JP2022525300A - 胃腸障害におけるｗｎｔシグナル伝達の調節 - Google Patents

胃腸障害におけるｗｎｔシグナル伝達の調節 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＷＮＴシグナル伝達経路の調節因子を用いて胃腸障害を治療する方法を提供する。また、投与方法および医薬組成物も提供される。【選択図】図１９Ａ

Description

本発明は、胃腸障害、特に炎症性腸疾患の治療としてのＷＮＴシグナル調節因子を提供する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月１１日に出願された米国仮出願第６２／８１６，７２９号、および２０１９年８月１９日に出願された米国仮出願第６２／８８８，７４９号の優先権を主張するものであり、各々、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙媒体ではなくテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＳＲＺＮ＿０１４＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、２０２０年３月１１日に作成され、約１０２ＫＢで、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
成人の腸上皮は、５～７日間の腺窩－絨毛通過時間に生じる細胞分裂、分化、遊走および剥脱のステレオタイプサイクルによる上皮細胞の連続的な置換により特徴付けられる。成体腸幹細胞微小環境内での増殖を制御する推定上の成長因子は、まだ完全には同定されていないが、研究は、増殖性腺窩区画内のβ－カテニン／Ｌｅｆ／Ｔｃｆシグナル伝達の細胞固有作用を関係付けた。
多数の病態が、腸の細胞に影響を及ぼす。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、小腸と大腸のいずれかまたは両方に関与し得る。クローン病および潰瘍性大腸炎は、ＩＢＤの最もよく知られた形態であり、両方が、その病因が不明であるため、病因は不明であるため、「特発性」炎症性腸疾患に分類される。「活動性」ＩＢＤは、急性炎症を特徴とする。「慢性」ＩＢＤは、腺窩歪みおよび瘢痕の構造的変化を特徴とする。腺窩膿瘍は、ＩＢＤの多くの形態で生じ得る。
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、遠位支配を伴うびまん性粘膜疾患として結腸を巻き込む。直腸は実質的に常に巻き込まれ、連続的なパターンで直腸から近位で拡張する結腸のさらなる部分が、巻き込まれる場合がある。ＵＣの病因は不明である。拡張したＵＣを有する患者は、大腸癌を発症するリスクが増加する。ＵＣを有する患者はまた、硬化性胆管炎および胆管癌を含む肝疾患の発症リスクも有する。
クローン病は、任意の部分の胃腸管を巻き込み得るが、最も頻繁には、遠位の小腸および結腸を巻き込む。炎症は典型的には経壁的であり、リンパ濾胞（アフタ様潰瘍）上の小さい潰瘍から深部の亀裂性潰瘍、経壁瘢痕および慢性炎症まで全てを生じ得る。症例の３分の１が肉芽腫を有し、リンパ節、肝臓、および関節などの結腸外部位も肉芽腫を有し得る。経壁的炎症は、腸のループと他の構造との間の瘻孔の発生につながる。炎症は典型的には、巻き込まれた腸の巻き込まれていない腸分離領域を伴う区域である。病因は不明であるが、感染および免疫学的機序が提唱されている。
ＷＮＴタンパク質は、胚発生中の細胞と細胞の間の相互作用を調節する高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリーを形成する。ＷＮＴ遺伝子およびＷＮＴシグナル伝達はまた、癌に関与する。ＷＮＴ作用の機序の見通しは、いくつかの系：例えば、ショウジョウバエおよび線虫における遺伝学；細胞培養およびアフリカツメガエル胚での異所性遺伝子発現における生化学からである。マウスの多くのＷＮＴ遺伝子が変異しており、非常に特異的な発生異常につながる。現在理解されているように、ＷＮＴタンパク質は細胞表面上のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーの受容体に結合する。いくつかの細胞質リレー構成成分を介して、シグナルは、ベータ－カテニンに伝達され、次いで、核に入り、ＴＣＦと複合体を形成して、ＷＮＴ標的遺伝子の転写を活性化する。ＷＮＴタンパク質の発現は変動するが、例えば、胚組織および胎児組織における発生過程に関連することが多い。
成人の生物におけるＷＮＴタンパク質の生理学的機能の探索は、機能的重複性と条件付き不活性化戦略の必要性によって妨げられている。Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１（Ｄｋｋ１）は、ＷＮＴシグナル伝達に強力に拮抗する分泌タンパク質ファミリーの設立メンバーとして最近特定された（Ｇｌｉｎｋａら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：３５７～６２；Ｆｅｄｉら、（１９９９年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：１９４６５～７２；およびＢａｆｉｃｏら、（２００１年）Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：６８３～６を参照されたい）。Ｄｋｋ１は、ＷＮＴ共受容体ＬＲＰ５／６と膜貫通型タンパク質Ｋｒｅｍｅｎの両方と関連し、生じた三元複合体は、迅速なＬＲＰ６内部移行および機能的Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ６ ＷＮＴ受容体複合体の不存在によるＷＮＴシグナル伝達の障害を生じる（Ｍａｏら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：３２１～５；Ｓｅｍｅｎｏｖら、（２００１年）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：９５１～６１；およびＭａｏら、（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ ４１７：６６４～７）。
Ｔｃｆ遺伝子座のノックアウトを有するトランスジェニックマウスは、後期胚発生中の小腸における増殖性幹細胞区画の喪失を示す。しかしながら、ノックアウトは、致死性であり、故に、成人では研究されていない。成人の解析を可能にするキメラトランスジェニックマウスでは、構成的に活性なＮＨ２切断型β－カテニンの発現は、小腸腺窩における増殖を刺激するが、ＮＨ２切断型β－カテニンまたはＬｅｆ－１／β－カテニン融合物のいずれかは、同様に、腺窩アポトーシスの増加を誘発した。多様な因子が、非Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ＧＰＣＲおよびＰＴＥＮ／ＰＩ－３－キナーゼを含む、β－カテニン／Ｌｅｆ／Ｔｃｆ依存性転写を調節するため、腸幹細胞欠損の原因は分かっていない。腸上皮成長の制御のための薬理学的な薬剤の開発は、臨床目的にとって非常に興味深いものである。
ＷＮＴアゴニストの探索は、それらが、本来可溶性の拡散可能な分子ではないという事実によって妨げられている。本発明は、特定のＦＺＤ受容体を介して、操作された可溶性ＷＮＴアゴニストを用いてＷＮＴシグナル伝達を特異的に調節し、特異的影響である上皮再生を達成する方法を提供する。
Ｇｌｉｎｋａら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：３５７～６２ Ｆｅｄｉら、（１９９９年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：１９４６５～７２ Ｂａｆｉｃｏら、（２００１年）Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：６８３～６ Ｍａｏら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：３２１～５ Ｓｅｍｅｎｏｖら、（２００１年）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：９５１～６１ Ｍａｏら、（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ ４１７：６６４～７
本発明は、胃腸上皮増殖、特に、炎症性腸疾患における胃腸上皮増殖を制御するためのＷＮＴアゴニストの使用に、一部、基づく。
一実施形態では、本発明は、対象に、操作されたＷＮＴシグナル伝達調節因子を投与することを含む、胃腸障害に罹患している対象を治療する方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達調節因子は、操作されたＷＮＴアゴニストである。さらなる実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストは、操作されたポリペプチド、少なくとも一つのエピトープ結合ドメインを含有する操作された抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸分子からなる群から選択される。別の実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストは、一つまたは複数のＦＺＤ受容体（ＦＺＤ１～１０）に結合する結合組成物および一つまたは複数のＬＲＰ（ＬＲＰ５～６）受容体に結合する結合組成物を含む。なおさらなる実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストの結合組成物は、ＦＺＤ５、ＦＺＤ８、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ７、ＦＺＤ５、８、ＦＺＤ１、２、７またはＦＺＤ１、２、７、５、８；ＦＺＤ４；ＦＺＤ９；またはＦＺＤ１０に結合する一つまたは複数の結合組成物；およびＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＬＲＰ５および６に結合する一つまたは複数の結合組成物を含む。さらなる実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストは、ＦＺＤ５および／またはＦＺＤ８に結合する一つまたは複数の結合組成物；ならびにＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合する一つまたは複数の結合組成物を含む。なおさらなる実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストは、ＦＺＤ５およびＦＺＤ８に結合する結合組成物、ならびにＬＲＰ６に結合する結合組成物を含む。さらなる実施形態では、ＷＮＴアゴニストは、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３の重鎖可変配列；および配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４の軽鎖可変配列を有する。別の実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストは、腸もしくは結腸における炎症性サイトカイン発現を低減し、および／または腸上皮を修復する。一部の実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストは、組織標的化分子を含む。さらなる実施形態では、組織標的化分子は、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、組織標的化分子は、細胞表面Ａ３３抗原（ＧＰＡ３３；代表的な配列は、ＮＣＢＩポリペプチド参照配列ＮＰ＿００５８０５．１である）、カドヘリン－１７（ＣＤＨ１７；代表的な配列は、ＮＣＢＩポリペプチド参照配列ＮＰ＿００４０５４．３である）、およびムチン１３（細胞表面関連（Ｍｕｃ－１３；代表的な配列は、ＮＣＢＩポリペプチド参照配列ＮＰ＿１４９０３８．３である）、またはその機能的断片もしくはバリアントからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＷＮＴアゴニストは、炎症性分子に特異的に結合する結合組成物と共に投与される。さらなる実施形態では、炎症性分子に特異的に結合する結合組成物は、炎症性分子のアンタゴニストである。さらなる実施形態では、炎症性分子のアンタゴニストは、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３、またはＩＬ－２３のアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、胃腸疾患は、炎症性腸疾患である。さらなる実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病（ＣＤ）、瘻孔形成を有するＣＤ、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）からなる群から選択される。
本発明はまた、対象に、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子を投与することを含む、胃腸障害に罹患している対象を治療する方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＷＮＴシグナル増強分子は、ａ）一つまたは複数のＥ３ユビキチンリガーゼに結合する第一のドメイン；およびｂ）組織特異的受容体に結合する第二のドメインを含む。さらなる実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、亜鉛ならびにリングフィンガータンパク質３（ＺＮＲＦ３）およびリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）からなる群から選択される。別の実施形態では、第一のドメインは、Ｒ－スポンジン（ＲＳＰＯ）ポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、ＲＳＰＯポリペプチドは、ＲＳＰＯ－１、ＲＳＰＯ－２、ＲＳＰＯ－３、およびＲＳＰＯ－４からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＲＳＰＯポリペプチドは、第一のフューリンドメインおよび第二のフューリンドメインを含む。ある特定の実施形態では、第二のフューリンドメインは、野生型であるか、またはロイシンリッチリピートを含有するＧタンパク質共役受容体４～６（ＬＧＲ４～６）へのより低い結合を有するように変異される。ある特定の実施形態では、操作されたアゴニストまたはＷｎｔシグナル増強分子は、組織標的化分子を取り込む。さらなる実施形態では、組織標的化分子は、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、組織標的化分子は、ＧＰＡ３３、ＣＤＨ１７、およびＭＵＣ－１３、またはその機能的断片もしくはバリアントからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＷＮＴアゴニストは、炎症性分子に特異的に結合する結合組成物と共に投与される。ある特定の実施形態では、炎症性分子に特異的な結合組成物は、炎症性分子のアンタゴニストである。さらなる実施形態では、炎症性分子のアンタゴニストは、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３、またはＩＬ－２３のアンタゴニストである。一部の実施形態では、胃腸疾患は、炎症性腸疾患である。さらなる実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病（ＣＤ）、瘻孔形成を有するＣＤ、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）からなる群から選択される。
別の実施形態では、本発明は、対象に、操作されたＷＮＴアゴニストおよび操作された組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子を投与することを含む、胃腸障害に罹患している対象を治療する方法を提供する。操作されたＷＮＴアゴニストおよび操作された組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、同時または異なる時間に投与されてもよい。一部の実施形態において、対象は、重複する期間、有効量の両方を含む。ある特定の実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストは、ＦＺＤ５、ＦＺＤ８、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ７、ＦＺＤ５および８、またはＦＺＤ１、２、および７に結合する一つまたは複数の結合組成物、ならびにＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＬＲＰ５に結合する一つまたは複数の結合組成物を含み、一部の実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストは、組織標的化分子を含む。ある特定の実施形態では、組織標的化分子は、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体またはその断片である。さらなる実施形態では、組織標的化分子は、ＧＰＡ３３、ＣＤＨ１７、およびＭＵＣ－１３、またはその機能的断片もしくはバリアントからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、操作されたＷＮＴシグナル増強分子は、一つまたは複数のＥ３ユビキチンリガーゼに結合する第一のドメイン；および組織特異的受容体に結合する第二のドメインを含む。さらなる実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、亜鉛ならびにリングフィンガータンパク質３（ＺＮＲＦ３）およびリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）からなる群から選択される。一部の実施形態では、第一のドメインは、Ｒ－スポンジン（ＲＳＰＯ）ポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＲＳＰＯポリペプチドは、ＲＳＰＯ－１、ＲＳＰＯ－２、ＲＳＰＯ－３、およびＲＳＰＯ－４からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＲＳＰＯポリペプチドは、第一のフューリンドメインおよび第二のフューリンドメインを含む。なおさらなる実施形態では、第二のフューリンドメインは、野生型であるか、またはロイシンリッチリピートを含有するＧタンパク質共役受容体４～６（ＬＧＲ４～６）へのより低い結合を有するように変異される。さらなる実施形態では、ＷＮＴシグナル増強分子は、配列番号１７、２０、または２３の重鎖配列および配列番号１６、１９、または２２の軽鎖配列を有する。一部の実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストおよび操作された組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、炎症性分子に特異的に結合する結合組成物と共に投与される。さらなる実施形態では、炎症性分子に特異的な結合組成物は、炎症性分子のアンタゴニストである。なおさらなる実施形態では、炎症性分子のアンタゴニストは、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３、またはＩＬ－２３のアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、胃腸疾患は、炎症性腸疾患である。さらなる実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病（ＣＤ）、瘻孔形成を有するＣＤ、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）からなる群から選択される。
別の実施形態では、本発明は、対象に、操作されたＷＮＴアゴニストおよび操作された組織特異的ＷＮＴシグナル増強組み合わせ分子を投与することを含む、胃腸障害に罹患している対象を治療する方法を提供する。ある特定の実施形態では、組み合わせ分子は、ａ）ＦＺＤ５、ＦＺＤ８、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ７、ＦＺＤ５および８、またはＦＺＤ１、２、および７に結合する一つまたは複数の結合組成物、ならびにＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＬＲＰ５に結合する一つまたは複数の結合組成物を含む操作されたＷＮＴアゴニスト、ならびにｂ）一つまたは複数のＥ３ユビキチンリガーゼに結合する第一のドメイン、および組織特異的受容体に結合する第二のドメインを含む操作されたＷＮＴシグナル増強分子を含む。さらなる実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、亜鉛ならびにリングフィンガータンパク質３（ＺＮＲＦ３）およびリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）からなる群から選択される。一部の実施形態では、第一のドメインは、Ｒ－スポンジン（ＲＳＰＯ）ポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＲＳＰＯポリペプチドは、ＲＳＰＯ－１、ＲＳＰＯ－２、ＲＳＰＯ－３、およびＲＳＰＯ－４からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＲＳＰＯポリペプチドは、第一のフューリンドメインおよび第二のフューリンドメインを含む。なおさらなる実施形態では、第二のフューリンドメインは、野生型であるか、またはロイシンリッチリピートを含有するＧタンパク質共役受容体４～６（ＬＧＲ４～６）へのより低い結合を有するように変異される。一部の実施形態では、組み合わせ分子は、組織標的化分子を取り込む。ある特定の実施形態では、組織標的化分子は、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体またはその断片である。さらなる実施形態では、組織標的化分子は、ＧＰＡ３３、ＣＤＨ１７、およびＭＵＣ－１３、またはその機能的断片もしくはバリアントからなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＷＮＴシグナル増強分子は、配列番号１７、２０、または２３の重鎖配列および配列番号１６、１９、または２２の軽鎖配列を有する。一部の実施形態では、組み合わせ分子は、炎症性分子に特異的に結合する結合組成物と共に投与される。さらなる実施形態では、炎症性分子に特異的な結合組成物は、炎症性分子のアンタゴニストである。なおさらなる実施形態では、炎症性分子のアンタゴニストは、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３、またはＩＬ－２３のアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、胃腸疾患は、炎症性腸疾患である。さらなる実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病（ＣＤ）、瘻孔形成を有するＣＤ、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）からなる群から選択される。
本明細書において開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、ＷＮＴアゴニストは、次の：ＰＣＴ出願公開第２０１６／０４０８９５号；米国公開第２０１７－０３０６０２９号；米国公開第２０１７－０３４９６５９号；ＰＣＴ出願公開第２０１９／１２６３９８号；またはＰＣＴ出願公開第２０２０／０１０３０号のいずれかにおいて開示されるものから選択される。本明細書において開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、次の：ＰＣＴ出願公開第２０１８／１４０８２１号；米国公開第２０２０－００４８３２４号；またはＰＣＴ出願公開第２０２０／１４２７１号のいずれかにおいて開示されるものから選択され、その全てが、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
別の実施形態では、本開示は、Ｆｒｉｚｚｅｄ ５（ＦＺＤ５）およびＦｒｉｚｚｌｅｄ ８（ＦＺＤ８）に特異的に結合するポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号３３～４０のいずれかに記載される配列に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗体または抗体結合断片を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３～４０のいずれか一つに記載される配列のいずれかに存在するＣＤＲの少なくとも５つまたは全６つを含む。一部の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号３３～４０のいずれか一つに記載される配列のいずれかに存在するＣＤＲの六つを含み、一つまたは複数のＣＤＲは、一つ、二つ、または三つのアミノ酸修飾、任意選択で、点変異、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入を任意選択で含む。
関連する実施形態では、本開示は、（ａ）ＦＺＤ５およびＦＺＤ８に結合する一つまたは複数の結合ドメインであって、一つまたは複数の結合ドメインの少なくとも一つは、配列番号３３～４０のいずれかに記載される配列に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有する配列を含むポリペプチドを含み、ならびに（ｂ）ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＬＲＰ５とＬＲＰ６の両方に結合する一つまたは複数の結合ドメインを含む操作されたＷＮＴアゴニストを提供する。一部の実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストは、配列番号７～１４のいずれか一つに少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の相同性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたＷＮＴアゴニストは、配列番号７に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列および配列番号８に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列；配列番号９に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列、および配列番号１０に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列；配列番号１１に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列および配列番号１２に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列；または配列番号１３に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列、および配列番号１４に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列を含む。
別の関連する実施形態では、本開示は、ａ）本明細書において開示される操作されたＷＮＴアゴニスト；およびｂ）一つまたは複数のＥ３ユビキチンリガーゼに結合する第一のドメインを含む操作されたＷＮＴシグナル増強分子；および組織特異的受容体に結合する第二のドメインを含む組み合わせ分子を提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書において開示されるポリペプチド、操作されたＷＮＴアゴニスト、または組み合わせ分子を含む医薬組成物を提供する。
