフォア、タンパク質および免疫モジュレーター）の能動的送達のための線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）のリガンドに関する。特に、本発明は、標的化の用途、特に、がん、炎症またはＦＡＰの過剰発現によって特徴付けられる別の疾患などの疾患または障害に関連する診断法および／または治療もしくは外科手術の方法のためのＦＡＰリガンドの開発に関する。
化学療法は、がん患者のおよび他の疾患の処置のために依然として広く適用されている。従来の抗がん化学療法剤は、細胞生存の基本的な機序に作用し、健康な細胞と悪性細胞との間を区別することができない。さらに、それらの薬物は、全身的投与で疾患の部位に効果的に蓄積しない。腫瘍部位での非特異的な作用機序および非効果的な局在化は、従来の化学療法の持続不可能な副作用および不十分な治療的有効性の主要因である。
全身的投与後に疾患の部位に選択的に局在化することができる標的化された薬物の開発が非常に望ましい。こうした薬物を発生させるための戦略は、細胞傷害性薬物または放射性核種のような治療的ペイロードの、疾患のマーカーに特異的なリガンドへの化学的コンジュゲーションによって代表される。疾患特異的モノクローナル抗体、ペプチドおよび小リガンドは、標的化された薬物製品の開発のための選択のリガンドとして考えられてきた。標的化の用途のための小リガンドの使用は、ペプチドおよび抗体のようなより大きい分子と比較していくつかの利点を有する：より急速なおよび効果的な腫瘍浸透、より低い免疫原性およびより低い製造コスト。
前立腺特異的膜抗原、葉酸受容体および炭酸脱水酵素ＩＸに特異的な小有機リガンドは、がんの前臨床モデルにおいておよび患者において優れた体内分布プロファイルを示してきた。これらのリガンドは、細胞傷害性薬物におよび放射性核種にコンジュゲートされることで、がんの処置のための小分子－薬物コンジュゲートおよび小分子－放射性コンジュゲート生成物（ＳＭＤＣおよびＳＭＲＣ）を発生させてきた。１７７－ルテチウム－ＰＳＭＡ－６１７は、転移性去勢抵抗性前立腺がん（ｍＣＲＰＣ）患者の処置のための第３相治験（ＶＩＳＩＯＮ治験）において現在調査されている後期段階ＳＭＲＣの例を代表する。
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）は、腫瘍成長および進行を促進する膜結合ゼラチナーゼであり、がん関連の線維芽細胞において過剰発現される。ＦＡＰは、正常の臓器におけるそれの低発現により、標的化されたＳＭＤＣおよびＳＭＲＣの開発のための理想的な標的を代表する。
ＷＯ２０１９１５４８８６およびＷＯ２０１９１５４８５９は、異なるがん型を処置するために使用される線維芽細胞活性化タンパク質－アルファ阻害剤として、複素環式化合物を記載している。ＷＯ２０１９１１８９３２は、異なる病態を処置するために使用される線維芽細胞活性化タンパク質－アルファ阻害剤として、置換されているＮ含有環式化合物を記載している。ＷＯ２０１９０８３９９０は、ＦＡＰ－アルファと関連する疾患を画像化するためにおよび増殖性疾患を処置するために使用されるＦＡＰ－アルファ阻害剤として、画像化用および放射線治療標的化用の線維芽細胞活性化タンパク質－アルファ（ＦＡＰ－アルファ）化合物を記載しており、そこに記載されている４－イソキノリノイルおよび８－キノリノイル誘導体が非常に低いＦＡＰ親和性によって特徴付けられることを注記している。ＷＯ２０１３１０７８２０は、がんなどの増殖性障害、および組織リモデリングによって示される疾患、または変形性関節症などの慢性炎症の処置において使用される置換ピロリジン誘導体を記載している。ＷＯ２００５０８７２３５は、ＩＩ型糖尿病を処置するためのジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤として、ピロリジン誘導体を記載している。ＷＯ２０１８１１１９８９は、がん関連の線維芽細胞を除去すること、インビトロで細胞の集団を画像化すること、およびがんを処置することに有用な、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）阻害剤、二価のリンカーおよび例えば近赤外（ＮＩＲ）色素を含むコンジュゲートを記載している。
Ｔｓｕｔｓｕｍｉら（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９４）は、一連のａ－ケト複素環式化合物の調製およびインビトロプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）阻害活性を記載している。Ｈｕら（Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２００５）は、ＦＡＰおよび他の２つのジペプチジルペプチダーゼに対する様々なＮ－アルキルＧｌｙ－ｂｏｒｏ－Ｐｒｏ誘導体の構造－活性関係を記載している。Ｅｄｏｓａｄａら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００６）は、ＦＡＰのジペプチド基質特異性およびＡｃ－Ｇｌｙ－ＢｏｒｏＰｒｏ ＦＡＰ選択的阻害剤の開発を記載している。Ｇｉｌｍｏｒｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００６）は、ＤＰＰ－ＩＶおよびＦＡＰに対する一連のジペプチドプロリンジフェニルホスホネートの設計、合成および動態試験を記載している。Ｔｒａｎら（Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２００７）は、ＦＡＰに対する様々なＮ－アシル－Ｇｌｙ－、Ｎ－アシル－Ｓａｒ－およびＮ－ブロック化－ｂｏｒｏＰｒｏ誘導体の構造－活性関係を記載している。Ｔｓａｉら（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１０）は、ＤＰＰ－ＩＶ、ＤＰＰ－ＩＩ、ＤＰＰ８およびＤＰＰ９に対して優れた選択性を有する多数のＦＡＰ阻害剤をもたらした構造－活性関係研究を記載している。Ｒｙａｂｔｓｏｖａら（Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２０１２）は、一連のＮ－アシル化グリシル－（２－シアノ）ピロリジンの合成およびＦＡＰ阻害特性の評価を記載している。Ｐｏｐｌａｗｓｋｉら（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１３）は、強力および選択的なＦＡＰ阻害剤としてＮ－（ピリジン－４－カルボニル）－Ｄ－Ａｌａ－ｂｏｒｏＰｒｏを記載している。Ｊａｎｓｅｎら（ＡＣＳ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２０１３）は、Ｎ－（４－キノリノイル）－Ｇｌｙ－（２－シアノピロリジン）足場に基づくＦＡＰ阻害剤を記載している。Ｊａｎｓｅｎら（Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１４）は、リナグリプチン足場に基づくＦＡＰ阻害剤の構造－活性関係を記載している。Ｊａｎｓｅｎら（Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１４）は、低いマイクロモル効力を有するキサンチンベースのＦＡＰ阻害剤を記載している。Ｊａｎｓｅｎら（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１４）は、Ｎ－４－キノリノイル－Ｇｌｙ－（２Ｓ）－ｃｙａｎｏＰｒｏ足場に基づくＦＡＰ阻害剤の構造－活性関係を記載している。Ｊａｃｋｓｏｎら（Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ２０１５）は、ＦＡＰのプソイドペプチド阻害剤の開発を記載している。Ｍｅｌｅｔｔａら（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１５）は、アテローム動脈硬化プラークの非侵襲的な画像化トレーサーとしてホウ素酸ベースのＦＡＰ阻害剤の使用を記載している。Ｄｖｏｒａｋｏｖａら（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１７）は、標的化の用途のためのＦＡＰ特異的阻害剤を含有するポリマーコンジュゲートの調製を記載している。Ｌｏｋｔｅｖら（Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０１８）は、ＦＡＰ特異的酵素阻害剤に基づくヨウ化およびＤＯＴＡ－カップリング放射性トレーサーの開発を記載している。Ｌｉｎｄｎｅｒら（Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０１８）は、診断治療トレーサーとしての使用のためのＦＡＰ阻害剤の修飾および最適化を記載している。Ｇｉｅｓｅｌら（Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０１９）は、ＦＡＰ阻害剤として作用するキノリンベースのＰＥＴトレーサーの臨床的画像化性能を記載している。
本発明は、標的化の用途に適当な線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）のバインダー（リガンド）の改善を提供するという問題を目指している。バインダーは、ＦＡＰの阻害、および／またはＦＡＰの過剰発現によって特徴付けられる疾患もしくは障害のリスクによって苦しめられるもしくはそのリスクがある部位への治療剤もしくは診断剤などのペイロードの標的化された送達に適当であるべきである。好ましくは、バインダーは、ＦＡＰとの安定な複合体を形成し、親和性の増加、阻害活性の増加、複合体からの解離のより遅い速度、および／または疾患部位での滞留の延長を呈するべきである。
本発明者らは、標的化の用途に適当な線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の新規な有機リガンドを見出した。本発明による化合物（リガンドまたはバインダーとも称される）は、以下の構造を有する小さい結合部分Ａを含む：
Figure 2023514275000002
本発明による化合物は、以下の一般式Ｉ、
Figure 2023514275000003
それの個々のジアステレオ異性体、それの水和物、それの溶媒和物、それの結晶形態、それの個々の互変異性体またはその薬学的に許容される塩によって表すことができ、式中、Ａは、結合部分であり；Ｂは、共有結合または部分ＡおよびＣを共有結合的に付着させる原子の鎖を含む部分であり；Ｃは、ペイロード部分である。
本発明は、前記化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。
本発明は、外科手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の体の処置の方法またはヒトもしくは動物の体に実施される診断法における使用のための前記化合物または薬学的組成物；ならびに前記化合物または医薬組成物の治療的または診断的に有効な量を、それを必要とする対象に投与することを含む、外科手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の体の処置の方法またはヒトもしくは動物の体に実施される診断法をさらに提供する。
本発明は、疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象の治療または予防の方法における使用のための前記化合物または薬学的組成物；ならびに疾患または障害の処置治療または予防の方法であって、前記疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象に前記化合物または医薬組成物の治療的または診断的に有効な量を投与することを含む方法をさらに提供する。
本発明は、疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象に実施されるガイドされた外科手術の方法における使用のための前記化合物または薬学的組成物；ならびに疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象に前記化合物または医薬組成物の治療的または診断的に有効な量を投与することを含む、ガイドされた外科手術の方法をさらに提供する。
本発明は、ヒトまたは動物の体に実施されるとともにポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）などの核医学画像化技法に関与する疾患または障害の診断の方法における使用のための前記化合物または薬学的組成物；ならびに疾患または障害の診断の方法であって、ヒトまたは動物の体に実施されるとともにポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）などの核医学画像化技法に関与し、前記化合物または医薬組成物の治療的または診断的に有効な量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法をさらに提供する。
本発明は、疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象への治療剤または診断剤の標的化された送達の方法における使用のための前記化合物または薬学的組成物；ならびに疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象への前記化合物または医薬組成物の治療的または診断的に有効な量の標的化された送達の方法をさらに提供する。
好ましくは、前述の疾患または障害は、ＦＡＰの過剰発現によって特徴付けられ、がん、炎症、アテローム動脈硬化症、線維症、組織リモデリングおよびケロイド障害から独立して選択され、好ましくは、がんは、乳がん、膵臓がん、小腸がん、結腸がん、多剤抵抗性結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、卵巣がん、肝細胞がん、食道がん、下咽頭がん、鼻咽腔がん、喉頭がん、骨髄腫細胞、膀胱がん、胆管腺癌、明細胞腎癌、神経内分泌腫瘍、腫瘍誘発性骨軟化症、肉腫、ＣＵＰ（不明な原発性の癌腫）、胸腺がん、デスモイド腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、子宮頚がん、皮膚がん、腎臓がんおよび前立腺がんからなる群から選択される。より好ましくは、疾患または障害は、黒色腫および腎細胞癌から選択される。
化合物（Ａ）ＥＳＶ６－ｆｌｕｏ（２６）および（Ｂ）Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏ（２３）の化学構造およびＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。 組換え体ｈＦＡＰの品質管理を示す図である：Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ）。 化合物ＥＳＶ６－ｆｌｕｏ（２６）およびＨａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏ（２３）およびｈＦＡＰの共溶出ＰＤ－１０実験を示す図である。安定な複合体が、ｈＦＡＰおよび小リガンドＥＳＶ６－ｆｌｕｏおよびＨａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏの間に形成される。 蛍光偏光によるヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈＦＡＰ）のための小有機リガンドの親和性決定を示す図である。ＥＳＶ６－ｆｌｕｏ（２６）は、前に記載されているリガンド、Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏ（２３）（０．８９ｎＭのＫＤ）と比較して、ｈＦＡＰに対するより高い親和性（０．７８ｎＭのＫＤ）を呈する。 小有機リガンドの存在下でのｈＦＡＰ阻害実験を示す図である。ＥＳＶ６リガンド（Ｐ３）は、前に記載されているリガンド、Ｈａｂｅｒｋｏｒｎリガンド（Ｈ６）（２４．６ｎＭ）と比較して、より低いＩＣ５０（２０．２ｎＭ）を呈する。 ｈＦＡＰからのＥＳＶ６－ｆｌｕｏ（２６）およびＨａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏ（２３）の解離速度測定を示す図である。ＥＳＶ６－ｆｌｕｏは、Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏ（回帰係数＝－０．０７５１１２）と比較して、より遅いペースで解離する（回帰係数＝－０．０９３５６４）。 静脈内投与（１５０ｎｍｏｌ／Ｋｇの用量）後の、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７黒色腫異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの近赤外蛍光画像化におけるＩＲＤｙｅ ７５０コンジュゲートの標的化性能の評価を示す図である。（Ａ）様々な時点（注射の５分後、２０分後および１時間後）での生きた動物の画像。（Ｂ）２時間でのエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物ＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０（１８）、高親和性ＦＡＰリガンド「ＥＳＶ６」の誘導体は、ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＩＲＤｙｅ７５０（１７）と比較した場合に、より高い腫瘍対肝臓、腫瘍対腎臓および腫瘍対腸の取り込み比を呈する。ＱＣＯＯＨ－ＩＲＤｙｅ７５０（１６）（標的化されていない対照）は、インビボでＳＫ－ＭＥＬ－１８７病変に局在化していない。 静脈内投与（１５０ｎｍｏｌ／Ｋｇの用量）後の、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７黒色腫異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの近赤外蛍光画像化におけるＩＲＤｙｅ ７５０コンジュゲートの標的化性能の評価を示す図である。（Ａ）様々な時点（注射の５分後、２０分後および１時間後）での生きた動物の画像。（Ｂ）２時間でのエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物ＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０（１８）、高親和性ＦＡＰリガンド「ＥＳＶ６」の誘導体は、ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＩＲＤｙｅ７５０（１７）と比較した場合に、より高い腫瘍対肝臓、腫瘍対腎臓および腫瘍対腸の取り込み比を呈する。ＱＣＯＯＨ－ＩＲＤｙｅ７５０（１６）（標的化されていない対照）は、インビボでＳＫ－ＭＥＬ－１８７病変に局在化していない。 （Ａ）ＳＫ－ＭＥＬ－１８７腫瘍保有マウスにおけるＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）およびＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２０）の治療的活性の判定を示す図である。データポイントは、平均腫瘍体積±ＳＥＭ（１群当たりｎ＝３）を表す。矢印は、異なる処置のＩＶ感染を示す。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ、高親和性ＦＡＰリガンド「ＥＳＶ６」の薬物コンジュゲート誘導体は、ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥと比較した場合に、より強力な抗腫瘍効果を呈する。（Ｂ）実験中の動物の体重における変化（％）の評価によって判定される場合の異なる処置の耐容性を示す図である。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥは、ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥと比較した場合に、より低い急性毒性を呈する。 （Ａ）ＳＫ－ＭＥＬ－１８７腫瘍保有マウスにおけるＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）およびＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２０）の治療的活性の判定を示す図である。データポイントは、平均腫瘍体積±ＳＥＭ（１群当たりｎ＝３）を表す。矢印は、異なる処置のＩＶ感染を示す。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ、高親和性ＦＡＰリガンド「ＥＳＶ６」の薬物コンジュゲート誘導体は、ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥと比較した場合に、より強力な抗腫瘍効果を呈する。（Ｂ）実験中の動物の体重における変化（％）の評価によって判定される場合の異なる処置の耐容性を示す図である。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥは、ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥと比較した場合に、より低い急性毒性を呈する。 異なる小有機リガンドの存在下でのｈＦＡＰ阻害実験を示す図である。実施例２からの化合物Ｐ４は、化合物２４（３３．４６ｎＭ、より低い阻害）と比較して、より低いＩＣ５０（１６．８３ｎＭ、より高い阻害）を呈する。 蛍光偏光（ＦＰ）によるヒトおよびマウス線維芽細胞活性化タンパク質のための小有機リガンドの親和性決定を示す図である。（Ａ）コンジュゲート１５は、コンジュゲート２５（ＫＤ＝１．０２ｎＭ）と比較して、ｈＦＡＰに対するより高い親和性（ＫＤ＝０．６８ｎＭ）を示す。（Ｂ）コンジュゲート１５は、コンジュゲート２５（ＫＤ＝３０．９４ｎＭ）と比較して、ｍＦＡＰに対するより高い親和性（ＫＤ＝１１．６１ｎＭ）を示す。コンジュゲート１５は、コンジュゲート２５と比較して、ｈＦＡＰに対する優位な結合特性およびマウス抗原に対するより良好な交差反応性を表す。（Ｃ）コンジュゲート１５および２５の構造を示す図である。 ｈＦＡＰ（Ａ）およびｍＦＡＰ（Ｂ）との小分子リガンドコンジュゲート１５の共溶出ＰＤ－１０実験を示す図である。安定な複合体が両方のタンパク質および小リガンドコンジュゲート１５の間に形成され、２つの分子の共溶出を一緒に可能にする。 共焦点顕微鏡法およびＦＡＣＳ分析を介するＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰおよび野生型腫瘍細胞上のコンジュゲート１５（１０ｎＭ）の選択的蓄積の評価を示す図である。（Ａ）異なる時点（ｔ＝０時間および１時間）にて化合物でインキュベートされたＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰの画像は、細胞膜上のコンジュゲート１５の蓄積を示す。（Ｂ）化合物でのインキュベーション後のＳＫ－ＲＣ－５２野生型の画像は、細胞膜上の蓄積を示さない（陰性対照）。（Ｃ）ＳＫ－ＲＣ－５２野生型（暗灰色ピーク）およびＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ（薄灰色ピーク）に対するＦＡＣＳ分析は、コンジュゲート１５（１０ｎＭ）のＦＡＰ特異的細胞結合を示す。（Ｄ）異なる時点（ｔ＝０時間および１時間）での化合物でインキュベートされたＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰの画像は、細胞膜上のおよびサイトゾルの内側のコンジュゲート１５の蓄積を示す。（Ｅ）化合物でのインキュベーション後のＨＴ－１０８０野生型の画像は、細胞膜上のおよびサイトゾル中の蓄積を示さない（陰性対照）。（Ｆ）ＨＴ－１０８０野生型（暗灰色ピーク）およびＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ（薄灰色ピーク）に対するＦＡＣＳ分析は、コンジュゲート１５（１０ｎＭ）のＦＡＰ特異的細胞結合を示す。 静脈内投与（４０ｎｍｏｌ）後の、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腎細胞癌異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるコンジュゲート１５の標的化性能の評価を示す図である。投与の１時間後のエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物は、高い腫瘍対臓器選択性で、静脈内注射の１時間後にインビボの腫瘍部位に急速におよび均質に局在化する。 静脈内投与（４０ｎｍｏｌ）後の、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腎細胞癌異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるコンジュゲート１５の標的化性能の評価を示す図である。投与の１時間後のエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物は、高い腫瘍対臓器選択性で、静脈内注射の１時間後にインビボの腫瘍部位に急速におよび均質に局在化する。 放射性化合物の放射ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。（Ａ）１７７Ｌｕで標識化した後のコンジュゲート９の放射ＨＰＬＣプロファイル（ｒ．ｔ．１１分）を示す図である。（Ｂ）遊離１７７Ｌｕの放射ＨＰＬＣプロファイル（２分）を示す図である。放射標識化した後、コンジュゲート９は、変換の＞９９％で単一ピークとして出現する。 ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腎細胞癌異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕにおけるコンジュゲート９（これは１７７Ｌｕ放射性ペイロードを含む）の体内分布実験を示す図である。（Ａ）コンジュゲート９（用量＝５０ｎｍｏｌ／Ｋｇ；０．５～２ＭＢｑ）の静脈内投与後の異なる時点（１０分、１時間、３時間および６時間）での腫瘍および健康な臓器および腫瘍対臓器における％ＩＤ／ｇ比分析を示す図である。（Ｂ）異なる用量（１２５ｎｍｏｌ／Ｋｇ、２５０ｎｍｏｌ／Ｋｇ、５００ｎｍｏｌ／Ｋｇおよび１０００ｎｍｏｌ／Ｋｇ；０．５～２ＭＢｑ）での１７７Ｌｕコンジュゲート９の静脈内投与の３時間後の腫瘍および健康な臓器および腫瘍対臓器における％ＩＤ／ｇ比分析を示す図である。用量依存性応答が観察され得、標的飽和は２５０ｎｍｏｌ／Ｋｇから５００ｎｍｏｌ／Ｋｇの間に達し得る。（Ｃ）１７７Ｌｕ溶液（陰性対照；１ＭＢｑ）の静脈内投与の３時間後の腫瘍および健康な臓器における％ＩＤ／ｇならびに腫瘍対臓器比分析を示す図である。 静脈内投与（１５０ｎｍｏｌ／Ｋｇの用量）後の、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７（右側腹部）およびＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ（左側腹部）異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの近赤外蛍光画像化におけるＩＲＤｙｅ ７５０コンジュゲート１８の標的化性能の評価を示す図である。（Ａ）注射（ｔ＝０）の前および静脈内注射の３０分後の生きた動物の画像を示す図である。（Ｂ）６０分でのエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物ＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０（１８）は、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰおよびＳＫ－ＭＥＬ－１８７腫瘍の両方に蓄積し、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７と比較して、より高いＦＡＰ発現によりＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腫瘍においてより高い蓄積を表示している。 異なる小有機リガンドの存在下でのｈＦＡＰ阻害実験を示す図である。コンジュゲート２８は、実施例２、Ｐ４と比較して、より低いＦＡＰ阻害特性を呈する。シアノピロリジンヘッドピースとピリジン環との間のＬ－アラニン構成単位を含めて、コンジュゲート２９は、アッセイにおいて試験された濃度でＦＡＰタンパク分解活性を阻害しない。 静脈内投与（１５０ｎｍｏｌ／Ｋｇの用量）後の、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰおよびＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの近赤外蛍光画像化におけるＩＲＤｙｅ ７５０コンジュゲート１８の標的化性能の評価を示す図である。１時間でのエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物ＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０（１８）は、ＦＡＰ発現を表示するＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ腫瘍に選択的に蓄積し、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔにおいては蓄積しない。 （Ａ）静脈内投与（４０ｎｍｏｌ）後の、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ（右側腹部）およびＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ（左側腹部）異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるコンジュゲート３０の標的化性能の評価を示す図である。投与の１時間後のエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物は、優れた腫瘍対臓器選択性で、静脈内注射の１時間後にＦＡＰ発現を表示する腫瘍にインビボにて急速に、均質におよび選択的に局所化する。 （Ｂ）ＥＳＶ６－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（３０）の構造を示す図である。 （Ａ）静脈内投与（４０ｎｍｏｌ）後の、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ（右側腹部）およびＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ（左側腹部）異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるコンジュゲート３０の標的化性能の評価を示す図である。投与の１時間後のエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物は、優れた腫瘍対臓器選択性で、静脈内注射の１時間後にＦＡＰ発現を表示する腫瘍にインビボにて急速に、均質におよび選択的に局在化する。 （Ｂ）ＥＳＶ６－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（３０）の構造を示す図である。 （Ａ）ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腫瘍保有マウスにおけるＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）およびＱＣＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（１９）の治療的活性の判定を示す図である。データポイントは、平均腫瘍体積±ＳＥＭ（１群当たりｎ＝４）を表す。化合物は、８日目から出発して、連続した６日間、静脈内に（尾静脈注射）投与した。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）、高親和性ＦＡＰリガンド「ＥＳＶ６」の薬物コンジュゲート誘導体は、ＱＣＯＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（１９）、分子の標的化されていないバージョンと比較した場合に、より強力な抗腫瘍効果を呈する。（Ｂ）実験中の動物の体重における変化（％）の評価によって判定される場合に異なる処置の耐容性を示す図である。（Ｃ）ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）およびＱＣＯＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（１９）の構造を示す図である。 （Ａ）ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腫瘍保有マウスにおけるＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）、Ｌ１９－ＩＬ２およびそれらの組合せの治療的活性の判定を示す図である。データポイントは、平均腫瘍体積±ＳＥＭ（１群当たりｎ＝４）を表す。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥは、８日目、１０日目、１２日目に静脈内に（尾静脈注射）投与した。Ｌ１９－ＩＬ２は、９日目、１１日目、１３日目に静脈内に（尾静脈注射）投与した。Ｌ１９－ＩＬ２と組み合わされたＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥは、Ｌ１９－２単独と比較した場合に非常に強力な抗腫瘍効果（４／４完全な腫瘍退縮）を呈する。（Ｂ）実験中の動物の体重における変化（％）の評価によって判定される場合の異なる処置の耐容性を示す図である。 右側腹部上にＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰおよび左側腹部上にＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔを保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおける小分子－薬物コンジュゲートＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）の定量的体内分布実験を示す図である。化合物は、ＦＡＰ陽性ＳＫ－ＲＣ－５２腫瘍中に選択的に蓄積する（即ち、静脈内投与の６時間後に腫瘍部位で１８％ＩＤ／ｇ）。対照的に、ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥは、ＦＡＰ陰性ＳＫ－ＲＣ－５２野生型腫瘍中に蓄積しない。健康な臓器におけるコンジュゲートの取り込みは無視できる（１％ＩＤ／ｇよりも低い）。 マウス血清中のコンジュゲート２７（これは６９Ｇａペイロードを含む）の安定性研究を示す図である。時間０でのおよびインキュベーションの６時間後の処理済み試料のＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳプロファイルは、正しい質量（予想質量：１０２８．３０。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ５１４．３（Ｍ＋２Ｈ））を有する単一ピークを示す。 コンジュゲート１５の構造、クロマトグラフィープロファイルおよびＬＣ／ＭＳ分析を示す図である。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １３４８．３６（Ｍ＋１Ｈ）＋。 ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）の構造、クロマトグラフィープロファイルおよびＬＣ／ＭＳ分析を示す図である。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １１１８．０５（Ｍ＋２Ｈ）２＋。 ＥＳＶ６－ＤＯＴＡＧＡ（８）の構造、クロマトグラフィープロファイルおよびＬＣ／ＭＳ分析を示す図である。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ９６０．３９（Ｍ＋Ｈ）＋。 実施例２、Ｐ４の構造、クロマトグラフィープロファイルおよびＬＣ／ＭＳ分析を示す図である。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４６０．２１（Ｍ＋Ｈ）＋。
本発明者らは、標的化の用途に適当である線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の小分子バインダーを同定した。本発明によるバインダーは、ＦＡＰの高い阻害、ＦＡＰに対する高い親和性を提供し、および／またはＦＡＰの過剰発現によって特徴付けられる疾患もしくは障害によって苦しめられるもしくはそのリスクがある部位への、治療剤もしくは診断剤などのペイロードの標的化された送達に適当である。本発明によるバインダーは、ＦＡＰとの安定な複合体を形成し、親和性の増加、阻害活性の増加、複合体からの解離のより遅い速度、および／または疾患部位での滞留の延長を呈する。本発明によるバインダーはさらに、増加された腫瘍対肝臓、腫瘍対腎臓および／または腫瘍対腸の取り込み比；より強力な抗腫瘍効果（例えば、平均腫瘍体積増加によって測定される）、および／またはより低い毒性（例えば、体重における変化（％）の評価によって判定される場合）を有することができる。本発明によるバインダーはさらに、ヒトおよびマウス線維芽細胞活性化タンパク質に対する高いもしくは改善された親和性および／またはマウス抗原に対する交差反応性を有することができる。本発明によるバインダーは、好ましくは、ＦＡＰ特異的細胞結合；細胞膜上のＦＡＰ選択的蓄積；サイトゾルの内側のＦＡＰ選択的蓄積を達成する。本発明によるバインダーは、さらに好ましくは、特に黒色腫および／または腎細胞癌について、高い腫瘍対臓器選択性でインビボの腫瘍部位に急速におよび均質に局在化することができる。放射性ペイロード（例えば、１７７Ｌｕ）を含む本発明によるバインダーは、好ましくは、標的飽和が２５０ｎｍｏｌ／Ｋｇから５００ｎｍｏｌ／Ｋｇの間で達せられ、および／または静脈内投与後最大１２時間まで、より好ましくは１時間から９時間、さらにより好ましくは３時間から６時間維持される用量依存性応答を達成する。
上記で説明されている通り、本発明は、化合物、それの個々のジアステレオ異性体、それの水和物、それの溶媒和物、それの結晶形態、それの個々の互変異性体またはその薬学的に許容される塩を提供し、ここで、化合物は、以下の構造を有する部分Ａを含む：
Figure 2023514275000004
上記で説明されている通り、本発明による化合物は、式Ｉによって表すことができる：
Figure 2023514275000005
そこで、Ｂは、共有結合、またはＡをＣに共有結合的に付着させる原子の鎖を含む部分であり；Ｃは、原子、分子もしくは粒子であってよく、および／または治療剤もしくは診断剤である。
したがって、本発明による化合物は、以下の構造を有する部分を含むことができ：
Figure 2023514275000006
式中、Ｂは、共有結合、または共有結合的に結合された原子の鎖を含む部分である。
部分Ａ
任意の理論によって結び付けられるのを望むことなく、これらの驚くべき技術効果は、小さい結合部分Ａの特別な構造と関連することが企図され、ここで、キノリン環は、アミノ基またはアミド基などの窒素含有基によって８位で置換されている：
Figure 2023514275000007
化合物のより高い標的タンパク質親和性は、インビボでより長い腫瘍滞留をもたらすことが以前に示された（Ｗｉｃｈｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７、２４１～２４９（２０１５））。本発明の化合物は、増加された親和性、従来技術化合物と比較した場合にＦＡＰに関するより遅い解離速度を有し、そのため、注射後好ましくは１時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、治療的または診断的に関連性のあるレベルで疾患部位での延長された滞留を有するとも考えられる。好ましくは、最も高い富化は、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間後に達成され；および／あるいは疾患部位における富化は、注射後５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間もしくは６時間の期間にわたってまたは少なくともその間、より好ましくは６時間を超えて、治療的または診断的に関連性のあるレベルで維持される。
