CN117693524A - 胃肠道病症中wnt信号传导的调节 - Google Patents

胃肠道病症中wnt信号传导的调节 Download PDF

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CN117693524A
CN117693524A CN202280031912.8A CN202280031912A CN117693524A CN 117693524 A CN117693524 A CN 117693524A CN 202280031912 A CN202280031912 A CN 202280031912A CN 117693524 A CN117693524 A CN 117693524A
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拉塞尔·弗莱彻
李圣真
李阳
鲁成钢
帕塔萨拉蒂·桑帕库玛
格特鲁伊·范霍夫
叶文琛
谢力勤
伦纳德·普雷斯塔
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Sirozen Opratine
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Sirozen Opratine
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Abstract

本申请提供了改造的WNT激动剂和利用WNT信号传导通路的调制剂治疗胃肠道病症的方法。

Description

胃肠道病症中WNT信号传导的调节
相关申请
本申请要求2021年3月10日递交的第63/159,010号美国临时专利申请系列和2021年5月19日递交的第63/190,535号美国临时专利申请系列，以及2021年9月22日递交的第63/247,151号美国临时专利申请系列的优先权，其通过引用整体并入本文中。
序列表
本申请经由EFS-Web以电子方式递交，并且包括以电子方式提交的.txt格式的序列表。该.txt文件包含于2022年3月7日生成并具有80千字节大小的标题为SRZN_020_03WO_ST25.txt的序列表。该.txt文件中包含的序列表是说明书的一部分，并且通过引用整体并入本文中。
技术领域
本申请提供了作为胃肠道病症，特别是炎症性肠病的治疗方式的WNT信号调制剂。
背景技术
WNT蛋白形成了一个高度保守的分泌信号传导分子家族，其在胚胎发生期间调节细胞间的相互作用。WNT基因和WNT信号传导也与癌症有关。对WNT作用机制的深入了解来自数个系统：果蝇(Drosophila)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的遗传学；细胞培养中的生物化学和爪蟾(Xenopus)胚胎中异位基因的表达。小鼠中的许多WNT基因发生了突变，导致了非常特定的发育缺陷。据目前所理解，WNT蛋白与细胞表面上的卷曲蛋白(Frizzled)家族受体结合。通过数种细胞质中继组分，信号被转导到β-连环蛋白，然后其进入细胞核并与TCF形成复合物，以激活WNT靶基因的转录。WNT蛋白的表达各不相同，但通常与发育过程有关，例如在胚胎和胎组织中。
功能冗余和条件失活策略的必要性阻碍了对成年生物体中WNT蛋白生理功能的探索。Dickkopf-1(Dkk1)最近被鉴定为一个有效拮抗WNT信号传导的分泌蛋白家族的创始成员(参见Glinka et al.(1998)Nature 391:357-62；Fedi et al.(1999)J Biol Chem 274:19465-72；以及Bafico et al.(2001)Nat Cell Biol 3:683-6)。Dkk1与WNT共受体LRP5和LRP6，以及跨膜蛋白Kreman结合，由此产生的三元复合物通过缺乏功能性卷曲蛋白/LRP6WNT受体复合物而产生LRP6的快速内化和WNT信号传导的损伤(参见例如，Mao et al.(2001)Nature 411:321-5；Semenov et al.(2001)Curr Biol 11:951-61；以及Mao et al.(2002)Nature 417:664-7)。
敲除Tcf基因座的转基因小鼠在胚胎发生后期表现出小肠中增殖性干细胞区室的丧失。然而，这种敲除是致命的，并因此还没有在成年中进行研究。在允许分析成年的嵌合转基因小鼠中，组成型活性NH2截短的β-连环蛋白的表达刺激小肠隐窝的增殖，尽管NH2截短的β-连环蛋白或Lef-1/β-连环蛋白融合也诱导增加的隐窝细胞凋亡。由于多种因素调节β-连环蛋白/Lef/Tcf依赖性转录，包括非卷曲蛋白GPCRs和PTEN/PI-3-激酶，肠干细胞缺陷的原因尚不清楚。
成年肠上皮的特征是在5-7天的隐窝-绒毛转运时间期间发生的通过细胞分裂、分化、迁移和脱落的立体型循环连续替换上皮细胞。成年肠道干细胞生态位中调节增殖的假定生长因子尚未完全确定，尽管研究涉及增殖性隐窝区室中β-连环蛋白/Lef/Tcf信号传导的细胞内在作用。
许多病理状况会影响肠道细胞。炎症性肠病(IBD)可累及小肠和大肠之一或两者。克罗恩病和溃疡性结肠炎是最著名的IBD形式，并且两者都落入“特发性”炎症性肠病类别内，因为它们的病因尚不清楚。“活动性”IBD的特点是急性炎症。“慢性”IBD的特征是隐窝变形和瘢痕形成的结构变化。隐窝脓肿可发生在许多形式的IBD中。
克罗恩病可累及GI道的任何部分，但最常累及远端小肠和结肠。炎症通常是透壁性的，并且可以产生从淋巴滤泡上的小溃疡(阿弗他样溃疡)到深裂隙样溃疡，再到透壁瘢痕和慢性炎症的任何状况。三分之一的病例有肉芽肿，并且诸如淋巴结、肝脏和关节等结肠外部位也可能有肉芽肿。透壁炎症导致在肠环和其他结构之间发展出瘘管。炎症通常是节段性的，未受累的肠道与受累的肠道区域分离。病因尚不清楚，尽管已经提出了感染和免疫机制。
溃疡性结肠炎(UC)涉及结肠，其是一种以远端为主的弥漫性粘膜疾病。事实上总是涉及直肠，并且另外的结肠部分可能涉及以连续模式从直肠向近端延伸。UC的病因尚不清楚。患有长期UC的患者发展结肠癌的风险增加。UC患者也有发展肝脏疾病的风险，包括硬化性胆管炎和胆管癌。目前，临床上的所有治疗方法和大多数正在开发的UC治疗方法都专注于减少炎症，而不是直接诱导上皮愈合，这强调了对促进上皮修复的治疗剂的需求尚未得到满足。
对于临床目的，开发用于调节肠上皮生长的药物学试剂引起极大的兴趣。然而，WNT激动剂作为药理学试剂的探索部分受到了它们不是天然可溶、可扩散的分子这一事实的阻碍。本公开提供了使用改造的可溶性WNT激动剂，通过特定FZD受体来特异性调节WNT信号传导的方法和组合物。例如，这种改造的WNT激动剂可以实现上皮特异性的瞬时Wnt信号传导激活，其驱动强大的上皮再生和屏障恢复，最终导致炎症减少和结肠炎的改善。
发明内容
在不同的方面，本公开提供了改造的WNT激动剂和相关的药物组合物及使用方法。
在一方面，本公开包括改造的WNT激动剂，其包含：(a)结合一种或多种FZD的一个或多个结合域；以及(b)结合LRP5、LRP6或LRP5和LRP6的一个或多个结合域，其中所述改造的WNT激动剂包含与SEQ ID NOs:1-18中的任一项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的多肽序列，或者SEQ ID NO:s 1-25、图2、图6、表1或表3中任一项中公开的多肽序列，或者以上的功能片段或变体，例如，以上的结合片段，例如，VHH结构域、重链的可变结构域或轻链的可变结构域。在某些实施方案中，结合一种或多种FZD的一个或多个结合域结合：i)FZD5；ii)FZD 8；iii)FZD 1；iv)FZD 2；v)FZD 7；vi)FZD 5和FZD 8；vii)FZD1、FZD 2和FZD 7；viii)FZD 1、FZD 2、FZD 7、FZD 5和FZD 8；ix)FZD4；x)FZD9；或者xi)FZD10。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂包含与SEQ ID NOs:1-18或19-25中任一项具有至少90％、至少95％,％、至少98％或至少99％序列同一性的一个或多个(例如，两个)多肽序列，或者表3中公开的序列。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂包含：(a)与SEQ IDNO:1具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列和与SEQ ID NO:2具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列；(b)与SEQ ID NO:3具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列和与SEQ ID NO:4具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列；(c)与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列和与SEQ IDNO:6具有至少80％、至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列；(d)与SEQ ID NO:7具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列和与SEQ ID NO:8具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列；(e)与SEQ ID NO:9具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列和与SEQID NO:10具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列；(f)与SEQID NO:7具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列和与SEQ IDNO:8具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列(g)与SEQ IDNO:11具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列和与SEQ IDNO:12具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列；(h)与SEQ IDNO:13具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列和与SEQ IDNO:14具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列；(i)与SEQ IDNO:15具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列和与SEQ IDNO:16具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列；或者(j)与SEQID NO:17具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列和与SEQ IDNO:18具有至少90％或至少95％同源性的一个或多个(例如，两个)多肽序列。在某些实施方案中，多肽包含存在SEQ ID NOs:1-18或19-25中任一项中的CDRs。在改造的WNT激动剂的某些实施方案中，结合LRP5、LRP6或LRP5和LRP6的一个或多个结合域被人源化。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂包含修饰的Fc结构域，其中所述修饰的Fc结构域包含LALAPG或N297G修饰。在某些实施方案中，WNT激动剂具有本文公开的任何结构或形式，包括各种抗体相关结构或形式中的任何一种。合适形式的实例包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、纳米抗体、双抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，包括但不局限于scFv、Fab和Fab2，只要它们表现出所需的生物活性，例如，WNT激动剂活性。在特定实施方案中，WNT激动剂是R2M13-h26。R2M13是亲本R2M13-26的人源化形式，其也包含Fc结构域中的LALAPG取代。R2M13-h26在本文中也可称为R2M13-h26-LALAPG、R2M13-26人源化的LALAPG或人源化的LALPG。
在相关的方面，本公开提供了药物组合物，其包含本文公开的改造的WNT激动剂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一相关的方面，本公开提供了治疗对象中易于通过增加的WNT通路信号传导进行治疗的疾病或病症的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂或药物组合物。在特定实施方案中，疾病或病症是胃肠道病症，如炎症性肠病。在某些实施方案中，疾病或病症选自：克罗恩病(CD)、伴有瘘管形成的CD和溃疡性结肠炎(UC)。在特定实施方案中，改造的WNT激动剂经口或肠胃外，例如，静脉内、腹膜内或皮下给药。在特定实施方案中，WNT激动剂是R2M13-h26。在某些实施方案中，WNT激动剂经静脉内给药，例如，作为团注注射。在特定实施方案中，WNT激动剂每周至少给药一次。在特定实施方案中，向对象给予约0.5至约100mg/kg体重的WNT激动剂，或者约2至约50mg/kg体重的WNT激动剂，例如，约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg。在特定实施方案中，每周至少一次经静脉内向对象给予约3至约30mg/kg体重的R2M13-h26，其中R2M13-h26包含通过二硫键结合的两种SEQ ID NO:9的多肽和两种SEQ ID NO:10的多肽。
在另一相关的方面，本公开提供了增加细胞中的WNT信号传导的方法，包括使细胞与本文公开的改造的WNT激动剂接触。在特定实施方案中，WNT激动剂是R2M13-h26。
在另一相关的方面，本公开提供了调节患有胃肠道病症的对象中一个或多个组织和/或细胞中的WNT通分子表达的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂或药物组合物。在某些实施方案中，WNT通路分子是表4-表7中任一项中列出的基因或蛋白质。在特定实施方案中，WNT通路分子选自：RNA酶4、血管生长素、Gsta3、Rnf43、Axin2，或者表7中列出的任何基因或蛋白质。在某些实施方案中，在给予改造的WNT激动剂后，对象的一个或多个组织和/或细胞中WNT通路分子(基因或蛋白质)的表达增加至少20％、至少50％、至少80％、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或者减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，组织是上皮组织。在某些实施方案中，细胞是胃肠上皮细胞，任选地：干细胞、TA1、TA2、基底杯状细胞、损伤诱导的替代祖细胞(AltEnteroPC)、损伤诱导的替代肠细胞(AltEntero)、肠细胞前体(EnteroPrecur)、杯状细胞1、杯状细胞2，或者肠内分泌或簇状细胞。在特定实施方案中，WNT激动剂是R2M13-h26。在某些实施方案中，WNT激动剂经静脉内给药，例如，作为团注注射。在特定实施方案中，WNT激动剂每周至少给药一次。在特定实施方案中，向对象给予约0.5至约100mg/kg体重的WNT激动剂，或者约2至约50mg/kg体重的WNT激动剂，例如，约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg。在特定实施方案中，每周至少一次经静脉内向对象给予约3至约30mg/kg体重的R2M13-h26，其中R2M13-h26包含通过二硫键结合的两种SEQ ID NO:9的多肽和两种SEQ ID NO:10的多肽。
在另一相关的方面，本公开提供了在患有胃肠道病症的对象中刺激组织修复的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂或药物组合物。在特定实施方案中，通过(或者方法导致)调节选自以下的至少一种WNT通路分子来刺激组织修复：与细胞周期相关的基因、与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因、与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因和/或表4-8中任一项中列出的任何基因。在某些实施方案中，与细胞周期相关的基因选自表4中提供的那些，或者Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1和Rrm2。在某些实施方案中，与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因选自表8中提供的那些，以及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1和Adh1。在某些实施方案中，与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因选自表6中提供的那些，或者Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16和Sprr2a3。在特定实施方案中，在给予改造的WNT激动剂后，对象的一个或多个组织和/或细胞中基因的表达增加至少20％、至少50％、至少80％、至少两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或者减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，WNT激动剂经静脉内给药，例如，作为团注注射。在特定实施方案中，WNT激动剂每周给药至少一次。在特定实施方案中，向对象给予约0.5至约100mg/kg体重的WNT激动剂，或者约2至约50mg/kg体重的WNT激动剂，例如，约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg。在特定实施方案中，每周至少一次经静脉内向对象给予约3至约30mg/kg体重的R2M13-h26，其中R2M13-h26包含通过二硫键结合的两种SEQ ID NO:9的多肽和两种SEQID NO:10的多肽。
在另一相关的方面，本公开提供了减少患有胃肠道病症的对象(或其组织或细胞)中的炎症的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂或药物组合物。在某些实施方案中，通过(或方法导致)调节选自以下的至少一种WNT通路分子来减少炎症：表5中提供的基因，或者Adamdec1、Atf3、Gpx2、Gsta3、Gstm1、Gstm3、Gdf15、Ihh、Il18、Lyz2、Nox1、Reg4、Sycn、Selenbp1、Tgfbr2和Timp3。在特定实施方案中，胃肠组织，任选地上皮组织中的炎症减少。在某些实施方案中，胃肠上皮细胞、上皮干细胞、TA1、TA2、基底杯状细胞、损伤诱导的替代祖细胞(Alt祖细胞)、损伤诱导的替代肠细胞(Alt肠细胞)、肠细胞前体(EnteroPrecur)、杯状细胞1、杯状细胞2，或者肠内分泌或簇状细胞中的炎症减少。在特定实施方案中，在给予改造的Wnt激动剂后，对象的一个或多个组织和/或细胞中WNT通路分子的表达减少至少20％、至少50％、至少80％、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或者减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，WNT激动剂经静脉内给药，例如，作为团注注射。在特定实施方案中，WNT激动剂每周至少给药一次。在特定实施方案中，向对象给予约0.5至约100mg/kg体重的WNT激动剂，或者约2至约50mg/kg体重的WNT激动剂，例如，约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg。在特定实施方案中，每周至少一次经静脉内向对象给予约3至约30mg/kg体重的R2M13-h26，其中R2M13-h26包含通过二硫键结合的两种SEQ ID NO:9的多肽和两种SEQ ID NO:10的多肽。
在公开的任何方法的特定实施方案中，改造的Wnt激动剂是R2M13-h26，或者包含其功能变体或片段。在公开的任何方法的特定实施方案中，对象是哺乳动物，任选人类。
在另一相关的方面，本公开提供了在患有上皮损伤对象中恢复胃肠上皮屏障的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂或药物组合物。在某些实施方案中，WNT激动剂经静脉内给药，例如，作为团注注射。在特定实施方案中，WNT激动剂每周给药至少一次。在特定实施方案中，向对象给予约0.5至约100mg/kg体重的WNT激动剂，或者约2至约50mg/kg体重的WNT激动剂，例如，约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg。在特定实施方案中，每周至少一次经静脉内向对象给予约3至约30mg/kg体重的R2M13-h26，其中R2M13-h26包含通过二硫键结合的两种SEQ ID NO:9的多肽和两种SEQ ID NO:10的多肽。在一些实施方案中，通过调节选自以下的至少一种WNT通路分子来恢复胃肠上皮屏障：与细胞周期相关的基因、与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因、与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因和/或表4、5、6、7、8和11中任一项中列出的任何基因。与细胞周期相关的基因可以选自表4中提供的那些基因，或者Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1和Rrm2。与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因可以选自表8中提供的那些基因，以及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1和Adh1。与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因可以选自表6中提供的那些基因，或者Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16和Sprr2a3。
在一些实施方案中，通过调节至少一种WNT通路分子来恢复胃肠上皮屏障，其中在给予改造的Wnt激动剂后，对象的一个或多个组织和/或细胞中WNT通路分子的表达增加至少20％、至少50％、至少80％、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或者减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，通过调节至少一种WNT通路分子来恢复胃肠上皮屏障，其中在给予改造的Wnt激动剂约24小时内，对象的一个或多个组织和/或细胞中WNT通路分子的表达增加。在一些实施方案中，在给予改造的Wnt激动剂约6天内，对象的上皮损伤实质上恢复。在一些实施方案中，向对象给予改造的Wnt激动剂不会诱导正常上皮的过度增殖。
在另一相关的方面，本公开提供了在患有胃肠道病症的对象中诱导上皮祖细胞分化的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂改造的WNT激动剂或药物组合物。在某些实施方案中，WNT激动剂经静脉内给药，例如，作为团注注射。在特定实施方案中，WNT激动剂每周给药至少一次。在特定实施方案中，向对象给予约0.5至约100mg/kg体重的WNT激动剂，或者约2至约50mg/kg体重的WNT激动剂，例如，约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg。在特定实施方案中，每周至少一次经静脉内向对象给予约3至约30mg/kg体重的R2M13-h26，其中R2M13-h26包含通过二硫键结合的两种SEQ ID NO:9的多肽和两种SEQ ID NO:10的多肽。在一些实施方案中，通过调节选自以下的至少一种WNT通路分子来诱导上皮细胞分化：与细胞周期相关的基因、与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因、与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因和/或表4、5、6、7、8和11中任一项中列出的任何基因。与细胞周期相关的基因可以选自表4中提供的那些基因，或者Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1和Rrm2。与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因可以选自表8中提供的那些基因，以及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1和Adh1。与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因可以选自表6中提供的那些基因，或者Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16和Sprr2a3。
在一些实施方案中，通过调节of至少一种WNT通路分子来诱导上皮细胞分化，其中在给予改造的WNT激动剂后，对象的一个或多个组织和/或细胞中WNT通路分子的表达增加至少20％、至少50％、至少80％、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或者减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，通过调节至少一种WNT通路分子来诱导上皮细胞分化，其中在给予改造的WNT激动剂约24小时内，对象的一个或多个组织和/或细胞中WNT通路分子的表达增加。
在一些实施方案中，给予改造的WNT激动剂诱导祖细胞在对象中分化成肠细胞、杯状细胞、肠内分泌或簇状细胞。在一些实施方案中，在给予改造的WNT激动剂约48小时内，在对象中诱导大量的祖细胞分化。在一些实施方案中，向对象给予改造的WNT激动剂不会诱导正常上皮的过度增殖。
附图说明
图1提供了改造的WNT激动剂的一项实施方案的说明性结构。R2M13抗Fzd5,8抗体包括两条重链和两条轻链，并且每条轻链还包括经由标签与其N端融合的抗LRP6 VHH。
图2A提供了亲本LRP6结合VHH、VHH26和最接近的人类种系基因的氨基酸序列比对。由Kabat方案定义的CDR H1、H2和H3环残基通过上面的粗线标识。使用Clustal-Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行序列比对。图2B提供了亲本VHH26及其六种不同的人源化变体的氨基酸序列比对。由Kabat方案定义的CDR H1、H2和H3环残基通过上面的粗线标识。使用Clustal-Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行序列比对。
图3A至图3B显示了六种人源化VHH26变体(H1-H6)的生物物理特征。图3A显示了来自金属亲和层析的Ni拉下洗脱级分的SDS-PAGE。VHH26-H1、VHH26-H2、VHH26-H3、VHH26-H4、VHH26-H5和VHH26-H6人源化变体的SEC和Octect-BLI特征总结在图3B的表中。单体％基于ProA纯化后人源化VHH26的SEC特征。ND＝未确定的。
图4显示了在完全改造的WNT激动剂形式的情形下，与所指示的亲本和变体VHH结构域的LRP5或LRP6结合的EC50。
图5A至图5D显示了Fzd5,8亚家族特异性Wnt模拟物R2M13-26的体外活性：
图5A的图显示了在Octet上测量的R2M13-26的Fzd5,8结合IgG与其靶标Fzd5 CRD的结合亲和力。
图5B的图显示了在Octet上测量的R2M13-26的Fzd5,8结合IgG与其靶标Fzd8 CRD的结合亲和力。
图5C的图显示了在Octet上检测的R2M13-26的Fzd5,8结合IgG对10种Fzd CRDs中的每一种的结合特异性。
图5D的图显示了在Huh-7细胞中测量的在20nM RSPO2存在下，R2M13-26、Fzd1,2,7特异性模拟物1RC07-26和Fzd1,2,5,7,8泛特异性模拟物R2M3-26的剂量依赖性STF活性。
图6提供了改造的WNT激动剂R2M13-h26中存在的重链和轻链的序列。重链VH和轻链VL结构域标有下划线；VHH26结构域为斜体；并且CDR残基为粗体。
图7提供了急性结肠炎的DSS模型的示意图，以及在用各种非人源化和人源化形式处理后产生的血清抗体暴露，包括：R2M13-03-LALAPG(非人源化的)、R2M13-26-LALAPG(非人源化的)、R2M13-36-LALAPG(非人源化的)、R2M13-人源化的-03-LALAPG、R2M13-人源化的-26-LALAPG、R2M13-人源化的-36-LALAPG、R2M13-人源化的-03-N297G和R2M13-人源化的-36-N297G。
图8提供的图显示了用各种非人源化和人源化形式处理的动物的疾病活动指数表，包括：R2M13-03-LALAPG(非人源化的)、R2M13-26-LALAPG(非人源化的)、R2M13-36-LALAPG(非人源化的)、R2M13-人源化的-03-LALAPG、R2M13-人源化的-26-LALAPG、R2M13-人源化的-36-LALAPG、R2M13-人源化的-03-N297G和R2M13-人源化的-36-N297G。在第10天的时间，图中从上到下的线对应于：R2M13-h03-LALAPG、抗GFP、R2M13-h03-N297G、R2M13-03-LALAPG、R2M13-36-LALAPG、R2M13-h36-N297G(在R2M13-h36-LALAPG之后)、R2M13-h36-LALAPG、R2M13-h26-LALAPG和无DSS，其中“h”表示人源化的。
图9提供的图显示了利用各种对照和非人源化的和人源化的形式处理的动物中细胞因子的水平，从左到右包括：无DSS、抗GFP、亲本R2M13-03-LALAPG(非人源化的)、亲本R2M13-26-LALAPG(非人源化的)、亲本R2M13-36-LALAPG(非人源化的)、R2M13-人源化的-03-LALAPG、R2M13-人源化的-26-LALAPG、R2M13-人源化的-36-LALAPG、R2M13-人源化的-03-N297G和R2M13-人源化的-36-N297G。
图10提供的图显示了利用各种对照和非人源化的和人源化的形式处理的动物的脂质运载蛋白2的水平，包括：无DSS、抗GFP、亲本R2M13-03-LALAPG(非人源化的)、亲本R2M13-26-LALAPG(非人源化的)、亲本R2M13-36-LALAPG(非人源化的)、R2M13-人源化的-03-LALAPG、R2M13-人源化的-26-LALAPG、R2M13-人源化的-36-LALAPG、R2M13-人源化的-03-N297G和R2M13-人源化的-36-N297G。
图11提供的显微照片显示了在利用改造的WNT激动剂处理后，急性结肠炎的DSS模型中上皮紧密连接标志物ZO-1的体内恢复。颜色鲜艳的区域是ZO-1。
图12提供的显微照片显示了相比对照抗GFP，在利用改造的WNT激动剂R2M13-h26-LALPG处理后，急性结肠炎的DSS模型中受损结肠上皮的体内修复。
图13提供的显微照片显示了相比对照抗GFP，在利用改造的WNT激动剂R2M13-h26-LALPG处理后，急性结肠炎的DSS模型中上皮细胞谱系，包括结肠细胞、杯状细胞和簇状细胞的体内恢复。
图14提供的图和表显示了如通过在给予大鼠后的不同时间测量血清中抗体的量，并与从小鼠获得的数据进行比较所确定的，在静脉内注射后亲本R2M13-26-LALAPG和人源化R2M13-26-LALAPG的药代动力学(PK)。
图15提供了急性慢性结肠炎DSS动物模型系统的示意图。
图16提供的图显示了利用R2M13-h26-LALAPG(R2M13-h26)或R2M13-26-LALAPG(R2M13-26)处理的动物的疾病活动指数(DAI)。在10天的时间，图从上到下的线对应于：抗GFP、环孢菌素A、R2M13-h26(2mpkx1)、R2M13-h26(20mpkx1)、R2M13-h26(1mpkx2)、R2M13-h26(6mpkx1)、R2M13-26(3mpkx2)、R2M13-h26(10mpkx2)、R2M13-26(10mpkx2)和无DSS。
图17显示了与抗GFP或环孢菌素A相比，R2M13-h26处理的动物的H&E染色的横结肠横截面。
图18提供了慢性DSS结肠炎动物模型的图。
图19显示了所示处理后结肠横截面的显微照片。
图20提供的图显示了所示处理后的组织学评分和总体疾病指数。
图21提供的图显示了所示处理后的脂质运载蛋白-2和IL-6表达。
图22是慢性DSS结肠炎动物模型的图示。
图23提供的图显示了R2M13-h26或IL12/23p40处理动物的疾病活动指数。
图24提供的图显示了R2M13-h26或IL12/23p40处理的动物中所示细胞因子的表达。
图25提供的图显示了所示的R2M13-26-LALAPG(R2M13-26)处理后的Axin2和Ki67表达。
图26A至图26C显示了在受损的和DSS处理的小鼠上从scRNA-seq检测到的结肠中的不同细胞类型：
图26A的示意图显示了scRNA seq实验的实验设计。
图26B是前两个主要组分的图：指示了谱系/组织层，显示了从中心辐射的三个组。
图26C提供的图显示了DSS损伤对不同组织层/谱系中表达的差异基因数量具有的强烈影响。左边的图显示了与未受损的小鼠相比，DDS小鼠在第5天和第6天来自每个组织层的差异表达基因的数量；右边的图显示了与抗GFP相比，在用R2M13-26处理的第5天和第6天来自每个组织层的差异表达基因的数量。每个条从上到下的组织/谱系对应于上皮、免疫和基质，具有在第5天用R2M13-26-LALAPG(R2M13-26)处理后的几乎所有上皮。
图27A至图27C显示虽然到第5天，DSS影响所有组织层，但在第5天的治疗后24小时，R2M13-26-LALAPG(R2M13-26)的最主要影响是对上皮。图27A至图27C显示R2M13-26-LALAPG(R2M13-26)增加了Wnt靶标和细胞周期基因表达，并在损伤后扩增上皮中的祖细胞。
图27A的表列出了相对于抗GFP处理的DSS损伤的上皮，在R2M13-26处理的DSS损伤的上皮中富集的最重要的选定基因集(来自GSEA)。
图27B和图27C显示了组织中scRNA-seq分析的验证。
图27B显示了未损伤、DSS/抗GFP和DSS/R2M13-26处理组中两个Wnt靶基因Axin2和Cdkn3的RNA原位杂交(第5天)；用DAPI标记细胞核。比例尺表示100微米。
图27C显示了未损伤、DSS/抗GFP和DSS/R2M13-26处理的结肠样品中增殖细胞标志物MKI67的免疫组织化学(第6天)；用DAPI标记细胞核。比例尺表示100微米。
图28A至图28E显示了DSS模型中R2M13-26-LALAPG(R2M13-216)处理引起的加速的适当分化：
图28A至图28D提供的图显示了上皮细胞的统一流形逼近投影(UMAP)图。
图28A的图显示了通过簇/细胞类型着色的上皮细胞的UMAP。
图28B的图显示了通过细胞的实验条件着色的UMAP。
图28C的图显示了基于相似性连接簇的medoids聚类的最小生成树。只包括几乎完全没有被损伤细胞定殖的细胞类型。将干细胞和TA2细胞类型合并，并设置为起始聚类。
图28D的图显示了完整的slingshot预测的谱系轨迹，表明在向未成熟和成熟肠细胞(上升)的过程中，从干细胞/TA细胞向EnteroPrecur细胞的转变；以及从干细胞/TA细胞向下分叉以朝向丛状细胞或朝向杯状细胞和肠内分泌细胞，在它们之间具有来自杯状祖细胞类型的第二分叉。
图28E提供了在48小时/第6天时间点，在沿着来源于图28D中示出的肠细胞谱系的伪时间或谱系轨迹轴的所示位置处，来自所示处理组的细胞数量的直方图。垂直的红色虚线表示在所有三张图中沿轴的相同位置，而分布显示在该位置处存在多少个细胞。伪时间顺序(x轴)在每张图中是相同的，并且为从左到右的顺序。图28E显示R2M13-26-LALPG(R2M13-26)处理增加了向肠细胞谱系的进展。
图29的A至图29的L和图29的A’至图29的L’显示卷曲蛋白受体家族在小肠上皮中呈现不同的表达模式：
图29的A至图29的L提供的图分别显示了通过RNAscope原位杂交确立的正常十二指肠中10种Fzd受体(Fzd1-10)中的每种、Axin2和Lgr5的表达。
图29的A’至图29的L’提供了显示小肠隐窝中Fzd表达的放大视图。图29的E’中的箭头表示肠干细胞。
图30的A至图30的T显示在结肠中以不同水平表达卷曲蛋白受体家族：
图30的A至图30的J提供的图显示了通过RNAscope原位杂交检测的原始小鼠中10种Fzd受体的结肠表达。
图30的K至图30的T提供的图显示了用4％ DSS处理7天的小鼠中10种Fzd受体的结肠表达。
图31显示了通过减少中性粒细胞浸润来减少炎症。S100A9是中性粒细胞浸润的标志物，并且CD45是活化的炎症细胞的标志物。
图32提供的图显示了给予所示剂量的R2M13-h26后增加的血清ALP。
图33的示意图示出了用于测量R2M13-h26的平均血清浓度的药代动力学测定。
图34提供的图显示了组2-4中R2M13-h26的平均血清浓度。
图35提供的图显示了第一次剂量后测量的个体血清R2M13-h26浓度。箭头指向30mg/kg剂量组中的两只动物，在给药后3天开始加速清除。
图36A至图36B提供的一组图显示了第0-7天(图36A)和第28-42天(图36B)不同R2M13-h26剂量组的ALP增加。
图37提供的图显示了单一剂量的R2M13-h26后的平均血清R2M13-h26浓度。
图38提供的表显示了单一计量的R2M13-h26后R2M13-h26的PK参数。
具体实施方式
如本文所用，包括所附权利要求书，单数形式的词语如“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”，包括其相应的复数参考物，除非上下文另有明确规定。
本文引用的所有参考文献均通过引用并入，其程度与每个单独的出版物、专利申请或专利被明确且单独地指示通过引用并入的程度相同。本文引用的所有参考文献均通过引用并入本文中，其程度与就像每项单独的出版物、专利申请或专利被明确且单独地指示通过引用并入本文中相同。
I.定义
