KR20080108592A - 캄토테신-세포 투과 펩티드 결합체 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치료학적 약물 제제의 표적 세포 또는 조직 내로의 개선된 전달에 사용되는 신규 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 이들의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로 상기 화합물은 수용해도, 약물 동력학 및 조직 분배의 향상, 치료 지수의 증가, 및 환자간 물질 대사 차이의 제한과 더불어 생물학적 활성 성분의 표적 세포 또는 조직으로의 전달 개선을 포함하여 많은 이점을 제공하는, 펩티드 모이어티와 캄토테신, 이의 유도체 또는 유사물의 결합체이다.
Description
본 발명은 치료학적 약물제제의 표적세포 또는 조직 내로의 개선된 전달에 사용되는 신규 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 이들의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로 상기 화합물은 수용해도, 약물 동력학 및 조직 분배의 향상, 치료지수의 증가, 및 환자간 물질대사 차이의 제한과 더불어 생물학적 활성성분의 표적세포 또는 조직으로의 전달 개선을 포함하여 많은 이점을 제공하는, 펩티드 모이어티와 캄토테신, 이의 유도체 또는 유사물의 결합체이다.
캄토테신(CPT)은 1960 년대에 발견된 캄토테카 아큐미나다(Camptotheca acuminata) 나무로부터 추출된 알칼로이드이다(Wall 등, J.Amer. Chem. Soc. 88:3888-3890 (1966)). 이 불수용성 분자는 매우 강력한 항종양 활성을 나타냈으나, 매우 강한 방광 독성 및 심한 설사로 인해 이의 임상적 이용이 제한되었다([Gottlieb 등, Cancer Chemother. Rep. 54:461-470 (1970)], [Moertel 등, Cancer Chemother. Rep. 56:95-101(1972)]). 구조-활성 연구에서 현재 시판 중인 다음의 2가지 수용성 항종양 유도체가 확인된 바 있다: 이리노테칸(CPT-11, Campto ®, Camptosar®) 및 토포테칸(Hycamtin®, 수용성 캄토테신 유도체). 상기 두 분자는 DNA의 단일가닥 파괴를 유도하여 DNA 복제를 저해하는 DNA 토포이소머라아제 I의 특이적인 억제제이다([Hsiang 등, J. Biol, Chem. 260:14873-14878 (1985)], [Kawato 등, Cancer Res. 51:4187-4191 (1991)], [Satoh 등, Biol, Pharm. Bull. 17:662-664 (1994)]).
이리노테칸은 이리노테칸의 간장 효소성 분해 이후 방출되는 활성 대사산물인 SN38의 수용성 전구약물(7-에틸-10-히드록시캄토테신)이다. SN38은 강력한 토포이소머라아제 I 억제제이며 항증식제로서 이리노테칸에 비해 2000 배 이상 큰 활성을 나타낸다. 그러나 SN38은 매우 불수용성이어서 이의 적절한 투여 및 생물학적 이용가능성을 확보하기 위한 전달계를 필요로 한다. 다수의 캄토테신 유도체들과 마찬가지로, SN38은 항종양 효능에 매우 중요한 락톤고리를 포함한다.
상기 락톤고리는 생리학적 또는 염기성 pH에서 불안정하며, 이는 활성약물의 불활성 카르복실레이트 형태로의 전환을 야기한다(Chabot, Clin. Pharmacokinetics, 33:245-259 (1997)).
이리노테칸은 결장암 치료에 널리 사용된다. 그러나 이에는 여러 가지 제한이 따른다. 투여 후, 이리노테칸은 활성을 띠는 SN38로 전환되어야 한다. 이리노테칸의 활성약물 SN38로의 간장 효소성 전환은 인간에 있어 매우 불완전하다([Rohtenberg 등, J. Clin. Oncology 11:2194-2204 (1993)], [Senter 등, Bioconjugate Chem. 12:1074-1080 (2001)]). 이리노테칸의 투여용량의 2 내지 8 % 만이 간장 및 종양 카르복실에스테라아제(CES)에 의해 친유성 대사산물 SN38로 분해된다([Senter 등, Bioconjugate Chem. 12:1074-1080 (2001)], [Xu 등, Clin. Cancer Res.8:2605-2611 (2002)]). 이러한 이화 작용의 동력학에 관한 분석을 통해, 효소 활성에 10 배 이하로 영향을 미치는 유전적 및 환경적 인자들로 인한 상당한 환자간 차이가 있음이 확인되었다(Charasson 등, Drug Metab. Dispos. 30:731-733 (2002)). 이는 이리노테칸의 물질대사에 있어 높은 수준의 개체간 차이를 야기하고, 이리노테칸의 내성 및 효능에 영향을 미치며, 환자의 치료를 상당히 어렵게 한다([Ohe 등, J. Natl. Cancer Inst. 84:972-974 (1992)], [Gupta 등, Cancer Res 54:3723-3725 (1994)], [Slatter 등, Drug Metab. Dispos. 28:423-433 (2000)], [Kraut 등, ASCO abstract No:2501, 2004]). SN38은 또한 간에서 유리딘 디포스페이트 글루쿠로노실 트랜스퍼라아제 1A1 (UGT1A1)에 의해 SN38-글루쿠로니드(SN38-G), 즉 비활성 글루쿠로노 결합체로 전환(해독)된다. 글루쿠로니드화에 의해 상기 분자는 담즙을 통한 위장 분비가 이루어지도록 친수화된다. 장 내에서 SN38-G는 장 세균총(베타-글루쿠로니다아제 효소)에 의해 SN38로 재전환된다. 이리노테칸 그 자체는 주로 담즙 내로 분비되어(> 26 %) 장 CES에 의해 SN38로 전환될 수 있다(M. Horikawa, Pharmaceutical Res., 19:1345-1353 (2002)). 이러한 SN38의 장내의 국부적 축적은 이리노테칸 치료 후에 관찰되는 높은 수준의 지연성 장 독성(설사)의 원인이 되며, 이것이 이리노테칸의 주요한 용량 제한 독성 중 하나이다([Xie 등, Clin. Pharmacol. Ther; 72:265-275 (2002)], [Alimonti 등, Cancer Treatment Rev. 30:55-562 (2004)]). 지연성 설사는 그 증상이 심하며(예 컨대, 생존을 위협할 정도), 때로 열을 동반하여 나타난다. 이리노테칸의 또 다른 주요 독성은 백혈구 감소(예컨대, 호중구 감소)이다. 혈액학적 장애는 때로 전신 감염에 의해 악화되는 심한 무형성증을 야기할 수도 있다. 치료 후에 관찰되는 이러한 심한 부작용들은 환자의 보충적인 병원 치료(장기 입원; 항설사 치료; 예방 항생제 요법)를 야기한다(Kehrer 등, Clin. Cancer Res. 7:1136-1141 (2001)). 이리노테칸 용량의 단계적 확대/강화가 향상된 치료반응을 가져온다는 것이 임상실험에서 밝혀진 바 있다. 이러한 용량효과는 결장 전이암 환자에게 입증되었다([Y chou 등, Cancer Chemother. Pharmacol 50:383-391 (2002)], [Van Cutsem 등, Br. J. Cancer. 92:1055-1062 (2005)]). 그러나 상기된 바와 같은 심한 부작용들에 의해 이리노테칸의 잠재적 효능이 감소되므로, 개체에 투여될 수 있는 용량이 제한된다.
인간 암 치료에 캄토테신 유도체를 반복적으로 사용하는 경우, 약물 내성이 증가할 수 있다(Nakagawa 등, Cancer Letters in press (2005)). 이러한 특성으로 인해, 캄토테신 유도체 및 기타 일반적으로 사용되는 항암제를 이용한 치료 이후에 효능 감소가 발생한다.
이에 따라, 상기한 바와 같은 캄토테신 유도체(예컨대, SN38)의 한계를 극복하기 위한 적절한 전달계의 개발에 상당한 관심이 모아지고 있다.
캄토테신 유도체, 예컨대 리포좀 제형의 SN38(NEOPHARM에 의해 출원된 PCT 특허출원 공개번호 WO 2004/035032에 기재), 나노입자 제형의 SN38(IMARX에 의해 출원된 PCT 특허출원 공개번호 WO 03/103596에 기재), 폴리글루탐산-캄토테신 결합 체(CELL THERAPEUTICS에 의해 출원된 PCT 특허출원 공개번호 WO 01/70275에 기재), 또는 PEG-캄토테신 결합체(ENZON에 의해 출원된 PCT 특허출원 공개번호 WO 03/097356 및 DEBIO에 의해 출원된 PCT 특허출원 공개번호 WO 03/031467에 기재) 또는 20-O-[글리실-아미노아실-글리실]-캄토테신의 중합성 결합체(PHARMACIA & UPJOHN에 의해 출원된 PCT 특허출원 공개번호 WO 99/17804에 기재)와 같은 캄토테신의 중합성 유도체의 전달을 위한 다양한 방법들이 제안된 바 있다.
또한 펩티드성 약물 전달계가 CYCLACEL에 의해 출원된 PCT 특허출원 공개번호 WO 00/01417에 기재되었으며, 이는 10-히드록시캄토테신과 같은 다양한 약물들의 전달을 촉진하는 것을 목적으로 한다. 상기 특허출원은 드로소필라 안테나페디아(Drosophila antennapedia) 호모단백질로 부터 유래된 호메오박스 펩티드 (바람직하게는, 페너트라틴이라 불리는 세포침투성 펩티드(CPP))를 다수의 세포 독성 약물과 결합하여 이의 전달 및/또는 치료 효과를 강화하는 데 사용하는 것에 대해 기재하고 있다. 그러나 상기 특허출원은 상기 결합체를 이용하여 수행한 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 실험을 제시하지 않는다. 따라서 본 출원인은 상기 특허출원 번호 WO 00/01417의 실시예 29에 기재된 결합체를 사용하여 시험관 내 인간 혈청 안정성 연구를 수행하였다. 이 연구에서 상기 결합체의 반감기(안정성)는 3 분 미만으로 나타났으며, 이는 생체 내에서 치료학적 유효량의 캄토테신 유도체의 세포내 전달에 충분하지 않은 것이다.
DIATOS에 의해 출원된 PCT 특허출원 공개번호 WO 01/64738은 아미노글리칸과 반응하여 매우 다양한 활성 물질(즉, 핵산, 단백질, 약물, 항원 또는 항체)을 외부 매질로부터 세포, 보다 구체적으로 세포 핵의 내부로 전달하는 아미노산 서열에 관한 것이다. 상기 서열은 인간 단백질로부터 유래한 것이며, 따라서 치료학적 치료를 필요로 하는 인간에게 투여되는 비면역유발성 세포침투성 펩티드(CPP)이다.
따라서 활성 화합물(예컨대, SN38)의 전달 효율, 안전성 및 효능을 강화할 필요가 있다.
본 발명의 근간이 된 연구에 있어서, 본 출원인은 다양한 CPP-캄토테신 유도체 결합체들을 합성하였다. 이어서 시험관 내 및 생체 내에서 이러한 결합체들의 안정성, 효능 및 독성을 평가하였다.
특히, 본 발명의 목적은 이리노테칸과 같은 캄토테신 유도체에 관하여 상기한 바와 같은 결점 및 원치 않는 부작용을 완화 또는 저감시키는 화합물을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명은 생물학적 활성제제의 용해도를 약학적으로 허용가능한 형태로 향상시키고/거나, 효과적인 세포내 전달을 가능케 하는 데 충분한 안정성을 가지고/거나, 유독한 또는 바람직하지 않은 부작용을 감소시키고/거나, 원하는 치료 효과의 작용 발생을 강화하고/거나, 약물 투여를 위한 대체 경로를 제공하고/거나, 환자간 차이를 감소시키고/거나, 약물의 조직 분배 및 물질대사를 개질시킬 수 있는 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 개에 있어서 DPV1047-MIC-SN38(10, 20, 50 mg/kg, 검은색 막대), DPV1047-BCH-SN38(5, 10 (n=2), 20 mg/kg, 회색 막대) 및 이리노테칸(30 mg/kg, 흰색 막대)을 주입한 후의 SN38의 혈액 AUC를 나타낸 것이다.
도 2는 DPV1047-MIC-SN38(50 mg/kg) 및 DPV1047-BCH-SN38(10 mg/kg)을 주입한 후의 DPV1047-MIC-SN38, DPV1047-BCH-SN38 및 SN38의 혈액 AUC를 나타낸 것이다.
▲: DPV1047-MIC-SN38; ▼: DPV1047-MIC-SN38으로부터의 SN38; ■: DPV1047-BCH-SN38; ●: DPV1047-BCH-SN38으로부터의 SN38. AUC는 한계 정량(7.8 ng/mL 당량 SN38)까지 주입한 후 측정하였음; 각 용량에서의 DPV1047-MIC-SN38 및 DPV1047-BCH-SN38의 AUC = AUC 0 내지 4.42 h.
[발명의 개요]
첫 번째 관점에서, 본 발명은 담체 모이어티에 연결된 약물 모이어티를 포함하는 결합체에 관한 것이며, 이때 상기 담체 모이어티는 운반부분(예컨대, 약물 모이어티)의 세포 또는 조직으로의 침투를 촉진하여 용해도를 증가시키고/거나 약물의 약물 동력학, 물질대사 및 조직 분배 특성을 개질시키고/거나 약물 내성의 발생을 저감시킬 수 있는 펩티드 또는 이의 유사물을 포함하고, 상기 약물 모이어티는 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체이다. 상기 펩티드 또는 이의 유사물은 또한 본원에서 세포침투성 펩티드(CPP)로 칭해진다.
본 발명은 또한 상기 결합체를 포함하는 약학 조성물 및 이의 치료학적 용도, 특히 암을 포함한 다양한 유형의 질병 치료를 위한 용도에 관한 것이다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명은 1 개 이상의 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체, 더욱 바람직하게는 담체 모이어티에, 바람직하게는 연결자 기를 통해 연결된 화합물 SN38을 포함하는 결합체를 제공한다.
상기 담체 모이어티는 운반 부분(예컨대, 약물 모이어티)의 세포 또는 조직으로의 침투를 촉진하여 용해도를 증가시키고/거나 약물 모이어티의 약물 동력학, 물질대사 및 조직 분배 특성을 개질시키고/거나 환자간 차이를 감소시키고거나 약물 내성의 발생을 저감시킬 수 있는 펩티드 또는 이의 유사물을 포함한다.
본 발명의 결합체에는 이의 염, 광학 및 기하 이성질체 또는 이들의 혼합물이 포함된다.
상기 결합체의 염은 특히 염기성 염 또는 산 부가 염이며, 바람직하게는 약학적 용도로 호환 가능하다. 약학적으로 허용가능한 무기산 중에는 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 및 질산이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적으로 허용가능한 유기산 중에는 아세트산, 트리플루오로아세트산, 젖산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 퓨마르산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 벤조산, 아스코르브산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 2-히드록시에탄설폰산 및 캄포르산이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적으로 허용가능한 염기 중에는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민 및 tert-부틸아민이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 결합체는 염화수소 염 형태이다.
유리하게는, 담체 모이어티의 약물(즉, 캄토테신 유도체)에의 결합은 비결합 약물과 비교할 때 약물의 약물 동력학적 거동의 개질화를 야기한다.
유리하게는, 상기 담체 모이어티는 결합체의 수용액 중에서 낮은 pH(예컨대, < 6.5 pH 값)를 유도하는 양전하성 모이어티(즉, 염기성 아미노산)를 포함한다. 이러한 산성 pH는 약학 조성물(락톤형 > 95 %) 중의 캄토테신 유도체 상의 락톤기의 안정화에 유리함에 따라, 살아 있는 동물 또는 인간 개체에 주입된 이후 락톤형과 카르복실레이트형 간의 혈장 내 평형에서 락톤형(> 약 55 % 락톤형)이 선호된다(Kaneda 등,, Biol. Pharm. Bull. 20:992-996 (1997)).
본 발명의 또 다른 이점은 약물의 조직 분배 및 뒤따른 생체 내 물질대사가 또한 담체 모이어티에의 결합에 의해 변경(예컨대, 개질화)된다는 것이다. 상기 물질대사 개질화는, 이리노테칸 활성화에 관한 간장 카르복실에스테라아제와 비교할 때, 혈장 및 조직 에스테라아제에 의한 본 발명의 결합체의 분해를 포함한다. 통합해 보건대, 본 발명의 개질된 조직 분배(즉, 간장내 섭취율의 감소) 및 전달계는 본 발명의 결합체의 간장 내 활성화를 필요 없도록 함으로써 60 % 초과의 활성 대사산물(즉, 치료학적 활성형태의 약물), 예컨대 SN38의 전달과 더불어 치료의 개체 간 차이 감소 및 (이리노테칸에 비해) 장 독성의 감소를 야기한다.
유리하게는, 본 발명의 결합체는 치료학적 유효량의 순환성 및 세포성 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체를 전달하기에 충분한 안정성을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 결합체는 연결자 기를 통해 담체 모이어티에 연결된 1개 이상의 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체를 포함하며, 이때 상기 담체 모이어티는 세포침투성 펩티드이고 시험관 내 37 ℃ 인간 혈청 중에서의 결합체의 반감기(즉, 본 발명의 결합체에 의해 방출된 자유 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체가 50 몰%로 되는 시간)는 5 분 이상이다.
용어 "결합" 또는 "결합됨"은 분자의 모이어티들이 단결함으로써 근접성이 유지되도록 하는 공유성, 이온성, 또는 소수성 상호작용을 의미한다.
용어 "반응됨"은 화학 분야의 당업자에게 있어 통상적인 의미를 가진다.
용어 "연결자" 또는 "가교자"는 본원에서 호환적으로 사용되며, 2개의 모이어티를 함께 결합/연결하고 1개 이상의 원자를 포함하는 사슬을 의미한다.
용어 "시험관 내"는, 정제된 시약 또는 추출물, 예컨대 세포 추출물을 포함하는, 예컨대 세포 배양이라는 당업계적 의미를 가진다. 또한 용어 "생체 내"는, 예컨대 유기체 내의 생세포 및/또는 유기체 내의 세포들을 포함하는 당업계적 의미를 가진다.
용어 "약물 동력학"은 약물이 몸에 의해 흡수, 분배, 물질대사, 및 제거되는 과정을 의미한다. 약물동력학적 거동은 일반적으로 약물 및 이의 대사산물들의 혈액, 혈장 또는 혈청 농도를 시간함수로서 전개시켜 평가한다. 관찰시간은 약 5 분 내지 약 24 시간 이상일 수 있다. 용어 "혈장 약물 동력학"은 약물 및 이의 대사산물의 혈액, 혈장 또는 혈청농도의 시간에 따른 전개를 의미한다.
용어 "조직 분배"는 정해진 시간의 다양한 조직, 즉 간, 폐, 위, 장, 이자, 뇌, 방광, 난소, 고환, 전립선, 자궁, 피부, 근육, 비장, 림프절, 종양, 또는 기타 관련 기관의 약물 또는 이의 대사산물에 대한 상대적 또는 절대적 노출을 의미한다. 조직 분배는 조직 내의 약물 또는 대사산물 농도를 시간함수로서 전개시켜 측정한다.
용어 "펩티드(들)"은 N 말단, 즉 아미노 말단은 좌측에, C 말단, 즉 카르복실 말단은 우측에 쓰는 것으로 약속된 아미노산 중합체를 의미한다. 20 개의 가장 일반적인 천연 L-아미노산은 3 자리 또는 1 자리 암호로 구별하여 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 펩티드는 "펩티드 유사물", 즉 L-아미노산 측쇄 또는 알파-아미노산 백본에 대한 하나 이상의 개질화를 포함하는 구조적 개질화를 포함하는 것으로 간주된다. 백본 개질화 펩티드 유사물의 예는 N-메틸 글리신 "펩토이드"이다(Zuckermann 등, J. Amer. Chem. Soc. 114:10646-47 (1992)).
