KR20210005597A - Wnt 시그널링 작용제 분자 - Google Patents

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유니베르시테 리브레 드 브룩크젤즈
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Abstract

본 출원은 신규 치료제, 특히(GPR) 124/RECK/Frizzled/지방단백질 수용체 관련 단백질(LRP)-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제에 관한 것으로, 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124가 없는 경우 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않는다 . 본 발명의 제제는 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애의 예방 또는 치료에 특히 유용하다.

Description

WNT 시그널링 작용제 분자
본 발명은 의학적 분야에 광범위하게 있으며, 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 장애를 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애의 치료에 관한 것이다. 본 발명은 치료에 유용하고, 특히 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 신경 혈관 장애 또는 CNS 장애의 치료에 유용한, 신규한 Wnt 시그널링 작용제 분자 및 관련 생성물, 방법 및 용도를 제공한다.
Wnt 단백질은 동물 발달 및 성인 조직 항상성 동안 세포 간 통신을 매개하는 고도로 보존되고 분비되는 지질 변형 단백질의 큰 패밀리를 구성한다. 이들은 세포 증식, 분화, 이동, 아포토시스, 극성 및 유전적 안정성을 조절함으로써 다면 발현 기능을 발휘한다. 조절되지 않은 Wnt 시그널링 수준은 신경 퇴행과 같은 CNS 장애 및 암을 포함하는 넓은 범위의 인간 병리와 관련이 있다.
Frizzled(Fz) 계열의 10개 구성원은 Wnt 단백질에 대한 수용체 역할을 하는 7-패스 막 전위 단백질이다. Wnt 시그널링의 복잡성에 크게 기여하는 Wnt/Fz 바인딩 관계는, 여러 Wnt가 개별 Fz에 바인딩하기 위해 경쟁하고 주어진 Wnt에 응답할 수 있는 여러 Fz와 함께 복잡하다. 최근의 결정학적 연구는 Wnt/Fz 상호 작용 화학이 명백한 Wnt 및 Fz 쌍과 양립할 수 없고, Wnt와 Fz 사이의 접촉 부위가 엄격하게 또는 화학적으로 보존된 잔기에 의해 지배되고 있음을 확인하였다(Janda et al. Science 2012, vol. 337, 59-64). 이들 관찰은 세포가 다수의 Wnt 리간드로부터 동시 및 때때로 상충되는 신호 입력의 혼합된 발현 패턴을 어떻게 해석하는지에 대한 의문을 제기한다. 일부 생물학적 설정에서, 세포는 모든 신호 입력을 비차별적으로 통합할 수 있고, 기능적으로 뒤얽힌 세포 내 시그널링 캐스케이드에 의한 조정된 해석뿐만 아니라 그들의 총 순 균형을 고려함으로써 적절한 반응을 유발할 수 있다. 그러나 다른 생물학적 공정은 복잡한 Wnt/Fz 발현 환경에도 불구하고 놀랍게도 엄격한 Wnt 리간드 선택성을 나타낸다.
포유동물 전뇌 및 복부 척수의 뇌 혈관 발달은 Wnt7a 및 Wnt7b의 독점적 제어하에 작동하므로 고도로 선택적 Wnt 반응 과정의 패러다임으로 작용한다. 신경 전구 세포 유래 Wnt7에 반응하고 Wnt/β-카테닌 시그널링을 활성화시키기 위해, 뇌 내피세포는 G 단백질-결합 수용체의 접착 등급의 고아원인 Gpr124 및 GPI-정착된 당 단백질 Reck을 발현해야 한다(Vanhollebeke et al. Elife 2015, vol. 4, 1-25). 또한, 배양된 세포에서 발현될 때, Gpr124 및 Reck는 Wnt7-특이적 반응을 물리적으로 상호 작용하고 상승적으로 자극한다.
중요하게도, 내피 Wnt/β-카테닌 시그널링은 혈액-뇌 장벽(BBB) 생리학의 중요한 조절자이며, 배아 발생 동안 CNS 혈관 네트워크의 확장 및 성숙을 제어하고 성인의 BBB 유지에 기여한다. BBB 기능 장애가 여러 신경계 질환에 오랫동안 관련되어 왔지만, 최근의 증거에 따르면 기능 장애 BBB에서 Wnt/β-카테닌 신호의 급격한 자극이 마우스의 허혈성 뇌졸중과 뇌암을 현저히 개선하기에 충분하다는 것이 시사되었다. 따라서, 다른 Frizzled 경로와 실질적으로 교차-반응하지 않고 뇌 내피세포에서 Wnt/β-카테닌 시그널링을 자극할 수 있는 요법은 다양한 신경계 장애의 치료에 매우 유리할 것이다.
본 발명은 적어도 부분적으로 Wnt7 리간드에 선택적으로 반응하기 위해 세포에 의해 사용된 최초의 "Wnt 디코딩 모듈"의 발견 및 특성에 기초한다. 특히, 본 명세서에 특징 지어진 Wnt 디코딩 모듈에서, 선택성은 RECK에 의해 부여되며, 이는 Frizled-독립적인 방식으로 Wnt7-특이적 결합을 매개한다. Frizzled 시그널링을 위한 Wnt7 가용성은, RECK-바운드 Wnt7과 세포 내 흐트러진(Dvl) 스캐폴드 사이의 시그널링-결함 막-횡단 사슬로서 작용하는 RECK 결합 파트너인, GPR124에 의존한다. Frizzled와 GPR124를 가교함으로써 Dvl 폴리머는 리간드-특이적 RECK/Gpr124/Frizzled/LRP 세포신호전달체를 조립한다. 따라서, 본 발명자들은 Dvl 중합체에 의한 Frizzled 및 GPR124의 동시 결합 및 Wnt7과 RECK의 특이적 결합을 통해 리간드-특이적 Wnt 세포신호전달체 내에서 고차 RECK/GPR124/Frizzled/LRP 수용체 복합체가 형성되는 모델을 제안한다.
이 새로운 기전을 밝혀낸 이후, 추가의 연구에 따르면 RECK 및 GPR124를 발현하는 세포에서 Wnt 시그널링을 선택적으로 활성화할 수 있는 신규 제제가 예기치 않게 밝혀질 수 있으며, 이러한 제제는 치료제, 특히 신경 혈관 영향을 동반하는 CNS 장애, 특히 뇌졸중, 다발성 경화증, 뇌암, 간질 및 신경 변성 장애의 치료에 유용한 치료제이다
따라서, 한 측면은 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화할 수 있는 제제를 제공하며, 여기서 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에서는 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화하지 않는다.
특정 실시 양태에서, 상기 제제는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 따라서, 또 다른 측면은 상기 제제를 코딩하는 핵산을 제공하며, 여기서 상기 제제는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드이다.
추가의 측면은 프로모터 및/또는 전사 및 번역 조절 신호에 작동 가능하게 연결된 상기 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트를 제공한다. 상기 핵산 또는 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터가 또한 제공된다.
또 다른 측면은 상기 제제, 상기 핵산 또는 핵산 발현 카세트 또는 상기 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 측면은 의약으로서 사용하기 위한 상기 제제, 상기 핵산 또는 핵산 발현 카세트, 상기 벡터 또는 상기 약제학적 조성물을 제공한다.
신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 제제, 상기 핵산 또는 핵산 발현 카세트, 상기 벡터 또는 상기 약제학적 조성물이 또한 제공된다.
또 다른 측면은 치료제로서 유용한 제제, 예를 들어 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 CNS 장애의 예방 또는 치료에 특히 유용한 제제를 확인하기 위한 시험관 내 방법을 제공하며, 상기 방법은 시험 제제가 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링를 활성화시키고 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않는지를 측정하는 것을 포함한다.
본 발명의 이들 및 추가의 양태 및 바람직한 실시 예는 다음 섹션 및 첨부된 청구 범위에 기재되어 있다. 첨부된 청구 범위의 주제는 본 명세서에 구체적으로 포함된다.
도 1은 (a) 비-침투 WT, FZ1-10 -/-, LRP5-/-; LRP6-/- 및 GPR124-/-, RECK-/- 세포에서 일시적으로 발현된 Wnt7a-V5 또는 Wnt3a-V5의 항-V5 면역 염색을 나타낸다. (b) Wnt7a-V5 및 표시된(공)-수용체를 일시적으로 공동 발현하는 GPR124-/-; RECK-/- 세포에서의 (a)와 동일하다. (c) 삼중(1: 1: 1) 공동 배양에서 리간드 포획 분석. Fz5로 형질감염되고 표시된 대로 다양한(공)-수용체로 형질감염된 FZ1-10 -/-/-HEK293T 경쟁 세포의 존재 하에 공 배양된 Wnt7a 또는 Wnt3a 방출 세포에 의해 파라 크린 방식으로 자극된, HEK293-STF 리포터 세포의 수퍼 탑-플래시 루시페라제(STF) 활성. (d) Wnt7a-V5 및 HA-Reck 또는 GPR124-/-; RECK-/- 세포에서 공 발현된 그의 변이체를 표적으로 하는 항-V5 및 항-HA 일차 항체를 사용하여 현장 PLA의 PLA 신호의 정량. (e) Wnt7a-V5에 대해 명시된 항-V5 및 항-HA 1차 항체 및 GPR124-/-; RECK-/-에 공동-발현된 표시된 HA-표지된(공)-수용체를 사용하여 현장 PLA의 PLA 신호의 정량화. 스케일 바: 10 ㎛. (f) Wnt7a-V5 또는 Wnt3a-V5로 공-형질감염된 GPR124-/-; RECK-/- 세포 및 Gpr124가 없는 경우 (x축) 및 있는 경우 (y-축) 표시된 HA-표지된 Reck 변이체의 항-V5/항-HA PLA 신호의 정량화. (g) Reck의 개략도 및 Gpr124 및 Wnt7 결합 모티프. * p <0.05, *** P <0.001; 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 2는 (a) GPR124-/-; RECK-/- 세포 공동 발현 HA-Reck에서 항-V5 및 항-HA 1차 항체를 사용하여 (b)에서 정량화된 PLA에서 조사된, V5-태그된 Wnt7a 변이체 및 패러로그인 Wnt7a의 도식적 표현을 나타낸다. (c) 101 개의 상이한 단일-잔류 변이체 Wnt7a의 시그널링의 HEK293-STF 세포에서의 Gpr124/Reck-의존적 상대 STF 루시페라제 활성 및 Wnt7a 구조에서의 위치(아래 x-축 및 구조 모델). 상대 루시페라제 활성은 WT Wnt7a 값으로 정규화된다. 모든 Wnt7a 잔기는 알라닌으로 돌연변이되고, 알라닌 잔기는 아르기닌으로 변화될 것으로 예상된다. (d) 척추 동물 계통군에 걸친 Wnt7 링커 도메인의 정렬. Mm, Mus musculus; Gg, Gallus gallus; Xl, Xenopus laevis; Dr, Danio rerio. Gpr124/Reck-의존적 시그널링이 10% 미만으로 감소된 8 개의 Wnt7a 변이체(아미노산 영역 pWnt7a 238-266에 속함)가 밑줄로 표시되어 있다. 상응하는 단일-잔류 변이체의 활성 및 이의 활성 클래스는 (c)에서 측정된다. Mm Wnt3a 및 4중 Wnt7a 변이체(Wnt74A) 링커 영역의 서열은 다음과 같다. (e) Wnt7a-V5 또는 Wnt7a4A-V5와 HA-Reck 사이의 항-V5/HA PLA. 리간드 분비는 연속 희석된 세포 상청액의 반 정량적 항-V5 도트 블롯 분석에 의해 평가되었다. 로딩 대조군으로서 폰세오(Ponceau) S 염색을 사용하였다. 스케일 바, 10 ㎛. * P <0.05, *** P <0.001; 데이터는 평균 ± SD(f)를 나타낸다. 등온 적정 열량 측정법(ITC)을 사용하여 정제된 재조합 Reck-CK-Fc와 합성 pWnt7a 펩티드 사이의 상호 작용을 조사한다. 재조합 Reck-CK-Fc 내로의 pWnt7a, pWnt7a4A 및 pWnt3a의 ITC(상부 판넬). pWnt7b로의 Reck-CK-Fc, Reck-CKΔCK1-Fc, Reck-CKΔCK2-Fc, Reck-CKΔCK3-Fc, Reck-CKΔCK4-Fc 및 Reck-CKΔCK5-Fc의 ITC(중간 및 하단 패널) (g) SMFS를 사용하여 Reck-CK-Fc/pWnt7b 상호 작용을 조사. 힘-거리 곡선 기반 원자력 현미경(FD-기반 AFM)의 원리가 도시되어 있다. pWnt7b 펩티드에 융합된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스페이서로 관능화된 AFM 팁이 접근하여 Reck-CK-Fc로 코팅된 표면으로부터 후퇴된다.
도 3은 (a) LRP5/6에서의 CRISPR/Cas9 프로토 스페이서 인접 모티프(PAM) 부위의 개략도(왼쪽 패널) 및 STF 리포터 플라스미드 및 Reck/Gpr124-의존적 Wnt7a 시그널링 또는 Gpr124/Reck의 독립적인 Wnt1 시그널링을 자극하는 플라스미드의 명시된 조합으로 형질감염 후 48시간에 WT HEK293T 세포 또는 LRP5-/-; LRP6-/- 이중 돌연변이체 LRP5-/-; LRP6-/- HEK293T 세포 클론에서의 루시페라제 활성을 보여준다. (b) 공동-발현된 Dkk-1의 존재 또는 부재 하에 WT HEK293T 세포에서 Gpr124/Reck-의존적 및-독립적 시그널링의 STF 활성. (c) STF 리포터 플라스미드 및 Reck/Gpr124-의존적 Wnt7a 시그널링 또는 Gpr124/Reck의 독립적인 Wnt1 시그널링을 자극하는 플라스미드의 명시된 조합으로 형질감염 후 48시간에 WT HEK293T 세포 또는 FZ 돌연변이체 HEK293T 세포 클론에서 루시페라제 활성. (d) Fz CRD 내의 CRISPR/Cas9 PAM 사이트의 개략도. (e) 표시된 Fz 또는 Fz CRD 변이체와의 동시 형질감염 후 FZ1-10-/- HEK293T에서 Gpr124/Reck-의존적 시그널링의 STF 활성. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 4는 (a) Gpr124 및 그의 도메인 변이체의 개략도를 보여준다. (b) 100 pg의 명시된 RNA가 주입된 WT 및 gpr124 돌연변이체 배아의 60 hpf 뇌 혈관 형성물의 대표적인 3D 와이어 다이어그램. 검은 색 혈관은 GPR124/Reck 의존성 뇌내 CtA를 나타내며 이것은 회색 골막 원위 후뇌 채널(PHBC)에서 발아한다. (c) 60 hpf gpr124 morphant 배아의 후뇌 중앙 동맥(CtAs)은 100 pg 명시된 mRNA로 1-세포 단계에서 주입된다. (d) Reck, Fz1, Wnt7a 및 명시된 Gpr124 변이체와 공동-형질감염된 HEK293-STF 세포의 상대적인 루시페라제 활성. *** p <0.001; 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다. (e) 60 hpf gpr124 morphant 배아의 후뇌 CtAs은 100 pg 명시된 mRNA로 1-세포 단계에서 주입된다. *** P <0.001; 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 5는 (a) Dpr-GFP 및 N-말단 FLAG-태깅된 버전의 Gpr124 또는 그의 ICD 변이체를 공동-발현하는 세포의 총 용해물에서 항-FLAG 공동-면역 침전 분석을 도시한다. (b) 명시된 플라스미드 조합으로 형질감염된 FZ1-10-/- 및 WT HEK293T 세포로부터 용해된 전체 세포에서 DVL2 및 p-DVL2(T224)의 면역 블롯. 인산화된 DVL2(T224)는 항-DVL2 항체(화살표 끝)를 갖는 서서히 이동하는 밴드로서 또는 명시된 바와 같이 구조물의 상이한 조합의 형질감염 48시간 후 수득된 전체 세포 추출물에서 포스포트레오닌 224(p-DVL2)를 인식하는 포스포 특이적 항체에 의해 검출될 수 있다. (c) 개별적으로 또는 제브라피시 포배 심층(DEL) 세포에서 Dvl의 존재 하에 발현된 Fz4-GFP 및 Gpr124-tagRFP의 세포 내 분포. (d) 제브라피시 포배 DEL에서 Fz4 또는 Gpr124와 함께 발현된 Dvl-GFP의 세포 내 분포 세포. (e) 제브라피시 포배 DEL 세포에서 Dvl의 부재 또는 존재 하에 공-발현된 Fz4-GFP 및 Gpr124-tagRFP의 세포 내 분포. 별표로 주석이 달린 세포는 오른쪽 패널에서 확대되고 a에서 b까지의 세포 피질을 따르는 가상 시계 방향 경로를 따라 녹색 및 빨간색 채널의 픽셀 강도가 아래에 표시된다. (f) EVL 세포의(e)와 동일한다. (g) Dvl 과발현의 존재 또는 부재에서 Gpr124-VN155(I152L) 및 Fz1-VC155를 발현하는 제브라피시 DEL 세포에서의 BiFC 신호. *** P <0.001; 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 6은 Gpr124/Reck-의존적 Wnt7-특이적 Fz 시그널링에 대한 예시적인 통합 모델을 나타낸다.
도 7은 (a) 상이한 Wnt7 변이체로 자극된, Fz5 의존성 경로(연회색, Fz5 형질감염) 또는 Gpr124/Reck 의존성 경로(검정색, Gpr124, RECK 및 Fz1 형질감염)의 HEK293-STF 세포에서의 상대 루시페라제 활성을 나타낸다. (b) Wnt7a의 101 개의 상이한 단일-잔류 변이체의 시그널링의 HEK293-STF 세포에서의 Gpr124/Reck-의존성 및 Fzd5 상대 STF 루시페라제 활성. 상대 루시페라제 활성은 WT Wnt7a 값으로 정규화된다. Wnt7a의 42 가지 단일-잔기 변이체는 야생형 Wnt7a 의 Gpr124/Reck/Fz/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성의 35% 이상까지 Gpr124/Reck/Fz/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킨다(직사각형 상자). (c) Gpr124/Reck 경로의 선택적 활성화를 나타내는 Wnt7a의 42 가지 단일-잔기 변이체의 시그널링의 HEK293-STF 세포에서의 Gpr124/Reck-의존적 및 Fzd5 상대 STF 루시페라제 활성. (d) 10개의 Fz 유전자 모두에 의한 Wnt7a 또는 Wnt7a1-278 또는 Wnt7aK190A의 공동 형질감염 후HEK-STF에서의 상대 루시페라제 활성. (e) 명시된 용량으로 Wnt7a 또는 Wnt7a1-278 또는 Wnt7aK190A mRNA로 1-세포 단계에서 주입된 3개의 dpf 유생의 측면도. (f)(d)의 3 dpf 유생의 표현형 스코어링. (g) 15 pg의 명시된 mRNA로 4-세포 배아의 하나의 복부 모세포종에 주입된 단계 36의 손톱개구리 배아의 등쪽 도면. 이차 축 형성의 분율(화살표 끝)은 각 조건에 대해 표시된다. (h) 명시된 mRNA로 1-세포 단계에서 주입된 72 hpf Wnt7aa morphant 유생의 트렁크 DRG. Tg(neurog1: GFP) DRG의 대표 이미지가 오른쪽에 표시된다. *** P <0.001; 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 8은 본원에 교시된 바와 같은 인간 Wnt7a 변이체의 아미노산 서열을 보여준다. 아미노산 치환 대 야생형 Wnt7a NTD 도메인 또는 전장 Wnt7a는 굵고 밑줄 친 글꼴로 표시된다.
도 9는 Wnt7aK190A 및 Wnt7a1-278의 형질전환 내피 발현이 GPR124/RECK-의존적 뇌 혈관 형성을 유발하고 Wnt7aa-/- 제브라피시에서 혈액-뇌 장벽을 회복시키는 것을 보여준다. (a) 60 hpf WT 또는 Wnt7aa-/- Tg(kdrl: EGFP) 배아의 대뇌 혈관의 등쪽 도면. Wnt7a-/- 돌연변이체에서 뇌내 CtA는 부족하다. Wnt7, Wnt7aK190A 또는 Wnt7a1-278은 내피-특이적 kdrl(혈관 내피 성장 인자 수용체 kdr-유사) 프로모터의 제어하에 Wnt7aa-/- 배아의 내피에서 일시적으로 발현되었다. Wnt7 리간드는 형질전환 마커로서 사용된 BFP(청색 형광 단백질)를 갖는 비스시스트로닉 구조물로서 발현되었다. 주입되지 않은 배아와 대조적으로, Wnt7, Wnt7aK190A 또는 Wnt7a1-278은 (b)에서 정량된 바와 같이 Wnt7aa-/- 돌연변이체에서 후뇌 CtA 형성을 회복시킨다. (c) 60 hpf Wnt7aa-/- 배아에서 Wnt7, Wnt7aK190A 및 Wnt7a1-278의 형질전환 발현 후 CtA의 항-GLUT1 염색. 형질전환 발현은 (a)에서와 같이 달성되었다. 이 데이터는 발견되지 않은 Wnt7aK190A 또는 Wnt7a1-278 제제가 Gpr124/Reck-의존적 과정에서 생체 내에서 활성임을 입증한다.
도 10은 뇌졸중 마우스 모델에서 GPR124/RECK-기반 유전자 요법을 나타낸다. AVV-PHP.eB 바이러스를 사용하여 8 주령 마우스의 뇌에 Wnt7aK190A 또는 상응하는 빈 AAV 대조군(Ctrl)을 전달하였다. (a) AAV-PHP.eB(AAV-PHP.eB-CAG-EGFP)를 인코딩하는 GFP를 사용하여 마우스 뇌(8 주령 마우스, 주입 후 2 주)에서 광범위한 형질전환 발현을 입증하였다. CAG 프로모터는 포유동물 발현 벡터에 사용되는 강력한 합성 프로모터이다. 왼쪽 패널, 손상되지 않은 고립된 뇌의 오른쪽 등쪽 도면, 오른쪽 패널 시상면 섹션. 항-CD31로 절편을 염색하여 혈관 구조를 표지하였다. (b) 2 주 전에 1.1011 AAV-PHP.eB-CAG-Wnt7aK190A-p2A-EGFP 바이러스 입자의 정맥 주사는 tMCAO(일시적 중뇌 동맥 폐색, 뇌졸중 모델) 뇌졸중 부피(mm3)를 감소 시켰으며, 발견된 제제는 전임상 모델에서 뇌졸중을 개선한다는 것을 입증했다. AAV-PHP.eB-CAG-EGFP 바이러스를 대조군으로 사용하였다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "한" 및 "그"는 문맥 상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 단수 및 복수 지시자를 모두 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "포함하는", "포함한" 및 "포함되는"은 "함유하는", "함유한" 또는 "함유되는"과 동의어이며, 포괄적이거나 개방적인 것이며 추가의 인용된 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어는 또한 "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는"을 포함하며, 이는 특허 용어에서 잘 확립된 의미이다.
종말 점에 의한 수치 범위의 인용은 인용된 종말 점뿐만 아니라 각각의 범위 내에 포함된 모든 수 및 분율을 포함한다.
매개 변수, 양, 시간적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 지정된 값의 변형, 예컨대 +/-10% 이하, 바람직하게는 +/-5% 이하, 보다 바람직하게는 +/-1% 이하, 더욱 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 변형을, 이러한 변형이 적절하기만 하다면, 포함한다. 변형 "약"이 지칭하는 값 자체도 또한 구체적이고 바람직하게는 개시되어 있는 것으로 이해되어야 한다.