関連する実施形態では、本開示は、Ｆｒｉｚｚｅｄ ５（ＦＺＤ５）およびＦｒｉｚｚｌｅｄ ８（ＦＺＤ８）に特異的に結合するポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号３３～４０のいずれかに記載されるか、または配列番号３３～４０のいずれかによりコードされる配列に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の相同性を有する一つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態では、請求項４９に記載のポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、抗体または抗体結合断片を含む。一部の実施形態では、当該抗体または抗体結合断片は、次の配列の組み合わせ：配列番号３３および３４；配列番号３５および３６；配列番号３７および３８；または配列番号３９および４０のいずれかに存在するＣＤＲの少なくとも５つまたは全６つを含む。一部の実施形態では、当該ポリペプチドは、次の配列の組み合わせ：配列番号３３および３４；配列番号３５および３６；配列番号３７および３８；または配列番号３９および４０のいずれかに存在するＣＤＲの六つを含み、ＣＤＲの一つまたは複数は、一つ、二つ、または三つのアミノ酸修飾、任意選択で、点変異、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入を含む。別の実施形態では、本開示は、ＦＺＤ５およびＦＺＤ８に結合する一つまたは複数の結合ドメインを含む操作されたＷＮＴアゴニストを提供し、一つまたは複数の結合ドメインの少なくとも一つは、Ｆｒｉｚｚｅｄ ５（ＦＺＤ５）およびＦｒｉｚｚｌｅｄ ８（ＦＺＤ８）に特異的に結合するポリペプチド、例えば、本明細書におけるいずれかの開示物；およびＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＬＲＰ５とＬＲＰ６の両方に結合する一つまたは複数の結合ドメインを含む。本開示はまた、本明細書において開示される操作されたＷＮＴアゴニスト；および一つまたは複数のＥ３ユビキチンリガーゼに結合する第一のドメインを含む操作されたＷＮＴシグナル増強分子；および組織特異的受容体に結合する第二のドメインを含む組み合わせ分子を提供する。
関連する実施形態では、本開示は、対象に、本明細書において開示される操作されたＷＮＴアゴニスト、操作されたＷＮＴシグナル増強分子、および／もしくは組み合わせ分子、または本明細書において開示される操作されたＷＮＴアゴニストもしくは組み合わせ分子を含む医薬組成物を投与することを含む、胃腸障害に罹患している対象を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、胃腸障害は、炎症性腸疾患であり、任意選択で、クローン病（ＣＤ）、瘻孔形成を有するＣＤ、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）からなる群から選択される。本明細書において開示される方法のいずれかは、本明細書において開示される操作されたＷＮＴアゴニスト、操作されたＷＮＴシグナル増強分子、および／または組み合わせ分子のいずれかを使用して実施され得る。
図１Ａ～１Ｌは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ＨＤアッセイ－レッドにより検出された、マウス小腸におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体（ＦＺＤ）１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０の発現（図１Ａ～１Ｊ）、ならびにヒト結腸におけるＦＺＤ５およびＦＺＤ７の発現（図１Ｋおよび１Ｌ）を示す。画像中の赤色の点の数は、ＦＺＤ受容体発現レベルを示す。選択された領域の拡大図は、図１Ｋ（ＦＺＤ５）および１Ｌ（ＦＺＤ７）の挿入画において示される。 同様。
図２は、組織培養細胞における組み換え可溶性ＷＮＴアゴニストの活性を示す。ＷＮＴアゴニストのシグナル伝達活性を、Ｓｕｐｅｒ ＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼレポーター（ＳＴＦ）アッセイによって試験した。Ｒ２Ｍ３－２６、１ＲＣ０７－０３、およびＲ２Ｍ１３－０３ルシフェラーゼレポーター活性についての用量応答曲線を、グラフに示す通り、測定した。
図３Ａ～３Ｅは、マウス腸オルガノイド上の異なるＦＺＤ受容体特異的組み換えＷＮＴアゴニストの活性を示す。マウス小腸オルガノイドを、Ｒ２Ｍ３－２６（図３Ａ）、１８Ｒ５－ＤＫＫ１ｃ ｓｃＦｖ（図３Ｂ）、Ｃ）Ｒ２Ｍ１３－０３（図３ＣおよびＤ）１ＲＣ０７－０３（図３Ｄ）を用いて、基礎培地中の１μＭ ＩＷＰ２（ヤマアラシ阻害剤）の存在下で処置した。図３Ｅは、１μＭ ＩＷＰ２のみで処置した対照オルガノイドを示す。Ｆ：基礎培地中で成長した通常のオルガノイド。図３Ａ、３Ｂ、および３Ｅにおけるスケールバーは、２００μｍであり、図３Ｃおよび３Ｄは、４００μｍである。
図４は、ＷＮＴアゴニスト処置時の細胞増殖を説明するための、抗Ｋｉ６７（赤色）および抗Ｅ－カドヘリン（緑色）で染色した、１００ｎＭ Ｒ２Ｍ３－２６を用いた処置後のマウス小腸オルガノイドの免疫組織化学染色を示す。
図５Ａは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性急性大腸炎マウスモデルにおけるインビボ研究に使用される実験プロトコールの模式図を示す。赤色の矢印は、毎日の体重（ＢＷ）、糞便スコアおよび糞便潜血試験を示す。バー上にある上の矢印（４日目および７日目）ならびに下の矢印（４、５、６、７、８および９日目）は、それぞれ、週２回および１日１回の処置回数を示す。 図５Ｂおよび５Ｃは、ＷＮＴアゴニストおよび／またはＲ－スポンジン２（ＲＳＰＯ２－Ｆｃ）の処置での経時的な体重および便スコアのグラフを示す。図５Ｂについて、９日目での上から下への線は、ＤＳＳなし、ＲＳＰＯ２－ｈＦｃ／Ｒ２Ｍ３、２６、毎日、ＲＳＰＯ２－ｈＦｃ／Ｒ２Ｍ３、２６、２回／週、Ｒ２Ｍ３－２６（１０ｍｐｋ）、２回／週、ＲＳＰＯ２－ｈＦｃ、３ｍｐｋ、毎日、抗ＧＦＰ、およびＲＳＰＯ２－ｈＦｃ、３ｍｐｋ、２回／週に対応する。図５Ｃについて、９日目での上から下への線は、ＲＳＰＯ２－ｈＦｃ、３ｍｐｋ、毎日、ＲＳＰＯ２－ｈＦｃ、３ｍｐｋ、２回／週、抗ＧＦＰ、Ｒ２Ｍ－２６（１０ｍｐｋ）、２回／週、ＲＳＰＯ２－ｈＦｃ／Ｒ２Ｍ３、２６、２回／週、およびＲＳＰＯ２－ｈＦｃ／Ｒ２Ｍ３、２６、毎日に対応する。週２回または１日１回のＲＳＰＯ２－Ｆｃ／Ｒ２Ｍ３－２６併用処置は、陰性対照と比較して、９日目にＤＡＩを有意に改善した。Ｒ２Ｍ３－２６単独および併用療法は、１０日目に体重を有意に改善した（＊Ｐ値０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ値＜０．０００１）。
図６Ａ～６Ｅは、単独および組み合わせでのＲ２Ｍ３－２６およびＲＳＰＯ２－Ｆｃの処置を用いた大腸炎モデルの病理画像解析を示す。
図７Ａ～７Ｅは、単独および組み合わせでのＲ２Ｍ３－２６およびＲＳＰＯ２－Ｆｃの処置後の大腸炎の程度の半定量的解析を示す。Ｒ２Ｍ３－２６処置は、１０日目の粘膜びらん、炎症性重症度、腺窩過形成、および杯細胞喪失についての組織学スコアを有意に減少させた（＊Ｐ値０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値）。組織学的スコアリングを、例えば、Ｇｅｂｏｅｓら、（２０００年）Ｇｕｔ ４７：４０４～４０９において記載される通り、評価した。
図８は、小腸の横断切片の組織学的画像を示す。Ｒ２Ｍ３－２６単独は、小腸過形成を引き起こさず、一方、ＲＳＰＯ２－Ｆｃ単独およびＲ２Ｍ３－２６の併用処置は、過形成を誘発した。
図９Ａ～９Ｊは、Ｒ２Ｍ３－２６処置、ＲＳＰＯ２－Ｆｃ処置およびＲ２Ｍ３－２６とＲＳＰＯ２－Ｆｃの併用処置が、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＴＮＦ－αの血清炎症性サイトカインレベルを低減したことを示す（＊Ｐ値、０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ値＜０．０００１）。各グラフについて、左から右のバーは以下の通りである：青色－ＤＳＳ処置なし；緑色－αＧＦＰ対照；紫色－Ｒ２Ｍ３－２６（１０ｍｐｋ）、２×／週；橙色－ＲＳＰＯ２－ｈＦｃ（３ｍｐｋ）、２×／週；黒色－ＲＳＰＯ２－ｈＦｃ（３ｍｐｋ）、毎日；茶色－ＲＳＰＯ２－ｈＦｃ（３ｍｐｋ）＋Ｒ２Ｍ３－２６（１０ｍｐｋ）、２×／週；および濃青色－ＲＳＰＯ２－ｈＦｃ（３ｍｐｋ）＋Ｒ２Ｍ３－２６（１０ｍｐｋ）、毎日。
図１０Ａ～１０Ｂは、ＤＳＳ誘発性急性大腸炎モデルにおける体重減少および糞便スコアを示す（４％ＤＳＳ、７日間、続いて、終了まで１％ＤＳＳ）。図１０Ａについて、１０日目での上から下への線は、ＤＤＳなし、Ｒ２Ｍ３－２６（１０ｍｐｋ）、２／週、Ｒ２Ｍ１３－２６（１０ｍｐｋ）、２／週、ＣＯ７－２６ ３ｍｐｋ、２／週、ＲＳＰＯ２／Ｒ２Ｍ３－２６、２／週、ＤＳＳ ＰＢＳ、および抗ＧＦＰ。図１０Ｂについて、１０日目での上から下への線は、ＲＳＰＯ２／Ｒ２Ｍ３－２６、２／週、抗ＧＦＰ、ＤＳＳ ＰＢＳ、Ｒ２Ｍ３－２６（１０ｍｐｋ）、２／週、Ｒ２Ｍ３－２６（１０ｍｐｋ）、毎日、ＣＯ７－２６、３ｍｐｋ、２／週、およびＲ２Ｍ１３－２６ １０ｍｐｋ、２／週。ＤＳＳ処置群の中で、週２回のＲ２Ｍ３－２６、Ｒ２Ｍ１３－２６、および１ＲＣ０７－２６処置は、陰性対照（ＰＢＳまたはαＧＦＰ）と比較して、１０日目に体重（図１０Ａ）および便スコア（図１０Ｂ）を有意に改善した。（＊Ｐ値、０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ値＜０．０００１）。
図１１Ａ～１１Ｈは、ＷＮＴアゴニスト処置が、ＤＳＳモデルにおいて結腸上皮損傷を修復したことを示す。ＤＳＳモデルマウスの横行結腸の組織学的評価は、粘膜から漿膜まで延びる炎症、腺窩過形成、杯細胞消失および潰瘍を含む結腸上皮損傷を示した。Ｒ２Ｍ３－２６、Ｒ２Ｍ１３－２６、および１ＲＣ０７－２６処置は、結腸上皮を効果的に修復し、上皮びらん、杯細胞喪失、および好中球遊走を減少する。
図１２Ａ～１２Ｈは、未処置、ＷＮＴアゴニスト、またはＷＮＴアゴニストとＲＳＰＯ２－ｈＦｃの組み合わせで処置したＤＳＳ大腸炎モデルマウスにおける小腸の横断切片を示す。Ｒ２Ｍ３－２６、Ｒ２Ｍ１３－２６、または１ＲＣ０７－３は、小腸過形成を引き起こさず、一方、Ｒ２Ｍ３－２６とＲＳＰＯ２－Ｆｃの併用処置は、小腸の過形成を誘発した。
図１３Ａ～１３Ｆは、ＷＮＴアゴニスト処置が、血清および結腸組織におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－８の炎症性サイトカインレベルを低減したことを示す（＊Ｐ値、０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ値＜０．０００１）。各グラフについて、左から右のバーは、以下に示される通りである。
図１４Ａ～１４Ｂは、Ｒ２Ｍ１３－２６処置が、ＤＳＳモデルにおいてＤＡＩにおける用量依存性有効性を示したことを示す。週２回の０．３、１、３、１０ｍｐｋでのＲ２Ｍ１３－２６処置、および週１回の１、３、１０、３０ｍｐｋでの処置は共に、用量応答パターンでＤＡＩを低減した（図１４Ｂ）（＊Ｐ値、０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ値＜０．０００１）。図１４Ａについて、１０日目の時点における上から下への線は、上から下への図の凡例と相関する。図１４Ｂについて、１０日目の時点における上から下への線は、ＤＳＳ抗ＧＦＰ、１０ｍｐｋ、２／週、Ｒ２Ｍ１３－２６、１ｍｐｋ、１／週、Ｒ２Ｍ１３－２６、３０ｍｐｋ、１／週、Ｒ２Ｍ１３－２６、１０ｍｐｋ、１／週、およびＲ２Ｍ１３－２６、３ｍｐｋ、１／週と相関する。
図１５Ａ～１５Ｊは、ＤＳＳモデルマウスの横行結腸の横断面の組織学的評価を示す。結腸上皮損傷は、好中球浸潤、浮腫、腺窩過形成、杯細胞喪失および潰瘍を含んでいた（図１５Ｂ）。異なる用量および頻度でのＲ２Ｍ１３－２６処置はすべて、ＤＳＳ大腸炎マウスにおいて、結腸組織学の改善、上皮びらんの修復ならびに杯細胞消失および好中球遊走の減少を示した。
図１６Ａ～１６Ｃは、異なる用量および頻度でのＲ２Ｍ１３－２６処置はすべて、血清におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、およびＩＬ－８の炎症性サイトカインレベルを低減したことを示す（＊Ｐ値、０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ値＜０．０００１）。
図１７Ａ～１７Ｃは、異なる用量および頻度でのＲ２Ｍ１３－２６処置はすべて、結腸組織におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、およびＩＬ－８の炎症性サイトカインレベルを低減したことを示す（＊Ｐ値、０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ値＜０．０００１）。
図１８は、四つのＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニストの活性。ＦＺＤ５、８特異的アゴニストのシグナル伝達活性を、Ｓｕｐｅｒ ＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼレポーター（ＳＴＦ）アッセイにより試験した。５７ＳＥ８－２６、５７ＳＢ８－２６、１７４Ｒ－Ｅ０１－２６および５７ＳＡ１０－２６ルシフェラーゼレポーター活性についての用量応答曲線を、示した通り、測定し、同じアッセイにおけるＲ２Ｍ１３－２６の活性と比較した。
図１９Ａ～１９Ｄは、急性ＤＳＳモデルにおける四つのＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニストの有効性を示す。図１９Ａは、四つのＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニストを用いた処置すべてが、ＤＳＳモデルにおいて疾患活動性指数（ＤＡＩ；Ｇｅｂｏｅｓら、（２０００年）、Ｇｕｔ ４７：４０４－４０９）を低下させることによる有効性を示したことを示す。週２回の１０ｍｐｋでのＷＮＴアゴニスト処置は、抗ＧＦＰ対照と比較して、ＤＡＩを有意に低減した（＊Ｐ値、０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ値＜０．０００１）。８日目の上から下への線は、抗ＧＦＰ、５７ＳＥ８－２６、５７ＳＢ８－２６、１７４ＲＥ０１－２６、Ｒ２Ｍ１３－２６、５７ＳＡ１０－２６、およびＤＳＳなしに対応する。
図１９Ｂ～１９Ｄは、同じ用量のＲ２Ｍ１３－２６と比較した、四つのＦＺＤ５、８－特異的ＷＮＴアゴニストの処置はすべて、血清におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、およびＩＬ－８の炎症性サイトカインレベルを低減したことを示す（＊Ｐ値、０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ値＜０．０００１）。 同上。 同上。
図２０は、ＭＵＣ－１３を発現するヒト腸ＨＴ２９細胞株に結合する、ＩｇＧ形式の抗体クローンＣ１４（例えば、国際公開第２０１６１６８６０７Ａ１号を参照）を示す。全長抗体としても発現した二つの追加のＭＵＣ－１３結合剤Ｃ４およびＣ７（例えば、国際公開第２０１６１６８６０７Ａ１号を参照）は、ヒト腸細胞ＨＴ２９への特異的結合を示さなかった（図２０Ａ～２０Ｃ）。非特異的結合を、ＭＵＣ－１３を発現しないＨＥＫ２９３細胞株（図２０Ｄ～２０Ｆ）を使用して評価した。ＭＵＣ－１３抗体の細胞表面結合を、ＦＡＣＳにより１０ｎＭで調べた。Ｃ１４は、ＨＴ２９細胞では明確なＦＡＣＳシフトを示したが、ＨＥＫ２９３細胞では示さず、これは、特異的結合を示唆している。
図２１は、ＭＵＣ－１３標的化変異体ＲＳＰＯ２（ｍｕｔＲＳＰＯ２）融合物のシグナル伝達活性を、ＨＴ２９細胞またはＨＥＫ２９３細胞におけるＳｕｐｅｒ ＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼレポーター（ＳＴＦ）アッセイによって試験したことを示す。ＭｕｔＲＳＰＯ２は、フューリン２結合ドメインにおいてアミノ酸変異を有し、これにより、ＬＧＲ１－４への結合を低減させる（例えば、国際公開第２０２００１４２７１号を参照のこと）。Ｃ４－ｍｕｔＲＳＰＯ２、Ｃ７－ｍｕｔＲＳＰＯ２、およびＣ１４－ｍｕｔＲＳＰＯ２ルシフェラーゼレポーター活性についての用量反応曲線を、グラフに示した通り、測定した。Ｃ１４－ｍｕｔＲＳＰＯは、野生型Ｆｃ－ＲＳＰＯ２に匹敵するＥＣ５０で、ＨＴ２９細胞においてのみ、用量応答曲線の特異的な左シフトを示した。
図２２は、野生型ＲＳＰＯを、培地中のＣ１４－ｍｕｔＲＳＰＯで置き換えたとき、ヒト小腸オルガノイドの成長を維持したことを示す。ヒト小腸オルガノイドを、ＲＳＰＯ－１を、示された連続希釈濃度の非上皮細胞（例えば、肝細胞）標的化ｍｕｔＲＳＰＯ１（ＡＳＧＲ１－ｍｕｔＲＳＰＯ１；例えば、国際公開第２０２００１４２７１号；および国際公開第２０１８１４０８２１号を参照）（図２２Ａ～２２Ｃ）または同じ濃度のＣ１４－ｍｕｔＲＳＰＯ２（図２２Ｄ～２２Ｆ）により置き換えた基礎培地において成長させた。ＲＳＰＯを含まない基礎培地中で成長させたときに観察されたものと同様に、ＡＳＧＲ１－ｍｕｔＲＳＰＯ１において成長させたオルガノイドは成長を停止し、変性し始める一方（図２２Ｇ）、Ｃ１４－ｍｕｔＲＳＰＯは、野生型ＲＳＰＯを含有するＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地と類似するオルガノイド成長を維持することができた（図２２Ｈ）。
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形の用語である「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、対応する複数形への言及を含む。
本明細書で引用されるすべての参考文献は、個々の刊行物、特許出願、または特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたのと同程度に、参照により組み込まれる。
Ｉ．定義。
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性への結合、遺伝子発現を刺激する能力への結合、抗原活性への結合、他の分子の活性の調節などを記述する、または指す場合がある。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、例えば、接着を調節または維持する活性、または細胞、例えば、細胞膜または細胞骨格の構造を維持する活性も指す場合がある。「活性」はまた、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫活性］／［ｍｇタンパク質］などを意味する場合がある。
本明細書で使用される場合、「投与する」、または「導入する」、または「提供する」という用語は、対象の細胞、複数の細胞、組織、組織オルガノイド、および／もしくは器官、または対象への組成物の送達を指す。こうした投与または導入は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで行われ得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原エピトープに特異的に結合するために必要な可変領域配列を含む単離した結合体または組換え結合剤を意味する。したがって、抗体は、例えば、特異的標的抗原に結合するなど、望ましい生物活性を呈する任意の形態の抗体またはその断片である。それ故に、最も広範な意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ、ダイアボディ、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびにｓｃＦｖ、Ｆａｂ、およびＦａｂ２を含むがこれらに限定されない抗体断片を、望ましい生物活性を示す限り、網羅する。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、例えば、無傷の抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、線形抗体（例えば、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７～１０６２（１９９５年））、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する二つの同一の抗原結合断片、すなわち「Ｆａｂ」断片と、容易に結晶化する能力を反映する意味である残留「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有し、なおも抗原を架橋結合可能なＦ（ａｂ’）２断片を産生する。
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤によって結合されることができる分子または分子の一部を指し、３０の追加的に、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を生成するために動物中でさらに使用することができる。一定の実施形態では、結合剤（例えば、ＷＮＴ代替分子もしくはその結合領域、またはＷＮＴアンタゴニスト）は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物においてその標的抗原を優先的に認識するときに、抗原を特異的に結合するとされる。
本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という用語は、目的の抗原、特に、一つまたは複数のＦＺＤ受容体、またはＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６に結合する、免疫グロブリン重鎖および／もしくは軽鎖、またはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（Ｎａｂ）のうち少なくとも一つのＣＤＲを含有するポリペプチド断片を指す。これに関して、本明細書に記載される抗体の抗原結合断片は、一つまたは複数のＦＺＤ受容体、またはＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合する抗体由来のＶＨおよびＶＬのうち１、２、３、４、５、または６つすべてのＣＤＲを含み得る。
本明細書で使用される場合、「生物学的活性」および「生物学的に活性」という用語は、細胞中の特定の生物学的要素に帰する活性を指す。例えば、ＷＮＴアゴニストまたはその断片もしくはバリアントの「生物学的活性」は、ＷＮＴシグナルを模倣または増強する能力を指す。別の例として、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントの生物学的活性は、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントが、例えば、結合、酵素活性など、その本来の機能を達成する能力を指す。一部の実施形態では、機能的断片またはバリアントは、対応する天然タンパク質または核酸の活性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％を保持する。第三の例として、遺伝子調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、コザック配列などの生物学的活性は、調節要素またはその機能的断片もしくはバリアントが、それぞれ、それが動作可能に連結される遺伝子の発現の翻訳を調節、すなわち、促進、増強、または活性化する能力を指す。
本明細書で使用される場合、「二機能性抗体」という用語は、一つの抗原部位に対する特異性を有する第一のアームと、異なる抗原部位に対する特異性を有する第二のアームとを含む抗体を指し、すなわち、二機能性抗体は二重特異性を有する。
本書で使用される場合、「二重特異性抗体」は、クアドローマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５（５９３４）：５３７～５４０（１９８３年）を参照）によって、二つの異なるモノクローナル抗体の化学的共役（Ｓｔａｅｒｚら、Ｎａｔｕｒｅ，３１４（６０１２）：６２８～６３１（１９８５年）を参照）によって、あるいはＦｃ領域に突然変異を導入するノブイントゥホール（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）または類似したアプローチ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（１４）：６４４４～６４４８（１９９３年）を参照）によって生成される完全長抗体であって、複数の異なる免疫グロブリン種をもたらし、そのうちどれか一つのみが機能的二重特異性抗体であるものを指す。二重特異性抗体は、その二つの結合アームのうちの一つ（一対のＨＣ／ＬＣ）で一つの抗原（またはエピトープ）に結合し、その第二のアーム（異なる対のＨＣ／ＬＣ）で異なる抗原（またはエピトープ）に結合する。この定義により、二重特異性抗体は、二つの別個の抗原結合アーム（特異性およびＣＤＲ配列の両方）を有し、それが結合する各抗原に対して一価である。
「含む」とは、列挙された要素が、例えば、組成物、方法、キットなどにおいて必要とされることを意味するが、例えば、組成物、方法、キットなどを特許請求の範囲内で形成するためにその他の要素を含んでもよい。例えば、プロモーターに動作可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットは、遺伝子およびプロモーターに加えて、例えば、ポリアデニル化配列、エンハンサー要素、他の遺伝子、リンカードメインなどの他の要素を含みうる発現カセットである。
「から本質的になる」とは、例えば、組成物、方法、キットなどの基礎特性および新規特性に実質的に影響しない、指定された材料または工程に記述された組成物、方法、キットなどの範囲の限定を意味する。例えば、プロモーターに動作可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子と、ポリアデニル化配列と「から本質的になる」発現カセットは、遺伝子の転写または翻訳に実質的に影響を与えない限り、例えばリンカー配列などの追加的な配列を含んでもよい。別の例として、列挙された配列「から本質的になる」、バリアントまたは突然変異体であるポリペプチド断片は、それが誘発された完全長無感作ポリペプチドに基づき、列挙された配列について、配列の境界部にプラスマイナス約１０個のアミノ酸残基を有し、例えば、列挙された境界のアミノ酸残基よりも１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個少ない残基数、または列挙された境界のアミノ酸残基よりも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個多い残基数のアミノ酸配列を有する。
「からなる」とは、請求項に特定されていない任意の要素、工程、または成分の組成物、方法、またはキットからの除外を意味する。例えば、列挙された配列「からなる」ポリペプチドまたはポリペプチドドメインは、列挙された配列のみを含有する。
「制御要素」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を与える場合があり、事実上、増強または抑制しうる。当該技術分野で公知の制御要素としては、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、一定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、普通はプロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始する能力を有するＤＮＡ領域である。
「エピトープ」は、抗体が認識して結合する抗原上の特異的領域であり、また「抗原決定基」とも呼称される。エピトープは通常、タンパク質の表面上の５～８アミノ酸長である。タンパク質は３次元的に折り畳まれた構造であり、エピトープは、溶液またはその天然形態に存在するときのみ、その形態で認識され得る。エピトープが、三次元構造によって一緒にもたらされるアミノ酸からなるとき、エピトープは立体構造であるか、または非連続である。エピトープが単一のポリペプチド鎖上に存在するとき、それは連続的または直線的エピトープである。抗体が認識するエピトープに応じて、タンパク質の断片または変性セグメントのみを結合するか、または天然タンパク質を結合することも可能である。
エピトープを認識する抗体またはその抗体断片の一部分は、「エピトープ結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」と呼ばれる。抗体または抗体断片のエピトープまたは抗原結合ドメインは、Ｆａｂ断片にあり、エフェクターは、Ｆｃ断片において機能する。重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）内の相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる六つのセグメントは、抗体の残りのフレームワーク（ＦＲ領域）球状構造からループアウトし、相互作用して、分子の一端で露出した表面を形成する。これは、抗原結合ドメインである。一般に、ＣＤＲの４～６つは、結合抗原に直接関与するが、主要な結合モチーフを提供することができるものは少ない。
