ES2957464T3 - Composiciones y métodos para tratar fibrosis pulmonar - Google Patents

Abstract

La inhibición de la expresión y/o función de la nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT) puede reducir, prevenir o revertir los cambios vasculares fisiopatológicos asociados con la aparición y progresión de la fibrosis pulmonar. Se proporcionan composiciones y métodos para inhibir la expresión y función de NAMPT para tratar y prevenir la fibrosis pulmonar en un sujeto que lo necesita. Las composiciones y métodos son útiles para la modulación de procesos fisiopatológicos que contribuyen al desarrollo y progresión de la fibrosis pulmonar al reducir la inflamación pulmonar, la acumulación aberrante de miofibroblastos y la deposición de colágeno en focos fibróticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para tratar fibrosis pulmonar

Campo de la invención

El campo de la invención se refiere generalmente a composiciones, y a métodos para reducir la morbimortalidad asociada con la fibrosis pulmonar.

Antecedentes de la invención

Los trastornos fibróticos humanos afectan a muchos aparatos y sistemas, incluyendo el corazón, los vasos sanguíneos, los riñones, el hígado y los pulmones. Se estima que el 45 % de las muertes en los EE. UU. son atribuibles a trastornos que se caracterizan por diversos grados de fibrosis. La forma más grave de fibrosis pulmonar es la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), un trastorno mortal e implacablemente progresivo. La FPI se caracteriza por una formación excesiva de tejido cicatricial y una destrucción irreversible del parénquima pulmonar, lo que da como resultado anomalías en el intercambio de gases e insuficiencia respiratoria. La evolución de la enfermedad de la FPI es implacablemente progresiva; la mediana de tasa de supervivencia es de menos de tres años. La FPI afecta aproximadamente a 200.000 personas en los EE. UU. y cinco millones en todo el mundo.

La fibrosis pulmonar puede desarrollarse a partir de exposiciones perjudiciales agudas o crónicas, incluso después de que cese la exposición. Por tanto, los pacientes que han experimentado estas exposiciones por inhalación tienen un mayor riesgo de desarrollar FPI. El envejecimiento es un factor de riesgo bien reconocido para la FPI (edad media = 66 años en el momento del diagnóstico), lo que conduce a una carga asistencial significativa entre la población envejecida. La prevalencia de la FPI es de 20,2 por 100.000 para los hombres y de 13,2 por 100.000 para las mujeres. La FPI es más prevalente entre los hombres ancianos y el tabaquismo es un factor de riesgo importante para la FPI. Se ha informado que el 20 % de la población adulta de EE. UU. consume tabaco.

A pesar del papel bien reconocido del estrés oxidativo en la fibrosis y el envejecimiento, la capacidad de seleccionar como diana con precisión a los mediadores clave de este proceso ha resultado difícil. Dado este cambio demográfico, es fundamental comprender la contribución del envejecimiento a los mecanismos celulares/moleculares que conducen a la patogenia de las enfermedades asociadas a la edad, tales como la FPI. Una limitación importante para la identificación de tratamientos eficaces para la FPI ha sido la incapacidad de los modelos animales preclínicos para reflejar de manera fiable la FPI humana y predecir la eficacia de los agentes terapéuticos en los ensayos clínicos. Un motivo importante de este fracaso es que la fibrosis se resuelve de manera espontánea en el modelo convencional de fibrosis en crías de ratones. En la fibrosis que se resuelve, los miofibroblastos pulmonares (la célula clave “generadora de tejido cicatricial”) experimentan apoptosis para promover la cicatrización. Por el contrario, los miofibroblastos de ratones ancianos con fibrosis que no se resuelve adquieren un fenotipo senescente y resistente a la apoptosis, mediado en parte por la expresión persistente de<n>A<d>PH-oxidasa-4 (Nox4). De manera similar, los miofibroblastos pulmonares de pacientes con FPI presentan senescencia y resistencia a la apoptosis, asociadas con una expresión elevada de Nox4. Sin embargo, aún se desconocen los mecanismos que impulsan la persistencia de Nox4 y la resistencia a la apoptosis de los miofibroblastos en el contexto del envejecimiento/FPI. El documento WO 2012/118910 A2 se refiere a composiciones y a un método para tratar enfermedades y lesiones pulmonares y sugiere regular por disminución el gen TLR2 o tanto el gen TLR2 como el gen TLR4.

Aunque recientemente dos fármacos obtuvieron la aprobación de la FDA para la FPI, no se ha demostrado que ningún tratamiento con fármacos mejore definitivamente la calidad de vida de los pacientes con FPI y sólo se ha demostrado que retrasan la muerte seis meses. Los fármacos actuales sólo ralentizan moderadamente la progresión del deterioro pulmonar. No existen terapias disponibles que puedan “revertir” la fibrosis. Las intervenciones de tratamiento existentes son en gran medida preventivas (administración de dosis antes o en el momento de la lesión), más que curativas. Claramente, se necesitan terapias mejoradas para el tratamiento de la FPI y otras enfermedades fibróticas para mejorar la experiencia y los desenlaces del paciente.

Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar composiciones y métodos de uso de las mismas para reducir y revertir los procesos fisiopatológicos asociados con la aparición y la progresión de la fibrosis pulmonar en un sujeto. También un objeto de la invención es proporcionar composiciones, dispositivos, injertos y métodos de uso de los mismos para reducir o prevenir una fibrosis inapropiada o perjudicial en un sujeto que tiene fibrosis pulmonar idiopática.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar formulaciones de dosificación de composiciones eficaces para tratar uno o más síntomas de fibrosis pulmonar en un sujeto.

Sumario de la invención

La invención es tal como se define en las reivindicaciones. Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía mencionados a continuación deben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en esos métodos.

Se ha establecido que la inhibición de la expresión y función de la nicotinamida fosforribosiltransferasa (“NAMPT”) reduce o previene los procesos fisiopatológicos que conducen a la aparición y progresión de la fibrosis pulmonar (FP) en humanos. Se describen formulaciones de dosificación que incluyen uno o más inhibidores de NAMPT en una cantidad eficaz para reducir o prevenir la progresión de FP en un humano.

Se proporcionan composiciones farmacéuticas para reducir o prevenir la progresión de FP en un sujeto que lo necesita, que incluyen uno o más inhibidores de la actividad enzimática de la nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT), o uno o más inhibidores de NAMPT como ligando para un receptor inflamatorio o combinaciones de los mismos, y un excipiente farmacéuticamente aceptable para administración sistémica. Los inhibidores de la actividad enzimática de la NAMPT, inhibidores de NAMPT como ligando, incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y proteínas que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo. En algunas realizaciones, el inhibidor es un fragmento F(Ab) de un anticuerpo, o un fragmento F(Ab)2' divalente de un anticuerpo.

Las composiciones son eficaces para reducir o prevenir uno o más procesos fisiológicos asociados con la patología de la FP en un sujeto con respecto a un sujeto de control. Por ejemplo, en una realización, las composiciones son eficaces para reducir o prevenir una o más de las actividades celulares asociadas con la F<p>, incluyendo acumulación de miofibroblastos, deposición excesiva de matriz extracelular, incluyendo deposición de colágeno y fibronectina en un sujeto con respecto a un sujeto de control. También se proporcionan formulaciones de dosificación para administrar de manera sistémica uno o más inhibidores de molécula pequeña de NAMPT en una cantidad entre 0,01 y 3,5 mg de molécula pequeña (definido como que tiene un peso molecular de 2.000 Dalton, más preferiblemente menos de 1.000 Dalton)/kg de peso corporal de un humano o entre 10 y 400 mg de anticuerpo o fragmento de anticuerpo/kg de peso corporal de un humano. Se proporcionan formas de dosificación que incluyen uno o más inhibidores de NAMPT en una cantidad para la administración mediante infusión intravenosa de entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 200 mg, inclusive. En algunas realizaciones, el inhibidor de NAMPT es un anticuerpo o fragmento del mismo en una cantidad para la administración mediante infusión de entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 400 mg, inclusive. En algunas realizaciones, un inhibidor de NAMPT es un fragmento F(Ab)2' en una cantidad para la administración mediante infusión de entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 200 mg, inclusive. Se administran preferiblemente moléculas pequeñas por vía oral una vez a la semana y se administran por vía intravenosa preferiblemente un anticuerpo y fragmentos de anticuerpos una vez al mes durante un periodo de tiempo.

Se proporcionan métodos que incluyen la administración de anticuerpos anti-NAMPT, fragmentos de anticuerpos de los mismos o proteínas que tienen la especificidad de unión de los mismos a un sujeto mediante infusión en una cantidad de entre 10 mg y 400 mg. En algunas realizaciones, la infusión se lleva a cabo a lo largo de una hora. La administración puede repetirse, preferiblemente una vez al mes.

Un receptor a modo de ejemplo de NAMPT es el receptor tipo Toll 4 (TLR4) humano. Por tanto, las composiciones a modo de ejemplo de inhibidores de NAMPT incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o proteínas que tienen la especificidad de unión de los anticuerpos que se unen a NAMPT o TLR4 y previenen o reducen la interacción entre NAMPT y TLR4. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-NAMPT, o fragmento del mismo, o proteína que tiene afinidad de unión del mismo se une a un epítopo en la proteína NAMPT que comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en Glu445, Gly446, Lys447, Gly448, Asp449, Leu450, Glu451, Glu452, Tyr453, Gly454, His455, Asp456 y Leu457. En otras realizaciones, el inhibidor de NAMPT se une a la molécula de NAMPT para prevenir o reducir la homodimerización de NAMPT.

También se proporcionan inhibidores de NAMPT en forma de ácido nucleico funcional. Los ácidos nucleicos funcionales a modo de ejemplo incluyen moléculas antisentido, ARNip, miARN, aptámeros, ribozimas, moléculas que forman tríplex, iARN y secuencias guía externas. En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos funcionales se expresan a partir de un vector de expresión.

También se proporcionan la expresión o función de los inhibidores de NAMPT, en forma de una molécula pequeña. Los inhibidores de molécula pequeña a modo de ejemplo incluyen FK-866, MS-1-82, Rari049 y Al-pii135. Se proporcionan formulaciones de dosificación que incluyen uno o más inhibidores de molécula pequeña de la función enzimática de la NAMPT en una cantidad para administración de entre aproximadamente 10 |ig/kg y aproximadamente 3,5 mg/kg de peso corporal del receptor, inclusive. En una realización a modo de ejemplo, el inhibidor de molécula pequeña es Rari049 en una cantidad de aproximadamente 2,5 mg/kg de peso corporal del receptor.

Las composiciones también pueden incluir un vehículo de administración, más normalmente una disolución acuosa tal como solución salina estéril. Otros vehículos de administración a modo de ejemplo incluyen nanopartículas, micropartículas, micelas, emulsiones, partículas de lipoproteínas sintéticas, liposomas, nanotubos de carbono, geles o recubrimientos. La composición también puede incluir uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales a modo de ejemplo incluyen compuestos vasoactivos, agentes antineαntimos, agentes quimioterápicos, antiinflamatorios esteroides y no esteroides, agentes inmunoterapéuticos convencionales, inmunodepresores, citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento.

Se proporcionan métodos que incluyen la administración de anticuerpos anti-NAMPT, fragmentos de anticuerpos de los mismos o proteínas inhibidoras de NAMPT que tienen la especificidad de unión de los mismos a un sujeto mediante infusión en una cantidad de entre 1 mg y 400 mg, más preferiblemente entre 20 mg y 200 mg. Los métodos reducen o previenen la inflamación pulmonar y la remodelación de tejido en un sujeto con respecto a un sujeto de control no tratado. En algunas realizaciones, la infusión se lleva a cabo a lo largo de una hora. La administración puede repetirse, por ejemplo, una vez por hora, una vez por día, una vez por semana, una vez por mes o de manera menos frecuente. Las moléculas pequeñas se administran preferiblemente por vía oral una vez a la semana y el anticuerpo y los fragmentos de anticuerpos se administran preferiblemente por vía intravenosa una vez al mes durante un periodo de tiempo. Los métodos pueden administrar combinaciones de inhibidores de NAMPT y uno o más fármacos al sujeto.

Los métodos reducen o previenen uno o más de los síntomas de FP en un sujeto con riesgo de tener FP o al que se le ha diagnosticado FP. Los métodos reducen o previenen la acumulación de miofibroblastos en un sujeto con respecto a un sujeto de control no tratado. Los métodos pueden administrar combinaciones de inhibidores de NAMPT y uno o más fármacos vasoactivos al sujeto.

Los métodos pueden reducir o prevenir la aparición o el desarrollo de FP, o uno o más síntomas de FP en un sujeto que lo necesita. Los síntomas de la FP que pueden reducirse, prevenirse o manejarse de otra manera incluyen disnea, fatiga, angina de pecho (dolor torácico), síncope, edema (hinchazón/enrojecimiento), insuficiencia cardiaca derecha, ingesta oral reducida, mareos, taquicardia y palpitaciones.

Los métodos pueden reducir o prevenir la aparición o el desarrollo de FP aguda o crónica, y/o tratar, prevenir o manejar uno o más de los síntomas de FP aguda o crónica en el sujeto con respecto a un sujeto de control no tratado. La FP aguda puede producirse en el ámbito de cuidados intensivos.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1C muestran que los ratones ancianos demuestran una falta de resolución de la lesión pulmonar inducida por bleomicina en comparación con las crías de ratones.

La figura 2 muestra que los fibroblastos aislados de crías de ratones y ratones ancianos demuestran una inducción de p16 en respuesta a una lesión que es transitoria en crías de ratones, mientras que se mantiene en ratones ancianos con fibrosis persistente. Los fibroblastos aislados de pulmones lesionados de ratones ancianos demuestran niveles más altos de actividad de p-galactosidasa (Pgal) asociada a la senescencia, un marcador de senescencia, en comparación con cohortes jóvenes mediante tinción celular para μgal. Estos resultados demuestran que la fibrosis que no se resuelve en ratones ancianos se asocia con la persistencia de miofibroblastos senescentes.

La figura 3 muestra la generación de ROS en fibroblastos de crías de ratones y ratones ancianos en los puntos de tiempo correspondientes (control, 3 semanas, 2 meses) evaluados.

Las figuras 4A y 4B muestran que las secciones de tejido pulmonar de ratones ancianos después de una lesión pulmonar muestran niveles más bajos de apoptosis (células TUNEL ) en regiones fibróticas en comparación con crías de ratones. Las células de fibroblastos aisladas de ratones ancianos demuestran resistencia a la apoptosis con menos células apoptóticas con resistencia al agente inductor de apoptosis, la estaurosporina (figura 4A). De acuerdo con la adquisición de un fenotipo antiapoptótico, los pulmones de ratones ancianos demuestran niveles elevados de Bcl-2 (figura 4B).

La figura 5 muestra que los ratones NAMPT heterocigotos Nampt+/- están protegidos de la lesión pulmonar inducida por bleomicina y de la fibrosis pulmonar reflejada por el colágeno soluble en los pulmones completos (en comparación con los ratones WT 3 semanas después de la lesión). En respuesta a la lesión, los ratones Nampt+/-demostraron una mayor supervivencia en comparación con los ratones WT (el 80 %, n = 8/10 frente al 50 %, n = 5/10). Estos estudios demuestran la viabilidad de que la selección como dianain vivode Nampt conduce a la protección contra la fibrosis pulmonar.

La figura 6 muestra que iNampt está regulado de manera aberrante en ratones ancianos y humanos con FPI. iNampt se regula por incremento en fibroblastos representativos de fibroblastos pulmonares senescentes y con FPI. Los niveles de ARNm de iNampt en fibroblastos aislados de pacientes con FPI en estadio avanzado frente a estadio inicial muestran un aumento de la expresión deNAMPTcon gravedad creciente (figura 6).

La figura 7 muestra que una expresión génica persistente deNampt(RT-PCR) se asocia con fibrosis que no se resuelve en ratones ancianos evaluados en tejido pulmonar 2 meses después de la lesión en comparación con la fibrosis que se resuelve en crías de ratones. El punto de tiempo de 2 meses después de la lesión representa un punto en el que la fibrosis se resuelve activamente en crías de ratones, mientras que en los ratones ancianos no. La figura 8A muestra que eNampt aumenta la expresión génica de rutas relacionadas con la fibrosis. A los ratones se les inyectaron por vía intratraqueal 60 |ig de Nampt recombinante y se recogió tejido pulmonar 4,5 h después de la administración. Se extrajo ARN de los pulmones y se realizaron 3 análisis de microalineamientos (Affymetrix Mouse430_2). Se evaluaron 630 rutas de expresión génica alterada. Se identificó un enriquecimiento significativo en varias rutas asociadas con la fibrosis pulmonar. Es importante destacar que en respuesta a la eNampt sistémica. La “fibrosis pulmonar” estuvo entre las rutas más significativamente alteradas, ocupando el décimo lugar entre las 640 rutas evaluadas. La figura 8B es un gráfico de barras horizontales que muestra el perfil transcriptómico de todo el genoma de las células endoteliales pulmonares silenciadas por NAMPT y el análisis de rutas que identifican rutas reguladas diferencialmente. Estos resultados respaldan el papel de eNampt en la mediación de respuestas fibróticas a la lesión pulmonar.

