CN110945128A - 用于治疗肺纤维化的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

对烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)的表达和/或功能的抑制可以减少、预防或逆转与肺纤维化的发作和进展相关联的病理生理学血管变化。提供了抑制NAMPT的表达和功能以用于治疗和预防有需要的受试者的肺纤维化的组合物和方法。这些组合物和方法可用于通过减少肺部炎症、异常成肌纤维细胞累积和胶原在纤维变性灶中的沉积来调节促进肺纤维化发展和进展的病理生理过程。

Description

用于治疗肺纤维化的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年4月14日提交的题为“用于治疗纤维化的方法(Methods fortreating fibrosis)”的美国临时申请第62/485,863号的优先权，该美国临时申请的内容以全文引用的方式并入。
序列表的引用
创建于2018年4月16日并且大小为17,398字节的以名为“UA_17_154_PCT_ST25.txt”的文本文件形式提交的序列表通过引用并入本文中。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在由退伍军人管理局授予的授权号1IK2 BXOOI477-01AI下在美国政府支持下完成的。美国政府在本发明中具有一定权利。
技术领域
本发明的领域总体上涉及用于降低与肺纤维化相关联的发病率和死亡率的组合物和方法。
背景技术
人纤维变性病症影响许多器官系统，包含心脏、血管、肾脏、肝脏和肺。据估计，在美国45％的死亡归因于以不同的纤维化程度为特征的病症。肺纤维化的最严重形式是特发性肺纤维化(IPF)，这是一种致命且不断恶化的病症。IPF的特征在于瘢痕组织形成过多并且肺实质遭到不可逆破坏，从而导致气体交换异常和呼吸衰竭。IPF的疾病进程是在不断恶化的；中数存活期少于三年。IPF在美国影响了大约20万人并且在全球范围内影响了五百万人。
即使在暴露停止后，急性或慢性损伤性暴露也可能发展为肺纤维化。因此，经历过这些吸入暴露的患者患上IPF的风险更高。衰老是公认的IPF危险因素(确诊时的平均年龄＝66)，从而导致老龄化人口产生巨大的医疗负担。IPF的患病率为男性20.2/100,000并且女性13.2/100,000。IPF在老年男性中最为普遍，并且吸烟是IPF的主要危险因素。据报道，美国成年人口中有20％的人使用烟草。
尽管公认氧化应激在纤维化和衰老中有作用，但已经证明，难以精确地靶向这一过程的关键介体。考虑到人口结构的这种变化，了解衰老对导致如IPF等年龄相关疾病的发病机理的一个或多个细胞/分子机制的贡献至关重要。鉴别IPF的有效治疗的主要限制是临床前动物模型无法可靠地反映人类IPF并且无法预测治疗剂在临床试验中的功效。这种失败的一个重要原因是纤维化在年轻小鼠的常规纤维化模型中自发消退。在使纤维化消退时，肺成肌纤维细胞(关键的‘瘢痕组织生成’细胞)经历细胞凋亡以促进愈合。相比之下，来自患有非消退纤维化的年老小鼠的成肌纤维细胞取得了部分地由NADPH-氧化酶-4(Nox4)的持续表达介导的衰老和细胞凋亡抗性表型。类似地，来自IPF患者的肺成肌纤维细胞表现出衰老和细胞凋亡抗性，这与升高的Nox4表达相关联。然而，在衰老/IPF的背景下促使Nox4持续存在并且成肌纤维细胞具有细胞凋亡抗性的机制仍然是未知的。
尽管有两种针对IPF的药物最近已经获得了FDA批准，但并无药物治疗表明决定性地改善了IPF患者的生活质量并且这些药物仅表明将死亡延迟六个月。当前药物仅适当地减缓慢了肺衰弱的进展。没有可以‘逆转’纤维化的可用疗法。现有的治疗干预主要是预防性的(在受伤前或受伤时给药)，而不是治愈性的。显然，需要改进的疗法来治疗IPF和其它纤维变性疾病，以改善患者体验和效果。
因此，本发明的目的是提供用于减少和逆转与受试者的肺纤维化的发作和进展相关联的病理生理过程的组合物和其使用方法。
本发明的另一个目的是提供用于减少或预防患有特发性肺纤维化的受试者中的不适当或有害的纤维化的组合物、装置、移植物和其使用方法。
本发明的进一步的目的是提供有效治疗受试者的肺纤维化的一种或多种症状的组合物的剂量调配物。
发明内容
已经确定，对烟酰胺磷酸核糖基转移酶(“NAMPT”)的表达和功能的抑制减少或预防了导致人的肺纤维化(PF)发作和进展的病理生理过程。描述了剂量调配物，这些剂量调配物包含有效减少或预防人的PF进展的量的一种或多种NAMPT抑制剂。
提供了用于减少或预防有需要的受试者的PF进展的药物组合物，这些药物组合物包含一种或多种烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)酶活性抑制剂、或作为炎性受体的配体的一种或多种NAMPT抑制剂、或一种或多种NAMPT受体(TLR4)抑制剂、或其组合、以及用于全身施用的药学上可接受的赋形剂。NAMPT酶活性抑制剂、作为配体的NAMPT抑制剂或NAMPT受体抑制剂包含具有抗体的结合特异性的抗体、抗体片段和蛋白质。在一些实施例中，该抑制剂是抗体的F(Ab)片段或抗体的二价F(Ab)2'片段。
这些组合物相对于对照受试者有效地减少或预防与受试者的PF的病理相关联的一个或多个生理过程。例如，在一个实施例中，这些组合物相对于对照受试者有效减少或预防受试者的与PF相关联的细胞活动中的一个或多个，这些细胞活动包含成肌纤维细胞累积、细胞外基质过多沉积，该细胞外基质过多沉积包含胶原和纤连蛋白沉积。还提供了剂量调配物，其用于以介于10微克到3.5mg小分子(被定义为分子量为2,000道尔顿，更优选地小于1,000道尔顿)/kg人体重量之间或介于10与400mg抗体或抗体片段/kg人体重之间的量全身性地递送一种或多种小分子NAMPT抑制剂、或一种或多种NAMPT受体TLR4抑制剂、或其组合。提供了包含一种或多种NAMPT抑制剂的剂型，该一种或多种NAMPT抑制剂以介于约10mg与约200mg之间的量通过静脉内输注施用，该量包含10mg和200mg。在一些实施例中，该NAMPT抑制剂是抗体或其片段，该抗体或其片段以介于约10mg与约400mg之间的量通过输注施用，该量包含10mg和400mg。在一些实施例中，NAMPT抑制剂是F(Ab)2'片段，该片段以介于约10mg与约200mg之间的量通过输注施用，该量包含10mg和200mg。小分子优选地每周一次口服施用，并且抗体和抗体片段优选地每月一次静脉内施用一段时间。
提供了包含通过输注向受试者施用介于10mg与400mg之间的量的抗NAMPT抗体、其抗体片段或具有其结合特异性的蛋白质的方法。在一些实施例中，在一小时的过程中执行该输注。可以重复施用，优选地每月一次。
NAMPT的示例性受体是人Toll样受体4(TLR4)。因此，NAMPT或NAMPT受体的抑制剂的示例性性组合物包含结合NAMPT或TLR4并预防或减少NAMPT与TLR4之间相互作用的抗体、抗体片段或具有这些抗体的结合特异性的蛋白质。在一些实施例中，该抗NAMPT抗体或其片段或具有其结合亲和力的蛋白质与NAMPT蛋白上的表位结合，该表位包括选自由Glu445、Gly446、Lys447、Gly448、Asp449、Leu450、Glu451、Glu452、Tyr453、Gly454、His455、Asp456和Leu457组成的组的一个或多个残基。在其它实施例中，该NAMPT抑制剂与NAMPT分子结合以预防或减少NAMPT的同源二聚化。在其它实施例中，该NAMPT抑制剂与TLR4受体结合以预防NAMPT的受体活化。
还提供了功能性核酸形式的NAMPT抑制剂、NAMPT配体抑制剂或其组合。示例性功能性核酸包含反义分子、siRNA、miRNA、适体、核酶、三链体形成分子、RNAi和外部引导序列。在一些实施例中，从表达载体表达一种或多种功能性核酸。
还提供了小分子形式的NAMPT表达或功能抑制剂、NAMPT受体连接小分子抑制剂、或NAMPT受体TLR4抑制剂、或其组合。示例性小分子抑制剂包含FK-866、MS-1-82、Rari049和Al-pii135。提供了剂量调配物，这些剂量调配物包含以介于约10μg/kg与约3.5mg/kg接受者体重之间的量施用的一种或多种NAMPT酶功能小分子抑制剂、NAMPT受体连接小分子抑制剂或NAMPT受体TLR4抑制剂，该量包含10μg/kg和3.5mg/kg。在示例性实施例中，该小分子抑制剂是约2.5mg/kg该接受者体重的量的Rari049。
这些组合物还可以包含递送媒剂，最通常为如无菌盐水等水溶液。其它示例性递送媒剂包含纳米颗粒、微粒、胶束、乳剂、合成脂蛋白颗粒、脂质体、碳纳米管、凝胶或包衣。该组合物还可以包含一种或多种另外的治疗剂。示例性的另外的治疗剂包含血管活性化合物、抗新内膜剂、化学治疗剂、甾体和非甾体抗炎药、常规免疫治疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、趋化因子和生长因子。
提供了包含以介于1mg与400mg之间，更优选地介于20mg与200mg之间的量通过输注向受试者施用抗NAMPT抗体、其抗体片段或具有其结合特异性的NAMPT抑制剂蛋白的方法。这些方法相对于未治疗的对照受试者减少或预防了受试者的肺部炎症和组织重塑。在一些实施例中，在一小时的过程中执行该输注。可以重复该施用，例如，每小时一次、每天一次、每周一次、每月一次或更低频率地。小分子优选地每周一次口服施用，并且抗体和抗体片段优选地每月一次静脉内施用一段时间。这些方法可以将NAMPT抑制剂和一种或多种药物的组合施用于该受试者。
这些方法减少或预防处于患上PF的风险或被诊断患有PF的受试者的PF的症状中的一种或多种症状。这些方法相对于未治疗的对照受试者减少或预防受试者的成肌纤维细胞累积。这些方法可以将NAMPT抑制剂和一种或多种血管活性药物的组合施用于该受试者。
这些方法可以减少或预防有需要的受试者的PF或PF的一种或多种症状的发作或发展。可以减少、预防或以其它方式管理的PF症状包含呼吸困难、疲劳、心绞痛(胸痛)、晕厥、水肿(肿胀/发红)、右心衰竭、口服摄入减少、头晕、心动过速和心悸。
这些方法可以减少或预防急性或慢性PF的发作或发展，和/或相对于未治疗的对照受试者，治疗、预防或管理该受试者的急性或慢性PF的一种或多种症状。急性PF可能发生在重症监护环境中。
附图说明
图1A-1C示出了与年轻小鼠相比，年老小鼠展现出缺乏博来霉素(bleomycin)诱导的肺损伤的消退。
图2示出了，从年轻和年老小鼠中分离出的成纤维细胞响应于损伤展现出p16诱导，所述诱导在年轻小鼠中是暂时的，而在患有持续性纤维化的年老小鼠中是持续的。如与通过β-半乳糖苷酶(βgal)(衰老标志物)细胞染色的年轻组群相比，从年老小鼠的受损肺中分离的成纤维细胞展现出更高水平的衰老相关βgal活性。这些结果展现出，年老小鼠的未消退纤维化与衰老成肌纤维细胞的持续存在相关联。
图3示出了在评估的对应时间点(对照组，3周，2个月)处来自年轻和年老小鼠的成纤维细胞中ROS的生成。
图4A和图4B示出了与年轻小鼠相比，来自肺损伤后年老小鼠的肺组织切片在纤维变性区域显示出更低水平的细胞凋亡(TUNEL+细胞)。从年老小鼠中分离的成纤维细胞展现出细胞凋亡抗性，较少凋亡细胞对细胞凋亡诱导剂星形孢菌素(staurosporine)具有抗性(图4A)。与抗凋亡表型的获取一致，年老小鼠的肺展现出升高的Bcl-2水平(图4B)。
图5示出了杂合的NAMPT小鼠Nampt+/-被保护以免于博来霉素诱导的肺损伤和全肺中可溶性胶原所反映的肺纤维化(与受伤后3周的WT小鼠相比)。与WT小鼠(50％，n＝5/10)相比，Nampt+/-小鼠响应于损伤展现出增加的存活率(80％，n＝8/10)。这些研究展现了在体内靶向Nampt产生了保护以免于肺纤维化的概念验证。
图6示出了iNampt在年老小鼠和患有IPF的人中异常调节。iNampt在来自衰老和IPF肺成纤维细胞的代表性成纤维细胞中上调。从晚期与早期IPF患者分离的成纤维细胞中的iNampt mRNA水平示出了NAMPT表达随着严重程度的增加而增加(图6)。
图7示出了Nampt(RT-PCR)的持续基因表达与在损伤后2个月的肺组织中评估的年老小鼠的未消退的纤维化相关联，相比之下，年轻小鼠的纤维化消退。损伤后2个月的时间点表示纤维化在年轻小鼠中主动消退而年老小鼠未消退的点。
图8A示出了eNampt增加了与纤维化有关的基因表达路径。将小鼠气管内注射60μg重组Nampt，并且在施用后4.5小时收获肺组织。从肺中提取RNA，并且进行3次微阵列分析(昂飞公司(Affymetrix)，小鼠430_2)。评估出改变的基因表达路径有630条。鉴别出与肺纤维化相关联的若干条路径中的显著富集。重要的是，响应全身性eNampt。“肺纤维化”是最显著改变的路径之一，是在评估出的640条路径中改变最大的第10条。图8B是水平条形图，示出了对NAMPT沉默的肺内皮细胞的全基因组转录组学图谱分析和鉴别出差异调节路径的路径分析。这些结果支持eNampt在介导对肺损伤的纤维变性响应中的作用。
图9A和图9B示出了eNampt介导了促纤维变性成肌纤维细胞表型。用外源性eNampt以剂量依赖性方式对成纤维细胞进行处理，从而导致增加了通过蛋白免疫印迹对αSMA、Nox4、iNampt和GAPDH的表达。这些结果表明，eNampt介导了成纤维细胞向成肌纤维细胞分化。eNampt导致诱导了氧化剂信号传导，如通过Nox4表达和ROS生成的剂量依赖性增加(图9A)以及成纤维细胞衰老(图9B)展现的。这些研究展现出Nampt介导了促纤维变性肺成肌纤维细胞表型。
图10示出了eNampt的促纤维变性效果需要TLR4信号传导。eNampt介导先天免疫并经由其已知的受体TLR4转导促活信号。用或不用TLR4拮抗剂、竞争性TLR4抑制剂(RS-LPS，英杰公司(Invitrogen))治疗的肺成纤维细胞然后用/不用外源性eNampt(50ng/ml，48小时)治疗表明，TLR4阻断阻止了eNampt-TLR4介导的成肌纤维细胞分化、如通过蛋白质印迹确定的那样抑制了Nox4诱导并且导致ROS生成以剂量依赖性方式减少。
图11A和11B示出了Nampt有助于小鼠和人IPF成纤维细胞抵抗细胞凋亡。与WT小鼠相比，在从Nampt+/-分离的肺成纤维细胞中，星形孢菌素(300nM，8小时)诱导的对细胞凋亡标志物即切割的半胱天冬酶3以及PARP(图11A)的表达增加。图11B展现出，iNAMPT介导的针对肺成肌纤维细胞(这些细胞表达了高水平的iNampt)中星形孢菌素诱导的细胞凋亡的抗性需要iNampt酶活性，因为用FK-866预处理的IPF成纤维细胞显示出恢复的细胞凋亡。
图12A-E示出了NAMPT抑制剂FK-866(图12A)的化学结构，该化学结构被分为三个区域(图12B)并通过用N-杂环置换而变化以生成新的FK866类似物：MS-1-82(图12C)、Rari049(图12D)、Alpii135(图12E)；
图13是柱状图，示出了在FK866和FK类似物MS-1-82、Rari049、Alpii135存在的情况下在0.1、1和10μM的浓度下NAMPT的归一化活性；
图14是柱状图，示出了Nampt酶活性在通过TUNEL测定限定的H2O2诱导的细胞凋亡中的作用。NAMPT酶抑制剂FK-866阻断了H2O2诱导的细胞凋亡。
图15是柱状图，示出了肺内皮细胞NAMPT启动子的活性响应于IPF相关刺激而增加。在暴露4小时和24小时后，响应于VEGF(100ng/ml)或TGFβ1(2ng/ml)用NAMPT荧光素酶启动子转染的人肺EC示出了增加的荧光素酶活性。
具体实施方式
I.定义
术语“给药”或“剂量”是指为了达到治疗目的(例如治疗NAMPT相关病症)而施用物质(例如抗NAMPT抗体)。
术语“药学上可接受的载剂”涵盖如以下等标准药物载剂中的任何一种：磷酸盐缓冲盐溶液、水和如油/水或水/油乳剂等乳剂、以及各种类型的润湿剂。
术语“抑制(inhibit)”或该词的其它形式，如“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指阻碍或限制特定特性。应当理解，这通常与某个标准或预期值有关，即它是相对的，但并不总是需要引用标准或相对值。例如，“抑制”是指相对于标准物或对照物，阻碍、干扰或限制基因的活性。“抑制”还可以指相对于标准物或对照物，阻碍或限制蛋白质的合成、表达或功能。
“治疗(treatment/treating)”是指将组合物施用于患有不期望的病状(例如高血压或心血管病症)的受试者或系统。病状可以包含疾病。“预防(prevention/preventing)”是指将组合物施用于有患上病状的风险的受试者或系统。病状可能是疾病的诱因。将组合物施用于受试者的效果(治疗和/或预防效果)可以是但不限于停止病状的特定症状、减少或预防病状的症状、降低病状的严重程度、完全消融病状、稳定或延迟特定结果或特征的发展或进展、或最小化特定结果或特征发生的机会。
术语“结合”是指通常由于特异性或非特异性结合或相互作用(包含但不限于生物化学、生理学和/或化学相互作用)而表现出相互亲和力或结合能力的对应的一对分子或其部分之间的相互作用。“结合配偶体”或“配体”是指可以经历与特定分子特异性结合的分子。“生物结合”定义了分子对之间发生的类型的相互作用，这些分子包含蛋白质、肽、核酸、糖蛋白、碳水化合物或内源性小分子。“特异性结合”是指能够以显著高于其它类似生物实体的程度结合或识别结合配偶体(或有限数量的结合配偶体)的分子，如多核苷酸。
术语“抗体”是指结合靶抗原的天然或合成抗体。该术语包含多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子之外，术语“抗体”中还包含那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及结合靶抗原的人或人源化免疫球蛋白分子版本。因此，术语“抗体”涵盖具有组合地形成靶抗原的特异性结合位点的来自轻链免疫球蛋白分子的至少一个可变区和来自重链分子的至少一个可变区的分子。抗体可以是IgG抗体，例如，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”被定义为免疫球蛋白分子的可变区的与其靶标结合的至少一部分，即抗原结合区。抗体可以是抗原结合抗体片段的形式，包含Fab片段、F(ab')2片段、单链可变区等。完整分子的片段可以使用本领域熟知的方法生成并且包含酶消化和重组手段。
如本文所用的术语“单链Fv”或“scFv”如本文所使用的是指单链可变片段，该单链可变片段包含通过接头连接的单个多肽链中的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，该接头使scFv能够形成用于抗原结合的期望结构(即以供单个多肽链的VH和VL相互缔合以形成Fv)。VL区和VH区可以来源于亲本抗体或者可以化学或重组合成。