하나 이상의 구성원 또는 하나 이상의 구성원 그룹의 하나 이상의 구성원과 같은 용어 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 그 자체로 명백하지만, 추가의 예시에 의해 용어는 특히 참조를 포함한다. 예를 들어, 상기 구성원의 임의의 ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 또는 ≥7 등과 같은 상기 구성원 중 어느 하나 또는 상기 둘 이상의 임의의 구성원, 및 상기 모든 구성원까지를 지칭할 수 있다. 다른 예에서, "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상을 지칭할 수 있다.
본 발명의 배경에 대한 논의는 본 발명의 내용을 설명하기 위해 포함된다. 이는 언급된 자료 중 어느 것이든 청구의 우선순위 날짜에 따라 어느 국가에서든 공개, 알려진 또는 일반적인 지식의 일부라는 인정으로 간주되어서는 안된다.
본 개시 전반에 걸쳐, 다양한 공개, 특허 및 공개된 특허 명세서가 식별 인용에 의해 참조된다. 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 특히, 본 명세서에서 구체적으로 언급된 이러한 문서의 교시 또는 단락은 참조로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 기술적 및 과학적 용어를 포함하여 본 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 추가의 안내에 의해, 용어 정의가 본 발명의 교시를 보다 잘 이해하기 위해 포함된다. 특정 용어가 본 발명의 특정 측면 또는 본 발명의 특정 실시 양태와 관련하여 정의될 때, 이러한 의미는 달리 정의되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐, 즉 본 발명의 다른 측면 또는 실시 양태와 관련하여 적용되도록 의도된다. .
하기 구절에서, 본 발명의 상이한 측면 또는 실시 양태가 보다 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각각의 양태 또는 실시 형태는 달리 명확하게 표시되지 않는 한 임의의 다른 양태 또는 실시 형태(들)와 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 명세서 전체에서 "일 실시 예", "실시 예"는 실시 예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시 예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체의 다양한 곳에서 "일 실시 예에서" 또는 "실시 예에서"라는 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시 예를 지칭하는 것은 아니지만, 가능할 수 있다. 또한, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시 예에서 본 개시로부터 당업자에게 명백한 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 일부 실시 예는 다른 실시 예에 포함된 일부 특징은 포함하고 다른 특징을 포함하지 않지만, 다른 실시 예의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있고, 당업자가 이해하는 바와 같이 다른 실시 예를 형성하는 것을 의미한다. 예를 들어, 첨부된 청구 범위에서, 청구된 실시 예 중 임의의 것이 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명자들은 Frizzled에 결합하는 능력에서 대체로 동의어인 Wnt 리간드를 구별할 수 있는 최초의 "Wnt 디코딩 모듈"을 특징으로 하여, 조직 발달 및 항상성을 조정하기 위해 세포가 Wnt 시그널링 입력의 복잡성을 해석하는 것을 돕는다. 본 명세서에서 특징화된 Wnt 디코딩 모듈에서, 선택성은 RECK에 의해 부여되며, 이는 Frizled-독립적인 방식으로 Wnt7-특이적 결합을 매개한다. RECK 결합 파트너인 G-단백질 연결 수용체 GPR124는 세포 내 Dishevelled(Dvl)을 동원할 수 있는 시그널링 결핍 막 횡단 단백질로서 작용한다. Dvl 스캐폴드는 GPR124 및 Frizzled를 브릿지하여 Wnt7 리간드-특이적 RECK/GPR124/Frizzled/지단백질 수용체-관련 단백질(LRP) 세포신호전달체를 조립한다.
본 발명자들은 또한 예기치 않게 RECK 및 GPR124를 발현하는 세포에서 Wnt 시그널링을 선택적으로 활성화할 수 있는 신규 제제의 설계를 입증하였으며, 이러한 제제는 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 장애를 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애, 특히 뇌졸중, 다발성 경화증 및 뇌암을 포함하는 장애의 치료와 같은 치료제로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 특히 다른 Frizzled 경로와의 교차반응성 없이 뇌 내피세포에서 Wnt/β-카테닌 시그널링을 자극할 수 있고 특히 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애에 대한 치료제로서 유용한 신규한 제제를 제공할 수 있게 한다.
따라서, 한 측면은 GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제를 제공하며, 여기서 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개된 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않는다 .
임의의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산에 대한 언급은 당 업계의 각각의 명칭에 따라 일반적으로 공지된 각각의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산을 나타낸다. 보다 구체적으로, "G-단백질 커플링된 수용체 124"(GPR124), "카잘 모티프를 갖는 복귀 유도 시스테인-풍부 단백질"(RECK), "Frizzled"(FZD) 또는 "지단백질 수용체-관련 단백질"(LRP)은 당 업계의 상기 명칭하에서 일반적으로 알려진 바와 같이, 문맥으로부터 명백한 바와 같이 각각의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산을 나타낸다.
상기 용어는 생체 샘플의 일부를 형성할 때, 생물체, 기관, 조직 또는 세포의 일부를 형성할 때뿐만 아니라 이러한 공급원으로부터 적어도 부분적으로 분리될 때의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산을 포함한다. 상기 용어는 또한 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 때 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산을 포함한다.
문맥에서 달리 명백하지 않으면, 본원에서 임의의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산에 대한 언급은 상기 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산의 변형된 형태, 예를 들어 인산화, 글리코실화, 지질화, 메틸화, 시스테인화, 설폰화, 글루타치오닐화, 아세틸화, 메티오닌의 메티오닌 설폭사이드 또는 메티오닌 설폰으로의 산화 등을 포함하는 발현 후 변형을 갖는 형태를 포함한다.
추가의 안내에 의해, G 단백질-결합 수용체 124는 당 업계에서 접착 G 단백질-커플링된 수용체 A2(ADGRA2) 또는 종양 내피 마커 5(TEM5)로도 알려져 있다. 예를 들어, 인간 GPR124 유전자는 NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 유전자 ID 25960로 등재되어 있다. 인간 GPR124 mRNA는 NCBI Genbank 수탁 번호 NM_032777.9로 등재되어 있다. NM_032777.9의 뉴클레오티드 387(시작 코돈) 내지 4403(정지 코돈)은 GPR124 코딩 서열을 구성한다. 인간 GPR124 단백질 서열은 NCBI Genbank 수탁 번호 NP_116166.9 및 Uniprot(www.uniprot.org) 수탁 번호 Q96PE1-1로 등재되어 있고, 아래에서 추가로 재현된다(서열 번호 1):
> NP_116166.9 접착 G 단백질 결합 수용체 A2 전구체 [호모 사피엔스]
MGAGGRRMRGAPARLLLPLLPWLLLLLAPEARGAPGCPLSIRSCKCSGERPKGLSGGVPGPARRRVVCSGGDLPEPPEPGLLPNGTVTLLLSNNKITGLRNGSFLGLSLLEKLDLRNNIISTVQPGAFLGLGELKRLDLSNNRIGCLTSETFQGLPRLLRLNISGNIFSSLQPGVFDELPALKVVDLGTEFLTCDCHLRWLLPWAQNRSLQLSEHTLCAYPSALHAQALGSLQEAQLCCEGALELHTHHLIPSLRQVVFQGDRLPFQCSASYLGNDTRIRWYHNRAPVEGDEQAGILLAESLIHDCTFITSELTLSHIGVWASGEWECTVSMAQGNASKKVEIVVLETSASYCPAERVANNRGDFRWPRTLAGITAYQSCLQYPFTSVPLGGGAPGTRASRRCDRAGRWEPGDYSHCLYTNDITRVLYTFVLMPINASNALTLAHQLRVYTAEAASFSDMMDVVYVAQMIQKFLGYVDQIKELVEVMVDMASNLMLVDEHLLWLAQREDKACSRIVGALERIGGAALSPHAQHISVNARNVALEAYLIKPHSYVGLTCTAFQRREGGVPGTRPGSPGQNPPPEPEPPADQQLRFRCTTGRPNVSLSSFHIKNSVALASIQLPPSLFSSLPAALAPPVPPDCTLQLLVFRNGRLFHSHSNTSRPGAAGPGKRRGVATPVIFAGTSGCGVGNLTEPVAVSLRHWAEGAEPVAAWWSQEGPGEAGGWTSEGCQLRSSQPNVSALHCQHLGNVAVLMELSAFPREVGGAGAGLHPVVYPCTALLLLCLFATIITYILNHSSIRVSRKGWHMLLNLCFHIAMTSAVFAGGITLTNYQMVCQAVGITLHYSSLSTLLWMGVKARVLHKELTWRAPPPQEGDPALPTPSPMLRFYLIAGGIPLIICGITAAVNIHNYRDHSPYCWLVWRPSLGAFYIPVALILLITWIYFLCAGLRLRGPLAQNPKAGNSRASLEAGEELRGSTRLRGSGPLLSDSGSLLATGSARV GTPGPPEDGDSLYSPGVQLGALVTTHFLYLAMWACGALAVSQRWLPRVVCSCLYGVAASALGLFVFTHHCARRRDVRASWRACCPPASPAAPHAPPRALPAAAEDGSPVFGEGPPSLKSSPSGSSGHPLALGPCKLTNLQLAQSQVCEAGAAAGGEGEPEPAGTRGNLAHRHPNNVHHGRRAHKSRAKGHRAGEACGKNRLKALRGGAAGALELLSSESGSLHNSPTDSYLGSSRNSPGAGLQLEGEPMLTPSEGSDTSAAPLSEAGRAGQRRSASRDSLKGGGALEKESHRRSYPLNAASLNGAPKGGKYDDVTLMGAEVASGGCMKTGLWKSETTV
추가 지침에 의해, RECK(카잘 모티프를 갖는 역전-유도 시스테인-풍부 단백질)는 또한 종양 형성 억제 단백질(ST15)의 억제제로 알려져 있다. 예를 들어, 인간 RECK 유전자는 NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 유전자 ID 8434로 등재되어 있다. 인간 RECK mRNA(transcript variant 1)는 NCBI Genbank 수탁 번호 NM_021111로 등재되어 있다. 2. NM_021111.2의 뉴클레오티드 87(시작 코돈) 내지 3002(정지 코돈)는 RECK 코딩 서열을 구성한다. 인간 RECK 단백질 서열은 NCBI Genbank 수탁 번호 NP_066934.1 및 Uniprot 수탁 번호 O95980-1로 등재되어 있고, 아래에서 추가로 재현된다(서열 번호 2):
> NP_066934.1 카잘 모티프 동형단백질 1 전구체가 있는 복귀 유도 시스테인이 풍부 단백질 [호모 사피엔스]
MATVRASLRGALLLLLAVAGVAEVAGGLAPGSAGALCCNHSKDNQMCRDVCEQIFSSKSESRLKHLLQRAPDYCPETMVEIWNCMNSSLPGVFKKSDGWVGLGCCELAIALECRQACKQASSKNDISKVCRKEYENALFSCISRNEMGSVCCSYAGHHTNCREYCQAIFRTDSSPGPSQIKAVENYCASISPQLIHCVNNYTQSYPMRNPTDSLYCCDRAEDHACQNACKRILMSKKTEMEIVDGLIEGCKTQPLPQDPLWQCFLESSQSVHPGVTVHPPPSTGLDGAKLHCCSKANTSTCRELCTKLYSMSWGNTQSWQEFDRFCEYNPVEVSMLTCLADVREPCQLGCRNLTYCTNFNNRPTELFRSCNAQSDQGAMNDMKLWEKGSIKMPFINIPVLDIKKCQPEMWKAIACSLQIKPCHSKSRGSIICKSDCVEILKKCGDQNKFPEDHTAESICELLSPTDDLKNCIPLDTYLRPSTLGNIVEEVTHPCNPNPCPANELCEVNRKGCPSGDPCLPYFCVQGCKLGEASDFIVRQGTLIQVPSSAGEVGCYKICSCGQSGLLENCMEMHCIDLQKSCIVGGKRKSHGTSFSIDCNVCSCFAGNLVCSTRLCLSEHSSEDDRRTFTGLPCNCADQFVPVCGQNGRTYPSACIARCVGLQDHQFEFGSCMSKDPCNPNPCQKNQRCIPKPQVCLTTFDKFGCSQYECVPRQLACDQVQDPVCDTDHMEHNNLCTLYQRGKSLSYKGPCQPFCRATEPVCGHNGETYSSVCAAYSDRVAVDYYGDCQAVGVLSEHSSVAECASVKCPSLLAAGCKPIIPPGACCPLCAGMLRVLFDKEKLDTIAKVTNKKPITVLEILQKIRMHVSVPQCDVFGYFSIESEIVILIIPVDHYPKALQIEACNKEAEKIESLINSDSPTLASHVPLSALIISQVQVSSSVPSAGVRARPSCHSLLLPLSLGLALHLLWTYN
"Frizzled" 또는 "FZD" 또는 "FZ"라는 용어는 Frizzled 계의 모든 구성원을 포함한다. 추가 지침을 통해, 표 1은 NCBI Genbank 및 Uniprot에 등재된 10명의 알려진 인간 Frizzled 계 구성원을 나타낸다.
NCBI Genbank Uniprot
GeneID mRNA 시작-정자 코돈 단백질 단백질
FZD1 8321 NM_003505.1 414-2357 NP_003496.1 Q9UP38-1
FZD2 2535 NM_001466.3 246-1943 NP_001457.1 Q14332-1
FZD3 7976 NM_017412.3NM_145866.1 530-2530
484-2484		 NP_059108.1
NP_665873.1		 Q9NPG1-1
FZD4 8322 NM_012193.3 314-1927 NP_036325.2 Q9ULV1-1
FZD5 7855 NM_003468.3 411-2168 NP_003459.2 Q13467-1
FZD6 8323 NM_001164615.1NM_001164616.1
NM_001317796.1
NM_003506.3		 291-2411
299-2323
463-1668
318-2438		 NP_001158087.1
NP_001158088.1
NP_001304725.1
NP_003497.2		 O60353-1
O60353-2
FZD7 8324 NM_003507.1 62-1786 NP_003498.1 O75084-1
FZD8 8325 NM_031866.2 6-2090 NP_114072.1 Q9H461-1
FZD9 8326 NM_003508.2 230-2005 NP_003499.1 O00144-1
FZD10 11211 NM_007197.3 485-2230 NP_009128.1 Q9ULW2-1
"지단백질 수용체-관련 단백질" 또는 "LRP"라는 용어는 당 업계에 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 또는 고밀도 지단백질 수용체-관련 단백질로 알려진 임의의 모든 지단백질 수용체-관련 단백질을 포함하며, 특히 Wnt 시그널링에 관여하는 LPR 단백질을 나타낸다. 특정 특히 바람직한 구체 예에서, 용어는 LRP5(GeneID: 4041), LRP6(GeneID: 4040) 또는 LRP5 및 LRP6(LRP5/6)을 나타낸다.
따라서, GPR124/RECK/Frizzled/LRP5/6-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제가 개시되며, 여기서 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124가 없는 상태에서 Frizzled/LRP5/6-매개 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않는다.
추가로, 시험 약이 GPR124/RECK를 활성화시키나 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP5/6-매개 Wnt 시그널링에 대해서는 그렇지 않은지를 결정하는 것을 포함하는, 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 CNS 장애의 예방 또는 치료에 유용한 치료제로서 유용한 제제를 확인하기 위한 시험관 내 방법이 개시되어 있다.
추가적인 지침에 의해, 인간 LRP5 mRNA는 NCBI Genbank 수탁 번호 NM_002335.3(전사 변이체 1; NM_002335.3의 뉴클레오티드 107(시작 코돈) 내지 4954(정지 코돈)은 LRP5 코딩 서열을 구성함) 또는 NM_001291902.(전사 변이체 2; NM_001291902.1의 뉴클레오티드 1872(시작 코돈) 내지 4976(정지 코돈)이 LRP5 코딩 서열을 구성함)로 등재되어 있다. 인간 LRP5 단백질 서열은 NCBI Genbank 수탁 번호 NP_002326.2(동형단백질 1 전구체) 또는 NP_001278831.1(동형단백질 2) 및 Uniprot 수탁 번호 O75197-1로 등재되어 있고, NP_002326.2로 등재된 LRP5 단백질 서열은 아래에 재현된다(서열 번호: 3):
> NP_002326.2 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 5 동형단백질 1 전구체 [호모 사피엔스]
MEAAPPGPPWPLLLLLLLLLALCGCPAPAAASPLLLFANRRDVRLVDAGGVKLESTIVVSGLEDAAAVDFQFSKGAVYWTDVSEEAIKQTYLNQTGAAVQNVVISGLVSPDGLACDWVGKKLYWTDSETNRIEVANLNGTSRKVLFWQDLDQPRAIALDPAHGYMYWTDWGETPRIERAGMDGSTRKIIVDSDIYWPNGLTIDLEEQKLYWADAKLSFIHRANLDGSFRQKVVEGSLTHPFALTLSGDTLYWTDWQTRSIHACNKRTGGKRKEILSALYSPMDIQVLSQERQPFFHTRCEEDNGGCSHLCLLSPSEPFYTCACPTGVQLQDNGRTCKAGAEEVLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQVDDIRHAIAIDYDPLEGYVYWTDDEVRAIRRAYLDGSGAQTLVNTEINDPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTSRKILVSEDLDEPRAIALHPVMGLMYWTDWGENPKIECANLDGQERRVLVNASLGWPNGLALDLQEGKLYWGDAKTDKIEVINVDGTKRRTLLEDKLPHIFGFTLLGDFIYWTDWQRRSIERVHKVKASRDVIIDQLPDLMGLKAVNVAKVVGTNPCADRNGGCSHLCFFTPHATRCGCPIGLELLSDMKTCIVPEAFLVFTSRAAIHRISLETNNNDVAIPLTGVKEASALDFDVSNNHIYWTDVSLKTISRAFMNGSSVEHVVEFGLDYPEGMAVDWMGKNLYWADTGTNRIEVARLDGQFRQVLVWRDLDNPRSLALDPTKGYIYWTEWGGKPRIVRAFMDGTNCMTLVDKVGRANDLTIDYADQRLYWTDLDTNMIESSNMLGQERVVIADDLPHPFGLTQYSDYIYWTDWNLHSIERADKTSGRNRTLIQGHLDFVMDILVFHSSRQDGLNDCMHNNGQCGQLCLAIPGGHRCGCASHYTLDPSSRNCSPPTTFLLFSQKSAISRMIPDDQHSPDLILPLHGLRNVKAIDYDPLDKFIYWVDGRQNI KRAKDDGTQPFVLTSLSQGQNPDRQPHDLSIDIYSRTLFWTCEATNTINVHRLSGEAMGVVLRGDRDKPRAIVVNAERGYLYFTNMQDRAAKIERAALDGTEREVLFTTGLIRPVALVVDNTLGKLFWVDADLKRIESCDLSGANRLTLEDANIVQPLGLTILGKHLYWIDRQQQMIERVEKTTGDKRTRIQGRVAHLTGIHAVEEVSLEEFSAHPCARDNGGCSHICIAKGDGTPRCSCPVHLVLLQNLLTCGEPPTCSPDQFACATGEIDCIPGAWRCDGFPECDDQSDEEGCPVCSAAQFPCARGQCVDLRLRCDGEADCQDRSDEADCDAICLPNQFRCASGQCVLIKQQCDSFPDCIDGSDELMCEITKPPSDDSPAHSSAIGPVIGIILSLFVMGGVYFVCQRVVCQRYAGANGPFPHEYVSGTPHVPLNFIAPGGSQHGPFTGIACGKSMMSSVSLMGGRGGVPLYDRNHVTGASSSSSSSTKATLYPPILNPPPSPATDPSLYNMDMFYSSNIPATARPYRPYIIRGMAPPTTPCSTDVCDSDYSASRWKASKYYLDLNSDSDPYPPPPTPHSQYLSAEDSCPPSPATERSYFHLFPPPPSPCTDSS
추가적인 지침에 의해, 인간 LRP6 mRNA는 NCBI Genbank 수탁 번호 NM_002336.2로 등재되어 있다. NM_002336.2의 뉴클레오티드 143(시작 코돈) 내지 4984(정지 코돈)는 LRP6 코딩 서열을 구성한다. 인간 LRP6 단백질 서열은 NCBI Genbank 수탁 번호 NP_002327.2 및 Uniprot 수탁 번호 O75581-1로 등재되어 있고, 아래에서 추가로 재현된다(서열 번호: 4):
> NP_002327.2 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 6 전구체 [호모 사피엔스]
MGAVLRSLLACSFCVLLRAAPLLLYANRRDLRLVDATNGKENATIVVGGLEDAAAVDFVFSHGLIYWSDVSEEAIKRTEFNKTESVQNVVVSGLLSPDGLACDWLGEKLYWTDSETNRIEVSNLDGSLRKVLFWQELDQPRAIALDPSSGFMYWTDWGEVPKIERAGMDGSSRFIIINSEIYWPNGLTLDYEEQKLYWADAKLNFIHKSNLDGTNRQAVVKGSLPHPFALTLFEDILYWTDWSTHSILACNKYTGEGLREIHSDIFSPMDIHAFSQQRQPNATNPCGIDNGGCSHLCLMSPVKPFYQCACPTGVKLLENGKTCKDGATELLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQLEDIRHAIAIDYDPVEGYIYWTDDEVRAIRRSFIDGSGSQFVVTAQIAHPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTMRKILISEDLEEPRAIVLDPMVGYMYWTDWGEIPKIERAALDGSDRVVLVNTSLGWPNGLALDYDEGKIYWGDAKTDKIEVMNTDGTGRRVLVEDKIPHIFGFTLLGDYVYWTDWQRRSIERVHKRSAEREVIIDQLPDLMGLKATNVHRVIGSNPCAEENGGCSHLCLYRPQGLRCACPIGFELISDMKTCIVPEAFLLFSRRADIRRISLETNNNNVAIPLTGVKEASALDFDVTDNRIYWTDISLKTISRAFMNGSALEHVVEFGLDYPEGMAVDWLGKNLYWADTGTNRIEVSKLDGQHRQVLVWKDLDSPRALALDPAEGFMYWTEWGGKPKIDRAAMDGSERTTLVPNVGRANGLTIDYAKRRLYWTDLDTNLIESSNMLGLNREVIADDLPHPFGLTQYQDYIYWTDWSRRSIERANKTSGQNRTIIQGHLDYVMDILVFHSSRQSGWNECASSNGHCSHLCLAVPVGGFVCGCPAHYSLNADNRTCSAPTTFLLFSQKSAINRMVIDEQQSPDIILPIHSLRNVRAIDYDPLDKQLYWIDSRQNMIRKAQEDGSQGF TVVVSSVPSQNLEIQPYDLSIDIYSRYIYWTCEATNVINVTRLDGRSVGVVLKGEQDRPRAVVVNPEKGYMYFTNLQERSPKIERAALDGTEREVLFFSGLSKPIALALDSRLGKLFWADSDLRRIESSDLSGANRIVLEDSNILQPVGLTVFENWLYWIDKQQQMIEKIDMTGREGRTKVQARIAQLSDIHAVKELNLQEYRQHPCAQDNGGCSHICLVKGDGTTRCSCPMHLVLLQDELSCGEPPTCSPQQFTCFTGEIDCIPVAWRCDGFTECEDHSDELNCPVCSESQFQCASGQCIDGALRCNGDANCQDKSDEKNCEVLCLIDQFRCANGQCIGKHKKCDHNVDCSDKSDELDCYPTEEPAPQATNTVGSVIGVIVTIFVSGTVYFICQRMLCPRMKGDGETMTNDYVVHGPASVPLGYVPHPSSLSGSLPGMSRGKSMISSLSIMGGSSGPPYDRAHVTGASSSSSSSTKGTYFPAILNPPPSPATERSHYTMEFGYSSNSPSTHRSYSYRPYSYRHFAPPTTPCSTDVCDSDYAPSRRMTSVATAKGYTSDLNYDSEPVPPPPTPRSQYLSAEENYESCPPSPYTERSYSHHLYPPPPSPCTDSS