好ましくは、結合部分Ａは、以下の構造Ａ１；より好ましくは以下の構造Ａ２を有し、式中、ｍは、０、１、２、３、４または５、好ましくは１である：
Figure 2023514275000008
部分Ｂ
部分Ｂは、共有結合、または例えば１つもしくは複数の共有結合を介してＡをペイロードＣに共有結合的に付着させる原子の鎖を含む部分である。部分Ｂは、切断可能なまたは切断不可能な二官能性のまたは多官能性の部分であってよく、これは、１つまたは複数のペイロードおよび／またはバインダー部分を連結するために使用することで、本発明の標的化されたコンジュゲートを形成することができる。一部の実施形態において、化合物の構造は独立して、１分子当たり２つ以上の部分Ａ、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の部分Ａ；および／または２つ以上の部分Ｃ、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の部分Ｃを含む。好ましくは、化合物の構造は、１分子当たり２つの部分Ａおよび１つの部分Ｃ；または１つの部分Ａおよび２つの部分Ｃを含む。
切断可能なリンカー単位が部分Ｂ内に存在する場合、放出機序は、細胞毒性ペイロードに連結されている抗体に特異的なものと同一であり得る。実際に、結合部分の性質は、その点において非依存性である。そのため、ｐＨ依存的［Ｌｅａｍｏｎ、Ｃ．Ｐ．ら（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１７、１２２６；Ｃａｓｉ、Ｇ．ら（２０１２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１３４、５８８７］、還元的［Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ、Ｇ．Ｊ．ら（２０１２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、５１．９４１；Ｙａｎｇ、Ｊ．ら（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３、１３８７２］および酵素的放出［Ｄｏｒｏｎｉｎａ Ｓ．Ｏ．ら（２００８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ、１９、１９６０；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｍ．Ｓ．Ｋ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２８１、１０５４０］と予想される。特定の設定において、官能基が結合部分またはペイロード（例えばチオール、アルコール）のいずれかの上に存在する場合、リンカーの無い接続が確立されることがあり、したがって、インタクトなペイロードを放出し、これは、大幅に薬物動態学的な分析を単純化する。
部分Ｂは、下記の表１に示されている単位を含むまたはそれからなることができ、ここで、式に示されている置換基ＲおよびＲｎは、適当には、Ｈ、ハロゲン、置換または非置換の（ヘテロ）アルキル、（ヘテロ）アルケニル、（ヘテロ）アルキニル、（ヘテロ）アリール、（ヘテロ）アリールアルキル、（ヘテロ）シクロアルキル、（ヘテロ）シクロアルキルアリール、ヘテロシクリルアルキル、ペプチド、オリゴ糖またはステロイド基から独立して選択することができる。好ましくは、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、これらの各々は、置換または非置換である。適当には、ＲおよびＲｎは、Ｈ、またはＣ１～Ｃ７アルキルまたはヘテロアルキルから独立して選択される。より適当には、ＲおよびＲｎは、Ｈ、メチルまたはエチルから独立して選択される。
Figure 2023514275000009
部分Ｂ、単位ＢＬおよび／または単位ＢＳは、適当には、切断可能な結合としてジスルフィド連結を含むことができるが、これは、これらの連結が、インビボにて標的で適当な薬物放出動態を与えながら加水分解に安定であり、チオール基を含めた薬物部分の痕跡のない切断を提供することができるからである。
部分Ｂ、単位ＢＬおよび／または単位ＢＳは、コンジュゲートの水溶性を改善するために極性または荷電されていてよい。例えば、リンカーは、１つまたは複数の公知の水溶性オリゴマー、例えば、ペプチド、オリゴ糖類、グリコサミノグリカン、ポリアクリル酸またはその塩、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリスルホネートなどの約１個から約２０個、適当には約２個から約１０個の残基を含むことができる。適当には、リンカーは、例えば２個から１０個のアミノ酸残基を含む極性または荷電ペプチド部分を含むことができる。アミノ酸は、任意の天然または非天然アミノ酸を指すことができる。薬物部分上にチオール基とともに前記切断可能なジスルフィド連結を形成するため、ペプチドリンカーは、適当には、遊離チオール基、好ましくはＮ末端のシステインを含む。Ｌ－またはＤ－アミノ酸を含有する任意のペプチドが適当であり得；この型の特に適当なペプチドリンカーは、Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｃｙｓおよび／またはＡｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ｃｙｓである。
これらのおよび他の実施形態において、部分Ｂ、単位ＢＬおよび／または単位ＢＳは、標的組織の細胞表面または細胞外領域上で１つまたは複数のプロテアーゼによって薬物部分から選択的に酵素的に切断されるように特化されている切断可能なまたは切断不可能なペプチド単位を含むことができる。ペプチド単位のアミノ酸残基鎖長は、適当には、単一のアミノ酸から約８個のアミノ酸残基までを範囲とする。本発明における使用に適当な多数の特異的な切断可能なペプチド配列は、それらの選択性において、特別な腫瘍関連の酵素、例えばプロテアーゼによる酵素的切断のために設計および最適化することができる。本発明における使用のための切断可能なペプチドとしては、プロテアーゼＭＭＰ－１、２もしくは３、またはカテプシンＢ、ＣもしくはＤに向かって最適化されているものが挙げられる。殊に適当なのは、カテプシンＢによって切断可能なペプチドである。カテプシンＢは、ユビキタスなシステインプロテアーゼである。それは、転移性腫瘍または関節リウマチなどの病態を除き、細胞内酵素である。カテプシンＢによって切断可能なペプチドの例は、配列Ｖａｌ－Ｃｉｔを含有している。
上記実施形態のいずれかにおいて、部分Ｂおよび特に、単位ＢＬは、適当には、リンカーの後に存在することができるまたはできない自己犠牲部分をさらに含む。自己犠牲リンカーは、電子カスケードリンカーとしても知られている。これらのリンカーは、ペプチドの酵素的切断で脱離および断片化を受けることで、活性形態、好ましくは遊離形態で薬物を放出する。コンジュゲートは、リンカーを切断できる酵素の非存在下にて細胞外で安定である。しかしながら、適当な酵素への曝露で、リンカーは切断されて、自己犠牲部分を薬物に共有結合的に連結する結合の切断をもたらす自発性自己犠牲反応を惹起して、それによって、それの非誘導体化または薬理学的に活性な形態における薬物の放出を果たす。これらの実施形態において、自己犠牲リンカーは、アミド結合を切断して自己犠牲反応を惹起する酵素のための基質を提供する、酵素的に切断可能なペプチド配列を介して結合部分にカップリングされる。適当には、薬物部分は、第１級もしくは第２級アミン基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはカルボキシル基など、薬物から突き出る化学反応性官能基を介してリンカーの自己犠牲部分に接続される。
自己犠牲リンカーの例は、薬物部分をコンジュゲートにおける結合部分に付着させるＰＡＢＣまたはＰＡＢ（パラ－アミノベンジルオキシカルボニル）である（Ｃａｒｌら（１９８１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：４７９～４８０；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙら（１９８３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６：６３８～６４４）。ペプチド単位のカルボキシ末端およびＰＡＢのパラ－アミノベンジルを連結するアミド結合は基質であり得、ある特定のプロテアーゼによって切断可能であり得る。芳香族アミンは、電子供与性になり、脱離基の排除に至る電子カスケードを惹起して、二酸化炭素の脱離後に遊離薬物を放出する（ｄｅ Ｇｒｏｏｔ、ら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６６（２６）：８８１５～８８３０）。さらなる自己犠牲リンカーは、ＷＯ２００５／０８２０２３に記載されている。
なお他の実施形態において、リンカーは、標的組織の細胞表面または細胞外領域上に存在するグルクロニダーゼによって切断可能であるグルクロニル基を含む。リソソームベータ－グルクロニダーゼがヒトがんにおいて壊死性部域における高い局所濃度にて細胞外で遊離されること、および標的化された化学療法に経路を提供することが示された（Ｂｏｓｓｌｅｔ、Ｋ．らＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８、１１９５～１２０１（１９９８））。
上記実施形態のいずれかにおいて、部分Ｂは、適当には、スペーサー単位をさらに含む。スペーサー単位は、例えばアミド、アミンまたはチオエーテル結合を介して結合部分Ａに連結することができる単位ＢＳであり得る。スペーサー単位は、例えば、切断可能なペプチド配列が、切断酵素（例えばカテプシンＢ）によって接触されるのを可能にする長さ、および適当にはその上、切断可能なペプチドを自己犠牲部分Ｘにカップリングするアミド結合の加水分解を可能にする長さである。スペーサー単位は、例えば、二価の基、例えば、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキルオキシ（例えば、ポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ）およびアルキルアミノ（例えば、ポリエチレンアミノ）の反復単位、または二酸エステルならびにスクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネートおよびカプロアミドを含めたアミドを含むことができる。
そこに記載されている実施形態のいずれかにおいて、＊は、部分Ａへの付着点、または部分Ａへの最も短い進路が場合によって・に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；・は、部分Ｃへの付着点、または部分Ｃへの最も短い進路が場合によって＊に関するものよりも少ない原子を含む部分Ｃへの付着点を表す。ペイロード部分Ｃよりはむしろ反応性部分Ｌが存在する場合にも、同じことが当てはまる。以下の表記および全ては、さらなる部分へのある特定の基または原子（例えば、Ｒ）の付着点の意味を有する：
Figure 2023514275000010
関連の構造がペプチドモノマーまたはオリゴマーであるならば、各＊は、部分Ａへの最も短い進路が・に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；各・は、部分Ｃへの最も短い進路が＊に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し、但し、ｎが＞１であり、それぞれの付着点が、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃのいずれか１つの上に示されている場合、それは、ペプチドモノマー単位の１つまたは複数に、好ましくは、それぞれの構造において示されている他の付着点から最も遠位の１つのペプチドモノマー単位に独立して存在することができる。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「テトラペプチド」などという用語は、タンパク質原性および／または非タンパク質原性アミノ酸によって形成される骨格を有するペプチドモノマーまたはオリゴマーを指す。本明細書で使用される場合、「アミノアシル」または「アミノ酸」という用語は、一般に、任意のタンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸を指す。好ましくは、そこに開示されている実施形態のいずれかにおいて、タンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸の側鎖残基は、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃのいずれかによって表され、これらの各々は、以下のリストから選択され：
Figure 2023514275000011
Figure 2023514275000012
式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、これらの各々は、置換または非置換であり；
各Ｘは、ＮＨ、ＮＲ、Ｓ、ＯおよびＣＨ２、好ましくはＮＨから独立して選択され；
各ｎおよびｍは、独立して、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択される整数である。
好ましくは、そこに開示されている実施形態のいずれかにおいて、タンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸の側鎖残基は、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃのいずれかによって表され、
これらの各々は、３員、４員、５員、６員または７員の環の一部であり得る。例えば、前記タンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸の側鎖アルファ、ベータおよび／またはガンマ位置は、以下のアミノ酸（プロリンおよびヒドロキシプロリン）におけるなど、アゼチジン環、ピロリジン環およびピペリジン環から選択される環構造の一部であってよく：
Figure 2023514275000013
これらの各々は、独立して、不飽和構造（即ち、それぞれの基Ｒａ、ＲｂおよびＲｃにジェミナルなＨ原子が存在しない）の一部、例えば：
Figure 2023514275000014
であり得る。
さらに好ましい非タンパク質原性アミノ酸は、以下のリストから選択することができる：
Figure 2023514275000015
部分Ｂならびに本発明による化合物に関する特に好ましい実施形態は、添付の請求項に示されている。
好ましくは、Ｂは、以下の一般式ＩＩ～Ｖのいずれかによって表され、式中：
Figure 2023514275000016
各ｘは、０から１００、好ましくは０から５０、より好ましくは０から３０の範囲から独立して選択される、いっそう好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択される整数であり；
各ｙは、０から３０の範囲から独立して選択される、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択される整数であり；
各ｚは、０から５の範囲から独立して選択される、好ましくは０、１、２、３および４から選択される整数であり；
＊は、部分Ａへの付着点を表し；
・は、部分Ｃへの付着点を表し、ここで：
（ａ）ＢＳおよび／またはＢＬは、アルキレン、シクロアルキレン、アリールアルキレン、ヘテロアリールアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、アリールアルケニレン、ヘテロアリールアルケニレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロシクロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アミノアシル、オキシアルキレン、アミノアルキレン、二酸エステル、ジアルキルシロキサン、アミド、チオアミド、チオエーテル、チオエステル、エステル、カルバメート、ヒドラゾン、チアゾリジン、メチレンアルコキシカルバメート、ジスルフィド、ビニレン、イミン、イミドアミド、ホスホラミド、糖類、リン酸エステル、ホスホラミド、カルバメート、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドからなる群から独立して選択される構造単位を含むまたはそれからなる基であり、これらの各々は、置換または非置換であり；ならびに／あるいは
（ｂ）ＢＳおよび／またはＢＬは、以下からなる群から独立して選択される構造単位を含むまたはそれからなる基であり：
Figure 2023514275000017
Figure 2023514275000018
Figure 2023514275000019
Figure 2023514275000020
Figure 2023514275000021
式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、これらの各々は、置換または非置換であり；
Ｒ４およびＲ５の各々は、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、これらの各々は、置換または非置換であり；
Ｒａ、ＲｂおよびＲｃの各々は、タンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸の側鎖残基から独立して選択され、これらの各々は、さらに置換されていてよく；
各Ｘは、ＮＨ、ＮＲ、Ｓ、ＯおよびＣＨ２、好ましくはＮＨから独立して選択され；
ｎおよびｍの各々は、独立して、０から１００、好ましくは０から５０、より好ましくは０から３０の整数、いっそう好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択され；
ここで、各＊は、部分Ａへの最も短い進路が・に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；各・は、部分Ｃへの最も短い進路が＊に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；ならびに／あるいは
（ｃ）１つまたは複数のＢＬは、独立して、以下の構造単位の１つまたは複数を含みまたはそれからなり：
Figure 2023514275000022
式中、上記の構造の各々において、ｎは、１、２、３または４であり；
各＊は、部分Ａへの最も短い進路が・に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；各・は、部分Ｃへの最も短い進路が＊に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し、但し、ｎが＞１であり、それぞれの付着点が、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃのいずれか１つの上に示されている場合、それは、独立して、ペプチドモノマー単位の１つまたは複数に、好ましくは、それぞれの構造において示されている他の付着点から最も遠位の１つのペプチドモノマー単位に存在することができ；ならびに／あるいは
（ｄ）ＢＬおよびＢＳの１つまたは複数は、以下の構造から独立して選択され：
Figure 2023514275000023
式中、各＊は、部分Ａへの最も短い進路が・に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；各・は、部分Ｃへの最も短い進路が＊に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；ならびに／あるいは
（ｅ）ｙは、１、２もしくは３であり；および／または少なくとも１つのＢＬは、以下の構造から独立して選択される切断可能なリンカー基をさらに含み：
Figure 2023514275000024
各＊は、部分Ａへの最も短い進路が・に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；各・は、部分Ｃへの最も短い進路が＊に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表す。
好ましくは、Ｂは、上記の通りに定義されているおよび／または以下の構造を有することができ：
Figure 2023514275000025
式中、Ｂ’ｓおよびＢ’’ｓは、以下からなる群から各々独立して選択され：
Figure 2023514275000026
各ＢＬは、以下からなる群から独立して選択され：
Figure 2023514275000027
各ｎは、０、１、２、３、４または５であり；
各ｍは、０、１、２、３、４または５であり；
各ｘ’は、０、１または２であり；
各ｘ’’は、０、１または２であり；
各ｙは、０、１または２であり；
ｚは、１または２であり、
ここで、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｘ、＊および・は、上記で定義されている通りである。
より好ましくは、本発明による化合物は、以下の式の１つによって表される構造を有する：
Figure 2023514275000028
Figure 2023514275000029
Figure 2023514275000030
Figure 2023514275000031
部分Ｃ
本発明における部分Ｃは、一般に任意の原子（Ｈを含める）、分子または粒子であってよいペイロードを表す。好ましくは、部分Ｃは、水素原子でない。
ペイロードは、放射標識化するためのキレーターであり得る。適当には、放射性核種は放出されない。キレーターは、当業者によく知られており、例えば、硫黄コロイド、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン，Ｎ－（グルタル酸）－Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－三酢酸（ＤＯＴＡＧＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＴＥＴＡ）、または添付の請求項において列挙されている好ましいキレーター構造のいずれかなどのキレーターが挙げられる。
ペイロードは、２２３Ｒａ、８９Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、４７Ｓｃ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１２１Ｓｎ、１６１Ｔｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１０５Ｒｈ、１７７Ｌｕ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８Ｆ、２１１Ａｔ、２２５Ａｃ、８９Ｓｒ、２２５Ａｃ、１１７ｍＳｎおよび１６９Ｅなどの同位体を含めて、放射性同位体を含むまたはそれからなる放射性基であってよい。好ましくは、１８Ｆおよび１２４ｌなどのポジトロンエミッター、または９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎおよび１２３Ｉなどのガンマエミッターは、診断用途のために（例えば、ＰＥＴのために）使用され、他方、８９Ｓｒ、１３１Ｉおよび１７７Ｌｕなどのベータ－エミッターは、好ましくは、治療用途のために使用される。２１１Ａｔ、２２５Ａｃおよび２２３Ｒａなどのアルファ－エミッターは、治療のためにも使用され得る。好ましい一実施形態において、放射性同位体は、８９Ｓｒまたは２２３Ｒａである。さらに好ましい実施形態において、放射性同位体は、６８Ｇａである。
ペイロードは、放射性同位元素のキレート、好ましくは、キレート化剤、好ましくは上記にリストされているキレート化剤もしくは添付の請求項９（ａ）において列挙されている好ましいキレーター構造のいずれかとともに上記下にリストされている同位体のキレート；または請求項９（ｃ）にリストされている構造から選択される基であってよい。
ペイロードは、好ましくはキサンテン色素、アクリジン色素、オキサジン色素、シアニン色素、スチリル色素、クマリン色素、ポルフィン色素、蛍光性金属－リガンド錯体、蛍光タンパク質、ナノ結晶、ペリレン色素、ボロン－ジピロメテン色素およびフタロシアニン色素から選択される、より好ましくは請求項９（ｄ）にリストされている構造から選択されるフルオロフォア基であってよい。
ペイロードは、細胞傷害性剤および／または細胞分裂阻害剤であってよい。こうした薬剤は、細胞の機能を阻害もしくは防止するおよび／または細胞の破壊を引き起こすことができる。細胞毒性剤の例としては、放射性同位元素、化学療法剤、ならびに合成類似体およびその誘導体を含めて、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素が挙げられる。細胞毒性剤は、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エンジイン、レキトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイドおよびビンカアルカロイド、またはその２つ以上の組合せからなる群から選択することができる。好ましい細胞傷害性および／または細胞分裂阻害性ペイロード部分は、請求項９（ｅ）にリストされている。
一実施形態において、ペイロードは、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード；エチレンイミン；アルキルスルホネート；トリアゼン；ピペラジン；およびニトロソウレア）、代謝拮抗剤（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、５－フルオロウラシル）、抗生物質（例えば、アントラサイクリン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アドリアマイシン、ミトラマイシン、ダクチノマイシン）有糸分裂撹乱物質（例えば、植物アルカロイド－例えば、ビンクリスチンおよび／または微小管アンタゴニスト－例えば、パクリタキセル）、ＤＮＡメチル化剤、ＤＮＡ挿入剤（例えば、カルボプラチンおよび／またはシスプラチン、ダウノマイシンおよび／またはドキソルビシンおよび／またはブレオマイシンおよび／またはサリドマイド）、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ－ＲＮＡ転写調節因子、酵素阻害剤、遺伝子調節因子、ホルモン応答モディファイヤー、低酸素症選択的細胞毒（例えば、チラパザミン）、上皮成長因子阻害剤、抗血管剤（例えば、キサンテノン５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸）、放射線活性化プロドラッグ（例えば、ニトロアリールメチル四級（ＮＭＱ）塩）もしくは生体内還元性薬物、またはその２つ以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤である。一部の実施形態において、ペイロード（即ち、部分Ｃ）は、アントラサイクリンから誘導されず、好ましくはＰＮＵ １５９６８２から誘導されない。
化学療法剤は、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、スーテント（ＳＵ１１２４８）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）．）、５－ＦＵ（５－フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）．）、ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６）、ロナファーニブ（ＳＣＨ ６６３３６）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）およびゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）．）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、またはその２つ以上の組合せからなる群から選択される。
化学療法剤は、アルキル化剤－例えば、チオテパ、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）および／またはシクロホスファミド；スルホン酸アルキル－例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよび／またはピポスルファン；アジリジン－例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよび／またはウレドーパ；エチレンイミンおよび／またはメチラメラミン－例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよび／またはトリメチロメラミン；アセトゲニン－例えば、ブラタシンおよび／またはブラタシノン；カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；クリプトフィシン；ドラスタチン；デュオカルマイシン；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード－例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミドおよび／またはウラシルマスタード；ニトロソウレア－例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよび／またはラニムスチン；ジネミシン；ビスホスホネート－例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；ネオカルチノスタチン発色団；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ドキソルビシン－例えば、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよび／またはデオキシドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン－例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝物－例えば、メトトレキセートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体－例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体－例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体－例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクシウリジン；アンドロゲン－例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬－例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充液－例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクォン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エポシロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；大環状デプシペプチド、例えば、メイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン－例えば、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよび／またはアングイジン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド－例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、パクリタキセル、アブラキサン、および／またはＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ドキセタキセル；クロラムブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）。ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体－例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）、ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド－例えば、レチノイン酸；カペシタビン；および薬学的に許容される塩、酸、誘導体または上記のいずれかの２つ以上の組合せであってよい。
ペイロードは、限定されないが以下を含めたチューブリン破壊剤であってよい：タキサン－例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル、ビンカアルカロイド、ディスコデルモリド、エポシロンＡおよびＢ、デスオキシエポチロン、クリプトフィシン、クラシンＡ、コンブレタスタチンＡ－４－ホスフェート、ＢＭＳ ２４７５５０、ＢＭＳ １８４４７６、ＢＭＳ １８８７９１；ＬＥＰ、ＲＰＲ １０９８８１Ａ、ＥＰＯ ９０６、ＴＸＤ ２５８、ＺＤ ６１２６、ビンフルニン、ＬＵ １０３７９３、ドラスタチン１０、Ｅ７０１０、Ｔ１３８０６７およびＴ９００６０７、コルヒチン、フェンスタチン、カルコン、インダノシン、Ｔ１３８０６７、オンコシジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンフルニン、ハリコンドリンＢ、イソホモハリコンドリンＢ、ＥＲ－８６５２６、ピロネチン、スポンギスタチン１、ｓｐｉｋｅｔ Ｐ、クリプトフィシン１、ＬＵ１０３７９３（セマトジンまたはセマドチン）、リゾキシン、サルコジクチン、エリュテロビン、ラウリマリド、ＶＰ－１６およびＤ－２４８５１ならびに薬学的に許容される塩、酸、誘導体または上記のいずれかの２つ以上の組合せ。
ペイロードは、限定されないが以下を含めたＤＮＡ挿入物質であってよい：アクリジン、アクチノマイシン、アントラサイクリン、ベンゾチオピラノインダゾール、ピクサントロン、クリスナトール、ブロスタリシン、ＣＩ－９５８、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、イダルビシン、ミトキサントロン、シクロホスファミド、メルファラン、マイトマイシンＣ、ビゼレシン、エトポシド、ミトキサントロン、ＳＮ－３８、カルボプラチン、シスプラチン、アクチノマイシンＤ、アムサクリン、ＤＡＣＡ、ピラゾロアクリジン、イリノテカンおよびトポテカンならびに薬学的に許容される塩、酸、誘導体または上記のいずれかの２つ以上の組合せ。
ペイロードは、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤－例えば、以下に限定されないが、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよび／またはフェアストントレミフェンならびに薬学的に許容される塩、酸、誘導体または上記のいずれかの２つ以上の組合せを含めて、抗エストロゲンおよび選択的なエストロゲン受容体モジュレーターであってよい。ペイロードは、副腎におけるエストロゲン産物を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤－例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）。エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）、ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）および／またはアナストロゾールならびに薬学的に許容される塩、酸、誘導体または上記のいずれかの２つ以上の組合せであってよい。
ペイロードは、抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、ゴセレリンおよび／またはトロキサシタビンならびに薬学的に許容される塩、酸、誘導体または上記のいずれかの２つ以上の組合せであってよい。
ペイロードは、タンパク質または抗体であってよい。好ましくは、ペイロードは、サイトカイン（例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー；またはインターフェロン、例えば、インターフェロンガンマ）である。
任意のペイロードは、非修飾または修飾形態で使用することができる。一部が修飾されていないとともに一部が修飾されているペイロードの組合せが使用され得る。例えば、ペイロードは、化学的に修飾されていてよい。化学的修飾の１つの形態は、カルボニル基の誘導体化－例えば、アルデヒドである。
好ましい実施形態において、部分Ｃは、オーリスタチン（即ち、オーリスタチン化合物ファミリーメンバーから誘導される構造を有する）またはオーリスタチン誘導体である。より好ましくは、部分Ｃは、以下の式に従った構造を有し：
Figure 2023514275000032
式中：
Ｒ１ｄは、独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル；好ましくはＨまたはＣＨ３であり；
Ｒ２ｄは、独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル；好ましくはＣＨ３またはｉＰｒであり；
Ｒ３ｄは、独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル；好ましくはＨまたはＣＨ３であり；
Ｒ４ｄは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、ＣＯＯ（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、ＣＯＮ（ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル）、Ｃ３～Ｃ１０アリールまたはＣ３～Ｃ１０ヘテロアリール；好ましくはＨ、ＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３またはチアゾリルであり；
Ｒ５ｄは、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル；好ましくはＨまたはＯＨであり；
Ｒ６ｄは、独立して、Ｃ３～Ｃ１０アリールまたはＣ３～Ｃ１０ヘテロアリール；好ましくは任意選択により置換されているフェニルまたはピリジルである。
より好ましくは、部分Ｃは、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦから誘導される。
好ましい実施形態において、部分Ｃは、以下の式に従った構造を有し：
Figure 2023514275000033
式中：
ｎは、０、１、２、３、４または５；好ましくは１であり；
Ｒ１ｅは、独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、アリール－ＣＯＯＨまたはヘテロアリール－ＣＯＯＨ；好ましくはＣＯＯＨであり；
Ｒ２ｅは、独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、アリール－ＣＯＯＨまたはヘテロアリール－ＣＯＯＨ；好ましくはＣＯＯＨであり；
各Ｒ３ｅは、独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、アリール－ＣＯＯＨまたはヘテロアリール－ＣＯＯＨ；好ましくはＣＯＯＨであり；
