JP2023153807A - Wntシグナル伝達アゴニスト分子 - Google Patents
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Abstract
Description
>NP_116166.9接着Gタンパク質共役型受容体A2前駆体[ヒト(Homo sapiens)]
MGAGGRRMRGAPARLLLPLLPWLLLLLAPEARGAPGCPLSIRSCKCSGERPKGLSGGVPGPARRRVVCSGGDLPEPPEPGLLPNGTVTLLLSNNKITGLRNGSFLGLSLLEKLDLRNNIISTVQPGAFLGLGELKRLDLSNNRIGCLTSETFQGLPRLLRLNISGNIFSSLQPGVFDELPALKVVDLGTEFLTCDCHLRWLLPWAQNRSLQLSEHTLCAYPSALHAQALGSLQEAQLCCEGALELHTHHLIPSLRQVVFQGDRLPFQCSASYLGNDTRIRWYHNRAPVEGDEQAGILLAESLIHDCTFITSELTLSHIGVWASGEWECTVSMAQGNASKKVEIVVLETSASYCPAERVANNRGDFRWPRTLAGITAYQSCLQYPFTSVPLGGGAPGTRASRRCDRAGRWEPGDYSHCLYTNDITRVLYTFVLMPINASNALTLAHQLRVYTAEAASFSDMMDVVYVAQMIQKFLGYVDQIKELVEVMVDMASNLMLVDEHLLWLAQREDKACSRIVGALERIGGAALSPHAQHISVNARNVALEAYLIKPHSYVGLTCTAFQRREGGVPGTRPGSPGQNPPPEPEPPADQQLRFRCTTGRPNVSLSSFHIKNSVALASIQLPPSLFSSLPAALAPPVPPDCTLQLLVFRNGRLFHSHSNTSRPGAAGPGKRRGVATPVIFAGTSGCGVGNLTEPVAVSLRHWAEGAEPVAAWWSQEGPGEAGGWTSEGCQLRSSQPNVSALHCQHLGNVAVLMELSAFPREVGGAGAGLHPVVYPCTALLLLCLFATIITYILNHSSIRVSRKGWHMLLNLCFHIAMTSAVFAGGITLTNYQMVCQAVGITLHYSSLSTLLWMGVKARVLHKELTWRAPPPQEGDPALPTPSPMLRFYLIAGGIPLIICGITAAVNIHNYRDHSPYCWLVWRPSLGAFYIPVALILLITWIYFLCAGLRLRGPLAQNPKAGNSRASLEAGEELRGSTRLRGSGPLLSDSGSLLATGSARVGTPGPPEDGDSLYSPGVQLGALVTTHFLYLAMWACGALAVSQRWLPRVVCSCLYGVAASALGLFVFTHHCARRRDVRASWRACCPPASPAAPHAPPRALPAAAEDGSPVFGEGPPSLKSSPSGSSGHPLALGPCKLTNLQLAQSQVCEAGAAAGGEGEPEPAGTRGNLAHRHPNNVHHGRRAHKSRAKGHRAGEACGKNRLKALRGGAAGALELLSSESGSLHNSPTDSYLGSSRNSPGAGLQLEGEPMLTPSEGSDTSAAPLSEAGRAGQRRSASRDSLKGGGALEKESHRRSYPLNAASLNGAPKGGKYDDVTLMGAEVASGGCMKTGLWKSETTV
>NP_066934.1カザールモチーフを有する復帰誘導性システインリッチタンパク質アイソフォーム1前駆体[ヒト]
MATVRASLRGALLLLLAVAGVAEVAGGLAPGSAGALCCNHSKDNQMCRDVCEQIFSSKSESRLKHLLQRAPDYCPETMVEIWNCMNSSLPGVFKKSDGWVGLGCCELAIALECRQACKQASSKNDISKVCRKEYENALFSCISRNEMGSVCCSYAGHHTNCREYCQAIFRTDSSPGPSQIKAVENYCASISPQLIHCVNNYTQSYPMRNPTDSLYCCDRAEDHACQNACKRILMSKKTEMEIVDGLIEGCKTQPLPQDPLWQCFLESSQSVHPGVTVHPPPSTGLDGAKLHCCSKANTSTCRELCTKLYSMSWGNTQSWQEFDRFCEYNPVEVSMLTCLADVREPCQLGCRNLTYCTNFNNRPTELFRSCNAQSDQGAMNDMKLWEKGSIKMPFINIPVLDIKKCQPEMWKAIACSLQIKPCHSKSRGSIICKSDCVEILKKCGDQNKFPEDHTAESICELLSPTDDLKNCIPLDTYLRPSTLGNIVEEVTHPCNPNPCPANELCEVNRKGCPSGDPCLPYFCVQGCKLGEASDFIVRQGTLIQVPSSAGEVGCYKICSCGQSGLLENCMEMHCIDLQKSCIVGGKRKSHGTSFSIDCNVCSCFAGNLVCSTRLCLSEHSSEDDRRTFTGLPCNCADQFVPVCGQNGRTYPSACIARCVGLQDHQFEFGSCMSKDPCNPNPCQKNQRCIPKPQVCLTTFDKFGCSQYECVPRQLACDQVQDPVCDTDHMEHNNLCTLYQRGKSLSYKGPCQPFCRATEPVCGHNGETYSSVCAAYSDRVAVDYYGDCQAVGVLSEHSSVAECASVKCPSLLAAGCKPIIPPGACCPLCAGMLRVLFDKEKLDTIAKVTNKKPITVLEILQKIRMHVSVPQCDVFGYFSIESEIVILIIPVDHYPKALQIEACNKEAEKIESLINSDSPTLASHVPLSALIISQVQVSSSVPSAGVRARPSCHSLLLPLSLGLALHLLWTYN
>NP_002326.2低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5アイソフォーム1前駆体[ヒト]
MEAAPPGPPWPLLLLLLLLLALCGCPAPAAASPLLLFANRRDVRLVDAGGVKLESTIVVSGLEDAAAVDFQFSKGAVYWTDVSEEAIKQTYLNQTGAAVQNVVISGLVSPDGLACDWVGKKLYWTDSETNRIEVANLNGTSRKVLFWQDLDQPRAIALDPAHGYMYWTDWGETPRIERAGMDGSTRKIIVDSDIYWPNGLTIDLEEQKLYWADAKLSFIHRANLDGSFRQKVVEGSLTHPFALTLSGDTLYWTDWQTRSIHACNKRTGGKRKEILSALYSPMDIQVLSQERQPFFHTRCEEDNGGCSHLCLLSPSEPFYTCACPTGVQLQDNGRTCKAGAEEVLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQVDDIRHAIAIDYDPLEGYVYWTDDEVRAIRRAYLDGSGAQTLVNTEINDPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTSRKILVSEDLDEPRAIALHPVMGLMYWTDWGENPKIECANLDGQERRVLVNASLGWPNGLALDLQEGKLYWGDAKTDKIEVINVDGTKRRTLLEDKLPHIFGFTLLGDFIYWTDWQRRSIERVHKVKASRDVIIDQLPDLMGLKAVNVAKVVGTNPCADRNGGCSHLCFFTPHATRCGCPIGLELLSDMKTCIVPEAFLVFTSRAAIHRISLETNNNDVAIPLTGVKEASALDFDVSNNHIYWTDVSLKTISRAFMNGSSVEHVVEFGLDYPEGMAVDWMGKNLYWADTGTNRIEVARLDGQFRQVLVWRDLDNPRSLALDPTKGYIYWTEWGGKPRIVRAFMDGTNCMTLVDKVGRANDLTIDYADQRLYWTDLDTNMIESSNMLGQERVVIADDLPHPFGLTQYSDYIYWTDWNLHSIERADKTSGRNRTLIQGHLDFVMDILVFHSSRQDGLNDCMHNNGQCGQLCLAIPGGHRCGCASHYTLDPSSRNCSPPTTFLLFSQKSAISRMIPDDQHSPDLILPLHGLRNVKAIDYDPLDKFIYWVDGRQNIKRAKDDGTQPFVLTSLSQGQNPDRQPHDLSIDIYSRTLFWTCEATNTINVHRLSGEAMGVVLRGDRDKPRAIVVNAERGYLYFTNMQDRAAKIERAALDGTEREVLFTTGLIRPVALVVDNTLGKLFWVDADLKRIESCDLSGANRLTLEDANIVQPLGLTILGKHLYWIDRQQQMIERVEKTTGDKRTRIQGRVAHLTGIHAVEEVSLEEFSAHPCARDNGGCSHICIAKGDGTPRCSCPVHLVLLQNLLTCGEPPTCSPDQFACATGEIDCIPGAWRCDGFPECDDQSDEEGCPVCSAAQFPCARGQCVDLRLRCDGEADCQDRSDEADCDAICLPNQFRCASGQCVLIKQQCDSFPDCIDGSDELMCEITKPPSDDSPAHSSAIGPVIGIILSLFVMGGVYFVCQRVVCQRYAGANGPFPHEYVSGTPHVPLNFIAPGGSQHGPFTGIACGKSMMSSVSLMGGRGGVPLYDRNHVTGASSSSSSSTKATLYPPILNPPPSPATDPSLYNMDMFYSSNIPATARPYRPYIIRGMAPPTTPCSTDVCDSDYSASRWKASKYYLDLNSDSDPYPPPPTPHSQYLSAEDSCPPSPATERSYFHLFPPPPSPCTDSS