术语“可变区”旨在区分免疫球蛋白的这种结构域与抗体广泛共享的结构域(如抗体Fc结构域)。可变区包含“高变区”，该高变区的残基对抗原结合负责。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，通常在大约轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)处以及在大约重链可变结构域中的残基27-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处；Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》,第5版,公共卫生署(Public Health Service),国立卫生研究院(National Institutes of Health),贝塞斯达(Bethesda),马里兰州(MD.)(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,1987,《分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)》196:901-917)。
如本文中定义的，术语“框架区”或“FR”残基是除了高变区残基以外的那些可变结构域残基。
“中和抗体”(或“中和NAMPT活性的抗体”)旨在指其与NAMPT的结合导致NAMPT的生物活性受到抑制的抗体。NAMPT或其配体的生物活性的这种抑制可以通过测量NAMPT生物活性的一个或多个指标来评估，如细胞外NAMPT(体外或体内)的数量、NAMPT诱导的细胞活化以及NAMPT与NAMPT配体的结合。NAMPT生物活性的这些指标可以通过本领域已知的几种标准体外或体内测定中的一种或多种来评估(参见实例)。例如，在一个实施例中，通过抑制NAMPT诱导的对成纤维细胞或内皮细胞的活化来评估抗体中和NAMPT活性的能力。作为NAMPT活性的另外的或替代性参数，可以评估抗体通过NFKB抑制NAMPT诱导的转录活动的能力作为NAMPT诱导的细胞活化的量度。
可以使用任何形式的“抗原”来生成对靶抗原具有特异性的抗体。因此，引发的抗原可以含有单个表位、多个表位或者可以单独地或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合地是整个蛋白质。引发的抗原可以是分离的全长蛋白、细胞表面蛋白(例如，用通过抗原的至少一部分转染的细胞进行免疫)或可溶性蛋白(例如，仅用蛋白质的胞外结构域部分进行免疫)。抗原可以在经过基因修饰的细胞中产生。对抗原进行编码的DNA可以是基因组的或非基因组的(例如cDNA)。可以采用任何适合于转化感兴趣的细胞的遗传载体，包含但不限于腺病毒载体、质粒和非病毒载体，如阳离子脂质。
如本文所用，术语“特异性地结合”是指抗体与其同源抗原结合，而未与其它抗原显著结合。优选地，抗体与该第二分子以大于约105mol-1(例如，106mol-1、107mol-1、108mol-1、109mol-1、1010mol-1、1011mol-1和1012mol-1或更大)的亲和常数(Ka)与抗原“特异性地结合”。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“MAb”是指从基本上均质的抗体群获得的抗体，即，除了抗体分子的小子集中可能存在的可能天然存在的突变外，群中的各个抗体完全相同。
如本文所用，术语“抑制”是指减小活性、响应、病状、疾病或其它生物参数。这可以包含但不限于活性、响应、病状或疾病的完全消融。还还可以包含例如与天然或对照水平相比，活性、响应、病状或疾病减少10％。因此，与天然或对照水平相比，减少量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何减少量。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指通过一个多肽的氨基末端与另一个多肽的羧基末端之间形成的肽键将两个或更多个多肽连接或者通过氨基酸侧链之间的反应(例如每个多肽上的半胱氨酸残基之间的二硫键)将一个多肽与另一个多肽连接而形成的多肽。融合蛋白可以通过构成的多肽的化学偶联形成，或者可以从对单个连续融合蛋白进行编码的核酸序列表达为单个多肽。可以使用分子生物学中的常规技术来制备融合蛋白，以将框内的这两个基因连接成单个核酸序列，并且然后在产生融合蛋白的条件下在适合的宿主细胞中表达核酸。
如本文所用，术语“变体”是指不同于参考多肽或多核苷酸但保留了基本性质的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体在氨基酸序列上不同于另一种参考多肽。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常类似并且在许多区域完全相同。变体和参考多肽在氨基酸序列上的不同之处可以在于一个或多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)。取代的或插入的氨基酸残基可以是或者可能不是由遗传密码编码的残基。多肽的变体可以是天然存在的如等位基因变体，或者可以是已知并非天然地存在的变体。
可以对本公开的多肽结构进行修饰和改变，并且修饰和改变仍然获得了具有与多肽类似的特性的分子(例如保守性氨基酸取代)。例如，某些氨基酸可以取代序列中的其它氨基酸而不明显丧失活性。因为多肽的相互作用能力和性质限定了多肽的生物功能活性，所以可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代，但是这些氨基酸序列取代仍然获得了具有相似性质的多肽。
在进行这种改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。本领域中通常理解亲水氨基酸指数在赋予多肽相互作用生物学功能方面的重要性。已知某些氨基酸可以取代具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸并且仍然产生了具有类似生物活性的多肽。基于每种氨基酸的疏水性和荷电特性，为每种氨基酸指定亲水指数。这些指数为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
据信，氨基酸的相对亲水特性确定了所得多肽的二级结构，这进而限定了多肽与如酶、底物、受体、抗体、抗原和辅因子等其它分子的相互作用。本领域中已知的是，氨基酸可以被具有类似亲水指数的另一个氨基酸取代并且仍然获得功能上等同的多肽。在这种变化中，优选亲水指数在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水指数在±1以内的氨基酸的取代，并且甚至更加特别优选亲水指数在±0.5以内的氨基酸的取代。
也可以在亲水性的基础上进行相似氨基酸的取代，特别是在由此产生的生物学功能等同多肽或肽旨在用于免疫学实施例的情况下。已对氨基酸残基指定了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解的是，氨基酸可以取代具有类似亲水性值的另一种氨基酸并且仍然获得生物学上等同的，特别是免疫学上等同的多肽。在这种变化中，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代，并且甚至更加特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
如上文所概述的，氨基酸取代通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员熟知的并且包含(原始残基:示例性取代)：(Ala:Gly,Ser)、(Arg:Lys)、(Asn:Gln,His)、(Asp:Glu,Cys,Ser)、(Gln:Asn)、(Glu:Asp)、(Gly:Ala)、(His:Asn,Gln)、(Ile:Leu,Val)、(Leu:Ile,Val)、(Lys:Arg)、(Met:Leu,Tyr)、(Ser:Thr)、(Thr:Ser)、(Tip:Tyr)、(Tyr:Trp,Phe)和(Val:Ile,Leu)。实施例包含如上所述多肽的功能或生物学等同物。具体地说，多肽的实施例可以包含与感兴趣的多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列一致性的变体。如本文所用的术语“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链的另一个氨基酸残基置换掉的氨基酸取代。本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，这些侧链包含碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
术语“百分比(％)序列一致性”被定义为在必要时比对序列并引入间隙以获得最大百分比序列一致性之后，候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。可以用本领域技术中的多种方式来实现出于确定百分比序列一致性的目的进行的比对，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过已知方法确定用于测量比对的适当参数，包含在被比较序列的全长范围内实现最大比对所需的任何算法。
出于本文的目的，给定核苷酸或氨基酸序列C相对于给定核酸序列D的％序列一致性(该％序列一致性可以可替代地表述为给定序列C与给定序列D具有或包含一定％序列一致性)计算如下：
100乘以分数W/Z，
其中W是由序列比对程序在该程序对C和D的比对中评分为完全相同的匹配的核苷酸或氨基酸的数量，并且其中Z是D中核苷酸或氨基酸的总数。应当了解，当序列C的长度不等于序列D的长度时，C与D的％序列一致性将不等于D与C的％序列一致性。
术语“Koff”旨在指分子与其配体例如来自抗体/抗原复合物的抗体之间相互作用的解离速率常数。
如本文所用，术语“Kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
术语“成肌纤维细胞累积”是指成纤维细胞灶的存在，该成纤维细胞灶的存在是由细胞过度增殖、成肌纤维细胞中组合地细胞凋亡/程序性细胞死亡以及细胞内稳态丧失/新陈代谢紊乱和某些生长因子失调的生理过程引起的。
如本文所用，术语“每月给药方案”、“每月给药”和“每月施用”是指为了达到治疗目的(例如治疗NAMPT相关病症)向受试者施用物质(例如抗NAMPT抗体)的时间过程。每月给药方案不旨在包含每周给药方案。优选地每26-36天、更优选地每28-31天、甚至更优选地每28-30天并且最优选地每30天施用物质。
如本文所用，术语“人NAMPT”(在本文中缩写为hNAMPT或简称NAMPT)旨在指以120kD分泌形式存在的人烟酰胺磷酸核糖基转移酶，其生物活性形式由非共价结合的60kD分子的二聚体构成。NAMPT的结构进一步描述于例如Kim等人,《分子生物学期刊》362:66-77(2006)中。术语NAMPT旨在包含重组人NAMPT，该重组人NAMPT可以通过标准重组表达方法制备。人NAMPT基因是指NAMPT。
II.组合物
已经开发了包含一种或多种NAMPT抑制剂和/或一种或多种NAMPT受体抑制剂的剂量调配物，这些剂量调配物有效地减少或预防人的PF的发展和/或进展。用于治疗IPF的组合物包含：i)对NAMPT基因的表达和功能的抑制剂；ii)对NAMPT基因产物的酶活性的抑制剂；iii)对NAMPT基因产物与其受体TLR4(NAMPT/TLR4)的相互作用的操纵；iv)对循环细胞外NAMPT(eNAMPT)的中和；v)对与NAMPT/TLR4相关联的下游细胞信号传导事件中的一个或多个事件的操纵，如NFkB磷酸化/活化。NAMPT基因产物功能的丧失导致与组织重塑和瘢痕形成相关联的细胞过程中功能异常，从而使人类受试者的IPF的发作、发展和严重程度相关联地降低。NAMPT基因产物功能的丧失导致成肌纤维细胞累积减少，从而使与人类受试者的PF的发作、发展和严重程度相关联的细胞过程相关联地减少。
提供了用于通过阻断细胞内NAMPT酶(iNAMPT)和/或细胞外NAMPT细胞因子(eNAMPT)的表达和/或功能来预防或减少以成肌纤维细胞累积为特征的疾病的组合物。
A.抑制靶标
1.烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)
在一些实施例中，抑制靶标是烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)。NAMPT基因产物是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)补救路径中的限速酶，其在哺乳动物体内将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸以实现NAD+生物合成。
细胞外NAMPT蛋白的成熟形式是约120kDa的同源二聚体，每个单体具有约500个氨基酸残基(Takahashi等人,《生物化学期刊(J.Biochem.)》147:95-107(2010))。
已经证实，减少或抑制NAMPT酶的功能的突变减少或阻止了产生PF的生理过程。据信，对NAMPT酶的调制提供了用于调制产生与PF相关联的成肌纤维细胞累积的生理过程的手段。
a.NAMPT基因
人NAMPT基因(NAMPT)位于7号染色体处(区段7q22.3；碱基对106,248,285到106,286,326)。人NAMPT基因产物的核酸序列在本领域中是已知的。例如，参见NCBI参考序列：NM_005746.2，智人
烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)mRNA，这提供了核酸序列：
Figure BDA0002278758100000131
(SEQ ID NO:1)。还公开了与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％氨基酸序列一致性的核苷酸序列。
b.NAMPT酶
NAMPT多肽是分子量为约52,521Da的473氨基酸胞质蛋白(也称为烟酰胺磷酸核糖基转移酶，前B细胞克隆增强因子(PBEF)蛋白)。通过NAMPT基因转录有3种mRNA变体，长度为2.0、2.4和4.0千碱基(kb)。2.4-kb变体是最丰富的，并且其开放阅读框对长度为473个氨基酸(aa)的蛋白质进行编码，预测大小为约52kDa(Samal等人,《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》14(2),1431-1437(1994))。已经在人内皮细胞中发现该变体，在这些人内皮细胞中，该变体能够通过上调VEGF和VEGFR以及分泌MCP-1来诱导血管生成。在人脐内皮细胞中，NAMPT增加了蛋白酶MMP 2/9的水平。NAMPT还发现于除B细胞外的各种免疫细胞中并且已被证明抑制了巨噬细胞和成纤维细胞的细胞凋亡。细胞外NAMPT(eNAMPT)已被证明增加了NFkB活化和随后对如TNF-α、IL-1β、IL-16和TGF-β1等炎性细胞因子以及趋化因子受体CCR3的诱导。NAMPT还增加了CD14+单核细胞、巨噬细胞和树突细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的产生，增强了T细胞的有效性并且参与了B和T淋巴细胞的发育(Sun等人,《细胞因子与生长因子综述(Cytokine&growth factor reviews)》24(5):433-442(2013))。
NAMPT酶晶体结构详细描述于Kim等人,《分子生物学期刊》362:66-77(2006)中。NAMPT是二聚体II型磷酸核糖基转移酶。酶的活性位点在两个NAMPT分子相互作用的二聚体界面处。在脱辅酶结构中，硫酸根离子代替NMN的磷酸根结合。Asp219与烟酰胺的酰胺之间的氢键阻止酶与烟酸或喹啉酸形成氢键。NAMPT的晶体结构可在蛋白质数据库中通过PDBID号2G95、2G96和2G97获得。人NAMPT酶的氨基酸序列在本领域中是已知的。例如，参见GenBank登录号NP_005737.1：
Figure BDA0002278758100000141
Figure BDA0002278758100000151
(SEQ ID NO:2)
与SEQ ID NO:2具有例如至少80％、85％、90％、95％、99％或100％氨基酸序列一致性的NAMPT多肽。
虽然NAMPT酶已与许多不同的细胞活动相关联，但是在PF的发作和进展中，NAMPT酶的生物学功能在很大程度上仍然是未知的。
Wang等人,《自然结构与分子生物学(Nat Struct Mol Biol)》13,661-662(2006)中描述的NAMPT酶的X射线晶体结构中描述了NAMPT酶成熟形式内的二聚化区域。界面中涉及的残留物包含Ser199和Ser200。
NAMPT蛋白可以通过与选自以下的一个或多个残基氢键合的相互作用而与一个或多个配体相互作用：Glu445、Gly446、Lys447、Gly448、Asp449、Leu450、Glu451、Glu452、Tyr453、Gly454、Gln455、Asp456和Leu457。这些残基形成可以以类似于MD-2的方式与TLR4相互作用的环。
2.NAMPT受体
在一些实施例中，抑制靶标是NAMPT的受体，如Toll样受体4(TLR4)。Toll样受体4是人体中由TLR4基因编码的蛋白质。TLR4是toll样受体家族的成员跨膜蛋白，该toll样受体家族属于模式识别受体(PRR)家族。TLR4的活化导致细胞内NF-κB信号传导路径和炎性细胞因子产生，这负责活化先天免疫系统。其最为熟知的是识别脂多糖(LPS)，存在于多种革兰氏阴性菌(例如奈瑟氏球菌属(Neisseria spp.)和所选革兰氏阳性菌中的组分。其配体还包含几种病毒蛋白、多糖和各种内源性蛋白，如低密度脂蛋白、β防御素和热休克蛋白。
人TLR4基因(TLR4)位于9号染色体处(区段9q32-q33)(Georgel等人,PLoS ONE4(11):e7803(2009))。人TLR4基因产物的核酸序列在本领域中是已知的。例如，参见NCBI参考序列：AAY82268.1，智人toll样受体4(TLR4)mRNA，这提供了核酸序列：
Figure BDA0002278758100000161
(SEQ ID NO:3)。还公开了与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％氨基酸序列一致性的核苷酸序列。
人TLR4的氨基酸序列在本领域中是已知的。例如，参见GenBank登录号AAY82268.1：
Figure BDA0002278758100000171
(SEQ ID NO:4)。
还描述了与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％氨基酸序列一致性的TLR4多肽。