Ｒ４ｅは、独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、アリール－ＣＯＯＨまたはヘテロアリール－ＣＯＯＨ；好ましくはＣＯＯＨであり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨまたはＳ；好ましくはＯである。
好ましい実施形態において、部分Ｃは、以下の式に従った構造を有し：
Figure 2023514275000034
式中：
ｎは、０、１、２、３、４または５；好ましくは１であり
Ｒ１ｆは、独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、アリール－ＣＯＯＨまたはヘテロアリール－ＣＯＯＨ；好ましくはＣＯＯＨであり；
Ｒ２ｆは、独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、アリール－ＣＯＯＨまたはヘテロアリール－ＣＯＯＨ；好ましくはＣＯＯＨであり；
Ｒ３ｆは、独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、アリール－ＣＯＯＨまたはヘテロアリール－ＣＯＯＨ；好ましくはＣＯＯＨであり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨまたはＳ；好ましくはＯである。
部分Ｃならびに本発明による化合物に関する特に好ましい実施形態は、添付の請求項に示されている。
好ましい化合物は、表２または３に従った構造を有するもの、それらの個々のジアステレオ異性体、水和物、溶媒和物、結晶形態、個々の互変異性体またはその薬学的に許容される塩である。
さらなる態様
一態様において、本明細書において開示されているのは、上記で定義されている一般式Ｉの化合物、それの個々のジアステレオ異性体、それの水和物、それの溶媒和物、それの結晶形態、それの個々の互変異性体またはその薬学的に許容される塩であり、式中：Ａは、上記で定義されている構造を有する結合部分であり；Ｂは、共有結合、または部分ＡおよびＣを共有結合的に付着させる原子の鎖を含む部分であり；Ｃは、ペイロード部分である。
１つのさらなる態様において、Ｂは、上記で定義されている一般式ＩＩ～Ｖのいずれかによって表され、式中、各ＢＳは、独立して、スペーサー基を表し；各ＢＬは、独立して、切断可能なまたは切断不可能なリンカー基を表し；各ｘは、０から１００、好ましくは０から５０、より好ましくは０から３０の範囲から独立して選択される、いっそう好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択される整数であり；各ｙは、０から３０の範囲から独立して選択される、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択される整数であり；各ｚは、０から５の範囲から独立して選択される、好ましくは０、１、２、３および４から選択される整数であり；＊は、部分Ａへの付着点を表し；・は、部分Ｃへの付着点を表す。
先行する態様のいずれかに従った１つのさらなる態様において、結合部分は、上記で定義されている構造Ａ１を有する。
先行する態様のいずれかに従った１つのさらなる態様において、ＢＳおよび／またはＢＬは、アルキレン、シクロアルキレン、アリールアルキレン、ヘテロアリールアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、アリールアルケニレン、ヘテロアリールアルケニレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロシクロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アミノアシル、オキシアルキレン、アミノアルキレン、二酸エステル、ジアルキルシロキサン、アミド、チオアミド、チオエーテル、チオエステル、エステル、カルバメート、ヒドラゾン、チアゾリジン、メチレンアルコキシカルバメート、二硫化物、ビニレン、イミン、イミドアミド、ホスホラミド、糖類、リン酸エステル、ホスホラミド、カルバメート、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドからなる群から独立して選択される構造単位を含むまたはそれからなる基であり、これらの各々は、置換または非置換である。
先行する態様のいずれかに従った１つのさらなる態様において、ＢＳおよび／またはＢＬは、添付の請求項５（ｂ）における通りに定義される基である。先行する態様のいずれかに従った好ましい一態様において、１つまたは複数のＢＬは、添付の請求項５（ｃ）における通りに定義される。先行する態様のいずれかに従った好ましい一態様において、ＢＬおよびＢＳの１つまたは複数は、添付の請求項５（ｄ）における通りに定義される。先行する態様のいずれかに従った好ましい一態様において、ｙは、１、２または３であり；および／または少なくとも１つのＢＬは、添付の請求項５（ｅ）における通りに定義される。先行する態様のいずれかに従った好ましい一態様において、Ｂは、添付の請求項６における通りに定義される。
先行する態様のいずれかに従った１つのさらなる態様において、化合物は、添付の請求項７における通りに定義される。
先行する態様のいずれかに従った１つのさらなる態様において、部分Ｃは、添付の請求項８および／または９に定義されている通りである。
先行する態様のいずれかに従った１つのさらなる態様において、化合物は、以下から選択される構造を有する：コンジュゲート１；コンジュゲート２；コンジュゲート３；コンジュゲート４；コンジュゲート５；コンジュゲート６；コンジュゲート７；コンジュゲート８；コンジュゲート９；コンジュゲート１０；コンジュゲート１１；コンジュゲート１２；コンジュゲート１３；コンジュゲート１４；コンジュゲート１５；およびＥＳＶ６－ｆｌｕｏ。
その上開示されているのは、先行する態様のいずれかに従った化合物、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。こうした医薬組成物は、その上、（ａ）外科手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の体の処置の方法またはヒトもしくは動物の体に実施される診断法；あるいは（ｂ）疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象の治療または予防の方法；あるいは（ｃ）疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象に実施されるガイドされた外科手術の方法；あるいは（ｄ）ヒトまたは動物の体に実施され、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）または単一光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などの核医学画像化技法を伴う疾患または障害の診断の方法；あるいは（ｅ）疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象への治療剤または診断剤の標的化された送達の方法における使用のために開示され、ここで、先行する（ｂ）～（ｅ）の各々において、前記疾患または障害は、がん、炎症、アテローム動脈硬化症、線維症、組織リモデリングおよびケロイド障害から独立して選択され、好ましくは、がんは、乳がん、膵臓がん、小腸がん、結腸がん、多剤抵抗性結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、卵巣がん、肝細胞がん、食道がん、下咽頭がん、鼻咽腔がん、喉頭がん、骨髄腫細胞、膀胱がん、胆管腺癌、明細胞腎癌、神経内分泌腫瘍、腫瘍誘発性骨軟化症、肉腫、ＣＵＰ（不明な原発性の癌腫）、胸腺がん、デスモイド腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、子宮頚がんおよび前立腺がんからなる群から選択され；好ましくは、化合物は、注射後好ましくは１時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、治療的または診断的に関連性のあるレベルで疾患部位にて延長された滞留を有する。
処置
本明細書に記載されている化合物は、疾患を処置するために使用することができる。処置は、治療および／または予防処置であってよく、狙いは、所望されない生理的な変化または障害を防止、低減または止めることである。処置は、処置を受けない場合の予想される生存と比較した場合に生存を延長することができる。
化合物によって処置される疾患は、処置から利益を受け得る任意の疾患であってよい。これは、障害にかかりやすいような病態を含めて、慢性および急性の障害または疾患を含む。
「がん」および「がん性」という用語は、細胞成長の非調節によって典型的に特徴付けられる哺乳動物における生理学的条件を意味するように、それの最も広い意味において使用される。腫瘍は、１つまたは複数のがん性細胞を含む。
がんを処置する場合、観察される治療的効果は、がん細胞の数の低減；腫瘍サイズの低減；末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害もしくは遅延；腫瘍成長の阻害；および／またはがんと関連する症状の１つもしくは複数の軽減であり得る。
動物モデルにおいて、効力は、処置の間の腫瘍の物理的測定によって、ならびに／またはがんの部分的なおよび完全な寛解を決定することによって判定することができる。がん治療について、効力は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を判定すること、および／または応答率（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。
本発明に関連する処置の方法についての特に好ましい実施形態は、添付の請求項に示されている。
本明細書において開示されているのは、その上、例えば、外科手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の体の処置の方法またはヒトもしくは動物の体に実施される診断法であり、該方法は、本明細書に記載されている化合物または医薬組成物の治療的または診断的に有効な量を、それを必要とする対象に投与するステップを伴う。より具体的には、本明細書において開示されているのは、疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象の、例えば、治療または予防による処置の方法；あるいは疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象に実施されるガイドされた外科手術による処置の方法；疾患または障害の診断、例えば、ヒトもしくは動物の体に実施されるおよび／またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）もしくは単一光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などの核医学画像化技法を伴う診断の方法；疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象への治療剤または診断剤の標的化された送達の方法である。前述の方法において、前記疾患または障害は、がん、炎症、アテローム動脈硬化症、線維症、組織リモデリングおよびケロイド障害から独立して選択することができ、好ましくは、がんは、乳がん、膵臓がん、小腸がん、結腸がん、多剤抵抗性結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、卵巣がん、肝細胞がん、食道がん、下咽頭がん、鼻咽腔がん、喉頭がん、骨髄腫細胞、膀胱がん、胆管腺癌、明細胞腎癌、神経内分泌腫瘍、腫瘍誘発性骨軟化症、肉腫、ＣＵＰ（不明な原発性の癌腫）、胸腺がん、デスモイド腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、子宮頚がん、皮膚がん、腎臓がんおよび前立腺がんからなる群から選択される。本明細書において開示されている方法において使用される場合、化合物は、注射後好ましくは１時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、治療的または診断的に関連性のあるレベルで疾患部位にて延長された滞留を有する。
医薬組成物
本明細書に記載されている化合物は、ヒトおよび獣医学におけるヒトまたは動物使用のためであり得る医薬組成物の形態であってよく、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤のいずれか１つまたは複数を典型的に含む。治療的使用のための許容される担体または希釈剤は、医薬技術においてよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集１９８５）に記載されている。薬学的担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な薬務に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤もしくは希釈剤として－またはそれらに加えて－任意の適当なバインダー、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。
保存料、安定剤、色素および更に香味剤が医薬組成物において提供され得る。保存料の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤および懸濁化剤も使用され得る。
異なる送達システムに依存性の異なる組成物／製剤要件がある。例として、医薬組成物は、ミニポンプを使用して投与されるように製剤化することができ、または例えば経鼻スプレーもしくは吸入用のエアロゾルもしくは経口摂取可能な溶液としての粘膜経路によって投与されるように製剤化することができ、または非経口的に投与されるように製剤化することができ、ここで、組成物は、例えば静脈内、筋肉内または皮下経路による送達のための注射可能な形態によって製剤化される。代替として、製剤は、多数の経路によって投与されるように設計することができる。
薬剤が胃腸粘膜を介して粘膜的に投与されるならば、それは、胃腸管を介しての移動中に安定なままでいることができるべきであり；例えば、それは、タンパク質分解に抵抗性、酸ｐＨで安定、および胆汁の洗剤効果に抵抗性であるべきである。
適切な場合、医薬組成物は、吸入によって、坐剤もしくはペッサリーの形態で、ローション、溶液、クリーム、軟膏もしくは散粉性粉末の形態で局所的に、皮膚パッチの使用によって、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態で、または単独でもしくは賦形剤との添加混合物でのいずれかでカプセルもしくは卵型剤において、または香味剤もしくは着色剤を含有するエリキシル、溶液もしくは懸濁液の形態で経口的に投与することができ、あるいは医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内に、筋肉内にまたは皮下に注射することができる。非経口投与のため、組成物は、溶液を血液と等張性にするために他の物質、例えば、十分な塩または単糖類を含有することができる滅菌水溶液の形態で最も良く使用され得る。頬側または舌下投与のため、組成物は、従来の方式で製剤化することができる錠剤またはロゼンジの形態で投与することができる。
本発明の化合物は、薬学的に許容される塩または活性塩の形態で投与することができる。薬学的に許容される塩は、当業者によく知られており、例えば、Ｂｅｒｇｅらによって、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６６、１～１９（１９７７）において記述されているものが挙げられる。塩としては、限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカル酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホネート、およびパモ酸塩（即ち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート））が挙げられる。
投与（送達）のための経路としては、以下に限定されないが、経口（例えば、錠剤、カプセルとして、または経口摂取可能な溶液として）、局所的、粘膜（例えば、経鼻スプレーまたは吸入用エアロゾルとして）、経鼻、非経口（例えば、注射可能な形態によって）、胃腸、髄腔内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼球内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、側脳室内、脳内、皮下、点眼（硝子体内または前房内を含める）、経皮、直腸、頬側、腟内、硬膜外、舌下の１つまたは複数を挙げることができる。
典型的には、医師が、個々の対象に最も適当である実際の投与量を決定する。任意の特別な患者のための投与量の特定の用量レベルおよび頻度は、変動することができ、用いられる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全般的な健康、性別、食療法、投与のモードおよび時間、排出速度、薬物組合せ、特別な状態の重症度、および治療を受ける個体を含めて、さまざまな因子に依存する。
製剤は、単位用量または多用量容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に包装することができ、投与のために滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥させた）状態で貯蔵することができる。即時注射溶液および懸濁液は、前に記載されている種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製される。例証的単位投与量製剤は、活性成分の日用量もしくは単位サブ日用量、またはその適切な画分を含有する。
前駆体化合物
本発明の一態様において、本明細書において開示されているのは、化合物、それの個々のジアステレオ異性体、それの水和物、それの溶媒和物、それの結晶形態、それの個々の互変異性体またはその塩であり、ここで、化合物（前駆体化合物）は、部分Ａ、ならびにコンジュゲーションパートナーと反応し共有結合を形成することができる反応性部分Ｌを含む。コンジュゲーションすると（即ち、反応し共有結合を形成すると）、前者の前駆体化合物は、前者のコンジュゲーションパートナーに、これが順じてペイロード部分Ｃに結合される。コンジュゲーションパートナーは、原子、分子、粒子、治療剤および／または診断剤であり得る。好ましくは、コンジュゲーションパートナーは、治療剤および／または診断剤であり、本発明によるコンジュゲートに関して上で詳細にすでに記載されているペイロード部分に対応することができる。
好ましくは、前駆体化合物は、以下の構造を有する部分を含み：
Figure 2023514275000035
式中、Ｂは、共有結合、または共有結合的に結合された原子の鎖を含む部分である。
前駆体化合物は、以下の式ＶＩによって表すことができ：
Figure 2023514275000036
式中、Ｂは、共有結合、またはＡをＬに共有結合的に付着させる原子の鎖を含む部分である。
部分Ａは、好ましくは、構造Ａ１またはＡ２を有し、ここで、ｍは、０、１、２、３、４または５である。
部分Ｂは、好ましくは、本発明によるコンジュゲートに関して上で詳細に記載されているのと同じ構造を有する。
部分Ｌは、好ましくは、反応することで、アミド、エステル、カルバメート、ヒドラゾン、チアゾリジン、メチレンアルコキシカルバメート、二硫化物、アルキレン、シクロアルキレン、アリールアルキレン、ヘテロアリールアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、アリールアルケニレン、ヘテロアリールアルケニレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロシクロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アミノアシル、オキシアルキレン、アミノアルキレン、二酸エステル、ジアルキルシロキサン、アミド、チオアミド、チオエーテル、チオエステル、エステル、カルバメート、ヒドラゾン、チアゾリジン、メチレンアルコキシカルバメート、二硫化物、ビニレン、イミン、イミドアミド、ホスホラミド、糖類、リン酸エステル、ホスホラミド、カルバメート、ジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチドの連結基を形成することができる。当業者によって理解される通り、コンジュゲーションパートナーと反応することで前述のリストに従った連結基を形成することができる反応性基をどのように提供するかについて複数の可能性が存在し、それらは全て、本開示によって包含される。
部分Ｂは、１つまたは複数の反応性および／またはバインダー部分を連結するために使用されて、本発明のコンジュゲート前駆体を形成することができる切断可能なまたは切断不可能な二官能性のまたは多官能性の部分であり得る。一部の実施形態において、化合物の構造は、独立して、１分子当たり２つ以上の部分Ａ、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の部分Ａ；および／または２つ以上の部分Ｌ、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の部分Ｌを含む。好ましくは、化合物の構造は、１分子当たり２つの部分Ａおよび１つの部分Ｌ；または１つの部分Ａおよび２つの部分Ｌを含む。
部分Ｌは、好ましくは、以下から選択され：Ｈ、ＮＨ２、Ｎ３、ＣＯＯＨ、ＳＨ、Ｈａｌ、
Figure 2023514275000037
Figure 2023514275000038
式中、各ｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；各ｍは、独立して、０、１、２、３、４または５であり；各Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；各Ｒ４は、カルボキシ、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール（ここで、前述の各々は、置換または非置換である）、ハロゲンおよびシアノから独立して選択される。
好ましい化合物は、表３に従った構造を有するもの、それらの個々のジアステレオ異性体、水和物、溶媒和物、結晶形態、個々の互変異性体またはその塩である。
コンジュゲートを調製する方法
本発明の一態様において、本明細書において開示されているのは、上に記載されている前駆体化合物をコンジュゲーションパートナーとコンジュゲートするステップを含む、コンジュゲートを調製する方法である。好ましくは、前駆体化合物は、共有結合を形成するためのコンジュゲーションパートナーと反応することによってコンジュゲーションパートナーにコンジュゲートされる。好ましくは、こうして得られたコンジュゲートは、本明細書において他所で記載されているコンジュゲート化合物である。
コンジュゲーションパートナーは、原子、分子、粒子、治療剤および／または診断剤であり得る。好ましくは、コンジュゲーションパートナーは、治療剤および／または診断剤であり、本発明によるコンジュゲートに関して上で詳細にすでに記載されているペイロード部分に対応することができる。
好ましくは、方法は、コンジュゲートを医薬組成物としてまたは診断用組成物として製剤化することをさらに含む。医薬または診断用組成物は、ヒトおよび獣医学におけるヒトまたは動物使用のためであってよく、典型的に、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤のいずれか１つまたは複数を含む。治療的使用のための許容される担体または希釈剤は、医薬技術においてよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集１９８５）に記載されている。担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な薬務に関して選択することができる。医薬または診断用組成物は、担体、賦形剤もしくは希釈剤として－またはそれらに加えて－任意の適当なバインダー、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。「医薬組成物」というセクションにおいて上記で開示されている全ての製剤化の詳細および態様は、ここでも完全に当てはまる。
一般の技法
本発明の実践は、別段に表示されていない限り、当業者に知られている化学、生化学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学および薬理学の従来の方法を用いる。こうした技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ａ．Ｒ．、編集（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．；Ｈａｒｄｍａｎ、Ｊ．Ｇ．、Ｌｉｍｂｉｒｄ、Ｌ．Ｅ．、およびＧｉｌｍａｎ、Ａ．Ｇ．、編集（２００１）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｃｏ．；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ、Ｓ．ら、編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．；Ｗｅｉｒ、Ｄ．Ｍ．、およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｃ．Ｃ．、編集（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ～ＩＶ巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．ら、編集（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｉ～ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、編集（１９９９）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｒｅａｍら、編集（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗｔｏｎ、Ｃ．Ｒ．、およびＧｒａｈａｍ、Ａ．、編集（１９９７）ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇを参照されたい。
化学合成
本明細書に記載されている化合物は、化学合成技法によって調製することができる。
感受性官能基が、化合物の合成中に保護および脱保護される必要があり得ることは、当業者に明らかである。これは、従来技術によって、例えば、Ｔ Ｗ ＧｒｅｅｎｅおよびＰ Ｇ Ｍ Ｗｕｔｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９９１）によって「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」に、およびＰ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉによって「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ」、Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）に記載されている通りに達成することができる。
一部の反応中に、存在するいずれの立体中心も、ある特定の条件下で、例えば塩基が、塩基感受性基を含む光学中心を有する基質との反応において使用されるならば、エピマー化され得ることは可能である。当技術分野においてよく知られている通り、反応順序、条件、試薬、保護／脱保護体制などの選択によって、これなどの潜在的な問題を回避するのは可能であるはずである。
定義
抗体。「抗体」という用語は、それの最も広い意味において使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ベニヤ化抗体、抗体断片および小免疫タンパク質（ＳＩＰ）を包含する（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００２）１０２、７５～８５を参照されたい）。抗体は、特定の抗原を認識するとともにそれに結合することができる、免疫系によって発生するタンパク質である。標的抗原は、一般に、複数の抗体上のＣＤＲによって認識される、エピトープとも呼ばれる多数の結合部位を有する。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原は、２つ以上の対応する抗体を有することができる。抗体は、全長免疫グロブリン分子または全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、目的の標的の抗原またはその一部を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を含む。抗体は、任意の型－例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）－任意のクラス－例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２－またはそのサブクラスであってよい。抗体は、マウス、ヒト、ウサギからまたは他の種に由来し得るまたはし得ない。
抗体断片。「抗体断片」という用語は、全長抗体の一部、一般に、抗原結合領域またはその可変領域を指す。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；ｄＡｂ、ラクダ科ＶＨＨ抗体、および軟骨魚類のＩｇＮＡＲ抗体を含めて、単一のドメイン抗体が挙げられる。抗体およびそれらの断片は、代替の非免疫グロブリン足場に基づく結合分子、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、非ペプチド骨格を基礎とするポリペプチドループを含む構造化ポリペプチド、天然受容体またはそのドメインによって置き換えることができる。
誘導体。誘導体は、化合物の化学的修飾を含む。こうした修飾の例としては、ハロ基、アルキル基、アシル基またはアミノ基などによる水素の置き換えが挙げられる。修飾は、１つまたは複数の水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用および／または双極子相互作用を増加または減少させることができる。
類似体。この用語は、任意のエナンチオマー、ラセミ体および立体異性体、ならびにこうした化合物の全ての薬学的に許容される塩および水和物を包含する。
別段に明記されていない限り、以下の定義は、本発明の化合物およびこうした化合物を含有する組成物に関連して使用される化学用語に当てはまる。
アルキルは、分岐または非分岐の飽和ヒドロカルビル基を指す。適当には、アルキル基は、１個から１００個、好ましくは３個から３０個の炭素原子、より好ましくは５個から２５個の炭素原子を含む。好ましくは、アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルを指す。
アルケニルは、１個または複数の炭素－炭素二重結合を含有する分岐または非分岐のヒドロカルビル基を指す。適当には、アルケニル基は、２個から３０個の炭素原子、好ましくは５個から約２５個の炭素原子を含む。
アルキニルは、１個または複数の炭素－炭素三重結合を含有する分岐または非分岐のヒドロカルビル基を指す。適当には、アルキニル基は、約３個から約３０個の炭素原子、例えば、約５個から約２５個の炭素原子を含む。
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素、好ましくはフッ素または塩素を指す。
シクロアルキルは、適当には３個、４個、５個、６個、７個または８個の炭素原子を有する脂環式部分を指す。基は、架橋または多環式環系であってよい。より頻繁に、シクロアルキル基は、単環式である。この用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルニル、ビシクロ［２．２．２］オクチルなどの基への言及を含む。
アリールは、適当には６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個または１６個の環炭素原子を含む芳香族炭素環系を指す。アリールは、２個以上の環を有する多環式環系であってよく、これらの少なくとも１個は、芳香族である。この用語は、フェニル、ナフチルフルオレニル、アズレニル、インデニル、アントリルなどの基への言及を含む。
本明細書において接頭辞（ヘテロ）は、基の炭素原子の１個または複数が窒素、酸素、リン、ケイ素または硫黄によって置換されていてよいことを意味する。ヘテロアルキル基としては、例えば、アルキルオキシ基およびアルキルチオ基が挙げられる。本明細書においてヘテロシクロアルキル基またはヘテロアリール基は、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個または１６個の環原子を有することができ、これらの少なくとも１つは、窒素、酸素、リン、ケイ素および硫黄から選択される。特に、３員から１０員の環または環系およびさらに特に５員または６員環は、飽和または不飽和であってよい。例えば、オキシラニル、アジリニル、１，２－オキサチオラニル、イミダゾリル、チエニル、フリル、テトラヒドロフリル、ピラニル、チオピラニル、チアントレニル、イソベンゾフラニル、ベンゾフラニル、クロメニル、２Ｈ－ピロリル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イミダゾリジニル、ベンズイミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピラゾリジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ジチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピペリジル、ピペラジニル、ピリダジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、殊に、チオモルホリノ、インドリジニル、１，３－ジオキソ－１，３－ジヒドロ－イソインドリル、３Ｈ－インドリル、インドリル、ベンズイミダゾリル、クマリル、インダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、プリニル、４Ｈ－キノリジニル、イソキノリル、キノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、デカヒドロキノリル、オクタヒドロイソキノリル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ジベンゾチオフェニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリル、キナゾリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、［ベータ］－カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フラザニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、クロメニル、イソクロマニル、クロマニル、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－イソキノリン－１－オン、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－イソキノリニルなどから選択される。
「置換されている」は、前記部分における水素原子の１個または複数、殊に最大５個まで、さらに殊に１個、２個または３個が、対応する数の置換基によって、互いに独立して置き換えられることを意味する。「任意選択により置換されている」という用語は、本明細書で使用される場合、置換または非置換であることを含む。当然、置換基は、それらが化学的に可能である位置にのみあることが理解され、当業者は、特別な置換が可能であるかどうかを、不適切な努力なく、決定する（実験的にまたは理論的にのいずれか）ことができる。例えば、遊離水素を有するアミノ基またはヒドロキシ基は、不飽和（例えば、オレフィン）結合で炭素原子に結合されるならば、不安定であり得る。好ましくは、「置換されている」という用語は、前記部分における水素原子の１個または複数、殊に最大５個まで、さらに殊に１個、２個または３個が、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択される対応する数の置換基によって互いに独立して置き換えられることを意味する。追加として、本明細書に記載されている置換基はそれら自体、当業者によって認識されている適切な置換に対する前述の制限を受けて、任意の置換基によって置換されていてよい。好ましくは、前述の置換基のいずれも、前述の置換基のいずれかによってさらに置換されていてよく、これらの各々は、前述の置換基のいずれかによってさらに置換されていてよい。
置換基としては、適当には、ハロゲン原子およびハロメチル基、例えば、ＣＦ３およびＣＣｌ３；酸素含有基、例えば、オキソ、ヒドロキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシ、アルコイル、アルコイルオキシ、アリールオキシ、アリーロイルおよびアリーロイルオキシ；窒素含有基、例えば、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、アジ化物およびニトロ；硫黄含有基、例えば、チオール、アルキルチオール、スルホニルおよびスルホキシド；それら自体が置換されていてよい複素環式基；それら自体が置換されていてよいアルキル基；ならびにそれら自体が置換されていてよいアリール基、例えば、フェニルおよび置換フェニルを挙げることができる。アルキルとしては、置換および非置換のベンジルが挙げられる。
２つ以上の部分が、原子または基のリストから「各々独立して」選択されると記載されている場合、これは、該部分が同じまたは異なっていてよいことを意味する。各部分の同一性は、そのため、１つまたは複数の他の部分の同一性と独立している。
参照を容易にするため、本明細書において開示されている一部の化合物の番号および構造は、以下の表２、３および４にまとめられている。疑念のある場合において、下記の番号および構造が優先される。
Figure 2023514275000039
Figure 2023514275000040
Figure 2023514275000041
Figure 2023514275000042
Figure 2023514275000043
Figure 2023514275000044
Figure 2023514275000045
Figure 2023514275000046
Figure 2023514275000047
Figure 2023514275000048
Figure 2023514275000049
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Figure 2023514275000052
Figure 2023514275000053
Figure 2023514275000054
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Figure 2023514275000058
Figure 2023514275000059
Figure 2023514275000060
Figure 2023514275000061
Figure 2023514275000062
Figure 2023514275000063
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Figure 2023514275000066
Figure 2023514275000067
Figure 2023514275000068
Figure 2023514275000069
材料＆方法
概論および手順
収量は、クロマトグラフィー的に精製された化合物を指す。
