WO2018147437A1 - 低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤 - Google Patents

低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤 Download PDF

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WO2018147437A1
WO2018147437A1 PCT/JP2018/004702 JP2018004702W WO2018147437A1 WO 2018147437 A1 WO2018147437 A1 WO 2018147437A1 JP 2018004702 W JP2018004702 W JP 2018004702W WO 2018147437 A1 WO2018147437 A1 WO 2018147437A1
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molecular weight
peptide
cell membrane
low molecular
pharmaceutical compound
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PCT/JP2018/004702
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真莉子 武田
敬泰 亀井
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学校法人神戸学院
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    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein

Definitions

  • the present invention relates to a transmucosal absorption accelerator for pharmaceutical substances.
  • Non-patent Document 1 cell-penetrating peptides (cell-penetrating peptides (CPPs)) such as TAT peptides and penetratin.
  • CPPs cell-penetrating peptides
  • TAT peptides TAT peptides
  • penetratin cell-penetrating peptides
  • these peptides promote the transmucosal absorption of drugs by crosslinking with drugs, or promote the transmucosal absorption of drugs with relatively large molecular weights such as proteins and peptides.
  • An object of the present invention is to provide a transmucosal absorption promoter of a low molecular weight pharmaceutical compound. It is another object of the present invention to provide a transmucosal absorption promoter that does not require cross-linking with a drug and has reduced adverse effects on a living body.
  • the present inventors have found that the membrane permeability of the low molecular weight pharmaceutical compound is improved by using the cell membrane permeable peptide together with the low molecular weight pharmaceutical compound without crosslinking. As a result of further research based on this finding, the present invention was completed.
  • the present invention includes the following embodiments: Item 1. A transmucosal absorption enhancer of a low molecular weight pharmaceutical compound containing a cell membrane penetrating peptide.
  • Item 2. Item 2. The transmucosal absorption promoter according to Item 1, wherein the cell membrane permeable peptide is at least one selected from the group consisting of penetratin and oligoarginine peptide.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 5. The transmucosal absorption promoter according to any one of Items 1 to 4, wherein the oral bioavailability of the low molecular weight pharmaceutical compound is 40% or less.
  • Item 6. A pharmaceutical composition comprising the transmucosal absorption promoter according to any one of Items 1 to 5 and a low molecular weight pharmaceutical compound.
  • Item 7. The pharmaceutical composition according to Item 6, which is a transmucosal administration agent.
  • Item 8. Item 8. The pharmaceutical composition according to Item 6 or 7, which is an oral agent.
  • a cell membrane permeation peptide for use as a transmucosal absorption enhancer of a low molecular weight pharmaceutical compound is provided.
  • Use of a cell membrane-penetrating peptide for producing a transmucosal absorption enhancer of a low molecular weight pharmaceutical compound is provided.
  • a method for promoting transmucosal absorption of a low molecular weight pharmaceutical compound comprising using a low molecular weight pharmaceutical compound and a cell membrane-penetrating peptide in combination.
  • transmucosal absorption enhancer of the present invention does not require crosslinking with a drug. Moreover, since the adverse effect on the medicine discharge mechanism of the living body is small and the problem of tight junction opening is small, the adverse effect on the living body is further reduced.
  • transmucosal absorption enhancer of the present invention it is possible to further reduce drug candidate compounds that drop out during development because they have excellent membrane activity but low membrane permeability. It is also possible to increase the success rate of pharmaceutical research and development.
  • low-membrane-permeability low-molecular-weight pharmaceutical compounds are mainly provided as injections, injections require the act of piercing a needle, and the burden on patients is great.
  • disposal after the use of a syringe places an economic burden and an environmental burden, and in developing countries, there is a possibility of infectious diseases caused by reusing the syringe.
  • a formulation form for example, a transmucosal administration agent
  • Test Example 1 The result of Test Example 1 is shown.
  • the vertical axis represents the relative value of the membrane permeability coefficient (P app ).
  • MTX represents methotrexate
  • VCR represents vincristine.
  • “Alone” indicates that the cell membrane-penetrating peptide is not used in combination
  • “+ D-Pen 50 ⁇ M” indicates that the cell membrane-penetrating peptide is used in combination with a peptide composed of a penetratin sequence composed only of D-amino acids.
  • “-Pen 50 ⁇ M” indicates a case where a peptide having a penetratin sequence composed only of L-amino acids is used in combination as a cell membrane-penetrating peptide.
  • Test Example 2 The result of Test Example 2 is shown.
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity, and the horizontal axis indicates the wavelength. Overlapping lines indicate changes in fluorescence intensity when the drug concentration is increased in order from top to bottom.
  • the result of Test Example 3 is shown.
  • the vertical axis represents the blood fluorescein concentration.
  • “Fluorescein” indicates the case where fluorescein was administered alone
  • “+ D-penetratin (0.5 mM)” represents a cell membrane permeation peptide (a peptide consisting of a penetratin sequence composed only of D-amino acids) together with fluorescein. The case where it uses together is shown.
  • the result of Test Example 4 is shown.
  • the vertical axis represents the rise amount of risedronate sodium.
  • “Risedronate (10 ⁇ M)” represents the case where risedronate sodium was administered alone
  • + D-penetratin (60 ⁇ M) indicates the case where a cell membrane permeation peptide (a peptide consisting of a penetratin sequence composed only of D-amino acids) is used in combination with risedronate sodium.
  • the result of Test Example 5 is shown.
  • the vertical axis shows the amount of zanamivir permeation.
  • Zanamivir (10 ⁇ M) indicates the case of administration of zanamivir alone
  • + D-penetratin (60 ⁇ M) is a cell membrane-penetrating peptide (a peptide consisting of a penetratin sequence composed only of D-amino acids together with zanamivir. ) Is used together.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is substituted with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitution with amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution.
  • amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues having non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan
  • Amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, and isoleucine
  • Aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine
  • substitutions between amino acid residues are conservative substitutions.
  • the transmucosal absorption enhancer of a low molecular weight pharmaceutical compound containing a cell membrane-penetrating peptide in this specification, sometimes referred to as “transmucosal absorption enhancer of the present invention”
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition (also referred to as “the pharmaceutical composition of the present invention” in the present specification) containing the transmucosal absorption promoter of the present invention and a low molecular weight pharmaceutical compound.
  • the cell membrane permeation peptide is a general term for peptides having cell membrane permeability per se, and is not particularly limited as long as it is such a peptide.