당업자는 서열 데이터베이스 또는 본 명세서에 표현된 임의의 서열이 각각의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산의 전구체일 수 있고, 성숙한 분자로부터 가공된 부분을 포함할 수 있음을 이해할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질"은 일반적으로 하나 이상의 폴리펩티드 사슬, 즉 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체 사슬을 포함하는 거대 분자를 포함한다. 상기 용어는 자연적으로, 재조합적으로, 반 합성적으로 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 제한 없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 설폰화, 메틸화, 유비퀴틴화, 신호 펩티드 제거, N-말단 Met 제거, 프로 효소 또는 예비-호르몬의 활성 형태로의 전환 등과 같은 폴리펩티드 사슬(들)의 하나 이상의 공동- 또는 후-발현-유형 변형을 갖는 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 예를 들어 상응하는 천연 단백질에 대한 아미노산 서열 변이, 예를 들어 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 단백질 변이체 또는 돌연변이체를 추가로 포함한다. 상기 용어는 전장 단백질 및 단백질 부분 또는 단편, 예를 들어, 이러한 전장 단백질의 가공으로 인해 발생하는 자연 발생 단백질 부분을 모두 고려한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체 사슬을 포함한다. 따라서, 특히 단백질이 단일 폴리펩티드 쇄로만 구성된 경우, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 이러한 단백질을 나타내기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어는 폴리펩티드 사슬의 임의의 최소 길이로 제한되지 않는다. 상기 용어는 자연적으로, 재조합적으로, 반합성적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 제한 없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 설폰화, 메틸화, 유비퀴틴화, 신호 펩티드 제거, N-말단 Met 제거, 프로 효소 또는 예비-호르몬의 활성 형태로의 전환 등과 같은 폴리펩티드 사슬의 하나 이상의 공동- 또는 후-발현-유형 변형을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 또한 상응하는 천연 폴리펩티드에 대한, 예를 들어 아미노산 결실, 추가 및/또는 대체와 같은 아미노산 서열 변이를 갖는 폴리펩티드 변이체 또는 돌연변이체를 추가로 포함한다. 상기 용어는 전장 폴리펩티드 및 폴리펩티드 부분 또는 단편, 예를 들어, 이러한 전장 폴리펩티드의 가공으로 인한 자연 발생 폴리펩티드 부분을 모두 고려한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "펩티드"는 바람직하게는 본질적으로 50개 이하의 아미노산, 예를 들어 45개 이하의 아미노산, 바람직하게는 40개 이하의 아미노산, 예를 들어 35개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 30개 이하의 아미노산, 예를 들어 25개 이하, 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 의미한다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 자연적으로, 예를 들어 자연에 존재하거나 자연으로부터 분리될 수 있으며, 예를 들어, 세포 또는 조직에 의해 자연적으로 또는 내생적으로 생성되거나 발현되고 임의로 이로부터 분리될 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합, 즉 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있고/있거나 부분적으로 또는 전체적으로 화학적으로 또는 생화학적으로 합성될 수 있다. 제한 없이, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 적합한 숙주 또는 숙주 세포 발현 시스템에 의해 재조합적으로 생산될 수 있고, 임의로 이로부터 분리될 수 있거나(예를 들어, 적합한 박테리아, 효모, 진균, 식물 또는 동물 숙주 또는 숙주 세포 발현 시스템), 또는 무 세포 번역 또는 무 세포 전사 및 번역, 또는 비 생물학적 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 합성에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산"은 전형적으로 뉴클레오시드 단위로 본질적으로 구성된 임의의 길이의 중합체(바람직하게는 선형 중합체)를 지칭한다. 뉴클레오시드 단위는 일반적으로 헤테로고리 염기 및 당기를 포함한다. 헤테로고리 염기는 특히 퓨린 및 피리미딘 염기, 예컨대 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)을 포함할 수 있으며, 이는 자연 발생 핵산, 기타 자연 발생 염기(예를 들어, 크산틴, 이노신, 하이포크산틴)뿐만 아니라 화학적 또는 생화학적으로 변형된(예를 들어, 메틸화된), 비 천연 또는 유도체화된 염기에 널리 퍼져있다. 예시적인 변형된 핵 염기는 2-아미노 프로필 아데닌, 5-프로피닐 우라실 및 5-프로피닐 시토신을 포함하는 5-치환된 피리미딘, 6-아자 피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 제한 없이 포함한다. 특히, 5-메틸 시토신 치환은 핵산 이중체 안정성을 증가시키는 것으로 나타났으며, 더욱 특히 2'-O-메톡시 에틸 당 변형과 조합될 때, 안티센스 제제에서 바람직한 염기 치환일 수 있다. 당 그룹은 특히 펜토스(펜토푸라노스) 그룹, 예컨대 바람직하게는 자연 발생 핵산에 공통적인 리보스 및/또는 2-데옥시리보스, 또는 아라비노스, 2-데옥시아라비노스, 트레오스 또는 헥소스 당 그룹, 및 변형 또는 치환된 당 그룹(예를 들어, 2'-O-알킬화, 예를 들어 2'-O-메틸화 또는 2'-O-에틸화 당, 예컨대 리보스; 2'-O-알킬옥시알킬화, 예를 들어 2'-O-메톡시에틸화 당, 예컨대 리보스; 또는 2'-O, 4'-C-알킬렌-연결된, 예를 들어 2'-O, 4'-C-메틸렌-연결된 또는 2'-O, 4'-C-에틸렌-연결된 당, 예컨대 리보스; 2'-플루오로-아라비노스 등)을 포함할 수 있다. 하나 이상의 리보 뉴클레오시드 단위를 포함하는 핵산 분자는 전형적으로 리보 핵산 또는 RNA로 지칭될 수 있다. 이러한 리보뉴클레오시드 단위(들)는 2'-OH 부분을 포함하고, 여기서 -H는 리보뉴클레오시드에 대해 당 업계에 공지된 바와 같이(예를 들어, 메틸, 에틸, 알킬 또는 알킬옥시알킬에 의해) 치환될 수 있다. 바람직하게는, 리보 핵산 또는 RNA는 주로 리보뉴클레오시드 단위, 예를 들어 핵산 분자를 구성하는 뉴클레오시드 단위의 ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% 또는 심지어 100%(수 기준)가 리보뉴클레오시드 단위일 수 있다. 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오시드 단위를 포함하는 핵산 분자는 전형적으로 데옥시리보뉴클레오시드 또는 DNA로 지칭될 수 있다. 이러한 데옥시리보뉴클레오시드 단위(들)는 2'-H를 포함한다. 바람직하게는, 데옥시리보 핵산 또는 DNA는 주로 데옥시리보뉴클레오시드 단위, 예를 들어 핵산 분자를 구성하는 뉴클레오시드 단위의 ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% 또는 심지어 100%가 데옥시리보뉴클레오시드 단위일 수 있다. 뉴클레오시드 단위는 특히 자연 발생 핵산에서 공통적인 포스포디에스테르 결합, 및 추가로 변형된 포스페이트- 또는 포스포네이트-기반 결합, 예컨대 포스포로티오에이트, 메틸포스포로티오에이트와 같은 알킬포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트와 같은 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 알킬포스포트리에스테르와 같은 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 포스포로피페라지네이트, 포스포로포스포리데이트, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌포스포네이트, 가교된 포스포로티오에이트; 및 추가의 실록산, 카보네이트, 설파메이트, 카보알콕시, 아세타미데이트, 3'-N-카바메이트와 같은 카바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 3'-티오아세탈 및 설폰 뉴클레오시드 간 연결을 포함하는 다수의 공지된 뉴클레오시드 간 연결 중 하나에 의해 서로 연결될 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오시드 간 연결은 보다 바람직하게는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결 또는 이들의 조합과 같은 변형된 포스페이트 기반 연결을 포함하는 포스페이트 기반 연결일 수 있다. 용어 "핵산"은 또한 펩티드 핵산(PNA), 포스페이트기를 갖는 펩티드 핵산(PHONA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노 포스포로디아미데이트-주쇄 핵산(PMO), 시클로헥센 핵산(CeNA), 트리시클로-DNA(tcDNA) 및 알킬 링커 또는 아미노 링커를 갖는 주쇄 부분을 갖는 핵산(예를 들어, Kurreck 2003(Eur J Biochem 270: 1628-1644 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는 핵산 모방체와 같은 임의의 다른 핵 염기 함유 중합체를 포함한다. 본원에 사용된 "알킬"은 특히 저급 탄화수소 부분, 예를 들어 C1-C4 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소, 예컨대 메틸, 에틸,에 테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐 및 이소 프로필을 포함한다. 본원에서 의도된 핵산은 자연 발생 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오시드 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오시드는 변형된 헤테로고리 염기, 변형된 당 단위, 변형된 뉴클레오시드 간 연결 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "핵산"은 바람직하게는 DNA, RNA 및 DNA/RNA 하이브리드 분자, 특히 hnRNA, pre-mRNA, mRNA, cDNA, 게놈 DNA, 증폭 산물, 올리고 뉴클레오티드 및 합성(예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드를 포함한다. RNA는 RNAi(억제 RNA), dsRNA(이중 가닥 RNA), siRNA(작은 간섭 RNA), mRNA(메신저 RNA), miRNA(마이크로 RNA), tRNA(운반 RNA, 포함되는 상응하는 아실화된 아미노산으로 충전 또는 방전 여부에 관계없이) 및 cRNA(상보적 RNA)를 포함한다. 핵산은 자연적으로, 예를 들어 자연에 존재하거나 자연으로부터 분리될 수 있으며, 예를 들어 세포 또는 조직에 의해 고유하게 또는 내생적으로 생성되고 임의로 이로부터 분리될 수 있다. 핵산은 재조합, 즉 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있고/있거나 부분적으로 또는 전체적으로 화학적으로 또는 생화학적으로 합성될 수 있다. 제한없이, 핵산은 적합한 숙주 또는 숙주 세포 발현 시스템에 의해 재조합적으로 생산될 수 있고, 선택적으로 이로부터 분리될 수 있거나(예를 들어, 적합한 박테리아, 효모, 진균, 식물 또는 동물 숙주 또는 숙주 세포 발현 시스템), 또는 세포 자유 전사 또는 비 생물학적 핵산 합성에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다. 핵산은 이중 가닥, 부분 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥인 경우, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 또한, 핵산은 원형 또는 선형일 수 있다.
임의의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산에 대한 언급은 발견된 임의의 유기체, 특히 동물, 바람직하게는 온혈 동물, 보다 바람직하게는 척추 동물, 보다 바람직하게는 인간 및 비인간 포유동물을 포함하는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간의 이러한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산을 포함한다.
따라서, 특정 실시 양태에서, 본원에 사용된 하나 이상의, 바람직하게는 모든 GPR124, RECK, FZD 및 LRP는 동물 기원, 바람직하게는 온혈 동물 기원, 보다 바람직하게는 척추 동물 기원, 보다 바람직하게는 인간 비인간을 포함한 포유동물 기원, 더욱 바람직하게는 인간 기원이다.
임의의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산에 대한 언급은 특히 고유 서열, 즉 1차 서열이 자연에서 발견되거나 유래된 핵산 펩티드, 폴리펩티드, 단백질의 것과 동일한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산을 포함할 수 있다. 당업자는 고유한 서열이 이러한 종 사이의 유전적 발산으로 인해 상이한 종간에 상이할 수 있다는 것을 이해한다. 더욱이, 고유 서열은 주어진 종 내에서 정상적인 유전 적 다양성(변이)으로 인해 동일한 종의 상이한 개체간에 또는 개체 내에서 상이할 수 있다. 또한, 천연 서열은 체세포 돌연변이, 또는 전사 후 또는 번역 후 변형으로 인해 동일한 종의 상이한 개체간에 또는 심지어 상이한 개체 내에서 상이할 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산의 임의의 이러한 변이체 또는 동형단백질이 본원에서 의도된다. 따라서, 자연에서 발견되거나 자연으로부터 유래된 모든 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 서열은 "천연"으로 간주된다.
특정 실시 양태에서, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산은 인간의 것일 수 있으며, 즉 이의 1차 서열은 자연 발생 인간 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산의 상응하는 1차 서열과 동일하거나 존재하는 것일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 한정자 "인간"은 각각의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산의 기원 또는 공급원이 아닌 1차 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산은 인간 대상체의 샘플에 존재 하거나 이로부터 분리될 수 있거나 다른 수단(예를 들어, 재조합 발현, 무 세포 전사 또는 번역, 또는 비 생물학적 핵산 또는 펩티드 합성)에 의해 수득될 수 있다 .
특정 구체 예에서, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산은 야생형일 수 있다. 대부분의 천연 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산은 야생형으로 간주될 수 있지만, 질병 표현형에 기여하거나 원인이 될 수 있는 부분적으로 또는 완전한 기능 상실을 초래하는 자연 발생 돌연변이를 갖는 것들은 일반적으로 "야생형"이라는 용어의 범위에서 제외된다.
임의의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산에 대한 언급은 또한 이러한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 특히 자연 발생적, 천연 또는 야생형의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "단편"은 일반적으로 펩티드의 폴리펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 일부, 예컨대 전형적으로 N- 및/또는 C-말단 절단 형태의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 단편은 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열 길이의 약 30% 이상, 예를 들어 약 50% 이상 또는 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 예를 들어 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상 또는 약 99% 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전장 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 길이를 초과하지 않는 한, 단편은 ≥5개의 연속 아미노산, 또는 ≥10개의 연속 아미노산, 또는 ≥20개의 연속 아미노산, 또는 ≥30개의 연속 아미노산, 예를 들어 ≥40개의 연속 아미노산, 예를 들어 ≥50개의 연속 아미노산, 예를 들어 ≥60, ≥70, ≥80, ≥90, ≥100, ≥200, ≥300, ≥400, ≥500, ≥600, ≥700, ≥800, ≥900 또는 ≥1000개 연속 아미노산 서열의 해당 전장 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다.
핵산(폴리뉴클레오티드)과 관련하여 용어 "단편"은 일반적으로 5'- 및/또는 3'-절단 형태의 핵산을 의미한다. 바람직하게는, 단편은 상기 핵산의 핵산 서열 길이의 약 30% 이상, 예를 들어 약 50% 이상 또는 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 예를 들어 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 약 95% 이상 또는 심지어 약 99% 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전장 핵산의 길이를 초과하지 않는 한, 단편은 ≥5 개의 연속 뉴클레오티드, 또는 ≥10개의 연속 뉴클레오티드, 또는 ≥20개의 연속 뉴클레오티드, 또는 ≥30개의 연속 뉴클레오티드, 예를 들어 ≥40개의 연속 뉴클레오티드 예를 들어, ≥60, ≥70, ≥80, ≥90, ≥100, ≥200, ≥300, ≥400, ≥500, ≥600, ≥700, ≥800, ≥900 또는 ≥1000, ≥1500, ≥2000, ≥2500, ≥3000, ≥3500 또는 ≥4000개의 연속 뉴클레오티드서열의 해당 전장 핵산을 포함할 수 있다.
상기 용어는 생체 내 및/또는 시험관 내의 임의의 메커니즘, 예를 들어 대안 적 전사 또는 번역, 엑소- 및/또는 엔도-단백질 분해, 엑소 및/또는 엔도-핵 생성, 또는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산의 분해, 예를 들어 물리적, 화학적 및/또는 효소적 단백질 분해 또는 핵 분해에 의해 제한없이 발생하는 단편을 포함한다..
단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산의 용어 "변이체"는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산의 서열에 대해 아미노산 서열 또는 핵산 서열이 실질적으로 동일한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 의미한다(즉, 대부분은 완전히 동일하지는 않다). 예를 들어, 인용된 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산의 서열에 대해, 약 80% 이상 동일 또는 약 85% 이상 동일, 예를 들어 바람직하게는 약 90% 이상 동일, 예를 들어 91% 이상 동일, 92% 동일, 보다 바람직하게는 약 93% 이상 동일, 예를 들어 94% 이상 동일, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상 동일, 예를 들어 96% 이상 동일, 더욱 바람직하게는 약 97% 이상 동일, 98% 이상 동일하고 가장 바람직하게 99% 이상 동일하다. 바람직하게는, 변이체는 인용된 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산의 전체 서열이 서열 정렬(즉, 전체 서열 동일성)로 조회될 때 언급된 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산에 대해 이러한 정도의 동일성을 나타낼 수 있다. 서열 동일성은 서열 정렬을 수행하고 그 자체로 알려진 서열 동일성을 결정하기 위해 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
예시적이지만 비 제한적인 알고리즘은, 예를 들어 Tatusova 및 Madden 1999(FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)에 의해 기술된 "Blast 2 서열" 알고리즘과 같은, Altschul et al.1990(J Mol Biol 215: 403-10)에 의해 원래 기술된 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)에 기초한 알고리즘을 포함한다. 예를 들어 공개된 기본 설정 또는 다른 적절한 설정( 예를 들어, BLASTN 알고리즘의 경우: 간격을 여는 비용 = 5, 간격을 연장하는 비용 = 2, 불일치에 대한 페널티 = -2, 일치에 대한 보상 = 1, 간격 x_dropoff = 50, 기대 값 = 10.0 , 단어 크기 = 28 또는 BLASTP 알고리즘의 경우: matrix = Blosum62(Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 10915-10919), 간격을 여는 비용 = 11, 연장 비용 간격 = 1, 기대 값 = 10.0, 단어 크기 = 3)을 사용한다.
특정 아미노산 서열과 조회 폴리펩티드의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율을 결정하기 위한 예시적인 절차는 웹 애플리케이션 또는 독립형으로 이용가능한 Blast 2 서열(Bl2seq) 알고리즘을 사용하여 2개의 아미노산 서열을 정렬시키는 것을 수반할 것이다. 적절한 알고리즘 매개 변수를 사용하여 NCBI 웹 사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 실행 프로그램(BLAST 버전 2.2.31+) 또는 웹 애플리케이션으로 사용가능하다. 적합한 알고리즘 파라미터의 예는 매트릭스 = Blosum62, 간격을 여는 비용 = 11, 간격을 연장하는 비용 = 1, 기대 값 = 10.0, 단어 크기 = 3)을 포함한다. 2개의 비교된 서열이 상동성을 공유하면, 출력은 상동성 영역을 정렬된 서열로 제시할 것이다. 2개의 비교된 서열이 상동성을 공유하지 않으면, 출력은 정렬된 서열을 나타내지 않을 것이다. 일단 정렬되면, 일치하는 수는 동일한 아미노산 잔기가 두 서열에서 제시되는 위치의 수를 세어 결정될 것이다. 동일성 백분율은 일치 횟수를 조회 폴리펩티드의 길이로 나눈 다음 결과 값에 100을 곱하여 결정된다. 동일성 백분율 값은 가장 가까운 10분의 1로 반올림할 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어 78.11, 78.12, 78.13 및 78.14는 78.1로 내림되고 78.15, 78.16, 78.17, 78.18 및 78.19는 78.2로 올림될 수 있다. 또한, B2seq에 의해 출력된 정렬의 각각의 세그먼트에 대한 상세도는 이미 편리하게 동일성 백분율을 포함한다는 것에 주목한다.
단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산의 변이체는 상기 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산의 상동체(예를 들어, 오르쏘로그(orthologue) 또는 파라로그(paralogue))일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "상동성"은 일반적으로 동일하거나 상이한 분류군으로부터의 2개의 거대 분자 사이의 구조적 유사성을 나타내며, 상기 유사성은 공유된 조상에 기인한다.
단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 변이체는 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여(즉, 이에 비해) 하나 이상의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 변이체(치환 변이체)는 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여(즉, 이에 비해) 70개 이하(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 또는 70)의 보존적 아미노산 치환; 및/또는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 변이체(치환 변이체)는 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여(즉, 이에 비해) 20개 이하(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19)의 비보존 적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 유사한 특성을 갖는 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 보존적 아미노산 치환은 다음 그룹 내의 치환을 포함한다: 발린, 알라닌 및 글리신; 로이신, 발린 및 이소로이신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 시스테인 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 비극성 소수성 아미노산은 알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(즉, 염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된(즉, 산성) 아미노산은 아스파르트 산 및 글루탐산을 포함한다. 동일한 기의 다른 구성원에 의한 상기 언급된 극성, 염기성 또는 산성 기의 한 구성원의 임의의 치환은 보존적 치환으로 간주될 수 있다. 대조적으로, 비보존적 치환은 하나의 아미노산이 다른 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 치환이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 변이체(결실 변이체)는 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드에 대해(즉, 이에 비해)최대 20개의 아미노산 세그먼트(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 세그먼트)가 결여될 수 있다. 결실 세그먼트(들)는 각각 독립적으로 하나의 아미노산, 두 개의 연속 아미노산 또는 세 개의 연속 아미노산으로 구성될 수 있다. 결실 세그먼트는 비 연속적이거나, 또는 2개 이상의 결실 세그먼트가 연속적일 수 있다.
핵산의 변이체는 상응하는 핵산과 비교하여(즉, 이에 비해) 하나 이상의 뉴클레오티드 첨가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
임의의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산의 "단편 또는 변이체" 또는 "변이체 또는 단편"에 대한 언급은 또한 이러한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산의 변이체의 단편, 및 이러한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산의 단편의 변이체를 포함한다.
인용된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성 단편 및/또는 변이체가 특히 고려된다. 용어 "생물학적 활성"은 단편 및/또는 변이체가 각각 또는 상응하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성 또는 의도된 기능성을 적어도 부분적으로 보유함을 나타내는 "기능적 활성" 또는 "기능적"과 같은 용어와 상호 교환가능하다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 "활성"에 대한 언급은 일반적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성의, 예를 들어 세포, 조직, 기관 또는 유기체 내에서, 임의의 하나 이상의 측면, 예컨대 생화학적 활성, 효소 활성, 시그널링 활성, 상호 작용 활성, 리간드 활성 및/또는 구조적 활성을 포함한다.
바람직하게는, 기능적으로 활성인 단편 또는 변이체는, 상응하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 비교한 생물학적 활성 또는 기능을 약 20% 이상, 예를 들어 약 25% 이상, 또는 30% 이상, 또는 약 40% 이상, 또는 약 50% 이상, 예를 들어 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 예를 들어 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상 또는 심지어 약 100%을 보유할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 기능적으로 활성인 단편 또는 변이체는 심지어 상응하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 비교하여 더 높은 생물학적 활성 또는 기능성을 나타낼 수 있으며, 예를 들어 상응하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 비교하여 의도된 생물학적 활성 또는 기능의 약 100% 이상, 또는 약 150% 이상, 또는 약 200% 이상, 또는 약 300% 이상, 또는 약 400% 이상 또는 약 500% 이상 이상을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 주어진 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 활성은 정량적 출력, 예를 들어 효소 분석 또는 시그널링 분석 또는 정량화 가능한 신호를 생성하는 결합 분석, 기능적으로 활성인 분석법으로 쉽게 측정될 수 있는 경우, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 단편 또는 변이체는 상응하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 의해 생성된 신호의 약 20% 이상, 또는 약 25% 이상, 또는 30% 이상, 또는 약 40% 이상, 또는 약 50% 이상, 또는 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 100% 이상, 또는 약 150% 이상, 또는 약 200% 이상, 또는 약 300% 이상, 또는 약 400% 이상, 또는 약 500% 이상인 신호를 생성할 수 있다.