Las figuras 9A y 9B muestran que eNampt media en los fenotipos de miofibroblastos profibróticos. Los fibroblastos se trataron de forma dependiente de la dosis con eNampt exógena, lo que dio como resultado una mayor expresión de aSMA, Nox4, iNampt y GAPDH mediante inmunotransferencia de tipo Western. Estos resultados muestran que eNampt media en la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos. eNampt condujo a la inducción de señalización oxidante, tal como lo demuestran los aumentos dependientes de la dosis en la expresión de Nox4 y la generación de ROS (figura 9a), y la senescencia de fibroblastos (figura 9B). Estos estudios demuestran que Nampt media los fenotipos de miofibroblastos pulmonares profibróticos.

La figura 10 muestra que el efecto profibrótico de eNampt requiere la señalización de TLR4. eNampt media en la inmunidad innata y transduce señales de prosupervivencia a través de su conocido receptor, TLR4. Los fibroblastos pulmonares tratados con o sin un antagonista de TLR4, un inhibidor competitivo de TLR4 (RS-LPS, Invitrogen), seguido de tratamiento con/sin eNampt exógena (50 ng/ml, 48 h) mostraron que el bloqueo de TLR4 previno la diferenciación de miofibroblastos mediada por eNampt-TLR4, inhibió la inducción de Nox4 tal como se determina mediante inmunotransferencia de tipo Western y condujo a una disminución de la generación de ROS de una manera dependiente de la dosis.

Las figuras 11A y 11B muestran que Nampt contribuye a la resistencia a la apoptosis de los fibroblastos de FPI humana y de ratón. La expresión inducida por estaurosporina (300 nM, 8 h) de marcadores apoptóticos, caspasa 3 escindida y PARP (figura 11A) aumentó en los fibroblastos pulmonares aislados de Nampt+/- en comparación con ratones W<t>. La figura 11B demuestra que la actividad enzimática de iNampt es necesaria para la resistencia mediada por iNAMPT a la apoptosis inducida por estaurosporina en miofibroblastos pulmonares (que expresan altos niveles de iNampt), ya que los fibroblastos con FPI pretratados con FK-866 mostraron apoptosis restaurada.

Las Figuras 12A-E muestran la estructura química del inhibidor de NAMPT, FK-866 (figura 12A) que se divide en tres regiones (figura 12B) y se varía reemplazándolo con N-heterociclos para generar nuevos análogos de FK866: MS-1-82 (figura 12C), Rari049 (figura 12D), Alpii135 (figura 12E).

La figura 13 es un gráfico de barras que muestra la actividad de NAMPT normalizada en presencia de FK866 y análogos de FK MS-1-82, Rari049, Alpii135 en concentraciones de 0,1, 1 y 10 |iM;

La figura 14 es un gráfico de barras que muestra el papel de la actividad enzimática de Nampt en la apoptosis inducida por H<2>O<2>definida mediante el ensayo TUNEL. El inhibidor enzimático de NAMPT, FK-866, bloquea la apoptosis inducida por H<2>O<2>.

La figura 15 es un gráfico de barras que muestra un aumento de la actividad del promotor de NAMPT de las células endoteliales pulmonares en respuesta a estímulos relevantes para la FPI. Las CE pulmonares humanas, transfectadas con un promotor de luciferasa de NAMPT en respuesta a VEGF (100 ng/ml) o TGFp1 (2 ng/ml) después de la exposición durante 4 h y 24 h, muestran una actividad de luciferasa aumentada.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

El término “administración de dosis” o “dosificación”, se refiere a la administración de una sustancia (por ejemplo, un anticuerpo anti-NAMPT) para lograr un objetivo terapéutico (por ejemplo, el tratamiento de un trastorno asociado a NAMPT).

El término “portador farmacéuticamente aceptable” abarca cualquiera de los portadores farmacéuticos convencionales, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones tales como una emulsión aceite/agua o agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes.

El término “inhibir” u otras formas de la palabra como “que inhibe” o “inhibición” significa obstaculizar o restringir una característica particular. Se entiende que esto está normalmente con respecto a algún valor convencional o esperado, es decir, es relativo, pero que no siempre es necesario hacer referencia al valor convencional o relativo. Por ejemplo, “inhibe” significa obstaculizar, interferir o restringir la actividad del gen con respecto a un patrón o un control. “ Inhibe” también puede significar impedir o restringir la síntesis, expresión o función de la proteína con respecto a un patrón o control.

“Tratamiento” o “tratar” significa administrar una composición a un sujeto o un sistema con una afección no deseada (por ejemplo, hipertensión o un trastorno cardiovascular). La afección puede incluir una enfermedad. “Prevención” o “prevenir” significa administrar una composición a un sujeto o un sistema en riesgo de padecer la afección. La afección puede ser una predisposición a una enfermedad. El efecto de la administración de la composición al sujeto (ya sea tratando y/o previniendo) puede ser, pero no se limita a, el cese de un síntoma particular de una afección, una reducción o prevención de los síntomas de una afección, una reducción de la gravedad de la afección, la destrucción completa de la afección, una estabilización o retraso del desarrollo o la progresión de un evento o una característica particular, o la minimización de las posibilidades de que se produzca un evento o una característica particular.

El término “unión” se refiere a la interacción entre un par correspondiente de moléculas o porciones de las mismas que presentan afinidad mutua o capacidad de unión, normalmente debido a una unión o interacción específica o no específica, incluyendo, pero sin limitarse a, interacciones bioquímicas, fisiológicas y /o químicas. “Pareja de unión” o “ligando” se refiere a una molécula que puede experimentar una unión específica con una molécula particular. “Unión biológica” define un tipo de interacción que se produce entre pares de moléculas que incluyen proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, glicoproteínas, hidratos de carbono o moléculas pequeñas endógenas. “Unión específica” se refiere a moléculas, tales como polinucleótidos, que son capaces de unirse o reconocer una pareja de unión (o un número limitado de parejas de unión) en un grado sustancialmente mayor que otras entidades biológicas similares.

El término “anticuerpo” se refiere a anticuerpos naturales o sintéticos que se unen a un antígeno diana. El término incluye anticuerpos policlonales y monoclonales. Además de las moléculas de inmunoglobulina intactas, también se incluyen en el término “anticuerpos” fragmentos o polímeros de esas moléculas de inmunoglobulina y versiones humanas o humanizadas de moléculas de inmunoglobulina que se unen al antígeno diana. Por tanto, el término “anticuerpo” abarca una molécula que tiene al menos una región variable de una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera y al menos una región variable de una molécula de cadena pesada que en combinación forman un sitio de unión específico para el antígeno diana. El anticuerpo puede ser un anticuerpo IgG, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Un “fragmento de anticuerpo” o “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo se define como al menos una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la región de unión a antígeno. Un anticuerpo puede estar en forma de un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que incluye un fragmento Fab, fragmento F(ab')<2>, una región variable de cadena sencilla, y similares. Pueden generarse fragmentos de moléculas intactas usando métodos bien conocidos en la técnica e incluyen digestión enzimática y medios recombinantes.

Tal como se usa en el presente documento, el término “Fv de cadena sencilla” o “scFv” tal como se usa en el presente documento significa un fragmento variable de cadena sencilla que incluye una región variable de cadena ligera (V<l>) y una región variable de cadena pesada (V<h>) en una cadena sencilla polipeptídica unida por un ligador que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno (es decir, para el V<h>y V<l>de la cadena sencilla polipeptídica se asocien entre sí para formar un Fv). Las regiones V<l>y V<h>pueden derivarse del anticuerpo original o pueden sintetizarse química o recombinantemente.

El término “región variable” pretende distinguir tal dominio de la inmunoglobulina de dominios que son ampliamente compartidos por anticuerpos (tal como un dominio Fc de anticuerpo). La región variable incluye una “región hipervariable” cuyos residuos son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable incluye residuos de aminoácido de una “región determinante de complementariedad” o “CDR” (es decir, normalmente en aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y en aproximadamente los residuos 27-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un “bucle hipervariable” (es decir, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917).

El término “región de entramado” o residuos “FR” son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable tal como se definen en el presente documento.

Un “anticuerpo neutralizante” (o un “anticuerpo que neutralizó la actividad de NAMPT”) pretende referirse a un anticuerpo cuya unión a NAMPT da como resultado la inhibición de la actividad biológica de NAMPT. Esta inhibición de la actividad biológica de NAMPT, o sus ligandos, puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de NAMPT, tales como las cantidades de NAMPT extracelular (ya seain vitrooin vivo),la activación celular inducida por NAMPT y la unión de NAMPT a ligandos de NAMPT. Estos indicadores de la actividad biológica NAMPT pueden evaluarse mediante uno o más de varios ensayosin vitrooin vivoconvencionales conocidos en la técnica (véanse los ejemplos). Por ejemplo, en una realización, la capacidad de un anticuerpo para neutralizar la actividad de NAMPT se evalúa mediante la inhibición de la activación de fibroblastos o células endoteliales inducida por NAMPT. Como parámetro adicional o alternativo de la actividad de NAMPT, puede evaluarse la capacidad de un anticuerpo para inhibir las actividades de transcripción inducidas por NAMPT a través de NFκΒ como medida de la activación celular inducida por NAMPT.

Puede usarse cualquier forma del “antígeno” para generar un anticuerpo que sea específico para un antígeno diana. Por tanto, el antígeno provocador puede contener un único epítopo, múltiples epítopos o puede ser la proteína completa sola o en combinación con uno o más agentes potenciadores de la inmunogenicidad conocidos en la técnica. El antígeno provocador puede ser una proteína aislada de longitud completa, una proteína de la superficie celular (por ejemplo, inmunizando con células transfectadas con al menos una porción del antígeno) o una proteína soluble (por ejemplo, inmunizando sólo con la porción del dominio extracelular de la proteína). El antígeno puede producirse en una célula modificada genéticamente. El ADN que codifica para el antígeno puede ser genómico o no genómico (por ejemplo, ADNc). Puede emplearse cualquier vector genético adecuado para la transformación de las células de interés, incluyendo, pero sin limitarse a, vectores adenovirales, plásmidos y vectores no virales, tales como lípidos catiónicos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “se une específicamente” se refiere a la unión de un anticuerpo a su antígeno relacionado sin unirse significativamente a otros antígenos. Preferiblemente, un anticuerpo “se une específicamente” a un antígeno con una constante de afinidad (Ka) mayor de aproximadamente 105 moles-1 (por ejemplo, 106 moles-1, 107 moles-1, 108 moles-1, 109 moles-1, 1010 moles-1, 1011 moles-1y 1012 moles-1 o más) con esa segunda molécula.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo monoclonal” o “AcM” se refiere a un anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales dentro de la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en un pequeño subconjunto de cantidad de moléculas de anticuerpo.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “inhibir” e “inhibición” significan disminuir una actividad, respuesta, afección, enfermedad u otro parámetro biológico. Esto puede incluir, pero sin limitarse a, la destrucción completa de la actividad, respuesta, afección o enfermedad. Esto también puede incluir, por ejemplo, una reducción del 10 % en la actividad, respuesta, afección o enfermedad en comparación con el nivel nativo o de control. Por tanto, la reducción puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 % o cualquier cantidad de reducción intermedia en comparación con los niveles nativos o de control.

Como se usa en el presente documento, el término “proteína de fusión” se refiere a un polipéptido formado por la unión de dos o más polipéptidos a través de un enlace peptídico formado entre el extremo amino terminal de un polipéptido y el extremo carboxilo terminal de otro polipéptido o mediante la unión de un polipéptido a otro a través de reacciones entre cadenas laterales de aminoácidos (por ejemplo, enlaces disulfuro entre residuos de cisteína en cada polipéptido). La proteína de fusión puede formarse mediante el acoplamiento químico de los polipéptidos constituyentes o puede expresarse como un único polipéptido a partir de una secuencia de ácido nucleico que codifica para la única proteína de fusión contigua. Las proteínas de fusión pueden prepararse usando técnicas convencionales en biología molecular para unir los dos genes en marco en una única secuencia de ácido nucleico y luego expresar el ácido nucleico en una célula huésped adecuada en las condiciones en las que se produce la proteína de fusión.

Tal como se usa en el presente documento, el término “variante” se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido o polinucleótido de referencia, pero que conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, adiciones y/o deleciones). Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no estar codificado por el código genético. Una variante de un polipéptido puede producirse de manera natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe que se produzca de manera natural.

Pueden realizarse modificaciones y cambios en la estructura de los polipéptidos de la divulgación y todavía obtener una molécula que tenga características similares a las del polipéptido (por ejemplo, una sustitución conservativa de aminoácidos). Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una secuencia sin una pérdida apreciable de actividad. Debido a que es la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido lo que define la actividad funcional biológica de ese polipéptido, pueden realizarse determinadas sustituciones de secuencias de aminoácidos en una secuencia de polipéptido y, no obstante, obtener un polipéptido con propiedades similares.

Al realizar tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a un polipéptido se comprende generalmente en la técnica. Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropáticos similares y aun así dar como resultado un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en su hidrofobicidad y características de carga. Esos índices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Se cree que el carácter hidropático relativo del aminoácido determina la estructura secundaria del polipéptido resultante, que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos y cofactores. Se sabe en la técnica que un aminoácido puede sustituirse por otro aminoácido que tenga un índice hidropático similar y todavía obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de 2, son particularmente preferidos aquellos dentro de 1, y aquellos dentro de 0,5 son incluso más particularmente preferidos.

La sustitución de aminoácidos similares también puede realizarse basándose en la hidrofilicidad, particularmente cuando el polipéptido o péptido biológico equivalente funcional creado de ese modo está destinado a su uso en realizaciones inmunológicas. Se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 1); glutamato (+3,0 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtener un polipéptido biológicamente equivalente y, en particular, inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de 2, son particularmente preferidos aquellos dentro de 1, y aquellos dentro de 0,5 son incluso más particularmente preferidos.

Tal como se explicó resumidamente antes, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Los expertos en la técnica conocen bien las sustituciones a modo de ejemplo que tienen en consideración diversas de las características anteriores e incluyen (residuo original: sustitución a modo de ejemplo): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gin: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) y (Val: Ile, Leu). Las realizaciones incluyen equivalentes funcionales o biológicos de un polipéptido tal como se expuso anteriormente. En particular, las realizaciones de los polipéptidos pueden incluir variantes que tienen aproximadamente un el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más de identidad de secuencia con el polipéptido de interés. El término “sustitución conservativa de aminoácidos”, tal como se usa en el presente documento, es una en la que un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

El término “porcentaje (%) de identidad de secuencia” se define como el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos o aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede lograrse de diversas maneras que están dentro de los conocimientos de la técnica, por ejemplo, usando un software informático disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN,<a>L<ig>N-2 o Megalign (DNASTAR). Los parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en la longitud completa de las secuencias que se comparan, pueden determinarse mediante métodos conocidos.

Para los propósitos del presente documento, el % de identidad de secuencia de una determinada secuencia de nucleótidos o aminoácidos C con respecto a, con o frente a una determinada secuencia de ácido nucleico D (que alternativamente puede expresarse como una determinada secuencia C que tiene o incluye un determinado % de identidad de secuencia con respecto a, con o frente a una determinada secuencia D) se calcula de la siguiente manera:

100 multiplicado por la fracción W/Z,

donde W es el número de nucleótidos o aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias en el alineamiento de C y D de ese programa, y donde Z es el número total de nucleótidos o aminoácidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia C no es igual a la longitud de la secuencia D, el % de identidad de secuencia de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de D a C.

El término “Koff”, pretende referirse a la constante de velocidad de disociación de una interacción entre una molécula y su ligando, por ejemplo, un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.

El término “Kd”, tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

El término “acumulación de miofibroblastos” se refiere a la presencia de focos de fibroblastos, provocada por procesos fisiológicos de proliferación celular excesiva, apoptosis reducida combinada/muerte celular programada en miofibroblastos y pérdida de homeostasis celular/metabolismo desordenado y desregulación de determinados factores de crecimiento.

Los términos “pauta posológica mensual”, “administración de dosis mensual” y “administración mensual”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a la evolución temporal de la administración de una sustancia (por ejemplo, un anticuerpo anti-NAMPT) a un sujeto para lograr un objetivo terapéutico (por ejemplo, el tratamiento de un trastorno asociado a NAMPT). La pauta posológica mensual no pretende incluir una pauta posológica semanal. Preferiblemente, la sustancia se administra cada 26-36 días, más preferiblemente cada 28-31 días, incluso más preferiblemente cada 28-30 días y lo más preferiblemente cada 30 días.