  • Various cell-permeable peptides have been reported. For example, penetratin, peptides composed of basic amino acids (oligoarginine (R 6 to R 12 ), HIV-TAT (47-57), pVEC, MAP (Model amphipathic peptide ), Transportan 10, Pep-1, etc.
  • HIV-1 Rev 34-50
  • FHV coat 35-49
  • CCMV Gag 7-25
  • Chimeric dermaseptin S4 and SV40 'S4 13 -PV' herpes simplex virus transcription factor (267-330) VP22
  • InfluencaHA-2 (1-20) KALA sequence, KLA sequence, sC18, Kaposis sarcoma fibroblast growth factor Kaposi FGF, Signal sequence of Ig light chain from Caiiman crocodylus, Integrin ⁇ 3-fragment, Grb2 (SH 2 domain), Fusion sequence HIV-1 gp41 (1-23), Hepatitis B virus translocation motif, Sperm-egg fusion protein (89-111), Human calcit onin partial
  • a peptide composed of penetratin and a basic amino acid is preferable, and penetratin is more preferable.
  • Cell membrane permeability can be determined by evaluating the migration from apical side to basal side in the case of using only a peptide according to or according to Test Example 1.
  • penetratin examples include, in addition to wild-type penetratin, which is a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (N-terminal-RQIKIWFQNRRMKWKK), modified penetratin comprising a sequence obtained by modifying the wild-type penetratin sequence.
  • modifications include reverse sequence, replacement of N-terminal sequence and C-terminal sequence, substitution of basic amino acids with other basic amino acids, addition of one or more basic amino acids, shuffling of amino acid sequence order, etc. Is mentioned.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (N-terminal—KKWKMRRNQFWIKIQR) (reverse sequence of the wild-type penetratin sequence), represented by SEQ ID NO: 3 (N-terminal—NRRMKWKKRQIKIWFQ) Peptide consisting of amino acid sequence, peptide consisting of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (N-terminal-RQIRIWFQNRRMRWRR), peptide consisting of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (N-terminal-KQIKIWFQNKKMKWKK), SEQ ID NO: 6 (N-terminal) -Peptide consisting of an amino acid sequence represented by -KQIRIWFQNKKMRWRR), peptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (N-terminal-RRRRRQIKIWFQNRRMKWKK), peptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:
  • Penetratin is substituted with one or more (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, preferably 1 to 2, more preferably 1) amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 , Deletion, addition, or insertion (preferably a substitution, more preferably a conservative substitution) amino acid sequence, and a peptide having a transmucosal absorption promoting effect.
  • the presence or absence of the transmucosal absorption promoting effect can be determined according to or according to a known method, for example, according to the method described in Test Example 1 described later.
  • a peptide composed of basic amino acids is a peptide formed by peptide bonding of a plurality of basic amino acids (preferably an amino group and a carboxyl group on the main chain of the basic amino acid), and is not particularly limited.
  • the peptide may be composed of only one basic amino acid, or may be composed of two or more basic amino acids.
  • the number of basic amino acids constituting the peptide is, for example, 6 to 12, preferably 7 to 10, and more preferably 7 to 9.
  • the basic amino acid is not particularly limited as long as the amino acid has a basic functional group in the side chain and an isoelectric point in the alkaline region (preferably an ⁇ -amino acid).
  • Examples of the basic functional group include a guanidino group, an amino group, an imidazolyl group and the like, preferably a guanidino group and an amino group, and more preferably a guanidino group.
  • the isoelectric point of the basic amino acid is, for example, more than 7, preferably 7.5 or more, more preferably 9 or more, and further preferably 10 or more.
  • the upper limit of the isoelectric point is not particularly limited, but is 14, for example.
  • basic amino acids include natural amino acids such as arginine, lysine, histidine, ornithine and citrulline.
  • natural amino acids such as arginine, lysine, histidine, ornithine and citrulline.
  • arginine, lysine and the like are preferable, and arginine is more preferable.
  • Non-patent Document 2 As for other cell membrane permeable peptides such as Tat peptide, pVEC, MAP (Model amphipathic peptide), transporter, and Pep-1, the amino acid sequence and the structure thereof are known (Non-patent Document 2). These cell membrane-penetrating peptides also have one or more (eg 1 to 5, preferably 1 to 3, preferably 1 to 2, more preferably 1) in the wild-type amino acid sequence as long as they have a transmucosal absorption promoting effect. May be substituted, deleted, added, or inserted (preferably substituted, more preferably conservative substitution).
  • the steric configuration of amino acids constituting the cell membrane-penetrating peptide is not particularly limited, and may be either L-form or D-form.
  • it is preferable that 95% or more, more preferably 100% of the constituent amino acids are L-form.
  • the transmucosal absorption promoting effect (particularly, transmucosal absorption promoting effect of zanamivir, etc.) is further improved, it is 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 90%. As described above, it is preferable that 95% or more, more preferably 100% of the constituent amino acids are D-form.
  • the cell membrane-penetrating peptide may be chemically modified as long as it has a transmucosal absorption promoting effect.
  • the carboxyl group at the end of the main chain may be any of carboxylate (—COO ⁇ ), amide (—CONH 2 ), or ester (—COOR).
  • R in the ester for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; C 6-12 aryl groups such as ⁇ -naphthyl; phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl; 14 aralkyl group; pivaloyloxymethyl group is used.
  • a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl
  • a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl
  • cell membrane-penetrating peptides have amino groups at the end of the main chain protected with protecting groups (eg, C 1-6 acyl groups such as C 1-6 alkanoyl such as formyl group, acetyl group, etc.)
  • protecting groups eg, C 1-6 acyl groups such as C 1-6 alkanoyl such as formyl group, acetyl group, etc.
  • Substituents on the chain eg, amino, imidazolyl, guanidino, etc.
  • appropriate protecting groups eg, C 1-6 acyl, such as C 1-6 alkanoyl, such as formyl, acetyl, etc.
  • C 1-6 acyl such as C 1-6 alkanoyl, such as formyl, acetyl, etc.
  • the cell membrane permeable peptide may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or a base.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and either an acidic salt or a basic salt can be employed.
  • acid salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, apple Organic acid salts such as acid salts, citrate salts, methanesulfonate salts, and paratoluenesulfonate salts; and amino acid salts such as aspartate salts and glutamate salts.
  • basic salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts.
  • the cell membrane permeable peptide may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
  • the cell membrane-penetrating peptides can be used alone or in combination of any two or more.
  • the transmucosal absorption promoter of the present invention is not particularly limited as long as it contains a cell membrane permeable peptide as an active ingredient.