「発現ベクター」は、本明細書に記載される、または当該技術分野で公知のベクター、例えばプラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、リポソームなどであり、目的の遺伝子産物をコードする領域を含み、意図された標的細胞における遺伝子産物の発現に影響を与えるために使用される。発現ベクターはまた、標的内の遺伝子産物の発現を促進するために、コード化領域に動作するように可能に連結された制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ標的化配列なども含む。制御要素と、発現のために動作可能に連結される遺伝子との組合せは、時に、「発現カセット」と称され、その多数が当該技術分野で公知であり、かつ利用可能であり、または当該技術分野で利用可能な構成要素から容易に構築することができる。
本明細書で使用される場合、「ＦＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲの枠組みをする四つの隣接するアミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合抗原と接触しうるが、抗原結合部位への、特にＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基へのＶ領域の折り畳みは、ＦＲが主に担う。ＦＲ内では、一定のアミノ残基および一定の構造的特徴は非常によく保存される。これに関して、すべてのＶ領域配列は、約９０個のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位に折り畳まれると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突き出たループモチーフとして示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、ＣＤＲループの折り畳み形状に影響を及ぼす、一定の「正準の」構造に保存されたＦＲの構造的領域があることが一般的に認識される。さらに、一定のＦＲ残基は、抗体の重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合ドメイン間接触に関与することが知られている。
「個体」、「宿主」、「対象者」、「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト霊長類（類人猿およびヒトを含む）、哺乳類競技動物（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｐｏｒｔ ａｎｉｍａｌ）（例えば、ウマ）、哺乳類家畜（例えば、ヒツジ、ヤギなど）、哺乳類ペット（イヌ、ネコなど）、および齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含むがこれに限定されない哺乳動物を指す。
「モノクローナル抗体」は、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（天然起源および非天然起源）を含む、均質な抗体集団を意味する。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられる。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷のモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体を包含するだけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、そのバリアント、モノクローナル抗体の抗原結合断片を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、および免疫グロブリン分子のその他任意の修飾構成も含み、この免疫グロブリン分子は、本明細書に開示のＷＮＴ代替分子を含めた、エピトープに結合する必要な特異性および能力の抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む。これは、抗体の供給源または抗体が作製される様態（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え体発現、遺伝子導入動物などによる）に関して限定されることは意図していない。この用語は、免疫グロブリン全体だけでなく、上記で「抗体」の定義の下で記述されている断片なども含む。
本明細書で使用される場合、「未変性」または「野生型」という用語は、野生型細胞、組織、器官または生物体内に存在するヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）、または遺伝子産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）を指す。本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば、未変性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の突然変異体を指し、すなわち、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列との１００％未満の配列同一性を有する。言い換えると、バリアントは、基準ポリヌクレオチド配列、例えば、未変性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対する少なくとも一つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。例えば、バリアントは、完全長未変性ポリヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、または７０％以上の配列同一性、例えば、完全長未変性ポリヌクレオチド配列と７５％または８０％以上の同一性（８５％、９０％、または９５％以上など）、例えば、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチドでもよい。別の例として、バリアントは、完全長未変性ポリペプチド配列と７０％以上の配列同一性、例えば、完全長未変性ポリペプチド配列と７５％または８０％以上の同一性（８５％、９０％、または９５％以上など）、例えば、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドでもよい。バリアントはまた、基準（例えば、未変性）配列の断片と７０％以上の配列同一性、例えば、未変性配列と７５％または８０％以上の同一性（８５％、９０％、または９５％以上など）、例えば、９８％または９９％の同一性を共有する基準（例えば未変性）配列のバリアント断片も含んでもよい。
「動作するように連結」または「動作可能に連結」は、遺伝的要素の並置を指し、要素は、それらが予期される様態での動作が許容される関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、プロモーターは、コード領域に動作するように連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在しうる。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識化成分との共役を含む。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組立の前または後に付与されうる。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、互換的に二本鎖分子および一本鎖分子を指す。別途指定または要求が無い限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載される本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知であるか、または予測される、二つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する一定のパーセントの「配列同一性」を有し、これは、二つの配列を比較するときに整列させると、その塩基またはアミノ酸のパーセントが同じであることを意味する。配列類似性は、多くの異なる様態で決定することができる。配列同一性を決定するために、配列は、ワールドワイドウェブ上でｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータプログラムを使用して整列させることができる。別の整列アルゴリズムはＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ（米国ウィスコンシン州マディソンにある、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全子会社）で入手可能なＦＡＳＴＡである。他の整列技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６年）、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡにおいて記載される。特に興味深いのは、配列のギャップを許容する整列プログラムである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列の整列のギャップを許容する、一つのタイプのアルゴリズムである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３～１８７（１９９７年）を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ整列法を使用したＧＡＰプログラムを利用して、配列を整列させることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３～４５３（１９７０年）を参照されたい。
興味深いのは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２～４８９（１９８１年））の局所相同性アルゴリズムを使用して配列同一性を決定するＢｅｓｔＦｉｔプログラムである。ギャップ生成ペナルティは、一般に１～５の範囲であり、普通は２～４であり、多くの実施形態では３である。ギャップ伸長ペナルティは、一般的に約０．０１～０．２０の範囲であり、多くの事例では０．１０である。プログラムは、比較するために入力された配列によって決定されるデフォルトパラメータを有する。配列同一性は、プログラムによって決定されるデフォルトパラメータを使用して決定されることが好ましい。このプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージからも入手可能である。
別の目的のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．１２７～１４９、１９８８年、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に記載がある。配列同一性のパーセントは、以下のパラメータに基づき、ＦａｓｔＤＢによって計算される：不一致ペナルティ：１．００；ギャップペナルティ：１．００；ギャップサイズペナルティ：０．３３；および結合ペナルティ：３０．０。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指令し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち転写を指令するために十分な最小配列を包含する。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は、ユビキタスであってもよく、これは広範囲の細胞、組織および種内で強力な活性であるか、または細胞型特異的、組織特異的、もしくは種特異的であることを意味する。プロモーターは、継続的活性を意味する「構成的」であってもよく、またはプロモーターが生物的要因または非生物的要因の存在または非存在によって活性化することも、または無効化することもできることを意味する「誘発性」であってもよい。また、本発明の核酸構築物またはベクターには、プロモーター配列と連続的であってもよく、または連続的でなくてもよいエンハンサー配列も含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を与え、未変性遺伝子の５’領域または３’領域に位置しうる。
ポリヌクレオチドに適用される場合、「組換え体」は、ポリヌクレオチドが、クローニング工程、制限工程またはライゲーション工程、および自然界に存在するポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組合せの産物であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ干渉」とは、内因性遺伝子サイレンシング経路（例えば、ＤｉｃｅｒおよびＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を介して標的ｍＲＮＡを分解することによって標的遺伝子の発現を減少する薬剤の使用を指す。ＲＮＡ干渉は、ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む様々な薬剤を使用して達成され得る。「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用され得るヘアピンターンを有する二本鎖の人工ＲＮＡ分子を指す。細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は、典型的には、プラスミドの送達によって、またはウイルスもしくは細菌ベクターを介して達成される。ｓｈＲＮＡは、比較的遅い分解速度およびターンオーバー速度を有するという点で、ＲＮＡｉの有利なメディエーターである。小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、通常、ｍｉＲＮＡと類似した２０～２５塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ分子の一種であり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で作用する。これは、転写後にｍＲＮＡを分解し、翻訳を防止することにより、相補的ヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現を妨害する。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長であり、その３’末端に２塩基オーバーハングを有する。ｓｉＲＮＡは、個々の細胞および／または培養系に導入され、標的ｍＲＮＡ配列の分解をもたらすことができる。本明細書で使用される場合、「モルホリノ」は、修飾核酸オリゴマーを指し、標準核酸塩基は、モルホリン環に結合され、ホスホロジアミデート結合を介して連結される。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡと同様に、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列に結合する。しかしながら、モルホリノは、分解のための相補的なｍＲＮＡ配列を標的化するよりむしろ、ｍＲＮＡ翻訳の立体的な阻害およびｍＲＮＡスプライシングの変化を介して機能する。
「治療」、「治療する」などの用語は、本明細書では、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般的に意味するために使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止する、例えば、疾患またはその症状が対象者に発生する可能性を低減するという点で、予防的であってもよく、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用に対する部分的または完全な治癒という点で、治療的であってもよい。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物における疾患の任意の治療を網羅し、これには（ａ）疾患にかかりやすい場合があるにもかかわらず、まだ罹患していると診断されていない対象における疾患の発生の防止、（ｂ）疾患の阻害、すなわち、その進行の阻止、または（ｃ）疾患の緩和、すなわち、疾患の退縮の発生が含まれる。治療剤は、疾患または損傷の開始前、開始中、または開始後に投与されてもよい。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または減少させる、進行中の疾患の治療は、特に興味深い。こうした治療は、罹患した組織における機能が完全に喪失する前に実施されることが望ましい。主題の療法は、疾患の症候期の間、および一部の事例では、疾患の症候期後に投与されることが望ましい。
本発明の実施は、別途指示がない限り、当業者の範囲内にある細胞生物学、分子生物学技法、微生物学、生化学および免疫学の従来の技法を採用する。そのような技術は、文献中で、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２編（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１年）において十分に説明され、その各々が、参照により本明細書に明白に取り込まれる。
本発明のいくつかの態様が、例示のための適用例を参照して以下に説明される。当然のことながら、本発明の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細、関係、および方法が明記されている。しかしながら、当業者であれば、本発明を、特定の詳細のうちの一つまたは複数を用いずに、または他の方法を用いて実施することができることを容易に認識するであろう。本発明は、いくつかの行為は、異なる順序で、および／または他の行為もしくは事象と同時に起こる場合があるため、行為または事象の例示された順序付けによって限定されない。さらに、例示されたすべての行為または事象が、本発明に従って方法論を実施するために必要とされるわけではない。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記述する目的のみのためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」）は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含む」（「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」）、「有する」（「ｈａｖｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｗｉｔｈ」）という用語、またはそれらの変形は、発明を実施するための形態および／または特許請求の範囲のいずれかに使用される限りにおいて、こうした用語は、「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）という用語と類似した様態で包含的であることが意図される。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、当該技術分野の慣行によれば、「約」とは、１以内、または１を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が明細書および特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記載がない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語が仮定されるべきである。
本明細書で言及される全ての刊行物は、その刊行物がそれに関して引用される方法および／または資料を開示および記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾がある限りにおいて、組み込まれた出版物の任意の開示に優先することが理解される。
あらゆる任意的な要素を除外するように、特許請求の範囲を立案しうることが、さらに注記される。したがって、この記述は、請求項要素の列挙、または「負」の限定の使用に関連した、「単に」、「のみ」などの排他的用語を使用するための先行的基礎としての役割を果たすことを意図している。
別途指示が無い限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者が使用することになるのと同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内にある微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技法を採用する。
ＩＩ．一般原則。
本発明は、クローン病、瘻孔形成を伴うクローン病、および潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない、炎症性腸疾患を含むが、これらに限定されない胃腸障害を改善するためのＷＮＴシグナルを調節する方法を提供する。特に、本発明は、これらの障害による損傷の結果としての腸上皮の再生を強化するためのＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達アゴニストを提供する。
ＷＮＴ（「ウィングレス関連統合部位」、または「ウィングレスおよびＩｎｔ－１」、または「ウィングレス－Ｉｎｔ」）リガンドおよびそれらのシグナルは、骨、肝臓、皮膚、胃、腸、腎臓、中枢神経系、乳腺、味蕾、卵巣、蝸牛、肺、およびその他多くの組織を含む、数多くの不可欠な器官および組織の発生、ホメオスタシス、および再生の制御において重要な役割を果たす（例えば、Ｃｌｅｖｅｒｓ、Ｌｏｈ、およびＮｕｓｓｅ、２０１４年；３４６：１２４８０１２によって概説される）。ＷＮＴシグナル伝達経路の調節は、変性疾患および組織損傷の治療の可能性がある。
治療としてのＷＮＴシグナル伝達を調節することに対する課題のうちの一つは、複数のＷＮＴリガンドおよびＷＮＴ受容体、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ １～１０（ＦＺＤ１～１０）の存在であり、多くの組織が複数の重複するＦＺＤを発現する。正準のＷＮＴシグナルはまた、ＦＺＤに加えて、様々な組織で広く発現される共受容体として、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）にも関与している。
Ｒ－スポンジン１～４は、ＷＮＴシグナルを増幅するリガンドのファミリーである。Ｒ－スポンジンの各々は、一方の末端に亜鉛およびリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）またはリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）を含有し、他方の末端にロイシンリッチな反復を含有するＧタンパク質結合受容体４－６（ＬＧＲ４－６）を含有する受容体複合体を介して作用する（例えば、ＫｎｉｇｈｔおよびＨａｎｋｅｎｓｏｎ ２０１４年、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ；３７：１５７～１６１により概説される）。Ｒ－スポンジンはまた、追加的な作用機序を通して作用する場合もある。ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、分解のためにＷＮＴ受容体（ＦＺＤ１～１０およびＬＲＰ５またはＬＲＰ６）を特異的に標的化する二つの膜結合型のＥ３リガーゼである。Ｒ－スポンジンのＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３およびＬＧＲ４－６への結合は、三元複合体のクリアランスまたは隔離を引き起こし、これが、ＷＮＴ受容体からＥ３リガーゼを除去し、ＷＮＴ受容体を安定化し、結果としてＷＮＴシグナルの増強をもたらす。各Ｒ－スポンジンは、二つのフューリンドメイン（１および２）を含有し、フューリンドメイン１はＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合し、フューリンドメイン２はＬＧＲ４－６に結合する。フューリンドメイン１および２を含有するＲ－スポンジンの断片は、ＷＮＴシグナル伝達を増幅するのに十分である。Ｒ－スポンジン効果は、ＷＮＴシグナルに依存するが、ＬＧＲ４－６およびＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の両方は、様々な組織に広く発現するため、Ｒ－スポンジンの効果は組織特異的ではない。
ＲＳＰＯまたはＷＮＴアゴニストによるＷＮＴシグナル伝達の活性化は、胃腸障害の治療に使用され得る。文献における従前の研究は、ＲＳＰＯが実験的な結腸大腸炎の治療に使用され得ることを示唆している（Ｊ．Ｚｈａｏら、２００７年）。ＷＮＴアゴニスト性分子は、胃腸障害の治療にも使用され得る。特に、活性ＷＮＴシグナル伝達は、主要な幹細胞維持シグナルをもたらすことができ、恒常性および損傷における腸上皮の再生を調節する上で重要な役割を果たしている。吸収型および分泌型の二つの腸上皮系統は、腸装置の二つの主な機能を定義し、分泌細胞は、ホルモンを分泌し、主に粘液および抗微生物ペプチドの分泌を通して、食物媒介性微生物、毒素、および抗原に対する重要なバリアを提供する。対照的に、吸収型の細胞は、主に小腸の絨毛の先端または結腸腺窩の先端に局在するため、食物栄養素の取り込みを行い、これにより、腸表面積にわたる管腔細胞の大部分を構成する（例えば、Ｓａｎｔｏｓら、（２０１８年）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．印刷中、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｔｃｂ．２０１８．０８．００１を参照されたい）。恒常性条件下では、腸上皮内のすべての細胞は、３～１０日で再生する。
異なるニッチ因子は、ＩＳＣ活性を維持し、別個の非上皮細胞および／または上皮細胞は、細胞微小環境を構成する様々なシグナルを作り上げる。このような微小環境因子には、ＷＮＴ、Ｒ－スポンジン、ノッチ、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などの基準シグナルが含まれるが、炎症および食事の影響も含まれる。損傷時に、ＩＳＣ微小環境は、その恒常性状態を超えて適応し、病原性刺激を解釈し、それらを上皮の再生へと解釈する。この再生は、生存しているＬｇｒ５＋ＩＳＣまたは腸細胞、腸内分泌細胞、または上皮再生目的にＬｇｒ５＋ＩＳＣに戻り得るパネート細胞などの他の成熟細胞のいずれかによって仲介される（ＢｅｕｍｅｒおよびＣｌｅｖｅｒｓ、（２０１６年）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４３：３６３９～３６４９）。
円柱基底細胞（ＣＢＣ）としても知られる、腸腺窩底部の腸幹細胞（ＩＳＣ）は、ＷＮＴ分泌パネート細胞と共に挿入される（ＣｈｅｎｇおよびＬｅｂｌｏｎｄ（１９７４年）Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１４１：５３７～５６１）。腸上皮を取り囲む間葉細胞はまた、いくつかのＷＮＴタンパク質を分泌し、これにより、インビボでの重複する幹細胞微小環境機能を果たす（Ｆａｒｉｎら、（２０１２年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１４３：１５１８～１５２９）。ＷＮＴシグナル伝達の存在下で、ＩＳＣは分裂して、自己再生幹細胞および機能的細胞タイプに分化する前に、まず数回の迅速な有限増殖（ＴＡ）分裂を経る、分化する娘細胞を生じる。また、腸腺窩において静止幹細胞集団である＋４細胞が存在し、これは、ＣＢＣが損傷されたとき、上皮再生に関与し得る（Ｔｉａｎら、（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ ４７８：２５５～２５９）。ＴＡ細胞は、ＷＮＴ産生細胞から離れて、腺窩－絨毛軸に沿って遊走するため、個々の系統および末端分化への関与が生じる。
一部の実施形態では、ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達アゴニストは、一つまたは複数のＦＺＤ受容体に結合し、ＷＮＴシグナル伝達を阻害または増強する結合剤またはエピトープ結合ドメインを含むことができる。ある特定の実施形態では、薬剤または抗体は、それが結合するヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体内のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に特異的に結合する。さらに、ＬＲＰに対するエピトープ結合ドメインを含有する結合剤も使用することができる。一部の実施形態では、ＷＮＴ／β－カテニンアゴニストは、Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する結合剤またはエピトープ結合ドメインを保有する。Ｅ３リガーゼアゴニスト抗体またはその断片は、単一分子であってもよく、または他のＷＮＴアンタゴニスト、例えば、ＦＺＤ受容体アンタゴニスト、ＬＲＰ受容体アンタゴニストなどと組合わされてもよい。