El término “NAMPT humana” (abreviado en el presente documento como hNAMPT, o simplemente NAMPT), tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a una enzima nicotinamida fosforribosiltransferasa humana que existe como una forma secretada de 120 kD, cuya forma biológicamente activa está compuesta de un dímero de moléculas de 60 kD unidas de manera no covalente. La estructura de la NAMPT se describe con más detalle, por ejemplo, en Kim,et al.J Mol Biol.; 362:66-77 (2006). Se pretende que el término NAMPT incluya NAMPT humana recombinante, que puede prepararse mediante métodos de expresión recombinantes convencionales. El gen de NAMPT humano se conoce comoNAMPT.

II. Composiciones

Se han desarrollado formulaciones de dosificación que incluyen uno o más inhibidores de NAMPT eficaces para reducir o prevenir el desarrollo y/o la progresión de FP en un humano. Las composiciones para el tratamiento de la FPI incluyen: i) inhibidores de la expresión y función del genNAMPT;ii) inhibidores de la actividad enzimática del producto génico de NAMPT; iv) neutralización de NAMPT extracelular circulante (eNAMPT); v) manipulación de uno o más de los eventos de señalización celular posteriores asociados con NAMPT, tal como la fosforilación/activación de NFkB. La pérdida de función del producto génico de NAMPT da lugar a una función anómala en los procesos celulares asociados con la remodelación y cicatrización del tejido, lo que da como resultado una reducción asociada en la aparición, el desarrollo y la gravedad de la FPI en sujetos humanos. La pérdida de función del producto génico de NAMPT da lugar a una reducción en la acumulación de miofibroblastos, lo que da como resultado una reducción asociada de los procesos celulares asociados con la aparición, el desarrollo y la gravedad de la FP en sujetos humanos.

Se proporcionan composiciones para prevenir o reducir enfermedades caracterizadas por acumulación de miofibroblastos mediante el bloqueo de la expresión y/o función de la enzima NAMPT intracelular (iNAMPT) y/o de la citocina NAMPT extracelular (eNAMPT).

A. Dianas de la inhibición

1. Nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT)

En algunas realizaciones, la diana de la inhibición es la nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT). El producto génico de NAMPT es la enzima limitante de la velocidad en la ruta de recuperación de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) que convierte la nicotinamida en mononucleótido de nicotinamida en mamíferos para permitir la biosíntesis de NAD+.

La forma madura de la proteína NAMPT extracelular es un homodímero de aproximadamente 120 kDa, teniendo cada monómero aproximadamente 500 residuos de aminoácido (Takahashiet al.,J. Biochem. 147: 95-107 (2010)). Se ha establecido que las mutaciones que reducen o inhiben la función de la enzima NAMPT reducen o previenen los procesos fisiológicos que dan lugar a la FP. Se cree que la modulación de la enzima NAMPT proporciona un medio para modular los procesos fisiológicos que dan lugar a la acumulación de miofibroblastos asociada con la FP. a. El gen de NAMPT

El gen de NAMPT humano (NAMPT)está ubicado en el cromosoma 7, (segmento 7q22,3; pares de bases de 106.248.285 a 106.286.326). En la técnica se conocen secuencias de ácido nucleico para el producto génicoNAMPThumano. Véase, por ejemplo, la secuencia de referencia del NCBI: NM_005746.2, nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT) deHomo sapiens,ARNm, que proporciona la secuencia de ácido nucleico:

(SEQ ID NO: 1). También se divulgan secuencias de nucleótidos que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1.

b. La enzima NAMPT

El polipéptido NAMPT es una proteína citoplasmática de 473 aminoácidos (también conocida como nicotinamida fosforribosiltransferasa, proteína del factor potenciador de colonias de células pre-B (PBEF)) con un peso molecular de aproximadamente 52.521 Da. Hay 3 variantes de ARNm, con longitudes de 2,0, 2,4 y 4,0 kilobases (kb), transcritas por el genNAMPT.La variante de 2,4 kb es la más abundante y su marco de lectura abierto codifica para una proteína de 473 aminoácidos (aa) de longitud, con un tamaño previsto de aproximadamente 52 kDa (Samal,et al.Mol. Cell. Biol. 14 (2), 1431-1437 (1994)). Se ha hallado en células endoteliales humanas, donde es capaz de inducir la angiogénesis mediante la regulación por incremento de VEGF y VEGFR y la secreción de MCP-1. En las células endoteliales umbilicales humanas, NAMPT aumenta los niveles de la proteasa MMP 2/9. NAMPT también se ha hallado en una variedad de células inmunitarias distintas de las células B y se ha demostrado que inhibe la apoptosis de macrófagos y fibroblastos. Se ha demostrado que la NAMPT extracelular (eNAMPT) aumenta la activación de NFkB y la posterior inducción de citocinas inflamatorias, tales como TNF-<a>, IL-1<p>, IL-16 y TGF-<P>1, y el receptor de quimiocina CCR3. NAMPT también aumenta la producción de IL-6, TNF-<a>e IL-1<p>en monocitos CD14+, macrófagos y células dendríticas, mejora la eficacia de las células T y participa en el desarrollo de linfocitos B y T (Sun,et al.,Cytokine & growth factor reviews 24(5):433-442 (2013)).

La estructura cristalina de la enzima NAMPT se describe en detalle en Kim,et al.J Mol Biol.; 362:66-77 (2006). NAMPT es una fosforribosiltransferasa dimérica de tipo II. El sitio activo de la enzima está en la superficie de contacto del dímero donde interactúan las dos moléculas de NAMPT. En la estructura de la apoenzima, se une un ion sulfato en lugar del fosfato de NMN. Un enlace de hidrógeno entre Asp219 y la amida de la nicotinamida impide que la enzima forme un enlace de hidrógeno con el ácido nicotínico o quinolínico. Las estructuras cristalinas de NAMPT están disponibles en el Protein Data Bank como PDB ID Nos. 2g 95, 2G96 y 2G97. Las secuencias de aminoácidos de la enzima NAMPT humana son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, el número de registro de GenBank NP_005737.1:

Polipéptidos NAMPT que tienen, por ejemplo, al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

La enzima NAMPT se ha asociado con muchas actividades celulares diversas; sin embargo, la función biológica de la enzima NAMPT en la aparición y la progresión de la FP sigue siendo en gran medida desconocida.

La región de dimerización dentro de la forma madura de la enzima NAMPT se describe en la estructura cristalina de rayos X de NAMPT, descrita en Wanget al.,Nat Struct Mol Biol, 13, 661-662. (2006). Los residuos implicados en la superficie de contacto incluyen Ser199 y Ser200.

Puede ser que la proteína NAMPT interactúe con uno o más ligandos mediante interacción por enlace de hidrógeno con uno o más residuos seleccionados de Glu445, Gly446, Lys447, Gly448, Asp449, Leu450, Glu451, Glu452, Tyr453, Gly454, Gln455, Asp456 y Leu457. Estos residuos forman un bucle que puede interactuar con TLR4 de manera análoga a MD-2.

2. Receptores de NAMPT

El receptor tipo Toll 4 es una proteína que en los humanos está codificada por el genTLR4.TLR4 es una proteína transmembrana, miembro de la familia de receptores tipo Toll, que pertenece a la familia de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Su activación conduce a una ruta de señalización intracelular de NF-kB y a la producción de citocinas inflamatorias que son responsables de activar el sistema inmunitario innato. Es más conocido por reconocer el lipopolisacárido (LPS), un componente presente en muchas bacterias Gram negativas (por ejemplo,Neisseriaspp.) y en bacterias Gram positivas seleccionadas. Sus ligandos también incluyen varias proteínas virales, polisacáridos y una variedad de proteínas endógenas tales como las lipoproteínas de baja densidad, las beta-defensinas y las proteínas de choque térmico.

El gen de TLR4 humano (TLR4)está ubicado en el cromosoma 9, (segmento 9q32-q33) (Georgel,et al.,PLoS ONE 4(11): e7803 (2009)). En la técnica se conocen secuencias de ácidos nucleico para el producto génicoTLR4humano. Véase, por ejemplo, la secuencia de referencia del NCBI: AAY82268.1, receptor tipo Toll 4 (TLR4) deHomo sapiens,ARNm, que proporciona la secuencia de ácido nucleico:

(SEQ ID NO: 3). También se divulgan secuencias de nucleótidos que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90%, 95 %, 99% o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 3.

Se conocen en la técnica secuencias de aminoácidos del TLR4 humano. Véase, por ejemplo, el n.° de registro de GenBank No. AAY82268.1:

Se describen polipéptidos TLR4 que tienen al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99% o100%de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4.

El antígeno linfocitario 96, también conocido como “MD2”, es una proteína asociada con TLR4 en la superficie celular y permite que TLR4 responda al LPS. MD-2 también permite que TLR4 responda a una amplia variedad de estructuras parciales endotóxicas de LPS, bacterias Gram negativas y ácido lipoteicoico Gram positivo, pero no a bacterias Gram positivas, peptidoglicanos y lipopéptidos. MD-2 se asocia físicamente con TLR4 y TLR2, pero la asociación con TLR2 es más débil que con TLR4. M<d>-2 y TLR4 mejoran cada uno la expresión del otro (Dziarski,et al.,J Endotoxin Res. 6(5):401-5 (2000)).

Se ha establecido que TLR4 es un receptor de NAMPT extracelular (eNAMPT) (Campet al.,Sci Rep. 5:13135 (2015)). Puede ser que eNAMPT se una a TLR4 en la región de interacción con<m>D2.

B. Inhibidores de NAMPT y receptores de NAMPT

El bloqueo de la expresión de NAMPT y/o función de NAMPT puede reducir o prevenir los procesos inmunitarios que dan lugar a la aparición y el desarrollo de la FP crónica y aguda. Se describen agentes que inhiben o reducen la transcripción, traducción o función de la enzima NAMPT, o que inhiben la interacción de NAMPT con TLR4 (NAMPT/TLR4).

Los inhibidores de NAMPT pueden unirse al gen de NAMPT o al polipéptido NAMPT y bloquear directa o indirectamente la función biológica del polipéptido NAMPT. Los inhibidores también pueden bloquear la función biológica de una o más rutas de señalización que constituyen la función biológica aguas abajo de NAMPT. En algunas realizaciones, los inhibidores de NAMPT actúan impidiendo que los receptores endógenos del polipéptido NAMPT interactúen con el polipéptido NAMPT o se unan directamente al mismo. Los inhibidores pueden bloquear las interacciones proteína-proteína que implican al polipéptido NAMPT, o pueden prevenir o reducir la actividad funcional de un complejo de la enzima NAMPT y sus receptores. Los inhibidores que se unen directamente al polipéptido NAMPT pueden actuar mediante oclusión directa de un sitio activo en el polipéptido NAMPT, o mediante oclusión indirecta, tal como mediante bloqueo esteárico de las interacciones de NAMPT. Por ejemplo, en algunas realizaciones el inhibidor obstruye u ocluye la función de un dominio de interacción de proteínas, tal como el sitio activo de la enzima, o el sitio de homodimerización entre dos monómeros de NAMPT dentro del polipéptido NAMPT activo, o el sitio de interacción con un receptor, por ejemplo, el sitio de interacción con TLR4. En otras realizaciones, los inhibidores se unen a una ubicación que es espacialmente distinta de un sitio activo. Por tanto, en determinadas realizaciones, los inhibidores que se unen al polipéptido NAMPT pueden prevenir la función de NAMPT mediante mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, prevenir o interrumpir la dimerización, inducir la oligomerización, inducir cambios conformacionales, prevenir funciones catalíticas, inducir la degradación, inducir la captación por células inmunitarias, prevenir la captación por las células diana, prevenir la unión a ligando, prevenir la fosforilación, inducir la desnaturalización, prevenir una o más modificaciones postraduccionales o alterar de otro modo la estructura terciaria nativa del polipéptido NAMPT.

Se entiende que la iniciación o transducción de rutas de señalización celular mediante NAMPT puede requerir la unión de un receptor mediante el polipéptido NAMPT. Por tanto, las proteínas, anticuerpos o moléculas pequeñas que bloquean las rutas de transducción de señales que implican a NAMPT y, opcionalmente, previenen la coligación de NAMPT y sus receptores son agentes inmunomoduladores útiles. Las clases de inhibidores de NAMPT que se analizan a continuación incluyen anticuerpos, fracciones de anticuerpos Fab y ácidos nucleicos funcionales que se unen directamente al polipéptido NAMPT.

1. Anticuerpos

Se proporcionan anticuerpos que inhiben la función de NAMPT mediante interacción específica directamente con la enzima NAMPT o sus moléculas accesorias. Los anticuerpos pueden incluir un sitio de unión a antígeno que se une a un epítopo de la enzima NAMPT. La unión de un anticuerpo a NAMPT puede inhibir o reducir la función de la enzima NAMPT a través de uno o más mecanismos distintos. Normalmente, los anticuerpos pueden reducir o neutralizar la actividad biológica de NAMPTin vitroein vivo.En algunas realizaciones, los anticuerpos tienen alta afinidad por NAMPT (por ejemplo, Kd = 10-8M o menos), una velocidad de ralentización para la disociación de NAMPT (por ejemplo, K f = 10-3 segundo-1, o menos), o una combinación de los mismos.

Se proporcionan anticuerpos de longitud completa, fragmentos de unión a antígeno de los mismos y proteínas de fusión basadas en los mismos. Los anticuerpos útiles y sus fragmentos de unión a antígeno se caracterizan típicamente por unirse a NAMPT, preferiblemente con alta afinidad y cinética de disociación lenta. En algunas realizaciones, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inhiben la actividad de NAMPT, incluyendo la transcripción inducida por NAMPT a través de NFκΒ (in vitroein vivo)y activación celular inducida por NAMPT. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un subtipo 1 de IgG, o anticuerpo IgG4) o puede comprender sólo una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2', scFv o dominio único F(Ab)). Un anticuerpo recombinante a modo de ejemplo se une a un epítopo que incluye dos o más de los residuos de aminoácido expuestos en SEQ ID NO. 2.

En algunas realizaciones, los inhibidores de NAMPT son proteínas que tienen la especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo, tal como un fragmento de un anticuerpo. El término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo”), se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, NAMPT).

Pueden usarse diversos tipos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en las composiciones y métodos divulgados, incluyendo inmunoglobulina completa de cualquier clase, fragmentos de la misma y proteínas sintéticas que contienen al menos el dominio variable de unión a antígeno de un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo IgG, tal como IgG.<1>, IgG<2>, IgG<3>o IgG<4>. Un anticuerpo puede estar en forma de un fragmento de unión a antígeno que incluye un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, una región variable de cadena sencilla y similares. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales (AcM).

Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos “quiméricos” en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que se unan específicamente al antígeno diana y/o presenten la actividad biológica deseada (patente estadounidense n.° 4.816.567; y Morrisonet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).

La función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CHI; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consisten en los dominios VH y CHI; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Wardet al.,(1989) Nature 341 :544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que les permite formarse como una cadena sencilla proteica en la que se encuentra el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Birdet al.(1988) Science 242:423-426; y Hustonet al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena sencilla estén incluidos dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo. También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una cadena sencilla polipeptídica, pero usan un ligador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, obligando de ese modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno.

a. Características de los anticuerpos

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo dentro de la proteína codificada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Un epítopo lineal es un epítopo formado por una secuencia continua de aminoácidos del antígeno. Los epítopos lineales normalmente incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 residuos de aminoácido continuos. Los anticuerpos se unen a un epítopo lineal basado en la secuencia primaria del antígeno. Por tanto, en algunas realizaciones, el epítopo puede ser un epítopo lineal y puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos consecutivos de la secuencia primaria de SEQ ID NO: 2. Un “epítopo conformacional” es un epítopo que incluye secciones discontinuas de la secuencia de aminoácidos del antígeno. Los anticuerpos se unen a un epítopo conformacional basado en características de superficie tridimensionales, forma o estructura terciaria del antígeno. Por tanto, en algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede unirse a un epítopo conformacional que incluye una característica de superficie tridimensional, forma o estructura terciaria de la enzima NAMPT. En algunas realizaciones, una característica de superficie tridimensional puede incluir cualquier número de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o los residuos correspondientes en un homólogo, ortólogo, parálogo o variante del mismo.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo interfiere con la interacción entre NAMPT y TLR4. NAMPT puede unirse a TLR4 a través de un bucle de unión que incluye algunos o todos los residuos en la secuencia de aminoácidos EGKGDLEEYGHDL (SEQ ID NO:5) correspondiente a los aminoácidos 445 a 457 de SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, SEQ ID NO: 5 sirve como parte o la totalidad de un antígeno para producir un anticuerpo anti-NAMPT. En algunas realizaciones, la SEQ ID NO: 5, o residuos de la misma, forman parte o la totalidad del epítopo al que se une el anticuerpo. En algunas realizaciones, SEQ ID NO: 5 forma parte o la totalidad de un epítopo de conformación.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo dentro de la proteína codificada por la secuencia de aminoácidos de SEQ I<d>NO: 2 sólo puede unirse si la proteína codificada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 no se une mediante un ligando o molécula pequeña. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se disocia de la NAMPT humana, o un ligando de la NAMPT humana, con una constante de velocidad Koff de 1 x 10‘Vs'1 o menos. Preferiblemente, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se disocia de la NAMPT humana, o de un ligando de NAMPT humana con una constante de velocidad Koff de 5 x 10'4/s_1 o menos. Incluso más preferiblemente, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se disocia de la NAMPT humana, o de un ligando de NAMPT humana con una constante de velocidad Koff de 1 x 10'4/s_1 o menos. Normalmente, el anticuerpo anti-NAMPT se une a un epítopo formado por dos o más residuos de aminoácido en la superficie de la estructura terciaria de la enzima NAMPT formada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2. Los anticuerpos adecuados a modo de ejemplo también se analizan en la patente estadounidense n.° 9.409.983.