分子的“活性”可描述或指分子与配体或受体的结合、催化活性、刺激基因表达的能力、抗原活性、调节其他分子的活性等。分子的“活性”也可以指调节或维持细胞间相互作用的活性，例如粘附，或者维持细胞结构，例如细胞膜或细胞骨架的活性。“活性”也可意指特异性活性，例如[催化活性]/[mg蛋白]或[免疫活性]/[mg]蛋白]等。
本文使用的术语“给予”或“引入”或“提供”是指将组合物递送至对象的一个细胞、多个细胞、组织、组织类器官和/或器官，或者递送至对象。这种给予或引入可以在体内、体外或离体下发生。
如本文所用，术语“抗体”意指分离的或重组的结合剂，其包含特异性结合抗原表位所必需的可变区序列。因此，抗体是表现出所需生物活性，例如结合特定靶抗原的任何形式的抗体或其片段。因此，它在最广泛的意义上被使用，并具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、VHH抗体、骆驼抗体、纳米抗体、双抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，包括但不限于scFv、Fab和Fab2，只要它们表现出所需的生物活性即可。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(例如，Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个具有单一抗原结合位点，以及残留的“Fc”片段，这一名称反映了易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。
术语“抗原”是指能够被选择性结合剂如抗体结合的分子或分子的一部分，并且30另外能够在动物中用于产生能够结合该抗原表位的抗体。在某些实施方案中，当结合剂在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，结合剂(例如，改造的WNT激动剂或其结合区，或者WNT拮抗剂)被称为特异性结合抗原。
本文使用的术语“抗原结合片段”是指含有免疫球蛋白重链和/或轻链或(Nab)的至少一个CDR的多肽片段，其结合目标抗原，特别是一种或多种FZD受体，或者LRP5和/或LRP6。在这方面，本文所述抗体的抗原结合片段可包含来自结合一种或多种FZD受体或LRP5和/或LRP6的抗体的VH和VL的1、2、3、4、5个或全部6个CDRs。
如本文所用，术语“生物活性”和“生物学上有活性的”是指归因于细胞中特定生物元素的活性。例如，WNT激动剂或其片段或变体的“生物活性”是指模拟或增强WNT信号的能力。作为另一个例子，多肽或其功能片段或变体的生物活性是指多肽或其功能片段或变体执行其天然功能的能力，例如结合、酶活性等。在一些实施方案中，功能片段或变体保留相应的天然蛋白质或核酸的活性的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。作为第三个例子，基因调控元件，例如启动子、增强子、Kozak序列等的生物活性是指调控元件或其功能片段或变体分别调控，即促进、增强或激活与其可操作连接的基因表达翻译的能力。
本文使用的术语“双功能抗体”是指包含对一个抗原位点具有特异性的第一臂和对不同抗原位点具有特异性的第二臂的抗体，即双功能抗体具有双重特异性。
“双特异性抗体”在本文中用于指通过以下方式产生的全长抗体：四源杂交瘤技术(参见Milstein et al.,Nature,305(5934):537-540(1983))、两种不同单克隆抗体的化学缀合(参见Staerz et al.,Nature,314(6012):628-631(1985))，或者杵臼(knob-into-hole)或类似方法，其在Fc区中引入突变(参见Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(14):6444-6448(1993))，导致多种不同的免疫球蛋白种类，其中只有一种是功能性双特异性抗体。双特异性抗体在其两个结合臂(一对HC/LC)中的一个上结合一种抗原(或表位)，并在其第二臂(不同的HC/LC对)上结合不同的抗原(或表位)。通过这种定义，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列方面)，并且对其结合的每种抗原都是单价的。
通过“包含(comprising)”，其意指在例如组合物、方法、试剂盒等中需要所述元素，但在权利要求的范围内，可以包括其他元素以形成例如组合物、方法、试剂盒等等。例如，“包含”编码可操作地连接到启动子的治疗多肽的基因的表达盒是除了基因和启动子外还可以包括其他元件，例如聚腺苷酸化序列、增强子元件、其他基因、接头结构域等的表达盒。
通过“主要由…组成”，其意指将所述的组合物、方法、试剂盒等的范围限制为不会对例如组合物、方法、试剂盒等基本和新特征产生实质性影响的特定材料或步骤。例如，“基本上由编码可操作地连接到启动子的治疗多肽的基因和聚腺苷酸化序列组成的表达盒”可以包括另外的序列，例如接头序列，只要它们不会实质性地影响基因的转录或翻译。作为另一实例，“基本上由所述序列组成”的变体或突变体多肽片段具有所述序列的氨基酸序列加上或减去基于其所来源的全长原始多肽的序列边界处的约10个氨基酸残基，例如比所述结合氨基酸残基少10、9、8、7、6、5、4、3、2个或1个残基，或者比所述结合氨基酸残基多1、2、3、4、5、6、7、8、9个或10个残基。
通过“由…组成”，其意指从组合物、方法或试剂盒中排除权利要求中未规定的任何元素、步骤或成分。例如，“由所述序列组成”的多肽或多肽结构域仅包含所述序列。
“控制元件”或“控制序列”是参与分子相互作用的核苷酸序列，其有助于多核苷酸的功能调节，包括多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。调节可能影响过程的频率、速度或特异性，并且在本质上可能是增强或抑制的。本领域已知的控制元件包括例如转录调控序列，如启动子和增强子。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(在3'方向上)的编码区域的转录的DNA区域。
“表位”是抗体识别并结合的抗原上的特定区域，并且也称为“抗原决定簇”。蛋白质表面上的表位通常为5-8个氨基酸长度。蛋白质是三维折叠的结构，并且表位只可以以其存在于溶液中的形式或其天然形式被识别。当表位由通过三维结构靠在一起的氨基酸组成时，该表位是构象的或不连续的。如果表位存在于单个多肽链上，则它是连续的或线性的表位。取决于抗体识别的表位，它可以仅结合蛋白质的片段或变性片段，或者它可能也能够结合天然蛋白质。
识别表位的抗体或其抗体片段的部分被称为“表位结合域”或“抗原结合域”。抗体或抗体片段的表位或抗原结合域在Fab片段中，并且效应子在Fc片段中发挥作用。重链和轻链可变区(VH和VL)内的称为互补决定区(CDRs)的六个片段从抗体其余部分的框架(FR区)球状结构中环出，并相互作用以在分子一端形成暴露的表面。这是抗原结合域。通常，4–6个CDRs将直接参与结合抗原，尽管较少可以提供主要的结合基序。
“表达载体”是一种载体，如本文所讨论或本领域已知的质粒、微环、病毒载体、脂质体等，包括编码目标基因产物的区域，并用于在预期靶细胞中实现基因产物的表达。表达载体还包括控制元件，例如启动子、增强子、UTRs、miRNA靶向序列等，其可操作地连接到编码区以促进靶标中基因产物的表达。控制元件和它们可操作地连接以进行表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中大量是本领域已知和可用的，或者可以容易地由本领域可用的组分构建。
如本文所用的，术语“FR集”是指构成重链或轻链V区的CDR集的CDRs的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可能接触结合的抗原；然而，FRs主要负责将V区折叠到抗原结合位点中，特别是直接与CDRs相邻的FR残基。在FRs中，某些氨基残基和某些结构特征是非常高度保守的。在这方面，所有V区序列都包含约90个氨基酸残基的内部二硫环。当V区折叠成结合位点时，CDRs显示为形成抗原结合表面的突出环基序。通常可以认识到，FRs中存在保守的结构区，其影响CDR环折叠成某些“经典”结构的形状—而与精确的CDR氨基酸序列无关。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链和轻链相互作用的非共价结构域间接触。
“人源化”抗体或其片段是指来自其蛋白质序列已被修饰以增加其与人类中天然产生的抗体变体的相似性的非人类物种的抗体或其片段。“人源化”的过程通常适用于为给予人类而开发的单克隆抗体。
术语“个体”、“宿主”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用，并且指哺乳动物，包括但不限于人类和非人类灵长类动物，包括猿和人类；哺乳类运动动物(例如，马)；哺乳类农场动物(例如，绵羊、山羊等)；哺乳类宠物(狗、猫等)；以及啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠等)。
“单克隆抗体”是指同质抗体群体，其中单克隆抗体由参与表位的选择性结合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)组成。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个表位。术语“单克隆抗体“不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且还包括其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、以上的变体、包含单克隆抗体的抗原结合片段的融合蛋白、人源化的单克隆抗体、嵌合单克隆抗体，以及免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，其包含具有所需特异性和结合表位能力的抗原结合片段(表位识别位点)，包括本文公开的改造的WNT激动剂。其不旨在关于抗体来源或其制造方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)为限制性的。该术语包括本文或在“抗体”定义下描述的完整免疫球蛋白以及片段等。
如本文所用的术语“天然的”或“野生型”是指存在于野生型细胞、组织、器官或生物体中的核苷酸序列，例如基因或基因产物，例如RNA或蛋白质。本文中使用的术语“变体”是指参考多核苷酸或多肽序列的突变体，例如天然多核苷酸或多肽序列，即与参考多核苷酸或多肽序列具有小于100％的序列同一性。换句话说，变体包含相对于参考多核苷酸序列，例如天然多核苷酸或多肽序列的至少一个氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)。例如，变体可以是与全长天然多核苷酸序列具有50％或更多、60％或更多，或者70％或更多序列同一性的多核苷酸，例如，与全长天然多核苷酸序列具有75％或80％或更多的同一性，如85％、90％或95％或更多，例如98％或99％的同一性。作为另一实例，变体可以是与全长天然多肽序列具有70％或更多的序列同一性的多肽，例如与全长天然多肽序列具有75％或80％或更多的同一性，如85％、90％或95％或更多，例如98％或99％的同一性。变体还可以包括参考的变体片段，例如天然序列，其与参考的片段共享70％或更高的序列同一性，例如天然的序列，例如75％或80％或更高，例如85％、90％或95％或更多，例如98％或99％与天然序列的同一性。变体还可以包括与参考序列，例如天然序列的片段共有70％或更多的序列同一性，例如与天然序列具有75％或80％或更多的同一性，如85％、90％或95％或更多，例如98％或99％的同一性的参考序列，例如天然序列的变体片段。
“操作性地(Operatively)连接的”或“可操作地(operably)连接的”是指遗传元素的并置，其中这些元素处于允许它们以预期方式操作的关系中。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子可操作地连接到编码区。只要保持这种功能关系，启动子和编码区之间就可能存在插入残基。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物。这些术语还包括已经被修饰的氨基酸聚合物；例如，以包括二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化或与标记组分缀合。
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者它们的类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分中断。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构赋予修饰。本文中使用的术语多核苷酸可交换地指双链和单链分子。除非另有规定或要求，本文所述的本发明的任何多核苷酸实施方案包括双链形式和已知或预测组成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
多核苷酸或多肽与另一种多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”，这意味着，当对齐时，在比较两个序列时，碱基或氨基酸的百分比是相同的。如本文所用，术语“同一性”和“相同的”就目标多肽或多核苷酸序列而言，是指在目标序列与参考序列的比对中，如通过BLAST算法生成的比对中精确匹配残基的百分比。除非另有规定，否则在参考序列的整个长度上计算同一性。因此，如果当参考序列(作为查询序列)与目标序列(作为对象序列)对齐时，对象序列中至少x％(向下取整)的残基作为与查询序列中相应残基的精确匹配而对齐，则目标序列与参考序列“共有至少x％同一性”，分母是参考序列的全长加上通过将参考序列与目标序列比对而插入到参考序列中的任何空位的长度。在对象序列具有可变位置(例如，表示为X的残基)的情况下，与查询序列中的任何残基的比对被计数为匹配。
序列相似性可以通过多种不同的方式来确定。为了确定序列同一性，可以使用包括BLAST在内的方法和计算机程序对序列进行比对，BLAST可在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，通过全球网站获得。序列比对可以使用NCBI Blast服务(BLAST+版本2.12.0)或给出相同结果的另一程序进行。除非指出相反，否则使用BLAST算法(例如，bl2seq)，利用默认参数来确定序列同一性。
另一种比对算法是FASTA，可在来自Madison,Wis.,USA——Oxford MolecularGroup,Inc.的全资子公司的Genetics Computing Group(GCG)软件包中获得。用于比对的其他技术描述于Methods in Enzymology,第266卷:Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis(1996),编辑Doolittle,Academic Press,Inc.——Harcourt Brace&Co.,San Diego,Calif.,USA的一个部门中。特别令人感兴趣的是允许序列中存在空位的比对程序。Smith-Waterman是一类允许序列比对中存在空位的算法。参见Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。而且，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可以用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48:443-453(1970)
感兴趣的是使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in AppliedMathematics 2:482-489(1981)来确定序列同一性的BestFit程序。空位产生罚分通常在1-5的范围内，通常在2-4的范围内，并且在许多实施方案中将是3。空位延伸罚分通常将在从约0.01-0.20的范围内，并且在许多情况下将是0.10。该程序具有由要比较的输入序列确定的默认参数。优选地，使用由程序确定的默认参数来确定序列同一性。该程序也可从来自Madison,Wis.,USA的Genetics Computing Group(GCG)软件包中获得。
另一目标程序是FastDB算法。FastDB描述于Current Methods in SequenceComparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,SelectedMethods and Applications,第127-149页,1988,Alan R.Liss,Inc.中。序列同一性百分比通过FastDB基于以下参数计算：错配罚分：1.00；空位罚分：1.00；空位大小罚分：0.33；以及加入罚分：30.0。
本文所用的“启动子”包括指导RNA聚合酶结合并从而促进RNA合成的DNA序列，即足以指导转录的最小序列。启动子和相应的蛋白质或多肽表达可能是普遍存在的，这意味着在广泛的细胞、组织和物种或细胞类型特异性、组织特异性或物种特异性中具有强烈活性。启动子可以是“组成型”的，意指是持续活性的，或者是“诱导型的”，意指启动子可以通过存在或不存在生物或非生物因子而被激活或失活。本发明的核酸构建体或载体中还包括增强子序列，其可以与启动子序列邻接或可以不邻接。增强子序列影响启动子依赖性基因表达，并且可以位于天然基因的5’或3’区中。
如应用于多核苷酸的“重组”意指多核苷酸是克隆、限制或连接步骤以及产生与天然下发现的多核苷酸不同的构建体的其他程序的各种组合的产物。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等在本文中通常用于意指获得所需的药理学和/或生理学效果。该效果可以在完全或部分预防疾病或其症状，例如，降低疾病或其症状在对象中发生的可能性方面是预防性的，以及/或者可以在部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良影响方面是治疗性的。本文所用的“治疗”涵盖了对哺乳动物中疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止可能易患疾病但尚未被诊断为患有疾病的对象中疾病的发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或者(c)减轻疾病，即引起疾病消退。治疗剂可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后给药。对正在进行的疾病的治疗，其中治疗稳定或减少患者的不良临床症状，是特别令人感兴趣的。这种治疗最好在受影响组织完全丧失功能之前进行。对象的治疗最好在疾病的症状阶段期间给予，并且在一些情况下，在疾病的症状阶段之后给予。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用细胞生物学、分子生物学技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术都在本领域技术人员的范围内。这样的技术在文献中有完整解释，如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",第二版(Sambrook etal.,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait,编辑,1984)；"Animal CellCulture"(R.I.Freshney,编辑,1987)；"Methods in Enzymology"(Academic Press,Inc.)；"Handbook of Experimental Immunology"(D.M.Weir&C.C.Blackwell,编辑)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(J.M.Miller&M.P.Calos,编辑,1987)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel et al.,编辑,1987)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis et al.,编辑,1994)；以及"CurrentProtocols in Immunology"(J.E.Coligan et al.,编辑,1991)，其各自通过引用明确地并入本文中。
下面参考用于说明的示例应用描述本发明的数个方面。应当理解，陈述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的完整理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易地认识到，本发明可以在没有一个或多个具体细节或与其他方法一起的情况下实践。本发明不受所示的动作或事件的顺序的限制，因为一些动作可以以不同的顺序和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并非需要所有示出的动作或事件来实施根据本发明的方法。
此处使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明。如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”旨在也包括复数形式。此外，到详细说明和/或权利要求书中使用术语“包括(including)”、“包括(includes)”，“具有(having)”、“具有(has)”、“带有(with)”或其变体的程度，这些术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式为包括性的。
术语“约(about)”或“近似(approximately)”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约(about)”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。可选地，“约(about)”可以意指给定值的高达20％，优选高达10％，更优选高达5％，且仍然更优选高达1％的范围。可选地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在值的一个数量级内，优选在5倍内，且更优选在2倍内。如果在申请和权利要求中描述了特定值，除非另有说明，否则应假设术语“约(about)”意指在特定值的可接受误差范围内。
本文提及的所有出版物均通过引用并入本文中，以公开和描述出版物结合其引用的方法和/或材料。应当理解，到存在矛盾的程度，本公开取代并入的出版物的任何公开内容。
还应注意，权利要求书的起草可以排除任何任选元素。因此，本声明旨在作为结合权利要求要素的陈述使用此类专有术语如“单独地(solely)”、“仅(only)”等，或使用“负”限制的前提基础。
除非另有指示，否则本文中使用的所有术语具有与本领域技术人员理解的相同含义，并且本发明的实践将采用常规的微生物学技术和重组DNA技术，其在本领域技术员的知识范围内。
II.总体描述
本发明提供了调节WNT信号的组合物和方法，以减轻可以从WNT信号传导通路的调节受益的各种疾病和病症，如胃肠道病症，包括但不限于炎症性肠病，包括但不限于克罗恩病、伴有瘘管形成的克罗恩病和溃疡性结肠炎。
WNT(“无翅基因相关的整合位点”或“无翅基因和Int-1”或“无翅基因-Int”)配体及其信号在控制许多重要器官和组织的发育、稳态和再生中发挥关键作用，包括骨、肝、皮肤、胃、肠、肾、中枢神经系统、乳腺、味蕾、卵巢、耳蜗、肺和许多其他组织(综述，例如由Clevers,Loh和Nusse,2014；346:1248012综述的)。WNT信号通路的调节具有治疗退行性疾病和组织损伤的潜力。
调节WNT信号传导作为治疗的挑战之一是存在多种WNT配体和WNT受体卷曲蛋白1-10(FZD1-10)，许多组织表达多种和重叠的FZDs。经典的WNT信号传导还涉及作为共受体的低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)和/或低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白6(LRP6)，除FZDs外，它们也在各种组织中广泛表达。LRP5和LRP6统称为LRP5/6，并且提及“LRP5/6结合”等表示与LRP5或LRP6的结合。
R-脊椎蛋白1-4(RSPO1-4)是一个放大WNT信号的配体家族。每种R-脊椎蛋白均通过受体复合物起作用，该受体复合物在一端包含锌和环指3(ZNRF3)或环指蛋白43(RNF43)，并且在另一端包含含有富含亮氨酸的重复序列的G-蛋白偶联受体4-6(LGR4-6)(例如，由Knight和Hankenson 2014,Matrix Biology；37:157-161综述的)。R-脊椎蛋白也可以通过另外的作用机制起作用。ZNRF3和RNF43是两种膜结合的E3连接酶，专门靶向WNT受体(FZD1-10和LRP5或LRP6)以进行降解。R-脊椎蛋白与ZNRF3/RNF43和LGR4-6的结合导致三元复合物的清除或螯合，这从WNT受体中去除E3连接酶并稳定WNT受体，导致增强的WNT信号。每种R-脊椎蛋白包含两个Furin结构域(1和2)，其中Furin结构区1与ZNRF3/RNF43结合，并且Furin结构体2与LGR4-6结合。含有Furin结构域1和2的R-脊椎蛋白片段足以放大WNT信号传导。虽然R-脊椎蛋白的影响取决于WNT信号，但由于LGR4-6和ZNRF3/RNF43在各种组织中广泛表达，因此R-脊椎蛋白的影响不是组织特异性的。
通过WNT激动剂激活WNT信号传导可用于治疗多种疾病和病症，包括胃肠道病症。类似地，通过RSPO或RSPO模拟物放大WNT信号传导可用于治疗多种疾病和病症，包括胃肠道病症。文献中先前的工作表明，RSPO可用于治疗实验性结肠结肠炎(J.Zhao et.al.,2007)。WNT激动剂分子也可用于治疗胃肠道病症。特别地，活性WNT信号传导可以提供主要的干细胞维持信号，并在稳态和损伤中调节肠上皮的再生中起关键作用。
两个肠上皮谱系，即吸收型和分泌型，定义了肠道器官的两种主要功能。分泌细胞分泌激素，并主要通过分泌粘液和抗微生物肽，提供针对食源性微生物、毒素和抗原的重要屏障。相比之下，吸收型细胞进行膳食营养素的吸收，因为它们主要定位在小肠中绒毛的尖端处或结肠隐窝的顶部处，从而构成肠表面积中的大多数管腔细胞(参见例如，Santos,et.al(2018)Trends in Cell Biol.印刷中,https://doi.org/10.1016/j.tcb.2018.08.001)。在稳态条件下，肠上皮中的所有细胞在3-10天内再生。
不同的生态位因子维持肠道干细胞(ISC)的活性，并且不同的非上皮和/或上皮细胞产生各种信号，其组成细胞生态位。这些生态位因子不仅包括经典信号如WNT、R-脊椎蛋白、Notch和骨形态发生蛋白(BMP)，而且还包括炎症和膳食影响。损伤后，ISC生态位适应其稳态之外的状态，以解释致病刺激并将其转化为上皮再生。这种再生是由存活的Lgr5+ISCs或其他成熟细胞类型介导的，如肠细胞、肠内分泌细胞或Paneth细胞，它们可以转化回Lgr5+ISCs，以帮助上皮再生(Beumer和Clevers(2016),Development 143:3639-3649)。
肠隐窝底部处的ISCs，也称为柱状基底细胞(CBCs)，插入分泌WNT的Paneth细胞(Cheng和Leblond(1974)Am.J.Anat.141:537-561)。肠上皮周围的间充质细胞也分泌一些WNT蛋白，在体内发挥重叠的干细胞生态位功能(Farin,el.al(2012)Gastroenterol.143:1518-1529)。在存在WNT信号传导的情况下，ISCs分裂产生自我更新的干细胞和分化的子细胞，这些子细胞在分化为功能性细胞类型之前首先经过一些快速过渡扩增(TA)分裂。肠隐窝中还有静止的干细胞群，即+4细胞，当CBCs受损时，它可能有助于上皮再生(Tian,el.al(2011)Nature 478:255-259)。当TA细胞沿着隐窝-绒毛轴远离产生WNT的细胞迁移出去时，就发生了向单个谱系和终末分化的定型。
III.改造的WNT激动剂
本公开提供了改造的WNT激动剂，并且包括使用改造的WNT激动剂来刺激、激动或促进WNT信号传导，例如，通过经典的WNT/β-连环蛋白信号传导通路。这种改造的WNT激动剂也可被称为WNT/β-连环蛋白信号传导激动剂或Wnt模拟物。
在改造Wnt蛋白以用于临床应用方面存在一些挑战。首先，Wnt蛋白难以产生，并且不包含典型的药物样特性。其次，据报道，在各种损伤模型中，体内过度表达或应用放大Wnt信号传导的外源性RSPO有助于肠上皮再生(Zhao et al.,2007)，但也有报道称其诱导正常肠上皮增殖增加(Yan Kelley S.et al.,2017)。
本公开通过提供具有药物样特性的合成Wnt模拟物，特别是以将Fzd和Lrp结合在一起以刺激信号传导的重组双特异性抗体的形式，模拟内源性Wnt配体，解决了第一项挑战。本公开的Wnt模拟物可以自由扩散，进入受损组织，并在需要Wnt信号的地方引导组织修复。
本公开通过提供能够在不与RSPO结合的情况下修复受损肠上皮的Wnt模拟物来解决第二项挑战。与RSPO不同，本公开的Wnt模拟物不诱导正常肠上皮的过度增殖。
本公开的Wnt模拟物具有将患病肠组织恢复回到正常生理学的所需特性。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物诱导受损上皮组织的快速恢复。在一些实施方案中，受损的上皮屏障可以在用本公开的Wnt模拟物治疗的约10天、约8天、约7天、约6天或约5天内恢复。在一些实施方案中，受损的上皮屏障可以在用本公开的Wnt模拟物治疗的约6天内恢复。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物在约12小时、约24小时、约36小时或约48小时内诱导受损上皮细胞中Wnt靶基因的表达。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物在约24小时内诱导受损的上皮细胞中Wnt靶基因的表达。在一些实施方案中，由本公开的Wnt模拟物诱导的Wnt靶基因包括Axin2、Rnf43、Cdkn3。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物在约24小时内诱导受损的上皮细胞中Axin2的表达。
在一些实施方案中，本文公开的Wnt激动剂支持患有中度至重度IBD患者的受损肠或结肠隐窝中干细胞的增殖和分化。在一些实施方案中，本文公开的Wnt激动剂具有加速肠屏障修复的潜力，这可导致穿透肠上皮的细菌减少以及免疫细胞活化和炎症的减少，从而治疗炎症性肠病。
在一些实施方案中，本文公开的Wnt激动剂同时具有数种有益影响：激活肠干细胞和祖细胞中的Wnt信号传导通路，导致增殖和分化；恢复肠道屏障功能和组织结构；减少组织炎症；以及降低中度至重度IBD的疾病活动性。
在一些实施方案中，本文公开的Wnt激动剂是靶向Fzd5/8和Lrp6的双特异性抗体。先前报道Fzd5在来自IBD患者的肠粘膜细胞中高表达。Fzd5在右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠模型中也高度表达。在一些实施方案中，本文公开的Wnt激动剂结合DSS受损的肠细胞，刺激Wnt信号传导，如通过Wnt通路中的下游靶基因Axin2的表达所测量的。在一些实施方案中，本文公开的Wnt激动剂结合肠干细胞上的Fzd5/8和Lrp6以激活Wnt信号传导。
在一些实施方案中，给予本文公开的Wnt激动剂改善了DSS模型中的疾病活动指数或DAI。DAI是一种由体重变化、腹泻和便血组成的综合评分，其在临床前啮齿动物模型和临床中经常用于量化疾病的严重程度。在一些实施方案中，给予本文公开的Wnt激动剂导致DAI的剂量依赖性降低。在一些实施方案中，用本文公开的Wnt激动剂治疗优于用环孢菌素、抗TNF抗体或抗IL12/23抗体治疗。在一些实施方案中，给予本文公开的Wnt激动剂改善了慢性DSS模型和急性DSS模型中的DAI。
在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物扩增上皮中的祖细胞群。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物通过增加所述细胞群中细胞周期基因的表达来扩增祖细胞群。祖细胞群可以包括例如，对损伤作出反应的正常祖细胞和处于改变的细胞状态如去分化的祖细胞。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物在约24小时内实质性扩增上皮中的祖细胞群。
在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物加速祖细胞分化为成熟细胞类型。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物加速祖细胞，例如，胃肠道祖细胞向肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞或簇状细胞的分化。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物加速祖细胞向肠细胞的分化。在一些实施方案中，在用本公开的Wnt模拟物处理的约24小时、约36小时、约48小时或约60小时内发生大量的祖细胞向成熟细胞类型的分化。在一些实施方案中，在用本公开的Wnt模拟物处理的约48小时内发生大量的祖细胞向成熟细胞类型的分化。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物加速祖细胞向成熟细胞类型的分化，同时减少高水平炎症基因的表达。
在一些实施方案中，肠道屏障的破坏触发管腔病原体的流入和导致进一步组织损伤的炎症反应。可以通过受损组织和血清中存在的炎性细胞因子水平来测量IBD的疾病改变。在一些实施方案中，用本公开的Wnt模拟物治疗上皮组织损伤减少了炎性细胞因子的产生。在一些实施方案中，相比不包括本公开的Wnt模拟物的治疗或相比不治疗，用本公开的Wnt模拟物治疗受损上皮组织将炎性细胞因子产生减少至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了能够在不诱导正常上皮的过度增殖的情况下有效修复上皮损伤的Wnt模拟物。在一些实施方案中，单独的本公开的Wnt模拟物不影响正常上皮的增殖。在一些实施方案中，上皮是结肠或小肠上皮。在一些实施方案中，本公开提供了相比包括RSPO的治疗，能够以更高的效力修复上皮损伤的Wnt模拟物。在一些实施方案中，本公开提供了相比包括RSPO和本公开的Wnt模拟物的治疗，能够以更高的效力修复上皮损伤的Wnt模拟物。在一些实施方案中，相比包括RSPO的治疗或包括RSPO和本公开的Wnt模拟物的治疗，本公开的Wnt模拟物以更好的效力将上皮损伤改善至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。修复受损上皮的效力可以通过组织学严重程度评分来确定，其中评分越高表示损伤越严重，或者通过疾病活动指数(DIA)来确定，其可以基于体重减轻、粪便稠度和肠出血程度的平均评分来计算。
在一些实施方案中，本公开提供了Fzd5,8和Lrp6特异性Wnt模拟物–(例如，R2M13-26或R2M13-h26)。在一些实施方案中，本公开的Fzd5,8和Lrp6特异性Wnt模拟物能够激活上皮细胞上的Wnt信号传导。可以使用本领域已知并在本公开中描述的scRNA-seq(单细胞RNA测序)方法，通过基因表达来测量Wnt信号传导的激活。在一些实施方案中，上皮细胞是结肠或小肠上皮细胞。在一些实施方案中，上皮细胞包括多个干细胞或祖细胞。
改造的WNT激动剂包括结合一种或多种FZD或其表位的一个或多个结合域，以及结合LRP5和/或LRP6中的一种或多种的或LRP5和/或LRP6内的表位的一个或多个结合域。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂特异性结合与其结合的人卷曲蛋白受体内的富含半胱氨酸的结构域(CRD)。
在某些实施方案中，改造的WNT激动剂可包含一个或多个另外的结合域。例如，它们可以包含一个或多个结合域，所述结合域结合E3连接酶、ZNRF3/RNF43中的一种或多种，或者任一种E3连接酶内的特定表位。在某些实施方案中，E3连接酶结合域包含R-SPO或其片段。
在某些实施方案中，改造的WNT激动剂可以包含特异性结合目标组织或细胞类型的一个或多个组织特异性或细胞类型特异性的结合域。
在一方面，本公开提供了结合LRP5和/或LRP6的VHH结构域。这些VHH结构域的说明性序列提供在表1中。VHH结合域可来源于所公开序列中的任一种。在特定实施方案中，VHH结合域是人源化的。本公开包括改造的WNT激动剂，其包含一种或多种公开的VHH结构域，包括本文公开的人源化VHH结构域中的任一种，以及此类VHH结构域的与本文公开的VHH序列中的任一种具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的功能片段和变体。在某些实施方案中，VHH结构域包含3种CDR序列：GRIFAIYDIA、IRPVVTEIDYADSVKG和RPWGSRDEY。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂包含与SEQ ID NOs:19-25中的任一种具有至少80％,至少85％,至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域。在特定实施方案中，改造的Wnt激动剂是包含IgG结构的双特异性抗体样分子，所述IgG结构包含两条重链和两条轻链，其中VHH结构域与抗体样分子中存在的每条轻链的N端融合。在特定实施方案中，重链是无效应子的，例如，包含LALAPG突变。
在另一方面，本公开提供了结合一种或多种FZD的FZD结合域。在来源于抗FZD抗体R2M13的VH和VL结构域的情况下，表3中提供了这些FZD结合域的说明性序列。本公开考虑了改造的WNT激动剂，其包含本文公开的VH或VL结构域中的一种或多种，以及与本文公开的任何VH或VL序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的此类VH或VL结构域的功能片段和变体。另外，本公开考虑了改造的WNT激动剂，其包含表3中提供的重链或轻链序列中的一种或多种，以及与本文公开的任何重链或重链序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的此类重链或轻链的功能片段和变体。在某些实施方案中，FZD结合域包含3种轻链CDR序列：RASQSISSYLN(CDRL1)、AASSLQS(CDRL2)和QQSYSTPLT(CDRL3)，以及/或者3种重链轻链CDR序列：GGTFTYRYLH(CDRH1)、GIIPIFGTGNYAQKFQG(CDRH2)和SMVRVPYYYGMDV(CDRH3)、本文提供的任何CDRs。