プロトン（１Ｈ）核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ４００（４００ＭＨｚ）分光計上で記録した。シフトは、内部標準として残留の溶媒を使用してｐｐｍで示される。カップリング定数（Ｊ）はＨｚで報告されており、以下の略語がスプリッティングを示すために使用される：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット。
質量分光分析法（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）スペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍと組み合わされたＡｇｉｌｅｎｔ ６１００ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ上で、ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８カラム、４．６ｍｍ×５６ｍｍを使用して、２ｍＬ 分－１の流量で、溶媒ＡおよびＢ（Ａ＝０．１％ギ酸［ＦＡ］を有するミリポア水、Ｂ＝０．１％ギ酸［ＦＡ］を有するＭｅＣＮ）の直線勾配にて記録した。
高分解能質量分光分析法（ＨＲＭＳ）スペクトルおよび分析用逆相超性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）は、ＰＤＡ ＵＶ検出器を有するＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＳｙｓｔｅｍにカップリングされたＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴＯＦ上で、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍを使用して、０．６ｍＬ 分－１の流量で、溶媒ＡおよびＢ（Ａ＝０．１％ＦＡを有するミリポア水、Ｂ＝０．１％ＦＡを有するＭｅＣＮ）の直線勾配にて記録した。
分取用逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓｙｓｔｅｍ上で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ（登録商標）５μｍ ＮＸ－Ｃ１８半分取カラム、１１０Å、１５０ｍｍ×１０ｍｍを使用して、５ｍＬ 分－１の流量で、溶媒ＡおよびＢ（Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸［ＴＦＡ］を有するミリポア水、Ｂ＝０．１％トリフルオロ酢酸［ＴＦＡ］を有するＭｅＣＮ）の直線勾配にて行った。
比較例１：（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－６－（３－（４－（３’，６’－ジヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－５－カルボニル）ピペラジン－１－イル）プロポキシ）キノリン－４－カルボキシアミド（「ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＦＬＵＯ」、２３）の合成
ステップ１：６－ヒドロキシ－４－キノリンカルボン酸（Ｈ１）
Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）中のＨＢｒ ４８ｗｔ．％中の６－メトキシキノリン－カルボン酸（２５０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を１３０℃で２時間の間加熱し、次いで、真空下で濃縮することで、生成物がオレンジ色の粉末として得られた（２９２ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ、定量的収量）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２７１（Ｍ＋Ｈ）＋。
ステップ２：１－Ｂｏｃ－４－（３－ヒドロキシプロピル）ピペラジン（Ｈ２）
無水Ｋ２ＣＯ３（８１５ｍｇ、５．９１ｍｍｏｌ、１．１当量）を乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の１－Ｂｏｃ－ピペラジン（１．０ｇ、５．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に添加し、その後、３－ブロモ－１－プロパノール（５３０μＬ、５．９１ｍｍｏｌ、１．１当量）が続き、反応混合物を室温で７２時間の間撹拌した。揮発性物を減圧下で除去し、残渣を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出し（２回）、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物をフラッシュクロマトグラフィー（９８：２から９０：１０のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によって精製することで、標題化合物が無色の油として得られた（１．２ｇ、４．９１ｍｍｏｌ、９１％の収率）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２４５（Ｍ＋Ｈ）＋。
ステップ３：３－（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピペラジン－１－イル）プロピル６－（３－（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピペラジン－１－イル）プロポキシ）キノリン－４－カルボキシレート（Ｈ３）
乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）中のＨ１（１００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）、Ｈ２（１８０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、２．０当量）およびトリフェニルホスフィン（１９３ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、２．０当量）の撹拌溶液をアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ；１４５μＬ、０．７４ｍｍｏｌ、２．０当量）で処理した。反応物を室温で１時間の間撹拌し、次いで、真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（９５：５から９０：１０のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によって直接精製することで、標題化合物が白色の粉末として得られた（１００ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ、４２％の収率）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ６４２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2023514275000070
ステップ４：６－（３－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルピペラジン－１－イル）プロポキシ）キノリン－４－カルボン酸（Ｈ４）
ＴＨＦ（５ｍＬ）中のＨ３（１００ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）中のＬｉＯＨ（１３ｍｇ、０．３１２ｍｍｏｌ、２．０当量）の溶液を添加し、反応物を室温で２時間の間撹拌した。混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出し、ＮＨ４Ｃｌ ｓ．ｓ．で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過することで、生成物が白色の粉末として得られた（６０ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ、９２％の収率）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４１６（Ｍ＋Ｈ）＋。
ステップ５：１－ピペラジンカルボン酸、４－［３－［［４－［［［２－［（２Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロ－１－ピロリジニル］－２－オキソエチル］アミノ］カルボニル］－６－キノリニル］オキシ］プロピル］－、１，１－ジメチルエチルエステル（Ｈ５）
ＤＣＭ（３ｍＬ）中のＨ４（１５ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＨＡＴＵ（２０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＨＯＢｔ（７．３ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ、１．５当量）の撹拌溶液に、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（２５μＬ、０．１４４ｍｍｏｌ、４当量）中の（Ｓ）－１－（２－アミノアセチル）－４，４－ジフルオロピロリジン－２－カルボニトリル（１０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を添加し、反応物を室温で９時間の間撹拌した。混合物を真空下で蒸発させ、ＤＭＳＯ中に溶解させ、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製することで、生成物が白色の固体として得られた（６．０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、２８％の収率）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ５８７（Ｍ＋Ｈ）＋。
ステップ６：（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－６－（３－（ピペラジン－１－イル）プロポキシ）キノリン－４－カルボキシアミド（Ｈ６）
ＭｅＣＮ（３ｍＬ）中のＨ５（５．０ｍｇ、８．０μｍｏｌ、１．０当量）および４－メチルベンゼンスルホン酸一水和物（６．８ｍｇ、４０μｍｏｌ、５．０当量）の撹拌溶液を５５℃で２時間の間加熱した。混合物を真空下で濃縮し、生成物を後続ステップにおいてそのまま使用した。白色の粉末（８．０ｍｇ、８．０μｍｏｌ、定量的収量）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４８７（Ｍ＋Ｈ）＋。
ステップ７：（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－６－（３－（４－（３’，６’－ジヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－５－カルボニル）ピペラジン－１－イル）プロポキシ）キノリン－４－カルボキシアミド（「ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＦＬＵＯ」、２３）
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＨ６（４．５ｍｇ、４．０μｍｏｌ、１．０当量）およびＴＥＡ（１．１μＬ、８．０μｍｏｌ、２．０当量）の撹拌溶液に、ＮＨＳ－フルオレセイン（２．８ｍｇ、６．０μｍｏｌ、１．５当量）を添加し、反応物を室温で９時間の間撹拌した。混合物をＲＰ－ＨＰＬＣによって直接精製することで、生成物がオレンジ色の粉末として得られた（０．９ｍｇ、１．０μｍｏｌ、２６％の収率）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ８４５（Ｍ＋Ｈ）＋（比較例１Ｂ；図１Ｂを参照されたい）。
実施例２：（Ｓ）－Ｎ１－（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）－Ｎ４－（２－（２－（２－（３－（３’，６’－ジヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－５－イル）チオウレイド）エトキシ）エトキシ）エチル）スクシンイミド（「ＥＳＶ６－ＦＬＵＯ」、２６）の合成
ステップ１：５，８－ジオキサ－２，１１－ジアザドデカン酸、１２－［（３’，６’－ジヒドロキシ－３－オキソスピロ［イソベンゾフラン－１（３Ｈ），９’－［９Ｈ］キサンテン］－６－イル）アミノ］－１２－チオキソ－、１，１－ジメチルエチルエステル（Ｐ１）
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－｛２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル｝カルバメート（１７３μＬ、０．７３１ｍｍｏｌ、１．５当量）の撹拌溶液に、フルオレセイン－５－イソチオシアネート（１９０ｍｇ、０．４８７ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、反応物を室温で１２時間の間撹拌した。混合物を真空下で濃縮し、粗製物をフラッシュクロマトグラフィー（９：１から８：２のＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ）によって直接精製することで、化合物がオレンジ色の粉末として得られた（２００ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ、６４％の収率）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ６３８（Ｍ＋Ｈ）＋。
ステップ２：チオ尿素、Ｎ－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチル］－Ｎ’－（３’，６’－ジヒドロキシ－３－オキソスピロ［イソベンゾフラン－１（３Ｈ），９’－［９Ｈ］キサンテン］－５－イル）－（Ｐ２）
０℃に冷却されたＤＣＭ（１０ｍＬ）中のＰ１（１５０ｍｇ、０．２３５ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、Ｅｔ２Ｏ（５ｍＬ）中のＨＣｌ ４Ｍを添加した。反応物を撹拌し、室温に２時間の間ゆっくり加熱し、次いで真空下で濃縮し、Ｅｔ２Ｏで数回共蒸発させた後に、オレンジ色の粉末を得た（１３５ｍｇ、０．２３５ｍｍｏｌ、定量的収量）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ５３８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2023514275000071
ステップ３：（Ｓ）－８－アミノ－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）キノリン－４－カルボキシアミド（Ｐ３）
市販で利用可能な８－アミノ－キノリン－４－カルボン酸（１９．０ｍｇ、１００μｍｏｌ、１．０当量）、ＤＩＰＥＡ（７０．０μＬ、４００μｍｏｌ、４．０当量）およびＨＡＴＵ（３８．０ｍｇ、１００μｍｏｌ、１．０当量）を１：１のＤＣＭ／ＤＭＦ混合物（２ｍＬ）中に溶解させた。１５分後、ＤＣＭ中の（Ｓ）－１－（２－アミノアセチル）－４，４－ジフルオロピロリジン－２－カルボニトリルトリフルオロアセテート（３０．３ｍｇ、１００μｍｏｌ、１．０当量）の溶液を添加した。反応混合物を１時間の間室温で撹拌し、水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮することで、茶色の粗製物が粘性油として得られた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（９１：１から９０：１０のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によって精製することで、純粋な生成物が茶色がかった油として得られた（２４．８ｍｇ、６８．９μｍｏｌ、６９％の収率）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ３６０（Ｍ＋Ｈ）＋。
ステップ４：（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（Ｐ４）
トリエチルアミン（２０．８μＬ、１５０μｍｏｌ、２．０当量）および４－ジメチルアミノピリジン（０．９１ｍｇ、１０．０μｍｏｌ、０．１当量）を、ＤＣＭ中のＰ３（２６．８ｍｇ、７０．０μｍｏｌ、１．０当量）の冷却溶液（０℃）に添加し、その後、無水コハク酸（１５．０ｍｇ、１５０μｍｏｌ、２．０当量）の滴下による添加が続いた。反応混合物を室温に戻しておいた。反応混合物を、予備加熱された４０℃の油浴に入れた後に、完全な変換が観察された。溶媒を蒸発させ、残渣をＲＰ－ＨＰＬＣによって精製することで、純粋な生成物が白色の粉末として得られた（９．４２ｍｇ、２０．０μｍｏｌ、２８％の収率）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４６０（Ｍ＋Ｈ）＋。図２８は、実施例２、Ｐ４の構造、クロマトグラフィープロファイルおよびＬＣ／ＭＳ分析を示す。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４６０．２１（Ｍ＋Ｈ）＋。
ステップ５：（Ｓ）－Ｎ１－（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）－Ｎ４－（２－（２－（２－（３－（３’，６’－ジヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－５－イル）チオウレイド）エトキシ）エトキシ）エチル）スクシンアミド（「ＥＳＶ６－ＦＬＵＯ」、２６）
Ｐ２（２２．０ｍｇ、４０．０μｍｏｌ、２．０当量）およびＨＡＴＵ（１５．６ｍｇ、４０．０μｍｏｌ、２．０当量）を１：１のＤＣＭ／ＤＭＦ混合物（２ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（７．２０μｌ、４０．０μｍｏｌ、２．０当量）中に取った。結果として得られた混合物を１５分間室温で撹拌した。ＤＣＭ中のＰ４（９．４２ｍｇ、２０．０μｍｏｌ、１．０当量）を添加し、反応混合物を室温で終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を分取用ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製することで、純粋な生成物が黄色の固体として得られた（２．５０ｍｇ、１０．０μｍｏｌ、２５％の収率）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ９７９（Ｍ＋Ｈ）＋（図１Ａ）。
本発明によるさらなるコンジュゲートが下記にリストされている。
コンジュゲート１：（２Ｓ，５Ｒ，８Ｒ，１１Ｒ）－２－（（（１－（６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｒ）－１－（（４－（（５Ｒ，８Ｓ，１１Ｒ，１２Ｓ）－１１－（（Ｒ）－ｓｅｃ－ブチル）－１２－（２－（（Ｒ）－２－（（１Ｓ，２Ｓ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－５，８－ジイソプロピル－４，１０－ジメチル－３，６，９－トリオキソ－２，１３－ジオキサ－４，７，１０－トリアザテトラデシル）フェニル）アミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－６－オキソヘキシル）－２，５－ジオキソピロリジン－３－イル）チオ）メチル）－５，１１－ビス（カルボキシメチル）－１６－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－８－（３－グアニジノプロピル）－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３，６，９，１２－テトラアザヘキサデカン酸
Figure 2023514275000072
コンジュゲート２：（２Ｓ，５Ｒ，８Ｒ，１１Ｒ）－８－（４－アミノブチル）－２－（（（１－（６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｒ）－１－（（４－（（５Ｒ，８Ｓ，１１Ｒ，１２Ｓ）－１１－（（Ｒ）－ｓｅｃ－ブチル）－１２－（２－（（Ｒ）－２－（（１Ｓ，２Ｓ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－５，８－ジイソプロピル－４，１０－ジメチル－３，６，９－トリオキソ－２，１３－ジオキサ－４，７，１０－トリアザテトラデシル）フェニル）アミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－６－オキソヘキシル）－２，５－ジオキソピロリジン－３－イル）チオ）メチル）－５，１１－ビス（カルボキシメチル）－１６－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３，６，９，１２－テトラアザヘキサデカン酸
Figure 2023514275000073
コンジュゲート３：（２Ｓ，５Ｒ，８Ｒ，１１Ｒ）－２－（（（１－（６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｒ）－１－（（４－（（５Ｒ，８Ｓ，１１Ｒ，１２Ｓ）－１１－（（Ｒ）－ｓｅｃ－ブチル）－１２－（２－（（Ｒ）－２－（（１Ｓ，２Ｓ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－５，８－ジイソプロピル－４，１０－ジメチル－３，６，９－トリオキソ－２，１３－ジオキサ－４，７，１０－トリアザテトラデシル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－６－オキソヘキシル）－２，５－ジオキソピロリジン－３－イル）チオ）メチル）－５，１１－ビス（カルボキシメチル）－１６－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－８－（３－グアニジノプロピル）－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３，６，９，１２－テトラアザヘキサデカン酸
Figure 2023514275000074
コンジュゲート４：Ｎ６－（４－（（３－（（３－（（（２Ｒ）－１－（（（１４Ｒ，１６Ｒ，３３Ｒ，２Ｓ，４Ｓ，１０Ｅ，１２Ｚ，１４Ｓ）－８６－クロロ－１４－ヒドロキシ－８５，１４－ジメトキシ－３３，２，７，１０－テトラメチル－１２，６－ジオキソ－７－アザ－１（６，４）－オキサジナナ－３（２，３）－オキシラナ－８（１，３）－ベンゼナシクロテトラデカファン－１０，１２－ジエン－４－イル）オキシ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）アミノ）－３－オキソプロピル）チオ）－２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）メチル）シクロヘキサン－１－カルボニル）－Ｎ２－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタノイル）－Ｄ－アスパルチル－Ｄ－アルギニル－Ｄ－アスパルチル－Ｄ－リジン
Figure 2023514275000075
コンジュゲート５：（２Ｒ，５Ｒ，８Ｒ，１１Ｒ）－５，１１－ビス（カルボキシメチル）－１６－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－２－（（１－（１４－（（４－（４，７－ジメチル－３，８，１１－トリオキソ－１１－（（２Ｓ，４Ｓ）－２，５，１２－トリヒドロキシ－７－メトキシ－４－（（（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）－９－メトキシ－１－メチルオクタヒドロ－１Ｈ－ピラノ［４’，３’：４，５］オキサゾロ［２，３－ｃ］［１，４］オキサジン－３－イル）オキシ）－６，１１－ジオキソ－１，２，３，４，６，１１－ヘキサヒドロテトラセン－２－イル）－２，９－ジオキサ－４，７－ジアザウンデシル）フェニル）カルバモイル）－１５－メチル－３，１２－ジオキソ－７，１０－ジオキサ－４，１３－ジアザヘキサデシル）－２，５－ジオキソピロリジン－３－イル）チオ）－８－（３－グアニジノプロピル）－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３，６，９，１２－テトラアザヘキサデカン酸
Figure 2023514275000076
コンジュゲート６：（１０Ｒ，１３Ｒ，１６Ｒ，１９Ｒ）－１－（（３ａＲ，４Ｒ，５Ｓ，１０ｂＲ）－４－アセトキシ－３ａ－エチル－９－（（３Ｓ，５Ｓ，７Ｓ，９Ｓ）－５－エチル－５－ヒドロキシ－９－（メトキシカルボニル）－１，４，５，６，７，８，９，１０－オクタヒドロ－２Ｈ－３，７－メタノ［１］アザシクロウンデシノ［５，４－ｂ］インドール－９－イル）－５－ヒドロキシ－８－メトキシ－６－メチル－３ａ，３ａ１，４，５，５ａ，６，１１，１２－オクタヒドロ－１Ｈ－インドリジノ［８，１－ｃｄ］カルバゾール－５－イル）－１０－カルボキシ－１３－（カルボキシメチル）－１９－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）－１６－（３－グアニジノプロピル）－１，４，１２，１５，１８－ペンタオキソ－５－オキサ－８，９－ジチア－２，３，１１，１４，１７－ペンタアザヘニコサン－２１－オイック酸
Figure 2023514275000077
コンジュゲート７：２，２’，２’’－（１０－（２－（（２－（３－（（（２Ｓ，５Ｒ，８Ｒ，１１Ｒ）－８－（４－アミノブチル）－２－カルボキシ－５，１１－ビス（カルボキシメチル）－１６－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３，６，９，１２－テトラアザヘキサデシル）チオ）－２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）エチル）アミノ）－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸
Figure 2023514275000078
コンジュゲート８：２，２’，２’’－（１０－（１－カルボキシ－４－（（２－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）エチル）アミノ）－４－オキソブチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸
Figure 2023514275000079
コンジュゲート９：１７７－ルテチウムで標識化された２，２’，２’’－（１０－（１－カルボキシ－４－（（２－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）エチル）アミノ）－４－オキソブチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸
Figure 2023514275000080
コンジュゲート１０：２２５－アクチニウムで標識化された２，２’，２’’－（１０－（１－カルボキシ－４－（（２－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）エチル）アミノ）－４－オキソブチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸
Figure 2023514275000081
コンジュゲート１１：６４－銅で標識化された２，２’，２’’－（１０－（１－カルボキシ－４－（（２－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）エチル）アミノ）－４－オキソブチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸
Figure 2023514275000082
コンジュゲート１２：６８－ガリウムで標識化された（Ｓ）－３－（（Ｓ）－２－アミノ－６－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）ヘキサンアミド）－４－（（（Ｒ）－１－カルボキシ－２－メルカプトエチル）アミノ）－４－オキソブタン酸
Figure 2023514275000083
コンジュゲート１３：（Ｓ）－３－（（Ｓ）－２－アミノ－６－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）ヘキサンアミド）－４－（（（Ｒ）－１－カルボキシ－２－メルカプトエチル）アミノ）－４－オキソブタン酸
Figure 2023514275000084
コンジュゲート１４：９９ｍ－テクネチウムで標識化された（Ｓ）－３－（（Ｓ）－２－アミノ－６－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）ヘキサンアミド）－４－（（（Ｒ）－１－カルボキシ－２－メルカプトエチル）アミノ）－４－オキソブタン酸
Figure 2023514275000085
コンジュゲート１５：（２Ｒ，５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ）－８－（４－アミノブチル）－５，１１－ビス（カルボキシメチル）－１６－（（４－（（２－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－２－（（（１－（３’，６’－ジヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－５－イル）－２，５－ジオキソピロリジン－３－イル）チオ）メチル）－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３，６，９，１２－テトラアザヘキサデカン酸
Figure 2023514275000086
実施例３：フルオレセイン標識化バインダー「ＥＳＶ６－ＦＬＵＯ」（２６）の特徴付け
ヒトＦＡＰの発現
ポリヒスチジン－タグ化ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈＦＡＰ）のアミノ酸配列：
ＬＲＰＳＲＶＨＮＳＥＥＮＴＭＲＡＬＴＬＫＤＩＬＮＧＴＦＳＹＫＴＦＦＰＮＷＩＳＧＱＥＹＬＨＱＳＡＤＮＮＩＶＬＹＮＩＥＴＧＱＳＹＴＩＬＳＮＲＴＭＫＳＶＮＡＳＮＹＧＬＳＰＤＲＱＦＶＹＬＥＳＤＹＳＫＬＷＲＹＳＹＴＡＴＹＹＩＹＤＬＳＮＧＥＦＶＲＧＮＥＬＰＲＰＩＱＹＬＣＷＳＰＶＧＳＫＬＡＹＶＹＱＮＮＩＹＬＫＱＲＰＧＤＰＰＦＱＩＴＦＮＧＲＥＮＫＩＦＮＧＩＰＤＷＶＹＥＥＥＭＬＡＴＫＹＡＬＷＷＳＰＮＧＫＦＬＡＹＡＥＦＮＤＴＤＩＰＶＩＡＹＳＹＹＧＤＥＱＹＰＲＴＩＮＩＰＹＰＫＡＧＡＫＮＰＶＶＲＩＦＩＩＤＴＴＹＰＡＹＶＧＰＱＥＶＰＶＰＡＭＩＡＳＳＤＹＹＦＳＷＬＴＷＶＴＤＥＲＶＣＬＱＷＬＫＲＶＱＮＶＳＶＬＳＩＣＤＦＲＥＤＷＱＴＷＤＣＰＫＴＱＥＨＩＥＥＳＲＴＧＷＡＧＧＦＦＶＳＴＰＶＦＳＹＤＡＩＳＹＹＫＩＦＳＤＫＤＧＹＫＨＩＨＹＩＫＤＴＶＥＮＡＩＱＩＴＳＧＫＷＥＡＩＮＩＦＲＶＴＱＤＳＬＦＹＳＳＮＥＦＥＥＹＰＧＲＲＮＩＹＲＩＳＩＧＳＹＰＰＳＫＫＣＶＴＣＨＬＲＫＥＲＣＱＹＹＴＡＳＦＳＤＹＡＫＹＹＡＬＶＣＹＧＰＧＩＰＩＳＴＬＨＤＧＲＴＤＱＥＩＫＩＬＥＥＮＫＥＬＥＮＡＬＫＮＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬＥＶＤＥＩＴＬＷＹＫＭＩＬＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰＬＬＩＱＶＹＧＧＰＣＳＱＳＶＲＳＶＦＡＶＮＷＩＳＹＬＡＳＫＥＧＭＶＩＡＬＶＤＧＲＧＴＡＦＱＧＤＫＬＬＹＡＶＹＲＫＬＧＶＹＥＶＥＤＱＩＴＡＶＲＫＦＩＥＭＧＦＩＤＥＫＲＩＡＩＷＧＷＳＹＧＧＹＶＳＳＬＡＬＡＳＧＴＧＬＦＫＣＧＩＡＶＡＰＶＳＳＷＥＹＹＡＳＶＹＴＥＲＦＭＧＬＰＴＫＤＤＮＬＥＨＹＫＮＳＴＶＭＡＲＡＥＹＦＲＮＶＤＹＬＬＩＨＧＴＡＤＤＮＶＨＦＱＮＳＡＱＩＡＫＡＬＶＮＡＱＶＤＦＱＡＭＷＹＳＤＱＮＨＧＬＳＧＬＳＴＮＨＬＹＴＨＭＴＨＦＬＫＱＣＦＳＬＳＤＨＨＨＨＨＨ
ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈＦＡＰ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ１２８８４（ＳＥＰＲ＿ＨＵＭＡＮ）アミノ酸２５－７６０）を、それの５’－に分泌配列、およびそれの３’末端に６×ポリヒスチジンタグを有するｐＣＤＮＡ３．１（＋）中でクローニングし、一過性遺伝子発現によってＣＨＯ細胞中で発現した。トランスフェクションミックスを以下の通りに構築した：０．６２５μｇのプラスミドＤＮＡ、１０６細胞について２．５μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度。細胞を６日間３７℃、５％のＣＯ２２、１２０ｒｐｍでインキュベートした。細胞を遠心分離（４５００ｒｐｍ、３０分、４℃）によって収集し、１ｍＬ（乾燥体積）の完全なＨｉｓタグ精製樹脂を濾過された上清に添加し、２時間の間、１２０ｒｐｍ、室温でインキュベートした。樹脂を８００ｍＬの洗浄緩衝液（イミダゾール１０ｍＭ、ＰＢＳ／ＮａＣｌ ２５０ｍＭ）で洗浄し、ｈＦＡＰを２５０ｍＭのイミダゾールＰＢＳ／ＮａＣｌ ２５０ｍＭで溶出した。溶出画分（１．５ｍＬ）を分光光度計上で吸光度について２８０ｎｍでチェックした。ｈＦＡＰ富化画分をプールし、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）に対して透析した。
組換えｈＦＡＰの試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって分析し（図２：Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ）を参照されたい）、酵素の活性を阻害アッセイにおいて確認した（「インビトロのヒトＦＡＰ酵素ＩＣ５０アッセイ」というセクションを参照されたい）。
蛍光偏光によるヒトＦＡＰに対する親和性測定（図４）
蛍光偏光測定を３８４ウェルプレート中で行った（非結合、ｐｓ、ｆ底、黒色、高い体積、３０μＬの最終体積）。バインダーの最終濃度を１０ｎｍで一定に保持しながら、ヒトＦＡＰ（４μＭ）のストック溶液を緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．４）で系列希釈した。３０分間３７℃で暗所にてインキュベートした後に蛍光偏光によって測定を実施した（図４）。ＥＳＶ６－ｆｌｕｏは、前に記載されているリガンド、Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏ（０．８９ｎＭのＫＤ）と比較して、ｈＦＡＰ（０．７８ｎＭのＫＤ）に対してより高い親和性を呈する。
インビトロのヒトＦＡＰ酵素ＩＣ５０アッセイ（図５）
Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ基質に対するヒトＦＡＰの酵素活性を、マイクロタイタープレートリーダー上にて室温で測定して、３６０ｎｍの励起波長および４６５ｎｍの発光波長で蛍光をモニタリングした。反応混合物は、２０μＭの基質、２０ｎＭのヒトＦＡＰ、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．４）および阻害剤（１０－６から１０－１１Ｍの間を範囲とする）を３０μＬの総体積で含有していた。ＩＣ５０値は、基質の添加より前に３７℃で酵素を用いる３０分のプレインキュベーション後の、酵素活性を５０％低減するために必要とされる阻害剤の濃度として定義される。
阻害剤ストック溶液（２００ｍＭ）をＤＭＳＯ中で調製した。実験の開始直前に、ストックをアッセイ緩衝液中で１０－６Ｍにさらに希釈し、これから、１：２の系列希釈を調製した。全ての測定をトリプリケートで行った。
図５は、小有機リガンドの存在下でのｈＦＡＰ阻害実験からの結果を示す。ＥＳＶ６リガンドは、前に記載されているリガンド、Ｈａｂｅｒｋｏｒｎリガンド（２４．６ｎＭ）と比較して、より低いＩＣ５０（２０．２ｎＭ）を呈する。
リガンド－タンパク質複合体のクロマトグラフィー共溶出実験（図３）
ＰＤ－１０カラムを、複合体の負荷の前に、アッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．４）で予備平衡化した。ヒトＦＡＰ（２μＭ）およびフルオレセイン標識化バインダー（６μＭ）を３０分間３７℃で暗所にてインキュベートした。混合物を負荷し、アッセイ緩衝液を使用してカラムをフラッシュした。フロースルーを９６ウェルプレート中に回収し、蛍光をＴＥＣＡＮマイクロタイタープレートリーダー上で直ちに測定して、４８５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長で蛍光をモニタリングした。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００／２０００ｃ分光光度計を使用して、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって、タンパク質分量を概算した。
図３は、小分子リガンドＥＳＶ６－ｆｌｕｏおよびＨａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏおよびｈＦＡＰの共溶出ＰＤ－１０実験の結果を示す。安定な複合体が、ｈＦＡＰおよび小リガンドＥＳＶ６－ｆｌｕｏおよびＨａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏの間に形成されている。
解離速度測定（図６）
ｋｏｆｆ値を決定するための蛍光偏光測定を３８４ウェルプレート中で行った（非結合、ｐｓ、ｆ底、黒色、高い体積、３０μＬの最終体積）。暗所にて３７℃で１．０μＭの一定濃度にてヒトＦＡＰを用いる２．０ｎＭのフルオレセイン標識化バインダーの予備インキュベーション後に、測定を実施した。大過剰の対応するフルオレセインフリーバインダー（各々２０μＭの最終濃度での、それぞれ、実施例２のステップ３で得られた化合物Ｐ３および比較例１のステップ６で得られた化合物Ｈ６）を添加することによって、フルオレセイン標識化化合物の解離を誘発した。
図６は、ｈＦＡＰからのＥＳＶ６－ｆｌｕｏおよびＨａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏの解離速度測定からの結果を示す。ＥＳＶ６－ｆｌｕｏは、Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ－ｆｌｕｏ（回帰係数＝－０．０７５１１２）と比較して、より遅いペース（回帰係数＝－０．０９３５６４）で解離する。
本出願における比較例１の化合物（「ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＦＬＵＯ」）は、従来技術の開示の、および特に、従来技術（ＷＯ２０１９／１５４８８６およびＷＯ２０１９／１５４８５９）に記載されているリガンドＦＡＰＩ－０４の構造の代表と考えられ得る。上記の結果は、本発明による化合物がｈＦＡＰと安定な複合体を形成するだけでなく、驚くべきことに、従来技術と比較した場合に親和性の著しい増加（より低いＫＤ）、阻害活性の増加（より低いＩＣ５０）、および解離のより遅い速度も示すことを示す。
実施例４：腫瘍モデルにおける比較実験
ＰＡＲＴ１－コンジュゲートの調製
ｔｅｒｔ－ブチル（８－アミノキノリン－４－カルボニル）グリシネートの合成
Figure 2023514275000087
ＤＩＰＥＡ（１８５μＬ、１．０６３ｍｍｏｌ、４当量）を、３００μＬのＤＭＦおよび３ｍＬのＤＣＭ中のｔｅｒｔ－ブチルグリシネート塩酸塩（８９ｍｇ、０．５３２ｍｍｏｌ、２．０当量）、８－アミノキノリン－４－カルボン酸（５０ｍｇ、０．２６６ｍｍｏｌ、０．１当量）およびＨＡＴＵ（１１１ｍｇ、０．２９２ｍｍｏｌ、１．１当量）の撹拌溶液に滴下により添加した。反応混合物を室温で１時間の間撹拌した。混合物を真空下で濃縮し、粗材料をフラッシュクロマトグラフィー（１００％から９．５：０．５のＤＭＣ／ＭｅＯＨ）によって直接精製することで、ｔｅｒｔ－ブチル（８－アミノキノリン－４－カルボニル）グリシネートが茶色の油として得られた（７０ｍｇ、０．２３２ｍｍｏｌ、８７．５％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ３０２．１４（Ｍ＋Ｈ）＋