용어 "세포침투성 펩티드(들)"(CPP(들))은 생물학적 막 또는 생리학적 장벽을 통과할 수 있는 담체 펩티드를 의미한다. 세포침투성 펩티드는 또한 세포 투과성 펩티드, 단백질 전달 도메인(Protein Transduction Domain; PTD) 또는 막 전위 서열(Membrane Translocation Sequence; MTS)이라고도 칭해진다. CPP는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 포유류 세포막을 전위시켜 세포 및/또는 세포 핵 내에 진입할 수 있으며, 약물 또는 마커와 같은 관심 있는 결합형 화합물을 원하는 세포 내 목적지로 유도한다. 따라서 CPP는 인지질막, 미토콘드리아막, 엔도좀막 또는 핵막을 통해 관심 있는 화합물이 침투하는 것을 유도 또는 촉진할 수 있다. CPP는 또한 관심 있는 화합물을 세포 외부로부터 혈장 막을 통해 세포질 또는 시토졸 내로 또는 세포 내의 원하는 위치, 예컨대 핵, 미토콘드리아, 세포질 세망, 리소좀 또는 페록시좀으로 유도할 수 있다. 그 대안으로서 또는 아울러, CPP는 관심 화합물이 혈액-뇌 또는 혈액-망막, 경점막, 피부, 위장 및/또는 폐 장벽을 통과하도록 유도할 수 있다. 여러 단백질 및 이의 펩티드 유도체들은 세포 내재화 특성을 가지는 것으로 밝혀졌으며, 이에는 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 단백질 Tat(Ruben 등, J. Virol. 63, 1-8 (1989)), 헤르페스 바이러스 외피 단백질 VP22(Elliott 및 O'Hare, Cell 88, 223-233 (1997)), 페너트라틴(Derossi 등, J. Biol. Chem. 271, 18188-18193 (1996)), 프로테그린 1(PG-1) 항균성 펩티드 SynB(Kokryakov 등, FEBS Lett. 327, 231-236 (1993)) 및 염기성 섬유아세포 성장인자(Jans, Faseb J. 8, 841-847 (1994))가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 담체 펩티드는 서로 서열 상동성을 거의 나타내지 않으나, 모두 상당히 양이온성이며 아르기닌 및 리신이 풍부하다. 사실상, 합성 폴리-아르기닌 펩티드는 높은 수준의 효율로 내재화되는 것으로 나타났다([Futaki 등, J. Mol. Recognit. 16, 260-264 (2003)]; [Suzuki 등, J.Biol. Chem. (2001)]).
따라서, 특정 구현예에서 본 발명의 결합체는 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 단백질 Tat, 헤르페스 바이러스 외피 단백질 VP22, 페너트라틴, 프로테그린 1(PG-1) 항균성 펩티드 SynB, 염기성 섬유아세포 성장인자, 합성 폴리-아르기닌 펩티드, 또는 세포 내재화 특성을 가지는 이들의 펩티드 유도체로부터 선택되는 CPP를 의미한다.
본 발명의 특정 양상에 따르면, CPP는 하기 화학식 (I)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다:
상기식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 아미노산 1 내지 20 개의 아미노산 서열이고; p 및 q는 독립적으로 0 내지 5, 바람직하게는 0 또는 1의 정수이고;
B는 독립적으로 염기성 아미노산이며, X는 독립적으로 비염기성 아미노산이고;
C는 독립적으로 부재하거나 또는 결합체의 나머지 부분에 연결된 티오에테르 결합을 포함하는 모이어티이며, 상기 모이어티는 바람직하게는 시스테인 또는 시스테아민이고;
m은 1 또는 2이고;
n은 1,2 또는 3이고;
o는 0 또는 1이고;
r은 0 또는 1이고;
s는 0, 1, 2 또는 3이다.
바람직한 구현예에서, CPP는 인간 단백질로부터 유래된 것으로, 인간에 투여되는 경우 면역원성을 피할 수 있다. 상기 특정 구현예에 따르면, CPP는 상기된 바와 같은 화학식 (I)로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다.
보다 바람직한 구현예에서, 본 발명의 CPP는 또한 본 발명의 CPP에 결합되지 않은 상기 분자와 비교할 때, 고도의 친유성 분자를 용해시키고/거나 약물 동력학 및 조직 분배를 개질시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 담체 모이어티는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 세포 표면 글리코사미노글리칸과 반응할 수 있는 CPP를 포함한다. 이러한 CPP는 DIATOS에 의해 출원된 PCT 특허출원 번호 WO 01/64738 및 WO 05/016960, 및 문헌[De Coupade 등 (Biochem J. 390:407-18 (2005))]에 기재되었다. 상기 펩티드는 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 인간 헤파린 결합 단백질 및/또는 항DNA 항체로부터 기원하는 아미노산 서열이다: 인간 아포리포단백질 B 또는 E와 같은 리포단백질(Cardin 등, Biochem. Biosphys. Res. Com. 154:741 (1988)), 아르긴(Campanelli 등, Development 122:1663-1672 (1996)), 인슐린 성장인자 결합 단백질(Fowlkes 등, Endocrinol. 138:2280-2285 (1997)), 인간 혈소판 유래 성장인자(Maher 등, Mol. Cell. Biol. 9:2251-2253 (1989)), 인간 세포외 수퍼옥시드 디스뮤타아제(EC-SOD)(Inoue 등, FEBS 269:89-92 (1990)), 인간 헤파린-결합 상피 성장인자형 성장인자(HB-EGF)(Arkonac 등, J. Biol. Chem. 273:4400-4405 (1998)), 산성 섬유아세포 성장인자(aFGF)(Fromm 등, Arch. Biochem. Bioph. 343:92 (1997)), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)(Yayon 등, Cell 64:841-848 (1991)), 인간 장 뮤신 2 서열(Xu 등, Glyconjug J. 13:81-90 (1996)), 인간 감마 인터페론(Lortat-Jacob & Grimaud, FEBS 280:152-154 (1991)), 인간 인터루킨 12의 서브유닛 p40(Hasan 등, J. Immunol. 162:1064-1070 (1999)), 간질세포 유래의 인자 1-알파(Amara 등, J. Biol. Chem. 272:200-204 (1999)), "헤파린 결합 단백질" 유래의 인간 호중구(CAP 37/아주로시딘)(Pohl 등, FEBS 272:200-204 (1990)), 항DNA 단일클론 마우스 항체 F4.1의 CDR2 및/또는 CDR3 영역과 같은 면역글로불린 분자(Avrameas 등, Proc Natl. Acad. Sci. 95:5601 (1998)), 인간 항DNA 단일클론 항체 RTT79의 고가변성 CDR3 영역(Stevenson 등, J. Autoimmunity 6:809 (1993)), 인간 항DNA 단일클론 항체 NE-1의 고가변성 영역CDR2 및/또는 CDR3(Hirabayashi 등, Scand. J. Immunol. 37:533 (1993)), 인간 항DNA 단일클론 항체 RT72 의 고가변성 영역 CDR3(Kalsi 등, Lupus 4:375 (1995)).
CPP가 글리코사미노글리칸(GAG)과 반응/결합하는 능력은 당업계에 공지된 직접적 또는 간접적 글리코사미노글리칸 결합 어세이, 에컨대 특허출원 WO 00/45831 에 기재된 펩티드 글리코사미노글리칸 결합용 어피니티 코일렉트로포레시스(ACE) 어세이에 의해 측정될 수 있다. 당업계에 널리 공지된 여러 다른 방법들, 예컨대 PCT 특허출원 WO 01/64738 또는 문헌[Weisgraber 및 Rall (J. Biol. Chem., 262(33):11097-103)]에 의해 기재된 방법(아포리포단백질 B-100에 관한 특정예); 또는 96-웰 플레이트를 특이적인 GAG(콘드로이틴 설페이트 A, B 및 C, 헤파린, 헤파린 설페이트, 히알루론산, 케라틴 설페이트, 신데칸)로 코팅하고, 이어서 마커에 결합된 펩티드를 정해진 시간 동안 첨가하고; 대략적인 세정 후, 펩티드 결합을 마커에 관한 특이적인 분석을 이용하여 측정하는 변형 ELISA 테스트는 GAG-펩티드 상호작용을 분석하는 데 이용 가능하다.
CPP는 임의의 길이일 수 있다. 예컨대, CPP는 아미노산 500, 250, 150, 100, 50, 25, 10, 6 또는 4개 이하의 길이이다. 예컨대, CPP는 아미노산 4, 6, 10, 25, 50, 100, 150, 250 또는 500개 이상의 길이이다. 당업자라면 CPP의 적절한 길이 및 구조를 쉽게 결정할 것이다. CPP에 관한 일반적인 참고문헌으로는, 하기가 인용될 수 있다: [CELL PENETRATING PEPTIDES: PROCESSES AND APPLICATIONS, edited by Ulo Langel (2002)]; 또는 [Advanced Drung Delivery Reviews 57:489-660 (2005)].
바람직한 구현예에서, CPP는 아미노산 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 길이이다.
바람직한 구현예에서, CPP는 아미노산 50개 미만, 바람직하게는 25개 미만 길이의 화학식 (I)의 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 화학식 (I)의 아미노산 서열은 8개 초과, 바람직하게는 10개 초과의 아미노산을 가진다.
특정 구현예에 따르면, 담체 모이어티는 C가 부재하거나 아미노산 서열의 임의의 위치에 존재하거나 또는 더욱 바람직하게는 상기 아미노산 서열의 C 또는 N 말단에 존재하는 화학식 (I)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다.
티올기를 포함하는 모이어티는 화학식 (I)의 아미노산 서열의 임의의 위치에 첨가되어 티오에테르 결합을 통해 펩티드를 캄토테신, 이의 유도체 또는 유사물에 결합시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는, 티올기를 포함하는 모이어티는 상기 아미노산 서열의 C 또는 N 말단 위치에 존재한다 (즉, 상기 모이어티는 C 및 N 말단 위치 중 한쪽에만 존재하고 화학식 (I)의 나머지 C 또는 N 위치에는 부재한다). 구체적으로, 상기 모이어티는 시스테인 또는 시스테아민이다.
바람직하게는, X1 및 X2는 독립적으로 아미노산 2 내지 15개, 더욱 바람직하게는 아미노산 2 내지 10개의 아미노산 서열이다. 이들은 염기성 또는 비염기성 아미노산을 포함할 수 있다. 더욱 특히, X1 및 X2는 시스테인 아미노산이 결여되어 있다.
용어 "염기성 아미노산"은 pH 7에서 양전하를 띠는 임의의 아미노산, 특히 구아니딜, 아미디닐 또는 아미노 모이어티를 가지는 임의의 아미노산을 의미한다. 용어 "구아니딜" 및 "구아니딘"은 호환적으로 사용되어 화학식 -HN=C(NH2)NH(비양자화된 형태)를 가지는 모이어티를 의미한다. 예를 들어, 아르기닌은 구아니딜 (구아니디노) 모이어티를 포함하며, 또한 2-아미노-5-구아니디노발레르산 또는 a-아미노-6-구아니디노발레르산을 의미한다. 용어 "아미디닐" 및 "아미디노"는 호환적으로 사용되며 화학식 -C(=NH)(NH2)를 가지는 모이어티를 의미한다. 바람직한 고염기성 아미노산은 히스티딘(H), 아르기닌(R) 및/또는 리신(K), 더욱 바람직하게는 K 및 R이다.
용어 "비염기성 아미노산"은 pH 7 이하에서 양전하를 띠지 않는 임의의 아미노산 잔기를 의미한다. 따라서, 이에는 임의의 비극성 아미노산(즉, 소수성 아미노산), 극성 비전하성 아미노산 및 pH 7에서 음전하를 띠는 아미노산이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 비극성 아미노산은 A, I, L, M, F, P, W, 및 V이다. 극성 비전하성 아미노산은 N, C, Q, G, S, T 및 Y이다. 음전하성 아미노산은 D 및 E이다.
바람직한 구현예에 따르면, 화학식 (I)의 BX(X)rXB 모이어티에 포함된 비염기성 아미노산은 글루탐산(E), 글리신(G), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 루신(L), 발린(V), 프롤린(P) 및 시트룰린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 바람직한 아미노산 서열은 하기와 같은 것이다:
- o는 1이고/거나,
- p 및/또는 q는 1이고/거나,
- X1 은 아미노산 3 내지 12개의 서열이고/거나,
- X2 는 아미노산 2 내지 10개의 서열이고/거나,
- r은 0이고/거나,
- m은 1이다.
따라서 인간 헤파린 결합 단백질로부터 유래되며 특이적으로 세포 내로 침투할 수 있는 바람직한 CPP는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
- DPV3(서열 번호: 1): 헤파린 및 인간 세포외 수퍼옥시드 디스뮤타아제(EC-SOD) 서열의 C-말단부로부터 유래된 펩티드 이량체와 반응하는 CPP(Inoue 등, FEBS 269:89-92 (1990));
- DPV6(서열 번호: 2): 헤파린과 반응하며 인간 혈소판 유래의 성장인자의 사슬 A의 C-말단부의 아미노산 서열로부터 유래되는 CPP(Maher 등, Mol. Cell. Biol. 9:2251-2253 (1989));
- DPV7(서열 번호: 3) 및 DPV7b(서열 번호: 4): 헤파린과 반응하며 인간 헤파린 결합 상피 성장인자형 성장인자(HB-EGF) 서열의 C-말단부로부터 유래되는 CPP(Arkonac 등, J. Biol. Chem. 273:4400-4405 (1998));
- DPV10(서열 번호: 5): 헤파린과 반응하며 인간 장 뮤신 2 서열의 C-말단부에 상응하는 CPP(Xu 등, Glyconjug J. 13:81-90 (1996));
- DPV3/10(서열 번호: 6): 헤파린과 반응하며 인간세포 외 수퍼옥시드 디스뮤타아제(EC-SOD) 서열의 C-말단부(상기 참조) 및 인간 장 뮤신 2 서열의 C-말단부(상기 참조)로부터 유래하는 CPP;
DPV10/6 (서열 번호: 7): 헤파린과 반응하며 인간 장 뮤신 2 서열의 C-말단부(상기 참조) 및 혈소판 유래 성장인자의 사슬 A의 C-말단부(상기 참조)로부터 유래되는 CPP;
DPV1047(서열 번호: 8) 및 DPV1048(서열 번호: 9): 헤파린과 반응하며, 인간 리포단백질 B의 아미노산 서열(3358-3372)(Cardin 등, Biochem. Biosphys. Res. Com. 154:741 (1988)) 및 인간 항DNA 단일클론 항체 NE-1의 고가변성 영역 CDR3에 상응하는 펩티드의 서열(Hirabayashi 등, Scand.J.Immunol. 37:533 (1993))로부터 유래되는 CPP;
- DPV15(서열 번호: 10) 및 DPV15b(서열 번호: 11): 헤파린 및 "헤파린 결합 단백질" CAP 37의 서열 일부를 포함하는 CPP.
본 발명에 따르면, 세포침투성 펩티드는 보다 구체적으로 하기의 표 1a에 제시된 하나의 펩티드로부터 선택된다.
표 1a
전기한 바와 같이, 표 1a에 제시된 각 펩티드들은 유리하게는 아미노산 서열의 C 또는 N 위치에 시스테인이 존재한다.
본 발명에 따른 세포침투성 펩티드는 상기한 바와 같은 것들 또는 이의 유사물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. "유사물"은 상기의 것들과 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 내지 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 95% 내지 99% 이상 동일한 것이다. 예컨대, 펩티드는 1, 2, 3, 4개 또는 그보다 많은 잔기에 치환기를 가질 수 있다. CPP는 (상기된 바와 같은) 단량형, 또는 중합형(이량체, 삼량체 등)으로 사용될 수 있다.
필요하다면, CPP를 생체 내 안정성 및/또는 생물학적 활성이 증가된 후보 약물로 전환시키기 위한 하기의 널리 공지된 여러 화학적 방법들이 당업자에 의해 사용될 수 있다:
- 엑소펩티다아제 분해를 방지하기 위한 N- 및 C-말단 개질화: C-말단 아미드화 또는 N-말단 아세틸화,
- 디설피드 브릿지 형성에 의한 고리화,
- 엔도펩티다아제 분해를 방지하기 위한 아미드 질소의 알킬화,
- 엔도펩티다아제의 인식 부위를 개질시키기 위한 비천연 아미노산(2-메틸알라닌, 알파-디알킬화 글리신, 올리고카르바메이트, 올리고유레아, 구아니디노 또는 아미디노 백본 등)의 도입,
- 유전자 암호화되지 않은 아미노산(글리신 또는 페닐알라닌의 메틸화, 할로겐화 또는 염소화)의 CPP 아미노산 서열 내로의 혼입,
- 일부 또는 거의 모든 L-아미노산의 이에 상응하는 D-아미노산 또는 베타-아미노산 유사물로의 대체. 상기 펩티드는 "역위(inverso)" 또는 "반(反)역위(retro-inverso)" 형태로, 즉 서열의 L-아미노산을 D-아미노산으로 대체함으로써 또는 아미노산 서열을 역행시키고 L-아미노산을 D-아미노산으로 대체함으로써 합성될 수 있다. 구조적으로, 반역위 펩티드는 단순한 D-유사물에 비해 원래의 펩티드에 훨씬 더 유사하다. D-펩티드는 L-펩티드 상보물에 비해 사실상 펩티다아제에 보다 저항적이고, 따라서 혈청 및 조직 내에서 보다 안정하다. 바람직한 구현예에서, L-아미노산을 포함하는 CPP는 단일의 D-아미노산으로 캐핑되어 엑소펩티다아제 파괴를 억제한다,
- CPP 유래의 올리고카르바메이트의 합성; 상기 올리고카르바메이트 백본은 비교적 강한 카르바메이트 결합을 통해 연결된 키랄 에틸렌 백본으로 이루어진다 (Cho 등, Science 261:1303-1305 (1993)).
본 발명에 따른 결합체는 또한 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체"는 시험관 내 및/또는 특히 생체 내에서 효소 DNA 토포이소머라아제 I에 결합하는 특성을 가지며 하기 화학식 (II)로 표시되는 캄토테신 백본을 포함하는 임의의 생물학적 활성 화합물을 의미한다:
상기 식에서, t는 0, 1 또는 2이고, Z는 -COO-기(-COO-기의 방향은 상기 화학식 (II)이 기재된 방식에 따라 상향) 또는 치환 또는 비치환된 2가 알킬기이다.
더욱 특히, 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체는 화학식 (II)의 캄토테신 백본을 포함하며, 이때, 화학식 (II)에 표시된 임의의 탄화수소기는 치환될 수 있으며, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개의 탄화수소기가 치환된다.
화학식 (II)의 치환기는 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체가 시험관 내 및/또는 특히 생체 내에서 효소 DNA 토포이소머라아제 I에 결합하는 특성을 나타내는 한에서는 다양하게 변화할 수 있다.
치환기는 독립적으로 동일하거나 상이하며, 바람직하게는 알킬기, 아릴기, 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR- C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 플루오로(C1-C4)알킬이거나, 또는 2개의 이웃기가 이들을 연결하는 탄소 원자들과 함께 화학식 -O(CH2)uO-의 기를 형성할 수도 있고, 이때, u는 정수 1 또는 2를 의미하며; 이때 R', R", R'" 및 R""는 바람직하게는 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C1-C8)헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴, (비치환된 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환된 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 선택된다. 예컨대, 본 발명의 캄토테신 유사물이 1개 초과의 R기를 포함하는 경우, 각 R기는 독립적으로 R', R", R'" 및 R""기가 1개 초과로 존재하는 경우의 이들 각각과 같이 선택된다. 상기 치환기는 또한 치환될 수 있다. 예컨대, 임의의 기는 1개 이상의 알킬기, 아릴기, 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -SiR'R"R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 플루오로(C1-C4)알킬로 치환될 수 있다.