淋巴细胞抗原96，也称为“MD2”，是与细胞表面上的TLR4缔合并且使TLR4能够对LPS作出响应的蛋白质。MD-2还使TLR4能够对各种内毒素LPS部分结构、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性脂磷壁酸作出响应，但对革兰氏阳性菌、肽聚糖和脂肽无响应。MD-2与TLR4和TLR2在物理上缔合，但与TLR2的缔合比与TLR4的缔合弱。MD-2和TLR4增强了彼此的表达(Dziarski等人,《内毒素研究期刊(J Endotoxin Res.)》6(5):401-5(2000))。
已经证实，TLR4是细胞外NAMPT(eNAMPT)的受体(Camp等人,《科学报告(SciRep.)》5:13135(2015))。eNAMPT可以在与MD2相互作用的区域中与TLR4结合。因此，描述了在与MD2相互作用的区域中与TLR4结合的抗体、小分子和功能性核酸。
B.NAMPT和NAMPT受体的抑制剂
阻断NAMPT表达和/或NAMPT的功能可以减少或阻止导致慢性和急性PF发作和发展的免疫过程。描述了抑制或减少NAMPT酶的转录、转译或功能或者抑制NAMPT与TLR4(NAMPT/TLR4)相互作用的药剂。
NAMPT抑制剂可以与NAMPT基因或NAMPT多肽结合并直接或间接阻断NAMPT多肽的生物功能。抑制剂还可以阻断构成NAMPT的下游生物功能的一个或多个信号传导路径的生物功能。在一些实施例中，NAMPT抑制剂通过阻止NAMPT多肽的内源性受体与NAMPT多肽相互作用或直接结合来发挥作用。抑制剂可以阻断涉及NAMPT多肽的蛋白质-蛋白质相互作用，或者这些抑制剂可以阻止或降低NAMPT酶和受体的复合物的功能活性。与NAMPT多肽直接结合的抑制剂可以通过直接闭塞NAMPT多肽上的活性位点或者通过间接闭塞(如通过硬脂酸阻断NAMPT相互作用)来发挥作用。例如，在一些实施例中，抑制剂阻塞或闭塞了蛋白质相互作用结构域的功能，如酶活性位点、或活性NAMPT多肽内的两个NAMPT单体之间的同源二聚化位点、或与受体相互作用的位点例如与TLR4相互作用的位点。在其它实施例中，抑制剂与空间上不同于活性位点的位置结合。因此，在某些实施例中，与NAMPT多肽结合的抑制剂可以通过机制来阻止NAMPT功能，这些机制包含但不限于：阻止或破坏二聚化、诱导寡聚化、诱导构象变化、阻止催化功能、诱导降解、诱导由免疫细胞摄取、阻止由靶细胞摄取、阻止配体结合、阻止磷酸化、诱导变性、阻止一个或多个转译后修饰或以其它方式改变NAMPT多肽的天然三级结构。
应当理解，通过NAMPT来引发或转导细胞信号传导路径可能需要通过NAMPT多肽来结合受体。因此，阻断涉及NAMPT的信号转导路径并任选地阻止NAMPT与其受体共连接的蛋白质、抗体或小分子是有用的免疫调节剂。下文讨论的NAMPT抑制剂的类别包含与NAMPT多肽直接结合的抗体、抗体的Fab部分和功能性核酸以及与NAMPT的配体结合的抗体、抗体的Fab部分和功能性核酸。
1.抗体
提供了通过与NAMPT酶、其受体或其辅助分子直接特异性地相互作用来抑制NAMPT的功能的抗体。抗体可以包含与NAMPT酶上的表位结合的抗原结合位点。抗体与NAMPT的结合可以通过一种或多种不同的机制来抑制或降低NAMPT酶的功能。通常，抗体可以在体外和体内降低或中和NAMPT生物活性。在一些实施例中，抗体对NAMPT具有高亲和力(例如，Kd＝10-8M或更小)、对NAMPT解离具有慢解离速率(例如，Koff＝10-3sec-1或更小)或其组合。
提供了全长抗体、其抗原结合片段和基于其的融合蛋白。有用的抗体和其抗原结合片段的典型特征是优选地以高亲和力和缓慢解离动力学与NAMPT或NAMPT的一个或多个配体结合。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段抑制NAMPT活性，包含NAMPT诱导的通过NFKB进行的转录(体外和体内)和NAMPT诱导的细胞活化。抗体可以是全长抗体(例如，IgG亚型1或IgG4抗体)或者可以仅包括抗原结合部分(例如，Fab、F(ab')2'scFv片段或F(Ab)单结构域)。示例性重组抗体结合包含SEQ ID NO.2中列出的氨基酸残基中的两个或更多个氨基酸残基的表位。
在一些实施例中，NAMPT的抑制剂或NAMPT的配体是具有抗体(如抗体片段)的抗原结合特异性的蛋白质。术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留与抗原(例如NAMPT)特异性地结合的能力的一个或多个抗体片段。
各种类型的抗体和抗体片段可以用于公开的组合物和方法中，包含任何类别的完整免疫球蛋白、其片段和至少含有抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白质。抗体可以是IgG抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。抗体可以是抗原结合片段的形式，包含Fab片段、F(ab')2片段、单链可变区等。抗体可以是多克隆或单克隆(mAb)。
单克隆抗体包含“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而一个或多个链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们特异性地结合靶抗原和/或表现出期望的生物活性即可(美国专利第4,816,567号；以及Martin等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,81:6851-6855(1984))。
抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的实例包含：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括在铰链区由二硫桥键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CHI结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)《自然(Nature)》341:544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是这两个结构域可以使用重组方法通过使这两个结构域能够制成单个蛋白链的合成接头来连接，在该单个蛋白链中，VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；例如，参见Bird等人(1988)《科学(Science)》242:423-426；以及Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊》85:5879-5883)。这种单链抗体也旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。
还涵盖了其它形式的单链抗体，如双抗体。双抗体是双价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头短得无法使同一条链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
a.抗体的特性
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段与由SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码的蛋白质内的表位特异性地结合。线性表位是由来自抗原的氨基酸的连续序列形成的表位。线性表位通常包含约5个到约10个连续氨基酸残基。抗体基于抗原的一级序列结合线性表位。因此，在一些实施例中，表位可以是线性表位并且可以包含SEQ ID NO:2的一级序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续氨基酸。“构象表位”是包含抗原的氨基酸序列的不连续部分的表位。抗体基于抗原的3-D表面特征、形状或三级结构结合构象表位。因此，在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段可以结合包含NAMPT酶的3-D表面特征、形状或三级结构的构象表位。在一些实施例中，3-D表面特征可以包含来自SEQ ID NO:2的任何数量的氨基酸、或其同源物、直向同源物、横向同源物或变体中的相应残基。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段干扰NAMPT和TLR4之间的相互作用。NAMPT可以通过结合环与TLR4结合，该结合环包含氨基酸序列EGKGDLEEYGHDL(SEQ ID NO:5)中与SEQ ID NO:2的氨基酸445到457相对应的部分或全部残基。在一些实施例中，SEQ IDNO:5用作用于产生抗NAMPT抗体的抗原的一部分或全部。在一些实施例中，SEQ ID NO:5或其残基形成抗体所结合的表位的一部分或全部。在一些实施例中，SEQ ID NO:5形成构象表位的一部分或全部。
在一些实施例中，只有当由SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码的蛋白质未被配体或小分子结合时，与由SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码的蛋白质中的表位特异性地结合的抗体或抗原结合片段才可以结合。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合部分以1×10-1/s-1或更小的Koff速率常数从人NAMPT或人NAMPT的配体中解离。优选地，抗体或其抗原结合部分以5×l0-4/s-1或更小的Koff速率常数从人NAMPT或人NAMPT的配体中解离。甚至更优选地，抗体或其抗原结合部分以1×10-4/s-1或更小的Koff速率常数从人NAMPT或人NAMPT的配体中解离。通常，抗NAMPT抗体结合由SEQ ID NO.2的氨基酸序列形成的NAMPT酶的三级结构表面处的两个或更多个氨基酸残基形成的表位。美国专利第9,409,983号中也讨论了示例性适合的抗体。
对NAMPT具有特异性的商业抗体是可获得的。例如，多克隆和单克隆兔、小鼠或大鼠抗人NAMPT抗体可从多个供应商商购获得(例如，兔抗人NAMPT多克隆抗体(赛默飞世尔科技公司(Thermo-Fischer scientific)目录#PA5-34858)；或小鼠抗人NAMPT单克隆抗体1D3A12(赛默飞世尔科技公司目录#MA5-15388)；或大鼠抗人NAMPT单克隆抗体362616(赛默飞世尔科技公司目录#MA5-24108))。
兔和小鼠多克隆和单克隆抗人TLR4抗体可从多个供应商商购获得(例如，兔抗人TLR4多克隆抗体(赛默飞世尔科技公司目录#48-2300)；或小鼠抗人TLR4单克隆抗体HTA125(赛默飞世尔科技公司目录#14-9917-82)；或小鼠单克隆抗体(赛默飞世尔科技公司目录#36-3700))。
在一些实施例中，使用了可商购获得的抗体。在一些实施例中，公开的组合物和方法中使用的抗体是人源化或嵌合抗体或其抗原结合片段(例如单链抗体)，其具有来自可商购获得的抗体的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR或者与可商购获得的抗体的对应CDR具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的其变体CDR。
在一些实施例中，抗体与可商购获得的抗NAMPT抗体或抗TRL4抗体或者本领域中以其它方式已知的抗NAMPT抗体或抗TRL4抗体具有相同的表位特异性。这可以通过产生含有可商购或以其它方式获得的抗体的互补位的重组抗体来实现。
b.抗体组合物和制造方法
为了制备与NAMPT或其受体特异性地结合的抗体，可以使用经过纯化的多肽、其片段、融合物或表位或从其核酸序列表达的多肽。使用经过纯化的NAMPT或NAMPT配体多肽或其受体片段、融合物或表位或从其核酸序列表达的蛋白质，抗体可以使用本领域已知的任何适合的方法来制备。
抗体可以在细胞培养物、噬菌体或各种动物中生成，这些动物包含小鼠、兔、绵羊和马。因此，在一些实施例中，抗体是哺乳动物抗体。噬菌体技术可以用于分离初始抗体或生成具有改变的特异性或亲合力特性的变体。这种技术是常规性的并且是本领域所熟知的。在一个实施例中，通过本领域已知的重组手段产生抗体。例如，可以通过用包括对抗体进行编码的DNA序列的载体转染宿主细胞来产生重组抗体。可以使用一种或多种载体来转染在宿主细胞中表达至少一个VL区和一个VH区的DNA序列。对抗体生成和产生的重组手段的示例性描述包含Delves,《抗体产生：基本技术(Antibody Production:EssentialTechniques)》(威利公司(Wiley),1997)；Shephard等人,《单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)》(牛津大学出版社,2000)；Goding,《单克隆抗体：原理和实践(MonoclonalAntibodies:Principles And Practice)》(学术出版社,1993)；《免疫学实验室指南(Current Protocols In Immunology)》(约翰威利父子公司(John Wiley&Sons),最新版本)。
可以通过重组手段修饰抗体，以增加抗体在介导期望的功能方面的功效。可以使用重组手段通过取代来修饰抗体。通常，取代将是保守性取代。例如，抗体的恒定区中的至少一个氨基酸可以用不同的残基置换。例如，参见美国专利第5,624,821号、美国专利第6,194,551号、申请第WO 9958572号；以及Angal等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》30:105-08(1993)。氨基酸修饰包含氨基酸的缺失、添加、取代。在某些情况下，进行这种改变是为了减少不期望的活动，例如补体依赖性细胞毒性。通常，通过共价或非共价连接提供可检测信号的物质来标记抗体。各种各样的标记和缀合技术是已知的并且在科学和专利文献中有大量报道。可以筛选这些抗体以与NAMPT或NAMPT配体多肽或其片段或融合物结合。例如，参见《抗体工程：实用方法(Antibody Engineering:A Practical Approach)》(牛津大学出版社,1996)。
具有期望的生物活动的适合的抗体可以通过体外测定以及以下体内测定如抑制肿瘤生长进行鉴别，这些体外测定包含但不限于：增殖、迁移、粘附、软琼脂生长、血管生成、细胞-细胞通信、细胞凋亡、转运、信号转导。
公开的组合物和方法中可以使用的抗体包含任何类别的整个免疫球蛋白(即完整抗体)、其片段以及至少含有抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白质。可变结构域在抗体之间在序列方面有所不同并且用于每个特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性通常不会均匀分布在抗体的可变结构域。其通常集中在轻链和重链可变结构域两者中的被称为互补性决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域的更高保守性部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，这四个FR区主要采用通过三个CDR连接的β-片层构型，这三个CDR形成连接β-片层结构的环并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密保持在一起并与来自另一条链的CDR一起促进抗体的抗原结合位点形成。
还公开了具有生物活性的抗体片段。无论是否与其它序列附接，片段都包含特定区域或特异性氨基酸残基的插入、缺失、取代或其它选定的修饰，条件是片段的活性与未经过修饰的抗体或抗体片段相比未显著改变或受损。
还可以采用用于生产对抗原蛋白具有特异性的单链抗体的技术。用于生产单链抗体的方法是本领域技术人员熟知的。可以通过使用短肽接头将重链和轻链的可变结构域融合在一起来创建单链抗体，从而在单个分子上重构抗原结合位点。在未显著破坏抗原结合或结合特异性的情况下，已经开发出单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C末端经由具有15到25个氨基酸的肽或接头与另一个可变结构域的N末端栓连。选择接头以允许重链和轻链以其适合的构象朝向结合在一起。
二价单链可变片段(di-scFv)可以通过连接两个scFv工程化。这可以通过产生具有两个VH区和两个VL区的单个肽链来完成，从而得到串联scFv。ScFv还可以设计为具有接头肽，这些接头肽对于这两个可变区来说短得无法折叠在一起(约五个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体。双抗体已被证明具有比相应scFv低高达40倍的解离常数，这意味着双抗体对其靶标具有更高的亲和力。更短的接头(一个或两个氨基酸)导致三聚体(三链抗体或三抗体)形成。四抗体也已经产生。其对靶标表现出的亲和力比双抗体高得多。
从基本上均质的抗体群中获得单克隆抗体，即，除了抗体分子的小子集中可能存在的可能天然存在的突变外，群中的各个抗体完全相同。单克隆抗体包含“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而一个或多个链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出预期的拮抗活性即可。
单克隆抗体可以使用产生单克隆抗体的任何程序来制备。在杂交瘤法中，小鼠或其它适当的宿主动物通常用免疫剂进行免疫以引发产生或能够产生将会与免疫剂特异性地结合的抗体的淋巴细胞。可替代地，淋巴细胞可以在体外免疫。
抗体还可以通过重组DNA法来制备。对公开的抗体进行编码的DNA可以使用常规程序(例如，通过使用能够与对鼠类抗体的重链和轻链进行编码的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。抗体或活性抗体片段的文库也可以生成并使用噬菌体展示技术进行筛选。
i.人和人源化抗体
许多非人抗体(例如源自小鼠、大鼠或兔的那些抗体)在人类中具有天然抗原性并且因此当施用于人类时会引起不期望的免疫响应。因此，在这些方法中使用人或人源化抗体是为了减少施用于人类的抗体引起不期望的免疫响应的机会。
可以采用能够在未产生内源性免疫球蛋白的情况下在免疫后产生完整的人类抗体库的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J(H))基因的纯合性缺失导致完全抑制了内源抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变小鼠中将导致在抗原激发后产生人抗体。
