TW202302647A

TW202302647A - 胃腸道病症中wnt訊號之調節

Info

Publication number: TW202302647A
Application number: TW111108741A
Authority: TW
Inventors: 羅素弗萊徹; 李聖眞; 陽李; 成鋼鲁; 帕莎莎拉希山姆帕司庫瑪; 范荷芙吉爾特鲁依; 文琛葉; 力勤謝; 倫納德普雷斯塔
Original assignee: 美商蘇羅森營運公司
Priority date: 2021-03-10
Filing date: 2022-03-10
Publication date: 2023-01-16
Also published as: JP2024509266A; CA3210599A1; EP4305070A1; AU2022232380A1; WO2022192445A1; US20240150473A1

Abstract

本發明提供經工程化WNT促效劑及使用該WNT傳訊路徑之調節劑治療胃腸道病症的方法。

Description

胃腸道病症中WNT訊號之調節

本發明提供WNT訊號調節劑，作為胃腸道病症，特定言之發炎性腸病之療法。

WNT蛋白質形成一個高度保守的分泌型傳訊分子家族，在胚胎發生期間調節細胞間之相互作用。WNT基因及WNT傳訊亦與癌症相關。對WNT作用機制之洞察來自若干系統：果蠅( Drosophila)及秀麗隱桿線蟲( Caenorhabditis elegan)中之遺傳學；細胞培養中之生物化學及爪蟾(Xenopus)胚胎中之異位基因表現。小鼠中之許多WNT基因已經突變，導致非常特殊的發育缺陷。如目前所理解，WNT蛋白質結合至細胞表面上之捲曲受體(Frizzled)家族的受體。經由若干細胞質中繼組件，將訊號轉導至β-連環蛋白，該β-連環蛋白隨後進入細胞核且與TCF形成複合物，以活化WNT目標基因之轉錄。WNT蛋白質之表現不同，但通常與發育過程相關，例如在胚胎及胎兒組織中。

對成年生物體中WNT蛋白質之生理功能的探索由於功能冗餘及必須採用條件性失活策略而受到阻礙。最近已將Dickkopf-1 (Dkk1)鑑別為有力地拮抗WNT傳訊之分泌蛋白家族之創始成員(參見Glinka等人. (1998) Nature 391:357-62；Fedi等人. (1999) J Biol Chem 274:19465-72；及Bafico等人. (2001) Nat Cell Biol 3:683-6)。Dkk1與WNT輔受體LRP5及LRP6兩者及跨膜蛋白Kremen締合，其中所得三元複合物引起LRP6快速內化且經由缺乏功能性捲曲受體/LRP6 WNT受體複合物而損害WNT傳訊(參見例如Mao等人. (2001) Nature 411:321-5；Semenov等人. (2001) Curr Biol 11:951-61；及Mao等人. (2002) Nature 417:664-7)。

Tcf基因座經基因剔除的轉殖基因小鼠在胚胎發生晚期期間展示出小腸中之增殖性幹細胞區室之損失。然而，該基因剔除為致死性的，且因此尚未在成體中進行研究。在允許分析成體之嵌合轉殖基因小鼠中，組成型活性NH2-截短型β-連環蛋白的表現刺激小腸隱窩之增殖，但NH2-截短型β-連環蛋白或Lef-1/β-連環蛋白融合物亦誘導隱窩細胞凋亡增加。因為多種因子調節β-連環蛋白/Lef/Tcf-依賴性轉錄，包括非捲曲受體GPCR及PTEN/PI-3-激酶，所以尚未知腸幹細胞缺陷之病因。

成體腸上皮組織之特徵在於經由在5至7天的隱窩-絨毛過渡時間期間發生的細胞分裂、分化、遷移及脫落之定型(stereo-typed)週期不斷更換上皮細胞。儘管研究表明β-連環蛋白/Lef/Tcf傳訊在增殖性隱窩區室內之細胞固有作用，但尚未完全鑑別出調節成體腸道幹細胞生態棲位內增殖之推定生長因子。

多種病理學病狀影響腸道細胞。發炎性腸病(IBD)可涉及小腸及大腸中之任一者或兩者。克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎為最著名的IBD形式，且均屬於「特發性」發炎性腸病之類別，因為其病因未知。「活動性」IBD之特徵在於急性發炎。「慢性」IBD之特徵在於隱窩變形及瘢痕形成之架構變化。隱窩膿腫可以發生在許多形式之IBD中。

克羅恩氏病可涉及胃腸道之任何部分，但最常涉及遠端小腸及結腸。發炎通常為透壁性的且可產生任何東西，自淋巴濾泡上的小潰瘍(口瘡性潰瘍)，至深裂潰瘍，至透壁性瘢痕形成及慢性發炎。三分之一的病例具有肉芽腫，且結腸外部位(諸如淋巴結、肝臟及關節)亦可具有肉芽腫。透壁性發炎使得在腸襻與其他結構之間出現瘺。發炎通常為節段性的，未受累的腸與受累的腸區相分離。儘管已提出感染及免疫機制，但病因未知。

潰瘍性結腸炎(UC)涉及結腸，為一種以遠端為主的彌漫性黏膜疾病。直腸幾乎始終受累，且結腸之其他部分可能受累，自直腸向近端延伸，呈連續模式。UC之病因未知。長期患有UC之患者罹患結腸癌之風險增加。患有UC之患者亦具有患上肝病之風險，該等肝病包括硬化性膽管炎及膽管癌。目前，用於治療UC之臨床上所有治療劑及大部分正在開發的治療劑集中於減少發炎且不直接誘導上皮癒合，此突出表明對促進上皮修復之治療劑的需求尚未得到滿足。

研發用於調節腸上皮組織生長之藥理學藥劑出於臨床目的備受關注。然而，WNT促效劑作為藥理學藥劑之探索受到妨礙，部分原因係其並非天然可溶、可擴散的分子。本發明提供使用經工程化可溶性WNT促效劑經由特定FZD受體特異性調節WNT傳訊的方法及組合物。此類經工程化WNT促效劑可實現例如上皮特異性瞬時Wnt傳訊活化，其驅動穩健的上皮再生及障壁恢復，最終引起發炎減少及結腸炎改善。

在各種態樣中，本發明提供經工程化WNT促效劑及相關醫藥組合物及使用方法。

在一個態樣中，本發明包括一種經工程化WNT促效劑，其包含：(a)一或多個結合域，其結合至一或多個FZD；及(b)一或多個結合域，其結合至LRP5、LRP6，或LRP5及LRP6兩者，其中該經工程化WNT促效劑包含與SEQ ID NOs:1-18中之任一者，或SEQ ID NO:s 1-25中之任一者，圖 2、圖 6、表1或表3中所揭示之多肽序列，或其功能片段或變異體，例如其結合片段，例如VHH域、重鏈之可變域或輕鏈之可變域，具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的多肽序列。在某些實施例中，結合至一或多個FZD之該一或多個結合域結合至：i) FZD5；ii) FZD 8；iii) FZD 1；iv) FZD 2；v) FZD 7；vi) FZD 5及FZD 8；vii) FZD 1、FZD 2及FZD 7；viii) FZD 1、FZD 2、FZD 7、FZD 5及FZD 8；ix) FZD4；x) FZD9；或xi) FZD10。在某些實施例中，經工程化WNT促效劑包含一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NOs:1-18或19-25中之任一者或表3中所揭示之序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的多肽序列。在某些實施例中，該經工程化WNT促效劑包含：(a)一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 1具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 2具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列；(b)一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 3具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO:4具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列；(b)一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 5具有至少80%、至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO:6具有至少80%、至少90%、或至少95%同源性之多肽序列；(d)一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 7具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO:8具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列；(e)一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 9具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO:10具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列；(f)一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 7具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO:8具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列；(g)一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 11具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO:12具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列；(h)一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 13具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO:14具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列；(i)一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 15具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO:16具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列；或(j)一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO: 17具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及一或多個(例如，兩個)與SEQ ID NO:18具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列。在某些實施例中，多肽包含存在於SEQ ID NOs: 1-18或19-25中之任一者中之CDR。在經工程化WNT促效劑之某些實施例中，結合至LRP5、LRP6或LRP5及LRP6兩者之該一或多個結合域經人源化。在某些實施例中，經工程化WNT促效劑包含經修飾Fc域，其中該經修飾Fc域包含LALAPG或N297G修飾。在某些實施例中，WNT促效劑具有本文所揭示之結構或形式中之任一者，包括各種抗體相關結構或形式中之任一者。適合之形式之實例包括(但不限於)單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、奈米抗體、雙功能抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，包括(但不限於)scFv、Fab及Fab ₂，只要其展現出所需生物活性，例如WNT促效活性即可。在特定實施例中，WNT促效劑為R2M13-h26。R2M13為親體R2M13-26之人源化形式，其亦包含Fc域中之LALAPG取代。R2M13-h26在本文中亦稱為R2M13-h26-LALAPG、R2M13-26人源化LALAPG或人源化LALPG。

在一相關態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所揭示之經工程化WNT促效劑及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。

在另一相關態樣中，本發明提供一種治療個體之能夠藉由增加WNT路徑傳訊治療之疾病或病症的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之經工程化WNT促效劑或醫藥組合物。在特定實施例中，疾病或病症為胃腸道病症，諸如發炎性腸病。在某些實施例中，該疾病或病症選自由以下組成之群：克隆氏病(CD)、伴有瘺形成之CD及潰瘍性結腸炎(UC)。在特定實施例中，經工程化WNT促效劑係經口或非經腸投與，例如靜脈內、腹膜內或皮下投與。在特定實施例中，WNT促效劑為R2M13-h26。在某些實施例中，WNT促效劑例如以推注注射形式靜脈內投與。在特定實施例中，至少每週一次投與WNT促效劑。在特定實施例中，向個體投與約0.5至約100 mg/kg體重之WNT促效劑，或約2至約50 mg/kg體重之WNT促效劑，例如約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg或約50 mg/kg。在特定實施例中，向個體每週至少一次靜脈內投與約3至約30 mg/kg體重之R2M13-h26，其中R2M13-h26包含由二硫鍵結合之SEQ ID NO:9之兩個多肽及SEQ ID NO:10之兩個多肽。

在另一相關態樣中，本發明提供一種增加細胞中WNT傳訊之方法，其包含使該細胞與本文所揭示之經工程化WNT促效劑接觸。在特定實施例中，WNT促效劑為R2M13-h26。

在另一相關態樣中，本發明提供一種調節患有胃腸道病症之個體之一或多種組織及/或細胞中的Wnt路徑分子之表現的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之該經工程化WNT促效劑或醫藥組合物。在某些實施例中，WNT路徑分子為表4-7中之任一者中所列的基因或蛋白質。在特定實施例中，WNT路徑分子選自由以下組成之群：RNAse4、血管生成素(Angiogenin)、Gsta3、Rnf43、Axin2或表7中所列出之基因或蛋白質中之任一者。在某些實施例中，WNT路徑分子(基因或蛋白質)之表現在投與該經工程化Wnt促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少20%、至少50%、至少80%、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在某些實施例中，組織為上皮組織。在某些實施例中，細胞為胃腸上皮細胞，視情況：幹細胞、TA1、TA2、杯狀細胞前驅細胞、損傷誘發之替代性前驅細胞(Alt前驅細胞)、損傷誘發之替代性腸上皮細胞(Alt腸上皮細胞)、腸上皮細胞前驅細胞(EnteroPrecur)、杯狀細胞前驅細胞(杯狀_PC)、杯狀細胞1、杯狀細胞2或腸道內分泌細胞或簇細胞。在特定實施例中，WNT促效劑為R2M13-h26。在某些實施例中，WNT促效劑例如以推注注射形式靜脈內投與。在特定實施例中，至少每週一次投與WNT促效劑。在特定實施例中，向個體投與約0.5至約100 mg/kg體重之WNT促效劑，或約2至約50 mg/kg體重之WNT促效劑，例如約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg或約50 mg/kg。在特定實施例中，向個體每週至少一次靜脈內投與約3至約30 mg/kg體重之R2M13-h26，其中R2M13-h26包含由二硫鍵結合之SEQ ID NO:9之兩個多肽及SEQ ID NO:10之兩個多肽。

在另一相關態樣中，本發明提供一種刺激患有胃腸道病症之個體之組織修復的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之經工程化WNT促效劑或醫藥組合物。在特定實施例中，該組織修復係藉由調節至少一種選自由以下組成之群的WNT路徑分子而刺激(或該方法引起)：與細胞週期相關之基因、與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之基因、與上皮細胞修復及障壁恢復相關之基因及/或表4-8中之任一者中所列之基因中之任一者。在某些實施例中，與該細胞週期相關之該等基因係選自表4中所提供之彼等，或Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1及Rrm2。在某些實施例中，與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之該等基因係選自表8中所提供之彼等，及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1及Adh1。在某些實施例中，與上皮細胞修復及障壁恢復相關之該等基因係選自表6中所提供之彼等，或Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16及Sprr2a3。在特定實施例中，基因之表現在投與該經工程化WNT促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少20%、至少50%、至少80%、至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在某些實施例中，WNT促效劑例如以推注注射形式靜脈內投與。在特定實施例中，至少每週一次投與WNT促效劑。在特定實施例中，向個體投與約0.5至約100 mg/kg體重之WNT促效劑，或約2至約50 mg/kg體重之WNT促效劑，例如約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg或約50 mg/kg。在特定實施例中，向個體每週至少一次靜脈內投與約3至約30 mg/kg體重之R2M13-h26，其中R2M13-h26包含由二硫鍵結合之SEQ ID NO:9之兩個多肽及SEQ ID NO:10之兩個多肽。

在另一相關態樣中，本發明提供一種減少患有胃腸道病症(或其組織或細胞)之個體之發炎的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之經工程化WNT促效劑或醫藥組合物。在某些實施例中，該發炎係藉由調節至少一種選自由以下組成之群的WNT路徑分子而減少：表5中所提供之基因，或Adamdec1、Atf3、Gpx2、Gsta3、Gstm1、Gstm3、Gdf15、Ihh、Il18、Lyz2、Nox1、Reg4、Sycn、Selenbp1、Tgfbr2及Timp3。在特定實施例中，該發炎係在胃腸道組織，視情況上皮組織中減少。在某些實施例中，發炎係在胃腸上皮細胞、上皮幹細胞、TA1、TA2、基底杯狀細胞、損傷誘發之替代性前驅細胞(Alt前驅細胞)、損傷誘發之替代性腸上皮細胞(Alt腸上皮細胞)、腸上皮細胞前驅細胞(EnteroPrecur)、杯狀細胞1、杯狀細胞2或腸道內分泌細胞或簇細胞。在特定實施例中，WNT路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少20%、至少50%、至少80%、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在某些實施例中，WNT促效劑例如以推注注射形式靜脈內投與。在特定實施例中，至少每週一次投與WNT促效劑。在特定實施例中，向個體投與約0.5至約100 mg/kg體重之Wnt促效劑，或約2至約50 mg/kg體重之WNT促效劑，例如約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg或約50 mg/kg。在特定實施例中，向個體每週至少一次靜脈內投與約3至約30 mg/kg體重之R2M13-h26，其中R2M13-h26包含由二硫鍵結合之SEQ ID NO:9之兩個多肽及SEQ ID NO:10之兩個多肽。

在所揭示之方法中之任一者的特定實施例中，該經工程化Wnt促效劑為R2M13-h26或包含功能性變異體或其片段。在所揭示之方法中之任一者的特定實施例中，該個體為哺乳動物，視情況人類。

在另一相關態樣中，本發明提供一種恢復具有受損上皮組織之個體中之胃腸上皮障壁的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之經工程化WNT促效劑或醫藥組合物。在某些實施例中，WNT促效劑例如以推注注射形式靜脈內投與。在特定實施例中，至少每週一次投與WNT促效劑。在特定實施例中，向個體投與約0.5至約100 mg/kg體重之WNT促效劑，或約2至約50 mg/kg體重之WNT促效劑，例如約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg或約50 mg/kg。在特定實施例中，向個體每週至少一次靜脈內投與約3至約30 mg/kg體重之R2M13-h26，其中R2M13-h26包含由二硫鍵結合之SEQ ID NO:9之兩個多肽及SEQ ID NO:10之兩個多肽。在一些實施例中，該胃腸上皮障壁係藉由調節至少一種選自由以下組成之群的WNT路徑分子而恢復：與細胞週期相關之基因、與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之基因、與上皮細胞修復及障壁恢復相關之基因及/或表4、5、6、7、8及11中之任一者中所列之基因中之任一者。與該細胞週期相關之該等基因可選自表4中所提供之彼等，或Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1及Rrm2。與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之該等基因可選自表8中所提供之彼等，及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1及Adh1。與上皮細胞修復及障壁恢復相關之該等基因可選自表6中所提供之彼等，或Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16及Sprr2a3。

在一些實施例中，該胃腸上皮障壁係藉由調節至少一種WNT路徑分子而恢復，其中WNT路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少20%、至少50%、至少80%、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一些實施例中，該胃腸上皮障壁係藉由調節至少一種WNT路徑分子而恢復，其中該Wnt路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑約24小時內的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加。在一些實施例中，該個體之受損上皮組織在投與該經工程化Wnt促效劑約6天內實質上恢復。在一些實施例中，向該個體投與該經工程化Wnt促效劑不誘導正常上皮組織之過度增殖。

在另一相關態樣中，本發明提供一種誘導患有胃腸道病症之個體之上皮前驅細胞分化的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之經工程化WNT促效劑、經工程化WNT促效劑或醫藥組合物。在某些實施例中，WNT促效劑例如以推注注射形式靜脈內投與。在特定實施例中，至少每週一次投與WNT促效劑。在特定實施例中，向個體投與約0.5至約100 mg/kg體重之WNT促效劑，或約2至約50 mg/kg體重之WNT促效劑，例如約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg或約50 mg/kg。在特定實施例中，向個體每週至少一次靜脈內投與約3至約30 mg/kg體重之R2M13-h26，其中R2M13-h26包含由二硫鍵結合之SEQ ID NO:9之兩個多肽及SEQ ID NO:10之兩個多肽。在一些實施例中，該上皮細胞分化係藉由調節至少一種選自由以下組成之群的WNT路徑分子而誘導：與細胞週期相關之基因、與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之基因、與上皮細胞修復及障壁恢復相關之基因及/或表4、5、6、7、8及11中之任一者中所列之基因中之任一者。與該細胞週期相關之該等基因可選自表4中所提供之彼等，或Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1及Rrm2。與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之該等基因可選自表8中所提供之彼等，及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1及Adh1。與上皮細胞修復及障壁恢復相關之該等基因可選自表6中所提供之彼等，或Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16及Sprr2a3。

在一些實施例中，該上皮細胞分化係藉由調節至少一種WNT路徑分子而誘導，其中WNT路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少20%、至少50%、至少80%、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一些實施例中，該上皮細胞分化係藉由調節至少一種WNT路徑分子而誘導，其中該WNT路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑約24小時內的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加。

在一些實施例中，投與該經工程化Wnt促效劑誘導該個體之前驅細胞分化至腸上皮細胞、杯狀細胞、腸道內分泌細胞或簇細胞中。在一些實施例中，實質性前驅細胞分化係在投與該經工程化Wnt促效劑約48小時內的該個體中誘導。在一些實施例中，向該個體投與該經工程化Wnt促效劑不誘導正常上皮組織之過度增殖。

相關申請案

本申請案主張以下之優先權：2021年3月10日申請之美國臨時專利申請案序列號63/159,010、2021年5月19日申請之美國臨時專利申請案序列號63/190,535及2021年9月22日申請之美國臨時專利申請案序列號63/247,151，該等申請案以全文引用之方式併入本文中。序列表

本申請案經由EFS-Web以電子方式申請且包括呈.txt格式之以電子方式提交之序列表。該.txt檔案含有標題為「SRZN_020_03WO_ST25.txt」的序列表，2022年3月7日建立且具有約80個千位元組的大小。此.txt文件中所含之序列表為本說明書之一部分且以全文引用的方式併入本文中。

除非上下文另外明確規定，否則如本文(包括隨附申請專利範圍)所用，諸如「一(a/an)」及「該」之詞語的單數形式包括其相應的複數個提及物。

本文中引用之所有參考文獻以引用之方式併入，其引用程度如同特定且個別地將各個別公開案、專利申請案或專利以引用的方式併入一般。 I.定義

分子之「活性」可描述或指分子與配位體或與受體之結合；催化活性；刺激基因表現之能力；抗原活性；其他分子活性之調節；及其類似物。分子之「活性」亦可指調節或維持細胞間相互作用，例如黏附之活性或維持細胞結構，例如細胞膜或細胞骨架之活性。「活性」亦可意謂比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白質]或[免疫活性]/[mg蛋白質]或其類似者。

如本文中所用，術語「投與」或「引入」或「提供」係指將組合物遞送至一或多種細胞、組織、組織類器官及/或遞送至個體之器官或遞送至個體。該等投與或引入可在活體內、活體外或離體進行。

如本文所用，術語「抗體」意謂一種經分離或重組結合物，其包含特異性結合抗原之抗原決定基所必需的可變區序列。因此，抗體為展現所要生物活性(例如結合特定目標抗原)之抗體或其片段之任何形式。因此，其以最廣泛意義使用且尤其覆蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、奈米抗體、雙功能抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，包括但不限於scFv、Fab及Fab2，只要其展現所要生物活性即可。

「抗體片段」包含完整抗體之一部分，例如完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab') ₂及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(例如Zapata等人, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995))；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個一致的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自具有單一抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名稱反映容易結晶之能力。胃蛋白酶處理產生F(ab') ₂片段，其具有兩個抗原組合位點且仍能夠與抗原交聯。

術語「抗原」係指能夠由選擇性結合物(諸如抗體)結合，且30能夠用於動物中以產生能夠結合於彼抗原之抗原決定基之抗體的分子或分子之一部分。在某些實施例中，結合物(例如，經工程化WNT促效劑或其結合區，或WNT拮抗劑)在其優先識別其在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之目標抗原時稱為特異性結合抗原。

如本文所用，術語「抗原結合片段」係指含有免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈，或Nanobody® (Nab)之至少一個CDR的多肽片段，其結合至相關抗原，尤其結合至一或多個FZD受體，或結合至LRP5及/或LRP6。就此而言，本文所描述之抗體的抗原結合片段可包含來自結合一或多種FZD受體或LRP5及/或LRP6之抗體的VH及VL之1個、2個、3個、4個、5個或所有6個CDR。

如本文所使用，術語「生物活性(biological activity/biologically active)」係指歸因於細胞中之特定生物元件的活性。舉例而言，WNT促效劑或其片段或變異體之「生物活性」係指模擬或增強WNT訊號之能力。作為另一個實例，多肽或其功能片段或變異體之生物活性係指該多肽或其功能片段或變異體發揮其例如結合、酶活性等天然功能的能力。在一些實施例中，功能性片段或變異體保留對應天然蛋白質或核酸之活性的至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。作為第三實例，基因調控元件，例如啟動子、強化子、Kozak序列及其類似物之生物活性係指該調控元件或其功能片段或變異體分別調節，亦即促進、增強其可操作地連接之基因之表現或活化該基因之轉譯的能力。

如本文所用，術語「雙官能抗體」係指包含對一個抗原位點具有特異性之第一臂及對不同抗原位點具有特異性之第二臂的抗體，亦即，雙功能抗體具有雙特異性。

「雙特異性抗體」在本文中用於指藉由四聯瘤(quadroma)技術(參見Milstein等人, Nature, 305(5934): 537-540 (1983))、藉由兩種不同單株抗體之化學共軛(參見Staerz等人, Nature, 314(6012): 628-631 (1985))或藉由杵-進入-臼(knob-into-hole)或類似方法產生之全長抗體，其在Fc區中引入突變(參見Holliger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993))，產生多種不同免疫球蛋白物種，其中僅一種為功能性雙特異性抗體。雙特異性抗體在其兩個結合臂中之一者(一對HC/LC)上結合一個抗原(或抗原決定基)，且在其第二臂(不同的HC/LC對)上結合不同抗原(或抗原決定基)。藉由此定義，雙特異性抗體具有兩種不同抗原結合臂(在特異性及CDR序列兩者方面)，且對於其所結合之各抗原呈單價。

「包含」意思指，所敍述之要素係例如組合物、方法、套組等中所需的，但亦可包括其他要素以形成在申請專利範圍之範圍內的例如該組合物、方法、套組等。舉例而言，「包含」可操作地連接至啟動子的編碼治療多肽之基因的表現卡匣係除該基因及啟動子外，亦可包括其他元件，例如聚腺苷酸化序列、強化子元件、其他基因、連接子域等的表現卡匣。

「基本上由……組成」意圖將所描述的例如組合物、方法、套組等之範圍限制於不會實質上影響例如該組合物、方法、套組等之基本及新穎特徵的指定材料或步驟。舉例而言，「基本上由可操作地連接至啟動子及聚腺苷酸化序列的編碼治療多肽之基因組成」的表現卡匣可包括額外序列，例如連接子序列，只要其不會實質上影響該基因之轉錄或轉譯即可。作為另一個實例，「基本上由所敍述之序列組成」的變異體或突變體多肽片段基於作為其來源之全長原始多肽而在序列之邊界處具有所敍述之序列±約10個胺基酸殘基的胺基酸序列，例如比所敍述之邊界胺基酸殘基少10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個殘基，或比所敍述之邊界胺基酸殘基多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基。

「由……組成」意謂自組合物、方法或套組除去申請專利範圍中未說明之任何元件、步驟或成分。舉例而言，「由所敍述之序列組成」的多肽或多肽域僅含所敍述之序列。

「控制元件」或「控制序列」係參與促成包括聚核苷酸之複製、倍增、轉錄、剪接、轉譯或降解在內的聚核苷酸之功能調控之分子之間的相互作用之核苷酸序列。該調節可影響該過程之頻率、速度或特異性，且可為增強性或抑制性的。此項技術中已知之控制元件包括例如轉錄調控序列，諸如啟動子及強化子。啟動子係在某些條件下能夠結合RNA聚合酶且起始通常位於啟動子下游(沿3'方向)之編碼區之轉錄的DNA區域。

「抗原決定基」係抗體識別且結合至之抗原上的特定區域，且亦稱為「抗原決定子」。抗原決定基在蛋白質表面上通常為5至8個胺基酸長。蛋白質為三維摺疊結構，且抗原決定基可以其存在於溶液中之形式或其天然形式被識別。當抗原決定基由三維結構結合在一起之胺基酸組成時，抗原決定基為構形或非連續的。若抗原決定基存在於單一多肽鏈上，則其為連續或線性抗原決定基。視抗原決定基而定，抗體識別可僅結合蛋白質之片段或變性片段，或其亦可能夠結合天然蛋白質。

識別抗原決定基之抗體或其抗體片段的部分稱為「抗原決定基結合域」或「抗原結合域」。抗體或抗體片段之抗原決定基或抗原結合域處於Fab片段中且效應功能處於Fc片段中。六個區段，稱為互補決定區(CDR)，其在重鏈及輕鏈之可變區(VH及VL)內自抗體之其餘部分之構架(FR區)球狀結構流出且相互作用以在分子一端形成暴露表面。此為抗原結合域。一般而言，CDR中之4至6個將直接涉及結合抗原，但較少可提供主要結合基元。

「表現載體」為如本文所論述或如此項技術中已知之載體，例如質體、微型環、病毒載體、脂質體及其類似物，其包含編碼感興趣基因產物之區域，且用於實現基因產物在預定目標細胞中之表現。表現載體亦包含可操作地連接至編碼區以促進基因產物在目標中之表現的控制元件，例如啟動子、增強子、UTR、miRNA靶向序列等。控制元件與一或多個其可操作地連接以進行表現之基因的組合有時稱為「表現卡匣」，許多表現卡匣係此項技術中已知且可獲得的，或可由此項技術中可得到的組分容易地構築。

如本文所用，術語「FR組」係指四個側接胺基酸序列，其構架重鏈或輕鏈V區之CDR組之CDR。一些FR殘基可接觸結合抗原；然而，FR主要負責摺疊V區以形成抗原結合位點，尤其直接鄰近CDR之FR殘基。在FR內，某些胺基殘基及某些結構特徵極度保守。就此而言，所有V區序列含有約90個胺基酸殘基之內部二硫環。當V區摺疊以形成結合位點時，CDR呈現為形成抗原結合表面之突出環模體。一般認為存在FR保守結構區，其影響CDR環形成某些「典型」結構之摺疊形狀，與精確CDR胺基酸序列無關。此外，已知某些FR殘基參與非共價域間接觸，該等接觸使抗體重鏈及輕鏈之相互作用穩定。

「人源化」抗體或其片段係指來自非人類物種之抗體或其片段，其蛋白質序列已經修飾以增加其與人類中天然產生之抗體變異體的相似性。「人源化」方法通常應用於經研發用於投與人類之單株抗體。

術語「個體」、「宿主」、「個體」及「患者」在本文中可互換地使用，且係指哺乳動物，包括但不限於人類及非人類靈長類動物，包括猿猴及人類；哺乳動物運動型動物(例如馬)；哺乳動物農畜(例如綿羊、山羊等)；哺乳動物寵物(犬、貓等)；及嚙齒動物(例如小鼠、大鼠等)。

「單株抗體」係指均質抗體群體，其中單株抗體由涉及抗原決定基之選擇性結合的胺基酸(天然存在及非天然存在)構成。單株抗體針對單一抗原決定基具高度特異性。術語「單株抗體」不僅涵蓋完整單株抗體及全長單株抗體，且亦涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)、Nanobodies®、其變異體、包含單株抗體、人源化單株抗體、嵌合單株抗體及免疫球蛋白分子之任何其他經修飾組態之抗原結合片段的融合蛋白質，其包含所需特異性及結合至抗原決定基之能力的抗原結合片段(抗原決定基識別位點)，包括本文所揭示之工程化WNT促效劑。並不意欲限制抗體之來源或其製造方式(例如藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現、轉殖基因動物等)。該術語包括整個免疫球蛋白以及上文在「抗體」定義下所描述之片段等。

如本文所使用，術語「天然」或「野生型」係指存在於野生型細胞、組織、器官或生物體中之核苷酸序列，例如基因或基因產物，例如RNA或蛋白質。如本文所使用，術語「變異體」係指參考聚核苷酸或多肽序列，例如天然聚核苷酸或多肽序列之突變體，亦即，與該參考聚核苷酸或多肽序列具有小於100%之序列一致性。換言之，變異體包含相對於參考聚核苷酸序列，例如天然聚核苷酸或多肽序列的至少一個胺基酸差異(例如胺基酸取代、胺基酸插入、胺基酸缺失)。舉例而言，變異體可為與全長天然聚核苷酸序列具有50%或更高、60%或更高、或70%或更高序列一致性，例如與全長天然聚核苷酸序列具有75%或80%或更高一致性，諸如85%、90%或95%或更高，例如98%或99%一致性的聚核苷酸。作為另一個實例，變異體可為與全長天然多肽序列具有70%或更高序列一致性，例如與全長天然多肽序列具有75%或80%或更高一致性，諸如85%、90%或95%或更高，例如98%或99%一致性的多肽。變異體亦可包括與參考序列(例如天然序列)之片段共有70%或更高序列一致性，例如與天然序列共有75%或80%或更高，諸如85%、90%或95%或更高一致性，例如98%或99%一致性的參考序列(例如天然序列)之變異體片段。

「操作性地連接」或「可操作地連接」係指遺傳元件之並接，其中該等元件係呈允許其以預期方式操作的關係。舉例而言，若啟動子有助於起始編碼序列之轉錄，則該啟動子係可操作地連接至編碼區。在啟動子與編碼區之間可存在介入殘基，只要維持此功能關係即可。

如本文所使用，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」係指任何長度之胺基酸的聚合物。該等術語亦涵蓋經修飾之胺基酸聚合物；例如以包括二硫鍵形成、糖基化、脂質化、磷酸化或與標記組分結合。

術語「聚核苷酸」係指任何長度之核苷酸之聚合形式，該等核苷酸包括去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物，且可間雜有非核苷酸組分。若存在，則可在聚合物組裝之前或之後賦予核苷酸結構之修飾。如本文所使用，術語聚核苷酸可互換地指雙股及單股分子。除非另有說明或要求，否則本文所描述的本發明之聚核苷酸的任何實施例涵蓋雙股形式及已知或預測構成該雙股形式之兩個互補單股形式中之每一個。

聚核苷酸或多肽與另一聚核苷酸或多肽具有一定百分比「序列一致性」，意謂，當比對時，在比較兩個序列時鹼基或胺基酸之彼百分比相同。如本文中所用，就相關多肽或聚核苷酸序列而言，術語「一致性」及「一致」係指相關序列與參考序列之比對中精確匹配殘基的百分比，例如由BLAST算法產生之比對。除非另外說明，否則一致性係在參考序列之全長內計算。因此，相關序列「與參考序列具有至少x%一致性」係若將參考序列與相關序列(作為查詢序列)比對(作為目標序列)時，則將目標序列中之至少x% (向下捨入)殘基按與查詢序列中之對應殘基的精確匹配比對，分母為參考序列之全長加上藉由參考序列與相關序列之比對插入至參考序列中的任何間隙之長度。當本發明序列具有可變位置(例如標示為X之殘基)時，與查詢序列中之任何殘基之比對視為匹配。

可以多種不同方式判定序列相似性。為確定序列一致性，可使用方法及電腦程式(包括BLAST，在全球資訊網ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上可用)比對序列。序列比對可使用NCBI Blast服務(BLAST+版本2.12.0)或提供相同結果之另一程式進行。除非有相反指示，否則序列一致性係使用BLAST演算法(例如bl2seq)，用預設參數確定。

另一種比對演算法係自美國威斯康星州(Wis. ,USA)之Madison (Oxford Molecular Group, Inc.之獨資子公司)之遺傳學計算組(Genetics Computing Group，GCG)軟體套裝中得到的FASTA。用於比對之其他技術描述於以下中：Methods in Enzymology, 第266卷：Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996)編. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, Calif., USA。尤其受關注之係准許序列中之空隙的比對程式。Smith-Waterman為一種准許序列比對中之空隙的演算法。參見Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)。此外，使用尼德曼(Needleman)及翁施(Wunsch)比對方法之GAP程式可用於比對序列。參見J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)

值得關注的係BestFit程式，其使用Smith及Waterman之局部同源演算法(Advances in Applied Mathematics 2: 482-489(1981))來確定序列一致性。空隙產生罰分將大體在1至5、通常2至4之範圍內，且在許多實施例中將為3。空位延伸罰分一般在約0.01至0.20之範圍內，且在許多實例中將為0.10。該程式具有由所輸入的用於比較之序列決定的預設參數。較佳地，使用由程式確定之預設參數來確定序列一致性。此程式亦可得自美國威斯康星州Madison之遺傳學計算組(GCG)套裝軟體。

另一所關注程式為FastDB演算法。FastDB描述於Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, 第127-149頁, 1988, Alan R. Liss公司中。基於以下參數藉由FastDB計算序列一致性百分比：不匹配罰分：1.00；空隙罰分：1.00；空隙大小罰分：0.33；及連接罰分：30.0。

如本文所使用，「啟動子」涵蓋引導RNA聚合酶之結合且由此促進RNA合成的DNA序列，亦即足以引導轉錄之最小序列。啟動子及相應蛋白質或多肽表現可為普遍存在的，意味著在眾多細胞、組織及物種中具有較強活性或具有細胞類型特異性、組織特異性或物種特異性。啟動子可為「組成性」的，意味著其具有連續地活性；或為「誘導性」的，意味著啟動子可因生物或非生物因素之存在或不存在而活化或去活化。本發明之核酸構築體或載體中亦包括可與或可不與啟動子序列鄰接之強化子序列。強化子序列影響啟動子依賴性基因表現且可位於天然基因之5'或3'區中。

「重組」當用於聚核苷酸時意思指，該聚核苷酸係選殖、限制或連接步驟或產生不同於在自然界中發現之聚核苷酸之構築體的其他程序之各種組合的產物。

術語「治療(treatment/treating)」及其類似術語在本文中一般用以意謂獲得所需藥理學及/或生理作用。就完全或部分預防疾病或其症狀，例如降低個體發生疾病或其症狀之可能性而言，該作用可為預防性的，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之副作用而言，該作用可為治療性的。如本文所用，「治療」覆蓋對哺乳動物之疾病之任何治療，且包括：(a)預防易患疾病但尚未診斷為患有該疾病之個體內出現疾病；(b)抑制疾病，亦即遏制其發展；或(c)緩解疾病，亦即引起疾病消退。治療劑可在疾病或損傷發作之前、期間或之後投與。對進行中之疾病之治療尤其受關注，其中治療穩定或減少患者之不期望的臨床症狀。此治療理想地在受影響組織之功能完全喪失之前進行。個體療法理想地在疾病有症狀階段期間且在一些情況下在疾病有症狀階段之後投與。

除非另外指示，否則本發明之實踐將採用在熟習此項技術者之技能範圍內的細胞生物學、分子生物學、微生物學、生物化學及免疫學之習知技術。此類技術在諸如以下之文獻中充分闡述：「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第二版 (Sambrook等人, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」 (M. J. Gait編, 1984)；「Animal Cell Culture」 (R. I. Freshney編, 1987)；「Methods in Enzymology」 (Academic Press, Inc.)；「Handbook of Experimental Immunology」 (D. M. Weir及C. C. Blackwell編)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」 (J. M. Miller及M. P. Calos編, 1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」 (F. M. Ausubel等人編, 1987)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis等人編, 1994)；及「Current Protocols in Immunology」 (J. E. Coligan等人編, 1991)，其中之每一者明確地以引用之方式併入本文中。

下文參考用於說明之實例應用來描述本發明之若干態樣。應瞭解，闡述眾多特定細節、關係及方法以提供對本發明之充分理解。然而，一般熟習此項技術者將易於認識到，可在無一或多個特定細節的情況下或藉由其他方法來實踐本發明。本發明不受動作或事件之所說明次序限制，此係因為一些動作可按不同次序發生及/或可與其他動作或事件同時發生。此外，實施根據本發明之方法不需要所有所說明的操作或事件。

本文中所使用之術語僅為了描述特定實施例，且並不意欲限制本發明。如本文中所使用，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一(a/an)」及「所述」亦意欲包括複數形式。此外，就實施方式及/或申請專利範圍中使用術語「包括(including)」、「包括(includes)」、「具有(having)」、「具有(has)」、「具有(with)」或其變化形式之程度而言，此類術語意欲以類似於術語「包含」之方式為包括性的。