>NP_002327.2低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質6前駆体[ヒト]
MGAVLRSLLACSFCVLLRAAPLLLYANRRDLRLVDATNGKENATIVVGGLEDAAAVDFVFSHGLIYWSDVSEEAIKRTEFNKTESVQNVVVSGLLSPDGLACDWLGEKLYWTDSETNRIEVSNLDGSLRKVLFWQELDQPRAIALDPSSGFMYWTDWGEVPKIERAGMDGSSRFIIINSEIYWPNGLTLDYEEQKLYWADAKLNFIHKSNLDGTNRQAVVKGSLPHPFALTLFEDILYWTDWSTHSILACNKYTGEGLREIHSDIFSPMDIHAFSQQRQPNATNPCGIDNGGCSHLCLMSPVKPFYQCACPTGVKLLENGKTCKDGATELLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQLEDIRHAIAIDYDPVEGYIYWTDDEVRAIRRSFIDGSGSQFVVTAQIAHPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTMRKILISEDLEEPRAIVLDPMVGYMYWTDWGEIPKIERAALDGSDRVVLVNTSLGWPNGLALDYDEGKIYWGDAKTDKIEVMNTDGTGRRVLVEDKIPHIFGFTLLGDYVYWTDWQRRSIERVHKRSAEREVIIDQLPDLMGLKATNVHRVIGSNPCAEENGGCSHLCLYRPQGLRCACPIGFELISDMKTCIVPEAFLLFSRRADIRRISLETNNNNVAIPLTGVKEASALDFDVTDNRIYWTDISLKTISRAFMNGSALEHVVEFGLDYPEGMAVDWLGKNLYWADTGTNRIEVSKLDGQHRQVLVWKDLDSPRALALDPAEGFMYWTEWGGKPKIDRAAMDGSERTTLVPNVGRANGLTIDYAKRRLYWTDLDTNLIESSNMLGLNREVIADDLPHPFGLTQYQDYIYWTDWSRRSIERANKTSGQNRTIIQGHLDYVMDILVFHSSRQSGWNECASSNGHCSHLCLAVPVGGFVCGCPAHYSLNADNRTCSAPTTFLLFSQKSAINRMVIDEQQSPDIILPIHSLRNVRAIDYDPLDKQLYWIDSRQNMIRKAQEDGSQGFTVVVSSVPSQNLEIQPYDLSIDIYSRYIYWTCEATNVINVTRLDGRSVGVVLKGEQDRPRAVVVNPEKGYMYFTNLQERSPKIERAALDGTEREVLFFSGLSKPIALALDSRLGKLFWADSDLRRIESSDLSGANRIVLEDSNILQPVGLTVFENWLYWIDKQQQMIEKIDMTGREGRTKVQARIAQLSDIHAVKELNLQEYRQHPCAQDNGGCSHICLVKGDGTTRCSCPMHLVLLQDELSCGEPPTCSPQQFTCFTGEIDCIPVAWRCDGFTECEDHSDELNCPVCSESQFQCASGQCIDGALRCNGDANCQDKSDEKNCEVLCLIDQFRCANGQCIGKHKKCDHNVDCSDKSDELDCYPTEEPAPQATNTVGSVIGVIVTIFVSGTVYFICQRMLCPRMKGDGETMTNDYVVHGPASVPLGYVPHPSSLSGSLPGMSRGKSMISSLSIMGGSSGPPYDRAHVTGASSSSSSSTKGTYFPAILNPPPSPATERSHYTMEFGYSSNSPSTHRSYSYRPYSYRHFAPPTTPCSTDVCDSDYAPSRRMTSVATAKGYTSDLNYDSEPVPPPPTPRSQYLSAEENYESCPPSPYTERSYSHHLYPPPPSPCTDSS
>NP_004616.2タンパク質Wnt-7a前駆体[ヒト]
MNRKARRCLGHLFLSLGMVYLRIGGFSSVVALGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACNKTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK
>NP_478679.1タンパク質Wnt-7b前駆体[ヒト]
MHRNFRKWIFYVFLCFGVLYVKLGALSSVVALGANIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGAQMGINECQYQFRFGRWNCSALGEKTVFGQELRVGSREAAFTYAITAAGVAHAVTAACSQGNLSNCGCDREKQGYYNQAEGWKWGGCSADVRYGIDFSRRFVDAREIKKNARRLMNLHNNEAGRKVLEDRMQLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPKFREVGHLLKEKYNAAVQVEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMETDLVYIEKSPNYCEEDAATGSVGTQGRLCNRTSPGADGCDTMCCGRGYNTHQYTKVWQCNCKFHWCCFVKCNTCSERTEVFTCK
LGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC(配列番号24)または
LGANIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGAQMGINECQYQFRFGRWNCSALGEKTVFGQELRVGSREAAFTYAITAAGVAHAVTAACSQGNLSNCGCDREKQGYYNQAEGWKWGGCSADVRYGIDFSRRFVDAREIKKNARRLMNLHNNEAGRKVLEDRMQLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPKFREVGHLLKEKYNAAVQVEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMETDLVYIEKSPNYC(配列番号25)、好ましくは配列番号24の、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225個の連続するアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
-アミノ酸配列HVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC(配列番号17)に対して少なくとも25%の配列同一性を有するアミノ酸配列;または
-アミノ酸配列VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT(配列番号18)に対して少なくとも25%の配列同一性を有するアミノ酸配列;または
-アミノ酸配列VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET(配列番号19)に対して少なくとも25%の配列同一性を有するアミノ酸配列;または
-アミノ酸配列XXXVXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXKXXXX(配列番号20)、VXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXK(配列番号21)、XXXVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXKXXXX(配列番号22)もしくはVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXK(配列番号23)であって、Xが任意のアミノ酸であり、好ましくはアミノ酸配列が配列番号18または配列番号19のいずれか1つに対して少なくとも50%の配列同一性を示す、アミノ酸配列
を含む、ステートメント10に記載の作用物質。