在相关的实施方案中，本公开考虑了改造的WNT激动剂，其包含本文公开的FZD结合域或LRP5/6结合域中存在的一种或多种CDRs：例如，图6或表1中所示的VHH CDRs中的一种或多种(例如，两种或三种)；本文公开的重链或轻链中存在的CDRs中的一种或多种(例如，两种或三种)。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂包含针对本文中，例如，在图6或表3中公开的FZD结合域显示的CDRs中的4、5种或所有6种。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂包含针对本文中，例如，在图6或表3中公开的改造的WNT激动剂显示的CDRs中的6、7、8种或所有9种。
本公开提供了包含与本文提供的结合域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成的多肽，以及包含本文公开的CDR序列中的两种或更多种，例如三种的多肽，如包含以下CDRs的多肽：GRIFAIYDIA、IRPVVTEIDYADSVKG和RPWGSRDEY(分别为VHH CDRs1-3)，并且其结合LRP5或LRP6，或者包含以下CDRs的多肽：RASQSISSYLN(CDRL1)、AASSLQS(CDRL2)和QQSYSTPLT(CDRL3)，其与重链组合，结合一种或多种FZD，或者包含以下CDRs的多肽：GGTFTYRYLH(CDRH1)、GIIPIFGTGNYAQKFQG(CDRH2)和SMVRVPYYYGMDV(CDRH3)，其与轻链组合，结合一种或多种FZD。本公开还包括包含两条重链和两条轻链的FZD结合域，其中每条重链包含以下CDRs中的两种或更多种：GGTFTYRYLH(CDRH1)、GIIPIFGTGNYAQKFQG(CDRH2)和SMVRVPYYYGMDV(CDRH3)，并且每条轻链包含以下CDRs中的两种或更多种：RASQSISSYLN(CDRL1)、AASSLQS(CDRL2)和QQSYSTPLT(CDRL3)，其中所述FZD结合域结合一种或多种FZD。在某些实施方案中，FZD结合域是抗体，并且重链还包含Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，其可被修饰。本公开还提供了多肽，其包含与本文中，例如，在SEQ ID NOs:1-25、图6或表3中公开的可变重链或可变轻链结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成。本公开还提供了多肽，其包含与本文中，例如，在SEQ DI NOs:1-25、图6或表3中公开的VHH结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成。本公开还提供了多肽，其包含与本文中，例如，在SEQ IDNOs:1-25、图6或表3中公开的重链或轻链或融合多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成。在本文公开的任何多肽变体的实施方案中，相比原始序列或亲本序列，CDRs未被修饰。
另外，本公开提供了编码本文所述的任何多肽，以及其功能片段和变体，例如，结合FZD或LRP5/6、VH结构域和VL结构域中的一种或多种的片段和变体的多核苷酸序列。
在某些实施方案中，本文公开的改造的WNT激动剂包含Fc结构域(例如，作为重链的一部分)。在特定实施方案中，Fc结构域被改造为包括特定氨基酸取代，包括与LALAPG或N297G对应的那些氨基酸取代。
在改造的WNT激动剂的特定实施方案中，将本文公开的一种或多种LRP5/6结合域(例如，VHH26-H1-H6中的任一种)与本文公开的FZD结合域(例如，R2M13衍生的FZD结合域)的轻链或重链中的一种或多种融合，例如，直接地或经由接头，例如肽接头。然而，在其他实施方案中，本文公开的任何LRP5/6结合域可以与不同的FZD结合域融合或复合以获得改造的WNT激动剂，并且本文公开的任何FZD结合域可以与不同的LRP5/6结合域融合或复合以获得改造的WNT激动剂。可以全部或部分存在于本文公开的改造的WNT激动剂中的多种抗FZD或抗LRP抗体包括在第7,462,697号美国专利、第WO 2019/126399号PCT公开和第WO 2019/126401号PCT公开中描述的那些。第WO 2019/126398号PCT公开中还提供了说明性的形式和序列，其中的每一项都被整体并入本文中。
改造的WNT激动剂可以采用多种不同的结构构象，每种都包含一个或多个，例如两个FZD结合域以及一个或多个，例如，两个)LRP5/6结合域。FZD结合域和LRP5/6结合域可以直接彼此融合，或者经由接头，例如肽接头融合。可选地，FZD结合域和LRP5/6结合域可以相互复合。
在某些实施方案中，改造的WNT激动剂包含两条重链和两条轻链，其中所述轻链包含融合的VHH，并且采用抗体样构象，其中所述两条重链经由二硫键彼此结合，并且所述两条轻链经由二硫键与重链结合。
改造的WNT激动剂可以采用其他抗体样结构或构象，包括在各种功能片段中发现的那些，包括但不限于本文公开的那些中的任一种。
如本领域中熟知的，抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区上的至少表位结合域特异性结合靶标，如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且还包括其含有表位结合域的片段(例如，dAb、Fab、Fab’、(F(ab’)2、Fv、单链(scFv)、骆驼抗体、(Nabs；也称为sdAbs或VHH结构域)、DVD-Igs、其合成的变体、天然存在的变体、包含和表位结合域的融合蛋白质、人源化的抗体、嵌合抗体，以及包含所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。通过基因融合构建的“双抗体”多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448,1993)也是本文考虑的特定抗体形式。本文还包括包含与CH3结构域连接的scFv的小抗体(S.Hu et al.,Cancer Res.,56,3055-3061,1996)。参见例如，Ward,E.S.et al.,Nature 341,544-546(1989)；Bird et al.,Science,242,423-426,1988；Huston et al.,PNAS USA,85,5879-5883,1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；P.Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448,1993；Y.Reiter et al.,Nature Biotech,14,1239-1245,1996；S.Hu et al.,Cancer Res.,56,3055-3061,1996。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生数个片段，其中两个片段(F(ab)片段)各自包含共价异二聚体，其包括完整的抗原结合位点。酶胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供数个片段，包括包含两种抗原结合位点的F(ab')2片段。根据本公开的某些实施方案使用的Fv片段可以通过优先蛋白水解切割IgM而产生，并且在极少数情况下可以通过切割IgG或IgA免疫球蛋白分子而产生。然而，Fv片段更常使用本领域已知的重组技术衍生。Fv片段包括非共价VH::VL异二聚体，其包括保留天然抗体分子的许多抗原识别和结合能力的抗原结合位点。Inbar et al.(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA69:2659-2662；Hochman et al.(1976)Biochem 15:2706-2710；以及Ehrlich et al.(1980)Biochem 19:4091-4096。
在某些实施方案中，本文所述的抗体及其抗原结合片段包括重链和轻链CDR集，其分别插入为CDRs提供支持并定义CDRs相对于彼此的空间关系的重链和轻链构架区(FR)集之间。如本文所用，术语“CDR集”是指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包括六个CDRs，其包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR集。包含单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。对许多抗原-抗体复合物的晶体学分析证明，CDRs的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
如本文所用，术语“FR集”是指构成重链或轻链V区的CDR集的CDRs的框架的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FRs主要负责将V区折叠到抗原结合位点中，特别是直接与CDRs相邻的FR残基。在FRs内，某些氨基残基和某些结构特征是非常高度保守的。在这方面，所有V区序列都包含约90个氨基酸残基的内部二硫环。当V区折叠到结合位点中时，CDRs显示为形成抗原结合表面的突出环基序。通常可以认识到，FRs中存在保守的结构区，其影响CDR环折叠成某些“经典”结构的形状—而与精确的CDR氨基酸序列无关。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链和轻链相互作用的非共价结构域间接触。
“单克隆抗体”是指同质抗体群，其中单克隆抗体由参与表位的选择性结合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)组成。单克隆抗体具有高度特异性，针对单一表位。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且还包括其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、以上的变体、包含单克隆抗体的抗原结合片段的融合蛋白、人源化的单克隆抗体、嵌合单克隆抗体，以及免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，其包含具有所需特异性和结合表位能力的抗原结合片段(表位识别位点)，包括本文公开的改造的WNT激动剂。其不旨在关于抗体来源或其制造方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)为限制性的。该术语包括完整的免疫球蛋白以及上文在“抗体”定义下描述的片段等。
在某些实施方案中，单链Fv或scFV抗体被考虑用于改造的WNT激动剂中。例如，κ抗体(Ill et al.,Prot.Eng.10:949-57(1997))；小抗体(Martin et al.,EMBO J 13:5305-9(1994))；双抗体(Holliger et al.,PNAS 90:6444-8(1993))；或者Janusins(Trauneckeret al.,EMBO J 10:3655-59(1991)和Traunecker et al.,Int.J.Cancer Suppl.7:51-52(1992))，可以根据本申请关于选择具有所需特异性的抗体的教导，使用标准分子生物学技术进行制备。在其他实施方案中，可以制造包含本公开的配体的双特异性或嵌合抗体。例如，嵌合抗体可以包含来自不同抗体的CDRs和框架区，而可以产生双特异性抗体，其通过一个结合域特异性结合一种或多种FZD受体，并通过第二结合域特异性结合第二分子。这些抗体可以通过重组分子生物学技术产生，或者可以物理缀合在一起。
单链Fv(scFv)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其由包括通过肽编码接头连接的编码VH和VL的基因的基因融合物表达。Huston et al.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA85(16):5879-5883。已经描述了许多识别化学结构的方法，以用于将来自抗体V区的天然聚集但化学分离的轻和重多肽链转化为scFv分子，该分子将折叠成实质上类似于抗原结合位点结构的三维结构。参见例如，Huston et al.的第5,091,513号和第5,132,405号美国专利；以及Ladner et al.的第4,946,778号美国专利。
在某些实施方案中，如本文所述的抗体为双抗体的形式。双抗体是多肽的多聚体，每种多肽包含包含免疫球蛋白轻链的结合区的第一结构域和包含免疫球蛋白质重链的结合区的第二结构域，这两个结构域被连接(例如，通过肽接头)，但不能相互结合以形成抗原结合位点：抗原结合位点是通过多聚体内一种多肽的第一结构域与多聚体内另一多肽的第二结构域的结合而形成的(WO94/13804)。
抗体的dAb片段由VH结构域(Ward,E.S.et al.,Nature 341,544-546(1989))组成。
在使用双特异性抗体的情况下，这些抗体可以是常规的双特异性抗体，其可以以多种方式制造(Holliger,P.和Winter G.,Current Opinion Biotechnol.4,446-449(1993))，例如，化学制备或从杂交杂交瘤制备，或者可以是上述的任何双特异性抗体片段。双抗体和scFv可以在没有Fc区的情况下构建，只使用可变结构域，这可能会减少抗独特型反应的影响。
与双特异性完整抗体相反，双特异性双抗体也可能特别有用，因为它们可以很容易地在大肠杆菌(E.coli)中构建和表达。可以容易地使用噬菌体展示(WO94/13804)从文库中选择具有适当结合特异性的双抗体(和许多其他的多肽，如抗体片段)。如果双抗体的一个臂保持恒定，例如，具有针对抗原X的特异性，则可以制备文库，其中改变另一个臂并选择具有适当特异性的抗体。可以通过杵臼改造制备双特异性完整抗体(J.B.B.Ridgeway etal.,Protein Eng.,9,616-621(1996))。
在某些实施方案中，本文所述的抗体可以以的形式提供。是一种去除了铰链区的IgG4抗体(参见GenMab Utrecht,The Netherlands；也参见例如US20090226421)。这项专有的抗体技术创造了一种稳定的、更小的抗体形式，与目前的小抗体形式相比，预计治疗窗口更长。IgG4抗体被认为是惰性的，并因此不与免疫系统相互作用。可以通过消除抗体的铰链区来修饰完整的人IgG4抗体，以获得相对于相应的完整IgG4(GenMab,Utrecht)具有不同稳定性特性的半分子片段。将IgG4分子减半只会在上留下一个可以与同源抗原(例如，疾病靶标)结合的区域，并因此只与靶细胞上的一个位点单价结合。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以采取单结构域(sdAb)或VHH抗体片段(也称为)的形式。sdAb或VHH技术最初是在发现和识别骆驼科(例如，骆驼和美洲驼)具有完整功能的抗体后开发的，这些抗体仅由重链组成，并因此缺乏轻链。这些仅重链抗体包含单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2、CH3)。克隆和分离的单个可变结构域具有完整的抗原结合能力，并且非常稳定。这些单一可变结构域利用其独特的结构和功能特性，形成了的基础。sdAbs或VHHs由单个基因编码，并且在几乎所有的原核和真核宿主，例如大肠杆菌(参见例如，第6,765,087号美国专利)、霉菌(例如曲霉菌(Aspergillus)或木霉(Trichoderma))和酵母(例如酵母菌(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyvermyces)、汉逊酵母(Hansenula)或毕赤酵母(Pichia)(参见例如，第6,838,254号美国专利)中有效地产生。生产过程是可扩展的，并且已经生产了数千克量的sdAbs或VHH可以配制成具有长保质期的即用型溶液。方法(参见例如，WO 06/079372)是一种基于B细胞的自动化高通量选择的产生针对所需靶标的的专有方法。sdAbs或VHH是骆驼特异性仅重链抗体的单结构域抗原结合片段。
考虑到的另一种抗体片段是双可变结构域-免疫球蛋白(DVD-Ig)，它是一种改造的蛋白质，将两种单克隆抗体的功能和特异性结合在一个分子实体中。DVD-Ig被设计为IgG样分子，除了每条轻链和重链包含通过短肽连接串联的两个可变结构域之外，而不是IgG中的一个可变结构域。两个可变结构域的融合方向和接头序列的选择对分子的功能活性和有效表达至关重要。DVD-Ig可以通过常规哺乳动物表达系统作为单一种类产生，以用于制造和纯化。DVD-Ig具有亲本抗体的特异性，在体内稳定，并表现出IgG样物理化学和药代动力学特性。DVD-Igs及其制备方法描述于Wu,C.,et al.,Nature Biotechnology,25:1290-1297(2007))中。
在某些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段是人源化的。这是指通常使用重组技术制备的嵌合分子，其具有来源于非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白结构和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含接枝到可变结构域中的适当框架区上的CDRs。表位结合位点可以是野生型的或通过一个或多个氨基酸取代而被修饰。这消除了人类个体中作为免疫原的恒定区，但存在对外来可变区产生免疫反应的可能性(LoBuglio,A.F.et al.,(1989)Proc Natl Acad Sci USA86:4220-4224；Queen et al.,PNAS(1988)86:10029-10033；Riechmann et al.,Nature(1988)332:323-327)。
另一种方法不仅聚焦于提供人类来源的恒定区，而且还对可变区进行修饰，以便将它们重塑为尽可能接近人类形式。已经了解到，重链和轻链的可变区都包含三个互补决定区(CDRs)，这些互补决定区对目标表位的反应不同，并决定结合能力，两侧是在给定物种中相对保守，并假定为CDRs提供支架的四个框架区(FRs)。当针对特定表位制备非人类抗体时，可以通过将来源于非人类抗体的CDRs接枝到待修饰的人类抗体中存在的FRs上，来“重塑”或“人源化”可变区。以下文献已报导了该方法在各种抗体中的应用：Sato,K.,et al.,(1993)Cancer Res 53:851-856；Riechmann,L.,et al.,(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.,et al.,(1988)Science 239:1534-1536；Kettleborough,C.A.,et al.,(1991)Protein Engineering 4:773-3783；Maeda,H.,et al.,(1991)Human AntibodiesHybridoma 2:124-134；Gorman,S.D.,et al.,(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185；Tempest,P.R.,et al.,(1991)Bio/Technology 9:266-271；Co,M.S.,et al.,(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873；Carter,P.,et al.,(1992)Proc Natl Acad SciUSA89:4285-4289；以及Co,M.S.et al.,(1992)J Immunol 148:1149-1154。在一些实施方案中，人源化的抗体保留所有CDR序列(例如，包含来自小鼠抗体的所有六种CDRs的人源化小鼠抗体)。在其他实施方案中，人源化的抗体具有相对于原始抗体改变的一种或多种CDRs(一种、两种、三种、四种、五种、六种)，其也被称为“来源于”来自原始抗体的一种或多种CDRs的一种或多种CDRs。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是嵌合抗体。在这方面，嵌合抗体由与不同抗体的异源Fc部分可操作地连接或以其他方式融合的抗体的抗原结合片段组成。在某些实施方案中，异源Fc结构域是人类来源的。在其他实施方案中，异源Fc结构域可以来自与亲本抗体不同的Ig类别，包括IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。在其他实施方案中，异源Fc结构域可以由来自一种或多种不同Ig类别的CH2和CH3结构域组成。如上文关于人源化抗体所述的，嵌合抗体的抗原结合片段可以仅包含本文所述抗体的一个或多个CDRs(例如，本文所述抗体的1、2、3、4、5或6个CDRs)，或者可以包含整个可变结构域(VL、VH或两者)。
免疫球蛋白CDRs和可变结构域的结构和位置可以通过参考以下文献来确定：Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest.第4版.USDepartment of Health and Human Services.1987，以及其更新，现在可在互联网(immuno.bme.nwu.edu)上获得。
在一些实施方案中，改造的WNT激动剂包含一个或多个Fab或其抗原结合片段，以及一个或多个VHH或sdAb或其抗原结合片段(或者可选地，一个或多个scFv或其抗原结合片段)。在某些实施方案中，Fab特异性结合一种或多种FZD受体，并且VHH或sdAb(或scFv)特异性结合LRP5和/或LRP6。在某些实施方案中，Fab特异性结合LRP5和/或LRP6，并且VHH或sdAb(或scFv)特异性结合一种或多种FZD受体。在某些实施方案中，VHH或sdAb(或scFv)融合至Fab的N端，而在一些实施方案中，VHH或sdAb(或scFv)融合至Fab的C端。在特定实施方案中，Fab以完整IgG形式存在，并且VHH或sdAb(或scFv)融合至IgG轻链的N端和/或C端。在特定实施方案中，Fab以完整IgG形式存在，并且VHH或sdAb(或scFv)融合至IgG重链的N端和/或C端。在特定实施方案中，两种或更多种VHH或sdAb(或scFvs)在这些位置的任意组合处融合至IgG。
可以将Fabs转化为包括Fab和Fc片段的完整IgG形式，例如，使用遗传改造以产生包含融合至Fc区的Fab的融合多肽，即Fab以完整IgG形式存在。完整IgG形式的Fc区可来源于多种不同Fcs中的任何一种，包括但不限于野生型的或修饰的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他同种型，例如，野生型的或修饰的人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、人IgG4Pro(包含防止IgG4半分子形成的核心铰链区中的突变)、人IgA、人IgE、人IgM或称为IgG1 LALAPG的修饰的IgG1。L235A、P329G(LALA-PG)变体已被证明可消除鼠IgG2a和人IgG1中的补体结合和固定以及Fc-γ依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。这些LALA-PG取代允许在小鼠和灵长类动物之间更准确地转化利用“无效应子(effectorless)”抗体框架支架产生的结果。在本文公开的任何IgG的特定实施方案中，IgG包含以下氨基酸取代中的一种或中：N297G、N297A、N297E、L234A、L235A或P236G。
提供了对一种或多种Fzd受体和LRP5和/或LRP6为二价的二价和双特异性改造的WNT激动剂的非限制性实例，包括但不限于表3中提供的那些。VHH或sdAb(或scFvs)可以与两条轻链的N端、两条重链的N端、两条轻链的C端或两条重链的C端融合。还考虑了，例如，VHH或sdAb(或scFvs)可以与重链和/或轻链的N端和C端、轻链和重链的N端、重链和轻链的C端、重链的N端和轻链的C端，或者重链的C端和轻链的N端融合。在其他相关的实施方案中，两种或更多种VHH或sdAb(或scFvs)可以任选地经由接头部分融合在一起，并在这些位置中的一个或多个处与Fab或IgG融合。在相关的实施方案中，改造的WNT激动剂具有异源IgG形式，而Fab作为半抗体存在，并且一种或多种VHH或sdAb(或scFv)与Fc的N端、Fab的N端、Fc的C端或Fab的C端中的一个或多个融合。在某些实施方案中，将Fab或其抗原结合片段(或IgG)直接融合到VHH或sdAb(或scFv)或其抗原结合片段，而在其他实施方案中，经由接头部分融合结合区。
在各种实施方案中，改造的WNT激动剂包含与一种或多种FZD受体结合的一种或多种Fab或其抗原结合片段，以及与LRP5和/或LRP6结合的一种或多种Fab或其抗原结合片段。在某些实施方案中，其包含结合一种或多种FZD受体的两个Fab或其抗原结合片段和/或结合LRP5和/或LRP6的两个Fab或其抗体结合片段。在特定实施方案中，一种或多种Fab以完整IgG形式存在，并且在某些实施方案中，两种Fab均以完整IgG形式存在。在某些实施方案中，完整IgG形式的Fab特异性结合一种或多种FZD受体，并且另一种Fab特异性结合LRP5和/或LRP6。在某些实施方案中，Fab特异性结合一种或多种FZD受体，并且完整IgG形式的Fab特异性结合LRP5和/或LRP6。在某些实施方案中，Fab特异性结合LRP5和/或LRP6，并且完整IgG形式的Fab特异性结合一种或多种FZD受体。在某些实施方案中，Fab任选地经由接头融合到IgG的N端，例如，融合到重链或轻链N端。在某些实施方案中，Fab与IgG重链的N端融合，并且不与轻链融合。在特定实施方案中，两条重链可以直接或经由接头融合在一起。在其他相关的实施方案中，两个或更多个VHH或sdAb可以任选地经由接头部分融合在一起，并且在这些位置中的一个或多个处与Fab或IgG融合。在相关实施方案中，改造的WNT激动剂具有异源IgG形式，而一种Fab作为半抗体存在，且另一种Fab与Fc的N端、Fab的N端或Fc的C端中的一个或多个融合。在某些实施方案中，Fab或其抗原结合片段直接与另一Fab或IgG或其抗原结合片段融合，而在其他实施方案中，结合区经由接头部分融合。
在某些实施方案中，本发明的WNT激动剂可以具有、包含本文的任何表、图或实施例中提供的任何序列或其功能片段或变体，或者由本文的任何表、图或实施例中提供的任何序列或其功能片段或变体组成。
在某些实施方案中，FZD结合域、LRP5/6结合域和/或改造的WNT激动剂以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小，或者约10nM或更小的解离常数(KD)结合。例如，在某些实施方案中，本文所述的与超过一种FZD结合的FZD结合域或抗体以约l00nM或更小、约20nM或更小，或者约10nM或更小的KD与那些FZDs结合。在某些实施方案中，结合域以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小，或者约1nM 20或更小的EC50与一种或多种其靶抗原结合。
本发明的改造的WNT激动剂、其结合域、抗体或其他试剂可通过本领域已知的任何方法进行特异性结合测定。可使用的免疫测定包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，其使用的技术如BIAcore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。这样的测定是常规的并且是本领域中熟知的(参见例如，Ausubel et al,编辑,1994,CurrentProtocols in Molecular Biology,第1卷,John Wiley&Sons,Inc.,New York，其通过引用整体并入本文中)。
例如，可以使用ELISA测定抗体与靶抗原的特异性结合。ELISA测定包括制备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向孔中加入与可检测化合物如酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)缀合的抗体或其他结合剂，孵育一段时间，并检测抗原的存在。在一些实施方案中，抗体或试剂不与可检测的化合物缀合，而是将识别第一抗体或试剂的第二缀合抗体添加到孔中。在一些实施方案中，代替用抗原包被孔，可以将抗体或试剂包被到孔上，并且可以在将抗原添加到包被的孔之后，添加与可检测化合物缀合的第二抗体。本领域技术人员将了解关于可被修改以增加检测到的信号的参数以及本领域已知的ELISAs的其他变型(参见例如，Ausubel et al,编辑,1994,Current Protocols in MolecularBiology,第1卷,John Wiley&Sons,Inc.,New York,11.2.1)。
可以通过竞争性结合测定法确定抗体或其他试剂与靶抗原的结合亲和力和抗体-抗原相互作用的解离率。竞争性结合测定法的一个实例是放射免疫测定法，其包括在存在增加量的未标记抗原的情况下将标记的抗原(例如，FZD、LRP)或其片段或变体与目标抗体一起孵育，然后检测与标记的抗原结合的抗体。可以通过斯卡查德图分析从数据中确定抗体的亲和力和结合解离率。在一些实施方案中，将BIAcore动力学分析用于确定抗体或试剂的结合率和解离率。BIAcore动力学分析包括分析抗体与在其表面上固定有抗原的芯片的结合和解离。
本发明的改造的WNT激动剂在结合一种或多种FZD受体和LRP5和LRP6中的一种或多种以及激活WNT信号传导方面具有生物活性。术语“WNT激动剂活性”是指激动剂模拟WNT蛋白与卷曲蛋白和/或LRP5或LRP6结合的影响或活性的能力。本文公开的改造的WNT激动剂模拟WNT活性的能力可以通过多种测定来证实。WNT激动剂通常引发与受体的天然配体引发的反应或活性相似或相同的反应或活性。特别地，本文公开的WNT激动剂激活、增强或增加经典WNT/β-连环蛋白信号传导通路。如本文所用，术语“增强”是指WNT/β-连环蛋白信号传导水平相比不存在WNT激动剂，例如本文公开的改造的WNT激动剂情况下的水平的可测量的增加。在特定实施方案中，相比不存在改造的WNT激动剂情况下，例如，在相同的细胞类型中的WNT/β-连环蛋白信号传导水平，WNT/β-连环蛋白信号传导水平的增加为至少10％、至少20％、至少50％、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少两倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。测量WNT/β-连环蛋白信号传导的方法是本领域已知的，并且包括本文所述的那些。
在特定实施方案中，本文公开的改造的WNT激动剂是双特异性的，即它们特异性结合两种或更多种不同的表位，例如一种或多种FZD受体，以及LRP5和/或LRP6。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂结合FZD5和/或FZD8，以及LRP5和/或LRP6。
在特定实施方案中，本文公开的改造的WNT激动剂是多价的，例如，它们包含各自特异性结合相同表位的两个或更多个区域，例如，结合一种或多种FZD受体内的表位的两个或更多个区域和/或结合LRP5和/或LRP6内的表位的两个或更多个区域。在特定实施方案中，它们包含与一种或多种FZD受体内的表位结合的两个或更多个区域和与LRP5和/或LRP6内的表位结合的两个或更多个区域。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂包含的结合一种或多种FZD受体的区域数量与结合LRP5和/或LRP6的区域数量的比例为或约为：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、2:3、2:5、2:7、7:2、5:2、3:2、3:4、3:5、3:7、3:8、8:3、7:3、5:3、4:3、4:5、4:7、4:9、9:4、7:4、5:4、6:7、7:6、1:2、1:3、1:4、1:5或1:6。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂是双特异性和多价的。
在某些方面，本公开提供了能够以组织或细胞特异性方式增强WNT活性的新的组织特异性WNT信号增强分子。这些可以单独使用或与本文公开的一种或多种改造的WNT激动剂组合使用。在某些实施方案中，组织特异性WNT信号增强分子是双功能分子，其包含结合一种或多种ZNRF3和/或RNF43连接酶的第一结构域，以及以组织或细胞特异性方式结合一种或多种靶向组织或细胞类型的第二结构域。第一结构域和第二结构域中的每一个可以分别是能够结合连接酶复合物或靶向组织或细胞的任何部分。例如，第一结构域和第二结构域中的每一个可以是但不限于选自以下的部分：多肽(例如，抗体或其抗原结合片段或不同于抗体的肽或多肽)、小分子和天然配体或其变体、片段或衍生物。在某些实施方案中，天然配体是多肽、小分子、离子、氨基酸、脂质或糖分子。第一结构域和第二结构域可以是彼此相同类型的部分，或者它们可以是不同类型的部分。在某些实施方案中，组织特异性WNT信号增强分子与组织或细胞特异性细胞表面受体结合。在特定实施方案中，组织特异性WNT信号增强分子将WNT信号传导增加或增强至少50％、至少两倍、至少三倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至少50倍，例如，相比阴性对照。
组织特异性WNT信号增强分子可以具有不同的形式。在特定实施方案中，组织特异性WNT信号增强分子是融合蛋白，其包含结合ZNRF3/RNF43的第一多肽序列，以及以组织或细胞特异性方式结合一种或多种靶向组织或细胞类型的第二多肽序列。在某些实施方案中，这两种多肽序列可以直接或经由接头融合。在某些实施方案中，组织特异性WNT信号增强分子包含两种或更多种多肽，如包含两种或更多种融合蛋白的二聚体或多聚体，每种融合蛋白包含第一结构域和第二结构域，其中两种或更多种多肽被连接，例如通过接头部分或经由两种或更多种多肽中的每种中的氨基酸残基之间的键，例如半胱氨酸残基之间的分子间二硫键。
在特定实施方案中，组织特异性WNT信号增强分子是包含抗体重链和轻链(或其抗原结合片段)的抗体，所述抗体重链或轻链构成第一结构域或第二结构域，其中另一个结构域(即第二结构区或第一结构域)连接到抗体重链或轻链，作为融合蛋白或经由接头部分。在特定实施方案中，另一个结构域连接到重链的N端、重链的C端、轻链的N端或轻链的C端。这种结构在本文中可以称为附加的IgG支架或形式。例如，组织特异性WNT信号增强分子可以是结合ZNRF3/RNF43的抗体，其中结合组织或细胞特异性受体的结合域融合或附加到结合ZNRF3/RNF43的抗体的重链或轻链上。在另一实例中，组织特异性WNT信号增强分子可以是结合组织或细胞特异性受体的抗体，其中结合ZNRF3/RNF43的结合域融合或附加到结合组织或细胞核特异性受体的抗体的重链或轻链上。
在特定实施方案中，肠特异性WNT信号增强分子是结合GPA33、CDH17、MUC-13的抗体或其抗原结合片段，其中结合ZNRF3/RNF43的结合域融合或附加到抗体或其抗体结合片段的重链或轻链上。在特定实施方案中，结合ZNRF3/RNF43的结合域包含Fu1和Fu2结构域，其中Fu1和Fu2结构域任选包含一个或多个氨基酸修饰，包括本文公开的那些中的任一种，例如F105R和/或F109A。
在某些实施方案中，组织特异性WNT信号增强分子包含结合ZNRF3/RNF43的第一结构域(“作用模块”)和结合组织或细胞特异性受体的第二结构域(“靶向模块”)，例如具有高亲和力。在某些实施方案中，这两种结构域中的每一种在通过自身增强WNT信号方面具有实质性降低的活性或是无活性的。然而，当组织特异性WNT信号增强分子与表达组织特异性受体的靶组织接合时，E3连接酶ZNRF3/RNF43被募集到具有组织特异性受体的三元复合物，导致它们经由受体介导的内吞作用被隔离和/或从细胞表面清除。最终结果是以组织特异性的方式增强WNT信号。
在某些实施方案中，作用模块是与ZNRF3/RNF43 E3连接酶的结合剂，并且其可以基于R-脊椎蛋白，例如R-脊椎蛋白1-4，包括但不限于人R-脊椎蛋白1-4进行设计。在某些实施方案中，作用模块是R-脊椎蛋白，例如野生型R-脊椎蛋白1-4，任选地人R-脊椎蛋白1-4，或者其变体或片段。在特定实施方案中，它是与相应的野生型R-脊椎蛋白1-4序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的R-脊椎蛋白1-4中的任一种的变体。在某些实施方案中，作用模块包含结合ZNRF3/RNF43的R-脊椎蛋白，例如R-脊椎蛋白1-4中的任一种的Furin结构域1，或者由其组成。还可以使用Furin结构域1的延伸形式(包括但不限于具有不再结合LGR4-6或与LGR4-6具有减少的结合的突变Furin结构域2的那些)或改造的抗体或任何其他衍生物或与能够特异性结合ZNRF3/RNF43的抗体不同的任何改造的多肽。在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白的一个或多个Furin结构域1。
在某些实施方案中，作用模块不包含R-脊椎蛋白的Furin结构域2，或者其包含R-脊椎蛋白的修饰的或变体Furin结构域2，例如相比野生型Furin结构域2具有降低的活性的Furin结构域2。在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白的Furin结构域1而非Furin结构域2。在某些实施方案中，作用模块包含两个或更多个Furin结构域1或Furin结构域1的多聚体。作用结构域可包含R-脊椎蛋白的一个或多个野生型Furin结构域1。在特定实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白的修饰的或变体Furin结构域1，其相比野生型Furin结构域1具有增加的活性，例如与ZNRF3/RNF43结合。可以识别具有增加的与ZNRF3/RNF43的结合的变体，例如通过筛选包含R-脊椎蛋白Furin结构域1的变体的噬菌体或酵母展示文库。也可以通过筛选识别与R-脊椎蛋白Furin结构域1无关但与ZNRF3/RNF43结合增加的肽或多肽。作用模块还可以包含另外的部分或多肽序列，例如另外的氨基酸残基，以稳定作用模块或其存在的组织特异性WNT信号增强分子的结构。