４－（（４－（（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸の合成
Figure 2023514275000088
４－ジメチルアミノピリジン（１４ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ、０．５当量）を、ＴＨＦ（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（８－アミノキノリン－４－カルボニル）グリシネート（７０ｍｇ、０．２３２ｍｍｏｌ、１．０当量）およびジヒドロフラン－２，５－ジオン（２３２ｍｇ、２．３２４ｍｍｏｌ、１０．０当量）の撹拌溶液に添加した。反応物を５０℃で６時間の間加熱した。混合物を真空下で濃縮し、ＤＣＭ中で希釈し、水で洗浄した。有機相を真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（９：１から７：３のＤＭＣ／ＭｅＯＨ）によって精製することで、化合物が茶色の油として得られた（５０ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ、８３．３％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４０２．１６（Ｍ＋Ｈ）＋
樹脂上のＣｙｓ（ＳＴｒｔ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＮＨＦｍｏｃの合成
Figure 2023514275000089
Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂上の市販で利用可能な予備負荷Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（５００ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ、ＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）をＤＭＦ中で膨張させ（３×５分×５ｍＬ）、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去し（１×１分×５ｍＬおよび２×１０分×５ｍＬ）、樹脂をＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）。ペプチドをＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨで、示された順序にて伸長させた。この目的のため、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（２．０当量）、ＨＢＴＵ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（４．０当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解させた。混合物を１０分間０℃で静置しておき、穏やかにかき混ぜながら１時間の間樹脂と反応させた。ＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）後、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去した（１×１分×５分および２×１０分×５ｍＬ）。脱保護ステップの後に、ＤＭＦを用いる洗浄ステップ（６×１分×５ｍＬ）が続き、その後に次のアミノ酸とのカップリングが続いた。
（２Ｒ，５Ｓ，８Ｓ，１１Ｒ）－８－（４－アミノブチル）－５，１１－ビス（カルボキシメチル）－１６－（（４－（（カルボキシメチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－２－（メルカプトメチル）－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３，６，９，１２－テトラアザヘキサデカン酸の合成
Figure 2023514275000090
樹脂上のＣｙｓ（ＳＴｒｔ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＮＨＦｍｏｃ（５０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中で膨張させた（３×５分×５ｍＬ）。ペプチドを４－（（４－（（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、２．０当量）、ＨＡＴＵ（１９ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（１７μＬ、０．１ｍｍｏｌ、４．０当量）で伸長させ、穏やかにかき混ぜながら１時間の間反応させておいた。ＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）後、樹脂をＤＣＭ中のＴＦＡ（１５％）、ＴＩＳ（２．５％）およびＨ２Ｏ（２．５％）の混合物と４時間の間室温でかき混ぜることによって化合物を切断した。樹脂をメタノール（２×５ｍＬ）で洗浄し、合わせた切断溶液および洗浄溶液を真空下で濃縮した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（２．４ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ、１２％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ８０７．４５（Ｍ＋Ｈ）＋
（２Ｒ，５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ）－８－（４－アミノブチル）－５，１１－ビス（カルボキシメチル）－１６－（４－（３－（（４－（（２－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－６－イル）オキシ）プロピル）ピペラジン－１－イル）－２－（メルカプトメチル）－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３，６，９，１２－テトラアザヘキサデカン酸の合成
Figure 2023514275000091
樹脂上のＣｙｓ（ＳＴｒｔ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＮＨＦｍｏｃ（６０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中で膨張させた（３×５分×５ｍＬ）。ペプチドを（Ｓ）－４－（４－（３－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－６－イル）オキシ）プロピル）ピペラジン－１－イル）－４－オキソブタン酸（１７．５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＨＡＴＵ（２２ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（２００μＬ、１．２ｍｍｏｌ、４０当量）で伸長させ、穏やかにかき混ぜながら１時間の間反応させておいた。ＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）後、樹脂をＤＣＭ中のＴＦＡ（１５％）、ＴＩＳ（２．５％）およびＨ２Ｏ（２．５％）の混合物と４時間の間室温でかき混ぜることによって化合物を切断した。樹脂をメタノール（２×５ｍＬ）で洗浄し、合わせた切断溶液および洗浄溶液を真空下で濃縮した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（１ｍｇ、０．９５μｍｏｌ、０．３％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １０４８．３９（Ｍ＋Ｈ）＋
（２Ｒ，５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ）－８－（４－アミノブチル）－５，１１－ビス（カルボキシメチル）－１６－（（４－（（２－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－２－（メルカプトメチル）－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３，６，９，１２－テトラアザヘキサデカン酸の合成
Figure 2023514275000092
樹脂上のＣｙｓ（ＳＴｒｔ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＮＨＦｍｏｃ（８０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中で膨張させた（３×５分×５ｍＬ）。ペプチドを（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（３７ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、２当量）、ＨＡＴＵ（３０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（２８μＬ、０．１６ｍｍｏｌ、４．０当量）で伸長させ、穏やかにかき混ぜながら１時間の間反応させておいた。ＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）後、樹脂をＤＣＭ中のＴＦＡ（１５％）、ＴＩＳ（２．５％）およびＨ２Ｏ（２．５％）の混合物と４時間の間室温でかき混ぜることによって化合物を切断した。樹脂をメタノール（２×５ｍＬ）で洗浄し、合わせた切断溶液および洗浄溶液を真空下で濃縮した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（１ｍｇ、０．９５μｍｏｌ、０．３％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ９２１．２９（Ｍ＋Ｈ）＋
「ＱＣＯＯＨ－ＩＲＤｙｅ７５０」の合成
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＱＣＯＯＨ（１４０μｇ、０．１７４μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８００μＬ）中に溶解させた。ＩＲＤｙｅ７５０マレイミド（２００μｇ、０．１７４μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（２００μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、緑色の固体が得られた（０．０６μｍｏｌ、４０％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ９７８（Ｍ＋２Ｈ）２＋
Figure 2023514275000093
コンジュゲート１６：「ＱＣＯＯＨ－ＩＲＤｙｅ７５０」の構造。
「ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＩＲＤｙｅ７５０」の合成
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＨＫ（１８１μｇ、０．１７４μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８００μＬ）中に溶解させた。ＩＲＤｙｅ７５０マレイミド（２００μｇ、０．１７４μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（２００μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、緑色の固体が得られた（０．０６μｍｏｌ、４０％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １０９９．８（Ｍ＋２Ｈ）２＋
Figure 2023514275000094
コンジュゲート１７：「ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＩＲＤｙｅ７５０」の構造。
ＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０の合成
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（１６０μｇ、０．１７４μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８００μＬ）中に溶解させた。ＩＲＤｙｅ７５０マレイミド（２００μｇ、０．１７４μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（２００μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、緑色の固体が得られた（０．０８μｍｏｌ、５０％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １０３６．３（Ｍ＋２Ｈ）２＋
Figure 2023514275000095
コンジュゲート１８：ＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０の構造。
「ＱＣＯＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ」の合成
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＱＣＯＯＨ（６１２μｇ、０．７６０μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させた。ＭＣ－ＶａｌＣｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１０００μｇ、０．７６０μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（３２２μｇ、２０％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２１２４．０３（Ｍ＋Ｈ）＋
Figure 2023514275000096
コンジュゲート１９：「ＱＣＯＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ」の構造。
「ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ」の合成
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＨＫ（７９５μｇ、０．７６０μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させた。ＭＣ－ＶａｌＣｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１０００μｇ、０．７６０μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（３２２μｇ、２０％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２３６４．１８（Ｍ＋Ｈ）＋
Figure 2023514275000097
コンジュゲート２０：「ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ」の構造。
「ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ」の合成
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（７００μｇ、０．７６０μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させた。ＭＣ－ＶａｌＣｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１０００μｇ、０．７６０μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（３２２μｇ、２０％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２２３６．０７（Ｍ＋Ｈ）＋
Figure 2023514275000098
コンジュゲート２１：「ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ」の構造。
図２６は、ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）の構造、クロマトグラフィープロファイルおよびＬＣ／ＭＳ分析を示す。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １１１８．０５（Ｍ＋２Ｈ）２＋。
ＰＡＲＴ２－動物実験
腫瘍細胞調製
解凍すると、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７腫瘍細胞を、ウシ胎児血清（１０％、ＦＢＳ）および抗生物質－抗糸状菌剤（１％、ＡＡ）が補充されたＲＰＭＩ培地において３７℃および５％のＣＯ２で培養保持した。継代するため、９０％コンフルエンスに達した時にトリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％を使用して細胞を剥離し、１：４の希釈度で再播種した。
ＩＶＩＳ実験
ＳＫ－ＭＥＬ－１８７異種移植された腫瘍を、上に記載されている通りに雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）に移植し、０．１ｍＬの平均体積に成長させておいた。皮下ＳＫ－ＭＥＬ－１８７腫瘍を保有するマウスに、ＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０、ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＩＲＤｙｅ７５０またはＱＣＯＯＨ－ＩＲＤｙｅ７５０（１５０ｎｍｏｌ／Ｋｇ、滅菌ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に調製された３０μＭ溶液として）を静脈内に注射した。マウスをイソフルランで麻酔にかけ、蛍光画像をＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、露出１ｓ、ビニング係数８、７４５ｎｍで励起、８００ｎｍで発光フィルター、ｆ数２、視野１３．１）上で獲得した。注射の５分後、２０分後および１時間後に画像を撮った。その期間中、食物および水を無制限に与えた。マウスを引き続いてＣＯ２窒息によって屠殺した（２時間の時間ポイント）。血液、心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓、胃、腸の切片およびＳＫ－ＭＥＬ－１８７腫瘍を回収し、上に記述されているパラメータを使用して個々に画像化した（図７）。
具体的に、図７は、静脈内投与（１５０ｎｍｏｌ／Ｋｇの用量）後の、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７黒色腫異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの近赤外蛍光画像化におけるＩＲＤｙｅ ７５０コンジュゲートの標的化性能の評価を示す：（Ａ）様々な時点（注射の５分後、２０分後および１時間後）での生きた動物の画像；（Ｂ）２時間でのエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物ＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０、高親和性ＦＡＰリガンド「ＥＳＶ６」の誘導体は、ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＩＲＤｙｅ７５０と比較した場合に、より高い腫瘍対肝臓、腫瘍対腎臓および腫瘍対腸の取り込み比を呈する。ＱＣＯＯＨ－ＩＲＤｙｅ７５０（標的化されていない対照）は、インビボでＳＫ－ＭＥＬ－１８７病変に局在化しない。
治療実験
ＳＫ－ＭＥＬ－１８７異種移植された腫瘍を、上に記載されている通りに雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）に移植し、０．１ｍＬの平均体積に成長させておいた。マウスを３匹の治療群に無作為に割り当てた。ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）およびＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）に、連続した７日間ＤＭＳＯの１％を有する滅菌ＰＢＳ溶液として毎日注射した。腫瘍を電子ノギスで測定し、動物を毎日秤量した。腫瘍体積（ｍｍ３）を式（長手側、ｍｍ）×（短手側、ｍｍ）×（短手側、ｍｍ）×０．５で算出した（図８）。Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）をデータ分析のために使用した（通常の二方向ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ試験）。
具体的に、図８は、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７腫瘍保有マウスにおけるＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥおよびＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥの治療的活性の判定を示す。データポイントは、平均腫瘍体積±ＳＥＭを表す（１群当たりｎ＝３）。（Ａ）矢印は、異なる処置のＩＶ感染を示す。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ、高親和性ＦＡＰリガンド「ＥＳＶ６」の薬物コンジュゲート誘導体は、ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥと比較した場合に、より強力な抗腫瘍効果を呈する。（Ｂ）異なる処置の耐容性は、実験中の動物の体重の変化（％）の評価によって判定された通りに示される。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥは、ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥと比較した場合に、より低い急性毒性を呈する。
実施例５：放射性標識化のためのコンジュゲートの調製
「ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＤＯＴＡ」の合成
（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－６－（３－（ピペラジン－１－イル）プロポキシ）キノリン－４－カルボキシアミド（１５ｍｇ、０．０３０ｍｏｌ、１．０当量）、ＨＡＴＵ（１３ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、１．１当量）およびトリ－ｔｅｒｔ－ブチル１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラアセテート（１９ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、１．１当量）を、ＤＣＭ／ＭＤＦ（８００μＬ／５０μＬ）中に溶解させた。ＤＩＰＥＡ（１８μＬ、０．１０１ｍｍｏｌ、３当量）を滴下により添加し、反応物を室温で１時間の間撹拌した。粗生成物をＴＦＡ（４０％）で終夜処理し、逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（４ｍｇ、１５％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ８７３．４（Ｍ＋Ｈ）＋
Figure 2023514275000099
コンジュゲート２２：「ＨＡＢＥＲＫＯＲＮ－ＤＯＴＡ」の構造。
「ＥＳＶ６－ＤＯＴＡ」（８）の合成
（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（１５ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＳＯ（４００μＬ）中に溶解させた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（９ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、１．３当量）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（４．５ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加し、反応物を終夜室温で撹拌し、光から保護した。２，２’，２”－（１０－（４－（（２－アミノエチル）アミノ）－１－カルボキシ－４－オキソブチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸（２０ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、１．２当量）を含有する１００μＬのＰＢＳ溶液を添加し、反応物を２時間の間撹拌した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（２．４ｍｇ、８％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ９６０．３９（Ｍ＋Ｈ）＋
Figure 2023514275000100
コンジュゲート８：「ＥＳＶ６－ＤＯＴＡ」の構造。
図２７は、ＥＳＶ６－ＤＯＴＡＧＡ（８）の構造、クロマトグラフィープロファイルおよびＬＣ／ＭＳ分析を示す。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ９６０．３９（Ｍ＋Ｈ）＋。
実施例６：化合物Ｐ４と化合物２４との間の比較実験
ＰＡＲＴ１－化合物２４の調製
７－（フェニルアミノ）キノリン－４－カルボン酸の合成
Figure 2023514275000101
７－ブロモキノリン－４－カルボン酸（３０ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ、１．０当量）を、トルエン（１ｍＬ）およびジオキサン（５００μＬ）中のアニリン（１１１ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ、１９８μＬ、１０．０当量）の撹拌溶液に、圧力バイアル中で添加した。溶液を５分間脱ガスし（アルゴン－真空サイクル）、次いで、ＢｒｅｔｔＰｈｏｓ Ｐａｌｌａｄａｃｙｃｌｅ（１０ｍｇ、０．０１１９ｍｍｏｌ、０．１当量）およびカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（５３ｍｇ、０．４７６ｍｍｏｌ、４．０当量）を添加し、反応物を１１０℃で４時間の間加温し、ＬＣ／ＭＳを介してチェックした。粗製物をシリカ上に吸収し、フラッシュクロマトグラフィー（９：１から２：８のＤＭＣ／ＭｅＯＨ）によって精製することで、化合物がオレンジ色の油として得られた（３１ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ、１００％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２６５．０９（Ｍ＋Ｈ）＋
（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－７－（フェニルアミノ）キノリン－４－カルボキシアミド（化合物２４）の合成
Figure 2023514275000102
７－（フェニルアミノ）キノリン－４－カルボン酸（３１ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ、１．０当量）、（Ｓ）－４，４－ジフルオロ－１－グリシルピロリジン－２－カルボニトリル（２４ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＨＡＴＵ（８９ｍｇ、０．２３４ｍｍｏｌ、２当量）を、溶液ＤＭＦ（２００μＬ）およびジクロロメタン（１ｍＬ）中に添加した。ＤＩＰＥＡ（４５ｍｇ、０．３５２ｍｍｏｌ、６１μＬ、３当量）を滴下により添加し、反応物を１５分間室温で撹拌した。ＤＣＭを蒸発させ、粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、黄色の固体が得られた（３．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、６．９％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４３６．１５（Ｍ＋１Ｈ）１＋
ＰＡＲＴ２－インビトロ実験
ｈＦＡＰに対するインビトロ阻害アッセイ
異なる小有機リガンド（実施例２からの化合物Ｐ４；化合物２４）の存在下でのＺ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ基質に対するヒトＦＡＰの酵素活性を、室温でマイクロタイタープレートリーダー上にて測定して、３６０ｎｍの励起波長および４６５ｎｍの発光波長で蛍光をモニタリングした。反応混合物は、２０μＭの基質、２０ｎＭのヒトＦＡＰ（一定）、アッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．４）および阻害剤（１０－６から１０－１１Ｍの系列希釈、１：２）を２０μＬの総体積で含有していた。ＩＣ５０値は、基質の添加後に酵素活性を５０％低減するのに必要とされる阻害剤の濃度として定義される）。
図９は、実施例２からの化合物Ｐ４が、化合物２４（３３．４６ｎＭ、より低い阻害）と比較して、より低いＩＣ５０（１６．８３ｎＭ、より高い阻害）を呈することを示す。
実施例７：コンジュゲート１５および２５の合成ならびにそれらの特徴付け
ＰＡＲＴ１－コンジュゲートの調製
コンジュゲート１５の合成
Figure 2023514275000103
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（２ｍｇ、２．１７１μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８００μＬ）中に溶解させた。フルオレセイン－５－マレイミド（１．８ｍｇ、４．３４３μｍｏｌ、２．０当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、黄色の固体が得られた（４２０ｎｍｏｌ、１９．３％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １３４８．３６（Ｍ＋１Ｈ）１＋
図２５は、コンジュゲート１５の構造、クロマトグラフィープロファイルおよびＬＣ／ＭＳ分析を示す。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １３４８．３６（Ｍ＋１Ｈ）＋。
コンジュゲート２５の合成
Figure 2023514275000104
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＨＫ（１ｍｇ、０．９５４μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８００μＬ）中に溶解させた。フルオレセイン－５－マレイミド（８１７μｇ、１．９０９μｍｏｌ、２．０当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、黄色の固体が得られた（３７３ｎｍｏｌ、３９．１％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １４７６．４７（Ｍ＋１Ｈ）１＋
ＰＡＲＴ２－インビトロ実験
蛍光偏光（ＦＰ）によるヒトおよびマウスＦＡＰに対する親和性測定
蛍光偏光実験を３８４ウェルプレート中で行った（非結合、ｐｓ、ｆ－底、黒色、高い体積、３０μＬの最終体積）。バインダーの最終濃度を１０ｎｍで一定に保持しながら、ヒトＦＡＰ（４μＭ）およびマウスＦＡＰ（５μＭ）のストック溶液を緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．４）で系列希釈した。蛍光異方性をＴＥＣＡＮマイクロタイタープレートリーダー上で測定した。実験をトリプリケートで行い、プリズム７を使用して平均異方性値をフィットさせた。
図１０Ａは、コンジュゲート１５が、コンジュゲート２５（ＫＤ＝１．０２ｎＭ）と比較して、ｈＦＡＰ（ＫＤ＝０．６８ｎＭ）に対してより高い親和性を有することを示す。図１０Ｂは、コンジュゲート１５が、コンジュゲート２５（ＫＤ＝３０．９４ｎＭ）と比較して、ｍＦＡＰ（ＫＤ＝１１．６１ｎＭ）に対してより高い親和性を有することを示す。コンジュゲート１５は、コンジュゲート２５と比較して、ｈＦＡＰに対して優位な結合特性およびマウス抗原に対してより良好な交差反応性を提示する。
リガンド－タンパク質複合体のクロマトグラフィー共溶出実験
ＰＤ－１０カラムを、複合体の負荷の前に、アッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．４）で予備平衡化した。異なるタンパク質（ｈＦＡＰ＝２μＭ、ｍＦＡＰ＝５μＭ）およびコンジュゲート１５（１００ｎＭ）の混合物をインキュベートし、カラム上に負荷した。アッセイ緩衝液を使用して、混合物をフラッシュした。フロースルーを９６ウェルプレート中に回収し、蛍光強度をＴＥＣＡＮマイクロタイタープレートリーダー上で直ちに測定して、４８５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長で蛍光をモニタリングした。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００／２０００ｃ分光光度計を使用して２８０ｎｍで吸光度を測定することによって、タンパク質の濃度を概算した。
図１１は、ｈＦＡＰ（Ａ）およびｍＦＡＰ（Ｂ）との小分子リガンドコンジュゲート１５の共溶出ＰＤ－１０実験の結果を示す。安定な複合体は、タンパク質および小リガンドコンジュゲート１５の両方の間に形成され、２つの分子の共溶出を一緒に可能にする。
ＰＡＲＴ３－動物実験
細胞培養
解凍すると、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰおよびＳＫ－ＲＣ－５２細胞を、ウシ胎児血清（１０％、ＦＢＳ）および抗生物質－抗糸状菌剤（１％、ＡＡ）が補充されたＲＰＭＩ培地において３７℃および５％のＣＯ２で培養保持した。継代するため、９０％コンフルエンスに達した時にトリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％を使用して細胞を剥離し、１：４の希釈度で再播種した。
解凍すると、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰおよびＨＴ－１０８０細胞を、ウシ胎児血清（１０％、ＦＢＳ）および抗生物質－抗糸状菌剤（１％、ＡＡ）が補充されたＤＭＥＭ培地において３７℃および５％のＣＯ２で培養保持した。継代するため、９０％コンフルエンスに達した時にトリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％を使用して細胞を剥離し、１：４の希釈度で再播種した。
ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ、ＳＫ－ＲＣ－５２、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰおよびＨＴ－１０８０に対する共焦点顕微鏡法分析
ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰおよびＳＫ－ＲＣ－５２細胞を、１０％ＦＣＳ、ＡＡおよびＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）が補充されたＲＰＭＩ培地において１ウェル当たり１０４細胞の密度で４ウェルカバースリップチャンバープレートに播種し、標準的な培養条件下で２４時間の間成長させておいた。核構造を染色するため、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核色素を使用した。
培養培地を、コンジュゲート１５（１００ｎＭ）を含有する新鮮な培地と置き換えた。無作為に選択されたコロニーを、ＡＯＢＳ装置（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）が備えられているＳＰ８共焦点顕微鏡上に画像化した。
ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰおよびＨＴ－１０８０細胞を、１０％ＦＣＳ、ＡＡおよびＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）が補充されたＤＭＥＭ培地（１ｍＬ）において１ウェル当たり１０４細胞の密度で４ウェルカバースリップチャンバープレートに播種し、標準的な培養条件下で２４時間の間成長させておいた。核構造を染色するため、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核色素を使用した。
培養培地を、コンジュゲート１５（１００ｎＭ）を含有する新鮮な培地と置き換えた。無作為に選択されたコロニーを、ＡＯＢＳ装置（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）が備えられているＳＰ８共焦点顕微鏡上に画像化した。
図１２は、共焦点顕微鏡法およびＦＡＣＳ分析を介するＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰおよび野生型腫瘍細胞上のコンジュゲート１５（１０ｎＭ）の選択的蓄積の評価を示す。（Ａ）化合物でインキュベートされたＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰの異なる時点（ｔ＝０および１時間）での画像は、細胞膜上のコンジュゲート１５の蓄積を示す。（Ｂ）化合物でのインキュベーション後のＳＫ－ＲＣ－５２野生型の画像は、細胞膜上の蓄積を示さなかった（陰性対照）。（Ｃ）ＳＫ－ＲＣ－５２野生型（暗灰色ピーク）およびＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ（薄灰色ピーク）に対するＦＡＣＳ分析は、コンジュゲート１５（１０ｎＭ）のＦＡＰ特異的細胞結合を示す。（Ｄ）化合物でインキュベートされたＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰの異なる時点（ｔ＝０および１時間）での画像は、細胞膜上およびサイトゾルの内側のコンジュゲート１５の蓄積を示す。（Ｅ）化合物でのインキュベーション後のＨＴ－１０８０野生型の画像は、細胞膜上およびサイトゾル中の蓄積を示さない（陰性対照）。
ＦＡＣＳ分析
Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ、ＨＴ－１０８０．ｗｔおよびＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰを培養プレートから剥離し、カウントし、ＰＢＳ ｐＨ７．４中のＦＣＳの１％ｖ／ｖ溶液中に１．５×１０６細胞／ｍＬの最終濃度に懸濁した。３×１０５細胞（２００μＬ）のアリコートをスピンダウンし、ＰＢＳ ｐＨ７．４（２００μＬ）中のＦＣＳの１％ｖ／ｖ溶液中のコンジュゲート１５（１５ｎＭ）の溶液中に再懸濁し、氷上で１時間の間インキュベートした。細胞をＰＢＳ ｐＨ７．４（２００μＬ）中のＦＣＳの１％ｖ／ｖ溶液２００μＬで１回洗浄し、スピンダウンし、ＰＢＳ ｐＨ７．４（３００μＬ）中のＦＣＳの１％ｖ／ｖ溶液中に再懸濁し、ＣｙｔｏＦＬＥＸサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で分析した。生データをＦｌｏｗＪｏ １０．４ソフトウェアで処理した。