任选地，抗体在其它物种中生成并“人源化”以在人类中施用。非人(例如鼠类)抗体的人源化形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合亚序列)。人源化抗体包含人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望的特异性、亲和力和能力的如小鼠、大鼠或兔等非人物种(供体抗体)的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基置换。人源化抗体还可以包含既未在受体抗体中发现也未在输入的CDR或框架序列中发现的残基。人源化抗体通常将包含至少一个并且通常两个可变结构域中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区域，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。
用于人源化非人抗体的方法是本领域所熟知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称为“输入(import)”残基，这些残基通常取自“输入”可变结构域。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵对抗体分子的一条或多条多肽链进行编码的DNA序列。人源化基本上可以通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来执行。因此，非人抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或片段，其中基本上少于完整的人可变结构域已经被非人物种的对应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。
选择人可变结构域即轻链和重链可变结构域两者用于制造人源化抗体对于降低抗原性而言是非常重要的。根据“最佳适配”法，对照已知人可变结构域序列的整个文库对啮齿动物抗体的可变结构域的序列进行筛选。然后接受与啮齿动物的序列最接近的人序列作为人源化抗体的人类框架(FR)。另一种方法使用源自具有特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。同一框架可以用于若干种不同的人源化抗体。
有时，仅CDR移植就可能导致结合亲和力降低或完全丧失，因为游标区中的一组支撑框架残基对维持CDR的构象很重要((Foote和Winter,《分子生物学期刊》,224:487-499(1992))。这个问题可以通过将鼠类残基重新引入人类框架中来解决(Queen等人,《美国国家科学院院刊》,86(24):10029-33(1989))；这种取代通常被称为回复突变(back-mutation)。
大多数治疗蛋白在不同程度上具有免疫原性(Van Walle等人,《生物疗法专家意见(Expert Opin.Biol.,Ther.)》,7:405-418(2007)；Stas等人,剑桥大学出版社,剑桥,(2009))，而且甚至所谓的全人类抗体疗法可以含有免疫原性区域(Harding等人,《色谱法B生物医学科学与应用期刊(J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.)》,752:233-245(2001))。免疫原性是诱导Th(T辅助细胞)响应的能力，当独特的T细胞受体识别出与抗原呈递细胞上展示的II类HLA分子结合的肽时，该响应被触发。肽由被抗原呈递细胞内在化的蛋白质生成，这些肽然后通过内体切割路径进行加工。只有对II类HLA分子有足够亲和力的肽才会呈递在细胞表面上并且会可能触发Th响应。
因此，通过去除Th表位，可以降低免疫原性，这一过程被称为去免疫化(Chamberlain,《监管审查(The Regulatory Review)》,5:4-9(2002)；Baker和Jones,《药物研发新见(Curr.Opin.Drug.Discov.Devel.)》,10:219-227(2007))。这是通过预测治疗蛋白中的哪些肽可以与II类HLA分子结合并且随后引入消除或降低肽对II类HLA分子的结合亲和力的取代来实现的。
有几种II类HLA基因，并且几乎所有这些基因都具有较高的多态性。另外，II类HLA分子由α和β链组成，每个链源自不同的基因，在固有的多态性下，该基因进一步增加了变化。每个个体表达基因：DRA/DRB、DQA/DQB和DPA/DPB。其中只有DRA是非多态的。另外，还可能存在‘第二’DRB基因(DRB3、DRB4或DRB5)，其产物也与DRA链缔合。
去免疫化期间的焦点是DR同种异型，已知DR同种异型表达的水平高于DQ和DP(Laupeze等人,《人类免疫学(Hum.Immunol.)》,61:591-97(1999)；Gansbacher和Zier,《细胞免疫学(Cell Immunol.)》,117:22-34(1988)；Berdoz等人,《免疫学期刊(J.Immunol.)》,139:1336-1341(1987)；Stunz等人,“在转录水平上差异地调节HLA-DRB1和HLA-DRB4基因(HLA-DRB1 and-DRB4 genes are differentially regulated at the transcriptionallevel)”,《免疫学期刊》,143:3081-3086(1989))。对各个表位的严重程度的评估是基于混杂标准，即特异性表位结合的HLA同种异型的数量以及群体中同种异型的重要性(频率)和对HLA:肽复合物结合强度的定性评估。在个体的T细胞群体已被选择为不识别“自身肽”时，可以针对与通常不应诱发Th响应的(已知)自身肽相对应的肽来筛选去免疫化的蛋白质。
因为治疗抗体的重要性质是结合活性，所以在人源化和去免疫化期间提出的取代基本上不影响抗体的亲和力或稳定性是很重要的。在过去的20年中，已经收集了大量关于以下的信息：CDR的人源化和移植(Jones等人,《自然》,321,522-525(1986)；FooteandWinter,《分子生物学期刊》,224:487-499(1992))、抗体的生物物理性质(Ewert等人,《分子生物学期刊》,325:531-553(2003))、CDR环的构象(Chothia and Lesk,《分子生物学期刊》,196:901-917(1987)；Al-Lazikani等人,《分子生物学期刊》,273:927-948(1997)；North等人,《分子生物学期刊》,406:228-256(2011))、以及框架(Vargas-Madrazo和Paz-García,《分子识别期刊(J.Mol.Recognit.)》,16:113-120(2003)、Honegger等人,《蛋白质工程设计与选择(Protein Eng.Des.Sel.)》,22:121-134(2009))，这些信息与蛋白质建模(Desmet等人,《蛋白质(Proteins)》,48:31-43(2002)；Almagro等人,《蛋白质》,79:3050-3066(2011))方面的进展一起使以实质上保留的结合亲和力和稳定性准确地人源化和去免疫化抗体成为可能。
例如，可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可得到的并且是本领域技术人员熟悉的。说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些展示的检查允许对残基在候选免疫球蛋白序列的功能方面的可能作用进行分析，即对影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基进行分析。以此方式，可以从共有和输入序列中选择并且组合FR残基，使得期望的抗体特性，如增加一种或多种靶抗原的亲和力得以实现。CDR残基通常直接地并且在多数情况下实质上涉及影响抗原结合。
ii.单链抗体
用于生产单链抗体的方法是本领域技术人员熟知的。通过使用短肽接头将重链和轻链的可变结构域融合在一起来创建单链抗体，从而在单个分子上重构抗原结合位点。在未显著破坏抗原结合或结合特异性的情况下，已经开发出单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C末端经由具有15到25个氨基酸的肽或接头与另一个可变结构域的N末端栓连。选择接头以允许重链和轻链以其适合的构象朝向结合在一起。这些Fv缺乏天然抗体的重链和轻链中存在的恒定区(Fc)。
iii.单价抗体
体外方法也适合于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段特别是Fab片段可以使用本领域已知的常规技术来完成。例如，消化可以用木瓜蛋白酶进行。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生：两个完全相同的抗原结合片段，称为Fab片段，这些片段各自具有单个抗原结合位点；以及残留的Fc片段。胃蛋白酶处理产生片段，称为F(ab')2片段，该片段具有两个抗原组合位点并且仍能够交联抗原。
抗体消化时产生的Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域。Fab'片段与Fab片段的区别在于在包含来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸的重链结构域的羧基末端处加入了几个残基。F(ab')2片段是包括在铰链区由二硫桥键连接的两个Fab片段的双价片段；Fab'-SH是本文对于Fab'的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离巯基。抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
iv.杂交抗体
抗体可以是杂交抗体。在杂交抗体中，一个重链和轻链对与针对一个表位提出的抗体中发现的链对同源，而另一个重链和轻链对与针对另一个表位提出的抗体中发现的链对同源。这产生了多功能价的性质，即二价抗体具有同时结合至少两个不同表位的能力。这种杂交体可以通过融合产生了相应的组成抗体的杂交瘤或通过重组技术形成。当然，这种杂交体还可以使用嵌合链形成。
v.抗体片段的缀合物或融合物
在治疗上，可以通过将抗体或其片段与治疗剂偶联来使用抗体的靶向功能。抗体或片段(例如免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分)与治疗剂的这种偶联可以通过制备免疫偶联物或通过制备包括抗体或抗体片段和治疗剂的融合蛋白来实现。
抗体或片段与治疗剂的这种偶联可以通过制备免疫偶联物或通过制备融合蛋白或通过将抗体或片段与包括抗体或抗体片段和治疗剂的如siRNA等核酸连接来实现。
在一些实施例中，修饰抗体以改变其半衰期。
在一些实施例中，期望增加抗体的半衰期，使得抗体在循环中或治疗位点处存在更长时间段。例如，可以期望在循环中或待治疗位置处维持抗体的滴度延长的时间段。抗体可以被工程化为具有延长了半衰期的Fc变体，例如使用XtendTM抗体半衰期延长技术(加利福尼亚州蒙罗维亚Xencor公司(Xencor,Monrovia,CA))。在其它实施例中，减小抗DNA抗体的半衰期以减少潜在的副作用。所公开的缀合物可以用于修饰给定的生物响应。药物部分不应被解释为限于典型的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可以包含例如毒素如相思子毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素。
vi.利用蛋白质化学制备抗体的方法
生产如抗体等蛋白质的一种方法是通过蛋白质化学技术将两种或更多种肽或多肽连接在一起。例如，肽或多肽可以使用目前可用的实验室设备利用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化学成分进行化学合成。(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA))。本领域技术人员可以容易地理解，例如，可以通过标准化学反应来合成对应于抗体的肽或多肽。例如，肽或多肽可以合成并且不从其合成树脂切下，而抗体的另一个片段可以被合成并随后从树脂切下，从而暴露出在另一个片段上功能性地阻断的端基。通过肽缩合反应，这两个片段可以分别在其羧基和氨基末端经由肽键共价结合，以形成抗体或其片段。可替代地，肽或多肽如上所述在体内独立地合成。一旦分离，这些独立的肽或多肽就可以经由类似的肽缩合反应连接以形成抗体或其抗原结合片段。例如，克隆的或合成的肽区段的酶连接允许将相对较短的肽片段连接以产生较大的肽片段、多肽或整个蛋白质结构域。可替代地，可以利用合成肽的天然化学连接由较短肽片段以合成方式构建大肽或多肽。
这种方法由两步化学反应组成。第一步是无保护的合成肽-α-硫酯与含有氨基末端Cys残基的另一个无保护肽区段的化学选择性反应，以提供硫酯连接的中间体作为初始共价产物。在反应条件不变的情况下，这种中间体经历自发的快速分子内反应，以在连接位点处形成天然肽键。
2.功能性核酸
公开了抑制NAMPT基因的转录、转译或功能的功能性核酸。功能性核酸是具有特异性功能的核酸分子，如结合靶分子或催化特异性反应。如下文更详细地讨论的，功能性核酸分子可以分为以下非限制性分类：反义分子、siRNA、miRNA、适体、核酶、三链体形成分子、RNAi和外部引导序列。功能性核酸分子可以充当具有靶分子所拥有的特异性活性的效应子、抑制剂、调节剂和刺激剂，或者功能性核酸分子可以拥有独立于任何其它分子的从头活性。
功能性核酸分子可以与如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链等任何高分子相互作用。因此，功能性核酸可以与NAMPT基因的mRNA或基因组DNA相互作用，或者功能性核酸可以与NAMPT多肽本身相互作用。基于靶分子与功能性核酸分子之间的序列同源性，常常将功能性核酸设计为与其它核酸相互作用。在其它情况下，功能性核酸分子与靶分子之间的特异性识别并非基于功能性核酸分子与靶分子之间的序列同源性，而是基于三级结构的形成，该三级结构允许发生特异性识别。因此，所公开的组合物可以包含被设计成减少NAMPT酶的表达或功能的一种或多种功能性核酸。
在一些实施例中，组合物包含被设计成靶向并减少或抑制NAMPT mRNA的表达或转译或者被设计成减少或抑制NAMPT酶的表达、降低NAMPT酶的活性或增加NAMPT酶的降解的功能性核酸或多肽。在一些实施例中，组合物包含适合于功能性核酸的体内表达的载体。
在一些实施例中，功能性核酸或多肽被设计成靶向对SEQ ID NO:2的氨基酸序列进行编码的核酸或其补体的区段或其变体，该区段或其变体具有与对SEQ ID NO:2的氨基酸序列进行编码的核酸65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。
在其它实施例中，功能性核酸或多肽被设计成靶向SEQ ID NO:1的核酸序列或其补体的区段或其变体，该区段或其变体具有与SEQ ID NO:1至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。
在一些实施例中，功能性核酸例如在严格条件下与SEQ ID NO:1的核酸或其补体杂交。在一些实施例中，功能性核酸例如在严格条件下与对SEQ ID NO:2进行编码的核酸序列或其补体杂交。
制备和使用供所公开的功能性核酸在体内表达的载体的方法是本领域已知的，这些功能性核酸如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA、EGS、核酶和适体。
i.反义分子
功能性核酸可以是反义分子。反义分子被设计成通过或经典或非经典碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子与靶分子的相互作用被设计成通过例如RNA酶H介导的RNA-DNA杂合降解来促进对靶分子的破坏。可替代地，反义分子被设计成中断通常会在靶分子上发生的加工功能，如转录或复制。可以基于靶分子的序列来设计反义分子。存在许多用于通过找到靶分子的最易接近区域来优化反义效率的方法。示例性方法包含体外选择实验和使用DMS和DEPC进行的DNA修饰研究。优选的是，反义分子以小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12的解离常数(Kd)结合NAMPT靶分子。
ii.适体
功能性核酸可以是适体。适体是优选地以特异性方式与靶分子相互作用的分子。适体通常是长度范围为15-50个碱基的小核酸，这些小核酸折叠成限定的二级结构和三级结构，如茎环或G-四联体。适体可以结合如ATP和茶碱等小分子以及如逆转录酶和凝血酶等大分子。适体可以以小于10-12M的Kd与靶分子紧密结合。优选的是，适体以小于10-6、10-8、10-10、或10-12的Kd结合NAMPT靶分子。适体可以以非常高的特异性程度结合靶分子。例如，已经分离出在分子上仅在单个位置处不同的靶分子与另一个分子之间的结合亲和力差异大于10,000倍的适体。优选的是，适体与NAMPT靶分子的Kd低于与本底结合分子的Kd至少10、100、1000、10,000或100,000倍。优选的是，当比较如多肽等分子时，本底分子是不同的多肽。
iii.核酶
功能性核酸可以是核酶。核酶是能够在分子内或在分子间催化化学反应的核酸分子。优选的是核酶催化分子间反应。公开了不同类型的核酶，这些核酶催化了核酸酶或核酸聚合酶型反应，这些反应是基于在自然系统中发现的如锤头状核酶等核酶。还公开了自然系统中未发现的核酶，但这些核酶已经被工程化成从头催化特异性反应。优选的核酶切割RNA或DNA底物并且更优选地切割RNA底物。核酶通常通过识别靶底物和将靶底物与随后的切割结合来切割核酸底物。这种识别常常主要基于典型或非典型的碱基对相互作用。这种性质使核酶成为用于靶向核酸的特异性切割的特别好的候选物，因为对靶底物的识别是基于靶底物序列。
iv.三链体形成寡核苷酸
功能性核酸可以是三链体形成寡核苷酸分子。三链体形成功能性核酸分子是可以与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链体分子与靶区域相互作用时，形成被称为三链体的结构，其中有三条DNA链形成依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对的复合物。优选三链体分子，因为这些三链体分子可以以高亲和力和特异性结合靶区域。优选的是，三链体形成分子以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合靶分子。
v.外部引导序列
功能性核酸可以是外部引导序列。外部引导序列(EGS)是结合形成复合物的靶核酸分子的分子，该复合物通过RNA酶P识别，该RNA酶然后切割靶分子。可以将EGS设计成特异性地靶向所选择的RNA分子。RNA酶P辅助加工细胞内的转移RNA(tRNA)。可以招募细菌RNA酶P，以通过使用使靶RNA:EGS复合物模仿天然tRNA底物的EGS来切割几乎任何RNA序列。类似地，可以利用RNA的真核EGS/RNA酶P定向切割来切割真核细胞内的期望靶标。如何制备和使用EGS分子以便于切割各种不同的靶分子的代表性实例是本领域已知的。