- 配列番号24または配列番号51の20位に対応する位置のイソロイシン(I)残基が、イソロイシン(I)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の25位に対応する位置のプロリン(P)残基が、プロリン(P)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の27位に対応する位置のアラニン(A)残基が、アラニン(A)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基、好ましくはアルギニン(R)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の28位に対応する位置のイソロイシン(I)残基が、イソロイシン(I)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の33位に対応する位置のグルタミン酸(E)残基が、グルタミン酸(E)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の37位に対応する位置のメチオニン(M)残基が、グルタミン酸(E)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の39位に対応する位置のロイシン(L)残基が、グルタミン酸(E)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の41位に対応する位置のグルタミン酸(E)残基が、グルタミン酸(E)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の44位に対応する位置のフェニルアラニン(F)残基が、フェニルアラニン(F)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の50位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の52位に対応する位置のアスパラギン(N)残基が、アスパラギン(N)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはグルタミン(Q)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の68位に対応する位置のバリン(V)残基が、バリン(V)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の129位に対応する位置のイソロイシン(I)残基が、イソロイシン(I)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の131位に対応する位置のフェニルアラニン(F)残基が、フェニルアラニン(F)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の133位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の135位に対応する位置のフェニルアラニン(F)残基が、フェニルアラニン(F)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の141位に対応する位置のイソロイシン(I)残基が、イソロイシン(I)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の146位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の158位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の159位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)、セリン(S)またはロイシン(L)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の181位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の191位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の198位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の200位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の205位に対応する位置のバリン(V)残基が、バリン(V)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の208位に対応する位置のグルタミン酸(E)残基が、グルタミン酸(E)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の214位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の216位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の218位に対応する位置のプロリン(P)残基が、プロリン(P)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の222位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の223位に対応する位置のイソロイシン(I)残基が、イソロイシン(I)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の229位に対応する位置のチロシン(Y)残基が、チロシン(Y)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の232位に対応する位置のプロリン(P)残基が、プロリン(P)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の235位に対応する位置のトレオニン(T)残基が、トレオニン(T)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の248位に対応する位置のグルタミン酸(E)残基が、グルタミン酸(E)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の289位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の291位に対応する位置のトリプトファン(W)残基が、トリプトファン(W)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の307位に対応する位置のトレオニン(T)残基が、トレオニン(T)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており、かつ/または
- 配列番号24または配列番号51の318位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されている、
ステートメント14に記載の作用物質。
- 試験作用物質を、Frizzled/LRP媒介性Wntシグナル伝達を行うことはできるがGPR124/RECK/Frizzled/LRP媒介性Wntシグナル伝達を行うことができない細胞と接触させ、前記Wntシグナル伝達を測定すること
を含む、ステートメント24に記載のインビトロにおける方法。
1.材料および方法
1.1.ゼブラフィッシュの系統
14時間明/10時間暗のサイクルにおいて、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)を28℃で維持した。胚を得て、European and national ethical and animal welfareのガイドライン(プロトコール承認番号:CEBEA-IBMM-2017-22:65)に従って標準的条件下で育成した。Kimmelら(C. B. Kimmel, W. W. Ballard, S. R. Kimmel, B. Ullmann, T. F. Schilling, Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995))に従って段階分けを行った。特徴付けしたトランスジェニック系統および突然変異体系統のTg(kdrl:GFP)s843、Tg(kdrl:ras-mCherry)s896およびgpr124s984(ゼブラフィッシュ)系統をこの研究において使用した(B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015);S.-W. Jin, D. Beis, T. Mitchell, J.-N. Chen, D. Y. R. Stainier, Development. 132, 5199-209 (2005);N. C. Chi et al., Genes Dev. 22, 734-739 (2008))。