術語「約(about)」或「大致(approximately)」意謂在如由一般熟習此項技術者所測定之特定值之可接受誤差範圍內，其將部分取決於如何量測或測定該值，亦即量測系統之限制。舉例而言，根據本領域中之實踐，「約」可意謂在1或大於1個標準差內。或者，「約」可意謂在給定值之至多20%，較佳至多10%，更佳至多5%且再更佳至多1%之範圍內。或者，尤其就生物系統或方法而言，該術語可意謂在一定值之一個數量級範圍內，較佳在5倍範圍內且更佳在2倍範圍內。若特定值描述於本申請案及申請專利範圍中，除非另有說明，否則應假設術語「約」意謂在特定值之可接受誤差範圍內。

本文所提及之全部公開案均以引用之方式併入本文中，以揭示及描述與所引用之公開案相關的方法及/或材料。應理解，在存在矛盾之情況下，本發明取代所併入公開案之任何揭示內容。

進一步應注意，申請專利範圍可經起草以排除任何視情況存在之要素。因此，此陳述意欲與對所主張要素之敍述結合充當使用諸如「僅僅(solely)」、「僅(only)」及其類似術語之排他性術語或使用「負性」限制之前提基礎。

除非另外指示，否則本文所使用之所有術語均具有與熟習此項技術者所知相同之含義且本發明之實踐將採用在熟習此項技術者之知識範圍內的微生物學及重組DNA技術之習知技術。 II.通用

本發明提供用於調節WNT訊號以改善可受益於調節WNT傳訊路徑之各種疾病及病症的組合物及方法，該等疾病及病症諸如胃腸道病症，包括(但不限於)發炎性腸病，包括(但不限於)克隆氏病、伴有瘺形成之克隆氏病及潰瘍性結腸炎。

WNT(「無翅基因相關整合位點(Wingless-related integration site)」或「無翅基因及Int-1」或「無翅基因-Int」)配體及其訊號在控制包括骨、肝、皮膚、胃、腸、腎、中樞神經系統、乳腺、口腔黏膜、味蕾、卵巢、耳蝸及許多其他組織在內的許多必不可少之器官及組織的發育、動態平衡及再生中起到關鍵作用(評述於例如Clevers, Loh, and Nusse, 2014; 346:1248012)。調節WNT訊號傳導路徑有可能治療退化性疾病及組織損傷。

調節WNT傳訊作為一種治療手段的一個難題係存在多種WNT配體及WNT受體，即捲曲蛋白1-10 (FZD1-10)，其中許多組織表現多種且重疊之FZD。除FZD外，標準WNT傳訊亦涉及低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白5 (LRP5)及/或低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白6(LRP6)作為輔受體，該等蛋白質在各種組織中廣泛表現。LRP5及LRP6被集體地稱作LRP5/6，且指代「LRP5/6結合」或其類似物，指示結合至LRP5及/或LRP6。

R-脊椎蛋白1-4 (RSPO1-4)係擴增WNT訊號之配體之家族。R-脊椎蛋白中之每一者經由受體複合物起作用，該受體複合物在一端上含有鋅及環指3 (ZNRF3)或環指蛋白質43 (RNF43)且在另一端上含有富含白胺酸含有重複G蛋白偶聯受體4-6 (LGR4-6) (例如藉由Knight and Hankenson 2014, Matrix Biology; 37: 157-161審查)。R-脊椎蛋白亦可經由額外作用機制發揮作用。ZNRF3及RNF43係兩種特異性靶向WNT受體(FZD1-10及LRP5或LRP6)以實現降解的膜結合E3連接酶。R-脊椎蛋白與ZNRF3/RNF43及LGR4-6結合引起三元複合物之清除或隔離，由此將E3連接酶自WNT受體移除且使WNT受體穩定，產生增強之WNT訊號。每種R-脊椎蛋白含有兩個弗林蛋白酶(Furin)域(1及2)，其中弗林蛋白酶域1結合至ZNRF3/RNF43，且弗林蛋白酶域2結合至LGR4-6。含有弗林蛋白酶域1及2之R-脊椎蛋白的片段足以擴增WNT傳訊。儘管R-脊椎蛋白之作用取決於WNT訊號，但由於LGR4-6及ZNRF3/RNF43兩者在各種組織中廣泛表現，故R-脊椎蛋白之作用不具有組織特異性。

藉由WNT促效劑活化WNT傳訊可用於治療多種疾病及病症，包括胃腸道病症。類似地，藉由RSPO或RSPO模擬物擴增WNT傳訊可用於治療多種疾病及病症，包括胃腸道病症。文獻中之先前研究表明RSPO可用於治療實驗結腸大腸炎(J. Zhao等人., 2007)。WNT促效劑分子亦可用於治療胃腸道病症。特定言之，活動性WNT傳訊可提供主要幹細胞維持訊號，且在調節腸上皮組織在體內平衡及損傷中之再生中起關鍵作用。

兩種腸道上皮譜系，吸收性及分泌性，界定腸道設備之兩種主要功能。分泌細胞分泌激素且主要經由黏液及抗微生物肽之分泌提供針對食源性微生物、毒素及抗原之重要阻擋層。相比之下，吸收性細胞進行膳食營養素之攝入，因為其主要位於小腸絨毛尖端處或結腸隱窩頂部處，因此構成腸表面區域上的大部分內腔細胞(參見例如Santos等人(2018) Trends in Cell Biol. in press, https://doi.org/10.1016/j.tcb.2018.08.001)。在體內平衡條件下，腸上皮組織中之所有細胞在3至10天之內再生。

不同的生態棲位因子維持腸幹細胞(ISC)活性，且不同的非上皮及/或上皮細胞加工構成細胞生態棲位之各種訊號。此類生態棲位因子不僅包括標準訊號，諸如WNT、R-脊椎蛋白、Notch及骨塑型蛋白(BMP)，且亦包括發炎性及膳食影響。在損傷後，ISC生態棲位適應超出其恆穩狀態，以解釋病原性刺激且將其轉譯成上皮組織再生。此再生係藉由存活Lgr5+ ISC或其他成熟細胞類型，諸如腸上皮細胞、腸道內分泌細胞或潘氏細胞介導，該等細胞可轉換回Lgr5+ ISC，以輔助上皮再生(Beumer and Clevers (2016), Development 143: 3639-3649)。

腸道隱窩底部之ISC，亦稱為柱狀基底細胞(CBC)與WNT分泌潘氏細胞一起插入(Cheng and Leblond (1974) Am. J. Anat. 141: 537-561)。腸道上皮組織周圍之間葉細胞亦分泌一些WNT蛋白質，在活體內發揮重疊幹細胞生態棲位功能(Farin等人(2012) Gastroenterol. 143: 1518-1529)。在WNT傳訊存在下，ISC分裂以產生自更新的幹細胞且分化的子細胞，該等細胞在分化成功能性細胞類型之前首先經過幾個快速傳輸擴增(TA)分裂。在腸道隱窩+4細胞中亦存在靜態幹細胞群，其可當CBC受損時引起上皮再生(Tian等人(2011) Nature 478: 255-259)。當TA細胞沿隱窩-絨毛軸遠離WNT生產細胞遷移出時，發生對個別譜系及最終分化之募集。 III.經工程化WNT促效劑

本發明提供經工程化WNT促效劑，且涵蓋使用經工程化WNT促效劑例如經由典型WNT/β-連環蛋白傳訊路徑刺激、促效或促進WNT傳訊。此類經工程化WNT促效劑亦可稱為WNT/β-連環蛋白傳訊促效劑或Wnt模擬物。

用於臨床應用之工程化Wnt蛋白質中存在若干挑戰。首先，Wnt蛋白質難以產生且不含有典型的類藥物特性。其次，據報導，擴增Wnt傳訊之外源性RSPO的活體內過度表現或應用幫助在各種損傷模型中再生腸上皮組織(Zhao等人., 2007)，但其亦據報導誘導正常腸上皮組織之增殖增加(Yan Kelley S.等人., 2017)。

本發明藉由提供具有藥物樣特性，尤其呈重組雙特異性抗體形式之合成Wnt模擬物來解決第一攻擊，該等抗體使Fzd及Lrp結合在一起以刺激傳訊，模擬內源性Wnt配位體。本發明之Wnt模擬物可自由地擴散、接近受損組織且導引組織修復，其中需要Wnt訊號。

本發明藉由提供能夠修復受損腸上皮組織而不與RSPO組合之Wnt模擬物來解決第二攻擊。不同於RSPO，本發明之Wnt模擬物不誘導正常腸上皮組織過度增殖。

本發明之Wnt模擬物具有使患病腸組織恢復回正常生理學之所需特性。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物誘導受損上皮組織之快速恢復。在一些實施例中，受損上皮障壁可在經本發明之Wnt模擬物處理之約10天、約8天、約7天、約6天或約5天內恢復。在一些實施例中，受損上皮障壁可在經本發明之Wnt模擬物處理約6天內恢復。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物在約12小時、約24小時、約36小時或約48小時內誘導受損上皮細胞中之Wnt目標基因的表現。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物在約24小時內誘導受損上皮細胞中之Wnt目標基因之表現。在一些實施例中，由本發明之Wnt模擬物誘導的Wnt目標基因包含 Axin2 、 Rnf43 、 Cdkn3。在一些實施例中，受損上皮細胞中之 Axin2之表現在約24小時內由本發明之Wnt模擬物誘導。

在一些實施例中，本文所揭示之Wnt促效劑支持患有中度至重度IBD之患者之受損腸道或結腸隱窩中之幹細胞的增殖及分化。在一些實施例中，本文所揭示之Wnt促效劑具有加速腸道屏障之修復的潛能，其可引起穿透腸上皮之細菌的減少及免疫細胞活化及發炎之減少，由此治療發炎性腸病。

在一些實施例中，本文所揭示之Wnt促效劑具有若干同時的有益作用：活化腸道幹細胞及前驅細胞中之Wnt傳訊路徑，引起增殖及分化；恢復腸障壁功能及組織架構；減少組織發炎；且降低中度至重度IBD中之疾病活性。

在一些實施例中，本文所揭示之Wnt促效劑為靶向Fzd5/8及Lrp6之雙特異性抗體。Fzd5先前據報導在IBD患者之腸道黏膜細胞中高度表現。Fzd5亦高度表現於由聚葡萄糖硫酸鈉(DSS)誘導之小鼠結腸炎模型中。在一些實施例中，本文所揭示之Wnt促效劑結合至DSS-受損之腸道細胞，刺激如藉由 Axin2(Wnt路徑中之下游目標基因)之表現所量測之Wnt傳訊。在一些實施例中，本文所揭示之Wnt促效劑結合至腸道幹細胞上之Fzd5/8及Lrp6，以活化Wnt傳訊。

在一些實施例中，投與本文所揭示之Wnt促效劑改進DSS模型中之疾病活動性指數或DAI。DAI為由通常用於定量臨床前嚙齒動物模型及臨床中之疾病嚴重程度的體重變化、腹瀉及血便之複合評分。在一些實施例中，投與本文所揭示之Wnt促效劑引起DAI之劑量依賴性降低。在一些實施例中，用本文所揭示之Wnt促效劑處理優於用環孢靈、抗TNF抗體或抗IL12/23抗體處理。在一些實施例中，投與本文所揭示之Wnt促效劑改進慢性DSS模型及急性DSS模型兩者中之DAI。

在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物擴增上皮組織中之前驅細胞群體。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物藉由增加該等細胞群體中細胞週期基因之表現來擴增前驅細胞群體。前驅細胞群體可包括例如對損傷起反應的正常前驅細胞及細胞狀態改變(諸如去分化)下之前驅細胞。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物在約24小時內實質上擴增上皮組織中之前驅細胞群體。

在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物促進前驅細胞分化成成熟細胞類型。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物加速前驅細胞，例如胃腸前驅細胞，分化成腸上皮細胞、杯狀細胞、腸道內分泌細胞或簇細胞。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物促進前驅細胞分化成腸上皮細胞。在一些實施例中，前驅細胞實質上分化成成熟細胞類型發生在經本發明之Wnt模擬物處理之約24小時、約36小時、約48小時或約60小時內。在一些實施例中，前驅細胞實質上分化成成熟細胞類型發生在經本發明之Wnt模擬物處理約48小時內。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物促進前驅細胞分化成成熟細胞類型，同時減少高表現量之發炎性基因。

在一些實施例中，腸道屏障之分解觸發內腔病原體之流入及引起另外組織損害之發炎反應。IBD中之疾病修飾可藉由受損組織中及血清中存在之發炎性細胞介素含量來量測。在一些實施例中，用本發明之Wnt模擬物處理上皮組織損傷減少發炎性細胞介素之產生。在一些實施例中，與不包含本發明之Wnt模擬物之處理相比，或與無處理相比，用本發明之Wnt模擬物處理受損的上皮細胞使發炎性細胞介素產生減少至少約1%、至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。

在一些實施例中，本發明提供能夠有效修復受損的上皮細胞而不誘導正常上皮組織過度增殖之Wnt模擬物。在一些實施例中，單獨的本發明之Wnt模擬物不影響正常上皮組織之增殖。在一些實施例中，上皮細胞為結腸或小腸上皮細胞。在一些實施例中，本發明提供能夠以比包含RSPO之治療更高的療效修復受損上皮之Wnt模擬物。在一些實施例中，本發明提供能夠以比包含本發明之RSPO及Wnt模擬物之處理更高的功效修復受損上皮的Wnt模擬物。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物以比包含RSPO之處理或包含本發明之RSPO及Wnt模擬物之處理更佳的功效改善受損上皮至少約1%，至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。修復受損上皮之功效可藉由組織學嚴重程度分數確定，其中較高分數指示更嚴重損害；或疾病活動性指數(DIA)，其可基於平均體重減輕分數、大便堅實度及腸出血程度來計算。

在一些實施例中，本發明提供Fzd5,8及Lrp6-特異性Wnt模擬物- (例如R2M13-26或R2M13-h26)。在一些實施例中，本發明之Fzd5,8及Lrp6-特異性Wnt模擬物能夠活化上皮細胞上之Wnt傳訊。Wnt傳訊之活化可藉由基因表現使用此項技術中已知且本發明中所描述之scRNA-seq (單細胞RNA定序)方法量測。在一些實施例中，上皮細胞為結腸或小腸上皮細胞。在一些實施例中，上皮細胞包括多個幹細胞或前驅細胞。

經工程化WNT促效劑包括一或多個結合域，其結合至一或多個FZD或其抗原決定基；及一或多個結合域，其結合至LRP5及/或LRP6中之一或多者或LRP5及/或LRP6內之抗原決定基。在某些實施例中，經工程化WNT促效劑特異性結合至其結合之人類捲曲受體內之富含半胱胺酸之域(CRD)。

在某些實施例中，經工程化WNT促效劑可包含一或多種其他結合域。舉例而言，其可包含一或多個結合至E3接合酶、ZNRF3/RNF43或E3接合酶中之任一者內的特定抗原決定基中之一或多者的結合域。在某些實施例中，E3連接酶結合域包含R-SPO或其片段。

在某些實施例中，經工程化WNT促效劑可包含一或多個特異性結合至目標組織或細胞類型的組織特異性或細胞特異性結合域。

在一個態樣中，本發明提供結合至LRP5及/或LRP6之VHH域。此等VHH域之說明性序列提供於表1中。VHH結合域可衍生自所揭示之序列中之任一者。在特定實施例中，將VHH結合域人源化。本發明涵蓋經工程化WNT促效劑，其包含一或多個所揭示之VHH域，其包括本文所揭示之人源化VHH域中之任一者，以及與本文所揭示之VHH序列中之任一者具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的此類VHH域之功能片段及變異體。在某些實施例中，VHH域包含三個CDR序列：GRIFAIYDIA、IRPVVTEIDYADSVKG及RPWGSRDEY。

在另一態樣中，本發明提供結合至一或多個FZD之FZD結合域。表3中提供此等FZD結合域之說明性序列，在衍生自抗FZD抗體之VH及VL域之情形下，R2M13。本發明涵蓋經工程化WNT促效劑，其包含一或多個所揭示之VH或VL域，以及與本文所揭示之VH或VL序列中之任一者具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的此類VH或VL域之功能片段及變異體。另外，本發明涵蓋經工程化WNT促效劑，其包含表3中所提供之重鏈或輕鏈序列中之一或多者，以及與本文所揭示之重鏈或輕鏈序列中之任一者具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的此類重鏈或輕鏈之功能片段及變異體。在某些實施例中，FZD結合域包含三個輕鏈CDR序列：RASQSISSYLN (CDRL1)、AASSLQS (CDRL2)及QQSYSTPLT (CDRL3)及/或三個重鏈輕鏈CDR序列：GGTFTYRYLH (CDRH1)、GIIPIFGTGNYAQKFQG (CDRH2)及SMVRVPYYYGMDV (CDRH3)，本文所提供之任何CDR。

在相關實施例中，本發明涵蓋經工程化WNT促效劑，其包含存在於本文所揭示之FZD結合域或LRP5/6結合域中之一或多個CDR：例如展示於圖 6或表1中之一或多個(例如，兩個或三個) VHH CDR；存在於本文所揭示之重鏈或輕鏈中之一或多個(例如，兩個或三個) CDR。在某些實施例中，經工程化WNT促效劑包含關於本文例如在圖 6或表3中所揭示之FZD結合域所示之4、5或所有六個CDR。在某些實施例中，經工程化WNT促效劑包含針對本文例如圖 6或表3中所揭示之經工程化WNT促效劑所示之6、7、8或全部9個CDR。

本發明提供多肽，其包含與本文所提供之結合域具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性的序列或由該序列組成，以及包含兩個或更多個，例如三個本文所揭示之CDR序列的多肽，諸如包含以下CDR之多肽：GRIFAIYDIA、IRPVVTEIDYADSVKG及RPWGSRDEY (分別為VHH CDRs1-3)，且其結合至LRP5或LRP6，或包含以下CDR之多肽：RASQSISSYLN (CDRL1)、AASSLQS (CDRL2)及QQSYSTPLT (CDRL3)，其與重鏈組合結合一或多個FZD，或包含以下CDR之多肽：GGTFTYRYLH (CDRH1)、GIIPIFGTGNYAQKFQG (CDRH2)及SMVRVPYYYGMDV (CDRH3)，其與輕鏈組合結合一或多個FZD。本發明亦包括FZD結合域，其包含兩條重鏈及兩條輕鏈，其中每一重鏈包含以下CDR中之兩者或更多者：GGTFTYRYLH (CDRH1)、GIIPIFGTGNYAQKFQG (CDRH2)及SMVRVPYYYGMDV (CDRH3)，且每一輕鏈包含以下CDR中之兩者或更多者：RASQSISSYLN (CDRL1)、AASSLQS (CDRL2)及QQSYSTPLT (CDRL3)，其中該FZD結合域結合至一或多個FZD。在某些實施例中，FZD結合域為抗體，且重鏈進一步包含可經修飾之Fc域，例如IgG1 Fc域。本發明進一步提供多肽，其包含與例如SEQ ID NOs: 1-25、圖6或表3中之本文所揭示之可變重鏈或可變輕鏈域具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性的序列或由該序列組成。本發明進一步提供多肽，其包含與例如SEQ ID NOs: 1-25、圖6或表3中之本文所揭示之VHH域具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%之一致性的序列或由該序列組成。本發明進一步提供多肽，其包含與例如SEQ ID NOs: 1-25、圖6或表3中之本文所揭示之重鏈或輕鏈或融合多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%之一致性的序列或由該序列組成。在本文所揭示之多肽變異體中之任一者的實施例中，CDR與原始或親體序列相比未經修飾。

另外，本發明提供編碼本文所描述之多肽中之任一者的聚核苷酸序列，以及其功能性片段及變異體，例如結合一或多個FZD或LRP5/6、VH域及VL域之片段及變異體。

在某些實施例中，本文所揭示之經工程化WNT促效劑包含Fc域(例如，作為重鏈之一部分)。在特定實施例中，Fc域經工程化以包括特異性胺基酸取代，包括對應於LALAPG或N297G之胺基酸取代。

在經工程化WNT促效劑之特定實施例中，本文所揭示之一或多個LRP5/6結合域(例如，VHH26-H1-H6中之任一者)例如直接或經由連接子，例如肽連接子融合至本文所揭示之FZD結合域之輕鏈或重鏈中之一或多者(例如，R2M13衍生之FZD結合域)。然而，在其他實施例中，本文所揭示之任何LRP5/6結合域可與不同FZD結合域融合或複合以實現經工程化WNT促效劑，且本文所揭示之任何FZD結合域可與不同LRP5/6結合域融合或複合以實現經工程化WNT促效劑。可全部或部分地存在於本文所揭示之經工程化WNT促效劑中之多種抗FZD或抗LRP抗體包括美國專利第7,462,697號、PCT公開案第WO 2019/126399號及PCT公開案第WO 2019/126401號中所描述之彼等。說明性型式及序列亦提供於PCT公開案第WO 2019/126398號中，其中之每一者全文併入本文中。

經工程化WNT促效劑可採用多種不同結構構形，其各自包含一或多個(例如兩個) FZD結合域及一或多個(例如兩個) LRP5/6結合域。FZD結合域及LRP5/6結合域可直接彼此融合或經由連接子(例如肽連接子)融合。或者，FZD結合域及LRP5/6結合域可彼此複合。

在某些實施例中，經工程化WNT促效劑包含兩個重鏈及兩個輕鏈，其中輕鏈包含融合之VHH，且採用抗體樣確認，其中兩個重鏈經由二硫鍵彼此結合且兩個輕鏈經由二硫鍵結合至重鏈。

經工程化WNT促效劑可採用其他抗體樣結構或確認，包括在各種功能性片段中發現之彼等結構，包括(但不限於)本文所揭示之彼等抗體樣結構或確認。

如此項技術中所熟知，抗體為能夠經由至少一個位於免疫球蛋白分子可變區上之抗原決定基結合域特異性結合於目標(諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所使用，術語不僅涵蓋完整多株或單株抗體，且亦涵蓋含有抗原決定基結合域之其片段(諸如dAb、Fab、Fab'、(F(ab')2、Fv、單鏈(scFv)、Nanobodies® (Nabs；亦稱為sdAb或VHH域)、DVD-Ig、其合成變異體、天然存在之變異體、包含及抗原決定基結合域之融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體及包含具所需特異性之抗原結合位點或片段(抗原決定基識別位點)之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾之組態。由基因融合構築之「雙功能抗體」多價或多特異性片段(WO94/13804；P. Holliger等人., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)亦為本文中所涵蓋之抗體的特定形式。本文亦包括包含接合至CH3域之scFv的微型抗體(S. Hu等人，Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996)。參見例如Ward, E. S.等人，Nature 341, 544-546 (1989)；Bird等人，Science, 242, 423-426, 1988；Huston等人，PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；P. Holliger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993；Y. Reiter等人，Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996；S. Hu等人，Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996。

蛋白分解酶番木瓜蛋白酶優先使IgG分子裂解，從而得到若干片段，其中兩個片段(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原結合位點之共價雜二聚體。酶胃蛋白酶能夠使IgG分子裂解，從而提供若干片段，包括包含兩個抗原結合位點之F(ab')2片段。根據本發明之某些實施例使用之Fv片段可藉由優先蛋白裂解IgM及偶爾蛋白裂解IgG或IgA免疫球蛋白分子而產生。然而，Fv片段更通常使用此項技術中已知之重組技術得到。Fv片段包括有包括抗原結合位點之非共價VH::VL雜二聚體，其保留天然抗體分子之許多抗原識別及結合能力。Inbar等人. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman等人. (1976) Biochem 15:2706-2710;及Ehrlich等人. (1980) Biochem 19:4091-4096。

在某些實施例中，涵蓋單鏈Fv或scFv抗體以用於經工程化WNT促效劑。舉例而言，κ體(Ill等人., Prot. Eng. 10: 949-57 (1997))；微型抗體(Martin等人., EMBO J 13: 5305-9 (1994))；雙功能抗體(Holliger等人., PNAS 90: 6444-8 (1993))；或Janusins (Traunecker等人., EMBO J 10: 3655-59 (1991)及Traunecker等人., Int. J. Cancer Suppl. 7: 51-52 (1992))可使用標準分子生物學技術，遵循本申請案關於選擇具有所需特異性之抗體的教示來製備。在另其他實施例中，可製備雙特異性或嵌合抗體且將其用於本發明之經工程化WNT促效劑中。舉例而言，嵌合抗體可包含來自不同抗體之CDR及構架區，而可產生經由一個結合域特異性結合至一或多個FZD受體及經由第二結合域特異性結合至第二分子的雙特異性抗體。此等抗體可經由重組分子生物學技術產生或可以物理方式結合於一起。

單鏈Fv (scFv)多肽為共價連接之VH::VL雜二聚體，其自包括由編碼肽之連接子連接的VH及VL編碼基因之基因融合物表現。Huston等人. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883。已描述多種方法來辨別化學結構以用於使來自抗體V區之天然聚集(但經化學分離)之輕多肽鏈及重多肽鏈轉化成scFv分子，該scFv分子將摺疊以形成大體上與抗原結合位點之結構類似之三維結構。參見例如美國專利第5,091,513及5,132,405號，至Huston等人；及美國專利第4,946,778號，至Ladner等人。

在某些實施例中，如本文所描述之抗體係呈雙功能抗體形式。雙功能抗體為多肽之多聚體，各多肽包含有包含免疫球蛋白輕鏈之結合區的第一域及包含免疫球蛋白重鏈之結合區的第二域，該等兩個域經連接(例如藉由肽連接子)但不能彼此結合以形成抗原結合位點；抗原結合位點係藉由多聚體內之一個多肽之第一域與多聚體內之另一多肽之第二域結合而形成(WO94/13804)。

抗體之dAb片段由VH域組成(Ward, E. S.等人，Nature 341, 544-546 (1989))。

當使用雙特異性抗體時，此等抗體可為習知雙特異性抗體，其可以多種方式製造(Holliger, P.及Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993))，例如以化學方式製備或自雜交融合瘤製備，或可為上述雙特異性抗體片段中之任一者。可僅使用可變域，在無Fc區之情況下構築雙功能抗體及scFv，從而潛在地降低抗個體基因型反應之作用。

與雙特異性完整抗體相對比，雙特異性雙功能抗體亦可尤其適用，因為其容易構築及表現於大腸桿菌中。可使用噬菌體呈現(WO94/13804)自庫容易地選擇具有適當結合特異性之雙功能抗體(及許多其他多肽，諸如抗體片段)。若雙功能抗體之一個臂要保持恆定，例如具有針對抗原X之特異性，則可製造其中另一個臂變化之庫且選擇具有適當特異性之抗體。可藉由杵-進入-臼(knobs-into-hole)工程化來製備雙特異性完全抗體(J. B. B. Ridgeway等人., Protein Eng., 9, 616-621 (1996))。

在某些實施例中，可提供呈UniBody®形式之本文所描述之抗體。UniBody®係移除鉸鏈區之IgG4抗體(參見GenMab Utrecht, The Netherlands；亦參見例如US20090226421)。此專有抗體技術產生預期治療窗比當前之小抗體型式更長之穩定的更小抗體型式。IgG4抗體視為惰性的，且因此不與免疫系統相互作用。完全人類IgG4抗體可藉由消除抗體之鉸鏈區修飾，以獲得相對於對應完整IgG4 (GenMab，Utrecht)具有明顯穩定性特性之半分子片段。將IgG4分子切半僅在UniBody®上留下一個可結合於同源抗原(例如疾病目標)之區域，且因此使UniBody®單價結合於目標細胞上之僅一個位點。

在某些實施例中，如本文所描述之抗體及其抗原結合片段包括重鏈及輕鏈CDR組，重鏈及輕鏈CDR分別插入於重鏈及輕鏈構架區(FR)組之間，重鏈及輕鏈構架區為該等CDR提供支撐且界定CDR相對於彼此之空間關係。如本文所使用，術語「CDR組」係指重鏈或輕鏈V區之三個高變區。自重鏈或輕鏈之N端開始，此等區分別標示為「CDR1」、「CDR2」及「CDR3」。因此，抗原結合位點包括六個CDR，包含來自重鏈及輕鏈V區中之每一者的CDR組。包含單一CDR (例如CDR1、CDR2或CDR3)之多肽在本文中稱為「分子識別單元」。多種抗原抗體複合物之結晶學分析已表明，CDR之胺基酸殘基與結合之抗原形成廣泛接觸，其中最廣泛抗原接觸係與重鏈CDR3。因此，分子識別單元主要導致抗原結合位點之特異性。

蛋白分解酶番木瓜蛋白酶優先使IgG分子裂解，從而得到若干片段，其中兩個片段(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原結合位點之共價雜二聚體。酶胃蛋白酶能夠使IgG分子裂解，從而提供若干片段，包括包含兩個抗原結合位點之F(ab')2片段。根據本發明之某些實施例使用之Fv片段可藉由優先蛋白裂解IgM及偶爾蛋白裂解IgG或IgA免疫球蛋白分子而產生。然而，Fv片段更通常使用此項技術中已知之重組技術得到。Fv片段包括有包括抗原結合位點之非共價VH::VL雜二聚體，其保留天然抗體分子之許多抗原識別及結合能力。Inbar等人. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662；Hochman等人. (1976) Biochem 15:2706-2710；及Ehrlich等人. (1980) Biochem 19:4091-4096。

在某些實施例中，涵蓋單鏈Fv或scFv抗體。舉例而言，κ主體(Ill等人., Prot. Eng. 10: 949-57 (1997))；微型抗體(Martin等人, EMBO J 13: 5305-9 (1994))；雙功能抗體(Holliger等人, PNAS 90: 6444-8 (1993))；或Janusins (Traunecker等人, EMBO J 10: 3655-59 (1991)及Traunecker等人., Int. J. Cancer Suppl. 7: 51-52 (1992))可使用標準分子生物學技術，遵循本申請案關於選擇具有所需特異性之抗體的教示來製備。在其他實施例中，可製備涵蓋本發明之配位體的雙特異性或嵌合抗體。舉例而言，嵌合抗體可包含來自不同抗體之CDR及構架區，而可產生經由一個結合域特異性結合至一或多個FZD受體及經由第二結合域特異性結合至第二分子的雙特異性抗體。此等抗體可經由重組分子生物學技術產生或可以物理方式結合於一起。

抗體之dAb片段由VH域組成(Ward, E. S.等人，Nature 341, 544-546 (1989))。當使用雙特異性抗體時，此等抗體可為習知雙特異性抗體，其可以多種方式製造(Holliger, P.及Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993))，例如以化學方式製備或自雜交融合瘤製備，或可為上述雙特異性抗體片段中之任一者。可僅使用可變域，在無Fc區之情況下構築雙功能抗體及scFv，從而潛在地降低抗個體基因型反應之作用。

在某些實施例中，本發明之抗體可呈單域(sdAb)或VHH抗體片段(亦稱為Nanobody®)形式。sdAb或VHH技術最初在發現及鑑別駱駝科(例如，駱駝及駱馬)具有僅由重鏈組成且因此缺乏輕鏈之完全功能性抗體之後發展。此等僅重鏈抗體含有單一可變域(VHH)及兩個恆定域(CH2、CH3)。選殖及分離之單一可變域具有完整抗原結合能力且極穩定。具有其獨特結構及功能特性之此等單一可變域形成「Nanobodies®」之基礎。sdAb或VHH由單一基因編碼且在幾乎所有原核及真核宿主，例如大腸桿菌(參見美國專利第6,765,087號)、黴菌(例如麴菌屬(Aspergillus)或木黴菌屬(Trichoderma))及酵母(例如酵母菌屬(Saccharomyces)、克魯維酵母菌屬(Kluyvermyces)、漢森酵母(Hansenula)或畢赤酵母屬(Pichia)中有效產生(參見美國專利第6,838,254號)。產生過程可擴大規模且已產生數公斤數量之Nanobodies®。sdAb或VHH可調配成具有較長存放期之備用溶液。Nanoclone®方法(參見例如，WO 06/079372)係基於B細胞之自動高通量選擇產生針對所要目標之奈米抗體的專有方法。sdAb或VHH為駱駝科特異性重鏈僅抗體之單個域抗原結合片段。

所涵蓋之另一抗體片段係雙-可變域-免疫球蛋白(DVD-Ig)係一種在一個分子實體中組合兩種單株抗體之功能及特異性的經工程化蛋白質。DVD-Ig設計為IgG樣分子，不同之處在於各輕鏈及重鏈經由短肽鍵而非IgG中之一個可變域串聯含有兩個可變域。兩個可變域之融合取向及連接子序列之選擇對於功能活性及分子之高效表現至關重要。DVD-Ig可由習知哺乳動物表現系統產生為製備及純化之單一物種。DVD-Ig具有親體抗體之特異性，活體內穩定，且展現IgG樣物理化學及藥物動力學特性。DVD-Ig及用於製備其之方法描述於Wu, C.,等人., Nature Biotechnology, 25:1290-1297 (2007))中。

在某些實施例中，如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段經人源化。此係指一般使用重組技術製備之嵌合分子，其具有來源於非人類物種之免疫球蛋白的抗原結合位點及基於人類免疫球蛋白之結構及/或序列的分子之剩餘免疫球蛋白結構。抗原結合位點可包含融合至恆定域上之完整可變域或僅接枝至可變域中之適當構架區上之CDR。抗原決定基結合位點可為野生型或藉由一或多個胺基酸取代來修飾。此消除作為人類個體中之免疫原的恆定區，但保留針對外來可變區之免疫反應的可能性(LoBuglio, A. F.等人., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:4220-4224；Queen等人., PNAS (1988) 86:10029-10033；Riechmann等人., Nature (1988) 332:323-327)。

另一方法不僅聚焦於提供人類來源之恆定區，且亦修飾可變區，從而將其重塑成儘可能接近人類形式。已知重鏈與輕鏈之可變區含有三個互補決定區(CDR)，該等互補決定區回應於相關抗原決定基而變化且決定結合能力，由在給定物種中相對保守且假定為CDR提供骨架之四個構架區(FR)側接。當關於特定抗原決定基製備非人類抗體時，可變區可藉由將來源於非人類抗體之CDR接枝在待修飾之人類抗體中所存在之FR上來「重塑」或「人源化」。各種抗體之此方法的應用已藉由以下報導：Sato, K.,等人., (1993) Cancer Res 53:851-856；Riechmann, L.,等人., (1988) Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.,等人., (1988) Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.,等人., (1991) Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.,等人., (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.,等人., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185；Tempest, P. R.,等人., (1991) Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.,等人., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873；Carter, P.,等人., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289；及Co, M. S.等人., (1992) J Immunol 148:1149-1154。在一些實施例中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗體含有來自小鼠抗體之所有六個CDR)。在其他實施例中，人類化抗體具有一或多個相對於原始抗體改變之CDR (一個、兩個、三個、四個、五個、六個)，亦稱為一或多個「來源於」來自原始抗體之一或多個CDR的CDR。

在某些實施例中，本發明之抗體可為嵌合抗體。就此而言，嵌合抗體由與不同抗體之異源Fc部分可操作地連接或以其他方式融合的抗體之抗原結合片段構成。在某些實施例中，異源Fc域來源於人類。在其他實施例中，異源Fc域可來自出自親本抗體之不同Ig類別，包括IgA (包括子類IgA1及IgA2)、IgD、IgE、IgG (包括子類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)及IgM。在其他實施例中，異源Fc域可包含來自不同Ig類別中之一或多者的CH2及CH3域。如上關於人類化抗體所指出，嵌合抗體之抗原結合片段可僅包含本文所描述之抗體之CDR中之一或多者(例如本文所描述之抗體之1、2、3、4、5或6個CDR)，或可包含整個可變域(VL、VH或兩者)。

免疫球蛋白CDR及可變域之結構及位置可參考Kabat, E. A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 第4版, 美國衛生與人群服務部(US Department of Health and Human Services), 1987及現可於網際網路(immuno.bme.nwu.edu)上獲得之其更新來確定。

在一些實施例中，經工程化WNT促效劑包含一或多種Fab或其抗原結合片段及一或多種VHH或sdAb或其抗原結合片段(或者，一或多種scFv或其抗原結合片段)。在某些實施例中，Fab特異性結合一或多個Fzd受體，且VHH或sdAb (或scFv)特異性結合LRP5及/或LRP6。在某些實施例中，Fab特異性結合LRP5及/或LRP6，且VHH或sdAb (或scFv)特異性結合一或多個Fzd受體。在某些實施例中，VHH或sdAb (或scFv)融合至Fab之N端，而在一些實施例中，VHH或sdAb (或scFv)融合至Fab之C端。在特定實施例中，Fab以完整IgG格式存在，且VHH或sdAb (或scFv)融合至IgG輕鏈之N端及/或C端。在特定實施例中，Fab以完整IgG格式存在，且VHH或sdAb (或scFv)融合至IgG重鏈之N端及/或C端。在特定實施例中，兩個或更多個VHH或sdAb (或scFv)在此等位置之任何組合處融合至IgG。

Fab可例如使用基因工程化轉化為包括Fab及Fc片段之完整IgG形式，以產生包含Fab融合至Fc區之融合多肽，亦即，Fab以完整IgG形式存在。完整IgG形式之Fc區可衍生自多種不同Fc中之任一者，包括(但不限於)野生型或經修飾IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他同型，例如野生型或經修飾人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4、人類IgG4Pro (包含核心鉸鏈區中之突變，從而阻止形成IgG4半分子)、人類IgA、人類IgE、人類IgM或經修飾IgG1(稱為IgG1 LALAPG)。L235A、P329G (LALA-PG)變異體已表明在鼠類IgG2a及人類IgG1中消除補體結合及固定以及Fc-γ依賴性抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。此等LALA-PG取代允許用小鼠與靈長類動物之間的「無效應(effectorless)」抗體構架產生的結果更準確地轉譯。在本文所揭示之IgG中之任一者的特定實施例中，IgG包含以下胺基酸取代中之一或多者：N297G、N297A、N297E、L234A、L235A或P236G。