제한이 아닌 예로서, GPR124, RECK, FZD 또는 LRP 폴리펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 상응하는 고유 또는 야생형 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP 폴리펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성의 하나 이상의 측면을 적어도 부분적으로 보유할 것이다. 예를 들어, GPR124, RECK, FZD 또는 LRP 폴리펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성에 대한 언급은 특히 GPR124/RECK/FZD/LRP 복합체에 참여하는 능력, 예를 들어 상기 복합체의 하나 이상의 다른 성분에 결합하는 능력 및/또는 GPR124/RECK/FZD/LRP 복합체의 일부로서 Wnt 시그널링을 매개하는 능력을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 명세서는 특히 GPR124/RECK/FZD/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제를 개시하며, 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124가 없는 경우 FZD/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않으며, 여기서 하나 이상의 또는 바람직하게는 모든 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP는 천연 또는 야생형 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP이다.
본 명세서는 특히 GPR124/RECK/FZD/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제를 개시하며, 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124가 없는 경우 FZD/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않으며, 여기서 하나 이상의 또는 바람직하게는 모든 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP는 천연 또는 야생형 인간 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP이다.
본 명세서는 특히 GPR124/RECK/FZD/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화할 수 있는 제제를 개시하며, 여기서 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124가없는 경우 FZD/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않으며, 여기서 하나 이상의 또는 바람직하게는 모든 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP는 본 명세서의 다른 곳에 제시된 Genbank 또는 Uniprot 항목에 등재된 바와 같이 천연 또는 야생형 인간 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP이다. Genbank 또는 Uniprot 항목이 전구체 폴리펩티드 또는 단백질의 서열을 제공하는 경우, 상응하는 성숙한 형태는 GPR124/RECK/FZD/LRP 복합체에 참여할 것으로 예상된다.
본 명세서는 특히 GPR124/RECK/FZD1/LRP5 또는 LRP6-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제를 개시하며, 여기서 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 FZD5/LRP5 또는 LRP6-매개 Wnt 시그널링을 활성화하지 않으며, 여기서 GPR124, RECK, FZD1, FZD5, LRP5 또는 LRP6 중 하나 이상 또는 바람직하게는 전부는 다른 곳에 제시된 Genbank 또는 Uniprot 항목에 등재된 천연 또는 야생형 인간 GPR124, RECK, FZD1, FZD5, LRP5 또는 LRP6이다.
본 명세서는 특히 GPR124/RECK/FZD/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제를 개시하며, 여기서 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124가 없을 때 FZD/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않으며, 여기서 하나 이상의 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP는 천연 또는 야생형 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP의 생물학적 활성 단편이거나 변이체이다.
본 명세서는 특히 GPR124/RECK/FZD/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화할 수 있는 제제를 개시하며, 여기서 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124가없는 경우 FZD/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않으며, 여기서 하나 이상의 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP는 천연 또는 야생형 인간 GPR124, RECK, FZD 또는 LRP의 생물학적 활성 단편이거나 변이체이다.
용어 "복합체", "단백질 복합체" 또는 "폴리펩티드 복합체"는 당 업계에서 잘 이해되고 있다. 추가의 안내 및 제한없이, 용어는 둘 이상의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 클러스터를 광범위하게 나타낸다. 클러스터는 비공유 결합, 보다 특히 비공유 단백질-단백질 상호 작용에 의해 안정화될 수 있으며, 여기서 클러스터 내에 존재하는 폴리펩티드의 전부 또는 일부는 물리적으로 상호 작용한다. 단백질 복합체는 전체적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 구성될 수 있거나, 탄수화물, 지질, 당지질, 핵산, 올리고 뉴클레오티드, 핵 단백질, 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 포스페이트, 효소 보조 인자, 포르피린, 금속 이온 등과 같은 다른 분자 또는 거대 분자를 포함할 수 있다. 상기 용어는 필수 또는 비-필수이거나 일시적이거나 영구적일 수 있고/있거나 동종 다량체 또는 이종 다량체일 수 있는 단백질 복합체를 제한없이 포함한다. 상기 용어는 세포막(플라즈마 막), 세포 외, 세포질, 세포 소기관 또는 세포 소기관의 막에 위치할 수 있는 단백질 복합체를 제한없이 포함한다. 세포막에 위치한 복합체는 전형적으로 하나 이상의 막 고정 또는 막 횡단 단백질을 함유한다. 상기 용어는 또한 주어진 신호 경로를 구획화하는 "세포신호전달체"로 알려진 막 마이크로도메인 및 막-관련 거대 분자 소기관 유사 구조를 포함한다. 이러한 고차 단백질 복합체는 세포 내 스캐폴드에 의해 적어도 부분적으로 안정화될 수 있다. 따라서, 용어는 또한 단백질 또는 폴리펩티드에 의해 매개되는 상기 부위에서 세포막을 통한 시그널링을 허용하기 위해, 특정 단백질 또는 폴리펩티드가 세포막의 주어진 부위에 국소적으로 농축되거나 축적되는 상황을 나타낼 수 있다.
GPR124/RECK/FZD/LRP 수용체 복합체는 단백질 복합체, 특히 막 관련 단백질 복합체, 보다 특히 하나 이상의 GPR124 폴리펩티드, 하나 이상의 RECK 폴리펩티드, 하나 이상의 FZD 폴리펩티드 및 하나 이상의 LRP 폴리펩티드를 포함하는 원형질 막 관련 단백질 복합체를 나타낸다. GPR124/RECK/FZD/LRP 수용체 복합체는, Wnt/β-카테닌 시그널링 경로의 하류 구성원(예를 들어, 흐트러진(Dvl))을 함유하는 세포의 원형질 막에 위치할 때, 세포 외적으로 제공된 Wnt7 리간드에 대한 반응으로 상기 세포에서 Wnt/β-카테닌 시그널링을 활성화시킬 수 있다.
FZD/LRP 수용체 복합체는 단백질 복합체, 특히 막-관련 단백질 복합체, 보다 특히 하나 이상의 FZD 폴리펩티드 및 하나 이상의 LRP 폴리펩티드를 포함하는 원형질 막-관련 단백질 복합체를 나타낸다. Fnt/β-카테닌 시그널링 경로(예를 들어, Dvl)의 하류 구성원을 함유하는 세포의 원형질 막에 위치할 때, FZD/LRP 수용체 복합체는 세포 외적으로 제공된 Wnt 리간드,(예컨대 Wnt7 리간드에 제한되지는 않는다)에 대한 반응으로 상기 세포에서 Wnt/β-카테닌 시그널링을 활성화시킬 수 있다
본원에 사용된 용어 "Wnt 시그널링"은 생물학적 활성 Wnt 리간드가 상기 세포의 활성 및/또는 작용을 조절하기 위해 세포에 그의 영향을 미치는 메커니즘을 의미한다. 생물학적으로 활성인 Wnt 리간드는 FZD/LRP 수용체 복합체와 같은 Wnt 수용체(들)에 결합함으로써 세포 활성 및/또는 작용을 조절한다. Wnt 리간드의 결합에 의해 활성화되면, Wnt 수용체(들)는 하나 이상의 세포 내 시그널링 경로를 활성화시킬 것이다. 3개의 Wnt 시그널링 경로는 고전적으로 인식된다: 정규(즉, 전사 공동-활성화제로서 β-카테닌 활성화에 의해 매개된) Wnt 경로, 비정규 평면 세포 극성 경로 및 비정규 Wnt/칼슘 경로. 3가지 경로는 모두 전형적으로 Wnt 리간드와 FZD 수용체의 결합에 의해 활성화된다. 그러나 RP 수용체의 동원은 정규(또는 β-카테닌-의존적) Wnt 시그널링을 유도하기 위한 전제 조건인 것으로 보인다. 당 업계에 공지된 바와 같이, Wnt/FZD/LRP-복합체( "비활성 정규 Wnt 시그널링")가 없는 경우, β-카테닌은 카제인 키나제 및 글리코겐 신타제 키나제-3(GSK-3)에 의해 세포질에서 인산화된다. 이들 키나제와 β-카테닌 사이의 상호 작용은 스캐폴딩 단백질, Axin 및 선종성 용종 대장균(APC)에 의해 촉진된다. 이들 단백질은 함께 '분해 복합체'를 형성하며, 이는 유비퀴틴화를 목표로 하고 프로테아좀에 의해 분해되는 베타-트랜스덕틴 반복 함유 단백질(β-TrCP)에 의해, 인산화된 β-카테닌을 인식할 수 있게 한다. 활성 표준(또는 베타-카테닌-의존적) Wnt 시그널링은 세포 표면상의 FZD 및 LRP의 수용체 복합체에 Wnt 리간드의 결합을 포함한다. 시그널링 동안, FZD는 Wnt 단백질의 결합이 2개의 수용체의 이량체화를 야기하는 방식으로 LRP와 협력한다. 이 이량체화는 FZD 및 LRP 수용체의 형태적 변화를 초래하는 것으로 이론화되었다. 결과적으로, LRP의 세포질 꼬리는 인산화-의존적 방식으로 스캐폴드 단백질 Axin을 모집하고 결합하여 DVL, Axin 및 GSK3을 포함하는 복합체의 형성을 초래한다. 수용체 결합 DVL 및 Axin 분자의 다량체는 LRP-FZD 이량체의 형성을 지지할 수 있다. 세포막에 GSK를 동원한 결과, β-카테닌 인산화가 억제되어 분해 복합체로부터 β-카테닌이 방출되고 β-카테닌이 세포질에 축적되게 한다. 세포질에서 β-카테닌의 축적은 β-카테닌이 핵으로 들어가고 TCF/LEF 전사 인자와 상호 작용할 수 있게 한다.
본 발명자들은 Wnt7-특이적 RECK/GPR124/Frizzled/LRP-매개 시그널링을 확인하였고, 여기서 Wnt7은 FZD-비 의존적 방식으로 Reck에 특이적으로 결합하고, RECK 결합 파트너인 GPR124는 RECK-결합된 Wnt7을 세포 내 DVL 스캐폴드를 통한 복합체를 통해 FZD/LRP에 연결시키고, 이에 의해 Wnt7-리간드 특이적 RECK/GPR124/FZD/LRP 세포신호전달체을 조립하고 표준 Wnt 시그널링을 활성화시킨다.
상기의 관점에서, 당업자는 FZD 및 LRP 폴리펩티드에 의해 매개되는 Wnt 시그널링의 경우와 같이, FZD/LRP 복합체는 상기 FZD/LRP 복합체를 통한 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 세포 외 제제 없이 또는 독립적으로 세포막 상에 형성되지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 다시 말해서, 제제는 FZD 및 LRP 폴리펩티드를 FZD/LRP 복합체 내로 조립하거나 조직화하는데, 예컨대 제제와 각각의 FZD 및 LRP 사이의 단백질-단백질 상호 작용에 의해 활성 역할을 할 수 있다. 이는 FZD/LRP 복합체의 형성 및 복합체에 의해 매개된 Wnt 시그널링의 활성화를 초래한다.
유사하게, GPR124/RECK/FZD/LRP 수용체 복합체는, 상기 GPR124/RECK/FZD/LRP 복합체를 통한 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 세포 외 제제가 없거나 독립적으로, 세포막 상에 형성되지 않을 수 있다. 다시 말해서, 제제는 예를 들어 제제 및 상기 GPR124, RECK, FZD 및 LRP 중 상기 둘 이상의 각각 사이의 단백질-단백질 상호 작용에 의해 GPR124, RECK, FZD 및 LRP 폴리펩티드 중 둘 이상을 GPR124/RECK/FZD/LRP 복합체로 조립하거나 조직화하는데 활성 역할을 할 수 있다. 이는 GPR124/RECK/FZD/LRP 복합체의 형성 및 복합체에 의해 매개된 Wnt 시그널링의 활성화를 초래한다.
따라서, "Gpr124/Reck/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제"라는 문구는 Gpr124, Reck, Frizzled 및 LRP 폴리펩티드를 통한 Wnt 시그널링을 유도하는 제제의 능력을 지칭한다. "Gpr124/Reck/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제"라는 문구는 제제와 Gpr124, Reck, Frizzled 및 LRP를 발현하는 세포를 접촉하기 전에 Gpr124/Reck/Frizzled/LRP 수용체 복합체의 존재를 반드시 암시하지는 않는다. 예를 들어 그리고 제한 없이, 제제는 Gpr124/Reck/Frizzled/LRP 시그널링 복합체의 형성 또는 조립에 기여하거나 촉진하여 상기 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링을 활성화할 수 있다. 유사하게, "Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화할 수 있는 제제"라는 문구는 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드를 통한 Wnt 시그널링을 유도하는 제제의 능력을 지칭한다. 문구 "Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제"는 Frizzled 및 LRP를 발현하는 세포를 이러한 제제와 접촉시키기 전에 반드시 Frizzled/LRP 수용체 복합체의 존재를 의미하지는 않을 것이다. 예를 들어 그리고 제한 없이, 이러한 제제는 Frizzled/LRP 시그널링 복합체의 형성 또는 조립에 기여하거나 촉진하여 상기 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링을 활성화할 수 있다. "상기 제제는 Reck 및/또는 Gpr124의 부재 하에 Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않는다"라는 문구는 반드시 Frizzled 및 LRP를 발현하지만 Reck 및/또는 또는 Gpr124 아닌 세포에서 Frizzled/LRP 수용체 복합체의 존재를 의미하지는 않는다. 예를 들어 그리고 제한 없이, 제제는 그러한 세포에서 Frizzled/LRP 시그널링 복합체의 형성 또는 조립에 기여하거나 이를 촉진시키지 못하여, 상기 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링을 활성화시키지 못할 수 있다.
당업자는 본원에 예상되는 GPR124/RECK/FZD/LRP 수용체 복합체가 복합체를 기능적으로 조절할 수 있거나 또는 조절할 필요가 없는 추가 성분(들)을 포함할 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 복합체는 Dishveled(Dvl)를 포함할 수 있으며, GPR124 및 Frizzled를 브리징할 수 있는 세포 내 스캐폴드를 형성한다.
특정 실시 양태에서, 그의 원형질 막에서 -GPR124, RECK, FZD 및 LRP 폴리펩티드를 발현하고 Wnt/β-카테닌 시그널링 경로의 하류 구성원을 함유하는 세포는 뇌 내피세포와 같은 세포 표면에서 모든 GPR124, RECK, FZD 및 LRP 폴리펩티드를 자연적으로 발현하는 세포이다. 추가의 실시 양태에서, 그의 원형질 막에서 GPR124, RECK, FZD 및 LRP 폴리펩티드를 발현하고 Wnt/β-카테닌 시그널링 경로의 하류 구성원을 함유하는 세포는 세포가 변형되도록(예를 들어, 유전자 조작된) 그 세포 표면에서 모든 GPR124, RECK, FZD 및 LRP 폴리펩티드를 발현한다. 예를 들어, 세포는 FZD 및 LRP를 자연적으로 발현하지만 GPR124 및 RECK를 자연적으로 발현하지 않는 배양된 세포일 수 있고, GPR124 및 RECK 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다(예를 들어, 상기 GPR124를 인코딩하는 발현성 핵산(들)으로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염 됨). 바람직하게는, 세포는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포이다.
특정 구체 예에서, GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화하지만 RECK 및/또는 GPR124가 없는 경우 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화하지 않는 제제의 능력은, RECK 및 GPR124의 존재 하에서 표준 Wnt 시그널링을 활성화하지만 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에서는 그렇지 않은 제제의 능력을 나타낸다.
문구 "RECK 및 GPR124의 존재"는 바람직하게는 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드와 상호 근접한 세포막에서 또는 세포막 가까이에 RECK 및 GPR124 폴리펩티드의 발생을 지칭한다. 밀접한 상호 근접성은, 여기에 교시된 제제가 세포에 외부로 공급될 때와 같이, 이를 유도하는 조건 하에서 GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체의 형성을 촉진할 수 있다. 한편, 문구 "RECK 및/또는 GPR124의 부재"는 세포막에서 RECK 및/또는 GPR124 폴리펩티드의 부족 또는 비-발생을 지칭한다. 세포가 RECK 및/또는 GPR124를 발현, 번역 또는 정확하게 전위시키지 않을 때 세포막에 또는 그 부근에 RECK 및/또는 GPR124가 없을 수 있다. RECK 및/또는 GPR124의 부재는 세포막에서 RECK 및/또는 GPR124 폴리펩티드의 완전한 부재를 나타낼 필요는 없지만, 예를 들어 검출할 수 없거나 또는 예를 들어 면역 블롯팅, 면역 세포 화학 또는 면역 형광과 같은 당업자에게 공지된 통상적인 단백질 검출 또는 정량 분석의 감도 범위 미만으로 떨어지는 RECK 및/또는 GPR124 폴리펩티드의 양을 지칭할 수 있다.
특정 실시 양태에서, RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링을 활성화시키지는 않지만 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링을 활성화시키는 제제의 능력은, GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 Wnt 시그널링을 매개할 수 있는 세포에서 Wnt 시그널링을 활성화하지만, GPR124 및/또는 RECK를 발현하지 않는 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링이 가능한 세포에서는 그렇지 않은 제제의 능력을 나타낸다.
GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 Wnt 시그널링을 매개할 수 있는 세포는 뇌 내피세포 또는 세포주와 같은 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링에 필요한 모든 세포 성분을 자연적으로 발현하는 세포일 수 있다. GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 Wnt 시그널링을 매개할 수 있는 세포는 또한 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링에 필요한 모든 세포 성분을 자연적으로 발현하지 않거나 전혀 발현하지 않는 세포일 수 있으며, 이는 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링에 필요한 누락된 세포 성분을 보상하기 위해 유전자 조작된 것과 같은 것으로 변형될 수 있다. 이러한 변형은 당 업계에 공지되어 있고 본원의 다른 곳에 기술되어 있다.
GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 Wnt 시그널링을 매개할 수 있는 세포는 척추 동물 세포 또는 세포주일 수 있다. 비 제한적 예는 인간 배아 신장 293 T(HEK239T), 인간 제대 정맥 내피세포(HUVEC), 인간 피부 미세 혈관 내피세포(HDMVEC), 인간 관상 동맥 내피세포(HCAEC), 인간 대동맥 내피세포(HAEC), 인간 뇌 미세 혈관 내피세포(HBMEC), Bend3 세포, Bend5 세포 또는 hCMEC/D3 세포를 포함한다. HEK293T 세포는, American Type Culture Collection(ATCC)(미국 버지니아 20110-2209, 10801 University Blvd. Manassas, USA)에 의해 유지되는 공개 컬렉션으로부터 얻을 수 있고, 예를 들어 ATCC acc. No. CRL-3216를 갖는 HEK293T를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시 양태에서, RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링을 활성화시키지는 않지만 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링을 활성화시키는 제제의 능력은 GPR124, RECK, FZ 및 LRP를 발현하지만 FZ 및 LRP를 발현하지 않지만 GPR124 및/또는 RECK를 발현하지 않는 세포에서는 Wnt 시그널링을 활성화시키는 제제의 능력을 나타내는데, 여기서 GPR124, RECK, FZ 및 LRP를 발현하는 세포 및 FZ 및 LRP를 발현하고 GPR124 및/또는 RECK를 발현하지 않는 세포는 실질적으로 동일하다.
특정 구체 예에서, GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화하지만 RECK 및/또는 GPR124가 없는 경우 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화하지 않는 제제의 능력은, 마우스 또는 인간 뇌 혈관 내피세포 또는 세포주에서 Wnt 시그널링을 활성화시키면서 RECK 및/또는 GPR124 유전자가 녹아웃된 마우스 또는 인간 뇌 혈관 내피세포 또는 세포주에서 Wnt 신호를 활성화시키지 않는 제제의 능력을 나타낸다. Wnt 시그널링의 활성화의 결정은 당 업계에 공지되어 있고 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 적합한 내피세포는 예를 들어 인간 뇌 미세 혈관 내피세포(HBMEC), Bend3 세포, Bend5 세포 또는 hCMEC/D3 세포를 포함한다. HBMEC는 ATCC 공개 컬렉션으로부터 얻을 수 있고, ATCC acc. No. CRL-2299를 갖는 bEnd.3 를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시 양태에서, RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링을 활성화시키지는 않지만 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링을 활성화시키는 제제의 능력은, 제브라피시의 내피에서 형질전환적으로 발현될 때 Wnt7aa-/- 제브라피시(Danio rerio)에서 뇌 혈관 구조 및/또는 혈액 뇌 장벽을 회복시키는 제제의 능력을 나타낸다. 반면, 야생형 제브라피시 배아에서 제제를 인코딩하는 mRNA의 미세주입은 사후 표현형을 유도하지 않거나, 야생형 제브라피시 배아에서 제제를 인코딩하는 mRNA의 미세주입은 야생형 제노푸스 배아에서 축 복제를 유도하지 않는다. 바람직하게는 mRNA는 1 pg 내지 100 pg의 용량으로 주입된다.
상기 제브라피시의 내피에서 형질전환하게 발현될 때 Wnt7aa-/-제브라피시에서 뇌 혈관 구조 및/또는 혈액-뇌 장벽을 회복시키는 제제의 능력은 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 뇌 혈관계 및/또는 혈액-뇌 장벽의 회복은 후뇌 중앙 동맥(CtA)의 양, 총 뇌 모세관 길이, 평균 혈관 크기 및/또는 평균 모세관 가지를 결정함으로써 평가될 수 있다. 본원에 교시된 제제를 유전자 변형적으로 발현하는 Wnt7aa-/- 제브라피시의 뇌 영역에서 GLUT1의 발현을 결정하는 것(예를 들어, 계내 혼성화 또는 면역 조직 화학 법을 사용하여)은 상기 제브라피시에서 뇌 혈관 구조를 시각화하는데 사용될 수 있다. 이어서, 본원에 교시된 바와 같이 제제를 유전자 변형적으로 발현하는 Wnt7aa-/- 제브라피시의 뇌 영역에서 GLUT1 발현 패턴을 야생형 제브라피시와 같은 대조군의 뇌 영역에서 GLUT1 발현 패턴과 비교할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 교시된 바와 같이 제제를 유전자 변형적으로 발현하는 Wnt7aa-/- 제브라피시의 뇌 혈관 구조 및 혈액-뇌 장벽은 본원에 교시된 바와 같이 제제를 유전자적으로 발현하는 Wnt7aa-/- 제브라피시의 후뇌 CtA의 양이 야생형 제브라피시의 후뇌 CtA 양의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상이면 회복되는 것으로 간주된다.
Wnt7aa-/- 제브라피시를 생성하고 제브라피시 내피에서 제제를 형질전환적으로 발현시키는 방법은 예를 들어 Shankaran et al., CRISPR/Cas-9 directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput 제브라피시 F0 screens, Curr Protoc Mol Biol.,119:31.9.1-31.9.22(2017)에 기술된 바와 같이 CRISPR/Cas-유도 유전자 편집을 사용하여 당 업계에 잘 알려져있다.
제브라피시 배아, 바람직하게는 1 내지 4-세포 단계 제브라피시 배아에서의 mRNA의 미세주입뿐만 아니라 제브라피시에서의 표현형의 발생 또는 부재의 평가는 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Rosen et al., Microinjection of 제브라피시 embryos to analyse gene function, J Vis Exp.(25): 1115(2009)를 참조한다. 제브라피시의 사후 표현형은 위축, 앞뇌 상실 및 제브라피시의 눈 구조 상실 중 전방 신경 외배엽의 후 경화를 포함한다(van de Water et al., Ectopic Wnt signal determines the eyeless phenotype of zebrafish masterblind mutant. Development. 128(20):3877-3888(2001)).