gpr124(5’-ACTGATATTGATTTAACTCACCACA-3’)に対するスプライスブロッキングモルフォリノ(B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015))を遺伝子ツール(Eugene、OR)から得て、1細胞段階において、2ngを注射した。mMessage mMachine SP6 Kit(Ambion、Carlsbad、CA)を使用してNotlを消化した後、pCS2プラスミドから合成mRNAを転写し、1細胞段階のゼブラフィッシュの胚中に注射した。
Fz1(addgene 番号42253)およびFz5(addgene 番号42267)を除いて、全てのWntシグナル伝達の構成成分および他のコンストラクトは、In-Fusionクローニング(Takara、Mountain View、CA)を使用する組換えの後に、pCS2ベクターのCMVプロモーターから発現した。In-Fusionクローニングとタンデムに重複するPCR産物とを使用して、単一点突然変異の変異体、欠失体およびキメラを生成した。全てのコンストラクトをサンガーシーケンシングによって確認した。Reck変異体の欠失体は、以下のアミノ酸に対応する:ReckΔCK1:46~93;ReckΔCK2:113~150;ReckΔCK3:160~206;ReckΔCK4:225~272;ReckΔCK5:301~347;ReckΔCK1-5:46~347;ReckΔCRD:352~484およびReckΔKAZAL:636~798。Reckにおける残基22、Gpr124における残基49およびFz5における残基22の後に、HAタグを挿入した。FLAGタグをGpr124における残基49の後に挿入した。
HEK293T細胞をATCC(CRL-3216)から入手し、HEK293 STF細胞株は、Jeremy Nathans(John Hopkins)によって好意により提供された。WTおよび突然変異体の細胞を10%のウシ胎仔血清を補充したDMEM/F12培地(Lonza、Basel、Switzerland)中で培養し、5%のCO2で平衡化した、加湿したインキュベーター内で維持した。HEK293 STF細胞においてCRISPR/Cas9アプローチを使用してGPR124およびRECKを遺伝的に無効化し、HEK293T細胞においてLRP5、LRP6およびFzを同様に無効化した。http://crispr.mit.edu/のウェブサイトを使用してCRISPR/Cas9のガイド配列を設計し、pSpCas9(BB)-2AGFP(F. A. Ran et al., Nat. Protoc. 8, 2281-308 (2013))中にクローニングした。トランスフェクションの48時間後に、GFP+細胞の上位1%をFACS(AriaIII、BD Biosciences、San Jose、CA)によって単離し、クローン増殖のために96ウェルプレート内に分配した。突然変異体細胞株の遺伝子の特徴付けを容易にするために、高解像度融解分析において複数のピークの誘導体融解曲線を生じるクローンを対抗選択した。各標的部位について、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)部位に集中した約1000bpのPCR産物とpCRTM-Blunt II-TOPO(登録商標)(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA)におけるPCR産物の少なくとも8つのサブクローンの両方のサンガーシーケンシングによって突然変異を特定した。CRISPR/Cas9に媒介される反復突然変異誘発によって突然変異体細胞株を得た。
細胞を96ウェルプレート中にプレーティングし、24時間後に三連でLipofectamine 2000(Life Technologies、Carlsbad、CA)によってトランスフェクトした。ウェル当たりのトランスフェクトされるプラスミドDNAの量を各発現ベクターごとに最適化した:別段に指定されていなければ、ウミシイタケルシフェラーゼ(0.5ng)(Jeremy Nathans(John Hopkins)によって好意により提供された)、Wntリガンド(20ng)、Fz受容体(5ng)、Lrp(2.5ng)、Gpr124(10ng)、Reck(5ng)およびDkk-1(10ng)。DNAの総量を空のpCS2ベクターを用いてウェル当たり100ngに調整した。STF細胞株を使用するか、または20ngのM50 Super 8x TOPFlashプラスミド(Addgene プラスミド番号12456)を同時にトランスフェクトすることによって、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。パッシブライシスバッファー(passive lysis buffer)(E1960、Promega、WI)中で細胞を収集し、トランスフェクションの48時間後に、Dual-Luciferase Reporter Assay系(E1960、Promega、Madison、WI)を使用して、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの活性を連続的に測定した。トランスフェクションの24時間後に、96ウェルプレート中90%のコンフルエンシーで、1:1:1の混合物として細胞をプレーティングすることによって、図1Cの競合アッセイを実施した。共培養の24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
細胞をガラスコーティングチャンバー(IBIDI、Martinsried、Germany)内で成長させ、24時間後に、Lipofectamine 2000(Life Technologies、Carlsbad、CA)によりトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞を室温(RT)で10分間、4%のパラホルムアルデヒドにより固定した。免疫蛍光染色(IF)のために、RTで1時間一次抗体に曝露する前に、細胞を1%のBSA-PBS中で30分間ブロッキングした。3回PBSで洗浄した後、細胞をRTで1時間、二次抗体と共にインキュベートした。Wntリガンドの抗V5染色のために、二次抗体溶液とのインキュベーションの前に、細胞を0.1%のTween20を含むPBS中で10分間さらに洗浄した。近接ライゲーションアッセイ(PLA)(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)のために、RTで1時間一次抗体と共にインキュベートする前に、製造業者によって提供されたBlocking溶液を用いて、細胞を37℃で30分間ブロックした。細胞を3回洗浄し、PLAプローブ抗ウサギPLUSと抗マウスMINUSと共に37℃で1時間インキュベートした。PBSで2回洗浄した後、細胞をDuolink Ligation溶液と共に、37℃で30分間インキュベートした。PBSで2回洗浄した後、細胞をDuolink Amplification溶液と共に、37℃で100分間インキュベートした。以下の抗体を使用した:IFとPLAが1:500のマウスモノクローナル抗V5(R96025、Life Technologies、Carlsbad、CA)、IFとPLAが1:400の精製したポリクローナルウサギ抗HA(H6908、St.Louis、MO)および1:5000の抗マウスAlexa488コンジュゲート二次抗体(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA)。PBS中で10μg/mlに希釈したHoechstを用いて、細胞を2分間染色した。
以下の抗体を使用した:ウサギ抗DLV2(1:1000、3216、Cell Signaling Technology、Leiden、Netherlands)、ウサギ抗DLV2-ホスホT224(1:1000、ab124941、Abcam、Cambridge、UK)および抗マウスβーアクチン(1:50,000、A5441、Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)、ニワトリ抗GFP(1:5000、GFP-1010、Aves、Tigard、OR)およびマウスモノクローナル抗FLAG M2(1:1000、F1804、Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)。BioDot SF装置(Bio-Rad、Munich、Germany)を用いて、標準的プロトコールに従い、ドットブロット分析を実施した。上清の連続希釈液をニトロセルロース膜(GE Healthcare、Little Chalfont、UK)上にスポットした。乾燥後、ウエスタンブロットのために、膜を上記のように抗体と共にインキュベートした。同時免疫沈降のために、6ウェルプレートからのトランスフェクトしたHEK293T細胞をPBSにより2回洗浄して、プレートから分離した。遠心分離によって細胞をペレット化させ、タンパク質阻害剤(ThermoFisher Scientific、Waltham、MA)を含有する溶解緩衝液(150mMのNaCl、25mMのTris(pH7.5)、1%のNP40)中に、4℃で30分間溶解させた。遠心分離後、上清を抗FLAG M2アフィニティーゲル(A2220、Sigma、St.Louis、MO)と共に、4℃で3時間インキュベートした。溶解緩衝液を用いて、ビーズを5回洗浄し、等量の2×Laemmli Sample緩衝液中で沸騰させた。
