CN110177566A - 用于制备靶向肿瘤-脉管系统的抗肿瘤剂的方法 - Google Patents

用于制备靶向肿瘤-脉管系统的抗肿瘤剂的方法 Download PDF

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Abstract

用于制备靶向肿瘤‑脉管的抗肿瘤剂的合成方法，其中所述抗肿瘤剂包含通过连接体缀合至抗癌药物的膜联蛋白‑1结合肽。用于以高纯度和高产率制备靶向肿瘤‑脉管的抗肿瘤剂的有效的、实用的、可再现的和可扩展的方法，其中抗肿瘤剂包含通过连接体缀合至抗癌药物的膜联蛋白‑1结合肽。

Description

用于制备靶向肿瘤-脉管系统的抗肿瘤剂的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月30日提交的美国临时专利申请号62/402,127的优先权权益。
技术领域
本发明涉及用于通过关键中间体BCH-SN38制备靶向肿瘤-脉管系统的抗肿瘤剂IF7-SN38的合成方法。IF7-SN38是一种抗肿瘤剂，其包含膜联蛋白-1结合肽，命名为IF7，其通过命名为BCH的连接体缀合至有效的抗癌药物SN38。
背景技术
在制备规模上合成候选药物的主要障碍是缺乏有效的方法，其可以导致经济地以高产率和纯度形成中间体和产物。用于合成活性药物成分(API)的早期药物化学方案需要大量的方法开发研究和优化以将mg-规模方案转化为适合于大规模制备API的方法。
根据Meyer-Losic et al.,Clin.Cancer Res.2008；14:2145-53描述的方法，做了一些修改，Hatakeyama等人和同一作者Michiko Fukuda,(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2011Dec6；108(49):19587-19592；WO2011079304 A1)报道了以毫克规模合成IF7-SN38。然而，该合成在可扩展性和可再现性方面存在严重问题，产生副反应，这反过来导致繁琐的纯化、低产率和纯度。由于在反应混合物中许多副产物的形成，需要几个反相纯化以纯化倒数第二步的BCH-SN38和最终产物。作为长时间纯化过程的结果，在纯化过程中观察到降解和新的副产物的形成，这使得合成方法对于IF7-SN38的大规模生产而言是难处理的、不能再现的和不切实际的。
因此，本发明的目的是开发一种有效的、实用的、可再现的和可扩展的方法，用于以高纯度和高产率制备cGMP等级IF7-SN38。
鉴于上述情况，本发明的目的是提供本文所描述的所期望的特征。
发明内容
公开了包含部分和肽的组合物，该肽包含可以与细胞上的碳水化合物受体结合的氨基酸序列。该组合物可用于治疗包括癌症的各种类型的疾病。碳水化合物受体可以是膜联蛋白-1。氨基酸序列可以选择性地结合碳水化合物受体。对象可包含细胞。细胞可以是内皮细胞。肽可以是膜联蛋白-1结合化合物。氨基酸序列可以是膜联蛋白-1结合化合物。
肽可以包含至少6个氨基酸。肽可以包含至少7个氨基酸。肽可以包含至少8个氨基酸。肽可以包含至少9个氨基酸。肽可以进一步包含部分肽。肽可以是头尾环状的。
本文公开的组合物可以包含一种或多种部分。例如，部分可以是分子、缀合物、缔合物、组合物和混合物。部分可以是小分子、药物、毒素、脂肪酸、可检测标志物、缀合标记、纳米壳或酶。实例部分包括但不限于抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化疗剂、细胞毒素剂、抗炎剂、抗关节炎剂、多肽、核酸分子、小分子、纳米颗粒和微粒。部分的至少一种可以是治疗剂。治疗剂的实例可以是紫杉醇和多西紫杉醇(docetaxel)。
该组合物可以进一步包含连接部分和肽的连接体。该组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。该组合物可以进一步包含可检测的试剂。该组合物可以进一步包含治疗剂。该组合物可以进一步包含抗癌剂。该组合物可以进一步包含多种肽，其中至少一种肽包含选择性结合至肿瘤脉管系统的氨基酸序列。
