JP5103748B2 - 医薬組成物 - Google Patents
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オリゴアルギニンペプチドによるインスリンin vivo(ラット)腸管吸収促進効果。
1.インスリン溶液の調製
ヒトリコンビナントインスリン(和光純薬)1.923mg(=50IU=0.33μmol)を秤量し、0.1M塩酸50μlに溶解した。これにメチルセルロース(MC)添加リン酸生理緩衝液pH7.4(PBS)1.2mlおよび0.1MNaOH溶液50μlを加えて中和し、さらにMC添加PBS1.2mlを加えて総容量を2.5mlとした。(インスリン濃度0.769mg/ml=20IU/ml)。
L−アルギニン6merペプチドまたはD−アルギニン6merペプチド(シグマジェノシス社にて合成)それぞれ2.5mg(2.6μmol)または5mg(5.2μmol)を秤量し、上記1で作製したインスリン溶液0.5ml(インスリン0.385mg=0.066μmol)を添加して溶解し、オリゴアルギニンペプチド−インスリン混合溶液とした。コントロール(オリゴアルギニンペプチド無し)については、インスリン溶液そのものを投与に用いた。
24時間絶食した体重約200gのSD系雄性ラットにペントバルビタールナトリウム50mg/kgを腹腔内注射することにより麻酔した後、正中線に沿って開腹し、腸管を露出した。回盲接合部から2−3cm回腸よりの部分からシリコンチューブを、およびその上部約10cmの部分からゾンデを挿入し、さらに内側6cmの部分に縫合糸を通した。
L−アルギニン6mer、D−アルギニン6merペプチドいずれについても、コントロールのインスリンのみの投与と比べて、血中インスリン濃度の明らかな上昇、および血糖値の明らかな低下が認められた(図1、2)。
サケプロタミンによるインスリンin vivo(ラット)腸管吸収促進効果。
サケプロタミン(シグマ社製)21.5mg(5μmol)を秤量した。実施例1と同様にして調製したインスリン溶液0.5mlを添加して溶解し、インスリン−サケプロタミン混合溶液とした。ラット腸管吸収の評価は、実施例1と同様の方法で行った。
サケプロタミン−インスリン混合溶液を投与することにより、コントロールのインスリンのみの投与と比べて、血中インスリン濃度の明らかな上昇、および血糖値の明らかな低下が認められた(図3,4)。
オリゴアルギニンペプチドによるin vitroインスリン回腸粘膜透過促進効果。
1.インスリン溶液の調製
ヒトリコンビナントインスリン(和光純薬)26.1mgを秤量し、0.1M HCl溶液 300μlを加え溶かした後、Krebs-Ringer Buffer 3.9ml及び 0.1M NaOH溶液 300mlを加えて4.5mlとしインスリン溶液(1mM)とした。
L−アルギニン6merペプチド2.1mgを秤量し、上記で作製したインスリン溶液550μlに溶解して、インスリン−オリゴアルギニンペプチド混合溶液とした(アルギニンペプチド濃度4mM、インスリン濃度1mM。)。
24時間絶食した体重約 200gのWistar系雄性ラットにペントバルビタールナトリウム 50mg/kgを腹腔内注射することにより麻酔し、腸管組織を摘出し常法に従い筋層剥離後、Ussing chamberに装着し、donor及びreceiver側にKrebs-Ringer Buffer 5mlを加えた。膜を20分間安定させた後、donor側から2mlを採取すると同時に、インスリンおよびオリゴアルギニンペプチド混合溶液2mlを加えた。(反応時濃度:インスリン0.4mM、オリゴアルギニンペプチド1.6mM。)これを開始時(0分)とし以降、10、15、30、60、90、120、150、180分後にreceiver側より 100μlをサンプリング(同容量のKrebs-Ringer Bufferで置換)し、酵素免疫測定法にてインスリン濃度を測定した。
インスリン−オリゴアルギニンペプチド混合溶液を用いた場合には、コントロールのインスリンのみの溶液を用いた場合と比較して、インスリンの回腸粘膜透過性の明らかな促進が認められた(図5)。
サケプロタミンによるin vivo(マウス)インスリン腸管吸収促進効果。
ヒトリコンビナントインスリン(和光純薬)4mgを秤量し、0.1M塩酸200μlに溶解した。これにリン酸生理緩衝液pH7.4(PBS)1.2mlおよび0.1MNaOH溶液200μlを加えて中和し、さらにPBSを加えて総容量を10.5mlとした。(インスリン濃度0.38mg/ml)。