細胞とゼブラフィッシュの胚をLSM710共焦点顕微鏡を用いて画像化し、画像をImageJにおいて処理した。眼の融合表現型の画像をLeica M165 FCで撮影した。Imarisソフトウェア(BitPlane、Zurich、Switzerland)を使用して、脳血管系の表示を作成した。PLA陽性(PLA+)面積とDAPI陽性(DAPI+)面積のパーセンテージを、約50~100個の細胞を含有する画像上でImageJを使用して計算した。固定閾値を手動で適用した後に、PLA+面積を測定した。Image Jにおいて「デフォルト」の閾値設定方法を適用した後、DAPI+面積を測定した。
アフリカツメガエルのWnt8a(PDB ID:4F0A)の構造(C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. Garcia, Science. 337, 59-64 (2012))をWnt7aに関する出発モデルとして使用した。プログラムModeller(B. Webb, A. Sali, Current Protocols in Bioinformatics (John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA, 2016), vol. 54, p. 5.6.1-5.6.37.)を使用して、欠損している残基と置換基をモデル化した。モデル化戦略には、Wnt8において観察したように、既存のジスルフィド架橋を説明することが含まれた。初期の最も良いモデルを真空でCαを拘束した共役勾配エネルギー最小化に供し、次いで、2回目の最小化工程で解放した。次いで、これらのモデルを水のボックス中に埋め込み、150mMのNa+カウンターイオンを添加することによって、電気的中性を達成した。3000工程において全系のエネルギーを再度最小化した。一定温度(310K)および一定圧力(1atm)において、周期的境界を有し、力場としてCHARMM36を使用する、プログラムNAMD 2.7を用い、分子動力学シミュレーションを0.5nsの間行った(J. C. Phillips et al., J. Comput. Chem. 26, 1781-1802 (2005))。2fsの時間工程を使用して、運動方程式を統合した。短い範囲の相互作用を12Åで切断し、平滑粒子メッシュEwald法を使用して、静電的相互作用を計算した。SHAKEアルゴリズムを使用して水素原子を拘束した。得られたモデルは、安定したシミュレーションの平均的代表例である。
Lipofectamine 2000(Life Technologies、Carlsbad、CA)によるトランスフェクションの72時間後に、HEK293T細胞培養物の上清から、Reck-CK-Fc融合タンパク質を無血清FreeStyle 293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA)中に回収した。採取後に、上清を遠心分離(GE Healthcare、Little Chalfont、UK)によって50回濃縮するか、またはプロテインGアフィニティー精製(Protein G Sepharose 4 Fast Flow、Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)にかけた。PAGE後にクマシーブルー染色を使用して、タンパク質の純度を評価した。合成Wntリンカーペプチドを90%を超える純度でChinapeptide Co.,Ltdから入手した。
Affinity ITC(TA Instruments)においてITC滴定を行った。測定前に、Reck-CK-Fcと全てのReck-CK-Fc融合体をTris-NaCl緩衝液(50mMのTris pH8、300mMのNaCl)に透析した。各事例において、タンパク質透析の最終工程から、Wnt由来ペプチドを緩衝液を用いて調製した。熱量計で調査される前に、試料を濾過および脱気し、25℃で滴定を実施した。全ての実験は、2μLという一定用量の滴定液を75rpmの撹拌速度で細胞(200μL)中に注入することからなる。名目上の試料濃度は細胞中で20μMから40μMの間であり、シリンジ内で400μMから1.0mMであった。実際の試料濃度は、透析または緩衝液交換の後に、280nmでのそれらの吸収を測定することによって、またはBCA法によって決定した。MicroCal Origin ITC 7.0、およびNanoAnalyzeソフトウェアパッケージを使用して、全てのデータを分析した。
薄金層でコーティングしたカバーガラスを紫外線照射およびオゾン(UV-O)クリーナー(Jetlight)中で15分間清浄化し、次いで、1mMの16-メルカプトドデカヘキサン酸と1-メルカプト-1-ウンデカノール(1:99の容積比)を含有するエタノール溶液中に一晩浸漬した。次いで、基質をエタノールで濯ぎ、N2で乾燥させ、等量の20mg/mlのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)と50mg/mlの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-arbodiimide)(EDC)を含有する溶液に30分間添加した。得られたNHSで活性化した表面を超純水で濯ぎ、10μg/mlのプロテインG溶液100μlで、RTにて1時間インキュベートした。次いで、試料を洗浄緩衝液を用いて(3×5分)洗浄し、100μlのブロッキング緩衝液において、RTで1時間さらにインキュベートした。最後に、0.2μg/mlのReck-CK-Fc溶液50μlを基質に1時間添加し、洗浄緩衝液で濯ぎ、次いで、AFM実験に使用した。Nanoscope VIII Multimode AFM(Bruker)を使用して、単一分子力分光法(SMFS)の測定をRTにてPBS緩衝液中で実施した。窒化ケイ素チップと0.01~0.06N/mの間の名目上のばね定数を有する三角のAFMカンチレバー(MSCT、Bruker)を使用した。Butt et al. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology 6, 1-7 (1995)に記載されているサーマルノイズ法を使用して、カンチレバーを各実験の終わりに較正した。Wildling et al., Probing binding pocket of serotonin transporter by single molecular force spectroscopy on living cells. J. Biol. Chem. 287, 105-113 (2012)に記載されているプロトコールに従って、機能化したチップをNHS-PEG27-マレイミドリンカーを使用して誘導体化し、C末端に付加したPep7bが連結しているシステイン残基に共有結合させた。機能化後に、カンチレバーをPBSで洗浄し(3×5分)、AFM実験において使用するまで、4℃で、ウェル当たり2mlのPBSを含有するマルチウェルディッシュの個々のウェル中に保存した。250pNの加力、0.25秒の接触時間ならびに1μm/秒という一定の接近と引き離しの速度を使用して、力-距離曲線を1×1μm2の面積に対する32×32ピクセルアレイとして記録した。動的分子間力分光法による測定のために、カンチレバーの引き離し速度を以下のように変化させた:20nm/秒、100nm/秒、200nm/秒、1μm/秒、2μm/秒、10μm/秒および20μm/秒。典型的には、少なくとも2000の力-距離曲線を、特定の引き離し速度で、各カンチレバーごとに実施した。採取したデータをNanoscope Analysisソフトウェア(Bruker)を使用して分析した。各曲線の引き離しセグメントを分析し、非結合事象が接触点から5~50nmの間の距離で起こった場合、それらを特異的であると考えた。最小接着力をさらに使用して、結合の確率と構築力分布のヒストグラムを計算した。測定した相互作用のエネルギー地形を再構築するために、チップカンチレバーが表面に降下を開始する前の接着事象の傾きとして、負荷速度を力対時間曲線から計算した。次いで、負荷速度に関する力の依存度を動的分子間力分光法プロットにおいてプロットした。
GraphPadソフトウェアを使用して統計分析を実施した。データは平均±SDで表す。正規分布に従うデータ(STFアッセイおよびPLAアッセイ)の多重比較および単一比較に関する一元ANOVA(ポストホックダネット検定)およびスチューデントのt検定によって、ならびに非正規分布に従うデータ(CtAの定量)の多重比較に関するKruskal-Wallis(ポストホックダネット検定)によって、p値を計算した;*p<0.05;**P<0.01;***p<0.001。