在其他实施方案中，作用模块包含另一抑制性部分，如核酸分子，其降低或阻止ZNRF3/RNF43活性或表达，例如反义寡核苷酸；小干扰RNA(siRNA)；短发夹RNA(shRNA)；microRNA(miRNA)；或者核酶。如本文所用，“反义”是指与核酸序列互补的核酸序列，无论长度如何。在某些实施方案中，反义RNA是指单链RNA分子，其可被引入单个细胞、组织或对象，并通过不一定依赖内源性基因沉默通路的机制导致靶基因表达降低。反义核酸可以包含修饰的主链，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其他物质，或者可以包含非天然的核苷间链接。反义核酸可以包含例如锁核酸(LNA)。在特定实施方案中，另一抑制剂部分抑制ZNRF3/RNF43中的一种或两种的活性，或者其抑制ZNRF3/RNF43中的一种或两种的基因、mRNA或蛋白质表达。在某些实施方案中，抑制性部分是与ZNRF3/RNF43基因或mRNA或其互补物结合的核酸分子。
在某些实施方案中，靶向模块特异性结合细胞特异性表面分子，例如细胞特异性表面受体，并且可以是例如天然配体、抗体或合成化学物质。在特定实施方案中，细胞特异性表面分子优先在靶器官、组织或细胞类型，例如，希望其增强WNT信号传导的器官、组织或细胞类型上表达，例如，以治疗或预防疾病或病症。在特定实施方案中，例如，相比一种或多种其他非靶向器官、组织和细胞类型，细胞特异性表面分子在靶器官、组织或细胞类型，例如，希望其增强WNT信号传导的器官、组织和细胞类型上具有增加或增强的表达，例如，以治疗或预防疾病或病症。例如，在特定实施方案中，如果相比细胞表面受体在一种或多种、五种或更多种、所有其他的器官、组织或细胞中的表达，或者所有其他的器官、组织或细胞的平均值，细胞表面受体分别在靶器官、组织或细胞中以高出至少两倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍的水平表达，则认为细胞表面受体是组织特异性的或细胞特异性的细胞表面分子。在某些实施方案中，组织特异性或细胞特异性细胞表面分子是细胞表面受体，例如多肽受体，其包含位于细胞表面膜内的区域和靶向模块可结合的细胞外区域。在各种实施方案中，可以通过特异性靶向仅在靶组织或包括靶组织的组织子集上表达的细胞表面分子，或者通过特异性靶向相比所有、大多数或大量数量的其他组织，在靶组织上具有更高水平的表达，例如，相比在至少两种、至少五种、至少十种或至少二十种其他组织上，在靶组织上具有更高表达的细胞表面分子，来实践本文所述的方法。
组织特异性和细胞特异性细胞表面受体在本领域是已知的。组织和细胞特异性表面受体的实例包括但不限于GPA33、CDH17和MUC-13。在某些实施方案中，靶向模块包含特异性结合这些肠特异性受体的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，改造的WNT激动剂的组分和WNT信号增强分子可以结合以赋予更多的组织特异性。
本发明部分基于将改造的WNT激动剂用于调节胃肠道上皮增殖，特别是在炎症性肠病中。
在一实施方案中，本发明提供了治疗患有胃肠道病症的对象的方法，包括向对象给予改造的WNT信号传导调节剂。
在某些实施方案中，改造的WNT激动剂包含结合一种或多种FZD受体(FZD1-10)的一个或多个结合域和结合一种或多种LRP(LRP5-6)受体的一个或多个结合域。在其他实施方案中，改造的WNT激动剂的结合域包含：结合FZD5、FZD8、FZD1、FZD2、FZD7、FZD5,8、FZD1,2,7或FZD1,2,7,5,8；FZD4；FZD9；或者FZD10的一个或多个结合域；以及结合LRP5、LRP6或LRP5和6的一个或多个结合域。在其他实施方案中，改造的WNT激动剂包含结合FZD5和/或FZD8的一个或多个结合域；以及结合LRP5和/或LRP6的一个或多个结合域。在其他实施方案中，改造的WNT激动剂包含结合FZD5和FZD8的结合域，以及结合LRP6的结合域。在其他实施方案中，WNT激动剂包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15或17的重链序列或来源于其的可变重链区；以及SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16或18的轻链序列，或者来源于其的可变轻链区。
在一些实施方案中，改造的WNT激动剂包含组织靶向分子。在其他实施方案中，组织靶向分子是结合组织特异性细胞表面抗原的抗体或其片段。在一些实施方案中，组织靶向分子选自细胞表面A33抗原(GPA33；代表性序列是NCBI多肽参考序列NP_005805.1)、钙粘蛋白-17(CDH17；代表性序列是NCBI多肽参考序列NP_004054.3)和粘蛋白13(细胞表面相关的(Muc-13；代表性序列是NCBI多肽参考序列NP_149038.3)或以上的功能片段或变体。在某些实施方案中，WNT激动剂与特异性结合炎症分子的结合域一起施用。在其他实施方案中，特异性结合炎症分子的结合域是炎症分子的拮抗剂。在其他实施方案中，炎症分子的拮抗剂是TNFα、IL-12、IL-12和IL-23或IL-23的拮抗剂。
在另一相关的实施方案中，本公开提供了一种组合分子，其包含：a)本文公开的改造的WNT激动剂；以及b)改造的WNT信号增强分子，其包含结合一种或多种E3泛素连接酶的第一结构域；以及与组织特异性受体结合的第二结构域。
在相关的实施方案中，本公开提供了特异性结合卷曲蛋白5(FZD5)和卷曲蛋白8(FZD8)的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NOs:1-18中任一项中所述的序列具有至少80％、至少90％、至少95％或至少98％同源性的一条或多条序列。在一些实施方案中，多肽包含抗体或抗体结合片段，例如一条或多条可变重链或可变轻链。在一些实施方案中，所述抗体或抗体结合片段包含以下序列组合中的任一项中存在的CDRs中的至少5个或所有6个：SEQ ID NO:1和2；SEQ ID NO:3和4；SEQ IDNO:5和6；或者SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16，或者SEQ ID NO:17和18。在一些实施方案中，所述多肽包含存在于任何这些序列组合中的CDRs中的6个，其中一个或多个CDRs包含一个、两个或三个氨基酸修饰，任选点突变、氨基酸缺失或氨基酸插入。
本公开还提供了组合分子，其包含：本文公开的改造的WNT激动剂；以及包含结合一种或多种E3泛素连接酶的第一结构域的改造的WNT信号增强分子；以及结合组织特异性受体的第二结构域。
在一些实施方案中，本公开的改造的WNT激动剂促进向肠细胞的细胞分化(例如，胃肠细胞、干细胞和/或上皮细胞)。在一些实施方案中，基于肠细胞前体的百分比来确定细胞分化。在一些实施方案中，采用基于时间戳的方法来确定细胞向肠细胞的分化。在一些实施方案中，为了补充基于时间戳的细胞分化的观察，采用了谱系轨迹推断工具slingshot。在一些实施方案中，slingshot预测来自初始起始组的细胞分化的方向。在说明性的实例中，slingshot预测的细胞将在一个方向上向TA1、杯状、簇状和肠内分泌细胞进展，并在另一个方向上向肠细胞进展。在一些实施方案中，预测的谱系轨迹假时间值显示相对于对照处理的细胞，在肠细胞谱系轨迹中更靠前的改造的WNT激动剂处理的样品的百分比更高；图28E提供了预测的伪时间值的说明性实例。在一些实施方案中，对肠细胞谱系的这种预测与实际的时间戳数据一致。
在一些实施方案中，验证分化改善的可靠标准是在诱导损伤后的给定日期，相对于对照组，改造的WNT激动剂处理组中成熟、分化的细胞类型标志物的表达看起来更像原始、未受损的结肠。在一些实施方案中，在改造的WNT激动剂处理后6天观察到分化改善。在一些实施方案中，改造的WNT激动剂处理的样品包括肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞、簇状细胞或以上的组合。
本文公开的证据表明，本公开的Wnt模拟分子具有所需的特性，包括将患病肠组织恢复回到正常生理的能力。在一些实施方案中，使用本公开的Wnt模拟物(例如，R2M13-26或R2M13-h26)的短期处理诱导上皮组织的快速恢复。在一个说明性的实例中，在严重DSS模型中，以不同剂量单次注射R2M13-26恢复了受损结肠组织的正常组织学。在处理6天内，R2M13-h26完全恢复了在急性DSS模型中严重受损的上皮屏障。
除了屏障和结肠组织修复，在一些实施方案中，用本公开的Wnt模拟物处理还降低了炎性细胞因子和疾病活动指数，表明消除了屏障破坏、微生物病原体入侵、组织炎症和损伤的恶性循环。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物直接影响上皮细胞，扩大祖细胞库并加速分化为所有成熟分化的细胞类型。在一些实施方案中，本公开的Wnt模拟物恢复受损结肠组织中的Wnt信号和干细胞生态位，而在修复后对隐窝没有额外的影响。
在一些实施方案中，单独用本公开的Wnt模拟物处理对正常肠上皮没有影响。在这样的实施方案中，RSPO可以诱导增生。总之，本公开提供了具有最佳组织修复和生理活性的Wnt激活剂。
在一个说明性的例子中，用Fzd5,8特异性Wnt模拟物R2M13-26处理导致粘膜快速愈合，在数天内改善了组织组织学和疾病活性，同时减少了炎症和结肠炎症状。在该损伤模型中，R2M13-26在给药后不久主要影响上皮。上皮中的Wnt靶基因如Axin2在处理后24小时增加，这表明利用FZD受体特异性是指导组织层特异性通路激活的可行选择。在诱导Wnt靶基因的同时，R2M13-26在广泛的祖细胞中引起细胞周期基因表达的强劲增加，无论是对损伤有反应的正常干细胞/祖细胞，还是在与去分化一致的改变的细胞状态中。这些转录组变化表现为祖细胞库的短暂扩增和加速分化为结肠上皮的适当分泌和吸收谱系，以及重新建立上皮屏障。其次，这种对上皮再生和屏障恢复的直接影响导致炎症信号和浸润免疫细胞的减少。
损伤/损害情况可能为上皮祖细胞扩增奠定基础。如所附实施例中所公开的，除了影响发育信号传导通路如EGF和Notch，损伤还在所有组织层中引起炎症反应。在上皮中，干扰素-γ和NF-κB通路在损伤后是活跃的，并且最近在其他干细胞小生境中的工作表明，炎症信号传导可以促进对损伤的初始增殖反应(M.Chen,Reed,&Lane,2017；Kyritsis etal.,2012)。NF-kB和Wnt通路的一起激活甚至可能促进肠道中向祖细胞去分化的过程(Schwitalla et al.,2013)。在一个说明性的例子中，在本公开的DSS模型中，结肠上皮中Wnt信号传导大幅减少，这可能是由于特定Wnts的表达减少和数种Wnt拮抗剂的增加所致。在该说明性的例子中，R2M13-h26能够克服这种Wnt信号传导缺陷。因此，R2M13-h26诱导的Wnt通路激活可能与这些炎症信号协同作用，以增强祖细胞增殖，尽管是短暂的。
与影响未受伤和受损上皮的RSPO的影响不同(Kim et al.,2005；Yan KelleyS.et al.,2017；Zhao et al.,2007)，与本公开的Wnt模拟物的靶向的、受体水平的Wnt信号传导激动作用可促进受损组织环境中的特定隐窝增殖。在一个说明性的例子中，当在DSS模型中将Wnt模拟物R2M13-26与RSPO2一起引入时，在小肠和结肠中观察到广泛的增殖。尽管在小鼠中观察到RSPO对DSS诱导的结肠炎的改善，但RSPO治疗也出现了过度增殖。发明人惊奇地发现，Wnt模拟物本身能够特异性地诱导受损结肠中β-连环蛋白靶基因的表达和上皮细胞的增殖。
在一个说明性的例子中，R2M13-26激活Wnt通路不会导致隐窝过度增殖或扩增。这不仅与RSPO治疗形成鲜明对比，而且还与可遗传的遗传突变体的影响形成鲜明对比。如先前报导的，当负调节因子Apc被基因消融或β-连环蛋白的组成型活性突变体被表达时，隐窝以不受控制的方式增殖，无法分化(Barker Nick et al.,2009；Krausova&Korinek,2014；Mah,Yan,&Kuo,2016)。然而，本公开的Wnt模拟物通过模拟内源性Wnt信号传导并在受体水平上启动通路激活而避免了这些结果，这与绕过负反馈的永久性遗传改变形成对比。R2M13-26通过在受体水平上影响通路，而允许负反馈机制发挥作用。在该说明性的例子中，Axin2被诱导，有助于破坏复合体；也是Wnt靶基因的E3泛素连接酶Rnf43的表达增加，这促进了FZD受体从细胞表面的去除。此外，在该说明性的例子中，R2M13-26增加了细胞周期蛋白依赖性激酶的一些抑制剂的表达，潜在地限制了增殖。
IV.药物组合物
还公开了包含本文所述的改造的WNT激动剂分子和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。在另一实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含本文公开的多肽、改造的WNT激动剂或组合分子，以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
在其他实施方案中，还公开了包含多核苷酸和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，所述多核苷酸包含编码本文所述的WNT激动剂分子(或其多肽链)的核酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸是DNA或mRNA，例如修饰的mRNA。在特定实施方案中，多核苷酸是还包含5’帽序列和/或3’尾序列，例如多聚A尾的修饰的mRNAs。在其他实施方案中，多核苷酸是包含可操作地连接到编码序列的启动子的表达盒。
在一些实施方案中，WNT激动剂是改造的重组多肽，其包含与WNT信号通路中的各种分子结合的各种表位结合片段。例如，FZD和LRP抗体片段(例如，Fab、scFv、sdAbs、VHH等)可以在一个分子上直接连接在一起或利用各种大小的接头连接在一起。
类似地，多肽如RSPO可以被改造以包含针对组织特异性细胞表面抗原，例如MUC-13的抗体或其片段。RSPO也可以与E3连接酶ZNRF3/RNF43的增强子同时或顺序给药。E3连接酶增强子可以是结合ZNRF3/RNF43并增强E3连接酶类活性的激动剂抗体或片段。
相反，WNT激动剂也可以是包含表位结合片段的重组多肽，所述表位结合片段与WNT信号传导通路中的各种分子结合并增强WNT信号传导。例如，WNT激动剂可以是与FZD受体和/或LRP受体结合并增强WNT信号传导的抗体或其片段。FZD和LRP抗体片段(例如，Fab、scFv、sdAbs或VHHs等)可以在一个分子上直接连接在一起或利用各种大小的接头连接在一起。
在其他实施方案中，还公开了包含表达载体，例如病毒载体的药物组合物，所述表达载体包含多核苷酸和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，所述多核苷酸包含编码本文所述的WNT激动剂分子的核酸序列。
本公开还考虑了包含细胞的药物组合物，所述细胞包含表达载体，所述表达载体包含多核苷酸和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，所述多核苷酸包含可操作地连接到编码WNT激动剂分子的核酸的启动子。在特定实施方案中，药物组合物还包含细胞，所述细胞包含表达载体，所述表达载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接到编码WNT激动剂的核酸序列的启动子。在特定实施方案中，细胞是从待治疗的对象获得的异源细胞或自体细胞。
题述分子可以单独或组合地与药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和用于制备通常安全、无毒和理想的制剂的试剂组合，并包括对于哺乳动物，例如人类或灵长类动物使用可接受的赋形剂。这种赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下是气体。这种载体、稀释剂和赋形剂的实例包括但不限于水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。补充活性化合物也可以掺入制剂中。用于制剂的溶液或悬浮液可以包括无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；洗涤剂如Tween20以防止聚集；以及用于调节张力的化合物，如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。在特定实施方案中，药物组合物是无菌的。
药物组合物还可以包括无菌水溶液或分散剂和无菌粉末，以用于临时制备无菌注射溶液或分散剂。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些情况下，组合物是无菌的，并且可以是流体，使得它可以被吸入注射器中或从注射器递送到对象。在某些实施方案中，它在制造和储存条件下是稳定的，并且被保存以抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是例如含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及以上的合适混合物的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的涂层、通过在分散的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌和抗真菌剂来实现预防微生物的作用，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、聚醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现内部组合物的延长吸收。
可以根据需要，通过将所需量的改造的WNT激动剂，例如抗体或其抗原结合片段(或编码多核苷酸或包含其的细胞)与上文列举的一种成分或成分的组合一起掺入合适的溶剂中，然后进行过滤灭菌，来制备无菌溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物包含基础分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。
在一实施方案中，用载体制备药物组合物，所述载体将保护抗体或其抗原结合片段免于从体内快速消除，如控释制剂，包括植入物和微胶囊递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。这些材料也可以商购获得。脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。
为了给药方便和剂量均匀，以剂量单位形式配制药物组合物可能是有利的。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗对象的单一剂量的物理上离散的单位；每个单元包含经计算以产生与所需药物载体相关的所需治疗效果的预定量的活性抗体或其抗原结合片段。剂量单位形式的规格由抗体或其抗原结合片段的独特特征和要达到的特定治疗效果，以及将这种活性抗体或其抗体结合片段复合用于治疗个体的技术中固有的局限性决定，并直接取决于此。
药物组合物可与给药说明书一起被包括在容器、包装或分配器，例如注射器，例如预填充注射器中。
本公开的药物组合物包含任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或者任何其他化合物，其在给予至包括人的动物时能够(直接或间接地)提供生物活性抗体或其抗原结合片段。
本公开包括本文所述的WNT激动剂分子的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指本公开的化合物的生理学和药学上可接收的盐：即保留亲本化合物的所需生物活性并且不会对其产生不期望的毒理学作用的盐。各种药学上可接受的盐是本领域已知的，并且描述于例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”,第17版,AlfonsoR.Gennaro(编辑),Mark Publishing Company,Easton,PA,USA,1985(及其更新的版本),“Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology”,第3版,James Swarbrick(编辑),Informa Healthcare USA(Inc.),NY,USA,2007，以及J.Pharm.Sci.66:2(1977)中。而且，对于合适的盐的综述，参见Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,2002)。药学上可接受的碱加成盐与金属或胺形成，如碱和碱土金属或有机胺。
用作阳离子的金属包括钠、钾、镁、钙等。胺包括N-N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见例如，Berge et al.,“Pharmaceutical Salts,”J.Pharma Sci.,1977,66,119)。所述酸性化合物的碱加成盐是通过使游离酸形式与足量的所需碱接触来以常规方式产生盐而制备的。游离酸形式可以通过使盐形式与酸接触并以常规方式分离游离酸来再生。游离酸形式与它们各自的盐形式在某些物理特性上有所不同，如在极性溶剂中的溶解度，但是对于本公开的目的，这些盐在其它方面等同于它们各自的游离酸。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含治疗有效量的WNT激动剂分子或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其他蛋白质的混合物。示例性的氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格和Hank's溶液，半胱氨酸、精氨酸、肉碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和二醇。优选地，该制剂在4℃下稳定至少6个月。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和普通技术人员已知的其他缓冲液，如Good et al.(1966)Biochemistry5:467所述的那些。缓冲液的pH可以为6.5至7.75，优选7至7.5，并且最优选7.2至7.4。
V.使用方法
本公开还提供了在各种治疗环境中使用改造的WNT激动剂和/或组织特异性WNT信号增强分子例如调节WNT信号传导通路，例如增加WNT信号传导，以及给予改造的WNT激动剂和/或组织特异性WNT信号增强分子的方法。
本文还提供了使用改造的WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子进行治疗的方法。
在某些实施方案中，改造的WNT激动剂可用于增加组织或细胞中的Wnt信号传导。因此，在一些方面，本发明提供了在组织或细胞中增加Wnt信号传导或增强Wnt信号传导的方法，包括使组织或细胞与本文公开的有效量的改造的WNT激动剂或其药学上可接受的盐接触，其中所述改造的WNT激动剂是WNT信号传导通路激动剂。在一些实施方案中，接触在体外、离体或体内发生。在特定实施方案中，细胞是培养的细胞，并且接触在体外发生。在某些实施方案中，方法包括进一步使组织或细胞与一种或多种Wnt多肽或Norrin多肽接触。
本文公开的改造的WNT激动剂可用于治疗疾病、病症或病况，例如通过增加靶向细胞、组织或器官中的Wnt信号传导。因此，在一些方面，本发明提供了治疗有需要的对象中的疾病或病况，例如与减少的Wnt信号传导相关的，或者增加的Wnt信号传导将为其提供治疗益处的疾病或病症的方法，包括使对象与有效量的本公开组合物接触。在特定实施方案中，组合物是包含以下中的任一种的药物组合物：改造的WNT激动剂；包含编码改造的WNT激动剂的核酸序列的多核苷酸，例如DNA或mRNA，任选地修饰的mRNA；包含编码改造的WNT激动剂的核酸序列的载体，例如表达载体或病毒载体；或者包含编码改造的WNT激动剂的核酸序列的细胞。在特定实施方案中，疾病或病况是病理性疾病或病症，或者损伤，例如由伤口引起的损伤。在某些实施方案中，伤口可以是另一种治疗性治疗的结果。在某些实施方案中，疾病或病况包括受损的组织修复、愈合或再生，或者将受益于增加的组织修复、愈合或再生。在一些实施方案中，接触发生在体内，即将题述组合物给予对象。
Wnt信号传导在干细胞的发育过程和维持中起着关键作用。Wnt信号的再激活与损伤和疾病后大多数组织的再生和修复有关。改造的WNT激动剂分子预期响应于损伤和疾病为愈合和组织修复提供益处。组织损伤和损失的原因包括但不限于老化、变性、遗传性病况、感染和炎症、创伤性损伤、毒素/代谢诱导的毒性或其他病理状况。Wnt信号和Wnt信号的增强剂已被证明能激活成年组织驻留干细胞。在一些实施方案中，给予本发明的化合物以用于治疗患病或受损组织，以用于组织再生和用于细胞生长和增殖和/或用于组织改造。
与Wnt通路突变相关的人类疾病为Wnt信号在疾病治疗和预防中的增强提供了强有力的证据。临床前的体内和体外研究提供了Wnt信号参与许多疾病状况的额外证据，并进一步支持改造的Wnt激动剂在各种人类疾病中的利用。例如，本发明的组合物可用于促进或增加骨生长或再生、骨移植、骨折愈合、骨质疏松症和骨质疏松性骨折的治疗、脊柱融合、脊髓损伤，包括脊椎压缩性骨折、术前脊柱手术优化、矫形设备的骨整合、腱骨整合、牙齿生长和再生、牙齿植入、牙周病、颌面部重建和颌骨坏死。它们也可以用于治疗脱发；增强感觉器官的再生，例如治疗听力损失，包括再生内部和外部听觉毛细胞治疗前庭功能减退、治疗黄斑变性、治疗视网膜病变，包括玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变、其他视网膜变性疾病、Fuchs营养不良、其他角膜疾病等；治疗中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、多发性营养不良(multiple dystrophy)、因少肌症或恶病质引起的肌肉萎缩，以及其他影响血脑屏障变性或完整性的病况。
在某些实施方案中，本发明提供了治疗患有与减少的WNT信号传导相关的，或者增加的Wnt信号传导对其可能有益的疾病或病症的对象的方法，包括向对象给予有效量的改造的WNT激动剂，或者包含改造的WNT激动剂的药物组合物。在某些实施方案中，疾病或病症选自：口腔粘膜炎、短肠综合征、炎症性肠病(IBD)、其他胃肠道病症，包括但不限于：移植物抗宿主病(GVHD)、酒精性肝炎、短肠综合症、乳糜泻、辐射诱导的胃肠粘膜炎和化疗诱导的胃肠粘膜炎；代谢综合征、血脂异常的治疗、糖尿病的治疗、胰腺炎、胰腺外分泌或内分泌组织受损的病况的治疗；需要增强的表皮再生的病况，例如表皮伤口愈合、糖尿病足溃疡的治疗、涉及牙齿、指甲或真皮发育不全的综合征等、血管生成有益的病况；心肌梗死、冠状动脉疾病、心力衰竭；免疫缺陷、移植物抗宿主病、急性肾损伤、慢性肾脏疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、急性肝衰竭、伴有丙型或乙型肝炎病毒感染或抗病毒药物治疗后的慢性肝病、酒精性肝病、酒精性肝炎、伴有脂肪变性或脂肪性肝炎的非酒精性肝病、听力损失，包括听觉毛细胞的内部和外部损失、前庭功能减退、黄斑变性的治疗、玻璃体视网膜病变的治疗、糖尿病视网膜病变、其他视网膜变性疾病、Fuchs营养不良、其他角膜疾病、中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症和其他影响血脑屏障的病况；脊髓损伤、骨相关疾病、其他脊髓疾病和脱发。
本发明的改造的WNT激动剂和组合物也可用于治疗口腔粘膜炎、治疗短肠综合征、炎症性肠病(IBD)，包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，特别是伴有瘘管形成的CD、其他胃肠道病症；治疗代谢综合征、血脂异常、治疗糖尿病、治疗胰腺炎、胰腺外分泌或内分泌组织受损的病况；需要增强的表皮再生的病况，例如表皮伤口愈合、治疗糖尿病足溃疡、涉及牙齿、指甲或真皮发育不全的综合征等、血管生成有益的病况；治疗心肌梗死、冠状动脉疾病、心力衰竭；增强造血细胞的生长，例如增强来自骨髓的造血干细胞移植物、动员外周血、治疗免疫缺陷、移植物抗宿主病等；治疗急性肾损伤、慢性肾脏疾病；治疗肺部疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维化，包括特发性肺纤维化、增强肺组织的再生。本发明的组合物还可用于增强肝细胞的再生，例如肝再生、治疗肝硬化、增强肝移植、治疗急性肝衰竭、治疗伴有丙型或乙型肝炎病毒感染或抗病毒药物治疗后的慢性肝病、酒精性肝病，包括酒精性肝炎、伴有脂肪变性或脂肪性肝炎的非酒精性肝病等。本发明的组合物可以治疗疾病和病症，包括但不限于需要再生细胞生长的病况。
涉及Wnt信号传导组分功能丧失或功能获得突变的人类遗传学显示了支持增强骨生长的Wnt信号的强有力的证据。需要增强骨生长的病况可以包括但不限于骨折、移植物、假体设备周围的向内生长、骨质疏松、骨质疏松性骨折、脊椎融合、脊椎压缩性骨折、脊柱手术的术前优化、颌骨坏死、牙科植入、牙周病、颌面重建等。改造的WNT激动剂增强和促进Wnt信号，这对促进骨再生至关重要。骨组织再生的方法受益于本发明化合物的给药，其可以是全身性的或局部的。在一些实施方案中，骨髓细胞被暴露于本发明的分子，使得该骨髓内的干细胞被激活。
在一些实施方案中，通过使响应性细胞群，例如骨髓、骨祖细胞、骨干细胞等与有效剂量的本文公开的改造的WNT激动剂接触来增强骨再生。骨组织再生的方法受益于改造的WNT激动剂的给药，该激动剂可以是全身性的或局部的。在一些这样的实施方案中，接触是在体内进行的。在其他这样的实施方案中，接触是在离体下进行的。分子可以定位在作用部位，例如通过装载到基质上，该基质任选地是可生物降解的，并且任选地提供活性剂的持续释放。基质载体包括但不限于可吸收的胶原海绵、陶瓷、水凝胶、聚合物微球、纳米颗粒、骨水泥等。
在特定实施方案中，包含本文公开的一种或多种改造的WNT激动剂(或编码改造的WNT激动剂的多核苷酸，或者包含编码改造的WNT激动剂的多核苷酸的载体或细胞)的组合物被用于治疗或预防骨疾病或病症，包括但不限于以下中的任何一种，或者治疗或预防与以下中的任何一种相关但不限于以下中的任何一种的损伤：骨质疏松症、骨质疏松性骨折、骨折，包括脊椎压缩性骨折、不愈合骨折、延迟愈合骨折、脊柱融合、骨坏死、颌骨、髋、股骨头坏死等、植入物的骨整合(例如，以在部分或全部膝或髋置换术后加速恢复)、成骨不全、骨移植、肌腱修复、颌面外科手术、牙科植入物、所有其他由遗传疾病、变性、老化、药物或损伤引起的骨病症或缺陷。在一实施方案中，结合Fzd1、Fzd 2和Fzd 7以及LRP5和/或LRP6的改造的WNT激动剂被用于治疗或预防任何骨疾病或病症。在一实施方案中，结合Fzd1、Fzd2、Fzd 5、Fzd 7和Fzd 8以及LRP5和/或LRP6的改造的WNT激动剂被用于治疗或预防任何骨疾病或病症。结合另外的Fzd受体的其他Fzd分子也可与LRP5和/或LRP6粘合剂一起使用。
在特定实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于：在对象中，增加骨矿物密度、增加骨体积(例如，胫骨和/或股骨体积)、增加皮质厚度(例如，在小梁区域中或在股骨中骨干中)、增加矿物沉积率、增加成骨细胞的数量和/或减少破骨细胞的数目(例如，在骨中)、增加骨硬度、增加骨折点的极限载荷、提高对骨折的骨抵抗力、减少骨吸收、减少与骨质疏松相关的骨损失或增加骨的生物化学强度。在一实施方案中，结合Fzd1、Fzd 2和Fzd 7的改造的WNT激动剂被用于这些所示用途中的任一种。在一实施方案中，结合Fzd1、Fzd 2、Fzd 5、Fzd 7和Fzd 8的改造的WNT激动剂被用于这些所示用途中的任一种。
本文公开的方法，包括治疗或预防骨疾病或病症的方法，包括这样的方法，其包括向有需要的对象提供改造的WNT激动剂和抗再吸收剂。在某些实施方案中，方法被用于治疗骨质疏松症，任选地绝经后骨质疏松症。
本公开还提供了抑制或减少有需要的对象中的骨吸收的方法，包括向对象提供有效量的改造的WNT激动剂，其中所述改造的WNT激动剂是WNT信号传导通路的激动剂。在某些实施方案中，方法还包括向对象提供抗再吸收剂。在某些实施方案中，对象已被诊断患有骨质疏松症，任选绝经后骨质疏松症，或者有骨质疏松症，任选绝经后骨质疏松症的风险。多种抗再吸收剂是本领域已知的，并且包括但不限于本文公开的那些。
当改造的WNT激动剂与另一种治疗剂如抗再吸收剂联合提供给对象时，这两种试剂可以在相同或不同的药物组合物中提供。它们可以在同一时间、不同时间，例如同时、连续地或在重叠或不重叠的时间段期间提供给对象。在某些实施方案中，这两种试剂在重叠的时间段期间在对象中具有治疗活性。
包含本文公开的一种或多种改造的WNT激动剂(或编码改造的WNT激动剂的多核苷酸，或者包含编码改造的WNT激动剂的多核苷酸的载体或细胞)的组合物可用于骨骼组织缺陷的体内治疗。通过“骨骼组织缺陷”，其意指希望恢复骨骼或结缔组织的任何部位处的骨或其他骨骼结缔组织中的缺陷，无论这种缺陷是如何产生的，例如，无论是由于手术干预、肿瘤切除、溃疡、植入物、骨折还是其他创伤或退行性病况。本发明的组合物可用作恢复结缔组织的软骨功能、修复软骨组织中的缺陷或病灶，如退行性磨损和关节炎、组织创伤、半月板撕裂移位、半月板切除术、韧带撕裂、关节错位、骨折或遗传性疾病导致的关节脱位的方案的一部分。
改造的WNT激动剂也可用于治疗牙周疾病。牙周疾病是牙齿脱落的主要原因，并且与多种系统性病况有关。在一些实施方案中，通过接触反应性细胞群来增强牙齿或下面的骨再生。在一些这样的实施方案中，接触是在体内进行的。在其他这样的实施方案中，接触是在离体下进行的，随后植入活化的干细胞或祖细胞。分子可以定位在作用部位，例如，通过装载到基质上，所述基质任选地是可生物降解的，并且任选地提供活性剂的持续释放。基质载体包括但不限于可吸收的胶原海绵、陶瓷、水凝胶、骨水泥、聚合物微球、纳米颗粒等。
研究表明，Wnt信号传导和R-脊椎蛋白的生物学能够促进损伤、老化或变性后内耳中感觉毛细胞的再生。涉及听力损失或前庭功能减退的内耳中感觉毛细胞的损失也可受益于本发明的组合物。在内耳中，听觉器官容纳着将声音振动转化为电脉冲所需的机械敏感毛细胞。前庭器官由半规管(SSCs)、胞囊和球囊组成，也包含感觉毛细胞，以检测头部的位置和运动。本发明的组合物可用于例如输注中；基质或其他储库系统中；或者其它局部应用于耳朵以增强听觉再生。
改造的WNT激动剂也可用于视网膜组织的再生。在成年哺乳动物视网膜中，Muller神经胶质细胞能够再生视网膜细胞，包括光感受器，例如在体内神经毒性损伤后。Wnt信号传导和Wnt信号增强剂可以在损伤后或变性期间促进Muller神经胶质来源的视网膜祖细胞的增殖。本发明的组合物也可用于眼睛中组织和其他细胞类型的再生。例如，年龄相关性黄斑变性(AMD)、其他视网膜退行性疾病、角膜疾病、Fuchs营养不良、玻璃体视网膜病变、遗传性疾病等可受益于本发明的组合物。AMD的特征是中心视力和敏度逐渐下降。Fuchs营养不良的特征是角膜内皮细胞的逐渐丧失。Wnt信号和Wnt信号的增强可促进眼组织中角膜内皮、视网膜上皮等的再生。在其他实施方案中，本发明的组合物可用于例如输注中；在基质或其他储库系统中；或者其他局部应用于眼睛以用于视网膜再生和治疗黄斑变性。
通过谱系追踪研究已经鉴定了用于肝细胞稳态更新的特定增殖细胞群，例如中央周围区域中的Axin2阳性细胞。谱系追踪研究还鉴定了另外的潜在的肝祖细胞，包括但不限于Lgr阳性细胞。自我更新的肝细胞和其他潜在祖细胞群，包括Lgr5阳性和Axin2阳性细胞，被鉴定为能够在损伤后响应于Wnt信号和/或R-脊椎蛋白而再生。许多急性肝损伤和衰竭以及慢性肝病的临床前模型表明，肝细胞的恢复和再生受益于增强Wnt信号。
在某些实施方案中，包含本文公开的改造的WNT激动剂(或编码改造的WNT激动剂的多核苷酸，或者包含编码改造的WNT激动剂的多核苷酸的载体或细胞)的组合物被用于促进肝再生、减少纤维化和/或改善肝功能。在某些实施方案中，本文公开的组合物和方法被用于：增加肝脏重量、增加肝脏与体重的比率、增加肝脏中PCNA和pH3阳性细胞核的数量、增加肝脏中Ki67和/或Cyclin D1的表达、增加肝细胞增殖和/或有丝分裂、减少慢性肝损伤后的纤维化或增加肝细胞功能。
在特定实施方案中，本发明的组合物可用于治疗急性肝衰竭、急性酒精性肝损伤、治疗伴有丙型或乙型肝炎病毒感染或抗病毒药物治疗后的慢性肝病、慢性酒精性肝病、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、治疗肝硬化和所有原因的严重慢性肝病，以及增强肝细胞的再生。肝组织再生的方法受益于本发明化合物的给药，其可以是全身性的或局部的。这些包括但不限于全身给药方法和局部给药方法，例如通过注射到肝组织中、通过注射到通向肝的静脉或血管中、通过植入缓释制剂等。
在特定实施方案中，包含本文公开的改造的WNT激动剂(或编码改造的WNT激动剂的多核苷酸，或者包含编码改造的WNT激动剂的多核苷酸的载体或细胞)的组合物被用于治疗或预防包括但不限于以下的肝脏疾病或病症，或者治疗或预防由以下中的任一种引起的肝脏损伤或病症：急性肝衰竭(所有原因)、慢性肝衰竭(所有原因)、肝硬化、肝纤维化(所有原因)、门静脉高压、酒精性肝病，包括酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(脂肪肝)、酒精性肝炎、丙型肝炎病毒诱导的肝病(HCV)、乙型肝炎病毒诱导的肝病(HBV)、其他病毒性肝炎(例如，甲型肝炎病毒诱导的肝病(HAV)和丁型肝炎病毒诱导的肝病(HDV))、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、肝脏手术、肝损伤、肝移植、肝脏手术和移植中的“小体积”综合征、先天性肝脏疾病和病症、任何其他的肝脏病症或由遗传疾病、变性、老化、药物或损伤引起的检测。
Wnt信号在各种上皮组织的再生中起着重要作用。各种表皮状况受益于用本发明的化合物进行治疗。当胃肠道内快速分裂的上皮细胞破裂，使粘膜组织容易溃疡和感染时，就会发生粘膜炎。覆盖口腔的上皮内层部分被称为口腔粘膜，是身体最敏感的部位之一，并且特别容易受到化疗和辐射的影响。口腔粘膜炎可能是癌症治疗，尤其是化疗和辐射中最常见的、使人虚弱的并发症。另外，本发明的组合物还可有益于治疗短肠综合征、炎症性肠病(IBD)或其他胃肠道病症。其他表皮病况包括表皮伤口愈合、糖尿病足溃疡、涉及牙齿、指甲或真皮发育不全的综合征等。本发明的分子可以在所有这些病况中使用，其中再生细胞与本发明的化合物接触。上皮组织再生的方法受益于本发明化合物的给药，其可以是全身性的或局部的。例如，接触可以是在目标部位等处局部，包括皮内、皮下、在凝胶、乳液、乳膏等中施加。
在临床前模型中，除了皮肤和胃肠道，Wnt信号以及Wnt信号的增强和促进在包括胰腺、肾脏和肺在内的组织的修复和再生中也起着重要作用。改造的WNT激动剂可能有益于涉及外分泌和内分泌胰腺、肾脏或肺的各种疾病状况。改造的WNT激动剂可用于治疗代谢综合征；治疗糖尿病、治疗急性或慢性胰腺炎、胰腺外分泌功能不全、治疗急性肾损伤、慢性肾脏疾病、治疗肺部疾病，包括但不限于慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维化，特别是特发性肺纤维化(IPF)，以及其他导致肺上皮组织损失的病况。这些组织再生的方法受益于本发明化合物的给药，其可以是全身性的或局部的。