  • a cell membrane-penetrating peptide a commercially available peptide can be used as it is, or it can be produced according to or according to a known synthesis method.
  • the low molecular weight pharmaceutical compound that is the target of absorption promotion of the transmucosal absorption promoter of the present invention is not particularly limited as long as it has biological activity and is a low molecular weight.
  • the molecular weight of the low molecular weight pharmaceutical compound is, for example, 1000 or less, preferably 100 to 1000, more preferably 300 to 1000.
  • the pKa of the low molecular weight pharmaceutical compound is, for example, from a neutral region to an acidic region, preferably pKa: 7 or less (or less than 7), more preferably pKa: 7 to 0.01, still more preferably pKa: 6 to 0.1, still more preferably pKa: 6-1.
  • the solubility of the low molecular weight pharmaceutical compound in water is preferably 40 mg / mL or less, more preferably 30 mg / mL or less.
  • the oral bioavailability of the low molecular weight pharmaceutical compound is, for example, 40% or less, preferably 30% or less, more preferably 20% or less.
  • Oral bioavailability can be measured according to a standard method, for example, according to the method described in the Japanese Pharmacopoeia.
  • the low molecular weight pharmaceutical compound is preferably a class 3 and class 4 drug of Biopharmaceutics® Classification® System® (BCS).
  • BCS Biopharmaceutics® Classification® System®
  • low molecular weight pharmaceutical compounds include various anticancer agents, low molecular weight pharmaceutical compounds that serve as substrates for gastrointestinal efflux transporters such as P-gp and BCRP, osteoporosis such as risedronate sodium, and bone page.
  • Disease treatment drugs antiviral drugs such as zanamivir, and the like.
  • anticancer agent include alkylating agents, antimetabolites, microtubule inhibitors, antibiotic anticancer agents, topoisomerase inhibitors, platinum preparations, hormone agents, and the like.
  • alkylating agent examples include cyclophosphamide, ifosfamide, nitrosourea, dacarbazine, temozolomide, nimustine, busulfan, melphalan, procarbazine, and ranimustine.
  • Antimetabolites include, for example, enositabine, carmofur, capecitabine, tegafur, tegafur uracil, tegafur gimeracil oteracil potassium, gemcitabine, cytarabine, cytarabine ocphosphate, nelarabine, fluorouracil, fludarabetine, pemetrexed, pentostatin , Doxyfluridine, hydroxycarbamide, mercaptopurine and the like.
  • the microtubule inhibitor include alkaloid anticancer agents such as vincristine and taxane anticancer agents such as docetaxel and paclitaxel.
  • Antibiotic anticancer agents include, for example, mitomycin C, doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, bleomycin, actinomycin D, aclarubicin, idarubicin, pirarubicin, pepromycin, mitoxantrone, amrubicin, dinostatin stimaramer and the like.
  • the topoisomerase inhibitor include CPT-11 having a topoisomerase I inhibitory action, irinotecan, nogitane, etoposide having a topoisomerase II inhibitory action, and sobuzoxane.
  • platinum preparation examples include cisplatin, nedaplatin, oxaliplatin, carboplatin and the like.
  • hormonal agent for example, dexamethasone, finasteride, tamoxifen, astrozole, exemestane, ethinylestradiol, chlormadinone, goserelin, bicalutamide, flutamide, brednisolone, leuprorelin, letrozole, estramustine, toremifene, phosfestol, mitotane
  • Examples include methyltestosterone, medroxyprogesterone, and mepithiostane.
  • the mucosa that is the target of the transmucosal absorption enhancer of the present invention is not particularly limited.
  • examples of the mucosa include intestinal mucosa, gastric mucosa, nasal mucosa, oral mucosa, lung mucous membrane, and the like, preferably intestinal mucosa.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described transmucosal absorption promoter of the present invention and a low molecular weight pharmaceutical compound, and may contain other components as necessary.
  • transmucosal absorbability of the low molecular weight pharmaceutical compound can be promoted.
  • the combination mode and the low molecular weight pharmaceutical compound and the cell membrane-penetrating peptide are brought into contact with each other.
  • the cell membrane-penetrating peptide and the low-molecular-weight pharmaceutical compound are not linked directly or via a linker and exist as separate molecules.
  • the other components are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable components.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a dosage form that can be absorbed from mucous membranes.
  • Oral preparations such as sustained release capsules, chewing tablets, drops, pills, liquids for internal use, confectionery tablets, sustained release agents, sustained release granules, etc .; nasal drops, inhalants, rectal suppositories, inserts, External preparations such as enemas and jelly agents can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be any of a solid agent, a semisolid agent and a liquid agent, preferably a solid agent and a semisolid agent, more preferably a solid agent.
  • the content of the low molecular weight pharmaceutical compound in the pharmaceutical composition of the present invention depends on the kind of the low molecular weight pharmaceutical compound, the administration subject, the administration route, the dosage form, the patient's condition, the judgment of the doctor, etc. Although not limited, it can be, for example, 0.0001 to 99% by weight, preferably 0.001 to 50% by weight.
  • the content of the cell membrane-penetrating peptide in the pharmaceutical composition of the present invention depends on the type of low molecular weight pharmaceutical compound, the administration subject, the administration route, the dosage form, the patient's condition, the judgment of the doctor, etc. For example, it may be 0.0001 to 99% by weight, preferably 0.001 to 50% by weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used so that the dose of the cell membrane permeation peptide per administration per 1 kg of body weight of the administration subject is, for example, 1 ⁇ g to 1000 ⁇ g.
  • Test Example 1 Transmucosal absorption enhancement of low molecular weight pharmaceutical compounds by cell membrane penetrating peptides 1
  • a peptide (L-Pen) consisting of a penetratin sequence (SEQ ID NO: 1 N-terminal-RQIKIWFQNRRMKWKK) and consisting only of L-amino acids and a penetratin sequence (SEQ ID NO: 1: N-terminal-RQIKIWFQNRRMKWKK)
  • D-Pen D-amino acids
  • methotrexate water solubility: 2.6 mg / mL, pKa: 4.7, oral bioavailability: ⁇ 20%)
  • VCR vincristine
  • Human colon cancer-derived cells (Caco-2 cells) are seeded in a 12-well transwell plate (1.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 ) and cultured in DMEM complete medium for 21-22 days (constant TEER (> 500 ⁇ cm 2) ) (Until a tight junction was formed in the monolayer). After the culture, the apical side of the transwell was replaced with 500 ⁇ L of Hanks buffer (HBSS).