vi.RNA干扰
在一些实施例中，功能性核酸通过RNA干扰(siRNA)诱导基因沉默。NAMPT基因的表达可以通过RNA干扰以高特异性方式有效地沉默。
最初通过添加双链RNA(dsRNA)观察到基因沉默(Fire等人,(1998)《自然》,391:806-11；Napoli等人,(1990)《植物细胞(Plant Cell)》2:279-89；Hannon,(2002)《自然》,418:244-51)。一旦dsRNA进入细胞，就会被称为Dicer的RNA酶III样酶切割成双链小干扰RNA(siRNA)，其长度为21-23个核苷酸并且在3'端含有2个核苷酸突出端(Elbashir等人,《基因与发展(Genes Dev.)》,15:188-200(2001)；Bernstein等人,《自然》,409:363-6(2001)；Hammond等人,《自然》,404:293-6(2000)；Nykanen等人,《细胞》,107:309-21(2001)；Martinez等人,《细胞》,110:563-74(2002))。iRNA或siRNA的作用或其用途不限于任何类型的机制。
在一个实施例中，siRNA在siRNA与靶标NAMPTRNA之间的序列一致性区域内触发如NAMPTmRNA等同源NAMPTRNA分子的特异性降解。
序列特异性基因沉默可以在哺乳动物细胞中使用合成的短双链RNA来实现，这些RNA模仿由酶dicer产生的siRNA(Elbashir等人,《自然》,411:494-498(2001))(Ui-Tei等人,《FEBS快报(FEBSLett)》,479:79-82(2000))。
siRNA可以化学或体外合成或者可以是在细胞内被加工成siRNA的短双链发夹状RNA(shRNA)的结果。例如，WO 02/44321公开了当与3'突出端碱基配对时能够对靶mRNA进行序列特异性降解的siRNA，本文通过引用的方式并入了制备这些siRNA的方法。通常使用算法和常规DNA/RNA合成仪来设计合成siRNA。供应商包含Ambion公司(得克萨斯奥斯汀(Austin,Texas))、ChemGenes公司(马萨诸塞州亚什兰(Ashland,Massachusetts)、Dharmacon公司(科罗拉多州拉斐特(Lafayette,Colorado))、格伦研究公司(GlenResearch)(弗吉尼亚州斯特林(Sterling,Virginia))、MWB生物技术公司(MWB Biotech)(德国埃斯伯斯贝格(Esbersberg,Germany))、Proligo公司(科罗拉多州博尔德(Boulder，Colorado))和凯杰公司(Qiagen)(荷兰温托(Vento,TheNetherlands))。siRNA还可以使用如Ambion公司的
Figure BDA0002278758100000322
siRNA构建试剂盒等试剂盒在体外合成。在一些实施例中，组合物包含表达功能性核酸的载体。由载体产生siRNA更常见的是通过转录短发夹RNA酶(shRNA)完成的。可获得用于生产包含shRNA的载体的试剂盒，如例如，Imgenex公司的GENESUPPRESSORTM构建试剂盒和英杰公司(Invitrogen)的BLOCK-ITTM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。在一些实施例中，功能性核酸是siRNA、shRNA或miRNA。
3.NAMPT的小分子抑制剂
描述了特异性地抑制NAMPT基因和/或基因产物的转录、转译或功能的小分子。NAMPT的小分子抑制剂是具有特异性功能的非蛋白非核酸分子，该特异性功能如结合靶分子或者减少、预防或以其它方式缓和特异性反应或相互作用。如下文更详细地讨论的，术语“小分子”通常包含分子量小于10,000Da的分子。与NAMPT或NAMPT受体特异性地相互作用的小分子可以充当具有靶分子所拥有的特异性活性的效应子、抑制剂、调节剂和刺激剂，或者小分子可以拥有独立于任何其它分子的从头活性。优选的小分子NAMPT抑制剂具有优异的剂量依赖性酶抑制性。示例性小分子NAMPT抑制剂包含NAMPT酶抑制剂FK-866以及FK-866类似物MS-1-82、Rari049和Alpii 135(参见图11A-11B)。
a.FK-866
Figure BDA0002278758100000321
式I：FK-866
FK-866((E)-N-[4-(1-苯甲酰基哌啶-4-基)丁基]-3-吡啶-3-基-2-丙烯酰胺)是有效的选择性非竞争性NAMPT抑制剂，该抑制剂抑制了NAMPT酶活性。FK-866(式C24H29N3O2；CAS号658084-64-1)可从多个商业来源获得(例如艾博抗公司(Abcam)目录号ab142148)。
b.FK-866的类似物
为了生成NAMPT抑制剂FK-866的功能性类似物，将FK-866结构分为三个区域并通过用N-杂环化合物置换而变化以生成FK866类似物。对MCT-PH的初步研究表明，Rari049有望作为预防性疗法降低右心室收缩压(RVSP)以及RV与LV的肥大率加上室间隔S重量(RVH-RV)。
Figure BDA0002278758100000331
式II：MS-1-82
Figure BDA0002278758100000332
式III：RARI-049
Figure BDA0002278758100000333
式IV：ALP-135
C.赋形剂、递送媒剂和装置
NAMPT抑制剂可以在具有或不具有递送媒剂的辅助的情况下施用。用于抑制剂的适当的递送媒剂是本领域已知的并且可以被选择以适合特定的抑制剂。在优选实施例中，通过静脉内注射或口服递送抑制剂。典型的载剂是盐水、磷酸盐缓冲盐水和其它可注射载剂。
可以将NAMPT抑制剂调配成包含一种或多种药学上可接受的载剂的药物组合物。
调配物也可以是悬浮液或乳液的形式并且任选地包含药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂。这种组合物包含稀释剂无菌水、具有各种缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲盐水、以及任选地添加剂，如洗涤剂和增溶剂(例如
Figure BDA0002278758100000341
20、
Figure BDA0002278758100000342
80，还称为聚山梨酯20或80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如硫柳汞(Thimersol)、苯甲醇)。非水溶剂或媒剂的实例是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油和玉米油等植物油、明胶以及如油酸乙酯等可注射有机酯。可以将调配物冷冻干燥并且在即将使用前重新溶解/重悬。调配物可以通过例如经由细菌保留过滤器过滤、通过将灭菌剂并入到组合物中、通过照射组合物或通过加热组合物来灭菌。
将抗体、具有抗体的结合性质的蛋白质、核酸或小分子以有效治疗NAMPT活性对受试者有害的疾病和病症的量施用于受试者。抗体与一种或多种另外的治疗剂一起或不一起施用。还描述了包含药物组合物和给药说明书的试剂盒以及含有药物组合物的预装载注射器。
III.使用方法
使用NAMPT抑制剂的方法包含向受试者全身施用有效量的包含一种或多种NAMPT抑制剂的组合物以预防、减少或抑制受试者中NAMPT的表达或功能。
提供了用于使用对NAMPT具有特异性的抗体来治疗PF的重复给药方案的方法。描述了每日、每周、每两周和每月给药方案。在优选实施例中，经由输注施用F(Ab)或F(Ab)2'，并且每月重复给药。与每周给药相比，每月给药具有许多优势，包含但不限于总注射次数减少、注射部位反应(例如局部疼痛和肿胀)次数减少、患者依从性增加(即由于注射频率降低)以及患者以及医疗保健提供者的费用的降低。
这些方法包含利用组合疗法，其中将人抗体与另一种治疗剂一起施用于受试者，该另一种治疗剂如结合其它靶标的一种或多种另外的抗体(例如结合NAMPT、NAMPT的一种或多种受体的抗体)、一种或多种细胞因子、可溶性NAMPT受体(例如可溶性TLR-4)和/或抑制NAMPT产生或活性的一种或多种化学剂(如小分子NAMPT抑制剂)或另一种血管活性药物。
A.治疗肺纤维化的方法
NAMPT抑制通过减少肺部炎症、减少成肌纤维细胞转化并预防纤维蛋白过多沉积而对肺纤维化具有治疗作用。在一些实施例中，治疗NAMPT活性有害的病症的方法包含肠胃外施用与人NAMPT或NAMPT的一种或多种特异性受体特异性地结合的人抗体、优选地重组人单克隆抗体、或其抗原结合片段。
在优选实施例中，一种或多种NAMPT抑制剂有效减轻、抑制或延迟与人类患者的血管增厚和僵化相关联的疾病、病症或病状的一种或多种症状。
使用NAMPT抑制剂的方法包含但不限于，被设计成抑制或阻断NAMPT酶的转录、转译或功能的方法可以用于调节细胞功能并预防、减少或逆转不期望的成肌纤维细胞累积。NAMPT的抑制可以用作诊断、预防或治疗机制，例如通过全身递送一种或多种NAMPT抑制剂或NAMPT配体抑制剂。下文更详细地讨论了使用任选地包含递送媒剂的所公开NAMPT抑制剂来治疗并预防疾病和病症的方法。
1.肺纤维化(PF)
提供了使用NAMPT抑制剂来治疗PH的方法。进行性纤维化是包含肝、肾、胰腺和肺在内的各个器官系统老化的标志。最致命且最具进行性的纤维变性肺病IPF不成比例地影响着老年人群并且现在被广泛认为是一种老化疾病。IPF的发病率和患病率随着年龄的增长而增加；在报告时，三分之二的IPF患者年龄超过60岁，诊断时的平均年龄为66岁。进一步地，IPF患者的存活率随年龄的增长而显著下降。
特发性肺纤维化(IPF)是肺纤维化的特异性亚组。IPF是由于不明原因导致肺部瘢痕化(纤维化)的肺部疾病。随时间推移，瘢痕化变得越来越严重并且变得难以深呼吸，并且肺部也无法吸入足够的氧气。IPF是间质性肺病的形式，主要涉及间质(肺气囊周围的组织和空间)并且不直接影响气道或血管。特发性肺纤维化的原因尚不完全清楚。
已将对IPF的家族和散发病例的近期研究与端粒缩短相关联，这进一步支撑了IPF可以表示年龄相关变性疾病过程的概念。在无突变的情况下IPF患者中的端粒缩短的一个或多个原因目前仍是未知的；然而，氧化应激表示一种潜在的机制。老化和纤维变性疾病都与累积的氧化剂负担相关联，并且来自IPF患者的肺组织展现出慢性氧化损伤的“特征(signature)”。考虑到肺部直接暴露于环境和吸入的空气，肺部特别容易被氧自由基损害和伤害。已经提出，在多个器官系统中介导纤维化的核心路径可以用作抗纤维变性药物开发的更好靶标。
IPF的常见危险因素包含遗传背景，多达20％的IPF患者的另一个家庭成员患有间质性肺病。在多于一个另外的家庭成员患有IPF的情况下，将该疾病称为“家族性肺纤维化”。
吸烟是另一个因素，大约75％的IPF患者目前或先前是吸烟者。胃酸反流(胃食管反流疾病[GERD])也是另一个因素，大约75％的IPF患者有胃酸反流(烧心)的症状。男性是另一个危险因素，大约75％的IPF患者是男性。年龄也很重要，几乎所有IPF患者的年龄均在50岁以上。
本领域的主要局限性在于缺乏可靠的动物模型来预测治疗剂在随后的临床试验中的功效。常用的模型是博来霉素诱导的肺损伤。然而，尽管使用这种动物模型时大量治疗剂具有临床前功效，但临床转译仍然较差；因此，使用这种动物模型对候选药物进行临床前评估已经遭到质疑。这种模型的显著局限性是纤维化的消退性，因为博来霉素诱导的肺损伤导致纤维变性响应有限，该响应在受伤后4-6周消退。
所描述的组合物和装置可以以有效减少或成肌纤维细胞累积的量施用于受试者，以减少或抑制平滑肌细胞增殖、迁移和其组合，并且由此治疗或预防受试者的PF和其它血管病症。在一些实施例中，使用含有NAMPT抑制剂的组合物，可以增加通过成肌纤维细胞累积而增厚和僵化的血管的开放性。因此，提供了在血管损伤、手术或外伤之前或之后向受试者施用含有NAMPT抑制剂的组合物，以在有需要的受试者体内预防、减少或逆转由于成肌纤维细胞累积而引起的血管变化的方法。
i.IPF的症状
指示需要治疗的IPF临床体征包含呼吸困难(即呼吸暂停、呼吸短促)(通常在运动期间)、慢性咳嗽、胸痛或紧绷、无法解释的体重减轻、食欲不振、疲劳和杵状指(即手指形状改变)。
约85％的IPF患者患有慢性咳嗽，持续时间超过8周。这常常是干咳，但一些人可能还会咳出唾液或痰。呼吸暂停可能会影响日常活动，如淋浴、爬楼梯、穿衣服和进食。随着肺部瘢痕化的恶化，呼吸暂停可能会妨碍所有活动。
用于鉴别出患有IPF的受试者的方法是本领域已知的。示例性临床诊断技术包含：肺功能测试(PFT；或呼吸测试)，用于测量肺部可以吸入/呼出的空气量以及肺部吸收氧气的能力；六分钟步行测试，用于确定身体健康状况以及静止和进行体育锻炼时血液中的氧量；胸部X光片：胸透，用于筛查间质性肺病并用于监测进展情况；血液测试，用于对间质性肺病的其它原因进行血清学鉴别；计算机断层扫描(CT扫描)，用于确定肺部瘢痕化的程度；支气管镜检，用于鉴别感染的存在或暗示间质性肺病的其它亚型；以及外科肺活检。
PF例如响应于用一种或多种NAMPT抑制剂进行治疗而改善的迹象包含以上症状中的任何一种或多种症状的改善。
构成PF治疗失败的标准包含以上症状的任何恶化/无变化、在患者已经服用药物的情况下有如毒性/耐受性/药物-药物相互作用问题等副作用、由于施用问题引起的感染、如6分钟步行距离等可观察到的因素的恶化或无变化、以及心肺测试结果恶化或无变化(例如耗氧量恶化)。
B.对照物
可以将NAMPT抑制剂的作用与对照物进行比较。适当的对照物是本领域已知的并且包含例如未治疗的细胞或未治疗的人类受试者。在一些实施例中，对照物是来自治疗的受试者或来自未治疗的受试者的未治疗组织。优选地，对照物的细胞或组织源自与经过治疗的细胞或组织相同的组织。在一些实施例中，未治疗的对照受试者患有与经过治疗的受试者相同的疾病或病状。例如，在一些实施例中，将受抗NAMPT治疗影响的药理学或生理学标志物或路径中的一种或多种与未治疗的对照细胞或未治疗的对照受试者中的相同药理学或生理学标志物或路径进行比较。例如，可以将经过抗NAMPT治疗的受试者与用其它PF抑制剂治疗的受试者进行比较，这些PF抑制剂如吡非尼酮(pirfenidone)、尼达尼布(nintedanib)、皮质类固醇、N-乙酰半胱氨酸、硫唑嘌呤、环磷酰胺或氧气。
与用NAMPT抑制剂治疗的受试者相比，用其它PF抑制剂治疗的受试者具有更高的术后PF发病率或受纤维化影响的组织减少的更少。
C.用于治疗PF的剂量和有效量
在一些体内方法中，以治疗有效量将NAMPT抑制剂的组合物施用于受试者，以用于治疗PF的体征或症状中的一种或多种。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻正在治疗的病症的一种或多种症状或以其它方式提供期望的药理学和/或生理学效果的剂量。精确剂量将根据各种因素而变化，如受试者依赖性变量(例如年龄、免疫系统健康状况等)、疾病或病症以及所实现的治疗。
对于所有公开的化合物，随着进行进一步的研究，将出现关于用于治疗各个患者的各种病状的适当剂量水平的信息，并且考虑到受体的治疗背景、年龄和总体健康状况，普通技术人员将能够确定正确给药。所选剂量取决于期望的治疗效果、施用途径和期望的治疗持续时间。通常，每次施用时，向人施用的剂量水平在0.1与15mg/kg体重之间。通常，对于静脉内注射或输注，剂量可以在30与400mg之间。优选地，将组合物调配成达到介于约1与约1,000μM之间的NAMPT抑制剂血清水平。
NAMPT抑制剂的药物组合物可用于调节促使包含成肌纤维细胞累积在内的PF的发作和进展的细胞过程。与成肌纤维细胞累积对细胞凋亡的沉积抗性相关联的示例性细胞过程增强了细胞外基质(ECM)的沉积，包含胶原蛋白和纤连蛋白的沉积。在一些实施例中，组合物降低或预防了NAMPT蛋白的表达和/或功能和/或该蛋白与如Toll样受体-4(TLR4)等配体的相互作用。因此，用于治疗和预防PF的组合物和方法包含预防、减少或以其它方式破坏TLR4与NAMPT(NAMPT/TLR4)之间的生理学相互作用的组合物和方法。通常，以有效减少或预防与NAMPT/TLR4生理学相互作用相关联的下游细胞过程中的一个或多个过程的量施用NAMPT/TLR4抑制剂。因此，还提供了减少或预防NAMPT/TLR4介导的对NFκB转录活动的活化以治疗受试者的PF的方法。在优选实施例中，一种或多种NAMPT抑制剂的量并未预防或减少受试者体内形成正常的健康血管新组织。通常，组合物包含量在0.1-15mg/kg人体重之间的一种或多种小分子NAMPT抑制剂。
1.靶标特异性效果
在一些实施例中，NAMPT抑制剂有效预防了平滑肌细胞的生物学活动，如增殖和活化。在一些实施例中，一种或多种抑制剂的量可以有效增加或刺激细胞中细胞凋亡的过程。
在一些实施例中，该一种或多种NAMPT抑制剂的量有效预防或减少了受试者体内的纤维蛋白沉积。在优选实施例中，与未治疗的对照物相比，一种或多种NAMPT抑制剂的量并未阻止受试者的伤口愈合或正常的健康血管新组织形成。在另一个实施例中，该一种或多种NAMPT抑制剂的量有效减少了成肌纤维细胞累积、异常/过多ECM产生和组织损伤的量。通常，将一种或多种NAMPT抑制剂以有效减少受试者的可溶性细胞外NAMPT量的量施用于受试者。因此，一种或多种NAMPT抑制剂可以有效地减少或预防由于细胞外NAMPT或由于可由细胞外NAMPT控制的下游信号传导事件而发生的一种或多种生物活动。例如，通过减少或预防细胞外NAMPT与TLR4之间的相互作用，NAMPT抑制剂可以减少或预防TLR4介导的对控制细胞活动的若干个信号传导路径的诱导，这些细胞活动包含细胞增殖、活化、趋化和肌动蛋白再组织。优选地，一种或多种NAMPT抑制剂的量并未阻止理想健康组织重塑作为健康伤口愈合和组织再生的组成部分发生。
NAMPT抑制剂可以以有效减少、预防或以其它方式或修饰NAMPT基因或NAMPT蛋白或一种或多种NAMPT受体的表达或功能的量的量施用。因此，在一些实施例中，可以以有效减少如HIF-1α、HIF-2α、STAT5和脯氨酸羟化酶2(PHD2)等调节NAMPT的转录的转录因子中的一个或多个的量施用抑制剂。
在慢性PF的情况下，成肌纤维细胞在肺内累积的过程是不必要的和不期望的，因此，增强成肌纤维细胞的细胞凋亡和/或过多的ECM产生和沉积是无害的。因此，NAMPT抑制剂可以以有效减少引起受试者的成肌纤维细胞累积的分子事件中的一个或多个的量施用。例如，抑制剂可以有效减少成肌纤维细胞对细胞凋亡的抗性、减少ECM的产生、减少纤连蛋白、减少胶原蛋白、以及其组合。
NAMPT抑制剂可以以有效增强PF患者的肺依从性的量施用。可以在与疾病的阶段和严重程度一致的时间段内达到期望的效果。例如，在施用一小时、一天、一周、一个月或超过一个月的时期后，可以在受试者中观察到这些效果中的任何一种或多种效果。
2.治疗量