提供對一或多種Fzd受體及LRP5及/或LRP6兩者呈二價之二價及雙特異性工程化WNT促效劑的非限制性實例，其包括(但不限於)表3中所提供之彼等者。VHH或sdAb (或scFv)可融合至兩個輕鏈之N端、兩個重鏈之N端、兩個輕鏈之C端或兩個重鏈之C端。進一步涵蓋例如VHH或sdAb (或scFv)可與重鏈及/或輕鏈之N端及C端兩者融合，與輕鏈及重鏈之N端融合，與重鏈及輕鏈之C端融合，與重鏈之N端及輕鏈之C端融合，或與重鏈之C端及輕鏈之N端融合。在其他相關實施例中，兩個或更多個VHH或sdAb (或scFv)可視情況經由連接部分融合在一起，且在此等位置中之一或多者處融合至Fab或IgG。在相關實施例中，工程化WNT促效劑具有雜IgG形式，而Fab作為半抗體存在，且一或多個VHH或sdAb (或scFv)融合至Fc之N端、Fab之N端、Fc之C端或Fab之C端中之一或多者。在某些實施例中，Fab或其抗原結合片段(或IgG)直接融合至VHH或sdAb (或scFv)或其抗原結合片段，而在其他實施例中，結合區經由連接部分融合。

在各種實施例中，工程化WNT促效劑包含一或多種結合一或多種FZD受體之Fab或其抗原結合片段及一或多種結合LRP5及/或LRP6之Fab或其抗原結合片段。在某些實施例中，其包含兩個結合一或多個FZD受體之Fab或其抗原結合片段及/或兩個結合LRP5及/或LRP6之Fab或其抗原結合片段。在特定實施例中，一或多個Fab以完整IgG形式存在，且在某些實施例中，兩個Fab均以完整IgG形式存在。在某些實施例中，完整IgG形式之Fab特異性結合一或多種FZD受體，且另一Fab特異性結合LRP5及/或LRP6。在某些實施例中，Fab特異性結合一或多種FZD受體，且呈完整IgG形式之Fab特異性結合LRP5及/或LRP6。在某些實施例中，Fab特異性結合LRP5及/或LRP6，且呈完整IgG形式之Fab特異性結合一或多種FZD受體。在某些實施例中，Fab視情況經由連接子融合至IgG之N端，例如融合至重鏈或輕鏈N端。在某些實施例中，Fab融合至IgG之重鏈之N端且未融合至輕鏈。在特定實施例中，兩條重鏈可直接或經由連接子融合在一起。在其他相關實施例中，兩個或更多個VHH或sdAb可視情況經由連接部分融合在一起，且在此等位置中之一或多者處融合至Fab或IgG。在相關實施例中，經工程化WNT促效劑具有異IgG形式，而Fab中之一者以半抗體形式存在，且另一Fab融合至Fc之N端、Fab之N端或Fc之C端中之一或多者。在某些實施例中，Fab或其抗原結合片段直接融合至其他Fab或IgG或其抗原結合片段，而在其他實施例中，結合區經由連接部分融合。

在某些實施例中，本發明之WNT促效劑可具有以下、包含以下或由以下組成：本文中之表中之任一者中提供的序列或其功能片段或變異體。

在某些實施例中，FZD結合域、LRP5/6結合域及/或經工程化WNT促效劑以約1 µM或更低、約100 nM或更低、約40 nM或更低、約20 nM或更低或約10 nM或更低之解離常數(KD)結合。舉例而言，在某些實施例中，結合至超過一個FZD的本文所描述之FZD結合域或抗體以約l00nM或更低、約20 nM或更低或約10 nM或更低之KD結合至彼等FZD。在某些實施例中，結合域以約1 µM或更低、約100 nM或更低、約40 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低或約1 nM 20或更低之EC50結合至一或多個其目標抗原。

可藉由此項技術中已知之任何方法分析本發明之經工程化WNT促效劑、其結合域、抗體或其他藥劑的特異性結合。可使用之免疫分析包括(但不限於)使用諸如以下之技術的競爭性及非競爭性分析系統：BIAcore分析、FACS分析、免疫螢光法、免疫細胞化學、西方墨點法、放射免疫分析、ELISA、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱反應、凝膠擴散沈澱反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射量分析、螢光免疫分析及蛋白A免疫分析。此等分析為常規的且在此項技術中已熟知(參見例如Ausubel等人編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology,第1卷, John Wiley & Sons, Inc., New York，其以全文引用的方式併入本文中)。

舉例而言，可使用ELISA確定抗體與目標抗原之特異性結合。ELISA分析包含製備抗原、用抗原塗佈96孔微量滴定盤之孔、添加與可偵測化合物(諸如酶促基質(例如，辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶))共軛之抗體或其他結合物至孔，培育一段時間且偵測抗原之存在。在一些實施例中，抗體或藥劑未與可偵測化合物共軛，而是將識別第一抗體或藥劑之第二經共軛抗體添加至孔中。在一些實施例中，代替用抗原塗佈孔，可將抗體或藥劑塗佈至孔中，且可在將抗原添加至經塗佈孔之後添加共軛至可偵測化合物之第二抗體。熟習此項技術者將瞭解經修飾以增加所偵測到之訊號的參數以及此項技術中已知之ELISA的其他變型(參見例如Ausubel等人,編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, 第1卷, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1)。

抗體或其他藥劑對目標抗原之結合親和力及抗體-抗原相互作用之解離速率可藉由競爭性結合分析確定。競爭性結合分析之一個實例為放射免疫分析，其包含將經標記抗原(例如，FZD、LRP)或其片段或變異體與所關注之抗體在增加量之未標記抗原存在下培育，接著偵測與經標記抗原結合的抗體。抗體之親和力及結合解離速率可藉由散點圖分析由資料確定。在一些實施例中，BIAcore動力學分析用於確定抗體或藥劑之結合速率及解離速率。BIAcore動力學分析包含分析抗體與在表面上具有固定抗原之晶片的結合及解離。

本發明之經工程化WNT促效劑與一或多種FZD受體及LRP5及LRP6中之一或多者之結合具有生物學活性，且對WNT傳訊之活化具有生物學活性。術語「WNT促效活性」係指促效劑模擬WNT蛋白質與捲曲蛋白及/或LRP5或LRP6結合之作用或活性的能力。本文所揭示之經工程化WNT促效劑模擬WNT活性的能力可藉由多種分析證實。WNT促效劑通常引發與由受體之天然配位體引發之反應或活性類似或相同的反應或活性。特定言之，本文所揭示之WNT促效劑活化、增強或增加典型WNT/β-連環蛋白傳訊路徑。如本文所用，術語「增強」係指與在無WNT促效劑，例如本文所揭示之經工程化WNT促效劑存在下之含量相比，WNT/β-連環蛋白傳訊量之可量測增加。在特定實施例中，與在無例如在相同細胞類型中之經工程化WNT促效劑存在下之WNT/β-連環蛋白傳訊量相比，WNT/β-連環蛋白傳訊量增加至少10%、至少20%、至少50%、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少兩倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。量測WNT/β-連環蛋白傳訊之方法為此項技術中已知且包括本文所描述之彼等方法。

在特定實施例中，本文所揭示之經工程化WNT促效劑為雙特異性的，亦即其特異性結合至兩個或更多個不同抗原決定基，例如一或多種FZD受體，及LRP5及/或LRP6。在某些實施例中，經工程化WNT促效劑結合至FZD5及/或FZD8，及LRP5及/或LRP6。

在特定實施例中，本文所揭示之經工程化WNT促效劑為多價的，例如其包含各自特異性結合至同一抗原決定基之兩個或更多個區，例如結合至一或多個FZD受體內之抗原決定基的兩個或更多個區，及/或結合至LRP5及/或LRP6內之抗原決定基的兩個或更多個區。在特定實施例中，其包含結合至一或多個FZD受體內之抗原決定基的兩個或更多個區，及結合至LRP5及/或LRP6內之抗原決定基的兩個或更多個區。在某些實施例中，經工程化WNT促效劑包含將一或多種FZD受體結合之區的數目與結合LRP5及/或LRP6之區的數目之比為或約：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、2:3、2:5、2:7、7:2、5:2、3:2、3:4、3:5、3:7、3:8、8:3、7:3、5:3、4:3、4:5、4:7、4:9、9:4、7:4、5:4、6:7、7:6、1:2、1:3、1:4、1:5或1:6。在某些實施例中，經工程化WNT促效劑為雙特異性及多價的。

在某些態樣中，本發明提供能夠以組織或細胞特異性方式增強WNT活性的新穎組織特異性WNT訊號增強分子。此等可單獨或與本文所揭示之一或多種經工程化WNT促效劑組合使用。在某些實施例中，組織特異性WNT訊號增強分子為雙功能性分子，其包含結合至一或多種ZNRF3及/或RNF43接合酶的第一域，及以組織或細胞特異性方式結合至一或多種經靶向組織或細胞類型的第二域。該第一域及該第二域中之每一者可為分別能夠結合至連接酶複合物或經靶向組織或細胞的任何部分。舉例而言，該第一域及該第二域各自可為(但不限於)選自以下之部分：多肽(例如，抗體或其抗原結合片段，或不同於抗體之肽或多肽)、小分子及天然配體或變異體、其片段或衍生物。在某些實施例中，該天然配體係多肽、小分子、離子、胺基酸、脂質或糖分子。該第一域及該第二域可為彼此相同之類型的部分，或其可為不同類型的部分。在某些實施例中，組織特異性WNT訊號增強分子結合至組織特異性或細胞特異性細胞表面受體。在特定實施例中，組織特異性WNT訊號增強分子使WNT傳訊例如與陰性對照相比增加或增強至少50%、至少兩倍、至少三倍、至少五倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍或至少五十倍。

組織特異性WNT訊號增強分子可具有不同形式。在特定實施例中，組織特異性WNT訊號增強分子為包含以組織或細胞特異性方式結合至ZNRF3/RNF43之第一多肽序列，及結合至一或多種靶向組織或細胞類型之第二多肽序列的融合蛋白質。在某些實施例中，該兩個多肽序列可直接或經由連接子融合。在某些實施例中，組織特異性WNT訊號增強分子包含兩種或更多種多肽，諸如包含兩種或更多種各自包含第一域及第二域之融合蛋白質的二聚體或多聚體，其中該兩個或更多個多肽例如經由連接部分或經由該兩個或更多個多肽中之每一者中的胺基酸殘基之間的鍵連接，例如半胱胺酸殘基之間的分子間二硫鍵。

在特定實施例中，組織特異性WNT訊號增強分子為包含構成第一域或第二域之抗體重鏈及輕鏈(或其抗原結合片段)的抗體，其中另一域(亦即，第二域或第一域)係以融合蛋白質形式或經由連接部分連接至抗體重鏈或輕鏈。在特定實施例中，另一域連接至重鏈之N端、重鏈之C端、輕鏈之N端或輕鏈之C端。此類結構在本文中可稱為附接IgG骨架或型式。舉例而言，組織特異性WNT訊號增強分子可為結合ZNRF3/RNF43之抗體，其中結合組織或細胞特異性受體之結合域融合或附接至結合ZNRF3/RNF43之抗體的重鏈或輕鏈。在另一實例中，組織特異性WNT訊號增強分子可為結合組織或細胞特異性受體之抗體，其中結合ZNRF3/RNF43之結合域融合或附接至結合組織或細胞特異性受體之抗體的重鏈或輕鏈。

在特定實施例中，腸特異性WNT訊號增強分子係結合GPA33、CDH17、MUC-13之抗體或其抗原結合片段，其中結合ZNRF3/RNF43之結合域與抗體或其抗原結合片段之重鏈或輕鏈融合或附接。在特定實施例中，結合ZNRF3/RNF43之結合域包含Fu1及Fu2域，其中Fu1及Fu2域視情況包含一或多個胺基酸修飾，包括本文所揭示之胺基酸修飾中之任一者，例如F105R及/或F109A。

在某些實施例中，組織特異性WNT訊號增強分子包含結合ZNRF3/RNF43之第一域(「作用模組」)及結合組織特異性受體或細胞特異性受體之第二域(「靶向模組」)，該等結合係例如以高親和力結合。在某些實施例中，此兩個域中之每一者在單獨增強WNT訊號方面具有實質上減小之活性或無活性。然而，當組織特異性WNT訊號增強分子與表現組織特異性受體之目標組織接合時，E3接合酶ZNRF3/RNF43與組織特異性受體募集至三元複合物，引起其隔離及/或經由受體介導之內飲作用自細胞表面中清除。淨結果係以組織特異性方式增強WNT訊號。

在某些實施例中，作用模組係與ZNRF3/RNF43 E3連接酶之結合物，且其可基於R-脊椎蛋白，例如R-脊椎蛋白-1-4，包括(但不限於)人類R-脊椎蛋白-1-4設計。在某些實施例中，作用模組係R-脊椎蛋白，例如野生型R-脊椎蛋白-1-4，視情況為人類R-脊椎蛋白-1-4，或其變異體或片段。在特定實施例中，其係與相應野生型R-脊椎蛋白-1-4序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列一致性的R-脊椎蛋白-1-4中之任一者的變異體。在某些實施例中，作用模組包含結合ZNRF3/RNF43的R-脊椎蛋白，例如R-脊椎蛋白1-4中之任一者的弗林蛋白酶域1，或由其組成。亦可使用弗林蛋白酶域1之延伸形式(包括(但不限於)具有不再結合至LGR4-6或與LGR4-6之結合減少的突變之弗林蛋白酶域2的形式)或不同於能夠特異性結合至ZNRF3/RNF43之抗體的經工程化抗體或任何其他衍生物或任何經工程化多肽。在某些實施例中，作用模組包含一或多個R-脊椎蛋白之弗林蛋白酶域1。

在某些實施例中，作用模組不包含R-脊椎蛋白弗林蛋白酶域2，或其包含經修飾或變異型R-脊椎蛋白弗林蛋白酶域2，例如相較於野生型弗林蛋白酶域2活性減小之弗林蛋白酶域2。在某些實施例中，作用模組包含R-脊椎蛋白弗林蛋白酶域1，但不包含弗林蛋白酶域2。在某些實施例中，作用模組包含兩個或更多個弗林蛋白酶域1或弗林蛋白酶域1之多聚體。作用域可包含R-脊椎蛋白之一或多個野生型弗林蛋白酶域1。在特定實施例中，作用模組包含相較於野生型弗林蛋白酶域1具有增加之活性，例如與ZNRF3/RNF43之結合增加的經修飾或變異型R-脊椎蛋白弗林蛋白酶域1。與ZNRF3/RNF43之結合增加的變異體可例如藉由篩選包含R-脊椎蛋白弗林蛋白酶域1之變異體的噬菌體或酵母展示庫來鑑別。與R-脊椎蛋白弗林蛋白酶域1不相關但與ZNRF3/RNF43之結合增加的肽或多肽亦可經由篩選鑑別。作用模組可進一步包含使作用模組或存在該作用模組之組織特異性WNT訊號增強分子之結構穩定的額外部分或多肽序列，例如額外胺基酸殘基。

在其他實施例中，作用模組包含減少或阻止ZNRF3/RNF43活性或表現之另一抑制性部分，諸如核酸分子，諸如例如反義寡核苷酸；小干擾RNA (siRNA)；短髮夾RNA (shRNA)；微小RNA (miRNA)；或核糖核酸酶。如本文中所用，「反義」係指核酸序列，無論長度如何，其與核酸序列互補。在某些實施例中，反義RNA係指可引入至個別細胞、組織或個體且經由未必依賴於內源性基因沉默路徑之機制引起目標基因之表現降低的單股RNA分子。反義核酸可含有經修飾主鏈，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或此項技術中已知之其他主鏈，或可含有非天然核苷間鍵。反義核酸可包含例如鎖定核酸(LNA)。在特定實施例中，另一抑制劑部分抑制ZNRF3/RNF43中之一者或兩者的活性，或其抑制ZNRF3/RNF43中之一者或兩者的基因、mRNA或蛋白質表現。在某些實施例中，抑制性部分為結合至 ZNRF3/ RNF43基因或mRNA或其補體之核酸分子。

在某些實施例中，靶向模組特異性結合至細胞特異性表面分子，例如細胞特異性表面受體，且可為例如天然配位體、抗體或合成化學試劑。在特定實施例中，細胞特異性表面分子較佳地表現於目標器官、組織或細胞類型(例如，希望增強WNT傳訊之器官、組織或細胞類型)上以例如治療或預防疾病或病症。在特定實施例中，例如與一或多種其他非靶向器官、組織或細胞類型相比，細胞特異性表面分子在目標器官、組織或細胞類型，例如需要增強WNT傳訊之器官、組織或細胞類型上具有增加或增強之表現，例如以治療或預防疾病或病症。在某些實施例中，相較於一或多種其他器官、組織或細胞類型，細胞特異性表面分子較佳地表現於目標器官、組織或細胞類型之表面上。舉例而言，在特定實施例中，若細胞表面受體在目標器官、組織或細胞中之表現量比其分別在一或多種、五種或更多種、所有其他器官、組織或細胞、或平均所有其他器官、組織或細胞中之表現量高至少兩倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍，至少100倍、至少500倍或至少1000倍，則認為該細胞表面受體為組織特異性或細胞特異性細胞表面分子。在某些實施例中，組織特異性或細胞特異性細胞表面分子係細胞表面受體，例如包含位於細胞表面膜內之區域及靶向模組可結合之胞外區的多肽受體。在各個實施例中，本文所描述之方法可藉由特異性靶向僅在目標組織或包括目標組織在內之一小組組織上表現的細胞表面分子，或藉由特異性靶向在目標組織上之表現量高於在所有、大部分或大量其他組織上之表現量，例如在目標組織上之表現量高於在至少兩種、至少五種、至少十種或至少二十種其他組織上之表現量的細胞表面分子來實行。

組織特異性及細胞特異性細胞表面受體為此項技術中已知的。組織及細胞特異性表面受體之實例包括(但不限於) GPA33、CDH17及MUC-13。在某些實施例中，靶向模組包含特異性結合此等腸特異性受體之抗體或其抗原結合片段。

在某些實施例中，可組合經工程化WNT促效劑及WNT訊號增強分子之組分以賦予更多組織特異性。

本發明部分地基於使用經工程化WNT促效劑來調節胃腸上皮組織增殖，尤其在發炎性腸病中。

在一個實施例中，本發明提供一種治療患有胃腸道病症之個體的方法，其包含向個體投與經工程化WNT傳訊調節劑。

在某些實施例中，經工程化WNT促效劑包含一或多個結合至一或多種FZD受體(FZD1-10)之結合域及一或多個結合至一或多種LRP (LRP5-6)受體之結合域。在又另一實施例中，經工程化WNT促效劑之結合域包含：結合至以下之一或多個結合域：FZD5、FZD8、FZD1、FZD2、FZD7、FZD5,8、FZD1,2,7或FZD1,2,7,5,8；FZD4；FZD9或FZD10；及結合至以下之一或多個結合域：LRP5、LRP6或LRP5及6。在另一實施例中，經工程化WNT促效劑包含一或多個結合至FZD5及/或FZD8之結合域；及一或多個結合至LRP5及/或LRP6之結合域。在另一實施例中，經工程化WNT促效劑包含結合至FZD5及FZD8之結合域及結合LRP6之結合域。在其他實施例中，WNT促效劑包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15或17之重鏈序列或自其衍生之可變重鏈區；及SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16或18之輕鏈序列或自其衍生之可變輕鏈區。

在一些實施例中，經工程化WNT促效劑包含靶向組織之分子。在另一實施例中，靶向組織之分子為與組織特異性細胞表面抗原結合之抗體或其片段。在一些實施例中，靶向組織之分子選自由以下組成之群：細胞表面A33抗原(GPA33；代表性序列為NCBI多肽參考序列NP_005805.1)、鈣黏素-17 (CDH17；代表性序列為NCBI多肽參考序列NP_004054.3)及黏蛋白13 (細胞表面相關性(Muc-13；代表性序列為NCBI多肽參考序列NP_149038.3)或其功能片段或變異體。在某些實施例中，WNT促效劑與特異性結合發炎性分子之結合域一起投與。在其他實施例中，特異性結合發炎性分子之結合域為發炎性分子之拮抗劑。在另一實施例中，發炎性分子之拮抗劑為TNFα、IL-12、IL-12及IL-23或IL-23之拮抗劑。

在另一相關實施例中，本發明提供一種組合分子，其包含：a)本文所揭示之經工程化WNT促效劑；及b)經工程化WNT訊號增強分子，其包含結合至一或多種E3泛蛋白接合酶之第一域；及結合至組織特異性受體之第二域。

在相關實施例中，本發明提供特異性結合捲曲蛋白5 (FZD5)及捲曲蛋白8 (FZD8)之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NOs: 1-18中之任一者中所闡述之序列具有至少80%、至少90%、至少95%或至少98%同源性的一或多個序列。在一些實施例中，多肽包含抗體或抗體結合片段，例如一或多個可變重鏈或可變輕鏈。在一些實施例中，該抗體或抗體結合片段包含存在於以下序列組合中之任一者中的至少5或所有六個CDR：SEQ ID NOs:1及2；SEQ ID NOs:3及4；SEQ ID NOs:5及6；或SEQ ID NOs:7及8、SEQ ID NOs:9及10、SEQ ID NOs: 11及12、SEQ ID NOs: 13及14、SEQ ID NOs:15及16或SEQ ID NOs:17及18。在一些實施例中，該多肽包含六個存在於序列之此等組合中之任一者中的CDR，其中CDR中之一或多者包含一個、兩個或三個胺基酸修飾，視情況包含點突變、胺基酸缺失或胺基酸插入。

本發明亦提供一種組合分子，其包含：本文所揭示之經工程化WNT促效劑；及經工程化WNT訊號增強分子，其包含結合至一或多種E3泛蛋白接合酶之第一域；及結合至組織特異性受體之第二域。

在一些實施例中，本發明之經工程化WNT促效劑促進細胞分化(例如，胃腸細胞、幹細胞及/或上皮細胞)成腸上皮細胞。在一些實施例中，細胞分化係基於腸上皮細胞前驅體之百分比確定。在一些實施例中，基於時間戳記之方法用於確定細胞分化成腸上皮細胞。在一些實施例中，為了彌補細胞分化之基於時間戳記的觀測結果，採用譜系軌跡推斷工具， slingshot。在一些實施例中， slingshot預測細胞自起步基團分化之方向。在示意性實例中， slingshot預測細胞將在一個方向上朝向TA1、杯狀、簇狀及腸道內分泌細胞發展，且在另一方向上朝向腸上皮細胞發展。在一些實施例中，預測之譜系軌跡偽時間展示較高百分比之經工程化WNT促效劑處理之樣品，其在腸上皮細胞譜系軌跡中相對於經對照處理之細胞進一步沿著；圖 28E提供經預測偽時間值之示意性實例。在一些實施例中，對腸上皮細胞譜系之此預測與實際時間戳記資料一致。

在一些實施例中，驗證改善之分化的可靠標準物為成熟、分化細胞類型標記物之表現看起來更像在誘導損傷後之給定日時相對於對照組經工程化WNT促效劑處理組中之未處理、未受損的結腸。在一些實施例中，經工程化WNT促效劑處理後6天觀測到改善之分化。在一些實施例中，經工程化WNT促效劑處理之樣品包括腸上皮細胞、杯狀細胞、腸道內分泌細胞、簇細胞或其組合。

本文所揭示之證據指示本發明之Wnt模擬物分子具有所需特性，包括使患病腸組織恢復回正常生理學之能力。在一些實施例中，使用本發明之Wnt模擬物(例如，R2M13-26或R2M13-h26)之短處理誘發上皮組織之快速復原。在說明性實例中，在重度DSS模型中，單次注射R2M13-26以各種劑量恢復受損結腸組織之正常組織學。在處理6天內，R2M13-h26完全恢復上皮屏障，其在急性DSS模型中嚴重受損。

在一些實施例中，除障壁及結腸組織恢復以外，用本發明之Wnt模擬物處理減少發炎性細胞介素及疾病活動性指數，表明屏障破壞、微生物病原體侵襲、組織發炎及破壞之惡意週期的消除。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物直接影響上皮細胞、擴增前驅細胞池且加速分化成所有成熟分化細胞類型。在一些實施例中，本發明之Wnt模擬物恢復受損結腸組織中之Wnt訊號及幹細胞生態棲位，而在修復之後對隱窩無額外影響。

在一些實施例中，用單獨的本發明之Wnt模擬物處理對正常腸上皮細胞不具有影響。在此等實施例中，RSPO可誘導增生。綜合而言，本發明提供具有最佳組織修復及生理活性之Wnt活化劑。

在示意性實例中，用Fzd5,8特異性Wnt模擬物R2M13-26處理在幾天內引起黏膜之快速癒合、改善組織組織學及疾病活性，同時降低發炎及結腸炎症狀。在此損傷模型中，R2M13-26在給藥後不久主要影響上皮組織。在處理後24小時，上皮組織中諸如 Axin2之Wnt目標基因增加，表明利用FZD受體特異性為引導組織-層特異性路徑活化之可行選項。與Wnt目標基因之誘導一致，R2M13-26引起廣譜前驅細胞中細胞週期基因表現之穩固增加，不論正常幹細胞/前驅細胞對損傷作出反應或在與去分化一致之改變的細胞狀態中。此等轉錄組變化表現於前驅細胞池之短暫擴增中且加速分化成結腸上皮組織之適當分泌及吸收性譜系且重建形成上皮屏障。此對上皮再生及障壁恢復之直接影響二次引起發炎性訊號及浸潤性免疫細胞減少。

損傷/破壞情境可設定上皮前驅細胞擴增之階段。如隨附實例中所揭示，除影響諸如EGF及Notch之發育傳訊以外，損傷在所有組織層中引起發炎反應。在上皮細胞中，干擾素γ及NF-κB路徑在損傷之後為活性的，且其他幹細胞生態棲位之最近工作已表明，發炎性傳訊可促進對損傷之初始增生性反應(M. Chen, Reed, & Lane, 2017；Kyritsis等人., 2012)。NF-kB及Wnt路徑一起之活化甚至可促進朝向腸中之前驅細胞的去分化過程(Schwitalla等人., 2013)。在一說明性實例中，在本發明之DSS模型中，Wnt傳訊在結腸上皮組織中大幅度減少，可能由特異性Wnt之表現減少及若干Wnt拮抗劑增加引起。在此說明性實例中，R2M13-h26能夠克服此Wnt傳訊不足。因此，R2M13-h26誘導之Wnt路徑活化可與此等發炎性訊號協同以增強前驅細胞增殖，即使短暫。

與影響未受損傷及受損上皮兩者的RSPO之作用不同(Kim等人., 2005; Yan Kelley S.等人., 2017; Zhao等人., 2007)，藉由本發明之Wnt模擬物靶向之受體-水準Wnt傳訊促效作用可促進受損組織環境中之特定腺管增殖。在一說明性實例中，當Wnt模擬物R2M13-26連同RSPO2引入DSS模型中時，在小腸及結腸中觀測到廣泛增殖。儘管觀測到RSPO改善小鼠之DSS誘導的結腸炎，但亦發生用RSPO處理之過度增殖。本發明人出人意料地發現，Wnt模擬物本身能夠誘導β-連環蛋白目標基因之表現及尤其在受損結腸中之上皮細胞之增殖。

在示意性實例中，R2M13-26之Wnt路徑活化未引起腺管過度增殖或擴增。此不僅與RSPO處理形成鮮明對比，且亦與可遺傳突變體、基因突變體之效應形成鮮明對比。如先前所報導，當遺傳消除負調控劑 Apc或表現β-連環蛋白之組成型活性突變體時，無法區分以不可控方式增殖之隱窩(Barker Nick等人., 2009; Krausova & Korinek, 2014; Mah, Yan, & Kuo, 2016)。然而，相比於避開負反饋之永久性遺傳改變，本發明之Wnt模擬物藉由在受體水準下模擬內源性Wnt傳訊及起始路徑活化來避免此等結果。藉由影響受體水準下之路徑，R2M13-26允許負回饋機制起作用。在此說明性實例中， Axin2經誘導，促成毀壞複合物；E3泛蛋白連接酶 Rnf43(亦為Wnt目標基因)之表現增加，其促進FZD受體自細胞表面移除。此外，在此說明性實例中，R2M13-26增加週期素依賴性激酶之一些抑制劑的表現，潛在地限制增殖。 IV.醫藥組合物

亦揭示包含本文所描述之經工程化WNT促效劑分子及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的醫藥組合物。在另一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所揭示之多肽、工程化WNT促效劑或組合分子及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。

在其他實施例中，亦揭示包含聚核苷酸及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的醫藥組合物，該聚核苷酸包含編碼本文所描述之WNT促效劑分子(或其多肽鏈)的核酸序列。在某些實施例中，聚核苷酸係DNA或mRNA，例如經修飾mRNA。在特定實施例中，聚核苷酸係經修飾mRNA，其進一步包含5'帽序列及/或3'加尾序列，例如聚A尾。在其他實施例中，聚核苷酸係包含可操作地連接至編碼序列之啟動子的表現卡匣。

在一些實施例中，WNT促效劑為併入各種抗原決定基結合片段的經工程化重組多肽，該等抗原決定基結合片段在WNT傳訊路徑中結合至各種分子。舉例而言，FZD及LRP抗體片段(例如Fab、scFv、sdAb、VHH等)可在一個分子上直接或與各種大小連接子連接在一起。

類似地，諸如RSPO之多肽可經工程化以含有針對組織特異性細胞表面抗原，例如MUC-13之抗體或其片段。RSPO亦可與E3接合酶之強化子ZNRF3/RNF43同時或依序投與。E3接合酶增強劑可為結合ZNRF3/RNF43且增強E3連接酶活性之促效劑抗體或片段。

反之，WNT促效劑亦可為併入抗原決定基結合片段的重組多肽，該等抗原決定基結合片段與WNT傳訊路徑中之各種分子結合且增強WNT傳訊。舉例而言，WNT促效劑可為結合至FZD受體及/或LRP受體且增強WNT傳訊之抗體或其片段。FZD及LRP抗體片段(例如Fab、scFv、sdAb或VHH等)可在一個分子上直接或與各種尺寸連接子連接在一起。

在其他實施例中，亦揭示包含表現載體(例如，病毒載體)及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的醫藥組合物，該表現載體包含具有編碼本文所描述之WNT促效劑分子之核酸序列的聚核苷酸。

本發明進一步涵蓋包含細胞之醫藥組合物，該細胞包含含有聚核苷酸之表現載體，該聚核苷酸包含可操作地連接至編碼WNT促效劑分子之核酸的啟動子，及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。在特定實施例中，醫藥組合物進一步包含含有聚核苷酸之表現載體的細胞，該聚核苷酸包含可操作地連接至編碼WNT促效劑之核酸序列的啟動子。在特定實施例中，細胞係自待處理之個體中獲得的異源細胞或自體細胞。

單獨或呈組合形式之主題分子可與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及適用於製備調配物之試劑組合，該調配物一般安全、無毒且合乎需要，且包括哺乳動物，例如人類或靈長類動物使用可接受的賦形劑。該等賦形劑可為固體、液體、半固體，或在氣溶膠組合物之情況下為氣態。此類載體、稀釋劑及賦形劑之實例包括(但不限於)水、鹽水、林格氏(Ringer's)溶液、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。補充活性化合物亦可併入至調配物中。用於調配物之溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、生理鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌化合物，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑化合物，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；清潔劑，諸如用於預防聚集之Tween 20；及用於調節滲性之化合物，諸如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或鹼，諸如鹽酸或氫氧化鈉加以調節。在特定實施例中，醫藥組合物為無菌的。

醫藥組合物可進一步包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。對於靜脈內投與，適合之載劑包括生理鹽水、抑菌水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在一些情況下，組合物為無菌的且可為液體，使得其可吸入注射器中或自注射器遞送至個體中。在某些實施例中，其在製造及儲存條件下穩定，且防止諸如細菌及真菌之類微生物的污染作用。載劑可為例如含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇，及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。舉例而言，可藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、藉由維持就分散液而言所需粒徑及藉由使用界面活性劑來維持適當之流動性。微生物作用之預防可藉由各種抗菌劑及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張滲藥劑，例如，糖、多元醇(諸如，甘露醇、山梨糖醇)、氯化鈉。可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鋁及明膠，來實現內部組合物之延長吸收。

無菌溶液可如下製備：將所需量之經工程化WNT促效劑(例如，抗體或其抗原結合片段(或編碼聚核苷酸或包含其之細胞))視需要與上文所列舉之一種成分或成分組合一起併入適當溶劑中，接著過濾滅菌。通常，藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基礎分散介質及來自上文所列舉之成分之其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥，其自其先前此前經無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何其他所需成分之散劑。

在一個實施例中，用將保護抗體或其抗原結合片段以免自身體快速消除的載劑製備醫藥組合物，諸如控制釋放調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法為熟習此項技術者顯而易見的。物質亦可在商業上獲得。脂質體懸浮液亦可用作醫藥學上可接受之載劑。此等載劑可根據熟習此項技術者已知之方法來製備。

為便於投與及劑量之均一性，宜將醫藥組合物調配成單位劑型。如本文所用，單位劑型係指作為單位劑量適用於待治療個體的實體不連續單元；各單元均含有經計算可產生所需治療效果的預定量之活性抗體或其抗原結合片段與所需醫藥載劑。單位劑型之規格由以下因素規定且直接視以下因素而定：抗體或其抗原結合片段之獨特特徵及欲達成之特定治療作用，及混配此類用於治療個體之活性抗體或其抗原結合片段之技術中的固有限制。

醫藥組合物可與投與說明書一起包括在容器、包裝或施配器，例如注射器，例如預填充注射器中。

本發明之醫藥組合物涵蓋此類酯之任何醫藥學上可接受之鹽、酯或鹽，或在投與包含人類之動物後能夠提供(直接或間接)生物活性抗體或其抗原結合片段的任何其他化合物。

本發明包括本文所描述之WNT促效劑分子的醫藥學上可接受之鹽。術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明之化合物的生理上且醫藥學上可接受之鹽：亦即，保持親本化合物之所需生物活性且不會賦予其不合需要之毒理作用的鹽。多種醫藥學上可接受之鹽為此項技術中已知的且描述於例如以下中：「Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology」, 第3版, James Swarbrick (編), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007中的「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 第17版, Alfonso R.Gennaro(編), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985(及其較新的版本)中，及J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977)中。此外，關於適合之鹽的綜述參見Stahl及Wermuth之「Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use」(Wiley-VCH, 2002)。醫藥學上可接受之鹼加成鹽由金屬或胺形成，諸如鹼金屬及鹼土金屬或有機胺。

用作陽離子之金屬包含鈉、鉀、鎂、鈣及類似金屬。胺包含N-N'-二苄基乙二胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、二環己胺、乙二胺、N-甲基還原葡糖胺及普魯卡因(參見例如Berge等人, 「Pharmaceutical Salts」, J. Pharma Sci., 1977, 66, 119)。該等酸性化合物之鹼加成鹽係藉由使游離酸形式與足夠量之所需鹼接觸以按習知方式產生鹽來製備。游離酸形式可藉由使鹽形式與酸接觸且以習知方式分離游離酸來再生。游離酸形式在某些物理特性(諸如在極性溶劑中之溶解度)方面在某種程度上不同於其各別鹽形式，但出於本發明之目的，在其他情況下，鹽等效於其各別游離酸。

在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含治療有效量之WNT促效劑分子或其醫藥學上可接受之鹽與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑，例如鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、磷酸鹽及胺基酸、聚合物、多元醇、糖、緩衝劑、防腐劑及其他蛋白質的混合物。例示性胺基酸、聚合物及糖及其類似物係辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇單硬脂酸酯化合物、聚氧化乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露糖醇、聚葡萄糖、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人類血清白蛋白、檸檬酸鹽、乙酸鹽、林格氏溶液及漢克氏溶液、半胱胺酸、精胺酸、肉鹼、丙胺酸、甘胺酸、離胺酸、纈胺酸、白胺酸、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯及乙二醇。較佳地，此調配物在4℃下穩定保持至少六個月。

在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或磷酸鈉/硫酸鈉、tris緩衝液、甘胺酸緩衝液、無菌水，及一般熟習此項技術者已知之其他緩衝液，諸如Good等人(1966) Biochemistry 5:467所描述之彼等緩衝液。緩衝液之pH值可在6.5至7.75範圍內，較佳地在7至7.5範圍內且最佳在7.2至7.4範圍內。 V. 使用方法

本發明亦提供使用經工程化WNT促效劑及/或組織特異性WNT訊號增強分子，例如調節WNT傳訊路徑，例如增加WNT傳訊且在多種治療性設定中投與經工程化WNT促效劑及/或組織特異性WNT訊號增強分子的方法。

本文亦提供使用工程化WNT促效劑分子及/或組織特異性WNT訊號增強分子處理方法。

在某些實施例中，經工程化WNT促效劑可用於增加組織或細胞中之Wnt傳訊。因此，在一些態樣中，本發明提供一種用於增加組織或細胞中之Wnt傳訊或增強Wnt傳訊之方法，其包含使組織或細胞與有效量之本文所揭示之經工程化WNT促效劑或其醫藥學上可接受之鹽接觸，其中經工程化WNT促效劑為Wnt傳訊路徑促效劑。在一些實施例中，接觸活體外、離體或活體內發生。在特定實施例中，細胞係經培養細胞，且該接觸係在活體外發生。在某些實施例中，該方法包含使組織或細胞與一或多種Wnt多肽或Norrin多肽進一步接觸。

本文所揭示之工程化WNT促效劑可用於例如藉由增加靶向細胞、組織或器官中之Wnt傳訊來治療疾病、病症或病狀。因此，在一些態樣中，本發明提供一種用於治療有需要之個體之疾病或病狀，例如與Wnt傳訊減少相關或增加Wnt傳訊將提供治療益處之疾病或病症的方法，其包含使該個體與有效量之本發明之組合物接觸。在特定實施例中，組合物為醫藥組合物，其包含以下中之任一者：經工程化WNT促效劑；包含編碼經工程化WNT促效劑(例如，DNA或mRNA) (視情況經修飾mRNA)之核酸序列的聚核苷酸；包含編碼經工程化WNT促效劑(例如，表現載體或病毒載體)之核酸序列的載體；或包含編碼經工程化WNT促效劑之核酸序列的細胞。在特定實施例中，該疾病或病況係病理性疾病或病症，或損傷，例如由傷口引起之損傷。在某些實施例中，傷口可為另一種治療性處理之結果。在某些實施例中，該疾病或病況包含組織修復、癒合或再生受損，或將得益於組織修復、癒合或再生增加。在一些實施例中，接觸發生於活體內，亦即將向組合物投與至個體。