제노푸스 배아에서 제제의 주사시 축 중복의 발생 또는 부재의 평가는 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Kuhl et al., Dorsal axis duplication as a functional readout for Wnt activity. Methods Mol Biol. 469:467-476(2008)을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "제제"는 광범위하게 임의의 화학 물질(예를 들어, 무기 또는 유기), 생화학적 또는 생물학적 물질, 분자 또는 거대 분자(예를 들어, 생물학적 거대 분자), 이들의 조합 또는 혼합물, 결정되지 않은 조성물의 샘플, 또는 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로 만들어진 추출물을 말한다. 비 제한적인 "제제"는 핵산, 올리고 뉴클레오티드, 리보자임, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 펩티드유사체, 항체, 항체 단편, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 앱타머, 광 앱타머, 스피에겔머, 화학 물질, 바람직하게는 유기 분자, 보다 바람직하게는 작은 유기 분자, 지질, 탄수화물, 다당류 등 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 문맥에 따라, "제제"라는 용어는 질병의 치료, 치료, 예방 또는 진단에 유용하거나 사용되는 "치료제" 또는 "약물"을 나타낼 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 화학 물질, 항체, 항체 단편, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 단백질 또는 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드 유사체, 앱타머, 광앱타머, 스피에겔머 및 핵산을 포함하거나 이들로부터 선택되고 바람직하게는 상기 제제는 단백질 또는 폴리펩티드이다.
본원에 개시된 바와 같은 제제는 화학 물질, 항체, 항체 단편, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 단백질 또는 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드유사체, 앱타머, 광 앱타머, 스피에겔머 및 핵산의 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 제제는 하나 이상의 폴리펩티드 영역과 하나 이상의 비-폴리펩티드 영역의 조합을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 제제는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 이루어진 군을 포함하거나 이로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "화학 물질"은 가장 넓은 의미로 사용되며 일반적으로 일정한 화학 조성 및 특성을 갖는 실질적으로 순수한 물질을 지칭한다. 화학 물질은 유기 분자, 바람직하게는 작은 유기 분자일 수 있다. 용어 "작은 분자"는 제약에 일반적으로 사용되는 유기 분자와 비슷한 크기를 갖는 화합물, 바람직하게는 유기 화합물을 지칭한다. 이 용어는 생물학적 거대 분자(예를 들어, 단백질, 펩티드, 핵산 등)를 배제한다. 바람직한 작은 유기 분자의 크기는 약 5000 Da 이하, 예를 들어 약 4000 이하, 바람직하게는 3000 Da 이하, 더욱 바람직하게는 2000 Da 이하, 더욱 더 바람직하게는 약 1000 Da 이하, 예를 들어, 약 900, 800, 700, 600 또는 약 500 Da 이하이다.
용어 "항체"는 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 일반적으로 키메라, 인간화, 인간, 재조합, 형질전환, 그라프팅 및 단일 사슬 항체, 또는 임의의 융합 단백질, 접합체, 단편, 또는 관심 항원에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 도메인을 함유하는 또는 유도체 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 면역학적 결합제, 예컨대 전체 항체를 지칭한다. 이로써 용어 항체는 전체 면역 글로불린 분자, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 또는 이들 중 임의의 면역학적으로 유효한 단편 등을 포함한다. 따라서, 용어는 온전한 단일클론 항체, 다클론 항체, 다가(예를 들어, 2, 3 또는 그 이상) 및/또는 2개 이상의 온전한 것으로 형성된 다중 특이적 항체(예를 들어, 2 또는 그 이상의 특이적인 항체), 및 바람직한 생물학적 활성(특히, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 능력)을 나타내는 항체 단편과 이러한 단편의 다가 및/또는 다중 특이적 복합체를 포함한다. 용어 "항체"는 면역화를 포함하는 방법에 의해 생성된 항체를 포함 할뿐만 아니라, 임의의 폴리펩티드, 예를 들어 재조합적으로 발현된 폴리펩티드를 포함하며, 이는 관심 항원상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하도록 만들어진다. 따라서, 용어는 시험관 내, 세포 배양에서 또는 생체 내에서 생성되는지에 관계없이 이러한 분자에 적용된다.
용어 "면역 글로불린 서열"-본원에서 중쇄 항체 또는 통상적인 4-쇄 항체를 지칭하기 위해 사용되든지 간에, 전체 크기 항체, 이의 개별 쇄 및 모든 부분, 도메인 또는 이들의 단편(각각 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인과 같은 항원-결합 도메인 또는 단편을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 포함하는 일반적인 용어로서 사용된다. 또한, 본원에 사용된 용어 "서열"(예를 들어, "면역 글로불린 서열", "항체 서열", "가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어)은 일반적으로 문맥이 보다 제한된 해석을 요구하지 않는 한, 관련 아미노산 서열뿐만 아니라 이를 인코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "에피토프"는 면역 글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정 인자를 포함한다. 에피토프 결정 인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함할 수 있으며, 특정 3 차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합된 항원의 영역이다. 항체는 단백질 및/또는 거대 분자의 복합 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
용어 "결합 영역", "결합 부위" 또는 "상호 작용 부위"는 본원에서 관심 항원에 결합하는 아미노산 잔기의 특정 부위, 부분, 도메인 또는 스트레치의 의미를 가져야한다. 이러한 결합 영역은 본질적으로 본원에 기재된 항체의 특정 아미노산 잔기로 이루어지며, 이 잔기는 표적 분자와 접촉한다.
용어 "특이성"은 특정 항원-결합 분자 또는 항원-결합 단백질(예컨대 항체) 분자가 결합할 수 있는 상이한 유형의 항원 또는 항원 결정기의 수를 지칭한다. 항원-결합 단백질의 특이성은 친화도 및/또는 결합활성에 기초하여 결정될 수 있다. 항원과 항원 결합 단백질(KD)의 해리에 대한 평형 상수로 표시되는 친화도는 항원 결정 단백질과 항원 결합 단백질의 항원 결합 부위 사이의 결합 강도에 대한 척도이다. KD의 값이 적을수록, 항원 결정기와 항원 결합 분자 사이의 결합 강도가 더 강하다(또는, 친화도는 친화성 상수(KA), 즉 1/KD로 표현될 수 있음). 당업자에게 명백한 바와 같이, 친화도는 관심있는 특정 항원에 따라 자체 공지된 방식으로 결정될 수 있다. 결합활성은 항원 결합 분자(예: 항체)와 관련 항원 간의 결합 강도의 척도이다. 결합활성은 항원 결정 분자와 항원 결합 분자의 항원 결합 부위 사이의 친화성과 항원 결합 분자에 존재하는 적절한 결합 부위의 수와 관련이 있다. 일반적으로, 항원-결합 단백질(예컨대 항체)은 10-5 내지 10-12 몰/리터(M) 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터(M) 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수(KD), 및/또는 107 M-1 이상, 바람직하게는 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상(예: 1012 M-1 이상)의 결합 상수(KA)로 결합된다. 10-4 M보다 큰 KD 값은 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 바람직하게는, 항체는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 KD로 원하는 항원에 결합할 것이다. 항원-결합 단백질의 항원 또는 항원 결정 인자에 대한 특이적 결합은 예를 들어, 스캐차드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 분석, 예컨대 방사선 면역 분석(RIA), 효소 면역 분석(EIA) 및 샌드위치 경쟁 분석법, 및 당 업계에 공지된 이의 다른 변형된 방법을 포함하여 공지된 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다.
자연적으로 존재하는 전장 항체는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역 글로불린 분자이다. 각 쇄의 아미노 말단 부분은 그 안에 포함된 상보성 결정 영역(CDR)을 통한 항원 인식을 주로 담당하는 약 100-110개의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다.
CDR은 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역과 함께 산재되어 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 중쇄 가변 영역(HCVR)은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된다. 경쇄의 3개의 CDR은 "LCDR1, LCDR2 및 LCDR3"으로 지칭되고, 중쇄의 3개의 CDR은 "HCDR1, HCDR2 및 HCDR3"으로 지칭된다. CDR은 항원과 특이적인 상호 작용을 형성하는 대부분의 잔기를 함유한다. LCVR 및 HCVR 영역 내에서 CDR 아미노산 잔기의 번호 및 위치는 잘 알려진 카 바트(Kabat) 번호 규칙에 따르며, 이는 항체의 중쇄 및 경쇄 영역의 다른 아미노산 잔기보다 더 가변적인(즉, 초 가변) 아미노산 잔기의 번호를 매기는 시스템을 지칭한다. (Kabat, et al., Ann. NYAcad. Sci. 190:382-93(1971 ); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242(1991 )). 항체의 가변 영역에서 CDR의 위치는 카바트 넘버링 또는 간단히 "카바트"를 따른다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류되며, 당 업계에 공지된 특정 불변 영역을 특징으로 한다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류되며, 항체의 이소 타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로 정의한다. IgG 항체는 서브 클래스, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 추가로 분류될 수 있다. 각각의 중쇄 유형은 당 업계에 공지된 서열을 갖는 특정 불변 영역을 특징으로 한다.
특정 실시 양태에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 클래스 중 임의의 것일 수 있고, 바람직하게는 IgG 클래스 항체일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 항체는 다클론 항체, 예를 들어 이로부터 정제된 항혈청 또는 면역 글로불린(예를 들어, 친화성 정제)일 수 있다.
다른 구체 예에서, 항체는 단일클론 항체 또는 단일클론 항체의 혼합물일 수 있다. 단일클론 항체는 더 큰 선택성 및 재현성을 갖는 항원 내의 특정 항원 또는 특정 에피토프를 표적으로 할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 예를 들어 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 말하며, 이것이 생산되는 방법은 아니다. 단일클론 항체는 바람직하게는 균질 또는 실질적으로 균질한 집단에 존재한다. 본 발명의 단일클론 항체 및 이의 항원 결합 단편은 예를 들어 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술, 예를 들어 CDR-그라프팅 또는 이러한 기술의 조합, 또는 당 업계에 공지된 다른 기술에 의해 제조될 수 있다.
제한이 아닌 예로서, 단일클론 항체는 Kohler et al. 1975(Nature 256: 495), 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, US 4,816,567에서와 같이)에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체는 또한 Clackson et al. 1991(Nature 352: 624-628) 및 Marks et al. 1991(J Mol Biol 222: 581-597)에 기재된 기술을 사용하는 파지 항체 라이브러리를 사용하여 제조될 수 있다.
이들 후자의 기술은 특히 US5837500, US5571698, US5223409, US7118879, US7208293 및 US7413537에 기재된 파지 디스플레이 기술에 기초한다. 간략하게, 치료 후보 분자, 예를 들어 인간 항체 단편(예를 들어, Fab), 펩티드 및 작은 단백질은 박테리오파지(또는 파지)라고 하는 작은 박테리아 바이러스의 표면에 표시된다. 표시된 분자의 모음을 라이브러리라고 한다. 파지 디스플레이는 이들 라이브러리를 통해 바람직하게는 높은 특이성 및/또는 친화력으로 관심있는 표적, 예를 들어 치료 표적을 찾는 것을 가능하게 한다 . 파지 항체 라이브러리의 비 제한적 예는 HuCAL®(인간 조합 항체 라이브러리, Morphosys), Ylanthia®(Morphosys), WO200070023에 기재된 인간 Fab 단편 라이브러리, 및 WO 1996040878에 기재된 바와 같은 짧은 꼬리 항체 라이브러리를 포함한다. 인간 조합 항체 라이브러리(Morphosys)는 인간 게놈에서 인코딩된 항체의 구조적 레퍼토리를 포함하는 합성 컨센서스 서열을 사용하여 WO 199708320에 기술된 바와 같이 제조되었다.
용어 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단위"는 전장 항체의 일부 또는 영역, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 도메인을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 단편, 단일 도메인(sd) Fv, 예컨대 VH 도메인, VL 도메인 및 VHH 도메인, 디아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 특히 중쇄 항체; 및 항체 단편(들)로부터 형성된 다가 및/또는 다중 특이적 항체, 예를 들어, 디바디, 트리바디 및 멀티바디를 포함한다. 상기 명칭 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 등은 이들의 기술적으로 확립된 의미를 갖도록 의도된다.
용어 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 영역"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 이들은 둘 이상의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 이중 특이적, 또는 다중 특이적 형식일 수도 있다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CHI 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab') 2 단편; (iii) VH 및 CHI 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) dAb 단편(Ward et al., Nature, 341: 544-546(1989); PCT 공개 WO 90/05144 ), 단일 가변 도메인을 포함함; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인 인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 결합되어 VL 및 VH 영역 쌍이 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐)로 만들 수 있다(Bird et al., Science, 242: 423-426(1988); and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 5879-5883(1988)). 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도되며, 디아바디와 같은 다른 형태의 단일 사슬 항체도 포함된다.
디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄상에서 발현되지만, 동일한 쇄상의 두 도메인 사이의 페어링을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인이 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어링되도록 하고 2개의 항원 결합 부위를 생성하도록 하는 2가의 이중 특이적 항체이다(Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 6444-6448(1993); Poljak, et al., Structure 2: 1121-1123(1994)). 이러한 항체 결합 부분은 당 업계에 공지되어 있다(Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering(2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp.(ISBN 3-540-41354-5)).
또한, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 항체 또는 항체 부분의 공유 또는 비공유 결합에 의해 형성된 더 큰 면역 접착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역 접착 분자의 예는 사량체 scFv 분자를 제조하기 위해서는 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov, SM, et al., Human Antibodies and Hybridomas, 6: 93-101(1995)) 및 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘의 사용을 포함한다(Kipriyanov, et al., Mol. Immunol., 31: 1047-1058(1994)). Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부분은 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상적인 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 또한, 항체, 항체 부분 및 면역 접착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 항체 단편은 Nanobody®일 수 있다. "Nanobody®" 및 "Nanobodies®"라는 용어는 Ablynx NV(벨기에)의 상표이다. 용어 "나노바디(Nanobody)"는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용되는 바와 같이 다음에 의해 수득된 면역학적 결합제를 포함한다: (1) 자연 발생 중쇄 항체, 바람직하게는 낙타에서 유래된 중쇄 항체 유래의 VHH 도메인을 단리함으로써; (2) 자연 발생 VHH 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해; (3) 자연 발생 VHH 도메인의 "인간화" 또는 그러한 인간화된 VHH 도메인을 코딩하는 핵산의 발현에 의해; (4) 임의의 동물 종, 특히 인간과 같은 포유동물 종으로부터의 자연 발생 VH 도메인의 "동화"에 의해 또는 낙타화된 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 발현에 의해; (5) 당 업계에 기재된 "도메인 항체" 또는 "dAb"의 "동화" 또는 이러한 낙타화된 dAb를 코딩하는 핵산의 발현에 의해; (6) 자체 공지된 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 아미노산 서열을 제조하기 위해 합성 또는 반합성 기술을 사용함으로써; (7) 자체 공지된 핵산 합성 기술을 사용하여 나노바디를 코딩하는 핵산을 제조한 다음, 수득된 핵산의 발현에 의해; 및/또는 (8) 전술한 것 중 하나 이상의 임의의 조합에 의해. 본 명세서에서 사용되는 "낙타류"는 구세계 낙타류(쌍봉 낙타 및 단봉 낙타) 및 신세계 낙타류(예를 들어, 알파카, 라마 및 비쿠냐)를 포함한다.
나노 바디의 아미노산 서열 및 구조는 - 이에 제한되지 않고 - 4개의 프레임워크 영역 또는 "FR"를 포함하는 것으로 간주될 수 있으며, 이는 당 업계 및 본원에서 "프레임워크 영역 1"또는 "FR1"로; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"로; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"로; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로 각각 지칭되며; 프레임워크 영역들은 3개의 상보 결정 영역 또는 "CDR's"에 의해 중단되는데, 이 3개의 상보 결정 영역 또는 "CDR's은 이 기술 분야에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"로; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"로; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로서 각각 지칭된다. 나노바디에서 아미노산 잔기의 총 수는 110-120, 바람직하게는 112-115의 영역에 있을 수 있다. 그러나, 나노바디의 부분, 단편, 유사체 또는 유도체는 길이 및/또는 크기에 특별히 제한되지 않으며, 그러한 부분, 단편, 유사체 또는 유도체가 여기에 설명된 목적을 위해 본원에 요약된 추가 요구 사항을 충족하고 바람직하게는 적합하다는 점에 유의해야 한다.
중쇄 항체 및 그의 가변 도메인에 대한 일반적인 설명을 위해, 하기 참고 문헌을 참조한다: Vrije Universiteit의 WO 94/04678, WO 95/04079 및 WO 96/34103; Unilever의 WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 및 WO 02/48193; Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)의 WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 및 WO 03/055527; Algonomics N.V. 및 출원인의 WO 03/050531; National Research Council of Canada의 WO 01/90190; Institute of Antibodies의 WO 03/025020(= EP 1 433 793); 그리고 출원인의 WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 및 다른 공개된 특허출원들; Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363(6428): 446-8; Davies and Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21; 339(3): 285-90; Muyldermans et al., Protein Eng. 1994 Sep; 7(9): 1129-3; Davies and Riechmann, Biotechnology(NY) 1995 May; 13(5): 475-9; Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. 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상기 참고 문헌에 사용된 용어에 따르면, 자연 발생 중쇄 항체에 존재하는 가변 도메인은 또한 통상적인 4-에 존재 하는 중쇄 가변 도메인(본원에서 "VH 도메인"으로 지칭 됨) 및 통상적인 4-쇄 항체(본 명세서에서 "VL 도메인"으로 지칭 됨)에 존재 하는 경쇄 가변 도메인과 구별하기 위해 "VHH 도메인"으로 지칭될 것이다. 상기 언급된 종래 기술에서 언급된 바와 같이, VHH 도메인은 단리된 VHH 도메인(및 그에 기초한 나노바디, 이러한 구조적 특징 및 기능적 특성을 자연 발생 VHH 도메인과 공유함) 및 기능성 항원-결합 도메인 또는 단백질로서 사용하기에 매우 유리한 것을 함유하는 단백질을 만드는 다수의 독특한 구조적 특성 및 기능적 특성을 갖는다. 특히, 이에 제한되지 않고, VHH 도메인(본질적으로 "경쇄 가변 도메인의 존재 및 상호 작용없이 항원에 기능적으로 결합하도록 설계됨") 및 나노바디는 단일, 상대적으로 작은, 기능성 항원 결합 구조 단위, 도메인 또는 단백질로서 기능할 수 있다. 이는 VHH 도메인을 통상적인 4-사슬 항체의 VH 및 VL 도메인과 구별하는데, 이들은 그자체로 일반적으로 단일 항원-결합 단백질 또는 도메인으로서의 실제 적용에는 적합하지 않지만, 일부 형태 또는 다른 형태로 조합되어 기능적 항원 결합 단위를 제공한다(예를 들어, Fab 단편과 같은 통상적인 항체 단편에서와 같이; VL 도메인에 공유적으로 연결된 VH 도메인으로 구성된 ScFv의 단편에서).
특정 실시 양태에서, 항체 단편은 도메인 항체(dAb)일 수 있다. 용어 "dAb"에 대해서는, 예를 들어 Ward et al. Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11): 484-490(Nature 1989 Oct. 12; 341(6242): 544-6); 예를 들어 WO 06/030220, WO 06/003388 및 Domantis Ltd의 다른 공개된 특허 출원을 참조로 한다. 단일 도메인 항체 또는 단일 가변 도메인은 특정 종의 상어로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 소위 "IgNAR 도메인" ", 예를 들어 WO 05/18629 참조).
추가의 실시 양태에서, 항체 또는 항체 단편은 각각 상이한 항원 또는 항원 결정기에 대해 명시된 2개 이상의(예를 들어, 2개, 3개 등) 결합 부위를 포함하는 다중 특이적(예를 들어, 이중 특이적, 3중 특이적 등의 항체)일 수 있다. .
일부 실시 양태에서, 치료제는 이중 가변 도메인 면역 글로불린(DVD-IgTM)일 수 있다.
용어 항체는 임의의 동물 종, 바람직하게는 척추 동물 종, 예를 들어 조류 및 포유동물로부터 유래된 하나 이상의 부분으로부터 유래되거나 이를 포함하는 항체를 포함한다. 제한없이, 항체는 닭, 칠면조, 거위, 오리, 기니 닭, 메추라기 또는 꿩일 수 있다. 또한, 제한없이, 항체는 인간, 쥐(예를 들어, 마우스, 랫트 등), 돼지, 당나귀, 토끼, 염소, 양, 기니피그, 원숭이(예를 들어, 마카카 원숭이), 낙타 중쇄 항체를 포함하는 낙타(예를 들어, 쌍봉낙타 및 단봉낙타) , 라마 중쇄 항체를 포함하는 라마(예를 들어, 알파카, 라마 또는 비쿠냐), 또는 말일 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체는 또한 2 종 이상의 동물 종으로부터 유래된 "키메라 항체"를 포함한다. 보다 구체적으로, 용어 "키메라 항체" 또는 "키메라 항체들"은 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 갖는 항체, 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 개, 말 또는 고양이 불변 영역에 연결된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체로부터의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 중쇄 및/또는 경쇄의 일부를 포함하지만, 사슬(들)의 나머지는 동일하다 다른 생물 종의 항체 또는 다른 항체 부류 또는 서브 클래스에 속하는 항체 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는, 이러한 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다(예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855(1984)). 키메라 항체는 한 종, 예를 들어 마우스 또는 원숭이로부터의 단일클론 항체의 일부, 예를 들어 Fv 영역을 코딩하는 DNA를, 다른 종, 예를 들어 인간으로부터의 항체-생성 DNA와 병합함으로써 제조된다.
특정 실시 양태에서, 치료제는 "완전 인간 항체"일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "완전 인간 항체"는 인코딩 유전자 정보가 인간 기원인 항체를 지칭한다. 따라서, 용어 "완전 인간 항체"는 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열에서만 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 따라서, "완전 인간 항체"라는 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하지 않는다. 완전한 인간 항체는 상기한 바와 같은 파지 인간 항체 라이브러리로부터 유래될 수 있거나, Lonberg 및 Husznar 1995(Int. Rev. Immunol. 13(1): 65-93)에 기재된 쥐 면역 글로불린 인코딩 영역을 대체하도록 조작된 형질전환 마우스의 면역화를 통해 수득될 수 있다. 파지 디스플레이를 사용하여 제조된 완전 인간 항체는 바람직하게는 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성하는 인간 세포주에서 재조합 발현에 의해 생성된다. 완전 인간 항체의 비 제한적 예는 HuCAL® 항체(Morphosys)이다. HuCAL® 항체를 구축하기 위한 유전자 정보는 HuCAL® 항체 라이브러리(Morphosys)로부터 추출되고 벡터 형태(즉, 형질감염)로 인간 PER.C6® 세포에 도입된다. 형질감염된 세포는 유전자 정보를 단백질로 번역한다. 단백질은 글리코실화에 의해 추가로 변형되고 생성된 항체 분자는 최종적으로 세포에 의해 배양 배지로 분비된다.
본원에 사용된 용어 항체는 또한 "인간화된 항체"를 포함하며, 이는 인간에서 자연적으로 생성된 항체와 그의 유사성을 증가시키도록 단백질 서열이 변형된 비인간 종으로부터 유래된 항체이다. 보다 구체적으로, 용어 "인간화된 항체"는 비인간 종(예를 들어, 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 보다 "인간-유사", 즉 인간 생식선 가변 서열과 더 유사하도록 변경된 항체를 말한다. 한 유형의 인간화 항체는 CDR-그래프팅된 항체이며, 여기서 비인간 CDR 서열은 인간 VH 및 VL 서열로 도입되어 상응하는 인간 CDR 서열을 대체한다.
인간화 항체는 관심 항원에 면역 특이적으로 결합하고 인간 항체의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 프레임워크(FR) 영역 및 비인간 항체의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. 인간화된 항체는 실질적으로 모든 또는 적어도 하나의, 전형적으로는 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv)을 포함하며, 여기서 비인간 면역 글로불린(즉, 공여자 항체)에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역 및 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역 글로불린 공통 서열의 것들이다. 인간화 항체는 또한 면역 글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역 글로불린의 것의 적어도 일부를 포함한다. 인간화 항체는 경쇄 및 적어도 중쇄의 가변 도메인 둘 다를 함유할 수 있다. 항체는 또한 중쇄의 CHI, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간화된 항체는 인간화된 경쇄 또는 인간화된 중쇄만을 함유할 수 있다. 예시적인 인간화 항체는 경쇄의 인간화 가변 도메인 및 중쇄의 인간화 가변 도메인을 함유한다.