結果は、図１２Ｆに示されており：ＨＴ－１０８０野生型（暗灰色ピーク）およびＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ（薄灰色ピーク）に対するＦＡＣＳ分析は、コンジュゲート１５（１０ｎＭ）のＦＡＰ特異的細胞結合を示す。
動物研究
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒａｍｔ ｄｅｓ Ｋａｎｔｏｎｓ Ｚｕｒｉｃｈによって与えられたライセンス番号ＺＨ０４／２０１８下でスイス動物福祉法および規制に従って、全ての動物実験を行った。
皮下ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腫瘍の移植
ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ細胞を８０％コンフルエンスに成長させ、トリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％で剥離した。細胞をＨＢＳＳ培地において５×１０７細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁した。５×１０６細胞（１００μＬの懸濁液）のアリコートを雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）の右側腹部の皮下に注射した。
エクスビボ実験
皮下ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腫瘍を保有するマウスに、コンジュゲート１５（滅菌ＰＢＳ中４０ｎｍｏｌ、ｐＨ７．４）を静脈内に注射した。動物を静脈内注射の１時間後にＣＯ２窒息によって屠殺し、臓器および腫瘍を切除し、ＯＣＴ培地においてスナップ凍結し、－８０℃で貯蔵した。クリオスタット切片（７μｍ）をカットし、核をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄａｋｏ Ｏｍｎｉｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ）で染色した。Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ ｍｏｔ ｐｌｕｓ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像を得、ＩｍａｇｅＪ １．５３ソフトウェアによって分析した。
図１３は、静脈内投与（４０ｎｍｏｌ）後の、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腎細胞癌異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるコンジュゲート１５の標的化性能の評価の結果を示す。投与の１時間後のエクスビボ臓器画像が表されている。化合物は、高い腫瘍対臓器選択性で、静脈内注射の１時間後にインビボにおける腫瘍部位に急速におよび均質に局在化する。
実施例８：コンジュゲート９の合成および特徴付け
ＰＡＲＴ１－コンジュゲートの調製
１７７－ルテチウムで標識化されたコンジュゲート９（２，２’，２’’－（１０－（１－カルボキシ－４－（（２－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）エチル）アミノ）－４－オキソブチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸の合成
Figure 2023514275000105
コンジュゲート８を１μｇ／μＬの最終濃度に酢酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝４）中に溶解させた。コンジュゲート８（２５μＬ中２５μｇ）のストック溶液を２５０μＬの酢酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝４）で希釈した。１７７ＬｕＣｌ３溶液（２５０μＬ、２５ＭＢｑ）を添加し、混合物を９５℃で１５分間加熱した。標識化用混合物を滅菌ＰＢＳ（１９７５μＬ、ｐＨ＝７．４）の添加によって希釈し、放射ＨＰＬＣ（５～１０μＬ、０．５～１ＭＢｑ、溶媒Ａとして水中０．１％ＴＦＡおよび溶媒Ｂとしてアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。プログラム：０～８分、２０％～６５％溶媒Ｂおよび流量１ｍｌ／分）を介して標識化効率をモニタリングした。コンジュゲート９への定量的変換を達成した（放射標識化効率＞９９％、図１４）。
図１４Ａは、１７７Ｌｕで標識化した後のコンジュゲート９の放射ＨＰＬＣプロファイル（ｒ．ｔ．１１分）を示す。図１４Ｂは、遊離１７７Ｌｕの放射ＨＰＬＣプロファイル（２分）を示す。放射標識化した後、コンジュゲート９は変換の＞９９％で単一ピークとして出現する。
ＰＡＲＴ２－動物実験
ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰにおける放射標識化および体内分布実験
ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腫瘍細胞を、実施例７に記載されている通りに雌性ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに移植し、２５０ｍｍ３の平均体積に３週間成長させておいた。マウスを無作為化し（１群当たりｎ＝４）、コンジュゲート９（５０、１２５、２５０、５００または１０００ｎｍｏｌ／Ｋｇ；０．５～２ＭＢｑ）の放射標識化調製物で静脈内に注射した。マウスをＣＯ２窒息によって注射の１０分後、１時間後、３時間後および６時間後に屠殺し、臓器を抽出し、秤量し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ γカウンターで放射性測定した。値は％ＩＤ／ｇ±ＳＤで表現される（図１５）。食物および水をその期間中無制限に与えた。
図１５は、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腎細胞癌異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕにおけるコンジュゲート９（これは、１７７Ｌｕ放射性ペイロードを含む）の体内分布実験の結果を示す。（Ａ）コンジュゲート９（用量＝５０ｎｍｏｌ／Ｋｇ；０．５～２ＭＢｑ）の静脈内投与後の異なる時点（１０分、１時間、３時間および６時間）での腫瘍および健康な臓器における％ＩＤ／ｇおよび腫瘍対臓器比分析。（Ｂ）異なる用量（１２５ｎｍｏｌ／Ｋｇ、２５０ｎｍｏｌ／Ｋｇ、５００ｎｍｏｌ／Ｋｇおよび１０００ｎｍｏｌ／Ｋｇ；０．５～２ＭＢｑ）での１７７Ｌｕコンジュゲート９の静脈内投与の３時間後の腫瘍および健康な臓器における％ＩＤ／ｇおよび腫瘍対臓器比分析。用量依存性応答が観察され得、標的飽和は、２５０ｎｍｏｌ／Ｋｇから５００ｎｍｏｌ／Ｋｇの間で達することができる。（Ｃ）１７７Ｌｕ溶液の静脈内投与の３時間後の腫瘍および健康な臓器における％ＩＤ／ｇ（陰性対照；１ＭＢｑ）および腫瘍対臓器比分析。
実施例９：化合物２７～３２の合成
６９－ガリウムで標識化された２，２’，２’’－（１０－（１－カルボキシ－４－（（２－（４－（（４－（（２－（（Ｒ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）エチル）アミノ）－４－オキソブチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸、コンジュゲート２７の合成
Figure 2023514275000106
コンジュゲート８を１μｇ／μＬの最終濃度に酢酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝４）中に溶解させた。
コンジュゲート８（１００μＬ中１００μｇ）のストック溶液を２５０μＬの酢酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝４）で希釈した。ＧａＣｌ３溶液（１８３μＬのＨＣｌ中１８３μｇ）を添加し、混合物を９０℃で１５分間加熱した。ＬＣ／ＭＳを介して、反応をチェックした。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １０２７．３０（Ｍ＋Ｈ）＋
メチル（６－メトキシキノリン－４－カルボニル）グリシネートの合成
Figure 2023514275000107
６－メトキシキノリン－４－カルボン酸（２００ｍｇ、０．９８５ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＨＢＴＵ（４００ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ、１．０５当量）、ＨＯＢｔ（１６７ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、１．１５当量）およびグリシンメチル塩酸塩（１０７ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ、１．１当量）を５ｍＬのＤＭＦ中に溶解させ、室温で撹拌した。ＤＩＰＥＡ（６１３μＬ、４．４２ｍｍｏｌ、４．５当量）を滴下により添加し、競合までＬＣ／ＭＳを介して反応をチェックした。クロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１０分で１００：０から８０：２０）を介して粗製物を直接精製することで、淡黄色の固体が得られた（４０ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ、１４．７％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２７５．１（Ｍ＋１Ｈ）。
（６－メトキシキノリン－４－カルボニル）グリシネートの合成
Figure 2023514275000108
メチル（６－メトキシキノリン－４－カルボニル）グリシネート（３０ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ、１．０当量）を１Ｍ ＬｉＯＨ溶液のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬ中に溶解させ、室温で６時間の間撹拌した。完了した時、わずかに酸性ｐＨに到達するまで塩基をＨＣｌ １Ｍでクエンチし、粗製物を凍結乾燥することで、白色の固体が得られた（定量的収量）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２６１．０８（Ｍ＋１Ｈ）１＋
（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－６－メトキシキノリン－４－カルボキシアミド、コンジュゲート２８の合成
Figure 2023514275000109
（６－メトキシキノリン－４－カルボニル）グリシネート（２８ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ、１．０当量）、（Ｓ）－ピロリジン－２－カルボニトリル（１６ｍｇ、０，１２０ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＨＡＴＵ（６２ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ、１．５当量）を２ｍＬのＤＭＦ中に溶解させ、懸濁液を室温で撹拌した。ＤＩＰＥＡ（４７μＬ、２．６２ｍｍｏｌ、２４当量）を滴下により添加し、競合までＬＣ／ＭＳを介して反応をチェックした。逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）を介して粗製物を直接精製し、凍結乾燥させることで、黄色の固体が得られた（２ｍｇ、５．９１μｍｏｌ、５．４％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ３３９．１４（Ｍ＋１Ｈ）１＋
ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメートの合成
Figure 2023514275000110
（Ｓ）－４，４－ジフルオロ－ピロリジン－２－カルボニトリル（５０ｍｇ、０，３７９ｍｍｏｌ、１当量）、（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－Ｌ－アラニン（１５４ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＨＡＴＵ（２８８ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、２当量）を４ｍＬのＤＭＦ中に溶解させ、懸濁液を室温で撹拌した。ＤＩＰＥＡ（３３５μＬ、１．８９３ｍｍｏｌ、５当量）を滴下により添加し、競合までＬＣ／ＭＳを介して反応をチェックした。ＤＭＦを真空下で除去し、粗製物をＤＣＭ中に希釈した。有機相を水および１Ｍ ＨＣｌで洗浄し、次いで、乾燥させることで、白色の泡が得られた（１１５ｍｇ、０．３７９ｍｍｏｌ、定量的収量）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ３０４．１４（Ｍ＋１Ｈ）１＋
（Ｓ）－１－（Ｌ－アラニル）－４，４－ジフルオロピロリジン－２－カルボニトリルの合成
Figure 2023514275000111
ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメート（１１５ｍｇ、０，３７９ｍｍｏｌ、１当量）を２ｍＬのＤＣＭ中に溶解させ、ＴＦＡ（２０３μＬ、７当量）を滴下により添加し、反応物を室温で撹拌し、競合までＬＣ／ＭＳを介してチェックした。粗製物をＤＣＭ中に希釈し、生成物をＨＣｌ １Ｍで抽出した。酸性水相を次いでＮａＯＨ １Ｍでクエンチし、生成物をＤＣＭで抽出し、乾燥させることで、淡黄色の油が得られた（３０ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、３８．７％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２０４．０７（Ｍ＋１Ｈ）１＋
ｔｅｒｔ－ブチル（（４－（（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）ピリジン－２－イル）メチル）カルバメートの合成
Figure 2023514275000112
（Ｓ）－１－（Ｌ－アラニル）－４，４－ジフルオロピロリジン－２－カルボニトリル（３０ｍｇ、０，１４７ｍｍｏｌ、１当量）、２－（（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）イソニコチン酸（７４ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＨＡＴＵ（１１２ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ、２当量）を１ｍＬのＤＭＦ中に溶解させ、懸濁液を室温で撹拌した。ＤＩＰＥＡ（１０２μＬ、０．５９０ｍｍｏｌ、４当量）を滴下により添加し、競合までＬＣ／ＭＳを介して反応をチェックした。ＤＭＦを真空下で除去し、粗製物をＤＣＭ中に希釈し、クロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１５分で９９：１から７０：３０）を介して精製することで、黄色の固体が得られた（１５ｍｇ。０．０３４ｍｍｏｌ、１９．７％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４３８．１９（Ｍ＋１Ｈ）１＋
２－（アミノメチル）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）イソニコチンアミドの合成
Figure 2023514275000113
ｔｅｒｔ－ブチル（（４－（（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）ピリジン－２－イル）メチル）カルバメート（１５ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１．０当量）を４００μＬのＤＣＭ中に溶解させ、ＴＦＡ（２００μＬ、体積の２０％）を滴下により添加した。反応物を室温で撹拌し、競合までＬＣ／ＭＳを介してチェックした。粗製物を乾燥させ、水：アセトニトリルの１：１溶液５００μＬ中で凍結乾燥させることで、黄色の粉末が得られた（４ｍｇ、１１．８６μｍｏｌ、３４．８％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ３３８．１４（Ｍ＋１Ｈ）１＋
４－（（（４－（（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）ピリジン－２－イル）メチル）アミノ）－４－オキソブタン酸、コンジュゲート２９の合成
Figure 2023514275000114
２－（アミノメチル）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）イソニコチンアミド（４ｍｇ、１１．８６μｍｏｌ、１．０当量）を５００μＬのＴＨＦ中に溶解させた。ＤＭＡＰ（６ｍｇ、４８μｍｏｌ、４．０当量）および無水コハク酸（３．５ｍｇ、３５．６μｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応物を室温で撹拌し、競合までＬＣ／ＭＳを介してチェックした。逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）を介して粗製物を直接精製し、凍結乾燥させることで、黄色の固体が得られた（１．３ｍｇ、２．９７μｍｏｌ、２５％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４３８．１５（Ｍ＋１Ｈ）１＋
ＥＳＶ６－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、コンジュゲート３０の合成
Figure 2023514275000115
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（２９３μｇ、０．３２μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（３００μＬ）中に溶解させた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（２００μｇ、０．２９μｍｏｌ、０．９当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、オレンジ色の固体が得られた（７０ｎｍｏｌ、２１．９％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １６１９．３９（Ｍ＋１Ｈ）１＋
ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＰＮＵ １５９６８２コンジュゲート３１の合成
Figure 2023514275000116
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ－６（２ｍｇ、２．１７μｍｏｌ、１．２当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（７５０μＬ）中に溶解させた。ＭＡ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＭＡＥ－ＰＮＵ １５９６８２（２．５ｍｇ、１．７５μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（２５０μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（３ｍｇ、７３％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２３４８．８８（Ｍ＋Ｈ）＋
ＱＣＯＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＰＮＵ １５９６８２コンジュゲート３２の合成
Figure 2023514275000117
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＱＣＯＯＨ（１．６ｍｇ、２．１７μｍｏｌ、１．２当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（７５０μＬ）中に溶解させた。ＭＡ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＭＡＥ－ＰＮＵ １５９６８２（２．５ｍｇ、１．７５μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（２５０μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（２．８ｍｇ、７３％）。
実施例１０：化合物１８、１９、２１、Ｐ４、２７、２８、２９、３０の特徴付けおよび生物学的試験
材料および方法
ｈＦＡＰに対するインビトロ阻害アッセイ
Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ基質に対するヒトＦＡＰの酵素活性をマイクロタイタープレートリーダー上にて室温で測定して、３６０ｎｍの励起波長および４６５ｎｍの発光波長で蛍光をモニタリングした。反応混合物は、２０μＭの基質、２０ｎＭのヒトＦＡＰ（一定）、アッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．４）および試験化合物（１０－６から１０－１１Ｍの系列希釈、１：２）を２０μＬの総体積で含有していた。ＩＣ５０値は、基質の添加後に酵素活性を５０％低減するのに必要とされる阻害剤の濃度として定義される。
細胞培養
解凍すると、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰおよびＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ細胞を、ウシ胎児血清（１０％、ＦＢＳ）および抗生物質－抗糸状菌剤（１％、ＡＡ）が補充されたＲＰＭＩ培地において３７℃および５％のＣＯ２で培養保持した。継代するため、９０％コンフルエンスに達した時にトリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％を使用して細胞を剥離し、１：４の希釈度で再播種した。
解凍すると、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰおよびＨＴ－１０８０．ｗｔ細胞を、ウシ胎児血清（１０％、ＦＢＳ）および抗生物質－抗糸状菌剤（１％、ＡＡ）が補充されたＤＭＥＭ培地において３７℃および５％のＣＯ２で培養保持した。継代するため、９０％コンフルエンスに達した時にトリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％を使用して細胞を剥離し、１：４の希釈度で再播種した。
動物研究
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒａｍｔ ｄｅｓ Ｋａｎｔｏｎｓ Ｚｕｒｉｃｈによって与えられたライセンス番号ＺＨ０４／２０１８下でスイス動物福祉法および規制に従って、全ての動物実験を行った。
皮下ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰおよびＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ腫瘍の移植
ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ細胞を８０％コンフルエンスに成長させ、トリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％で剥離した。細胞を５×１０７細胞／ｍＬの最終濃度にＨＢＳＳ培地中に再懸濁した。５×１０６細胞のアリコート（１００μＬの懸濁液）を雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）の側腹部の皮下に注射した。ＳＫ－ＭＥＬ－１８７細胞を８０％コンフルエンスに成長させ、トリプシン－ＥＤＴＡ ０．０５％で剥離した。細胞を１０×１０７細胞／ｍＬの最終濃度にＨＢＳＳ：マトリゲルの１：１混合物中に再懸濁した。５×１０６細胞のアリコート（２００μＬの懸濁液）を雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）の側腹部の皮下に注射した。
ＩＶＩＳ実験
第１の実験において、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ異種移植された腫瘍を、上に記載されている通りに雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）の右側腹部に移植し、０．１ｍＬの平均体積に成長させておいた。ＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ異種移植された腫瘍を、上に記載されている通りに雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）の右側腹部に移植し、０．１ｍＬの平均体積に成長させておいた。
マウスにＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０（１８、１５０ｎｍｏｌ／Ｋｇ、滅菌ＰＢＳ中に調製された３０μＭ溶液として、ｐＨ７．４）を静脈内に注射した。マウスをＣＯ２窒息によって屠殺し（１時間の時間ポイント）、全ての回収された臓器（血液、心臓、筋肉、肺、腎臓、肝臓、脾臓、胃、腸の切片、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ腫瘍およびＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ）の蛍光画像をＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、露出１ｓ、ビニング係数８、７４５ｎｍで励起、８００ｎｍで発光フィルター、ｆ数２、視野１３．１）上で獲得した。
異なる実験において、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７異種移植された腫瘍を、上に記載されている通りに雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）の右側腹部に移植し、０．１ｍＬの平均体積に成長させておいた。ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ異種移植された腫瘍を、上に記載されている通りに雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）の左側腹部に移植し、０．１ｍＬの平均体積に成長させておいた。マウスにＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０（１８、１５０ｎｍｏｌ／Ｋｇ、滅菌ＰＢＳ中で調製された３０μＭ溶液として、ｐＨ７．４）を静脈内に注射した。マウスをＣＯ２窒息によって屠殺し（１時間の時間ポイント）、全ての回収された臓器（血液、心臓、筋肉、肺、腎臓、肝臓、脾臓、胃、腸の切片、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７腫瘍およびＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ）の蛍光画像をＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、露出１ｓ、ビニング係数８、７４５ｎｍで励起、８００ｎｍで発光フィルター、ｆ数２、視野１３．１）上で獲得した。
エクスビボ実験
右側腹部上に皮下ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰまたはＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ腫瘍をおよび左側腹部上にＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ腫瘍を保有するマウスに、コンジュゲート３０（滅菌ＰＢＳ中４０ｎｍｏｌ、ｐＨ７．４）を静脈内に注射した。動物を静脈内注射の１時間後にＣＯ２窒息によって屠殺し、臓器および腫瘍を切除し、ＯＣＴ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてスナップ凍結し、－８０℃で貯蔵した。クリオスタット切片（７μｍ）をカットし、核をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄａｋｏ Ｏｍｎｉｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ）で染色した。Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ ｍｏｔ ｐｌｕｓ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像を得、ＩｍａｇｅＪ １．５３ソフトウェアによって分析した。
治療実験
ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ異種移植された腫瘍を、上に記載されている通りに雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）に移植し、０．１ｍＬの平均体積に成長させておいた。
マウスを各々４匹の８つの治療群に無作為に割り当てた（５つの単一薬剤群、２つの組合せ群およびビヒクル群）。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１、５００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＱＣＯＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（１９、５００ｎｍｏｌ／ｋｇ）をＤＭＳＯ ２％での滅菌ＰＢＳ溶液として注射した。Ｌ１９－ＩＬ２を適切な製剤緩衝液中に３３０μｇ／ｍＬで希釈し、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。
単一薬剤群におけるマウスは、ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ、ＱＣＯＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥまたはＬ１９－ＩＬ２の注射を毎日受けた。
組合せ群におけるマウスは、腫瘍移植後８日目、１０日目および１２日目にＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥの注射を、ならびに腫瘍移植後９日目、１１日目および１３日目にＬ１９－ＩＬ２の注射を受けた。
腫瘍を電子ノギスで測定し、動物を毎日秤量した。腫瘍体積（ｍｍ３）を式（長手側、ｍｍ）×（短手側、ｍｍ）×（短手側、ｍｍ）×０．５で算出した。
Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）をデータ分析（通常の二方向ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ試験）のために使用した。
体内分布実験
ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ（右側腹部）およびＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ（左側腹部）異種移植された腫瘍を、上に記載されている通りに雌性胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）に移植し、０．１ｍＬの平均体積に成長させておいた。
マウスにＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１、２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を注射し、静脈内注射の６時間後にＣＯ２窒息によって屠殺し、臓器および腫瘍を切除し、－８０℃で保存した。凍結された臓器をメス（５０ｍｇ）でカットし、６００μＬの９５：５のアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ）中に懸濁させた。３：９７のアセトニトリル／水（０．１％ＦＡ；内部標準、５０μＬ、５０ｎＭ）中のＤ８－ＭＭＡＥの溶液を添加した。試料をＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、３０Ｈｚ振盪、１５分）で機械的に溶解した。血漿試料（５０μＬ）を３：９７のアセトニトリル／水（０．１％ＦＡ；内部標準、５０μＬ、５０ｎＭ）中のＤ８－ＭＭＡＥの溶液とともに添加し、タンパク質を６００μＬの９５：５のアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ）の添加によって沈殿させた。臓器および血漿試料の両方からのタンパク質を遠心分離によってペレット化し、上清を真空遠心機で乾燥させた。固体残留物を１ｍＬの３：９７のアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ）中に再懸濁し、ＨＢＬ Ｏａｓｉｓカラム上での第１の精製ステップおよびＣ１８ Ｍａｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ上での第２の精製を介して溶液を清浄した。精製され乾燥させた溶出物を１５０μＬの３：９７のアセトニトリル／水（０．１％ＦＡ）中に再懸濁し、ＭＳによって分析した。ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００とフィットさせたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（両方ともＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する液体クロマトグラフィー－タンデム質量分光分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって、全ての試料を分析した。Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８、５０μｍ×１５０ｍｍ、２μｍ分析カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて０．３μＬ／分の流量で６０分かけて３％から５０％のＡＣＮから直線勾配を実行することによって、分析物を分解した。全ての緩衝液は、０．１％ギ酸を含有していた。７００００の分解能および１００ｍｓの最大注入時間を用いるＳＩＭスキャンモードにおいて、ＭＳスペクトルを記録した。ＭＳ／ＭＳを３５０００の分解能および２５０ｍｓの最大注入時間で記録した。４つのＳＩＭウィンドウを、それぞれＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ、１１１９．０４３５ｍ／ｚおよび７４６．３６４８ｍ／ｚの二重および三重荷電イオンの中央に置いた。
生ファイルを次いでＳｋｙｌｉｎｅソフトウェアで分析した。２つのイオンのＭＳ１面積を定量化のために使用した。
マウス血清安定性
コンジュゲート２７（１００μＬ、２００μＭ）の標識化用溶液を１００μＬのマウス血清中にスパイクし、室温でインキュベートした。添加の直後ならびに１０分後、１時間後、３時間後および６時間後に、１００μＬのメタノールを添加することによってタンパク質を沈殿させ、試料を１６３００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収し、分析ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）でチェックし、ＬＣ／ＭＳを介してピークの同一性を判定した。
結果
図１６は、静脈内投与（１５０ｎｍｏｌ／Ｋｇの用量）後の、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７（右側腹部）およびＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ（左側腹部）異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの近赤外蛍光画像化におけるＩＲＤｙｅ ７５０コンジュゲート１８の標的化性能の評価の結果を示す：（Ａ）注射の前および静脈内注射の３０分後の生きた動物の画像；（Ｂ）１時間でのエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物ＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０（１８）は、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰおよびＳＫ－ＭＥＬ－１８７腫瘍の両方に蓄積し、ＳＫ－ＭＥＬ－１８７と比較して、より高いＦＡＰ発現によりＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腫瘍におけるより高い蓄積を表示している。
図１７は、異なる小有機リガンドの存在下でのｈＦＡＰ阻害実験を示す。コンジュゲート２８は、実施例２、Ｐ４と比較して、より低いＦＡＰ阻害特性を呈する。シアノピロリジンヘッドピースとピリジン環との間のＬ－アラニン構成単位を含めて、コンジュゲート２９は、アッセイにおいて試験された濃度でＦＡＰタンパク分解活性を阻害しない。
図１８は、静脈内投与（１５０ｎｍｏｌ／Ｋｇの用量）後の、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰおよびＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの近赤外蛍光画像化におけるＩＲＤｙｅ ７５０コンジュゲート１８の標的化性能の評価の結果を示す。１時間でのエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物ＥＳＶ６－ＩＲＤｙｅ７５０（１８）は、ＦＡＰ発現を表示するＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ腫瘍に選択的に蓄積し、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔにおいては蓄積しない。
図１９は、静脈内投与（４０ｎｍｏｌ）後の、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ（右側腹部）およびＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ（左側腹部）異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるコンジュゲート３０の標的化性能の評価の結果を示す。投与の１時間後のエクスビボ臓器画像が表示されている。化合物は、優れた腫瘍対臓器選択性で、静脈内注射の１時間後にＦＡＰ発現を表示する腫瘍でインビボにて急速に、均質におよび選択的に局所化する。（Ｂ）は、ＥＳＶ６－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（３０）の構造を示す。
図２０は、静脈内投与（４０ｎｍｏｌ）後の、ＨＴ－１０８０．ｈＦＡＰ（右側腹部）およびＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔ（左側腹部）異種移植片を保有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるコンジュゲート３０の標的化性能の評価の結果を示す。投与の１時間後のエクスビボ臓器画像が表示されている（Ａ）。化合物は、優れた腫瘍対臓器選択性で、静脈内注射の１時間後にＦＡＰ発現を表示する腫瘍でインビボにて急速に、均質におよび選択的に局在化する。（Ｂ）は、ＥＳＶ６－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（３０）の構造を示す。