Wnt傳訊在幹細胞發育過程及維持中起到關鍵作用。Wnt訊號之再活化與損傷及疾病之後大部分組織之再生及修復相關。預期經工程化WNT促效劑分子可提供響應於損傷及疾病之癒合及組織修復的益處。組織損傷及損失之原因包括(但不限於)衰老、退化、遺傳狀況、感染及發炎、創傷性損傷、毒素/代謝誘導之毒性或其他病理狀況。經顯示，Wnt訊號及Wnt訊號之增強劑可活化成體、組織駐留幹細胞。在一些實施例中，本發明化合物係投與用於治療患病或受損組織，用於組織再生及用於細胞生長及增殖及/或用於組織工程化。

與Wnt路徑突變相關之人類疾病提供增強Wnt訊號以治療及預防疾病之有力證據。臨床前活體內及活體外研究提供Wnt訊號參與許多疾病狀況之額外證據且進一步支持工程化WNT促效劑在各種人類疾病中之效用。舉例而言，本發明之組合物可用於促進或增加骨生長或再生、骨移植、骨折癒合、骨質疏鬆治療及骨質疏鬆性骨折、脊柱融合術、脊髓損傷(包括椎骨壓縮骨折)、手術前脊柱手術優化、矯形外科裝置之骨整合、肌腱-骨骼整合、牙齒生長及再生、牙齒植入、牙周病、頜面重建及顎骨壞死。其亦可用於治療禿髮；增強感覺器官再生，例如治療聽覺喪失，包括內及外聽覺毛髮細胞再生；治療前庭功能低下；治療黃斑變性；治療視網膜病，包括玻璃體視網膜病變；糖尿病性視網膜病變；視網膜變性之其他疾病；福奇氏病變；其他角膜疾病等；治療中風、創傷性腦損傷、阿耳滋海默症、多發性硬化症、多發性營養不良、由於肌肉減少症或惡病體質所致之肌肉萎縮及其他影響血腦障壁之退化或完整性的病況。

在某些實施例中，本發明提供一種用於治療患有與WNT傳訊降低相關或Wnt傳訊增加可為有益的疾病或病症之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之經工程化WNT促效劑，或包含經工程化WNT促效劑之醫藥組合物。在某些實施例中，疾病或病症選自由以下組成之群：口腔黏膜炎、短腸侯症群、發炎性腸病(IBD)、其他胃腸道病症包括(但不限於)：移植體對抗宿主疾病(GVHD)、酒精性肝炎、短腸侯症群、乳糜瀉、放射線誘發之胃腸黏膜炎及化學療法誘發之胃腸黏膜炎；代謝症候群、血脂異常之治療、糖尿病之治療、胰腺炎之治療、外分泌或內分泌胰臟組織受損之病狀；代謝症候群、血脂異常之治療、糖尿病之治療、胰腺炎之治療、外分泌或內分泌胰臟組織受損之病狀；需要增強之表皮再生的病狀，例如表皮傷口癒合、糖尿病性足潰瘍之治療、涉及牙齒、指甲或真皮發育不全之症候群等，其中血管生成為有益的；心肌梗塞、冠狀動脈疾病、心臟衰竭；免疫缺乏症、移植物抗宿主疾病、急性腎臟損傷、慢性腎病、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺纖維化(IPF)、肝硬化、急性肝臟衰竭、肝炎(C型或B型)病毒感染或抗病毒藥療法後引起之慢性肝病、酒精性肝病、酒精性肝炎、具有脂肪變性或脂肝炎之非酒精性肝病、聽覺喪失治療，包括聽覺毛髮細胞內部及外部喪失、前庭功能障礙、黃斑變性之聽覺喪失、治療玻璃體視網膜病變、糖尿病性視網膜病變、視網膜變性之其他疾病、福奇氏變性、其他角膜疾病、中風、創傷性腦損傷、阿耳滋海默症、多發性硬化症及影響血腦屏障之其他病況；脊髓損傷、骨骼相關疾病、其他脊髓疾病及禿髮。

本發明之經工程化WNT促效劑及組合物亦可用於治療口腔黏膜炎、治療短腸侯症群、發炎性腸病(IBD)，包括克隆氏病(CD)及潰瘍性結腸炎(UC)，特定言之伴有瘺形成之CD、其他胃腸道病症；代謝症候群之治療、血脂異常、糖尿病之治療、治療胰臟炎、外分泌或內分泌胰臟組織受損之病狀；需要增強之表皮再生的病狀，例如表皮傷口癒合、糖尿病性足潰瘍之治療、涉及牙齒、指甲或真皮發育不全等之症候群，其中血管生成為有益的；治療心肌梗塞、冠狀動脈疾病、心臟衰竭；造血細胞之生長增強，例如造血幹細胞骨髓移植、自體外周血增強、治療免疫缺乏症、移植物抗宿主疾病等；治療急性腎臟損傷、慢性腎病；治療肺病、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纖維化，包括特發性肺部纖維化、肺組織再生增加。本發明之組合物亦可用於增強肝臟細胞之再生，例如肝再生；治療肝硬化；增強肝移植；治療急性肝衰竭；治療肝炎(C型或B型)病毒感染或抗病毒藥療法後引起之慢性肝病、酒精性肝病(包括酒精性肝炎)、伴隨脂肪變性或脂肪變性肝炎之非酒精性肝病，及其類似疾病。本發明之組合物可治療疾病及病症，包括但不限於希望再生性細胞生長的病況。

涉及Wnt傳訊組分中之功能損失型或功能獲得型突變之人類遺傳學展示支持增強骨骼生長之Wnt訊號的強力證據。需要增強骨骼生長之病況可包括(但不限於)骨折、移植術、圍繞輔助裝置向內生長、骨質疏鬆症、骨質疏鬆性骨折、脊柱融合、椎骨壓縮骨折、脊椎手術之手術前優化、顎骨壞死、牙齒植入、牙周疾病、頜面重建及其類似疾病。工程化WNT促效劑增強且促進在促進骨骼再生中關鍵的Wnt訊號。用於使骨骼組織再生之方法得益於本發明化合物之投與，該投與可為全身性或局部的。在一些實施例中，骨髓細胞暴露於本發明之分子，使得該骨髓細胞內之幹細胞變得活化。

在一些實施例中，藉由使反應性細胞群體，例如骨髓、骨髓前驅細胞、骨髓幹細胞等與有效劑量之本文所揭示之經工程化WNT促效劑接觸來增強骨骼再生。用於使骨骼組織再生之方法得益於經工程化WNT促效劑之投與，該投與可為全身性或局部的。在一些實施例中，接觸係在活體內進行。在其他此類實施例中，離體進行接觸。分子可位於作用部位，例如藉由負載至視情況可生物降解之基質上，且視情況提供活性劑之持續釋放。基質載劑包括(但不限於)可吸收膠原蛋白海綿、陶瓷、水凝膠、聚合微球體、奈米粒子、骨黏合劑及其類似物。

在特定實施例中，包含一或多種本文所揭示之經工程化WNT促效劑(或編碼經工程化WNT促效劑之聚核苷酸，或包含編碼經工程化WNT促效劑之聚核苷酸的載體或細胞)的組合物用於治療或預防骨骼疾病或病症，包括(但不限於)以下中之任一者，或治療或預防與(但不限於)以下中之任一者相關之損傷：骨質疏鬆、骨質疏鬆性骨折、包括以下之骨折：椎體壓縮性骨折、不癒合骨折、延遲癒合骨折、脊柱融合術、骨壞死、顎骨壞死、股骨壞死、股骨頭壞死等、植入物骨整合(例如，以在部分或全膝或髖置換之後加速恢復)、成骨不全、骨骼移植、肌腱修復、顎面手術、牙齒植入、由遺傳病、退化症、衰老、藥物或損傷引起之所有其他骨骼病症或缺陷。在一個實施例中，結合Fzd1、Fzd 2及Fzd 7以及LRP5及/或LRP6之經工程化WNT促效劑用於治療或預防任何骨骼疾病或病症。在一個實施例中，結合Fzd1、Fzd 2、Fzd 5、Fzd 7及Fzd 8以及LRP5及/或LRP6之經工程化WNT促效劑用於治療或預防任何骨骼疾病或病症。結合至額外Fzd受體之其他Fzd分子亦可與LRP5及/或LRP6結合物一起使用。

在特定實施例中，本文所揭示之組合物及方法可用於在個體中增加骨礦物質密度、增加骨骼體積(例如，脛骨及/或股骨骨骼體積)、增加皮層厚度(例如，在小樑區域中或在股骨中段骨幹中)、增加骨礦質接合速率、增加成骨細胞之數目及/或降低破骨細胞之數目(例如，在骨骼中)、增加骨骼硬度、增加極限負載至斷裂點、改善斷裂性、減少骨骼對骨折之抗性、減少骨骼再吸收、降低與骨質疏鬆相關之骨質流失或增加骨骼之生物化學強度。在一個實施例中，結合Fzd1、Fzd 2及Fzd 7之工程化WNT促效劑用於此等所指示用途中之任一者。在一個實施例中，結合Fzd1、Fzd 2、Fzd 5、Fzd 7及Fzd 8之工程化WNT促效劑用於此等所指示用途中之任一者。

本文所揭示之方法，包括用於治療或預防骨骼疾病或病症之方法包括包含向有需要之個體提供經工程化WNT促效劑及抗吸收劑兩者的方法。在某些實施例中，該等方法用於治療骨質疏鬆，視情況停經後骨質疏鬆。

本發明亦提供一種抑制或降低有需要之個體之骨骼再吸收的方法，其包含向個體提供有效量之經工程化WNT促效劑，其中該經工程化WNT促效劑為Wnt傳訊路徑之促效劑。在某些實施例中，該方法進一步包含向個體提供抗吸收劑。在某些實施例中，個體已經診斷患有或處於骨質疏鬆症、視情況停經後骨質疏鬆症風險中。多種抗再吸收劑為此項技術中已知的且包括(但不限於)本文所揭示之彼等。

當向個體提供經工程化WNT促效劑以及另一治療劑(諸如抗再吸收劑)時，兩種試劑可提供於相同或不同醫藥組合物中。其可同時、在不同時間，例如同時、連續或在重疊或非重疊時間段期間向個體提供。在某些實施例中，兩種藥劑在重疊時間段期間在個體中具有治療活性。

包含一或多種本文所揭示之工程化WNT促效劑的組合物(或編碼工程化WNT促效劑之聚核苷酸或包含編碼工程化WNT促效劑之聚核苷酸的載體或細胞)可用於骨骼組織不足之活體內處理。「骨骼組織缺乏」意指骨骼或其他骨骼結締組織在希望恢復骨骼或結締組織之任何部位處之缺乏，無論該缺乏如何產生，例如手術介入、腫瘤移除、潰瘍、植入物、骨折或其他創傷性或退化性病症之結果。本發明之組合物可用作將軟骨功能恢復至結締組織之方案的一部分，用於修復軟骨組織中之缺陷或病變，諸如變性性磨損及關節炎、對組織之創傷、半月板撕裂之位移、半月板切除術、撕裂韌帶引起之關節脫位、關節錯位、骨折或遺傳性疾病。

經工程化WNT促效劑亦可用於治療牙周疾病。牙周疾病為牙齒損傷之主要原因且與多種全身性病況有關。在一些實施例中，牙齒或潛在骨骼再生藉由接觸反應性細胞群體增強。在一些實施例中，接觸係在活體內進行。在其他此類實施例中，接觸係活體外進行，隨後植入活化的幹細胞或前驅細胞。分子可位於作用部位，例如藉由負載至視情況可生物降解之基質上，且視情況提供活性劑之持續釋放。基質載劑包括(但不限於)可吸收膠原蛋白海綿、陶瓷、水凝膠、骨黏合劑、聚合微球體、奈米粒子及其類似物。

研究已顯示，Wnt傳訊及R-脊椎蛋白之生物學能夠促進損傷、衰老或退化之後內耳中之感覺毛髮細胞再生。涉及聽覺損失或前庭功能障礙之內耳中之感覺毛髮細胞損失亦可受益於本發明之組合物。在內耳中，聽覺器官容納將聲振動轉變為電脈衝所需的機械敏感性毛髮細胞。由半圓形道(SSC)、小囊及球囊構成之前庭器官亦含有感覺毛髮細胞，以便偵測頭部位置及運動。本發明之組合物可例如以輸注形式；以基質或其他儲存系統形式；或以其他局部施用至耳部以便增強聽覺再生。

經工程化WNT促效劑亦可用於再生視網膜組織。在成年哺乳動物視網膜中，米勒膠質細胞能夠例如在活體內神經毒性損傷之後再生視網膜細胞，包括感光體。Wnt傳訊及Wnt訊號之強化子可在破壞之後或在變性期間促進米勒膠質衍生之視網膜前驅細胞的增殖。本發明之組合物亦可用於眼睛中之組織及其他細胞類型的再生中。舉例而言，老年性黃斑變性(AMD)、其他視網膜退化性疾病、角膜疾病、福奇氏病變、玻璃體視網膜病變、遺傳性疾病等可受益於本發明之組合物。AMD之特徵在於中心視覺及視覺銳度逐漸降低。福奇氏病變之特徵在於角膜內皮細胞之進行性損失。Wnt訊號及Wnt訊號之增強可促進眼組織中角膜內皮、視網膜上皮組織等之再生。在其他實施例中，本發明之組合物可例如以輸注形式；以基質或其他儲存系統形式；或其他局部施用至眼睛以用於視網膜再生及治療黃斑變性。

已經由譜系追蹤研究，例如中心周圍區域中之Axin2陽性細胞鑑別出用於肝細胞之恆定更新的特定增殖性細胞群。譜系追蹤研究亦鑑別出額外的潛在肝前驅細胞，包括但不限於Lgr陽性細胞。鑑別出自更新肝細胞及包括Lgr5陽性及Axin2陽性細胞在內的其他潛在前驅細胞群在損傷後能夠對Wnt訊號及/或R-脊椎蛋白起反應而再生。急性肝損傷及衰竭以及慢性肝病的多個臨床前模型顯示肝細胞得益於增強Wnt訊號而恢復及再生。

在某些實施例中，包含本文所揭示之工程化WNT促效劑(或編碼工程化WNT促效劑之聚核苷酸或包含編碼工程化WNT促效劑之聚核苷酸的載體或細胞)的組合物用於促進肝臟再生、降低纖維化及/或改善肝功能。在某些實施例中，本文所揭示之組合物及方法用於：增加肝臟體重、增加肝臟與體重比率、增加肝臟中PCNA及pH3陽性細胞核之數目、增加肝臟中Ki67及/或Cyclin D1之表現、增加肝臟細胞增殖及/或有絲分裂、降低慢性肝損傷後之纖維化或增加肝細胞功能。

在特定實施例中，本發明之組合物可用於治療急性肝衰竭、急性酒精性肝臟損傷、治療(C型或B型)病毒感染或抗病毒藥療法後引起之慢性肝病、慢性酒精性肝病、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝臟疾病及非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、治療肝硬化及所有原因之重度慢性肝病及肝臟細胞再生增加。用於肝臟組織再生之方法受益於可為全身性或局部的本發明化合物之投與。此等方法包括(但不限於)全身投與方法及局部投與方法，例如藉由注射至肝臟組織中、藉由注射至通向肝臟中之靜脈或血管中、藉由植入持續釋放調配物及其類似方法。

在特定實施例中，包含本文所揭示之工程化WNT促效劑(或編碼工程化WNT促效劑之聚核苷酸，或包含編碼工程化WNT促效劑之聚核苷酸的載體或細胞)的組合物用於治療或預防肝病或病症，包括(但不限於)以下，或治療或預防由以下中之任一者產生之肝損傷或病症：急性肝衰竭(所有原因)、慢性肝功能衰竭(所有原因)、肝硬化、肝纖維化(所有原因)、門靜脈高血壓、酒精性肝病，包括酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD) (脂肪肝)、酒精性肝炎、C型肝炎病毒誘發之肝病(HCV)、B型肝炎病毒誘發之肝病(HBV)、其他病毒性肝炎(例如，A型肝炎病毒誘發之肝病(HAV)及D型肝炎病毒誘發之肝病(HDV))、原發性膽汁性肝硬化、自體免疫性肝炎、肝臟手術、肝臟損傷、肝臟移植、肝臟手術及移植中之「小肝」綜合症、先天性肝病及病症、由遺傳病、退化症、衰老、藥物或損傷引起之任何其他肝臟病症或缺陷。

Wnt訊號在各種上皮組織之再生中起重要作用。各種表皮病況受益於用本發明化合物處理。黏膜炎發生在胃腸道內壁之快速分裂的上皮細胞破裂時，使黏膜組織易於發生潰瘍及感染。覆蓋口腔之上皮內層的一部分(口腔黏膜)為身體最敏感部分中之一者且尤其易受化學療法及輻射影響。口腔黏膜炎可能為癌症治療(尤其化學療法及放射線)之最常見、致衰弱的併發症。另外，本發明之組合物亦可有益於治療短腸侯症群、發炎性腸病(IBD)或其他胃腸道病症。其他表皮病況包括表皮傷口癒合、糖尿病足潰瘍、涉及牙齒、指甲或真皮發育不全等之症候群及其類似者。本發明之分子可用於所有此等病況，其中再生細胞與本發明化合物接觸。用於使上皮組織再生之方法得益於本發明化合物之投與，該投與可為全身性或局部的。接觸可為例如局部，包括皮內、皮下以凝膠、洗劑、乳膏等形式施用於靶向位點處。

除皮膚及胃腸道以外，Wnt訊號及Wnt訊號之增強及促進亦在臨床前模型中在包括胰臟、腎臟及肺之組織的修復及再生中起重要作用。經工程化WNT促效劑可有益於涉及外分泌及內分泌胰臟、腎臟或肺之各種疾病病況。經工程化WNT促效劑可用於治療代謝症候群；治療糖尿病、治療急性或慢性胰臟炎、外分泌胰臟功能不全、治療急性腎臟損傷、慢性腎病、治療肺病，包括(但不限於)慢性阻礙性肺病(COPD)、肺纖維化，特定言之特發性肺部纖維化(IPF)及引起肺上皮組織損失之其他病況。用於使此等組織再生之方法得益於本發明化合物之投與，該投與可為全身性或局部的。

表皮Wnt傳訊，與經由其他生長因子之傳訊配合對於成年毛囊再生至關重要。脫髮為常見問題，且雄激素性脫髮(通常稱為男性型脫髮)為男性中最常見形式之脫髮。在一些實施例中，毛囊再生藉由使反應性細胞群體與本發明之分子接觸而增強。在一些實施例中，接觸係在活體內進行。在其他此類實施例中，離體進行接觸。分子可位於作用部位，例如局部洗劑、凝膠、乳膏及其類似物。

中風、創傷性腦損傷、阿耳滋海默症、多發性硬化症及影響血腦障壁(BBB)之其他病況可經工程化WNT促效劑治療。血管生成對於確保氧及養分供應至全身許多組織至關重要，且對於CNS而言尤其重要，因為神經組織對低氧及缺血極其敏感。形成BBB之CNS內皮細胞在非神經組織中不同於內皮細胞，因為其為藉由緊密連接而固持在一起且表現特異性轉運子之高度極化細胞。Wnt傳訊調節CNS血管形成及/或功能。BBB受損之條件可受益於投與本發明化合物，其可為全身性或局部的，例如藉由直接注射、鞘內投與、持續釋放調配物植入及其類似方式。另外，Wnt訊號主動參與神經生成且在損傷之後起神經保護作用。本發明之組合物亦可用於治療脊髓損傷、其他脊髓疾病、中風、創傷性腦損傷等。

Wnt訊號亦用作血管生成。經工程化WNT促效劑可有益於血管生成為有益的病況、心肌梗塞之治療、冠狀動脈疾病、心臟衰竭、糖尿病性視網膜病變等及來自遺傳性疾病之病況。用於使此等組織再生之方法得益於本發明化合物之投與，該投與可為全身性或局部的。

在某些實施例中，本發明方法促進組織再生，例如在經歷損傷或組織或細胞降低或損失之組織中。損失或損傷可為使得細胞數目削弱之任何東西，包括疾病或損傷。舉例而言，事故、自體免疫病症、治療副作用或疾病病況可構成創傷。組織再生增加組織內之細胞數目，且較佳使得能夠重新建立組織之細胞之間的連接，且更佳地重新獲得組織之功能性。

如本文中所用，術語「投與」或「引入」或「提供」係指將組合物遞送至一或多種細胞、組織及/或個體之器官或遞送至個體。該等投與或引入可在活體內、活體外或離體進行。

在特定實施例中，醫藥組合物係非經腸投與，例如靜脈內、經口、經直腸或藉由注射投與。在一些實施例中，其係局部投與，例如表面或肌肉內投與。在一些實施例中，向目標組織投與組合物，例如向骨骼、關節、耳組織、眼組織、胃腸道、皮膚、傷口部位或脊髓。本發明之方法可在活體內或離體實行。在一些實施例中，目標細胞或組織與經工程化WNT促效劑之接觸係離體進行，隨後將細胞或組織(例如，活化幹細胞或前驅細胞)植入個體中。熟習此項技術者可基於所治療之疾病或病症確定適當投與部位及途徑。

劑量及給藥方案可取決於醫師易於確定之多種因素，諸如疾病或病症之性質、個體之特徵及個體之病史。在特定實施例中，投與或向個體提供之經工程化WNT促效劑之量在該個體之體重約0.01 mg至約50 mg、約0.1 mg至約500 mg或約0.1 mg至約50 mg範圍內。在本文所揭示之方法中之任一者的某些實施例中，向例如哺乳動物之個體靜脈內投與WNT促效劑，例如以推注注射形式或皮下投與。在特定實施例中，至少每週一次投與WNT促效劑。在特定實施例中，向個體投與約0.5至約100 mg/kg體重之WNT促效劑，或約2至約50 mg/kg體重之WNT促效劑，例如約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg或約50 mg/kg。在特定實施例中，向個體投與約25 mg、約75 mg、約250 mg、約750 mg、約1500 mg或約2250 mg之WNT促效劑。在特定實施例中，向個體每週至少一次靜脈內或皮下投與約3至約30 mg/kg體重之R2M13-h26，其中R2M13-h26包含由二硫鍵結合之SEQ ID NO:9之兩個多肽及SEQ ID NO:10之兩個多肽。

術語「治療(treatment/treating)」及其類似術語在本文中一般用以意謂獲得所需藥理學及/或生理作用。就完全或部分預防疾病或其症狀，例如降低個體發生疾病或其症狀之可能性而言，該作用可為預防性的，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之副作用而言，該作用可為治療性的。如本文所用，「治療」覆蓋對哺乳動物之疾病之任何治療，且包括：(a)預防易患疾病但尚未診斷為患有該疾病之個體內出現疾病；(b)抑制疾病，亦即遏制其發展；或(c)緩解疾病，亦即引起疾病消退。治療劑(例如，工程化WNT促效劑)可在疾病或損傷發作之前、期間或之後投與。對進行中之疾病之治療尤其受關注，其中治療穩定或減少患者之不期望的臨床症狀。此治療理想地在受影響組織之功能完全喪失之前進行。個體療法理想地在疾病有症狀階段期間且在一些情況下在疾病有症狀階段之後投與。在一些實施例中，本發明方法產生治療效益，例如預防病症之發展、阻止病症之進展、逆轉病症之進展等。在一些實施例中，本發明方法包含偵測已實現之治療益處的步驟。一般熟練技術人員應瞭解，此類治療功效量測將適用於所改善之特定疾病，且將識別用於量測治療功效之適當偵測方法。

在某些實施例中，在向個體投與本文所揭示之經工程化WNT促效劑後，本文所揭示之方法產生以下PK/PD參數中之一或多者：10-50或約25之清除(mL/天/kg)；2-5天或約4天之t1/2；50至300或100至200或約140之Cmax (ug/mL)、約3至4 (天)或約4之MRT，或約100至1000或約100至約500或約190之AUC (天*μg/mL)。

其他實施例部分地係關於本文所揭示之經工程化WNT促效劑例如藉由使細胞或組織與一或多種經工程化WNT促效劑視情況與Norrin或R-脊椎蛋白多肽組合接觸來促進或增強細胞、組織及器官之生長或增殖的用途。在某些實施例中，細胞或組織為離體、活體外或活體內的。此類方法可用於產生用於治療用途，例如待移植或接枝至個體中之細胞、組織或類器官。其亦可用於產生用於研究用途之細胞、組織或類器官。經工程化WNT促效劑在非治療方法，例如活體外研究方法中具有普遍應用。

在某些實施例中，經工程化WNT促效劑(包括本文所揭示之彼等)可用於保存細胞、組織、器官或類器官，例如用於移植之組織或器官。舉例而言，細胞、組織、器官或類器官可與經工程化WNT促效劑活體內或離體接觸。在保持細胞、組織或器官進行移植之情形下，細胞、組織、器官或類器官可與經工程化WNT促效劑接觸，同時仍在供體中(亦即，在自供體移除之前)及/或在自供體移除之後。該等方法可例如在儲存期間或在移植至受體中之前維持或增強細胞、組織或器官之存活率。在特定實施例中，細胞、組織或器官在包含經工程化WNT促效劑之組合物或溶液中灌注。在某些實施例中，使某些器官組織與WNT超促效劑分子接觸，以維持該組織之存活率。在特定實施例中，器官組織係欲移植至有需要之接受者體內的供體器官組織。在某些實施例中，供體器官組織例如在自供體移除器官組織之前用包含本文所揭示之經工程化WNT促效劑之溶液活體內灌注。在某些實施例中，供體器官組織例如在儲存期間或在自供體傳輸至接收者期間用包含本文所揭示之經工程化WNT促效劑之溶液離體灌注。在特定實施例中，與經工程化WNT促效劑接觸之器官組織保持對於移植而言比其未與經工程化WNT促效劑接觸之情況長至少10%、至少20%、至少50%或至少100%。在某些實施例中，器官組織為肝臟組織。

在某些實施例中，經工程化WNT促效劑(包括本文所揭示之彼等)可用於活體外組織(例如皮膚組織)之擴增及/或維持。在特定實施例中，組織自供體或患者分離。可使組織活體內或離體與經工程化WNT促效劑接觸(例如維持或在其存在下培養)。在某些實施例中，組織離體接觸，例如藉由灌注包含工程化WNT促效劑之組合物。

在另一實施例中，經工程化WNT促效劑(包括本文所揭示之彼等)可用於產生或維持類器官或類器官培養物。舉例而言，可使類器官培養物與經工程化WNT促效劑接觸，例如藉由在包含經工程化WNT促效劑之培養基中培養類器官。在某些實施例中，藉由使類器官培養物與本文所揭示之一或多種經工程化WNT促效劑接觸來產生、生長或維持類器官培養物。在特定實施例中，經工程化WNT促效劑存在於用於生長或維持類器官組織之培養基中。

本發明提供一種用於組織再生受損組織(諸如上文所論述之組織)的方法，其包含向細胞投與工程化WNT促效劑。經工程化WNT促效劑可直接活體內向細胞投與，經口、靜脈內向個體投與或藉由此項技術中已知之其他方法投與，或投與至離體細胞。在投與經工程化WNT促效劑至離體細胞之一些實施例中，此等細胞可在投與經工程化WNT促效劑之前、之後或期間移植至個體中。

Wnt傳訊為幹細胞培養物之關鍵組分。舉例而言，如WO2010/090513、WO2012/014076、Sato等人, 2011 (GASTROENTEROLOGY 201 1; 141: 1762-1772)及Sato等人, 2009 (Nature 459, 262-5)中所描述之幹細胞培養基。本文所揭示之經工程化WNT促效劑為適用於R-脊椎蛋白之替代物以用於此等幹細胞培養基，或可與R-脊椎蛋白組合。

因此，在一個實施例中，本發明提供一種用於增強幹細胞增殖之方法，其包含使幹細胞與本文所揭示之一或多種經工程化WNT促效劑接觸。在一個實施例中，本發明提供一種包含本文所揭示之一或多種經工程化WNT促效劑的細胞培養基。在一些實施例中，細胞培養基可為此項技術中已知之通常包含Wnt或R-脊椎蛋白之任何細胞培養基，但其中Wnt或R-脊椎蛋白由本文所揭示之經工程化WNT促效劑置換(完全或部分)或補充。舉例而言，培養基可如以下中所描述：WO2010/090513、WO2012/014076，Sato等人, 2011 (GASTROENTEROLOGY 201 1；141: 1762-1772)及Sato等人., 2009 (Nature 459, 262-5)，其特此以全文引用之方式併入。

幹細胞培養基通常包含額外生長因子。此方法可因此另外包含向幹細胞供應生長因子。細胞培養基中通常使用之生長因子包括表皮生長因子(EGF，(Peprotech)、轉型生長因子-α (TGF-α，Peprotech)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF，Peprotech)、大腦衍生神經滋養因子(BDNF，R&D系統)、肝細胞生長因子(HGF)及角質細胞生長因子(KGF, Peprotech，亦稱為FGF7)。EGF為多種經培養外表皮及間表皮細胞之有效促有絲分裂因子且對活體內及活體外特異性細胞及細胞培養物中之一些纖維母細胞之分化具有深遠作用。EGF前驅體以蛋白分解方式裂解以產生刺激細胞之53-胺基酸肽激素的膜結合分子形式存在。因此，EGF或其他促有絲分裂生長因子可供應至幹細胞。在培養幹細胞期間，可每隔一天將促有絲分裂生長因子添加至培養基中，同時較佳地每四天更新培養基。一般而言，促有絲分裂因子選自由以下組成之群：i) EGF、TGF-α及KGF，ii) EGF、TGF-α及FGF7；iii) EGF、TGF-α及FGF；iv) EGF及KGF；v) EGF及FGF7；vi) EGF及FGF；vii) TGF-α及KGF；viii) TGF-α及FGF7；ix)或來自TGF-α及FGF。在某些實施例中，本發明包括幹細胞培養基，其包含本文所揭示之工程化WNT促效劑，例如視情況與本文所描述之生長因子或其組合中之一或多者組合。

增強幹細胞增殖之此等方法可用於使新穎類器官及組織自幹細胞中生長，例如WO2010/090513 WO2012/014076，Sato等人, 201 1 (GASTROENTEROLOGY 2011；141: 1762-1772)及Sato等人, 2009 (Nature 459, 262-5)中所描述。

在一些實施例中，經工程化WNT促效劑用於增強幹細胞再生。相關說明性幹細胞包括(但不限於)：肌衛星細胞；造血幹細胞及自其衍生之前驅細胞(美國專利第5,061,620號)；神經幹細胞(參見Morrison等人. (1999) Cell 96: 737-749)；胚胎幹細胞；間葉幹細胞；間表皮幹細胞；肝臟幹細胞；脂肪組織衍生之幹細胞等。

本發明部分地基於使用經工程化WNT促效劑調節胃腸上皮組織增殖，尤其在發炎性腸病中。

在一個實施例中，本發明提供一種治療患有胃腸道病症之個體的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之經工程化WNT促效劑。在某些實施例中，胃腸道疾病為發炎性腸病。在其他實施例中，該發炎性腸病選自由以下組成之群：克隆氏病(CD)、伴有瘺形成之CD及潰瘍性結腸炎(UC)。在某些實施例中，經工程化WNT促效劑減少腸或結腸及/或修復腸上皮組織中之發炎性細胞介素表現。

在某些態樣中，本發明亦提供一種治療患有胃腸道病症之個體的方法，其包含向該個體投與組織特異性WNT訊號增強分子。在某些實施例中，WNT訊號增強分子包含：a)結合至一或多種E3泛蛋白接合酶之第一域；及b)結合至組織特異性受體之第二域。在另一實施例中，E3泛蛋白接合酶係選自由鋅及環指蛋白質3 (ZNRF3)及環指蛋白質43 (RNF43)組成之群。在另一實施例中，第一域包含R-脊椎蛋白(RSPO)多肽。在另一實施例中，RSPO多肽選自由以下組成之群：RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3及RSPO-4。在某些實施例中，RSPO多肽包含第一弗林蛋白酶域及第二弗林蛋白酶域。在某些實施例中，第二弗林蛋白酶域為野生型或經突變以具有較低富含白胺酸含有重複G蛋白偶聯受體4-6 (LGR4-6)之結合。在某些實施例中，工程化促效劑或Wnt訊號增強分子併入靶向組織之分子。在其他實施例中，靶向組織之分子為與組織特異性細胞表面抗原結合之抗體或其片段。在某些實施例中，靶向組織之分子選自由以下組成之群：GPA33、CDH17及MUC-13或其功能片段或變異體。在一些實施例中，WNT促效劑與特異性結合發炎性分子之結合域一起投與。在某些實施例中，對發炎性分子具有特異性之結合域為發炎性分子之拮抗劑。在其他實施例中，發炎性分子之拮抗劑為TNFα、IL-12、IL-12及IL-23或IL-23之拮抗劑。在一些實施例中，胃腸道疾病為發炎性腸病。在其他實施例中，該發炎性腸病選自由以下組成之群：克隆氏病(CD)、伴有瘺形成之CD及潰瘍性結腸炎(UC)。

在另一實施例中，本發明提供一種治療患有胃腸道病症之個體的方法，其包含向該個體投與工程化WNT促效劑及工程化組織特異性WNT訊號增強分子。工程化WNT促效劑及工程化組織特異性WNT訊號增強分子可同時或在不同時間投與。在一些實施例中，個體在重疊時間段期間包含有效量之兩者。在某些實施例中，工程化WNT促效劑包含結合至FZD5、FZD8、FZD1、FZD2、FZD7、FZD 5及8，或FZD1、2及7之一或多個結合域，及結合至LRP5、LRP6或LRP5之一或多個結合域。在一些實施例中，經工程化WNT促效劑包含靶向組織之分子。在某些實施例中，靶向組織之分子為與組織特異性細胞表面抗原結合之抗體或其片段。在其他實施例中，靶向組織之分子選自由以下組成之群：GPA33、CDH17及MUC-13或其功能片段或變異體。在某些實施例中，經工程化WNT訊號增強分子包含結合至一或多種E3泛蛋白接合酶之第一域及結合至組織特異性受體之第二域。在其他實施例中，E3泛蛋白接合酶係選自由鋅及環指蛋白質3 (ZNRF3)及環指蛋白質43 (RNF43)組成之群。在一些實施例中，第一域包含R-脊椎蛋白(RSPO)多肽。在其他實施例中，RSPO多肽選自由以下組成之群：RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3及RSPO-4。在另一實施例中，RSPO多肽包含第一弗林蛋白酶域及第二弗林蛋白酶域。在又另一實施例中，第二弗林蛋白酶域為野生型或經突變以具有較低富含白胺酸含有重複G蛋白偶聯受體4-6 (LGR4-6)之結合。在其他實施例中，經工程化WNT促效劑揭示於表3中。在一些實施例中，工程化WNT促效劑及工程化組織特異性WNT訊號增強分子與特異性結合發炎性分子之結合域一起投與。在其他實施例中，對發炎性分子具有特異性之結合域為發炎性分子之拮抗劑。在又其他實施例中，發炎性分子之拮抗劑為TNFα、IL-12、IL-12及IL-23或IL-23之拮抗劑。在某些實施例中，胃腸道疾病為發炎性腸病。在其他實施例中，該發炎性腸病選自由以下組成之群：克隆氏病(CD)、伴有瘺形成之CD及潰瘍性結腸炎(UC)。

在另一實施例中，本發明提供一種治療患有胃腸道病症之個體的方法，其包含向該個體投與工程化WNT促效劑及工程化組織特異性WNT訊號增強組合分子。在某些實施例中，組合分子包含：a)工程化WNT促效劑，其包含一或多個結合至FZD5、FZD8、FZD1、FZD2、FZD7、FZD 5及8或FZD1、2及7之結合域，及一或多個結合至LRP5、LRP6或LRP5之結合域，及b)工程化WNT訊號增強分子，其包含結合至一或多個E3泛蛋白接合酶之第一域，及結合至組織特異性受體之第二域。在其他實施例中，E3泛蛋白接合酶係選自由鋅及環指蛋白質3 (ZNRF3)及環指蛋白質43 (RNF43)組成之群。在一些實施例中，第一域包含R-脊椎蛋白(RSPO)多肽。在其他實施例中，RSPO多肽選自由以下組成之群：RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3及RSPO-4。在另一實施例中，RSPO多肽包含第一弗林蛋白酶域及第二弗林蛋白酶域。在又另一實施例中，第二弗林蛋白酶域為野生型或經突變以具有較低富含白胺酸含有重複G蛋白偶聯受體4-6 (LGR4-6)之結合。在一些實施例中，組合分子併入靶向組織之分子。在某些實施例中，靶向組織之分子為與組織特異性細胞表面抗原結合之抗體或其片段。在其他實施例中，靶向組織之分子選自由以下組成之群：GPA33、CDH17及MUC-13或其功能片段或變異體。在一些實施例中，組合分子與特異性結合發炎性分子之結合域一起投與。在其他實施例中，對發炎性分子具有特異性之結合域為發炎性分子之拮抗劑。在又其他實施例中，發炎性分子之拮抗劑為TNFα、IL-12、IL-12及IL-23或IL-23之拮抗劑。在某些實施例中，胃腸道疾病為發炎性腸病。在其他實施例中，該發炎性腸病選自由以下組成之群：克隆氏病(CD)、伴有瘺形成之CD及潰瘍性結腸炎(UC)。

在本文所揭示之方法中之任一者的特定實施例中，經工程化WNT促效劑選自以下中之任一者中所揭示之彼等：PCT申請公開案第WO 2016/040895號；US申請公開案第US 2017-0306029號；US申請公開案第US 2017-0349659號；PCT申請公開案第WO 2019/126398號；或PCT申請公開案第WO 2020/01030號。在本文所揭示之方法中之任一者的特定實施例中，組織特異性WNT訊號增強分子選自以下中之任一者中所揭示之彼等：PCT申請公開案第WO 2018/140821號；美國申請公開案第US 2020-0048324號；或PCT申請公開案第WO 2020/14271號，以上所有者以全文引用的方式併入本文中。