部分可以与肽共价连接。部分可以与肽的氨基末端连接。部分可以与肽的羧基末端连接。部分可以与肽内的氨基酸连接。部分可以是喜树碱(CPT)衍生物。部分可以是SN38。部分可包含可检测的试剂。部分可包含治疗剂。治疗剂可包含用于治疗癌症的化合物或组合物。治疗剂可包含化合物或组合物以诱导程序性细胞死亡或凋亡。治疗剂可以是Abraxane。治疗剂可以是紫杉醇。治疗剂可以是多西紫杉醇。部分的至少一种可以是可检测的试剂。可检测的试剂可以是FAM。
所公开的膜联蛋白-1结合化合物和部分可以以任何有用的方式连接。例如，膜联蛋白-1结合化合物和部分可以共价偶联(直接或间接)、非共价偶联(直接或间接)或两者。直接偶联可以通过膜联蛋白-1结合化合物与部分之间的共价键。在这种情况下的共价键可以被认为是膜联蛋白-1结合化合物与部分之间的连接。间接偶联可以通过一种或多种间插分子或组分。有用的直接偶联可以通过连接体。连接体，偶联膜联蛋白-1结合化合物和部分的连接体中的任何键，膜联蛋白-1结合化合物与连接体之间的键，和/或部分和连接体之间的键可以被认为是连接。可以使用任何合适的连接体。例如，连接体可以是低聚体，诸如肽或肽模拟物。
本文公开的组合物可以作为药学上可接受的无机或有机盐制备和/或施用，通过与无机或有机酸反应形成(P.H.Stahl and C.G.Wermuth,editors,Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use,Weinheim/Zürich:Wiley-VCH/VHCA,2002)。无机酸和有机酸的示例性实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硼酸、高氯酸、硝酸、硫酸、磷酸，和有机酸诸如甲酸、乳酸、柠檬酸、草酸，甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸和富马酸。
应理解，除非另有说明，否则所公开的方法和组合物不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特定的反应物，并且因此可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述具体的实施方式的目的，而不旨在是限制性的。
本发明涉及制备IF7-SN38的方法。该方法涉及三个步骤，如图1-3中所描述：(1)BCH的合成；(2)BCH-SN38的合成；(3)IF7-SN38的合成。与现有技术出版物中描述的方法不同，本发明描述了简单的、可扩展的和经济的方法，并且利用高纯度BCH-SN38以高产率和高纯度生产IF7-SN38而无需大规模反相柱色谱纯化方法。
当将IF7-SN38静脉内注射到携带人结肠HCT116肿瘤的裸鼠中时，它在低剂量下有效抑制肿瘤生长，没有明显的副作用。这些结果表明IF7肽通过靶向肿瘤脉管系统表面上表达的Anxa1而充当有效的药物递送载体。
本发明的一个目的是提供靶向肿瘤-脉管的抗肿瘤剂。
本发明的另一个目的是提供靶向肿瘤-脉管的抗肿瘤剂，其中抗肿瘤剂包含通过连接体缀合至抗癌药物的膜联蛋白-1结合肽。
本发明的又另一个目的是提供靶向肿瘤-脉管的抗肿瘤剂，其中膜联蛋白-1结合肽是具有序列IFLLWQR(IF7)的肽。
本发明的仍另一个目的是提供靶向肿瘤-脉管的抗肿瘤剂，其中抗癌药物是7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)。
本发明的另一个目的是提供靶向肿瘤-脉管的抗肿瘤剂，其中连接体是4-{4-[(N-马来酰亚胺(maleimydo)甲基)环己烷甲酰氨基]甲基}环己烷-1-羧酸(BCH)。
本发明的进一步的目的是提供制备IF7-SN38的方法。
本发明的又另一个目的是提供制备IF7-SN38的方法，其中该方法包括：
a)合成BCH；