図２１は、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腫瘍保有マウスにおけるＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）およびＱＣＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（１９）の治療的活性の判定の結果を示す（Ａ）。データポイントは、平均腫瘍体積±ＳＥＭ（１群当たりｎ＝４）を表す。化合物を８日目から出発して連続した６日間、静脈内に投与した（尾静脈注射）。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）、高親和性ＦＡＰリガンド「ＥＳＶ６」の薬物コンジュゲート誘導体は、ＱＣＯＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（１９）、分子の標的化されていないバージョンと比較した場合に、より強力な抗腫瘍効果を呈する。（Ｂ）は、実験中動物の体重における変化（％）の評価によって判定される場合の異なる処置の耐容性を示す。（Ｃ）ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）およびＱＣＯＯＨ－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（１９）の構造。
図２２は、ＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰ腫瘍保有マウスにおけるＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）、Ｌ１９－ＩＬ２およびそれらの組合せの治療的活性の判定の結果を示す（Ａ）。データポイントは、平均腫瘍体積±ＳＥＭ（１群当たりｎ＝４）を表す。ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥを８日目、１０日目、１２日目に静脈内に投与した（尾静脈注射）。Ｌ１９－ＩＬ２を９日目、１１日目、１３日目に静脈内に投与した（尾静脈注射）。Ｌ１９－ＩＬ２と組み合わされたＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥは、Ｌ１９－２単独と比較した場合に、非常に強力な抗腫瘍効果（４／４完全な腫瘍退縮）を呈する。（Ｂ）は、実験中の動物の体重における変化（％）の評価によって判定される場合の異なる処置の耐容性を示す。
図２３は、右側腹部上にＳＫ－ＲＣ－５２．ｈＦＡＰおよび左側腹部上にＳＫ－ＲＣ－５２．ｗｔを保有するＢＡＬＢ／Ｃ／ｎｕ－／ｎｕマウスにおける小分子－薬物コンジュゲートＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ（２１）の定量的体内分布実験の結果を示す。化合物は、ＦＡＰ陽性のＳＫ－ＲＣ－５２腫瘍中に選択的に蓄積する、（即ち、静脈内投与の６時間後、腫瘍部位で１８％ＩＤ／ｇ）。対照的に、ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥは、ＦＡＰ陰性ＳＫ－ＲＣ－５２野生型腫瘍中に蓄積しない。健康な臓器におけるコンジュゲートの取り込みは（１％ＩＤ／ｇよりも低い）。
図２４は、マウス血清におけるコンジュゲート２７（これは、６９Ｇａペイロードを含む）の安定性研究の結果を示す。時間０でのおよびインキュベーションの６時間後の処理済み試料のＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳプロファイルは、正しい質量で単一ピークを示す（予想質量：１０２８．３０。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ５１４．３（Ｍ＋２Ｈ））。
実施例１１：さらなるコンジュゲートの合成
コンジュゲート３９の合成
Figure 2023514275000118
（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（１５ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＳＯ（４００μＬ）中に溶解させる。ジシクロヘキシルカルボジイミド（９ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、１．３当量）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（４．５ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加し、反応物を終夜室温で撹拌し、光から保護する。２，２’－（７－（４－（（２－アミノエチル）アミノ）－１－カルボキシ－４－オキソブチル）－１，４，７－トリアゾナン－１，４－ジイル）二酢酸（１６．２ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、１．２当量）を含有する１００μＬのＰＢＳ溶液を添加し、反応物を２時間の間撹拌する。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ８５８．３５（Ｍ＋Ｈ）＋
コンジュゲート４０の合成
Figure 2023514275000119
酢酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４）中のコンジュゲート３９（１ｍＬ、１５０μＭ）の溶液を、新に調製された（Ａｌ１８Ｆ）２＋溶液（文献、Ｃｌｅｅｒｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．２０１６において前に記載されている通りに得られた）を含有する別々のバイアルに添加する。密閉したバイアルを９５℃の温度で１２分間加熱する。複合体のための形成を放射ＨＰＬＣおよび放射ＴＬＣ分析によって確認する。
コンジュゲート４１の合成
Figure 2023514275000120
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（２ｍｇ、２．１７１μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８００μＬ）中に溶解させる。マレイミド－ＮＯＴＡ（３．０ｍｇ、４．３４３μｍｏｌ、２．０当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、黄色の固体が得られる。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １３４５．４８（Ｍ＋１Ｈ）１＋。
コンジュゲート４３ａの合成
Figure 2023514275000121
Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂上の市販で利用可能な予備負荷Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ＮｅＢｏｃ）（３００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、ＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）をＤＭＦ（３×５分×５ｍＬ）中で膨張させ、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去し（１×１分×５ｍＬおよび２×１０分×５ｍＬ）、樹脂をＤＭＦで洗浄する（６×１分×５ｍＬ）。ペプチドをＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨおよび（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸で、示されている順序にて伸長させる。この目的のため、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（２．０当量）、ＨＢＴＵ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（４．０当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解させる。混合物を１０分間０℃で静置しておき、次いで、穏やかにかき混ぜながら１時間の間樹脂と反応させる。ＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）後、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去する（１×１分×５分および２×１０分×５ｍＬ）。脱保護ステップの後に、ＤＭＦを用いる洗浄ステップ（６×１分×５ｍＬ）が続き、その後に次のアミノ酸とのカップリングが続く。ペプチドをＤＣＭ中の２０％ＴＦＡの混合物にて室温で１時間の間樹脂から切断する。溶媒を減圧下で除去し、粗製物を冷たいジエチルエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、水／ＡＣＮ中に溶解させ、ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、１５分で９．５：０．５から５：５）を介して精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。化合物を、２，３，５，６－テトラフルオロフェニル６－（トリメチル－λ４－アザニル）ニコチネート（２．０当量）と乾燥アセトニトリル（２ｍＬ）中で終夜反応させる。粗製化合物を［１８Ｆ］ＴＢＡＦ（２．０当量）、ＴＢＡＨＣＯ３（２．０当量）とｔＢｕＯＨ：ＭｅＯＨ（５：２）の混合物中にて５０℃で１０分間反応させることで、最終化合物が得られる。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ９６７．３３（Ｍ＋１Ｈ）１＋
樹脂上のＣｙｓ（ＳＴｒｔ）－Ｃｙｓ（ＳＴｒｔ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＮＨＦｍｏｃの合成
Figure 2023514275000122
Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂上の市販で利用可能な予備負荷Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（５００ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ、ＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）をＤＭＦ中で膨張させ（３×５分×５ｍＬ）、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去し（１×１分×５ｍＬおよび２×１０分×５ｍＬ）、樹脂をＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）。ペプチドをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨで、示されている順序にて伸長させた。この目的のため、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（２．０当量）、ＨＢＴＵ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（４．０当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解させた。混合物を１０分間０℃で静置しておき、次いで、穏やかにかき混ぜながら１時間の間樹脂と反応させた。ＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）後、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去した（１×１分×５分および２×１０分×５ｍＬ）。脱保護ステップの後に、ＤＭＦを用いる洗浄ステップ（６×１分×５ｍＬ）が続き、その後に次のアミノ酸とのカップリングが続いた。
（２Ｒ，５Ｒ，８Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ）－１１－（４－アミノブチル）－８－（カルボキシメチル）－１４－（４－（（４－（（２－（（Ｓ）－２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタンアミド）－２，５－ビス（メルカプトメチル）－４，７，１０，１３－テトラオキソ－３，６，９，１２－テトラアザヘキサデカン二酸（ＳＨ－Ｃｙｓ－ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６、Ｐ７）の合成
Figure 2023514275000123
樹脂上のＣｙｓ（ＳＴｒｔ）－Ｃｙｓ（ＳＴｒｔ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＮＨＦｍｏｃ（８０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中で膨張させた（３×５分×５ｍＬ）。ペプチドを（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（３７ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、２当量）、ＨＡＴＵ（３０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（２８μＬ、０．１６ｍｍｏｌ、４．０当量）で伸長させ、穏やかにかき混ぜながら１時間の間反応させておいた。ＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）後、樹脂をＤＣＭ中のＴＦＡ（１５％）、ＴＩＳ（２．５％）およびＨ２Ｏ（２．５％）の混合物と４時間の間室温でかき混ぜることによって化合物を切断した。樹脂をメタノール（２×５ｍＬ）で洗浄し、合わせた切断溶液および洗浄溶液を真空下で濃縮した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（８ｍｇ、０．９５μｍｏｌ、２．４％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １０２４．２８（Ｍ＋Ｈ）＋
ＥＳＶ６－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ－ｂｉｓ（４４）の合成
Figure 2023514275000124
ＳＨ－Ｃｙｓ－ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（Ｐ７、１．２ｍｇ、１．１７５μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させる。ＭＣ－ＶａｌＣｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（４．６ｍｇ、３．５２５μｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ３６５６．９（Ｍ＋Ｈ）＋
ＥＳＶ６＿２－ＶａｌＣｉｔ－ＭＭＡＥ－ｂｉｓ（４５）の合成
Figure 2023514275000125
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（Ｐ７、１ｍｇ、１．０９μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させる。ＭＣ－ＶａｌＣｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１．４ｍｇ、１．０９μｍｏｌ、１．０当量）およびＯＳｕ－Ｇｌｕ－ＶａｌＣｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１．４ｍｇ、１．０９μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ３４５６．８（Ｍ＋Ｈ）＋
（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－８－（へキサ－５－インアミド）キノリン－４－カルボキシアミド（Ｐ８）の合成
Figure 2023514275000126
５－ヘキシン酸（９４ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ、１．５当量）を２５ｍＬ丸底フラスコにおいて１．５ｍＬのＤＣＭおよび２０μＬのＤＭＦ中に溶解させた。混合物を０℃で冷却し、塩化オキサリル（１０７ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下により添加した。氷浴を除去し、反応物を１５分間撹拌した。混合物を次いで、ＤＭＦ中の実施例２－Ｐ４の冷却溶液に添加した。３０分後、粗製物をＮａＨＣＯ３水溶液で希釈し、ＤＣＭで抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。クロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１０分で１００：０から９０：１０）を介して粗製物を精製することで、黄色の油が得られた（７８ｍｇ。０．２６７ｍｍｏｌ、３４％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４５４．１６（Ｍ＋１Ｈ）１＋
（Ｓ）－８－（４－（１－（５－（（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）－５－オキソペンチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）ブタンアミド）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）キノリン－４－カルボキシアミド（Ｐ９）の合成
Figure 2023514275000127
Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂上の市販で利用可能な予備負荷アミノ－ＰＥＧ２（３００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）をＤＭＦ中で膨張させた（３×５分×５ｍＬ）。樹脂をＤＭＦ（５ｍＬ）中の５アジド吉草酸（２．０当量）、ＨＢＴＵ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（４．０当量）で伸長させた。混合物を１０分間０℃で静置しておき、次いで、穏やかにかき混ぜながら１時間の間樹脂と反応させた。（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－８－（へキサ－５－インアミド）キノリン－４－カルボキシアミド（７８ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、０．８６当量）、ＣｕＩ（４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、０．１当量）およびＴＢＴＡ（３４ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、０．３当量）を５ｍＬの混合物１：１のＤＭＦ／ＴＨＦ中に溶解させた。
ペプチドをＤＣＭ中の２０％ＴＦＡの混合物にて室温で１時間の間樹脂から切断した。溶媒を減圧下で除去し、粗製物を冷たいジエチルエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、水／ＡＣＮ中に溶解させ、ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、１５分で９．５：０．５から５：５）を介して精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（３０ｍｇ、２１％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ７２７．８（Ｍ＋Ｈ）＋
コンジュゲート４６の合成
Figure 2023514275000128
（Ｓ）－８－（４－（１－（５－（（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）－５－オキソペンチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）ブタンアミド）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）キノリン－４－カルボキシアミド（１ｍｇ、１．４μｍｏｌ、１．０当量）をＴＨＦ（２００μＬ）中に溶解させ、乾燥ＤＩＰＥＡ（４００μｇ、３．３μｍｏｌ、２．４当量）を滴下により添加した。ＦＩＴＣ異性体Ｉ（０．８ｍｇ、２．１μｍｏｌ、１．５当量）をＤＭＳＯ溶液として２０μＬ中１ｍｇの濃度で添加した。反応物を３時間の間撹拌し、光から保護し、粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって直接精製し、凍結乾燥させることで、黄色の粉末が得られた（１．１ｍｇ、７０．４％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １１１６．４（Ｍ＋Ｈ）＋
（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－８－（へキサ－５－インアミド）キノリン－４－カルボキシアミド（Ｐ１０）の合成
Figure 2023514275000129
（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１当量）、プロパルギルアミン（７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＨＡＴＵ（４９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１．２当量）を、２ｍＬのＤＣＭおよび１００μＬのＤＭＦの中に溶解させた。ＤＩＰＥＡ（５６ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、４当量）を滴下により添加し、反応物を３０分間室温で撹拌した。水を添加し、有機層から分離し、次いで、ＤＣＭで３回抽出した。粗製物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。クロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１０分で１００：０から９５：５）を介して粗製物を精製することで、ダーク油が得られた（３２ｍｇ。０．０６３８ｍｍｏｌ、５８％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４９５．４７（Ｍ＋１Ｈ）１＋
Ｂｉ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１１）の合成
Figure 2023514275000130
Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂上の市販で利用可能な予備負荷Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（３００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、ＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）をＤＭＦ中で膨張させ（３×５分×５ｍＬ）、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去し（１×１分×５ｍＬおよび２×１０分×５ｍＬ）、樹脂をＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）。ペプチドをＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｎ３－Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨおよび（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸で、示されている順序にて伸長させた。この目的のため、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（２．０当量）、ＨＢＴＵ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（４．０当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解させた。混合物を１０分間０℃で静置しておき、次いで、穏やかにかき混ぜながら１時間の間樹脂と反応させた。ＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）後、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去した（１×１分×５分および２×１０分×５ｍＬ）。脱保護ステップの後に、ＤＭＦを用いる洗浄ステップ（６×１分×５ｍＬ）が続き、その後に次のアミノ酸とのカップリングが続いた。（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－８－（へキサ－５－インアミド）キノリン－４－カルボキシアミド（１７４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、２当量）、ＣｕＩ（４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、０．１当量）およびＴＢＴＡ（２８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、０．３当量）を、５ｍＬの混合物１：１のＤＭＦ／ＴＨＦ中に溶解させた。ペプチドをＤＣＭ中の２０％ＴＦＡの混合物にて室温で１時間の間樹脂から切断した。溶媒を減圧下で除去し、粗製物を冷たいジエチルエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、水／ＡＣＮ中に溶解させ、ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、１５分で９．５：０．５から５：５）を介して精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（１８ｍｇ、６％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １６８７．７（Ｍ＋Ｈ）＋
コンジュゲート４７の合成
Figure 2023514275000131
Ｂｉ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１１、１ｍｇ、０．５９μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させる。マレイミド－フルオレセイン（０．７６ｍｇ、１．７７μｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、黄色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２１１４．７（Ｍ＋Ｈ）＋
コンジュゲート４８の合成
Figure 2023514275000132
Ｂｉ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１１、１ｍｇ、０．５９μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（３００μＬ）中に溶解させる。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（２００μｇ、０．２９μｍｏｌ、０．５当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、オレンジ色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２３８５．８（Ｍ＋１Ｈ）１＋
コンジュゲート４９の合成
Figure 2023514275000133
Ｂｉ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１１、１ｍｇ、０．５９μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させる。ＭＣ－ＶａｌＣｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１ｍｇ、０．７６μｍｏｌ、１．３当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ３００３．５（Ｍ＋Ｈ）＋
コンジュゲート５０の合成
Figure 2023514275000134
Ｂｉ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１１、１ｍｇ、０．５９μｍｏｌ、３．３当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（３００μＬ）中に溶解させる。ＩＲＤｙｅ７５０（２００μｇ、０．１７４μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、オレンジ色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２８３８．０（Ｍ＋１Ｈ）１＋
コンジュゲート５１の合成
Figure 2023514275000135
Ｂｉ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１１、１ｍｇ、０．５９μｍｏｌ、１当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（３００μＬ）中に溶解させる。マレイミド－ＤＯＴＡ（４６５μｇ、０．５９μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、オレンジ色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２２１３．９（Ｍ＋１Ｈ）１＋
ＡｌｂｕＴａｇ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１２）の合成
Figure 2023514275000136
Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂上の市販で利用可能な予備負荷Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（３００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、ＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）をＤＭＦ中で膨張させ（３×５分×５ｍＬ）、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去し（１×１分×５ｍＬおよび２×１０分×５ｍＬ）、樹脂をＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）。ペプチドをＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｎ３－Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ－ａ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨおよび４－（４－ヨードフェニル）ブタン酸で、示されている順序にて伸長させた。この目的のため、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（２．０当量）、ＨＢＴＵ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（４．０当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解させた。混合物を１０分間０℃で静置しておき、次いで、穏やかにかき混ぜながら１時間の間樹脂と反応させた。ＤＭＦで洗浄した（６×１分×５ｍＬ）後、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去した（１×１分×５分および２×１０分×５ｍＬ）。脱保護ステップの後に、ＤＭＦを用いる洗浄ステップ（６×１分×５ｍＬ）が続き、その後に次のアミノ酸とのカップリングが続いた。（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－８－（へキサ－５－インアミド）キノリン－４－カルボキシアミド
（１７４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、２当量）、ＣｕＩ（４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、０．１当量）およびＴＢＴＡ（２８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、０．３当量）を５ｍＬの混合物１：１のＤＭＦ／ＴＨＦ中に溶解させた。ペプチドをＤＣＭ中の２０％ＴＦＡの混合物にて室温で１時間の間樹脂から切断した。溶媒を減圧下で除去し、粗製物を冷たいジエチルエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、水／ＡＣＮ中に溶解させ、ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、１５分で９．５：０．５から５：５）を介して精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られた（６ｍｇ、２％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １６４６．６（Ｍ＋Ｈ）＋
コンジュゲート５２の合成
Figure 2023514275000137
ＡｌｂｕＴａｇ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１２、１ｍｇ、０．６１μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させる。マレイミド－フルオレセイン（０．７８ｍｇ、１．８２μｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、黄色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２０７３．６（Ｍ＋Ｈ）＋
コンジュゲート５３の合成
Figure 2023514275000138
ＡｌｂｕＴａｇ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１２、１ｍｇ、０．６１μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（３００μＬ）中に溶解させた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（４００μｇ、０．５８μｍｏｌ、０．９５当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、オレンジ色の固体が得られた（１８０ｎｍｏｌ、３０％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２３４５．７（Ｍ＋１Ｈ）１＋
コンジュゲート５４の合成
Figure 2023514275000139
ＡｌｂｕＴａｇ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１２、１ｍｇ、０．６１μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させる。ＭＣ－ＶａｌＣｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１ｍｇ、０．７６μｍｏｌ、１．２５当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２９６３．８（Ｍ＋Ｈ）＋
コンジュゲート５５の合成
Figure 2023514275000140
ＡｌｂｕＴａｇ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１２、１ｍｇ、０．６１μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（３００μＬ）中に溶解させた。ＩＲＤｙｅ７５０（４００μｇ、０．３８４μｍｏｌ、０．５８当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌した。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、オレンジ色の固体が得られた（５５ｎｍｏｌ、９％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２７９７．９（Ｍ＋１Ｈ）１＋
コンジュゲート５６の合成
Figure 2023514275000141
ＡｌｂｕＴａｇ－ＥＳＶ６－ペプチド（Ｐ１２、１ｍｇ、０．６１μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（３００μＬ）中に溶解させる。マレイミド－ＤＯＴＡ（４８０μｇ、０．６１μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、オレンジ色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２１７２．７（Ｍ＋１Ｈ）１＋
Ｂｉ－ＥＳＶ６（Ｐ１３）の合成
Figure 2023514275000142
市販で利用可能な２－クロロ－トリチル塩化物樹脂（３００ｍｇ）をＤＭＦ中で膨張させる（３×５分×５ｍＬ）。樹脂をＤＭＦ（５ｍＬ）中のＮＨＦｍｏｃ－アジド－リジン（１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１．０当量）、ＨＯＢｔ（１．０当量）およびＤＩＰＥＡ（２．０当量）で伸長させる。混合物を１０分間０℃で静置しておき、次いで、穏やかにかき混ぜながら１時間の間樹脂と反応させる。樹脂を次いでメタノールで洗浄する。樹脂をＤＭＦ（５ｍＬ）中の（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．０当量）およびＤＩＰＥＡ（２．０当量）で伸長させる。（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）－８－（へキサ－５－インアミド）キノリン－４－カルボキシアミド（７８ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、０．８６当量）、ＣｕＩ（４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、０．１当量）およびＴＢＴＡ（３４ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、０．３当量）を５ｍＬの混合物１：１のＤＭＦ／ＴＨＦ中に溶解させる。ペプチドをＤＣＭ中の５０％ＨＦＩＰの混合物にて室温で１時間の間樹脂から切断する。溶媒を減圧下で除去し、粗製物を冷たいジエチルエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、水／ＡＣＮ中に溶解させ、ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、１５分で９．５：０．５から５：５）を介して精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １１１１．１（Ｍ＋Ｈ）＋