Se encuentran disponibles anticuerpos comerciales específicos para NAMPT. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales y monoclonales de conejo, ratón o rata anti-NAMPT humana están disponibles comercialmente de múltiples proveedores (por ejemplo, anticuerpo policlonal de conejo anti-NAMPT humana (# de catálogo Thermo-Fischer scientific PA5-34858); o anticuerpo monoclonal de ratón anti-NAMPT humana 1D3A12 (# de catálogo Thermo-Fischer scientific MA5-15388); o anticuerpo monoclonal de rata anti-NAMPT humana 362616 (# de catálogo Thermo-Fischer scientific MA5-24108)).

Los anticuerpos policlonales y monoclonales de conejo y ratón anti-TLR4 humana están disponibles comercialmente de múltiples proveedores (por ejemplo, anticuerpo policlonal de conejo anti-TLR4 humana (# de catálogo Thermo-Fischer scientific 48-2300); o anticuerpo monoclonal de ratón anti-TLR4 humana HTA125 (# de catálogo Thermo-Fischer scientific 14-9917-82); o anticuerpo policlonal de ratón (# de catálogo Thermo-Fischer scientific 36-3700)). En algunas realizaciones, se usa un anticuerpo disponible comercialmente. En algunas realizaciones, el anticuerpo utilizado en las composiciones y métodos divulgados es un anticuerpo humanizado o quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla), que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de un anticuerpo disponible comercialmente, o que tiene CDR variantes del mismo que tienen un 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad de secuencia con las CDR correspondientes del anticuerpo disponible comercialmente.

En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene la misma especificidad de epítopo que un anticuerpo anti-NAMPT disponible comercialmente o un anticuerpo anti-NAMPT que por lo demás se conoce en la técnica. Esto puede lograrse produciendo un anticuerpo recombinante que contenga el parátopo del anticuerpo disponible comercialmente o de otro modo.

b. Composición de anticuerpo y métodos de fabricación

Para preparar un anticuerpo que se une específicamente a NAMPT, pueden usarse polipéptidos purificados, fragmentos, fusiones o epítopos de los mismos, o polipéptidos expresados a partir de sus secuencias de ácido nucleico. Usando la NAMPT purificada, fusiones o epítopos de la misma o proteínas expresadas a partir de sus secuencias de ácido nucleico, pueden prepararse anticuerpos usando cualquier método adecuado conocido en la técnica.

Los anticuerpos pueden generarse en cultivos celulares, en fagos o en diversos animales, incluyendo ratones, conejos, ovejas y caballos. Por tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo de mamífero. Pueden usarse técnicas en fagos para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de especificidad o avidez alteradas. Tales técnicas son habituales y bien conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo se produce mediante medios recombinantes conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede producirse un anticuerpo recombinante transfectando una célula huésped con un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica para el anticuerpo. Pueden usarse uno o más vectores para transfectar la secuencia de ADN que expresa al menos una región VL y una región VH en la célula huésped. Las descripciones a modo de ejemplo de medios recombinantes de generación y producción de anticuerpos incluyen Delves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Shephard,et al.,Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Academic Press, 1993); Current Protocols actuales In Immunology (John Wiley & Sons, edición más reciente).

Los anticuerpos pueden modificarse mediante medios recombinantes para aumentar la eficacia del anticuerpo en la mediación de la función deseada. Los anticuerpos pueden modificarse mediante sustituciones utilizando medios recombinantes. Normalmente, las sustituciones serán sustituciones conservativas. Por ejemplo, al menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo puede reemplazarse por un residuo diferente. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.624.821, la patente estadounidense n.° 6.194.551, la solicitud n.° WO 9958572; y Angalet al.,Mol. Inmunol. 30:105-08 (1993). La modificación de aminoácidos incluye deleciones, adiciones y sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, tales cambios se realizan para reducir actividades no deseadas, por ejemplo, citotoxicidad dependiente del complemento. Frecuentemente, los anticuerpos se marcan uniendo, de manera covalente o no covalente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y se informan ampliamente tanto en la bibliografía científica como en la de patentes. Estos anticuerpos pueden seleccionarse para determinar su unión a NAMPT, o fragmentos o fusiones de los mismos. Véase, por ejemplo, Antibody Engineering: A Practical Approach (Oxford University Press, 1996).

Los anticuerpos adecuados con las actividades biológicas deseadas pueden identificarse mediante ensayosin vitroincluyendo, pero sin limitarse a: proliferación, migración, adhesión, crecimiento en agar blando, angiogénesis, comunicación célula-célula, apoptosis, transporte, transducción de señales y los siguientes ensayosin vivotales como la inhibición del crecimiento tumoral.

Los anticuerpos que pueden usarse en las composiciones y métodos divulgados incluyen inmunoglobulina completa (es decir, un anticuerpo intacto) de cualquier clase, fragmentos de la misma y proteínas sintéticas que contienen al menos el dominio variable de unión a antígeno de un anticuerpo. Los dominios variables difieren en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye habitualmente de manera uniforme entre los dominios variables de los anticuerpos. Normalmente, se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan entramado (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas incluyen cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina beta. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, junto con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos.

También se divulgan fragmentos de anticuerpos que tienen bioactividad. Los fragmentos, ya sea que estén unidos a otras secuencias o no, incluyen inserciones, deleciones, sustituciones u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o residuos de aminoácidos específicos, siempre que la actividad del fragmento no se altere o deteriore significativamente en comparación con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no modificado.

También pueden adaptarse técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla específicos de una proteína antigénica. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para la producción de anticuerpos de cadena sencilla. Puede crearse un anticuerpo de cadena sencilla fusionando los dominios variables de las cadenas pesada y ligera usando un ligador peptídico corto, reconstituyendo de ese modo un sitio de unión a antígeno en una única molécula. Se han desarrollado fragmentos variables de anticuerpos de cadena sencilla (scFv) en los que el extremo C terminal de un dominio variable está unido al extremo N terminal del otro dominio variable mediante un péptido o ligador de 15 a 25 aminoácidos sin alterar significativamente la unión a antígeno o la especificidad de la unión. El ligador se elige para permitir que la cadena pesada y la cadena ligera se unan en su orientación conformacional adecuada.

Pueden modificarse por ingeniería fragmentos variables de cadena sencilla divalentes (di-scFv) uniendo dos scFv. Esto puede hacerse produciendo una cadena sencilla peptídica con dos regiones VH y dos VL, produciendo scFv en tándem. Los scFv también pueden diseñarse con péptidos ligadores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas (aproximadamente cinco aminoácidos), lo que obliga a los scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos. Se ha demostrado que los diacuerpos tienen constantes de disociación hasta 40 veces más bajas que los scFv correspondientes, lo que significa que tienen una afinidad mucho mayor por su diana. Los ligadores aún más cortos (uno o dos aminoácidos) conducen a la formación de trímeros (triacuerpos o tricuerpos). También se han producido tetracuerpos. Presentan una afinidad incluso mayor por sus dianas que los diacuerpos.

Un anticuerpo monoclonal se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales dentro de la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en un pequeño subconjunto de moléculas de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos “quiméricos” en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad antagonista deseada.

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante cualquier procedimiento que produzca anticuerpos monoclonales. En un método de hibridoma, normalmente se inmuniza un ratón u otro animal huésped adecuado con un agente inmunizante para provocar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarsein vitro.

Los anticuerpos también pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante. El ADN que codifica para los anticuerpos divulgados puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótido que sean capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). También pueden generarse y seleccionarse bibliotecas de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos activos usando técnicas de presentación en fago.

i. Anticuerpos humanos y humanizados

Muchos anticuerpos no humanos (por ejemplo, los derivados de ratones, ratas o conejos) son naturalmente antigénicos en humanos y, por tanto, pueden dar lugar a respuestas inmunitarias no deseadas cuando se administran a humanos. Por tanto, el uso de anticuerpos humanos o humanizados en los métodos sirve para disminuir la posibilidad de que un anticuerpo administrado a un humano provoque una respuesta inmunitaria no deseada.

Pueden emplearse animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J(H)) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno.

Opcionalmente, los anticuerpos se generan en otras especies y se “humanizan” para su administración en humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')<2>, u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de entramado Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden contener residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o entramado importadas. En general, el anticuerpo humanizado contendrá sustancialmente todos los de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son los de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. De manera óptima, el anticuerpo humanizado también contendrá al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana.

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, a un anticuerpo humanizado se le introducen uno o más residuos de aminoácido procedentes de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan residuos “importados”, que normalmente se toman de un dominio variable “importado”. Las técnicas de humanización de anticuerpos generalmente implican el uso de tecnología de ADN recombinante para manipular la secuencia de ADN que codifica para una o más cadenas polipeptídicas de una molécula de anticuerpo. La humanización puede realizarse esencialmente sustituyendo CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, una forma humanizada de un anticuerpo no humano (o un fragmento del mismo) es un anticuerpo o fragmento quimérico, en el que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que van a usarse en la fabricación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el método de “mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se selecciona frente a toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como entramado (FR) humano para el anticuerpo humanizado. Otro método usa un entramado particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede usarse el mismo entramado para varios anticuerpos humanizados diferentes.

A veces, el injerto de CDR por sí solo puede conducir a una reducción o pérdida completa de la afinidad de unión, ya que un conjunto de residuos de entramado de soporte en la zona de Vernier es importante para mantener la conformación de las CDR (Foote y Winter, J. Mol. Bio., 224:487-499 (1992)). Este problema puede abordarse reintroduciendo residuos murinos en el entramado humano (Queenet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(24):10029-33 (1989)); tales sustituciones se denominan habitualmente retromutaciones.

La mayoría de las proteínas terapéuticas son, en mayor o menor medida, inmunogénicas (Van Walleet al.,Expert Opin. Biol. Ther., 7:405-418 (2007), Staset al.,Cambridge University Press, Cambridge, (2009)) e incluso los denominados agentes terapéuticos con anticuerpos totalmente humanos pueden contener regiones inmunogénicas (Hardinget al.,J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 752:233-245 (2001)). La inmunogenicidad es la capacidad de inducir una respuesta de Th (células T auxiliares), que se desencadena cuando un único receptor de células T reconoce un péptido unido a las moléculas de HLA de clase II que se muestran en las células presentadoras de antígenos. Los péptidos se generan a partir de proteínas internalizadas por la célula presentadora de antígeno que luego se procesan a través de la ruta de escisión endosómica. Sólo los péptidos con suficiente afinidad por las moléculas de HLA de clase II se presentarán en la superficie celular y posiblemente podrían desencadenar una respuesta de Th.

Por consiguiente, es posible reducir el potencial de inmunogenicidad eliminando los epítopos de Th, un proceso conocido como desinmunización (Chamberlain, The Regulatory Review, 5:4-9 (2002), Baker y Jones, Curr. Opin. Drug. Discov. Devel., 10:219-227 (2007)). Esto se logra prediciendo qué péptidos en la proteína terapéutica pueden unirse a las moléculas de HLA de clase II y posteriormente introduciendo sustituciones que eliminan o reducen la afinidad de unión del péptido por las moléculas de HLA de clase II.

Existen varios genes de HLA de clase II y casi todos son altamente polimórficos. Además, las moléculas de HLA de clase II consisten en una cadena alfa y beta, cada una derivada de un gen diferente que, con el polimorfismo inherente, aumenta adicionalmente la variación. Cada individuo expresa los genes: DRA/DRB, DQA/DQB y DPA/DPB. De estos, sólo DRA no es polimórfico. Además, también puede estar presente un “segundo” gen DRB (DRB3, DRB4 o DRB5), cuyo producto también se asocia con la cadena de DRA.

La atención se centra durante una desinmunización en los alotipos de DR, que se sabe que se expresan en un nivel más alto que DQ y DP (Laupezeet al.,Hum. Inmunol., 61:591-97 (1999), Gansbacher y Zier, Cell Immunol., 117:22-34 (1988), Berdozet al.,J. Immunol., 139:1336-1341 (1987), Stunzet al.,“HLA-DRB1 abd -DRB4 genes are diferenteially regulated at the transcriptional level, J. Immunol., 143:3081-3086 (1989)). La evaluación de la gravedad de los epítopos individuales se basa en los criterios de promiscuidad, es decir, el número de alotipos de HLA a los que se une un epítopo específico, así como la importancia (frecuencia) de los alotipos en la población y una evaluación cualitativa de la fuerza de unión del complejo HLA:péptido. Como la población de células T de un individuo ha sido seleccionada para no reconocer los “autopéptidos”, es posible seleccionar la proteína que se está desinmunizando en busca de péptidos que correspondan a autopéptidos (conocidos) que normalmente no deberían inducir una respuesta de Th.

Debido a que una propiedad importante de un anticuerpo terapéutico es la actividad de unión, es importante que las sustituciones propuestas durante la humanización y desinmunización no afecten sustancialmente a la afinidad o estabilidad del anticuerpo. Gran cantidad de información se ha recopilado en los últimos 20 años sobre la humanización y el injerto de las CDR (Joneset al.,Nature, 321, 522-525 (1986), Foote y Winter, J. Mol. Bio., 224:487-499 (1992)), las propiedades biofísicas de los anticuerpos (Ewertet al.,J. Mol. Biol., 325:531-553 (2003)), la conformación de los bucles de CDR (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), Al-Lazikani,et al.,J. Mol. Biol., 273:927-948 (1997), North,et al.,J. Mol. Biol., 406:228-256 (2011)) y para los entramados (Vargas-Madrazo y Paz-García, J. Mol. Recognit., 16:113-120 (2003), Honegger,et al.,Protein Eng. Des. Sel., 22:121-134 (2009)), que junto con los avances en el modelado de proteínas (Desmet,et al.,Proteins, 48:31-43 (2002), Almagro,et al.,Proteins, 79:3050-3066 (2011)) permite humanizar y desinmunizar con precisión anticuerpos manteniendo sustancialmente la afinidad de unión y la estabilidad.

Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos humanizados mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulinas tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de la secuencia consenso e importada de modo que se consiga la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el/los antígeno(s) diana. En general, los residuos de CDR están directa y sustancialmente implicados en la influencia de la unión a antígeno.

ii. Anticuerpos de cadena sencilla

Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para la producción de anticuerpos de cadena sencilla. Un anticuerpo de cadena sencilla se crea fusionando los dominios variables de las cadenas pesada y ligera usando un ligador peptídico corto, reconstituyendo de ese modo un sitio de unión a antígeno en una única molécula. Se han desarrollado fragmentos variables de anticuerpos de cadena sencilla (scFv) en los que el extremo C terminal de un dominio variable está unido al extremo N terminal del otro dominio variable mediante un péptido o ligador de 15 a 25 aminoácidos sin alterar significativamente la unión a antígeno o la especificidad de la unión. El ligador se elige para permitir que la cadena pesada y la cadena ligera se unan en su orientación conformacional adecuada. Estos Fv carecen de las regiones constantes (Fc) presentes en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo nativo.

iii. Anticuerpos monovalentes

Los métodosin vitrotambién son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede lograrse usando técnicas habituales conocidas en la técnica. Por ejemplo, la digestión puede realizarse usando papaína. La digestión de anticuerpos con papaína normalmente produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un único sitio de unión a antígeno y un fragmento Fc residual. El tratamiento con pepsina produce un fragmento, denominado fragmento F(ab')<2>, que tiene dos sitios de combinación de antígenos y todavía es capaz de reticular el antígeno.