当該技術分野で周知のように、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域上に位置する少なくとも一つのエピトープ結合ドメインを介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を包含するだけでなく、その断片であって、エピトープ結合ドメイン（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ｓｃＦｖ）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ｎａｂ；ｓｄＡｂもしくはＶＨＨドメインとしても知られる）、ＤＶＤ－Ｉｇ、その合成バリアント、天然起源のバリアント、エピトープ結合ドメインを含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ならびに必要とされる特異性の抗原結合部位または断片（エピトープ認識部位）を含む、免疫グロブリン分子のその他任意の修飾構成を含む断片も包含する。遺伝子融合（国際特許出願公開第９４／１３８０４号；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４～６４４８、１９９３年）によって構築される多価または多重特異性断片の「ダイアボディ」もまた、本明細書で企図される抗体の特定の形態である。ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディも本明細書に含まれる（Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６、３０５５～３０６１、１９９６年）。例えば、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４～５４６（１９８９年）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３～４２６、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８５、５８７９～５８８３、１９８８年）；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；国際特許出願公開第９４／１３８０４号；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４－６４４８、１９９３年；Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４、１２３９～１２４５、１９９６年；Ｓ．Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６、３０５５～３０６１、１９９６年を参照されたい。
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を産生し、そのうちの二つ（Ｆ（ａｂ）断片）はそれぞれ、無傷の抗原結合部位を含む共有結合性ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含むいくつかの断片を提供することができる。本開示の一定の実施形態による使用のためのＦｖ断片は、ＩｇＭ免疫グロブリン分子、また稀にＩｇＧ免疫グロブリン分子またはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的タンパク質分解切断によって生成することができる。しかしながら、Ｆｖ断片は、当該技術分野で公知の組換え技法を使用してより一般的に誘発される。Ｆｖ断片は、未変性抗体分子の抗原認識および結合能力の大部分を保持する抗原結合部位を含む非共有結合性ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒら、（１９７２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９～２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら、（１９７６年）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６～２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら、（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１～４０９６を参照されたい。
一定の実施形態では、一本鎖ＦｖまたはｓｃＦＶ抗体が企図される。例えば、Ｋａｐｐａ ｂｏｄｙｓ（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９４９～５７（１９９７年））；ミニボディ（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ Ｊ １３：５３０５～９（１９９４年））；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ ９０：６４４４～８（１９９３年））；またはジャヌシン（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ １０：３６５５～５９（１９９１年）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５１～５２（１９９２年））は、望ましい特異性を有する抗体の選択に関して、本明細書の教示に従い、標準的な分子生物学の技法を使用して調製されうる。さらに他の実施形態では、本開示のリガンドを包含する二重特異性抗体またはキメラ抗体が作製されてもよい。例えば、キメラ抗体は、異なる抗体からのＣＤＲおよびフレームワーク領域を含みうる一方、二重特異性抗体は、一つの結合ドメインを介して一つまたは複数のＦＺＤ受容体に特異的に結合し、第二の結合ドメインを介して第二の分子に特異的に結合するものが作製されてもよい。これらの抗体は、組換え分子生物学的技法を介して生成されてもよく、または物理的に一緒に共役されてもよい。
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体であり、これはペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９～５８８３を参照されたい。抗体Ｖ領域に由来する、自然に凝集したが、化学的に分離された軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造に折り畳むｓｃＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するための、数多くの方法が記述されてきた。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらの米国特許第５，０９１，５１３号、および同第５，１３２，４０５号、ならびにＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号を参照。
一定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ダイアボディの形態である。ダイアボディはポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは、免役グロブリン軽鎖の結合領域を含む第一のドメインと、免役グロブリン重鎖の結合領域を含む第二のドメインを含み、二つのドメインはリンクしているが（例えば、ペプチドリンカーによって）、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない。抗原結合部位は、多量体内の一つのポリペプチドの第一のドメインと、多量体内の別のポリペプチドの第二のドメインとの会合によって形成される（国際特許出願公開第９４／１３８０４号）。
抗体のｄＡｂ断片は、ＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４～５４６（１９８９年））。
二重特異性抗体が使用される場合、これらは、様々な方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ Ｇ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４、４４６～４４９（１９９３年））で（例えば、化学的に、または混成ハイブリドーマから調製）製造できる、従来の二重特異性抗体であってもよく、または上述の二重特異性抗体断片のいずれかであってもよい。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用して、Ｆｃ領域なしで、構築することができ、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低減する。
二重特異性ダイアボディは、大腸菌中で容易に構築および発現することができるため、二重特異性の全抗体とは対照的に、特に有用でありうる。適切な結合特異性のダイアボディ（および抗体断片などのその他多くのポリペプチド）は、ファージディスプレイ（国際特許出願第９４／１３８０４号）を使用してライブラリから容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームが、例えば、抗原Ｘに対して向けられた特異性で一定に保たれる場合、他方のアームが変化し、適切な特異性の抗体が選択されるライブラリを作製することができる。二重特異性の全抗体は、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）工学（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、９、６１６～６２１（１９９６年））によって作製されうる。
一定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供されてもよい。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ Ｕｔｒｅｃｈｔ（オランダ）を参照、例えば、米国特許公開第２００９０２２６４２１号も参照）。この独自の抗体技術は、現在の小さい抗体フォーマットより長い治療ウィンドウが予期される安定したより小さい抗体フォーマットを作り出す。ＩｇＧ４抗体は不活性とみなされ、それ故に免疫系と相互作用しない。完全ヒトＩｇＧ４抗体は、抗体のヒンジ領域を除去することによって修飾されて、対応する無傷のＩｇＧ４（ＧｅｎＭａｂ、ユトレヒト）に対して別個の安定性特性を有する半分子断片を得てもよい。ＩｇＧ４分子を半減させると、同種抗原（例えば、疾患標的）に結合できる一つの領域のみがＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）上に残り、したがってＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞上の一つの部位にのみに一価的に結合する。
一定の実施形態では、本明細書に記載される抗体およびその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖のＣＤＲセットを含み、それぞれが重鎖と軽鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）セットの間に介在し、それらはＣＤＲに支持を提供し、相互に対してＣＤＲの空間的関係を画定する。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲセット」という用語は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の三つの超可変領域を指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から生じるこれらの領域は、
それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」として示される。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々のＣＤＲセットを含む、６個のＣＤＲを含む。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドを、本明細書では「分子認識ユニット」と呼ぶ。多数の抗原－抗体複合体の結晶解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基が結合抗原と広範囲な接触を形成することが示され、最も広範囲な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３との接触である。それ故に、分子認識ユニットは、抗原結合部位の特異性を主に担う。
本明細書で使用される場合、「ＦＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲの枠組みをする四つの隣接するアミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合抗原と接触しうるが、抗原結合部位への、特にＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基へのＶ領域の折り畳みは、ＦＲが主に担う。ＦＲ内では、一定のアミノ残基および一定の構造的特徴は非常によく保存される。これに関して、すべてのＶ領域配列は、約９０個のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位に折り畳まれると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突き出たループモチーフとして示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、ＣＤＲループの折り畳み形状に影響を及ぼす、一定の「正準の」構造に保存されたＦＲの構造的領域があることが一般的に認識される。さらに、一定のＦＲ残基は、抗体の重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合ドメイン間接触に関与することが知られている。
「モノクローナル抗体」は、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（天然起源および非天然起源）を含む、均質な抗体集団を意味する。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられる。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷のモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体を包含するだけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、そのバリアント、モノクローナル抗体の抗原結合断片を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、および免疫グロブリン分子のその他任意の修飾構成も含み、この免疫グロブリン分子は、本明細書に開示のＷＮＴ代替分子を含めた、エピトープに結合する必要な特異性および能力の抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む。これは、抗体の供給源または抗体が作製される様態（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え体発現、遺伝子導入動物などによる）に関して限定されることは意図していない。この用語は、免疫グロブリン全体だけでなく、上記で「抗体」の定義の下で記述されている断片なども含む。
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を産生し、そのうちの二つ（Ｆ（ａｂ）断片）はそれぞれ、無傷の抗原結合部位を含む共有結合性ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含むいくつかの断片を提供することができる。本開示の一定の実施形態による使用のためのＦｖ断片は、ＩｇＭ免疫グロブリン分子、また稀にＩｇＧ免疫グロブリン分子またはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的タンパク質分解切断によって生成することができる。しかしながら、Ｆｖ断片は、当該技術分野で公知の組換え技法を使用してより一般的に誘発される。Ｆｖ断片は、未変性抗体分子の抗原認識および結合能力の大部分を保持する抗原結合部位を含む非共有結合性ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒら、（１９７２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９～２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら、（１９７６年）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６～２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら、（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１～４０９６を参照されたい。
一定の実施形態では、一本鎖ＦｖまたはｓｃＦＶ抗体が企図される。例えば、Ｋａｐｐａ ｂｏｄｙｓ（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９４９～５７（１９９７年））；ミニボディ（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ Ｊ １３：５３０５～９（１９９４年））；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ ９０：６４４４～８（１９９３年））；またはジャヌシン（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ １０：３６５５～５９（１９９１年）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５１～５２（１９９２年））は、望ましい特異性を有する抗体の選択に関して、本明細書の教示に従い、標準的な分子生物学の技法を使用して調製されうる。さらに他の実施形態では、本開示のリガンドを包含する二重特異性抗体またはキメラ抗体が作製されてもよい。例えば、キメラ抗体は、異なる抗体からのＣＤＲおよびフレームワーク領域を含みうる一方、二重特異性抗体は、一つの結合ドメインを介して一つまたは複数のＦＺＤ受容体に特異的に結合し、
第二の結合ドメインを介して第二の分子に特異的に結合するものが作製されてもよい。これらの抗体は、組換え分子生物学的技法を介して生成されてもよく、または物理的に一緒に共役されてもよい。
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、共有結合したＶＨ：ＶＬヘテロ二量体であり、これはペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子および
ＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９～５８８３を参照されたい。抗体Ｖ領域に由来する、自然に凝集したが、化学的に分離された軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造に折り畳むｓｃＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するための、数多くの方法が記述されてきた。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらの米国特許第５，０９１，５１３号、および同第５，１３２，４０５号、ならびにＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号を参照。
一定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ダイアボディの形態である。ダイアボディはポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは、免役グロブリン軽鎖の結合領域を含む第一のドメインと、免役グロブリン重鎖の結合領域を含む第二のドメインを含み、二つのドメインはリンクしているが（例えば、ペプチドリンカーによって）、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない。抗原結合部位は、多量体内の一つのポリペプチドの第一のドメインと、多量体内の別のポリペプチドの第二のドメインとの会合によって形成される（国際特許出願公開第９４／１３８０４号）。
抗体のｄＡｂ断片は、ＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４～５４６（１９８９年））。二重特異性抗体が使用される場合、これらは、様々な
方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ Ｇ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４、４４６～４４９（１９９３年））、例えば、化学的に調製された、またはハイブリッドハイブリドーマから調製された、または上述の二重特異性抗体断片のいずれかであってもよい。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用して、Ｆｃ領域なしで、構築することができ、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低減する。
二重特異性ダイアボディは、大腸菌中で容易に構築および発現することができるため、二重特異性の全抗体とは対照的に、特に有用でありうる。適切な結合特異性のダイアボディ（および抗体断片などのその他多くのポリペプチド）は、ファージディスプレイ（国際特許出願第９４／１３８０４号）を使用してライブラリから容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームが、例えば、抗原Ｘに対して向けられた特異性で一定に保たれる場合、他方のアームが変化し、適切な特異性の抗体が選択されるライブラリを作製することができる。二重特異性の全抗体は、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）工学（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、９、６１６～６２１（１９９６年））によって作製されうる。
一定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供されてもよい。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ Ｕｔｒｅｃｈｔ（オランダ）を参照、例えば、米国特許公開第２００９０２２６４２１号も参照）。この独自の抗体技術は、現在の小さい抗体フォーマットより長い治療ウィンドウが予期される安定したより小さい抗体フォーマットを作り出す。ＩｇＧ４抗体は不活性とみなされ、それ故に免疫系と相互作用しない。完全ヒトＩｇＧ４抗体は、抗体のヒンジ領域を除去することによって修飾されて、対応する無傷のＩｇＧ４（ＧｅｎＭａｂ、ユトレヒト）に対して別個の安定性特性を有する半分子断片を得てもよい。ＩｇＧ４分子を半減させると、同種抗原（例えば、疾患標的）に結合できる一つの領域のみがＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）上に残り、したがってＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞上の一つの部位にのみに一価的に結合する。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、単一ドメイン（ｓｄＡｂ）またはＶＨＨ抗体断片（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）としても知られる）の形態を取り得る。ｓｄＡｂまたはＶＨＨ技術は、当初は、ラクダ科（例えば、ラクダおよびラマ）が重鎖のみからなる完全機能性抗体を保有し、それゆえ軽鎖を欠くという発見および同定に続いて開発された。これらの重鎖のみの抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）と二つの定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３）を含む。クローン化および単離された単一可変ドメインは、完全な抗原結合能力を有し、かつ非常に安定している。これらの単一可変ドメインは、その固有の構造的および機能的な特性により、「Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）」の基礎を形成する。ｓｄＡｂまたはＶＨＨは、単一遺伝子によりコードされ、かつ例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号を参照）、カビ（例えば、アスペルギルス属またはトリコデルマ属）、および酵母（例えば、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、ハンゼヌラ属またはピキア属（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号を参照）などほぼすべての原核生物および真核生物宿主において効率よく生成される。生成プロセスは、測定可能であり、複数キログラム量のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）が生成されている。ｓｄＡｂまたはＶＨＨは、長い使用期限を有するすぐに使用できる溶液として製剤され得る。Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）法（例えば、国際特許出願第０６／０７９３７２号を参照）は、Ｂ細胞の自動化されたハイスループット選択に基づいて、望ましい標的に対してＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を生成するための独自の方法である。ｓｄＡｂまたはＶＨＨは、ラクダ特異的重鎖のみの抗体の単一ドメイン抗原結合断片である。
企図される別の抗体断片は、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ）であり、これは二つのモノクローナル抗体の機能と特異性を一つの分子実体に組合わせる改変タンパク質である。ＤＶＤ－Ｉｇは、各軽鎖および重鎖が、ＩｇＧ中の一つの可変ドメインではなく、短いペプチド結合を介して縦一列に並んだ二つの可変ドメインを含有することを除いて、ＩｇＧ様分子として設計される。二つの可変ドメインの融合の配向およびリンカー配列の選択は、分子の機能的活性および効率的な発現に重要である。ＤＶＤ－Ｉｇは、製造および精製のための単一の種として、従来の哺乳類発現システムによって産生することができる。ＤＶＤ－Ｉｇは、親抗体の特異性を有し、インビボで安定であり、ＩｇＧ様の物理化学的および薬物動態学的な特性を示す。ＤＶＤ－Ｉｇおよびその作製方法は、Ｗｕ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：１２９０～１２９７（２００７年）に記載されている。
一定の実施形態では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化される。これは、一般的に組換え技法を使用して調製され、非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいた分子の残りの免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合された完全可変ドメイン、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植されたＣＤＲのみのいずれかを含んでもよい。エピトープ結合部位は、野生型であってもよく、または一つまたは複数のアミノ酸置換によって修飾されてもよい。これはヒト個体における免疫原としての定常領域を除去するが、異質の可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら、（１９８９年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：４２２０～４２２４；Ｑｕｅｅｎら、ＰＮＡＳ（１９８８年）８６：１００２９～１００３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８年）３３２：３２３～３２７）。本明細書に開示される
抗ＦＺＤまたはＬＲＰ抗体のヒト化のための例示的な方法は、米国特許第７，４６２，６９７号に記載されている方法を含む。