2.1.Reckは、Frizzledに依存しないWnt7特異的受容体である。
Wnt/Fz結合の関係は乱雑であり、複数のWntが単一のWntに対して応答することが可能な個々のFzおよびいくつかのFzに対する結合に関して競合している。最近の結晶学の研究によって、Wnt/Fz相互作用の化学が、明確なWntとFzの対合と不適合であり、Wnt/Fzの接触は、保存された残基または同一の化学修飾によって支配されることが確認された(C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. Garcia, Science. 337, 59-64 (2012))。これらの観察によって、細胞が、対抗する生物学的機能を有することがある複数のWntリガンドの空間的かつ時間的な重複する発現パターンを解釈する方法についての疑問が生じる。
Wntリガンドは、高レベルの組換え体産生に対して悪名高く抵抗性であり、全長組換えWnt7とReckの間の無細胞生化学的または生物物理学的相互作用の研究を妨げる。
Wntリガンドは、リガンドのN末端ドメイン(NTD)のパルミトイル化した「サム」と「インデックス」のC末端ドメイン(CTD)の疎水性残基によって、球状のFzシステインリッチドメイン(CRD)をヒトの手でつまむことを連想させる2つのドメイン構造を採用する。Fz結合に関与する構造は、「サム」と「インデックス」の末端に主に位置する。2つのドメインは、NTDの可撓性ドメイン内リンカー領域を介して接続されている。
Reck自体は、原形質膜の唯一の外部のリーフレットに対するそのGPIアンカー方式のために、膜二重層にわたってWnt7シグナルを変換する可能性が限定されており、したがって、シグナル変換は、受容体複合体の他の構成成分、すなわち、Gpr124および/またはFz/Lrp5/6に依拠しなければならない。
FZ1~10 -/- HEK293T細胞において、N末端をFLAGでタグ付けしたGpr124とDvl-GFPの間で実施した同時免疫沈降実験によって、C末端のETTVの非存在下でも、Gpr124とDvlの間での相互作用が確認された(図5A)。Fzと異なり、Gpr124は、β-カテニン安定化の上流のWntシグナル伝達活性化の早期指標である、リン酸化Dvlレベルにおいて検出可能な増加を得なかった(S. I. Yanagawa, F. Van Leeuwen, A. Wodarz, J. Klingensmith, R. Nusse, Genes Dev. 9, 1087-1095 (1995);X. Huang et al., Science. 339, 1441-1445 (2013))(図5B)。このようなGpr124に誘導されるDvl活性化の非存在は、シグナル伝達欠損タンパク質としてGpr124を特定した図4の実験と一致した。まとめると、これらの実験は、そのWnt7シグナル伝達活性を媒介することができる構成的なGpr124の結合パートナーとしてDvlを特定する。
1.材料および方法
1.1.ゼブラフィッシュの系統
State of Belgium(プロトコール承認番号:CEBEA-IBMM-2017-22:65)の規則に従って、標準的な条件下で、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)を育成し取り扱った。以下の系統を使用した:Tg(-17.0neurog1:EGFP)w61(McGraw et al., J. Neurosci 28(47):12558-69 (2008))。
以下のスプライスブロッキングモルフォリノ(MO)(GeneTools、Eugene、OR)を1細胞段階において、胚に注射した:wnt7aa(TTCCATTTGACCCTACTTACCCAAT、6ng)。mMessage mMachine SP6 Kit(Ambion、Carlsbad、CA)を使用してNotlを消化した後、pCS2プラスミドから合成mRNAを転写し、1細胞段階のゼブラフィッシュの胚中に注射した。アフリカツメガエルのマイクロインジェクションでは、15pgのwnt7aまたはwnt7aK190Aまたはwnt7a1~278のmRNAを4細胞段階の胚の1つの腹側割球中に注射した。
Fz1(addgene 番号42253)およびFz5(addgene 番号42267)を除いて、全てのWntシグナル伝達の構成成分および他の発現コンストラクトは、In-Fusionクローニング(Takara、Mountain View、CA)を使用する組換えの後に、pCS2ベクターのCMVプロモーターから発現した。in-Fusionクローニングとタンデムに重複するPCR産物とを使用して、単一点突然変異の変異体および欠失体を生成した。全てのコンストラクトをシーケンシングによって確認した。
HEK293T細胞をATCC(CRL-3216)から入手し、HEK293 STF細胞株は、Jeremy Nathans(John Hopkins)によって好意により提供された。細胞を10%のウシ胎仔血清を補充したDMEM/F12培地(Lonza、Basel、Switzerland)中で培養し、5%のCO2で平衡化した、加湿したインキュベーター内で維持した。7B。
細胞を96ウェルプレート中にプレーティングし、24時間後に、Lipofectamine 2000(Invitrogen、Carlsbad、CA)によって3連でトランスフェクトした。ウェル当たりのトランスフェクトされるプラスミドDNAの量を各発現ベクターごとに最適化した:別段に指定されていなければ、ウミシイタケルシフェラーゼ(0.5ng)、Wnt(20ng)、Fz(5ng)、LRP(2.5ng)、Gpr124(10ng)、Reck(10ng)。DNAの総量を空のpCS2ベクターを用いてウェル当たり100ngに調整した。パッシブライシスバッファー(E1960、Promega、Wisconsin)中で細胞を収集し、トランスフェクションの48時間後に、Dual-Luciferase Reporter Assay系(E1960、Promega、Madison、Wisconsin)を使用して、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの活性を連続的に測定した。
ゼブラフィッシュの胚をLSM710共焦点顕微鏡を用いて画像化し、画像をImageJにおいて処理した。ゼブラフィッシュ発生の表現型の画像をLeica M165 FCで撮影した。アフリカツメガエルの幼生をOlympus SZX16で画像化した。
GraphPadソフトウェアを使用して統計分析を実施した。データは平均±SDを表す。正規分布に従うデータ(STFアッセイ)の多重比較および単一比較に関する一元ANOVA(ポストホックダネット検定)およびスチューデントのt検定によって、ならびに非正規分布に従うデータ(DRGの定量)の多重比較に関するKruskal-Wallis(ポストホックダネット検定)によって、p値を計算した;*p<0.05;**P<0.01;***p<0.001。
本発明者らは、実験1において、Reckが、Fzによって繋がったリガンドと異なる部位で、Wnt7a内のリンカーを認識することによって、Wntリガンドを識別することを特定した。よって、結合の機序は、Wnt7が、Fz、ReckおよびLRP5/6によって同時に繋がる、細胞内足場によってまとめられた高次のWnt7/Reck/Gpr124/Fz/LRP5/6複合体の形成と一致しているようである。本発明者らは、Wnt7aのN末端ドメイン(Wnt7a1~278)が依然としてReckに結合することをさらに明らかにした。
1.材料および方法
1.1.AAVプラスミドコンストラクト(AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190A-p2A-EGFP)の生成
pCAGプロモーターの調節エレメントの下に隣接するITR配列を含有するpAAV導入遺伝子ベクター中に、全長mWnt7aK190A変異体をクローニングした。Wnt7変異体は、自己切断するp2Aペプチドの中間体によってEGFPへの融合体として発現された。AAVベクターを産生し、HEK293細胞のpAAV導入遺伝子プラスミド、ヘルパープラスミド(AAV-PHP.eBカプシド変異体+rep+挿入配列をコードする)およびアデノウイルスヘルパープラスミドとの三重の同時トランスフェクションによって、Korbelin et al., 2016に記載されているように精製した。
AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190A-p2A-EGFPまたはAAV-PHP.eB対照ベクター(マウス1匹当たり1×1011vg)を含有する50μlの濃縮したベクター(マウス1匹当たり1×1011vg)を10匹のC57BL/6マウスの眼窩周囲静脈中に静脈内注射した。感染の2週間後に、CNS内皮細胞においてEGFPシグナルを評価し、導入遺伝子の発現を確認した。
GFPをコードするコンストラクトを使用して、マウスの脳における広範囲のトランスジェニック発現を実証した(図10A)。