表皮Wnt信号传导与经由其他发育因子的信号传导相协调，对成人毛囊再生至关重要。脱发是一个常见的问题，并且雄激素性脱发，通常被称为男性型脱发，是男性中最常见的脱发形式。在一些实施方案中，通过使响应性细胞群与本发明的分子接触来增强毛囊再生。在一些这样的实施方案中，接触是在体内进行的。在其他这样的实施方案中，接触是在离体下进行的。分子可以定位在作用部位，例如局部乳液、凝胶、乳膏等。
可以用改造的WNT激动剂治疗中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症和其他影响血脑屏障(BBB)的病况。血管生成对于确保向全身许多组织供应氧气和营养物至关重要，并且对CNS尤为重要，因为神经组织对缺氧和缺血极为敏感。形成BBB的CNS内皮细胞与非神经组织中的内皮细胞的不同之处在于，它们是通过紧密连接保持在一起的高度极化细胞，并表达特定的转运蛋白。Wnt信号传导调节CNS血管的形成和/或功能。BBB受损的病况可受益于本发明化合物的给药，其可以是全身性的或局部的，例如通过直接注射、鞘内给药、植入缓释制剂等。另外，Wnt信号主动参与神经发生，并在损伤后起神经保护作用。本发明的组合物也可用于治疗脊髓损伤、其他脊髓疾病、中风、创伤性脑损伤等。
Wnt信号也在血管生成中起作用。改造的WNT激动剂可有益于血管生成有益的病况、治疗心肌梗死、冠状动脉疾病、心力衰竭、糖尿病视网膜病变等，以及来自遗传性疾病的病况。这些组织再生的方法受益于本发明化合物的给药，其可以是全身性的或局部的。
在某些实施方案中，本发明的方法促进组织再生，例如，在受到损伤或组织或细胞减少或损失的组织中。损失或损害可以是导致细胞数量减少的任何状况，包括疾病或损伤。例如，事故、自身免疫性疾病、治疗副作用或疾病状态都可能构成创伤。组织再生增加了组织内的细胞数量，并且优选地实现待重新建立的组织的细胞之间的连接，并且更优选地实现待重新获得的组织的功能。
如本文使用的术语“给予(administering)”或“引入(introducing)”或“提供(providing)”是指将组合物递送至对象的一个细胞、多个细胞、组织和/或器官，或者递送至对象。这种给予或引入可以在体内、体外或离体下发生。
在特定实施方案中，药物组合物经肠胃外，例如静脉内、经口、直肠或通过注射给药。在一些实施方案中，它被局部性地给药，例如局部或肌肉内给药。在一些实施方案中，将组合物给予靶组织，例如，骨、关节、耳组织、眼组织、胃肠道、皮肤、伤口部位或脊髓。本发明的方法可以在体内或离体下实施。在一些实施方案中，靶细胞或组织与改造的WNT激动剂的接触在离体下进行，随后将细胞或组织，例如活化的干细胞或祖细胞植入对象中。本领域技术人员可以基于正在治疗的疾病或病症来确定合适的给药部位和给药途径。
剂量和给药方案可能取决于医生容易确定的各种因素，如疾病或病症的性质、对象的特征和对象的病史。在特定实施方案中，给予或提供给对象的改造的WNT激动剂的量的范围为约0.01mg/kg对象体重至约50mg/kg对象体重、约0.1mg/kg对象体重至约500mg/kg对象体重或约0.1mg/kg对象体重至约50mg/kg对象体重。在本文公开的任何方法的某些实施方案中，将WNT激动剂经静脉内，例如作为团注注射或皮下给予对象，例如哺乳动物。在特定实施方案中，WNT激动剂每周给药至少一次。在特定实施方案中，对象被给予约0.5至约100mg/kg体重的WNT激动剂，或者约2至约50mg/kg体重的WNT激动剂，例如约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg。在特定实施方案中，对象被给予约25mg、约75mg、约250mg、约750mg、约1500mg或约2250mg的WNT激动剂。在特定实施方案中，对象每周至少一次经静脉内或皮下被给予约3至约30mg/kg体重的R2M13-h26，其中R2M13-h26包含通过二硫键结合的两种SEQ ID NO:9的多肽和两种SEQ ID NO:10的多肽。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等在本文中通常意指获得所需的药理学和/或生理学效果。效果可以在完全或部分预防疾病或其症状方面是预防性的，例如降低疾病或其症状在对象中发生的可能性，以及/或者可以在疾病和/或可归因于疾病的不良影响的部分或完全治愈方面是治疗性的。本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物中疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止可能易患疾病但尚未被诊断为患有该疾病的对象中疾病的发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或者(c)减轻疾病，即引起疾病消退。治疗剂(例如，改造的WNT激动剂)可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后给药。对正在进行的疾病的治疗是特别令人感兴趣的，其中治疗稳定或减少患者的不希望的临床症状。这种治疗最好在受影响组织完全丧失功能之前进行。对象的治疗最好在疾病的症状阶段期间给予，并且在一些情况下，在疾病症状阶段之后给予。在一些实施方案中，主题方法产生治疗益处，例如，预防病症的发展、停止病症的进展、逆转病症的进展等。在一些实施方案中，主题方法包括检测已经实现治疗益处的步骤。普通技术人员将认识到，这种治疗功效的测量将适用于被改良的特定疾病，并且将认识到用于测量治疗功效的适当检测方法。
在某些实施方案中，在向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂后，本文公开的方法导致以下PK/PD参数中的一种或多种：10-50或约25的清除(mL/天/kg)；2-5天或约4天的最终t1/2；50-300或100-200，或者约140的Cmax(ug/mL)、约3-4(天)，或者约4的MRT，或者约100-1000或约100至约500，或者约190的AUC(天*μg/mL)。
其他实施方案部分涉及将本文公开的改造的WNT激动剂用于促进或增强细胞、组织和类器官的生长或增殖，例如，通过使细胞或组织与一种或多种改造的WNT激动剂接触，任选地与Norrin或R脊椎蛋白多肽组合。在某些实施方案中，在离体下、在体外或体内接触细胞或组织。这种方法可用于产生用于治疗用途，例如移植或接枝到对象中的细胞、组织或类器官。它们也可以用于产生细胞、组织或类器官，以用于研究用途。改造的WNT激动剂在非治疗方法，例如体外研究方法中有广泛的应用。
在某些实施方案中，改造的WNT激动剂，包括本文公开的那些，可用于保存细胞、组织、器官或类器官，例如用于移植的组织或器官。例如，细胞、组织、器官或类器官可以在体内或离体下与改造的WNT激动剂接触。在保存细胞、组织或器官以用于移植的情况下，细胞、组织、器官或类器官可以在仍在供体中时(即在从供体移除之前)和/或在从供体移除之后与改造的WNT激动剂接触。该方法可以保持或增强细胞、组织或器官的活力，例如，在储存期间或在移植到受体中之前。在特定实施方案中，将细胞、组织或器官灌注在包含改造的WNT激动剂的组合物或溶液中。在某些实施方案中，使某些器官组织与WNT超级激动剂分子接触，以保持组织的活力。在特定实施方案中，器官组织是待移植到有需要的受体中的供体器官组织。在某些实施方案中，利用包含本文公开的改造的WNT激动剂的溶液在体内灌注供体器官组织，例如，在从供体移除器官组织之前。在某些实施方案中，利用包含本文公开的改造的WNT激动剂的溶液离体灌注供体器官组织，例如，在储存期间或在从供体运输到受体期间。在特定实施方案中，相比未与改造的WNT激动剂接触时，与改造的WNT激动剂接触的器官组织保持移植存活的时间长至少10％、至少20％、至少50％或至少100％。在某些实施方案中，器官组织是肝组织。
在某些实施方案中，改造的WNT激动剂，包括本文公开的那些，可用于离体组织，例如皮肤组织的扩增和/或维持。在特定实施方案中，从供体或患者分离组织。组织可以在体内或离体下与改造的WNT激动剂接触(例如，在其存在的情况下保持或培养)。在某些实施方案中，离体接触组织，例如通过灌注包含改造的WNT激动剂的组合物。
在另一实施方案中，改造的WNT激动剂，包括本文公开的那些，可用于产生或维持类器官或类器官培养物。例如，类器官培养物可与改造的WNT激动剂接触，例如，通过在包含改造的WNT激动剂的培养基中培养类器官。在某些实施方案中，通过使类器官培养物与本文公开的一种或多种改造的WNT激动剂接触，来产生、生长或维持类器官培养物。在特定实施方案中，改造的WNT激动剂存在于用于生长或维持类器官组织的培养基中。
本发明提供了受损组织如上文讨论的组织的组织再生方法，包括向细胞给予改造的WNT激动剂。改造的WNT激动剂可以在体内直接给予细胞，经口、静脉内或通过本领域已知的其他方法给予对象，或者给予离体细胞。在将改造的WNT激动剂给予离体细胞的一些实施方案中，这些细胞可以在给予改造的WNT激动剂之前、之后或期间移植到对象中。
Wnt信号传导是干细胞培养物的关键组分。例如，如WO2010/090513、WO2012/014076、Sato et al.,2011(GASTROENTEROLOGY 201 1；141:1762-1772)和Sato et al.,2009(Nature459,262-5)中所述的干细胞培养基。本文公开的改造的WNT激动剂是在这些干细胞培养基中使用的R脊椎蛋白的合适替代物，或者可以与R脊椎蛋白组合。
因此，在一实施方案中，本公开提供了增强干细胞增殖的方法，包括使干细胞与本文公开的一种或多种改造的WNT激动剂接触。在一实施方案中，本公开提供了包含本文公开的一种或多种改造的WNT激动剂的细胞培养基。在一些实施方案中，细胞培养基可以是本领域已知的任何细胞培养基，其通常包含Wnt或R脊椎蛋白，但其中Wnt或R脊椎蛋白被本文公开的改造的WNT激动剂(全部或部分地)取代或补充。例如，培养基可以如WO2010/090513、WO2012/014076、Sato et al.,2011(GASTROENTEROLOGY 201 1；141:1762-1772)和Sato etal.,2009(Nature459,262-5)中所述，其在此通过引用整体并入本文中。
干细胞培养基通常包含另外的生长因子。因此，该方法可另外包括向干细胞提供生长因子。细胞培养基中常用的生长因子包括表皮生长因子(EGF，(Peprotech)、转化生长因子-α(TGF-α，Peprotech)、碱性成纤维生长因子(bFGF，Peprotech)、脑源性神经营养因子(BDNF，R&D Systems)、干细胞生长因子(HGF)和角质形成细胞生长因子(KGF，Peprotech，也称为FGF7)。EGF是多种培养的外胚层和中胚层细胞的一种有效的有丝分裂因子，并且对体内和体外特定细胞的分化以及细胞培养中一些成纤维细胞的分化具有深远影响。EGF前体作为膜结合分子存在，其被蛋白水解切割以产生刺激细胞的53个氨基酸的肽激素。因此，EGF或其他促有丝分裂生长因子可被提供给干细胞。在干细胞的培养期间，可每两天将促有丝分裂生长因子添加到培养基中，而培养基优选每四天更新一次。通常，促有丝分裂因子选自：i)EGF、TGF-α和KGF，ii)EGF、TGF-α和FGF7；iii)EGF、TGF-α和FGF；iv)EGF和KGF；v)EGF和FGF7；vi)EGF和FGF；vii)TGF-α和KGF；viii)TGF-α和FGF7；ix)或来自TGF-α和FGF。在某些实施方案中，本公开包括干细胞培养基，其包含本文公开的改造的WNT激动剂，例如，任选地与本文所述的一种或多种生长因子或其组合进行组合。
这些增强干细胞增殖的方法可用于从干细胞生长新的类器官和组织，如例如WO2010/090513WO2012/014076、Sato et al.,201 1(GASTROENTEROLOGY 2011；141:1762-1772)和Sato et al.,2009(Nature459,262-5)中所述。
在一些实施方案中，改造的WNT激动剂被用于增强干细胞再生。说明性的目标干细胞包括但不限于：肌肉卫星细胞；造血干细胞和来源于其的祖细胞(第5,061,620号美国专利)；神经干细胞(参见Morrison et al.(1999)Cell 96:737-749)；胚胎干细胞；间充质干细胞；中胚层干细胞；肝干细胞；脂肪组织来源的干细胞等。
本发明部分基于使用改造的WNT激动剂来调节胃肠上皮增殖，特别是在炎症性肠病中。
在一实施方案中，本发明提供了治疗患有胃肠道病症的对象的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂。在某些实施方案中，胃肠道疾病是炎症性肠病。在其他实施方案中，炎症性肠病选自：克罗恩病(CD)、伴有瘘管形成的CD和溃疡性结肠炎(UC)。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂减少肠道或结肠中的炎性细胞因子表达和/或修复肠道上皮。
在某些方面，本发明还提供了治疗患有胃肠道病症的对象的方法，包括向对象给予组织特异性的WNT信号增强分子。在某些实施方案中，WNT信号增强分子包含：a)结合一种或多种E3泛素连接酶的第一结构域；以及b)与组织特异性受体结合的第二结构域。在其他实施方案中，E3泛素连接酶选自锌和环指蛋白3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)。在另一实施方案中，第一结构域包含R-脊椎蛋白(RSPO)多肽。在其他实施方案中，RSPO多肽选自RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3和RSPO-4。在某些实施方案中，RSPO多肽包含第一furin结构域和第二furin结构域。在某些实施方案中，第二furin结构域是野生型的，或者突变为与包含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-6(LGR4-6)具有较低的结合。在某些实施方案中，改造的激动剂或Wnt信号增强分子包含组织靶向分子。在其他实施方案中，组织靶向分子是结合组织特异性细胞表面抗原的抗体或其片段。在某些实施方案中，组织靶向分子选自GPA33、CDH17和MUC-13，或者以上的功能片段或变体。在一些实施方案中，WNT激动剂与特异性结合炎症分子的结合域一起施用。在某些实施方案中，炎症分子特异性的结合域是炎症分子的拮抗剂。在其他实施方案中，炎症分子的拮抗剂是TNFα、IL-12、IL-12和IL-23或IL-23的拮抗剂。在一些实施方案中，胃肠道疾病是炎症性肠病。在其他实施方案中，炎症性肠病选自：克罗恩病(CD)、伴有瘘管形成的CD和溃疡性结肠炎(UC)。
在另一实施方案中，本发明提供了治疗患有胃肠道病症的对象的方法，包括向对象给予改造的WNT激动剂和改造的组织特异性WNT信号增强分子。可以在同一时间或不同的时间给予改造的WNT激动剂和改造的组织特异性WNT信号增强分子。在一些实施方案中，在重叠的时间段期间，对象包括有效量的二者。在某些实施方案中，改造的WNT激动剂包含结合FZD5、FZD8、FZD1、FZD2、FZD7、FZD 5和8或FZD1、2和7的一个或多个结合域，以及结合LRP5、LRP6或LRP5的一个或多个结合域。在一些实施方案中，改造的WNT激动剂包含组织靶向分子。在某些实施方案中，组织靶向分子是结合组织特异性细胞表面抗原的抗体或其片段。在其他实施方案中，组织靶向分子选自GPA33、CDH17和MUC-13，或者以上的功能片段或变体。在某些实施方案中，改造的WNT信号增强分子包含结合一种或多种E3泛素连接酶的第一结构域和结合组织特异性受体的第二结构域。在其他实施方案中，E3泛素连接酶选自锌和环指蛋白3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)。在一些实施方案中，第一结构域包含R-脊椎蛋白(RSPO)多肽。在其他实施方案中，RSPO多肽选自RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3和RSPO-4。在其他实施方案中，RSPO多肽包含第一furin结构域和第二furin结构域。在又一实施方案中，第二furin结构域是野生型的，或者突变为与包含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-6(LGR4-6)具有较低的结合。在其他实施方案中，表3中公开了改造的WNT激动剂。在一些实施方案中，改造的WNT激动剂和改造的组织特异性WNT信号增强分子与特异性结合炎症分子的结合域一起施用。在其他实施方案中，炎症分子特异性的结合域是炎症分子的拮抗剂。在其他实施方案中，炎症分子的拮抗剂是TNFα、IL-12、IL-12和IL-23或IL-23的拮抗剂。在某些实施方案中，胃肠道疾病是炎症性肠病。在其他实施方案中，炎症性肠病选自：克罗恩病(CD)、伴有瘘管形成的CD和溃疡性结肠炎(UC)。
在另一实施方案中，本发明提供了治疗患有胃肠道病症的对象的方法，包括向对象给予改造的WNT激动剂和改造的组织特异性WNT信号增强组合分子。在某些实施方案中，组合分子包含：a)改造的WNT激动剂，其包含结合FZD5、FZD8、FZD1、FZD2、FZD7、FZD 5和8，或者FZD1、2和7的一个或多个结合域，以及结合LRP5、LRP6或LRP5的一个或多个结合域，以及b)改造的WNT信号增强分子，其包含结合一种或多种E3泛素连接酶的第一结构域和结合组织特异性受体的第二结构域。在其他实施方案中，E3泛素连接酶选自锌和环指蛋白3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)。在一些实施方案中，第一结构域包含R-脊椎蛋白(RSPO)多肽。在其他实施方案中，RSPO多肽选自RSPO-1、RSPO-2、RSPO-3和RSPO-4。在其他实施方案中，RSPO多肽包含第一furin结构域和第二furin结构区。在其他实施方案中，第二furin结构域是野生型的，或者突变为与包含富含亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体4-6(LGR4-6)具有较低的结合。在一些实施方案中，组合分子包含组织靶向分子。在某些实施方案中，组织靶向分子是结合组织特异性细胞表面抗原的抗体或其片段。在其他实施方案中，组织靶向分子选自GPA33、CDH17和MUC-13，或者其功能片段或变体。在一些实施方案中，组合分子与特异性结合炎症分子的结合域一起施用。在其他实施方案中，炎症分子特异性的结合域是炎症分子的拮抗剂。在其他实施方案中，炎症分子的拮抗剂是TNFα、IL-12、IL-12和IL-23或IL-23的拮抗剂。在某些实施方案中，胃肠道疾病是炎症性肠病。在其他实施方案中，炎症性肠病选自：克罗恩病(CD)、伴有瘘管形成的CD和溃疡性结肠炎(UC)。
在本文公开的任何方法的特定实施方案中，改造的WNT激动剂选自以下任何公开中公开的那些：第WO 2016/040895号PCT申请公开；第US2017-0306029号美国申请公开；第US2017-0349659号美国申请公开；第WO 2019/126398号PCT申请公开；或者第WO 2020/01030号PCT申请公开。在本文公开的任何方法的特定实施方案中，组织特异性WNT信号增强分子选自以下任何公开中公开的那些：第WO 2018/140821号PCT申请公开；第US2020-0048324号美国申请公开；或者第WO 2020/14271号PCT申请公开，其全部通过引用整体并入本文中。
在相关的实施方案中，本公开提供了治疗患有胃肠道病症的对象的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂、改造的WNT信号增强分子和/或组合分子，或者本文公开的包含改造的WNT激动剂或组合分子的药物组合物。在一些实施方案中，胃肠道病症是炎症性肠病，任选地选自：克罗恩病(CD)、伴有瘘管形成的CD和溃疡性结肠炎(UC)。可以使用本文公开的改造的WNT激动剂、改造的WNT信号增强分子和/或组合分子中的任何一种实践本文公开的任何方法。
在本文公开的任何方法的某些实施方案中，经静脉内，例如作为团注注射向对象，例如哺乳动物给予WNT激动剂。在特定实施方案中，WNT激动剂每周至少给药一次。在特定实施方案中，对象被给予约0.5至约100mg/kg体重的WNT激动剂，或者约2至约50mg/kg体重的WNT激动剂，例如约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg。在特定实施方案中，每周至少一次经静脉内向对象给予约3至约30mg/kg体重的R2M13-h26，其中R2M13-h26包含通过二硫键结合的两种SEQ ID NO:9的多肽和两种SEQ ID NO:10的多肽。在特定实施方案中，方法被用于治疗IBD，例如，利用本文公开的WNT激动剂，例如R2M13-h26治疗中度至严重IBD。在某些实施方案中，IBD克罗恩病、伴有瘘管形成的克罗恩病或溃疡性结肠炎。
还可以使用WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强分子的组合或包含WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强的组合分子(组合分子)来实践本文公开的任何方法，例如，如本文所述的。在一实施方案中，将WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子提供给患有涉及不适当或失调的WNT信号传导的疾病的对象。在某些实施方案中，本文公开的方法包括向需要的对象单独或组合提供WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子，或者组合分子。在某些实施方案中，在相同或不同的药物组合物中向对象提供WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强分子。在一些实施方案中，在同一时间或不同的时间，例如，一种在另一种之前或之后，向对象提供WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强分子。在一些实施方案中，方法包括向对象提供有效量的WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子。在一些实施方案中，在重叠的时间段，例如一天、两天或一周期间，有效量的WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强分子存在于对象中。在其他实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的对象提供包含WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强分子的组合分子(组合分子)。
在某些实施方案中，可以实践本文公开的任何方法来减少炎症(例如，与IBD相关的炎症或受IBD影响的组织，如胃肠道组织，例如小肠、大肠或结肠中的炎症)、增加WNT信号传导、减少IBD的任何组织学症状(例如，本文公开的那些)、降低发炎组织(例如胃肠道组织)中的细胞因子水平，或者降低如本文公开的疾病活动指数。
在某些实施方案中，WNT激动剂分子或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子可用于增强组织或细胞中的WNT信号传导通路。激动WNT信号传导通路可以包括例如，在组织或细胞中增加WNT信号传导或增强WNT信号传导。因此，在一些方面，本公开提供了激动细胞中的WNT信号传导通路的方法，包括使组织或细胞与有效量的本文公开的WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子或以上的药学上可接受的盐接触，其中所述WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子是WNT信号传导通路激动剂。在某些实施方案中，本公开提供了增加细胞中的WNT信号传导的方法，包括使细胞与本文公开的改造的WNT激动剂接触。在特定实施方案中，WNT激动剂是R2M13-h26。在一些实施方案中，接触在体外、离体下或体内发生。在特定实施方案中，细胞是培养的细胞，并且接触在体外发生。
WNT激动剂和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子可用于治疗胃肠道病症，包括但不限于炎症性肠病，包括但不限于克罗恩病、伴有瘘管形成的克罗恩病和溃疡性结肠炎。在特定实施方案中，WNT激动剂可用于治疗胃肠道病症，包括但不限于炎症性肠病，包括但不限于伴有或没有瘘管形成的克罗恩病，包括但不限于溃疡性结肠炎，包括但不限于急性肠道GVHD(移植物抗宿主病)，包括但不限于短肠综合征和任何其他的胃肠道疾病，其中上皮屏障受损或者肠道变短。特别地，本发明提供了WNT/β-连环蛋白信号传导WNT/β-连环蛋白激动剂，以增强由来自这些病症的损伤引起的肠道上皮再生。在特定实施方案中，WNT激动剂是R2M13-h26。
改造的WNT激动剂还可用于调节多种组织和/或细胞过程，以及调节组织和/或细胞内的基因表达。在某些实施方案中，本公开提供了调节基因表达的方法，包括使对象、器官、组织或细胞与本文公开的改造的WNT激动剂(例如表3中的那些)接触。对象可被给予改造的WNT激动剂，并且器官、组织或细胞可以在体内、离体下或体外与改造的WNT激动剂接触。在特定实施方案中，方法导致WNT信号传导通路中的一个或多个基因的上调或下调，包括但不限于表4至表8中公开的任何基因。基因表达的上调或下调可以在RNA或蛋白质水平上进行测量，并且可能在给药后在对象的一个或多个组织和/或细胞中导致至少两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍的增加或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的减少。在某些实施方案中，可基于与预定对照水平或对于未与改造的WNT激动剂接触的相应细胞或组织所确定的水平的比较来确定增加或减少。
在一些实施方案中，本公开提供了调节患有胃肠道病症的对象中的一个或多个组织和/或细胞中的WNT通路分子表达的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂或药物组合物。在某些实施方案中，WNT通路分子是表4至表7中任一项中列出的基因或蛋白质。在特定实施方案中，WNT通路分子选自：RNA酶4、血管生成素、Gsta3、Rnf43、Axin2、Ccnb1或表7中列出的任何基因或蛋白质。在某些实施方案中，在给予改造的WNT激动剂后，在对象的一个或多个组织和/或细胞中，WNT通路分子(基因或蛋白质)的表达增加了至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍或减少了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，组织是上皮组织。在某些实施方案中，细胞是胃肠上皮细胞，任选地：干细胞、TA1、TA2、基底杯状、损伤诱导的替代祖细胞(AltEnteroPC)、损伤诱导的替代肠细胞(Alt Entero)、肠细胞前体(EnteroPrecur)、杯状细胞1、杯状细胞2、肠内分泌或簇状细胞。在特定实施方案中，WNT激动剂是R2M13-h26。
在另一实施方案中，本公开提供了刺激患有胃肠道病症的对象中的组织修复的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂或药物组合物。在特定实施方案中，组织修复是通过(或者方法导致)调节选自以下的至少一种WNT通路分子来刺激的：与细胞周期相关的基因、与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因、与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因和/或表4至表8中的任一项中列出的任何基因。在某些实施方案中，与细胞周期相关的基因选自表4中提供的那些，或者Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1和Rrm2。在某些实施方案中，与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因选自表8中提供的那些，以及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1和Adh1。在某些实施方案中，与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因选自表6中提供的那些，或者Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16和Sprr2a3。在特定实施方案中，在给予改造的WNT激动剂后，在对象的一个或多个组织和/或细胞中，基因的表达增加了至少两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍或减少了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在特定实施方案中，WNT激动剂是R2M13-h26。
在另一实施方案中，本公开提供了减少患有胃肠道病症的对象(或其组织或细胞)中的炎症的方法，包括向对象给予本文公开的改造的WNT激动剂或药物组合物。在某些实施方案中，炎症通过(或者方法导致)调节选自以下的至少一种WNT通路分子而减少：表5中提供的基因，或者Adamdec1、Atf3、Gpx2、Gsta3、Gstm1、Gdf15、Il18、Nox1、Reg4、Sycn、Selenbp1、Tgfbr2和Timp3。在特定实施方案中，胃肠组织，任选地上皮组织中的炎症减少。在某些实施方案中，胃肠上皮细胞、上皮干细胞、TA1、TA2、基底杯状细胞、损伤诱导的替代祖细胞(AltEnteroPC)、损伤诱导的替代肠细胞(AltEnteros)、肠细胞前体(EnteroPrecur)、杯状细胞1、杯状细胞2或肠内分泌细胞中的炎症减少。在特定实施方案中，在给予改造的WNT激动剂后，在对象的一个或多个组织和/或细胞中，WNT通路分子的表达增加了至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍或减少了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在特定实施方案中，WNT激动剂是R2M13-h26。
在本文公开的任何方法的某些实施方案中，WNT激动剂分子还可以包含组织靶向部分，例如识别肺组织特异性受体或细胞表面分子的抗体或其片段。
本发明还提供了与胃肠道病症，特别是炎症性肠病(IBD)的已知和新的治疗方法的联合治疗。例如，WNT激动剂可以与数种已知的IBD疗法组合，包括但不限于5-氨基水杨酸盐(5-ASAs)；免疫抑制剂如皮质类固醇、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤和环孢素A或他克莫司；TNFα抑制剂如英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗；抗整合素如维多珠单抗；炎性细胞因子拮抗剂如乌司奴单抗；janus激酶(JAK)抑制剂如托法替尼；SMAD 7抑制剂如mongersen；以及S1P调节剂如奥扎莫德(ozanimod)和艾曲莫德(etrasimod)；以及市场上可能出现的针对上述病症的任何新的试剂。上述治疗药物可以与本发明的分子顺序或同时给药。
治疗剂(例如，改造的WNT激动剂和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子)可在疾病或损伤发作之前、期间或之后给药。对正在进行的疾病的治疗是特别令人感兴趣的，其中治疗稳定或减少患者的不希望的临床症状。这种治疗最好在受影响组织完全丧失功能之前进行。主题治疗最好在疾病症状阶段期间给予，并且在一些情况下，在疾病症状阶段之后给予。在一些实施方案中，题述方法引起治疗益处，例如，预防病症的发展、停止病症的进展、逆转病症的进展等。在一些实施方案中，题述方法包括检测已经实现治疗益处的步骤。普通技术人员将认识到，这种治疗功效的测量将适用于被改善的特定疾病，并且将认识到用于测量治疗功效的适当检测方法。
本说明书中提及的和/或在申请数据表中列出的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开均通过引用整体并入本文中。
从前面的内容可以理解，尽管为了说明的目的，在本文中描述了本公开的具体实施方案，但在不偏离本公开的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，除了受所附权利要求的限制外，本公开不受其他限制。
参考以下实施例可以最好地理解本发明的范围，这些实施例并不旨在将本发明限制于具体的实施方案。
实施例
实施例1
一般方法
利用了分子生物学中的标准方法，并且其描述于例如以下文献中：Maniatis etal.(1982)Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Wu(1993)Recombinant DNA,第217卷,Academic Press,San Diego,Calif。标准方法也出现在Ausbelet al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第1-4卷,John Wiley andSons,Inc.New York,N.Y.中，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
描述了蛋白质纯化方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶，例如，在Coliganet al.(2000)Current Protocols in Protein Science,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York中。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化；参见例如，Coligan et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,第2卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel et al.(2001)Current Protocols inMolecular Biology,第3卷,John Wiley and Sons,Inc.,NY,N.Y.,第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,Mo.；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,第384-391页。描述了多克隆抗体和单克隆抗体的产生、纯化和片段化，例如，在Coligan et al.(2001)Current Protocols in Immunology,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,NewYork；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Harlow和Lane(同上)中。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的。参见例如，Coligan et al.(2001)Current Protocols in Immunology,第4卷,John Wiley,Inc.,New York。
用于流式细胞术的方法，包括荧光活化细胞分选检测系统是可用的；参见例如，Owens et al.(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical LaboratoryPractice,John Wiley and Sons,Hoboken,N.J.；Givan(2001)Flow Cytometry,第2版；Wiley-Liss,Hoboken,N.J.；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley andSons,Hoboken,N.J.。可获得适用于修饰核酸的荧光试剂，包括核酸引物和探针、多肽和抗体，例如以用作诊断试剂。Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,Mo。
描述了免疫系统组织学的标准方法。参见例如，Muller-Harmelink(编辑)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,N.Y.；Hiatt,et al.(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,Pa.；Louis,et al.(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.。
可获得用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库。参见例如，GenBank,VectorSuite(Informax,Inc,Bethesda,Md.)；GCG Wisconsin软件包(Accelrys,Inc.,San Diego,Calif.)；(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nev.)；Menne et al.(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne et al.(2000)Bioinformatics Applications Note16:741-742；Wren et al.(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；vonHeijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690。
以下提供本公开中使用的示例性方法和材料。
RNA原位杂交：
通过RNAscope原位杂交(ACD Bio)检测mRNA的表达。使用的RNAscope探针列出如下。对于比色可视化，遵循标准2.5HD Assay-Red方案(www.acdbio.com)，并在配备有DFC7000T彩色相机的Leica DMi8显微镜上采集图像。对于荧光RNAscope原位杂交，遵循标准RNAscope多重荧光试剂试剂盒v2测定方案(ACD Bio文件#323100-USM)，并与TSA Plus Cyanine 3和5系统偶联。荧光图像是用Leica Thunder成像系统采集的。