在相關實施例中，本發明提供一種治療患有胃腸道病症之個體的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之工程化WNT促效劑、工程化WNT訊號增強分子及/或組合分子，或包含本文所揭示之工程化WNT促效劑或組合分子的醫藥組合物。在一些實施例中，胃腸道病症為發炎性腸病，視情況選自由以下組成之群：克隆氏病(CD)、伴有瘺形成之CD及潰瘍性結腸炎(UC)。本文所揭示之方法中之任一者可使用本文所揭示之經工程化WNT促效劑、經工程化WNT訊號增強分子及/或組合分子中之任一者來實踐。

在本文所揭示之方法中之任一者的某些實施例中，向例如哺乳動物之個體靜脈內投與WNT促效劑，例如以推注注射形式。在特定實施例中，至少每週一次投與WNT促效劑。在特定實施例中，向個體投與約0.5至約100 mg/kg體重之WNT促效劑，或約2至約50 mg/kg體重之WNT促效劑，例如約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg或約50 mg/kg。在特定實施例中，向個體每週至少一次靜脈內投與約3至約30 mg/kg體重之R2M13-h26，其中R2M13-h26包含由二硫鍵結合之SEQ ID NO:9之兩個多肽及SEQ ID NO:10之兩個多肽。在特定實施例中，該方法用於治療IBD，例如患有本文所揭示之WNT促效劑(例如R2M13-h26)之中度至重度IBD。在某些實施例中，IBD克隆氏病、伴有瘺形成之克隆氏病或潰瘍性結腸炎。

本文所揭示之方法中的任一者亦可使用WNT促效劑分子與組織特異性WNT訊號增強分子之組合或包含WNT促效劑分子及組織特異性WNT訊號增強的組合分子(組合分子)實施，例如如本文中所描述。在一個實施例中，向患有涉及不適當或失調WNT傳訊之疾病的個體提供WNT促效劑分子及/或組織特異性WNT訊號增強分子或組合分子。在某些實施例中，本文所揭示之方法包含向有需要之個體單獨或組合地提供WNT促效劑分子及/或組織特異性WNT訊號增強分子或組合分子。在某些實施例中，在相同或不同醫藥組合物中向個體提供WNT促效劑分子及組織特異性WNT訊號增強分子。在一些實施例中，WNT促效劑分子及組織特異性WNT訊號增強分子同時或在不同時間向個體提供，例如一個在另一個之前或之後。在一些實施例中，方法包含向該個體提供有效量之WNT促效劑分子及/或組織特異性WNT訊號增強分子。在一些實施例中，在重疊時間段，例如一天、兩天或一週期間，個體中存在有效量之WNT促效劑分子及組織特異性WNT訊號增強分子。在其他實施例中，本文所揭示之方法包含向有需要之個體提供包含WNT促效劑分子及組織特異性WNT訊號增強分子(組合分子)的組合分子。

在某些實施例中，可實踐本文所揭示之方法中的任一者以降低發炎(例如，與IBD相關或受IBD影響的組織中之發炎，諸如胃腸道組織，例如小腸、大腸或結腸)、增加WNT傳訊、降低IBD之組織症狀中的任一者(例如，彼等本文所揭示)、降低發炎組織中之細胞介素含量(例如，胃腸道組織)或降低疾病活動性指數。

在某些實施例中，WNT促效劑分子或組織特異性WNT訊號增強分子或組合分子可用於增強組織或細胞中之WNT傳訊路徑。促效WNT傳訊路徑可包括例如增加組織或細胞中之WNT傳訊或增強WNT傳訊。因此，在一些態樣中，本發明提供一種用於促效細胞中之WNT傳訊路徑之方法，其包含使組織或細胞與有效量之本文所揭示之WNT促效劑分子及/或組織特異性WNT訊號增強分子或組合分子或其醫藥學上可接受之鹽接觸，其中該WNT促效劑分子及/或組織特異性WNT訊號增強分子或組合分子為WNT傳訊路徑促效劑。在某些實施例中，本發明提供一種增加細胞中WNT傳訊之方法，其包含使該細胞與本文所揭示之經工程化WNT促效劑接觸。在特定實施例中，WNT促效劑為R2M13-h26。在一些實施例中，接觸活體外、離體或活體內發生。在特定實施例中，細胞係經培養細胞，且該接觸係在活體外發生。

WNT促效劑及/或組織特異性WNT訊號增強分子或組合分子可用於治療胃腸道病症，包括(但不限於)發炎性腸病，包括(但不限於)克隆氏病、伴有瘺形成之克隆氏病及潰瘍性結腸炎。在特定實施例中，WNT促效劑可用於治療胃腸道病症，包括(但不限於)發炎性腸病，包括(但不限於)克隆氏病，具有或不具有瘺形成，包括(但不限於)潰瘍性結腸炎，包括(但不限於)急性腸道GVHD (移植物抗宿主疾病)，包括(但不限於)短腸侯症群及任何其他胃腸疾病，其中上皮障壁減弱或腸縮短。特定言之，本發明提供WNT/β-連環蛋白傳訊WNT/β-連環蛋白促效劑，以增強腸上皮組織之再生，由此等病症損傷所致。在特定實施例中，WNT促效劑為R2M13-h26。

經工程化WNT促效劑亦可用於調節多種組織及/或細胞過程，且調節組織及/或細胞內之基因表現。在某些實施例中，本發明提供調節基因表現之方法，其包含使個體、器官、組織或細胞與本文所揭示之工程化WNT促效劑接觸，例如表3中。可向個體投與經工程化WNT促效劑，且可使器官、組織或細胞活體內、離體或活體外與經工程化WNT促效劑接觸。在特定實施例中，該方法引起WNT傳訊路徑中一或多個基因之上調或下調，該WNT傳訊路徑包括(但不限於)表4至8中所揭示之基因中之任一者。基因表現之上調或下調可在RNA或蛋白質水準下量測，且可在投與後在個體之一或多種組織及/或細胞中引起增加至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在某些實施例中，增加或減少可基於與預定對照含量或針對未與經工程化WNT促效劑接觸之相應細胞或組織所確定之含量的比較來確定。

在一些實施例中，本發明提供一種調節患有胃腸道病症之個體之一或多種組織及/或細胞中的WNT路徑分子之表現的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之經工程化WNT促效劑或醫藥組合物。在某些實施例中，WNT路徑分子為表4-7中之任一者中所列的基因或蛋白質。在特定實施例中，WNT路徑分子選自由以下組成之群：RNAse4、血管生成素(Angiongenin)、Gsta3、Rnf43、Axin2、Ccnb1或表7中所列出之基因或蛋白質中之任一者。在某些實施例中，WNT路徑分子(基因或蛋白質)之表現在投與該經工程化Wnt促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在某些實施例中，組織為上皮組織。在某些實施例中，細胞為胃腸上皮細胞，視情況：幹細胞、TA1、TA2、基底細胞、損傷誘發之替代性前驅細胞(AltEnteroPC)、損傷誘發之替代性腸上皮細胞(Alt Entero)、腸上皮細胞前驅細胞(EnteroPrecur)、杯狀細胞1、杯狀細胞2、腸道內分泌細胞或簇細胞。在特定實施例中，WNT促效劑為R2M13-h26。

在另一實施例中，本發明提供一種刺激患有胃腸道病症之個體之組織修復的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之經工程化WNT促效劑或醫藥組合物。在特定實施例中，該組織修復係藉由調節至少一種選自由以下組成之群的WNT路徑分子而刺激(或該方法引起)：與細胞週期相關之基因、與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之基因、與上皮細胞修復及障壁恢復相關之基因及/或表4-8中之任一者中所列之基因中之任一者。在某些實施例中，與該細胞週期相關之該等基因係選自表4中所提供之彼等，或Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1及Rrm2。在某些實施例中，與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之該等基因係選自表8中所提供之彼等，及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1及Adh1。在某些實施例中，與上皮細胞修復及障壁恢復相關之該等基因係選自表6中所提供之彼等，或Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16及Sprr2a3。在特定實施例中，基因之表現在投與該經工程化Wnt促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在特定實施例中，WNT促效劑為R2M13-h26。

在另一實施例中，本發明提供一種減少患有胃腸道病症(或其組織或細胞)之個體之發炎的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之經工程化WNT促效劑或醫藥組合物。在某些實施例中，該發炎係藉由調節至少一種選自由以下組成之群的WNT路徑分子而減少(或該方法引起)：表5中所提供之基因，或Adamdec1、Atf3、Gpx2、Gsta3、Gstm1、Gdf15、Il18、Nox1、Reg4、Sycn、Selenbp1、Tgfbr2及Timp3。在特定實施例中，該發炎係在胃腸道組織，視情況上皮組織中減少。在某些實施例中，發炎係在胃腸上皮細胞、上皮幹細胞、TA1、TA2、基底杯狀細胞、損傷誘發之替代性前驅細胞(Alt前驅細胞)、損傷誘發之替代性腸上皮細胞(AltEnteros)、腸上皮細胞前驅細胞(EnteroPrecur)、杯狀細胞1、杯狀細胞2或腸道內分泌細胞。在特定實施例中，WNT路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在特定實施例中，WNT促效劑為R2M13-h26。

在本文所揭示之方法中之任一者的某些實施例中，WNT促效劑分子亦可併入靶向組織之部分，例如識別肺部組織特異性受體或細胞表面分子之抗體或其片段。

本發明亦提供使用用於胃腸道病症，尤其發炎性腸病(IBD)之已知及新穎治療的組合治療。舉例而言，WNT促效劑可與用於IBD之若干已知療法組合，包括(但不限於)：5-胺基水楊酸鹽(5-ASA)；免疫抑止劑，諸如皮質類固醇、硫唑嘌呤或6-巰基嘌呤、甲胺喋呤及環孢菌素-A或他克莫司；TNFα抑制劑，諸如英利昔單抗、阿達木單抗及戈利木單抗；抗整合素，諸如維多珠單抗；發炎性細胞介素拮抗劑，諸如烏司奴單抗；詹納斯(Janus)激酶(JAK)抑制劑，諸如托法替尼；SMAD 7抑制劑，諸如蒙格森；及S1P調節劑，諸如奧劄莫德及伊拉斯莫；及可能針對上述疾病出售的任何新藥劑。以上治療藥物可與本發明之分子依序或同時投與。

治療劑(例如，經工程化WNT促效劑及/或組織特異性WNT訊號增強分子或組合分子)可在疾病或損傷發作之前、期間或之後投與。對進行中之疾病之治療尤其受關注，其中治療穩定或減少患者之不期望的臨床症狀。此治療理想地在受影響組織之功能完全喪失之前進行。個體療法理想地在疾病有症狀階段期間且在一些情況下在疾病有症狀階段之後投與。在一些實施例中，本發明方法產生治療效益，例如預防病症之發展、阻止病症之進展、逆轉病症之進展等。在一些實施例中，本發明方法包含偵測已實現之治療益處的步驟。一般熟練技術人員應瞭解，此類治療功效量測將適用於所改善之特定疾病，且將識別用於量測治療功效之適當偵測方法。

本說明書中提及及/或申請案資料表中所列之以上美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外來專利、外來專利申請案及非專利公開案中之全部以全文引用的方式併入本文中。

根據以上內容應瞭解，雖然已出於說明之目的在本文中描述了本發明之特定實施例，但可在不偏離本發明之精神及範疇之情況下進行各種修改。因此，除了隨附申請專利範圍之外，本發明不受限制。

參考以下實例最佳地理解本發明之範疇，該等實例並不意欲將本發明限於特定實施例。實例實例1 通用方法

使用分子生物學中之標準方法且其描述於例如以下中：Maniatis等人. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 第3版., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Wu (1993) Recombinant DNA, 第217卷, Academic Press, San Diego, Calif。標準方法亦見於Ausbel, 等人 (2001) Current Protocols in Molecular Biology,第1-4卷, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.,中，其描述細菌細胞之選殖及DNA突變誘發(第1卷)、哺乳動物細胞及酵母之選殖(第2卷)、醣接合物及蛋白質表現(第3卷)及生物資訊學(第4卷)。

用於蛋白質純化之方法，包括免疫沈澱、層析、電泳、離心及結晶，描述於例如Coligan等人(2000) Current Protocols in Protein Science, 第1卷, John Wiley and Sons, Inc., New York中。描述了化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融合蛋白質之產生、蛋白質之醣基化；參見例如Coligan等人. (2000) Current Protocols in Protein Science, 第2卷, John Wiley and Sons, Inc., New York；Ausubel等人. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, 第3卷, John Wiley and Sons, Inc., NY, N.Y., 第16.0.5-16.22.17頁; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.; 第45-89頁; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., 第384-391頁。多株及單株抗體之產生、純化及片段化描述於例如以下中：Coligan等人(2001) Current Protocols in Immunology,第1卷, John Wiley and Sons, Inc., New York；Harlow及Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Harlow及Lane, 前述。用於表徵配位體/受體相互作用之標準技術係可用的。參見例如Coligan等人. (2001) Current Protocols in Immunology,第4卷, John Wiley, Inc., New York。

用於流動式細胞測量術的方法，包括螢光活化細胞分選偵測系統(FACS®)，係可用的；參見例如Owens等人. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.；Givan (2001) Flow Cytometry, 第2版.; Wiley-Liss, Hoboken, N.J.; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J。可獲得用作例如診斷試劑的適用於修飾核酸，包括核酸引子及探針、多肽及抗體之螢光試劑。Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, Mo。

描述了免疫系統之組織學的標準方法。參見例如Muller-Harmelink (編) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, N.Y.; Hiatt等人. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, Pa.; Louis等人. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, N.Y。

用於確定例如抗原片段、前導序列、蛋白質摺疊、功能域、醣基化位點及序列比對之套裝軟體及資料庫係可用的。參見例如GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, Md.)；GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, Calif.)；DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nev.)；Menne等人. (2000) Bioinformatics16: 741-742; Menne等人. (2000) Bioinformatics Applications Note16:741-742; Wren等人 (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690。

本發明中所用之例示性方法及物質提供於下文中。 RNA 原位雜交：

mRNA之表現藉由RNAscope原位雜交(ACD Bio)來偵測。下文列舉所使用之RNAscope探針。對於比色可視化，遵循標準RNAscope® 2.5 HD分析-紅色方案(www.acdbio.com)，且在配備有DFC7000T彩色照相機之Leica DMi8顯微鏡上獲取影像。對於螢光RNAscope原位雜交，遵循標準RNAscope多重螢光試劑套組v2分析方案(ACD生物文件#323100-USM)，且與TSA Plus花青3及5系統組合。使用Leica Thunder成像系統獲取螢光影像。 RNA 分離及 RT-qPCR ：

MagMAX™ mirVana (Thermofisher，A27828)總RNA分離套組用於在KingFisher (Thermofisher)樣品純化系統上之RNA分離。使用Applied Biosystems高容量cDNA反轉錄套組(Thermofisher，4368814)進行反轉錄，且Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermofisher，4444557)用於qPCR。 親和性量測：

R2M13、R2M13-26之Fzd結合部分、Fab與Fzd5,8之每一CRD的結合動力學係藉由生物層干涉法(BLI)使用Octet Red 96 (PALL ForteBio，Fremont，CA)儀器在30℃下，1000 rpm下使用鏈黴抗生物素蛋白(SA)生物感測器來確定的。將在操作緩衝液(PBS，0.05% Tween-20，0.5% BSA，pH 7.2)中稀釋至25 nM之Fzd的生物素化CRD捕獲至SA生物感測器上，接著浸漬至含有不同濃度R2M13 Fab蛋白質於操作緩衝液中之孔中或浸漬至僅有操作緩衝液作為參考通道之孔中。基於與1:1結合模型之擬合，藉由Octet系統軟體計算每一結合物之KD。亦藉由BLI分析檢測R2M13 IgG與10 Fzds之結合特異性。將在操作緩衝液中稀釋至50 nm之生物素化Fzd CRD (H. Chen, Lu, Lee, & Li, 2020)捕獲至SA生物感測器，接著浸漬至含有200 nM R2M13 IgG於操作緩衝液中之孔中。 Super TopFlash (STF) 分析：

遵循建立之方案(H. Chen, Lu, Lee, & Li, 2020)，使用含有由WNT反應性啟動子控制之螢光素酶基因的Huh7人類肝臟細胞(Super TopFlash報導分析，STF)來量測Wnt模擬物之傳訊活性。 類器官培養及增殖分析 ：

將小鼠小腸類器官維持於小鼠IntestiCult™類器官生長培養基(STEMCELL technologies)中，且每週繼代一次，直至Wnt模擬物活性分析之日(H. Chen, Lu, Lee, & Li, 2020)。為了分析類器官增殖，類器官用溫和細胞解離試劑(STEMCELL technologies)在振盪下解離10 min，在冷PBS (Gibco)中洗滌2次，且在冰上1:1再懸浮於基質膠(Corning)中。將基質膠中之25 ul細胞再懸浮液接種至預溫熱之48孔組織培養盤之各孔的中心，且使其在37℃下固化5分鐘。將300 ul基礎培養基(表10)，基礎培養基+IWP2+抗βGal或基礎培養基+IWP2+Wnt模擬物施加至該等孔中。各條件包括5至6次重複。接種後第4天，將培養基及處理改變一次。在第7天獲取3D經培養之類器官的影像。 動物飼養：

七週齡C57Bl/6J雌性小鼠係獲自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME，USA)且以4-5隻/籠圈養。所有動物實驗均根據國家科學院(National Academy of Sciences)制定的「實驗動物照護及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)」之標準進行。動物實驗之方案由Surrozen機構動物護理及使用委員會批准。在開始實驗之前，使小鼠適應最少兩天。將小鼠在30%至70%濕度環境及在20℃至26℃範圍內之室溫中保持12/12小時亮/暗循環。 DSS 誘發之急性結腸炎 ：

7至8週齡雌性C57BL6/J小鼠自第1天至第7天用含4% (wt/vol)硫酸葡聚糖鈉(DSS，MP Biomedicals，分子量36-50 kDa，Ref# 160110)之飲用水飼餵，以誘導結腸炎，且自第8天改用1% DSS。蛋白質處理在第7天給予一次，或在第4天及第7天給予兩次。動物在第10天處死，允許6天的蛋白質處理過程，且收集結腸用於組織學及RT-qPCR。在一項研究中，對於用抗GFP處理之動物，DSS誘導的小鼠體重損失在第9天接近25%，因此動物改用無DSS之飲用水，以便符合IACUC規則。疾病活動性指數(DAI)基於體重損失、糞便稠度及腸道出血程度的平均分數計算(Wirtz Stefan等人., 2017)。按等級劃分的評分系統使用以下參數以0至4之等級計算：體重損失(0，0-1%；1，1-6%；2，6-12%；3，12-18%；4，＞18%)，糞便稠度(0，正常；1，軟但仍成型；2，軟；3，極軟濕潤；4，水樣腹瀉)及腸出血(0-1，hemoccult陰性；2，hemoccult陽性；3，糞便中可見血跡；4，直腸大出血)。 組織組織學：

取出小腸及結腸，且在移除糞便內含物之後，稱重且量測長度。切出所需小腸節段(十二指腸、空腸、回腸)及結腸節段(升結腸、橫結腸及降結腸)且直接固定於10%中性緩衝福馬林(NBF)中隔夜。隨後將組織轉移至70%乙醇中，之後石蠟包埋。隨後將石蠟組織塊切成5 µM的厚度，且用蘇木精及曙紅(H&E)染色用於組織學分析。病理學閱讀由獨立病理學家執行。 免疫組織化學及間接免疫螢光 ：

簡言之，將載片上之五微米厚福馬林固定之石蠟包埋的組織切片脫蠟，接著在蒸鍋中進行檸檬酸鹽緩衝液(pH 6)抗原修復。載片隨後用自來水充分洗滌，接著用PBST洗滌1次。隨後，組織切片在室溫下用無血清蛋白質阻斷劑(Agilent，X090930-2)阻斷一小時，接著在一級抗體中培育。初級抗體培育之後，組織切片在含0.1 % TX-100之PBS (PBST)中洗滌至少三次，接著在二級抗體中培育。隨後，組織切片用PBST洗滌，且蓋玻片用具有DAPI之Vectashield Vibrance抗衰減封固劑(Vector Laboratories，H-1800)封固。 螢光活化細胞分選 (FACS)小鼠結腸如下所描述解離且再懸浮於FACS緩衝液(HBSS，2% FBS，10 mM HEPES，1 mM丙酮酸鈉及1 %青黴素-鏈黴素或抗生素/抗黴劑溶液)中。在FACS之前，使細胞通過40微米過濾器，且添加DAPI以區分活細胞/死細胞。在目標抗體培育之前，將FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec，130-092-575)添加至樣品中且培育10分鐘。 單細胞 RNA- 定序 (scRNA-seq) ： 組織解離、細胞分離、庫製備、定序

對於急性DSS模型，在整個實驗期間用4% DSS在其飲用水中處理小鼠。在DSS處理之第4天，以10 mpk R2M13-26或抗GFP抗體給予經DSS處理之動物。在每個時間點收集來自第5天和第6天的兩隻未受損傷的未處理小鼠(無DSS)的細胞以及來自抗GFP及R2M13-26處理之DSS動物各自三個重複的細胞。將每一動物視為一個重複。

自各動物分離橫結腸且去除糞便。在冷PBS中短暫洗滌之後，縱向切割結腸，以將腸管打開成平坦薄片，且將組織切成3-4 mm長度的片段。在含有5 mM EDTA之預溫熱(37℃)的PBS中在37℃ 150 rpm的振盪器中培育組織片段15分鐘。15分鐘後，劇烈振盪含有樣品之試管10秒，以釋放更多上皮細胞。將懸浮液中漂浮之上皮細胞移至新試管中且在200 rcf下離心兩分鐘。

隨後在37℃下在150 rpm水平振盪下使含有剩餘上皮及基質/固有層之殘餘組織在8-12.5 mL固有層解離緩衝液(AdvDMEM/F12，具有10 mM HEPES，0.2 % FBS，DNAse1 (80 U/mL)，Liberase TM (0.2 mg/mL)及1%抗生素/抗黴劑)中培育30分鐘。在沈澱之後，上皮細胞再懸浮於1 mL具有DNase1之TrypLE中，且其在37℃下培育五分鐘且用P1000移液管濕磨30秒。在濕磨之後，將10 mL PBS加50 U/mL DNAse1添加至上皮細胞中，且將其在500 rcf，4℃下離心，且移除上清液。隨後將上皮細胞在FACS緩衝液(HBSS，2% FBS，10 mM HEPES，1 mM丙酮酸鈉及1%青黴素-鏈黴素或抗生素/抗黴劑溶液)中洗滌一次，之後進行另一輪離心且最終再懸浮於0.5 mL之FACS緩衝液中。在LP解離緩衝液中解離30分鐘後，使剩餘組織片段及懸浮液在500 rcf下離心五分鐘。將上清液移除降至1 mL，且用P1000濕磨樣品，直至溶液為均質的且所有組織片段均已解離。濕磨之後，將樣品在4℃下在500 rcf下離心5分鐘，且在FACS緩衝液中洗滌，之後再懸浮於1 mL FACS緩衝液中準備用於FACS。

所有細胞在FACS之前均通過40微米過濾器。使用DAPI藉由FACS評估存活率，且僅收集活(DAPI陰性)細胞。使用無DAPI的陰性對照確保正確的DAPI閘控。自上皮部分收集細胞，且隨後自上皮/固有層部分收集細胞，且將該等細胞合併(1:5比率)且在細胞捕獲之前在血球計上計數。使用標準10x Genomics Chromium 3' v3 scRNA-seq試劑(PN1000075)。每個通道加載約4000-4500個細胞。每個通道捕獲來自一個個別動物重複之細胞。遵循標準10x Genomics Chromium 3' v3 scRNA-seq RT、cDNA擴增及定序庫製備方案。在Illumina Nova Seq 6000 S1通道上對多重分析定序庫進行定序，平均每細胞約50,000個讀段。 scRNA-seq 分析：

使用10x Genomics Cellranger (版本3.0.2)管線處理Illumina讀段資料，該管線對mm10-3.0.0版本之小鼠總轉錄本運作STAR比對器。隨後評定解多工UMI計數資料，且遵循探索性資料分析，低品質細胞及低表現基因藉由使用R程式包 scone(版本1.14.0)及資料集特異性截至值來部分移除：僅保留具有＞ 1000個UMI及具有＞= 500及＜= 6500個基因且小於或等於60000個UMI之細胞，以去除可能的空滴且限制雙值。對粒線體基因百分比大於平均值超過一個標準差之細胞進行過濾。僅獲得在至少三個細胞之上四分位數表現之彼等基因，產生16039個基因。UMI計數資料使用來自R程式包 scran(版本1.18.5；(Lun, Bach, & Marioni, 2016)的解卷積縮放標準化。在標準化之後，當在降維空間中進行評估時，未觀測到批次特異性細胞組，亦未觀測到QC度量值與基因表現主成分之間的強相關性。

對於完整且過濾之資料集，藉由使用與來自R程式包igraph (1.2.6)至跨資料組自前2000個最可變基因衍生之前10個主成分的cluster_louvain函數耦接的k等於40之來自R程式包scran (版本1.18.5)之包裝函式(buildSNNGraph)應用基於共用最近鄰(SNN)圖示之叢集方法(Xu & Su, 2015)。此允許細胞之廣泛分組及在三種組織層/譜系(免疫、基質、上皮)內鑑別細胞類型。基於此初始叢集，將資料分成此等三個較小資料集，且各層/譜系內之細胞使用基於SNN圖示之方法及藉由來自igraph程式包之cluster_walktrap功能實施之walktrap算法集群，應用於衍生自該分層/譜系(免疫、基質、上皮)內之前2000個最可變基因之前15個主成分。使用所建立標記基因及公開文獻確定細胞類型/亞型標識。

在生物複製樣品內單細胞聚集之後，實驗條件之間的差異性基因表現分析係使用進行偽批量樣品上之R程式包 edgeR(版本3.32.1) (Y. Chen, Lun, & Smyth, 2016; Robinson, McCarthy, & Smyth, 2010)。此類型之DE分析在譜系水準及細胞類型/集群水準下實施。在三個層/譜系(上皮、基質、免疫)中之每一者內及在各時間點(24小時或48小時)之各譜系內的個別叢集/細胞類型內，在實驗條件(DSS-損傷相較於未受損傷及在針對R2M13-26處理相較於抗GFP處理之DSS損傷樣品內)之間進行差異性表現比較。藉由實施來自R程式包 edgeR(版本3.32.1)之 fry功能來應用基因集富集分析(GSEA)，亦稱為路徑分析(Y. Chen, Lun, & Smyth, 2016)。基因組係獲自Broad Institute分子特徵資料庫(MSigDB)且包括KEGG、Biocarta、PID、Reactome、ST、SIG、SA類型之標誌及策展(C2)基因組。亦實施 edgeR程式包之 kegga功能，其僅使用KEGG路徑，且觀測到類似結果(資料未展示)。為鑑別在一個實驗條件下相對於另一實驗條件差異性富集之路徑，在成對及更具體對比中對藉由複製聚集之偽批量樣品施用GSEA。

使用R程式包 slingshot進行譜系軌跡推斷(版本1.8.0；(Street等人, 2018)。

為確定R2M13-26影響Wnt目標基因表現之能力，將文獻支撐之基因添加至Wnt傳訊目標基因清單(Gougelet等人., 2014)，且藉由組織層差異性表現基因且呈現於表7中。表7顯示在24小時或48小時時，R2M13-26處理與抗GFP處理相比時，在上皮譜系內差異性表現之Wnt目標基因。在＜ 0.05之經調節p值(假發現率(FDR))上過濾差異性表現。實例2 經工程化Wnt促效劑

合成呈IgG1形式之經工程化Wnt促效劑，包括具有與Fzd結合抗體之各輕鏈之N端融合的人源化Lrp5/6結合域之Wnt促效劑。例示性結構展示於圖 1中。Lrp5/6結合域衍生自選自VHH03、VHH26或VHH36之各種駱駝科單鏈抗體(VHH)結合域。VHH03域結合Lrp5；VHH26域結合Lrp6；且VHH36域結合Lrp5及Lrp6。藉由保留CDR序列但用人類抗體主鏈置換其他序列來使駱駝科單鏈抗體人源化。對所得LRP5/6結合域進行修飾以移除潛在的責任。

如下文所描述進行VHH26之人源化。駱駝科VHH域之人源化被視為具有挑戰性，因為其衍生自單鏈均二聚抗體，缺乏異四聯人類IgG1抗體中所存在的VL:CL或VH:CH相互作用。駱駝科VHH之表面特性(Muyldermans (2013) Annu. Rev. Biochem. 82:775-797；Vincke等人(2009) J. Biol. Chem. 284: 3273-3284)在進化中重構，以使單鏈抗體之均二聚性質的穩定性最佳化。駱駝科VHH26之人源化最初藉由CDR-嫁接(有關評述：Safdari等人, (2013) Biotechnol. Genet. Eng. Rev.27: 175-186)至具有最高序列一致性之人類生殖系序列中來進行。在後續步驟中，製備具有回復突變至駱駝科序列之若干不同人源化VHH26構築體，以鑑別具有最佳表現、均勻性及生物物理學特性(諸如與Lrp6受體之結合親和力)的工程化VHH。VHH26 (表1)及其最接近的人類生殖系序列IGHV3-23*01之比對如圖 2A所示。六種不同人源化VHH26 (H1-H6)序列在表1中列出且其與親體VHH26之比對展示於圖 2B中。

此等六種人源化VHH26變異體H1至H6及親體VHH26在Expi293細胞(80mL規模)中短暫表現，具有C端六組胺酸標籤。遵循標準程序，使用His-Complete樹脂(Roche, USA)純化蛋白質。藉由SDS-PAGE及SEC (尺寸排阻層析)分析VHH26及其人源化變異體之表現量及均勻性。對於Lrp6:VHH26親和力確定，VHH26-H1、VHH26-H2、VHH26-H3、VHH26-H4、VHH26-H5、VHH26-H6及VHH26_His與生物素化LRP6E3E4之結合動力學(Chen等人, (2020) Cell Chemical Biol.27, 1-12)藉由生物層干涉法(BLI)使用Octet Red 96 (PALL ForteBio, Fremont, CA)儀器在30℃，1000 rpm鏈黴抗生物素蛋白(SA)生物感測器確定。將在操作緩衝液(PBS，0.05% Tween-20，0.5% BSA，pH 7.2)中稀釋至50 nM之生物素化LRP6E3E4捕獲至SA生物感測器，接著浸漬至含有不同濃度的指定VHH26蛋白質於操作緩衝液中之孔中，或浸漬至僅有操作緩衝液作為參考通道之孔中。基於與1:1結合模型之擬合，藉由Octet系統軟體計算每一結合物之KD。每一實驗之動力學值(Kon、Koff、KD)根據用Octet資料分析9.0 (PALL ForteBio, Fremont, CA)測試之不同濃度分子的七個技術重複計算。

VHH26及其人源化變異體之SDS-PAGE、SEC及Octet-BLI概況展示於圖 3A- 圖 3B中。SDS-PAGE對Ni-拉下樣品之分析揭露，在六種VHH26人類變異體中，與VHH26-H1、VHH26-H3及VHH26-H6相比，VHH26-H2、VHH26-H4及VHH26-H5中展現出高表現量( 圖 3A)。所有六種人源化VHH26構築體之SEC分析揭露個峰值且結果概述於圖 3B中。此等峰值中之每一者的中心部分利用Octect-BLI檢驗其與Lrp6相互作用之能力。表2中列舉VHH26構築體與Lrp6E3E4域之間的相互作用之動力學參數，諸如kon、koff及KD。此等參數之分析揭露，與親體VHH26相比，VHH26-H5人源化變異體對Lrp6之結合親和力的影響最小(表2；圖 3B)。為了比較，圖 2B中展示親體VHH26與VHH26-H5之比對。

基於上文，在其他實驗中使用VHH26-H5作為融合至Fzd結合域之人源化LRP結合域，例如四價雙特異性WNT促效劑。Fzd結合域來源於R2M13抗體，其結合Fzd5及Fzd8，且包括保留FcRn結合之無效應Fc區，例如LALAPG或N297G (Wang X等人., Protein Cell2018, 9:63-73)。N297G為IgG1抗體之去醣基化形式，其中Asn經Gly取代。在R2M13-26人源化N297之情況下，N297對應於胺基酸N302，因此N297G突變可替代地稱為N302G。LALAPG代表IgG1之Fc域中的三種突變。使用典型IgG1序列編號，使Leu234及Leu235突變成Ala；類似地，Pro329突變為Gly。因此，Fc域中之此三突變體被稱為「LALAPG」。在R2M13-h26之情況下，此等突變分別在序列位置239、240及334中。VHH26-H5經由五個胺基酸的連接子融合至R2M13抗體之輕鏈的N端，因此產生包含R2M13抗體之IgG樣分子，其中VHH位於兩條抗體輕鏈之N端。

R2M13重鏈IgG及R2M13輕鏈之序列藉由存在於各種Wnt促效劑中之胺基酸連接子與各種LRP5/6 VHH結合域融合，提供於表3中。不具有LALPG或N297G修飾之親體R2M13-03、R2M13-26、R2M13-36 Wnt促效劑中存在之重鏈及輕鏈序列在PCT申請公開案第WO2019/126398號中以SEQ ID NOs: 136-138 (各別地輕鏈)及SEQ ID NO:153 (重鏈)提供，其以全文引用的方式併入本文中。指定Wnt促效劑包括呈抗體型形式之重鏈中之兩者及輕鏈中之兩者，其中該等鏈經由二硫鍵連接。表 1 ： 親體序列 及 VHH26 之 六個人源化變異體

名稱	序列
VHH26_H1 (SEQ ID NO: 19)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFAIYDIAWVRQAPGKGLEWVSMIRPVVTEIDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKKRPWGSRDEYWGQGTTVTVSS
VHH26_H2(SEQ ID NO: 20)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGRIFAIYDIAWYRQAPGKGLEWVAMIRPVVTEIDYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNAKRPWGSRDEYWGQGTTVTVSS
VHH26_H3(SEQ ID NO: 21)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGRIFAIYDIAWYRQAPGKGREWVAMIRPVVTEIDYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNAKRPWGSRDEYWGQGTTVTVSS
VHH26_H4(SEQ ID NO: 22)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGRIFAIYDIAWYRQAPGKGRELVAMIRPVVTEIDYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNAKRPWGSRDEYWGQGTTVTVSS
VHH26_H5(SEQ ID NO: 23)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGRIFAIYDIAWYRQAPGKGREWVAMIRPVVTEIDYADSVKGRFTISRDNSKKTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNAKRPWGSRDEYWGQGTTVTVSS
VHH26_H6(SEQ ID NO: 24)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGRIFAIYDIAWYRQAPGKGRELVAMIRPVVTEIDYADSVKGRFTISRDNSKKTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNAKRPWGSRDEYWGQGTTVTVSS
VHH26 (親體) (SEQ ID NO: 25)	DVQLVESGGGLVQAGGSLRLACAGSGRIFAIYDIAWYRHPPGNQRELVAMIRPVVTEIDYADSVKGRFTISRNNAMKTVYLQMNNLKPEDTAVYYCNAKRPWGSRDEYWGQGTQVTVSS

表2：VHH26構築體與Lrp6E3E4域之間相互作用的動力學參數

構築體名稱	SEC 部分	kon	koff	KD nM
VHH26-H1	C3	1.42E+04	3.98E-03	281
VHH26-H2	G3	2.44E+05	6.84E-02	280
VHH26-H3	C3	1.84E+04	7.75E-03	422
VHH26-H4	G3	2.90E+04	5.56E-03	192
VHH26-H5	C3	1.35E+05	1.47E-02	109
VHH26-H6	G3	1.72E+04	8.36E-03	486
VHH26 (親體)	D3	1.05E+06	1.82E-02	17
VHH26-H1	C1	ND	ND	ND
VHH26-H2	G1	1.48E+05	6.53E-02	441
VHH26-H3	C1	1.63E+04	5.22E-02	3203
VHH26-H4	G1	1.44E+05	9.51E-02	662
VHH26-H5	C1	4.28E+05	1.77E-02	41
VHH26-H6	G1	4.52E+04	3.11E-02	687
VHH26 (親體)	D3	8.10E+05	1.77E-02	22

表3：Wnt促效劑重鏈及輕鏈之序列.