b)合成BCH-SN38；和
c)合成IF7-SN38
附图说明
本发明的新颖特征以及本发明本身，关于其结构和其操作二者，都将从附图中结合所附说明书得到最好的理解，并且其中：
图1图解了BCH的化学合成。
图2图解了BCH-SN38的化学合成。
图3图解了IF7-SN38的化学合成。
现在转到以下实施例可以更好地显现本发明。
具体实施方式
化学药品和反应物的缩写
SMCC 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯
AMCA 反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸(氨甲环酸(Tranexamic acid))
BCH 4-{4-[(N-马来酰亚胺甲基)环己烷甲酰氨基]甲基}环己烷-1-羧酸
SN38 7-乙基-10-羟基喜树碱
IF7C(RR) IFLLWQR-C-RR肽
TCTU O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲(uronium)四氟硼酸盐
DIPEA 二异丙基乙胺
ACN 乙腈
DMF 二甲基甲酰胺
MTBE 甲基叔丁基醚
DCM 二氯甲烷
IF7-SN38是一种用于靶向疗法的新型抗癌前体药物。目前正在临床试验中的竞争者药物是聚乙二醇缀合的SN38胶束(聚乙二醇化(PEGylated)SN38)，其穿透肿瘤通过无组织的内皮细胞层并声称对脑肿瘤细胞有效。这种药物的临床试验由美国公司NEKTOR和Enzon赞助。Enzon对结肠直肠癌的II期临床试验未获成功。另一方面，NEKTOR赞助的对脑肿瘤II期的临床试验取得了成功，并且该药物已转入III期。
PEG-SN38克服血脑屏障，但不靶向脑肿瘤。结果，患者注射了高剂量的聚乙二醇化SN38，这导致严重的副作用。相比之下，由于IF7肽的独特性质，IF7-SN38以高效率靶向脑肿瘤，并通过被动转胞吞机制克服血脑屏障。因此，使用本文的靶向疗法，需要向患者注射少量的IF7-SN38。IF7-SN38的效率在小鼠中是前所未有的，特别是对于脑恶性肿瘤。实验研究表明，使用IF7-SN38治疗患有肿瘤的小鼠导致肿瘤大小显著缩小，而在治疗小鼠中没有产生任何副作用。相信IF7-SN38通过靶向包括脑恶性肿瘤在内的恶性肿瘤比聚乙二醇化SN38更好地起作用。IF7-SN38在靶细胞中释放SN38的低剂量、特异性和易降解性质是本文的药物优于PEG-SN38的主要因素。
本发明提供了可靠的可再现的方法，用于制备用于临床研究的大量API。
实施例
之前的毫克规模IF7-SN38的制备缺乏API的大规模生产所需的性质和方法特征。进行了有效的方法开发和优化，以建立强健的和可再现的方法，以克服我们迫切需要的超出体外和体内研究的用于下一期活动的大量的API的问题。本发明为高产率和高纯度的IF7-SN38的大规模制备提供了有效的、强健的和成本有效的方法。
使用分析型反相高效液相色谱(HPLC)体系开发适用于检测3步方法的所有组分的HPLC方法。最后优化HPLC方法并用于监测所有反应。在不同的反应条件下监测和评估产物的面积百分纯度和反应速率。基于反应混合物的总纯度曲线和在cGMP条件下大规模制备API的反应条件的相容性来选择最佳条件。在开发的方法中评估了所有决定性的方法参数(CPP)，并为该方法选择了最佳反应条件，该方法参数包括反应物和反应物的类型和化学计量比、反应物的添加顺序、温度、时间、反应溶剂的类型，以及反应混合物的可选的后处理(work up)(酸性、中性和碱性)。
下面详细提供了制备约10克概念验证批(Proof-of-Concept batch)IF7-SN38的代表性过程，但可根据需要增加或减少批量大小。进一步强调，对于所述批量大小，反应物和溶剂的温度范围、重量和体积以及反应时间是示例性的，并且不应被解释为限制性的。这些参数可以根据所期望的批量大小而变化。在本领域中充分理解的是，偶尔会发生与特定过程的微小偏差，并且在本发明的范围内是允许的。本发明的方法在以下过程中详述，这些程序是以举例说明的方式提供的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