특히, 치환기는 알킬기, 바람직하게는 저급 알킬기; -OR', 이때 R'은 H; -OC(O)R', 이때 R'은 헤테로알킬기, 더욱 바람직하게는 헤테로시클로알킬기, 예컨대 피페리딘 또는 피페라진기를 포함하는 알킬기; -NR'R" 또는 헤테로알킬기, 더욱 바람직하게는 헤테로시클로알킬기, 예컨대 피페리딘 또는 피페라진기로 치환된 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다; 2개의 이웃기가 이들을 연결하는 탄소 원자들과 함께 화학식 -O(CH2)uO-의 기를 형성할 수도 있으며, 이때 u는 정수 1 또는 2, 바람직하게는 2를 나타낸다.
달리 기술되지 않는 한, 용어 "알킬"은 단독으로 또는 또 다른 치환기의 일부로, 임의로는 O, N, Si 및 S를 포함한 1개 이상의 헤테로원자가 개입된 직쇄 또는 분지쇄형, 또는 고리형 탄화수소 라디칼(아래 정의된 바와 같음), 또는 이들의 조합을 의미하며, 이는 완전히 포화되거나 단일 또는 고도 불포화될 수도 있으며 표시된 개수의 탄소 원자(즉, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미)를 가지는 2가 또는 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 이의 동종물 및 이성질체, 예컨대 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기들이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 불포화 알킬기는 1개 이상의 이중결합(예컨대, 알케닐기) 또는 삼중결합(예컨대, 알키닐기)을 가지는 것이다. 불포화 알킬기의 예에는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3 (1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동종물 및 이성질체가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 달리 기술되지 않는 한, 용어 "알킬"은 또한 이하에 보다 상세히 정의된 알킬의 유도체, 예컨대 "헤테로알킬"을 포함하는 것을 의미한다. 탄화수소기에 한정되는 알킬기는 "호모알킬"이라 칭해진다.
용어 "알킬"은 단독으로 또는 또 다른 치환기의 일부로, 알칸으로부터 유래되는 1가 또는 2가 라디칼을 포함한다. 2가 라디칼 중에는 -CH2-, - CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-가 언급될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
대체로, 알킬기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이며, 본 발명에서는 10개 이하의 탄소 원자를 가지는 기가 바람직하다. "저급 알킬"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 가지는 단쇄 알킬기이다.
달린 기술되지 않는 한, 용어 "헤테로알킬"은 단독으로 또는 또 다른 용어와 조합되어, 표시된 개수의 탄소 원자 및 O, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 헤테로원자로 이루어진 안정한 직쇄 또는 분지쇄, 또는 고리형 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미하며, 이때 질소, 탄소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 선택적으로 4가화(quaternize)될 수 있다.
상기 헤테로원자(들) O, N, S 및 Si는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치에 또는 분자의 나머지 부분에 알킬기가 부착되는 위치에 존재할 수 있다. 이러한 예에는 -CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 및 CH=CH-N(CH3)-CH3가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 규소기는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치에 또는 분자의 나머지 부분에 알킬기가 부착되는 위치에 존재하는 Si를 의미한다. 예컨대 -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-S-(CH3)3와 같이, 2개 이하의 헤테로원자가 연속될 수도 있다.
유사하게, 용어 "헤테로알킬"은 단독으로 또는 또 다른 치환기의 일부로, 헤테로알킬로부터 유래된 2가 라디칼, 예컨대 -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-(이에 한정되는 것은 아님)을 포함한다. 용어 "헤테로알킬"은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 이의 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 2가 알킬 및 헤테로알킬기에 있어서 그 기의 화학식이 쓰여진 방향이 연결기의 지향을 의미하는 것은 아니다. 예컨대, 화학식 -C(O)2R'-은 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2 둘 모두를 나타낸다.
용어 "저급"은 용어 "헤테로알킬"와 조합되는 경우, 1 내지 8개의 탄소 원자를 가지는 모이어티를 의미한다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 통상적인 의미로 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노기, 또는 황 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된 알킬기를 의미한다.
일반적으로, "아실 치환기"는 또한 상기 제시된 군으로부터 선택된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아실 치환기"는 본 발명의 화합물에 직접 또는 간접적으로 부착된 카르보닐 탄소의 원자가를 만족시키며 부착된 기를 의미한다.
달리 기술되지 않는 한, 용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여, 각각 치환 또는 비치환된 "알킬"(더욱 바람직하게는, C1-C10 시클로알킬) 및 치환 또는 비치환된 "헤테로알킬"(더욱 바람직하게는, C1-C10 헤테로시클로알킬)의 고리형을 나타낸다. 아울러, 헤테로시클로알킬에 있어 헤테로원자는 헤테로고리가 분자의 나머지 부분에 부착된 위치를 차지할 수 있다. 시클로알킬의 예에는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 헤테로시클로알킬의 예에는 1-(l,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로퓨란-2-일, 테트라히드로퓨란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고리형 구조의 헤테로원자 및 탄소 원자는 선택적으로 산화된다.
달리 기술되지 않는 한, 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 단독으로 또는 또 다른 치환기의 일부로, 플루오르, 염소, 브롬, 또는 요오드 원자를 의미한다. 아울러, "할로 알킬"과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예컨대, 용어 "할로(C1-C4) 알킬"은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하는 것을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
달리 기술되지 않는 한, 용어 "아릴"은 함께 융합된 또는 공유적으로 연결된 단일 고리 또는 다중 고리(바람직하게는, 1 또는 3개의 고리)일 수 있는 치환 또는 비치환된 고도 불포화 방향족 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 아릴기(또는 고리)를 의미하며, 이때 질소, 탄소 및 황 원자는 선택적으로 산화되고 질소 원자(들)는 선택적으로 4가화된다. 헤테로아릴기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴기의 예에는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-퓨릴, 3-퓨릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 아릴 및 헤테로아릴 고리계 각각에 관한 치환기는 하기 허용가능한 치환기 군으로부터 선택된다. "아릴" 및 "헤테로아릴"은 또한 1개 이상의 비방향족 고리계가 아릴 또는 헤테로아릴계에 융합 또는 결합된 고리계를 포함한다.
요컨대, 용어 "아릴"은 다른 용어와 조합되어 사용되는 경우(예컨대, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬), 상기 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 둘 모두를 포함한다.
따라서 용어 "아릴 알킬"은 탄소 원자(예컨대, 메틸렌기)가 예컨대 산소 원자로 대체된 알킬기(예컨대, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)를 포함한 알킬기(예컨대, 벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등)에 아릴기가 부착된 라디칼을 포함하는 것을 의미한다.
캄토테신, 이의 유사물 및 유도체 중에서, 더욱 바람직하게는 이하의 특허/특허출원에 기재된 화합물이 언급될 수 있다: WO 99/09996, WO 99/65493, WO 00/53607, EP 1 101 765, EP 137,145, EP 074,256, US 4,604,463, EP 56,692, EP 88,642, EP 296,612, EP 321,122, EP 325,247, EP 540,099, EP 737,686, WO 90/03169, WO 96/37496, WO 96/38146, WO 96/38449, WO 97/00876, US 7,104,894, 이들 각각의 명세서는 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.
바람직한 구현예에서, 캄토테신 백본은 상기 정의된 바와 같이 t가 0 이고 Z가 COO기인 화학식 (II)의 것이며, 이는 하기 화학식 (III)으로 표시될 수 있다:
더욱 바람직한 구현예에 따르면, 캄토테신 백본은 하기 화학식 (IV)로 표시된다:
더욱 특히, 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체는 화학식 (III), 더욱 바람직하게는 화학식 (IV)의 캄토테신 백본을 포함하며, 이때 그에 표시된 임의의 탄화수소기는 상기 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.
특히, 캄토테신, 이의 유사물 및 유도체는 이리노테칸, 토포테칸, GI-147211C, SN38, 7-히드록시메틸 캄토테신, 9-아미노캄토테신(9-AC), 7-아미노메틸 캄토테신, 10-히드록시캄토테신 및 (20S)-캄토테신(캄토테신이라 칭함)으로부터 선택된다. 상기 화합물들의 구조는 하기와 같다:
약물 모이어티는 담체 모이어티에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 약물 모이어티가 담체에 간접적으로 연결된 바람직한 구현예에서, 연결기는 하기된 바와 같은 매개 결합기일 수 있고, 이때 그러한 모든 연결기 및 기타 하기의 것들은 이하에서 연결자 모이어티라 칭해지거나, 또는 하기 정의된 가교용 시약으로부터 유래된다.
본 발명에 따르면, 각 담체 모이어티는 1개 이상의 약물 모이어티, 더욱 바람직하게는 하나의 약물 모이어티에 연결된다.
특정 구현예에서, 담체 모이어티는 1개 초과의 약물 모이어티에의 연결을 촉진하도록 제조되며, 이때 각 약물 모이어티는 동일하거나 상이하다. 예컨대, 담체 모이어티는 천연 아미노산, 예컨대 시스테인의 유도체와 같은 1개 초과의 약물 모이어티의 부착, 또는 다가 합성 아미노산 또는 복수의 활성 부위를 가지는 연결자의 삽입을 스스로 촉진하는 성분을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 단일의 담체 모이어티는 2 내지 10개, 또는 더욱 바람직하게는 4 내지 5개의 약물 모이어티를 운반할 수 있다. 이러한 추가의 구현예에서, 각 약물 모이어티는 동일하거나 상이한 연결자 모이어티에 의해 담체 모이어티에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 1개 초과의 서로 다른 유형의 약물 모이어티가 부착되는 경우, 특이적인 약물 조합물의 투여를 촉진하기 위해 개개의 약물의 비율 및 투여량을 조화시킬 수 있다.
직접적 연결은 약물 모이어티 상의 임의의 통상적인 작용기, 예컨대 히드록시, 카르복시 또는 아미노기를 매개로 발생할 수 있다.
간접적 연결이 바람직한데, 이는 연결 모이어티를 매개로 발생한다. 연결 모이어티는 또한 분자 내 유연성을 제공하거나 또는 결합 도메인들 간의 분자 내 거리를 조정할 수 있어 생물학적 활성을 유지하는 데 도움이 될 수 있다. 적절한 연결 모이어티는 독립적으로 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 알데히드, 산, 에스테르, 무수물, 설피드릴 또는 카르복실기로부터 선택되는 2작용성 및 다작용성 유기 라디칼, 예컨대 하기 정의된 바와 같은 말레이미도 유도체, 말레이미도 시클로헥산 유도체, 말레이미도 벤조산 유도체, 말레이미도카프로산 유도체 및 숙신이미도 유도체를 포함하거나, 또는 시아노겐 브로마이드 또는 클로라이드, 숙신이미딜 에스테르 또는 설포닉 할라이드 등, 또는 이들의 조합물로부터 유래될 수 있다.
상기 용어들(예컨대, "알킬", "헤테로 알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴") 각각은 제시된 라디칼의 치환 또는 비치환된 형태 둘 모두를 포함한다. 각 유형의 라디칼에 관한 바람직한 치환기는 아래에 제공되어 있다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼(종종 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐이라 칭해지는 기들을 포함)에 관한 치환기는 일반적으로 각각 "알킬 치환기" 및 "헤테로알킬 치환기"를 의미하며, 이들은 -OR', =O, =NR', =N-OR',-NR'R", -SR', -할로겐, - SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', NRR'SO2R", -CN 및 -NO2로부터 선택(이에 한정되는 것은 아님)되는 0 내지 (2m'+1)개인 1개 이상의 다양한 기들일 수 있으며, 이때, m'은 상기 라디칼 내의 총 탄소 원자 수이다. R', R", R"' 및 R""은 각각 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 예컨대 1 내지 3개의 할로겐, 치환 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기로 치환된 아릴, 또는 아릴알킬기를 의미한다. 예컨대, 본 발명의 화합물이 1개 초과의 R기를 포함하는 경우, 각 R기는 독립적으로 R', R", R'" 및 R""기가 1개 초과로 존재하는 경우의 이들 각각과 같이 선택된다. R' 및 R"이 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5, 6 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예컨대, NR'R"은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치환기에 관한 상기의 논의에 따라, 당업자라면 용어 "알킬"이 수소기를 제외한 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기들, 예컨대 할로 알킬(예컨대,-CF3 및-CH2CF3) 및 아실(예컨대, -C(O)CH3, -C(O)CF3, C(O)CH2OCH3 등)을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 관하여 기재된 치환기들과 유사하게, 아릴 치환기 및 헤테로아릴 치환기는 일반적으로 각각 "아릴 치환기" 및 "헤테로아릴 치환기"를 의미하나 변경되기도 하며, 방향족 고리계의 0 내지 열린 원자가의 총 갯수로, 예컨대 하기로부터 선택된다: 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R"-, OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R''', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬; 이때, R', R", R'" 및 R""은 바람직하게는 독립적으로 수소, (C1-C8) 알킬 및 헤테로알킬, 비치환된 아릴 및 헤테로아릴, (비치환된 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환된 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 선택된다. 예컨대, 본 발명의 연결 모이어티가 1개 초과의 R기를 포함하는 경우, 각 R기는 독립적으로 R', R", R'" 및 R""기가 1개 초과로 존재하는 경우의 이들 각각과 같이 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 이웃 원자들 상의 두 아릴 치환기는 선택적으로 화학식 -T-C(O)-(CRR')v-U-의 치환기로 대체될 수 있으며, 이때 T 및 U는 독립적으로 NR-, -O-, -CRR'- 또는 단일결합이고, v는 0 내지 3 의 정수이다. 다르게는, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 이웃 원자들 상의 상기 두 치환기는 화학식 -A-(CH2)x-B-의 치환기로 대체될 수 있으며, 이때 A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일결합이고, x는 1 내지 4의 정수이다. 상기 형성된 새로운 고리의 단일결합 중 하나는 선택적으로 이중결합으로 대체될 수 있다. 다르게는, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 이웃 원자들 상의 두 치환기는 선택적으로 화학식-(CRR')b-X-(CR"R"')d-의 치환기로 대체될 수 있으며, 이때 b 및 d는 독립적으로 0 내지 3 의 정수이고, X는 -O-, NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2, 또는 -S(O)2NR'-이다. 치환기 R, R', R" 및 R'"는 바람직하게는 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 (C1-C6) 알킬로부터 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로원자"에는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 규소(Si)가 포함된다.
위에서 사용된 바와 같이, 기호 "R"은 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴기로부터 선택되는 치환기를 나타내는 일반적인 약자이다.
한편으로는 연결자와 약물 간의, 다른 한편으로는 연결자와 담체 모이어티 간의 공유결합을 형성하는 데 사용되는 연결자 모이어티 상의 작용기(즉, 반응성기)는 더욱 특히 아미노, 히드라지노, 히드록실, 티올, 말레이미도, 카르보닐 및 카르복실기를 포함한 동일한 작용기(즉, 호모작용기) 또는 바람직하게는 다른 유형의 작용기(즉, 헤테로작용기)일 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 작용기는 카르복실기(-COOH) 및 말레이미도기로부터 선택된다. 연결자 모이어티는 선택적으로 연결자 모이어티가 담체 모이어티에 결합하는 매개인 티올기를 포함하는 아미노산 잔기 1 내지 4개의 짧은 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 담체 모이어티와 약물 모이어티의 결합은 가교용 시약을 통해 이루어질 수 있다. 이용될 수 있는 여러 분자 간 가교용 시약들이 있으며, 예컨대, 문헌[Means 및 Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43]을 참조하도록 한다. 상기 시약 중에는 예컨대, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP) 또는 N,N'-(1,3-페닐렌)비스말레이미드(둘 모두 설프히드릴기에 매우 특이적이며 비가역적 연결을 형성); N,N'-에틸렌-비스-(요오도아세트아미드) 또는 6 내지 11개의 탄소 메틸렌 브릿지를 가지는 기타 시약들(설프히드릴기에 비교적 특이적); 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(아미노 및 티로신기와 비가역적 연결을 형성)이 있다. 상기 목적에 유용한 기타 가교용 시약에는 하기가 포함된다: p,p'-디플루오로-N,N'-디니트로디페닐설폰(아미노기 및 페놀기와 비가역적 가교를 형성); 디메틸 아디프이미데이트(아미노기에 특이적); 페놀-1,4-디설포닐클로라이드(주로 아미노기와 반응); 헥사메틸렌디이소시아네이트 또는 디이소티오시아네이트, 또는 아조페닐-p-디이소시아네이트(주로 아미노기와 반응); 글루타르알데히드(다양한 측쇄들과 반응) 및 디스디아조벤지딘(주로 티로신 및 히스티딘과 반응); N-3-말레이미도프로판산; N-6-말레이미도카프로산; N-11-말레이미도운데칸산, 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-6-아미도카프로산; 4-[(N-말레이미도에틸)카르복스아미도에틸(Peg)4 카르복스아미도메틸]시클로헥산카르복실산.
전기된 바와 같이, 가교용 시약은 동종이작용성(homobifunctional), 즉 동일한 반응을 수행하는 2가지 작용성을 가질 수 있다. 동종이작용성 가교용 시약의 예는 비스말레이미도헥산("BMH")이다. BMH는 2개의 말레이미드 작용기를 포함하며, 이는 온화한 조건(pH 6.5 내지 7.7) 하에 설프히드릴 함유 화합물과 특이적으로 반응한다. 상기 두 말레이미드기는 탄화수소쇄에 의해 연결된다. 따라서 BMH는 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드의 비가역적 가교에 유용하다. 가교용 시약은 또한 이종이작용성(heterobifunctional)일 수도 있다. 이종이작용성 가교용 시약은 각각 자유 아민 및 티올을 가지는 두 모이어티를 가교하는 2개의 다른 작용기, 예컨대 아민-반응성기 및 티올-반응성기를 가진다. 바람직한 이종이작용성 가교용 시약은 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트("SMCC"), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시(6-아미도카프로에이트)("LC-SMCC"), N-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르("MBS"), 및 숙신이미드 4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트("SMPB"), MBS의 연장쇄 유사물이다. 상기 가교용 시약의 숙신이미딜기는 아미드 결합을 형성하는 1차 아민과 반응하며, 티올-반응성 말레이미드는 (예컨대, 시스테인의) 티올기와 공유 티오에테르 결합을 형성한다.
가교용 시약은 종종 수중 용해도가 낮다. 친수성 모이어티, 예컨대 설포네이트기는 가교용 시약에 첨가되어 수중 용해도를 향상시킬 수 있다. 수중 용해도에 관하여 개질된 가교용 시약의 예는 설포-MBS 및 설포-SMCC이다.
다수의 가교용 시약은 본래 세포 내 조건 하에 비분해성인 결합체를 생성한다. 그러나 일부 가교용 시약은 세포 내 조건 하에 분해성인 공유결합, 예컨대 디설피드를 포함한다. 예컨대, 트라우트 시약(Traut's reagent), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)("DSP"), 및 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트("SPDP")가 널리 공지된 분해성 가교용 시약이다. 직접적 디설피드 연결이 또한 유용할 수도 있다.
상기된 것들을 포함한 다수의 가교용 시약들이 시판 중이다. 이들의 사용에 관한 상세한 설명서는 판매자로부터 입수 가능하다. 단백질 가교 및 결합체 제조에 관한 주요 참고문헌은 다음과 같다: [Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING, CRC Press (1991)].