別のアプローチは、ヒト由来の定常領域の提供だけでなく、ヒト形態に可能な限り近づけるように再形成するための可変領域の修飾にも焦点を当てる。重鎖および軽鎖の両方の可変領域は、問題のエピトープに応答して変化する三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有することと、所与の種において相対的に保存され、かつＣＤＲの足場を推定的に提供する、四つのフレームワーク領域（ＦＲ）に隣接して結合能力を決定することとが知られている。特定のエピトープに関して非ヒト抗体が調製される場合、可変領域は、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを、修飾されるヒト抗体中に存在するＦＲ上に移植することによって、「再構成」または「ヒト化」することができる。このアプローチの様々な抗体への適用は、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、（１９９３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：８５１～８５６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３～３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ら、（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４～１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９１年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３～３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら、（１９９１年）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：１２４～１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら、（１９９１年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：４１８１～４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら、（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６～２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ら、（１９９１年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：２８６９～２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、（１９９２年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４２８５～４２８９；およびＣｏ，Ｍ．Ｓ．ら、（１９９２年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１１４９～１１５４によって報告されている。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、すべてのＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体由来の６個のＣＤＲをすべて含有するヒト化マウス抗体）を保存する。その他の実施形態では、ヒト化抗体は、もとの抗体に関して改変される一つまたは複数のＣＤＲ（１個、２個、３個、４個、５個、６個）を有し、これはまた、もとの抗体からの一つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」一つまたは複数のＣＤＲとも称される。
一定の実施形態では、本開示の抗体は、キメラ抗体であってもよい。これに関して、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分に動作可能に連結された、または別の方法で融合された抗体の抗原結合断片を含む。一定の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ヒト起源のものである。その他の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラスを含む）、ならびにＩｇＭを含む親抗体とは異なるＩｇクラス由来であってもよい。さらなる実施形態では、異種Ｆｃドメインは、異なるＩｇクラスのうちの一つまたは複数からのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んでもよい。ヒト化抗体に関して上述したように、キメラ抗体の抗原結合断片は、本明細書に記載される抗体のＣＤＲのうちの一つまたは複数（例えば、本明細書に記載される抗体の１個、２個、３個、４個、５個、または６個のＣＤＲ）のみを含んでもよく、または可変ドメイン全体（ＶＬ、ＶＨまたはその両方）を含んでもよい。
免疫グロブリンＣＤＲおよび可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第４編により確定されうる。米国保健社会福祉省の１９８７年版およびその更新版は、現在、インターネット（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）で入手可能である。
一部の実施形態では、ＷＮＴ代替分子は、一つまたは複数のＦａｂまたはその抗原結合断片および一つまたは複数のＶＨＨもしくはｓｄＡｂまたはその抗原結合断片（または代わりに、一つまたは複数のｓｃＦｖまたはその抗原結合断片）を含む。ある特定の実施形態では、Ｆａｂは、一つまたは複数のＦｚｄ受容体に特異的に結合し、ＶＨＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）は、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、Ｆａｂは、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に特異的に結合し、ＶＨＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）は、一つまたは複数のＦｚｄ受容体に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＶＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）は、ＦａｂのＮ末端に融合され、一方、一部の実施形態では、ＶＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）は、ＦａｂのＣ末端に融合される。特定の実施形態では、Ｆａｂは、完全なＩｇＧ形式で存在し、ＶＨＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）は、ＩｇＧ軽鎖のＮ末端および／またはＣ末端に融合される。特定の実施形態では、Ｆａｂは、完全なＩｇＧ形式で存在し、ＶＨＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）は、ＩｇＧ重鎖のＮ末端および／またはＣ末端に融合される。特定の実施形態では、二つ以上のＶＨＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）は、これらの位置の任意の組み合わせでＩｇＧに融合される。
Ｆａｂは、例えば、Ｆｃ領域に融合された、Ｆａｂを含む融合ポリペプチド、すなわち、Ｆａｂが完全なＩｇＧ形式で存在する、を生成するための遺伝子操作を使用して、Ｆａｂ断片とＦｃ断片の両方を含む完全なＩｇＧ形式に変換されてもよい。完全ＩｇＧフォーマットのＦｃ領域は、野生型もしくは改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４または他のアイソタイプ、例えば、野生型もしくは改変されたヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ４プロ（ＩｇＧ４半分子の形成を妨げる中心ヒンジ領域において変異を含む）、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＥ、ヒトＩｇＭ、またはＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧとして言及される改変されたＩｇＧ１を含むが、これらに限定されない、様々な異なるＦｃのいずれかからもたらされ得る。Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ）バリアントは、マウスＩｇＧ２ａとヒトＩｇＧ１の両方において、補体結合および固定ならびにＦｃ－γ依存性抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を除去することが示された。これらのＬＡＬＡ－ＰＧ置換は、結果物のより正確な翻訳が、マウスと霊長類との間の「エフェクターなし」の抗体フレームワークスキャフォールドを用いて成されることを可能にする。本明細書において開示されるＩｇＧのいずれかの特定の実施形態では、以下のアミノ酸置換：Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｅ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、またはＰ２３６Ｇの一つまたは複数を含む。
一つまたは複数のＦｚｄ受容体とＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６の両方に対して二価である、二価および二重特異性ＷＮＴ代替分子の非限定的な例が提供される。ＶＨＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）は、両方の軽鎖のＮ末端、両方の重鎖のＮ末端、両方の軽鎖のＣ末端、または両方の重鎖のＣ末端に融合されてもよい。例えば、ＶＨＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）は、重鎖および／または軽鎖のＮ末端ならびにＣ末端の両方、軽鎖および重鎖のＮ末端、重鎖および軽鎖のＣ末端、重鎖のＮ末端および軽鎖のＣ末端、または重鎖のＣ末端および軽鎖のＮ末端に融合され得ることがさらに企図される。他の関連する実施形態では、二つ以上のＶＨＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖｓ）は、一緒に融合されてもよく、任意選択で、リンカー部分を介して融合されてもよく、これらの位置の一つまたは複数でＦａｂまたはＩｇＧに融合されてもよい。関連の実施形態では、ＷＮＴ代替分子は、ヘテロＩｇＧ形式を有し、一方、Ｆａｂは半抗体として存在し、一つまたは複数のＶＨＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）は、ＦｃのＮ末端、ＦａｂのＮ末端、ＦｃのＣ末端、またはＦａｂのＣ末端の一つまたは複数に融合される。ある特定の実施形態では、Ｆａｂまたはその抗原結合断片（もしくはＩｇＧ）は、ＶＨＨまたはｓｄＡｂ（もしくはｓｃＦｖ）あるいはその抗原結合断片に直接融合され、一方、他の実施形態では、結合領域は、リンカー部分を介して融合される。
様々な実施形態では、ＷＮＴ代替分子は、一つまたは複数のＦＺＤ受容体に結合する一つまたは複数のＦａｂまたはその抗原結合断片、ならびにＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６に結合する一つまたは複数のＦａｂまたはその抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、これは、一つまたは複数のＦＺＤ受容体に結合する二つのＦａｂまたはその抗原結合断片、ならびに／またはＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６に結合する二つのＦａｂまたはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、Ｆａｂの一つまたは複数は、完全なＩｇＧ形式で存在し、ある特定の実施形態では、両方のＦａｂは、完全なＩｇＧ形式で存在する。ある特定の実施形態では、完全なＩｇＧ形式のＦａｂは、一つまたは複数のＦＺＤ受容体に特異的に結合し、他のＦａｂは、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、Ｆａｂは、一つまたは複数のＦＺＤ受容体に特異的に結合し、完全なＩｇＧ形式のＦａｂは、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、Ｆａｂは、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に特異的に結合し、完全なＩｇＧ形式のＦａｂは、一つまたは複数のＦＺＤ受容体に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、Ｆａｂは、ＩｇＧのＮ末端、例えば、任意選択的で、リンカーを介して、重鎖または軽鎖Ｎ末端に融合される。ある特定の実施形態では、Ｆａｂは、ＩｇＧの重鎖のＮ末端に融合され、軽鎖に融合されない。特定の実施形態では、二つの重鎖は、直接的にまたはリンカーを介して、一緒に融合され得る。両方の受容体に関するこのような二重特異性および二価の例を、図１Ｂの上部に示す。他の関連する実施形態では、二つ以上のＶＨＨまたはｓｄＡｂは、一緒に融合されてもよく、任意選択で、リンカー部分を介して融合されてもよく、これらの位置の一つまたは複数でＦａｂまたはＩｇＧに融合されてもよい。関連する実施形態では、ＷＮＴ代替分子は、ヘテロＩｇＧ形式を有し、一方、Ｆａｂの一つは、半抗体として存在し、他のＦａｂは、ＦｃのＮ末端、ＦａｂのＮ末端、またはＦｃのＣ末端の一つまたは複数に融合される。ある特定の実施形態では、Ｆａｂまたはその抗原結合断片は、他のＦａｂもしくはＩｇＧまたはその抗原結合断片に直接融合され、一方、他の実施形態では、結合領域は、リンカー部分を介して融合される。
ある特定の実施形態では、本発明のＷＮＴアゴニストは、表２、表４、表５、表６、もしくは表７において提供される配列、またはその機能的断片もしくはバリアントのいずれかを有するか、含むか、またはからなり得る。
ある特定の実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニスト結合剤は、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する。例えば、ある特定の実施形態では、複数のＦＺＤに結合する本明細書に記載されるＦＺＤ結合剤または抗体は、約１００ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下のＫＤでそれらのＦＺＤに結合する。ある特定の実施形態では、結合剤は、一つまたは複数のその標的抗原に、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、または約１ｎＭ２０以下のＥＣ５０で結合する。
本発明の抗体または他の薬剤は、当該技術分野で公知の任意の方法によって特異的結合について試験することができる。使用することができる免疫測定法としては、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＦＡＣＳ分析、免疫蛍光法、免疫細胞化学、ウエスタンブロット、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ法、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、凝集測定法、補体結合測定法、免疫放射線測定法、蛍光免疫測定法、およびプロテインＡ免疫測定法などの技法を使用した競合および非競合の測定システムが挙げられるが、これらに限定されない。かかる測定法は、当該技術分野で日常的であり周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。この全文は参照により本明細書に組み込まれる）。
例えば、標的抗原への抗体の特異的結合は、ＥＬＩＳＡ法を使用して決定されてもよい。ＥＬＩＳＡ測定法は、抗原の調製と、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルの抗原によるコーティングと、抗体または他の結合剤（酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物に共役されたもの）のウェルへの追加と、一定期間の培養と、抗原の存在の検出とを含む。一部の実施形態では、抗体または薬剤は、検出可能な化合物に共役されず、代わりに、第一の抗体または薬剤を認識する第二の共役された抗体がウェルに追加される。一部の実施形態では、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体または薬剤でウェルをコーティングして、検出可能な化合物に共役された第二の抗体を、コーティング済のウェルに抗原を追加した後で、追加することができる。当業者であれば、検出されるシグナルを増加させるように修飾されうるパラメータだけでなく、当該技術分野で公知の他のＥＬＩＳＡ法の変形についても知識を有するであろう（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｔ １１．２．１を参照）。
標的抗原に対する抗体または他の薬剤の結合親和性および抗体－抗原相互作用のオフレートは、競合結合測定法によって決定することができる。競合結合測定法の一例は、放射免疫測定法であり、この試験法は、非標識抗原の量の増加が存在する中での、目的の抗体を用いた、標識抗原（例えば、ＦＺＤ、ＬＲＰ）またはその断片もしくはバリアントの培養と、それに続く標識抗原に結合された抗体の検出とを含む。抗体の親和性および結合オフレートは、スキャッチャードプロット解析によってデータから決定することができる。一部の実施形態では、ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析を使用して、抗体または薬剤の結合オンレートおよびオフレートを決定する。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、表面上に抗原が固定化されたチップからの抗体の結合および解離の分析を含む。
本発明のＷＮＴ代替分子は、一つまたは複数のＦＺＤ受容体ならびにＬＲＰ５およびＬＲＰ６の一つまたは複数への結合、ならびにＷＮＴシグナル伝達の不活性化において生物学的に活性であり、すなわち、ＷＮＴ代替分子は、ＷＮＴアゴニストである。用語「ＷＮＴアゴニスト活性」は、ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質および／またはＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６に結合するＷＮＴタンパク質の効果または活性を模倣するアゴニストの能力を指す。ＷＮＴの活性を模倣する、本明細書において開示されるＷＮＴ代替分子および他のＷＮＴアゴニストの能力は、多数のアッセイによって確認することができる。ＷＮＴアゴニストは、典型的には、受容体の天然リガンドによって開始される反応または活性と類似または同一の反応または活性を開始する。特に、本明細書において開示されるＷＮＴアゴニストは、基準のＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達経路を活性化するか、強化するか、または増加させる。本明細書で使用される場合、用語「増強する」は、ＷＮＴアゴニスト、例えば、本明細書において開示されるＷＮＴ代替分子の不存在下でのレベルと比較して、ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達のレベルにおける測定可能な増加を指す。特定の実施形態では、ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達のレベルの増加は、例えば、同じ細胞タイプにおける、ＷＮＴアゴニストの不存在下でのＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達のレベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍である。ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達を測定する方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書において記載されるものを含む。
特定の実施形態では、本明細書において開示されるＷＮＴ代替分子は、二重特異性であり、すなわち、それらは、二つ以上の異なるエピトープ、例えば、一つまたは複数のＦＺＤ受容体、ならびにＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＷＮＴ代替分子は、ＦＺＤ５および／またはＦＺＤ８、ならびにＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合する。
特定の実施形態では、本明細書において開示されるＷＮＴ代替分子は、多価であり、例えば、それらは、各々が同じエピトープに特異的に結合する二つ以上の領域、例えば、一つまたは複数のＦＺＤ受容体内のエピトープに結合する二つ以上の領域、ならびに／またはＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６内のエピトープに結合する二つ以上の領域を含む。特定の実施形態では、それらは、一つまたは複数のＦＺＤ受容体内のエピトープに結合する二つ以上の領域、ならびにＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６内のエピトープに結合する二つ以上の領域を含む。ある特定の実施形態では、ＷＮＴ代替分子は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、２：３、２：５、２：７、７：２、５：２、３：２、３：４、３：５、３：７、３：８、８：３、７：３、５：３、４：３、４：５、４：７、４：９、９：４、７：４、５：４、６：７、７：６、１：２、１：３、１：４、１：５、もしくは１：６の、またはそれらと同等の、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合する領域の数に対する一つまたは複数のＦＺＤ受容体に結合する領域の数の比を含む。ある特定の実施形態では、ＷＮＴ代替分子は、二重特異性かつ多価である。
ある特定の態様では、本開示は、組織特異的様式または細胞特異的様式でＷＮＴ活性を増強することができる新規の組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子を提供する。ある特定の実施形態では、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、一つまたは複数のＺＮＲＦ３および／またはＲＮＦ４３リガーゼに結合する第一のドメイン、ならびに組織特異的様式または細胞特異的様式で一つまたは複数の標的化組織または細胞タイプに結合する第二のドメインを含む二機能的分子である。第一のドメインおよび第二のドメインの各々は、それぞれ、リガーゼ複合体または標的化組織または細胞に結合することができる任意の部分であってもよい。例えば、第一のドメインおよび第二のドメインの各々は、以下に限定されないが、ポリペプチド（例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体とは異なるペプチドもしくはポリペプチド）、小分子、ならびに天然リガンドあるいはそのバリアント、その断片あるいは誘導体から選択される部分であってもよい。ある特定の実施形態では、天然リガンドは、ポリペプチド、小分子、イオン、アミノ酸、脂質、または糖分子である。第一のドメインおよび第二のドメインは、互いに同じタイプの部分であってもよく、またはこれらは、異なるタイプの部分であってもよい。ある特定の実施形態では、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、組織特異的表面受容体または細胞特異的細胞表面受容体に結合する。特定の実施形態では、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、例えば、陰性対照と比較して、ＷＮＴシグナル伝達を少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍増加するか、または強化する。
組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、異なる形式を有してもよい。特定の実施形態では、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する第一のポリペプチド配列および組織特異的様式または細胞特異的様式で一つまたは複数の標的化組織または細胞タイプに結合する第二のポリペプチド配列を含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、二つのポリペプチド配列は、直接的またはリンカーを介して融合されてもよい。ある特定の実施形態では、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、二つ以上の融合タンパク質を含む二量体または多量体などの二つ以上のポリペプチドを含み、各々が第一のドメインおよび第二のドメインを含み、二つ以上のポリペプチドは、例えば、リンカー部分を介してまたは二つ以上のポリペプチドの各々のアミノ酸残基の間の結合、例えば、システイン残基の間の分子間ジスルフィド結合を介して連結される。
特定の実施形態では、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、第一のドメインまたは第二のドメインのいずれかを構成する抗体重鎖および軽鎖を含む抗体（またはその抗原結合断片）であり、他のドメイン（すなわち、第二のドメインまたは第一のドメイン）は、融合タンパク質としてまたはリンカー部分を介して、抗体重鎖または軽鎖に連結される。特定の実施形態では、他のドメインは、重鎖のＮ末端、重鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、または軽鎖のＣ末端に連結される。このような構造は、付加ＩｇＧスキャフォールドまたは形式として本明細書において称されてもよい。例えば、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する抗体であってもよく、組織特異的受容体または細胞特異的受容体に結合する結合ドメインは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する抗体の重鎖または軽鎖のいずれかに融合されるか、または付加される。別の例では、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、組織特異的受容体または細胞特異的受容体に結合する抗体であってもよく、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する結合ドメインは、組織特異的受容体または細胞特異的受容体に結合する抗体の重鎖または軽鎖のいずれかに融合されるか、または付加される。
特定の実施形態では、腸特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、ＧＰＡ３３、ＣＤＨ１７、ＭＵＣ－１３に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片の重鎖または軽鎖のいずれかに融合されるか、または付加される。特定の実施形態では、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する結合ドメインは、Ｆｕ１ドメインおよびＦｕ２ドメインを含み、Ｆｕ１ドメインおよびＦｕ２ドメインは、任意選択で、本明細書において開示されるもののいずれか、例えば、Ｆ１０５Ｒおよび／またはＦ１０９Ａを含む、一つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。
ある特定の実施形態では、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する第一のドメイン（「作用モジュール」）および組織特異的受容体または細胞特異的受容体を、例えば、高い親和性で結合する第二のドメイン（「標的化モジュール」）を含む。ある特定の実施形態では、これらの二つのドメインの各々は、実質的に減少した活性を有するか、またはＷＮＴシグナルを増強する際にそれ自体不活性である。しかしながら、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子が、組織特異的受容体を発現する標的組織と会合するとき、Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３は、組織特異的受容体との三元複合体に動員され、これにより、これらは、受容体介在性エンドサイトーシスを介して細胞表面から隔離および／または除去される。最終結果は、組織特異的様式でＷＮＴシグナルを増強することである。