  • HBSS Hanks buffer
  • HBSS 100 ⁇ L containing only low molecular weight pharmaceutical compound or low molecular weight pharmaceutical compound and cell membrane penetrating peptide
  • final concentration 10 ⁇ M for low molecular weight pharmaceutical compound, cell membrane penetrating peptide was added to the apical side to a final concentration of 50 ⁇ M
  • the basal side was replaced with 1500 ⁇ L of HBSS.
  • a portion of HBSS on the basal side was collected 15, 30, 60, 90, and 120 minutes after drug addition, and the concentration of the low molecular weight pharmaceutical compound was measured by HPLC.
  • FIG. 1 shows that the membrane permeability of the low-molecular-weight pharmaceutical compound is improved by about 2 times by using the cell membrane-penetrating peptide together. This suggested that the cell membrane-penetrating peptide has a transmucosal absorption promoting action of a low molecular weight pharmaceutical compound.
  • Test Example 2 Interaction of cell membrane penetrating peptides with small molecule pharmaceutical compounds 1
  • the interaction between the cell membrane-penetrating peptide (L-Pen) used in Test Example 1 and the low molecular weight pharmaceutical compound (VCR) was analyzed by a fluorescence quenching method. Specifically, a predetermined concentration of VCR solution (2-100 ⁇ M in HBSS) was added to the L-Pen solution (50 ⁇ M in HBSS), and the fluorescence intensity after the addition was measured at 25 ° C. The results are shown in FIG.
  • Test Example 3 Transmucosal absorption enhancement of low molecular weight pharmaceutical compounds by cell membrane permeation peptide 2
  • a peptide (D-penetratin) consisting of a penetratin sequence (SEQ ID NO: 1: N-terminal-RQIKIWFQNRRMKWKK) and consisting only of D-amino acids was produced by consignment synthesis as a cell membrane-penetrating peptide.
  • a commercial product of sodium fluorescein molecular weight 376 was purchased.
  • In-vivo nasal administration experiment was conducted using the above materials. Specifically, it was performed as follows. A mixture of equal amounts of a 2.0 mg / mL sodium fluorescein solution dissolved in PBS (pH 7.4) containing 0.001% methylcellulose and a 1 mM D-penetratin solution was used as an administration solution. That is, the final concentrations of sodium fluorescein and D-penetratin were 1.0 mg / mL and 0.5 mM, respectively. After pentobarbital sodium was intraperitoneally administered to male ddY mice (30 to 40 g) (Japan SLC), the administration solution was administered to the left and right nasal cavities in a volume of 5 ⁇ L (10 ⁇ L in total) with the mouse lying on its back. At 15 minutes after administration, blood was collected from the vein and centrifuged (4,500 xg, 15 minutes) to obtain plasma. Plasma fluorescein concentration was measured using a fluorescent microplate reader.
  • FIG. 3 shows that the blood concentration of the low-molecular-weight pharmaceutical compound is improved by about 1.4 times by using the cell membrane-penetrating peptide in combination.
  • Test Example 4 Transmembrane mucosal absorption promoting effect of low molecular weight pharmaceutical compounds by cell membrane permeation peptide 3
  • a cell membrane-penetrating peptide a peptide consisting of penetratin sequence (SEQ ID NO: 1 N-terminal-RQIKIWFQNRRMKWKK) and consisting only of D-amino acid (D-penetratin) and penetratin sequence (SEQ ID NO: 1: N-terminal-RQIKIWFQNRRMKWKK) And a peptide composed only of L-amino acids (L-penetratin) was prepared by commissioned synthesis.
  • a low molecular weight pharmaceutical compound a commercial product of risedronate sodium (molecular weight 305) was purchased.
  • FIG. 4 shows that the permeation amount of the low molecular weight pharmaceutical compound is improved by about 1.3 times by using the cell membrane-penetrating peptide together.
  • Test Example 5 Transmucosal absorption enhancement of low molecular weight pharmaceutical compounds by cell membrane penetrating peptides 4
  • a peptide consisting of a penetratin sequence (SEQ ID NO: 1: N-terminal-RQIKIWFQNRRMKWKK) and consisting only of D-amino acids was produced by consignment synthesis as a cell membrane-penetrating peptide.
  • a commercial product of zanamivir molecular weight 332 was purchased.
  • FIG. 5 shows that the permeation amount of the low-molecular-weight pharmaceutical compound is improved about 1.2 times by using the cell membrane-penetrating peptide together.

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Abstract

低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤を提供することを課題とし、該課題を、細胞膜透過ペプチドを含有する、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤により解決する。

Description

低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤
　本発明は、医薬物質の経粘膜吸収促進剤に関する。
　近年見出される新規医薬品候補化合物は、膜透過性が低く、製剤学的・薬物動態学的な特性に問題を抱える場合が多いことが指摘されている。これらはBiopharmaceutics Classification System (BCS) のクラス3あるい4に分類され、消化管に発現するP-glycoprotein (P-gp) やBreast Cancer Resistance Protein (BCRP) 等の薬剤排出トランスポーターの基質となることが、低膜透過性の主な要因となっている。優れた候補化合物であっても、経粘膜吸収性が著しく低く、動態制御が困難となれば、開発途中でドロップアウトする割合も増加する。抗がん剤等の開発コストの過度の高騰を抑え、薬剤費や国の医療費を低減させるためには、医薬品候補となり得る化合物の経粘膜吸収性を改善し、医薬品研究開発の成功確率を高める基盤技術を構築することが不可欠である。
　薬剤排出トランスポーターの基質となる難吸収性薬物の経粘膜吸収性を改善することを目的として、これまでにトランスポーターに対する特異的阻害剤の使用や薬物間相互作用を利用した競合的な手法が試みられてきた。しかしながら、これらの従来のアプローチは本来生体が備えているはずの異物排出機能を破綻させる、あるいは、他の薬物の作用を増減させる可能性があるため、安全性の観点から万能な手法とは言い切れない。また、ナノ粒子キャリアに薬物を封入してトランスポーターからの認識を回避する手法も試みられてきたが、必ずしも有用であるとは言えず、その調製方法も複雑化してしまう。
　近年、TATペプチド、ペネトラチン等の種々の細胞膜透過ペプチド（cell-penetrating peptides (CPPs)）を用いることにより、バイオ薬物の細胞内導入を促進できることが報告されている（非特許文献１）。ただ、これらのペプチドは、薬物と架橋して用いることにより薬物の経粘膜吸収を促進するものであったり、タンパク質、ペプチド等の比較的分子量が大きい薬物の経粘膜吸収を促進するものであった（特許文献１）。
国際公開第2010/134537号
Copolovici DM, Langel K, Eriste E, Langel U 2014. Cell-penetrating peptides: design, synthesis, and applications. ACS Nano. 8(3):1972-1994. Journal of Peptide Science. 2014; 20: 760-784.