Los fragmentos Fab producidos en la digestión del anticuerpo también contienen los dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo terminal del dominio de cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. El fragmento F(ab<' )2>es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes porta un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

iv. Anticuerpos híbridos

El anticuerpo puede ser un anticuerpo híbrido. En los anticuerpos híbridos, un par de cadenas pesada y ligera es homólogo al que se halla en un anticuerpo producido contra un epítopo, mientras que el otro par de cadenas pesada y ligera es homólogo a un par hallado en un anticuerpo producido contra otro epítopo. Esto da como resultado la propiedad de valencia multifuncional, es decir, un anticuerpo bivalente tiene la capacidad de unirse al menos a dos epítopos diferentes simultáneamente. Tales híbridos pueden formarse mediante fusión de hibridomas que producen los respectivos anticuerpos componentes, o mediante técnicas recombinantes. Por supuesto, tales híbridos también pueden formarse usando cadenas quiméricas.

v. Conjugados o fusiones de fragmentos de anticuerpos

La función de selección como diana del anticuerpo puede usarse terapéuticamente acoplando el anticuerpo o un fragmento del mismo con un agente terapéutico. Tal acoplamiento del anticuerpo o fragmento (por ejemplo, al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina) con el agente terapéutico puede lograrse preparando un inmunoconjugado o preparando una proteína de fusión, que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y el agente terapéutico.

Tal acoplamiento del anticuerpo o fragmento con el agente terapéutico puede lograrse preparando un inmunoconjugado o preparando una proteína de fusión, o uniendo el anticuerpo o fragmento a un ácido nucleico tal como un ARNip, que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y el agente terapéutico.

En algunas realizaciones, el anticuerpo se modifica para alterar su semivida. En algunas realizaciones, es deseable aumentar la semivida del anticuerpo para que esté presente en la circulación o en el sitio de tratamiento durante periodos de tiempo más largos. Por ejemplo, puede ser deseable mantener los títulos del anticuerpo en la circulación o en la ubicación que va a tratarse durante periodos de tiempo prolongados. Los anticuerpos pueden modificarse por ingeniería con variantes de Fc que extienden la semivida, por ejemplo, usando la tecnología de prolongación de la semivida de los anticuerpos Xtend™ (Xencor, Monrovia, CA). En otras realizaciones, la semivida del anticuerpo anti-ADN se disminuye para reducir los posibles efectos secundarios. Los conjugados divulgados pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada. El resto de fármaco no debe considerarse limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto del fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina dePseudomonaso toxina diftérica.

vi. Método de producción de anticuerpos usando química de proteínas

Un método para producir proteínas tales como anticuerpos es unir dos o más péptidos o polipéptidos mediante técnicas de química de proteínas. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos pueden sintetizarse químicamente usando equipos de laboratorio actualmente disponibles usando química de Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) o Boc (terc-butiloxicarbonilo). (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Un experto en la técnica podrá apreciar fácilmente que un péptido o polipéptido correspondiente al anticuerpo, por ejemplo, puede sintetizarse mediante reacciones químicas convencionales. Por ejemplo, un péptido o polipéptido puede sintetizarse y no escindirse de su resina de síntesis, mientras que el otro fragmento de un anticuerpo puede sintetizarse y posteriormente escindirse de la resina, exponiendo de ese modo un grupo terminal que está funcionalmente bloqueado en el otro fragmento. Mediante reacciones de condensación de péptidos, estos dos fragmentos pueden unirse covalentemente mediante un enlace peptídico en sus extremos carboxilo y amino terminales, respectivamente, para formar un anticuerpo, o un fragmento del mismo. Alternativamente, el péptido o polipéptido se sintetiza de manera independientein vivotal como se describió anteriormente. Una vez aislados, estos péptidos o polipéptidos independientes pueden unirse para formar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo mediante reacciones de condensación de péptidos similares. Por ejemplo, el ligamiento enzimático de segmentos peptídicos clonados o sintéticos permite unir fragmentos peptídicos relativamente cortos para producir fragmentos peptídicos, polipéptidos o dominios proteicos completos más grandes. Alternativamente, puede utilizarse el ligamiento químico nativo de péptidos sintéticos para construir de manera sintética péptidos o polipéptidos grandes a partir de fragmentos peptídicos más cortos. Este método consiste en una reacción química de dos etapas. La primera etapa es la reacción quimioselectiva de un péptido-alfa-tioéster sintético desprotegido con otro segmento peptídico desprotegido que contiene un residuo Cys amino-terminal para dar un producto intermedio unido a tioéster como producto covalente inicial. Sin un cambio en las condiciones de reacción, este producto intermedio experimenta una reacción intramolecular rápida y espontánea para formar un enlace peptídico nativo en el sitio de ligamiento.

2. Ácidos nucleicos funcionales

Se divulgan ácidos nucleicos funcionales que inhiben la transcripción, traducción o función del genNAMPT.Los ácidos nucleicos funcionales son moléculas de ácido nucleico que tienen una función específica, tal como unirse a una molécula diana o catalizar una reacción específica. Tal como se analiza con más detalle a continuación, las moléculas de ácidos nucleicos funcionales pueden dividirse en las siguientes categorías: moléculas antisentido, ARNip, miARN, aptámeros, ribozimas, moléculas que forman tríplex, iARN y secuencias guía externas. Las moléculas de ácidos nucleicos funcionales pueden actuar como efectores, inhibidores, moduladores y estimuladores de una actividad específica que posee una molécula diana, o las moléculas de ácidos nucleicos funcionales pueden poseer una actividad independientede novode cualquier otra molécula.

Las moléculas de ácidos nucleicos funcionales pueden interactuar con cualquier macromolécula, como ADN, ARN, polipéptidos o cadenas de hidratos de carbono. Por tanto, los ácidos nucleicos funcionales pueden interactuar con el ARNm o el ADN genómico del genNAMPTo pueden interactuar con el propio polipéptido NAMPT. Los ácidos nucleicos funcionales a menudo se diseñan para interactuar con otros ácidos nucleicos basándose en la homología de secuencia entre la molécula diana y la molécula de ácido nucleico funcional. En otras situaciones, el reconocimiento específico entre la molécula de ácido nucleico funcional y la molécula diana no se basa en la homología de secuencia entre la molécula de ácido nucleico funcional y la molécula diana, sino que más bien se basa en la formación de una estructura terciaria que permite que se lleve a cabo el reconocimiento específico. Por tanto, las composiciones divulgadas pueden incluir uno o más ácidos nucleicos funcionales diseñados para reducir la expresión o función de la enzima NAMPT.

En algunas realizaciones, la composición incluye un polipéptido o ácido nucleico funcional diseñado para seleccionar como diana y reducir o inhibir la expresión o traducción del ARNm de NAMPT; o para reducir o inhibir la expresión, reducir la actividad o aumentar la degradación de la enzima NAMPT. En algunas realizaciones, la composición incluye un vector adecuado para la expresiónin vivodel ácido nucleico funcional.

En algunas realizaciones, un polipéptido o ácido nucleico funcional se diseña para seleccionar como diana un segmento del ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o el complemento de la misma, o variantes de la misma que tiene una secuencia de ácido nucleico del 65 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntico a un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

En otras realizaciones, un polipéptido o ácido nucleico funcional se diseña para seleccionar como diana un segmento de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, o el complemento de la misma, o variantes de la misma que tiene una secuencia de ácido nucleico al menos el 65 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntico a SEQ ID NO: 1

En algunas realizaciones, el ácido nucleico funcional se hibrida con el ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, o un complemento del mismo, por ejemplo, en condiciones rigurosas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico funcional se hibrida con una secuencia de ácido nucleico que codifica para SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma, por ejemplo, en condiciones rigurosas.

En la técnica se conocen métodos para producir y usar vectores para la expresiónin vivode los ácidos nucleicos funcionales divulgados, tales como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, miARN, SGE, ribozimas y aptámeros.

i. Moléculas antisentido

Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser moléculas antisentido. Las moléculas antisentido se diseñan para interactuar con una molécula de ácido nucleico diana mediante un apareamiento de bases canónico o no canónico. La interacción de la molécula antisentido y la molécula diana se diseña para promover la destrucción de la molécula diana mediante, por ejemplo, degradación del híbrido ARN-ADN mediada por ARNasa H. Alternativamente, la molécula antisentido se diseña para interrumpir una función de procesamiento que normalmente tendría lugar en la molécula diana, tal como la transcripción o la replicación. Pueden diseñarse moléculas antisentido basándose en la secuencia de la molécula diana. Existen numerosos métodos para optimizar la eficiencia antisentido hallando las regiones más accesibles de la molécula diana. Los métodos a modo de ejemplo incluyen experimentos de selecciónin vitroy estudios de modificación del ADN usando DMS y DEPC. Se prefiere que las moléculas antisentido se unan a la molécula dianaNAMPTcon una constante de disociación (Kd) menor de o igual a 10-6, 10-8, 10-10 o 10-12. ii. Aptámeros

Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser aptámeros. Los aptámeros son moléculas que interactúan con una molécula diana, preferiblemente de manera específica. Normalmente, los aptámeros son pequeños ácidos nucleicos con una longitud de entre 15 y 50 bases que se pliegan para dar estructuras secundarias y terciarias definidas, tales como tallo-bucles o cuartetos G. Los aptámeros pueden unirse a moléculas pequeñas, tales como ATP y teofilina, así como a moléculas grandes, tales como la transcriptasa inversa y la trombina. Los aptámeros pueden unirse muy estrechamente con las Kd de la molécula diana de menos de 10-12 M. Se prefiere que los aptámeros se unan a la molécula diana NAMPT con una Kd de menos de 10-6, 10-8, 10'1° o 10-12 Los aptámeros pueden unirse a la molécula diana con un grado muy alto de especificidad. Por ejemplo, se han aislado aptámeros que tienen una diferencia superior a 10.000 veces en las afinidades de unión entre la molécula diana y otra molécula que difiere en una sola posición de la molécula. Se prefiere que el aptámero tenga una Kd con la molécula diana NAMPT de al menos 10, 100, 1000, 10.000 o 100.000 veces menor que la Kd con una molécula de unión de fondo. Al realizar la comparación para una molécula tal como un polipéptido, se prefiere que la molécula de fondo sea un polipéptido diferente. iii. Ribozimas

Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ácido nucleico que son capaces de catalizar una reacción química, ya sea intramolecular o intermolecularmente. Se prefiere que las ribozimas catalicen reacciones intermoleculares. Se describen diferentes tipos de ribozimas que catalizan reacciones de tipo nucleasa o polimerasa de ácido nucleico que se basan en ribozimas halladas en sistemas naturales, tales como ribozimas de cabeza de martillo. También se divulgan ribozimas que no se hallan en sistemas naturales, pero que se han modificado por ingeniería para catalizar reacciones específicasde novo.Las ribozimas preferidas escinden sustratos de ARN o ADN, y más preferiblemente escinden sustratos de ARN. Las ribozimas normalmente escinden sustratos de ácidos nucleicos mediante el reconocimiento y la unión del sustrato diana con escisión posterior. Este reconocimiento a menudo se basa principalmente en interacciones de pares de bases canónicas o no canónicas. Esta propiedad hace que las ribozimas sean candidatos particularmente buenos para seleccionar como diana la escisión específica de ácidos nucleicos porque el reconocimiento del sustrato diana se basa en la secuencia de los sustratos diana.

iv. Oligonucleótidos que forman tríplex

Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser moléculas de oligonucleótidos que forman tríplex. Las moléculas de ácido nucleico funcionales que forman tríplex son moléculas que pueden interactuar con ácidos nucleicos bicatenarios o monocatenarios. Cuando las moléculas de tríplex interactúan con una región diana, se forma una estructura llamada tríplex en la que hay tres hebras de ADN que forman un complejo que depende del apareamiento de bases de Watson-Crick y Hoogsteen. Se prefieren las moléculas de tríplex porque pueden unirse a regiones diana con alta afinidad y especificidad. Se prefiere que las moléculas que forman tríplex se unan a la molécula diana con una Kd de menos de 10-6, 10-8, 10-10 o 10-12.

v. Secuencias guía externas

Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser secuencias guía externas. Las secuencias guía externas (SGE) son moléculas que se unen a una molécula de ácido nucleico diana formando un complejo, que es reconocido por la ARNasa P, que luego escinde la molécula diana. Las SGE pueden diseñarse para seleccionar como diana específicamente a una molécula de ARN de elección. La ARNasa P ayuda a procesar el ARN de transferencia (ARNt) dentro de una célula. La ARNasa P bacteriana puede reclutarse para escindir prácticamente cualquier secuencia de ARN mediante el uso de un SGE que haga que el complejo<a>RN:SGE diana imite el sustrato natural del ARNt. De manera similar, la escisión de<a>R<n>dirigida por SGE/ARNasa P eucariótica puede utilizarse para escindir dianas deseadas dentro de células eucarióticas. En la técnica se conocen ejemplos representativos de cómo preparar y usar moléculas de SGE para facilitar la escisión de una variedad de moléculas diana diferentes. vi. Interferencia de ARN

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos funcionales inducen el silenciamiento de genes mediante interferencia de ARN (ARNip). La expresión del genNAMPTpuede silenciarse de manera eficaz de una manera muy específica mediante interferencia de ARN.

El silenciamiento genético se observó originalmente con la adición de ARN bicatenario (ARNbc) (Fire,et al.(1998) Nature, 391:806-11; Napoli,et al.(1990) Plant Cell 2:279-89; Hannon, (2002) Nature, 418:244-51). Una vez que el ARNbc entra una célula, se escinde por una enzima similar a la ARNasa III denominada Dicer, en pequeñas interferencias de ARN bicatenarias (ARNip) de 21 a 23 nucleótidos de longitud que contienen 2 proyecciones de nucleótidos en los extremos 3' (Elbashir,et al.,Genes Dev., 15:188-200 (2001); Bernstein,et al.,Nature, 409:363-6 (2001); Hammond,et al.,Nature, 404:293-6 (2000); Nykanen,et al.,Cell, 107:309-21 (2001); Martínez,et al.,Cell, 110:563-74 (2002)). El efecto del iARN o ARNip o su uso no se limita a ningún tipo de mecanismo.

En una realización, un ARNip desencadena la degradación específica de homólogos de moléculas de ARN deNAMPT,tales como ARNm deNAMPT,dentro de la región de identidad de secuencia entre el ARNip y el ARN deNAMPTdiana.

El silenciamiento de genes específicos de secuencia puede lograrse en células de mamíferos usando ARN bicatenarios cortos sintéticos que imitan los ARNip producidos por la enzima Dicer (Elbashir,et al.,Nature, 411:494-498 (2001)) (Ui-Tei,et al.,FEBS Lett, 479:79-82 (2000)).

El ARNip puede sintetizarse químicamente oin vitroo puede ser el resultado de ARN bicatenarios en horquilla corta (ARNhc) que se procesan para dar ARNip dentro de la célula. Por ejemplo, el documento WO 02/44321 divulga ARNip capaces de degradación específica de secuencia de ARNm diana cuando se aparean sus bases con extremos con proyecciones en 3’. Los ARNip sintéticos generalmente se diseñan usando algoritmos y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Los proveedores incluyen Ambion (Austin, Texas), ChemGenes (Ashland, Massachusetts), Dharmacon (Lafayette, Colorado), Glen Research (Sterling, Virginia), MWB Biotech (Esbersberg, Alemania), Proligo (Boulder, Colorado) y Qiagen (Vento, Los Países Bajos). El ARNip también puede sintetizarsein vitrousando kits tales como el kit de construcción de ARNip SILENCER® de Ambion. En algunas realizaciones, la composición incluye un vector que expresa el ácido nucleico funcional. La producción de ARNip a partir de un vector se realiza más comúnmente mediante la transcripción de una ARNasa en horquilla corta (ARNhc). Están disponibles kits para la producción de vectores que incluyen ARNhc, tal como, por ejemplo, los kits de construcción GENESUPPRESSOR™ de Imgenex y los vectores de lentivirus y plásmidos de iARN inducibles BLOCK-IT™ de Invitrogen. En algunas realizaciones, el ácido nucleico funcional es ARNip, ARNhc o miARN.

3. Inhibidores de molécula pequeña de NAMPT

Se describen pequeñas moléculas que inhiben específicamente la transcripción, traducción o función del gen de NAMPT y/o del producto génico. Los inhibidores de molécula pequeña de NAMPT son moléculas no proteicas ni de ácido nucleico que tienen una función específica, tal como unirse a una molécula diana o reducir, prevenir o moderar de otro modo una reacción o interacción específica. Tal como se analiza con más detalle a continuación, el término “moléculas pequeñas” generalmente incluye una molécula de menos de 10.000 Da de peso molecular. Las moléculas pequeñas que interactúan específicamente con NAMPT pueden actuar como efectores, inhibidores, moduladores y estimuladores de una actividad específica que posee una molécula diana, o las moléculas pequeñas pueden poseer una actividad independientede novode cualquier otra molécula. Los inhibidores de molécula pequeña de NAMPT preferidos tienen excelentes propiedades inhibidoras de enzimas dependientes de la dosis. Los inhibidores de molécula pequeña de NAMPT a modo de ejemplo incluyen los inhibidores enzimáticos de NAMPT FK-866 y los análogos de<f>K-866 MS-1-82, Rari049 y Alpii135 (véanse las figuras 11A-11B).

a. FK-866

FÓRMULA I: FK-866

FK-866 ((E)-N-[4-(1-benzoilpiperidin-4-il)butil]-3-piridin-3-ilprop-2-enamida) es un inhibidor de NAMPT potente, selectivo y no competitivo que inhibe la actividad enzimática de NAMPT. FK-866 (fórmula C24H29N3O2; número CAS 658084-64-1) está disponible de múltiples fuentes comerciales (por ejemplo, n.° de catálogo de Abcam ab142148).

b. Análogos de FK-866

Para generar análogos funcionales del inhibidor de NAMPT FK-866, la estructura de FK-866 se dividió en tres regiones y se varió reemplazándola con N-heterociclos para generar análogos de FK866. Los estudios preliminares en MCT-PH muestran que Rari049 es prometedor como terapia preventiva que reduce tanto la tensión arterial sistólica del ventrículo derecho (RVSP) como el cociente de hipertrofia del VD y el VI más el peso del pilar septal (RVH-RV).