ある特定の実施形態では、作用モジュールは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３ Ｅ３リガーゼの結合剤であり、Ｒ－スポンジン、例えば、ヒトＲ－スポンジン１～４を含むが、これらに限定されない、Ｒ－スポンジン１～４に基づき設計することができる。ある特定の実施形態では、作用モジュールは、Ｒ－スポンジン、例えば、野生型Ｒ－スポンジン１～４、任意選択で、ヒトＲ－スポンジン１～４、またはそのバリアントもしくは断片である。特定の実施形態では、それは、対応する野生型Ｒ－スポンジン１～４配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、Ｒ－スポンジン１～４のいずれかのバリアントである。ある特定の実施形態では、作用モジュールは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する、Ｒ－スポンジン、例えば、Ｒ－スポンジン１～４のいずれかのフューリンドメイン１を含むか、またはからなる。フューリンドメイン１の拡張バージョン（ＬＧＲ４－６にもはや結合しないか、またはＬＧＲ４－６への低減した結合を有する、変異フューリンドメイン２を有するものを含むが、これらに限定されない）、または操作された抗体もしくは任意の他の誘導体、またはＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる抗体とは異なる任意の操作されたポリペプチドも使用され得る。ある特定の実施形態では、作用モジュールは、Ｒ－スポンジンの一つまたは複数のフューリンドメイン１を含む。
ある特定の実施形態では、作用モジュールは、Ｒ－スポンジンのフューリンドメイン２を含まないか、またはこれは、Ｒ－スポンジン、例えば、野生型フューリンドメイン２と比較して低減した活性を有するフューリンドメイン２の改変またはバリアントフューリンドメイン２を含む。ある特定の実施形態では、作用モジュールは、Ｒ－スポンジンのフューリンドメイン１を含むが、フューリンドメイン２を含まない。ある特定の実施形態では、作用モジュールは、二つ以上のフューリンドメイン１またはフューリンドメイン１の多量体を含む。作用ドメインは、Ｒ－スポンジンの一つまたは複数の野生型フューリンドメイン１を含んでもよい。特定の実施形態では、作用モジュールは、例えば、野生型フューリンドメイン１と比較して、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３への増加した活性を有するＲ－スポンジンの改変またはバリアントフューリンドメイン１を含む。ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３への増加した結合を有するバリアントは、例えば、Ｒ－スポンジンフューリンドメイン１のバリアントを含むファージまたは酵母ディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、同定され得る。Ｒ－スポンジンフューリンドメイン１とは無関係だが、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３への増加した結合を伴うペプチドまたはポリペプチドも、スクリーニングを介して同定され得る。作用モジュールは、追加の部分またはポリペプチド配列、例えば、作用モジュールまたはそれが存在する組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子の構造を安定化するための追加のアミノ酸残基をさらに含んでもよい。
さらなる実施形態において、作用モジュールは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはリボザイムなどの、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の活性または発現を低減するか、または妨げる核酸分子などの別の阻害部分を含む。本明細書で使用される場合、「アンチセンス」は、長さに関係なく、核酸配列に相補的である核酸配列を指す。ある特定の実施形態では、アンチセンスＲＮＡは、個々の細胞、組織、または対象に導入され得る一本鎖ＲＮＡ分子を指し、必ずしも内因性遺伝子サイレンシング経路に頼らない機序を介して標的遺伝子の発現の減少をもたらす。アンチセンス核酸は、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当該技術分野で公知の他のものを含有し得るか、または非天然のヌクレオシド間結合を含有してもよい。アンチセンス核酸は、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。特定の実施形態では、他の阻害剤部分は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の一方もしくは両方の活性を阻害するか、またはＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の一方もしくは両方の遺伝子、ｍＲＮＡ、もしくはタンパク質発現を阻害する。ある特定の実施形態では、阻害部分は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３遺伝子もしくはｍＲＮＡ、またはその相補鎖に結合する核酸分子である。
ある特定の実施形態では、標的化モジュールは、細胞特異的表面分子、例えば、細胞特異的表面受容体に特異的に結合し、例えば、天然のリガンド、抗体、または合成化学物質であり得る。特定の実施形態では、細胞特異的表面分子は、標的器官、組織または細胞タイプ、例えば、疾患または障害を治療または予防するために、ＷＮＴシグナル伝達を増強することが望ましい器官、組織または細胞タイプで優先的に発現される。特定の実施形態では、細胞特異的表面分子は、標的器官、組織または細胞タイプ、例えば、一つまたは複数の他の非標的化器官、組織または細胞タイプと比較して、例えば、疾患または障害を治療または予防するために、ＷＮＴシグナル伝達を増強することが望ましい器官、組織または細胞タイプで増加または増強した発現を有する。ある特定の実施形態では、細胞特異的表面分子は、それぞれ、一つまたは複数の他の器官、組織または細胞タイプと比較して、標的器官、組織または細胞タイプの表面で優先的に発現される。例えば、特定の実施形態では、細胞表面受容体は、それらが、それぞれ、一つまたは複数、五つ以上、すべての他の器官、組織もしくは細胞において発現されるより、またはすべての他の器官、組織もしくは細胞の平均より、それらが、標的器官、組織または細胞において少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍のレベルで発現する場合、組織特異的表面分子または細胞特異的細胞表面分子であるとみなされる。ある特定の実施形態では、組織特異的細胞表面分子または細胞特異的細胞表面分子は、細胞表面受容体、例えば、細胞表面膜内に位置する領域および標的化モジュールが結合することができる細胞外領域を含むポリペプチド受容体である。様々な実施形態では、本明細書において記載される方法は、標的化組織または標的化組織を含む組織のサブセット上でのみ発現される細胞表面分子を特異的に標的化することによって実施されてもよく、またはすべて、大部分、または実質的な数の他の器官と比較して、標的組織でのより高いレベルの発現、例えば、少なくとも二個、少なくとも五個、少なくとも十個、または少なくとも二十個の他の組織より標的組織でのより高い発現を有する細胞表面分子を特異的に標的化することによって実施されてもよい。
組織特異的細胞表面受容体および細胞特異的細胞表面受容体は、当該技術分野で公知である。組織特異的表面受容体および細胞特異的表面受容体の例としては、限定されるものではないが、ＧＰＡ３３、ＣＤＨ１７、およびＭＵＣ－１３が挙げられる。ある特定の実施形態では、標的化モジュールは、これらの腸特異的受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
ある特定の実施形態では、ＷＮＴ代替およびＷＮＴシグナル増強分子の構成要素を組み合わせて、より多くの組織特異性を付与してもよい。
ＩＩＩ．医薬組成物
本明細書に記載されるＷＮＴアゴニスト分子と、一つまたは複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含む医薬組成物も開示されている。
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるＷＮＴアゴニスト分子をコードする核酸配列と、一つまたは複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物も開示されている。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、例えば、修飾ｍＲＮＡである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列および／または３’テーリング配列、例えばポリＡテールをさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コード配列に動作するように連結されたプロモーターを含む発現カセットである。
一部の実施形態では、ＷＮＴアゴニストは、ＷＮＴシグナル伝達経路中の様々な分子に結合する様々なエピトープ結合断片を組み込んだ、改変組換えポリペプチドである。例えば、ＦＺＤ抗体断片およびＬＲＰ抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨＨなど）は、一つの分子上で、直接または様々なサイズのリンカーと一緒に結合されてもよい。同様に、ＲＳＰＯなどのポリペプチドは、組織特異的細胞表面抗原、例えば、ＭＵＣ－１３に対する抗体またはその断片を含有するように操作されてもよい。ＲＳＰＯはまた、Ｅ３リガーゼのエンハンサー、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３と同時または順次投与されてもよい。Ｅ３リガーゼエンハンサーは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合し、Ｅ３リガーゼ活性を増強するアゴニスト抗体または断片であってもよい。
逆に、ＷＮＴアゴニストはまた、ＷＮＴシグナル伝達経路の様々な分子に結合し、かつＷＮＴシグナル伝達を増強するエピトープ結合断片を組み込んだ組換えポリペプチドとすることもできる。例えば、ＷＮＴ作動薬は、ＦＺＤ受容体および／またはＬＲＰ受容体に結合し、かつＷＮＴシグナル伝達を増強する抗体またはその断片とすることができる。ＦＺＤ抗体断片およびＬＲＰ抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂまたはＶＨＨなど）は、一つの分子上で、直接または様々なサイズのリンカーと一緒に結合されてもよい。
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるＷＮＴアゴニスト分子をコードする核酸配列と、一つまたは複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含むポリヌクレオチドを含む、発現ベクター、例えばウイルスベクターを含む医薬組成物も開示されている。
本開示は、ＷＮＴアゴニストをコードする核酸に動作するように連結されたプロモーターと、一つまたは複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含む、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞を含む医薬組成物をさらに企図する。特定の実施形態では、医薬組成物は、ＷＮＴアゴニストをコードする核酸配列に動作するように連結されたプロモーターを含む、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞をさらに含む。特定の実施形態では、細胞は、治療される対象者から得られた異種細胞または自己細胞である。
主題の分子は、単独で、または組み合わせて、一般的に安全で、非毒性で、かつ望ましい製剤の調製に有用な、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、および試薬と組み合わせることができ、哺乳類、例えば、ヒトまたは霊長類の使用に許容可能な賦形剤を含む。かかる賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合、ガス状とすることができる。こうした担体、希釈剤、および賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。補助的な活性化合物も、製剤に組み込むことができる。製剤に使用される溶液または懸濁液は、無菌希釈剤（注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など）、抗菌化合物（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）、抗酸化物質（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）、キレート化合物（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など）、洗剤（凝集を防止するためのＴｗｅｅｎ ２０など）、および張度を調整するための化合物（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は無菌である。
医薬組成物は、無菌注射用溶液または分散液の即時調整のための無菌水溶液または分散液および無菌粉末をさらに含みうる。静脈内投与のために、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。一部の事例では、組成物は無菌であり、かつシリンジに引き込むこと、またはシリンジから対象者に送達することができるように、流体であるべきである。一定の実施形態では、これは、製造および保存の条件下で安定であり、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど）を組成物中に含むことによって、内部組成物の持続性の吸収をもたすことができる。
無菌液は、ＷＮＴアゴニスト抗体またはその抗原結合断片（またはポリヌクレオチドをコードするもの、もしくはポリヌクレオチドを含む細胞）を、必要に応じて、上記で列挙された成分の一つまたは組み合わせを用いて適切な溶媒中に必要量で組み込み、その後に濾過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体と、上記で列挙したものから必要とされる他の成分とを含有する無菌媒体に組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分の粉末に加えて、前もって滅菌濾過されたその溶液から追加的な任意の望ましい成分をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。
一実施形態では、医薬組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤など、身体からの急速な排除から抗体またはその抗原結合断片を保護する担体を用いて調製される。生分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などが使用できる。こうした製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液は、薬学的に許容可能な担体としても使用できる。これらは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
投与の容易さおよび用量の均一性のために、医薬組成物を単位剤形で製剤化することが有利でありうる。本明細書で使用される場合、単位剤形は、治療される対象者のための単位用量として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して望ましい治療効果を生成するために計算された所定量の活性抗体またはその抗原結合断片を含有する。単位剤形の仕様は、抗体またはその抗原結合断片の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果、ならびにこうした活性抗体またはその抗原結合断片を、個体の治療のために配合する当該技術分野に固有の制限によって決定付けられ、かつそれらに直接的に依存する。
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー（例えば、シリンジ、例えば、プレフィルドシリンジ）内に、投与説明書と一緒に入れることができる。
本開示の医薬組成物は、任意の薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物への投与時には、生物学的に活性な抗体またはその抗原結合断片を（直接的または間接的に）提供することができる任意の他の化合物を包含する。
本開示は、本明細書に記載されるＷＮＴアゴニスト分子の薬学的に許容可能な塩を含む。「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本開示の化合物の生理学的および薬学的に許容可能な塩、すなわち、親化合物の望ましい生物活性を保持し、かつそれに対して望ましくない毒性効果を付与しない塩を指す。様々な薬学的に許容可能な塩が当該技術分野で公知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．），Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ，１９８５（およびその最近の版）、“Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊａｍｅｓ Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ（Ｅｄ．），Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＳＡ（Ｉｎｃ．），ＮＹ，ＵＳＡ，２００７、およびＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｓｃｉ．６６：２（１９７７）に記載がある。また、適切な塩については、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ”ｂｙ Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００２年）を参照されたい。薬学的に許容可能な塩基付加塩は、アルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンを用いて形成される。
陽イオンとして使用される金属としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。アミンは、Ｎ－Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、およびプロカインを含む（例えば、Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．、１９７７年、６６、１１９を参照）。前述の酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸型を、従来の様態で塩を生成するのに十分な量の望ましい塩基と接触させることによって調製される。遊離酸型は、塩形態を酸と接触させ、従来的の様態で遊離酸を単離することによって再生されてもよい。遊離酸型は、極性溶媒への溶解性などの一定の物理的特性において、それらのそれぞれの塩形態とは多少異なるが、それ以外は、塩は、本開示の目的のために、それぞれの遊離酸と同等である。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、治療的に有効な量のＷＮＴアゴニスト分子またはその薬学的に許容可能な塩を、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸塩およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝剤、防腐剤、ならびに他のタンパク質と混合したものを含む。例示的なアミノ酸、ポリマーおよび糖類などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアリン酸化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、リンゲル液およびハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リジン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ならびにグリコールである。この製剤は、４℃で少なくとも６カ月間安定であることが好ましい。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、無菌水、およびＧｏｏｄら、（１９６６年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：４６７に記載のあるものなど当業者に公知のその他の緩衝剤などの緩衝剤を含む。緩衝剤のｐＨは６．５～７．７５の範囲内であってもよく、好ましくは７～７．５であり、最も好ましくは７．２～７．４である。
Ｖ．使用方法
本開示はまた、ＷＮＴアゴニスト分子および／または組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子を使用して、例えば、ＷＮＴシグナル伝達経路を調節し、例えば、ＷＮＴシグナル伝達を増加させる方法、ならびに様々な治療的設定でのＷＮＴアゴニスト分子および／または組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子の投与方法を提供する。ＷＮＴアゴニスト分子および／または組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子を使用する方法が、本明細書において提供される。本明細書に開示される方法のいずれかはまた、例えば、本明細書において記載される、ＷＮＴアゴニスト分子と組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子の組み合わせ、またはＷＮＴアゴニスト分子と組織特異的ＷＮＴシグナル増強の両方を含む組み合わせ分子（組み合わせ分子）を使用して、実施されてもよい。一実施形態では、ＷＮＴ アゴニスト分子および／もしくは組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子、または組み合わせ分子は、不適切または制御不能なＷＮＴシグナル伝達が関与する疾患を有する対象に提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において開示される方法は、それを必要とする対象に、ＷＮＴアゴニスト分子および／または組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子を、単独もしくは組み合わせで、または組み合わせ分子を提供することを含む。ある特定の実施形態では、ＷＮＴアゴニスト分子および組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、同じ医薬組成物または異なる医薬組成物において対象に提供される。一部の実施形態では、ＷＮＴアゴニスト分子および組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、対象に同時または異なる時間で、例えば、一方が他方の前または後のいずれかで提供される。一部の実施形態では、方法は、対象に、有効量のＷＮＴアゴニスト分子および／または組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子を提供することを含む。一部の実施形態では、有効量のＷＮＴアゴニスト分子および組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、重複した期間、例えば、１日、２日、または１週間、対象に存在する。他の実施形態では、本明細書において開示される方法は、それを必要とする対象に、ＷＮＴアゴニスト分子および組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子を含む組み合わせ分子を提供することを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかを実施して、炎症（例えば、胃腸管組織、例えば、小腸、大腸、または結腸などの、ＩＢＤと関連する炎症またはＩＢＤが影響する組織における炎症）を低減するか、ＷＮＴシグナル伝達を増加させるか、ＩＢＤの組織学的症状（例えば、本明細書において開示されるもの）のいずれかを低減するか、炎症組織（例えば、胃腸管組織）におけるサイトカインレベルを低減するか、または本明細書において開示される疾患活動性指数を低減してもよい。
ある特定の実施形態では、ＷＮＴアゴニスト分子もしくは組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子または組み合わせ分子を使用して、組織または細胞におけるＷＮＴシグナル伝達経路を増強してもよい。ＷＮＴシグナル伝達経路の作動作用は、例えば、組織または細胞におけるＷＮＴシグナル伝達の増加またはＷＮＴシグナル伝達の増強を含みうる。それ故に、一部の態様では、本開示は、細胞においてＷＮＴシグナル伝達経路を作動する方法であって、組織または細胞を、有効量の本明細書に開示されるＷＮＴアゴニスト分子および／もしくは組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子、または組み合わせ分子、あるいはその薬学的に許容し得る塩と接触させることを含み、ＷＮＴアゴニスト分子および／もしくは組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子、または組み合わせ分子は、ＷＮＴシグナル伝達経路アゴニストである、方法を提供する。一部の実施形態では、接触は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで生じる。特定の実施形態では、細胞は培養細胞であり、接触はインビトロで生じる。
ＷＮＴアゴニスト性および／または組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子、または組み合わせ分子は、限定されるものではないが、クローン病、瘻孔形成を伴うクローン病、および潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない、炎症性腸疾患を含むが、これらに限定されない、胃腸障害の治療に使用され得る。特に、本発明は、これらの障害による損傷の結果としての腸上皮の再生を増強するためのＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達ＷＮＴ／β－カテニンアゴニストを提供する。
一実施形態では、ＷＮＴアゴニスト分子はまた、肺組織特異的受容体または細胞表面分子を認識する組織標的化部分、例えば、抗体またはその断片を組み込んでもよい。
本発明はまた、既知の治療との併用療法を、胃腸障害、特に、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に提供する。例えば、ＷＮＴアゴニストおよび／もしくは組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子、または組み合わせ分子は、５－アミノサリチル酸塩（５－ＡＳＡ）；コルチコステロイド、アザチオプリンもしくは６－メルカプトプリン、メトトレキサート、およびシクロスポリン－Ａもしくはタクロリムスなどの免疫抑制剤；インフリキシマブ、アダリムマブ、およびゴリムマブなどのＴＮＦ－α阻害剤；ベドリズマブなどの抗インテグリン；ウステキヌマブなどの炎症性サイトカインアンタゴニスト；トファシチニブなどのヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤；モンゲルセンなどのＳＭＡＤ７阻害剤；ならびにオザニモドおよびエトラシモドなどのＳ１Ｐ調節因子を含むが、これらに限定されない、ＩＢＤのためのいくつかの既知の療法と組み合わされ得る。上記の治療薬は、本発明の分子と順次または同時に投与することができる。