　本発明は、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤を提供することを課題とする。さらには、薬物との架橋を必要とせず、また生体に対する悪影響がより低減された、経粘膜吸収促進剤を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、細胞膜透過ペプチドを低分子医薬化合物と架橋せずに併用することにより、該低分子医薬化合物の膜透過性が向上することを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
　項１．　細胞膜透過ペプチドを含有する、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤．
　項２．　前記細胞膜透過ペプチドが、ペネトラチン及びオリゴアルギニンペプチドからなる群より選択される少なくとも1種である、項１に記載の経粘膜吸収促進剤．
　項３．　前記細胞膜透過ペプチドがペネトラチンである、項１又は２に記載の経粘膜吸収促進剤．
　項４．　前記低分子医薬化合物の分子量が1000以下である、項１～３のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤．
　項５．　前記低分子医薬化合物の経口バイオアベイラビリティが40％以下である、項１～４のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤．
　項６．　項１～５のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤及び低分子医薬化合物を含有する、医薬組成物．
　項７．　経粘膜投与剤である、項６に記載の医薬組成物．
　項８．　経口剤である、項６又は７に記載の医薬組成物．
　項９．　低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤としての使用のための、細胞膜透過ペプチド．
　項１０．　低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤を製造するための、細胞膜透過ペプチドの使用．
　項１１．　低分子医薬化合物と細胞膜透過ペプチドを併用することを含む、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進方法．
　本発明によれば、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤を提供することができる。本発明の経粘膜吸収促進剤は、薬物との架橋を必要としない。また、生体が有する薬剤排出機構に対する悪影響が少なく、タイトジャンクション開口の問題も少ないので、生体に対する悪影響がより低減されている。
　本発明の経粘膜吸収促進剤によれば、優れた活性を有していながらも低膜透過性であるが故に開発途中でドロップアウトする医薬品候補化合物をより低減することが可能であり、これにより、医薬品研究開発の成功確率を高めることも可能である。
　低膜透過性の低分子医薬化合物は主に注射剤として提供されているが、注射剤は、針を刺すという行為を必要とするものであり、患者にとっての負担感は大きい。また、注射器の使用後の廃棄には経済的負担や環境負荷がかかり、さらに発展途上国等においては注射器の使い回しによる感染症の可能性がある。本発明によれば、低分子医薬化合物の経粘膜吸収性を向上させることにより、上記問題がより生じ難い製剤形態（例えば経粘膜投与剤等）で提供することができる。
試験例1の結果を示す。縦軸は、膜透過係数（Papp）の相対値を示す。横軸中、MTXはメトトレキサートを示し、VCRはビンクリスチンを示す。「Alone」は細胞膜透過ペプチドを併用しない場合を示し、「＋D-Pen 50 μM」は、細胞膜透過ペプチドとして、D－アミノ酸のみから構成されるペネトラチン配列からなるペプチドを併用した場合を示し、「＋L-Pen 50 μM」は、細胞膜透過ペプチドとして、L－アミノ酸のみから構成されるペネトラチン配列からなるペプチドを併用した場合を示す。 試験例2の結果を示す。縦軸は蛍光強度を示し、横軸は波長を示す。重なるラインは、上から下に向かって、薬物濃度を順番に濃くしたときの蛍光強度の変化を示す。 試験例3の結果を示す。縦軸は、血中フルオレセイン濃度を示す。横軸中、「Fluorescein」はフルオレセイン単独で投与した場合を示し、「＋D-penetratin (0.5 mM)」は、フルオレセインと共に、細胞膜透過ペプチド（D－アミノ酸のみから構成されるペネトラチン配列からなるペプチド）を併用した場合を示す。 試験例4の結果を示す。縦軸は、リセドロン酸ナトリウムの透過量を示す。横軸中、「Risedronate (10μM)」はリセドロン酸ナトリウム単独で投与した場合を示し、「＋L-penetratin (60μM)」は、リセドロン酸ナトリウムと共に、細胞膜透過ペプチド（L－アミノ酸のみから構成されるペネトラチン配列からなるペプチド）を併用した場合を示し、「＋D-penetratin (60μM)」は、リセドロン酸ナトリウムと共に、細胞膜透過ペプチド（D－アミノ酸のみから構成されるペネトラチン配列からなるペプチド）を併用した場合を示す。 試験例5の結果を示す。縦軸は、ザナミビルの透過量を示す。横軸中、「Zanamivir (10μM)」はザナミビル単独で投与した場合を示し、「＋D-penetratin (60μM)」は、ザナミビルと共に、細胞膜透過ペプチド（D－アミノ酸のみから構成されるペネトラチン配列からなるペプチド）を併用した場合を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本発明は、その一態様として、細胞膜透過ペプチドを含有する、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤（本明細書において、「本発明の経粘膜吸収促進剤」と示すこともある。）、並びに本発明の経粘膜吸収促進剤及び低分子医薬化合物を含有する、医薬組成物（本明細書において、「本発明の医薬組成物」と示すこともある。）に関する。以下に、これらについて説明する。
　細胞膜透過ペプチドは、それ自身が細胞膜透過性を有するペプチドの総称であり、このようなペプチドである限りにおいて特に制限されない。細胞膜透過ペプチドとしては、各種報告されており、例えばペネトラチン、塩基性アミノ酸から構成されるペプチド（オリゴアルギニン(R6~R12)、HIV-TAT (47-57)、pVEC、MAP（Model amphipathic peptide）、Transportan 10、Pep-1等を代表的に挙げることができる。これら以外にも、例えば、HIV-1 Rev (34-50)、FHV coat (35-49)、CCMV Gag (7-25)、Chimeric dermaseptin S4 and SV40 ‘S413-PV’、単純ヘルペスウイルス転写因子（267-330）VP22、CPP with protease cleavage side YTA2、MPGα、MPGβ、MPG8、CADY、PepFect6、PepFect14、PepFect15、NickFect、Hel 11-27、InfluencaHA-2 (1-20) KALA sequence、KLA sequence、sC18、Kaposis sarcoma fibroblast growth factor Kaposi FGF、Signal sequence of Ig light chain from Caiiman crocodylus、Integrin β3-fragment、Grb2 (SH2 domain)、Fusion sequence HIV-1 gp41(1-23)、Hepatitis B virus translocation motif、Sperm-egg fusion protein (89-111)、Human calcitonin partial sequence 9-32、hCT(9-32)-br、hCT(18-32)-br、Substance P and analogs、RGD peptides αvβ3、RGD peptides αvβ3, αvβ5、RGD peptide、RGD peptides α5β1、AGR (prostata carcinoma)、LyP-2 (skin and cervix tumor)、REA (prostata, cervix, breast carcinoma)、LSD (melanoma, osteosarcoma)、Mastoparan、Mellitin、Scorpion