1.材料および方法
1.1.AAVプラスミドコンストラクト(AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190S-p2A-EGFPおよびAAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190L-p2A-EGFP)の生成
AAVプラスミドコンストラクトを実施例3のセクション1.1に記載したように生成した。
動物実験を実施例3のセクション1.1に記載したように実施する。
1回拍出量の低減をマウスのWnt7aK190SまたはWnt7aK190Lを含むベクターを注射したマウスにおいて測定する。
1.材料および方法
AAVプラスミドコンストラクトを実施例3のセクション1.1に記載したように作成し、動物実験を実施例3のセクション1.1に記載したように実施する。
1回拍出量の低減をマウスのWnt7aQ48A、Wnt7aI51A、Wnt7aP56A、Wnt7aA58R、Wnt7aI59A、Wnt7aE64A、Wnt7aM68A、Wnt7aL70A、Wnt7aE72A、Wnt7aF75A、Wnt7aR81A、Wnt7aN83Q、Wnt7aV99A、Wnt7aI160A、Wnt7aF162A、Wnt7aK164A、Wnt7aF166A、Wnt7aI172A、Wnt7aR177A、Wnt7aR189A、Wnt7aK212A、Wnt7aR222A、Wnt7aK229A、Wnt7aK231A、Wnt7aV236A、Wnt7aE239A、Wnt7aR245A、Wnt7aK247A、Wnt7aP249A、Wnt7aK253A、Wnt7aI254A、Wnt7aY260A、Wnt7aP263A、Wnt7aT266A、Wnt7aE279A、Wnt7aR320A、Wnt7aW322A、Wnt7aT338AまたはWnt7aK349Aを含むベクターを注射したマウスにおいて測定する。
Claims (25)
- Gタンパク質共役型受容体(GPR)124/RECK/Frizzled/リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)媒介性Wntシグナル伝達を活性化することができる作用物質であって、RECKおよび/またはGPR124の非存在下でのFrizzled/LRP媒介性Wntシグナル伝達は活性化しない、作用物質。
- RECKおよびGPR124の存在下では細胞膜におけるFrizzledポリペプチドとLRPポリペプチドのヘテロマー形成(heteromerization)を誘導することができるが、RECKおよび/またはGPR124の非存在下での当該ヘテロマー形成を誘導することができない、請求項1に記載の作用物質。
- RECKおよびGPR124の存在下では細胞膜においてFrizzledポリペプチドとLRPポリペプチドに同時に結合することができるが、RECKおよび/またはGPR124の非存在下ではFrizzledポリペプチドとLRPポリペプチドに同時に結合することができない、請求項2に記載の作用物質。
- GPR124および/またはRECKポリペプチドに結合することができる、請求項1から3のいずれか一項に記載の作用物質。
- RECKポリペプチドに結合することができる、請求項1から4のいずれか一項に記載の作用物質。
- RECKポリペプチドのシステインノット4(CK4)領域、CK5領域、またはCK4領域およびCK5領域に結合することができる、請求項5に記載の作用物質。
- Frizzledポリペプチドのシステインリッチドメイン(CRD)に結合することができる、請求項1から6のいずれか一項に記載の作用物質。
- LRPポリペプチドのDKK結合性部位および/またはWnt結合性部位に結合することができる、請求項1から7のいずれか一項に記載の作用物質。
- 化学物質、抗体、抗体断片、抗体様タンパク質足場、タンパク質またはポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、光アプタマー、シュピーゲルマーおよび核酸からなる群を含むかまたはそれから選択され、好ましくはタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の作用物質。
- 前記作用物質が、RECK結合性ドメイン、Frizzled結合性ドメインおよびLRP結合性ドメインを含み、前記RECK結合性ドメイン、前記Frizzled結合性ドメイン、および前記LRP結合性ドメインが、Wnt7aポリペプチドまたはWnt7bポリペプチドなどのWnt7ポリペプチドに由来する、請求項1から9のいずれか一項に記載の作用物質。
- 前記RECK結合性ドメインが、
-アミノ酸配列HVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC(配列番号17)に対して少なくとも25%の配列同一性を有するアミノ酸配列;または
-アミノ酸配列VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT(配列番号18)に対して少なくとも25%の配列同一性を有するアミノ酸配列;または
-アミノ酸配列VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET(配列番号19)に対して少なくとも25%の配列同一性を有するアミノ酸配列;または
-アミノ酸配列XXXVXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXKXXXX(配列番号20)、VXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXK(配列番号21)、XXXVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXKXXXX(配列番号22)もしくはVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXK(配列番号23)であって、Xが任意のアミノ酸であり、好ましくはアミノ酸配列が配列番号18または配列番号19のいずれか1つに対して少なくとも50%の配列同一性を示す、アミノ酸配列
を含む、請求項10に記載の作用物質。 - Wnt7aポリペプチドまたはWnt7bポリペプチドの断片などの、Wnt7ポリペプチドの断片であるかまたはそれから本質的になる、請求項1から11のいずれか一項に記載の作用物質。
- 前記断片が、Wnt7ポリペプチドのN末端ドメイン(NTD)であるかまたはそれから本質的になる、請求項12に記載の作用物質。
- Wnt7aポリペプチドまたはWnt7bポリペプチドの変異体などの、Wnt7ポリペプチドの変異体である、請求項1から13のいずれか一項に記載の作用物質。
- - 配列番号24または配列番号51の17位に対応する位置のグルタミン(Q)残基が、グルタミン(Q)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の20位に対応する位置のイソロイシン(I)残基が、イソロイシン(I)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の25位に対応する位置のプロリン(P)残基が、プロリン(P)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の27位に対応する位置のアラニン(A)残基が、アラニン(A)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基、好ましくはアルギニン(R)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の28位に対応する位置のイソロイシン(I)残基が、イソロイシン(I)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の33位に対応する位置のグルタミン酸(E)残基が、グルタミン酸(E)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の37位に対応する位置のメチオニン(M)残基が、グルタミン酸(M)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の39位に対応する位置のロイシン(L)残基が、グルタミン酸(L)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の41位に対応する位置のグルタミン酸(E)残基が、グルタミン酸(E)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の44位に対応する位置のフェニルアラニン(F)残基が、フェニルアラニン(F)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の50位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