治療剤（例えば、ＷＮＴアゴニストおよび／もしくは組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子または組み合わせ分子）は、疾患または損傷の発症の前、最中、または後に投与されてもよい。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または減少させる、進行中の疾患の治療は、特に興味深い。こうした治療は、罹患した組織における機能が完全に喪失する前に実施されることが望ましい。主題の療法は、疾患の症候期の間、および一部の事例では、疾患の症候期後に投与されることが望ましい。一部の実施形態では、主題の方法は、治療的利益、例えば、障害の発症の防止、障害の進行の停止、障害の進行の逆転などをもたらす。一部の実施形態では、主題の方法は、治療的利益が達成されたことを検出する工程を含む。当業者であれば、こうした治療有効性の手段が、修飾される特定の疾患に適用可能であることを理解し、また治療有効性の測定に使用する適切な検出方法を認識するであろう。
本明細書において参照される、および／または出願データシートに列挙される、上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許文献の全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
前述から、当然のことながら、本開示の特定の実施形態は、例示の目的で本明細書に記述されているが、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な修正がなされうる。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲による場合を除き、限定されない。
本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照して最もよく理解されるが、これは本発明を特定の実施形態に限定することを意図するものではない。
Ｉ．一般的方法
分子生物学における標準方法が記載されている。Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｗｕ（１９９３年）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、２１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ。標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌら、（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１～４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．にも記載があり、これは細菌細胞でのクローニングおよびＤＮＡ変異原性（１巻）、哺乳類細胞および酵母でのクローニング（２巻）、複合糖質およびタンパク質発現（３巻）、ならびにバイオインフォマティクス（４巻）について記載されている。
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製の方法が記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎら、（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、タンパク質のグリコシル化が記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら、（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ，Ｎ．Ｙ．、ｐｐ．１６．０．５～１６．２２．１７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．； ｐｐ．４５～８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１年）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、ｐｐ．３８４～３９１を参照のこと。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製、および断片化が記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎら、（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９年）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記。リガンド／受容体の相互作用を特徴解析するための標準的な技法が利用可能である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
蛍光活性化細胞ソーティング検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））を含むフローサイトメトリー用の方法が利用可能である。例えば、Ｏｗｅｎｓら、（１９９４年）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．；Ｇｉｖａｎ（２００１年）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、第２編；Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．、 Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．を参照のこと。例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチド、ならびに抗体を含む核酸の修飾に適した蛍光試薬が利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３年）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３年）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ。
免疫系の組織学の標準方法が記載されている。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６年）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｎ．Ｙ．；Ｈｉａｔｔら、（２０００年）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ、Ｐａ．；Ｌｏｕｉｓら、（２００２年）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質折り畳み、機能ドメイン、グリコシル化部位、および配列の整列を決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖ．）；Ｍｅｎｎｅら、（２０００年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１６：７４１～７４２；Ｍｅｎｎｅら、（２０００年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ１６：７４１～７４２；Ｗｒｅｎら、（２００２年）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７～１８１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７～２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３～４６９０を参照のこと。
ＩＩ．マウス小腸、ならびにマウスおよびヒト結腸におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の発現。
マウス小腸および結腸上皮におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のそれぞれの発現パターンを決定するために、個々のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のｍＲＮＡを、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（ＡＣＤ）により検出した。使用したＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）プローブを表１に列挙する。標準ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＨＤアッセイ－レッドプロトコールに従った。
Figure 2022525300000002
ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、およびＦＺＤ９は、マウス腸上皮において異なるレベルで発現する（図１）。ＦＺＤ５は、腸腺窩および絨毛において最も高いレベルで発現した。腺窩において、ＦＺＤ５発現は、有限増殖（ＴＡ）細胞が存在する尖端区画の近くではるかに高かった。ＦＺＤ１を、腸上皮と、腸腺窩のすぐ周囲の固有層の両方において低いレベルで検出した。ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、およびＦＺＤ７は、低レベルで発現し、腸絨毛と腺窩の両方において均等に分布した。ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、およびＦＺＤ１０の発現は非常に低く、主に、腸腺窩で検出した。
ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、およびＦＺＤ９はまた、マウス結腸において異なるレベルで発現する。ＦＺＤ５は、結腸腺窩で最も高いレベルで発現し、発現は、管腔側に向かい高くなった。ＦＺＤ１およびＦＺＤ７を、結腸上皮において低レベルで検出した。ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８およびＦＺＤ９を、低レベルで発現し、結腸腺窩に均等に分布した。腸においてＦＺＤ１０の検出可能な発現はなかった。ＦＺＤ発現のレベルは、マウスＤＳＳ大腸炎ＩＢＤモデルの結腸およびヒト潰瘍性大腸炎患者結腸において影響を受けた。
ヒト結腸上皮におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のそれぞれの発現パターンを決定するために、個々のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のｍＲＮＡを、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（ＡＣＤ）により検出した。標準ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＨＤアッセイ－レッドプロトコールに従った。ＦＺＤ５は、結腸腺窩において最も高いレベルで発現した。ＦＺＤ７を、結腸上皮および結腸腺窩を包含する間質細胞において、より低いレベルで検出した。
ＩＩＩ．操作した可溶性ＷＮＴアゴニストの活性
三つのＦｒｉｚｚｌｅｄバイアス型ＷＮＴアゴニスト、Ｒ２Ｍ３－２６（ＦＺＤ１、２、５、７、８およびＬＲＰ６結合剤）、１ＲＣ０７－０３（ＦＺＤ１、２、７およびＬＲＰ５結合剤）ならびにＲ２Ｍ１３－０３（ＦＺＤ５、８およびＬＲＰ５結合剤）の活性を、ヒト肝細胞株、Ｈｕｈ７細胞において調べて、ＷＮＴシグナル伝達を活性化する能力を決定した。三つのＷＮＴアゴニストは、国際公開第２０１９１２６３９８号に既に記載されている。表２は、使用した三つのＷＮＴアゴニストのＬＣ鎖およびＨＣ鎖の配列を提供する。
Figure 2022525300000003
細胞を、１日目に９６ウェルプレート当たり１００万個で播種し、一晩成長させた。２０ｎＭ Ｒ－スポンジンの存在下で、１００ｎＭから始まる１０倍希釈で細胞にタンパク質をトリプリケートで加えた。ルシフェラーゼレポーター活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてウェル中でアッセイし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で読み取った。各タンパク質希釈液についてのトリプリケートの平均絶対ＲＬＵ値を示す（図２）。Ｒ２Ｍ３－２６（ＦＺＤ１、２、５、７、８）は、最も高いレポーター活性を示した。Ｒ２Ｍ１３－０３（ＦＺＤ５、８）は、ＳＴＦアッセイにおいて最も低い活性を示した。
ＩＶ．ＷＮＴシグナル伝達の活性化は、ＦＺＤ５およびＦＺＤ８を介してマウス小腸オルガノイド増殖を特異的に刺激した
マウス小腸オルガノイドを、マウスＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）オルガノイド成長培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてで維持した。オルガノイド増殖についてアッセイするために、オルガノイドを、Ｇｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１０分間、振とうしながら解離させ、冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で２回洗浄し、氷上で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中１：１で懸濁した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の細胞再懸濁液２５μｌを、予め温めた４８ウェル組織培養プレート上の各ウェルの中心に播種し、３７℃で５分間固めた。基礎培地（表３）、基礎培地＋ＩＷＰ２または基礎培地＋ＩＷＰ２＋代替ＷＮＴアゴニスト３００μｌを、ウェルに適用した。各条件は、５～６回の反復を含む。培地および処理を、播種後４日目に１回交換した。７日目に取得した３Ｄ培養オルガノイドの画像を図３に示す。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ ３Ｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、処理したオルガノイド上で７日目に行った。
Figure 2022525300000004
腸オルガノイドは、ＷＮＴアゴニスト処理の存在下で、増殖し、形態学的に丸くなる。内因性ＷＮＴ発現を、ヤマアラシ阻害剤ＩＷＰ－２を用いたアッセイにおいて阻害した。Ｒ２Ｍ３－２６（ＦＺＤ１、２、５、７、８）とＲ２Ｍ１３－０３（ＦＺＤ５、８）の両方は、オルガノイド増殖を強く刺激し、オルガノイドの数の増加および個々のオルガノイドの拡大によって反映される（図３Ａおよび３Ｃ）。１ＲＣ０７－０３（ＦＺＤ１、２、７）はまた、オルガノイドの増殖を刺激するが、程度ははるかに低い。すべてのＷＮＴアゴニストは、１８Ｒ５－Ｄｋｋ１ｃよりも高い活性を示した（その構造は、Ｊａｎｄａら、（２０１７年）Ｎａｔｕｒｅ ５４５：２３４～２３７）。ＦＺＤアンタゴニストを、オルガノイド培養物において同様に試験することができる。
ＶＩ．マウスオルガノイド培養物のＩＨＣ解析
マウス小腸オルガノイドに対するＲ２Ｍ３－２６の活性を、増殖マーカーＫＫｉ６７染色を用いて示した。８ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ、１５４５３４）において培地を浸漬させたＭａｔｒｉｇｅｌにおいて成長させたマウス小腸オルガノイドを、上述のように１００ｎＭ Ｒ２Ｍ３－２６で７日間処理した。次いで、オルガノイドを４％ＰＦＡ中で固定し、ＰＢＳ＋０．２％トリトン中で２０分間透過処理し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋０．２％トリトン＋３％ＢＳＡ）においてブロッキングした。一次抗体ウサギ抗Ｋｉ６７（Ａｂｃａｍ ａｂ１５５８０、１：１０００）およびヤギ抗Ｅ－カドヘリン（Ｒ＆Ｄ ＡＦ７４８、１：２０００）をブロッキング緩衝液中で混合し、オルガノイドに添加した。室温で一次抗体と１時間インキュベーション後、オルガノイドをＰＢＳ＋０．２％トリトンで３回洗浄し、次いで、二次抗体ロバ抗ウサギ Ａｌｅｘａ５６８（Ａｂｃａｍ）とロバ抗ヤギＡｌｅｘａ４８８（Ａｂｃａｍ）の１：１０００希釈液と共に室温で３０分間インキュベートした。次いで、オルガノイドをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に入れた。Ｚスタック信号チャネル画像を、Ｚｅｉｓｓ ＤＭｉ８蛍光顕微鏡で撮影し、デジタルデコンヴォルーションし、２Ｄ上に投影し、説明のため２チャネル合成した。ＷＮＴアゴニスト処理は、マウス小腸オルガノイドの増殖を刺激した。抗Ｋｉ６７（赤色）および抗Ｅ－カドヘリン（緑色）で染色した１００ｎＭ Ｒ２Ｍ３－２６で処理した後のマウス小腸オルガノイドは、ＷＮＴアゴニスト処理の際に細胞増殖を示す（図４）。
ＶＩＩ．インビボデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）ＩＢＤマウスモデル
６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊメスのマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から入手し、ケージ当たり４匹、収容した。すべての動物実験は、米国科学アカデミーが準備した「実験動物の世話と使用に関するガイド」の基準に従った。動物実験のプロトコールを、Ｓｕｒｒｏｚｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ実験動物委員会が承認した。実験開始前の少なくとも２日間、マウスを馴化させた。マウスは、３０～７０％の湿度環境および２０℃～２６℃の範囲にある室温において、１２／１２時間の明暗サイクルを維持した。
急性大腸炎を誘発するために、７～８週齢のメスのマウスに、４．０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＭＦＣＤ０００８１５５１）を含有する飲料水を７日間、および１．０％（ｗ／ｖ）ＤＳＳを含有する飲料水を２日間自由に摂取させた（図５Ａ）。ＤＳＳに供したマウスは、重大かつ持続的な体重減少（図５Ｂ）および血性下痢を特徴とする重度の大腸炎を発症し、これにより、糞便スコアによって表される、疾患指数の増加をもたらした（図５Ｃ）。週２回または１日１回のＲＳＰＯ２－Ｆｃ（Ｒ－スポンジン２－Ｆｃ；配列番号２４）とＲ２Ｍ３－２６の併用処置は、陰性対照と比較して、９日目に疾患活動性指数（ＤＡＩ）を有意に改善した。Ｒ２Ｍ３－２６単独およびＲ２Ｍ３－２６＋ＲＳＰＯ２－Ｆｃ処置は、１０日目に体重を有意に改善した。
ＤＳＳモデルマウスの横行結腸の組織学的評価は、粘膜から漿膜まで伸びる炎症、腺窩過形成、杯細胞消失および潰瘍化を示し（図６Ａ～６Ｅ）、対照的に、ＷＮＴアゴニストで処置したマウスの結腸は、ほぼ正常であり、すべての処置群の中で最も低い組織学的スコアであった（図６Ｃ）。ＲＳＰＯ２－Ｆｃは、結腸組織の組織学的スコアに有意な陽性効果を有しない。ＲＳＰＯ２－Ｆｃ＋Ｒ２Ｍ３－２６併用群は、対照抗ＧＦＰ群と比較して、結腸組織のより低い組織学的スコアを有する（Ｐ＜０．０、図７Ａ）。Ｒ２Ｍ３－２６は、小腸腺窩または絨毛に影響を与えないようであり（図８Ｃ）、一方、ＲＳＰＯ２－Ｆｃおよび併用は、絨毛および腺窩の過形成を誘発した（図８Ｄ～８Ｅ）。組織学的スコアリングを、例えば、Ｇｅｂｏｅｓら、（２０００年）、上記に記載の通り、評価した。
血清中の炎症性サイトカインを、炎症促進パネル１キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｋ１５０４８Ｄ）により分析し、Ｒ２Ｍ３－２６、ＲＳＰＯ２－Ｆｃ、およびＲ２Ｍ３－２６プラスＲＳＰＯ２－Ｆｃの治療すべてが、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－１βのサイトカインレベルを低減する（それぞれ、図９Ａ～９Ｊ、特に、図９Ａ、９Ｊおよび９Ｂ）。
ＲＳＰＯ２－Ｆｃ単独は、小腸過形成を誘発し、体重減少およびＤＡＩに有意な利益をもたらさなかった。ＷＮＴアゴニスト／ＲＳＰＯ２－Ｆｃ併用治療は、疾患活性を低減し、損傷した結腸上皮を修復し、一方、小腸における過形成を誘発した。Ｒ２Ｍ３－２６単独は、ａ）体重を改善し、ｂ）損傷した結腸上皮を修復し、ｃ）血清炎症性サイトカインマーカーを減少し、ｄ）小腸過形成を引き起こさず、これにより、ＷＮＴアゴニスト単独が、上皮バリアを改善し、これによって炎症を低減することによって、急性結腸大腸炎を治療するために使用することができることを示す。
ＶＩＩＩ．腸の炎症および上皮組織の修復の改善
先行研究は、多特異性ＷＮＴアゴニストであるＲ２Ｍ３－２６が、ＤＳＳ大腸炎マウスモデルにおいて腸の炎症を改善し、上皮損傷を修復することができたことを示した。結腸におけるＦＺＤ５およびＦＺＤ８の選択的な発現を考慮すると、ＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニスト、Ｒ２Ｍ１３－２６、およびＦＺＤ１、２、７特異的ＷＮＴアゴニスト、１ＲＣ０７－２６のいずれかまたは両方が、マウスモデルにおいてＤＳＳ誘発性大腸炎を軽減できたかどうかを確認するために試験した。
６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊメスのマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から入手し、ケージ当たり５匹、収容した。すべての動物実験は、米国科学アカデミーが準備した「実験動物の世話と使用に関するガイド」の基準に従った。動物実験のプロトコールを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ実験動物委員会が承認した。
急性大腸炎を誘発するために、７～８週齢のメスのマウスに、４．０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＭＦＣＤ０００８１５５１）を含有する飲料水を７日間、および１．０％（ｗ／ｖ）ＤＳＳを含有する飲料水を３日間自由に摂取させた。ＤＳＳに供したマウスは、重大かつ持続的な体重減少（図１０Ａ）および血性下痢を特徴とする重度の大腸炎を発症し、これにより、糞便スコア（図１０Ｂ）および疾患指数（ＤＡＩ）の増加をもたらした。週２回のＲ２Ｍ３－２６、Ｒ２Ｍ１３－２６、および１ＲＣ０７－２６処置は、それぞれ、陰性対照（ＰＢＳまたは抗ＧＦＰ）と比較して、１０日目に体重（図１０Ａ）および便スコア（図１０Ｂ）を有意に改善した。ＤＳＳモデルマウスの横行結腸の組織学的評価は、好中球浸潤、腺窩過形成、杯細胞消失および潰瘍を示した（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。Ｒ２Ｍ３－２６、Ｒ２Ｍ１３－２６、および１ＲＣ０７－２６処置は、結腸組織学を修復し、これにより、上皮びらん、杯細胞喪失、および好中球遊走の改善を示した（図１１Ｄ～Ｈ）。Ｒ２Ｍ３－２６、Ｒ２Ｍ１３－２６、またはＣ０７－３は、小腸過形成を引き起こさず（図１１Ｂおよび１１Ｃ）、一方、Ｒ２Ｍ３－２６／ ＲＳＰＯ併用処置は、小腸過形成を誘発した（図１２Ｄ～Ｈ）。血清および結腸組織における炎症性サイトカインを、炎症促進パネル１キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｋ１５０４８Ｄ）を使用して分析し、その結果は、Ｒ２Ｍ３－２６およびＲ２Ｍ１３－２６処置が、血清中のＴＮＦ－αレベルおよびＩＬ－８レベル（図１３Ａおよび１３Ｃ）、ならびに結腸組織におけるＩＬ－６およびＩＬ－８レベル（図１３Ｅおよび１３Ｆ）を有意に低減したことを示した。
上記の実施例ＩＶで言及した通り、Ｒ２Ｍ３－２６は、ＤＳＳ大腸炎マウスにおいて腸炎症を低減し、上皮損傷を修復した。この研究はさらに、ＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニスト、Ｒ２Ｍ１３－２６、およびＦＺＤ１、２、７特異的ＷＮＴアゴニスト、１ＲＣ０７－２６が、ＤＡＩを改善し、小腸過形成を伴わないで損傷した結腸上皮を修復し、結腸および血清中の炎症性サイトカインレベルを低減することができたことを示した。
ＩＸ．マウスＤＳＳモデルにおけるＲ２Ｍ１３－２６の用量応答解析
ＩＢＤのＤＳＳマウスモデルにおけるＲ２Ｍ１３－２６（ＦＺＤ５、８結合剤）の最適用量を決定するために、６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊメスのマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から入手し、ケージ当たり５匹を収容した。すべての動物実験は、米国科学アカデミーが準備した「実験動物の世話と使用に関するガイド」の基準に従った。動物実験のプロトコールを、Ｓｕｒｒｏｚｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ実験動物委員会が承認した。
急性大腸炎を誘発するために、７～８週齢のメスのマウスに、４．０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＭＦＣＤ０００８１５５１）を含有する飲料水を７日間、および１．０％（ｗ／ｖ）ＤＳＳを含有する飲料水を３日間自由に摂取させた。ＤＳＳに供した対照マウスは、重大かつ持続的な体重減少および血性下痢を特徴とする重度の大腸炎を発症し、これにより、疾患指数（ＤＡＩ、図１４Ａ～１４Ｂ）の増加をもたらした。
０．３、１、３、１０ｍｐｋ、週２回のＲ２Ｍ１３－２６処置は、用量反応パターンでＤＡＩを改善した（図１４Ａ）。さらなる濃度である１、３、１０、３０ｍｐｋ、週１回のＲ２Ｍ１３－２６処置は、用量応答パターンでＤＡＩを改善した（図１４Ｂ）。ＤＳＳモデルマウスの横行結腸の横断面の組織学的評価は、好中球浸潤、浮腫、腺窩過形成、杯細胞消失および潰瘍を示した。異なる用量および頻度でのＲ２Ｍ１３－２６処置はすべて、ＤＳＳ大腸炎マウスにおいて、上皮びらん、杯細胞消失および好中球遊走に対する改善を示した（図１５Ａ～１５Ｊ）。血清および結腸組織における炎症性サイトカインを、炎症促進パネル１キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｋ１５０４８Ｄ）を使用して分析し、その結果は、異なる用量および頻度でのＲ２Ｍ１３－２６処置すべてが、血清中のＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－８レベル（図１６Ａ～１６Ｃ）、ならびに結腸組織におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－８レベル（図１７Ａ～１７Ｃ）を有意に減少したことを示した。
Ｒ２Ｍ１３－２６は、広範な用量範囲で、大腸炎マウスモデルにおいて腸炎症を低減し、上皮損傷を修復し、これにより、腸上皮バリアの改善を介して急性大腸炎の治療におけるＦＺＤ５、８特異的分子（Ｒ２Ｍ１３－２６）をさらに検証した。
Ｘ．急性ＤＳＳモデルにおける異なるＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニストの有効性
四つのＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニスト、５７ＳＥ８－２６、５７ＳＢ８－２６、１７４Ｒ－Ｅ０１－２６および５７ＳＡ１０－２６の活性を、ヒト肝細胞株であるＨｕｈ７細胞において調べて、ＷＮＴシグナル伝達を活性化するそれらの能力を決定した。表４は、ＦＺＤ５、８ＷＮＴアゴニストの構成要素の配列を提供する。これらのＷＮＴアゴニストは、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含有するＦａｂであるＦＺＤ結合ドメインならびにリンカーを介してＬＣのＮ末端でＦＺＤ Ｆａｂに結合したＶＨＨであるＬＲＰ結合ドメインを含む。ＷＮＴアゴニストは、示したＬＣ鎖の二つおよび示したＨＣ鎖の二つを含む。
Figure 2022525300000005
Figure 2022525300000006
ＦＺＤ－ＶＨ配列を太字で示し、ＦＺＤ－ＣＨ１配列を斜体で示し、ヒンジ配列を太字の斜体で示し、ＣＨ２配列を、下線付き斜体で示し、ＣＨ３配列を、下線付き太字で示し、リンカーを介してＶＬのＮ末端に結合したＬＲＰ（２６）ＶＨＨ配列を、下線付き太字の斜体で示し、リンカー配列は下線のみであり、ＦＺＤ－ＶＬは、網掛け灰色であり、ＦＺＤ－ＣＬは、網掛け灰色かつ下線である。
ＦＺＤ５およびＦＺＤ８に特異的に結合する（かつ他のＦＺＤに有意に結合しない）ＦＺＤ５／８特異的結合ドメインを表５に示す。
Figure 2022525300000007
Figure 2022525300000008
Figure 2022525300000009
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号７～１４または３３～４０のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号７～１４または３３～４０のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＦＺＤ結合ドメインを含むＷＮＴアゴニストを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号３３～４０のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号７～１４または３３～４０のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＦＺＤ結合ドメインを含む組み合わせ分子を提供する。