RNA分离和RT-qPCR：
在KingFisher(Thermofisher)样品纯化系统上，使用MagMAXTMmirVana(Thermofisher,A27828)总RNA分离试剂盒进行RNA分离。利用Applied Biosystems大容量cDNA反转录试剂盒(Thermofisher,4368814)进行反转录，并使用Applied BiosystemsTaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermofisher,4444557)进行qPCR。
亲和力测量：
通过生物层干涉测量法(BLI)，使用Octet Red 96(PALL ForteBio,Fremont,CA)仪器，在30℃、1000rpm下，使用链霉亲和素(SA)生物传感器，确定R2M13、R2M13-26的Fzd结合部分、Fab与Fzd5,8的每个CRD的结合动力学。将在运行缓冲液(PBS，0.05％ Tween-20，0.5％BSA，pH 7.2)中稀释至25nM的Fzds的生物素化的CRDs捕获到SA生物传感器，然后浸入含有于运行缓冲液中的不同浓度的R2M13 Fab蛋白的孔中或仅具有运行缓冲液作为参考通道的孔中。基于1:1结合模型的拟合，通过Octet System软件计算每种粘合剂的KD。也通过BLI测定检查了R2M13 IgG与10种Fzds的结合特异性。将于运行缓冲液中稀释至50nM的生物素化的Fzd CRDs(H.Chen,Lu,Lee,&Li,2020)捕获到SA生物传感器，然后浸入含有于运行缓冲液中的200nM R2M13 IgG的孔中。
Super TopFlash(STF)测定：
根据确定的方案(H.Chen,Lu,Lee,&Li,2020)，使用含有由WNT响应性启动子控制的荧光素酶基因(Super TopFlash报告子测定，STF)的Huh7人肝细胞，测量Wnt模拟物的信号传导活性。
类器官培养物和增殖测定：
将小鼠小肠类器官维持在小鼠IntestiCultTM类器官生长培养基(STEMCELLtechnologies)中，并每周传代一次，直到Wnt模拟活性测定之日(H.Chen,Lu,Lee,&Li,2020)。为了测定类器官增殖，在振荡下用温和细胞解离试剂(STEMCELL technologies)解离类器官10min，在冷PBS(Gibco)中洗涤2x，并在冰上于Matrigel(Corning)中以1:1重悬。将25μL的于Matrigel中的细胞重悬液接种到预加热的48孔组织培养板上的每个孔的中心，并在37度下固化5min。将300μL基础培养基(表10)、基础培养基+IWP2+抗βGal或基础培养基+IWP2+Wnt模拟物施加到孔上。每种情况包括5-6次重复。培养基和处理在接种后第4天改变一次。在第7天采集3D培养的类器官的图像。
动物饲养：
从Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME,USA)获得7周龄C57Bl/6J雌性小鼠，且每笼饲养4-5只。所有动物实验均符合美国国家科学院编制的“实验动物护理和使用指南”的标准。Surrozen机构动物护理和使用委员会批准了动物实验方案。小鼠在开始实验前至少适应两天。将小鼠在30％-70％的湿度和20℃-26℃范围的室温下保持12/12小时的光/暗循环。
DSS诱导的急性结肠炎：
从第1天至第7天，给7-8周龄雌性C57BL6/J小鼠喂食于饮用水中的4％(wt/vol)葡聚糖硫酸钠(DSS，MP Biomedicals，分子量36-50kDa，Ref#160110)以诱导结肠炎，并从第8天切换为1％ DSS。蛋白质处理在第7天给予一次或在第4天和第7天给予两次。在第10天终止动物，允许6天的蛋白质处理过程，并收获结肠进行组织学和RT-qPCR。在研究中的一项中，在第9天，用抗GFP处理的动物的DSS诱导的小鼠体重减轻了近25％，因此动物被切换到没有DSS的饮用水，以遵守IACUC规则。疾病活动指数(DAI)是基于体重减轻、粪便稠度和肠道出血程度的平均评分计算的(Wirtz Stefan et al.,2017)。分级评分系统按0-4的等级，使用以下参数：体重减轻(0，0％-1％；1，1％–6％；2，6％–12％；3，12％–18％；4，>18％)、粪便稠度(0，正常；1，柔软但仍形成；2，柔软；3，非常柔软、潮湿；4，水样腹泻)和肠出血(0-1，阴性潜血检测(hemoccult)；2，阳性潜血检测；3，粪便中可见的血迹；4，直肠大出血)。
组织组织学：
提取小肠和结肠，并在去除粪便内容物后，称重并测量长度。切下所需的小肠段(十二指肠、空肠、回肠)和结肠段(升结肠、横结肠和降结肠)，并直接在10％中性缓冲福尔马林(NBF)中固定过夜。然后在石蜡包埋之前将组织转移到70％乙醇中。然后将石蜡组织块切片至5μM厚，并用苏木精和伊红(H&E)染色以进行组织学分析。病理学读取由独立病理学家进行。
免疫组织化学和间接免疫荧光：
简言之，将载玻片上5微米厚的福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片脱蜡，然后在蒸锅中进行柠檬酸盐缓冲液(pH 6)抗原回收。然后在自来水中彻底洗涤载玻片，然后在PBST中洗涤1x。随后，在室温下用无血清蛋白块(Agilent,X090930-2)封闭组织切片1小时，然后在一抗中孵育。在一抗孵育后，将组织切片在于PBS(PBST)中的0.1％TX-100中洗涤至少三次，然后在二抗中孵育。然后，用PBST洗涤组织切片，并用具有DAPI的VectashieldVibrance抗荧光淬灭封片介质(Vector Laboratories,H-1800)封固盖玻片。
荧光活化细胞分选(FACS)
按如下所述解离小鼠结肠，并将其重悬于FACS缓冲液(HBSS，2％ FBS，10mMHEPES，1mM丙酮酸钠和1％Pen-strep或抗生素/抗真菌溶液)中。在FACS之前，使细胞通过40微米的过滤器，并加入DAPI以区分活细胞/死细胞。在靶抗体孵育之前，将FcR阻断试剂(Miltenyi Biotec,130-092-575)加入样品中并孵育10分钟。
单细胞RNA测序(scRNA-seq)：组织解离、细胞分离、文库制备、测序
对于急性DSS模型，在整个实验持续期间，用于小鼠的饮用水中的4％ DSS处理小鼠。DSS处理的动物在DSS处理的第4天被给予10mpk R2M13-26或抗GFP抗体。收集每个时间点的来自第5天和第6天的两只未受伤的原始小鼠(无DSS)以及来自抗GFP和R2M13-26处理的DSS动物的每种三次重复的细胞。每只动物都被认为是一次重复。
从每只动物中分离横结肠，并清除粪便。在冷PBS中短暂洗涤后，纵向切割结肠以将管打开成平片，并将组织切割成3-4mm长的片段。在37℃、150rpm的摇床中，将组织片段在预热的(37℃)具有5mM EDTA的PBS中孵育15分钟。15分钟后，将含有样品的试管剧烈摇晃10秒，以释放更多的上皮细胞。漂浮在悬浮液中的上皮细胞被移到新的管中，并在200rcf下离心两分钟。
然后在37℃下，在150rpm水平摇动下，将含有剩余上皮和基质/固有层的残余组织在8-12.5mL固有层解离缓冲液(AdvDMEM/F12，具有10mM HEPES、0.2％FBS、DNAse1(80U/mL)、释放酶TM(0.2mg/mL)和1％抗生素/抗真菌剂)中孵育30分钟。沉淀后，将上皮细胞重悬于1mL具有DNA酶1的TrypLE中，并将它们在37℃下孵育5分钟，并用P1000移液管研磨30秒。研磨后，将10mL PBS加50U/mL DNA酶1加入上皮细胞中，并将它们在500rcf、4℃下离心，并除去上清液。然后将上皮细胞在FACS缓冲液(HBSS，2％ FBS、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和1％Pen-strep或抗生素/抗真菌溶液)中洗涤一次，然后进行另一轮离心，并最终重悬在0.5mL FACS缓冲液中。在LP解离缓冲液中解离30分钟后，将剩余的组织片段和悬浮液在500rcf下离心5分钟。去除上清液至低至1mL，并用P1000研制样品，直到溶液均匀且所有组织片段都已解离。研磨后，将样品在500rcf、4℃下离心5分钟，并在FACS缓冲液中洗涤，然后重新悬浮于1mL FACS缓冲液中，以准备进行FACS。
在FACS之前将所有细胞通过40微米的过滤器。将DAPI用于通过FACS评估活力，并且仅收集存活(DAPI阴性)细胞。使用不含DAPI的阴性对照以确保适当的DAPI门控。从上皮部分收集细胞，然后从上皮/固有层部分收集细胞，并合并(1:5的比例)，并在细胞捕获前在血细胞计数器上计数。使用标准10x Genomics Chromium 3’v3 scRNA-seq试剂(PN1000075)。每个通道装载大约4000-4500个细胞。每个通道捕获来自一个单个动物重复的细胞。遵循标准的10x Genomics Chromium 3’v3scRNA-seq RT、cDNA扩增和测序文库制备方案。在Illumina Nova Seq6000S1泳道上对多重测序文库进行测序，平均每个细胞约50,000个读段。
scRNA-seq分析：
使用10x Genomics Cellranger(version 3.0.2)管线处理Illumina读段数据，其运行小鼠转录组的mm10-3.0.0版本的STAR对准器。然后评估解复用的UMI计数数据，并在探索性数据分析之后，通过使用R软件包scone(版本1.14.0)和数据集特异性过滤截止值来部分去除低质量细胞和低表达基因：仅保留>1000UMIs且>＝500和<＝6500个基因以及小于或等于60000UMIs的细胞，以去除可能的空液滴并限制双联物。过滤线粒体基因百分比比均值多出超过一个标准偏差的细胞。仅获得了在至少三个细胞的上四分位数中表达的基因，产生了16039个基因。使用来自R软件包scran(版本1.18.5；(Lun,Bach,&Marioni,2016)的反褶积缩放对UMI计数数据进行标准化。标准化后，当在降维空间中评估时，没有观察到批次特异性细胞组，也没有观察到QC指标和基因表达主成分之间的强相关性。
对于完整和过滤的数据集，通过使用来自R软件包scran(版本1.18.5)的wrapper函数(buildSNNGraph)，利用k等于40，结合来自R软件包igraph(1.2.6)的cluster_louvain函数，将基于共享最近邻(SNN)图的聚类方法(Xu&Su,2015)应用于来源于数据集中前2000个变异最大的基因的前10个组成分。这允许在3个组织层/谱系(免疫、基质、上皮)内对细胞进行广泛的分组和识别细胞类型。基于该初始聚类，将数据细分为这三个较小的数据集，并使用基于SNN图的方法和利用来自igraph软件包的cluster_walktrap函数实施的、应用于来源于该层/谱系(免疫、基质、上皮)子集内的前2000个变异最大的基因的前15个组成分的walktrap算法，对每个/谱系内的细胞进行聚类。使用确立的标记基因和出版的文献确定细胞类型/亚型特征。
在聚合生物重复样品内的单个细胞后，利用R软件包edgeR(版本3.32.1)(Y.Chen,Lun,&Smyth,2016；Robinson,McCarthy,&Smyth,2010)，对伪批量(pseudobulk)样品进行实验条件之间的差异基因表达分析。这种类型的DE分析在谱系水平和细胞类型/簇水平上实施。对每个时间点(24小时或48小时)进行三个层/谱系(上皮、基质、免疫)中的每个内的以及每个谱系内的单个簇/细胞类型内的实验条件(DSS损伤相对于未受损的，以及对于R2M13-26处理的相对于抗GFP处理的，在DSS受损的样品内)之间的差异表达比较。基因集富集分析(GSEA)，也称为通路分析，通过执行来自R软件包edgeR(版本3.32.1)(Y.Chen,Lun,&Smyth,2016)的fry函数来应用。基因集从Broad研究所的分子特征数据库(MSigDB)获得，并且包括KEGG、Biocarta、PID、Reactome、ST、SIG、SA类型的Hallmark和精选(C2)基因集。还执行了edgeR软件包的kegga函数，其仅使用KEGG通路，并观察到类似的结果(数据未显示)。为了鉴定在一种实验条件下相对于另一种实验情况下差异富集的通路，以成对和更具体的对比方式将GSEA应用于通过重复聚合的伪批量样品。
使用R软件包slingshot(版本1.8.0；(Street et al.,2018)进行谱系轨迹推断。
为了确定R2M13-26影响Wnt靶基因表达的能力，将具有文献支持的另外的基因添加到Wnt信号传导靶基因列表(Gougelet et al.,2014)，以及组织层差异表达的基因，并且显示在表7中。表7显示了当比较24小时或48小时的R2M13-26处理和抗GFP处理时，上皮谱系内差异表达的Wnt靶基因。基于<0.05的调整p值(错误发现率(FDR))过滤差异表达。
实施例2
改造的WNT激动剂
合成了IgG1形式的改造的Wnt激动剂，包括具有融合到Fzd结合抗体的每条轻链的N端的人源化Lrp5/6结合域的Wnt激动剂。说明性的结构显示在图1中。Lrp5/6结合域来源于选自以下的各种骆驼单链抗体(VHH)结合域：VHH03、VHH26或VHH36。VHH03结构域结合Lrp5；VHH26结构域结合Lrp6；并且VHH36结构域结合Lrp5和Lrp6。骆驼单链抗体通过保留CDR序列但用人抗体主链取代其他序列而被人源化。对所得到的LRP5/6结合域进行修饰，以消除潜在的阻碍。
按如下所述进行VHH26的人源化。骆驼VHH结构域的人源化被认为是具有挑战性的，因为它们来源于缺乏异四聚体人IgG1抗体中存在的VL:CL或VH:CH相互作用的单链同源二聚体抗体。骆驼VHHs的表面特性(Muyldermans(2013)Annu.Rev.Biochem.82:775-797；Vincke et al(2009)J.Biol.Chem.284:3273-3284)在进化上被重塑，以优化单链抗体的同源二聚体性质的稳定性。最初通过将CDR接枝(对于综述：Safdari et al.,(2013)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.27:175-186)到具有最高序列同一性的人类种系序列中来进行骆驼VHH26的人源化。在随后的步骤中，制造了数种对于骆驼序列具有回复突变的不同的人源化VHH26构建体，以鉴定具有最佳表达、同质性和生物物理特性，如与Lrp6受体的结合亲和力的改造的VHH。VHH26(表1)与其最接近的人类种系序列IGHV3-23*01的比对如图2A所示。表1列出了六种不同的人源化VHH26(H1-H6)的序列，并且它们与亲本VHH26的比对如图2B所示。
在具有C端六组氨酸标签的Expi293细胞中瞬时表达这六种人源化VHH26变体H1-H6和亲本VHH26(以80mL规模)。使用His-Complete树脂(Roche,USA)，按照标准程序纯化蛋白质。通过SDS-PAGE和SEC(尺寸排阻色谱法)分析VHH26及其人源化变体的表达水平和同质性。对于Lrp6:VHH26亲和力确定，在30℃下，使用Octet Red 96(PALL ForteBio,Fremont,CA)仪器、1000rpm链霉亲和素(SA)生物传感器，通过生物层干涉测量法(BLI)，确定VHH26-H1、VHH26-H2、VHH26-H3、VHH26-H4、VHH26-H5、VHH26-H6和VHH26_His与生物素化的LRP6E3E4的结合动力学(Chen et al.,(2020)Cell Chemical Biol.27,1–12)。将在运行缓冲液(PBS，0.05％ Tween-20、0.5％ BSA，pH 7.2)中稀释至50nM的生物素化的LRP6E3E4捕获到SA生物传感器，然后浸入含有于运行缓冲液中的不同浓度的所示VHH26蛋白的孔中或仅具有运行缓冲液作为参考通道的孔中。基于1:1结合模型的拟合，通过Octet System软件计算每种粘合剂的KD。从用Octet Data Analysis 9.0(PALL ForteBio,Fremont,CA)测试的不同浓度分子的七个技术重复中计算每项实验的动力学值(Kon、Koff、KD)。
VHH26及其人源化变体的SDS-PAGE、SEC和Octet-BLI特征如图3A至图3B所示。对Ni拉下样品的SDS-PAGE分析揭示出，在六种VHH26人类变体中，与VHH26-H1、VHH26-H3和VHH26-H6相比，VHH26-H2、VHH26-H4和VHH26-H5显示出更高的表达水平(图3A)。对所有六种人源化VHH26构建体的SEC分析揭示了两个峰值，并且结果总结在图3B中。通过Octect-BLI检查这些峰中每一个的中心部分与Lrp6相互作用的能力。表2中列出了VHH26构建体和Lrp6E3E4结构域之间相互作用的动力学参数，如kon、koff和KD。对这些参数的分析揭示出，与亲本VHH26相比，在VHH26-H5人源化变体的情况下，对Lrp6的结合亲和力受到的影响最小(表2；图3B)。对于比较，亲本VHH26和VHH26-H5的比对如图2B所示。
基于上述结果，VHH26-H5在其他实验中被用作与Fzd结合域融合的人源化LRP结合域，例如四价的双特异性WNT激动剂。Fzd结合域来源于结合Fzd5和Fzd8的R2M13抗体，并包括保留FcRn结合的无效应Fc区，例如LALAPG或N297G(Wang X et al.,Protein Cell 2018,9:63–73)。N297G是IgG1抗体的无糖基化(aglycosylated)形式，其中Asn被Gly取代。在R2M13-26人源化N297的情况下，N297对应于氨基酸N302，因此N297G突变可替换地称为N302G。LALAPG代表IgG1的Fc结构域中的三个突变。使用经典的IgG1序列编号，Leu234和Leu235突变为Ala；类似地，Pro329突变为Gly。因此，Fc结构域中的这种三重突变体被称为“LALAPG”。在R2M13-h26的情况下，这些突变分别位于序列位置239、240和334中。VHH26-H5经由五个氨基酸的接头与R2M13抗体的轻链的N端融合，从而产生包含R2M13抗体的IgG样分子，其中VHH在两条抗体轻链的N端。
表3中提供了通过存在于各种Wnt激动剂中的氨基酸接头与各种LRP5/6VHH结合域融合的R2M13重链IgG和R2M13轻链的序列。没有LALPG或N297G修饰的亲本R2M13-03、R2M13-26、R2M13-36Wnt激动剂中存在的重链和轻链的序列在第WO2019/126398号PCT申请公开中作为SEQ ID NOs:136-138(分别为轻链)和SEQ ID NO:153(重链提供，其通过引用整体并入本文中。所示的Wnt激动剂包括抗体型形式的两条重链和两条轻链，其中链经由二硫键连接。
表1：VHH26的亲本和六种人源化变体的序列
表2：VHH26构建体和Lrp6E3E4结构域之间相互作用的动力学参数
构建体名称 SEC部分 kon koff KD nM
VHH26-H1 C3 1.42E+04 3.98E-03 281
VHH26-H2 G3 2.44E+05 6.84E-02 280
VHH26-H3 C3 1.84E+04 7.75E-03 422
VHH26-H4 G3 2.90E+04 5.56E-03 192
VHH26-H5 C3 1.35E+05 1.47E-02 109
VHH26-H6 G3 1.72E+04 8.36E-03 486
VHH26(亲本) D3 1.05E+06 1.82E-02 17
VHH26-H1 C1 ND ND ND
VHH26-H2 G1 1.48E+05 6.53E-02 441
VHH26-H3 C1 1.63E+04 5.22E-02 3203
VHH26-H4 G1 1.44E+05 9.51E-02 662
VHH26-H5 C1 4.28E+05 1.77E-02 41
VHH26-H6 G1 4.52E+04 3.11E-02 687
VHH26(亲本) D3 8.10E+05 1.77E-02 22
表3：WNT激动剂重链和轻链的序列。
使用Super TOPFlash萤光素酶报告子(STF)测定法确定在完整改造的Wnt激动剂形式的情况下，具有与各种人源化Lrp结合域配对的Fzd结合物R2M13的Wnt激动剂的活性，该测定法测量Wnt应答的Huh-7报告子细胞系(Huh-7STF)中经典Wnt信号传导的激活。结果如图4所示。R2M13-人源化的_26-LALAPG构建体(“R2M13-26人源化的LALAPG”；本文中也称为R2M13-h26、R2M13-h26-LALAPG或人源化的LALPG)显示出人源化的Lrp结合域的最高活性。R2M13-人源化的_26-N297G构建体(R2M13-26人源化的N297G；人源化的N297G)不稳定。当与R2M13配对时，VHH03和VHH36的人源化显著降低了体外效力，尽管它们的绝对EC50值与与和R2M13配对的VHH26相当。R2M13-人源化的_26-LALAPG构建体(R2M13-h26)的重链和轻链的序列如图6所示。该构建体由通过二硫键结合的两条重链和两条轻链组成。Fc结构域中的LALAPG突变去除了效应器功能(参见例如，Wang,et al.(2018)Protein Cell.9:63-73)。显示了R2M13-h26构建体的各种结构域，并且可以基于这些容易地确定其他构建体的结构域。
实施例3
DSS急性结肠炎动物模型中改造的Wnt激动剂的剂量反应
本研究的目的是检查第2020-0308287号美国专利申请公开中公开的Fzd5,8特异性Wnt模拟物R2M13-26的功效及其在急性DSS结肠炎小鼠模型中的剂量反应，在急性DSS结肠炎小鼠模型中表征不同剂量和频率的R2M13-26的体内活性，以及评估R2M13-26对以下因素的影响：1)体重、粪便评分和潜血，2)通过组织学的上皮/屏障修复，以及3)血清和结肠中的炎性细胞因子。
从Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME,USA)获得6-8周龄C57Bl/6J雌性小鼠(共86只)，且每笼饲养5只。所有动物实验均符合美国国家科学院编制的“实验动物护理和使用指南”的标准。Surrozen机构动物护理和使用委员会批准了动物实验方案。
为了诱导急性结肠炎，7-8周龄雌性小鼠被随意给予含有4.0％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS,MP Biomedicals,MFCD00081551)的饮用水7天，然后给予含有1.0％(w/v)DSS的饮用水3天。各组小鼠未经处理、用同种型对照抗体(抗GFP)处理，或者用所示的改造的Wnt激动剂处理，在第4天处理一次，或者在第4天和第7天处理两次。
每周一次以1、3、10、30mg/kg和每周两次以0.3、1、3、10mg/kg进行R2M13-26处理，降低了急性DSS小鼠模型中的疾病活动指数(DAI)。从1mg/kg R2M13-26开始的单一剂量或每周两次剂量能够修复受损的结肠上皮，改善组织学评分。从1mg/kg R2M13-26开始的单一剂量或每周两次剂量能够降低血清炎性细胞因子和结肠细胞因子水平。
本研究证实，在急性DSS小鼠模型中，单独的Fzd5,8特异性Wnt模拟物(R2M13-26)能够改善疾病活动指数，修复受损的结肠上皮，并降低结肠和血清中的炎性细胞因子水平。总之，在急性小鼠IBD模型(急性DSS)中，R2M13-26利用宽剂量范围的处理，改善了粪便评分和体重，修复了受损的结肠上皮，并降低了结肠和血清中的炎性细胞因子水平。
实施例4
改造的Wnt激动剂修复DSS急性结肠炎动物模型中受损的结肠上皮
在急性结肠炎DSS模型中测试了各种改造的人源化的WNT激动剂，如图7中概括的。所测试的构建体包括非人源化的和人源化的形式，包括：R2M13-03-LALAPG、R2M13-26-LALAPG、R2M13-36-LALAPG、R2M13-人源化的-03-LALAPG、R2M13-人源化的-26-LALAPG、R2M13-人源化的-36-LALAPG、R2M13-人源化的-03-N297G和R2M13-人源化的-36-N297G。
从Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME,USA)获得6周龄C57Bl/6J雌性小鼠(共96只)，且每笼饲养5只。所有动物实验均符合美国国家科学院编制的“实验动物护理和使用指南”的标准。Surrozen机构动物护理和使用委员会批准了动物实验方案。小鼠在开始实验前至少适应两天。小鼠在30％-70％的湿度环境和20℃-26℃范围的室温下保持12/12小时的光/暗循环。
为了诱导急性结肠炎，7-8周龄雌性小鼠被随意给予含有4.0％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS,MP Biomedicals,MFCD00081551)的饮用水7天，然后再给予含有1.0％(w/v)DSS的饮用水3天(图7)。各组小鼠未经处理、在第4天和第7天用同种型对照抗体(抗GFP)处理，或者用1mg/kg所示的改造的Wnt激动剂处理。所有蛋白质处理在终止时均显示出相当的血清抗体暴露(图7)。
接受DSS的对照处理的动物发展出严重的结肠炎，其特征是严重且持续的体重减轻和带血腹泻，导致粪便评分所代表的疾病活动指数增加。用LALAPG或N297G形式的人源化的R2M13-26和人源化的R2M13-36处理，显著改善了DSS小鼠的体重。与亲本构建体相比，人源化的R2M13-36-LALAPG的体重有显著改善。这些构建体还显著降低了DSS小鼠中的疾病活动指数(DAI)(图8)；降低了DSS小鼠中的粪便平分；增加了DSS小鼠中的结肠长度和粪便；并增加了DSS小鼠中的结肠长度和重量。此外，人源化的R2M13-26(H-LALAPG 26)和人源化的R2M13-36(H-LALAPG 36)降低了炎性细胞因子、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)(图9)以及脂质运载蛋白-2的血清水平，它们在DSS处理组中升高(图10)。与亲本构建体相比，人源化的R2M13-36-LALAPG的体重有显著改善。此外，人源化的R2M13-26-LALAPG(R2M13-h26-LALAPG)被证明可以在体内恢复上皮紧密连接标志物ZO-1(图11)，修复受损的结肠上皮(图12)，并恢复上皮细胞谱系，包括结肠细胞、杯状细胞和簇状细胞(图13)。因此，人源化的R2M13-26和人源化的R2M13-36在DSS小鼠中均显示出良好的功效。
实施例5
改造的Wnt激动剂的药代动力学(PK)
通过测量大鼠给药后不同时间血清中抗体的量，并与从小鼠获得的数据进行比较，确定静脉注射后亲本R2M13-26(R2M13-26-LALAPG)和人源化的R2M13-26(R2M13-h26-LALAPG)的药代动力学(PK)(图14)。人源化的R2M13-26(R2M13-h26)的Cmax高于亲本R2M13-26(R2M13-26)，因此差异会随时间而延续；然而，倍数差异随时间而增加。人源化的R2M13-26具有的清除率(25.3mL/天/kg)低于亲本R2M13-26(40.0mL/天/kg)，并且人源化的R2M13-26比亲本R2M13-26(2.47天)具有更长的半衰期(3.75天)。
实施例6
DSS慢性结肠炎模型中改造的Wnt激动剂的评估
由于R2M13-26处理改善了DSS模型中的急性结肠炎(实施例3)，因此在DSS冲洗的重复周期的不同时间点，在慢性结肠炎的DSS模型中测试了改造的Wnt激动剂R2M13-20，以证明改造的Wt激动剂在慢性结肠炎模型中的功效。
从Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME,USA)获得6-8周龄C57Bl/6J雌性小鼠，且每笼饲养4-5只。所有动物实验均符合美国国家科学院编制的“实验动物护理和使用指南”的标准。Surrozen机构动物护理和使用委员会批准了动物实验方案。
为了诱导慢性结肠炎，雌性小鼠被随意给予三个周期的含有3.0％(w/v)的葡聚糖硫酸钠(DSS,MP Biomedicals,MFCD00081551)的饮用水5天，然后给予纯饮用水7天。在第16、19、28和31天，将各组小鼠用同种型对照抗体(抗GFP)处理，或者用4剂剂量的R2M13-26-LALAPG(R2M13-26)以10mg/kg处理。在第33天终止动物。
R2M13-26处理改善了慢性DSS模型中的体重和疾病活动指数。R2M13-26还改善了结肠组织学。另外，R2M13-26在研究终结的第33天降低了血清炎症介质IL-6和脂质运载蛋白-2(数据未显示)。
实施例7
改造的Wnt激动剂对DSS急性结肠炎模型的影响
实施例3和实施例4证明Fzd5,8特异性R2M13-26和R2M13-h26 Wnt激动剂在治疗急性小鼠结肠炎(急性DSS)模型中是有效的。本研究的目的是使用类似的模型系统，建立对R2M13-26在整个修复过程中影响结肠中的细胞的作用机制的更全面的理解。
从Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME,USA)获得6-7周龄C57Bl/6J雌性小鼠，且每笼饲养4-5只。所有动物实验均符合美国国家科学院编制的“实验动物护理和使用指南”的标准。Surrozen机构动物护理和使用委员会批准了动物实验方案。
为了诱导急性结肠炎，雌性小鼠被随意给予含有4.0％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS,MP Biomedicals,MFCD00081551)的饮用水7天，并给予含有1.0％(w/v)DSS的饮用水3天。各组小鼠未经处理，在第4天用对照抗体(抗GFP)处理，或者用单次腹膜内注射的R2M13-26-LALAPG(R2M13-26)处理。总共123只小鼠被分组：(第3天＝13，第4天＝13，第5天＝26，第6天＝24，第7天＝26，第10天＝21)，其中91只用于组织学终点，且21只用于scRNA-seq(因机制原因而取消的组)。测量每日食物摄入量、BW、粪便评分和潜血。终止时，对小鼠进行如下处理：A-E组：收集横结肠进行qPCR和组织学检查(A组在第3、4天终止；C组在第3、4、5、6、7天终止；且B、D和E组在第5、6、7和10天终止)。测定/终点包括RT-qPCR、组织学、scRNA-seq、粪便稠度和潜血的粪便评分、疾病活动指数(DAI)＝(BW减轻+粪便稠度+血液)/3、血清炎性细胞因子(TNF-a、IL-6、脂质运载蛋白2)和解剖病理学：升结肠、横结肠和降结肠、H&E。组织病理学评分标准包括：炎症严重程度、炎症范围、粘膜侵蚀、隐窝增殖和杯状细胞损失。
在第3天至第7天，在DSS的PBS和抗GFP处理之间没有观察到差异(数据未显示)。然而，用R2M13-26处理在第5天至第10天表现出更健康的结肠组织，R2M13-206处理的动物到第7天有明显的组织学改善(数据未显示)。R2M13-26改善了DSS小鼠中的排便平分和BW减轻(数据未显示)，从而改善了小鼠中的实验性结肠炎。
对批量结肠样品进行RT-qPCR分析，以评估基因表达的变化。Wnt诱导的检查显示DSS的Axin2显著降低。R2M13-26在无DSS条件下诱导Axin2的表达。增殖标志物的检查显示，在第4天利用DSS&通过R2M13-26挽救显著降低了Ki67。在DSS存在的情况下，R2M13-26挽救了Cdk1的下调。干细胞标志物的分析显示，在第4天利用DSS显著降低了Lrig1，并通过R2M13-h26被挽救。关于IBD的临床标志物，在第5天&第6天观察到Gpx2的显著上调。
对于检查DSS模型中基因表达的scRNA-seq实验，在整个实验持续期间，用于小鼠的饮用水中的4％ DSS处理小鼠。DSS处理的动物在DSS处理的第4天被给予10mpk R2M13-26或抗GFP抗体。在第5天和第6天，分别在给药后24小时和48小时收集三只Wnt激动剂和抗GFP给药动物中的每只。在第5天和第6天的时间点，还采集了两份原始的、未受损的动物样品。在终止时收集结肠、小肠、脾脏和肝组织，并检查或冷冻以用于mRNA分析。对新鲜横结肠样品进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，以进行单细胞分离，并对新鲜横结肠进行RT-qPCR，以仅分离上皮。
从每只动物中分离横结肠，并清除粪便。在冷PBS中短暂洗涤后，纵向切割结肠以将管打开成平片，并将组织切割成3-4mm长的片段。在摇床中，在37℃、150rpm下，将组织片段在预热的具有5mM EDTA的(37℃)PBS中孵育15分钟。15分钟后，将含有样品的试管剧烈摇晃10秒，以释放更多的上皮细胞。将漂浮在悬浮液中的上皮细胞移到新的管中，并在200rcf下离心两分钟，以沉淀从组织中解离的上皮细胞。然后在37℃下，在150rpm水平摇动下，将含有剩余上皮和固有层的残余组织在8-12.5mL固有层解离缓冲液中孵育30分钟。沉淀后，将上皮细胞重悬于1mL具有DNA酶1的TrypLE中，并将上皮细胞在37℃下孵育约8分钟，并用P1000移液管研磨约25次。研磨后，在500rcf、4℃下离心上皮细胞，并除去上清液。然后在FACS缓冲液中洗涤上皮细胞一次，然后进行另一轮离心，并最终重悬于0.5mL FACS缓冲液中。在LP解离缓冲液中解离30分钟后，将剩余的组织片段和悬浮液在500rcf下离心5分钟。去除上清液至低至1mL，并用P1000研磨样品，直到溶液均匀且所有组织片段都已解离。研磨后，在4℃下，将样品在500rcf下离心5分钟，并在FACS缓冲液中洗涤，然后悬浮在1mL FACS缓冲液中，以准备进行FACS。
所有细胞在FACS之前通过40微米过滤器。将DAPI用于通过FACS评估活力，并且仅收集存活(DAPI阴性)细胞。从上皮部分收集细胞，然后从上皮/固有层部分收集细胞，并合并，并在血细胞计数器上计数，然后进行细胞捕获。遵循标准的10x Genomics 3’v3 scRNA-seq方案，且每个通道装载约4500-5000个细胞。每个通道捕获来自单只动物的样品。遵循标准10x Genomics 3’v3 scRNA-seq RT、cDNA扩增和测序文库制备。在Illumina Nova Seq6000S1泳道上对多重测序文库进行测序。
使用10x Genomics Cellranger管线处理Illumina读段数据。然后评估多重UMI计数数据，并去除低质量细胞和低表达基因。使用来自R软件包scran的去卷积缩放对UMI计数数据进行标准化，并且使用R软件包scran，使用基于SNN图的聚类方法对细胞进行聚类。使用确立的细胞类型标志物确定细胞类型特征。通过使用R软件包clusterExperiment来运行EdgeR，使用每个谱系内的一个对所有和成对的比较，在单细胞水平上对每个聚类进行差异基因表达。在基于谱系水平或细胞类型/簇水平聚合生物重复样品后，利用R软件包edgeR对伪批量样品进行实验条件间的差异基因表达分析。对每个时间点(24小时或48小时)进行沿着上皮谱系的和代表上皮谱系内的细胞类型的单个簇内的实验条件(DSS受损的相对于未受损的，然后对于R2M13-26处理的相对于抗GFP处理的，在DSS受损的样品内)之间的差异表达比较。
R2M13-26主要通过直接影响结肠上皮细胞来发挥其影响，这是由于FZD5在肠上皮细胞上的高表达及其在干细胞和祖细胞群中的富集。当比较R2M13-26和对照处理之间整个上皮谱系及其包含的所有细胞类型的表达时，以下Wnt靶基因增加(表7)。如果在上皮谱系中，分子在处理和对照之间表现出至少两倍增加并且文献中已表明它们是直接的Wnt靶标，则选择这些分子。大多数Wnt靶基因取自Gougelet et al.(2014)中发表的遗传操作和染色质免疫沉淀实验。另外的scRNA-seq数据如表4至表6和表8所示。
除了研究在整个上皮谱系中表现出显著变化的分子，还将scRNA-seq数据用于检查特定细胞类型，并比较R2M13-26处理的细胞和对照处理的细胞之间的基因表达，以鉴定上皮谱系中每种相关细胞类型中增加或减少的Wnt靶基因。对以下相关上皮细胞类型进行了这种类型的差异表达分析：干细胞、TA1、TA2、基底杯状细胞、损伤诱导的替代祖细胞(AltEnteroPC)、损伤诱导的替代肠细胞(AltEntero)、肠细胞前体(EnteroPrecur)、杯状细胞1、杯状细胞2、肠内分泌细胞和簇状细胞。表7中显示了上皮谱系中具有例如log2倍变化的作为整体和/或在特定上皮亚型中调节的Wnt靶基因的组合列表。scRNA-seq实验中检测到的上皮细胞热图如图26B所示。
当与R2M13-26和对照处理之间的聚合的上皮谱系和/或其包含的任何细胞类型的表达比较时，许多分子被鉴定为显著增加或减少。如果在IBD的急性DSS小鼠模型中，分子在上皮谱系中或在至少一种上皮细胞类型中的处理和对照之间表现出至少两倍变化，则选择这些分子。这些分子如表4至表8所示。
将R2M13-26处理后增加的基因与确立的细胞周期基因(Giotti et al.,2019)列表进行交叉，以鉴定参与细胞周期进展和调节的基因，这些基因通过用R2M13-26处理而增加。表4列出了已鉴定的基因。Wnt信号传导的一种确立的作用是维持干细胞和祖细胞，并且调节细胞周期是该功能的一个重要方面(Davidson,2010；Hirata 2013)。R2M13-26促进了受损结肠上皮中干细胞和祖细胞的扩增，这对它们再生上皮的能力至关重要。这些数据表明，这些基因中的数个也是直接的Wnt靶标(表8)。
除了促进干细胞和祖细胞的扩增以促进上皮的再生，Wnt信号传导对于维持和更新干细胞和祖细胞库以及调节其分化也是至关重要的(Pinto et al.,2003；Ma et al.,2016)。R2M13-26通过维持干细胞和祖细胞促进上皮的修复和再生，参与这一过程的数个关键基因的表达增加证明了这一点(表8)，包括Id1(Hollnagel 1999；Meteoglu 2008；Ruzinova2003)、Nhp2(Fong 2014；McCann 2020)和Hmga2(Nishino 2008；Parisi2020)、Foxq1(Tu 2018；Zhang 2018)和Aldh1(Tomita 2016)。此外，还对Areg的表达具有影响，Areg是EGFR信号传导的配体，后者对肠道干细胞生态位维持很重要(Fujii 2008；Mahtouk2005；Suzuki 2010；Takahashi2020)。另一有趣的分子是胰高血糖素(Gcg)，在R2M13-26处理后，它在一些干细胞和祖细胞中被诱导并表现出显著增加的表达。胰高血糖素可以被加工成多种小肽，其中包括GLP-1和GLP-2，它们在减轻IBD中的炎症方面起作用。GLP-2还充当生长因子来促进干细胞和祖细胞增殖以及上皮隐窝的再生(Drucker 1999；Markovic2019；Zatorski 2019)。这些数据表明，Wnt信号传导激活增加了胰高血糖素的表达，其将导致GLP-2水平的增加，并有助于干细胞和祖细胞的扩增。