toxin MAUROCALCINE with replacement of C by Abu、Mini maurocalcine peptides、Rattle snake toxin (Crotamine) derived NrTP6、Pentapeptides derived from BAX inhibitory peptides、Bacterial peptides (Bac7 (1-35)、Bac7 (5-35))、Protegrin-1、Lactoferrin sequences、N-terminal prion peptides、Histones and histidine peptides (H1, H2A, H2B, H3, H4、Histidine-rich CPP)、Proline-based biodendrimers、Cationic amphiphilic polyPro、Poly(Lys)、Sweet arrow peptide (SAP)、Amphipathic negative CPP、Polyglutamic acid、MMP (2,9)-activatable CPP、Thrombin-activatable CPP、pH-sensitive (activatable) CPP、HIF-1α ΔODD、HIF-1α ΔODD、Nitroimidazole-peptide conjugates、COOa with endosomolytic GALA-sequence、Redox protein azurin ‘p18’、Redox protein azurin ‘p28’、Cyt c86-101、LRRK、eNOS492-507、Pharmaliposome、Conjugate of CPP with branched PEI等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはペネトラチン、塩基性アミノ酸から構成されるペプチドが挙げられ、より好ましくはペネトラチンが挙げられる。細胞膜透過性は、試験例1に従って又は準じて、ペプチドのみを用いた場合の、apical側からbasal側への移行性を評価することによって判定することができる。
　ペネトラチンとしては、例えば配列番号1（N末端－RQIKIWFQNRRMKWKK）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである野生型ペネトラチン以外にも、野生型ペネトラチン配列を改変してなる配列からなる改変型ペネトラチンも包含される。改変としては、例えば逆配列、N末端側配列とC末端側配列の入れ替え、塩基性アミノ酸の他の塩基性アミノ酸への置換、1つ又は複数の塩基性アミノ酸の付加、アミノ酸配列順のシャッフル等が挙げられる。改変型ペネトラチンの具体例としては、配列番号2（N末端－KKWKMRRNQFWIKIQR）で表されるアミノ酸配列（野生型ペネトラチン配列の逆配列）からなるペプチド、配列番号3（N末端－NRRMKWKKRQIKIWFQ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4（N末端－RQIRIWFQNRRMRWRR）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号5（N末端－KQIKIWFQNKKMKWKK）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号6（N末端－KQIRIWFQNKKMRWRR）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号7（N末端－RRRRRQIKIWFQNRRMKWKK）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号8（N末端－RQIKIWFQNRRMKWKKRRRR）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号9（N末端－RIQKNFMIWRRWKQKK）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号10（N末端－RWFKIQMQIRRWKNKK）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号11（N末端－KWFRIQMQIKKWRNRR）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号12（N末端－RRWKNKKIQMQIRWFK）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド等が挙げられる。
　ペネトラチンは、配列番号1～12で示されるアミノ酸配列において、1又は複数個（例えば1～5個、好ましくは1～3個、好ましくは1～2個、より好ましくは1個）のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入（好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）されたアミノ酸配列からなり、且つ経粘膜吸収促進効果を有するペプチドであってもよい。なお、本明細書において、経粘膜吸収促進効果の有無は、公知の方法に従って又は準じて判定することができ、例えば後述の試験例1に記載の方法に従って又は準じて判定することができる。
　塩基性アミノ酸から構成されるペプチドは、複数の塩基性アミノ酸同士（好ましくは塩基性アミノ酸の主鎖上のアミノ基及びカルボキシル基）がペプチド結合してなるペプチドであり、この限りにおいて特に制限されない。該ペプチドは、1種の塩基性アミノ酸のみから構成されるものであってもよく、2種以上の塩基性アミノ酸から構成されるものであってもよい。
　該ペプチドを構成する塩基性アミノ酸の数は、例えば6～12、好ましくは7～10、より好ましくは7～9である。
　塩基性アミノ酸は、側鎖に塩基性官能基を有し、且つ等電点がアルカリ性領域にあるアミノ酸（好ましくはα－アミノ酸）であれば特に制限されない。
　塩基性官能基としては、例えばグアニジノ基、アミノ基、イミダゾリル基等が挙げられ、好ましくはグアニジノ基、アミノ基等が挙げられ、より好ましくはグアニジノ基が挙げられる。
　塩基性アミノ酸の等電点は、例えば7超、好ましくは7.5以上、より好ましくは9以上、さらに好ましくは10以上である。等電点の上限は特に限定されないが、例えば14である。
　塩基性アミノ酸の具体例としては、例えば天然アミノ酸であるアルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン、シトルリン等が挙げられる。これらの中でも、経粘膜吸収促進効果の観点から、好ましくはアルギニン、リシン等が挙げられ、より好ましくはアルギニンが挙げられる。
　Tatペプチド、pVEC、MAP（Model amphipathic peptide）、トランスポータン、Pep-1等の他の細胞膜透過ペプチドについては、アミノ酸配列、及びその構造は公知である（非特許文献２）。これらの細胞膜透過ペプチドについても、経粘膜吸収促進効果を有する限り、野生型アミノ酸配列において、1又は複数個（例えば1～5個、好ましくは1～3個、好ましくは1～2個、より好ましくは1個）のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入（好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）されていてもよい。
　細胞膜透過ペプチドを構成するアミノ酸の立体配置は、特に制限されず、L体又はD体のいずれでもよい。本発明の一態様においては、経粘膜吸収促進効果（特に、ビンクリスチン、メトトレキサート等の経粘膜吸収促進効果）がより向上するという観点から、50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは100％の構成アミノ酸がL体であることが好ましい。本発明の別の一態様においては、経粘膜吸収促進効果（特に、ザナミビル等の経粘膜吸収促進効果）がより向上するという観点から、50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは100％の構成アミノ酸がD体であることが好ましい。
　細胞膜透過ペプチドは、経粘膜吸収促進効果を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