또한, 예를 들어, 인간화 항체는 낙타과, 특히 라마(예를 들어, 알파카, 라마 및 비쿠냐)로부터 통상적인 항체(즉, 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역 글로불린 분자)로부터 유래될 수 있고, 그 가변 도메인은 인간 항체의 가변 도메인과 높은 정도의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다. 이러한 인간화 항체의 생산에 적합한 플랫폼은 WO 2011080350에 기재된 SIMPLE Antibody 플랫폼(ArGEN-X)이다.
통상의 기술자는 항체가 하나 이상의 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환(예를 들어, 보존적 치환)을 포함할 수 있으며, 이러한 변경은 각각의 항원의 그의 결합을 보존한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 미국 특허 8,323,962에 기재된 바와 같이 면역원성을 손상시키지 않으면서 생체 내 반감기를 연장시키기 위해 돌연변이를 항체, 특히 Fc 영역에 도입할 수 있다.
항체는 또한 그 구성 아미노산 잔기의 하나 이상의 고유 또는 인공 변형(예를 들어, 글리코실화 등)을 포함할 수 있다.
다클론 및 단일클론 항체 및 이의 단편의 제조 방법은 재조합 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법과 같이 당 업계에 잘 알려져있다(예를 들어, Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988; Harlow and Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447; "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", by Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760; "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach", by Dean & Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229; Methods in Molecular Biology, vol. 248: "Antibody Engineering: Methods and Protocols", Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921 참조)
제시 담체에 임의로 융합되거나 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되거나, 결합 또는 흡착된 면역화 항원을 사용하여 동물, 예를 들어 실험실 또는 농장 동물과 같은 비인간 동물을 면역화하는 방법 및 면역 혈청으로부터의 항체 또는 세포 시약의 제조 방법 그 자체는 잘 알려져 있으며 본 명세서의 다른 곳에서 언급된 문서에 기술되어 있다. 면역화될 동물은 임의의 동물 종, 바람직하게는 온혈 종,보다 바람직하게는 척추동물 종, 예를 들어 조류 및 포유동물을 포함할 수 있다. 제한없이, 항체는 닭, 칠면조, 거위, 오리, 기니 닭, 메추라기 또는 꿩일 수 있다. 또한, 제한없이, 항체는 인간, 쥐(예를 들어, 마우스, 랫트 등), 돼지, 당나귀, 토끼, 염소, 양, 기니피그, 낙타, 라마 또는 말일 수 있다. 용어 "제시 담체" 또는 "담체"는 제 2 분자에 결합될 때, 일반적으로 추가의 T 세포 에피토프의 제공을 통해, 후자의 면역 반응을 증강시키는 면역원성 분자를 의미한다. 제시 담체는 특히 글리칸, 폴리에틸렌글리콜, 펩티드 모방체, 합성 중합체 등과 같은(폴리)펩티드 구조 또는 비 펩티드 구조일 수 있다. 예시적인 비 제한 담체는 인간 B 형 간염 바이러스 코어 단백질, 다중 C3d 도메인, 파상풍 독소 단편 C 또는 효모 Ty 입자를 포함한다. 면역 후, 동물로부터의 항체-생성 세포를 분리하여 당 업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 단일클론 항체-생산 혼성세포를 생성하는 데 사용할 수 있다.
재조합 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법은 숙주 유기체 또는 세포를 필요로 한다. 용어 "숙주 세포" 및 "숙주 유기체"는 박테리아와 같은 원핵생물 및 진핵생물, 예컨대 효모, 진균, 원생동물, 식물 및 동물을 포함하는 세포 또는 유기체를 적절하게 지칭할 수 있다. 항체의 생산을 위한 숙주 유기체 또는 세포로서 고려되는 것은 특히 단세포 유기체, 예컨대 박테리아(예를 들어, 대장균) 및(배양된) 동물 세포(예를 들어, 포유동물 세포 또는 인간 세포)를 포함한다. 박테리아에서 항체를 생산하는 이점은 다른 것들 중에서도 박테리아 세포의 비교적 안전하고 간단한 취급 및 미생물의 빠른 복제주기이다. 박테리아는 간단한 구조를 갖는 항체 단편의 생산에 특히 적합하다. 원핵 세포에서 전장 면역 글로불린 또는 보다 복잡한 항체 단편의 생산을 위해, 박테리아 세포는 각각 항체 단편 또는 면역 글로불린의 상이한 부분, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 적어도 2개의 핵산으로, 전장 면역 글로불린에 대해서는 WO 2009021548에 기재된 바와 같이, 형질전환될 수 있다. 박테리아 세포에서, 항체를 코딩하는 유전 정보를 읽고 단백질로 번역한다. 생성된 항체는 주변 세포질 공간에 축적되고 박테리아 세포의 용해시 수확될 수 있다. 항체를 정제하기 위해 추가의 분리 단계가 수행될 수 있다. WO 2009021548은 대장균-기반 분비 시스템을 기술하며, 여기서 박테리아는 항체 인코딩 작제물로의 신호 서열의 도입으로 인해 박테리아가 주변 배양 배지에서 항체를 방출한다. 이는 세포 배양 배지로부터 항체를 쉽고 편리하게 정제할 수 있게 한다. 항체 생산에 사용될 수 있는 예시적인 포유동물 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 항체 생산에 적합한 예시적인 인간 세포주는 ECAC no. 96022940 및 WO 2000063403 또는 그의 유도체에 기술되어 있다. 인간 세포주는 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성하기 때문에 완전 인간 항체의 생산에 특히 적합하다.
달리 지시되지 않는 한, 구체적으로 상세히 기술되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자에게 명백한 바와 같이 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행되었다. 예를 들어 표준 핸드북뿐만 아니라 여기에 언급된 일반적인 배경 기술 및 여기에 인용된 추가 참조를 다시 참조한다.
Wnt 시그널링을 활성화시키는 능력은 FZD 및 LRP, 예를 들어 FZD/LRP 복합체에 결합하는 천연 Wnt 리간드의 신호전달 효과 및/또는 활성을 모방, 재생 또는 근사화하는 본원에 개시된 바와 같은 제제의 능력을 지칭한다.
Wnt 시그널링의 활성화 성능은 하나 이상의 Wnt 표적 유전자의 발현, TCF 리포터 유전자 발현, 베타-카테닌 안정화, LRP 인산화 및/또는 공지된 바와 같이 세포질로부터 세포막으로의 Axin의 전위를 측정함으로써 적절하게 결정 및/또는 정량될 수 있다. 예를 들어, Wnt 시그널링의 활성화는 Wnt 시그널링의 1차 출력인 TCF 유전자의 발현을 측정함으로써(예를 들어, RT-PCR 또는 임의의 다른 전사체 검출 방법에 의해) 적절하게 결정 및/또는 정량될 수 있다(Nature, 1997, vol. 385(6619), 829-33). 예를 들어, TCF 리포터 분석(TOP/FOP 또는 TOPflash라고도 함)을 사용하여 TCF/LEF 제어 유전자의 전사 변화를 평가할 수 있다. TCF 리포터 분석은 루시페라제 리포터 분석일 수 있다. 또한, 예를 들어, Wnt 시그널링의 활성화는 c-myc(He et al., 1998, Science, 281(5382), 1509-12), n-myc(Ten Berge et al., 2008, Development, 135(19), 3247-57), LEF1(Hovanes et al., 2001, Nat Genet, 28(1), 53-7; Filali et al., 2002, J Biol Chem, 277(36), 33398-410) 또는 c-jun(Mann et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96(4), 1603-8)의 발현을 측정함으로써 적절하게 결정 및/또는 정량될 수 있다.
대안적으로, Wnt 시그널링의 활성화는 β-카테닌의 위치, 수준 및/또는 인산화 상태를 측정함으로써 결정될 수 있다. 이러한 분석의 비 제한적인 예는 "β-카테닌 재분배 분석"(Thermo Scientific)으로, 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 C-말단에 융합된 인간 β-카테닌을 안정적으로 발현하는 재조합 U20S 세포를 제공한다. 이 분석은 막으로부터 핵으로의 GFP-β-카테닌 융합 단백질의 전위의 시각화 및 모니터링을 가능하게 한다. Wnt 시그널링의 활성화를 결정하는 또 다른 방법은 예를 들어 GFP-Axin 융합 단백질을 이용한 Axin 전위의 시각화이다.
특정 실시 양태에서, 제제가, 예를 들어 본원의 다른 곳에 기재된 분석법에서 측정된, 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 Wnt/β-카테닌 시그널링 기준선 또는 백그라운드와 비교하여, Wnt/β-카테닌 시그널링을 10배 이상, 20배 이상, 30배 , 40배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 250배 이상, 500배 이상, 750배 이상, 1000배 이상, 1x104 배 이상, 또는 1x105 배 이상 향상시키는 경우, 본원에 개시된 제제는(정규) Wnt 시그널링을 활성화할 수 있는 것으로 간주될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 제제가, 예를 들어 본원의 다른 곳에 기재된 분석법에서 측정된, 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 Wnt/β-카테닌 신호 기준선 또는 백그라운드와 비교하여 Wnt/β-카테닌 시그널링을 10배 미만, 예를 들어 최대 5 배 또는 최대 2.5 배 향상시키거나, 증가시키지 않거나 심지어 감소시키는 경우(예를 들어, 2 배 미만 또는 5 배 미만 또는 10배 미만), 본원에 개시된 바와 같은 제제는(정규) Wnt 시그널링을 활성화시키지 않는 것으로 간주될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 제제에 의해 유도된 RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성이, RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 상기 제제에 의해 유도된 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성보다 3.5 배 이상, 5 배 이상, 10배 이상, 15 배 이상, 20배 이상, 25 배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 500배 이상, 1000배 이상, 1x104 배 이상, 또는 1x105 배 이상, 바람직하게는 적어도 50배 이상이라면, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시키지만, RECK 및/또는 GPR124 부재 시 Frizzled/LRP-매개 Wnt는 활성화시키지 않는 것으로 간주될 수 있다. RECK 및/또는 GPR124 부재 시 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 신호 활성(이 단락에서“활성 1”으로 표시)과 Frizzled/LRP-매개 Wnt 신호 활성(이 단락에서“활성 2”로 표시)을 비교하기 전에, 제제에 의해 유도된 활성 1 및 활성 2는 각각 야생형 Wnt7a에 의해 유도된 활성 1 및 활성 2로 정규화될 수 있으며, 후자는 예를 들어 100% 활성을 나타내도록 설정된다.
예를 들어, 1) GPR124, RECK, FZ 및 LRP를 발현하는 세포 및 별도로 2) FZ 및 LRP를 발현하지만 GPR124 및/또는 RECK를 발현하지 않는 세포를 포함하는 시험관 내 또는 생체 내 세포 분석 시스템에서, 그 외에는 1) 및 2)가 실질적으로 동일한 경우, 실질적으로 동일한 조건 하에서 동일한 양의 상기 제제에 의해 유도된 Wnt 시그널링 활성이 2) 조건의 세포보다 1) 조건의 세포가 3.5 배 이상, 5 배 이상, 10배 이상, 15 배 이상, 20배 이상 더 많고, 적어도 25 배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 500배 이상, 1000배 이상, 1x104배 이상, 또는 1x105배 이상이라면 제제는 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화하나 RECK 및/또는 GPR124가 없을 때 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링은 활성화하지 않는 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 1) 및 2) 하의 세포는 동일한 1차 세포 공급원으로부터 유래하거나, 동일한 세포주일 수 있고, GPR124 및/또는 RECK의 발현이 상이하도록 유전자 조작될 수 있다.
Wnt 시그널링 경로의 활성화는 세포 막에서 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드의 밀접한 회합 또는 상호 근접성을 촉진함으로써 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드를 포함하는 막 관련 이종 올리고머를 형성함으로써 일어날 수 있다. Frizzled-LRP 헤테로-올리고머의 리간드-구동 형성시, LRP 폴리펩티드의 세포 내 부분은 예를 들어 CK1 및 GSK-3에 의해 인산화에 접근할 수 있게 되고, 이는 Axin에 대한 그의 친화력을 크게 증가시킨다. 둘째, LRP 폴리펩티드와 함께 이종 올리고머에 존재할 때, Frizzled 폴리펩티드의 세포 내 부분은 인산화 및 DVL의 동원을 유도할 수 있다. 활성화된 LRP-FZD-DVL-Axin 복합체의 생성된 어셈블리는 베타-카테닌의 파괴 복합체의 해리를 간접적으로 유도하여, 베타-카테닌이 세포질에 축적되고 베타-카테닌이 유전자 전사를 유도할 수 있는 세포핵으로 이동될 수 있게 한다 .
따라서, 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 RECK 및 GPR124의 존재 하에 세포막에서 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드의 이종체화(예를 들어, 이종이량체화)를 유도할 수 있지만, RECK 및/또는 GPR124 부재 하에서는 그렇지 않다.
세포막에서 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드의 이종체화 또는 밀접한 결합을 달성하기 위해, 예를 들어 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드 둘 다의 세포 외 부분에 결합함으로써 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드 둘 다에 동시에 결합할 수 있는 제제가, 사용될 수 있다.
세포막에서 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드의 이종체화는, 면역 형광 염색, 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의해 형광 표지된 막 단백질의 이종체화를 가시화하는 것, Dvl의 존재 및 인산화를 검출하는 것과 같은 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드의 이종체화의 다운 스트림 이벤트의 발생을 측정하는 것과 같은, 막 단백질의 이종체화를 결정하기 위해 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.
따라서, 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 RECK 및 GPR124의 존재 하에 세포막에서 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있지만, RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에서는 그렇지 않다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "결합", "상호 작용", "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 상호 작용"은 제제가 하나 이상의 목적하는 분자 또는 피분석물에 결합하거나 영향을 미치는 것을 의미하고, 실질적으로 랜덤이거나 관련이 없는 다른 분자는 배제하고, 선택적으로 구조적으로 관련된 다른 분자를 배제한다. 상기 용어는 반드시 제제가 의도된 표적(들)에 독점적으로 결합할 것을 요구하지는 않는다. 예를 들어, 결합 조건 하에서 이러한 의도된 표적(들)에 대한 친화도가 약 비 표적 분자에 대한 친화성보다 2 배 이상, 바람직하게는 약 5 배 이상, 보다 바람직하게는 약 10배 이상, 더욱 바람직하게는 약 25 배 이상, 더욱 바람직하게는 약 50배 이상, 더욱 바람직하게는 약 100배 이상, 예를 들어, 약 1000배 이상, 약 1x104 배 이상, 또는 약 1x105 배 이상이면 제제가 관심 표적(들)에 특이적으로 결합한다고 말할 수 있다
제제와 이의 의도된 표적(들) 사이의 결합 또는 상호 작용은 공유(즉, 원자들 사이에서 전자 쌍의 공유를 포함하는 하나 이상의 화학 결합에 의해 매개 됨), 또는, 보다 전형적으로는 비공유(즉, 예를 들어, 수소 결합, 쌍극성 상호 작용, 반데르발스 상호 작용 등과 같은 비공유력)일 수 있다. 바람직하게는, 제제는 이러한 결합의 친화도 상수(KA) KA≥1×106 M-1의 친화력 상수(KA), 보다 바람직하게는 KA≥1×107 M-1, 더욱 바람직하게는 KA≥1×108 M-1, 더욱 바람직하게는 KA≥1×109 M-1, 더욱더 바람직하게는 KA≥ 1×1010 M-1 또는 KA≥ 1×1011 M-1를 가지고 의도된 표적(들)에 결합하거나 그의 의도된 표적(들)과 상호 작용할 수 있으며, 여기서 KA = [A_T]/[A][T], A는 제제를 나타내고, T는 의도된 표적을 나타낸다. KA의 측정은 예를 들어 평형 투석 및 스캐차드 플롯(Scatchard plot) 분석을 사용하는 것과 같이 당 업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 제제의 표적에 대한 결합 및 상기 결합의 친화도 및 특이성은 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 이의 비 제한적 예는 공동 면역 침전, 이분자 형광 상보, 친화성 전기 영동, 라벨 전달, 파지 디스플레이, 근접 결찰 분석(PLA), 탠덤 친화성 정제(TAP), 인실리코 도킹 및 예측된 깁스(Gibbs) 결합 에너지의 계산 및 경쟁 결합 분석이 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 하나 이상의 상이한 Frizzled 폴리펩티드, 예를 들어 Fzd 1, Fzd2, Fzd3, Fzd4, Fzd5, Fzd6, Fzd7, Fzd8, Fzd9 및 Fzd10로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 Frizzled 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 제제는 적어도 Fzd4, 및 임의로 하나 이상의 다른 Fzd에 특이적으로 결합할 수 있고; 또는 실질적으로 다른 Fzd를 배제하고 Fzd4에 특이적으로 결합할 수 있다. Fzd4는 중추 신경계의 내피세포에서 지배적인 Fzd 패밀리 구성원인 것으로 여겨진다. 보다 바람직하게는, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 인간 Fzd4에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 제제는 하나 이상의 바람직한 Frizzled 폴리펩티드에 대해 선택적일 수 있으며, 예를 들어 하나 이상의 바람직한 Frizzled 폴리펩티드에 대한 특이성이 다른 바람직하지 않은 Frizzled 폴리펩티드와 비교하여 5 배 이상, 10배 이상, 25 배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 1000배 이상, 1x104 배 이상, 또는 1x105 배 이상일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 Wnt 시그널링에 관여하는 하나 이상의 상이한 LRP 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 LRP5 및/또는 LRP6, 예를 들어 LRP5 및 LRP6 중 임의의 하나 또는 각각에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게는, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 인간 LRP5 및/또는 LRP6, 예를 들어 인간 LRP5 및 인간 LRP6 중 임의의 하나 또는 각각에 결합할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 제제는 하나 이상의 바람직한 LRP 폴리펩티드에 대해 선택적일 수 있으며, 예를 들어 하나 이상의 바람직한 LRP 폴리펩티드에 대한 특이성이 다른 바람직하지 않은 LRP 폴리펩티드와 비교하여 적어도 5 배, 10배 이상, 25 배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 1000배 이상, 1x104 배 이상, 또는 1x105 배 이상일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 GPR124 및/또는 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드, 및 GPR124 및/또는 RECK 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 Frizzled, LRP 및 RECK 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있다.
RECK는 5 개의 N-말단 시스테인-노트(CK) 모티프 또는 영역(즉, CK1, CK2, CK3, CK4 및 CK5), 시스테인이 풍부한 도메인(CRD) 및 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI)-앵커 부위 앞의 3개의 카잘 모티프로 구성된다. CK 모티프, CRD 및 카잘 모티프는 세포 외에 위치한다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같이 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제제는 CK1 모티프, CK2 모티프, CK3 모티프, CK4 모티프, CK5 모티프, CRD 및/또는, RECK 폴리펩티드의 하나 이상의 카잘 모티프에 결합할 수 있다.
본 발명자들은 RECK 폴리펩티드에, 특히 본원에 개시된 바와 같은 RECK 폴리펩티드의 CK4 및/또는 CK5 영역에 결합할 수 있는 제제의 결합이 GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링의 활성화를 확립하는 데 중요한 것으로 보인다는 것을 발견하였다.
따라서, 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 RECK 폴리펩티드의 CK4 및/또는 CK5 영역에 결합할 수 있다.
CK4 모티프는 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이 NCBI Genbank 수탁 번호 NP_066934.1로 등재된 인간 RECK 단백질의 아미노산 서열의 아미노산 C292 내지 C338에 걸쳐있다. 따라서, 인간 RECK의 CK4 모티프는 아미노산 서열 CCDRAEDHACQNACKRILMSKKTEMEIVDGLIEGCKTQPLPQDPLWQC(서열 번호 5)를 포함하거나, 필수적으로 그 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그 아미노산 서열로 이루어지고, 인간 RECK의 CK5 모티프는 아미노산 서열 CCSKANTSTCRELCTKLYSMSWGNTQSWQEFDRFCEYNPVEVSMLTC(서열 번호 6)를 포함하거나, 필수적으로 그 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 서열 번호: 5의 아미노산 서열 및/또는 서열 번호: 6의 아미노산 서열에 결합할 수 있다.
Frizzled 수용체는 G 단백질-커플링된 수용체 단백질이며 길이는 약 500 내지 약 700개의 아미노산이다. N-말단은 세포 외인 것으로 예측되며 대략 120개 아미노산의 시스테인 풍부 도메인 CRD)에 이어 대략 40-100개 아미노산의 친수성 링커 영역을 포함한다. Frizzled 수용체는 또한 막전위 알파-나선을 형성할 것 예측되는 7개의 소수성 도메인을 포함한다. 세포 내 C-말단 도메인은 가변 길이를 갖고, 세포 내 도메인은 상이한 패밀리 구성원들 사이에서 전체적으로 잘 보존되지 않지만, 근위 KTXXXW 아미노산 모티프(서열 번호 7)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있고, 이는 Frizzled 폴리펩티드에서 고도로 보존되고 정규 Wnt 시그널링에 필요하다.
Frizzled CRD 도메인은 10개의 불변 간격 시스테인의 모티프로 구성되며 알려진 Frizzled 계 구성원간에 크게 보존되지만 RECK, 분비된 frizzled 관련 단백질(SFRP), 수용체 티로신 키나제(RTK) 및 콜라겐 α1 XVIII에도 있다. CRD 도메인은, 예를 들어 리간드 접촉 부위 1에 존재 하는 시스-불포화지방 아실기 또는 Wnt 리간드 "검지" 접촉 부위 2에 존재 하는 잔기의 인식 및/또는 결합에 의해 Frizzled 폴리펩티드에 대한 리간드(예를 들어, Wnt) 결합에 중요하다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 제제는 Frizzled 폴리펩티드의 시스테인-풍부 도메인(CRD)에 결합할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 제제는 Frizzled 폴리펩티드의 CRD 도메인 또는 CRD 내의 "검지" 접촉 부위 내에 위치한 시스-불포화지방 아실기-결합 도메인에 결합할 수 있다.
LRP의 N-말단 세포 외 도메인은 4개의 YWTD(서열 번호 8) 반복 도메인(또는 베타-프로펠러 도메인), 4개의 표피 성장 인자(EGF)-유사 도메인 및 LDLR-유사 도메인(LDLRLD)으로 구성된다. 단일 YWTD 반복 도메인은 6개의 탠덤 YWTD 시퀀스를 포함한다. 처음 2개의 대부분의 N-말단 YWPD 반복 도메인은 Wnt 리간드에 결합하는 것으로 예측되고, YWPD 반복 도메인의 두번째 2개 세트는 Dickkopf(DKK)에 결합하는 것으로 예측된다. N-말단 세포 외 도메인 다음에는 단일 막-스패닝 세그먼트 및 1 내지 3개의 NPXY 모티프(서열 번호 9) 사이, 또는 1 내지 5개의 PPPSP 모티프(서열 번호 10)(예를 들어 LRP5 및 LRP6) 사이에 존재 하는 세포질 꼬리가 있으며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다(예를 들어 LRP1, LRP2, LRP4, APOER2, LDLR, LRP9).
용어 "Dickkopf" 또는 "DKK"는 DKK1(RefSeq 단백질: NP_036374.1; GeneID: 22943), DKK2(RefSeq 단백질: NP_055236 1; GeneID: 27123), DKK3(RefSeq 단백질: NP_001317149.1; GeneID: 27122) 및 DKK4(RefSeq 단백질: NP_055235.1; GeneID: 27121)를 포함하는 공지된 인간 DKK 단백질과 같은 DKK 패밀리의 모든 구성원을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 용어는 특히 DKK1을 나타낼 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 LRP 폴리펩티드의 세포 외 도메인에 결합할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 LRP 폴리펩티드의 DKK-결합 부위에 결합할 수 있다. 보다 특정한 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 LRP5 및/또는 LRP6 폴리펩티드의 DKK1-결합 부위에 결합할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 LRP 폴리펩티드의 Wnt-결합 부위에 결합할 수 있다. 보다 특정한 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 LRP5 및/또는 LRP6 폴리펩티드의 Wnt-결합 부위에 결합할 수 있다.