プロタミンとインスリンの混合液をマウス腸管に投与することにより、コントロールのインスリンのみの投与と比べて、マウス血中のインスリン濃度の明らかな上昇、および血糖値の明らかな低下が認められた(図6、7)。
オリゴアルギニンペプチドによるインスリンの腸管上皮細胞(Caco2)単層透過促進効果。
1.蛍光色素(フルオレセイン)標識インスリンの調製
ヒトリコンビナントインスリン(和光純薬)10mgを秤量し、0.1M HCl溶液 250μlに溶解した後、PBS 2.5ml及び 0.1M NaOH溶液 250μlを加えて3mlとした。この溶液を、脱塩カラム(アマシャム社PD−10)を用いて脱塩し、6mlの50mM炭酸水素ナトリウム溶液とした。(インスリン濃度1.67mg/ml)。この溶液に、4.8mgのNHS−フルオレセイン(ピアス社)を0.6mlの50mM炭酸水素ナトリウム溶液に溶解した液を全量添加し、25℃で4時間反応させた。さらに1Mのトリス塩酸緩衝液(pH8)0.6mlを添加して30分間反応させた後、脱塩カラムを用いて10mlの純水に対して脱塩し、未反応のNHS−フルオレセインを除去することで、フルオレセイン標識インスリン水溶液を得た。
10%の胎仔ウシ血清を添加したD−MEM培地中で、37℃、5%のCO2の条件下に、Caco−2細胞をトランスウェル(Transwell)(Corning社製、メンブレン直径12mm、培養面積1.0cm2、孔サイズ0.4μm)フィルター上で培養した。2日〜3日ごとに培地を交換して21日間培養することで十分に分化した細胞単層を得た。
フィルター上の細胞単層をHBSS溶液で洗浄後、フルオレセイン標識インスリン0.77mg/mlおよびオリゴアルギニンペプチド(L−アルギニン6mer)を0、1.25または5mg/mlの濃度で含むHBSS溶液を0.5mlをapical側に添加し、30、60、120分後にbasolateral側の透過液(容量1.5ml)から0.1mlを回収して5.5倍に希釈後、蛍光プレートリーダーにて透過したフルオレセインインスリンに由来する蛍光(励起波長490nm、検出波長520nm)を測定した。既知濃度のフルオレセインインスリン溶液の蛍光測定値をもとに、透過液サンプル中のフルオレセインインスリンの濃度を算出した。
basolateral側に透過したインスリン総量(μg)/apical側に添加したインスリン総量(μg)x100(%)
で算出した。
オリゴアルギニンペプチド(L−Arg6mer)の添加により、透過するインスリン量の明らかな増大が認められた(表1)。
オリゴアルギニンペプチドによるインターフェロンin vivo(ラット)腸管吸収促進効果。
L−アルギニン6merペプチド5mgおよびインターフェロンβ(東レ製)を含有するPBS溶液0.5mlを調製し、実施例1と同様にして全量をラット腸管内に投与した。投与するインターフェロンβ量は、ラット体重kgあたり2.25x106IUとなるように調製した。経時的に採血を行い、血漿中のインターフェロンβ濃度をELISA法(鎌倉テクノサイエンス社製キット)にて測定した。
オリゴアルギニン−インターフェロンβ混合溶液を投与することにより、コントロールのインターフェロンβのみの投与と比べて、血中インターフェロンβ濃度の上昇が認められた(図8)。
Claims (5)
- 生理活性タンパク質を、活性を保持した状態で腸管内から血中に移行させる医薬組成物であって、成分として等電点が5.5以下の生理活性タンパク質およびカチオン性ペプチドであるプロタミンあるいはその部分ペプチドあるいはその誘導体(ただし、アルギニンオリゴマーを除く。)を含有し、生理活性タンパク質とカチオン性ペプチドが共有結合で連結されていない腸管吸収性医薬組成物。
- カチオン性ペプチドと生理活性タンパク質の混合比が、モル比((カチオン性ペプチドのモル数)/(生理活性タンパク質のモル数))として3000以下である請求項1記載の腸管吸収性医薬組成物。
- 生理活性タンパク質の分子量が、30000以下である請求項1または2に記載の腸管吸収性医薬組成物。
- 生理活性タンパク質が、インスリン、成長ホルモン、等電点が5.5以下のインターフェロン類、等電点が5.5以下のインターロイキン類、およびG−CSFから選ばれる請求項1〜3のいずれかに記載の腸管吸収性医薬組成物。
- プロタミンあるいはその部分ペプチドあるいはその誘導体(ただし、アルギニンオリゴマーを除く。)が魚類由来である、請求項1〜4のいずれかに記載の腸管吸収性医薬組成物。
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