　細胞膜透過ペプチドは、主鎖末端のカルボキシ基が、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）のいずれであってもよい。
　ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　さらに、細胞膜透過ペプチドには、主鎖末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、側鎖上の置換基（例えばアミノ基、イミダゾイル基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているもの等も包含される。
　細胞膜透過ペプチドは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　細胞膜透過ペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　細胞膜透過ペプチドは、1種単独で用いることもできるし、任意の2種以上を組み合わせて用いることもできる。
　本発明の経粘膜吸収促進剤は、有効成分として、細胞膜透過ペプチドを含有する限り、特に限定されない。細胞膜透過ペプチドは、市販されているものをそのまま用いることもできるし、公知の合成方法に従って又は準じて製造することもできる。
　本発明の経粘膜吸収促進剤の吸収促進対象である低分子医薬化合物は、生物活性を有し、且つ低分子である限り特に制限されない。
　低分子医薬化合物の分子量は、例えば1000以下、好ましくは100～1000、より好ましくは300～1000である。
　低分子医薬化合物のpKaは、例えば中性領域から酸性領域、好ましくはpKa：7以下（又は7未満）、より好ましくはpKa：7～0.01、さらに好ましくはpKa：6～0.1、よりさらに好ましくはpKa：6～1が挙げられる。
　低分子医薬化合物の水への溶解度は、好ましくは40 mg/mL以下、より好ましくは30 mg/mL以下である。
　低分子医薬化合物の経口バイオアベイラビリティは、例えば40％以下、好ましくは30％以下、より好ましくは20％以下が挙げられる。経口バイオアベイラビリティは、定法に従って、例えば日本薬局方に記載の方法に従って測定することができる。
　低分子医薬化合物としては、好ましくはBiopharmaceutics Classification System (BCS)のクラス3及びクラス4の薬物が挙げられる。
　低分子医薬化合物として、具体的には、例えば各種抗がん剤や、P-gpやBCRPなどの消化管排出トランスポーターの基質となる低分子医薬化合物、リセドロン酸ナトリウム等の骨粗鬆症、骨ページェット病の治療薬、ザナミビル等の抗ウイルス薬等が挙げられる。抗がん剤としては、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、ホルモン剤などが挙げられる。アルキル化剤としては、例えばシクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、プロカルバジン、ラニムスチンなどが挙げられる。代謝拮抗剤としては、例えばエノシタビン、カルモフール、カペシタビン、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ネララビン、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メトトレキサート、クラドリビン、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、メルカプトプリンなどが挙げられる。微小管阻害剤としては、例えば、ビンクリスチンなどのアルカロイド系抗がん剤、ドセタキセル、パクリタキセルなどのタキサン系抗がん剤が挙げられる。抗生物質抗がん剤としては、例えば、マイトマイシンC、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、アクチノマイシンD、アクラルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、アムルビシン、ジノスタチンスチマラマーなどが挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としては、トポイソメラーゼI阻害作用を有するCPT-11、イリノテカン、ノギテカン、トポイソメラーゼII阻害作用をもつエトポシド、ソブゾキサンが挙げられる。白金製剤としては、例えば、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンなどが挙げられる。ホルモン剤としては、例えば、デキサメタゾン、フィナステリド、タモキシフェン、アストロゾール、エキセメスタン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、ブレドニゾロン、リュープロレリン、レトロゾール、エストラムスチン、トレミフェン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタンなどが挙げられる。
　本発明の経粘膜吸収促進剤の対象となる粘膜は、特に制限されない。粘膜としては、例えば腸粘膜、胃粘膜、鼻粘膜、口腔粘膜、肺粘膜等が挙げられ、好ましくは腸粘膜が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、上述した本発明の経粘膜吸収促進剤と低分子医薬化合物とを含有する限り特に制限されず、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。細胞膜透過ペプチドと低分子医薬化合物とを併用することにより、低分子医薬化合物の経粘膜吸収性を促進することができる。併用の態様、低分子医薬化合物と細胞膜透過ペプチドとが接触できる状態になる限り、特に制限されない。なお、本発明の医薬組成物において、細胞膜透過ペプチドと低分子医薬化合物とは、直接又はリンカーを介して連結されておらず、別々の分子として存在する。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の剤形としては、粘膜からの吸収を目的とし得る剤形である限り特に限定されず、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、シロップ剤、腸溶剤、徐方性カプセル剤、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放剤、徐放性顆粒剤等の経口剤；　点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤等の外用剤等が挙げられる。また、本発明の医薬組成物は、固形剤、半固形剤、液剤のいずれでもよいが、好ましくは固形剤、半固形剤であり、より好ましくは固形剤である。
　本発明の医薬組成物中の低分子医薬化合物の含有量は、低分子医薬化合物の種類、投与対象、投与経路、剤形、患者の状態、及び医師の判断等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～99重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の医薬組成物中の細胞膜透過ペプチドの含有量は、低分子医薬化合物の種類、投与対象、投与経路、剤形、患者の状態、及び医師の判断等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～99重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の医薬組成物は、投与対象の体重1 kgに対する1回あたりの細胞膜透過ペプチドの投与量が、例えば1μg～1000 mgとなるように用いられる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．細胞膜透過ペプチドによる、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進作用1
　細胞膜透過ペプチドとして、ペネトラチン配列（配列番号1：N末端－RQIKIWFQNRRMKWKK）からなり、且つL－アミノ酸のみから構成されるペプチド（L-Pen）、及びペネトラチン配列（配列番号1：N末端－RQIKIWFQNRRMKWKK）からなり、且つD－アミノ酸のみから構成されるペプチド（D-Pen）を、委託合成により作製した。また、低分子医薬化合物として、メトトレキサート（MTX）（水への溶解度：2.6 mg/mL、pKa：4.7、経口バイオアベイラビリティ：<20%）、及びビンクリスチン（VCR）（水への溶解度：>25 mg/mL、pKa：5.0、7.4、経口バイオアベイラビリティ：NA）の市販品を購入した。