추가의 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 LRP 폴리펩티드의 DKK-결합 부위 및 Wnt-결합 부위에 결합할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 LRP 폴리펩티드의 β-프로펠러-EGF-유사 도메인 1 및 2(P1E1P2E2) 및/또는 β-프로펠러-EGF-유사 도메인 3 및 4(P3E3P4E4)에 결합할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 제제는 RECK-결합 도메인 및 Frizzled-결합 도메인, 및 임의로 LRP-결합 도메인을 포함한다. 보다 특정한 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인 및 LRP-결합 도메인을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 제제의 RECK-결합 도메인은 높은 친화도로 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있는, 예컨대 약 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M 이상, 1 x 10-9 M 이상; 1 x 10-10 M 이상, 1 x 10-11 M 이상, 또는 1 x 10-12 M 이상의 해리 상수(KD)로 RECK 폴리펩티드에 결합하는, 임의의 도메인일 수 있다. 예를 들어, KD는 약 5 x 10-6 M 이상이다.
특정 실시 양태에서, 상기 RECK-결합 도메인은 RECK 특이적 항체를 포함하거나, 항체의 RECK-결합 영역, 바람직하게는 가변 영역 서열 또는 CDR을 포함한다. 바람직하게는, RECK 특이적 항체는 RECK 폴리펩티드의 세포 외 부분, 예컨대 RECK 폴리펩티드의 CK4 및/또는 CK5 영역(들)에 관한 것이다. RECK 항체의 비 제한적 예는 당해 분야에 공지되어 있고 상업적으로 이용 가능하고, 예를 들어 Abcam(예를 들어, 인간 전장 RECK에 특이적인 ab88249 및 ab89915), Cell Signaling Technology (예를 들어, 인간, 마우스, 쥐, 원숭이 RECK(D8C7)에 특이적인 # 3433), ), Santa Cruz(예: 인간 RECK의 C-말단에 특이적인 sc-373929)로부터 구입가능하다.
특정 실시 양태에서, RECK-결합 도메인은 RECK 특이적 항체의 각각의 CDR(들)과 각각 독립적으로 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 CDR(들)을 포함한다.
특정 실시 양태에서, RECK-결합 도메인은 RECK 특이적 scFv, 예컨대 RECK 특이적 항체의 하나 이상의(바람직하게는 모든 6) CDR(들)을 포함하는 scFv이다.
특정 실시 양태에서, RECK-결합 도메인은 RECK 특이적 VHH, 예컨대 RECK 특이 중쇄 항체의 하나 이상의(바람직하게는 모든 3) CDR(들)을 포함하는 VHH이다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 RECK-결합 도메인은 둘 이상의 상이한 RECK 특이적 항체의 각각의 CDR(들)과 각각 독립적으로 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 2 이상의 CDR(들)을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 상기 RECK-결합 도메인은 RECK-결합 폴리펩티드, 예를 들어, Wnt 리간드 또는 Wnt 폴리펩티드를 포함하거나, 그로부터 필수적으로 구성되거나, 구성되거나 또는 유도된다(예를 들어 생물학적 활성 단편 또는 변이체). 바람직하게는, RECK-결합 도메인은 본원의 다른 곳에 기술된 Wnt7 폴리펩티드(예를 들어, Wnt7a 또는 Wnt7b), 더욱 바람직하게는 인간 또는 쥐 Wnt7 폴리펩티드, 더욱 더 바람직하게는 인간 Wnt7 폴리펩티드(예를 들어, 인간 Wnt7a 또는 인간Wnt7b)로부터 유래된다. 예를 들어, 특정 실시 양태에서, RECK-결합 도메인은 Wnt7(예를 들어, Wnt7a 또는 Wnt7b), 바람직하게는 인간 또는 마우스 Wnt7, 보다 바람직하게는 인간 Wnt7(예를 들어, 인간 Wnt7a 또는 인간Wnt7b)의 RECK-결합 단편 또는 그 변이체를 포함하거나, 그로부터 필수적으로 구성되거나, 구성된다. 추가의 예에서, 특정 실시 양태에서, RECK-결합 도메인은 아미노산 서열 VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT(서열 번호 18) 또는 VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET(서열 번호 19)와의 서열 동일성이 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상 . 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 95% 이상, 또는 99% 이상, 바람직하게는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
용어 "Wnt", "Wnt 리간드" 또는 "Wnt 폴리펩티드"는 Wnt 패밀리의 임의의 및 모든 구성원을 포함한다. 추가 지침에 의해, 표 2는 NCBI Genbank 및 Uniprot에 주석이 달린 19명의 알려진 인간 Wnt 패밀리 구성원을 제시한다.
NCBI Genbank Uniprot
GeneID mRNA 단백질 단백질
WNT1 7471 NM_005430.3 NP_005421.1 P04628.1
WNT2 7472 NM_003391.2 NP_003382.1 P095544.1
WNT2B 7482 NM_004185.4 NP_004176.2 Q93097.2
WNT3 7473 NM_030753.4 NP_110380.1 P56703.2
WNT3A 89780 NM_033131.3 NP_149122.1 P56704.1
WNT4 54361 NM_030761.4 NP_110388.2 P56705
WNT5A 7474 NM_003392.4 NP_003383.2　 P41221.1
WNT5B 81029 NM_030775.2 NP_110402.2 Q9H1J7.2
WNT6 7475 NM_006522.3 NP_006513.1 Q9Y6F9
Wnt7a 7476 NM_004625.3 NP_004616.2 O00755.2
WNT7B 7477 NM_058238.2 NP_478679.1 P56706.2
WNT8A 7478 NM_001300939.1 NP_001287868.1 Q9H1J5.1
WNT8B 7479 NM_003393.3 NP_003384.2 Q93098.3
WNT9A 7483 NM_003395.2 NP_003386.1 O14904.2
WNT9B 7484 NM_001320458.1 NP_001307387.1 E7EPC3
WNT10A 80326 NM_025216.2 NP_079492.2 Q9GZT5.1
WNT10B 7480 NM_003394.3 NP_003385.2 O00744.2
WNT11 7481 NM_004626.2 NP_004617.2 O96014.2
WNT16 51384 NM_016087.2 NP_057171.2 Q9UBV4.1
특정 실시 양태에서, 본원에 사용된 Wnt 폴리펩티드는 동물 기원, 바람직하게는 온혈 동물 기원,보다 바람직하게는 척추 동물 기원, 더욱 바람직하게는 인간 기원 및 비인간 포유동물 기원, 더욱 더 바람직하게는 인간 기원을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 제제의 Frizzled-결합 도메인은 하나 이상의 Frizzled 폴리펩티드에 결합할 수 있는 임의의 도메인일 수 있다. 임의의 메커니즘 또는 이론에 제한되지 않고, 제제의 Frizzled-결합 도메인의 친화도는 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화하기에 충분히 높을 수 있지만(즉, DVL 네트워크를 통해 RECK에 제제의, GPR124에 RECK의, 및 GPR124 Frizzled에 GPR124의 결합이 제제 및 보다 특히 Frizzled-결합 도메인의 근접 또는 제시를 보장할 때), GPR124가 없는 상태에서 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링의 활성화를 피하기에 충분히 낮다(예: 활성화 부족 또는 최소한의 활성화, 예를 들어 생리적으로 중요하지 않은 정도의 활성화). 제한없이, 특정 실시 양태에서, Frizzled-결합 도메인은 약 1 x 10-9 M 미만, 약 1 x 10-8 M 미만, 또는 약 1 x 10-7 M, 또는 약 1 x 10-6 M 미만, 예를 들어 약 1 x 10-6 M과 약 1 x 10-7 M 사이, 또는 약 1 x 10-6 M과 5 x 10-6 M 사이의 KD로 하나 이상의 Frizzled 폴리펩티드에 결합할 수 있다.
특정 실시 양태에서, Frizzled-결합 도메인은 Frizzled 특이적 항체를 포함하거나 하나 이상의 Frizzled 특이적 항체 또는 항체들의 Frizzled-결합 영역, 바람직하게는 가변 영역 서열 또는 CDR을 포함한다. 바람직하게는, Frizzled 특이적 항체는 Frizzled 수용체의 세포 외 부분, 예컨대 Frizzled 수용체의 CRD에 관한 것이다. Frizzled 항체의 비 제한적 예는 공지되어 있고 상업적으로 이용가능하며, 예를 들어 Biolegend(예: 인간 Frizzled 4에 특이적인 클론 CH3A4a7, 인간 Frizzled 9에 특이적인 클론 W3C4E11) 및 Abcam에서 이용 가능한 항체(예: Frizzled 7에 특이적인 ab64636, 인간 Frizzled 4에 특이적인 ab83042, 인간 Frizzled 7에 특이적인 ab77379, 인간 Frizzled 8에 특이적인 ab75235, 인간 Frizzled 9에 특이적인 ab102956)가 포함된다. 예를 들어, Frizzled-결합 도메인은 전체 특이적 frizzled 항체 OMP-18R5(vantictumab)의 6개의 CDR 영역을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, Frizzled-결합 도메인은 Frizzled 특이적 항체의 각각의 CDR(들)과 각각 독립적으로 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 CDR(들)을 포함한다.
특정 실시 양태에서, Frizzled-결합 도메인은 Frizzled 특이적 scFv, 예컨대 Frizzled 특이적 항체의 하나 이상의(바람직하게는 모든 6) CDR(들)을 포함하는 scFv이다.
특정 실시 양태에서, Frizzled-결합 도메인은 Frizzled 특이적 VHH, 예컨대 Frizzled 특이 중쇄 항체의 하나 이상의(바람직하게는 모든 3) CDR(들)을 포함하는 VHH이다.
특정 실시 양태에서, Frizzled-결합 도메인은 2개 이상의 상이한 Frizzled 특이적 항체의 각각의 CDR(들)과 각각 독립적으로 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 2 이상의 CDR(들)을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 Frizzled-결합 도메인은 Frizzled-결합 폴리펩티드, 예를 들어 Wnt 리간드 또는 Wnt 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나, 이로부터 유래된다(예를 들어, 생물학적 활성 단편 및/또는 변이체), 바람직하게는, Frizzled-결합 도메인은 본원의 다른 곳에 기술된 Wnt7 폴리펩티드(예를 들어, Wnt7a 또는 Wnt7b),보다 바람직하게는 인간 Wnt7 폴리펩티드(예를 들어, 인간 Wnt7a 또는 인간 Wnt7b)로부터 유래된다.
Wnt 폴리펩티드의 Frizzled 결합 영역은 Xenopus Wnt8a 결정학적 분석(C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. Garcia, Science. 337, 59-64(2012))에 기초하여 Wnt 폴리펩티드의 3차원 구조를 모델링함으로써 결정될 수 있다.
XWnt8은 Frizzled를 2개의 단종된 부위에 결합시키는 것으로 나타났다. 하나는 엄지(부위 1)라고 하고 다른 하나는 검지(부위 2)라고 한다. XWnt8 엄지의 중요한 잔기는 K182, I186, S187, G188 및 W196 인 것으로 보인다. S187은 위치 1에서의 결합에 중요한 팔미톨레산을 보유한다. 부위 2 접점은 F317, W319, C321, T322 및 V323에 의해 지배되는 것으로 보인다. 또한 XWnt8은 P34, Y37, L38, S41, A42, A45, V46, T70, L71, A74, F147, G150, L151 및 T153으로 구성된 의사-부위 3을 통해 고차 Wnt/Fz 다량체를 형성할 수 있다. 부위 1(특히 K182, S187, G188 및 W196) 및 부위 2(특히 W319, C321 및 V323)의 중요 아미노산 잔기는 상이한 Wnt 폴리펩티드 사이에서 고도로 보존되는 반면, 의사-부위 3 잔기는 보다 다양하다. 이를 고려하여, 당업자는 Wnt 폴리펩티드의 Frizzled 결합 영역이 XWnt8과의 서열 정렬을 사용하여 결정될 수 있음을 이해할 것이다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 Frizzled-결합 도메인은 Wnt 리간드의 '엄지'(부위 1)를 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 이들로 구성되며, 바람직하게는 Frizzled-결합 도메인은 아미노산 서열 XKXXXXSGXXXXXXXW( 서열 번호 11)을 포함하는 결합 도메인을 포함하고, 여기에서 X는 임의의 아미노산일 수 있고, 바람직하게는 상기 아미노산 서열은 CKCHGVSGSCTTKTCW(서열 번호: 12)에 대해 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50 이상을 나타냄%, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 적어도 99%, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
바람직한 구체 예에서, 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 12의 아미노산 위치 7에서 세린은 지방산 잔기, 바람직하게는 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 12의 아미노산 위치 7에서 상기 상기 세린이 팔미토일화된, 지방산 잔기에 연결된다.
바람직한 구체 예에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 Frizzled-결합 도메인은 Wnt 리간드의 '검지'(부위 2)를 포함하지 않는다. 보다 구체적으로, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 Frizzled-결합 도메인은 바람직하게는 아미노산 서열 WXCXV(서열 번호 13)를 포함하지 않으며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 제제의 LRP-결합 도메인은 하나 이상의 LRP 폴리펩티드에 결합할 수 있는 임의의 도메인일 수 있다. 임의의 메커니즘 또는 이론에 제한되지 않고, 제제의 LRP-결합 도메인의 친화력은 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화하기에 충분히 높을 수 있고(즉, DVL 네트워크를 통한 RECK에 대한 제제의 결합, 합, GPR124에 대한 RECK의 결합, 및 Frizzled에 대한 GPR124의 결합이 제제, 특히 LRP에 LRP 결합 도메인의 근접성 또는 표시를 보장할 때) RECK 및/또는 GPR124가 없을 때 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성화를 회피하기에((예: 활성화 부족 또는 최소한의 활성화) 충분히 낮을 수 있다. 제한없이, 특정 실시 양태에서 LRP-결합 도메인은 약 1 x 10-9 M 미만, 또는 약 1 x 10-8 M 미만, 또는 1 x 10-7 M 미만, 예를 들어 약 1 x 10-3M 내지 약 1 x 10-9 M, 또는 약 1 x 10-3 M 내지 약 1 x 10-8 M, 또는 약 1 x 10-3 M 및 내지 약 1 x 10-7 M의 KD를 갖는 하나 이상의 LRP 폴리펩티드에 결합할 수 있다 .
특정 실시 양태에서, 상기 LRP-결합 도메인은 하나 이상의 LRP 특이적 항체 또는 항체의 LRP 특이적 항체 또는 LRP-결합 영역, 바람직하게는 가변 영역 서열 또는 CDR을 포함한다. 바람직하게는, LRP 특이적 항체는 LRP5 및/또는 LRP6 특이적 항체이다. 바람직하게는, LRP 특이적 항체는 LRP 폴리펩티드의 세포 외 부분, 예컨대 LRP5 및/또는 LRP6의 DKK-결합 도메인에 관한 것이다. LRP5 특이적 항체의 비 제한적 예는 당 업계에 공지되어 있고 상업적으로 입수가능한 항체, 예를 들어 Abcam(예: 토끼 및 인간 LRP5에 특이적인 ab36121) 또는 산타 크루즈(예를 들어, 인간 LRP5에 특이적인 sc-21390)를 포함한다. LRP6 특이적 항체의 비 제한적 예는 Abcam(예를 들어, 마우스, 랫트 및 인간 LRP6에 특이적인 ab134146) 또는 산타 크루즈(예를 들어, 인간 LRP6에 특이적인 sc-25317)로부터 입수가능한 항체를 포함한다.
특정 실시 양태에서, LRP-결합 도메인은 LRP 특이적 항체, 바람직하게는 LRP5 또는 LRP6 특이적 항체의 각각의 CDR(들)과 각각 독립적으로 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상, 바람직하게는 100%의 서열 동일성 이상을 갖는 하나 이상의, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 CDR(들)을 포함한다 .
특정 실시 양태에서, LRP 결합 도메인은 LRP5 또는 LRP6 특이적 scFv, 예컨대 LRP5 또는 LRP6 특이적 항체의 하나 이상의(바람직하게는 모든 6) CDR(들)을 포함하는 scFv이다.
특정 실시 양태에서, LRP-결합 도메인은 LRP5 또는 LRP6 특이적 VHH, 예컨대 LRP5 또는 LRP6 특이 중쇄 항체의 하나 이상의(바람직하게는 모든 3) CDR(들)을 포함하는 VHH이다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 LRP-결합 도메인은 둘 이상의 상이한 LRP 특이적 항체, 바람직하게는 LRP5 또는 LRP6 특이적 항체의 각각의 CDR(들)과 각각 독립적으로 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상, 바람직하게는 100%의 서열 동일을 갖는 2 이상의 CDR(들)을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 상기 LRP-결합 도메인은 Wnt 리간드 또는 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt7a 또는 Wnt7b), DKK 폴리펩티드(예: DKK1, DKK2, DKK3 또는 DKK4), Sclerostin(또는 SOST) 또는 Wise(또는 SOSTDC1), 또는 그의 변이체와 같은 LRP-결합 폴리펩티드, 예를 들어 Wnt 리간드 또는 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt7a 또는 Wnt7b), DKK 폴리펩티드(예: DKK1, DKK2, DKK3 또는 DKK4), Sclerostin(또는 SOST) 또는 Wise(또는 SOSTDC1), 또는 그의 변이체를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나 또는 이로부터 유래된다(예를 들어, 생물학적 활성 단편 및/또는 변이체이다)
예를 들어, 사람 SOST 유전자는 NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 유전자 ID 50964로 등재되어 있다. 인간 SOST mRNA는 NCBI Genbank 수탁 번호 NM_025237.2로 표시된다. NM_025237.2의 뉴클레오티드 48(시작 코돈) 내지 689(정지 코돈)는 SOST 코딩 서열을 구성한다. 인간 SOST 단백질 서열은 NCBI Genbank 수탁 번호 NP_079513.1 및 Uniprot(www.uniprot.org) 수탁 번호 Q9BQB4.1로 등재되어 있다.
예를 들어, 인간 WISE(또는 1을 포함하는 sclerostin 도메인(SOSTDC1)) 유전자는 NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 유전자 ID 25928로 등재되어 있다. 인간 WISE mRNA는 NCBI Genbank 수탁 번호 NM_015464.2. NM_015464.2의 뉴클레오티드 182(시작 코돈) 내지 802(정지 코돈)는 WISE 코딩 서열을 구성한다. 인간 WISE 단백질 서열은 NCBI Genbank 수탁 번호 NP_056279.1 및 Uniprot(www.uniprot.org) 수탁 번호 Q6X4U4.2로 등재되어 있다.
바람직하게는, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 LRP-결합 도메인은 Wnt7(예를 들어, Wnt7a 또는 Wnt7b) 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 인간 Wnt7 폴리펩티드(예를 들어, 인간 Wnt7a 또는 인간 Wnt7b) 또는 그의 변이체로부터 유래된다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 상기 LRP-결합 도메인은 DKK 폴리펩티드, 바람직하게는 DKK1 폴리펩티드, 또는 Wnt 폴리펩티드, 바람직하게는 Wnt7 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나 또는 유래된다. 바람직한 구체 예에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 상기 LRP-결합 도메인은 Wnt7 폴리펩티드로부터 유래된다.
Ahn V.E. et al., Dev Cell. 2011 Nov 15; 21(5): 862-873은 DKK1의 C-말단 영역이 LRP6에 결합하는 것을 책임진다고 개시하고 있다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 상기 LRP-결합 도메인은 DKK1의 C-말단 도메인을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나 또는 이로부터 유래된다. 예를 들어, 인간 DKK1의 C-말단 도메인(인간 DKK1은 NCBI Genbank 수탁 번호 NP_036374.1 및 Uniprot 수탁 번호 O94907.1로 등재됨)은 아미노산 서열 MYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH(서열 번호: 14)을 포함한다.
한편, Bourhis E. et al.(Bourhis, Eric et al., Structure, Volume 19, Issue 10, 1433-1442는 DKK1의 N-말단에서 그리고 DKK2, DKK4, WISE 및 SOST에서 LRP5/6 상호 작용 모티프 NXI/V를 확인했으며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다. 본 명세서에서, LRP-결합 도메인은 NXI 또는 NXV를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다.
임의의 메커니즘 또는 이론에 제한되지 않고, 제제의 Frizzled-결합 도메인 및 LRP-결합 도메인의 친화도는 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-측정된 Wnt 시그널링을 활성화시키기 위해 전체적으로 충분히 높을 수 있고(즉, DVL 네트워크를 통해 제제의 RECK에 대한, RECK의 GPR124에 대한, GPR124의 Frizzled로의 결합이 제제, 특히 LRP에 LRP 결합 도메인의 근접성 또는 표시를 보장할 때), RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성화를 피하기에 전체적으로 충분히 낮다(예: 생리학적으로 중요하지 않은 정도의 활성화 같은 활성화 부족 또는 기껏해야 최소한의 활성화).
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 제제는 단백질 융합체이다.
용어 "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩티드"및 "단백질 융합체" 또는 "폴리펩티드 융합체"는 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 방식으로 연결, 또는 결합된 둘 이상의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 혼성 또는 키메라 분자를 의미한다. 분자는 아미노산 기반 화합물, 즉 주로 아미노산 잔기를 포함하지만 독점적으로 반드시 포함하는 것은 아닌 물질 또는 분자로 표시될 수 있다. 재조합적으로, 반합성적으로 또는 합성적으로 생성된 융합체 또는 융합물이 포함된다. 융합체 또는 융합물은 원하는 경우 글리코실화, 인산화, 설폰화, 메틸화, 아세틸화, 지질화, 페길화 등에 의해 변형될 수 있다.
보다 구체적으로, 용어 "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩티드"는, 융합 생성물을 인코딩하는 단일 연속 폴리뉴클레오티드 분자의 유전자 발현을 통해 이들의 개별 폴리펩티드 골격을 통해 동일 선형 공유 결합에 의해 연결된 2개 이상의 단백질, 폴리펩티드 또는 그의 변이체 또는 단편에 의한 유전자 융합을 나타낸다. 전형적으로, 융합 생성물을 코딩하는 연속적인 폴리뉴클레오티드 분자를 생성하기 위해, 주어진 폴리펩티드 세그먼트를 각각 코딩하는 각각의 2개 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 연결되어 각각의 원래 ORF에 대한 정확한 리딩 프레임을 유지하는 방식으로 연속적인 더 긴 ORF를 형성한다. 생성된 재조합 융합 폴리펩티드에서, 원래의 ORF에 의해 인코딩된 2개 이상의 폴리펩티드 세그먼트는 동일한 폴리펩티드 분자에 결합되는 반면, 이들은 정상적으로 자연적으로 결합되지는 않는다. 따라서, 판독 프레임은 융합된 유전자 세그먼트에 걸쳐 연속적으로 만들어지지만, 이렇게 융합된 폴리펩티드 세그먼트는 예를 들어 인-프레임 폴리펩티드 또는 펩티드 링커에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다.