ＤＯＴＡ－ＧＡ－Ｂｉ－ＥＳＶ６（５７）の合成
Figure 2023514275000143
Ｂｉ－ＥＳＶ６（Ｐ１３、４５ｍｇ、４０．５μｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＳＯ（４００μＬ）中に溶解させる。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０．９ｍｇ、５２．７μｍｏｌ、１．３当量）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１４ｍｇ、１２２μｍｏｌ、３当量）を添加し、反応物を終夜室温で撹拌し、光から保護する。
２，２’，２”－（１０－（４－（（２－アミノエチル）アミノ）－１－カルボキシ－４－オキソブチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸（２５ｍｇ、４８．６μｍｏｌ、１．２当量）を含有する１００μＬのＰＢＳ溶液を添加し、反応物を２時間の間撹拌した。
粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １６２４．８（Ｍ＋Ｈ）＋
ＭＣ－アミノ酸（ＯｔＢｕ）の合成のための一般的手順
Figure 2023514275000144
上記一般的手順は、例えばＡＡ＝グリシンについて下に記載されている通りに行うことができる。
６－マレイミドヘキサン酸（１．０当量）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ／ｍｍｏｌ）中にアルゴン雰囲気下で溶解させ、溶液を０℃に冷却した。ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．１当量）、ＤＩＰＥＡ（２．３当量）および所望のＨ－ＡＡ－ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（１．１当量）を引き続いて添加する。完了まで、反応物を室温で撹拌する。混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、ＫＨＳＯ４水溶液１Ｍ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液およびブラインで洗浄する。有機相を乾燥し、濃縮することで、所望の生成物が白色の粉末として得られる。
ＭＣ－アミノ酸の合成のための一般的手順
Figure 2023514275000145
上記一般的手順は、例えばＡＡ＝グリシンに対応するＲについて下に記載されている通りに行うことができる。
所望のＭＣ－アミノ酸－ＯｔＢｕ（１．０当量）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（０，３ｍＬ／ｍｍｏｌ）中にアルゴン雰囲気下で溶解させる。ＴＦＡ（２２．０当量）を添加し、混合物を室温で２時間の間撹拌する。溶液を濃縮し、ヘキサンで沈殿させて、生成物を白色の粉末として得る。
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２Ｓ）－２－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）カルバモイル）－１λ４－ピロリジン－１－カルボキシレートの合成
Figure 2023514275000146
Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ（３１２ｍｇ；０．９２ｍｍｏｌ；１．０当量）およびＨＡＴＵ（３９３ｍｇ；１．０１ｍｍｏｌ；１．１当量）を乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）中にアルゴン雰囲気下で溶解させ、溶液を０℃に冷却した。ＤＩＰＥＡ（５０５μＬ；２．７６ｍｍｏｌ；３．０当量）を滴下により添加し、混合物を同じ温度で１５分間撹拌した。４－アミノベンジルアルコール（２２６ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ、２当量）を乾燥ＤＭＦ中の溶液として添加した。混合物を終夜室温で撹拌した。反応混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、１Ｍ ＫＨＳＯ４水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄した。プールされた有機相を乾燥させ、真空下で濃縮した。クロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１０分で９９：１から９５：５）を介して粗製物を精製することで、生成物が白色の粉末として得られた（２７４ｍｇ；０．６６ｍｍｏｌ；６６％の収率）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ４４３．１９（Ｍ＋１Ｈ）１＋
（Ｓ）－Ｎ－（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）ピロリジン－２－カルボキシアミドの合成
Figure 2023514275000147
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２Ｓ）－２－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）カルバモイル）－１λ４－ピロリジン－１－カルボキシレート（２７４ｍｇ；０．６６ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３０ｍＬ）中にアルゴン雰囲気下で溶解させ、０℃に冷却する。ピペリジン（３２５μＬ；３．２９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１時間の間撹拌する。溶液を高真空下で濃縮し、ＡｃＯＥｔ（１００ｍＬ）中に溶解させ、ＮａＨＣＯ３水溶液およびブラインで洗浄する。有機相を乾燥し、真空下で濃縮する。クロマトグラフィー（０．５％ＴＥＡとともに９９：１から９０：１０のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）を介して粗材料を精製することで、生成物が茶色の油として得られる。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ２２１．１２（Ｍ＋１Ｈ）１＋
ＭＣ－ＡＡ－Ｐｒｏ－ＰＡＢの合成のための一般的手順
Figure 2023514275000148
所望のＭＣ－アミノ酸（１．１当量）を乾燥ＤＭＦ（０．５ｍＬ／ｍｍｏｌ）中にアルゴン雰囲気下で溶解させ、溶液を０℃に冷却する。ＨＡＴＵ（１．１当量）、（Ｓ）－Ｎ－（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）ピロリジン－２－カルボキシアミド（１．０当量）およびＤＩＰＥＡ（１．５当量）を引き続いて添加する。反応物をゆっくり室温に達するままにし、終夜撹拌する。混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、１Ｍ ＫＨＳＯ４およびブラインで洗浄する。有機相を乾燥し、真空下で濃縮し、クロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９３：７）を介して粗製物を精製することで、所望のＭＣ－ＡＡ－Ｐｒｏ－ＰＡＢが得られる。
ＭＣ－ＡＡ－Ｐｒｏ－ＰＡＢ－ＰＮＰの合成のための一般的手順
Figure 2023514275000149
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ／ｍｍｏｌ）中の４－ニトロフェニルクロロホルメート（２．２当量）の溶液を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ／ｍｍｏｌ）およびピリジン（１．５当量）中の所望のＭＣ－ＡＡ－Ｐｒｏ－ＰＡＢ（１．０当量）の懸濁液に、アルゴン雰囲気下で添加する。完了後、溶媒を真空下で除去し、ＡｃＯＥｔで溶出するシリカのパッド上で粗製混合物を濾過することで、ＭＣ－ＡＡ－Ｐｒｏ－ＰＡＢ－ＰＮＰが得られる。
ＭＣ－ＡＡ－Ｐｒｏ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥの合成のための一般的手順
Figure 2023514275000150
モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ・ＴＦＡ １．１当量）を乾燥ＤＭＦ（２００μＬ）中に窒素雰囲気下で溶解させる。ＭＣ－ＡＡ－Ｐｒｏ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（１．０当量）、ＨＯＡｔ（０．５当量）およびＤＩＰＥＡ（５．０当量）を引き続いて添加する。混合物を室温で４８時間の間撹拌し、真空下で濃縮する。粗製物を２００μｌの混合物１：１の水／メタノールで希釈し、逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）上で精製することで、所望の生成物が白色の固体として得られる。
ＥＳＶ６－ＡＡ－Ｐｒｏ－ＭＭＡＥ（５８）の合成のための一般的手順
Figure 2023514275000151
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（Ｐ７、７００μｇ、０．７６０μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させる。ＭＣ－ＡＡ－Ｐｒｏ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。
誘導体の使用されたＡＡ、ｍ／ｚおよび収量は、下記の表にリストされている。
Figure 2023514275000152
Ｐｙ－Ｓ－Ｓ－ＭＭＡＥの合成のための一般的手順
Figure 2023514275000153
モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ・ＴＦＡ １．１当量）を乾燥ＤＭＦ（２００μＬ）中に窒素雰囲気下で溶解させる。様々に置換されている４－ニトロフェニル（２－（ピリジン－２－イルジスルファニル）エチル）カーボネート（１．０当量）、ＨＯＡｔ（０．５当量）およびＤＩＰＥＡ（５．０当量）を引き続いて添加する。混合物を室温で４８時間の間撹拌し、真空下で濃縮する。粗製物を２００μｌの混合物１：１の水／メタノールで希釈し、逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）上で精製することで、所望の生成物が白色の固体として得られる。
ＥＳＶ６－Ｓ－Ｓ－ＭＭＡＥ（５９）の合成のための一般的手順
Figure 2023514275000154
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（Ｐ７、７００μｇ、０．７６０μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させる。所望のＰｙ－Ｓ－Ｓ－ＭＭＡＥ（１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。
誘導体の使用されたＲ基、ｍ／ｚおよび収量は、下記の表にリストされている。
Figure 2023514275000155
ＰｅｎＣｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６ペプチド（Ｐ１４）の合成
Figure 2023514275000156
市販で利用可能な２－クロロ－トリチル塩化物樹脂（３００ｍｇ）をＤＭＦ中で膨張させる（３×５分×５ｍＬ）。樹脂をＦｍｏｃ－ＰｅｎＣｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ＮＨＢｏｃ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨで、示されている順序にて伸長させる。この目的のため、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（２．０当量）、ＨＢＴＵ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（４．０当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解させる。樹脂をＤＭＦ（５ｍＬ）中の（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２．０当量）およびＤＩＰＥＡ（２．０当量）で伸長させる。ペプチドをＤＣＭ中の５０％ＨＦＩＰの混合物にて室温で１時間の間樹脂から切断する。溶媒を減圧下で除去し、粗製物を冷たいジエチルエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、水／ＡＣＮ中に溶解させ、ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、１５分で９．５：０．５から５：５）を介して精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ９４９．３（Ｍ＋Ｈ）＋
ＰｅｎＥＳＶ６－Ｓ－Ｓ－ＭＭＡＥ（６０）の合成のための一般的手順
Figure 2023514275000157
ＰｅｎＣｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（７００μｇ、０．７６０μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８４０μＬ）中に溶解させる。所望のＰｙ－Ｓ－Ｓ－ＭＭＡＥ（１．０当量）を乾燥ＤＭＦ溶液（１６０μＬ）として添加した。反応物を３時間の間撹拌する。
粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、白色の固体が得られる。
誘導体の使用されるＲ基およびｍ／ｚは、下記の表にリストされている。
Figure 2023514275000158
（Ｓ）－Ｎ１－（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）－Ｎ４－（２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）スクシンイミド（Ｐ１５）の合成
Figure 2023514275000159
（Ｓ）－４－（（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）アミノ）－４－オキソブタン酸（６５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）、ＨＡＴＵ（５４ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）および１－（２－アミノエチル）マレイミドＨＣｌ（２５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）を、１．５ｍＬのＤＣＭおよび５００μＬのＤＭＦの中に溶解させた。ＤＩＰＥＡ（５４ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、３当量）を滴下により添加し、反応物を３０分間室温で撹拌した。水を添加し、有機層から分離し、次いで、ＤＣＭで３回抽出した。粗製物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。クロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１０分で１００：０から９５：５）を介して粗製物を精製することで、黄色の油が得られた（５０ｍｇ。０．０８６８ｍｍｏｌ、６２％）。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ ５８２．６（Ｍ＋１Ｈ）１＋
コンジュゲート６６の合成
Figure 2023514275000160
ＳＨ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－ＥＳＶ６（２ｍｇ、２．１７１μｍｏｌ、１．０当量）をＰＢＳ ｐＨ７．４（８００μＬ）中に溶解させる。マレイミド－ＮＯＤＡＧＡ（３．３ｍｇ、４．３４３μｍｏｌ、２．０当量）を乾燥ＤＭＳＯ溶液（２００μＬ）として添加する。反応物を３時間の間撹拌する。粗材料を逆相ＨＰＬＣ（水０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル０．１％ＴＦＡ、２０分で９．５：０．５から２：８）によって精製し、凍結乾燥させることで、黄色の固体が得られる。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ １３４６．３６（Ｍ＋１Ｈ）１＋
タンパク質－ＯｎｃｏＦＡＰの一般的合成
Figure 2023514275000161
システイン残基当たり３０当量のＴＣＥＰ－ＨＣｌを使用して、タンパク質を終夜４℃で還元する。ＦＰＬＣを介して生成物を精製し、生成物を含有する画分を統合する。
還元されたタンパク質を次いで、システイン残基当たり２０当量で、（Ｓ）－Ｎ１－（４－（（２－（２－シアノ－４，４－ジフルオロピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）カルバモイル）キノリン－８－イル）－Ｎ４－（２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）スクシンアミドと、１時間の間室温で穏やかな振盪下にて反応させる。
生成物を次いで、ＦＰＬＣを介して精製し、ＬＣ／ＭＳで分析することで、同一性を確認する。
記載されているプロトコールを使用することで、タンパク質、酵素、標的、抗体、免疫サイトカイン、炎症促進性タンパク質、および１つまたは複数のシステイン残基を含有するペプチドを官能化することができる。
本発明によるタンパク質コンジュゲートのさらなる例は以下である：下記に例証されている通り、ＦＡＰ標的剤にカップリングされるタンパク質（例えば、コンジュゲート６３、６３ａ）、および複数のＦＡＰ標的剤にカップリングされるタンパク質（例えば、６９、６９ａ）。ボールは、包括的なタンパク質構造を表す。
Figure 2023514275000162

Claims (32)

  1. 以下の構造を有する部分Ａを含む化合物、それの個々のジアステレオ異性体、それの水和物、それの溶媒和物、それの結晶形態、それの個々の互変異性体またはその薬学的に許容される塩：
    Figure 2023514275000163
  2. 以下の構造を有する部分を含む、請求項１に記載の化合物：
    Figure 2023514275000164
     （式中、Ｂは、共有結合、または共有結合的に結合された原子の鎖を含む部分である）。
  3. 以下の式Ｉによって表される、請求項１または２に記載の化合物：
    Figure 2023514275000165
     （式中、Ｂは、共有結合、またはＡをＣに共有結合的に付着させる原子の鎖を含む部分であり；
    Ｃは、原子、分子もしくは粒子であり、および／または治療剤もしくは診断剤である）。
  4. 部分Ａが、以下の構造Ａ１またはＡ２を有し、式中、ｍが０、１、２、３、４または５である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物：
    Figure 2023514275000166
  5. Ｂが、以下の一般式ＩＩ～Ｖのいずれかによって表される、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物：
    Figure 2023514275000167
     ［式中、各ｘは、０から１００、好ましくは０から５０、より好ましくは０から３０の範囲から独立して選択される、いっそう好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択される整数であり；
    各ｙは、０から３０の範囲から独立して選択される、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択される整数であり；
    各ｚは、０から５の範囲から独立して選択される、好ましくは０、１、２、３および４から選択される整数であり；
    ＊は、部分Ａへの付着点を表し；
    ・は、部分Ｃへの付着点を表し、ここで：
    （ａ）ＢＳおよび／またはＢＬは、アルキレン、シクロアルキレン、アリールアルキレン、ヘテロアリールアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、アリールアルケニレン、ヘテロアリールアルケニレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロシクロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アミノアシル、オキシアルキレン、アミノアルキレン、二酸エステル、ジアルキルシロキサン、アミド、チオアミド、チオエーテル、チオエステル、エステル、カルバメート、ヒドラゾン、チアゾリジン、メチレンアルコキシカルバメート、二硫化物、ビニレン、イミン、イミドアミド、ホスホラミド、糖類、リン酸エステル、ホスホラミド、カルバメート、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドからなる群から独立して選択される構造単位を含むまたはそれからなる基であり、これらの各々は、置換または非置換であり；
    （ｂ）ＢＳおよび／またはＢＬは、以下からなる群から独立して選択される構造単位を含むまたはそれからなる基であり：
    Figure 2023514275000168
    Figure 2023514275000169
    Figure 2023514275000170
    Figure 2023514275000171
    Figure 2023514275000172
     （式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、これらの各々は、置換または非置換であり；
    Ｒ４およびＲ５の各々は、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択され、これらの各々は、置換または非置換であり；
    Ｒａ、ＲｂおよびＲｃの各々は、タンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸の側鎖残基から独立して選択され、これらの各々は、さらに置換されていてよく；
    各Ｘは、ＮＨ、ＮＲ、Ｓ、ＯおよびＣＨ２、好ましくはＮＨから独立して選択され；
    ｎおよびｍの各々は、独立して、０から１００、好ましくは０から５０、より好ましくは０から３０、いっそう好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選択される整数であり；
    ここで、各＊は、部分Ａへの最も短い進路が・に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；各・は、部分Ｃへの最も短い進路が＊に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表す）；
    （ｃ）１つまたは複数のＢＬは、独立して、以下の構造単位の１つまたは複数を含みまたはそれからなり：
    Figure 2023514275000173
     （式中、上記の構造の各々において、ｎは、１、２、３または４であり；
    各＊は、部分Ａへの最も短い進路が・に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；各・は、部分Ｃへの最も短い進路が＊に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し、但し、ｎが＞１であり、それぞれの付着点が、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃのいずれか１つの上に示されている場合、それは、ペプチドモノマー単位の１つまたは複数に、好ましくはそれぞれの構造において示されている他の付着点から最も遠位の１つのペプチドモノマー単位に独立して存在することができる）；
    （ｄ）ＢＬおよびＢＳの１つまたは複数は、以下の構造から独立して選択され：
    Figure 2023514275000174
     （式中、各＊は、部分Ａへの最も短い進路が・に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；各・は、部分Ｃへの最も短い進路が＊に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表す）；
    ならびに／あるいは
    （ｅ）ｙは、１、２もしくは３であり；および／または少なくとも１つのＢＬは、以下の構造から独立して選択される切断可能なリンカー基をさらに含む：
    Figure 2023514275000175
     （各＊は、部分Ａへの最も短い進路が・に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表し；各・は、部分Ｃへの最も短い進路が＊に関するものよりも少ない原子を含む付着点を表す）］。
  6. Ｂが、以下の構造を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物：
    Figure 2023514275000176
     ［式中、Ｂ’ｓおよびＢ’’ｓは、以下からなる群から各々独立して選択され：
    Figure 2023514275000177
     各ＢＬは、以下からなる群から独立して選択され：
    Figure 2023514275000178
     各ｎは、０、１、２、３、４または５であり；
    各ｍは、０、１、２、３、４または５であり；
    各ｘ’は、０、１または２であり；
    各ｘ’’は、０、１または２であり；
    各ｙは、０、１または２であり；
    ｚは、１または２であり、
    ここで、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｘ、＊および・は、先行する請求項のいずれか一項における通りに定義される］。
  7. 以下の式の１つによって表される構造を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物：
    Figure 2023514275000179
    Figure 2023514275000180
    Figure 2023514275000181
    Figure 2023514275000182
  8. 部分Ｃが、（ａ）放射標識化するのに適当なキレート化剤基；（ｂ）放射性同位体を含む放射性基；（ｃ）キレート化剤との放射性同位元素のキレート；（ｄ）フルオロフォア基；（ｅ）細胞傷害性剤および／または細胞分裂阻害剤；（ｆ）免疫モジュレーター剤；または（ｇ）タンパク質から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. （ａ）放射標識化するのに適当なキレート化剤基が、硫黄コロイド、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＴＥＴＡ）、イミノジ酢酸、ビス（カルボキシメチルイミダゾール）グリシン、６－ヒドラジノピリジン－３－カルボン酸（ＨＹＮＩＣ）、
    Figure 2023514275000183
     から選択され；
    （ｂ）放射性同位体を含む放射性基が、２２３Ｒａ、８９Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、４７Ｓｃ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１２１Ｓｎ、１６１Ｔｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１０５Ｒｈ、１７７Ｌｕ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８Ｆ、２１１Ａｔ、２２５Ａｃ、８９Ｓｒ、２２５Ａｃ、１１７ｍＳｎおよび１６９Ｅｒから選択され；
    （ｃ）放射性同位元素のキレートが、上記の（ｂ）の下でリストされている同位体の、および／または上記の（ａ）の下でリストされているキレート化剤とのキレートであり；または部分Ｃが、以下の構造：
    Figure 2023514275000184
     のいずれかから選択される基であり；
    （ｄ）フルオロフォア基が、キサンテン色素、アクリジン色素、オキサジン色素、シアニン色素、スチリル色素、クマリン色素、ポルフィン色素、蛍光性金属－リガンド錯体、蛍光タンパク質、ナノ結晶、ペリレン色素、ボロン－ジピロメテン色素およびフタロシアニン色素から選択され、好ましくは以下の構造：
    Figure 2023514275000185
     から選択され；
    （ｅ）細胞傷害性剤および／または細胞分裂阻害剤が、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、有糸分裂撹乱物質、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ－ＲＮＡ転写調節因子、酵素阻害剤、遺伝子調節因子、ホルモン応答モディファイヤー、低酸素症選択的細胞毒、上皮成長因子阻害剤、抗血管剤およびそれらの２つ以上の組合せからなる群から選択され、好ましくは以下の構造：
    Figure 2023514275000186
    Figure 2023514275000187
    Figure 2023514275000188
    Figure 2023514275000189
    Figure 2023514275000190
     から選択される化学療法剤から選択され；
    （ｆ）免疫モジュレーター剤が、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＴＬＲ、ＳＴＩＮＧ、４－１ＢＢＬ、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ｍＴｏｒ、ＰＤＬ－１、ＮＫＧ－２Ｄ ＩＭｉＤのリガンドなど、免疫系をモジュレートできることが知られている分子から選択され、ここで、リガンドは、アゴニストおよび／またはアンタゴニストであってよく；あるいは
    （ｇ）タンパク質が、ＩＬ２、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＴＮＦ、インターフェロンガンマなどのサイトカインから選択される、または抗体である、
    請求項８に記載の化合物。
  10. 部分Ｂが、１つまたは複数の部分Ｃおよび／または部分Ａを連結する二官能性または多官能性部分である、請求項２～９のいずれか一項に記載の化合物。
  11. 独立して、２つ以上の部分Ａ、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の部分Ａを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物。
  12. 独立して、２つ以上の部分Ｃ、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の部分Ｃを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物。
  13. 表２または３に従った構造を有する化合物、それの個々のジアステレオ異性体、それの水和物、それの溶媒和物、それの結晶形態、それの個々の互変異性体またはその薬学的に許容される塩。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  15. （ａ）外科手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の体の処置の方法またはヒトもしくは動物の体に実施される診断法；あるいは
    （ｂ）疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象の治療または予防の方法；あるいは
    （ｃ）疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象に実施されるガイドされた外科手術の方法；あるいは
    （ｄ）ヒトまたは動物の体に実施され、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）または単一光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などの核医学画像化技法を伴う疾患または障害の診断の方法；あるいは
    （ｅ）疾患または障害を患うまたはそのリスクを有する対象への治療剤または診断剤の標的化された送達の方法
    における使用であって、
    ここで、先行する（ｂ）～（ｅ）の各々において、前記疾患または障害は、がん、炎症、アテローム動脈硬化症、線維症、組織リモデリングおよびケロイド障害から独立して選択され、好ましくは、がんは、乳がん、膵臓がん、小腸がん、結腸がん、多剤抵抗性結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、卵巣がん、肝細胞がん、食道がん、下咽頭がん、鼻咽腔がん、喉頭がん、骨髄腫細胞、膀胱がん、胆管腺癌、明細胞腎癌、神経内分泌腫瘍、腫瘍誘発性骨軟化症、肉腫、ＣＵＰ（不明な原発性の癌腫）、胸腺がん、デスモイド腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、子宮頚がん、皮膚がん、腎臓がんおよび前立腺がんからなる群から選択される、
    使用のための請求項１～１３のいずれか一項に記載の化合物または請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 化合物が、注射後好ましくは１時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、治療的または診断的に関連性のあるレベルで疾患部位にて延長された滞留を有する、請求項１５に記載の使用のいずれかのための請求項１～１３のいずれか一項に記載の化合物または請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 以下の構造：
    Figure 2023514275000191
     を有する部分Ａ
    およびコンジュゲーションパートナーと反応し共有結合を形成することができる反応性部分Ｌ
    を含む化合物、それの個々のジアステレオ異性体、それの水和物、それの溶媒和物、それの結晶形態、それの個々の互変異性体またはその塩。
  18. 以下の構造を有する部分を含む、請求項１７に記載の化合物：
    Figure 2023514275000192
     （式中、Ｂは、共有結合、または共有結合的に結合された原子の鎖を含む部分である）。
  19. 以下の式ＶＩによって表される、請求項１７または１８に記載の化合物：
    Figure 2023514275000193
     （式中、Ｂは、共有結合、またはＡをＬに共有結合的に付着させる原子の鎖を含む部分である）。
  20. 部分Ａが、以下の構造Ａ１またはＡ２を有し、式中、ｍが０、１、２、３、４または５である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の化合物：
    Figure 2023514275000194
  21. Ｌが、反応することで、アミド、エステル、カルバメート、ヒドラゾン、チアゾリジン、メチレンアルコキシカルバメート、二硫化物、アルキレン、シクロアルキレン、アリールアルキレン、ヘテロアリールアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、アリールアルケニレン、ヘテロアリールアルケニレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロシクロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アミノアシル、オキシアルキレン、アミノアルキレン、二酸エステル、ジアルキルシロキサン、アミド、チオアミド、チオエーテル、チオエステル、エステル、カルバメート、ヒドラゾン、チアゾリジン、メチレンアルコキシカルバメート、二硫化物、ビニレン、イミン、イミドアミド、ホスホラミド、糖類、リン酸エステル、ホスホラミド、カルバメート、ジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチドの連結基を形成することができる、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の化合物。
  22. 部分Ｂが、請求項５、６または７に定義されている通りである、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の化合物。
  23. 部分Ｂが、１つまたは複数の部分Ｌおよび／または部分Ａを連結する二官能性または多官能性部分である、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の化合物。
  24. 独立して、２つ以上の部分Ａ、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の部分Ａを含む、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の化合物。
  25. 独立して、２つ以上の部分Ｌ、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の部分Ｌを含む、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の化合物。
  26. 部分Ｌが：Ｈ、ＮＨ２、Ｎ３、ＣＯＯＨ、ＳＨ、Ｈａｌ、
    Figure 2023514275000195
     から選択される、請求項１７～２５のいずれか一項に記載の化合物
    （式中、各ｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
    各ｍは、独立して、０、１、２、３、４または５であり；
    各Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
    各Ｒ４は、カルボキシ、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール（ここで、前述の各々は、置換または非置換である）、ハロゲンおよびシアノから独立して選択される）。
  27. 表３に従った構造を有する化合物、それの個々のジアステレオ異性体、それの水和物、それの溶媒和物、それの結晶形態、それの個々の互変異性体またはその塩。
  28. 請求項１７～２７のいずれか一項に記載の化合物をコンジュゲーションパートナーとコンジュゲートするステップを含む、コンジュゲートを調製する方法。
  29. 化合物が、共有結合を形成するためのコンジュゲーションパートナーと反応することによってコンジュゲートされる、請求項２８に記載の方法。
  30. コンジュゲートが、請求項１～１３のいずれか一項に記載の化合物である、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. コンジュゲーションパートナーが、治療剤または診断剤である、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. コンジュゲートを医薬組成物としてまたは診断用組成物として製剤化するステップをさらに含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
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