除了调节干细胞和祖细胞的自我更新和分化，组织修复和上皮再生的一个关键方面是修复细胞内和细胞外损害以及重建上皮屏障。为此目的，R2M13-26处理后诱导和/或增加的数个基因与这些过程有关(表6)。例如，Apex1对DNA修复至关重要(Park 2014)。粘液产生和粘液屏障的功能障碍是IBD的关键方面(Antoni 2014；Dorofeyev 2013；Kim,Ho2010)。通过R2M13-26处理增加的数个基因促进粘液分泌和粘液屏障的建立(B3gnt7、Agr2、Muc2、Muc3、Tff3、Fcgbp和Zg16)。这些基因在粘液产生、加工和粘液分泌中起着重要作用(Agr2：Bergstrom 2014；Park2009；B3gnt7：Arike 2017；Fcgbp：van der Post 2019；Muc2、Muc3：Arike2017；Svensson 2018；Kim 2010；Ho 2006；Tff3：Aihara 2017；Zg16：Bergstrom2016。另外，Sprr2a3——一种参与上皮屏障形成的富含脯氨酸的小重复蛋白质成员(Gibbs1993)被富集。
重要的是，这些基因中的许多的表达减少或缺失与小鼠模型中结肠炎的严重程度增加和/或IBD的发展和进展有关(Dorofeyev 2013；van der Post 2019)。例如，在严重CD和UC中，MUC2、MUC3和TFF3的表达减少(Dorofeyev 2012)。在小鼠结肠炎模型中，MUC2的减少使小鼠对DSS诱导的结肠炎更敏感(Kim,Ho 2010)。此外，GWAS研究已经鉴定了Agr2的风险等位基因，这些基因似乎会在促进IBD时降低其表达(Zheng 2006)。
除了通过调节干细胞和祖细胞增殖和分化、细胞修复和屏障形成来影响上皮修复和再生，R2M13-26还促进了许多与减少损伤和IBD中的炎症反应相关的基因和通路的表达(表5)。这些分子具有抗炎效应和/或其减少与炎症增加或IBD恶化有关。
R2M13-26处理组在注射后24小时和48小时对血清抗体浓度表现出剂量反应，并且R2M13-26在1、3和10mpk给药下表现出线性。R2M13-26在单次腹膜内注射后两天增加了Axin2和Ki67的表达(图25)，并且R2M13-26在注射后两天增加了LGR5的表达。R2M13-26处理在注射后2天增加了闭合蛋白的表达。
实施例8
DSS结肠炎模型中改造的WNT激动剂相比其他试剂的评估
实施例3和实施例4证明Fzd5,8特异性R2M13-26和R2M13-h26在治疗急性小鼠结肠炎(急性DSS)模型中有效，并且实施例6证明R2M13-206在治疗慢性小鼠结肠炎(慢性DSS)模型中有效。本研究的目的是将R2M13-h26在治疗结肠炎模型中的有效性与其他试剂的有效性进行比较，包括环孢菌素A、抗TNF抗体和抗IL-12/23抗体。从Jackson Laboratories(BarHarbor,ME,USA)获得6-7周龄C57Bl/6J雌性小鼠，且每笼饲养4-5只。所有动物实验均符合美国国家科学院编制的“实验动物护理和使用指南”的标准。Surrozen机构动物护理和使用委员会批准了动物实验方案。
环孢菌素A的研究概括在图15中。为了诱导急性结肠炎，雌性小鼠被随意给予含有4.0％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS,MP Biomedicals,MFCD00081551)的饮用水7天，并给予含有1.0％(w/v)DSS的饮用水3天。各组小鼠未经处理、用同种型对照抗体(抗GFP)处理，或者在第4天用一次或在第4天和第7天用两次注射经覆膜内注射所示剂量的R2M13-h26进行处理，或者用图示的环孢菌素A处理。
R2M13-h26处理比环孢菌素A更多地改善体重、降低粪便评分和降低疾病活动指数(DAI)(图16)。另外，R2M13-h26在体内比环孢菌素A更有效地修复结肠上皮(图17)，改善结肠组织学评分(数据未显示)，并比环孢菌素A更多地降低血清炎性细胞因子水平(数据未显示)。总之，R2M13-h26在低至每周两次1mg/kg或2mg/kg单一剂量下表现出修复结肠上皮、改善组织学和疾病活动指数(DAI)，以及减少炎性细胞因子的疗效。环孢菌素A对降低DAI和脂质运载蛋白-2表现出温和的效应，并且通常远不如R2M13-h26有效。
比较慢性DSS模型中R2M13-h26与抗TNF的研究概括在图18中。小鼠被给予3％DSS，持续间隔7天的三个7天周期，然后是3天的1％ DSS冲洗期，导致慢性肠上皮损伤。以1、3或10mpk给予R2M13-h26处理，进行2、4或6次注射。以5或25mpk给予抗TNF，进行4或7次注射。在第38天读数。
在慢性DSS结肠炎模型中，R2M13-h26比抗TNF更有效地修复结肠上皮(图19)。R2M13-h26降低了结肠组织学评分，改善了体重，降低了粪便评分，并降低了DAI，而抗TNF对这些疾病参数没有影响(图20，且数据未显示)。在慢性体内模型中，R2M13-h26还比抗TNF更多地降低血清炎性细胞因子水平、脂质运载蛋白-2和IL-6(图21)。在慢性小鼠IBD模型(在38天内具有3个重复DSS损伤周期的慢性DSS)中，不同给药方案(从1mg/kg 4剂剂量到10mg/kg 2、4或6剂剂量)的Fzd5,8特异性R2M13-h26能够实现对结肠上皮的修复、组织学和疾病活动指数的改善以及炎性细胞因子的减少的显著影响。相比之下，抗TNF Ab不能改善慢性DSS小鼠中的上皮损伤或DAI。
在慢性DSS结肠炎小鼠模型中，还检测了抗IL12/23p40相对于R2M13-h26在以下方面的功效：1)体重、粪便评分和潜血，2)通过组织学的上皮/屏障修复，以及3)血清炎性细胞因子。将6-8周雌性C57BL/6小鼠用3.0％葡聚糖硫酸钠(DSS)处理三个周期，以诱导慢性结肠结肠炎，如图22中概括的。前两个周期由利用DSS的7天和基于无DSS的水的7天组成，并且第三个周期由基于3％ DSS的7天和基于1％ DSS的3天组成。以0.1和1mpk给予R2M13-h26处理，进行4次注射。以3或10mpk给予抗IL 12/23，进行4次或8次注射。抗IL12/23p40是来自Invivoplus Bioxcell的克隆C17.8。在第38天进行读数。
R2M13-h26处理降低了慢性DSS小鼠模型中的疾病活动指数(DAI)，而抗IL12/23p40处理则没有(图23)。另外，R2M13-h26处理比抗IL12/23更有效地降低血清细胞因子水平(图24)。该研究证实，在慢性DSS小鼠模型中，R2M13-h26能够修复损害的结肠上皮并降低血清炎性细胞因子水平，而BioXcell的抗IL12/23p40单克隆抗体则不能。
实施例9
改造的Wnt激动剂对Wnt通路激活和炎症减少的影响
选择性的Wnt通路激活
Fzd5在右旋糖酐硫酸钠或DSS诱导的结肠炎小鼠模型的结肠中高度表达。在该模型中，DSS暴露导致肠道屏障破坏，导致类似于在IBD患者中看到的炎症反应。观察到R2M13-h26与DSS受损的肠细胞结合，刺激如通过WNT通路中的下游靶基因Axin2的表达测量的Wnt信号传导，恢复组织结构、上皮细胞类型组成和上皮屏障功能。暴露于DSS七天的小鼠导致肠道屏障破裂，这可以在结肠的染色横截面中很容易地可视化。在没有DSS的情况下，有完整的肠壁，并且隐窝紧密堆积，以形成连续的结构。暴露于DSS然后用阴性对照抗体抗GFP处理，导致数种效应：肠壁破裂；结肠隐窝收缩；以及到第十天产生多个不连续的节段。然而，在第4天和第7天给予的R2M13-h26处理的DSS暴露小鼠导致这种损伤的剂量依赖性修复，1mg/kg或更高的剂量恢复了通过组织学可见的大部分损伤。在DSS的慢性模型中观察到类似的结果。利用R2M13-h26，通过组织学测量的上皮修复程度大于在利用环孢菌素A、抗TNF抗体或抗IL12/23抗体的另外的实验中获得的程度。
组织学染色显示，利用R2M13-26和R2M13-h26给药进行处理导致作为细胞间结构的紧密连接标志物的恢复，细胞间结构有助于肠道屏障，其阻止肠道和腹腔之间的自由物质交换。在健康的肠道组织中，发现紧密连接的一种组分，即闭锁小带(zonula occludens)1蛋白或ZO-1，是沿着肠道刷边界的一个连续层。在DSS受损的肠组织中，ZO-1的连续表达模式被破坏。R2M13-h26-LALAPG处理使ZO-1定位恢复为沿肠道刷边界的连续层(图11)。
炎症减少
在小鼠DSS模型中，用R2M13-h26给药进行处理导致大量炎性细胞因子如TNFα、白细胞介素-6或IL-6和白细胞素-8或IL-8的显著剂量依赖性降低。在结肠组织和血清中都观察到细胞因子水平的降低(数据未显示)。这些结果表明R2M13-h26不仅具有直接修复上皮的潜力，而且因此具有减少炎症的潜力。
实施例10
用Wnt模拟物处理快速修复DSS受损的结肠上皮
各种葡聚糖亚硫酸钠(DSS)诱导的结肠结肠炎模型被广泛用作临床前模型，以研究旨在治疗溃疡性结肠炎的治疗性化合物和生物制剂的功效。建立了急性严重DSS小鼠模型以研究Wnt信号激活对上皮修复的影响(参见WO 2020/185960A1，通过引用整体并入本文中)。在该模型中，在前七天使用了高百分比的DSS(4％)来触发对结肠上皮的损害。然后将动物维持在1％ DSS，直到第10天去除，以维持已建立的损害并最大限度地减少上皮的自发修复。与先前报道的DSS研究一致(Cooper,H.S.,Murthy,S.N.,Shah,R.S.,&Sedergran,D.J.(1993).Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimentalmurine colitis.Laboratory Investigation,69(2),238–249)，在第4天通过苏木精和伊红(H&E)染色可见结肠上皮损害，并继续进展到第7天(参见WO 2020/185960A1)。RNAscope原位杂交分析显示，结肠上皮和周围间充质细胞层中Wnt靶基因Axin2、Lgr5、Rnf43以及Wnt配体Wnt2b和Wnt5a的mRNA表达分别减少。结肠隐窝下方的间充质细胞中主要的小鼠肠道R-脊椎蛋白Rspo3的mRNA表达不受DSS的影响(参见WO 2020/185960A1)。
在建立的DSS模型中，给小鼠注射两剂R2M3-26或靶向FZD1,2,5,7,8和LRP6的Wnt模拟物，LRP6在Fowler et al.(Fowler,T.W et al.,(2021).Development of selectivebispecific Wnt mimetics for bone loss and repair.Nature Communications,12(1).https://doi.org/10.1038/s41467-021-23374-8)中被称为FA-L6，在第4天开始，此时DSS对上皮的损伤已经可见，然后在第7天再给药，并在第10天评估其对上皮修复的影响，即6天的处理。R2M3-26处理的结肠类似于未经DSS处理的结肠，与PBS或抗GFP对照处理相比，以较少的组织炎症恢复了隐窝结构(参见WO 2020/185960A1)。结肠组织由对处理不知情的病理学家进行检查，并对常见的结肠炎病理特征进行评分(参见实施例1中描述的方法)。组织学评分一致显示R2M3-26有效修复了DSS损害的结肠组织，将结肠炎评分从4.75降低到2.0(参见WO 2020/185960A1)。
由于先前报道RSPO可改善小鼠中DSS诱导的结肠炎(Zhao et al.,2007)，因此还检查了RSPO2在本文所述DSS小鼠模型中的影响。在DSS处理的第4天开始，每周或每天两次经腹膜内注射RSPO2。虽然观察到用RSPO2处理对受损结肠上皮的修复，但与R2M3-26的效果相比，该效果不那么显著。类似地，R2M3-26和RSPO2的联合治疗，无论是每周两次还是每天两次，都恢复了结肠隐窝结构并改善了结肠组织学，但程度低于单独的R2M3-26(参见WO2020/185960A1)。
单独的RSPO或RSPO和Wnt模拟物18R5-DKK1c的联合治疗先前显示可刺激小肠干细胞和瞬时扩增(TA)细胞的过度增殖，导致正常小鼠中小肠隐窝和绒毛长度的生长(YanKelley S.et al.,2017)。在本文所述的DSS模型中，在第10天，在十二指肠和结肠中还观察到通过RSPO2处理或通过R2M3-26和RSPO2在的组合处理，Ki67表达的扩增(数据未显示)。然而，在第10天，在DSS模型的十二指肠或结肠上皮中，单独的R2M3-26没有导致Ki67的扩增，这与先前在未受损的动物中表达Wnt激动剂的研究一致(Yan Kelley S.et al.,2017)。结果表明，单独的Wnt激动剂处理能够修复DSS损害的结肠上皮，而不会在正常结肠或小肠中引起过度增殖。
实施例11
靶向Fzd5,8的Wnt模拟物R2M13-26刺激小鼠肠道类器官的生长
RNAscope原位杂交分析显示，在小鼠小肠上皮中，Fzd5表达水平最高(图29的E)，随后是Fzd1(图29的A)和Fzd7(图29的G)。Fzd1和Fzd7主要在Lgr5阳性干细胞所在的隐窝底部附近表达(图29的L)。Fzd5的表达集中在隐窝-绒毛边界附近和与强Axin2阳性结构域重叠的十二指肠中的隐窝底部柱状干细胞中，所述结构域对干细胞标志物Lgr5也呈阳性(图29的K)。
然后测试了利用Fzd5和Fzd8亚家族(R2M13-26)或Fzd1、2和7亚家族(1RC07-26)特异性的WNT激动剂刺激Wnt信号传导是否足以刺激小鼠小肠类器官培养物中的上皮细胞增殖。在Super TopFlash(STF)测定中，亚家族特异性Wnt模拟物在体外具有活性(图5)。用豪猪抑制剂IWP2处理小鼠小肠类器官，以抑制培养的类器官中的内源性Wnt配体分泌。当这些类器官不进行蛋白质处理或用对照抗β-gal IgG处理时，类器官不能维持并快速退化。相比之下，用R2M3-26，即Fzd1,2,5,7,8泛特异性Wnt模拟物，以宽剂量范围处理能够刺激细胞增殖，产生生长的透明球形类器官。Fzd5,8特异性Wnt模拟物(“R2M13-26”)和Fzd1,2,7特异性Wnt模拟物(“1RC07-26”，在(Fowler et al.,2021)中也称为FB-L6)都能够刺激类器官增殖和生长(参见WO 2020/185960A1)。亚家族特异性Wnt模拟物的效果与泛特异性激动剂的效果相当。
实施例12
Fzd5,8特异性Wnt模拟物R2M13-26在修复DSS损害的结肠上皮中是有效的
原位分析表明，结肠上皮显示出与小肠相似的Fzd表达模式(图30)，并且Fzd5在结肠上皮中的所有Fzds中也以最高水平表达。尽管DSS降低了所有Fzds的表达，但Fzds在DSS条件下的差异表达得以维持(图30的K至图30的T)。
接下来检查Fzd亚家族特异性模拟物是否能够修复DSS损害的结肠上皮。在DSS模型中，在第4天和第7天经由腹膜内注射两剂对照抗GFP IgG处理或蛋白质处理，并在第10天处死动物，以进行组织学和血清分析。与在无蛋白质处理或抗GFP处理的结肠中观察到的严重组织损害和炎症相反，R2M13-26(Fzd5,8)和1RC07-26(Fzd1,2,7)处理均导致结肠上皮的修复。对来自两种Fzd亚家族特异性Wnt模拟物(R2M13-26和1RC07-26)的结肠组织学的影响与Fzd1,2,5,7,8泛特异性模拟物R2M3-26)相当(参见WO 2020/185960A1)。
与R2M3-26处理类似，R2M13-26和1RC07-26处理也改善了粪便评分和疾病活动指数(DAI)(参见WO 2020/185960A1)。与R2M3-26或1RC07-26相比，R2M13-26对粪便评分和DAI的改善更为明显。为了进一步理解不同Wnt模拟物的组织修复程度，由对处理组不知情的病理学家再次分析结肠组织(参见WO 2020/185960A1)。与DAI一致，R2M13-26处理的DSS结肠的总体组织学评分显著改善，并且优于1RC07-26处理的结肠，这表明来自Fzd5,8特异性Wnt模拟物R2M13-26的结肠炎减少和上皮修复比Fzd1,2,7特异性Wt模拟物1RC07-26更有效。
然后确定利用Wnt模拟物观察到的结肠炎减少是否伴随着血清细胞因子水平的降低。用三种Wnt模拟物中的每一种处理都降低了DSS诱导的促炎细胞因子TNF-α、IL6和IL-8的血清水平(参见WO 2020/185960A1)。
利用剂量范围研究进一步测试了R2M13-26在DSS模型中的功效，其中R2M13-20在第4天以1、3、10和30mpk经腹膜内注射一次，或者在第4和第7天以0.3、1、3和10mpk注射两次。观察到所有剂量组的组织组织学、DAI和组织学评分均有显著改善(数据未显示)。所有剂量组都显示促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的血清和组织水平的显著减少(参见WO2020/185960A1)。
实施例13
DSS损伤在所有组织层中都引起强力的炎症反应，但R2M13-26主要的直接影响是在上皮细胞上
使用scRNA-seq来确定哪些细胞首先对R2M13-26处理作出反应，R2M13-26如何影响上皮细胞的分化，以及对减少炎性细胞因子的影响是直接发生在免疫细胞上还是通过上皮的恢复间接发生。为了研究这些问题，应用scRNA-seq来研究急性DSS小鼠模型中R2M13-26处理的结肠的早期转录组反应。与上述实施例中一样，于水中给予4％(w/v)DSS，并在第4天给小鼠经腹膜内注射10mg/kg的抗GFP对照蛋白或10mg/kg的R2M13-26，终点分别为注射后第5天和第6天、24小时和48小时(图26A)。过滤后，数据集总共包含22,717个细胞。将标准化和聚类分析应用于完整的数据集，以识别每个谱系/组，随后细分每个谱系/组；对每个中的细胞子集应用降维和聚类分析(图26B)。有三个主要的细胞群，即免疫(4835个细胞)、间充质/间质(7509个)和上皮(10373个)(图26B)。
DSS损伤在每个时间点对所有三个谱系都有强烈影响，导致每个组织层中500至超过1400个基因的差异基因表达，其中免疫谱系显示出最大数量的变化(图26C)。
为了理解R2M13-26在DSS模型中的影响，首先通过比较DSS、抗GFP条件和未受损条件来评估DSS损伤的影响。DSS在每个组织层或谱系中诱导不同的细胞类型，并且这是谱系水平差异基因表达中的大部分的原因。在免疫谱系中，没有细胞类型在损伤后消失。相反，到DSS处理的第5天，在损害的结肠样品中出现了数种细胞类型，包括活化的中性粒细胞(ActNeutropil)、两个促炎单核细胞群(InjuryMono1,2)、刺激的树突状细胞(ActDendritic)和两组富集IgM重链基因表达和Ighd的B细胞(Bcell1_IgM、Bcell2_IgM)。在基质细胞中，DSS损伤导致新的表达炎性细胞因子和趋化因子的成纤维细胞群的出现，这与最近关于UC患者和DSS小鼠模型中促炎性成纤维细胞的报道一致(Kinchen et al.,2018；Smillie et al.,2019)。两组成纤维细胞几乎完全由受损细胞组成(InjuryCryptFB1、InjuryCryptFB2)(数据未显示)。
R2M13-26在施用后立即在上皮中促进Wnt靶标和细胞周期基因的表达并扩增祖细胞群。
R2M13-26的直接影响主要是对上皮。在总体水平上，在施用后24小时，R2M13-26导致上皮中超过300个基因的表达差异增加，但在免疫和基质细胞/谱系中几乎没有或没有基因的表达差异增加(图27)。R2M13-26通过增加表达水平和通过增加表达基因的细胞百分比，增加了上皮中广泛的Wnt靶基因和细胞周期基因的表达(图27C；表4和表7)。表4显示了当将24小时或48小时的R2M13-26处理与抗GFP处理进行比较时，在上皮谱系内差异表达的细胞周期基因。基于<0.05的调整p值(错误发现率(FDR))过滤差异表达。
上皮上将R2M13-26与抗GFP处理进行比较的GSEA显示，上皮中的细胞周期、端粒维持、MTORC信号传导和UPR应激反应被R2M13-26强烈上调(图27A)。
重要的是，在任何基质细胞或免疫细胞中均未检测到谱系或细胞类型水平的Axin2富集(数据未显示)。此外，当将R2M13-26与抗GFP处理进行比较时，GSEA在基质或免疫细胞中富集的通路非常少(如果有的话)(数据未显示)，这再次证实R2M13-26主要的直接影响是在给药后24小时对上皮的影响。在这里，重要的是要强调，尽管在第5天或第6天早期没有观察到R2M13-26对基质细胞或免疫细胞的主要影响，但随着时间的推移，到第10天可以检测到免疫细胞和细胞因子水平的降低(数据未显示)，这表明这些变化是继发于R2M13-26对上皮的早期直接影响。如图31所示，R2M13-26处理后，中性粒细胞浸润和炎症标志物的表达均降低。
R2M13-26影响的主要细胞类型是祖细胞和前体细胞群，包括损伤诱导的改变的肠细胞类型。差异表达分析揭示出，在数种不同的细胞类型(例如，AlEnteroPC、TA2、EnteroPrecur)中，Axin2、Rnf43、Cdkn3和/或其他Wnt靶基因显著增加。此外，R2M13-26显著增加了上皮中多种祖细胞亚型中参与细胞周期的许多基因的表达(表4)，尤其是TA2和损伤特异性祖细胞(AltEnteroPC)。这些基因中的一些本身就是Wnt靶标(例如，Ccnb1、Cdca3、Aurka、Cdkn3)。Wnt靶基因表达的增加得到了验证，并且在R2M13-26处理的样品的结肠隐窝中检测到Axin2和Cdkn3表达的增加(图27B)。此外，TA1和TA2祖细胞具有最高的细胞周期相关基因表达，并且在处理后24小时，这些组中R2M13-26处理的样品的贡献增加(数据未显示)，这与给药后早期祖细胞的扩增一致。
为了验证细胞周期基因表达的早期增加反映了增殖细胞数量的增加，使用增殖细胞标志物Ki-67应用免疫组织化学分析。到给药后48小时，观察到当与抗GFP处理组相比时，R2M13-26处理后结肠上皮中的增殖细胞数量强力增加(图27C)，这与scRNA-seq分析和通过RT-qPCR在结肠样品上检测到的细胞周期基因表达的增加一致。值得注意的是，增殖细胞并不局限于隐窝的基底，而是经常位于顶端表面附近。
除了增加直接参与细胞周期的基因的表达外，R2M13-26还增加了数种干/祖细胞基因的表达，如Lrig1(Powell et al.,2012)、Hmga2(Nishino,Kim,Chada,&Morrison,2008；Parisi,Piscitelli,Passaro,&Russo,2020)和Nhp2，Nhp2是与端粒维持相关的角化不良(Dyskerin)复合物的一个成员，其被证明对干细胞维持很重要(Fong,Ho,Inouye,&Tjian,2014；McCann,Kavari,Burkholder,Phillips,&Hall,2020)。
总之，在给药后24小时，R2M13-26在多种细胞类型中增加Wnt靶标和细胞周期基因表达，主要是在干细胞和祖细胞的不同亚型中，包括损伤诱导的改变的肠上皮细胞类型，导致祖细胞库的扩增。R2M13-26处理的上皮细胞在增殖后分化更快。
时间戳允许确定第6天(48小时)细胞相对于第5天(24小时)细胞在所有三种处理条件下富集的位置，即未受损的、受损的/抗GFP和受损的/R2M13-26。第5天和第6天未受损的细胞在所有簇中被近似相等地代表，其中未受损的细胞如预期的那样在两个时间点都存在(图28A、图28B、图28C和图28D)。然而，在R2M13-26或抗GFP处理的第5天和第6天受损样品的优先富集的细胞类型之间存在明显差异。对于抗GFP样品，相对于第6天的时间点，在第5天，改变的肠细胞组(AltEntero2、3)和TA1组中有更多的细胞，并且在两个时间点，替代祖细胞(AltEnteroPC)中有大约相等百分比的细胞。在R2M13-26样品中，相对于第6天，第5天的TA1和TA2细胞更多，并且相对于第5天，第6天的干细胞百分比更高。重要的是，基于实时戳，在第6天，肠细胞前体中R2M13-26处理的细胞大量富集，并且相对于抗GFP处理的样品，表达高水平炎症基因的替代肠细胞(AltEntero)更少。因此，第6天(48小时)R2M13-26样品在向肠细胞分化方面似乎加速了。
为了补充基于时间戳的观察，采用了一种谱系轨迹推断工具slingshot。因为有证据表明，在DSS损伤后，一些肠细胞正在去分化，所以去除了明显的去分化/改变状态的肠细胞簇，并将slingshot应用于包括来自未受损条件的至少5％细胞的细胞簇。将组合的干细胞/TA2细胞设置为起始点(图28A)，并且slingshot预测，从最初的起始组，细胞将在一个方向上向TA1、杯状、簇状和肠内分泌细胞进展，并在另一个方向上向肠细胞进展(图28D)。基于预测的谱系轨迹伪时间值，到第6天(48小时)，相对于对照处理的细胞，在肠细胞谱系轨迹中更靠前的R2M13-26处理的样品的百分比更高(图28E)。此外，如图28E所示，R2M13-26处理增加了向肠细胞谱系的进展。这种对肠细胞谱系的预测与实际的时间戳数据一致，即用R2M13-26处理的第6天(48小时)细胞在向未成熟肠细胞分化的过程中(但仍然很早)加速了。
验证分化改善的一个可靠标准是，在DSS诱导的损伤后第10天(R2M13-26处理后6天)，相对于抗GFP对照，R2M13-26处理组中成熟、分化的细胞类型标志物的表达看起来更像原始、未受损的结肠(图13)。与抗GFP处理的对照样品不同，R2M13-26处理的样品具有恢复的肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和簇状细胞。
R2M13-26处理导致上皮屏障恢复和炎症减少
在考虑损伤后第10天的研究中，观察到R2M13-26处理在组织学水平上导致上皮的修复。给药后24小时，相对于TA1细胞中的抗GFP，R2M13-26处理的样品中粘蛋白和屏障相关基因表达增加。当在第10天评估紧密连接标志物TJP1(ZO1)的表达时，观察到在第10天，其在R2M13-26相对于对照处理的结肠中的表达增加并更有组织性，这与紧密连接的重新建立一致。
除了对上皮细胞再生的直接影响外，R2M13-26还导致涉及谷胱甘肽(一种可能在减少炎症中起作用的抗氧化剂)缀合的基因表达的强烈增加：两种谷胱甘肽转移酶(Gstm1、Gstm3)和谷胱甘肽过氧化物酶Gpx2，所有这三个基因都被报道是Wnt靶基因(Gougelet etal.,2014；Kipp,Banning,&Brigelius-Flohé,2007)。
实施例14
非人类灵长类动物(NHP)中R2M13-h26的毒性研究
为了评估R2M13-h26的毒性并评估4周恢复期后任何发现的潜在可逆性，在食蟹猴中进行了静脉内(IV)团注注射后R2M13-h26的4周非GLP(良好实验室实践)毒性研究。另外，确定了R2M13-h26的毒代动力学(TK)特征。
在第1天、第8天、第15天、第22天和第29天，每天向原始的雌性2-4年龄的柬埔寨食蟹猕猴(2-4kg)给予一次静脉内团注注射。媒介物仅用作对照。在给药前以及第16天和第30天进行临床病理学(血液学、化学、凝血、尿液分析)。TK采样是在进行和终止期间的选定时间点进行的；在第1天和第29天对完整的TK特征进行采样，并在第15天对峰值/波谷进行采样。在给药前和第15、29和58天进行抗药物抗体(ADA)采样。在第30天和第58天终止时进行组织病理学。表11显示了TK研究的实验设置。
表11.NHP中用于TK研究的剂量
临床观察、体重和食物消耗均未发现异常。在临床病理学中观察到轻微变化。在R2M13-h26组中观察到血清碱性磷酸酶(ALP)的轻微至中度的非不良增加(图32)，这可能归因于骨中R2M13-h26的影响。未检测到总体或微观的病理结果。未观察到有害作用水平(NOAEL)被确定为30mg/kg。未检测到对器官重量的影响，并且未观察到肠段重量的变化。有一些证据表明，处理动物的十二指肠和结肠中的Axin2增加(数据未显示)。
R2M13-h26的平均血清浓度是使用药代动力学测定法测量的，该测定法是基于同质双抗原的测定法，如图33所示。将组氨酸缀合的人卷曲蛋白5(Fzd5)和小鼠低密度脂蛋白受体相关蛋白6小鼠-Fc嵌合体(Lrp6)与R2M13-h26一起预孵育，以形成复合物。然后将Fzd5/R2M13-h26/Lrp6复合物施加到镀镍板上，从而允许通过Fzd5组氨酸标签捕获。通过盐/洗涤剂缓冲液洗涤去除基质干扰和过量试剂，随后通过采用对小鼠Fc部分具有特异性的第二过氧化物酶缀合的抗体来检测捕获的复合物。用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物显色，并用酸化猝灭HRP反应，并在微孔板读数仪上分析样品。
表12.R2M13-h26的平均(S.D.)TK参数
*AUC(0-7)＝给药后0-7天的浓度-时间曲线下面积；D＝剂量；Cmax＝最大观察血清浓度；比较了3、10mg/kg的AUC(0-1)和30mg/kg的AUC(0-7)的累积比率。
R2M13-h26的平均血清浓度如表12和图34所示。TK与剂量成比例，并且未观察到与处理相关的不良反应。没有证据表明重复剂量引起暴露的非典型积聚或大量损失。30mg/kg剂量组中有一只动物ADA呈阳性。另外，在第一剂剂量后测量个体血清R2M13-h26浓度。如图35所示，30mg/kg剂量组中的两只动物在给药后3天开始加速清除。在研究期间，这些动物也具有一致较低的R2M13-h26谷浓度。在研究结束时，发现一只动物具有快速血清清除。
观察到血清ALP的轻度(与基线<2X)、非不良、剂量依赖性增加，停止给药后恢复到基线(图36)。同工酶分析表明ALP增加可能是骨源性的。
总体而言，结果表明R2M13-h26在NHP中耐受性良好，高达30mg/kg/周，持续四周。在任何参数中均未观察到与处理相关的不良反应。暴露与指示研究成功的预期一致，一些证据表明一小部分动物中的暴露减少。ALP的增加提供了可能饱和的PD效应的证据。
实施例15
非人类灵长类动物(NHP)中R2M13-h26-LALAPG的药代动力学(PK)研究
在单一剂量的R2M13-h26静脉内(IV)团注注射后，在NHP中评估R2M13-h26的药代动力学(PK)。
在第0天，向4只雌性食蟹猴中的每只给予3mg/kg R2M13-h26的单次IV剂量。在选定的时间点收集血清样品，直到给药后21天。使用实施例14中描述的药代动力学测定法测量平均血清R2M13-h26浓度，且结果如图37所示。确定了R2M13-h26的PK参数，包括t1/2、AUC最后、C0、血清清除率、MRT最后、Vc和Vss，且提供在图38中。
结果表明R2M13-h26的PK与IgG水平一致，并显示出低分布体积。R2M13-h26的清除速度略快于NHP中的典型IgG。因此，这些结果表明R2M13-h26可以安全地给予NHPs，PK适用于人类。
表4.响应于WNT激动剂调节的说明性细胞周期基因(logFC＝Log2倍数变化；FDR＝错误发现率)
表5.响应于WNT激动剂调节的说明性抗炎症基因
基因 完整基因名称 细胞类型 条件 logFC FDR
Gpx2 谷胱甘肽过氧化物酶2 上皮 R2M13-26-抗GFP d5_24h 1.684747 0.002898753
Gdf15 生长分化因子15 上皮 R2M13-26-抗GFP d5_24h 1.329711 0.040472669
Nox1 NADPH氧化酶1 上皮 R2M13-26-抗GFP d5_24h 1.519086 0.047660807
Gsta3 谷胱甘肽S-转移酶α3 上皮 R2M13-26-抗GFP d6_48h 2.134244 0.001683607
Gstm1 谷胱甘肽S-转移酶μ1 上皮 R2M13-26-抗GFP d6_48h 1.354221 0.003355493
Gpx2 谷胱甘肽过氧化物酶2 上皮 R2M13-26-抗GFP d6_48h 1.266339 0.007234804
Gdf15 生长分化因子15 上皮 R2M13-26-抗GFP d6_48h 1.489524 0.021811964
Sycn syncollin 干细胞 R2M13-26-抗GFP 2.1329872 2.70118E-10
Il18 白细胞介素18 干细胞 R2M13-26-抗GFP 1.7187707 0.00015452
Sycn syncollin TA1 R2M13-26-抗GFP 2.4171978 0.02147903
Il18 白细胞介素18 TA2 R2M13-26-抗GFP 1.7057293 0.006732627
Sycn syncollin TA2 R2M13-26-抗GFP 1.6236126 0.014890009
Selenbp1 硒结合蛋白1 TA2 R2M13-26-抗GFP 1.0085511 0.042565765
Gpx2 谷胱甘肽过氧化物酶2 TA2 R2M13-26-抗GFP 0.8943478 0.012570697
Tgfbr2 转化生长因子β受体2 AltEnteroPC R2M13-26-抗GFP 1.4772761 0.001488099
Gdf15 生长分化因子15 AltEnteroPC R2M13-26-抗GFP 1.7517547 0.008596591
Gpx2 谷胱甘肽过氧化物酶2 AltEnteroPC R2M13-26-抗GFP 1.1711801 0.017581212
Gdf15 生长分化因子15 AltEntero1 R2M13-26-抗GFP 3.3934844 0.00000708
Gpx2 谷胱甘肽过氧化物酶2 AltEntero1 R2M13-26-抗GFP 1.4841473 0.00050619
Tgfbr2 转化生长因子β受体2 AltEntero2 R2M13-26-抗GFP 2.5918296 0.002738698
Gdf15 生长分化因子15 EnteroPrecur R2M13-26-抗GFP 3.5638037 0.008484168
Timp3 TIMP金属肽酶抑制剂3 EnteroPrecur R2M13-26-抗GFP 7.4998669 0.020951038
Reg4 再生家族成员4 杯状1 R2M13-26-抗GFP 8.5213571 3.29983E-16
表6.响应于WNT激动剂调节的说明性上皮屏障基因
表7.R2M13-26处理后作为整体的上皮谱系中和/或特定细胞类型中调节的Wnt靶基因
表8.响应于WNT激动剂调节的说明性干细胞和祖细胞基因
基因 细胞类型 条件 log2FC FDR
Nhp2 上皮 R2M13-26-抗GFP d5_24h 1.857028 0.00143981
Axin2 上皮 R2M13-26-抗GFP d5_24h 1.768324 0.028289949
Hmga2 上皮 R2M13-26-抗GFP d6_48h 1.477929 0.000425025
Foxq1 上皮 R2M13-26-抗GFP d6_48h 1.520334 0.000861389
Id1 上皮 R2M13-26-抗GFP d6_48h 1.665552 0.001762431
Nhp2 上皮 R2M13-26-抗GFP d6_48h 1.189143 0.010340642
Adh1 干细胞 R2M13-26-抗GFP 3.7215173 1.28645E-20
Nhp2 TA2 R2M13-26-抗GFP 0.7075035 0.014352053
Nhp2 AltEnteroPC R2M13-26-抗GFP 1.6504603 0.001488099
Hmga2 AltEnteroPC R2M13-26-抗GFP 1.8393351 0.008885208
Axin2 AltEnteroPC R2M13-26-抗GFP 2.6986444 0.023278564
Foxq1 AltEnteroPC R2M13-26-抗GFP 1.6513882 0.028212078
Id1 杯状1 R2M13-26-抗GFP 2.7008097 0.000231565
Areg 杯状1 R2M13-26-抗GFP 2.2493817 0.01136303
表9.材料
表10.基础培养基组成
DMEM/F12K Life technologies
HEPES Life technologies 10mM
青霉素/链霉素 Life technologies 1X
GlutaMAX Life technologies 1X
N2补充100× Life technologies 1X
B27补充50x Life technologies 1X
N-乙酰半胱氨酸 Sigma-Aldrich 1.25mM
重复人EGF Peprotech 50ng/mL
重组人Noggin Peprotech 50ng/mL
重组人R脊椎蛋白-1 R&D Systems 500ng/mL
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以上描述的各种实施方案可以组合以提供其他的实施方案。在本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开均通过引用并入整体本文中。如果需要，可以修改实施方案的各方面以采用各种专利、申请和出版物的概念，来提供其他的实施方案。可以根据以上详细描述对实施方案进行这些和其他改变。
通常，在以下权利要求中，所使用的术语不应被理解为将权利要求限制为说明书和权利要求中公开的具体实施方案，而应被理解为包括所有可能的实施方案以及此类权利要求所享有的等同物的完整范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
序列表
<110> 瑟罗泽恩奥普瑞汀公司 (Surrozen Operating, Inc.)
<120> 胃肠道病症中WNT信号传导的调节
<130> SRZN-020/03WO 328202-2153
<150> US 63/247,151
<151> 2021-09-22
<150> US 63/190,535
<151> 2021-05-19
<150> US 63/159,010
<151> 2021-03-10
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> R2M13-03亲本LALAPG- 重链
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
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Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
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355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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<400> 2
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Ala Asn Ile Asn Ser Ile Glu
20 25 30
Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Glu Ser Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
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Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp Ile Gln
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Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
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Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