Wnt 促效劑	重鏈(HC) 及輕鏈(LC) 序列(R2M13 抗體之LC 帶下劃線；連接子呈粗體；VHH 域無加粗或帶下劃線))
R2M13-03親體LALAPG	HC ( SEQ ID NO: 1) EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTYRYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTGNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSMVRVPYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LC ( SEQ ID NO: 2) DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTSSANINSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYAGSLKGRFTMSTESAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCYVKLRDDDYVYRGQGTQVTVSS GGSGSGSG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
R2M13-03人源化LALAPG	HC ( SEQ ID NO: 3) EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTYRYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTGNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSMVRVPYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LC ( SEQ ID NO: 4) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDEDYVYRGQGTQVTVSS GGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
R2M13-03人源化N297G	HC ( SEQ ID NO: 5) EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTYRYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTGNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSMVRVPYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LC ( SEQ ID NO: 6) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDEDYVYRGQGTQVTVSS GGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
R2M13-26親體LALAPG (R2M13-26)	HC ( SEQ ID NO: 7) EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTYRYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTGNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSMVRVPYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LC ( SEQ ID NO: 8) DVQLVESGGGLVQAGGSLRLACAGSGRIFAIYDIAWYRHPPGNQRELVAMIRPVVTEIDYADSVKGRFTISRNNAMKTVYLQMNNLKPEDTAVYYCNAKRPWGSRDEYWGQGTQVTVSS GSGSG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
R2M13-26人源化LALAPG (R2M13-h26)	HC ( SEQ ID NO: 9) EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTYRYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTGNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSMVRVPYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LC ( SEQ ID NO: 10) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGRIFAIYDIAWYRQAPGKGREWVAMIRPVVTEIDYADSVKGRFTISRDNSKKTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNAKRPWGSRDEYWGQGTTVTVSS GGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
R2M13-26人源化N297G	HC ( SEQ ID NO: 11) EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTYRYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTGNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSMVRVPYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LC ( SEQ ID NO: 12) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGRIFAIYDIAWYRQAPGKGREWVAMIRPVVTEIDYADSVKGRFTISRDNSKKTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNAKRPWGSRDEYWGQGTTVTVSS GGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
R2M13-36親體LALAPG	HC ( SEQ ID NO: 13) EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTYRYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTGNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSMVRVPYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LC ( SEQ ID NO: 14) QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSIYDMGWFRQAPGKEREFVSGIRWSGGTSYADSVKGRFTISKDNAKNTIYLQMNNLKAEDTAVYYCGSRGYWGQGTLVTVSS GSGSG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
R2M13-36人源化LALAPG	HC ( SEQ ID NO: 15) EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTYRYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTGNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSMVRVPYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LC ( SEQ ID NO: 16) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSIYDMGWFRQAPGKEREFVSGIRWSGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTIYLQMNSLRAEDTAVYYCGSRGYWGQGTLVTVSS GGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
R2M13-36人源化N297G	HC ( SEQ ID NO: 17) EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTYRYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTGNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSMVRVPYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK LC ( SEQ ID NO: 18) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSIYDMGWFRQAPGKEREFVSGIRWSGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTIYLQMNSLRAEDTAVYYCGSRGYWGQGTLVTVSS GGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

使用超TOPFlash螢光素酶報導子(STF)分析確定Wnt促效劑之活性，其中Fzd結合物R2M13與在完全工程化Wnt促效劑形式之情況下的各種人源化Lrp結合域配對，其量測Wnt反應Huh-7報導體細胞株(Huh-7STF)中之典型Wnt傳訊之活化。結果展示於圖 4中。R2M13-人源化_26-LALAPG構築體(「R2M13-26人源化LALAPG」；在本文中亦稱為R2M13-h26、R2M13-h26-LALAPG或人源化LALPG)展現出人源化Lrp結合域之最高活性。R2M13-人源化_26-N297G構築體(R2M13-26人源化N297G；人源化N297G)係不穩定的。當與R2M13配對時，VHH03及VHH36之人源化顯著降低活體外效能，但其絕對EC50值與與R2M13配對之VHH26類似。R2M13-人源化_26-LALAPG構築體之重鏈及輕鏈序列(R2M13-h26)展示於圖 6中。構築體包含藉由二硫鍵結合之兩條重鏈及兩條輕鏈。Fc域中之LALAPG突變移除效應功能(參見例如Wang等人. (2018) Protein Cell.9:63-73)。展示R2M13-h26構築體之各種域，且其他構築體之域可容易地基於此等而確定。實例3 DSS急性結腸炎動物模型中之工程化Wnt促效劑的劑量反應

此研究之目標為檢查揭示於美國專利申請公開案第2020-0308287號中之Fzd5,8特異性Wnt模擬物R2M13-26之功效及其在急性DSS結腸炎小鼠模型中之劑量反應，表徵具有不同劑量及頻率之R2M13-26之活體內活性，在急性DSS結腸炎小鼠模型中表徵具有不同劑量及頻率之R2M13-26之活體內活性，且評估R2M13-26對以下之影響：1)體重、糞便評分及潛血，2)藉由組織學之上皮組織/屏障修復，及3)血清及結腸中之發炎性細胞介素。

六-八週齡C57Bl/6J雌性小鼠(總共86)係獲自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME，USA)且以5隻/籠圈養。所有動物實驗均根據國家科學院(National Academy of Sciences)制定的「實驗動物照護及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)」之標準進行。動物實驗之方案均由Surrozen機構動物護理及使用委員會批准。

為了誘導急性結腸炎，7至8週齡雌性小鼠隨意給予含有4.0% (w/v)硫酸葡聚糖鈉(DSS，MP Biomedicals，MFCD00081551)之飲用水持續7天，接著給予含有1.0% (w/v) DSS之飲用水持續3天。各組小鼠未經處理、經同型對照抗體(抗GFP)處理或在第4天經指定工程化Wnt促效劑處理一次或在第4天及第7天處理兩次。

在1、3、10、30 mg/kg下每週一次及在0.3、1、3、10 mg/kg下每週兩次R2M13-26處理降低急性DSS小鼠模型中之疾病活動性指數(DAI)。始於1 mg/kg R2M13-26之單次劑量或每週兩次劑量能夠修復受損結腸上皮組織，改進組織學評分。自1 mg/kg R2M13-26起始之單次劑量或每週兩次劑量能夠降低血清發炎性細胞介素及結腸細胞因子含量。

此研究確認單獨Fzd5,8特異性Wnt模擬物(R2M13-26)能夠在急性DSS小鼠模型中改進疾病活動性指數、修復受損結腸上皮組織且降低結腸及血清中之發炎性細胞介素含量。總體而言，R2M13-26，在治療之寬劑量範圍下，改進糞便評分及體重，修復受損結腸上皮組織，且在急性小鼠IBD模型(急性DSS)中降低結腸及血清中之發炎性細胞介素含量。實例4 DSS急性結腸炎動物模型中之工程化Wnt促效劑修復受損結腸上皮組織

如圖 7中所概述，在急性結腸炎DSS模型中測試各種工程化人源化Wnt促效劑。所測試之構築體包括非人源化及人源化型式，其包括：R2M13-03-LALAPG、R2M13-26-LALAPG、R2M13-36-LALAPG、R2M13-人源化-03-LALAPG、R2M13-人源化-26-LALAPG、R2M13-人源化-36-LALAPG、R2M13-人源化-03-N297G及R2M13-人源化-36-N297G。

六週齡C57Bl/6J雌性小鼠(總共96)係獲自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME，USA)且以5隻/籠圈養。所有動物實驗均根據國家科學院(National Academy of Sciences)制定的「實驗動物照護及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)」之標準進行。動物實驗之方案均由Surrozen機構動物護理及使用委員會批准。在起始實驗之前，使小鼠適應最少兩天。將小鼠在30%至70%濕度環境及範圍自20℃至26℃之室溫中保持12/12小時亮/暗循環。

為了誘導急性結腸炎，7至8週齡雌性小鼠隨意給予含有4.0% (w/v)硫酸葡聚糖鈉(DSS，MP Biomedicals，MFCD00081551)之飲用水持續7天，接著給予含有1.0% (w/v) DSS之飲用水再3天( 圖 7)。各組小鼠未經處理、經同型對照抗體(抗GFP)處理或在第4天及第7天經1 mg/kg指定工程化Wnt促效劑處理。所有蛋白質處理展示處死時類似的血清抗體暴露( 圖 7)。

經歷DSS的經對照處理之動物出現嚴重結腸炎，其特徵為嚴重及持久體重減輕及出血腹瀉，引起如由糞便評分表示之疾病活動性指數增加。用LALAPG或N297G形式之人類化R2M13-26及人類化R2M13-36處理顯著提高DSS小鼠之體重。相比於親體構築體，利用人源化R2M13-36-LALAPG，體重顯著提高。此等構築體亦會顯著降低DSS小鼠中之疾病活動性指數(DAI) ( 圖 8)；降低DSS小鼠中之糞便評分；增加DSS小鼠中之結腸長度及糞便；且增加DSS小鼠中之結腸長度及重量。此外，人源化R2M13-26 (H-LALAPG 26)及人源化R2M13-36 (H-LALAPG 36)降低發炎性細胞介素、腫瘤壞死因子α (TNF-α)、介白素-6 (IL-6)及介白素-8 (IL-8) ( 圖 9)及脂質運載蛋白-2之血清含量，其在DSS處理組中升高( 圖 10)。相比於親體構築體，利用人源化R2M13-36-LALAPG，體重顯著提高。此外，表明人源化R2M13-26-LALAPG (R2M13-h26-LALAPG)活體內恢復上皮緊密型連結標記物ZO-1 ( 圖 11)、修復受損結腸上皮組織( 圖 12)且恢復上皮細胞譜系，包括結腸上皮細胞、杯狀細胞及簇細胞( 圖 13)。因此，人源化R2M13-26及人源化R2M13-36兩者均顯示在DSS小鼠中之良好功效。實例5 工程化Wnt促效劑之藥物動力學(PK)

在靜脈內注射之後親體R2M13-26 (R2M13-26-LALAPG)及人源化R2M13-26 (R2M13-h26-LALAPG)之藥物動力學(PK)藉由量測在投與大鼠之後各時間時且與自小鼠獲得之資料相比血清中之抗體量確定( 圖 14)。人源化R2M13-26 (R2M13-h26)之Cmax高於針對R2M13-26 (R2M13-26)之Cmax，所以差異隨著時間推移延續；然而，倍差隨著時間推移增加。人源化R2M13-26之清除(25.3 mL/天/kg)低於親體R2M13-26 (40.0mL/天/kg)，且人源化R2M13-26之半衰期(3.75天)長於親體R2M13-26 (2.47天)。實例6 DSS慢性結腸炎模型中之工程化Wnt促效劑的評估

由於R2M13-26處理改善DSS模型中之急性結腸炎(實例3)，在重複循環的DSS清除之不同時間點時工程化Wnt促效劑R2M13-26係在慢性結腸炎之DSS模型中測試，以證明工程化Wnt促效劑在慢性結腸炎模型中之功效。

六至八週齡C57Bl/6J雌性小鼠係獲自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME，USA)且以4-5隻/籠圈養。所有動物實驗均根據國家科學院(National Academy of Sciences)制定的「實驗動物照護及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)」之標準進行。動物實驗之方案均由Surrozen機構動物護理及使用委員會批准。

為了誘導慢性結腸炎，雌性小鼠隨意給予含有3.0% (w/v)硫酸葡聚糖鈉(DSS，MP Biomedicals，MFCD00081551)之飲用水持續5天，接著給予純飲用水持續7天。各組小鼠經同型對照抗體(抗GFP)處理，或在第16、19、28及31天以10 mg/kg用4劑量之R2M13-26-LALAPG (R2M13-26)處理。動物在第33天處死。

R2M13-26處理改進慢性DSS模型中之體重及疾病活動性指數。R2M13-26亦改進結腸組織學。另外，R2M13-26在研究結束時在第33天降低血清發炎介體IL-6及脂質運載蛋白-2 (資料未示出)。實例7 工程化Wnt促效劑對DSS急性結腸炎模型之影響

實例3及4證明Fzd5,8特異性R2M13-26及R2M13-h26 Wnt促效劑在治療急性小鼠結腸炎(急性DSS)模型中為有效的。此研究之目標為研發在整個使用類似模型系統之修復過程中對R2M13-26影響結腸中之細胞所藉由之作用機制的更全面理解。

六至七週齡C57Bl/6J雌性小鼠係獲自Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME, USA)且以4-5隻/籠圈養。所有動物實驗均根據國家科學院(National Academy of Sciences)制定的「實驗動物照護及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)」之標準進行。動物實驗之方案均由Surrozen機構動物護理及使用委員會批准。

為了誘導急性結腸炎，雌性小鼠隨意給予含有4.0% (w/v)硫酸葡聚糖鈉(DSS, MP Biomedicals, MFCD00081551)之飲用水持續7天，且給予含有1.0% (w/v) DSS之飲用水持續3天。各組小鼠未經處理、經對照抗體(抗GFP)處理，或在第4天經單次腹膜內注射R2M13-26-LALAPG (R2M13-26)處理。將總計123隻小鼠分組：(第3天=13、第4天=13、第5天=26、第6天=24、第7天=26、第10天=21)，其中91隻用於組織學終點，且21隻用於scRNA-seq (因機械而消除之組)。量測每日食物攝入、BW、糞便評分及潛血。在處死時，小鼠如下處理：組A-E：收集橫結腸用於qPCR及組織學(在第3天、第4天處死組A；在第3天、第4天、第5天、第6天、第7天處死組C；且在第5天、第6天、第7天及第10天處死組B、D及E)。分析/終點包括RT-qPCR、組織學、scRNA-seq、糞便稠度及潛血之糞便評分、疾病活動性指數(DAI) = (BW損失+ 糞便稠度 + 血液) / 3、血清發炎性細胞介素(TNF-a、IL-6、脂質運載蛋白2)及解剖病理學：升結腸、橫結腸以及降結腸，H&E。組織病理學評分準則包括：發炎嚴重程度、發炎延伸、黏膜沖蝕、腺管增殖及杯狀細胞損失。

在第3天至第7天，在PBS與用抗DSS之抗GFP處理之間未觀測到差異(資料未示出)。然而，R2M13-26處理在5天至10天時展現出更健康的結腸組織，其中在經R2M13-26處理之動物中，第7天具有明顯的組織學改善(資料未示出)。R2M13-26改進DSS小鼠中之糞便評分及BW損失(資料未示出)，由此改善小鼠中之實驗性結腸炎。

對主體結腸樣品進行RT-qPCR分析以評估基因表現之變化。Wnt誘導之檢查顯示具有DSS之軸蛋白2顯著減少。在無DSS情況下R2M13-26誘導軸蛋白2之表現。增殖標記物之檢查顯示具有DSS之Ki67在第4天顯著降低且被R2M13-26救援。R2M13-26在DSS存在下拯救Cdk1下調。對幹細胞標記物之分析顯示Lrig1在第4天隨著DSS顯著減少，且被R2M13-h26救援。關於IBD之臨床標記物，在第5天及第6天可見Gpx2顯著上調。

對於檢查DSS模型中之基因表現的scRNA-seq實驗，在整個實驗期間，小鼠在其飲用水以含4% DSS處理。經DSS處理之動物在DSS處理之第4天，給予10 mpk R2M13-26或抗GFP抗體。在第5天及第6天，分別在給藥後24小時及48小時時，收集各給予Wnt促效劑及抗GFP動物中之三者。亦在第5天及第6天時間點收集兩隻未處理、未受損傷動物樣品。在處死時收集結腸、小腸、脾臟及肝臟組織，且檢驗或冷凍以進行mRNA分析。對新鮮橫結腸樣品進行單細胞RNA定序(scRNA-seq)以分離單細胞，且對新鮮橫結腸進行RT-qPCR以分離僅上皮細胞。

自各動物分離橫結腸且去除糞便。在冷PBS中短暫洗滌之後，縱向切割結腸以打開管進入平坦薄片，且將組織切割成3-4 mm長度的片段。在37℃下在含有5 mM EDTA之振盪器的預溫熱(37℃) PBS中在150 rpm下培育組織片段15分鐘。15分鐘後，劇烈振盪含有樣品之試管10秒，以釋放更多上皮細胞。將懸浮液中浮動之上皮細胞移至新試管，且在200 rcf下離心兩分鐘以集結自組織中解離之上皮細胞。含有剩餘上皮及固有層之殘留組織隨後在37℃下在以150 rpm水平振盪下在8-12.5 mL固有層解離緩衝液中培育30分鐘。在沈澱之後，上皮細胞再懸浮於1 mL具有DNase1之TrypLE中，且上皮細胞在37℃下培育約八分鐘且用P1000移液管濕磨約25次。在濕磨之後，在500 rcf，4℃下離心上皮細胞，且移除上清液。隨後上皮細胞在FACS緩衝液中洗滌一次，之後再進行離心且最終再懸浮於0.5 mL FACS緩衝液中。在LP解離緩衝液中解離30分鐘後，使剩餘組織片段及懸浮液在500 rcf下離心五分鐘。將上清液移除降至1 mL，且用P1000濕磨樣品，直至溶液為均質的且所有組織片段均已解離。濕磨之後，將樣品在4℃下在500 rcf下離心5分鐘，且在FACS緩衝液中洗滌，之後再懸浮於1 mL FACS緩衝液中準備用於FACS。

所有細胞在FACS之前均通過40微米過濾器。使用DAPI藉由FACS評估存活率，且僅收集活(DAPI陰性)細胞。自上皮部分收集細胞，且隨後自上皮/固有層部分收集細胞，且將該等細胞合併且在細胞捕獲之前在血球計上計數。遵循標準10x Genomics 3' v3 scRNA-seq方案，且每個通道加載大致4500-5000個細胞。每個通道捕獲來自個別動物之樣品。遵循標準10x Genomics 3' v3 scRNA-seq RT、cDNA擴增及定序庫製備方案。在Illumina Nova Seq 6000 S1泳道上對經多工定序庫進行定序。

使用10x Genomics Cellranger管線處理Illumina讀段資料。隨後評定經解多工UMI計數資料，且移除低品質細胞及低表現基因。UMI計數資料使用來自R程式包 scran之解卷積縮放標準化，且使用基於SNN圖示之聚集方法，使用R程式包 scran對細胞進行集群。使用已建立之細胞類型標記物確定細胞類型標識。藉由使用R程式包叢集實驗進行EdgeR，在各譜系內使用一次相對於所有及成對比較，在各集群之單細胞水準下進行差異基因表現。在基於譜系水準或在細胞類型/集群水準下聚集生物複製樣品之後，用R程式包 edgeR對偽批量樣品進行實驗條件之間的差異基因表現分析。沿著上皮譜系且在代表各時間點(24小時或48小時)之上皮譜系內之上皮譜系內之細胞類型的個別叢集內，在實驗條件(DSS受傷相對於未受傷，且隨後在經R2M13-26處理相較於抗GFP處理之DSS損傷樣品內)之間執行差異性表現比較。

R2M13-26主要藉由直接影響結腸之上皮細胞發揮其作用，因為FZD5對腸道上皮細胞之高表現及其在幹細胞及前驅細胞群體中之富集。當比較整個上皮譜系之表現及含有R2M13-26與對照處理之間的所有細胞類型時，以下Wnt目標基因增加(表7)。若其在治療與對照之間在整個上皮譜系中顯示至少兩倍增加，則選擇分子，且其已顯示為文獻中之直接Wnt目標。大部分Wnt目標基因獲自Gougelet等人中公開之基因操控及染色體免疫沈澱實驗(2014)。額外scRNA-seq資料展示於表4-6及8中。

除研究展現整個上皮譜系中之顯著變化之分子以外，scRNA-seq資料用於檢查特定細胞類型且比較經R2M13-26處理之細胞與經對照處理之細胞之間的基因表現，以鑑別在上皮譜系內之各相關細胞類型中增加或減少之Wnt目標基因。針對以下相關上皮細胞類型進行此類型差異性表現分析：幹細胞、TA1、TA2、基礎杯狀細胞、損傷誘發之替代性前驅細胞(AltEnteroPC)、損傷誘發之替代性腸上皮細胞(AltEntero)、腸上皮細胞前驅細胞(EnteroPrecur)、杯狀細胞1、杯狀細胞2、腸道內分泌細胞或簇細胞。在作為整體之上皮譜系中及/或在特定上皮亞型中以實例log2倍數變化調節之Wnt目標基因之組合清單顯示於表7中。scRNA-seq實驗中偵測到之上皮細胞的熱圖在圖 26B中所示。

相較於聚集上皮譜系及/或含有R2M13-26與對照處理之間的細胞類型中之任一者的表現，多種分子鑑別為顯著增加或減少。若其在處理與對照之間在上皮譜系中或在IBD之急性DSS小鼠模型中之至少一種上皮細胞類型內展示至少兩倍改變，則選擇分子。此等分子展示於表4-8中。

在用R2M13-26處理之後增加之基因與建立之細胞週期基因之清單相交(Giotti等人., 2019)以鑑別涉及藉由用R2M13-26處理增加之細胞週期進程及調節之基因。所鑑別之基因列於表4中。Wnt傳訊之所建立角色中之一者為維持幹細胞及祖細胞，且調節細胞週期為該功能之重要態樣(Davidson, 2010; Hirata 2013)。R2M13-26促進受損結腸上皮細胞中之幹細胞及祖細胞擴增，其對於其再生上皮細胞之能力為至關重要的。此等資料表明，此等基因中之若干者亦為直接Wnt目標(表8)。

除促進幹細胞及前驅細胞之擴增以促進上皮組織再生以外，Wnt傳訊對於維持及更新幹細胞及前驅細胞池及調節其分化為關鍵的(Pinto et al., 2003; Ma et al., 2016)。R2M13-26藉由維持幹細胞及前驅細胞來促進上皮組織之修復及再生，其由參與此過程之若干關鍵基因的增加表現證明(表8)，包括Id1 (Hollnagel 1999; Meteoglu 2008; Ruzinova 2003)、Nhp2 (Fong 2014; McCann 2020)及Hmga2 (Nishino 2008; Parisi 2020)、Foxq1 (Tu 2018; Zhang 2018)及Aldh1 (Tomita 2016)。此外，對於Areg，EGFR傳訊之配位體(其對於腸道幹細胞生態棲位維持為重要的)之表現亦存在影響(Fujii 2008; Mahtouk 2005; Suzuki 2010; Takahashi 2020)。誘發且顯示R2M13-26處理後若干幹細胞及前驅細胞中之顯著增加表現的另一受關注之分子為升糖素(Gcg)。升糖素可加工成多種較小肽，其中為GLP-1及GLP-2，其在減少IBD中之發炎中起作用。GLP-2亦充當生長因子以促進上皮隱窩之幹細胞及前驅細胞增殖及再生(Drucker 1999; Markovic 2019; Zatorski 2019)。此等資料顯示Wnt傳訊活化增加升糖素之表現，其將引起GLP-2之含量增加且促進幹細胞及前驅細胞之擴增。

除改變幹細胞及前驅細胞自體更新及分化之外，組織修復及上皮再生之關鍵態樣中之一者為細胞內及細胞外損傷之修復及上皮障壁之重建。為此目的，在R2M13-26處理後所誘導及/或增加之若干基因與此等製程相關(表6)。舉例而言，Apex1對於DNA修復至關重要(Park 2014)。黏液產生中之功能障礙及黏液障壁為IBD之關鍵態樣(Antoni 2014; Dorofeyev 2013; Kim, Ho 2010)。若干基因藉由用R2M13-26處理而增加，促進黏液分泌且產生黏液屏障(B3gnt7、Agr2、Muc2、Muc3、Tff3、Fcgbp及Zg16)。此等基因在黏液產生、處理及黏液分泌中起重要作用(Agr2：Bergstrom 2014；Park 2009；B3gnt7：Arike 2017；Fcgbp：van der Post 2019；Muc2、Muc3：Arike 2017；Svensson 2018；Kim 2010；Ho 2006；Tff3：Aihara 2017；Zg16：Bergstrom 2016。另外，涉及上皮屏障形成之小富含脯胺酸之重複蛋白質的成員Sprr2a3 (Gibbs 1993)富集。

重要的是，許多此等基因之表現減少或損失與小鼠模型中之結腸炎之嚴重程度增加及/或IBD之發展及進展相關(Dorofeyev 2013; van der Post 2019)。舉例而言，MUC2、MUC3及TFF3在重度CD及UC中之表現降低(Dorofeyev 2012)。在小鼠結腸炎模型中，MUC2降低使小鼠更可接受DSS誘導之結腸炎(Kim, Ho 2010)。此外，GWAS研究已鑑別出似乎降低其表現為促進IBD之Agr2的風險對偶基因(Zheng 2006)。

除了藉由調節幹細胞及祖細胞增殖及分化、細胞修復及屏障形成來影響上皮修復及再生以外，R2M13-26亦促進與減少損傷及IBD中之發炎反應相關的許多基因及路徑之表現(表5)。此等分子具有消炎作用及/或其減少與IBD之炎症或惡化增加相關。

R2M13-26處理組在注射後24小時及48小時時展現出血清抗體濃度之劑量反應，且R2M13-26在1、3及10 mpk給藥時顯示線性。R2M13-26在單次腹膜內注射後兩天增加軸蛋白2及Ki67表現(圖25)，且R2M13-26在注射後兩天增加LGR5表現。R2M13-26處理在注射後2天增加緊連蛋白表現。實例8 DSS結腸炎模型中工程化Wnt促效劑相比於其他藥劑之評估

實例3及4證明Fzd5,8特異性R2M13-26及R2M13-h26對治療急性小鼠結腸炎(急性DSS)模型有效，且實例6證明R2M13-26對治療慢性小鼠結腸炎(慢性DSS)模型有效。此研究之目標為比較R2M13-h26治療結腸炎模型之有效性與其他藥劑，包括環孢素A、抗TNF抗體及抗IL-12/23抗體之有效性。六至七週齡C57Bl/6J雌性小鼠係獲自傑克遜實驗室(Bar Harbor, ME, USA)且以4-5隻/籠圈養。所有動物實驗均根據國家科學院制定的「實驗動物照護及使用指南」之標準進行。動物實驗之方案均由Surrozen機構動物護理及使用委員會批准。

使用環孢素A之研究概述於圖 15中。為了誘導急性結腸炎，向雌性小鼠隨意給予含有4.0% (w/v)硫酸葡聚糖鈉(DSS, MP Biomedicals, MFCD00081551)之飲用水持續7天，且給予含有1.0% (w/v) DSS之飲用水持續3天。小鼠組未經治療，用同型對照抗體(抗GFP)治療，或在第4天一次I.P.注射指定劑量之R2M13-h26，或在第4天及第7天注射兩次進行治療，或用如圖所示之環孢素A。

R2M13-h26治療比環孢靈A更能改善體重、降低糞便評分及降低疾病活動性指數(DAI) ( 圖 16)。另外，R2M13-h26比環孢靈A更有效地在活體內修復結腸上皮( 圖 17)，改善結腸組織學評分(資料未示出)，且比環孢素A更多地降低發炎性細胞介素之血清含量(資料未示出)。總體而言，R2M13-h26在劑量低至1 mg/kg一週兩次或2 mg/kg單次劑量下對結腸上皮細胞的修復、組織學及疾病活動性指數(DAI)的改善以及發炎性細胞介素的減少展示功效。環孢素A在降低DAI及脂質運載蛋白-2方面展示輕微作用，且通常遠不如R2M13-h26有效。

在慢性DSS模型中比較R2M13-h26與抗TNF之研究概述於圖 18中。向小鼠投與3% DSS三個7天週期，間隔休息7天，接著為3天1% DSS清除期，導致慢性腸上皮損傷。R2M13-h26治療以1、3或10 mpk投與，持續2、4或6次注射。抗TNF以5或25 mpk投與，持續4或7次注射。在第38天進行讀取。

在慢性DSS結腸炎模型中，R2M13-h26比抗TNF更有效地修復結腸上皮( 圖 19)。R2M13-h26降低結腸組織學評分、改善體重、降低糞便評分且降低DAI，而抗TNF對此等疾病參數無影響( 圖 20及資料未顯示)。在慢性活體內模型中，R2M13-h26亦比抗TNF更多地降低血清發炎性細胞介素含量、脂質運載蛋白-2及IL-6 ( 圖 21)。在慢性小鼠IBD模型(慢性DSS，在38天內有3個重複的DSS損傷週期)中，Fzd5,8特異性R2M13-h26在各種給藥方案(4個1 mg/kg劑量至2、4、或6個10 mg/kg劑量)下對結腸上皮的修復、組織學及疾病活動性指數的改善以及發炎性細胞介素的減少均能夠達到顯著效果。相比之下，抗TNF Ab未能改善慢性DSS小鼠之上皮損傷或DAI。

亦在慢性DSS結腸炎小鼠模型中關於以下各者檢查了抗IL12/23p40相對於R2M13-h26之功效：1)體重、糞便評分及潛血，2)組織學上皮/障壁修復，及3)血清發炎性細胞介素。用三個週期之3.0%葡聚糖硫酸鈉(DSS)治療6-8週齡雌性C57BL/6小鼠，以誘導慢性結腸炎，如圖 22中所概述。前兩個週期由7天DSS及7天無DSS的水組成，且第三個週期包含7天3% DSS及3天1% DSS。R2M13-h26治療以0.1及1 mpk投與，持續4次注射。抗IL 12/23以3或10 mpk投與，持續4或8次注射。抗IL12/23p40為來自Invivoplus Bioxcell之純系C17.8。在第38天進行讀取。

R2M13-h26治療降低了慢性DSS小鼠模型中之疾病活動性指數(DAI)，而抗IL12/23p40治療則未如此( 圖 23)。此外，R2M13-h26治療比抗IL12/23更有效地降低血清細胞介素含量( 圖 24)。此研究證實，在慢性DSS小鼠模型中，R2M13-h26能夠修復受損的結腸上皮且降低血清發炎性細胞介素含量，而BioXcell之抗IL12/23p40單株抗體則不能。實例9 工程化Wnt促效劑對Wnt路徑活化及炎症減輕的影響 選擇性 Wnt 路徑活化

Fzd5展示為高度表現於由葡聚糖硫酸鈉或DSS誘導之結腸炎小鼠模型的結腸中。在此模型中，DSS暴露導致腸障壁的破裂，導致與IBD患者中所見類似的炎症反應。觀測到R2M13-h26與DSS損傷的腸細胞結合，刺激Wnt傳訊，如藉由 Axin2(Wnt路徑中之下游目標基因)之表現所量測，恢復組織結構、上皮細胞類型組成及上皮障壁功能。暴露於DSS七天之小鼠導致腸障壁的破裂，其可在結腸之染色橫截面中容易地觀測到。在不存在DSS之情況下，腸壁完整，且隱窩緊密排列以形成連續結構。暴露於DSS，接著用陰性對照抗體抗GFP治療會產生多種影響：腸壁破裂；結腸隱窩收縮；且截至第十天產生多個不連續段。然而，用在第四天及第七天投與之R2M13-h26治療之DSS暴露小鼠引起此損傷之劑量依賴性修復，1 mg/kg或更高的劑量可恢復組織學可見的大部分損傷。在慢性DSS模型中觀測到類似結果。使用R2M13-h26藉由組織學量測之上皮修復程度高於使用環孢靈A、抗TNF抗體或抗IL12/23抗體之額外實驗中獲得的程度。

組織學染色顯示，用R2M13-26及R2M13-h26投藥進行治療使得緊密連接標記恢復，該等標記為有助於阻止腸道與腹腔之間的自由物質交換之腸障壁的細胞間結構。在健康腸組織中，發現閉鎖小帶(zonula occludens) 1蛋白或ZO-1 (緊密連接之組分)為沿著腸刷狀緣之連續層。在DSS損傷之腸組織中，ZO-1之連續表現模式被破壞。用R2M13-h26-LALAPG治療使ZO-1定位恢復為沿著腸刷狀緣之連續層( 圖 11)。

炎症減輕

在小鼠DSS模型中，用R2M13-h26投藥進行治療引起多種發炎性細胞介素，諸如TNFα、介白素-6或IL-6及介白素-8或IL-8之顯著劑量依賴性減少。在結腸組織及血清中均觀測到細胞介素含量的減少(資料未示出)。此等結果表明，R2M13-h26不僅具有直接修復上皮之潛力，且亦因此具有減輕炎症之潛力。實例10 用Wnt模擬物治療可快速修復DSS損傷之結腸上皮

各種葡聚糖亞硫酸鈉(DSS)誘導之結腸炎模型被廣泛用作臨床前模型，以研究旨在治療潰瘍性結腸炎之治療化合物及生物製劑的功效。建立急性重症DSS小鼠模型以研究Wnt信號活化對上皮修復的影響(參見WO 2020/185960A1，以全文引用之方式併入本文中)。在此模型中，前七天使用高百分比之DSS (4%)來觸發結腸上皮損傷。接著將動物維持在1% DSS直至第10天取下，以維持已建立的損傷且最大限度地減少上皮之自發修復。與先前報導之DSS 研究一致(Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S.及Sedergran, D. J. (1993). Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Laboratory Investigation, 69(2), 238-249)，在第4天，蘇木精及曙紅(H&E)染色可見結腸上皮損傷，且繼續進展至第7天(參見WO 2020/185960A1)。RNAscope原位雜交分析顯示結腸上皮及周圍間質細胞層中Wnt目標基因 Axin2、 Lgr5、 Rnf43以及Wnt配位體 Wnt2b及 Wnt5a之mRNA表現分別降低。結腸隱窩下方之間質細胞中主要的小鼠腸R-脊椎蛋白 Rspo3之mRNA表現不受DSS影響(參見WO 2020/185960A1)。

在已建立之DSS模型中，向小鼠注射兩劑R2M3-26或靶向FZD1、2、5、7、8及LRP6之Wnt模擬物，在Fowler等人(Fowler, T. W等人, (2021). Development of selective bispecific Wnt mimetics for bone loss and repair. Nature Communications, 12(1). https://doi.org/10.1038/s41467-021-23374-8)中稱為FA-L6，注射自第4天開始，此時DSS對上皮之損傷已可見，接著在第7天注射另一劑量，且在第10天評估其對上皮修復之影響，治療為期6天。與PBS或抗GFP對照治療相比，經R2M3-26治療之結腸類似於未經DSS治療之結腸，恢復了具有較少組織炎症之隱窩結構(參見WO 2020/185960A1)。結腸組織由對治療不知情的病理學家檢查，且對常見的結腸炎病理特徵進行評分(參見實例1中所述之方法)。組織學評分一致顯示R2M3-26有效修復了DSS損傷之結腸組織，將結腸炎評分自4.75降低至2.0 (參見WO 2020/185960A1)。

由於先前報導RSPO改善DSS誘導之小鼠結腸炎(Zhao等人, 2007)，因此亦檢查RSPO2在本文所述之DSS小鼠模型中的作用。自DSS治療之第4天開始，每週兩次或每天一次IP注射RSPO2。雖然在RSPO2治療之情況下觀測到對受損結腸上皮的修復，但與R2M3-26之作用相比，作用不太顯著。類似地，R2M3-26及RSPO2之組合療法，無論每週兩次及每天兩次，均恢復結腸隱窩結構且改善結腸組織學，但程度低於單獨的R2M3-26 (參見WO 2020/185960A1)。

先前顯示單獨RSPO或RSPO及Wnt模擬物18R5-DKK1c之組合療法刺激小腸幹細胞及瞬時擴增(TA)細胞的過度增殖，導致正常小鼠小腸隱窩及絨毛長度的生長(Yan Kelley S.等人, 2017)。在本文所述之DSS模型中，在第10天，亦觀測到藉由RSPO2治療或藉由R2M3-26及RSPO2之組合治療使十二指腸及結腸中之Ki67表現擴增(資料未示出)。然而，在DSS模型之第10天，單獨的R2M3-26並未引起Ki67在十二指腸或結腸上皮中的擴增，與之前在未受傷動物中表現Wnt促效劑之研究一致(Yan Kelley S.等人, 2017)。結果表明，單獨的Wnt促效劑治療能夠修復DSS損傷之結腸上皮，而不會在正常結腸或小腸造成過度增殖。實例11 R2M13-26，一種Fzd5,8靶向Wnt模擬物可刺激小鼠腸類器官之生長

RNAscope原位雜交分析展示，在小鼠小腸上皮中，Fzd5以最高水準表現( 圖 29E)，其次為Fzd1 ( 圖 29A)及Fzd7 ( 圖 29G)。Fzd1及Fzd7主要表現於Lgr5陽性幹細胞所在的隱窩底部附近( 圖 29L)。Fzd5之表現集中在隱窩-絨毛邊界附近及十二指腸中之隱窩底部柱狀幹細胞中，與強Axin2陽性域重疊，該域對於幹細胞標記Lgr5亦為陽性的( 圖 29K)。

接著測試用對Fzd5及Fzd8亞家族(R2M13-26)或Fzd1、2及7亞家族(1RC07-26)特異之Wnt促效劑刺激Wnt傳訊是否足以刺激小鼠小腸類器官培養物中之上皮細胞增殖。亞家族特異性Wnt模擬物在Super TopFlash (STF)分析中具有活體外活性( 圖 5)。用豪豬抑制劑IWP2處理小鼠小腸類器官，以抑制培養之類器官中的內源性Wnt配位體分泌。當此等類器官未經蛋白質處理或用對照抗β-gal IgG處理時，該等類器官無法維持且迅速退化。相比之下，用大劑量範圍之Fzd1,2,5,7,8泛特異性Wnt模擬物R2M3-26處理能夠刺激細胞增殖，產生生長的透明球形類器官。Fzd5,8特異性Wnt模擬物(「R2M13-26」)及Fzd1,2,7特異性Wnt模擬物(「1RC07-26」，在(Fowler等人, 2021)中亦稱為FB-L6))均能夠刺激類器官增殖及生長(參見WO 2020/185960A1)。亞家族特異性Wnt模擬物之作用與泛特異性促效劑之作用相當。實例12 Fzd5,8特異性Wnt模擬物R2M13-26有效地修復DSS損壞之結腸上皮

原位分析表明，結腸上皮展示與小腸類似的Fzd表現模式( 圖 30)，且Fzd5在結腸上皮中之所有Fzd中亦以最高水準表現。Fzds之此差異表現在DSS條件下得以維持，儘管DSS降低了所有Fzds之表現( 圖 30K - 圖 30T)。

接下來檢查Fzd亞家族特異性模擬物是否能夠修復DSS損傷之結腸上皮。在DSS模型中，在第4天及第7天經由I.P.注射兩劑對照抗GFP IgG治療或蛋白質治療，且在第10天處死動物以進行組織學及血清分析。與在無蛋白質治療或經抗GFP治療之結腸中觀測到的嚴重組織損傷及炎症相比，R2M13-26 (Fzd5,8)及1RC07-26 (Fzd1,2,7)治療均引起結腸上皮修復。兩種Fzd亞家族特異性Wnt模擬物(R2M13-26及1RC07-26)對結腸組織學之影響與Fzd1,2,5,7,8泛特異性模擬物R2M3-26相當 (參見WO 2020/185960A1)。

與R2M3-26治療相似，糞便評分及疾病活動性指數(DAI)亦藉由R2M13-26及1RC07-26治療得到改善(參見WO 2020/185960A1)。與R2M3-26或1RC07-26相比，R2M13-26在糞便評分及DAI中之改善更明顯。為了進一步瞭解不同Wnt模擬物之組織修復程度，結腸組織再次由對治療組不知情之病理學家分析(參見WO 2020/185960A1)。與DAI一致，R2M13-26治療之DSS結腸的整體組織學評分顯著改善且優於1RC07-26治療之結腸，表明Fzd5,8特異性Wnt模擬物R2M13-26之結腸炎減輕及上皮修復比Fzd1,2,7特異性Wnt模擬物1RC07-26更有效。

接著確定在Wnt模擬物之情況下觀測到的結腸炎減輕是否會伴隨著血清細胞介素含量降低。用三種Wnt模擬物中之每一者治療均降低DSS誘導之促炎性細胞介素、TNF-α、IL6及IL-8的血清含量(參見WO 2020/185960A1)。