FÓRMULA II: MS-1-82

FÓRMULA III: RARI-049

FÓRMULA IV: ALP-135

C. Excipientes, vehículos y dispositivos de administración

Los inhibidores de NAMPT pueden administrarse con o sin la ayuda de un vehículo de administración. Los vehículos de administración adecuados para los inhibidores se conocen en la técnica y pueden seleccionarse para adaptarse al inhibidor particular. En una realización preferida, el inhibidor se administra mediante inyección intravenosa o por vía oral. Los vehículos típicos son solución salina, solución salina tamponada con fosfato y otros vehículos inyectables.

Los inhibidores de NAMPT pueden formularse en composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.

La formulación también puede estar en forma de suspensión o emulsión y, opcionalmente, incluir diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen como diluyentes agua estéril, solución salina tamponada con diversos contenidos de tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica y opcionalmente aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween®20, Tween®80 también denominados polisorbato 20 u 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) y conservantes (por ejemplo, timersol, alcohol bencílico). Ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Las formulaciones pueden liofilizarse y redisolverse/resuspenderse inmediatamente antes de su uso. La formulación puede esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, incorporando agentes esterilizantes en las composiciones, irradiando las composiciones o calentando las composiciones.

Los anticuerpos, proteínas que tienen las propiedades de unión de los anticuerpos, ácidos nucleicos o moléculas pequeñas se administran a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar enfermedades y trastornos en los que la actividad de NAMPT es perjudicial para el sujeto. Los anticuerpos se administran con o sin uno o más agentes terapéuticos adicionales. También se describen kits que contienen una composición farmacéutica e instrucciones para la administración de dosis, y jeringas precargadas que contienen composiciones farmacéuticas.

III. Métodos de uso

Los métodos para usar los inhibidores de NAMPT incluyen administrar sistémicamente a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que incluye uno o más inhibidores de NAMPT para prevenir, reducir o inhibir la expresión o función de NAm Pt en el sujeto.

Se proporcionan métodos para las pautas posológicas repetidas para usar anticuerpos específicos de NAMPT para tratar la FP. Se describen pautas posológicas diarias, semanales, quincenales y mensuales. En una realización preferida, los anticuerpos, F(Ab)s o F(Ab)2' se administran mediante infusión y la administración de dosis se repite mensualmente. La administración de dosis mensual tiene muchas ventajas sobre la administración de dosis semanal incluyendo, pero sin limitarse a, un menor número de inyecciones totales y un menor número de reacciones en el sitio de la inyección (por ejemplo, dolor local e hinchazón), mayor cumplimiento terapéutico del paciente (es decir, debido a las inyecciones menos frecuentes) y menos coste para el paciente, así como para el profesional sanitario. Los métodos incluyen la utilización de una terapia de combinación en la que se administran anticuerpos humanos a un sujeto con otro agente terapéutico, tal como uno o más anticuerpos adicionales que se unen a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se unen a NAMPT), una o más citocinas y/o uno o más agentes químicos que inhiben la producción o actividad de NAMPT (tal como inhibidores de molécula pequeña de NAMPT) u otro fármaco vasoactivo.

A. Métodos de tratamiento para la fibrosis pulmonar

La inhibición de NAMPT tiene efectos terapéuticos en la fibrosis pulmonar al reducir la inflamación pulmonar, reducir la transición de miofibroblastos y prevenir la deposición excesiva de fibrina. En algunas realizaciones, los métodos para tratar trastornos en los que la actividad de NAMPT es perjudicial incluyen la administración parenteral de anticuerpos humanos, preferiblemente anticuerpos monoclonales humanos recombinantes, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a la NAMPT humana.

En realizaciones preferidas, uno o más inhibidores de NAMPT son eficaces para reducir, inhibir o retrasar uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno o afección asociada con el engrosamiento y rigidez de los vasos sanguíneos en un paciente humano.

Los métodos de uso de inhibidores de NAMPT incluyen, pero no se limitan a, métodos diseñados para inhibir o bloquear la transcripción, traducción o función de la enzima NAMPT que pueden usarse para modular funciones celulares y prevenir, reducir o revertir la acumulación indeseable de miofibroblastos. La inhibición de NAMPT puede usarse como mecanismo diagnóstico, profiláctico o terapéutico, por ejemplo, mediante administración sistémica de uno o más inhibidores de NAMPT. A continuación se analizan con más detalle los métodos de tratamiento y prevención de enfermedades y trastornos que usan los inhibidores de NAMPT divulgados que incluyen opcionalmente un vehículo de administración.

1. Fibrosis pulmonar (FP)

Se proporcionan inhibidores de NAMPT para el tratamiento de la FP. La fibrosis progresiva es un rasgo característico del envejecimiento en diversos aparatos y sistemas, incluyendo el hígado, los riñones, el páncreas y los pulmones. La FPI, la enfermedad pulmonar fibrótica más mortal y progresiva, afecta desproporcionadamente a la población anciana y ahora se considera ampliamente como una enfermedad del envejecimiento. La incidencia y prevalencia de la FPI aumentan con la edad; dos tercios de los pacientes con FPI tienen más de 60 años en el momento de la presentación, con una edad media de 66 años en el momento del diagnóstico. Además, la tasa de supervivencia de los pacientes con FPI disminuye notablemente con la edad.

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es un subgrupo específico de fibrosis pulmonar. La FPI es una enfermedad pulmonar que provoca cicatrización (fibrosis) en los pulmones por un motivo desconocido. A lo largo del tiempo, la cicatrización empeora y resulta difícil respirar profundamente y los pulmones no pueden absorber suficiente oxígeno. La FPI es una forma de enfermedad pulmonar intersticial, que afecta principalmente al intersticio (el tejido y el espacio alrededor de los alvéolos de los pulmones) y no afecta directamente las vías respiratorias ni los vasos sanguíneos. La causa de la fibrosis pulmonar idiopática no se comprende completamente.

Estudios recientes de casos hereditarios y esporádicos de FPI se han asociado con el acortamiento de los telómeros, lo que respalda adicionalmente el concepto de que la FPI puede representar un proceso de enfermedad degenerativa asociado a la edad. Actualmente se desconocen el/los motivo(s) de los telómeros acortados en pacientes con FPI sin mutaciones en la telomerasa; sin embargo, el estrés oxidativo representa un mecanismo potencial. El envejecimiento y la enfermedad fibrótica están asociados con una carga oxidativa acumulativa, y el tejido pulmonar de pacientes con FPI demuestra “firmas” de daño oxidativo crónico. Los pulmones son particularmente propensos a sufrir traumatismos y lesiones por radicales libres de oxígeno dada su exposición directa al entorno y al aire inspirado. Se ha sugerido que las rutas centrales que median en la fibrosis en múltiples aparatos y sistemas pueden servir como mejores dianas para el desarrollo de fármacos antifibróticos.

Los factores de riesgo comunes para la FPI incluyen antecedentes genéticos; teniendo hasta el 20 % de las personas con FPI otro miembro de la familia con una enfermedad pulmonar intersticial. Cuando más de un miembro adicional de la familia tiene FPI, la enfermedad se denomina “fibrosis pulmonar hereditaria”.

El tabaquismo es otro factor: aproximadamente el 75 % de las personas con FPI son fumadores actuales o anteriores de cigarrillos. El reflujo de ácido (enfermedad por reflujo gastroesofágico [ERGE]) también es otro factor, teniendo aproximadamente el 75 % de las personas con FPI síntomas de reflujo de ácido (ardor de estómago). El sexo masculino es otro factor de riesgo, siendo aproximadamente el 75 % de los pacientes con FPI hombres. La edad también es importante, ya que casi todos los pacientes con FPI tienen más de 50 años.

Una limitación importante en este campo es la falta de modelos animales fiables que predigan la eficacia de los agentes terapéuticos en ensayos clínicos posteriores. Un modelo habitualmente usado es la lesión pulmonar inducida por bleomicina. Sin embargo, a pesar de la eficacia preclínica de un gran número de agentes terapéuticos que usan este modelo animal, la traducción clínica ha sido deficiente; por tanto, se ha cuestionado el uso de este modelo animal para la evaluación preclínica de fármacos candidatos. Una limitación significativa de este modelo es la naturaleza resolutiva de la fibrosis, ya que la lesión pulmonar inducida por bleomicina da como resultado una respuesta fibrótica limitada que se resuelve entre 4 y 6 semanas después de la lesión.

Las composiciones y dispositivos descritos pueden administrarse a un sujeto para reducir o inhibir la proliferación, migración y una combinación de las mismas de células del músculo liso en una cantidad eficaz para reducir la acumulación de miofibroblastos y tratar o prevenir de ese modo la FP y otros trastornos vasculares en el sujeto. En algunas realizaciones, la permeabilidad de los vasos que se han engrosado y endurecido por la acumulación de miofibroblastos puede aumentarse usando una composición que contiene un inhibidor de NAMPT. Por tanto, se proporcionan métodos para administrar una composición que contiene un inhibidor de NAMPT al sujeto antes o después de una lesión, cirugía o traumatismo vascular para prevenir, reducir o revertir cambios vasculares debidos a la acumulación de miofibroblastos en un sujeto que lo necesita.

i. Síntomas de la FPI

Los signos clínicos de FPI que indican la necesidad de tratamiento incluyen uno o más de disnea (es decir, dificultad para respirar, respiración dificultosa), habitualmente durante el ejercicio, tos crónica, dolor u opresión torácica, pérdida de peso inexplicable, pérdida de apetito, fatiga y dedos en palillo de tambor (es decir, cambio de forma de los dedos).

Aproximadamente el 85 % de las personas con FPI tienen tos crónica que dura más de 8 semanas. Suele ser una tos seca, pero algunas personas también pueden toser esputo o flema. La dificultad para respirar puede afectar las actividades cotidianas tales como ducharse, subir escaleras, vestirse y comer. A medida que la cicatrización en los pulmones empeora, la dificultad para respirar puede impedir todas las actividades.

Los métodos para identificar a un sujeto que tiene FPI son conocidos en la técnica. Las técnicas de diagnóstico clínico a modo de ejemplo incluyen prueba de función pulmonar (PFT; o prueba de respiración) para medir cuánto aire puede inhalarse/exhalarse dentro y fuera de los pulmones y la capacidad de los pulmones para absorber oxígeno; prueba de caminata de seis minutos para determinar la aptitud física, así como la cantidad de oxígeno en sangre en reposo y con actividad física; radiografía de tórax: radiografía de tórax para detectar enfermedad pulmonar intersticial y monitorizar la progresión; análisis de sangre para identificar serológicamente otras causas de enfermedad pulmonar intersticial; tomografía computarizada (TAC) para determinar el alcance de la cicatrización en los pulmones; broncoscopia para identificar la presencia de infección o sugerir otros subtipos de enfermedad pulmonar intersticial; y biopsia pulmonar quirúrgica.

Los signos de mejora en la FP, por ejemplo, en respuesta al tratamiento con uno o más inhibidores de NAMPT, incluyen una mejora en uno cualquiera o más de los síntomas anteriores.

Los criterios que constituyen un fracaso del tratamiento en la FP incluyen cualquier empeoramiento o ningún cambio de los síntomas anteriores, efectos secundarios como problemas de toxicidad/tolerabilidad/interacciones fármacofármaco con fármacos que el paciente ya está tomando, infecciones debido a problemas de administración, empeoramiento o ningún cambio en un factor observable tal como una distancia de caminata de 6 minutos y empeoramiento o ningún cambio en los resultados de las pruebas cardiopulmonares (por ejemplo, empeoramiento del consumo de oxígeno).

B Controles

El efecto de un inhibidor de NAMPT puede compararse con el de un control. Los controles adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, células no tratadas o un sujeto humano no tratado. En algunas realizaciones, el control es tejido no tratado del sujeto que se trata, o de un sujeto no tratado. Preferiblemente, las células o el tejido del control derivan del mismo tejido que las células o el tejido tratados. En algunas realizaciones, un sujeto de control no tratado padece la misma enfermedad o afección que el sujeto tratado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, uno o más de los marcadores o las rutas farmacológicos o fisiológicos afectados por el tratamiento anti-NAMPT se compara con el mismo marcador o ruta farmacológicos o fisiológicos en células de control no tratadas o sujetos de control no tratados. Por ejemplo, los sujetos tratados con anticuerpo anti-NAMPT pueden compararse con sujetos tratados con otros inhibidores de FP, tales como pirfenidona, nintedanib, corticosteroide, N-acetilcisteína, azatioprina, ciclofosfamida u oxígeno.

Los sujetos tratados con otros inhibidores de FP pueden tener una mayor incidencia de FP posoperatoria o una reducción reducida del tejido afectado por la fibrosis que los sujetos tratados con los inhibidores de NAMPT.

C. Dosificaciones y cantidades eficaces para tratar la FP

En algunos enfoquesin vivo,las composiciones de inhibidores de NAMPT se administran a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz para el tratamiento de uno o más de los signos o síntomas de FP.

El término “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” significa una dosificación suficiente para tratar, inhibir o aliviar uno o más síntomas del trastorno que se está tratando o para proporcionar de otro modo un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. La dosificación precisa variará según una variedad de factores, tales como las variables que dependen del sujeto (por ejemplo, edad, salud del sistema inmunitario, etc.), la enfermedad o trastorno y el tratamiento que se realiza.

Para todos los compuestos divulgados, a medida que se realicen estudios adicionales, surgirá información sobre los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas afecciones en diversos pacientes, y el trabajador experto en la técnica, considerando el contexto terapéutico, la edad y la salud general del receptor, podrá determinar la administración de dosis adecuada. La dosificación seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la duración del tratamiento deseado. Generalmente se administran a humanos niveles de dosificación de entre 0,1 y 15 mg/kg de peso corporal por administración. Generalmente, para inyección o infusión intravenosa, la dosificación puede ser de entre 30 y 400 mg. Preferiblemente, las composiciones se formulan para lograr un nivel en suero del inhibidor de NAMPT de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 1.000 |<i>M.

Las composiciones farmacéuticas de inhibidores de NAMPT son útiles para la modulación de procesos celulares que contribuyen a la aparición y progresión de la FP, incluyendo la acumulación de miofibroblastos. Procesos celulares a modo de ejemplo asociados con la deposición de acumulación de miofibroblastos, resistencia a la apoptosis, deposición mejorada de matriz extracelular (MEC), incluyendo la deposición de colágeno y fibronectina. En algunas realizaciones, las composiciones reducen o previenen la expresión y/o función de la proteína NAMPT y/o su interacción con ligandos, tales como el receptor tipo Toll-4 (TLR4). Por tanto, las composiciones y métodos para el tratamiento y la prevención de FP incluyen composiciones y métodos que previenen, reducen o alteran de otro modo la interacción fisiológica entre TLR4 y NAMPT (NAMPT/TLR4). Normalmente, los inhibidores de NAMPT/TLR4 se administran en una cantidad eficaz para reducir o prevenir uno o más de los procesos celulares aguas abajo asociados con la interacción fisiológica de NAMPT/TLR4. Por tanto, también se proporcionan métodos para reducir o prevenir la activación mediada por NAMPT/TLR4 de las actividades transcripcionales de NP<k>B para tratar la FP en un sujeto. En realizaciones preferidas, la cantidad de uno o más inhibidores de NAMPT no previene ni reduce la formación de neotejido vascular sano y normal en el sujeto. Normalmente, las composiciones incluyen uno o más inhibidores de NAMPT de molécula pequeña, en una cantidad de entre 0,1 y 15 mg/kg de peso corporal de un humano.

1. Efectos específicos de diana

En algunas realizaciones, los inhibidores de NAMPT son eficaces para prevenir las actividades biológicas de las células del músculo liso, tales como la proliferación y la activación. En algunas realizaciones, uno o más inhibidores pueden estar en una cantidad eficaz para aumentar o estimular el proceso de apoptosis en una célula.