본 발명에 따라 사용될 수 있는 연결자들은 결합되는 경우 생물학적 유체(예컨대, 인간 혈장) 중 안정성 면에서 서로 상이할 수 있다. 용어 "안정성"은 본 발명의 결합체로부터의 캄토테신 유도체 방출의 반감기로 정의되며, 이는 선택된 연결자에 의존적이다. 유리하게는, 본 발명의 결합체가 안정하며, 특히 이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 시간의 반감기를 나타낸다. 불안정성 결합체는 보다 짧은 반감기, 예컨대 < 5 분을 가지는 약물 모이어티를 방출할 것이다. 고안정성 결합체는 11 시간 초과의 혈장 반감기를 가진다. 바람직하게는, 상기 결합체는 시험관 내 인간 혈장에서 안정하여 37℃에서 약 1 내지 6.5 시간의 반감기를 가진다. 결합체의 반감기는 실시예 II에 기재된 바와 같이 측정된다.
본 발명의 바람직한 이종이작용성 가교용 시약은 자유 -COOH기 및 자유 말레이미드기를 포함한다. 상기 가교용 시약 중에는, 하기 화합물들이 언급될 수 있다:
아울러 더욱 특히, 본 발명의 결합체는 하기의 가교용 시약으로부터 유래된다:
이러한 관점에서, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 화학식 (V)으로 표시되는, 특히 가교용 시약으로 적합한 신규 화합물, 이의 염 및/또는 이성질체에 관한 것이다:
상기식에서, B는 치환 또는 비치환된 시클로알킬기이고, R1 및 R2는 독립적으로 부재(즉, 공유 결합)하거나 또는 치환 또는 비치환된 2가 알킬, 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기이다.
상기 가교용 시약은 그로부터 수득된 결합체가 유리하게는 37℃에서 5 분 초과의 반감기를 가지며 시험관 내 인간 혈장 중에서 안정하므로 매우 유용하다.
화학식 (V)의 표시된 기들은 상기 정의된 바와 같다.
특정 구현예에서, 상기 화합물은 화학식 (V)로 표시되며, 이때 R1 은 치환 또는 비치환된 2가 알킬, 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기이고, R2는 부재하거나 또는 치환 또는 비치환된 2가 알킬, 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기이다.
또 다른 특정 구현예에서, 상기 화합물은 화학식 (V)로 표시되며, 이때 1개 이상의 R1 및 R2는 -O-, -NR'-, -SR'-, -SiR'R"-, -OC(O)-, -C(O)-, -CO2-, -CONR'-, - NR'CO-, -OC(O)NR'-, -NR"OC(O)-, 및 NR"C(O)2-로부터 선택되는 1개 이상의 2가 라디칼이 개입되며, 이때 R' 및 R"은 독립적으로 상기 정의된 바와 같고, 특히 R' 및 R"은 상기 정의된 바와 같이 수소, (C1-C8)알킬, (C1-C8)헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택된다.
R1 및/또는 R2가 1개 이상의 2가 라디칼로 개입되어 있는 경우, 상기 개입은 R1 및/또는 R2기의 임의의 내부 위치에 또는 R1 및/또는 R2기가 화학식 (V)의 화합물의 나머지 부분에 부착되는 위치에 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기와 같은 화학식 (V)의 화합물에 관한 것이다:
- B는 시클로(C3-C8)알킬, 바람직하게는 비치환된 시클로알킬, 예컨대 시클로펜틸 또는 시클로헥실 라디칼이고/거나,
- R1은 특히 폴리(에틸렌 글리콜)(즉, PEG) 및 이의 유도체, 예컨대 PEG-3, -4, -5, 또는 -6을 포함한 헤테로알킬기이고/거나.
- R1은 직쇄형 (C1-C8) 알킬쇄, 특히 -CH2- 또는 -CH2CH2-이고/거나,
- R1은 선택적으로 -OC(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'-, 및 -NR"C(O)2-, 바람직하게는 -CONR'- 또는 -NR"OC(O)-로부터 선택되는 1개 이상의, 바람직하게는 1 또는 2개의 2가 라디칼이 개입된 (C1-C8) 알킬쇄로서, 이때 R' 및 R"는 상호 독립적으로 바람직하게는 수소 및 (C1-C8)알킬로부터 선택되며, 선택적으로 상기 (C1-C8) 알킬쇄는 상기 정의된 바와 같은 1개 이상의 시클로알킬쇄를 포함하고/거나,
- R2는 부재하고/거나,
- R2는 특히 폴리(에틸렌 글리콜)(즉, PEG) 및 이의 유도체, 예컨대 PEG-3, -4, -5, 또는 -6을 포함한 헤테로알킬기이고/거나,
- R2는 직쇄형 (C1-C8) 알킬쇄, 특히 -CH2- 또는 -CH2CH2-이고/거나,
- R2는 선택적으로 -OC(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'- 및 -NR"C(O)2-, 바람직하게는 -CONR'- 또는 -NR"OC(O)-로부터 선택되는 1개 이상의, 바람직하게는 1 또는 2개의 2가 라디칼이 개입된 (C1-C8) 알킬쇄로서, 이때 R' 및 R"은 상호 독립적으로 바람직하게는 수소 및 (C1-C8)알킬로부터 선택되며, 선택적으로 상기 (C1-C8) 알킬쇄는 상기 정의된 바와 같은 1개 이상의 시클로알킬쇄를 포함한다.
특히, 화학식 (V)의 화합물은 상기 화합물들로, 즉 하기와 같이 표시될 수 있다:
4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-6-아미도카프로산,
4-[(N-말레이미도에틸)카르복스아미도에틸(Peg)4카르복스아미도메틸]시클로헥산카르복실산,
4-[(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-6-아미도헥산카르복스아미도 메틸]시클로헥산카르복실산, 또는
4-[((N-말레이미도메틸)시클로헥산카르복스아미도)메틸]시클로헥산카르복실산.
화학식 (V)의 화합물은 당업계에 널리 공지된 다양한 방법들에 의해 제조될 수 있다. 특히, 화학식 (V)의 화합물은 실시예에 기재된 방법들에 의해 제조된다.
본 발명의 특정 양상에 따르면, 결합체는 상기 정의된 바와 같이 담체 모이어티에 연결된 약물 모이어티를 포함하며, 이때 약물 모이어티는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (V)의 화합물(가교용 시약) 유래의 연결자를 가지는 담체 모이어티와 공유적으로 연결된다.
본 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 결합체는 더욱 특히는 하기 화학식 (VI)로 표시된다:
상기식에서, X는 상기 정의된 바와 같은, 특히 화학식 (I)로 표시되는 담체 모이어티(CPP)이며, 이는 티오에테르 결합에 의해 화합물의 나머지 부분에 부착되고,
B, R1, R2는 상기 정의된 바와 같은 기이고, 및
Y는 상기 정의된 바와 같은 약물 모이어티, 특히 SN38 모이어티이다.
추가의 특정 구현예에서, 결합체는 화학식 (VI)로 표시되며, 이때 Y는 티오에테르, 히드라존, 아미드, 에스테르, 에테르, 카르바메이트 또는 티오카르바메이트 결합을 통해, 더욱 특히는 에테르 결합(-O-), 디설피드 또는 티오에테르 결합을 통해 결합체의 나머지 부분에 부착된다.
화학식 (VI)의 것을 포함하여 본원에 기재된 결합체는 신규의 화학체이다.
본 발명의 특정 양상에서, 본 발명의 결합체는 담체 모이어티가 화학식 (I)(상기된 임의의 바람직한 구현예를 포함)로 표시되고 선택적으로 연결자 기가 자유 -COOH기 및 자유 말레이미드기를 포함하는 가교용 시약, 특히 N-6-말레이미도카프로산 및 4-[((N-말레이미도메틸)시클로헥산카르복스아미도)메틸]시클로헥산카르복실산으로부터 유래되는 것들을 포함한다.
본원에 개시된 특정 화학체에는 하기가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다:
상기식에서, X는 상기 정의된 바와 같으며, 특히 DPV3, DPV3.10, DPV6, DPV7, DPV7b, DPV15, DPV15b, DPV1047, DPV1048, DPV10 또는 DPV10/6, 더더욱 바람직하게는 DPV3, DPV15, DPV15b 또는 DPV1047이다.
본 발명은 또한 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 결합체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
예컨대, 담체 모이어티(또는 펩티드)는 통상의 용액상 또는 고체상 펩티드 합성법을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 펩티드는 이후 약물 모이어티, 약물 모이어티의 적절한 반응성 유도체, 또는 가교용 시약과 직접적으로 반응할 수 있다.
약물 모이어티 또는 이의 유도체는 예컨대 티오에테르, 히드라존, 아미드, 에스테르, 에테르, 카르바메이트, 티오카르바메이트 또는 디설피드 결합 형성을 통해 담체 모이어티에 부착될 수 있다.
다르게는, 상기된 바와 같은, 특히 화학식 (VI)의 결합체를 제조하는 데 사용되는 연결자 기가 가교용 시약, 특히 화학식 (V)의 가교용 시약과 담체 모이어티의 적절한 작용기, 특히 티올기와의 반응에 의해 도입된 다음, 연결자 기와 약물 모이어티 간의 공유 결합이 형성된다. 화학식 (VI)의 결합체의 특정 구현예에서, 약물은 적절한 작용을 제공하여 연결자와 공유 결합을 형성한다. 상기 적절한 작용은 더욱 바람직하게는 연결자 기와 약물 모이어티 간의 에스테르 결합을 형성하기 위한 히드록실기이다. 다가 약물-전달 결합체는 특히, 예컨대 2가 또는 3가 화학기를 이용한 담체 모이어티의 적절한 작용의 연속적인 연장에 의해 수득될 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 가교용 시약은 담체 모이어티와의 반응 이전에 약물 모이어티와 결합한다.
이러한 방법들을 사용하여, 당업자는 다양한 연결자 모이어티를 이용하여 매우 다양한 약물-담체 결합체를 제조할 수 있을 것이다. 이하 예시된 바와 같이, 약물 모이어티 상의 적절한 기는 담체 모이어티에의 부착 및 원한다면 약물 또는 담체 모이어티에 연결된 연결자에, 또는 결합 이전에는 둘 모두에 관련하여 선택될 수 있다. 다르게는, 약물은 또한 개질화되어 결합을 야기할 수 있다.
본 발명의 결합체는 다양한 방법에 의해 수의학적, 예컨대 포유류, 특히 인간용 제약물로서의 사용을 위한 생리학적으로 허용가능한 지지체, 전달체 또는 부형제를 이용하여 제형될 수 있다.
본 발명은 하기 정의된 바와 같은 치료학적 치료에 관한 본 발명의 결합체의 용도에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 범위는 상기된 바와 같은 장애의 치료 또는 예방용 약제(또는 제약물)의 제조에 관한 본 발명의 화합물의 용도까지 확장된다. 따라서 본 발명의 결합체는 투여에 적합한 조성물, 바람직하게는 약학 조성물 내로 혼입될 수 있다. 상기 조성물은 대체로 본 발명에 따른 결합체, 또는 결합체와 선택적으로 약학적으로 허용가능한 전달체의 혼합물을 1개 이상 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 전달체"는 약학적 투여와 호환성이 있는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것을 의미한다. 상기 매질 및 제제들의 약학적 활성물질에 관한 용도는 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 본 발명의 활성 결합체와 호환성이 없는 경우는 제외하고는, 상기 조성물에 있어 그들의 사용이 예상된다. 보충적인 활성 화합물이 또한 조성물 내에 혼입될 수 있다.
본 발명의 조성물, 바람직하게는 약학 조성물은 원하는 투여 경로와 호환 가능하도록 제형된다. 투여 경로의 예에는 정맥 내 주사 또는 주입, 피내(皮內), 피하, 복강 내, 근육 내, 경구(예컨대, 흡입), 경피성(예컨대, 국소성), 두개(頭蓋) 내, 척수 내, 및 경점막성 투여가 포함된다. 상기 투여 경로에 사용되는 용액 또는 현탁액에는 하기 성분들이 포함될 수 있다: 살균 희석제, 예컨대 주입용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 비설피트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충용액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 긴장성 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 포도당. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조절할 수 있다. 비경구 제제는 앰풀, 1 회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱 재질의 다중 투여 바이알에 담을 수 있다.
주사 용도에 적합한 약학 조성물에는 살균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 살균 주사용액 또는 분산액 즉석 제조용 살균분말이 포함된다. 정맥 내 투여에 관하여, 적절한 전달체는 생리 식염수, 세균 발육 저지용수, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에 있어, 조성물은 살균되어야 하고, 투여 가능할 정도로 유동성이 있어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하고, 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 전달체는, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예컨대 레시틴과 같은 코팅제를 사용하여, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기가 유지되도록 하여, 및 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 미생물의 상기 작용은 여러 항균제 및 항진균제, 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 방지할 수 있다. 많은 경우, 조성물 중에 등장제, 예컨대 당, 마니톨과 같은 폴리알콜, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 지연된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
살균 주사용액은 상기 성분들 중 하나 또는 그 조합을 포함하는 적절한 용매에 필요량의 본 발명의 결합체를 혼입한 후, 필요에 따라 여과액을 살균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기된 바와 같은 필요한 기타 성분들을 포함하는 살균 전달체에 본 발명의 활성 결합체를 혼입함으로써 제조된다. 살균 주사용액 제조용 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이의 기 살균 여과시킨 용액으로부터의 임의의 원하는 추가 성분을 생성하는 진공건조 및 동결건조이다.
경구용 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 전달체를 포함한다. 이는 젤라틴 캡슐에 봉해지거나 정제로 압착될 수 있다. 경구 치료 투여의 목적에 있어, 본 발명의 활성 결합체는 부형제와 혼합되어 정제, 트로키 또는 캡슐 형태로 사용될 수 있다. 경구용 조성물은 또한 구강세정용 유체 전달체를 사용하여 제조될 수 있으며, 이때 유체 전달체 중의 본 발명의 결합체는 경구 적용되거나, 뿌려지거나, 뱉어지거나, 삼켜진다. 약학적으로 호환가능한 결합제 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 트로키 등은 임의의 하기 성분들, 또는 유사한 천연물의 화합물들을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정질 셀룰로오스, 트래거캔스 고무 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 녹말 또는 락토오스, 알긴산과 같은 붕괴제, 프리모겔 또는 옥수수 녹말; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로트; 유동화제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 자당 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료.
흡입에 의한 투여에 있어, 본 발명의 결합체는 적절한 추진제, 예컨대 이산화탄소와 같은 기체를 포함하는 압력용기 또는 분배기, 또는 흡입기로부터의 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
또한 침투성 투여는 경점막성 또는 경피성 수단에 의할 수 있다. 경점막성 또는 경피성 투여에 있어, 장벽을 침투하는 데 적합한 침투제가 제형 중에 사용된다. 상기 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 경점막성 투여의 경우 세정제, 담즙, 염 및 퓨시드산 유도체를 포함한다. 경점막성 투여는 비강내 스프레이 또는 좌제를 사용하여 이루어질 수 있다. 경피성 투여에 있어, 본 발명의 활성 결합체는 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 연고, 샐브, 겔, 또는 크림으로 제형된다.
본 발명의 결합체는 또한 (예컨대, 코코아 버터 및 기타 글리세리드와 같은 통상의 좌제 원료를 포함하는) 좌제 또는 직장내 전달용 정체 관장제의 형태로 제조될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 활성 결합체는 임플란트 및 마이크로 또는 매크로 캡슐화 전달계를 포함하여 몸으로부터의 빠른 제거에 대응하여 본 발명의 결합체를 보호하는 전달체, 예컨대 제어 방출형 제형을 이용하여 제조된다.
에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리악트산, 또는 이들의 조합물과 같은 생분해성, 생호환성 중합체가 사용될 수 있다.
상기 제형들의 제조 방법은 당업자에게 자명할 것이다.
상기 물질들은 예컨대 Alza Corportion사에 의해 시판되고 있으며, 또한 약학적으로 허용가능한 전달체로서 사용될 수 있다. 이들은 예컨대 U.S. 특허번호 4,522, 811에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위한 투여 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같이 투여 단위 형태는 치료 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합한, 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 본 발명의 활성 결합체를 소정량 함유하는 각 단위는 필요한 약학 전달체에 관하여 원하는 치료효과를 나타내도록 계산된 것이다. 본 발명의 투여 단위 형태에 관한 상세사항은 본 발명의 활성 결합체의 고유의 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료효과, 및 개체의 치료에 관한 본 발명의 활성 결합체의 합성 분야 고유의 제한사항에 따라 달라지고 그에 직접적으로 의존적이다.
상기와 같은 본 발명의 결합체의 독성 및 치료학적 효능은, 예컨대 MTD(최대 내성 용량), TGI(종양 성장 억제, 100-T/C (%)로 정의되는 TGI%) 및 T/C(치료 동물의 평균 종양 부피 대 대조군의 평균 종양 부피의 비)를 측정하기 위한 세포 배양 또는 실험용 동물 모델에 관한 표준 제약 절차에 의해 측정될 수 있다. 치료효과와 독성 간의 용량비는 치료 지수이며, 이는 ED50/LD50 비로 나타낼 수 있다. 본 발명의 결합체는 치료학적 지수가 크게 나타날수록 바람직한 것이다. 독성 부작용을 나타내는 본 발명의 결합체가 사용될 수도 있으나, 이러한 본 발명의 결합체를 손상받은 조직 부위로 유도하는 전달계를 설계하여 비종양 세포에 대한 잠재적 손상을 최소함으로써 부작용을 감소시키도록 치료가 이루어져야 한다.
동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간 용도의 투여량 범위를 정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 본 발명의 결합체의 투여량은 바람직하게는 무독성 또는 허용 가능한 유효 용량 수준을 포함하는 범위 내이다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라지는 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용되는 임의의 본 발명의 결합체에 있어, 치료학적 유효량은 우선 동물 모델에 관한 어세이로부터 측정될 수 있다. 그 정보는 인간에 유용한 용량을 보다 정확하게 측정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 결합체를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량(즉, 효과적인 투여량)은 당업자에 의해 용이하게 측정된다. 예컨대, 치료학적 유효량은 이종이식된 인간 암의 종양 성장을 20 퍼센트 이상 억제하는 양이다. 특정 구현예에서는, 보다 높은 억제 백분율, 예컨대 45, 50, 75, 85, 90 퍼센트 또는 그 이상이 바람직할 수 있다. 예시 용량에는 대상체 체중 킬로그램 당 본 발명의 화합물의 밀리그램 또는 마이크로그램량(예컨대, 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 1 그램, 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 50 마이크로그램, 또는 킬로그램 당 약 50 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 5 밀리그램)이 포함된다. 조성물은 약 1 내지 10 주, 예컨대 2 내지 8 주, 또는 약 3 내지 7 주 동안, 또는 약 4, 5, 또는 6 주 동안, 주당 1 회 이상, 또는 매일 또는 2, 3, 4, 5 또는 6 일에 1 회 투여될 수 있다.
당업자라면 질병 또는 장애의 정도, 치료력, 대상체의 일반 건강 및/또는 연령, 및 기타 보유 질병(이에 한정되는 것은 아님)을 포함하는 특정의 인자들이 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 아울러, 치료학적 유효량의 조성물을 이용한 대상체의 치료에는 단일 치료 또는 일련의 치료들이 포함될 수 있다.
또한 조성물의 적절한 투여량이 발현도 또는 활성의 조절에 관한 조성물의 효능에 따라 달라짐은 공지된 것이다.
이러한 하나 이상의 본 발명의 화합물을 동물(예컨대, 인간)에 투여하고자 하는 경우, 예컨대 의사, 수의사 또는 연구자는 우선 비교적 낮은 용량을 처방한 다음 적절한 반응이 수득될 때까지 용량을 증가시킬 수 있다. 아울러, 임의의 특정 대상체에 특이적인 용량 수준은 사용되는 특정의 본 발명의 화합물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식습관, 투여 시간, 투여 경로, 분비 속도, 임의의 약물 조합, 및 발현도 또는 활성의 조절 정도를 포함하는 다양한 인자들에 따라 달라질 것임이 공지되어 있다.