NAMPT抑制剂的治疗有效量的范围可以根据以下中的一种或多种而变化：抑制剂的类型、作用机制、施用途径、要缓解的病状的类型和严重程度、以及与受体有关的如年龄、体重等生理学参数等。
抗体或抗体结合片段的治疗或预防有效量的示例性非限制性范围在约10mg与200mg之间(包含10mg和200mg)，更优选地在约20mg与100mg之间并且最优选地为约40mg。应注意的是，剂量值可以随要缓解的病状的类型和严重程度变化。
在一些实施例中，经由静脉内输注将NAMPT或NAMPT配体的一种或多种抗体或其抗原结合片段抑制剂以介于0.1与1.5mg/kg体重之间(包含0.1和1.5mg/kg体重)的量施用于被诊断为患有PF的人类受试者，以治疗慢性PF的体征或症状中的一种或多种。在一些实施例中，将NAMPT或NAMPT配体的一种或多种抗体或其抗原结合片段抑制剂经由气管内施用以介于10mg与400mg体重之间(包含10mg和400mg体重)的量施用，以治疗慢性PF的体征或症状中的一种或多种。
在一些实施例中，将一种或多种小分子NAMPT抑制剂经由口服或经由静脉内输注以介于0.1与3mg/kg体重之间(包含0.1mg/kg和3mg/kg体重)的量，例如10mg/kg、100mg/kg或1mg/kg体重施用于被诊断为患有PF的人受试者。该一种或多种小分子NAMPT抑制剂可以单独地或包含在脂质体内施用。
在一些实施例中，将信号转导子和转录激活子(STAT5)的一种或多种可渗透细胞的抑制剂(如烟酰基肼、SPI或匹莫齐特(pimozide))以介于1μg/kg与20mg/kg受体之间，最优选地介于10μg/kg与3.5mg/kg受体之间(包含10μg/kg和3.5mg/kg受体)的量经由静脉内输注施用于被诊断为患有PF的人类受试者。STAT5的该一种或多种抑制剂可以单独地或包含在脂质体内施用。
在一些实施例中，将NAMPT配体如TLR4的一种或多种抑制剂施用于被诊断为患有PF或有PF风险的人类受试者。示例性药剂是来自光合细菌类球形红球菌(Rhodobactersphaeroides)的脂多糖(LPS-RS)，该类球形红球菌是来自病原菌的脂多糖(LPS)的强效拮抗剂。例如，在一些实施例中，将LPS-RS每天以介于1mg与400g之间的量施用于患有PF或有PF风险的受试者。
3.施用定时和剂量方案
可以向受试者施用一个或多个剂量的组合物，直到观察到功效为止。对于小分子，这些剂量通常在一天、每周两次或每周一次之间施用。对于静脉内输注，这些剂量通常每周一次、每月一次或每季度一次地施用。对抗NAMPT疗法开始的定时应当基于受试者的需要确定。在一些实施例中，一旦成肌纤维细胞累积的生理学体征或症状或PF减轻，就可以停止使用NAMPT抑制剂的疗法。
在一些实施例中，受试者是重症监护患者。在重症监护环境中，包含一种或多种NAMPT抑制剂的组合物可以在一小时的时间内施用，例如作为救援疗法或挽救疗法。根据需要，可以每小时一次、每天一次、每周一次或每月一次地重复施用。在特定实施例中，经由气管内滴注例如使用气管内导管递送NAMPT抑制剂。在其它实施例中，在一小时的时间内经由静脉内输注将抑制剂递送到患者。
PF可能与如硬皮病和系统性红斑狼疮等潜在的自身免疫性疾病、结节病、如胺碘酮或呋喃妥因(nitrofurantoin)等药物毒性或暴露于石棉相关联或者与辐射诱发的肺损伤相关联。在涉及肺部的损伤的情况下，可以立即施用NAMPT抑制剂，并且随后在肺组织表面愈合和再生时一直施用。
D.组合疗法
作为治疗或预防性治疗方案的一部分，可以单独地或与一种或多种另外的活性剂组合地施用包含NAMPT抑制剂的组合物。
术语“组合(combination)”或“组合(combined)”用于指两种或更多种药剂的伴随、同时或相继施用。因此，组合可以伴随地(例如作为掺入物)、单独但同时(例如经由进入同一受试者体内的单独的静脉内管线)、或相继(例如先给予化合物或药剂中的一种，然后给予第二种)施用。例如，一种或多种NAMPT抑制剂可以与第二活性剂在同一天或不同的一天施用。在一些实施例中，第二活性剂可以在一种或多种NAMPT抑制剂之后或之前的第一天、第二天、第三天或第四天施用。
在一些实施例中，另外的治疗剂是吡非尼酮。吡非尼酮
Figure BDA0002278758100000411
Figure BDA0002278758100000412
是减缓IPF的进展的抗瘢痕化(抗纤维变性)药物。一些服用吡非尼酮的患者有副作用，最常见的是胃部不适和皮疹，特别是暴露在阳光下时。吡非尼酮已经被加拿大卫生部(Health Canada)批准用于治疗轻度到中度IPF。
在一些实施例中，另外的治疗剂是尼达尼布
Figure BDA0002278758100000413
尼达尼布是减缓IPF的进展的抗瘢痕化(抗纤维变性)药物。一些服用尼达尼布的患者有副作用，最常见的副作用包含腹泻。
在一些实施例中，另外的治疗剂是皮质类固醇，如皮质类固醇丸(例如，强的松口服丸(Prednisone oral pill)，
Figure BDA0002278758100000414
)，其可以通过抑制免疫系统来减少肺部的炎症。皮质类固醇仅用于其肺纤维化急性加重的IPF患者并且可能对瘢痕稳定或缓慢恶化的IPF患者有害。
在一些实施例中，另外的治疗剂是N-乙酰半胱氨酸(NAC；口服或雾化；
Figure BDA0002278758100000415
)。NAC是频繁用于IPF患者的抗氧化剂。2014年5月发表的大型临床试验表明，NAC并未减慢IPF的进展。
在一些实施例中，另外的治疗剂是硫唑嘌呤、环磷酰胺等。
在一些实施例中，另外的治疗剂是氧气。一些患有肺动脉高压的人最终需要连续氧气疗法。
可以与一种或多种NAMPT抑制剂和/或NAMPT配体抑制剂组合的另外类别的药物包含抗新内膜剂、化学治疗剂、抗生素、抗病毒药、类固醇和非类固醇抗炎药、常规免疫治疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、趋化因子和/或生长因子、被设计用来治疗或预防PF的抗增殖剂或抗迁移剂、影响迁移和细胞外基质产生的药剂、影响血小板沉积或血栓形成的药剂、以及促进血管愈合和再内皮化的药剂。
示例性抗增殖剂包含但不限于紫杉醇(Paclitaxel)(Taxol)、QP-2长春新碱(QP-2Vincristin)、甲氨蝶呤(Methotrexat)、血管肽(Angiopeptin)、丝裂霉素(Mitomycin)、BCP 678、反义c-myc、ABT 578、放线菌素-D(Actinomycin-D)、RestenASE、1-氯代-脱氧腺苷、PCNA核酶和塞来昔布(Celecoxib)。
调节细胞复制/增殖的示例性药剂包含：雷帕霉素(rapamycin)靶标(TOR)抑制剂(包含西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)和ABT-578)；紫杉醇和抗肿瘤剂，包含烷化剂(例如，环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲基苄肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、六甲蜜胺(altretamine)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin))；抗肿瘤抗生素(例如，博来霉素、放线菌素D、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素C、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、阿霉素(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、去甲氧基柔红霉素(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)和米托蒽醌(mitoxantrone))；抗代谢物(例如，脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2-氯脱氧腺苷、羟基脲(hydroxyurea)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氮杂胞苷(azacytidine)、吉西他滨(gemcitabine)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)和天冬酰胺酶(aspariginase))；抗有丝分裂剂(例如，长春新碱、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、多西他赛(docetaxel)、雌莫司汀(estramustine))；以及分子靶向剂(例如，伊马替尼(matinib)、维甲酸(tretinoin)、贝沙罗汀(bexarotene)、贝伐单抗(bevacizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、奥佐米星(ozogamicin)和地尼白介素(denileukin diftitox))。
另外的治疗剂可以局部或全身地施用于受试者，或包被到或并入到装置或移植物上或中。另外的治疗剂可以通过同一途径或通过不同的途径并且通过不同的手段施用。例如，一种或多种NAMPT抑制剂可以经由输注与通过不同手段递送的以下中的一种或多种一起递送：紫杉醇、泰素帝(taxotere)和其它紫杉类化合物、甲氨蝶呤、如阿霉素等蒽环霉素(anthracycline)、依维莫司、西罗莫司(serolimus)、雷帕霉素或雷帕霉素衍生物。
E.用于诊断性和预防性治疗的方法
鉴于NAMPT抑制剂与NAMPT结合的能力，在一些实施例中，NAMPT抑制剂可用于使用如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学等常规免疫测定来检测NAMPT(例如，在如血液、血清或血浆等生物样本中)。因此，提供了用于检测和/或量化生物样本中的NAMPT量的方法。这些方法包含使生物样本与一种或多种NAMPT抑制剂接触并检测与NAMPT结合的抑制剂或未结合的抑制剂，以检测和/或量化生物样本中的NAMPT。在一些实施例中，NAMPT抑制剂是抗体或其片段。例如，抗NAMPT抗体直接地或间接地用可检测物质标记，以便于检测结合的或未结合的抗体。适合的可检测物质包含各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。作为标记抑制剂的替代性方案，通过竞争性免疫测定，例如利用标记有可检测物质的NAMPT标准品和未标记的抗NAMPT抗体，可以在生物体液中测定NAMPT。在该测定中，将生物样本、带标记NAMPT标准品和抗NAMPT抗体组合，并且确定与未标记的抗体结合的带标记NAMPT标准品的量。生物样本中的NAMPT量与和抗NAMPT抗体结合的带标记NAMPT标准品的量成反比。
因此，在一些实施例中，这些方法包含鉴别需要抗NAMPT治疗的受试者的步骤，例如处于与有害的NAMPT活性相关联的疾病或病症的风险中的受试者。示例性受试者是处于PF风险中的人。这些方法可以包含以下步骤：与归一化标准品或对照样本相比，测定来自受试者的生物体液以确定样本中NAMPT的存在和/或样本中存在的NAMPT量。示例性对照样本包含取自健康个体的等效生物体液的样本。
将参考以下非限制性实例进一步理解本发明。
实例
实例1：IPF肺成肌纤维细胞展现出衰老和细胞凋亡抗性。
材料和方法
试剂：猪血小板衍生的TGF-β1，来自R&D系统公司(明尼苏达州明尼阿波里斯市(Minneapolis,MN))。星形孢菌素，来自LC实验室(马萨诸塞州沃本(Woburn,MA))。针对以下的抗体：肌动蛋白(克隆AC-15)和α-微管蛋白(克隆B-5-1-2)，来自西格玛公司(Sigma)(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))；a-SMA(克隆ASM-1)，来自美国研究产品公司(AmericanResearch Products)(马萨诸塞州贝尔蒙特(Belmont,MA))；切割半胱天冬酶3、切割PARP以及Bcl-2，来自细胞信号传导公司(Cell Signaling)(马萨诸塞州波士顿(Boston,MA))；Nox4和Ki67，来自诺伟思生物制药公司(Novus Biologicals)(科罗拉多州立托顿(Littleton,CO))；以及p21、Col1A1和核纤层蛋白A/C，来自圣克鲁兹生物技术公司(SantaCruz Biotechnology)(德克萨斯州达拉斯(Dallas,TX))。针对p16INK4a的抗体来自圣克鲁兹生物技术公司和BD生物科学公司(BD Biosciences)(加利福尼亚州圣何塞(San Jose,CA))。针对GAPDH的抗体来自艾博抗公司和细胞信号传导公司。除非另有说明，否则所有其它试剂均购自西格玛公司(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))。
肺组织学和免疫组织化学染色：对石蜡包埋的组织切片进行加工以进行肺组织学和免疫组织化学染色。
免疫荧光标记：将组织切片用含1％Triton-X100的PBS渗透化、用含1％BSA的PBS阻断并在室温下与初级抗体一起在PBS中培育1小时。然后将组织切片用PBS洗涤，之后与缀合的二级抗体一起在PBS中培育1小时。然后将切片用PBS洗涤，并且使用含有DAPI的核染色封固介质。用荧光显微镜使载玻片可视化，并且获得图像。
TUNEL染色：根据试剂盒说明书，使用原位细胞死亡检测试剂盒(德国曼海姆罗氏公司(Roche,Mannheim,Germany))揭示组织切片中的凋亡细胞。首先将切片与抗αSMA一起在4℃下培育过夜。在TUNEL方案之后，将载玻片封固在含有DAPI的介质(载体实验室公司(Vector Labs))中，并且使细胞在蔡司荧光显微镜上可视化。在15-20个视野中按视野对TUNEL阳性细胞进行计数并归一化至来自DAPI染色的总细胞。
人肺组织和成纤维细胞是根据机构审查委员会(Institutional Review Board)的批准方案，从如先前描述的(18)确诊患有IPF的患者的肺中分离出来的。分离成纤维细胞并通过免疫荧光、免疫组织化学和/或生化测定评估细胞凋亡、衰老和ROS水平。
衰老测定.根据制造商的说明书，我们使用了高灵敏度底物(荧光素二-β-D-半乳糖苷酶)对细胞衰老进行定量评估(标记基因技术公司(MarkerGene Technologies))。通过DAPI(荧光细胞计数归一化试剂盒；标记基因技术公司)将细胞数归一化。我们还使用了被设计成组织化学地检测培养细胞中的SA-β-GAL活性的衰老检测试剂盒(艾博抗公司)。
结果
人IPF成肌纤维细胞展现出衰老和细胞凋亡抗性。衰老标志物p16在成纤维细胞灶(FF)中表达，PF是IPF肺的关键病理标志。表达Ki67(细胞增殖标志物)的细胞在FF内大部分不存在并且主要在病灶外围的细胞中检测到。在肺泡空间内里的上皮细胞中检测到高水平的细胞凋亡，通过指示人IPF肺的FF内显性非增殖、衰老且抗细胞凋亡的表型的存在的TUNEL和免疫荧光证明，在这些病灶内上皮下αSMA阳性成肌纤维细胞中几乎不存在细胞凋亡的证据。
实例2：年老小鼠显示出纤维化的受损消退和衰老成肌纤维细胞的累积。
材料和方法
上文描述了材料和方法。
检测H2O2.从培养的细胞测定细胞外H2O2释放。通过DAPI(荧光细胞计数归一化试剂盒；标记基因技术公司)将细胞数归一化。
结果
图1示出了与年轻小鼠相比，年老小鼠展现出缺乏博来霉素诱导的肺损伤的消退。如与纤维化消退的年轻小鼠相比，如通过αSMA免疫组织化学(IHC)染色确定的，年老小鼠表现出在受伤后2个月在肺的纤维变性区域中成肌纤维细胞持续存在。图2示出了，从年轻和年老小鼠中分离出的成纤维细胞响应于在年轻小鼠中暂时的损伤展现出p16诱导，而该损伤在患有持续性纤维化的年老小鼠中是持续的。如与通过β-半乳糖苷酶(βgal)(衰老标志物)细胞染色的年轻组群相比，从年老小鼠的受损肺中分离的成纤维细胞展现出更高水平的衰老相关βgal活性。这些结果展现出，年老小鼠的未消退纤维化与衰老成肌纤维细胞的持续存在相关联。
图3示出了在评估的对应时间点(对照组，3周，2个月)处来自年轻和年老小鼠的成纤维细胞中ROS的生成。
实例3：年老小鼠中累积的衰老成肌纤维细胞对细胞凋亡显示出抗性。
材料和方法
上文描述了材料和方法。
结果
与人IPF数据一致，图4A和4B示出了与年轻小鼠相比，来自肺损伤后年老小鼠的肺组织切片在纤维变性区域显示出更低水平的细胞凋亡(TUNEL+细胞)。从年老小鼠中分离的成纤维细胞展现出细胞凋亡抗性，较少凋亡细胞对凋亡诱导剂星形孢菌素具有抗性(图4A)。与抗凋亡表型的获取一致，年老小鼠的肺展现出升高的Bcl-2水平(图4B)。
综上所述，这些结果展现出，老化时未消退的纤维化与衰老的且具有细胞凋亡抗性的成肌纤维细胞表型的获取相关联。
实例4：NAMPT蛋白在人IPF组织中增加。
材料和方法
上文描述了材料和方法。
蛋白免疫印迹：在RIPA缓冲液中制备细胞溶解产物，在还原条件下进行SDSPAGE，并执行蛋白免疫印迹。根据制造商的建议，使用Pierce Ne-Per试剂盒或EpigentekEpiQuik核提取试剂盒制备细胞溶质和核溶解产物。
根据说明书，使用Micro BCA蛋白测定试剂盒(Pierce公司)或Dc蛋白测定试剂盒(Bio Rad公司)对溶解产物定量。
结果
FNAMPT蛋白在人IPF组织中增加。NAMPT经由IHC NAMPT染色特异性地表达在IPF肺组织的纤维变性区域内的成纤维细胞中。
实例5：NAMPT杂合小鼠(Nampt+/-)在年老小鼠肺纤维化模型中受到保护。
材料和方法
如实例4所描述的。
结果
图5示出了杂合的NAMPT小鼠Nampt+/-被保护以免于博来霉素诱导的肺损伤和全肺中可溶性胶原所反映的肺纤维化(与受伤后3周的WT小鼠相比)。进一步地，与WT小鼠(50％，n＝5/10)相比，Nampt+/-小鼠响应于损伤展现出增加的存活率(80％，n＝8/10)。这些研究展现了在体内靶向Nampt产生了保护以免于肺纤维化的概念验证。
实例6：NAMPT在纤维化未消退的年老小鼠的肺中持续地表达。
材料和方法
材料和方法如上所述。
半胱天冬酶活性测定.使用半胱天冬酶溶解缓冲液溶解细胞，并根据制造商的说明书使用生物视野半胱天冬酶3荧光测定试剂盒(加利福尼亚州苗必达生物视野股份有限公司(BioVision,Inc,Milpitas,CA))分析活化的半胱天冬酶3。
细胞培养：从卡瑞尔细胞库(Coriell Cell Repositories)(新泽西州卡姆登(Camden,NJ))购买处于低(11)和高(39)人口倍增(PD)的人胎肺成纤维细胞(IMR-90细胞)。从年轻和年老C57BL/6小鼠的肺中分离出原代成纤维细胞。将所有细胞在补充有10％胎牛血清(犹他州洛根Hyclone实验室(Hyclone Laboratories,Logan,UT))、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1.25μg/ml两性霉素B的DMEM(生命技术股份有限公司(LifeTechnologies,Inc.))中并且在37℃下在5％CO2、95％空气中培养。