En una realización, el uno o más inhibidores de NAMPT están en una cantidad eficaz para prevenir o reducir la deposición de fibrina en un sujeto. En una realización preferida, la cantidad de uno o más inhibidores de NAMPT no previene la cicatrización de heridas o la formación de neotejido vascular sano y normal en un sujeto en comparación con un control no tratado. En otra realización, el uno o más inhibidores de NAMPT están en una cantidad eficaz para disminuir la cantidad de acumulación de miofibroblastos, la producción aberrante/excesiva de ECM y el daño tisular. Normalmente, se administran uno o más inhibidores de NAMPT a un sujeto en una cantidad eficaz para disminuir la cantidad de NAMPT extracelular soluble en el sujeto. Por consiguiente, uno o más inhibidores de NAMPT pueden ser eficaces para reducir o prevenir una o más actividades biológicas que se producen como resultado de NAMPT extracelular, o como resultado de eventos de señalización aguas abajo controlados por NAMPT extracelular. Por ejemplo, al reducir o prevenir la interacción entre NAMPT extracelular y TLR4, los inhibidores de NAMPT pueden reducir o prevenir la inducción mediada por TLR4 de varias rutas de señalización que controlan las actividades celulares, incluyendo la proliferación, activación, quimiotaxis y reorganización de actina celular. Preferiblemente, la cantidad de uno o más inhibidores de NAMPT no impide la remodelación del tejido sano deseable que se produce como un componente de la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos sanos.

Los inhibidores de NAMPT pueden administrarse en una cantidad eficaz para reducir, prevenir o modificar de otro modo la cantidad, expresión o funciones del gen de NAMPT o de la proteína NAMPT. Por tanto, en algunas realizaciones, los inhibidores pueden administrarse en una cantidad eficaz para reducir uno o más de los factores de transcripción que regulan la transcripción de NAMPT, tales como HIF-1<a>, HIF-2<a>, STATS y prolina hidroxilasa-2 (PHD2).

En el caso de la FP crónica, el proceso de acumulación de miofibroblastos dentro de los pulmones es innecesario y no deseado, por tano, mejorar la apoptosis de los miofibroblastos y/o la producción y deposición excesivas de ECM no es perjudicial. Por tanto, los inhibidores de NAMPT pueden administrarse en una cantidad eficaz para reducir uno o más de los eventos moleculares que dan lugar a la acumulación de miofibroblastos en un sujeto. Por ejemplo, los inhibidores pueden ser eficaces para reducir la resistencia de los miofibroblastos a la apoptosis, reducir la producción de ECM, reducir la fibronectina, reducir el colágeno y combinaciones de los mismos.

Los inhibidores de NAMPT pueden administrarse en una cantidad eficaz para mejorar la distensibilidad pulmonar en un sujeto con FP. El efecto deseado puede lograrse durante un periodo de tiempo consistente con el estadio y la gravedad de la enfermedad. Por ejemplo, cualquiera de uno o más de los efectos pueden observarse en un sujeto tras la administración después de un periodo de una hora, un día, una semana, un mes o más de un mes.

2. Cantidades terapéuticas

El intervalo para una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de NAMPT puede variar según uno o más del tipo de inhibidor, el mecanismo de acción, la vía de administración, el tipo y gravedad de la afección que va a aliviarse y los parámetros fisiológicos relacionados con el receptor, tal como edad, peso, etc.

Un intervalo a modo de ejemplo, no limitativo, para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo es de entre aproximadamente 10 mg y 200 mg, inclusive, más preferiblemente entre aproximadamente 20 mg y 100 mg y lo más preferiblemente aproximadamente 40 mg. Cabe señalar que los valores de dosificación pueden variar según el tipo y la gravedad de la afección que va a aliviarse. En algunas realizaciones, uno o más inhibidores de NAMPT de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se administran a través de infusión intravenosa a un sujeto humano diagnosticado con FP, en una cantidad de entre 0,1 y 1,5 mg/kg de peso corporal, inclusive, para tratar uno o más de los signos o síntomas de la FP crónica. En algunas realizaciones, uno o más inhibidores de NAMPT de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se administran mediante administración endotraqueal en una cantidad de entre 10 mg y 400 mg de peso corporal, inclusive, para tratar uno o más de los signos o síntomas de la FP crónica.

En algunas realizaciones, se administran uno o más inhibidores de molécula pequeña de NAMPT a un sujeto humano diagnosticado con FP a través de infusión oral o intravenosa en una cantidad de entre 0,1 y 3 mg/kg de peso corporal, inclusive, por ejemplo, 10 mg/kg, 100 mg/kg o 1 mg/kg de peso corporal. El uno o más inhibidores de molécula pequeña de NAMPT pueden administrarse solos o contenidos dentro de liposomas.

En algunas realizaciones, uno o más inhibidores permeables a las células del transductor y activador de señales de la transcripción (STAT5), tales como nicotinoil hidracina, SPI o pimozida, se administran a un sujeto humano diagnosticado con FP a través de infusión intravenosa en una cantidad de entre 1 |ig/kg y 20 mg/kg del receptor, lo más preferiblemente entre 10 |ig/kg y 3,5 mg/kg del receptor, inclusive. El uno o más inhibidores de STATS pueden administrarse solos o contenidos dentro de liposomas.

3. Programación de administración y pautas posológicas

Al sujeto se le pueden administrar una o más dosis de la composición hasta que se observe eficacia. Para las moléculas pequeñas, normalmente se administran entre un día, dos veces por semana o semanalmente. Para la infusión intravenosa, normalmente se administran semanal, mensual o trimestralmente. La programación del comienzo de la terapia anti-NAMPT debe determinarse basándose en las necesidades del sujeto. En algunas realizaciones, la terapia que usa inhibidores de NAMPT puede suspenderse una vez que hayan disminuido los signos fisiológicos de acumulación de miofibroblastos o los síntomas de FP.

En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente en cuidados intensivos. En el ámbito de los cuidados intensivos, las composiciones que incluyen uno o más inhibidores de NAMPT pueden administrarse a lo largo de una hora, por ejemplo, como terapia de rescate o terapia de recuperación. La administración puede repetirse cada hora, día, semana o mes, según sea necesario. En una realización particular, los inhibidores de NAMPT se administran a través de instilación endotraqueal, por ejemplo, usando un tubo endotraqueal. En otras realizaciones, los inhibidores se administran al paciente a través de infusión intravenosa a lo largo de una hora.

La FP puede asociarse con una enfermedad autoinmunitaria subyacente tal como la esclerodermia y el lupus sistémico, la sarcoidosis, la toxicidad de fármacos tal como la amiodarona o la nitrofurantαna o la exposición al amianto, o asociada con una lesión pulmonar inducida por la radiación. En caso de lesión que afecte a los pulmones, los inhibidores de NAMPT pueden administrarse inmediatamente, así como posteriormente durante la cicatrización y regeneración de la superficie del tejido pulmonar.

D. Terapias de combinación

Las composiciones que incluyen inhibidores de NAMPT pueden administrarse solas o en combinación con uno o más agentes activos adicionales, como parte de un régimen de tratamiento terapéutico o profiláctico.

El término “combinación” o “combinada” se usa para referirse a la administración concomitante, simultánea o secuencial de dos o más agentes. Por tanto, las combinaciones pueden administrarse de manera concomitante (por ejemplo, como mezcla), por separado, pero simultáneamente (por ejemplo, a través de líneas intravenosas separadas en el mismo sujeto), o secuencialmente (por ejemplo, uno de los compuestos o agentes se da primero seguido del segundo). Por ejemplo, pueden administrarse uno o más inhibidores de NAMPT el mismo día o un día diferente que el segundo agente activo. En algunas realizaciones, el segundo agente activo puede administrarse el primer, segundo, tercer o cuarto día, después o antes de uno o más inhibidores de NAMPT.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es pirfenidona. La pirfenidona (ESBRIET®, PIRESPA®, ETUARY®) es un medicamento anticicatrización (antifibrótico) que retarda la progresión de la FPI. Algunos pacientes que toman pirfenidona tienen efectos secundarios, más comúnmente malestar estomacal y erupción cutánea, particularmente con la exposición al sol. La pirfenidona ha sido aprobada por Health Canada para el tratamiento de la FPI de leve a moderada.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es nintedanib (VARGATEF®, OFEV®). Nintedanib es un medicamento anticicatrización (antifibrótico) que retarda la progresión de la FPI. Algunos pacientes que toman nintedanib tienen efectos secundarios, entre los que suele incluirse diarrea.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un corticosteroide, tal como pastillas de corticosteroides (por ejemplo, pastillas orales de prednisona, ORASONE®, ADASONE®) puede reducir la inflamación en los pulmones al suprimir el sistema inmunitario. Los corticosteroides sólo se usan en pacientes con FPI que tienen una exacerbación aguda de su fibrosis pulmonar y pueden ser dañinos en pacientes con FPI que tienen cicatrización estable o que empeoran lentamente.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es N-acetilcisteína (NAC; oral o en aerosol; MUCOMYST®). La NAC es un antioxidante que se ha usado con frecuencia en pacientes con FPI. Un gran ensayo clínico publicado en mayo de 2014 demostró que la NAC no frena la progresión de la FPI.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es azatioprina, ciclofosfamida, y otros.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es oxígeno. Algunas personas que padecen hipertensión pulmonar eventualmente requieren oxigenoterapia continua.

Clases adicionales de fármacos que pueden combinarse con uno o más inhibidores de NAMPT incluyen agentes antineαntimos, agentes quimioterápicos, antibióticos, antivirales, antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, agentes inmunoterapéuticos convencionales, inmunodepresores, citocinas, quimiocinas y/o o factores de crecimiento, agentes antiproliferativos o antimigratorios diseñados para tratar o prevenir la FP, agentes que afectan la migración y la producción de matriz extracelular, agentes que afectan la deposición de plaquetas o la formación de trombos y agentes que promueven la cicatrización y reendotelización vascular.

Los agentes antiproliferativos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel (Taxol), vincristina QP-2, metotrexato, angiopeptina, mitomicina, BCP 678, c-myc antisentido, ABT 578, actinomicina-D, RestenASE, 1-clorodesoxiadenosina, PCNA ribozima y celecoxib.

Los agentes a modo de ejemplo que modulan la replicación/proliferación celular incluyen dianas de inhibidores de rapamicina (TOR) (incluyendo sirolimus, everolimus y ABT-578), paclitaxel y agentes antineoplásicos, incluyendo agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, mecloretamina, clorambucilo, melfalán, carmustina, lomustina, ifosfamida, procarbazina, dacarbazina, temozolomida, altretamina, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino), antibióticos antitumorales (por ejemplo, bleomicina, actinomicina D, mitramicina, mitomicina C, etopósido, tenipósido, amsacrina, topotecán, irinotecán, doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona y mitoxantrona), antimetabolitos (por ejemplo, desoxicoformicina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2-clorodesoxiadenosina, hidroxiurea, metotrexato, 5-fluorouracilo, capecitabina, arabinósido de citosina, azacitidina, gemcitabina, fosfato de fludarabina y aspariginasa), agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, docetaxel, estramustina) y agentes molecularmente dirigidos (por ejemplo, imatinib, tretinαna, bexaroteno, bevacizumab, gemtuzumab ogomicina y denileucina diftitox).

Los agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse local o sistémicamente al sujeto, o recubrirse o incorporarse sobre o dentro de un dispositivo o injerto. Los reactivos terapéuticos adicionales pueden administrarse por la misma vía o por diferentes vías y por diferentes medios. Por ejemplo, uno o más inhibidores de NAMPT pueden administrarse a través de infusión con uno o más de paclitaxel, Taxotere y otros compuestos taxoides, metotrexato, antraciclinas tales como doxorrubicina, everolimus, serolimus, rapamicina o derivados de rapamicina administrados por diferentes medios.

E. Métodos para diagnóstico y tratamiento profiláctico

Dada su capacidad para unirse a NAMPT, los inhibidores de NAMPT son útiles para detectar NAMPT (por ejemplo, en una muestra biológica, tal como sangre, suero o plasma), usando un inmunoensayo convencional, tal como un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica tisular. Los métodos incluyen poner en contacto una muestra biológica con uno o más inhibidores de NAMPT y detectar el inhibidor unido a NAMPT o el inhibidor no unido, para detectar y/o cuantificar el NAMPT en la muestra biológica. Por ejemplo, el anticuerpo anti-NAMPT se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Como alternativa al marcaje del inhibidor, la NAMPT puede analizarse en líquidos biológicos mediante un inmunoensayo de competencia, por ejemplo, usando patrones de NAMPT marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-NAMPT no marcado. En este ensayo, se combinan la muestra biológica, los patrones de NAMPT marcados y el anticuerpo anti-NAMPT y se determina la cantidad de patrón de NAMPT marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de NAMPT en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de NAMPT marcado unido al anticuerpo anti-NAMPT.

Por tanto, los métodos incluyen la etapa de identificar un sujeto que necesita tratamiento anti-NAMPT, por ejemplo, un sujeto en riesgo de sufrir una enfermedad o trastorno asociado con la actividad perjudicial de NAMPT. Un sujeto a modo de ejemplo es un humano en riesgo de FP. Los métodos pueden incluir la etapa de analizar un líquido biológico del sujeto para determinar la presencia y/o cantidad de NAMPT presente en la muestra, en comparación con un patrón normalizado o una muestra de control. Una muestra de control a modo de ejemplo incluye una muestra de líquido biológico equivalente tomado de un individuo sano.

Ejemplos

Ejemplo 1: Miofibroblastos pulmonares con FPI demuestran senescencia y resistencia a la apoptosis.

Materiales y métodos

Reactivos: TGF-<P>1 derivado de plaquetas porcinas de R&D Systems (Minneapolis, MN). Estaurosporina de LC Laboratories (Woburn, MA). Anticuerpos contra: actina (clon AC-15) y<a>-tubulina (clon B-5-1-2) de Sigma (St. Louis, MO); a-SMA (clon ASM-1) de American Research Products (Belmont, MA); caspasa 3 escindida, PARP escindida y Bcl-2 de Cell Signaling (Boston, MA); Nox4 y Ki67 de Novus Biologicals (Littleton, CO); y p21, Col1A1 y lamin A/C de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). Los anticuerpos contra p16INK4a eran de Santa Cruz Biotechnology y BD Biosciences (San José, CA). Los anticuerpos contra GAPDH eran de Abcam y Cell Signaling. Todos los otros reactivos se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO), a menos que se especifique lo contrario.

Histología pulmonar y tinción inmunohistoquímica: se procesaron secciones de tejido incorporadas en parafina para histología pulmonar y tinción inmunohistoquímica.

Marcaje de inmunofluorescencia: Las secciones de tejido se permeabilizaron con Triton-X100 al 1 % en PBS, se bloquearon con BSA al 1 % en PBS y se incubaron con anticuerpos primarios en PBS a temperatura ambiente durante 1 h. Luego se lavaron las secciones de tejido con PBS seguido de una incubación con anticuerpos secundarios conjugados en PBS durante 1 h. Luego se lavaron las secciones con PBS y se usaron medios de preparación de tinción nuclear que contenían DAPI. Los portaobjetos se visualizaron con un microscopio de fluorescencia y se obtuvieron imágenes.

Tinción TUNEL: se revelaron células apoptóticas en cortes de tejido usando el kit de detección de muerte celularin situ(Roche, Mannheim, Alemania) según las instrucciones del kit. En primer lugar, se incubaron los cortes con anticuerpo anti-<a>SMA durante la noche a 4 °C. Después del protocolo TUNEL, se montaron los portaobjetos en medios que contenían DAPI (Vector Labs) y se visualizaron las células en un microscopio de fluorescencia Zeiss. Se contaron por campo las células positivas para TUNEL en 15-20 campos y se normalizaron al total de células de la tinción con DAPI.

Tejido pulmonar y fibroblastos humanos. Se aislaron de los pulmones de pacientes con un diagnóstico confirmado de FPI tal como se describió anteriormente (18), según un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Se aislaron los fibroblastos y se evaluaron para determinar la apoptosis, la senescencia y los niveles de ROS mediante ensayos de inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y/o bioquímicos.

Ensayos de senescencia. Se usó un sustrato de alta sensibilidad (fluoresceína d i-<p>-D-galactosidasa) para la evaluación cuantitativa de la senescencia celular (MarkerGene Technologies), según las instrucciones del fabricante. El número de células se normalizó mediante DAPI (kit de normalización del recuento de células fluorescentes; MarkerGene Technologies). También se usó un kit de detección de senescencia diseñado para detectar histoquímicamente la actividad de SA-<p>-GAL en células cultivadas (Abcam).

Resultados

Los miofibroblastos con FPI humanos demuestran senescencia y resistencia a la apoptosis. El marcador de senescencia, p16, se expresó en los focos de fibroblastos (FF), un rasgo característico patológico clave del pulmón con FPI. Las células que expresan Ki67, un marcador de proliferación celular, estuvieron en gran medida ausentes dentro del FF y se detectaron principalmente en las células de la periferia de los focos. Se detectan altos niveles de apoptosis en las células epiteliales que recubren los espacios alveolares, con poca evidencia de apoptosis en miofibroblastos subepiteliales positivos para aSMA dentro de estos focos, manifestada por TUNEL e inmunofluorescencia, lo que indica la presencia de un fenotipo predominantemente no proliferativo, senescente y antiapoptótico dentro de los FF de pulmones humanos con FPI.