表６は、上記のＦＺＤ５、８結合ドメインのＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＦＺＤ５、８結合ドメインのいずれかのＶＨおよび／もしくはＶＬ ＣＤＲ配列のいずれかまたは両方を含むポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書において同定したＦＺＤ５、８結合ドメインのいずれかの重鎖（ＣＤＲＨ１－３）および／もしくは軽鎖（ＣＤＲＬ１－３）ＣＤＲ配列のいずれかまたは両方を含むＦＺＤ結合ドメイン、例えば、５７ＳＥ８、５７ＳＢ８１７４ＲＥ、または５７ＳＡ１０を含むＷＮＴアゴニストを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＦＺＤ５、８結合ドメインのいずれかのＶＨおよび／もしくはＶＬ ＣＤＲ配列のいずれかまたは両方を含む抗体またはその高原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＦＺＤ５、８結合ドメインのいずれかのＶＨおよび／もしくはＶＬ ＣＤＲ配列のいずれかまたは両方を含むＷＮＴアゴニストを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＦＺＤ５、８結合ドメインのいずれかのＶＨおよび／もしくはＶＬ ＣＤＲ配列のいずれかまたは両方を含むＦＺＤ結合ドメインを含む組み合わせ分子を提供する。他の実施形態では、ポリペプチド、抗体もしくはその結合断片、ＷＮＴアゴニスト、または組み合わせ分子は、結合ドメインのいずれかに存在する６つのうち少なくとも５つのＣＤＲを含む。他の実施形態では、ポリペプチド、抗体もしくはその結合断片、ＷＮＴアゴニスト、または組み合わせ分子は、結合ドメインのいずれかに存在する六つのＣＤＲを含み、ＣＤＲは、天然のＣＤＲと比較して、一つまたは複数、例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ以上のアミノ酸修飾をまとめて含む。特定の実施形態では、ＷＮＴアゴニストまたは組み合わせ分子は、開示したＣＤＲまたはそのバリアントのいずれかをまとめて有する二つの重鎖および二つの軽鎖を含む。
Figure 2022525300000010
細胞を、１日目に９６ウェルプレート当たり１００万個で播種し、一晩成長させた。２０ｎＭ Ｒ－スポンジンの存在下で、１００ｎＭから始まる１０倍希釈で細胞にタンパク質をトリプリケートで加えた。ルシフェラーゼレポーター活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてウェル中でアッセイし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で読み取った。各タンパク質希釈液についてのトリプリケートの平均絶対ＲＬＵ値を示す（図１８）。Ｒ２Ｍ１３－２６を、比較のため同じアッセイに含めた。
ＩＢＤのＤＳＳマウスモデルにおける追加のＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニストの有効性を決定するために、６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊメスのマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から入手し、ケージ当たり５匹を収容した。すべての動物実験は、米国科学アカデミーが準備した「実験動物の世話と使用に関するガイド」の基準に従った。動物実験のプロトコールを、Ｓｕｒｒｏｚｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ実験動物委員会が承認した。
急性大腸炎を誘発するために、７～８週齢のメスのマウスに、４．０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＭＦＣＤ０００８１５５１）を含有する飲料水を７日間、および１．０％（ｗ／ｖ）ＤＳＳを含有する飲料水を３日間自由に摂取させた。ＤＳＳに供した対照マウスは、重大かつ持続的な体重減少および血性下痢を特徴とする重度の大腸炎を発症し、これにより、疾患指数の増加をもたらした（ＤＡＩ、図１９Ａ）。
１０ｍｐｋ、週２回のＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニスト処置は、Ｒ２Ｍ１３－２６と同様に、ＤＡＩを改善した（図１９Ａ）。血清中の炎症性サイトカインを、炎症促進パネル１キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｋ１５０４８Ｄ）により分析し、その結果は、５８ＳＥ８－２６を除く、ＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニストすべてが、血清中（図１６Ａ～１６Ｃ）および結腸組織（図１９Ｂ～１９Ｄ）におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－８レベルを有意に減少することを示した。
ＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニストは、腸炎症を低減し、上皮損傷を修復し、これにより、ＤＳＳ大腸炎マウスモデルにおけるＤＡＩの改善をもたらし、これにより、腸上皮バリアの改善を介した急性大腸炎の治療において、本明細書に記載するＦＺＤ５、８特異的ＷＮＴアゴニスト分子をさらに検証した。
ＸＩ．組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子は、インビトロで、ＷＮＴシグナル伝達を有効に活性化し、腸オルガノイド成長を刺激した
ＭＭＵＣ－１３結合剤Ｃ４、Ｃ７、およびＣ１４（例えば、国際特許出願公開第２０１６１６８６０７Ａ１号を参照）をクローニングし、完全長ＩｇＧ形式で作製し、ＭＵＣ－１３に対するそれらの結合能力を、ＭＵＣ－１３を発現するＨＴ２９細胞に対するＦＡＣＳ分析により決定した。ＭＵＣ－１３非発現ＨＥＫ２９３細胞へのそれらの潜在的な結合も、陰性対照として分析した。細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（－Ｃａ２＋、－Ｍｇ２＋）、０．１％ＢＳＡ、０．５％アジ化ナトリウム）を用いて２回洗浄し、１０６個の細胞／ｍｌでＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。細胞懸濁液６０μｌを、９６ウェルｖ底プレートの各ウェルに分注し、プレートを１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液を除去し、その後、ＦＡＣＳ緩衝液中で希釈した１０ｎＭの対応するＭＵＣ－１３抗体または抗ＧＦＰ対照抗体を加え、４℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを遠心分離して、一次抗体を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、その後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒト二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、遠心分離後に、この培地を除去し、プレートを、ＦＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄した。次いで、細胞を１５０ ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、１０，０００現象でＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）細胞アナライザー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。ＨＴ２９（図２０Ａ－２０Ｃ）およびＨＥＫ２９３細胞（図２０Ｄ－２０Ｆ）についてのＦＡＣＳプロットを比較すると、試験したＭＵＣ－１３結合剤のうちの一つであるＣ１４のみが、ＨＴ２９細胞における特異的なＦＡＣＳシフトを示し、これは、Ｃ１４のＭＵＣ－１３特異的結合活性を示している。表７は、試験したＭＵＣ－１３結合剤の配列を提供する。
Figure 2022525300000011
Figure 2022525300000012
上述のＭＵＣ－１３結合剤が、腸特異的ＷＮＴシグナル伝達増強分子の組織特異性をもたらす役目を果たすことができるかどうかを調べるために、変異体（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ＲＳＰＯ２（ｍｕｔＲＳＰＯ２、フューリン２結合ドメインにおけるアミノ酸変異を有し、これにより、ＬＧＲ１－４への結合を低減する（例えば、国際特許出願公開第２０２００１４２７１号を参照））を、１５個のアミノ酸ＧＳリンカーを用いてＭＵＣ－１３ ＩｇＧ抗体（または陰性対照としてのＧＦＰ抗体）の重鎖のＣ末端に融合させた。これらのＭＵＣ－１３標的化ｍｕｔＲＳＰＯ２（ｍｕｔＲＳＰＯ）分子のこれらのシグナル伝達活性を、上述の通り、ＨＴ２９細胞またはＨＥＫ２９３細胞におけるスーパーＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼレポーター（ＳＴＦ）アッセイにより試験した。Ｃ４－ｍｕｔＲＳＰＯ２、Ｃ７－ｍｕｔＲＳＰＯ２、およびＣ１４－ｍｕｔＲＳＰＯ２ルシフェラーゼレポーター活性についての用量反応曲線を測定した（図２１）。再度、ＭＵＣ－１３標的化ＷＮＴ増強分子の中で、Ｃ１４－ｍｕｔＲＳＰＯ２のみが、ＨＴ２９細胞における揚々応答曲線の特異的な左シフトを示したが、ＨＥＫ２９３細胞では示さず、これは、野生型Ｆｃ－ＲＳＰＯ２（配列番号２４）に匹敵するＥＣ５０を伴った。これは、ＩｇＧとしてのＣ－１４のＭＵＣ－１３結合活性と一致し、これは、ＭＵＣ－１３結合によって標的とされるとき、Ｌｇｒ４－６結合能を欠くＷＮＴ増強分子は、天然ＲＳＰＯ２のように機能して、細胞においてＷＮＴシグナル伝達を調節することができることを示唆している。
ＭＵＣ－１３標的化ＷＮＴシグナル伝達増強分子のシグナル伝達活性も、ヒト小腸オルガノイドにおいて調べた。オルガノイド培養物の成長および維持を、上記に記載した。野生型ＲＳＰＯを培地中のＣ１４－ｍｕｔＲＳＰＯ２で置き換えたとき、ヒト小腸オルガノイドの成長を維持した。ヒト小腸オルガノイドを、示した連続希釈濃度の非腸上皮細胞標的化ｍｕｔＲＳＰＯ１（ＡＳＧＲ１－ｍｕｔＲＳＰＯ１、例えば、国際特許出願公開第２０２００１４２７１号を参照のこと）（図２１Ａ～２１Ｃ）または同じ濃度のＣ１４－ｍｕｔＲＳＰＯ２（図２１Ｄ～２１Ｆ）によりＲＳＰＯ－１を置き換えた基礎培地において成長させた。ＲＳＰＯを含まない基礎培地において成長させたときに観察するもの（図２１Ｇ）と同様に、ＡＳＧＲ１－ｍｕｔＲＳＰＯ１で成長させたオルガノイドは成長を停止し、変性し始めた一方、Ｃ１４－ｍｕｔＲＳＰＯは、野生型ＲＳＰＯを含有するＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）オルガノイド成長培地と同様に、オルガノイド成長を維持することができた（図２１Ｈ）。このアッセイは、ＭＵＣ－１３標的化ＷＮＴシグナル伝達増強分子が、ヒト小腸微小組織において無傷の上皮上で機能し得ることを示した。
上述の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書において参照され、かつ／または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、
なおさらなる実施形態を提供するために、様々な特許、出願、および公報の概念を採用するために、必要に応じて修正することができる。これらの変更およびその他の変更は、上記に詳述した説明に照らし、実施形態に対して行うことができる。
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定するものとして解釈されるべきではなく、こうした特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むものとして解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。

Claims (59)

  1. 胃腸障害に罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に、操作されたＷＮＴシグナル伝達調節因子を投与することを含む、方法。
  2. 前記操作されたＷＮＴシグナル伝達調節因子が、操作されたＷＮＴアゴニストである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記操作されたＷＮＴシグナル伝達調節因子が、操作されたポリペプチド、少なくとも一つのエピトープ結合ドメインを含有する操作された抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸分子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記操作されたＷＮＴアゴニストが、一つまたは複数のＦＺＤ受容体（ＦＺＤ１～１０）に結合する一つまたは複数の結合組成物および一つまたは複数のＬＲＰ受容体（ＬＲＰ５～６）に結合する一つまたは複数の結合組成物を含む、請求項２に記載の方法。
  5. 前記操作されたＷＮＴアゴニストの前記結合組成物が、
    ａ）
    ｉ）ＦＺＤ５；
    ｉｉ）ＦＺＤ８；
    ｉｉｉ）ＦＺＤ１；
    ｉｖ）ＦＺＤ２；
    ｖｉ）ＦＺＤ７；
    ｖｉ）ＦＺＤ５およびＦＺＤ８；
    ｖｉｉ）ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、およびＦＺＤ７；
    ｖｉｉｉ）ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ７、ＦＺＤ５、およびＦＺＤ８；
    ｉｘ）ＦＺＤ４；
    ｘ）ＦＺＤ９；または
    ｘｉ）ＦＺＤ１０に結合する一つまたは複数の結合組成物；および
    ｂ）
    ｉ）ＬＲＰ５；
    ｉｉ）ＬＲＰ６；または
    ｉｉｉ）ＬＲＰ５／６に結合する一つまたは複数の結合組成物を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＷＮＴアゴニストが、ＦＺＤ５およびＦＺＤ８に結合する一つまたは複数の結合組成物、およびＬＲＰ５またはＬＲＰ６に結合する一つまたは複数の結合組成物を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＷＮＴアゴニストが、ＦＺＤ５およびＦＺＤ８に結合する結合組成物、およびＬＲＰ６に結合する結合組成物を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＷＮＴアゴニストは、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３の重鎖可変配列；および配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４の軽鎖可変配列を含む、請求項５に記載の方法。
  9. 前記操作されたＷＮＴシグナル伝達調節因子が、腸上皮を修復し、および／または発現炎症性サイトカインを低減する、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記操作されたＷＮＴシグナル伝達調節因子が、組織標的化分子を含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  11. 前記組織標的化分子は、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体またはその断片である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記組織標的化分子が、ＧＰＡ３３、ＣＤＨ１７、およびＭＵＣ－１３ポリペプチド、およびその機能的断片またはバリアントからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＷＮＴシグナル伝達調節因子が、炎症性分子に特異的に結合する結合組成物と共に投与される、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  14. 前記炎症性分子に特異的に結合する前記結合組成物が、前記炎症性分子のアンタゴニストである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記炎症性分子の前記アンタゴニストが、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３、またはＩＬ－２３のアンタゴニストである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記胃腸疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  17. 前記炎症性腸疾患が、クローン病（ＣＤ）、瘻孔形成を有するＣＤ、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 胃腸障害に罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に、組織特異的ＷＮＴシグナル増強分子を投与することを含む、方法。
  19. 前記ＷＮＴシグナル増強分子が、
    ａ．一つまたは複数のＥ３ユビキチンリガーゼに結合する第一のドメイン；および
    ｂ．組織特異的受容体に結合する第二のドメインを含む、操作された分子である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記一つまたは複数のＥ３ユビキチンリガーゼが、亜鉛ならびにリングフィンガータンパク質３（ＺＮＲＦ３）およびリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記第一のドメインが、Ｒ－スポンジン（ＲＳＰＯ）ポリペプチドを含む、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記ＲＳＰＯポリペプチドが、ＲＳＰＯ－１、ＲＳＰＯ－２、ＲＳＰＯ－３、およびＲＳＰＯ－４からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＲＳＰＯポリペプチドが、第一のフューリンドメインおよび第二のフューリンドメインを含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記第二のフューリンドメインが、野生型であるか、またはロイシンリッチリピートを含有するＧタンパク質共役受容体４～６（ＬＧＲ４～６）へのより低い結合を有するように変異される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＷＮＴシグナル増強分子が、組織標的化分子を含む、請求項１８に記載の方法。
  26. 前記組織標的化分子は、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体またはその断片である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記組織標的化分子が、ＧＰＡ３３、ＣＤＨ１７、およびＭＵＣ－１３ポリペプチド、ならびにその機能的断片およびバリアントからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ＷＮＴシグナル増強分子が、配列番号１７、２０、または２３の重鎖配列および配列番号１６、１９、または２２の軽鎖配列を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ＷＮＴシグナル増強分子が、炎症性分子に特異的に結合する結合組成物と共に投与される、請求項１８～２８のいずれかに記載の方法。
  30. 前記炎症性分子に特異的に結合する前記結合組成物が、前記炎症性分子のアンタゴニストである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記炎症性分子の前記アンタゴニストが、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３、またはＩＬ－２３のアンタゴニストである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記胃腸疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１８～２８のいずれかに記載の方法。
  33. 前記炎症性腸疾患が、クローン病（ＣＤ）、瘻孔形成を有するＣＤ、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 胃腸障害に罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に、操作されたＷＮＴアゴニストおよび操作された組織特異的ＷＮＴシグナル増強組み合わせ分子を投与することを含む、方法。
  35. 前記組み合わせ分子が、
    ａ）ＦＺＤ５結合組成物、ＦＺＤ８結合組成物、ＦＺＤ１結合組成物、ＦＺＤ２結合組成物、ＦＺＤ７結合組成物、ＬＲＰ５結合組成物、ＬＲＰ６結合組成物、およびＬＲＰ５／６結合組成物からなる群から選択される前記操作されたＷＮＴアゴニスト；ならびに
    ｂ）一つまたは複数のＥ３ユビキチンリガーゼに結合する第一のドメイン；および組織特異的受容体に結合する第二のドメインを含む、前記操作されたＷＮＴシグナル増強分子を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記Ｅ３ユビキチンリガーゼが、亜鉛ならびにリングフィンガータンパク質３（ＺＮＲＦ３）およびリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記第一のドメインが、Ｒ－スポンジン（ＲＳＰＯ）ポリペプチドを含む、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記ＲＳＰＯポリペプチドが、ＲＳＰＯ－１、ＲＳＰＯ－２、ＲＳＰＯ－３、およびＲＳＰＯ－４からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＲＳＰＯポリペプチドが、第一のフューリンドメインおよび第二のフューリンドメインを含む、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記第二のフューリンドメインが、野生型であるか、またはロイシンリッチリピートを含有するＧタンパク質共役受容体４～６（ＬＧＲ４～６）へのより低い結合を有するように変異される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記組み合わせ分子が、組織標的化分子を取り込む、請求項３４に記載の方法。
  42. 前記組織標的化分子は、組織特異的細胞表面抗原に結合する抗体またはその断片である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記組織標的化分子が、ＧＰＡ３３、ＣＤＨ１７、およびＭＵＣ－１３ポリペプチド、ならびにその機能的断片およびバリアントからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記組み合わせ分子が、炎症性分子に特異的に結合する結合組成物と共に投与される、請求項３４～４２のいずれかに記載の方法。
  45. 前記炎症性分子に特異的である前記結合組成物が、前記炎症性分子のアンタゴニストである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記炎症性分子の前記アンタゴニストが、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３、またはＩＬ－２３のアンタゴニストである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記胃腸疾患が、炎症性腸疾患である、請求項３４～４２のいずれかに記載の方法。
  48. 前記炎症性腸疾患が、クローン病（ＣＤ）、瘻孔形成を有するＣＤ、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. Ｆｒｉｚｚｅｄ ５（ＦＺＤ５）およびＦｒｉｚｚｌｅｄ８（ＦＺＤ８）に特異的に結合するポリペプチドであって、配列番号３３～４０のいずれかに記載されるか、または配列番号３３～４０のいずれかによりコードされる配列に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有する一つまたは複数の配列を含む、ポリペプチド。
  50. 前記ポリペプチドが、抗体または抗体結合断片を含む、請求項４９に記載のポリペプチド。
  51. 前記抗体または抗体結合断片が、次の配列の組み合わせ：配列番号３３および３４；配列番号３５および３６；配列番号３７および３８；または配列番号３９および４０のいずれかに存在するＣＤＲの少なくとも５つまたは全６つを含む、請求項５０に記載のポリペプチド。
  52. 前記ポリペプチドが、次の配列の組み合わせ：配列番号３３および３４；配列番号３５および３６；配列番号３７および３８；または配列番号３９および４０のいずれかに存在するＣＤＲの六つを含み、前記ＣＤＲの一つまたは複数は、一つ、二つ、または三つのアミノ酸修飾、任意選択で、点変異、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入を含む、請求項５０に記載のポリペプチド。
  53. （ａ）ＦＺＤ５およびＦＺＤ８に結合する一つまたは複数の結合ドメインであって、前記一つまたは複数の結合ドメインの少なくとも一つが、請求項４９～５２のいずれか一つに記載のポリペプチドを含む、一つまたは複数の結合ドメイン；ならびに
    （ｂ）ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＬＲＰ５とＬＲＰ６の両方に結合する一つまたは複数の結合ドメインを含む、操作されたＷＮＴアゴニスト。
  54. 配列番号７～１４のいずれか一つに少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたＷＮＴアゴニスト。
  55. （ａ）配列番号７に少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列および配列番号８に少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列；
    （ｂ）配列番号９に少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列および配列番号１０に少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列；
    （ｃ）配列番号１１に少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列および配列番号１２に少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列；または
    （ｄ）配列番号１３に少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列および配列番号１４に少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列を含む、請求項５４に記載の操作されたＷＮＴアゴニスト。
  56. ａ）請求項５３～５５のいずれか一項に記載の操作されたＷＮＴアゴニスト；ならびに
    ｂ）一つまたは複数のＥ３ユビキチンリガーゼに結合する第一のドメイン；および組織特異的受容体に結合する第二のドメインを含む、操作されたＷＮＴシグナル増強分子を含む、組み合わせ分子。
  57. 請求項４９～５２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の操作されたＷＮＴアゴニスト、または請求項５６に記載の組み合わせ分子を含む、医薬組成物。
  58. 胃腸障害に罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の操作されたＷＮＴアゴニスト、請求項５６に記載の組み合わせ分子、または請求項５７に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  59. 前記胃腸障害が、炎症性腸疾患であり、任意選択で、クローン病（ＣＤ）、瘻孔形成を有するＣＤ、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
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