藉由劑量範圍研究進一步測試R2M13-26在DSS模型中之功效，其中R2M13-26在第4天以1、3、10及30 mpk注射一次，或在第4天及第7天以0.3、1、3及10 mpk注射兩次。觀測到所有劑量組之組織組織學、DAI及組織學評分的顯著改善(資料未示出)。所有劑量組亦展示促炎性細胞介素TNF-α、IL-6及IL-8之血清及組織含量的顯著降低(參見WO 2020/185960A1)。實例13 DSS損傷在所有組織層中引起強烈的炎症反應，但R2M13-26之主要直接作用係對於上皮細胞

scRNA-seq用於確定何等細胞首先對R2M13-26之治療產生反應，R2M13-26如何影響上皮細胞之分化，以及減少發炎性細胞介素之作用係在免疫細胞上直接發生或經由恢復上皮細胞間接發生。為研究此等問題，應用scRNA-seq研究急性DSS小鼠模型中R2M13-26治療之結腸的早期轉錄組反應。如同以上實例，在水中投與4% (w/v) DSS，且在第4天向小鼠IP注射10 mg/kg抗GFP對照蛋白或10 mg/kg R2M13-26，終點分別在第5天及第6天、注射後24小時及48小時( 圖 26A)。過濾後，資料集含有22,717個總細胞。將標準化及聚類分析應用於完整資料集以鑑別各譜系/群組，隨後細分各譜系/群組；將降維及聚類分析應用於各細胞之子集( 圖 26B)。存在三個主要細胞群組，免疫細胞(4835個細胞)、間質/基質(7509個)及上皮細胞(10373個) ( 圖 26B)。

DSS損傷在各時間點對所有三個譜系均有強烈影響，導致各組織層中500與超過1400個基因之間的差異基因表現，其中免疫譜系顯示出最大數量的變化( 圖 26C)。

為理解R2M13-26在DSS模型中之影響，首先藉由比較DSS、抗GFP條件與未受傷條件來評估DSS損傷之影響。DSS在各組織層或譜系中誘導不同的細胞類型，且此為譜系層面差異基因表現之大部分原因。在免疫譜系中，無細胞類型在損傷後消失。相反，截至DSS治療之第5天，受損結腸樣品中出現若干細胞類型，包括活化之嗜中性球(ActNeutropil)、兩個促炎性單核球群體(InjuryMono1,2)、受刺激之樹突狀細胞(ActDendritic)及兩組富含IgM重鏈基因表現及 Ighd之B細胞(Bcell1_IgM、Bcell2_IgM)。在基質細胞中，DSS損傷導致表現發炎性細胞介素及趨化因子之纖維母細胞群體的出現，與最近報導的UC患者及DSS小鼠模型中之促炎性纖維母細胞一致((Kinchen等人, 2018；Smillie等人, 2019)。兩組纖維母細胞幾乎完全由受損細胞(InjuryCryptFB1、InjuryCryptFB2)組成(資料未示出)。 R2M13 - 26 促進 Wnt 靶標及細胞週期基因表現 ， 且在給藥後立即擴增上皮中之先驅細胞群體。

R2M13-26之直接作用主要係對於上皮細胞。在全球層面上，在給藥後24小時，R2M13-26導致上皮中超過300個基因之表現的差異增加，但在免疫及基質細胞/譜系中幾乎無或無基因( 圖 27)。R2M13-26藉由擴大表現量及藉由擴大表現基因之細胞的百分比來增加上皮細胞中廣泛範圍之Wnt目標基因及細胞週期基因的表現( 圖 27C；表4及7)。表4顯示在24小時或48小時時，R2M13-26治療與抗GFP治療相比時，在上皮譜系內差異性表現之細胞週期基因。在＜ 0.05之經調節p值(假發現率(FDR))上過濾差異性表現。比較R2M13-26與抗GFP治療之上皮上的GSEA顯示細胞週期、端粒維持、MTORC傳訊及UPR應激反應在上皮中經R2M13-26強烈上調( 圖 27A)。

重要的是，在任何基質或免疫細胞中均未偵測到譜系或細胞類型水準下之 Axin2富集(資料未示出)。此外，當對R2M13-26與抗GFP治療進行比較時，GSEA在基質或免疫細胞中富集之路徑極少(若存在) (資料未示出)，再次證實R2M13-26之主要直接影響係對於給藥後24小時之上皮細胞。此處，重要的是強調，儘管在第5天或第6天早期未觀測到R2M13-26對基質或免疫細胞之主要影響，但免疫細胞及細胞介素含量隨時間推移而降低，截至第10天可偵測到該降低(資料未示出)，表明此等變化繼發於R2M13-26對上皮之早期直接影響。如圖31中所示，嗜中性球浸潤及炎症標記在R2M13-26治療之後的表現均降低。

受R2M13-26影響之主要細胞類型為先驅細胞及前驅體群體，包括損傷誘導之、經改變之腸上皮細胞類型。差異表現分析顯示 Axin2、 Rnf43、 Cdkn3及/或其他Wnt目標基因在若干不同細胞類型(例如AlEnteroPC、TA2、EnteroPrecur)中顯著增加。此外，R2M13-26顯著增加上皮細胞中多種前驅細胞亞型中許多參與細胞週期之基因(表4)的表現，尤其是TA2及損傷特異性前驅細胞(AltEnteroPC)。此等基因中之一些本身為Wnt靶標(例如 Ccnb1、 Cdca3、Aurka、 Cdkn3)。驗證了Wnt目標基因表現的增加，且偵測到在R2M13-26治療之樣品之結腸隱窩中 Axin2及 Cdkn3表現的擴增( 圖 27B)。此外，TA1及TA2前驅細胞具有最高的細胞週期相關基因表現，且在治療後24小時，此等組中R2M13-26治療之樣品的貢獻擴大(資料未示出)，其與給藥後早期前驅細胞之擴增一致。

為驗證細胞週期基因表現之早期增加反映了增殖細胞數量的增加，使用增殖細胞標記Ki-67進行免疫組織化學分析。在給藥後48小時觀測到與抗GFP治療組相比時，R2M13-26治療後結腸上皮細胞中之增殖細胞數量的強勁增加( 圖 27C)，與scRNA-seq分析及藉由RT-qPCR在結腸樣品上偵測到的細胞週期基因表現的增加一致。應注意，增殖細胞不限於隱窩底部，而是經常位於頂端表面附近。

除了增加直接參與細胞週期之基因的表現外，R2M13-26亦增加幾種幹細胞/前驅細胞基因之表現，諸如 Lrig1(Powell等人, 2012)、 Hmga2(Nishino、Kim、Chada及Morrison, 2008；Parisi、Piscitelli、Passaro及Russo, 2020)及 Nhp2，其為與端粒維持相關的Dyskerin複合體之成員，已被證明對幹細胞維持而言重要(Fong、Ho、Inouye及Tjian, 2014；McCann、Kavari、Burkholder、Phillips及Hall, 2020)。

總之，在給藥後24小時，R2M13-26增加了多種細胞類型中之Wnt靶標及細胞週期基因表現，主要在幹細胞及前驅細胞之不同亞型中，包括損傷誘導之、經改變之腸上皮細胞類型，使得前驅細胞池擴大。 R2M13 - 26 治療之上皮細胞在增殖後更快地分化。

時間戳允許確定在所有三種治療條件(未受傷、受傷/抗GFP及受傷/R2M13-26)下，第6天(48小時)細胞相對於第5天(24小時)細胞富集的位置。第5天及第6天未受傷細胞在所有簇中之代表大致相同，其中未受傷細胞在兩個時間點均存在，如所預期( 圖 28A 、圖 28B 、圖 28C 及圖 28D)。然而，在R2M13-26或抗GFP治療之第5天及第6天受傷樣品優先富集之細胞類型之間存在明顯差異。對於抗GFP樣品，相對於第6天時間點，改變之腸上皮細胞組(AltEntero2, 3)及TA1組中之細胞在第5天更多，而替代前驅細胞(AltEnteroPC)中之細胞百分比在兩個時間點大致相等。在R2M13-26樣品中，第5天之TA1及TA2細胞相對於第6天更多，且第6天之幹細胞百分比相對於第5天更高。重要的是，基於即時時間戳，相對於抗GFP治療之樣品，R2M13-26治療之細胞在第6天在腸上皮細胞前驅體中大量富集，且表達高水準之發炎性基因(AltEntero)的替代腸上皮細胞更少。因此，第6天(48小時) R2M13-26樣品似乎加速向腸上皮細胞分化。

為了補充基於時間戳之觀測結果，採用了譜系軌跡推斷工具 slingshot。因為有證據表明一些腸細胞在DSS損傷後去分化，所以移除明顯的去分化/改變狀態的腸上皮細胞簇，且將 slingshot應用於包括至少5%未受傷狀態細胞之細胞簇。將組合之幹細胞/TA2細胞設定為起點( 圖 28A)，且 slingshot預測，自最初的起始組開始，細胞將在一個方向上朝TA1、杯狀、簇狀及腸內分泌進展，且在另一個方向上朝腸上皮細胞進展( 圖 28D)。基於預測的譜系軌跡偽時間值，相對於對照治療之細胞，截至第6天(48小時)在腸上皮細胞譜系軌跡中更遠的R2M13-26治療之樣品的百分比更高( 圖 28E)。此外，如圖28E中所示，隨著R2M13-26治療，朝腸上皮細胞譜系之進展增加。對腸上皮細胞譜系之此預測與實際時間戳資料一致，亦即用R2M13-26治療之第6天(48小時)細胞在朝不成熟腸上皮細胞之分化過程中加速，但仍非常早期。

驗證改善分化之可靠標準為，在DSS誘導之損傷後第10天(R2M13-26治療後6天)，相對於抗GFP對照，R2M13-26治療組中成熟、分化的細胞類型標記之表現看起來更像初始、未受傷之結腸( 圖 13)。不同於抗GFP治療之對照樣品，R2M13-26治療之樣品恢復了腸上皮細胞、杯狀細胞、腸內分泌及簇狀細胞。 R2M13 - 26 治療引起上皮障壁恢復且減輕炎症

在觀察損傷後第10天之研究中，觀測到R2M13-26治療引起上皮在組織學層面上的修復。在給藥後24小時，相對於TA1細胞中之抗GFP，R2M13-26治療之樣品中之黏液素及障壁相關基因表現增加。當在第10天評估緊密連接標記TJP1 (ZO1)之表現時，觀測到在第10天，相對於對照治療之結腸，其表現在R2M13-26治療之結腸中增加且更有組織，與緊密連接之重建一致。

除了對上皮細胞再生之直接影響外，R2M13-26亦使得涉及麩胱甘肽(一種可在減輕炎症中起作用之抗氧化劑)結合之基因的表現強烈增加：兩種麩胱甘肽轉移酶( Gstm1、 Gstm3)及谷胱甘肽過氧化酶 Gpx2，已報導所有三者均為Wnt目標基因(Gougelet等人, 2014；Kipp、Banning及Brigelius-Flohé, 2007)。實例14 R2M13-h26在非人靈長類動物(NHP)中之毒性研究

為了評估R2M13-h26之毒性且評估4週恢復期後任何發現之潛在可逆性，對食蟹獼猴進行靜脈內(IV)彈丸注射後R2M13-h26之4週非GLP (良好實驗室規範)毒性研究。另外，確定R2M13-h26之毒理動力學(TK)特徵。

在第1、8、15、22及29天，每天一次對初始雌性2-4歲柬埔寨食蟹獼猴(2-4 kg)進行靜脈內彈丸注射。媒劑僅用作對照。臨床病理學(血液學、化學、凝血、尿分析)係在給藥前及第16天及第30天進行。TK取樣在執行期間之選定時間點進行且直至終止；在第1天及第29天對全TK概況進行取樣，且在第15天對峰值/谷值進行取樣。在給藥前及第15、29及58天進行抗藥物抗體(ADA)取樣。在第30天終止時及第58天進行病理組織學。表11展示TK研究之實驗設置。表11. NHP中用於TK研究之劑量

組	測試材料	劑量水準 (mg/kg)	劑量濃度 (mg/mL)	劑量體積 (mL/kg)	雌性
終止 ( 第 30 天 )	恢復 ( 第 58 天 )
1	對照	0	0	5	3	2
2	R2M13-h26	3	0.6	5	3	-
3	R2M13-h26	10	2	5	3	-
4	R2M13-h26	30	6	5	3	2

臨床觀測、體重及攝食量均未見異常。在臨床病理學中觀測到適度變化。在R2M13-h26組中觀測到血清鹼性磷酸酶(ALP)之非不良、極小至中度增加( 圖 32)，其可歸因於R2M13-h26在骨中之作用。未偵測到肉眼或顯微鏡下的病理學發現。無觀測之不良作用含量(NOAEL)測定為30 mg/kg。未偵測到對器官重量之影響，且未觀測到腸段重量之變化。有一些證據表明經治療動物之十二指腸及結腸中的Axin2增加(資料未示出)。

R2M13-h26之平均血清濃度使用藥物動力學分析來量測，該分析為基於均質雙抗原之分析，如圖 33中所描繪。將組胺酸結合之人類Frizzled 5 (Fzd5)及小鼠低密度脂蛋白受體相關蛋白6小鼠-Fc嵌合體(Lrp6)與R2M13-h26一起預培育以形成複合物。接著將Fzd5/R2M13-h26/Lrp6複合物施加至鍍鎳板上，允許Fzd5組胺酸標籤捕獲。藉由鹽/清潔劑緩衝液洗滌移除基質干擾及過量試劑，且隨後藉由採用對小鼠Fc部分具有特異性之二級過氧化酶結合抗體來偵測捕捉之複合物。使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)受質顯色，且藉由酸化淬滅HRP反應物，且在SpectraMax® Paradigm®酶標儀上分析樣品。表12. R2M13-h26之平均(S.D.) TK參數

劑量 (mg/kg)	天	AUC _(0-7)(µg-天/mL)	AUC _(0-7)/D (µg-天/mL// mg/kg)	AUC累積比率	C _max(µg/mL)	C _max/D (µg/mL//mg/kg)	C _max累積比率
3	0	107 (5.91)	35.6 (1.97)	NA	60.0 (3.11)	20.0 (1.03)	NA
28	NA	NA	1.18 (0.69)	66.2 (3.26)	22.1 (1.09)	1.11 (0.102)
10	0	375 (23.1)	37.5 (2.31)	NA	230 (19.5)	23.0 (1.95)	NA
28	NA	NA	1.12 (0.026)	243 (11.4)	24.3 (1.14)	1.06 (0.042)
30	0	1065 (221)	35.5 (7.37)	NA	656 (39.4)	21.9 (1.31)	NA
28	796 (290)	26.5 (9.68)	0.754 (0.227)	731 (77.0)	24.4 (2.57)	1.11 (0.055)

* AUC ₍ ₀ _- ₇ ₎=給藥後0至7天之濃度-時間曲線下面積；D =劑量；C _max=最大觀測血清濃度；累積比率對於3、10 mg/kg為比較AUC ₍ ₀ _- ₁ ₎且對於30 mg/kg為AUC ₍ ₀ _- ₇ ₎。

R2M13-h26之平均血清濃度展示於表12及圖 34中。TK與劑量成比例，且未觀測到治療相關不良作用。無證據表明重複給藥會導致非典型累積或實質性暴露損失。一隻動物在30 mg/kg劑量組中呈ADA陽性。另外，在第一劑量後量測個體血清R2M13-h26濃度。如圖 35中所示，30 mg/kg劑量組中之兩隻動物在給藥後3天開始加速清除。在研究期間，此等動物之R2M13-h26谷濃度亦始終較低。發現一隻動物在研究結束時具有快速血清清除。

觀測到血清之ALP輕度(相對於基線＜2X)、非不良的劑量依賴性增加，停止給藥後恢復至基線( 圖 36)。同工酶分析表明增加之ALP可為骨源性的。

總體而言，結果表明R2M13-h26在NHP中在持續4週之至多30 mg/kg/週下具有良好耐受性。在任何參數中均未觀測到與治療相關的不良作用。暴露與表明研究成功之預期一致，一些證據表明一小部分動物之暴露減少。ALP之增加提供了可能飽和之PD效應的證據。實例15 R2M13-h26-LALAPG在非人靈長類動物(NHP)中之藥物動力學(PK)研究

在單劑R2M13-h26靜脈內(IV)彈丸注射後，在NHP中評估R2M13-h26之藥物動力學(PK)。

在第0天向4隻雌性食蟹獼猴中之每一者給與單次IV劑量之3 mg/kg R2M13-h26。在選定時間點收集血清樣品，直至給藥後21天。使用實例14中所述之藥物動力學分析來量測平均血清R2M13-h26濃度，且結果展示於圖 37中。測定了R2M13-h26之PK參數，包括t ₁ _/ ₂、AUC _last、C ₀、血清清除率、MRT _last、V _c及V _ss，且呈現於圖 38中。

結果表明，R2M13-h26之PK與IgG水準一致，且展示低分佈容積。R2M13-h26之清除率略快於NHP中之典型IgG。因此，此等結果表明R2M13-h26可安全地投與至NHP，PK適合用於人類。表4.響應於Wnt促效劑而調節之說明性細胞週期基因(logFC = Log2倍數變化；FDR =假發現率)

基因	全基因名稱	細胞類型	條件	logFC	FDR
Tipin	TIMELESS相互作用蛋白	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.632145	0.00143981
Pa2g4	增殖相關2G4	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.239787	0.002379216
Rfc4	複製因子C次單元4	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.476028	0.003082582
Fen1	片狀結構特異性核酸內切酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.528652	0.003082582
Spc24	NDC80著絲點複合物之SPC24組分	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.751851	0.0040443
Mthfd1	亞甲基四氫葉酸脫氫酶、環水解酶及甲醯四氫葉酸合成酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.050683	0.004094943
Dtymk	脫氧胸苷酸激酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.319476	0.004146102
Ran	RAN，RAS致癌基因家族成員	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.379784	0.004442951
Mcm5	微型染色體維持複合物組分5	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.26413	0.0050001
Cdca8	細胞分裂週期相關8	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.40295	0.0050001
Chaf1b	染色質組裝因子1次單元B	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.562627	0.0050001
Tyms	胸苷酸合成酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.183866	0.0050001
Birc5	含桿狀病毒IAP重複序列之5	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.725848	0.0050001
Rfc5	複製因子C次單元5	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.34582	0.005698527
Cdk1	週期素依賴性激酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.538018	0.005842661
Prim1	DNA引子酶次單元1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.271932	0.005959274
Mcm6	微型染色體維持複合物組分6	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.23061	0.005959274
Stmn1	微管不穩定蛋白1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.427388	0.005959274
Pclaf	PCNA夾相關因子	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.480806	0.005959274
Nup85	核孔蛋白85	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.052163	0.005959274
Ube2t	泛素結合酶E2 T	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.495746	0.006507412
Pbk	PDZ結合激酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.568091	0.006639875
Nup43	核孔蛋白43	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.663265	0.006639875
Hat1	組蛋白乙醯基轉移酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.339853	0.006639875
Lig1	DNA連接酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.011951	0.006639875
Mcm7	微型染色體維持複合物組分7	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.294281	0.006639875
Ruvbl2	RuvB樣AAA ATP酶2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.255863	0.007136635
Cenph	著絲點蛋白H	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.678124	0.007184767
Pold2	DNA聚合酶δ 2，輔助次單元	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.174795	0.007573386
Cks1b	CDC28蛋白激酶調節次單元1B	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.310798	0.008380365
Dhfr	二氫葉酸還原酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.211103	0.008576568
Gmnn	聯會蛋白DNA複製抑制劑	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.054867	0.008586835
Uhrf1	具有PHD及無名指域之泛素樣1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.252776	0.008602422
Mcm2	微型染色體維持複合物組分2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.219725	0.008619493
Pole3	DNA聚合酶ε 3，輔助次單元	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.089279	0.008851502
Cenpm	著絲點蛋白M	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.737091	0.008918625
Aurka	極光激酶A	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.251548	0.009399304
Orc6	起源識別複合物次單元6	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.264605	0.009990261
Smc2	染色體結構維持2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.191401	0.009990261
Dut	去氧尿苷三磷酸酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.373491	0.009990261
Cdkn3	週期素依賴性激酶抑制劑3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.659597	0.009990261
Rrm2	核糖核苷酸還原酶調節次單元M2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.246787	0.010234729
Cdc20	細胞分裂週期20	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.294395	0.010451406
Nup37	核孔蛋白37	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.41603	0.01046245
Ccne1	週期素E1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.73646	0.010798551
Ccnb2	週期素B2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.381396	0.011562403
Rrm1	核糖核苷酸還原酶催化次單元M1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.008432	0.011604874
Rfc3	複製因子C次單元3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.029058	0.011933798
Tk1	胸苷激酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.262877	0.013481779
Cdca7	細胞分裂週期相關7	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.171612	0.013644871
Haus4	HAUS augmin樣複合物次單元4	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.172548	0.013787289
Melk	母體胚胎白胺酸拉鏈激酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.43941	0.014216405
Mybl2	MYB原致癌基因樣2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.346163	0.015042194
Incenp	內著絲點蛋白	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.02303	0.015042194
Asf1b	抗沉默功能1B組蛋白伴隨蛋白	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.743891	0.01529826
Mcm3	微型染色體維持複合物組分3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.204862	0.015584636
Ndc1	NDC1跨膜核孔蛋白	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.014847	0.016082636
Cdt1	染色質許可及DNA複製因子1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.018289	0.017100865
Cenpq	著絲點蛋白Q	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.256335	0.018231158
Cenpu	著絲點蛋白U	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.42333	0.018231158
Fbxo5	F-盒蛋白5	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.247194	0.018773023
Ccnb1	週期素B1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.15428	0.018882603
Rad51	RAD51重組酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.254654	0.020252318
Chaf1a	染色質組裝因子1次單元A	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.060375	0.021679924
Chtf18	染色體傳遞保真因子18	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.61156	0.023550092
Cdc45	細胞分裂週期45	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.625426	0.023829659
Cenpw	著絲點蛋白W	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.167276	0.024072569
Dscc1	DNA複製及姊妹染色單體內聚1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.628844	0.024595671
Dctpp1	dCTP焦磷酸酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.252019	0.025060476
Orc2	起源識別複合物次單元2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.123944	0.025075902
Aurkb	極光激酶B	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.390542	0.025455962
Exo1	核酸外切酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.721342	0.025512129
Ticrr	TOPBP1相互作用檢查點及複製調節劑	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.509485	0.02716189
Cdca3	細胞分裂週期相關3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.190729	0.027458596
Slc29a1	溶質載體家族29成員1 (Augustine血型)	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.167626	0.02841159
Fignl1	fidgetin樣1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.279447	0.028531028
Cenpa	著絲點蛋白A	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.022438	0.029439811
Cenpp	著絲點蛋白P	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.372066	0.030422111
Atp23	ATP23金屬肽酶及ATP合酶組裝因子同系物	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.343583	0.03094977
Rad54l	RAD54樣	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.547449	0.03230685
Spc25	NDC80著絲點複合物之SPC25組分	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.114321	0.032395687
Clspn	卡環(claspin)	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.223129	0.032495844
Sgo1	守護蛋白1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.1496	0.032993748
Dtl	無齒E3泛素蛋白連接酶同系物	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.160475	0.032993748
Gtse1	G2及S期表現1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.582519	0.034291034
Tdp1	酪胺醯基-DNA磷酸二酯酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.339477	0.034751507
Rpa2	複製蛋白A2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.05017	0.036291188
Ttk	TTK蛋白激酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.330748	0.036497959
Timeless	永恆的晝夜節律調節劑	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.202788	0.036821283
Ncapg	非SMC凝聚蛋白I複合物次單元G	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.114402	0.037236766
Ncaph	非SMC凝聚蛋白I複合物次單元H	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.367556	0.03815944
Haus1	HAUS augmin樣複合物次單元1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.489593	0.038215468
Tmem107	跨膜蛋白107	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.113684	0.038332591
Mgme1	粒線體基因體維持核酸外切酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.00791	0.039373631
Gins2	GINS複合物次單元2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.185892	0.041317167
Blm	BLM RecQ樣解螺旋酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.457756	0.042825952
Ccna2	週期素A2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.047711	0.042825952
Tcf19	轉錄因子19	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.321349	0.043154589
Nusap1	核仁及紡錘體相關蛋白1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.15807	0.043742483
Ercc6l	ERCC切除修復6樣，紡錘體組裝檢查點解螺旋酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.404036	0.045777559
Pole2	DNA聚合酶ε 2，輔助次單元	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.520026	0.046680088
Nuf2	NDC80著絲點複合物之NUF2組分	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.158623	0.048977568
Tpx2	TPX2微管成核因子	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.035609	0.049289307
Paics	磷酸核糖胺基咪唑羧化酶及磷酸核糖胺基咪唑丁二醯甲醯胺合酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.188391	0.000459648
Knstrn	著絲點局部化astrin (SPAG5)結合蛋白	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.558298	0.001186047
Fance	FA互補組E	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.089463	0.01101854
Cdkn3	週期素依賴性激酶抑制劑3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.577324	0.014478228
Spc24	NDC80著絲點複合物之SPC24組分	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.222922	0.018014474
Cdca8	細胞分裂週期相關8	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.047894	0.018840895
Stmn1	微管不穩定蛋白1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.063046	0.020701159
Ccnb2	週期素B2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.25735	0.020796218
Cdk1	週期素依賴性激酶 1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.154977	0.0226473
Gins2	GINS複合物次單元2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.406959	0.024409629
Ccnb1	週期素B1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.121675	0.026441863
Poc1a	POC1中心粒蛋白A	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.149281	0.027909366
Cdc20	細胞分裂週期20	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.069994	0.030688699
Birc5	含桿狀病毒IAP重複序列之5	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.117698	0.035102419
Kif2c	驅動蛋白家族成員2C	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.29897	0.040169664
Chaf1b	染色質組裝因子1次單元B	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.029016	0.040657598
Cdca3	細胞分裂週期相關3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.087222	0.042790541
Nup37	核孔蛋白37	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.081951	0.047110197
Cdkn3	週期素依賴性激酶抑制劑3	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.3120771	0.009450084
Ccnb2	週期素B2	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.0643399	0.016199086
Cdca8	細胞分裂週期相關8	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.0597273	0.006732627
Ccnb1	週期素B1	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.9711337	0.025176249
Cdc20	細胞分裂週期20	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.9321585	0.024278951
Birc5	含桿狀病毒IAP重複序列之5	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.9313397	0.010292255
Hist1h1c	H1.2連接子組蛋白，簇成員	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.920003	0.024582003
Cdca3	細胞分裂週期相關3	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.9149279	0.032472471
Pbk	PDZ結合激酶	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.9027055	0.036739905
Anapc15	分裂後期促進複合物次單元15	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.8402356	0.049919161
Melk	母體胚胎白胺酸拉鏈激酶	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.8377668	0.038296186
Cdk1	週期素依賴性激酶1	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.8293001	0.044231948
Cenpx	著絲點蛋白X	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.816434	0.018966406
Cks2	CDC28蛋白激酶調節次單元2	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.7936245	0.01843014
Spc24	NDC80著絲點複合物之SPC24組分	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.7683087	0.028434251
Tubb4b	微管蛋白β 4B IVb類	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.7245988	0.019007425
Ran	RAN，RAS致癌基因家族成員	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.7024503	0.024153629
Slc29a1	溶質載體家族29成員1 (Augustine血型)	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	2.5372566	0.009284855
Ran	RAN，RAS致癌基因家族成員	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	0.9721908	0.01482332
Cdca7	細胞分裂環相關7	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.3346868	0.016301248
Spc24	NDC80著絲點複合物之SPC24組分	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.5029041	0.02394704
Birc5	含桿狀病毒IAP重複序列之5	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.2655255	0.024646336
Dtymk	脫氧胸苷酸激酶	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.0466804	0.034922079
Pa2g4	增殖相關2G4	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	0.9910247	0.035006869
Mthfd1	亞甲基四氫葉酸脫氫酶、環水解酶及甲醯四氫葉酸合成酶1	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	0.9193116	0.042750243
Stmn1	微管不穩定蛋白1	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.2770102	0.046544163
Mcm5	微型染色體維持複合物組分5	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.4828272	0.046544163
Mki67	增殖標記Ki-67	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	4.3362876	0.007949392
Dctpp1	dCTP焦磷酸酶1	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	1.8139038	0.016430974
Birc5	含桿狀病毒IAP重複序列之5	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	3.2691073	0.0312592
Knstrn	著絲點局部化astrin (SPAG5)結合蛋白	EnteroPrecur	R2M13-26減去抗GFP	3.6130018	0.005975418
Stmn1	微管不穩定蛋白1	EnteroPrecur	R2M13-26減去抗GFP	2.0258273	0.024502711

表5. 響應於Wnt促效劑調節之說明性抗炎基因

基因	全基因名稱	細胞類型	條件	logFC	FDR
Gpx2	麩胱甘肽過氧化酶2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.684747	0.002898753
Gdf15	生長分化因子15	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.329711	0.040472669
Nox1	NADPH氧化酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.519086	0.047660807
Gsta3	麩胱甘肽S-轉移酶α 3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	2.134244	0.001683607
Gstm1	麩胱甘肽S-轉移酶μ 1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.354221	0.003355493
Gpx2	麩胱甘肽過氧化酶2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.266339	0.007234804
Gdf15	生長分化因子15	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.489524	0.021811964
Sycn	成束蛋白(syncollin)	幹細胞	R2M13-26減去抗GFP	2.1329872	2.70118E-10
Il18	介白素18	幹細胞	R2M13-26減去抗GFP	1.7187707	0.00015452
Sycn	成束蛋白	TA1	R2M13-26減去抗GFP	2.4171978	0.02147903
Il18	介白素18	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.7057293	0.006732627
Sycn	成束蛋白	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.6236126	0.014890009
Selenbp1	硒結合蛋白1	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.0085511	0.042565765
Gpx2	麩胱甘肽過氧化酶2	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.8943478	0.012570697
Tgfbr2	轉型生長因子β受體2	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.4772761	0.001488099
Gdf15	生長分化因子15	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.7517547	0.008596591
Gpx2	麩胱甘肽過氧化酶2	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.1711801	0.017581212
Gdf15	生長分化因子15	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	3.3934844	0.00000708
Gpx2	麩胱甘肽過氧化酶2	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	1.4841473	0.00050619
Tgfbr2	轉型生長因子β受體2	AltEntero2	R2M13-26減去抗GFP	2.5918296	0.002738698
Gdf15	生長分化因子15	EnteroPrecur	R2M13-26減去抗GFP	3.5638037	0.008484168
Timp3	TIMP金屬肽酶抑制因子3	EnteroPrecur	R2M13-26減去抗GFP	7.4998669	0.020951038
Reg4	再生家族成員4	Goblet1	R2M13-26減去抗GFP	8.5213571	3.29983E-16

表6.響應於Wnt促效劑調節之說明性上皮障壁基因

基因	全基因名稱	細胞類型	條件	logFC	FDR
Apex1	無嘌呤核酸/無嘧啶核酸內切脫氧核糖核酸酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.509778	0.00143981
B3gnt7	UDP-GlcNAc:βGal β-1,3-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶7	幹細胞	R2M13-26減去抗GFP	7.249154	2.5377E-08
Muc3	黏液素3A，細胞表面相關	幹細胞	R2M13-26減去抗GFP	1.581388	3.63964E-06
Agr2	前梯度2蛋白二硫鍵異構酶家族成員	TA1	R2M13-26減去抗GFP	2.133347	0.02147903
Fcgbp	Fcγ結合蛋白	TA1	R2M13-26減去抗GFP	3.442198	0.02147903
Muc2	黏液素2，寡聚黏液/膠凝	TA1	R2M13-26減去抗GFP	2.820366	0.02147903
Sprr2a3	小脯胺酸富集蛋白2A3	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.658477	0.007949994
Apex1	無嘌呤核酸/無嘧啶核酸內切脫氧核糖核酸酶1	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.335568	0.021848139

表7.在R2M13-26治療後，在整個上皮譜系及/或在特定細胞類型中調節之Wnt目標基因

基因	全基因名稱	細胞類型	條件	logFC	FDR
Gsta3	麩胱甘肽S-轉移酶α 3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	2.134244	0.001683607
Axin2	axin 2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.768324	0.028289949
Myc	MYC原致癌基因，bHLH轉錄因子	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.682412	0.005698527
Cbr3	羰基還原酶3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.766906	0.001882869
Cdkn3	週期素依賴性激酶抑制劑3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.659597	0.009990261
Ang	血管生成素	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.617788	0.014661067
Plbd1	含磷脂酶B域之1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.612844	0.001495964
Gtse1	G2及S期表現1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.582519	0.034291034
Cdkn3	週期素依賴性激酶抑制劑3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.577324	0.014478228
Ass1	精胺基丁二酸合酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.551104	0.016176013
Greb1	生長調節雌激素受體結合1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.49355	0.016925608
Aurkb	極光激酶B	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.390542	0.025455962
Ncaph	非SMC凝聚蛋白I複合物次單元H	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.367556	0.03815944
Gstm1	麩胱甘肽S-轉移酶μ 1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.354221	0.003355493
Csrp2	半胱胺酸及甘胺酸富集蛋白2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.344247	0.006631182
Ddx39	DExD-盒解螺旋酶39A	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.325891	0.009226283
Gstm3	麩胱甘肽S-轉移酶μ 3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.32171	0.019200281
Cdc20	細胞分裂週期20	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.294395	0.010451406
Fignl1	fidgetin樣1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.279447	0.028531028
Prim1	DNA引子酶次單元1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.271932	0.005959274
Uhrf1	具有PHD及無名指域之泛素樣1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.252776	0.008602422
Aurka	極光激酶A	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.251548	0.009399304
Hmmr	玻尿酸介導之運動受體	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.232073	0.037487771
Mcm6	微型染色體維持複合物組分6	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.23061	0.005959274
H2afz	H2A.Z變異組蛋白1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.214723	0.009949543
Tubb5	微管蛋白β I類	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.201435	0.006508255
Rnf43	無名指蛋白43	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.201113	0.008880037
Cdca3	細胞分裂週期相關3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.190729	0.027458596
Nusap1	核仁及紡錘體相關蛋白1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.15807	0.043742483
Ccnb1	週期素B1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.15428	0.018882603
Slc22a1	溶質載體家族22成員1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.154254	0.01465192
Ccnb1	週期素B1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.121675	0.026441863
Ncapg	非SMC凝聚蛋白I複合物次單元G	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.114402	0.037236766
Cacybp	鈣週期素結合蛋白	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.110488	0.010288843
Cdca3	細胞分裂週期相關3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.087222	0.042790541
Aifm1	凋亡誘導因子粒線體相關1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.082337	0.020582406
Abcc4	ATP結合卡匣亞家族C成員4	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.072043	0.029986876
Cdc20	細胞分裂週期20	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.069994	0.030688699
Adck5	含aarF域之激酶5	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.067199	0.012882464
Enc1	外胚層-神經皮層1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.066644	0.015513811
Retsat	視黃醇飽和酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.052705	0.007480498
Gstm2	麩胱甘肽S-轉移酶μ 2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.037239	0.030848582
Tpx2	TPX2微管成核因子	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.035609	0.049289307
Hsp90aa1	熱休克蛋白90 α家族A類成員1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.02753	0.009990261
Them4	硫酯酶超家族成員4	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.010967	0.009949162
Dnajc9	DnaJ熱休克蛋白家族(Hsp40)成員C9	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.010877	0.011604874
Tbcel	微管蛋白摺疊輔因子E樣	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	-1.002073	0.017100865
Nuak2	NUAK家族激酶2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.024343	0.015597046
Max	MYC相關因子X	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.05474	0.014043244
Endod1	含核酸內切酶域之1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.097355	0.004966893
Prom1	prominin 1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.102851	0.003137357
Gda	鳥嘌呤脫胺酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.105871	0.007109783
Fgfr2	纖維母細胞生長因子受體2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.117038	0.009891201
Srxn1	硫氧還蛋白1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.148904	0.003836896
Slc41a2	溶質載體家族41成員2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.18125	0.031893846
Nav2	神經元導航子2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.204498	0.00436655
Iqgap2	含IQ模體之GTP酶活化蛋白2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.340588	0.007355661
Dhrs9	脫氫酶/還原酶9	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	-1.522466	0.045290714
Xdh	黃嘌呤脫氫酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.527022	0.000636765
Mylk	肌凝蛋白輕鏈激酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.545616	0.001643054
Ptpn6	蛋白酪胺酸磷酸酶非受體6型	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.606503	0.001304912
Aqp8	水通道蛋白8	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-1.984066	0.017787136
Ntrk2	神經營養受體酪胺酸激酶2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-2.067901	0.040815414
Adamts17	具有凝血栓蛋白1型模體17之ADAM金屬肽酶	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-2.186084	0.035254338
Rin3	Ras及Rab相互作用因子3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-2.193379	0.020701159
Agt	血管收縮素原	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-2.336405	0.003508667
Pde4b	磷酸二酯酶4B	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-2.476977	0.016218193
Ces2a	羧酸酯酶2A	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-2.557209	0.000210476
Dhrs9	脫氫酶/還原酶9	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-2.586128	0.003285788
Pdzrn3	含PDZ域之無名指3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-2.621326	0.010600635
Chac1	ChaC麩胱甘肽特異性γ-麩胺醯基環轉移酶1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-2.855996	0.032696198
Slc3a1	溶質載體家族3成員1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-3.071134	0.000312095
Cdkn1c	週期素依賴性激酶抑制劑1C	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-3.285102	0.000856899
Tbx3	T-盒轉錄因子3	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	-3.463032	0.004904275
Ly6c1	淋巴球抗原6複合物，基因座C1	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.6287964	0.043275696
Cbr3	羰基還原酶3	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.5500278	0.026039076
Cdkn3	週期素依賴性激酶抑制劑3	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.3120771	0.009450084
Aqp4	水通道蛋白4	TA2	R2M13-26減去抗GFP	1.0520023	0.019007425
Hmmr	玻尿酸介導之運動受體	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.9735407	0.041539633
Ccnb1	週期素B1	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.9711337	0.025176249
Cdc20	細胞分裂週期20	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.9321585	0.024278951
Cdca3	細胞分裂週期相關3	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.9149279	0.032472471
H2afz	H2A.Z變異組蛋白1	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.8243693	0.008959534
Tmem97	跨膜蛋白97	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.787852	0.033582389
Ddx39	DExD-盒解螺旋酶39A	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.6631842	0.043886108
Slc4a4	溶質載體家族4成員4	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-0.6817186	0.014890009
Irf1	干擾素調節因子1	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-0.8049192	0.008959534
Ets2	ETS原致癌基因2，轉錄因子	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-0.9529111	0.018546796
Iffo2	中間長絲家族孤兒2	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-1.0854602	0.015121057
Socs3	細胞介素傳訊抑制劑3	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-1.1837287	0.016676011
Cbs	胱硫醚β-合酶	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-1.1868333	0.013213267
Rara	視黃酸受體α	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-1.5454715	0.031305634
Ptpn6	蛋白酪胺酸磷酸酶非受體6型	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-1.5508438	0.042059189
Nav2	神經元導航子2	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-1.5512663	0.015064266
Per2	週期晝夜節律調節劑2	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-1.6163439	0.028434251
Icam1	細胞間黏附分子1	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-1.7416709	0.049047753
Bcl2l11	BCL2樣11	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-1.958148	0.030826041
Pim1	Pim-1原致癌基因，絲胺酸/蘇胺酸激酶	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-2.0762894	0.007565276
Pde4b	磷酸二酯酶4B	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-3.2363764	0.017171089
Fmnl1	形成素樣1	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-3.4292968	0.042565765
Tgm1	轉麩醯胺酸酶1	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-3.4897912	0.047774647
Sla	Src樣轉接子	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-3.688632	0.026086655
Nlrp12	含NLR家族比林域之12	TA2	R2M13-26減去抗GFP	-5.513192	0.032472471
Slc3a1	溶質載體家族3成員1	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	-2.0928036	0.001488099
Rnf43	無名指蛋白43	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.5234993	0.004842976
Rnase4	核糖核酸酶A家族成員4	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.3663333	0.009933524
Ang	Ang	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.4470403	0.01068326
Paqr4	孕激素及adipoQ受體家族成員4	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	-0.8389525	0.018109402
H2afz	H2A.Z變異組蛋白1	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	0.9795262	0.020976162
Myc	MYC原致癌基因，bHLH轉錄因子	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.7404093	0.021596045
Axin2	axin 2	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	2.6986444	0.023278564
Mylk	肌凝蛋白輕鏈激酶	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	-1.0365547	0.023569754
Dhrs9	脫氫酶/還原酶9	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	-1.4543531	0.02409328
Iqgap2	含IQ模體之GTP酶活化蛋白2	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	-0.9729629	0.027528807
Nap1l1	核小體組裝蛋白1樣1	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	0.8905891	0.032187986
Tmem97	跨膜蛋白97	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	0.8972574	0.037953454
Aldh3a2	醛脫氫酶3家族成員A2	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	-0.8574181	0.038525278
Xdh	黃嘌呤脫氫酶	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	-1.1647674	0.046544163
Usp18	泛素特異性肽酶18	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	-3.7789824	0.047229267
Prom1	prominin 1	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	-0.8889568	0.048205082
Aqp4	水通道蛋白4	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	-2.0782112	1.24E-05
Rnase4	核糖核酸酶A家族成員4	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	2.3195336	0.000714494
Tubb5	微管蛋白β I類	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	1.9521151	0.005899592
Plac8	胎盤相關8	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	-0.9414611	0.00830699
Slc30a10	溶質載體家族30成員10	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	1.8028155	0.008421521
Pim1	Pim-1原致癌基因，絲胺酸/蘇胺酸激酶	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	1.7028913	0.015789747
Rnf43	無名指蛋白43	AltEntero1	R2M13-26減去抗GFP	2.1403004	0.032501039
Ang	Ang	AltEntero2	R2M13-26減去抗GFP	2.2769739	0.001298915
Rnase4	核糖核酸酶A家族成員4	AltEntero2	R2M13-26減去抗GFP	1.6427213	0.013496946
Cxcl2	C-X-C模體趨化因子配位體2	EnteroPrecur	R2M13-26減去抗GFP	-3.7609511	9.79689E-05
Pde4b	磷酸二酯酶4B	EnteroPrecur	R2M13-26減去抗GFP	-3.7333516	0.002304168
Tubb5	微管蛋白β I類	EnteroPrecur	R2M13-26減去抗GFP	1.956738	0.013112905
H2afz	H2A.Z變異組蛋白1	EnteroPrecur	R2M13-26減去抗GFP	1.2091412	0.024502711
Cxcl2	C-X-C模體趨化因子配位體2	Enteroend2	R2M13-26減去抗GFP	-7.9140875	1.61916E-21