方法的第一步是在如下描述的优化条件下合成BCH。
步骤1
·冲洗100mL三颈圆柱形烧瓶，配备机械搅拌器，J-Kem温度控制器和氮气入口，在氮气下
·向烧瓶中加入SMCC和AMCA，然后在搅拌下加入乙腈和水
·缓慢加入DIPEA，让混合物在环境温度(22±2℃)下搅拌过夜(14小时)
·通过HPLC分析混合物中SMCC的消失和BCH的形成
·用MTBE(61mL)稀释反应混合物并搅拌5分钟
·过滤固体并用MTBE(2×20mL)洗涤
·将所得的白色固体溶于20％MeOH/DCM(407mL)中
·用15％盐水溶液(2×40.7mL)洗涤有机溶液
·分离有机溶液，并用DCM(40.7mL)萃取合并的水溶液
·用Na2SO4(270g)干燥合并的有机溶液10分钟
·过滤溶液并用DCM(122mL)洗涤过滤器
·在20-25℃下将溶液浓缩至白色固体
·在环境温度下将固体在丙酮(61mL)中悬浮(slurry)30分钟
·过滤固体并用丙酮(20mL)和1：1 MTBE/丙酮(2×20mL)洗涤
·在20-30℃的高真空下干燥固体至少24小时
该方法得到的BCH为白色固体(3.106g，68％产率)，通过HPLC和NMR的纯度>99.9％。包括1H-NMR&13C-NMR和质谱的分析数据与分子的结构一致。
该方法的第二步是在如下描述的优化条件下合成BCH-SN38。
步骤2
·冲洗500mL三颈圆柱形烧瓶，配备机械搅拌器，J-Kem温度控制器和氮气入口，在氮气下
·向烧瓶中加入BCH、SN38、TCTU和Na2SO4
·在(0±1℃)搅拌下加入无水DMF
·一次性加入NaHCO3，并在相同温度下搅拌混合物
·3小时后通过HPLC分析该批
·4小时后淬灭该批
·将该批冷却至-5±5℃
·在搅拌下一次性用冷的0.08M HCl(290mL)水溶液稀释该批
·搅拌该批5分钟
·过滤该批并用冰冷的20％DMF/水(3×60mL)和MTBE(2×60mL)溶液洗涤
·将湿固体溶于DCM(290mL)中，并用0.01 M HCl(120mL)和盐水(120mL)洗涤
·用硫酸钠干燥有机溶液10分钟
·用DCM(2×120mL)过滤并洗涤过滤器
·浓缩溶液并将固体重新溶解在DCM(60mL)中
·在搅拌下用MTBE(350mL)稀释DCM溶液
·过滤固体并用6：1 MTBE/DCM(60mL)和MTBE(60mL)洗涤滤饼
·在25-30℃的高真空下干燥固体至少18小时
该方法得到的BCH-SN38为浅黄色固体(4.98g，89％产率)，通过HPLC和NMR的纯度为97.7％。包括1H-NMR&13C-NMR和质谱的分析数据与分子的结构一致。
该方法的最后一步是在如下描述的优化条件下合成IF7-SN38。
步骤3
·冲洗500mL三颈圆柱形烧瓶，配备机械搅拌器，J-Kem温度控制器和氮气入口，在氮气下
·向烧瓶中加入BCH-SN38
·在环境温度(22±2℃)下搅拌下加入无水DMF(12mL)
·在搅拌下缓慢加入IF7C(RR)在无水DMF(48mL)中的溶液。
·让混合物在相同温度下搅拌过夜
·在15小时后通过HPLC分析该批以完成反应
·16小时后淬灭该批
·在搅拌下用乙腈(400mL)稀释该批
·搅拌该批10分钟
·过滤固体并用乙腈(3×80mL)洗涤滤饼
·将湿固体悬浮在乙腈(80mL)中1小时
·过滤固体并用乙腈(2×40mL)洗涤滤饼
·再次重复乙腈悬浮过程
·过滤固体并用乙腈(2×40mL)洗涤滤饼
·在25-30℃的高真空下干燥固体至少3天
该方法得到的IF7-SN38为浅黄色固体(11.374g，90％收率)，通过HPLC和NMR作为其TFA盐的纯度为96.8％。TFA是IF7肽的抗衡离子，并将在最后一步转移到API。包括1H-NMR&13C-NMR和质谱的分析数据与产物的结构一致。