实时PCR：根据制造商的方案，使用
Figure BDA0002278758100000461
迷你试剂盒(凯杰公司)从细胞中分离总RNA，并使用RT-qPCR用iScript逆转录SuperMix(iScript Reverse TranscriptionSuperMix for RT-qPCR)(Bio Rad公司)进行逆转录。使用
Figure BDA0002278758100000462
Select Master Mix(应用生物系统公司)和HO-1、NQO-1、GCLC和β-肌动蛋白基因特异性引物对(表S1，引物序列)一式两份地进行每个cDNA样本的实时PCR反应。在StepOnePlus实时PCR系统(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)中，将反应执行40个循环(95℃下15秒钟，60℃下1分钟)。将每个靶基因的实时PCR数据归一化到内源性α-肌动蛋白，并使用2-ΔΔCt法进行比较。
结果
iNampt在年老小鼠和患有IPF的人中异常调节。iNampt在来自衰老和IPF肺成纤维细胞的代表性成纤维细胞中上调(图8A)。从晚期与早期IPF患者分离的成纤维细胞中的iNampt mRNA水平示出了NAMPT表达随着严重程度的增加而增加(图6)。
图7示出了Nampt(RT-PCR)的持续基因表达与在损伤后2个月的肺组织中评估的年老小鼠的未消退的纤维化相关联，相比之下，年轻小鼠的纤维化消退。损伤后2个月的时间点表示纤维化在年轻小鼠中主动消退而年老小鼠未消退的点。
实例7：NAMPT介导对肺损伤的纤维变性基因反应。
材料和方法
上文描述了材料和方法。
结果
图8A示出了eNampt增加了与纤维化有关的基因表达路径。将小鼠气管内注射60μg重组Nampt，并且在施用后4.5小时收获肺组织。从肺中提取RNA，并且进行3次微阵列分析(昂飞公司(Affymetrix)，小鼠430_2)。评估出改变的基因表达路径有630条；鉴别出与肺纤维化相关联的若干条路径中的显著富集。重要的是，响应全身性eNampt。“肺纤维化”是最显著改变的路径之一，是在评估出的640条路径中改变最大的第10条。图8B是水平条形图，示出了对NAMPT沉默的肺内皮细胞的全基因组转录组学图谱分析和鉴别出差异调节路径的路径分析。这些结果支持eNampt在介导对肺损伤的纤维变性响应中的作用。
实例8：eNampt促进促纤维变性成肌纤维细胞表型。
材料和方法
材料和方法如上所述。
结果
eNampt介导了促纤维变性成肌纤维细胞表型。用外源性eNampt以剂量依赖性方式对成纤维细胞进行处理，从而导致增加了通过蛋白免疫印迹对αSMA、Nox4、iNampt和GAPDH的表达。
这些结果表明，eNampt介导了成纤维细胞向成肌纤维细胞分化。eNampt导致诱导了氧化剂信号传导，如通过Nox4表达和ROS生成的剂量依赖性增加(图9A)以及成纤维细胞衰老(图9B)展现的。
这些研究展现了Nampt在介导促纤维变性肺成肌纤维细胞表型中的作用。
实例9：eNampt介导的促纤维变性效果需要TLR4依赖性Nox4信号传导。
材料和方法
上文描述了材料和方法。
结果
eNampt的促纤维变性效果需要TLR4信号传导。已知eNampt介导先天免疫并经由其已知受体TLR4转导促活信号。用或不用TLR4拮抗剂、竞争性TLR4抑制剂(RS-LPS，英杰公司)治疗的肺成纤维细胞然后用/不用外源性eNampt(50ng/ml，48小时)治疗表明，TLR4阻断阻止了eNampt-TLR4介导的成肌纤维细胞分化、如通过蛋白质印迹确定的那样抑制了Nox4诱导并且导致ROS生成以剂量依赖性方式减少(图10)。
实例10：iNampt赋予小鼠和IPF肺成肌纤维细胞对细胞凋亡的抗性。
材料和方法
上文描述了材料和方法。
结果
Nampt有助于小鼠和人IPF成纤维细胞抵抗细胞凋亡。与WT小鼠相比，在从Nampt+/-分离的肺成纤维细胞中，星形孢菌素(300nM，8小时)诱导的对细胞凋亡标志物即切割的半胱天冬酶3以及PARP(图11)的表达增加。
实例11：对IPF成肌纤维细胞中的NAMPT酶活性的药理学抑制恢复了对细胞凋亡的敏感性。
材料和方法
上文描述了材料和方法。
结果
图111B展现出，iNAMPT介导的对肺成肌纤维细胞(这些细胞表达了高水平的iNampt)中星形孢菌素诱导的细胞凋亡的抗性需要iNampt酶活性，因为用FK-866预处理的IPF成纤维细胞显示出恢复的细胞凋亡。
图12A-D示出了NAMPT抑制剂FK-866(图12A)的化学结构，该化学结构被分为三个区域(图12B)并通过用N-杂环置换而变化以生成新的FK866类似物：MS-1-82(图12C)、Rari049(图12D)、Alpii135(图12E)；图13是柱状图，示出了在FK866和FK类似物MS-1-82、Rari049、Alpii135存在的情况下在0.1、1和10μM的浓度下NAMPT的归一化活性；
图14是柱状图，示出了Nampt酶活性在通过TUNEL测定限定的H2O2诱导的细胞凋亡中的作用。NAMPT酶抑制剂FK-866阻断了H2O2诱导的细胞凋亡
实例12：纤维变性刺激诱导了NAMPT启动子活性。
材料和方法
上文描述了材料和方法。
结果
图15是柱状图，示出了肺内皮细胞NAMPT启动子的活性响应于IPF相关刺激而增加。在暴露4小时和24小时后，响应于VEGF(100ng/ml)或TGFβ1(2ng/ml)用NAMPT荧光素酶启动子转染的人肺EC示出了增加的荧光素酶活性。
实例13：抗NAMPT Fab强效中和了rhNAMPT诱导的NFkB磷酸化。
材料和方法
上文描述了材料和方法。
结果
抗NAMPT Fab强效中和了rhNAMPT诱导的NFkB磷酸化。用rhNAMPT(1ug/ml，1小时)单独地或用rhNAMPT-抗体混合物治疗人肺内皮细胞(EC)，然后溶解并经由蛋白印迹探测磷酸-NFkB和总NFkB。两个人噬菌体衍生的Fab 2K和3K(200ug/ml)在比原型NAMPT多克隆pAb更高的水平下中和rhNAMPT诱导的NFkB磷酸化。
序列表
<110> 代表亚利桑那大学的亚利桑那董事会（ARIZONA BOARD OF REGENTS
ON BEHALF OF THE UNIVERSITY OF ARIZONA）
以退伍军人事务署为代表的美利坚合众国（The United States of America asRepresented by the Department of Veterans Affairs）
<120> 用于治疗肺纤维化的组合物和方法
<130> UA 17-154 PCT
<150> 62/485,863
<151> 2017-04-14
<160> 5
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
atgaatcctg cggcagaagc cgagttcaac atcctcctgg ccaccgactc ctacaaggtt 60
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gaaaagaaga cagaaaactc caaattaagg aaggtgaaat atgaggaaac agtattttat 180
gggttgcagt acattcttaa taagtactta aaaggtaaag tagtaaccaa agagaaaatc 240
caggaagcca aagatgtcta caaagaacat ttccaagatg atgtctttaa tgaaaaggga 300
tggaactaca ttcttgagaa gtatgatggg catcttccaa tagaaataaa agctgttcct 360
gagggctttg tcattcccag aggaaatgtt ctcttcacgg tggaaaacac agatccagag 420
tgttactggc ttacaaattg gattgagact attcttgttc agtcctggta tccaatcaca 480
gtggccacaa attctagaga gcagaagaaa atattggcca aatatttgtt agaaacttct 540
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caagagactg ctggcatagg agcatctgct cacttggtta acttcaaagg aacagataca 660
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<210> 2
<211> 491
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
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Ser Tyr Lys Val Thr His Tyr Lys Gln Tyr Pro Pro Asn Thr Ser Lys
20 25 30
Val Tyr Ser Tyr Phe Glu Cys Arg Glu Lys Lys Thr Glu Asn Ser Lys
35 40 45
Leu Arg Lys Val Lys Tyr Glu Glu Thr Val Phe Tyr Gly Leu Gln Tyr
50 55 60
Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Lys Gly Lys Val Val Thr Lys Glu Lys Ile
65 70 75 80
Gln Glu Ala Lys Asp Val Tyr Lys Glu His Phe Gln Asp Asp Val Phe
85 90 95
Asn Glu Lys Gly Trp Asn Tyr Ile Leu Glu Lys Tyr Asp Gly His Leu
100 105 110
Pro Ile Glu Ile Lys Ala Val Pro Glu Gly Phe Val Ile Pro Arg Gly
115 120 125
Asn Val Leu Phe Thr Val Glu Asn Thr Asp Pro Glu Cys Tyr Trp Leu
130 135 140
Thr Asn Trp Ile Glu Thr Ile Leu Val Gln Ser Trp Tyr Pro Ile Thr
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Val Ala Thr Asn Ser Arg Glu Gln Lys Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Leu
165 170 175
Leu Glu Thr Ser Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Tyr Lys Leu His Asp
180 185 190
Phe Gly Tyr Arg Gly Val Ser Ser Gln Glu Thr Ala Gly Ile Gly Ala
195 200 205
Ser Ala His Leu Val Asn Phe Lys Gly Thr Asp Thr Val Ala Gly Leu
210 215 220
Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Tyr Gly Thr Lys Asp Pro Val Pro Gly Tyr
225 230 235 240
Ser Val Pro Ala Ala Glu His Ser Thr Ile Thr Ala Trp Gly Lys Asp
245 250 255
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260 265 270
Pro Val Ser Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Ile Tyr Asn Ala Cys Glu
275 280 285
Lys Ile Trp Gly Glu Asp Leu Arg His Leu Ile Val Ser Arg Ser Thr
290 295 300
Gln Ala Pro Leu Ile Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asn Pro Leu Asp Thr
305 310 315 320
Val Leu Lys Val Leu Glu Ile Leu Gly Lys Lys Phe Pro Val Thr Glu
325 330 335
Asn Ser Lys Gly Tyr Lys Leu Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Val Ile Gln
340 345 350
Gly Asp Gly Val Asp Ile Asn Thr Leu Gln Glu Ile Val Glu Gly Met
355 360 365
Lys Gln Lys Met Trp Ser Ile Glu Asn Ile Ala Phe Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Gly Leu Leu Gln Lys Leu Thr Arg Asp Leu Leu Asn Cys Ser Phe Lys
385 390 395 400
Cys Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Ile Asn Val Phe Lys Asp
405 410 415
Pro Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg Leu Ser Leu
420 425 430
His Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe Val Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly
435 440 445
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450 455 460
Gly Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Ile Arg Lys Asn Ala
465 470 475 480
Gln Leu Asn Ile Glu Leu Glu Ala Ala His His
485 490
<210> 3
<211> 2520
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
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gtgagaccag aaagctggga gccctgcgtg gaggtggttc ctaatattac ttatcaatgc 120
atggagctga atttctacaa aatccccgac aacctcccct tctcaaccaa gaacctggac 180
ctgagcttta atcccctgag gcatttaggc agctatagct tcttcagttt cccagaactg 240
caggtgctgg atttatccag gtgtgaaatc cagacaattg aagatggggc atatcagagc 300
ctaagccacc tctctacctt aatattgaca ggaaacccca tccagagttt agccctggga 360
gccttttctg gactatcaag tttacagaag ctggtggctg tggagacaaa tctagcatct 420
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cttatccaat ctttcaaatt acctgagtat ttttctaatc tgaccaatct agagcacttg 540
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atgcccctac tcaatctctc tttagacctg tccctgaacc ctatgaactt tatccaacca 660
ggtgcattta aagaaattag gcttcataag ctgactttaa gaaataattt tgatagttta 720
aatgtaatga aaacttgtat tcaaggtctg gctggtttag aagtccatcg tttggttctg 780
ggagaattta gaaatgaagg aaacttggaa aagtttgaca aatctgctct agagggcctg 840
tgcaatttga ccattgaaga attccgatta gcatacttag actactacct cgatgatatt 900
attgacttat ttaattgttt gacaaatgtt tcttcatttt ccctggtgag tgtgactatt 960
gaaagggtaa aagacttttc ttataatttc ggatggcaac atttagaatt agttaactgt 1020
aaatttggac agtttcccac attgaaactc aaatctctca aaaggcttac tttcacttcc 1080
aacaaaggtg ggaatgcttt ttcagaagtt gatctaccaa gccttgagtt tctagatctc 1140
agtagaaatg gcttgagttt caaaggttgc tgttctcaaa gtgattttgg gacaaccagc 1200
ctaaagtatt tagatctgag cttcaatggt gttattacca tgagttcaaa cttcttgggc 1260
ttagaacaac tagaacatct ggatttccag cattccaatt tgaaacaaat gagtgagttt 1320
tcagtattcc tatcactcag aaacctcatt taccttgaca tttctcatac tcacaccaga 1380
gttgctttca atggcatctt caatggcttg tccagtctcg aagtcttgaa aatggctggc 1440