表8.響應於Wnt促效劑調節之說明性幹細胞及前驅細胞基因

基因	細胞類型	條件	log2FC	FDR
Nhp2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.857028	0.00143981
Axin2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d5_24h	1.768324	0.028289949
Hmga2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.477929	0.000425025
Foxq1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.520334	0.000861389
Id1	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.665552	0.001762431
Nhp2	上皮細胞	R2M13-26減去抗GFP d6_48h	1.189143	0.010340642
Adh1	幹細胞	R2M13-26減去抗GFP	3.7215173	1.28645E-20
Nhp2	TA2	R2M13-26減去抗GFP	0.7075035	0.014352053
Nhp2	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.6504603	0.001488099
Hmga2	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.8393351	0.008885208
Axin2	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	2.6986444	0.023278564
Foxq1	AltEnteroPC	R2M13-26減去抗GFP	1.6513882	0.028212078
Id1	Goblet1	R2M13-26減去抗GFP	2.7008097	0.000231565
Areg	Goblet1	R2M13-26減去抗GFP	2.2493817	0.01136303

表9.材料

試劑或資源	來源	標識符
抗體、酶套組
兔抗絨毛蛋白(SP145)	Abcam	ab130751
兔抗DCLK/DCAMKL1 (D2U3L)	Cell signal	CST 62257
兔抗染色顆粒素A	Abcam	ab15160
兔抗ZO-1 (純系1A12)	Thermofisher	33-9100
兔抗Ki67	Abcam	15580
兔抗KI67 (純系SolA15)	Thermofisher	14-5698-82
兔抗EPCAM-Alexa-488 (純系G8.8)	Biolegend	118210
兔抗LY6A-Alexa-647 (純系E13-161.7)	Biolegend	122518
大鼠IgG2同型對照-Alexa-488	Biolegend	400525
FcR阻斷試劑	Miltenyi Biotec	130-092-575
驢抗大鼠IgG (H&L)，高度交叉吸附之二級抗體，Alexa Fluor 488	Thermofisher	A-21208
抗GFP人類IgG	Surrozen
hFc-RSPO2	Surrozen
R2M3-26，雙特異性附加人類IgG無效應子形式	Surrozen
R2M13-26，雙特異性附加人類IgG無效應子形式(R2M13-h26之親本分子)	Surrozen
1RC07-26，雙特異性附加人類IgG無效應子形式	Surrozen
RNAscope® 2.5 HD Assay-Red	ACD Bio
RNAscope Mulitplex Fluorescent Reagent Kit, v2 Assay	ACD Bio
Zymo Direct-zol RNA Microprep	Zymo	R2062
MagMAX™ mirVana™ Total RNA Isolation Kit	Thermofisher	A27828
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermofisher	4368814
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermofisher	4444557
化學品、肽、蛋白質
DMEM/F12	Thermo Fisher	12634-010
4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)	Thermo Fisher	D1306
胎牛血清(FBS)	Thermo Fisher	10438-026
釋放酶TM	Sigma	05401127001
DNA酶1	Sigma	04716728001
乙二胺四乙酸(EDTA)
磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)	Thermo Fisher	10010-023
HEPES	Thermo Fisher	J16924-AE
丙酮酸鈉	Thermo Fisher	11360-070
Pen-Strep	Thermo Fisher	15140-122
抗生素/抗黴劑100X	Thermo Fisher	15240-062
漢克斯緩衝鹽水溶液(HBSS)	Thermo Fisher	14175-079
TrypLE	Thermo Fisher	12604-013
TX-100
TSA Plus Cyanine 3 System	Akoya Bioscience	NEL744001KT
TSA Plus cyanine 5 System	Akoya Bioscience	NEL745001KT
含DAPI之Vectashield Vibrance抗螢光衰減封固劑	Vector Laboratories	H-1800

表10.基礎培養基組成

DMEM/F12K	Life technologies
HEPES	Life technologies	10mM
青黴素/鏈黴素	Life technologies	1X
GlutaMAX	Life technologies	1X
N2補充劑100×	Life technologies	1X
B27補充劑50x	Life technologies	1X
N-乙醯半胱胺酸	Sigma-Aldrich	1.25mM
重組人類EGF	Peprotech	50ng/mL
重組人類頭蛋白	Peprotech	50ng/mL
重組人類R-脊椎蛋白-1	R&D Systems	500ng/mL

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可組合上述各種實施例以提供其他實施例。本說明書中所提及及/或本申請資料表單中所列出之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利出版物均以全文引用之方式併入本文中。必要時，可修改實施例之態樣以採用多個專利、申請案及公開案之構思，從而提供又另外的實施例。可鑒於以上實施方式對實施例進行此等及其他改變。

一般而言，在以下申請專利範圍中，所用術語不應解釋為將申請專利範圍限制於本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例，而應解釋為包括所有可能之實施例以及該申請專利範圍有權要求的等效物之全部範疇。因此，申請專利範圍不受本發明限制。

圖 1提供經工程化WNT促效劑之一個實施例的說明性結構。R2M13抗Fzd5,8抗體包括兩條重鏈及兩條輕鏈，且各輕鏈亦包括經由標籤稠合至其N端的抗LRP6 VHH。

圖 2A提供結合VHH、VHH26及最近人類生殖系基因之親體LRP6的胺基酸序列比對。如Kabat方案所定義之CDR H1、H2及H3環殘基係藉由上文粗線鑑別。使用Clustal-Omega進行序列比對(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)。圖 2B提供親體VHH26及其六種不同人源化變異體的胺基酸序列比對。如Kabat方案所定義之CDR H1、H2及H3環殘基係藉由上文粗線鑑別。使用Clustal-Omega進行序列比對(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)。

圖 3A-3B展示六種人源化VHH26變異體(H1-H6)之生物物理學表徵。圖 3A展示來自金屬-親和性層析之Ni-拉下溶離份之SDS-PAGE。VHH26-H1、VHH26-H2、VHH26-H3、VHH26-H4、VHH26-H5及VHH26-H6人源化變異體之SEC及Octect-BLI概況概述於圖 3B之表中。單體%係基於人源化VHH26 ProA純化後之SEC概況。ND=未確定。

圖 4展示在完整工程化Wnt促效劑形式之情形下結合至指定親體及變異體VHH域之LRP5或LRP6的EC50。

圖 5A-5D展示Fzd5,8子族特異性Wnt模擬物R2M13-26之活體外活性：圖 5A為展示R2M13-26之Fzd5,8結合物IgG與其在Octet上量測之目標Fzd5 CRD的結合親和力的圖。圖 5B為展示R2M13-26之Fzd5,8結合物IgG與其在Octet上量測之目標Fzd8 CRD的結合親和力的圖。圖 5C為展示R2M13-26之Fzd5,8結合物IgG與其在Octet上量測之10 Fzd CRD中之每一者的結合特異性的圖。圖 5D為展示在Huh-7細胞中量測20nM RSPO2存在下R2M13-26、Fzd1,2,7-特異性模擬物1RC07-26及Fzd1,2,5,7,8盤式特異性模擬物R2M3-26之劑量依賴性STF活性的圖。

圖 6提供存在於經工程化WNT促效劑，R2M13-h26中之重鏈及輕鏈序列。重鏈VH及輕鏈VL域帶下劃線；VHH26域呈斜體；且CDR殘基呈粗體。

圖 7提供在經包括以下之各種非人源化及人源化型式處理後急性大腸炎之DSS模型及所得血清抗體暴露之示意圖：R2M13-03-LALAPG (非人源化)、R2M13-26-LALAPG (非人源化)、R2M13-36-LALAPG (非人源化)、R2M13-人源化-03-LALAPG、R2M13-人源化-26-LALAPG、R2M13-人源化-36-LALAPG、R2M13-人源化-03-N297G及R2M13-人源化-36-N297G。

圖 8提供展示經包括以下之各種非人源化及人源化型式處理之動物之疾病活動性指數的圖：R2M13-03-LALAPG (非人源化)、R2M13-26-LALAPG (非人源化)、R2M13-36-LALAPG (非人源化)、R2M13-人源化-03-LALAPG、R2M13-人源化-26-LALAPG、R2M13-人源化-36-LALAPG、R2M13-人源化-03-N297G及R2M13-人源化-36-N297G。在10天時間，圖自上而下之線對應於：R2M13-h03-LALAPG、抗-GFP、R2M13-h03-N297G、R2M13-03-LALAPG、R2M13-36-LALAPG、R2M13-h36-N297G (R2M13-h36-LALAPG後面)、R2M13-h36-LALAPG、R2M13-h26-LALAPG及無DSS，其中「h」指示人源化。

圖 9提供在經自左至右包括以下之各種對照及非人源化及人源化型式處理之動物中細胞介素含量的圖：無DSS、抗GFP、親體R2M13-03-LALAPG (非人源化)、親體R2M13-26-LALAPG (非人源化)、親體R2M13-36-LALAPG (非人源化)、R2M13-人源化-03-LALAPG、R2M13-人源化-26-LALAPG、R2M13-人源化-36-LALAPG、R2M13-人源化-03-N297G及R2M13-人源化-36-N297G。

圖 10提供展示經包括以下之各種對照及非人源化及人源化型式處理之動物之脂質運載蛋白2含量的圖：無DSS、抗-GFP、親體R2M13-03-LALAPG (非人源化)、親體R2M13-26-LALAPG (非人源化)、親體R2M13-36-LALAPG (非人源化)、R2M13-人源化-03-LALAPG、R2M13-人源化-26-LALAPG、R2M13-人源化-36-LALAPG、R2M13-人源化-03-N297G及R2M13-人源化-36-N297G。

圖 11提供展示在經工程化WNT促效劑處理後急性大腸炎之DSS模型中活體內恢復上皮緊密型連結標記物ZO-1的顯微照片。亮染色區域為ZO-1。

圖 12提供展示在經工程化WNT促效劑，R2M13-h26-LALPG處理後與對照抗GFP相比在急性大腸炎之DSS模型中活體內修復受損的結腸上皮組織之顯微照片。

圖 13提供展示在經工程化WNT促效劑，R2M13-h26-LALPG處理後與對照抗GFP相比在急性大腸炎之DSS模型中活體內恢復包括結腸上皮細胞、杯狀細胞及簇細胞之上皮細胞譜系的顯微照片。

圖 14提供展示在靜脈內注射之後如在向大鼠投與之後，且與自小鼠獲得之資料相比各種時間量測血清中抗體之量由所確定的親體R2M13-26-LALAPG及人源化R2M13-26-LALAPG之藥物動力學(PK)的圖式及表。

圖 15提供急性慢性大腸炎DSS動物模型系統之示意圖。

圖 16提供展示經R2M13-h26-LALAPG (R2M13-h26)或R2M13-26-LALAPG (R2M13-26)處理之動物之疾病活動性指數(DAI)的圖。在10天時間時，自上而下之圖的直線對應於：抗-GFP、環孢靈A、R2M13-h26 (2 mpkx1)、R2M13-h26 (20 mpkx1)、R2M13-h26 (1 mpkx2)、R2M13-h26 (6 mpkx1)、R2M13-26 (3 mpkx2)、R2M13-h26 (10 mpkx2)、R2M13-26 (10 mpkx2)及無DSS。

圖 17展示具有與抗GFP或環孢素A相比經R2M13-h26處理之動物的H&E染色的橫結腸之截面。

圖 18提供慢性DSS大腸炎動物模型之圖。

圖 19展示在指定處理之後橫結腸部分的顯微照片。

圖 20提供展示在指定處理之後組織學評分及整體疾病指數之圖式。

圖 21提供展示在指定處理之後脂質運載蛋白-2及IL-6表現之圖。

圖 22為慢性DSS大腸炎動物模型之圖。

圖 23提供展示經R2M13-h26或IL12/23p40處理之動物的疾病活動性指數(DAI)的圖。

圖 24提供展示在經R2M13-h26或IL12/23p40處理之動物中指定細胞介素之表現的圖。

圖 25提供展示在經R2M13-26-LALAPG (R2M13-26)之指定處理之後Axin2及Ki67表現之圖式。

圖 26A-26C展示在未受損及DSS處理之小鼠上來自scRNA-seq之結腸中偵測到的不同細胞類型：圖 26A為展示scRNA seq實驗之實驗設計的示意圖。圖 26B為前兩個主成分的圖：指示譜系/組織層，展示了自中心輻射的三個組。圖 26C提供展示DSS損傷對不同組織層/譜系中表現之差異性基因數目的較強影響的圖。左側上之圖展示與未受損小鼠相比DDS小鼠在第5天及第6天來自各組織層之差異性表現之基因數目；右側上之圖展示與抗GFP相比經R2M13-26處理在第5天及第6天來自各組織層之差異性表現之基因數目。每一條自上而下之組織/譜系對應於上皮組織、免疫及基質，在第5天時經R2M13-26-LALAPG (R2M13-26)處理後幾乎所有上皮組織。

圖 27A-27C展示儘管DSS在第5天影響所有組織層，R2M13-26-LALAPG (R2M13-26)之主要作用係在第5天處理之後24小時時對上皮組織產生影響。圖 27A-27C展示R2M13-26-LALAPG (R2M13-26)增加Wnt目標及細胞週期基因表現且擴增損傷之後上皮組織中之前驅細胞。圖 27A為列出所選擇之最高基因組(來自GSEA)的表，該等基因組富集於R2M13-26處理之DSS-受損的上皮組織(相對於抗-GFP處理之DSS-受損的上皮組織中)。圖 27B及 27C展示組織中之scRNA-seq分析的驗證。圖 27B展示在未受損之DSS/抗-GFP及DSS/ R2M13-26處理組(第5天)；經DAPI標記之細胞核中兩種Wnt目標基因Axin2及Cdkn3的RNA原位雜交。比例尺表示100微米。圖 27C展示針對未受損之DSS/抗-GFP及DSS/ R2M13-26處理之結腸樣品(第6天)；經DAPI標記之細胞核中之增殖性細胞標記物MKI67的免疫組織化學。比例尺表示100微米。

圖 28A-28E展示R2M13-26-LALAPG (R2M13-216)處理引起DSS模型中之加速、恰當的分化：圖 28A-D提供展示上皮細胞之均勻歧管近似預測值(UMAP)曲線的圖。圖 28A為展示按簇/細胞類型著色之上皮細胞之UMAP的圖。圖 28B為展示按細胞之實驗條件著色之UMAP的圖。圖 28C為展示基於相似性連接簇的簇中心點之最小生成樹的圖。僅包括未因受損細胞幾乎完全填充之細胞類型。將幹細胞及TA2細胞類型合併且設定為起始簇。圖 28D為展示的圖已完成 slingshot-預測之譜系軌跡指示自幹細胞/TA細胞至EnteroPrecur細胞在朝向不成熟及成熟腸上皮細胞過程中的轉變(上升)；且自幹細胞/TA細胞向下分叉，朝向簇狀細胞或朝向杯狀及腸道內分泌細胞，其中其之間的第二分叉點來自杯狀前驅細胞類型。圖 28E提供在48-小時/天6個時間點在沿著源自圖 28D中呈現之腸上皮細胞譜系之偽時間及譜系軌跡軸之指定位置處來自指定處理組之細胞數目的直方圖。豎直紅色虛線表示所有三個曲線中沿著軸線之相同位置，而分佈展示多少細胞存在於該位置處。偽時間次序(x軸)在每一繪圖中相同且自左至右排序。圖28E展示朝向腸上皮細胞譜系之進展在經R2M13-26-LALPG (R2M13-26)處理下增加。

圖 29A-29L 及 29A ' -29L '展示在小腸上皮組織中呈現差異性表現模式之捲曲受體家族：圖 29A-29L提供展示如RNAscope原位雜交由所確定分別在正常十二指腸中之10 Fzd受體(Fzd1-10)、Axin2及Lgr5中之每一者之表現的圖。圖 29A ' -29 ' L提供具有放大視圖的圖，顯示小腸隱窩中之Fzd表現。圖E'中之箭頭指示腸道幹細胞。

圖 30A-30T展示捲曲受體家族在結腸中以不同量表現：圖 30A-30J提供展示在藉由RNAscope原位雜交檢測之未經處理小鼠中10 Fzd受體之結腸表現。圖 30K-30T提供展示在經7天之4% DSS處理之小鼠中10 Fzd受體之結腸表現的圖。

圖 31展示藉由降低嗜中性白血球浸潤來降低發炎。S100A9為嗜中性白血球浸潤之標記物，且CD45為活化發炎細胞之標記物。

圖 32提供展示在投與指定劑量之R2M13-h26後血清ALP增加的圖。

圖 33為描繪用於量測R2M13-h26之平均血清濃度之藥物動力學分析的草圖。

圖 34提供展示組2-4中之R2M13-h26之平均血清濃度的圖。

圖 35提供展示在第一劑量之後量測之個別血清R2M13-h26濃度的圖。箭頭指向30 mg/kg劑量組中之兩隻動物，在給藥後3天開始加速清除。

圖 36A-36B提供展示一對針對R2M13-h26之不同劑量組在第0-7天( 圖 36A)及第28-42天( 圖 36B)天時ALP增加的圖。

圖 37提供展示在單次劑量R2M13-h26之後平均血清R2M13-h26濃度的圖。

圖 38提供展示在單次劑量之R2M13-h26之後針對R2M13-h26之PK參數的表。


          <![CDATA[<110>  美商蘇羅森營運公司(Surrozen Operating, Inc.)]]>
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          Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
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                      420                 425                 430         
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                  435                 440                 445             
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                  35                  40                  45              
          Ala Asn Met Arg Gly Gly Gly Tyr Met Lys Tyr Ala Gly Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Glu Ser Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
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              290                 295                 300                 
          Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 
                          325                 330                 335     
          Gly Glu Cys 
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
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          <![CDATA[<400>  3]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450         
          <![CDATA[<210>  4]]>
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          <![CDATA[<400>  4]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Ala Asn Ile Gln Ser Ile Glu 
                      20                  25                  30          
          Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Ala Asn Met Arg Gly Gly Gly Tyr Met Lys Tyr Ala Asp Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr 
                          85                  90                  95      
          Val Lys Leu Arg Asp Glu Asp Tyr Val Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 
                  115                 120                 125             
          Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 
              130                 135                 140                 
          Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 
                  195                 200                 205             
          Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 
              210                 215                 220                 
          Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 
                          245                 250                 255     
          Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 
                      260                 265                 270         
          Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 
                  275                 280                 285             
          Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 
              290                 295                 300                 
          Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                          325                 330                 335     
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  R2M13-03人源化N297G-重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450         
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211]]>>  336]]&gt;
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          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Ala Asn Ile Gln Ser Ile Glu 
                      20                  25                  30          
          Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Ala Asn Met Arg Gly Gly Gly Tyr Met Lys Tyr Ala Asp Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr 
                          85                  90                  95      
          Val Lys Leu Arg Asp Glu Asp Tyr Val Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 
                  115                 120                 125             
          Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 
              130                 135                 140                 
          Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 
                  195                 200                 205             
          Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 
              210                 215                 220                 
          Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 
                          245                 250                 255     
          Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 
                      260                 265                 270         
          Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 
                  275                 280                 285             
          Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 
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          Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 
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          Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                          325                 330                 335     
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  7]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450         
          <![CDATA[<210>  8]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
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          <![CDATA[<400>  8]]>
          Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Met Lys Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met 
                  115                 120                 125             
          Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 
              130                 135                 140                 
          Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 
                      180                 185                 190         
          Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 
                  195                 200                 205             
          Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 
                          245                 250                 255     
          Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 
                      260                 265                 270         
          Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 
                  275                 280                 285             
          Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 
              290                 295                 300                 
          Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 
          305                 310                 315                 320 
          Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 
                          325                 330                 335     
          Glu Cys 
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  9]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450         
          <![CDATA[<210>  10]]>
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          <![CDATA[<400>  10]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 
                  115                 120                 125             
          Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 
              130                 135                 140                 
          Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 
                      180                 185                 190         
          Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 
                  195                 200                 205             
          Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 
                          245                 250                 255     
          Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 
                      260                 265                 270         
          Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 
                  275                 280                 285             
          Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 
              290                 295                 300                 
          Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 
          305                 310                 315                 320 
          Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 
                          325                 330                 335     
          Glu Cys 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  R2M13-26人源化N297G-重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450         
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  338]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  R2M13-26人源化N297G-輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 
                  115                 120                 125             
          Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 
              130                 135                 140                 
          Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 
                      180                 185                 190         
          Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 
                  195                 200                 205             
          Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 
                          245                 250                 255     
          Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 
                      260                 265                 270         
          Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 
                  275                 280                 285             
          Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 
              290                 295                 300                 
          Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 
          305                 310                 315                 320 
          Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 
                          325                 330                 335     
          Glu Cys 
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  R2M13-36親體LALAPG-重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450         
          <![CDATA[<210>  14]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>  ]]>
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          <![CDATA[<400>  14]]>
          Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Asn Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 
                      100                 105                 110         
          Ser Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 
                          165                 170                 175     
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 
                      260                 265                 270         
          Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 
                  275                 280                 285             
          Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 
              290                 295                 300                 
          His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
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          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  R2M13-36人源化LALAPG-重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450         
          <![CDATA[<210>  16]]>
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          <![CDATA[<220>  ]]>
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          <![CDATA[<400>  16]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ile Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 
                      100                 105                 110         
          Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 
                          165                 170                 175     
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 
                      260                 265                 270         
          Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 
                  275                 280                 285             
          Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 
              290                 295                 300                 
          His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  R2M13-36人源化N297G-重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  R2M13-36人源化N297G-輕鏈]]&gt;
          <br/>
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          <br/>
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          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ile Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 
                      100                 105                 110         
          Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 
                          165                 170                 175     
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 
                      260                 265                 270         
          Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 
                  275                 280                 285             
          Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 
              290                 295                 300                 
          His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 
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          Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                          325                 330 
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          <![CDATA[<400>  19]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  20]]>
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
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          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 
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          Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
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          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
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          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
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          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
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                  115                 
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  VHH26_H5]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  VHH26_H6]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  VHH26 (親體)]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Met Lys Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  60]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  VHH26_ 親體-比對1]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr 
              50                  55                  60  
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  60]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  IGHV3-23_IGHJ6-比對1]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 
              50                  55                  60  
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  60]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  VHH26-H1-比對1]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr 
              50                  55                  60  
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  60]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>  
          <![CDATA[<223>  VHH26-H2-比對1]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr 
              50                  55                  60  
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  60]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  VHH26-H3-比對1]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr 
              50                  55                  60  
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  60]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  VHH26-H4-比對1]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr 
              50                  55                  60  
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  60]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  VHH26-H5-比對1]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr 
              50                  55                  60  
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  60]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  VHH26-H6-比對1]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr 
              50                  55                  60  
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  58]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  VHH26_親體-比對2]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Met 
          1               5                   10                  15      
          Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Ser Ser 
              50                  55              
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  57]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                  35                  40                  45              
          Gly Gln Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
              50                  55          
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          Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
              50                  55                  
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          Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 
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          Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
              50                  55                  
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          Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
              50                  55                  
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          Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
              50                  55                  
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          Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
              50                  55                  
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          Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
              50                  55

Claims

一種經工程化WNT促效劑，其包含： (a)一或多個結合域，其結合至一或多個FZD；及 (b) 一或多個結合域，其結合至LRP5、LRP6，或LRP5及LRP6兩者，其中該經工程化WNT促效劑包含與SEQ ID NO:1至25中之任一者，或圖2、圖6、表1或表3中所揭示之多肽序列，或其結合片段具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的多肽序列；及視情況，其中結合至一或多個FZD之該一或多個結合域結合至： i) FZD5； ii) FZD 8； iii) FZD 1； iv) FZD 2； vi) FZD 7； vi) FZD 5及FZD 8； vii) FZD 1、FZD 2及FZD 7； viii) FZD 1、FZD 2、FZD 7、FZD 5及FZD 8； ix) FZD4； x) FZD9；或 xi) FZD10。
如請求項1之經工程化WNT促效劑，其包含： (a)與SEQ ID NO: 1至25中之任一者或表3中所揭示之序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的多肽序列；或 (b)包含存在於圖2中所揭示之VHH域、VH域或VL域中之任一者中的CDR序列中之兩者或三者的多肽序列，視情況其中該多肽序列包含存在於SEQ ID NO: 1至25中之任一者中的CDR。
如請求項2之經工程化WNT促效劑，其包含： (a)與SEQ ID NO: 1具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及與SEQ ID NO:2具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列； (b)與SEQ ID NO: 3具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及與SEQ ID NO:4具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列； (c)與SEQ ID NO: 5具有至少80%、至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及與SEQ ID NO:6具有至少80%、至少90%、或至少95%同源性之多肽序列； (d)與SEQ ID NO: 7具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及與SEQ ID NO:8具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列； (e)與SEQ ID NO: 9具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及與SEQ ID NO:10具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列； (f)與SEQ ID NO: 7具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及與SEQ ID NO:8具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列； (g)與SEQ ID NO: 11具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及與SEQ ID NO:12具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列； (h)與SEQ ID NO: 13具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及與SEQ ID NO:14具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列； (i)與SEQ ID NO: 15具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及與SEQ ID NO:16具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列；或 (j)與SEQ ID NO: 17具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，及與SEQ ID NO: 18具有至少90%、或至少95%同源性之多肽序列，視情況其中該多肽包含存在於SEQ ID NO: 1至18中之任一者中的CDR。
如請求項1至3中任一項之經工程化WNT促效劑，其中結合至LRP5、LRP6或LRP5及LRP6兩者之該一或多個結合域經人源化。
如請求項1至4中任一項之經工程化WNT促效劑，其包含經修飾Fc域，其中該經修飾Fc域包含LALAPG或N297G修飾。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之經工程化WNT促效劑及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
一種能夠藉由增加WNT路徑傳訊治療之治療個體中疾病或病症的方法，其包含向該個體投與如請求項1至5中任一項之經工程化WNT促效劑，或如請求項6之醫藥組合物。
如請求項7之方法，其中該疾病或病症為胃腸道病症。
如請求項8之方法，其中該胃腸道病症為發炎性腸病。
如請求項9之方法，其中該發炎性腸病選自由以下組成之群：克隆氏病(Crohn’s disease；CD)、伴有瘺形成之CD及潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis；UC)。
如請求項7至10中任一項之方法，其中該經工程化WNT促效劑係經口或非經腸投與。
如請求項11之方法，其中該經工程化WNT促效劑係靜脈內、腹膜內或皮下投與。
一種增加細胞中之WNT傳訊的方法，其包含使該細胞與如請求項1至5中任一項之經工程化WNT促效劑接觸。
一種調節患有胃腸道病症之個體之一或多種組織或細胞中的WNT路徑分子之表現的方法，其包含向該個體投與如請求項1至5中任一項之經工程化WNT促效劑或如請求項6之醫藥組合物。
如請求項14之方法，其中該WNT路徑分子為表4、5、6、7、8及11中之任一者中所列之基因或蛋白質。
如請求項14之方法，其中該WNT路徑分子選自由以下組成之群：麩胱甘肽過氧化酶2 (glutathione peroxidase 2；Gpx2)、干擾素調節因子8 (interferon regulatory factor 8；Irf8)、Rel、RelA、RelB、RNAse4、血管生成素(Angiongenin)、Gsta3、Rnf43、Axin2、Ki67、緊連蛋白(Occludin)或表7中所列之基因或蛋白質中之任一者。
如請求項14至16中任一項之方法，其中該WNT路徑分子之表現在投與之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少20%、至少50%、至少80%、至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
如請求項14至17中任一項之方法，其中該組織為上皮組織及/或該等細胞為胃腸上皮細胞，視情況：幹細胞、TA1、TA2、杯狀細胞前驅細胞、損傷誘發之替代性前驅細胞(injury-induced alternative progenitor；Alt前驅細胞)、損傷誘發之替代性腸上皮細胞(Alt腸上皮細胞)、腸上皮細胞前驅細胞(EnteroPrecur)、杯狀細胞前驅細胞(杯狀_PC)、杯狀細胞1、杯狀細胞2或腸道內分泌細胞。
一種刺激患有胃腸道病症之個體之組織修復的方法，其包含向該個體投與如請求項1至5中任一項之經工程化WNT促效劑，或如請求項6之醫藥組合物。
如請求項19之方法，其中該組織修復係藉由調節至少一種選自由以下組成之群的WNT路徑分子而刺激：與細胞週期相關之基因、與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之基因、與上皮細胞修復及障壁恢復相關之基因及/或表4、5、6、7、8及11中之任一者中所列之基因中之任一者。
如請求項20之方法，其中與該細胞週期相關之該等基因係選自表4中所提供之彼等，或Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1及Rrm2。
如請求項20之方法，其中與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之該等基因係選自表8中所提供之彼等，及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1、Hes6及Adh1。
如請求項20之方法，其中與上皮細胞修復及障壁恢復相關之該等基因係選自表6中所提供之彼等，或Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16及Sprr2a3。
如請求項20至23中任一項之方法，其中該WNT路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少20%、至少50%、至少80%、至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
一種減少患有胃腸道病症之個體之發炎的方法，其包含向該個體投與如請求項1至5中任一項之經工程化WNT促效劑，或如請求項6之醫藥組合物。
如請求項19之方法，其中該發炎係藉由調節至少一種選自由以下組成之群的分子而減少：表5中所提供之基因，或Adamdec1、Atf3、Gpx2、Gsta3、Gstm1、Gstm3、Gdf15、Ihh、Il18、Lyz2、Nox1、Reg4、Sycn、Selenbp1、Tgfbr2及Timp3。
如請求項25或請求項26之方法，其中該發炎在胃腸道組織，視情況上皮組織中係經減少的。
如請求項27之方法，其中該胃腸組織包含胃腸上皮細胞，視情況：幹細胞、TA1、TA2、杯狀細胞前驅細胞、損傷誘發之替代性前驅細胞(Alt前驅細胞)、損傷誘發之替代性腸上皮細胞(Alt腸上皮細胞)、腸上皮細胞前驅細胞(EnteroPrecur)、杯狀細胞前驅細胞(杯狀_PC)、杯狀細胞1、杯狀細胞2或腸道內分泌細胞。
如請求項25至28中任一項之方法，其中該WNT路徑分子之表現在投與之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少20%、至少50%、至少80%、至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
如請求項7至29中任一項之方法，其中該經工程化Wnt促效劑為R2M13-h26或包含功能性變異體或其片段。
一種產生、培養或維持器官、組織、細胞或類器官培養物之方法，其包含使該器官、組織、細胞或類器官培養物與以下接觸： a)如請求項1至5中任一項之經工程化WNT促效劑；或 b)如請求項6之醫藥組合物。
如請求項31之方法，其用於活體外維持該器官或組織之存活率，該方法包含： a)使獲自供體之器官或組織活體外與包含該經工程化WNT促效劑的組合物或該醫藥組合物接觸，視情況藉由灌注；或 b)使供體器官或組織活體內與包含該經工程化WNT促效劑的組合物或該醫藥組合物接觸。
如請求項31之方法，其用於產生或維持該類器官培養物，該方法包含視情況藉由在包含該經工程化WNT促效劑之培養基中培養該類器官培養物而接觸該類器官培養物。
一種恢復具有受損上皮組織之個體中之胃腸上皮障壁的方法，其包含向該個體投與如請求項1至5中任一項之經工程化WNT促效劑，或如請求項6之醫藥組合物。
如請求項34之方法，其中該胃腸上皮障壁係藉由調節至少一種選自由以下組成之群的WNT路徑分子而恢復：與細胞週期相關之基因、與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之基因、與上皮細胞修復及障壁恢復相關之基因及/或表4、5、6、7、8及11中之任一者中所列之基因中之任一者。
如請求項35之方法，其中與該細胞週期相關之該等基因係選自表4中所提供之彼等，或Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1及Rrm2。
如請求項35之方法，其中與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之該等基因係選自表8中所提供之彼等，及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1、Hes6及Adh1。
如請求項35之方法，其中與上皮細胞修復及障壁恢復相關之該等基因係選自表6中所提供之彼等，或Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16及Sprr2a3。
如請求項35至38中任一項之方法，其中該WNT路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少20%、至少50%、至少80%、至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
如請求項39之方法，其中該WNT路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑約24小時內的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加。
如請求項34至40中任一項之方法，其中該個體之受損上皮組織在投與該經工程化Wnt促效劑約6天內實質上恢復。
如請求項34至41中任一項之方法，其中向該個體投與該經工程化Wnt促效劑不會誘導正常上皮組織之過度增殖。
一種誘導患有胃腸道病症之個體之上皮前驅細胞分化的方法，其包含向該個體投與如請求項1至5中任一項之經工程化WNT促效劑，或如請求項6之醫藥組合物。
如請求項43之方法，其中該上皮細胞分化係藉由調節至少一種選自由以下組成之群的WNT路徑分子而誘導：與細胞週期相關之基因、與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之基因、與上皮細胞修復及障壁恢復相關之基因及/或表4、5、6、7、8及11中之任一者中所列之基因中之任一者。
如請求項44之方法，其中與該細胞週期相關之該等基因係選自表4中所提供之彼等，或Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1及Rrm2。
如請求項44之方法，其中與幹細胞及前驅細胞更新及分化相關之該等基因係選自表8中所提供之彼等，及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1、Hes6及Adh1。
如請求項44之方法，其中與上皮細胞修復及障壁恢復相關之該等基因係選自表6中所提供之彼等，或Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16及Sprr2a3。
如請求項44至47中任一項之方法，其中該WNT路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑之後的該個體之一或多種組織及/或細胞中增加至少20%、至少50%、至少80%、至少兩倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
如請求項48之方法，其中該WNT路徑分子之表現在投與該經工程化Wnt促效劑約24小時內的該個體之一或多種組織及/或細胞中係經增加的。
如請求項43至49中任一項之方法，其中投與該經工程化Wnt促效劑誘導該個體之前驅細胞分化至腸上皮細胞、杯狀細胞、腸道內分泌細胞或簇細胞中。
如請求項43至50中任一項之方法，其中實質性前驅細胞分化係在投與該經工程化Wnt促效劑約48小時內的該個體中誘導。
如請求項43至51中任一項之方法，其中向該個體投與該經工程化Wnt促效劑不會誘導正常上皮組織之過度增殖。