使用肽的相应盐将实现IF7-SN38的其他盐形式，特别是HCl盐的合成。列出相应盐
本发明的一个实施方式提供了靶向肿瘤-脉管的抗肿瘤剂。
本发明的另一个实施方式提供了一种靶向肿瘤-脉管的抗肿瘤剂，其中抗肿瘤剂包含通过连接体缀合至抗癌药物的膜联蛋白-1结合肽。
本发明的又另一个实施方式提供了靶向肿瘤-脉管的抗肿瘤剂，其中膜联蛋白-1结合肽具有肽序列IFLLWQR(IF7)。
本发明的进一步实施方式提供了靶向肿瘤-脉管的抗肿瘤剂，其中抗癌药物是7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)。
本发明的另一个实施方式提供了靶向肿瘤-脉管的抗肿瘤剂，其中连接体是4-{4-[(N-马来酰亚胺甲基)环己烷甲酰氨基]甲基}环己烷-1-羧酸。
本发明的进一步实施方式提供了制备IF7-SN38的方法。
本发明的仍另一个实施方式提供了制备IF7-SN28的方法，其中该方法包含：
a)合成BCH；
b)合成BCH-SN38；和
c)合成IF7-SN38。
本发明的又另一个实施方式提供了用于制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，该抗癌化合物具有式I的最终结构，
其中R是包含IFLLWQRX1X2X3的氨基酸序列的肽，
(a)提供具有以下最终结构的连接体：
其中连接体是通过偶联4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)和反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸(AMCA)形成的，根据以下合成：
(b)提供用于连接至连接体的部分，其中该部分是喜树碱类似物，进一步其中该部分连接于连接体，得到部分-连接体产物；和
(c)将(b)的部分-连接体产物与R缀合，得到式I。
本发明的仍另一个实施方式提供了制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，其中该方法进一步包含：
(d)纯化连接体；
(e)纯化连接体-部分产物；和
(f)纯化式I的产物。
本发明的进一步实施方式提供了制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，其中使用碱和至少两种溶剂，该碱包含二异丙基乙胺和溶剂包含乙腈和水。
本发明的另一个实施方式提供了制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，其中BCH连接体通过悬浮/研制(slurry/trituration)进行纯化。在优选的实施方式中，连接体-部分产物通过悬浮/研制进行纯化。在另一个优选的实施方式中，抗癌化合物通过悬浮/研制进行纯化。在仍另一个优选的实施方式中，在悬浮/研制中使用至少一种溶剂，至少一种溶剂包含乙腈。
本发明的又另一个实施方式提供了制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，其中在悬浮/研制中使用至少两种溶剂，至少两种溶剂包含丙酮和甲基叔丁基醚。
本发明的仍另一个实施方式提供了制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，其中连接体-部分产物通过连接体和喜树碱类似物的偶联制备。
本发明的进一步仍实施方式提供了制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，其中偶联在O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和硫酸钠或硫酸钾存在下发生。
本发明的另一个实施方式提供了制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，其中使用碱和至少一种溶剂，其中碱选自碳酸氢钠和碳酸氢钾以及溶剂是二甲基甲酰胺或等同物。