약학 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 팩 또는 분배기에 담을 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 화합물은 치료학적 유효량으로, 다른 치료학적 식이요법 또는 제제(예컨대, 복합 약물 식이요법)와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 특히, 다른 치료학적 식이요법 또는 제제는 항암치료 또는 약물, 예컨대 5-플루오로우라실, 류코보린, 옥살리플라틴, 카페시타빈, 빈크리스틴, 셀레브렉스, 테모졸로미드, 올리고요소(예컨대, 셀레늄), 탈리도미드, 세툭시맙, 겜시타빈, 도세탁셀, 3-AP(Triapine®), 카르보플라틴, 보르테조밉, 베바시주맙, 소라페닙, 시스플라틴, 게피티닙, 플라보피리돌, 엘보린, 카르보플라틴, 암루비신, 트라스투주맙, 페메트렉세드, 에를로티닙, 미토마이신 C, AMG706, 파니투맙, 파클리탁셀, 랄티트렉세드, 이마티닙, 아브식시맙, 인픽시맙, 팔리비주맙, 리툭시맙, 겜투주맙 오조가미신, 알렘투주맙 또는 이브리투모맙 티욱세탄에 상응한다.
동시 투여가 수행되는 경우, 활성 제제는 동일하거나 상이한 조성물로 투여될 수 있다. 이러한 동시 치료는 치료학적 이점의 증가 및/또는 독성의 감소를 목적으로 한다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 방사선 요법 및 동시 또는 순차적으로 투여되는 본 발명의 화합물의 조합에 관한 것이다.
또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 질병, 특히 암의 치료에 관한 약학 조성물의 제조에 있어 상기 정의된 바와 같은 유효량의 1개 이상의 본 발명의 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 용도에 관한 바람직한 화합물은 상기 정의된 바와 같은 임의의 하위기 및 상기된 바와 같은 임의의 특정 화합물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 치료 방법으로서, 이는 그러한 치료가 필요한 환자에게 상기된 바와 같은 유효량의 1개 이상의 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 결합체에 포함된 약물 모이어티로 인해, 본 발명의 결합체는 다양한 조건 하에 다양한 질병을 치료하는 데 적합하다. 이러한 관점에서, "치료" 또는 "치료하는 것"은 치료학적 및 예방적 치료 둘 모두를 포함한다. 따라서, 결합체는 질병의 매우 초기 단계에, 또는 전이를 포함한 상당한 진행 이후에 사용될 수 있다. 용어 "치료" 또는 "치료하는 것"은 특히, 환자의 부담 감소, 예컨대 세포 증식 속도의 감소, 병든 증식 세포의 파괴, 종양 질량 또는 종양 크기의 감소, 종양 전이의 감소, 종양 진행의 지연과 더불어 완전한 종양 억제, 생존률 향상, 또는 임의의 기타 적절한 임상적 종점을 의미한다.
본 발명의 결합체는 특히 암, 예컨대 고체 종양 또는 림프성 종양의 치료에 적합하다. 구체적인 예에는 결장암, 폐암(즉, 소세포암, 비소세포암, 기관지암), 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암, 간암, 두경부암, 위암, 방광암, 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 흑색종, 백혈병, 신경모세포종 및 아교모세포종이 포함된다.
결합체는 여러 경로에 의해, 대체로 주입, 예컨대 침투성 주입(들)에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 15 분에서 길면 1 또는 2 일간 볼루스 또는 주입에 의한 정맥 내이다. 그러나 또한 다른 투여 경로들, 예컨대 근육 내, 피 내, 피하, 종양 내 등이 사용될 수 있다. 아울러, 필요하다면 반복 주입이 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암이 있는 대상체에 유효량의 본 발명에 따른 결합체를 투여함으로써 암 세포 증식을 저감시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전이암 치료가 필요한 대상체에 유효량의 본 발명에 따른 결합체를 투여함에 따른 전이암 치료 방법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전이암의 치료 또는 암 세포 증식의 저감을 위한 약학 조성물의 제조에 관한 상기 정의된 바와 같은 결합체의 용도이다.
본 발명의 다른 양상 및 이점들은 이하의 실시예에서 개시될 것이며, 이는 예시적인 것으로 간주되어야 하며 본원의 범위를 제한하는 것이 아니다.
I. 재료 및 방법
I.1a 세포침투성 펩티드(CPP)
DPV3: Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser (서열 번호 1)
DPVI047: Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val (서열 번호 8)
DPV15: Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (서열 번호 10)
DPV15b: Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (서열 번호 11)
DPV7: Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro (서열 번호 3)
Tat48-60: Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln (서열 번호 44)
페너트라틴: Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys (서열 번호 29)
DPV51(D): D-Lys D-Arg Gly D-Leu D-Lys D-Leu D-Arg D-His (서열 번호 51)
DPVI047(D): Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val (D 배열의 서열 번호 8)
CPP와 연결자-SN38 모이어티(실시예 I.4 참조) 간의 결합을 가능케 하기 위해서는 하기와 같아야 한다:
- DPV3, DPV15, DPV7 및 Tat48-60은 아미노산 서열의 C 말단 위치에 시스테인(Cys)을 추가로 포함,
- DPV1047, DPV15b, 페너트라틴 및 DPV51은 아미노산 서열의 N 말단 위치에 시스테인(Cys)을 추가로 포함.
아미노산 서열은 [Neosystem, France]에 의해 합성되었다.
I.1b 비세포침투성 펩티드
폴리E(16): Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu (서열 번호 52)
폴리E(16)과 연결자-SN38 모이어티(실시예 I.4 참조) 간의 결합을 가능케 하기 위해서는, 폴리E(16)은 아미노산 서열의 N 말단 위치에 시스테인(Cys)을 추가로 포함한다.
아미노산 서열은 [Neosystem, France]에 의해 합성되었다.
I.2 연결 모이어티 (연결자)
연결자 #1:
N-3-말레이미도프로파노산
(PIERCE, France, 제품 Ref: 22296)
연결자 #2 ("MIC"로도 칭해짐):
N-6-말레이미도카프로산
(SIGMA, France, 제품 Ref: M8904)
연결자 #3:
N-11-말레이미도운데카노산
(PIERCE, France, 제품 Ref: 22211)
연결자 #4:
4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-6-아미도카프로산
연결자 #5 ("
BCH
"로도 칭해짐):
4-[((N-말레이미도메틸)시클로헥산카르복스아미도)메틸]시클로헥산카르복실산
연결자 #6:
4-[(N-말레이미도에틸)카르복스아미도에틸(Peg)4카르복스아미도메틸]시클로헥산카르복실산
연결자 #7:
4-[(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-6-아미도헥산카르복스아미도 메틸]시클로헥산카르복실산
I.3 연결자 4 내지 7의 합성
I.3.1 연결자 #4의 합성
숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트(PIERCE Ref: 22360)(25 mmol)의 DMF(100 mL) 중 용액을 5 분간 교반한 후, 실온에서 6-아미노헥 사노산(50 mmol)(SIGMA Ref: A2504)의 H2O(50 mL) 중 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄을 첨가하고(100 mL) 유기층을 물(3x150 mL), 이어서 5 % 수성 시트르산(3x150 mL)으로 세정하여 여분의 6-아미노헥사노산을 제거하였다. 유기층을 진공 하에 건조시킨 후 수득된 백색 분말을 -20 ℃에 보관하였다.
I.3.2 연결자 #5("BCH")의 합성
숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트(PIERCE Ref: 22360)(25 mmol)의 DMF(100 mL) 중 용액을 5 분간 교반한 후, 실온에서 트랜스-4-(아미노메틸)시클로헥산카르복실산(50 mmol)(SIGMA ref: 08455)의 H2O(50 mL) 중 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄을 첨가하고(100 mL) 유기층을 물(3x150 mL), 이어서 5 % 수성 시트르산(3x150 mL)으로 세정하여 여분의 트랜스-4-(아미노메틸)시클로헥산카르복실산을 제거하였다. 유기층을 진공 하에 건조시킨 후 수득된 백색 분말을 -20 ℃에 보관하였다.
I.3.3 연결자 #6의 합성
Mal-dPeg4-NHS(Quanta BioDesign Ref: 10214)(25 mmol)의 DMF(100 mL) 중 용액을 5 분간 교반한 후, 실온에서 트랜스-4-(아미노메틸)시클로헥산카르복실산(50 mmol)(SIGMA ref: 08455)의 H2O(50 mL) 중 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄을 첨가하고(100 mL) 유기층을 물(3x150 mL), 이어서 5 % 수성 시트르산(3x150 mL)으로 세정하여 여분의 트랜스-4-(아미노 메틸)시클로헥산카르복실산을 제거하였다. 유기층을 진공 하에 건조시킨 후 수득된 백색 분말을 -20 ℃에 보관하였다.
I.3.4 연결자 #7의 합성
숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복시-[6-아미도카프로에이트])(PIERCE Ref: 22362)(25 mmol)의 DMF(100 mL) 중 용액을 5 분간 교반한 후, 실온에서 트랜스-4-(아미노메틸)시클로헥산카르복실산(50 mmol)(SIGMA ref: 08455)의 H2O(50 mL) 중 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄을 첨가하고(100 mL) 유기층을 물(3x150 mL), 이어서 5 % 수성 시트르산(3x150 mL)으로 세정하여 여분의 트랜스-4-(아미노메틸)시클로헥산카르복실산을 제거하였다. 유기층을 진공 하에 건조시킨 후 수득된 백색 분말을 -20 ℃에 보관하였다.
I.4 캄토테신 및 이의 유도체
I.5 CPP-연결자-SN38 결합체의 제조 방법
CPP-연결자-SN38 결합체를 하기 방법에 따라 제조하였다. 상기된 다양한 연결자를 사용하여 다양한 CPP를 SN38에 결합시키는 데에는 동일한 방법을 사용하였다.
10-O-연결자-SN38의 제조
SN38 및 "연결자"는 N-메틸-2-피롤리디논 중 O-(1H-6클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄에 의해 매개되는 축합을 수행한다. 디클로로메탄을 이용한 추출 및 수성 세정에 의한 N-메틸-2-피롤리디논 제거 이후, 연결자-SN38 중간체를 디클로로메탄/메틸 tert-부틸 에테르로부터 침전에 의해 분리 및 정제하였다.
합성 경로의 예는 하기와 같다:
연결자(15.29 mmol, 예컨대 MIC의 경우 3.23 g) 및 O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄(HCTU)(6.1 g, 14.74 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(DIPEA)(5.4 mL, 30.9 mmol)의 N-메틸-2-피롤리디논(NMP)(50 mL) 중 용액을 0 ℃에서 15 분간 교반하였다. 그 반응 혼합물에 SN38(5 g, 12.75 mmol)을 황색 고체 분말로서 첨가하였다. 그 혼합물을 0 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 그 용액을 디클로로메탄(130 mL) 중에 취한 다음, 1 M NaCl(3x130 mL), 이어서 5 % 수성 시트르산(3x130 mL)으로 연속 추출하였다. 유기층을 0 ℃에서 메틸 tert-부틸 에테르(MTBE)(600 mL)에 (30 분 이상에 걸쳐) 서서히 첨가하였다. 이어서 형성된 황색 침전물을 여과한 후 진공(200 mBar) 하에 밤새 건조시켰다.
CPP의 10-O-연결자-SN38에의 결합
연결자-SN38 모이어티를 CPP에 결합하여 CPP-연결자-SN38 결합체의 DMF(디메틸 포름아미드) 중 혼합물을 수득하였다. 생성물을 수중에서 추출한 후 동결건조하여 황색 고체를 수득하였다.
합성 경로의 예는 하기와 같다:
CPP-SH(5.69 mmol), 예컨대 N-말단 위치에 시스테인을 함유하는 DPV1047(21.49 g)의 디메틸포름아미드(DMF)(200 mL) 중 용액을 실온에서 5 분간 교반하였다. 이어서 10-O-연결자-SN38(5 g, 8.54 mmol)을 황색 고체 분말로서 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고(200 mL) 수성층을 디클로로메탄(5x150 mL)으로 추출하여 여분의 10-O-연결자-SN38을 제거하였다. 수성층을 -80 ℃에서 4 시간 동안 보관한 다음, 동결건조시켰다. CPP-연결자-SN38 결합체를 -20 ℃에서 보관하였다. CPP-연결자-SN38의 최종 수득량을 HPLC에 의해 측정하였다. SN38 표준 곡선(364 nm)과 비교하여 최종 수득량을 계산하였다.
10-O-연결자-히드록시캄토테신의 제조
10-히드록시캄토테신 및 "연결자"는 N-메틸-2-피롤리디논 중 O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄에 의해 매개되는 축합을 수행한다. 디클로로메탄을 이용한 추출 및 수성 세정에 의한 N-메틸-2-피롤리디논 제거 이후, 중간체 10-O-연결자-히드록시캄토테신을 디클로로메탄/메틸 tert-부틸 에테르로부터의 침전에 의해 분리 및 정제하였다.
합성 경로의 예는 하기와 같다:
연결자(16.47 mmol, 예컨대, BCH의 경우 6.20 g) 및 O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄(HCTU)(6.53 g, 15.78 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(DIPEA)(5.74 mL, 32.94 mmol)의 N-메틸-2-피롤리디논(NMP)(50 mL) 중 용액을 0 ℃에서 15 분간 교반하였다. 그 반응 혼합물에 10-히드록시캄토테신(5 g, 13.72 mmol)을 황색 고체 분말로서 첨가하였다. 그 혼합물을 0 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 그 용액을 디클로로메탄(130 mL) 중에 취한 다음, 1 M NaCl(3x130 mL), 이어서 5 % 수성 시트르산(3x130 mL)으로 연속 추출하였다. 유기층을 0 ℃에서 메틸 tert-부틸 에테르(MTBE)(600 mL)에 (30 분 이상에 걸쳐) 서서히 첨가하였다. 이어서 형성된 황색 침전물을 여과한 후 진공(200 mBar) 하에 밤새 건조시켰다.
CPP의 10-O-연결자-히드록시캄토테신에의 결합
10-O-연결자-히드록시캄토테신을 CPP에 결합하여 CPP-10-O-연결자-히드록시 캄토테신 결합체의 디메틸포름아미드 중 혼합물을 수득하였다. 생성물을 수중에서 추출한 후 동결건조시켜 황색 고체를 수득하였다.
합성 경로의 예는 하기와 같다:
CPP-SH(4.61 mmol), 예컨대 N-말단 위치에 시스테인을 함유하는 DPV1047(17.42 g)의 디메틸포름아미드(200 mL) 중 용액을 실온에서 5 분간 교반하였다. 이어서 10-O-연결자-히드록시캄토테신(5.0 g, 6.92 mmol)을 황색 고체 분말로서 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고(200 mL) 수성층을 디클로로메탄(5x150 mL)으로 추출하여 여분의 10-O-연결자-히드록시캄토테신을 제거하였다. 수성층을 -80 ℃에서 4 시간 동안 보관한 다음, 동결건조시켰다. CPP-10-O-연결자-히드록시캄토테신 결합체를 -20 ℃에서 보관하였다. CPP-10-O-연결자-히드록시캄토테신의 최종 수득량을 HPLC에 의해 측정하였다. 10-히드록시캄토테신 표준 곡선(364 nm)과 비교하여 최종 수득량을 계산하였다.
20-O-연결자
#
1-캄토테신의 제조
합성 경로의 예는 하기와 같다:
연결자 #1(16.47 μmol, 2.78 mg) 및 디시클로헥실카르보디이미드(6.8 mg, 33 μmol)의 디클로로메탄 1 mL 중 용액을 0 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 형성된 침전물(DCU, N,N'-디시클로헥실유레아)을 여과에 의해 제거한 후, 여과액을 +0 ℃에서 캄토테신(3.4 mg, 9.7 μmol) 및 DMAP(2 mg, 16.47μmol)에 첨가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 4 시간 동안 교반한 다음, 1 M NaCl(3x1 mL), 이어서 5 % 수성 시트르산(3x1 mL)으로 연속 추출하였다. 유기층을 0 ℃에서 메틸 tert-부틸 에테르(10 mL)에 서서히 첨가하였다. 이어서 형성된 황색 침전물 (20-O-연결자 #1-캄토테신)을 여과한 후 진공(200 mBar) 하에 밤새 건조시켰다.
CPP의 20-O-연결자 #1-캄토테신에의 결합
합성 경로의 예는 하기와 같다:
CPP-SH(4.61 μmol), 예컨대 N-말단 위치에 시스테인을 함유하는 DPV1047(16.6 mg)의 디메틸포름아미드(1 mL) 중 용액을 실온에서 5 분간 교반하였다. 이어서 20-O-연결자 #1-캄토테신(3.4 mg, 7 μmol)을 황색 고체 분말로서 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고(1 mL) 수성층을 디클로로메탄(5X1 mL)으로 추출하여 여분의 20-O-연결자-캄토테신을 제거하였다. 수성층을 -80 ℃에서 2 시간 동안 보관한 다음, 동결건조시켰다. CPP-20-O-연결자-캄토테신 결합체를 -20 ℃에서 보관하였다. CPP-20-O-연결자-캄토테신의 최종 수득량을 HPLC에 의해 측정하였다. 캄토테신 표준 곡선(364 nm)과 비교하여 최종 수득량을 계산하였다.
20-O-연결자 #5-캄토테신의 제조
합성 경로의 예는 하기와 같다:
캄토테신(10 mg, 28.7 μmol)의 디클로로메탄(10 mL) 중 용액에 DMAP(10.5 mg, 86.2 μmol) 및 연결자 #5(BCH, 21.6 mg, 57.7 μmol)를 첨가하였다. 그 용액을 5 분간 교반한 다음, EDC(11.1 mg, 57.7 μmol) 및 트리에틸아민(12 μl, 86.2 μmol)의 디클로로메탄(50.5 mL) 중 용액을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 그 용액을 1 M NaCl(3x10 mL), 이어서 5 % 수성 시트르산(3x10 mL)으로 연속 추출하였다. 유기층을 부피 1 mL가 수득될 때까지 증발시킨 후, 그 용액을 0 ℃에서 메틸 tert-부틸 에테르(20 mL)에 (5 분 이상에 걸쳐) 서서히 첨가하였다. 이어서 형성된 황색 침전물을 여과한 후 진공(200 mBar) 하에 밤새 건조시켰다.
CPP의 20-O-연결자 #5-캄토테신에의 결합
합성 경로의 예는 하기와 같다:
CPP-SH(4.61 μmol), 예컨대 N-말단 위치에 시스테인을 함유하는 DPV1047(16.6 mg)의 디메틸포름아미드(1 mL) 중 용액을 실온에서 5 분간 교반하였다. 이어서 20-O-연결자-캄토테신(5 mg, 7 μmol)을 황색 고체 분말로서 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고(1 mL) 수성층을 디클로로메탄(5X1 mL)으로 추출하여 여분의 20-O-BCH-캄토테신을 제거하였다. 수성층을 -80 ℃에서 2 시간 동안 보관한 다음, 동결건조시켰다. CPP-20-O-BCH-캄토테신 결합체를 -20 ℃에서 보관하였다. CPP-20-O-연결자-캄토테신의 최종 수득량을 HPLC에 의해 측정하였다. 캄토테신 표준 곡선(364 nm)과 비교하여 최종 수득량을 계산하였다.
II. 안정성 연구
결합체 안정성에 대한 연결자의 영향을 시험하기 위해, 동일한 CPP, 상이한 연결자를 이용하여 상이한 결합체들을 합성하였다.
CPP-연결자 #1-SN38
CPP-연결자 #2-SN38
CPP-연결자 #3-SN38
CPP-연결자 #4-SN38
CPP-연결자 #5-SN38
CPP-연결자 #6-SN38
CPP-연결자 #7-SN38
결합체의 안정성을 상이한 종(하기 표 1 참조)들로부터의 시트레이트화된 혈장(10 % (v/v) 나트륨 시트레이트 완충용액, 0.106 M) 중에서 시험하였다. 2.55 μM의 결합체를 37 ℃에서 혈장 중에서 인큐베이션하였다. 시료를 TFA/아세토니트릴 추출한 후 하기된 HPLC 형광법(크로마토그래피 설비 및 조건 참조)을 사용하여 분석한 다음, 결합체에 의해 방출된 자유 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체 (예 컨대, SN38)의 양을 측정하였다.