Ejemplo 2: Los ratones ancianos mostraron una alteración de la resolución de la fibrosis y la acumulación de miofibroblastos senescentes.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos se describieron anteriormente.

Detección de H<2>O<2>. Se analizó la liberación de H<2>O<2>extracelular a partir de células cultivadas. Se normalizó el número de células mediante DAPI (kit de normalización del recuento de células fluorescentes; MarkerGene Technologies).

Resultados

La figura 1 muestra que los ratones ancianos demuestran una falta de resolución de la lesión pulmonar inducida por bleomicina en comparación con las crías de ratones. Los ratones ancianos mostraron persistencia de miofibroblastos en las regiones fibróticas del pulmón 2 meses después de la lesión, según lo determinado mediante tinción inmunohistoquímica (IHC) para aSMA, en comparación con crías de ratones con fibrosis que se resuelve. La figura 2 muestra que los fibroblastos aislados de crías de ratones y ratones ancianos demuestran una inducción de p16 en respuesta a una lesión que es transitoria en crías de ratones, mientras que se mantiene en ratones ancianos con fibrosis persistente. Los fibroblastos aislados de pulmones lesionados de ratones ancianos demuestran niveles más altos de actividad de p-galactosidasa (Pgal) asociada a la senescencia, un marcador de senescencia, en comparación con cohortes jóvenes mediante tinción celular para μgal. Estos resultados demuestran que la fibrosis que no se resuelve en ratones ancianos está asociada con la persistencia de miofibroblastos senescentes.

La figura 3 muestra la generación de ROS en fibroblastos de crías de ratones y ratones ancianos en los puntos de tiempo correspondientes (control, 3 semanas, 2 meses) evaluados.

Ejemplo 3: Los miofibroblastos senescentes acumulados de ratones ancianos muestran resistencia a la apoptosis. Materiales y métodos

Los materiales y métodos se describieron anteriormente.

Resultados

De acuerdo con los datos de FPI humana, las figuras 4A y 4B muestran que las secciones de tejido pulmonar de ratones ancianos después de una lesión pulmonar muestran niveles más bajos de apoptosis (células TUNEL ) en regiones fibróticas en comparación con crías de ratones. Las células de fibroblastos aisladas de ratones ancianos demuestran resistencia a la apoptosis con menos células apoptóticas con resistencia al agente inductor de apoptosis, la estaurosporina (figura 4A). De acuerdo con la adquisición de un fenotipo antiapoptótico, los pulmones de ratones ancianos demuestran niveles elevados de Bcl-2 (figura 4B).

En conjunto, estos resultados demuestran que la fibrosis que no se resuelve en el envejecimiento se asocia con la adquisición de un fenotipo de miofibroblastos senescentes y resistentes a la apoptosis.

Ejemplo 4: La proteína NAMPT se aumenta en tejidos con FPI humanos.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos se describieron anteriormente.

Inmunotransferencia de tipo Western: Se prepararon lisados celulares en tampón RIPA, se sometieron a SDSPAGE en condiciones reductoras y se realizó inmunotransferencia de tipo Western. Se prepararon lisados citosólicos y nucleares usando el kit Ne-Per de Pierce o el kit de extracción nuclear EpiQuik de Epigentek según las recomendaciones del fabricante.

Se cuantificaron los lisados usando un kit de ensayo de proteína Micro BCA (Pierce) o el kit de ensayo de proteína Dc (Bio Rad) según las instrucciones.

Resultados

La proteína FNAMPT aumenta en los tejidos con FPI humanos. NAMPT se expresa específicamente en fibroblastos dentro de regiones fibróticas del tejido pulmonar con FPI mediante tinción con IHC para NAMPT.

Ejemplo 5: Los ratones NAMPT heterocigotos (Nampt+/-) están protegidos en un modelo de ratón anciano de fibrosis pulmonar.

Materiales y métodos

Eran como los descritos en el ejemplo 4.

Resultados

La figura 5 muestra que los ratones NAMPT heterocigotos Nampt+/- están protegidos de la lesión pulmonar inducida por bleomicina y de la fibrosis pulmonar reflejada por el colágeno soluble en los pulmones completos (en comparación con los ratones WT 3 semanas después de la lesión). Además, en respuesta a la lesión, los ratones Nampt+/- demostraron una supervivencia aumentada en comparación con los ratones WT (el 80 %, n = 8/10 frente al 50 %, n = 5/10). Estos estudios demuestran la viabilidad de que la selección como dianain vivode Nampt conduce a la protección contra la fibrosis pulmonar.

Ejemplo 6: NAMPT sigue expresándose de manera persistente en los pulmones de ratones ancianos con fibrosis que no se resuelve.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos eran tal como se describió anteriormente

Ensayo de actividad de caspasa. Se lisaron células usando tampón de lisis de caspasa y se analizaron para determinar la caspasa 3 activada usando el kit de ensayo fluorométrico de caspasa 3 de BioVision según las instrucciones del fabricante (BioVision, Inc, Milpitas CA).

Cultivo de células: Se adquirieron fibroblastos de pulmón fetal humano (células IMR-90) con una duplicación de población (PD) baja (11) y alta (39) de Coriell Cell Repositories (Camden, NJ). Se aislaron fibroblastos primarios de los pulmones de crías de ratones y ratones ancianos C57BL/6. Todas las células se cultivaron en DMEM (Life Technologies, Inc.) complementado con suero de ternero fetal al 10 % (Hyclone Laboratories, Logan, UT), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 |<i>g/ml y anfotericina B 1,25 |<i>g/ml. y a 37 °C en el 5 % de CO<2>, el 95 % de aire.

PCR en tiempo real: Se aisló ARN total de las células usando el mini kit RNeasy® (Qiagen) y se realizó transcripción inversa usando iScript Reverse Transcription SuperMix para RT-qPCR (Bio Rad) según los protocolos de los fabricantes. Las reacciones de PCR en tiempo real para cada muestra de ADNc se realizaron por duplicado usando SYBR®Select Master Mix (Applied Biosystems) y pares de cebadores específicos de genes para HO-1, NQO-1, GCLC y beta-actina (tabla S1, secuencias de cebadores). Se llevaron a cabo las reacciones durante 40 ciclos (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se normalizaron los datos de PCR en tiempo real para cada gen diana con respecto a la a-actina endógena y se compararon usando el método 2-<A A>Ct.

Resultados

iNampt está regulada de manera aberrante en ratones ancianos y en humanos con FPI. iNampt está regulado por incremento en fibroblastos representativos de fibroblastos pulmonares senescentes y con FPI (figura 8A). Los niveles de ARNm de iNampt en fibroblastos aislados de pacientes con FPI en estadio avanzado frente a estadio inicial muestran un aumento de la expresión deNAMPTcon gravedad creciente (figura 6).

La figura 7 muestra que una expresión génica persistente deNampt(RT-PCR) está asociada con fibrosis que no se resuelve en ratones ancianos evaluados en tejido pulmonar 2 meses después de la lesión en comparación con la fibrosis que se resuelve en crías de ratones. El punto de tiempo 2 meses después de la lesión representa un punto en el que la fibrosis se resuelve activamente en crías de ratones, mientras que en los ratones ancianos no.

Ejemplo 7: NAMPT media en las respuestas fibróticas de genes a lesión pulmonar.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos se describieron anteriormente.

Resultados

La figura 8A muestra que eNampt aumenta la expresión genética de rutas relacionadas con la fibrosis. A los ratones se les inyectaron por vía intratraqueal 60 |ig de Nampt recombinante y se recogió tejido pulmonar 4,5 h después de la administración. Se extrajo ARN de los pulmones y se realizaron 3 análisis de microalineamientos (Affymetrix Mouse430_2). Se evaluaron 630 rutas de expresión génica alterada; Se identificó un enriquecimiento significativo en varias rutas asociadas con la fibrosis pulmonar. Es importante destacar que en respuesta a la eNampt sistémica. La “fibrosis pulmonar” estuvo entre las rutas más significativamente alteradas, ocupando el décimo lugar entre las 640 rutas evaluadas. La figura 8B es un gráfico de barras horizontales que muestra el perfil transcriptómico de todo el genoma de las células endoteliales pulmonares silenciadas por NAMPT y el análisis de rutas que identifican rutas reguladas diferencialmente. Estos resultados respaldan el papel de eNampt en la mediación de respuestas fibróticas a la lesión pulmonar.

Ejemplo 8: eNampt promueve fenotipos de miofibroblastos profibróticos.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos eran tal como se describió anteriormente

Resultados

eNampt media en los fenotipos de miofibroblastos profibróticos. Se trataron los fibroblastos de manera dependiente de la dosis con eNampt exógena dando como resultado una mayor expresión de aSMA, Nox4, iNampt y GAPDH mediante inmunotransferencia de tipo Western. Estos resultados muestran que eNampt media en la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos. eNampt condujo a la inducción de señalización oxidante, tal como lo demuestran los aumentos dependientes de la dosis en la expresión de Nox4 y la generación de ROS (figura 9A), y la senescencia de fibroblastos (figura 9B).

Estos estudios demuestran un papel de Nampt en la mediación de fenotipos de miofibroblastos pulmonares profibróticos.

Ejemplo comparativo 9: Los efectos profibróticos mediados por eNampt requieren la señalización de Nox4 dependiente de TLR4.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos se describieron anteriormente.

Resultados

El efecto profibrótico de eNampt requiere la señalización de TLR4. Se sabe que eNampt media en la inmunidad innata y transduce señales de supervivencia a través de su receptor conocido, TLR4. Los fibroblastos pulmonares tratados con o sin un antagonista de TLR4, un inhibidor competitivo de TLR4 (RS-LPS, Invitrogen), seguido de tratamiento con/sin eNampt exógena (50 ng/ml, 48 h) mostraron que el bloqueo de TLR4 previno la diferenciación de miofibroblastos mediada por eNampt-TLR4, inhibió la inducción de Nox4 según lo determinado por inmunotransferencia de tipo Western y condujo a una disminución de la generación de ROS (figura 10) de manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 10: iNampt confiere resistencia a la apoptosis en ratones y miofibroblastos pulmonares con FPI.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos se describieron anteriormente.

Resultados

Nampt contribuye a la resistencia a la apoptosis de los fibroblastos con FPI humanos y de ratón. La expresión inducida por estaurosporina (300 nM, 8 h) de marcadores apoptóticos, caspasa 3 escindida y PARP (figura 11A) aumentó en los fibroblastos de pulmón aislados de Nampt+/- en comparación con ratones WT.

Ejemplo 11: La inhibición farmacológica de actividad enzimática de NAMPT en miofibroblastos con FPI restableció la susceptibilidad a la apoptosis.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos se describieron anteriormente.

Resultados

La figura 11B demuestra que la actividad enzimática de iNampt es necesaria para la resistencia mediada por iNAMPT a la apoptosis inducida por estaurosporina en miofibroblastos pulmonares (que expresan altos niveles de iNampt), ya que los fibroblastos con FPI pretratados con FK-866 mostraron apoptosis restaurada.

Las figuras 12A-D mostrar la estructura química del inhibidor de NAMPT, FK-866 (figura 12A) que se divide en tres regiones (figura 12B) y se varió reemplazándolo con N-heterociclos para generar nuevos análogos de FK866: MS-1-82 (figura 12C), Rari049 (figura 12D), Alpes135 (figura 12E); figura 13 es un gráfico de barras que muestra la actividad de NAMPT normalizada en presencia de FK866 y análogos de FK MS-1-82, Rari049, Alpii135 en concentraciones de 0,1, 1 y 10 |iM;

La figura 14 es un gráfico de barras que muestra el papel de la actividad enzimática de Nampt en la apoptosis inducida por H<2>O<2>definida por el ensayo TUNEL. El inhibidor enzimático de NAMPT, FK-866, bloquea la apoptosis inducida por H<2>O<2>.

Ejemplo 12: Los estímulos fibróticos inducen actividad del promotor de NAMPT.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos se describieron anteriormente.

Resultados

La figura 15 es un gráfico de barras que muestra un aumento de la actividad del promotor de NAMPT de células endoteliales pulmonares en respuesta a estímulos relevantes para la FPI. Las CE de pulmón humano, transfectadas con un promotor de luciferasa NAMPT en respuesta a VEGF (100 ng/ml) o TGFp1 (2 ng/ml) después de la exposición durante 4 h y 24 h, muestran una actividad de luciferasa aumentada.

Ejemplo 13: Los Fab anti-NAMPT neutralizan de manera potente la fosforilación de NFkB inducida por rhNAMPT. Materiales y métodos

Los materiales y métodos se describieron anteriormente.

Resultados

Los Fab anti-NAMPT neutralizan de manera potente la fosforilación de NFkB inducida por rhNAMPT. Se trataron células endoteliales (CE) pulmonares humanas con rhNAMPT solo (1 ug/ml, 1 h) o una mezcla de anticuerporhNAMPT, luego se lisaron y se sondaron para determinar fosfo-NFkB y NFkB total mediante inmunotransferencia de tipo Western. Dos Fab humanos derivados de fagos, 2K y 3K, (200 ug/ml) neutralizan la fosforilación de NFkB inducida por rhNAMPT a un nivel mayor que el AcP policlonal prototípico de NAMPT.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Composición para su uso en un método de tratamiento de fibrosis pulmonar (FP) en un sujeto que lo necesita que comprende uno o más inhibidores de nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT) y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable para su administración en el cuerpo, en la que el uno o más inhibidores se seleccionan del grupo que consiste en:

anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, o proteínas que tienen la especificidad de unión de los mismos que se unen a la NAMPT,

un ácido nucleico funcional que inhibe la transcripción, traducción o función del gen de NAMPT seleccionado del grupo que consiste en una molécula antisentido, ARNip, miARN, aptámeros, ribozimas, moléculas que forman tríplex, iARN, y secuencias guía externas, opcionalmente en la que uno o más ácidos nucleicos funcionales se expresan a partir de un vector de expresión, o

en la que el uno o más inhibidores de NAMPT se seleccionan del grupo que consiste en FK-866, MS-1-82, Rari049 y Alpiil35.

2. Composición para su uso según la reivindicación 1 en una formulación de dosificación que administra uno o más inhibidores de NAMPT en una cantidad de entre 0,1 y 15 mg/kg de peso corporal de un humano.

3. Composición para su uso según la reivindicación 1, en una dosificación eficaz para reducir o prevenir la aparición o el desarrollo de FP aguda y/o para tratar, prevenir o manejar uno o más de los síntomas de FP aguda en el sujeto con respecto a un sujeto de control no tratado.

4. Composición para su uso según la reivindicación 1, (i) en la que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o proteína que tiene la especificidad de unión de un anticuerpo anti-NAMPT se une a un epítopo en la proteína NAMPT que comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en Glu445, Gly446, Lys447, Gly448, Asp449, Leu450, Glu451, Glu452, Tyr453, Gly454, His455, Asp456 y Leu457; o (ii), en la que los fragmentos de anticuerpos, o proteínas se unen a la molécula de NAMPT intracelular para prevenir o reducir la homodimerización de NAMPT intracelular.

5. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la composición se administra mediante administración parenteral, mediante infusión o inyección intravenosa o por vía oral o, cuando el sujeto es un paciente en cuidados intensivos, a través de instilación endotraqueal.

6. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en una cantidad para la administración mediante infusión a un humano con fibrosis pulmonar de entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 400 mg, inclusive.

7. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que uno o más inhibidores de NAMPT son un anticuerpo o fragmentos de anticuerpos, o proteínas que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo anti-NAMPT, se administran mediante infusión en una cantidad de entre 1 mg y 200 mg, opcionalmente en la que la infusión se lleva a cabo a lo largo de una hora o en la que la composición se administra semanalmente, mensualmente o de manera menos frecuente.

8. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 ó 5, que comprende administrar una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste en FK-866, MS-1-82, Rari049 y Alpiil35 en una dosificación de entre aproximadamente 1,0 mg/kg y aproximadamente 3,0 mg/kg de peso corporal del receptor, inclusive, opcionalmente que comprende administrar Rari049 en una cantidad de aproximadamente 2,5 mg/kg de peso corporal del receptor.

9. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que se le diagnostica al paciente con fibrosis pulmonar idiopática o fibrosis pulmonar hereditaria, o en la que el paciente tiene fibrosis pulmonar aguda.

10. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el paciente ha experimentado, está experimentando, o experimentará traumatismo vascular, angioplastia, cirugía vascular o arteriopatía por trasplante.

11. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la composición se administra durante un tiempo y en una dosificación eficaz para reducir o prevenir el desarrollo y/o la progresión de fibrosis pulmonar en un sujeto con respecto a un sujeto de control no tratado.