aattctttcc aggaaaactt ccttccagat atcttcacag agctgagaaa cttgaccttc 1500
ctggacctct ctcagtgtca actggagcag ttgtctccaa cagcatttaa ctcactctcc 1560
agtcttcagg tactaaatat gagccacaac aacttctttt cattggatac gtttccttat 1620
aagtgtctga actccctcca ggttcttgat tacagtctca atcacataat gacttccaaa 1680
aaacaggaac tacagcattt tccaagtagt ctagctttct taaatcttac tcagaatgac 1740
tttgcttgta cttgtgaaca ccagagtttc ctgcaatgga tcaaggacca gaggcagctc 1800
ttggtggaag ttgaacgaat ggaatgtgca acaccttcag ataagcaggg catgcctgtg 1860
ctgagtttga atatcacctg tcagatgaat aagaccatca ttggtgtgtc ggtcctcagt 1920
gtgcttgtag tatctgttgt agcagttctg gtctataagt tctattttca cctgatgctt 1980
cttgctggct gcataaagta tggtagaggt gaaaacatct atgatgcctt tgttatctac 2040
tcaagccagg atgaggactg ggtaaggaat gagctagtaa agaatttaga agaaggggtg 2100
cctccatttc agctctgcct tcactacaga gactttattc ccggtgtggc cattgctgcc 2160
aacatcatcc atgaaggttt ccataaaagc cgaaaggtga ttgttgtggt gtcccagcac 2220
ttcatccaga gccgctggtg tatctttgaa tatgagattg ctcagacctg gcagtttctg 2280
agcagtcgtg ctggtatcat cttcattgtc ctgcagaagg tggagaagac cctgctcagg 2340
cagcaggtgg agctgtaccg ccttctcagc aggaacactt acctggagtg ggaggacagt 2400
gtcctggggc ggcacatctt ctggagacga ctcagaaaag ccctgctgga tggtaaatca 2460
tggaatccag aaggaacagt gggtacagga tgcaattggc aggaagcaac atctatctga 2520
<210> 4
<211> 839
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Met Met Ser Ala Ser Arg Leu Ala Gly Thr Leu Ile Pro Ala Met Ala
1 5 10 15
Phe Leu Ser Cys Val Arg Pro Glu Ser Trp Glu Pro Cys Val Glu Val
20 25 30
Val Pro Asn Ile Thr Tyr Gln Cys Met Glu Leu Asn Phe Tyr Lys Ile
35 40 45
Pro Asp Asn Leu Pro Phe Ser Thr Lys Asn Leu Asp Leu Ser Phe Asn
50 55 60
Pro Leu Arg His Leu Gly Ser Tyr Ser Phe Phe Ser Phe Pro Glu Leu
65 70 75 80
Gln Val Leu Asp Leu Ser Arg Cys Glu Ile Gln Thr Ile Glu Asp Gly
85 90 95
Ala Tyr Gln Ser Leu Ser His Leu Ser Thr Leu Ile Leu Thr Gly Asn
100 105 110
Pro Ile Gln Ser Leu Ala Leu Gly Ala Phe Ser Gly Leu Ser Ser Leu
115 120 125
Gln Lys Leu Val Ala Val Glu Thr Asn Leu Ala Ser Leu Glu Asn Phe
130 135 140
Pro Ile Gly His Leu Lys Thr Leu Lys Glu Leu Asn Val Ala His Asn
145 150 155 160
Leu Ile Gln Ser Phe Lys Leu Pro Glu Tyr Phe Ser Asn Leu Thr Asn
165 170 175
Leu Glu His Leu Asp Leu Ser Ser Asn Lys Ile Gln Ser Ile Tyr Cys
180 185 190
Thr Asp Leu Arg Val Leu His Gln Met Pro Leu Leu Asn Leu Ser Leu
195 200 205
Asp Leu Ser Leu Asn Pro Met Asn Phe Ile Gln Pro Gly Ala Phe Lys
210 215 220
Glu Ile Arg Leu His Lys Leu Thr Leu Arg Asn Asn Phe Asp Ser Leu
225 230 235 240
Asn Val Met Lys Thr Cys Ile Gln Gly Leu Ala Gly Leu Glu Val His
245 250 255
Arg Leu Val Leu Gly Glu Phe Arg Asn Glu Gly Asn Leu Glu Lys Phe
260 265 270
Asp Lys Ser Ala Leu Glu Gly Leu Cys Asn Leu Thr Ile Glu Glu Phe
275 280 285
Arg Leu Ala Tyr Leu Asp Tyr Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Asp Leu Phe
290 295 300
Asn Cys Leu Thr Asn Val Ser Ser Phe Ser Leu Val Ser Val Thr Ile
305 310 315 320
Glu Arg Val Lys Asp Phe Ser Tyr Asn Phe Gly Trp Gln His Leu Glu
325 330 335
Leu Val Asn Cys Lys Phe Gly Gln Phe Pro Thr Leu Lys Leu Lys Ser
340 345 350
Leu Lys Arg Leu Thr Phe Thr Ser Asn Lys Gly Gly Asn Ala Phe Ser
355 360 365
Glu Val Asp Leu Pro Ser Leu Glu Phe Leu Asp Leu Ser Arg Asn Gly
370 375 380
Leu Ser Phe Lys Gly Cys Cys Ser Gln Ser Asp Phe Gly Thr Thr Ser
385 390 395 400
Leu Lys Tyr Leu Asp Leu Ser Phe Asn Gly Val Ile Thr Met Ser Ser
405 410 415
Asn Phe Leu Gly Leu Glu Gln Leu Glu His Leu Asp Phe Gln His Ser
420 425 430
Asn Leu Lys Gln Met Ser Glu Phe Ser Val Phe Leu Ser Leu Arg Asn
435 440 445
Leu Ile Tyr Leu Asp Ile Ser His Thr His Thr Arg Val Ala Phe Asn
450 455 460
Gly Ile Phe Asn Gly Leu Ser Ser Leu Glu Val Leu Lys Met Ala Gly
465 470 475 480
Asn Ser Phe Gln Glu Asn Phe Leu Pro Asp Ile Phe Thr Glu Leu Arg
485 490 495
Asn Leu Thr Phe Leu Asp Leu Ser Gln Cys Gln Leu Glu Gln Leu Ser
500 505 510
Pro Thr Ala Phe Asn Ser Leu Ser Ser Leu Gln Val Leu Asn Met Ser
515 520 525
His Asn Asn Phe Phe Ser Leu Asp Thr Phe Pro Tyr Lys Cys Leu Asn
530 535 540
Ser Leu Gln Val Leu Asp Tyr Ser Leu Asn His Ile Met Thr Ser Lys
545 550 555 560
Lys Gln Glu Leu Gln His Phe Pro Ser Ser Leu Ala Phe Leu Asn Leu
565 570 575
Thr Gln Asn Asp Phe Ala Cys Thr Cys Glu His Gln Ser Phe Leu Gln
580 585 590
Trp Ile Lys Asp Gln Arg Gln Leu Leu Val Glu Val Glu Arg Met Glu
595 600 605
Cys Ala Thr Pro Ser Asp Lys Gln Gly Met Pro Val Leu Ser Leu Asn
610 615 620
Ile Thr Cys Gln Met Asn Lys Thr Ile Ile Gly Val Ser Val Leu Ser
625 630 635 640
Val Leu Val Val Ser Val Val Ala Val Leu Val Tyr Lys Phe Tyr Phe
645 650 655
His Leu Met Leu Leu Ala Gly Cys Ile Lys Tyr Gly Arg Gly Glu Asn
660 665 670
Ile Tyr Asp Ala Phe Val Ile Tyr Ser Ser Gln Asp Glu Asp Trp Val
675 680 685
Arg Asn Glu Leu Val Lys Asn Leu Glu Glu Gly Val Pro Pro Phe Gln
690 695 700
Leu Cys Leu His Tyr Arg Asp Phe Ile Pro Gly Val Ala Ile Ala Ala
705 710 715 720
Asn Ile Ile His Glu Gly Phe His Lys Ser Arg Lys Val Ile Val Val
725 730 735
Val Ser Gln His Phe Ile Gln Ser Arg Trp Cys Ile Phe Glu Tyr Glu
740 745 750
Ile Ala Gln Thr Trp Gln Phe Leu Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ile Phe
755 760 765
Ile Val Leu Gln Lys Val Glu Lys Thr Leu Leu Arg Gln Gln Val Glu
770 775 780
Leu Tyr Arg Leu Leu Ser Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Glu Asp Ser
785 790 795 800
Val Leu Gly Arg His Ile Phe Trp Arg Arg Leu Arg Lys Ala Leu Leu
805 810 815
Asp Gly Lys Ser Trp Asn Pro Glu Gly Thr Val Gly Thr Gly Cys Asn
820 825 830
Trp Gln Glu Ala Thr Ser Ile
835
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Glu Gly Lys Gly Asp Leu Glu Glu Tyr Gly His Asp Leu
1 5 10

Claims (29)

1.一种用于治疗有需要的受试者的肺纤维化(PF)的组合物，所述组合物包括一种或多种烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)抑制剂、或一种或多种NAMPT受体抑制剂、或其组合、以及任选地药学上可接受的赋形剂以用于施用于体内。
2.根据权利要求1所述的组合物，其呈剂量调配物形式，以介于0.1与15mg/kg人类体重之间的量递送一种或多种NAMPT抑制剂、或一种或多种NAMPT受体抑制剂、或其组合。
3.根据权利要求1所述的组合物，其剂量相对于未治疗的对照患者有效减少或预防了PF患者的成肌纤维细胞累积。
4.根据权利要求1所述的组合物，其剂量相对于未治疗的对照患者有效减少或预防了PF患者的PF诱发的呼吸困难。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中一种或多种NAMPT抑制剂或NAMPT受体抑制剂或其组合是抗体、其抗体片段或具有其结合特异性的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述抑制剂是与NAMPT或与NAMPT受体结合的抗体的F(Ab)片段。
7.根据权利要求5到6中任一项所述的组合物，其中所述NAMPT抑制剂是与NAMPT或与NAMPT受体结合的抗体的二价F(Ab)2'片段。
8.根据权利要求5到7中任一项所述的组合物，其中具有抗NAMPT抗体的结合特异性的抗体、抗体片段或蛋白质预防或减少了NAMPT与一种或多种NAMPT受体之间的相互作用。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中具有抗NAMPT抗体的所述结合特异性的所述抗体、所述抗体片段或所述蛋白质预防或减少了NAMPT与TLR4之间的相互作用。
10.根据利要求5到9中任一项所述的组合物，其中具有抗NAMPT抗体的所述结合特异性的所述抗体、所述抗体片段或所述蛋白质与NAMPT蛋白上的表位结合，所述表位包括选自由Glu445、Gly446、Lys447、Gly448、Asp449、Leu450、Glu451、Glu452、Tyr453、Gly454、His455、Asp456和Leu457组成的组的一个或多个残基。
11.根据权利要求5到7中任一项所述的组合物，其中所述抗体、所述抗体片段或所述蛋白质与NAMPT分子结合以预防或减少NAMPT的同源二聚化。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的组合物，其包括根据权利要求5到11中任一项所述的抗体、抗体片段或蛋白质，所述抗体、所述抗体片段或所述蛋白以介于约10mg与约400mg之间的量用于通过输注施用于患有肺纤维化的人，所述量包含10mg和400mg。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述抗体以介于约50mg与约200mg之间的量用于通过输注施用，所述量包含50mg和200mg。
14.根据权利要求1到4中任一项所述的组合物，其中一种或多种NAMPT抑制剂或TLR4抑制剂或其组合是选自由反义分子、siRNA、miRNA、适体、核酶、三链体形成分子、RNAi和外部引导序列组成的组的功能性核酸。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中从表达载体表达一种或多种功能性核酸。
16.根据权利要求1到4中任一项所述的组合物，其中一种或多种NAMPT抑制剂是小分子。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述小分子是选自由FK-866、MS-1-82、Rari049和Al-pii135组成的组。
18.一种治疗患者的肺纤维化的方法，其包括向有需要的所述患者施用根据权利要求1到17中任一项所述的组合物。
19.根据权利要求18所述的治疗肺纤维化的方法，其中所述组合物是抗体或其片段，所述方法包括通过静脉内施用来施用介于10与400mg之间的所述抗体或其片段。
20.根据权利要求18所述的方法，其中一种或多种NAMPT抑制剂或TLR4抑制剂或其组合是具有抗NAMPT抗体的结合特异性的抗体、抗体片段或蛋白质，或者抗TLR4抗体通过输注以介于1mg与200mg之间的量施用。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在一小时的过程中执行所述输注。
22.根据权利要求20所述的方法，其中每周一次、每月一次或不那么频繁地施用所述组合物。
23.根据权利要求18所述的方法，其包括以介于约1.0mg/kg与约3.0mg/kg接受者体重之间的剂量施用一种或多种根据权利要求17所述的小分子，所述剂量包含1.0mg/kg和3.0mg/kg接受者体重。
24.根据权利要求23所述的方法，其包括以约2.5mg/kg所述接受者体重的量施用Rari049。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述患者被诊断为患有特发性肺纤维化或家族性肺纤维化。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述患者已经经历、正在经历或将经历血管外伤、血管成形术、血管外科手术或移植动脉病。
27.根据权利要求18所述的方法，其中以相对于未治疗的对照受试者有效减少或预防受试者的成肌纤维细胞累积的时间和剂量施用所述组合物。
28.根据权利要求18所述的方法，其用于减少或预防人受试者的异常成肌纤维细胞累积，其包括以相对于未治疗的对照受试者有效减少或抑制所述受试者的NAMPT与NAMPT受体之间的相互作用的量向所述受试者施用一种或多种烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)抑制剂、或一种或多种NAMPT受体抑制剂、或其组合。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述NAMPT受体是Toll样受体4(TLR4)。
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