크로마토그래피 설비 및 조건: 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 각 시료 150 μL를 담았다. 각 튜브에 H2O 중 5 % (v/v) TFA 450 μL를 첨가한 후, 그 혼합물을 5 초간 와류시켰다. 이어서 시료를 16000 g으로 3 분간 +4 ℃에서 원심분리하였다. 상청액 100 μL를 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 담았다. 이어서 즉시 메탄올(100 μL)을 첨가한 후 5 초간 와류시켰다. 이어서 시료를 16000 g으로 3 분간 실온에서 원심분리하였다.
HPLC 분석을 위해 상청액 150 μL를 회수하였다. 결합체, 대사산물 및 캄토테신 유도체 (즉, SN38)를 4.6 x 100 mm(3 μm 입자 크기) Luna C18(2) 컬럼(Phenomenex ref. 00D-4251-E0, Le Pecq, France)을 사용한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC; 형광 검출기가 장착된 Agilent 1100 시리즈)에 의해 분리하였다. 이동상 (A)의 수성 성분은 수중 0.1 % (v/v) TFA이었다. 유기 개질제 (B)는 0.1% (v/v) TFA를 함유하는 아세토니트릴이었다. 결합체 및 이의 대사산물에 있어, B의 비율이 2 분 후에는 15 % 내지 37 %로, 6 분 후에는 37 % 내지 47 %로, 2 분 후에는 90 %로 선형 증가하는 용리 구배를 1.2 mL/분의 일정한 유속으로 적용하였다. 이어서 B의 비율은 3.0 분 동안 초기 상태로 복귀되었다.
표 1은 37 ℃ 혈장에서의 DPV1047-연결자-SN38의 반감기(분)이다.
결합체의 반감기는 본 발명의 결합체에 의해 방출되는 자유 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체가 50 몰%이 되는 데 필요한 시간에 상응한다. 인간 혈장에서, 결합체 DPV1047-연결자 #1-SN38의 반감기(5 분 미만)는 결합체 DPV1047-연결자 #2-SN38(6 내지 7 분)보다 짧았으며, 이는 또한 결합체 DPV1047-연결자 #3-SN38(12 분)보다 짧았다. 가장 안정한 결합체는 DPV1047-연결자 #5-SN38(400 분)인 것으로 밝혀졌으며, 이의 반감기는 DPV1047-연결자 #2-SN38 결합체에 비해 60 배 더 길다. 또한 랫트 혈장에서는 연결자 #5를 포함하는 결합체가 가장 안정하다.
III. 누드마우스에 이식된 인간 HCT 116 이종이식 결장 종양 모델에 있어 4 가지 CPP-MIC-SN38 결합체의 효능 측정
인간 기원의 HCT 116 종양을 가진 암컷 NMRi 누드마우스(6 주령)(Janvier, France)에 대해 Q4Dx3 투여계획(4 일마다 1 회 주입, 3 회 반복)을 사용하여, 관심 있는 CPP-연결자 #2-SN38 결합체(결합체는 실시예 I.4 에 정의된 바와 같이 생성)를 확인하기 위한 항종양 효능연구를 수행하였다. HCT 116 종양 세포(ATCC 번호: CCl-247)를 세포 현탁액의 피내 이식에 의해 마우스의 우측 옆구리에 자리잡게 하였다. 종양 크기가 약 100 mm3(식 [길이 x 폭2]/2 에 의해 계산)에 도달한 종양 세포 이식 후 3 일째에 약물의 최초 주입을 수행한 후, 마우스를 6개의 군으로 임의 추출하여 Q4Dx3 투여계획에 따라 측부 꼬리정맥에의 10 μL/g의 볼루스 정맥 내 주입에 의해 소정의 최대 투여가능 용량(MAD)의 CPP-MIC-SN38으로 치료하였다.
최소 T/C %는 최대의 종양 성장 억제가 달성되었음을 의미하는 것이다.
치료 당시 및 그 이후에, 주입된 결합체의 효능 및 독성을 평가하고자 임상적 징후, 체중 및 종양 크기를 기록하였다. 약물 치료군 대 전달체 치료군의 평균 종양 부피 백분율(T/Cx100) 및 100-T/C (%)로 정의되는 종양 성장 억제율(TGI%)을 사용하여 치료효능을 평가하였다.
4가지 CPP-MIC-SN38 결합체의 치료적 매개변수는 이하 표 2에 요약되어 있다.
표 2는 누드마우스에 피내 이식된 HCT 116 인간 결장 암종의 모델에 있어 4가지 CPP-MIC-SN38 결합체의 효능이다.
3가지 CPP-MIC-SN38 결합체(DPV15b-MIC-SN38, DPV15-MIC-SN38 및 DPV1047-MIC-SN38)는 식염수 대조군에 비해 상당한 항종양 활성(TGI = 60 내지 63 %)을 나타낸 반면, DPV3-MIC-SN38 결합체는 HCT 116 종양 모델에서 보통의 항종양 활성(TGI = 32 %)만을 나타냈다.
CPP-MIC-SN38 결합체를 MAD로 투여한 연구에서 독성의 임상적 징후, 예컨대 체중 감소, 설사 또는 탈모는 관찰되지 않았다.
DPV15b-MIC-SN38, DPV15-MIC-SN38 및 DPV1047-MIC-SN38에 관하여 설명된 바와 같이, 고용량 수준(30 내지 50 μmol/kg)으로 투여된 결합체는 식염수 대조군에 비해 최대의 항종양 활성을 나타냈다.
IV. 누드마우스에 이식된 인간 HCT 116 이종이식 결장 종양 모델 또는 누드 랫트에 이식된 인간 LS 174T 이종이식 종양 결장 모델에 있어 CPP-연결자-SN38 결합체의 치료적 효능에 대한 연결자 안정성의 영향에 관한 평가
CPP-연결자-SN38의 효능에 대한 연결자 안정성의 영향을 2가지 이종이식 모델에서 평가하였다. 연결자는 시험관 내 혈장 안정성에 기초하여 선택하였다: MIC 연결자(연결자 #2)는 인간 혈장에서 비교적 불안정한 반면, BCH 연결자(연결자 #5)는 높은 인간 혈장 안정성을 나타내었다. 마우스에서 4가지 결합체, DPV15-MIC-SN38, DPV1047-MIC-SN38, DPV15-BCH-SN38 및 DPV1047-BCH-SN38의 특성을 분석하였다. 랫트에서 2가지 결합체, DPV1047-MIC-SN38 및 DPV1047-BCH-SN38의 특성을 분석하였다.
실시예 III에 기재된 바와 같이 이식 및 HCT 116 종양 성장을 수행하였다. 최초 주입일에 마우스를 6개의 군으로 임의 추출하고 Q4Dx3 투여계획(4 일에 1 회 주입, 3 회 반복)에 따라 측부 꼬리정맥에 10 μL/g의 볼루스 정맥 내 주입에 의해 동일한 등몰 용량(30 μmol/kg)의 CPP-연결자-SN38 결합체로 치료하였다.
Harlan 브리딩 센터(Gannat, France)로부터 구입한 암컷 누드 랫트(8 주령)을 사용하여 LS 174T 연구를 수행하였다. LS 174T 종양을 동물의 우측 옆구리에 세포(ATCC 번호: CCl-188) 현탁액의 피하 이식에 의해 자리잡게 했다. 종양크기가 약 1000 mm3 에 도달하면 약물의 최초 주입을 수행하였다. 종양부피는 식[길이 x 폭2]/2에 의해 계산하였다. 최초 주입일에 랫트를 8개의 군으로 임의 추출하고 Q3/4Dx5 투여계획(3 또는 4 일마다, 5 회 반복)에 따라 측부 꼬리정맥에의 10 μL/g의 볼루스 정맥 내 주입에 의해 소정의 MAD의 CPP-연결자-SN38 결합체로 치료하였다.
실험 과정에서, 임상적 징후, 체중 및 종양크기를 주 2 회 제어하였다. 치료군 대 전달체 치료군(대조군)의 평균 종양부피 백분율(T/Cx100 %) 및 100-T/C (%)로 정의되는 종양 성장 억제율(TGI%)을 사용하여 치료효능을 평가하였다.
최소 T/C %는 최대의 종양 성장 억제가 달성되었음을 의미하는 것이다.
HCT 116 종양 보유 마우스에 있어 4가지 CPP-연결자-SN38 결합체의 치료적 매개변수는 표 3에 요약되어 있다.
표 3는 누드마우스에 피내 이식된 HCT 116 인간 결장 암종 종양 모델에 있어 CPP-연결자-SN38 결합체의 효능에 대한 2가지 화학적 연결자의 영향이다.
4가지 결합체 모두 HCT 116 종양 모델에서 상당한 항종양 효능을 나타냈다. DPV1047-BCH-SN38(TGI = 80 %)은 DPV15-MIC-SN38(TGI = 63 %)보다 더, DPV1047-MIC-SN38(TGI = 60 %), DPV15-BCH-SN38(TGI = 61 %)보다는 훨씬 더 상당한 활성을 나타냈다.
CPP-MIC-SN38 또는 CPP-BCH-SN38 결합체를 MAD로 투여한 연구에 있어 독성의 임상적 징후, 예컨대 체중 감소, 설사 또는 탈모는 관찰되지 않았다.
LS 174T 종양 보유 랫트에 있어 2가지 DPV1047-연결자-SN38 결합체의 효능은 표 4에 제시되어 있다.
표 4는 누드 랫트에 피하 이식된 LS 174T 인간 결장 암종 종양 모델에 있어 CPP-연결자-SN38 결합체의 효능에 대한 2 가지 화학적 연결 모이어티의 영향이다.
DPV1047-MIC-SN38 및 DPV1047-BCH-SN38 둘 모두(TGI = 56 내지 57 %) LS 174T 종양 모델에서 동일하게 상당한 항종양 활성을 나타냈다.
CPP-MIC-SN38 또는 CPP-BCH-SN38를 MAD로 투여한 연구에 있어 독성의 임상적 징후, 예컨대 체중 감소, 설사 또는 탈모는 관찰되지 않았다.
종양 보유 마우스에서, 시험된 4가지 결합체 중 DPV1047-BCH-SN38 이 가장 큰 활성을 나타냈다. 종양 보유 랫트에서, DPV1047-MIC-SN38 및 DPV1047-BCH-SN38 은 동일한 활성을 나타냈다.
V. 누드마우스에 이식된 인간 HCT 116 결장 종양 모델에 있어 DPV1047-BCH-SN38 결합체 및 기타 SN38-유도체의 효능 비교
DPV1047-BCH-SN38(= DPV1047-연결자 #5-SN38) 결합체와, 활성분자를 가용화시키는 기타 전달계를 사용한 SN38 유도체의 활성을 비교하였다. DPV1047-BCH-SN38 (상기와 같이 시험된 모든 CPP 및 연결자 중 최대 생체 내 효능을 갖는 것으로 나타남)를 다음의 것들과 비교하였다: 이리노테칸, 즉 시판 중인 SN38의 가용성 전구약물(Campto®, Aventis), 및 (글루탐산)16Cys-MIC-SN38 결합체(폴리E(16)-MIC-SN38). 폴리E(16) 펩티드는 이의 생체 적합성, 비독성적 특성, 친수성 및 가용화 특성 때문에 본 발명에 따른 비세포침투성 펩티드로서 선택되었다.
이식 및 HCT 116 종양 성장을 상기된 바와 같이 수행하였다. 최초 주입일에 마우스를 6개의 군으로 임의 추출하고 측부 꼬리정맥에의 10 μL/g의 볼루스 정맥 내 주입에 의해 최적의 투여 조건(표 5 참조)에 따라 다양한 결합체들로 치료하였다.
실험 과정에서, 임상적 징후, 체중 및 종양 크기를 주 2 회 제어하였다. 약물 치료군 대 전달체 치료군의 평균 종양부피 백분율(T/Cx100 %) 및 100-T/C (%)로 정의되는 종양 성장 억제율(TGI%)을 사용하여 치료효능을 평가하였다.
최소 T/C %는 최대의 종양 성장 억제가 달성되었음을 의미하는 것이다.
상이한 SN38 결합체들의 치료적 매개변수는 표 5에 요약되어 있다.
표 5는 누드마우스에 피내 이식된 HCT 116 인간 결장 암종 종양에 있어 DPV1047-BCH-SN38 결합체 및 기타 SN38-유도체의 효능 비교이다.
DPV1047-BCH-SN38은 HCT 116 종양 모델에 대한 투여계획이 무엇이든 유사한 TGI를 나타냈다. Q2D3x3W 계획은 다른 두 계획에 비해 보다 연장된 활성을 유도하였다.
폴리E(16)-MIC-SN38을 Q4Dx3 투여계획를 사용하여 고용량 수준(40 μmol/kg)으로 투여했으나, 상기 모델에서 활성을 나타내지 않았다. 친수성 펩티드성 서열 폴리E(16)과의 결합에 의한 SN38의 가용화는 생체 내에서 활성형의 SN38의 효과적인 전달을 가능케 하는 데 충분하지 않았다.
DPV1047-BCH-SN38 및 이리노테칸은 Q2D3x3W 계획에 따라 28 일 후 최소의 T/C%와 더불어 연장된 종양 성장 억제를 야기하며 최대 효능을 나타냈다.
마우스에 관한 효능 연구에서 이리노테칸은 투여계획에 관계없이 DPV1047-BCH-SN38과 유사한 활성을 나타냈다. 마우스의 경우 이리노테칸의 SN38로의 전환은 카르복실에스테라아제에 관한 종 간 차이로 인해 인간의 경우보다 상당히 높았고, 이에 따라 이리노테칸의 효능은 마우스 모델에서 과대평가된 것이다(J. Thompson 등, BBA 1998;1400:301-319).
DPV1047-BCH-SN38 결합체를 MAD로 투여한 연구에 있어 독성의 임상적 징후, 예컨대 체중 감소, 설사 또는 탈모는 관찰되지 않았다.
VI. 개에 있어 DPV1047-BCH-SN38, DPV1047-MIC-SN38 및 이리노테칸의 독성 및 약물 동력학 비교 연구
이리노테칸에 비교하여 DPV1047-연결자-SN38 결합체의 장 및 혈액 독성을 비글견에서 평가하였다. 이 개는 이 종에서의 이리노테칸의 물질대사가 인간과 유사하며(M. Inaba 등, Cancer Chem. Pharmacol. 41:130-108 (1998)) 이 개가 인간에서 관찰되는 바와 같은 지연성 설사증상을 나타내므로 적절한 실험모델이다.
성체 암컷 및 수컷 비글견 각각에 수돗물에의 자유 접근이 갖춰진 장소를 제공하였다. 매일 펠렛형 식이를 분배하였다.
개(각 약물 및 용량에 대하여 개 1 마리)에게 두개 또는 두렁 정맥을 통해 정맥 내 주입하였다. 1 회용 카테터(Intraflon®) 및 주사기 펌프에 연결된 플라스틱 주사기를 사용하여 정맥 내 주입을 수행하였다. 주입 중에는, 동물에게 해먹을 씌웠다.
DPV1047-BCH-SN38(DPV1047-연결자 #5-SN38)을 45 분 주입에 의해 5, 10 및 20 mg/kg(0.3 내지 0.4 mL/분)으로 투여하였다. DPV1047-MIC-SN38(DPV1047-연결자 #2-SN38)을 20 분 주입에 의해 10 및 20 mg/kg으로, 및 45 분 주입에 의해 50 및 70 mg/kg(0.3 내지 0.4 mL/분)으로 투여하였다. 이리노테칸(임상 등급)을 최대 내성 용량(MTD), 즉, 20 분 주입에 의해 30 mg/kg(0.3 내지 0.4 mL/분)(F. Lavelle 등, Seminar in Oncology (1996))으로 주사하였다. 결합체를 주입용수(최종 부피의 10 %)에 용해한 후, 0.9 % NaCl을 이용하여 최종 농도로 희석하였다. 각 동물에 투여된 부피는 체중에 따라 조절되었다.
임상적 징후, 혈액 및 장 독성을 주입 후 15 일의 기간 동안 모니터하였다. 각 동물에 있어 사망률 또는 사망 징후에 관하여 1 일 2 회 이상 검사하였다.
각 동물의 체중을 -1, 4, 10 및 13 일째에 기록하였다.
-1, 5, 11 및 14 일째에 다음의 매개변수들의 측정을 위해 말초 혈액시료를EDTA 튜브에 취하였다: 적혈구, 헤모글로빈, 평균 세포부피, 패킹된 세포부피, 평균 세포 헤모글로빈 농도, 평균 세포 헤모글로빈, 혈소판, 백혈구, 세포형태에 따른 백혈구 감별 계수.
이리노테칸으로 치료한 개는 다음과 같이 일반적인 이리노테칸 독성의 임상적 징후를 나타냈다(F.Lavelle I, Seminar in Oncology, 1996): 초기(1 일째) 및 지연성(4 일 내지 6 일째) 설사, 체중 감소(-8.5 %), 구토 및 심하나 회복 가능한 혈독성이 5 일째에 보고되었다(92 %의 백혈구 소실, 아래의 표 6 참조).
5 및 10 mg/kg의 DPV1047-BCH-SN38로 치료한 개는 MTD 미만에서 다수의 세포 독성 분자에 있어 관찰된 바와 같이, 백혈구(WBC) 수에서의 완만하나 용량 비의존적인 감소 외에는 임상적 징후를 나타내지 않았다. DPV1047-BCH-SN38 20 mg/kg에서는 음식 섭취량 감소와 더불어 백혈구의 상당한 감소(WBC의 93 % 감소)가 관찰되었으며, 이는 최대 내성 용량(MTD)에 도달했음을 나타내는 것이다. DPV1047-BCH-SN38 30 mg/kg에서는, 설사 및 심한 혈독성을 포함하는 명백한 독소 징후들이 나타났다.
DPV1047-MIC-SN38 10, 20, 40 및 50 mg/kg로 치료한 개는 백혈구(WBC)의 완만한 감소 외에는 임상적 징후를 나타내지 않았다. DPV1047-MIC-SN38 70 mg/kg에서는 다음을 포함하는 독성 징후가 나타났다: 위장 독성, 설사 및 구토. 심한 혈독성이 보고되었다(94 %의 WBC 소실).
상기 결과들은 DPV1047-BCH-SN38의 MTD가 20 mg/kg(SN38 2.6 mg 당량) 안팎이고 DPV1047-MIC-SN38의 경우 50 내지 70 mg/kg(SN38 6.5 내지 9.1 mg 당량)임을 의미한다. 따라서 DPV1047-BCH-SN38가 DPV1047-MIC-SN38 보다 독성이 더 크다.
2가지 SN38 결합체의 비글견에서의 독성 연구는 표 6에 요약되어 있다.
표 6은 이리노테칸, DPV1047-BCH-SN38 및 DPV1047-MIC-SN38의 주입에 따른 비글견의 독성 연구이다.
상기 연구의 일부로서, DPV1047-BCH-SN38, DPV1047-MIC-SN38, 이리노테칸, 및 이들의 주요 대사산물의 약물 동력학을 비교하였다. 약물 동력학 분석을 위해 주입 이후 여러 시간대에 말초 혈액시료를 취하였다. 10 및 20 mg/kg의 이리노테칸 및 DPV1047-MIC-SN38에 있어, 혈액은 시간 0(주입 전), 주입 종료 직전(20 분) 및 주입 종료 후 10, 20, 40, 220, 460 분에 시료 채취되었다. 그 외 모든 군에 있어, 혈액은 시간 0(주입 전), 주입 종료 직전(45 분) 및 주입 종료 후 10, 20, 40, 120, 220 분에 시료 채취되었다.