の52位に対応する位置のアスパラギン(N)残基が、アスパラギン(N)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはグルタミン(Q)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の68位に対応する位置のバリン(V)残基が、バリン(V)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の129位に対応する位置のイソロイシン(I)残基が、イソロイシン(I)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の131位に対応する位置のフェニルアラニン(F)残基が、フェニルアラニン(F)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の133位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の135位に対応する位置のフェニルアラニン(F)残基が、フェニルアラニン(F)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の141位に対応する位置のイソロイシン(I)残基が、イソロイシン(I)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の146位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の158位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の159位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)、セリン(S)またはロイシン(L)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の181位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の191位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の198位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の200位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の205位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の205位に対応する位置のバリン(V)残基が、バリン(V)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の208位に対応する位置のグルタミン酸(E)残基が、グルタミン酸(E)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の214位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の216位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の218位に対応する位置のプロリン(P)残基が、プロリン(P)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の222位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の223位に対応する位置のイソロイシン(I)残基が、イソロイシン(I)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の229位に対応する位置のチロシン(Y)残基が、チロシン(Y)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の232位に対応する位置のプロリン(P)残基が、プロリン(P)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の235位に対応する位置のトレオニン(T)残基が、トレオニン(T)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の248位に対応する位置のグルタミン酸(E)残基が、グルタミン酸(E)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の289位に対応する位置のアルギニン(R)残基が、アルギニン(R)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の291位に対応する位置のトリプトファン(W)残基が、トリプトファン(W)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており;
- 配列番号24または配列番号51の307位に対応する位置のトレオニン(T)残基が、トレオニン(T)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されており、かつ/または
- 配列番号24または配列番号51の318位に対応する位置のリシン(K)残基が、リシン(K)以外の1つまたは複数のアミノ酸残基によって、好ましくはアラニン(A)残基によって置換されている、
請求項14に記載の作用物質。 - 請求項1から15のいずれか一項に記載の作用物質をコードする核酸であって、前記作用物質が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、核酸。
- プロモーターならびに/または転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルに作動可能に連結した、請求項16に記載の核酸を含む核酸発現カセット。
- ウイルスベクターなどの、請求項16に記載の核酸または請求項17に記載の核酸発現カセットを含むベクター。
- 請求項1から15のいずれか一項に記載の作用物質、請求項16に記載の核酸、請求項17に記載の核酸発現カセットまたは請求項18に記載のベクター、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1から15のいずれか一項に記載の作用物質、請求項16に記載の核酸、請求項17に記載の核酸発現カセット、請求項18に記載のベクターまたは請求項19に記載の医薬組成物。
- 神経血管機能不全を含む神経血管障害または中枢神経系(CNS)障害の予防または治療における使用のための、請求項1から15のいずれか一項に記載の作用物質、請求項16に記載の核酸、請求項17に記載の核酸発現カセット、請求項18に記載のベクターまたは請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記神経血管障害が、虚血性脳卒中、出血性卒中、虚血/再灌流傷害、脳動脈瘤、動静脈奇形(AVM)、海綿状血管奇形、血管炎、脳出血、くも膜下出血、脊髄血管奇形、頸動脈狭窄、もやもや病および頭蓋内アテローム性動脈硬化症、およびこれらの組合せからなる群から選択されるか、または、前記CNS障害が、多発性硬化症、虚血性脳卒中、脳がん、てんかん、認知症、血管性認知症、HIV-1関連認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、感染性脳疾患、外傷性脳損傷、片頭痛および慢性外傷性脳障害、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項21に記載の使用のための作用物質。
- 例えば神経血管機能不全を含む神経血管障害またはCNS障害の予防または治療に有用なものなどの、治療薬として有用な作用物質を同定するためのインビトロにおける方法であって、試験作用物質が、GPR124/RECK/Frizzled/LRP媒介性Wntシグナル伝達を活性化するが、RECKおよび/またはGPR124の非存在下でのFrizzled/LRP媒介性Wntシグナル伝達は活性化しないものであるかどうかを決定することを含む方法。
- - 試験作用物質を、GPR124/RECK/Frizzled/LRP媒介性Wntシグナル伝達を行うことができる細胞と接触させ、前記Wntシグナル伝達を測定すること、および
- 試験作用物質を、Frizzled/LRP媒介性Wntシグナル伝達を行うことはできるがGPR124/RECK/Frizzled/LRP媒介性Wntシグナル伝達を行うことができない細胞と接触させ、前記Wntシグナル伝達を測定すること
を含む、請求項23に記載のインビトロにおける方法。 - 試験作用物質がRECKポリペプチドに結合することができるかどうかを決定することをさらに含む、請求項23または24に記載のインビトロにおける方法。
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