本发明的又另一个实施方式提供了制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，其中具有式I结构的抗癌化合物通过连接体-部分产物和R的肽偶联制备。在优选的实施方式中，在二甲基甲酰胺或等同物中发生偶联。
本发明的进一步实施方式提供了制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，其中连接体-部分产物在X1位置处缀合至R。
本发明的仍另一个实施方式提供了制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，其中X2和X3是相同的氨基酸。在另一个实施方式中，X2和X3是不同的氨基酸。
应当理解，出于说明的目的给出的前述实施方式的细节不应解释为限制本发明的范围。尽管上面已经详细描述了本发明的几个实施方式，但是本领域技术人员将容易理解，在示例性实施方式中可以进行许多修改而不实质上脱离本发明的新颖教导和优点。因此，所有这些修改都旨在包括在本发明的范围内，本发明的范围由所附权利要求及其所有等同物限定。进一步，认识到可以构思出许多实施方式，这些实施方式不能实现一些实施方式特别是优选实施方式的所有优点，但是特定优点的不存在不应被解释为必需地意味着这样的实施方式在本发明的范围之外。

Claims (17)

1.一种制备能够靶向肿瘤的抗癌化合物的方法，所述抗癌化合物具有式I的最终结构，
其中R是包含氨基酸序列IFLLWQRX1X2X3的肽，所述方法包含以下步骤：
(a)提供连接体，其最终结构为：
其中所述连接体通过偶联4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)和反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸(AMCA)形成，根据以下合成：
(b)提供用于连接至所述连接体的部分，其中所述部分是喜树碱类似物，进一步其中所述部分连接于所述连接体，得到部分-连接体产物；和
(c)将(b)的所述部分-连接体产物与X缀合，得到式I。
2.权利要求1所述的方法，进一步包括：
(d)纯化所述连接体；
(e)纯化所述连接体-部分产物；和
(f)纯化式I的所述产物。
3.权利要求2所述的方法，其中使用碱和至少两种溶剂，所述碱包含二异丙基乙胺和溶剂包含乙腈和水。
4.权利要求1所述的方法，其中所述连接体通过悬浮/研制来纯化。
5.权利要求4所述的方法，其中在所述悬浮/研制中使用至少两种溶剂，所述至少两种溶剂包含丙酮和甲基叔丁基醚。
6.权利要求1所述的方法，其中所述连接体-部分产物通过所述连接体和所述喜树碱类似物的偶联制备。
7.权利要求6所述的方法，其中所述偶联在O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和硫酸钠或硫酸钾存在下发生。
8.权利要求6所述的方法，其中使用碱和至少一种溶剂，其中所述碱选自碳酸氢钠和碳酸氢钾，并且所述溶剂是二甲基甲酰胺或等同物。
9.权利要求1所述的方法，其中所述连接体-部分产物通过悬浮/研制来纯化。
10.权利要求9所述的方法，其中在悬浮/研制中使用至少两种溶剂，所述至少两种溶剂包含二氯甲烷和甲基叔丁醚。
11.权利要求1所述的方法，其中所述具有所述式I结构的抗癌化合物通过使所述连接体-部分产物和R的肽偶联制备。
12.权利要求11所述的方法，其中所述偶联发生在二甲基甲酰胺或等同物中。
13.权利要求1所述的方法，其中所述抗癌化合物通过悬浮/研制来纯化。
14.权利要求13所述的方法，其中在所述悬浮/研制中使用至少一种溶剂，所述至少一种溶剂包含乙腈。
15.权利要求1所述的方法，其中所述连接体-部分产物在X1位置处缀合至R。
16.权利要求1所述的方法，其中X2和X3是相同的氨基酸。
17.权利要求1所述的方法，其中X2和X3是不同的氨基酸。
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