혈액 시료(2.5 mL)를 5 % TFA (v/v) 2.5 mL를 포함하는 트리나트륨 시트레이트 튜브(Sarstedt S-Monovette® 9NC)에 5 mL로 취한 후 -80 ℃에서의 보관(2 주 미만 동안) 전에 5 초 동안 와류시켰다.
이어서 시료를 하기된 바와 같이 TFA 및 아세토니트릴 추출 이후 HPLC 형광법에 의해 분석하였다. 이를 실온의 수욕에서 5 분간 해동시킨 후, 2.5 % TFA (v/v)를 포함하는 H2O 5 밀리리터로 2 배 희석하였다. 모든 혈액 시료를 TFA로 산화시켜 결합체의 에스테르 결합의 가수분해를 방지하고 단백질 침전이 결합체 및 SN38 회수를 향상시킬 수 있도록 하였다.
이어서 각 시료 500 마이크로리터를 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 담아 +4 ℃에서 3 분간 16000 xg로 원심분리하였다. 100 마이크로리터의 상청액을 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 담은 후 새로 제조한 1.12 μg/mL 캄토테신 용액(내부 표준; 4 시간 이하의 빙수욕 중에 +4 ℃로 유지) 20 μL를 첨가하였다. 이어서 메탄올(100 μL)을 즉시 첨가하고 그 혼합물에 대해 5 초간 격렬한 교반(와류)을 수행하였다. 이어서 시료를 실온에서 3 분간 16000 xg로 원심분리하였다.
HPLC 분석을 위해 150 마이크로리터의 상청액을 회수하였다.
HPLC 분석
이하의 방법을 사용하여 DPV1047-BCH-SN38 및 이의 대사산물 SN38을 고성능 액체 크로마토그래피(형광 검출기를 갖춘 HPLC Agilent 1100)로 분리하였다:
용매 A: H2O 중 0.1 % (v/v) TFA
용매 B: 아세토니트릴 중 0.1 % (v/v) TFA
컬럼: Luna, C18(2), 3 μM, 100 x 4.6 mm(Phenomenex ref. 00D-4251-E0)
용리: 2 분 후에 15 내지 37 %의 B, 6 분 후에 37 내지 47 %, 0.5 분 후에 90 %의 B, 2 분간 90 %의 B. 2 분간 15 %의 B
주입 부피: 100 μL
유속: 1.2 mL/분
검출: 형광; 여기(勵起) 375 nm, 방사 560 nm (감도 18)
이하의 방법을 사용하여 DPV1047-MIC-SN38, 이리노테칸 및 이들의 대사산물 SN38을 고성능 액체 크로마토그래피(형광 검출기를 갖춘 HPLC Agilent 1100)에 의해 분리하였다:
용매 A: H2O 중 0.1 % (v/v) TFA
용매 B: 아세토니트릴 중 0.1 % (v/v) TFA
컬럼: Luna, C18(2), 3 μM, 100 x 4.6 nun(Phenomenex ref. 00D-4251-E0)
용리: 10 분 후에 15 내지 50 %의 B, 0.5 분 후에 90 %의 B, 2 분간 90 %의 B. 2 분간 15 %의 B
주입 부피: 100μL
유속: 1.2 mL/분
검출: 형광; 여기 375 nm, 방사 560 nm (감도 18)
도 1은 이리노테칸 30 mg/kg에 대응하여 여러 용량의 DPV1047-BCH-SN38 및 DPV1047-MIC-SN38 주입 이후 SN38에 대한 혈액 노출(AUC)을 비교한 것이다. DPV1047-BCH-SN38(용량≤ 20 mg/kg) 및 DPV1047-MIC-SN38(용량≤ % 50 mg/kg)의 비독성 용량에서, SN38 Cmax 및 AUC는 둘 모두 결합체의 용량에 대해 선형으로 증가하였다. 이리노테칸 30 mg/kg(그의 MTD)의 주입 후 SN38(이리노테칸의 활성 대사산물)의 AUC는, DPV1047-MIC-SN38 또는 DPV1047-BCH-SN38 각각의 MTD 안팎의 용량의 주입 후 SN38의 AUC에 비해 80 배 이상 더 낮다. 이리노테칸과 달리, DPV1047-연결자-SN38 결합체는 비독성 용량에서 혈액 내 상당히 높은 양의 활성 대사산물, SN38을 전달하였다. SN38의 AUC는 등몰 용량의 DPV1047-MIC-SN38에 비해 DPV1047-BCH-SN38 주입 후에 상당히 더 크다(도 1).
혈액 내에서의 DPV1047-BCH-SN38의 순환 반감기는 DPV1047-MIC-SN38의 경우보다 더 길고, 따라서 DPV1047-BCH-SN38에 의해 전달된 SN38의 AUC가 DPV1047-MIC-SN38에 의해 방출된 경우보다 더 크다(도 2). DPV1047-BCH-SN38에 관하여 관찰된 독성 증가는 활성(세포 독성) 분자, SN38의 AUC 증가와 많은 관련이 있다.
개에서의 독성 연구에서는 DPV1047-BCH-SN38 결합체가 DPV1047-MIC-SN38 결합체보다 독성이 크다는 것이 밝혀졌다. BCH 및 MIC 결합체는 둘 모두 위장 독성 및 혈독성을 특징으로 하는 동일한 독성 프로필을 나타낸다. BCH 결합체의 MTD는 MIC 결합체의 경우에 비해 약 3 배 더 낮으나, 이는 BCH 결합체로부터 훨씬 더 많은 SN38이 방출되는 것과 많은 관련이 있다. SN38의 AUC의 용량 의존적 증가는 DPV1047-BCH-SN38이 5 내지 20 mg/kg의 용량으로 주입되는 경우 및 DPV1047-MIC-SN38이 10 내지 50 mg/kg으로 주입되는 경우에 관찰되었다.
이러한 결과들은 DPV1047-연결자-SN38 결합체가 상당히 독성이 감소된 이리노테칸에 비해 훨씬 더 순환성이 있는 SN38을 전달할 수 있음을 나타낸다. 이는, 인간의 이리노테칸의 용량 증가가 활성 대사산물, SN38에의 높은 노출로 인해 치료 반응을 개선시킴이 널리 공지되어 있으며([de Jonge M. J., 등, J Clin Oncol, 195-203, 2000]; [Ychou, M., 등, Cancer Chemotherapy And Pharmacology, 50: 383-391, (2002)]) 그러한 용량 증가가 이리노테칸의 용량 제한적 독성으로 인해 거의 불가능하기 때문에, 매우 중요하다.
VII. 설치동물에 이식된 여러 인간 종양 모델에 있어 DPV1047-BCH-SN38 결합체의 생체 내 효능 평가
다양한 종양 모델에 있어 DPV1047-BCH-SN38 결합체의 활성을 평가하여 광범위한 종양 유형에 대한 상기 결합체의 적용가능성을 측정하였다. 다음과 같은 5가지 인간 종양 모델을 선택하였다: HCT 116 결장 암종 모델(ATCC 번호: CCl-247), LS 174T 결장 암종 모델(ATCC 번호:CCl-188), HT-29 결장 암종 모델(ATCC 번호: HTB-38), NCI-H460 폐 암종(ATCC 번호: HTB-177) 및 MDA-MB-231 유방 암종 모델(ATCC 번호: HTB-26).
HCT 116, HT-29, NCI-H460 및 MDA-MB-231 종양을 7 주령 암컷 NMRi 누드마우스(Janvier, France)의 세포의 피내 또는 피하 이식에 의해 우측 옆구리에 자리잡게 하였다(각각 1 x 107, 1 X 107, 3 X 106 및 3 x 106개의 세포가 주입). LS 174T 종양 세포를 Rh rnu/rnu 누드 랫트에 이식하였다(2 x 107개 세포). 종양크기가 마우스의 경우 약 100 mm3(식 [길이 x 폭2]/2에 의해 계산) 또는 랫트의 경우 1000 mm3에 도달하면 치료를 시작하였다. 최조 주입일에 동물을 여러 군(군당 6 내지 8 마리)으로 임의 추출하여 측부 꼬리정맥에의 10 μL/g의 볼루스 정맥 내 주입(i.v.)에 의해 식염수에 용해한 DPV1047-BCH-SN38을 전달하였다.(표 7)
실험 과정에서, 임상적 징후, 체중 및 종양 크기를 주당 2 회 제어하였다. 약물 치료군 대 전달체 치료군의 평균 종양부피 백분율(T/Cx100 %) 및 100-T/C (%)로 정의되는 종양 성장 억제율(TGI%)을 사용하여 치료효능을 평가하였다.
최소 T/C %는 최대의 종양 성장 억제가 달성되었음을 의미하는 것이다.
상이한 종양 모델에 있어 DPV1047-BCH-SN38 결합체의 효능은 표 7에 요약되어 있다.
표 7은 설치동물에 피내 또는 피하 이식된 상이한 인간 종양 모델들에 있어 DPV1047-BCH-SN38 결합체의 효능 평가이다.
DPV1047-BCH-SN38(= DPV1047-연결자 #5-SN38) 결합체는 시험한 모든 결장, 폐 및 유방암 모델에서 상당 수준의 항종양 활성을 나타냈으며, 이는 DPV1047-BCH-SN38이 광범위한 인간 종양에서 활성을 나타냄을 의미한다. 아울러, 여러 용량을 시험한 경우, 용량 의존적인 효능이 관찰되었다.
VIII. 베바시주맙 또는 5-플루오로우라실과 조합된 DPV1047-BCH-SN38 결합체에 관한 생체 내 효능의 평가
임상적으로, 이리노테칸은 5-플루오로우라실(5-FU)(Teva® Pharma) 및 베바시주맙(Avastin®, Roche)과 같은 제제와 함께 사용하면 상승 효과를 갖는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 제제들과 조합된 DPV1047-BCH-SN38의 활성을 평가하기 위해 조합 연구를 수행하였다. 마우스에 HT-29 종양을 이식하고 10 μL/g의 복강내 투여(베바시주맙) 또는 볼루스 정맥내 주입(5-FU 또는 DPV1047-BCH-SN38)에 의해 치료하였다. 실험적으로 정의된 DPV1047-BCH-SN38, 5-FU 및 베바시주맙의 차선적 용량을, 문헌[Prewett 등, Clin Cancer Res. May; 8(5):994-1003 (2002) 및 Azrak 등, Clin Cancer Res. Feb 1;10(3):1121-9 (2004)]에서 정립된 계획에 따라 투여하였다. 베바시주맙, 5-FU 또는 DPV1047-BCH-SN38 로의 치료 후에 T/C 비를 계산하였다. 이러한 T/C 비를 사용하여 베바시주맙 및 DPV1047-BCH-SN38, 또는 5-FU 및 DPV1047-BCH-SN38을 이용한 조합 치료에 관한 T/C 기대값을 평가하였다(DPV1047-BCH-SN38의 T/C x 베바시주맙 또는 5-FU의 T/C). 조합 치료 후의 T/C 관찰값을 실험적으로 정의하였다. T/C 기대값을 T/C 관찰값으로 나누어 두 분자의 조합지수를 계산하였다. 지수>1은 상승효과를 나타내고, 약 1의 지수는 부가적 효과를 나타내며, 지수<1은 반대(antagonistic)효과를 나타낸다. 이러한 실험 결과는 표 8에 요약되어 있다.
표 8은 HT-29 종양 모델에 있어 5-FU 또는 베바시주맙과 조합된 DPV1047-BCH-SN38의 상승효과의 평가이다.
상기 실험에서, DPV1047-BCH-SN38은 5-FU 또는 베바시주맙과 조합되어 항종양 효능이 증가되었다. 5-FU의 경우 조합효과는 상승이었던 반면(조합지수 > 1), 베바시주맙의 경우 조합효과는 부가적이었다(조합 지수가 약 1임).
IX. DPV1047-BCH-SN38·HCl에 비교한 DPV1047-BCH-SN38·TFA의 시험관 내 및 생체 내 활성의 평가
이어서 DPV1047-BCH-SN38·TFA 및 DPV1047-BCH-SN38·HCl 화합물의 효능 및 독성을 비교하였다.
DPV1047-BCH-SN38 히드로클로라이드(DPV1047-BCH-SN38·HCl)를 DPV1047-BCH-SN38·TFA의 이온교환 크로마토그래피에 의해 형성하였다. 앰버라이트 IRA-410이온 교환수지(475 g)(Fluka)를 30 분간 2 N HCl에 현탁시켰다. 이어서 상기 수지를 컬럼에 패킹하고 물로 세정하였다. 24 g의 DPV1047-BCH-SN38·TFA를 물 125 mL에 용해하고, 컬럼 상에 로딩한 후 물로 용출시켰다. HIACHI U-2000 분광 광도계를 사용하여 364 nm에서의 UV 흡광도에 의해 여러 분획들 중 DPV1047-BCH-SN38·HCl의 농도를 측정하였다. 이어서 상응하는 분획들을 모아 냉동 및 동결건조시켰다. 이어서 DPV1047-BCH-SN38·HCl 결합체를 아르곤 하에 -20 ℃에 보관하였다.
DPV1047-BCH-SN38의 상기 두 염 형태 간에 효능 차이는 관찰되지 않았다; NCI-H460 폐 선암 모델(ATCC 번호: HTB-177)에 대한 시험관 내 세포 독성 및 생체 내 효능 연구에서 DPV1047-BCH-SN38·HCl이 DPV1047-BCH-SN38·TFA 및 DPV1047-BCH-SN38·HCl 각각에 대해 22.9 % 및 18.4 %의 생체 내 최적 T/C의 활성을 보유한 것으로 확인되었다(표 9 참조).
표 9는 DPV1047-BCH-SN38·TFA 및 DPV1047-BCH-SN38·HCl의 시험관 내(IC50) 및 생체 내 효능의 평가이다.
X. DPV1047-BCH-SN38의 용해도 평가
DPV1047-BCH-SN38(=DPV1047-연결자 #5-SN38)의 수중 용해도는 SN38 또는 이리노테칸보다 훨씬 큰 것으로 밝혀졌다: DPV1047-BCH-SN38·HCl ≥ 1 g/mL, 이리노테칸 ≤ 2.5 mg/mL 및 SN38 ≤ 5μg/mL.
XI. 여러 CPP-연결자 캄토테신 유도체의 안정성 및 시험관 내 효능의 평가
개에 있어 독성역학 비교 연구에서는 DPV1047 과 SN38 간의 연결자의 안정성이 SN38의 혈장 AUC의 증가와 관련이 있는 것으로 나타났다(실시예 VI 참조).
따라서 다양한 CPP-연결자-캄토테신 유도체의 시험관 내 안정성을 평가하기 위한 연구들을 수행하였다. 다양한 CPP, 다양한 연결자 및 2가지 캄토테신, 즉 SN38 또는 10-히드록시캄토테신을 이용하여 결합체를 합성하였다.
CPP-연결자-SN38 결합체:
DPV1047-연결자 #5-SN38
DPV1047-연결자 #1-SN38
페너트라틴-연결자 #5-SN38
페너트라틴-연결자 #1-SN38
DPV7-연결자 #5-SN38
Tat-연결자 #5-SN38
DPV1047D-연결자#5-SN38
DPV51D-연결자 #5-SN38
CPP-연결자-10-히드록시캄토테신 결합체:
페너트라틴-연결자 #5-10-히드록시캄토테신
페너트라틴-연결자 #1-10-히드록시캄토테신(PCT 특허 출원번호 WO 00/01417 에 기재)
DPV1047-연결자 #5-10-히드록시캄토테신
DPV1047-연결자 #1-10-히드록시캄토테신
Tat-연결자 #4-10- 히드록시캄토테신
Tat-연결자 #7-1O-히드록시캄토테신.
실시예 II에서와 같이, 상기 결합체의 안정성을 인간 또는 개 혈장에서 시험하였다.
37 ℃에서 인큐베이션한 다음, 시료를 실시예 II에 기재된 바와 같이 TFA 아세토니트릴 추출 후 HPLC 형광법에 의해 분석하였다. 또한 상기 화합물의 시험관 내 세포 독성(IC50)을 평가하였다.
치료적 화합물의 첨가 이전에 24 시간 동안 시딩(seeding)된 세포에 의해 세포 독성 평가를 수행하였다. 치료적 화합물의 여러 희석액을 이용하여 세포를 48 시간(37 ℃) 동안 인큐베이션하였다. 이어서 WST-1 어세이(Roche)를 사용하여 세포 생존력을 평가하였다. 결과는 Graph Pad Prism 3.02 소프트웨어를 사용하여 S자 회귀곡선으로부터 평가된 평균 세포 독성농도(세포 생존력의 50%를 억제하는 IC50값 또는 몰농도)로서 표시하였다.
연구에는 다음과 같은 2가지 세포주를 사용하였다:
- HCT 116(ATCC #: CCL-247): 인간 상피 결장 암종 세포. 세포를 McCoy's 5a 배지 + 1.5 mM L-글루타민 및 10 % 소 태아 혈청에서 배양하였다. 세포를 8000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 배치하였다;
- NCI-H460(ATCC#: HTB-177): 인간 상피 폐 암종 세포. 세포를 RPMI 1640 + 글루타맥스 및 10 % of 소 태아 혈청에 배양하였다. 세포를 10,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 배치하였다.
CPP-연결자-SN38 결합체:
표 10에 나타난 바와 같이, DPV1047-연결자 #5-SN38이 초기에 관찰된 것과 동일한 안정성을 나타낸 가장 안정한 결합체였다(인간 및 개 혈장에서 각각 360 분 및 260 분의 반감기)(실시예 II 참조). 개 및 인간 혈장에 있어, CPP가 SN38과 결합한 경우 CPP-연결자 #5-SN38 결합체는 항상 CPP-연결자 #1-SN38 결합체보다 더 안정했으며, 이로써 연결자 #5(= BCH)가 연결자 #1 보다 더 안정함이 확인되었다.
표 10은 37 ℃ 혈장에서의 SN38 결합체의 반감기(분)이다.
(연결자 #5를 포함하는) 상기 가장 안정한 화합물의 시험관 내 세포 독성을 평가하여 그 화합물의 세포 독성 성질이 유지되는지를 측정하였다. 표 11에서는 모든 CPP-연결자 #5-SN38 결합체가 시험된 2가지 세포주에서 SN38과 동등한 세포 독성 활성을 유지했음이 확인된다.
표 11은 48 시간의 지속적 노출 이후 2가지 세포주에서 50 %의 세포 생존력을 억제하는 약물 농도(IC50)이다. 데이터는 nM으로 표시되며 3가지 독립적 실험의 평균값을 나타낸다.
CPP가 D 배열인 CPP-연결자 #5-SN38 결합체의 시험관 내 혈장 안정성 및 세포 독성을 또한 평가하였다. 표 12에 제시된 바와 같이, CCP-연결자 #5-SN38 D-이소형(isoform) 결합체들 모두의 안정성은 CPP-연결자 #1-SN38 결합체에 관해 관찰된 것보다 훨씬 높다(표 10 참조). CCP-연결자 #5-SN38 D-이소형 결합체들의 안정성은 인간 혈장에서 100 분 초과의 반감기를 가지나, DPV1047-연결자 #5-SN38 결합체보다 안정성이 낮다. 결과는 아래 표 12에 나타나 있다.
표 12는 37 ℃ 혈장에서의 SN38 결합체의 반감기(분)이다.
상기 결합체의 시험관 내 세포 독성을 평가하여 그 화합물의 세포 독성 성질이 유지되는지 측정하였다. 표 13에서는 2가지 CPP-연결자 #5-SN38 D-이소형 결합체들이 DPV1047-연결자 #5-SN38과 동등한 세포 독성 활성을 유지하는 것으로 확인된다. 결과는 아래 표 13에 나타나 있다.