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Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
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Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg
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Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
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Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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275 280 285
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
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Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> R2M13-03人源化的LALAPG- 轻链
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Ala Asn Ile Gln Ser Ile Glu
20 25 30
Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Ile
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Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
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Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
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Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
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325 330 335
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<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> R2M13-03人源化的N297G- 重链
<400> 5
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1 5 10 15
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Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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165 170 175
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405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
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Ser Pro Gly Lys
450
<210> 6
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> R2M13-03人源化的N297G- 轻链
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Ala Asn Ile Gln Ser Ile Glu
20 25 30
Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Ile
35 40 45
Ala Asn Met Arg Gly Gly Gly Tyr Met Lys Tyr Ala Asp Ser Leu Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Val Lys Leu Arg Asp Glu Asp Tyr Val Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
115 120 125
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
130 135 140
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
145 150 155 160
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
180 185 190
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
195 200 205
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
210 215 220
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
245 250 255
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
260 265 270
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
275 280 285
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
290 295 300
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
305 310 315 320
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330 335
<210> 7
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> R2M13-26亲本LALAPG (R2M13-26)-重链
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg
20 25 30
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100 105 110
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
115 120 125
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
130 135 140
Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
145 150 155 160
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
165 170 175
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
180 185 190
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr
195 200 205
Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
210 215 220
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
225 230 235 240
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
245 250 255
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
260 265 270
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
275 280 285
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
290 295 300
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
305 310 315 320
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330
<210> 17
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> R2M13-36人源化的N297G-重链
<400> 17
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 18
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> R2M13-36人源化的N297G-轻链
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ile Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
115 120 125
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
130 135 140
Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
145 150 155 160
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
165 170 175
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
180 185 190
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr
195 200 205
Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
210 215 220
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
225 230 235 240
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
245 250 255
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
260 265 270
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
275 280 285
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
290 295 300
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
305 310 315 320
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330
<210> 19
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26_H1
<400> 19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26_H2
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26_H3
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26_H4
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26_H5
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26_H6
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26 (亲本)
<400> 25
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Met Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26_ 亲本-对齐1
<400> 26
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr
50 55 60
<210> 27
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> IGHV3-23_IGHJ6-对齐1
<400> 27
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
50 55 60
<210> 28
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H1-对齐1
<400> 28
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr
50 55 60
<210> 29
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H2-对齐1
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr
50 55 60
<210> 30
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H3-对齐1
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr
50 55 60
<210> 31
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H4-对齐1
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr
50 55 60
<210> 32
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H5-对齐1
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr
50 55 60
<210> 33
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H6-对齐1
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr
50 55 60
<210> 34
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26_ 亲本-对齐2
<400> 34
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Met
1 5 10 15
Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr
35 40 45
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Ser Ser
50 55
<210> 35
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> IGHV3-23_IGHJ6-对齐2
<400> 35
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
1 5 10 15
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
35 40 45
Gly Gln Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
50 55
<210> 36
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H1-对齐2
<400> 36
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
1 5 10 15
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr
35 40 45
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
50 55
<210> 37
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H2-对齐2
<400> 37
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
1 5 10 15
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr
35 40 45
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
50 55
<210> 38
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H3-对齐2
<400> 38
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
1 5 10 15
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr
35 40 45
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
50 55
<210> 39
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H4-对齐2
<400> 39
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
1 5 10 15
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr
35 40 45
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
50 55
<210> 40
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H5-对齐2
<400> 40
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
1 5 10 15
Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr
35 40 45
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
50 55
<210> 41
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH26-H6-对齐2
<400> 41
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
1 5 10 15
Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr
35 40 45
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
50 55

Claims (52)

1.改造的WNT激动剂，其包含：
(a)结合一种或多种FZD的一个或多个结合域；以及
(b)结合LRP5、LRP6或者LRP5和LRP6两者的一个或多个结合域，
其中所述改造的WNT激动剂包含与SEQ ID NOs:1-25中任一项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的多肽序列，或者图2、图6、表1或表3中公开的多肽序列，或者以上的结合片段；并且
任选地，其中所述结合一种或多种FZD的一个或多个结合域结合：
i)FZD5；
ii)FZD 8；
iii)FZD 1；
iv)FZD 2；
vi)FZD 7；
vi)FZD 5和FZD 8；
vii)FZD 1、FZD 2和FZD 7；
viii)FZD 1、FZD 2、FZD 7、FZD 5和FZD 8；
ix)FZD4；
x)FZD9；或者
xi)FZD10。
2.如权利要求1所述的改造的WNT激动剂，其包含：
(a)与SEQ ID NOs:1-25中任一项具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的多肽序列，或者表3中公开的序列；或者
(b)包含两个或三个存在于图2中公开的VHH结构域、VH结构域或VL结构域的任一个中的CDR序列的多肽序列，
任选地，其中所述多肽序列包含存在于SEQ ID NOs:1-25中任一项中的CDR。
3.如权利要求2所述的改造的WNT激动剂，其包含：
(a)与SEQ ID NO:1具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列和与SEQ ID NO:2具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列；
(b)与SEQ ID NO:3具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列和与SEQ ID NO:4具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列；
(c)与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少90％或至少95％同源性的多肽序列和与SEQ IDNO:6具有至少80％、至少90％或至少95％同源性的多肽序列；
(d)与SEQ ID NO:7具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列和与SEQ ID NO:8具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列；
(e)与SEQ ID NO:9具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列和与SEQ ID NO:10具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列；
(f)与SEQ ID NO:7具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列和与SEQ ID NO:8具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列
(g)与SEQ ID NO:11具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列和与SEQ ID NO:12具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列；
(h)与SEQ ID NO:13具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列和与SEQ ID NO:14具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列；
(i)与SEQ ID NO:15具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列和与SEQ ID NO:16具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列；或者
(j)与SEQ ID NO:17具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列和与SEQ ID NO:18具有至少90％或至少95％同源性的多肽序列，
任选地，其中所述多肽包含存在于SEQ ID NOs:1-18任一项中的CDR。
4.如权利要求1-3中任一项所述的改造的WNT激动剂，其中所述结合LRP5、LRP6或LRP5和LRP6两者的一个或多个结合域被人源化。
5.如权利要求1-4中任一项所述的改造的WNT激动剂，其包含修饰的Fc结构域，其中所述修饰的Fc结构域包含LALAPG或N297G修饰。
6.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的改造的WNT激动剂以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
7.治疗对象中易于通过增加的WNT通路信号传导进行治疗的疾病或病症的方法，包括向所述对象给予权利要求1-5中任一项所述的改造的WNT激动剂或权利要求6所述的药物组合物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述疾病或病症是胃肠道病症。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述胃肠道病症是炎症性肠病。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述炎症性肠病选自：克罗恩病(CD)、伴有瘘管形成的CD和溃疡性结肠炎(UC)。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述改造的WNT激动剂经口或肠胃外给药。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述改造的WNT激动剂经静脉内、腹膜内或皮下给药。
13.增加细胞中的WNT信号传导的方法，其包括使所述细胞与权利要求1-5中任一项所述的改造的WNT激动剂接触。
14.调节患有胃肠道病症的对象中的一个或多个组织或细胞中的WNT通路分子表达的方法，包括向所述对象给予权利要求1-5中任一项所述的改造的WNT激动剂或权利要求6所述的药物组合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述WNT通路分子是表4、5、6、7、8和11中任一项中列出的基因或蛋白质。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述WNT通路分子选自：谷胱甘肽过氧化物酶2(Gpx2)、干扰素调节因子8(Irf8)、Rel、RelA、RelB、RNA酶4、血管生成素、Gsta3、Rnf43、Axin2、Ki67、闭合蛋白，或者表7中列出的任何基因或蛋白质。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中在给药后，所述对象的一个或多个组织和/或细胞中所述WNT通路分子的表达增加至少20％、至少50％、至少80％、至少两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或者减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述组织是上皮组织和/或所述细胞是胃肠上皮细胞，任选地是：干细胞、TA1、TA2、杯状细胞祖细胞、损伤诱导的替代祖细胞(Alt祖细胞)、损伤诱导的替代肠细胞(Alt肠细胞)、肠细胞前体(EnteroPrecur)、杯状细胞祖细胞(杯状_PC)、杯状细胞1、杯状细胞2或肠内分泌细胞。
19.刺激患有胃肠道病症的对象中的组织修复的方法，其包括向所述对象给予权利要求1-5中任一项所述的改造的WNT激动剂或权利要求6所述的药物组合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中通过调节选自以下的至少一种WNT通路分子来刺激所述组织修复：与细胞周期相关的基因、与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因、与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因和/或表4、5、6、7、8和11中任一项中列出的任何基因。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述与细胞周期相关的基因选自表4中提供的那些基因，或者Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1和Rrm2。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因选自表8中提供的那些基因，以及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1、Hes6和Adh1。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因选自表6中提供的那些基因，或者Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16和Sprr2a3。
24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中在给予所述改造的Wnt激动剂后，所述对象的一个或多个组织和/或细胞中所述WNT通路分子的表达增加至少20％、至少50％、至少80％、至少两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或者减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
25.减少患有胃肠道病症的对象中的炎症的方法，包括向所述对象给予权利要求1-5中任一项所述的改造的WNT激动剂或权利要求6所述的药物组合物。
26.如权利要求19所述的方法，其中通过调节选自以下的至少一种分子来减少所述炎症：表5中提供的基因，或者Adamdec1、Atf3、Gpx2、Gsta3、Gstm1、Gstm3、Gdf15、Ihh、Il18、Lyz2、Nox1、Reg4、Sycn、Selenbp1、Tgfbr2和Timp3。
27.如权利要求25或权利要求26所述的方法，其中胃肠组织，任选地上皮组织中的所述炎症减少。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述胃肠组织包括胃肠上皮细胞，任选地包括：干细胞、TA1、TA2、杯状细胞祖细胞、损伤诱导的替代祖细胞(Alt祖细胞)、损伤诱导的替代肠细胞(Alt肠细胞)、肠细胞前体(EnteroPrecur)、杯状细胞祖细胞(杯状_PC)、杯状细胞1、杯状细胞2或肠内分泌细胞。
29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中在给药后，所述对象的一个或多个组织和/或细胞中所述WNT通路分子的表达减少至少20％、至少50％、至少80％、至少两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或者减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
30.如权利要求7-29中任一项所述的方法，其中所述改造的Wnt激动剂是R2M13-h26，或者包含其功能变体或片段。
31.产生、培养或维持器官、组织、细胞或类器官培养物的方法，包括使所述器官、组织、细胞或类器官培养物与以下物质接触：
a)权利要求1-5中任一项所述的改造的WNT激动剂；或者
b)权利要求6所述的药物组合物。
32.如权利要求31所述的方法，其用于在离体下维持所述器官或组织的活力，所述方法包括：
a)使从供体获得的器官或组织与包含所述改造的WNT激动剂的组合物或所述药物组合物在离体下接触，任选地通过灌注；或者
b)使供体器官或组织与包含所述改造的WNT激动剂的组合物或所述药物组合物在体内接触。
33.如权利要求31所述的方法，其用于产生或维持所述类器官培养物，所述方法包括接触所述类器官培养物，任选地，通过在包含所述改造的WNT激动剂的培养基中培养所述类器官培养物。
34.恢复患有上皮损伤的对象中的胃肠上皮屏障的方法，其包括向所述对象给予权利要求1-5中任一项所述的改造的WNT激动剂或权利要求6所述的药物组合物。
35.如权利要求34所述的方法，其中通过调节选自以下的至少一种WNT通路分子来恢复所述胃肠上皮屏障：与细胞周期相关的基因、与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因、与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因和/或表4、5、6、7、8和11中任一项中列出的任何基因。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述与细胞周期相关的基因选自表4中提供的那些基因，或者Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1和Rrm2。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因选自表8中提供的那些基因，以及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1、Hes6和Adh1。
38.如权利要求35所述的方法，其中所述与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因选自表6中提供的那些基因，或者Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16和Sprr2a3。
39.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其中在给予所述改造的Wnt激动剂后，所述对象的一个或多个组织和/或细胞中所述WNT通路分子的表达增加至少20％、至少50％、至少80％、至少两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或者减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
40.如权利要求39所述的方法，其中在给予所述改造的Wnt激动剂约24小时内，所述对象的一个或多个组织和/或细胞中所述WNT通路分子的表达增加。
41.如权利要求34-40中任一项所述的方法，其中在给予所述改造的Wnt激动剂约6天内，所述对象的上皮损伤实质上被恢复。
42.如权利要求34-41中任一项所述的方法，其中向所述对象给予所述改造的Wnt激动剂不会诱导正常上皮的过度增殖。
43.在患有胃肠道病症的对象中诱导上皮祖细胞分化的方法，包括向所述对象给予权利要求1-5中任一项所述的改造的WNT激动剂或权利要求6所述的药物组合物。
44.如权利要求43所述的方法，其中通过调节选自以下的至少一种WNT通路分子来诱导所述上皮细胞分化：与细胞周期相关的基因、与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因、与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因和/或表4、5、6、7、8和11中任一项中列出的任何基因。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述与细胞周期相关的基因选自表4中提供的那些基因，或者Aurka、Aurkb、Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd2、Ccne1、Cdc45、Cdk1、Cdkn3、Cenpm、Cenpp、Cenpq、Cenpu、Hells、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Myc、Pbk、Plk1、Rrm1和Rrm2。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述与干细胞和祖细胞更新和分化相关的基因选自表8中提供的那些基因，以及Axin2、Id1、Hmga2、Nhp2、Foxq1、Hes6和Adh1。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述与上皮细胞修复和屏障恢复相关的基因选自表6中提供的那些基因，或者Apex1、Agr2、B3gnt7、Fcgbp、Muc2、Muc3、Tff3、Zg16和Sprr2a3。
48.如权利要求44-47中任一项所述的方法，其中在给予所述改造的Wnt激动剂后，所述对象的一个或多个组织和/或细胞中所述WNT通路分子的表达增加至少20％、至少50％、至少80％、至少两倍、至少五倍、至少10倍或至少20倍，或者减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
49.如权利要求48所述的方法，其中在给予所述改造的Wnt激动剂约24小时内，所述对象的一个或多个组织和/或细胞中所述WNT通路分子的表达增加。
50.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中给予所述改造的Wnt激动剂在所述对象中诱导祖细胞分化成肠细胞、杯状细胞、肠内分泌或簇状细胞。
51.如权利要求43-50中任一项所述的方法，其中在给予所述改造的Wnt激动剂约48小时内，在所述对象中诱导了大量的祖细胞分化。
52.如权利要求43-51中任一项所述的方法，其中向所述对象给予所述改造的Wnt激动剂不会诱导正常上皮的过度增殖。
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