　ヒト結腸がん由来細胞（Caco-2細胞）を12ウェルトランスウェルプレートに播種（1.0×105cells/cm2）し、DMEM完全培地中で、21～22日間（一定のTEER（＞500Ωcm2）（単層中にタイトジャンクションが形成されたことを示す。）に達するまで）培養した。培養後、トランスウェルのapical側を、ハンクス緩衝液 (HBSS) 500μLに置換した。置換から30分間経過後に、apical側のHBSS 100μLを除き、低分子医薬化合物のみ、或いは低分子医薬化合物及び細胞膜透過ペプチドを含有する HBSS 100μLを、低分子医薬化合物については終濃度10μM、細胞膜透過ペプチドについては終濃度50μMになるようにapical側に添加し、basal側をHBSS 1500μLに置換した。薬物添加から15、30、60、90、及び120分後にbasal側の一部のHBSSを採取し、低分子医薬化合物の濃度をHPLCで測定した。得られた測定値に基づいて、低分子医薬化合物の透過速度（dQ/dt）を算出した。さらに、透過速度（dQ/dt）、細胞全体の表面積（S）及びApical側の低分子医薬化合物の初濃度（C1(0)）から、式（Papp＝(dQ/dt)×(1/ C1(0) S)）により、膜透過係数（Papp）を算出した。結果を図１に示す。
　図１より、細胞膜透過ペプチドを併用することにより、低分子医薬化合物の膜透過性が2倍前後に向上することが示された。このことから、細胞膜透過ペプチドは、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進作用を有することが示唆された。
　また、上記試験においては、細胞膜透過ペプチドにより、TEER（経上皮電気抵抗）の低下は認められなかった。このことから、膜透過性の向上は、タイトジャンクションの開口が主因ではないことが示唆された。
　さらに、本試験系（試験例1：ApicalからBasalへの膜透過性の試験）の改変法（BasalからApicalへの膜透過性の試験）により、細胞膜透過ペプチドは薬剤排出トランスポーターを阻害しないことが示された。
　試験例2．細胞膜透過ペプチドと低分子医薬化合物との相互作用1
　試験例1で使用した細胞膜透過ペプチド（L-Pen）と低分子医薬化合物（VCR）との相互作用を、蛍光クエンチング法により解析した。具体的には、L-Pen溶液（50μM in HBSS）に対して、所定濃度のVCR溶液（2-100μM in HBSS）を添加して、添加後の蛍光強度を25℃で測定した。結果を図２に示す。
　図２に示されるように、VCRの濃度の上昇に伴い蛍光の消光が認められ、細胞膜透過ペプチド（L-Pen）と低分子医薬化合物（VCR）とは相互作用を示すことが分かった。
　試験例3．細胞膜透過ペプチドによる、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進作用2
　細胞膜透過ペプチドとして、ペネトラチン配列（配列番号1：N末端－RQIKIWFQNRRMKWKK）からなり、且つD－アミノ酸のみから構成されるペプチド（D-penetratin）を、委託合成により作製した。また、低分子医薬化合物として、フルオレセインナトリウム（分子量376）の市販品を購入した。
　上記材料を用いて、In vivo経鼻投与実験を行った。具体的には次のようにして行った。メチルセルロースを0.001%含有するPBS (pH7.4) に溶解した2.0 mg/mLのフルオレセインナトリウム溶液と1 mMのD-penetratin溶液を等量混合したものを投与液として用いた。すなわち、フルオレセインナトリウムとD-penetratinの終濃度はそれぞれ1.0 mg/mLおよび0.5 mMとした。雄のddYマウス（30~40g）（日本エスエルシー社）にペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与した後、マウスを仰向けにした状態で投与液を左右の鼻腔に5μLずつ（計10μL）投与した。投与した15分後に経静脈から血液を採取し、遠心処理（4,500 xg、15分間）することにより血漿を得た。蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、血漿中フルオレセイン濃度を測定した。
　結果を図３に示す。図３より、細胞膜透過ペプチドを併用することにより、低分子医薬化合物の血中濃度が約1.4倍に向上することが示された。
　試験例4．細胞膜透過ペプチドによる、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進作用3
　細胞膜透過ペプチドとして、ペネトラチン配列（配列番号1：N末端－RQIKIWFQNRRMKWKK）からなり、且つD－アミノ酸のみから構成されるペプチド（D-penetratin）、及びペネトラチン配列（配列番号1：N末端－RQIKIWFQNRRMKWKK）からなり、且つL－アミノ酸のみから構成されるペプチド（L-penetratin）を、委託合成により作製した。また、低分子医薬化合物として、リセドロン酸ナトリウム（分子量305）の市販品を購入した。
　上記材料を用いて、細胞膜透過ペプチドの終濃度を60μMとする以外は試験例1と同様にして、Caco-2細胞を用いたIn vitro透過実験を行った。薬物添加から120分後にbasal側の一部のHBSSを採取し、HPLC測定することにより、リセドロン酸ナトリウムの透過量を算出した。結果を図４に示す。
　図４より、細胞膜透過ペプチドを併用することにより、低分子医薬化合物の透過量が約1.3倍に向上することが示された。
　試験例5．細胞膜透過ペプチドによる、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進作用4
　細胞膜透過ペプチドとして、ペネトラチン配列（配列番号1：N末端－RQIKIWFQNRRMKWKK）からなり、且つD－アミノ酸のみから構成されるペプチド（D-penetratin）を、委託合成により作製した。また、低分子医薬化合物として、ザナミビル（分子量332）の市販品を購入した。
　上記材料を用いて、試験例4と同様にして、Caco-2細胞を用いたIn vitro透過実験を行った。薬物添加から120分後にbasal側の一部のHBSSを採取し、HPLC測定することにより、ザナミビルの透過量を算出した。結果を図５に示す。
　図５より、細胞膜透過ペプチドを併用することにより、低分子医薬化合物の透過量が約1.2倍に向上することが示された。

Claims (11)

  1. 細胞膜透過ペプチドを含有する、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤。
  2. 前記細胞膜透過ペプチドが、ペネトラチン及びオリゴアルギニンペプチドからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１に記載の経粘膜吸収促進剤。
  3. 前記細胞膜透過ペプチドがペネトラチンである、請求項１又は２に記載の経粘膜吸収促進剤。
  4. 前記低分子医薬化合物の分子量が1000以下である、請求項１～３のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤。
  5. 前記低分子医薬化合物の経口バイオアベイラビリティが40％以下である、請求項１～４のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤。
  6. 請求項１～５のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤及び低分子医薬化合物を含有する、医薬組成物。
  7. 経粘膜投与剤である、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 経口剤である、請求項６又は７に記載の医薬組成物。
  9. 低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤としての使用のための、細胞膜透過ペプチド。
  10. 低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進剤を製造するための、細胞膜透過ペプチドの使用。
  11. 低分子医薬化合物と細胞膜透過ペプチドを併用することを含む、低分子医薬化合物の経粘膜吸収促進方法。
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