표 13은 48 시간의 지속적 노출 이후 50 %의 세포 생존력을 억제하는 약물 농도(IC50)이다. 데이터는 nM로 표시된다.
CPP-연결자-10-히드록시캄토테신 결합체:
또한 여러 CPP-연결자 조합의 안정성을 10-히드록시캄토테신을 이용하여 시험하였다. CPP-연결자 #5-SN38 결합체의 경우와 같이, CPP-연결자 #5-10-히드록시캄토테신 결합체는 항상 CPP-연결자 #1-10-히드록시캄토테신 결합체보다 더 안정하였다. DPV1047-연결자 #5-SN38에 관해 관찰된 바와 같이, DPV1047-연결자 #5-10-히드록시캄토테신 결합체의 안정성은 인간 및 개 혈장 둘 모두에서 다른 CPP-연결자 #5-10-히드록시캄토테신 결합체들보다 더 컸다. 결과는 아래 표 14에 나타나 있다.
표 14는 37 ℃ 혈장에서의 10-히드록시캄토테신 결합체들의 반감기(분)이다.
(연결자 #5를 포함하는) 가장 안정한 화합물의 시험관 내 세포 독성을 평가하여 그 화합물의 세포 독성 성질이 유지되는지 측정하였다. 표 15에서는 모든 CPP-연결자 #5-10 히드록시캄토테신 결합체가 시험한 두 세포주에 관하여 10-히드록시캄토테신보다 약간 낮기는 하나 동등한 정도의 유사한 활성을 나타냈음이 확인된다.
표 15는 48 시간의 지속적 노출 이후 2가지 세포주에서 50 %의 세포 생존력을 억제하는 약물 농도 (IC50)이다. 데이터는 nM으로 표시되며 3가지 독립적 실험의 평균값을 나타낸다.
연결자 #4 및 #5는 시험된 모든 CPP 결합체에 관하여 연결자 #1 보다 큰 안정성을 나타낸다. 이러한 연결자 #5의 안정성은 또한 SN38 및 10-히드록시캄토테신 유도체 둘 모두에 관하여 연결자 #1 보다 컸다.
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<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser
1 5 10 15
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys
1 5 10 15
Pro
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro
1 5 10 15
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Pro Arg Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg
1 5 10 15
His Leu
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Arg Lys Arg
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
1 5 10 15
Asp Val
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg
1 5 10 15
<210> 11
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg
1 5 10 15
Arg Glu Arg Gln Ser Arg
20
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
1 5 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys
20
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His
1 5 10 15
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
20 25 30
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met Ser Met Lys Ile Arg Pro
1 5 10 15
Phe Phe Pro Gln Gln
20
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Lys Thr Arg Tyr Tyr Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro
1 5 10 15
Phe Asn Arg Leu
20
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Arg Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Arg Ala Val Arg Met Lys Ile Arg Pro
1 5 10 15
Leu Val Thr Gln
20
<210> 17
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro
20
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Asn Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser
1 5 10
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His
1 5 10 15
Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala
20 25 30
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu
1 5 10
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 24
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met
1 5
<210> 27
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr
1 5 10 15
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 34
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp
1 5 10 15
Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro
20 25
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 36
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe
1 5 10
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Ala Trp Ser Phe Arg Val Ser Tyr Arg Gly Ile Ser Tyr Arg Arg Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 45
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 46
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Ile Leu
20
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
1 5 10
<210> 49
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
1 5 10 15
Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
20 25 30
Val Asp
<210> 50
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr
1 5 10 15
Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro Lys Pro Asp
20 25
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His
1 5
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> non cell penetrating peptide
<400> 52
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Claims (42)
- 연결자 기를 통해 담체 모이어티에 연결된 1개 이상의 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체를 포함하는 결합체로서, 상기 담체 모이어티가 세포침투성 펩티드(CPP)이며 상기 결합체의 반감기가 시험관 내 37 ℃ 인간 혈장 조건에서 5 분 이상인 결합체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 연결자 기가 하기로부터 선택되는 가교용 시약에서 유래하는 결합체:N-6-말레이미도카프로산, 및N-11-말레이미도운데칸산.
- 제 1 항에 있어서, 상기 결합체가 하기 화학식 (VI)을 가지는 결합체:
상기식에서, X는 티오에테르 결합에 의해 결합체의 나머지 부분에 부착된 세포침투성 펩티드를 나타내고,Y는 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체를 나타내고,B는 치환 또는 비치환된 시클로알킬기이고,R1 및 R2는 독립적으로 부재하거나, 또는 치환 또는 비치환된 2가 알킬, 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기이다. - 제 3 항에 있어서, Y가 티오에테르, 히드라존, 아미드, 에스테르, 에테르, 카르바메이트, 또는 티오카르바메이트 결합, 더욱 특히는 에테르 결합, 디설피드 또는 티오에테르 결합에 의해 결합체의 나머지 부분에 부착된 결합체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체가 시험관 내 및/또는 특히 생체 내에서 효소 DNA 토포이소머라아제 I에 결합하는 특성을 가지며 하기 화학식 (II)로 표시되는 캄토테신 백본을 포함하는 생물학적 활성 화합물인 결합체:
상기식에서, t는 0, 1 또는 2이고, Z는 -COO-기 또는 치환 또는 비치환된 2가 알킬기이다. - 제 5 항에 있어서, 상기 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체가 화학식 (II)의 캄토테신 백본을 포함하며, 이때 화학식 (II)에 표시된 1개 이상의 탄화수소기가 치환되고, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개의 탄화수소기가 치환된 결합체.
- 제 6 항에 있어서, 상기 치환기가 알킬기, 아릴기, 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -SiR'R"R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R''', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되거나, 또는 2개의 이웃기가 이들을 연결하는 탄소 원자들과 함께 화학식 -O(CH2)uO-의 기를 형성할 수 있고, 이때 u는 정수 1 또는 2를 나타내며; 이때 R', R", R"' 및 R""이 바람직하게는 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C1-C8)헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴, (비치환된 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환된 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 선택되며, 상기 치환기가 선택적으로 상기 기들 중 임의의 것으로 치환되는 결합체.
- 제 7 항에 있어서, 상기 치환기가 알킬기, 바람직하게는 저급 알킬기; -OR', 이때 R'은 H; -OC(O)R', 이때 R'은 헤테로알킬기, 더욱 바람직하게는 피페리딘 또는 피페라진기와 같은 헤테로시클로알킬기; NR'R" 또는 헤테로알킬기, 더욱 바람직 하게는 피페리딘 또는 피페라진기와 같은 헤테로시클로알킬기로 치환된 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되며; 2개의 이웃기가 이들을 연결하는 탄소 원자들과 함께 화학식 -O(CH2)uO-의 기를 형성할 수 있으며, 이때 u는 정수 1 또는 2, 바람직하게는 2를 나타내는 결합체.
- 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캄토테신 백본이 화학식 (II)를 가지며, 이때 t는 0 이고, Z는 COO기인 것으로서 하기 화학식 (III)으로 표시될 수 있는 결합체:
- 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캄토테신 백본이 하기 화학식 (IV)로 표시되는 결합체:
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캄토테신, 이의 유사물 및 유도체가 이리노테칸, 토포테칸, GI-147211C, SN38, 7-히드록시메틸 캄토테신, 9-아미노캄토테신, 7-아미노메틸 캄토테신, 10-히드록시캄토테신 및 (20S)-캄토테신으로부터 선택되는 결합체.
- 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 R1 및 R2가 -O-, -NR'-, -SR'-, -SiR'R"-, -OC(O)-, -C(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'-, -NR"OC(O)-, 및 -NR"C(O)2-로부터 선택되는 1개 이상의 2가 라디칼에 의해 개입되어 있으며, 이때 R' 및 R"은 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C1-C8)헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택되는 결합체.
- 제 3 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 치환 또는 비치환된 2가 알킬, 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기이고 R2는 부재하거나 또는 치환 또 는 비치환된 2가 알킬, 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기인 결합체.
- 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (VI)을 가지며,- B는 시클로펜틸 또는 시클로헥실 라디칼을 포함하는 시클로(C3-C8)알킬, 바람직하게는 비치환된 시클로알킬이고/거나,- R1은, 특히 폴리(에틸렌 글리콜)(즉, PEG) 및 이의 유도체, 예컨대 PEG-3, -4, -5, 또는 -6을 포함한 헤테로알킬기이고/거나,- R1은 직쇄형 (C1-C8) 알킬쇄, 특히 -CH2- 또는 -CH2CH2-이고/거나,- R1은 선택적으로 -OC(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'- 및 -NR"C(O)2-, 바람직하게는 -CONR'- 또는 -NR"OC(O)-로부터 선택되는 1개 이상의, 바람직하게는 1 또는 2개의 2가 라디칼이 개입된 (C1-C8) 알킬쇄로서, 이때 R' 및 R"은 상호 독립적으로 바람직하게는 수소 및 (C1-C8)알킬로부터 선택되며, 선택적으로 상기 (C1-C8) 알킬쇄는 1개 이상의 시클로알킬쇄를 포함하고/거나,- R2는 부재하고/거나,- R2는, 특히 폴리(에틸렌 글리콜)(즉, PEG) 및 이의 유도체, 예컨대 PEG-3, -4, -5, 또는 -6을 포함한 헤테로알킬이고/거나.- R2는 직쇄형 (C1-C8) 알킬쇄, 특히 -CH2- 또는 -CH2CH2-이고/거나,- R2는 선택적으로 -OC(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'- 및 -NR"C(O)2-, 바람직하게는 -CONR'- 또는 -NR"OC(O)-로부터 선택되는 1개 이상의, 바람직하게는 1 또는 2개의 2가 라디칼이 개입된 (C1-C8) 알킬쇄로서, 이때 R' 및 R"은 상호 독립적으로 바람직하게는 수소 및 (C1-C8)알킬로부터 선택되며, 선택적으로 상기 (C1-C8) 알킬쇄는 1개 이상의 시클로알킬쇄를 포함하는 결합체.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캄토테신, 이의 유사물 또는 유도체가 하기로부터 선택되는 화합물 유래의 연결자를 이용하여 담체 모이어티에 공유적으로 연결된 결합체:4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-6-아미도카프로산,4-[(N-말레이미도에틸)카르복스아미도에틸(Peg)4 카르복스아미도메틸]시클로헥산카르복실산,4-[(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-6-아미도헥산카르복스아미도 메틸]시클로헥산카르복실산, 및4-[((N-말레이미도메틸)시클로헥산카르복스아미도)메틸]시클로헥산카르복실산.
- 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택되는 결합 체:
상기식에서, X는 제 3 항에 정의된 바와 같다. - 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포침투성 펩티드 (또는 X)가 매우 양이온성이고 아르기닌 또는 리신이 풍부한 결합체.
- 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포침투성 펩티드가 세포 내재화 특성을 가지는 단백질 또는 이의 펩티드 유도체를 나타내는 결합체.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포침투성 펩티드가 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 단백질 Tat, 헤르페스 바이러스 외피 단백질 VP22, 페너트라틴, 프로테그린 1(PG-1) 항균성 펩티드 SynB, 염기성 섬유아세포 성장인자, 합성 폴리-아르기닌 펩티드, 또는 세포 내재화 특성을 가지는 이들의 펩티드 유도체를 나타내는 결합체.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 모이어티가 하기 화학식 (I)을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인 결합체:
상기식에서,X1 및 X2는 독립적으로 아미노산 1 내지 20개의 아미노산 서열이고; p 및 q는 독립적으로 0 내지 5, 바람직하게는 0 또는 1의 정수이고;B는 독립적으로 염기성 아미노산이고;X는 독립적으로 비염기성 아미노산이고;C는 독립적으로 부재하거나, 또는 결합체의 나머지 부분에 연결된 티오에테르 결합을 포함하는 임의의 모이어티이며, 상기 모이어티는 바람직하게는 시스테인 또는 시스테아민이고;m은 1 또는 2이고;n은 1, 2 또는 3이고;o는 0 또는 1이고;r은 0 또는 1이고;s는 0, 1, 2 또는 3이다. - 제 20 항에 있어서, 상기 펩티드가 아미노산 50개 미만, 바람직하게는 25개 미만 길이의 화학식 (I)의 아미노산 서열을 포함하는 결합체.
- 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, C가 부재하거나 또는 상기 아미노산 서열의 임의의 위치에 있거나, 또는 더욱 바람직하게는 상기 아미노산 서열의 C 또는 N 말단 위치에 있는 결합체.
- 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, X1 및 X2가 독립적으로 아미노산 2 내지 15개, 더욱 바람직하게는 아미노산 2 내지 10개의 아미노산 서열인 결합체.
- 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 아미노산이 리신, 아르기닌 또는 히스티딘, 더욱 바람직하게는 리신 또는 아르기닌인 결합체.
- 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 BX(X)rXB 모이어티에 포함된 상기 비염기성 아미노산이 글루탐산(E), 글리신(G), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 루신(L), 발린(V), 프롤린(P), 및 시트룰린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합체.
- 제 20 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 화학식 (I)로 표시되며,- o는 1이고/거나,- p 및/또는 q는 1이고/거나,- X1은 아미노산 3 내지 12개의 서열이고/거나,- X2는 아미노산 2 내지 10개의 서열이고/거나,- r은 0이고/거나,- m은 1인 결합체.
- 제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 인간 헤파린 결합 단백질 유래이고 세포 또는 조직 내로 침투할 수 있으며 하기로 이루어진 군으로부터, 특히 서열 번호 1, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 및 서열 번호 8로부터 선택되는 결합체:- DPV3(서열 번호: 1): Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser- DPV6(서열 번호: 2): Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys Pro- DPV7(서열 번호: 3): Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro- DPV7b(서열 번호: 4): Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Pro Arg Ser Arg- DPV10(서열 번호: 5): Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly- DPV3/10(서열 번호: 6): Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro ArgHis Leu- DPV10/6(서열 번호: 7): Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg- DPV1047(서열 번호: 8): Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val- DPV1048 (서열 번호: 9): Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Asp Val- DPV15(서열 번호: 10): Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg- DPV15b(서열 번호: 11): Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg.
- 제 27 항에 있어서, 상기 펩티드가 C 또는 N 위치에 시스테인이 존재하는 결합체.
- 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택되는 결합 체:
- 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 1개 이상의 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체 내에 포함하는 약학 조성물.
- 제 30 항에 있어서, 경구, 두개 내, 척수 내, 소화관 또는 비경구 투여를 목적으로 하는 약학 조성물.
- 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 다른 치료학적 요법 또는 제제와의 동시적 또는 순차적 투여를 목적으로 하는 약학 조성물.
- 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료용 약학 조성물.
- 제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 결장암, 폐암(즉, 소세포암, 비소세포암, 기관지암), 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암, 간암, 두경부암, 위암, 방광암, 비호지킨 림프종암, 흑색종, 백혈병, 신경모세포종, 또는 아교모세포종의 치료용 약학 조성물.
- 제 32 항에 있어서, 다른 치료학적 요법 또는 제제, 예컨대 5-플루오로우라실, 류코보린, 옥살리플라틴, 카페시타빈, 빈크리스틴, 셀레브렉스, 테모졸로미드, 셀레늄, 탈리도미드, 테모졸로미드, 세툭시맙, 겜시타빈, 도세탁셀, 3-AP, 카르보플라틴, 보르테조밉, 베바시주맙, 소라페닙, 시스플라틴, 게피티닙, 플라보피리돌, 엘보린, 카르보플라틴, 암루비신, 류코보린, 트라스투주맙, 페메트렉세드, 에를로티닙, 미토마이신 C, AMG706, 파니투맙, 파클리탁셀, 랄티트렉세드, 이마티닙, 아브식시맙, 인픽시맙, 팔리비주맙, 리툭시맙, 겜투주맙 오조가미신, 알렘투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄을 이용한 동시적 또는 순차적 치료에 의한 항암 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 유효량의 1개 이상의 화합물의, 암 치료용 약학 조성물의 제조에 있어서의 용도.
- 하기 화학식 (V)로 표시되는 화합물 또는 이의 염 및/또는 이성질체:
상기식에서, B는 치환 또는 비치환된 시클로알킬기이고, R1 및 R2는 독립적으로 부재하거나, 또는 치환 또는 비치환된 2가 알킬, 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기이다. - 제 37 항에 있어서, R1은 치환 또는 비치환된 2가 알킬, 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기이고, R2는 부재하거나 또는 치환 또는 비치환된 2가 알킬, 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기인 화합물.
- 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 1개 이상의 R1 및 R2가 -O-, -NR'-, -SR'-, -SiR'R"-, -OC(O)-, -C(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'-, -NR"OC(O)-, 및 -NR"C(O)2-로부터 선택되는 1개 이상의 2가 라디칼이 개입되어 있으며, 이때 R' 및 R"는 독립적으로 상기 정의된 바와 같고, 특히 R' 및 R"는 수소, (C1-C8)알킬, (C1-C8)헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택되는 화합물.
- 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,- B는 시클로펜틸 또는 시클로헥실 라디칼을 포함하는 시클로(C3-C8)알킬, 바람직하게는 비치환된 시클로알킬이고/거나,- R1은 폴리(에틸렌 글리콜)(즉, PEG) 및 이의 유도체, 예컨대 PEG-3, -4, -5, 또는 -6을 포함하는 헤테로알킬기이고/거나,- R1은 직쇄형 (C1-C8) 알킬쇄, 특히 -CH2- 또는 -CH2CH2-이고/거나,- R1은 임의로는 -OC(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'- 및 -NR"C(O)2-, 바람직하게는 -CONR'- 또는 -NR"OC(O)-로부터 선택되는 1개 이상의, 바람직하게는 1 또는 2개의 2가 라디칼이 개입된 (C1-C8) 알킬쇄로서, 이때 R' 및 R"은 상호 독립적으로 바람직하게는 수소 및 (C1-C8)알킬로부터 선택되며, 선택적으로 상기 (C1-C8) 알킬쇄는 상기 정의된 바와 같이 1개 이상의 시클로알킬쇄를 포함하고/거나,- R2는 부재하고/거나,- R2는 폴리(에틸렌 글리콜)(즉, PEG) 및 이의 유도체, 예컨대 PEG-3, -4, -5, 또는 -6을 포함하는 헤테로알킬이고/거나,- R2는 직쇄형 (C1-C8) 알킬쇄, 특히 -CH2- 또는 -CH2CH2-이고/거나,- R2는 선택적으로 -OC(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'- 및 -NR"C(O)2-, 바람직하게는 -CONR'- 또는 -NR"OC(O)-로부터 선택되는 1개 이상의, 바람직하게는 1 또는 2개의 2가 라디칼이 개입된 (C1-C8) 알킬쇄로서, 이때 R' 및 R"은 상호 독립적으로 바람직하게는 수소 및 (C1-C8)알킬로부터 선택되며, 선택적으로 상기 (C1-C8) 알킬쇄는 1개 이상의 시클로알킬쇄를 포함하는 화합물.
- 제 37 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및/또는 R2가 1개 이상의 2가 라디칼에 의해 개입되어 있으며, 상기 개입이 R1 및/또는 R2기의 임의의 내부 위치 또는 R1 및/또는 R2기가 화학식 (V)의 화합물의 나머지 부분에 부착되는 위치에 존재하는 화합물.
- 제 37 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택되는 화합물:4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-6-아미도카프로산,4-[(N-말레이미도에틸)카르복스아미도에틸(Peg)4 카르복스아미도메틸]시클로헥산카르복실산,4-[(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-6-아미도헥산카르복스아미도 메틸]시클로헥산카르복실산, 및4-[((N-말레이미도메틸)시클로헥산카르복스아미도)메틸]시클로헥산카르복실 산.
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