보다 구체적으로, 용어 "단백질 융합체" 또는 "폴리펩티드 융합체"는 둘 이상의 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편이 비유전적 수단에 의해 결합되는 반면, 이들은 본질적으로 자연적으로 결합되지 않는, 물질 또는 분자를 의미한다. 폴리펩티드 세그먼트는 개별 폴리펩티드 골격을 통해 또는 하나 이상의 각각의 아미노산 측쇄를 통해 연결될 수 있거나, 하나의 단백질 세그먼트는 그의 폴리펩티드 골격을 통해 다른 폴리펩티드 세그먼트의 아미노산 측쇄에 연결될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제의 RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인 및/또는 LRP-결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 커플링될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 본원에 사용된 용어 "커플링된"은 "연결된", "결합된", "융합된"과 동의어이며, 적어도 2개의 요소 또는 구성 요소 사이의 물리적 링크를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 다른 요소를 연결하는 역할을 하는 연결 요소를 지칭한다. 링커는 강성 링커 또는 가요성 링커일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 링커는 공유 결합을 달성하는 공유 링커이다. 용어 "공유" 또는 "공유 결합"은 두 원자 사이에 하나 이상의 전자 쌍을 공유하는 것을 포함하는 화학 결합을 지칭한다. 많은 분자들에 있어서, 전자의 공유는 각 원자가 안정적인 전자 구성에 상응하는 완전한 외부 전자 쉘의 등가물을 얻을 수 있게 한다. 공유 결합은 σ-결합, π-결합, 금속-금속 결합, 애그노스틱 상호 작용, 굽은 결합 및 3 중심 2-전자 결합을 포함하는 상이한 유형의 상호 작용을 포함한다.
특정 구체 예에서, 링커는(폴리) 펩티드 링커 또는 비 펩티드성 폴리머와 같은 비 펩티드성 링커, 예를 들어 비 생물학적 폴리머이다. 바람직하게는, RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인 및/또는 LRP-결합 도메인 사이의 연결(들)은 가수 분해적으로 안정적인 연결, 즉 특히 생리학적 조건 하에서, 연장된 시간 동안, 예를 들어 며칠 동안, 유용한 pH 값에서 물에서 실질적으로 안정적일 수 있다. 특정 구체 예에서, 링커는 하나 이상의 아미노산의 펩티드 링커이다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 아미노산, 자연적으로 코딩된 아미노산, 비 자연적으로 코딩된 아미노산, 비 자연적으로 발생하는 아미노산, 아미노산 유사체 및 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 모방체, 이들의 구조가 그러한 입체 이성질체 형태를 허용한다면, 이들의 모든 D 및 L 입체 이성질체를 포함한다. 아미노산은 본 명세서에서 이들의 명칭, 통상적으로 공지된 3개의 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법위원회에 의해 권장되는 1 문자 기호로 지칭된다. 용어 "자연적으로 발생하는"은 일반적으로 자연에서 발견되고 사람에 의해 조작되지 않는 물질을 지칭한다. "비 자연적으로 발생하는", "비 자연적인"등의 용어는 일반적으로 자연에서 발견되지 않거나 사람에 의해 구조적으로 변형, 반합성 또는 합성된 물질을 지칭한다. "천연적으로 코딩된 아미노산"은 20개의 일반적인 아미노산 또는 피롤리신, 피롤린-카르복시-리신 또는 셀레노시스테인 중 하나인 아미노산을 지칭한다. 20개의 일반적인 아미노산은 알라닌(A 또는 Ala), 시스테인(C 또는 Cys), 아스파르트산(D 또는 Asp), 글루탐산(E 또는 Glu), 페닐알라닌(F 또는 Phe), 글리신(G 또는 Gly) , 히스티딘(H 또는 His), 이소로이신(I 또는 Ile), 리신(K 또는 Lys), 로이신(L 또는 Leu), 메티오닌(M 또는 Met), 아스파라긴(N 또는 Asn), 프롤린(P 또는 Pro), 글루타민(Q 또는 Gln), 아르기닌(R 또는 Arg), 세린(S 또는 Ser), 트레오닌(T 또는 Thr), 발린(V 또는 Val), 트립토판(W 또는 Trp) 및 티로신(Y 또는 Tyr)이다. "비천연적으로 코딩된 아미노산"은 20개의 일반적인 아미노산 또는 피롤리신, 피롤린-카르복시-리신 또는 셀레노시스테인 중 하나가 아닌 아미노산을 지칭한다. 상기 용어는 자연적으로 코딩된 아미노산의 변형(예를 들어 번역 후 변형)에 의해 발생하는 아미노산을 제한없이 포함하지만, 그 자체가 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드 사슬에 자연적으로 통합되는 것은 아니다. 제한없이 예시되는 것으로는, N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신이 있다. 비천연적으로 코딩된, 비 천연 또는 변형된 아미노산의 추가 예는 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 베타-아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 피페리딘산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노이소피밀산, 2,4-디아미노부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸라스파라긴, 호모세린, 호모시스테인, 히드록시리신, 알로히드록시리신, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로 이소로이신, N-메틸글리신, N-메틸이소로이신, 6-N-메틸리신, N-메틸린신, N-메틸렌신 또는 오르니틴이 있다. 하나 이상의 개별 원자가 다른 원자, 동일한 원자의 동위 원소 또는 다른 작용기로 대체된 아미노산 유사체도 포함된다. 또한 엘만(Ellman) 등의 문헌 Methods Enzymol. 1991, vol. 202, 301-36에 기재된 비 천연 아미노산 및 아미노산 유사체가 포함된다. 비 천연 아미노산을 단백질 또는 폴리펩티드에 혼입하는 것은 다수의 상이한 방식으로 유리할 수 있다. 예를 들어, D-아미노산-함유 폴리펩티드는 L-아미노산-함유 대응물과 비교하여 시험관 내 또는 생체 내에서 증가된 안정성을 나타낸다. 보다 구체적으로, D-아미노산-함유 폴리펩티드는 내인성 펩티다제 및 프로테아제에 대해 더욱 내성일 수 있으며, 이에 의해 제제의 생체 이용률이 개선되고 생체 내 연장된 수명이 제공될 수 있다.
보다 구체적으로, 펩티드 링커는 1 내지 50개 아미노산 길이 또는 2 내지 50개 아미노산 길이 또는 1 내지 45 개 아미노산 길이 또는 2 내지 45 개 아미노산 길이, 바람직하게는 1 내지 40개 아미노산 길이 또는 2 내지 40개 아미노산 길이, 또는 1 내지 35 개 아미노산 길이 또는 2 내지 35 개 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 1 내지 30개 아미노산 길이 또는 2 내지 30개 아미노산 길이일 수 있다 . 더욱 바람직하게는, 링커는 5 내지 25 개 아미노산 길이 또는 5 내지 20개 아미노산 길이일 수 있다. 특히 바람직하게는, 링커는 5 내지 15 개 아미노산 길이 또는 7 내지 15 개 아미노산 길이일 수 있다. 따라서, 특정 구체 예에서, 링커는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 길이일 수 있다. 다른 구체 예에서, 링커는 5, 6, 7, 8 또는 9 개 아미노산 길이일 수 있다. 추가의 구체 예에서, 링커는 10, 11, 12, 13 또는 14개 아미노산 길이일 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 링커는 15, 16, 17, 18 또는 19 개 아미노산 길이일 수 있다. 추가의 구체 예에서, 링커는 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개 아미노산 길이일 수 있다. 특정 구체 예에서, 링커는 4-10 또는 5-9 또는 6-8 또는 7 아미노산 길이이다. 다른 구체 예에서, 링커는 12-18 또는 13-17 또는 14-16 또는 15 아미노산 길이이다.
링커를 구성하는 아미노산의 성질은 이에 연결된 폴리펩티드 세그먼트의 생물학적 활성이 실질적으로 손상되지 않고 링커가 제제의 RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인, 및/또는 LRP-결합 도메인의 의도된 공간적 분리를 제공하는 한 특별히 관련이 없다. 바람직한 링커는 본질적으로 비 면역원성 및/또는 단백질 분해 절단되기 쉬운 것이다.
특정 바람직한 구체 예에서, 펩티드 링커는 글리신, 세린, 알라닌, 트레오닌 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어질 수 있다. 훨씬 더 바람직한 구체 예에서, 링커는 글리신, 세린 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어질 수 있다. 이러한 링커는 특히 우수한 유연성을 제공한다. 특정 구체 예에서, 링커는 글리신 잔기만으로 구성될 수 있다. 특정 구체 예에서, 링커는 단지 세린 잔기로 구성될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 링커는 비 펩티드성 링커이다. 바람직한 구체 예에서, 비 펩티드성 링커는 비 펩티드 중합체를 포함하거나 본질적으로 구성되거나 구성될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비 펩티드 중합체"는 펩티드 결합을 제외한 공유 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 반복 단위를 포함하는 생체 적합성 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 비 펩티드 중합체는 2 내지 200 단위 길이 또는 2 내지 100 단위 길이 또는 2 내지 50 단위 길이 또는 2 내지 45 단위 길이 또는 2 내지 40 단위 길이 또는 2 내지 35 단위 길이 또는 2 내지 30 단위 길이, 또는 5-25 단위 길이 또는 5-20 단위 길이 또는 5-15 단위 길이일 수 있다. 비 펩티드 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중 합체, 폴리 옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 중합체, 예컨대 PLA(폴리락트산) 및 PLGA(폴리락트-글리콜산), 지질 중합체, 키틴, 히알루론산 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 특히 바람직한 것은 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이다. 비 펩티드 중합체의 분자량은 바람직하게는 1 내지 100 kDa, 그리고 바람직하게는 1 내지 20 kDa일 수 있다. 비 펩티드 폴리머는 하나의 폴리머 또는 상이한 유형의 폴리머의 조합일 수 있다. 비 펩티드성 폴리머는 융합체를 형성하는 RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인, 및/또는 LRP-결합 도메인에 결합할 수 있는 반응성기를 갖는다. 바람직하게는, 비 펩티드 중합체는 각 말단에 반응성기를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 반응성기는 반응성 알데히드기, 프로피온 알데히드기, 부틸 알데히드기, 말레이미드 기 및 숙신이미드 유도체의 화합물. 숙신이미드 유도체는 숙신이미딜 프로피오네이트, 히드록시 숙신이미딜, 숙신이미딜 카르복시 메틸 또는 숙신이미딜 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 비 펩티드 중합체의 양 말단의 반응성 기는 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 비 펩티드 중합체는 양쪽 말단에 반응성 알데히드기를 갖는다. 예를 들어, 비 펩티드 중합체는 한쪽 말단에 말레이미드 그룹, 다른 쪽 말단에 알데하이드 그룹, 프로피오닉 알데하이드 그룹 또는 부틸 알데하이드 그룹을 가질 수 있다. 양 말단에 반응성 히드록시 그룹을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 비 펩티드 폴리머로 사용되는 경우, 히드록시 그룹은 공지된 화학 반응에 의해 다양한 반응성 그룹으로 활성화될 수 있거나, 또는 상업적으로 이용 가능한 변형된 반응성을 갖는 PEG는 단백질 접합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
하나 이상의 링커의 포함은 약제의 RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인 및/또는 LRP-결합 도메인 사이의 공간적 분리를 증가시키며, 이는 약제의 Wnt 시그널링 활성에 유리하게 영향을 줄 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 단일 쇄 또는 다량체로서 제공된다. 다량체 형태를 달성하기 위해, RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인 및/또는 LRP-결합 도메인은 예를 들어 덴드리머, 항체 또는 폴리-L-리신으로 구성된 스캐폴드 또는 골격에 부착될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인 및 LRP-결합 도메인을 포함하고, 여기서 상기 RECK-결합 도메인, 상기 Frizzled-결합 도메인 및 상기 LRP-결합 도메인은 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드와 같은 Wnt7 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드와 같은 인간 Wnt 폴리펩티드로부터 유래된다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인 및 LRP-결합 도메인을 포함하고, 여기서 하나 이상의, 둘 이상의 또는 모두 3개의 결합 도메인은 Wnt7 폴리펩티드, 예컨대 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 Wnt 폴리펩티드, 예컨대 인간 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드로부터 유래된다.
예를 들어, 인간 Wnt7a 유전자는 NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 유전자 ID 7476으로 등재되어 있다. 인간 Wnt7a mRNA(transcript variant 1)는 NCBI Genbank 접근 번호 NM_004625.3으로 등재되어 있다. NM_004625.3의 뉴클레오티드 306(시작 코돈) 내지 1355(정지 코돈)는 Wnt7a 코딩 서열을 구성한다. 인간 Wnt7a 단백질 서열은 NCBI Genbank 수탁 번호 NP_004616.2 및 Uniprot 수탁 번호 O00755.2로 등재되어 있고, 아래에서 추가로 재현된다(서열 번호: 15):
> NP_004616.2 단백질 Wnt-7A 전구체 [호모 사피엔스]
MNRKARRCLGHLFLSLGMVYLRIGGFSSVVALGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACNKTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK.
예에 의해, 인간 Wnt7a 단백질(신호 펩티드를 포함하지 않음)의 성숙된 형태는 이하에 재현되는 아미노산 서열(서열 번호: 15)를 포함한다.
LGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACNKTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK.
예를 들어, 인간 WNT7B 유전자는 NCBI Genbank 유전자 ID 7477로 등재되어 있다. 인간 WNT7B mRNA(전사 변형체 1)는 NCBI Genbank 수탁 번호 NM_058238.2로 등재되어 있다. NM_058238.2의 뉴클레오티드 375(시작 코돈) 내지 1424(정지 코돈)는 WNT7B 코딩 서열을 구성한다. 인간 WNT7B 단백질 서열은 NCBI Genbank 수탁 번호 NP_478679.1 및 Uniprot 수탁 번호 P56706.2로 등재되어 있고, 아래에서 추가로 재현된다(서열 번호: 16):
> NP_478679.1 단백질 Wnt-7b 전구체 [호모 사피엔스]
MHRNFRKWIFYVFLCFGVLYVKLGALSSVVALGANIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGAQMGINECQYQFRFGRWNCSALGEKTVFGQELRVGSREAAFTYAITAAGVAHAVTAACSQGNLSNCGCDREKQGYYNQAEGWKWGGCSADVRYGIDFSRRFVDAREIKKNARRLMNLHNNEAGRKVLEDRMQLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPKFREVGHLLKEKYNAAVQVEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMETDLVYIEKSPNYCEEDAATGSVGTQGRLCNRTSPGADGCDTMCCGRGYNTHQYTKVWQCNCKFHWCCFVKCNTCSERTEVFTCK
특정 실시 예에서, 상기 RECK-결합 도메인은 HVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC(서열 번호: 17), VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT(서열 번호: 18) 또는 VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET(서열 번호:19), 또는 서열 번호: 17 , 서열 번호: 18, 또는 서열 번호: 19의 아미노산 서열과 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65%, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 구성된다. 특정 실시 양태에서, Wnt7 폴리펩티드로부터 유래된 상기 RECK-결합 도메인은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 또는 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 구성된다.
특정 실시 양태에서, 상기 RECK-결합 도메인은 아미노산 서열 XXXVXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXKXXXX(서열 번호 20), VXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXK(서열 번호 21), XXXVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXKXXXX(서열 번호 22) 또는 VXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXKXXXX(서열 번호 23)를 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 구성되고, 여기에서 X는 임의의 아미노산이고, 바람직하게 아미노산 서열은 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 19 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상을 나타냄 , 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99 이상, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 나타낸다.
특정 실시 양태에서, 상기 RECK-결합 도메인은 Wnt7 폴리펩티드로부터 유래되고, Frizzled-결합 도메인 및 LRP-결합 도메인은 Wnt7 폴리펩티드로부터 유래되지 않는다.
특정 실시 양태에서, 상기 RECK-결합 도메인은 Wnt7 폴리펩티드로부터 유래되고, Frizzled-결합 도메인 및 LRP-결합 도메인은 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt 11 및 Wnt16로 이루어진 목록으로부터 선택된 Wnt 폴리펩티드로부터 유래된다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 Wnt7 폴리펩티드의 단편, 예컨대 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드의 단편, 바람직하게는 인간 Wnt7 폴리펩티드의 단편, 예컨대 인간 Wnt7a의 단편 또는 인간 Wnt7b 폴리펩티드이거나 이들로 필수적으로 구성된다.
특정 구체 예에서, Wnt7 폴리펩티드의 단편은 전장 Wnt7 폴리펩티드의 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 바람직하게는 100%를 갖는다.
특정 실시 양태에서, Wnt7 폴리펩티드의 단편은 전장 Wnt7 폴리펩티드의 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성보다 더 높은(예를 들어, 1.1-배, 1.2-배, 1.3-배, 1.4-배, 1.5-배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 1.9 배 또는 2 배 더 높거나 더 높음) GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링 활성을 갖는다.
본 발명자들은 Wnt7a의 N-말단 도메인이 RECK에 결합하고 GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있고, 반면에 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개된 Wnt 시그널링은 활성화시키지 못한다는 것을 입증하였다.
따라서, 특정 실시 양태에서, Wnt7 폴리펩티드의 단편은 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에서 전장 Wnt7의 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성보다 10배 이하, 또는 100배 이하, 또는 1000배 이하, 또는 1×104 배 이하, 또는 1×105 배 이하, 또는 1×106 배 이하인, Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성을 갖는다.
특정 실시 양태에서, 상기 Wnt7 폴리펩티드의 단편은 Wnt7 폴리펩티드의 N-말단 도메인(NTD), 예컨대 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드의 NTD, 바람직하게는 인간 Wnt7 폴리펩티드의 NTD, 예컨대 인간 Wnt7a 또는 Wnt7b이거나 이들로 필수적으로 이루어진다. 인간 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드의 N-말단 도메인은 전형적으로 서열 번호 24(Wnt7a) 또는 서열 번호 25(Wnt7b)의 위치 1에 해당하는 위치에서 로이신(L) 잔기에서부터 서열 번호: 24(Wnt7a) 또는 서열 번호: 25(Wnt7b)의 위치 247에 해당하는 위치에서 시스테인 잔기까지이다.
특정 실시 양태에서, 상기 Wnt7 폴리펩티드의 단편은 적어도 Wnt7 폴리펩티드의 NTD를 포함하고 Wnt7 폴리펩티드의 C-말단 도메인(CTD)을 포함하지 않는다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 제제는 50 이상, 75 이상, 100 이상, 125 이상, 150 이상, 175 이상, 200 이상, 225 이상의 인간 Wnt7a 폴리펩티드의 NTD의 인접 아미노산을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고, 보다 구체적으로, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 하기 아미노산 서열의 50 이상, 75 이상, 100 이상, 125 이상, 150 이상, 175 이상, 200 이상, 225 이상의 인접 아미노산을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
LGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC(서열 번호: 24) 또는
LGANIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGAQMGINECQYQFRFGRWNCSALGEKTVFGQELRVGSREAAFTYAITAAGVAHAVTAACSQGNLSNCGCDREKQGYYNQAEGWKWGGCSADVRYGIDFSRRFVDAREIKKNARRLMNLHNNEAGRKVLEDRMQLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPKFREVGHLLKEKYNAAVQVEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMETDLVYIEKSPNYC(서열 번호: 25), 바람직하게는 서열 번호:24.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열, 바람직하게는 서열 번호 24 또는 아미노산 서열 서열 번호 24 또는 서열 번호 25, 바람직하게는 서열 번호 24에 대한 서열 동일성이 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이것으로 구성된다.
당업자는 본원에 교시된 바와 같이 제제를 숙주 세포에 의해 발현시키고 분비하는 것이 예상된다면, 본원에 교시된 바와 같이 제제를 인코딩하는 핵산은 바람직하게는 N-말단 신호 펩티드 서열을 포함하는 제제의 전구체 형태를 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 핵산은 인간 Wnt7a 또는 Wnt7b의 전구체 폴리펩티드와 같은 Wnt7의 전구체 폴리펩티드(즉, 신호 펩티드 포함)의 단편을 인코딩할 수 있다. 특정 구체 예에서, 핵산은 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 24 또는 서열 번호 25에 대해 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이것으로 이루어진 약제를 인코딩하고, 여기서 상기 아미노산 서열은 아미노산 서열 MNRKARRCLGHLFLSLGMVYLRIGGFSSVVA(서열 번호 26) 또는 MHRNFRKWIFYVFLCFGVLYVKLGALSSVVA(서열 번호 27)를 각각 갖는 신호 펩티드에 의해N-말단에 선행한다. 대안적으로, 본원에 교시된 바와 같이 제제를 코딩하는 핵산은 신호 펩티드를 제공하는 벡터 내에 포함될 수 있다. 신호 펩티드는 본원에 교시된 바와 같은 제제의 생산에 사용되는 숙주 세포에 따라 상동성 또는 이종성 신호 펩티드일 수 있다. 또한, 본원에 교시된 바와 같은 제제의 원핵성 발현을 위해, 단백질 분해 효소 절단 부위 모티프는 상기 신호 펩티드의 C-말단에 그리고 본원에 교시된 바와 같은 제제의 N-말단에 존재할 수 있다.
본 발명자들은 인간 또는 쥣과 동물의 Wnt7a 폴리펩티드의 특정 변이체가 GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링을 활성화시키는데 효과적이거나 더 효과적이며, Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않는 것을 입증하였다. 야생형 인간 또는 쥣과 동물 Wnt7a 폴리펩티드와 비교하여 각각 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 존재한다.
따라서, 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드의 변이체와 같은 Wnt7 폴리펩티드의 변이체이다. 추가의 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 제제는 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드의 NTD의 변이체이다.
특정 실시 양태에서, 이러한 변형에서, 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 17에 해당하는 위치의 글루타민(Q) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 20에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 25에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 27에 해당하는 위치의 알라닌(A) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 28에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 33에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 37에 해당하는 위치의 메티오닌(M) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 39에 해당하는 위치의 로이신(L) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 41에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 44에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 50에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 52에 해당하는 위치의 아스파라긴(N) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 68에 해당하는 위치의 발린(V) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 129에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기; 서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 131에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 133에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 135에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 141에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 146에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 158에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 159에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 181에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 191에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 198에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 200에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 205에 해당하는 위치의 발린(V) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 208에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 208에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 214에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 216에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 218에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 222에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 223에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 229에 해당하는 위치의 티로신(Y) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 232에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 235에 해당하는 위치의 트레오닌(T) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 248에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 289에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 291에 해당하는 위치의 트립토판(W) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 307에 해당하는 위치의 트레오닌(T) 잔기; 및/또는 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 318에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 하나 이상의(바람직하게는 3 이하의, 바람직하게는 2 이하의, 보다 바람직하게는 하나의) 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기, 아르기닌(R) 잔기 또는 글루타민(Q) 잔기, 더욱 바람직하게는 알라닌(A) 잔기에 의해 치환된다. 특정 실시 양태에서, 이러한 변형에서, 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 17에 해당하는 위치의 글루타민(Q) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 20에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 25에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 28에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 33에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 37에 해당하는 위치의 메티오닌(M) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 39에 해당하는 위치의 로이신(L) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 41에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 44에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 50에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 68에 해당하는 위치의 발린(V) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 129에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기; 서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 131에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 133에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 135에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 141에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 146에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 158에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 181에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 191에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 198에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 200에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 205에 해당하는 위치의 발린(V) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 208에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 208에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 214에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 216에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 218에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 222에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 223에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 229에 해당하는 위치의 티로신(Y) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 232에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 235에 해당하는 위치의 트레오닌(T) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 248에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 289에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 291에 해당하는 위치의 트립토판(W) 잔기; 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 307에 해당하는 위치의 트레오닌(T) 잔기; 및/또는 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 318에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 알라닌(A) 잔기로 치환되고; 및/또는 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 27에 해당하는 위치의 알라닌(A) 잔기는 아르기닌(R) 잔기로 치환되고; 및/또는 서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 52에 해당하는 위치의 아스파라긴(N) 잔기는 글루타민(Q) 잔기로 치환되고; 및/또는 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 159에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 알라닌(A), 세린(S) 또는 로이신(L) 잔기도 치환된다.
특정 실시 양태에서, Wnt7 폴리펩티드의 변이체는 상기 열거된 아미노산 치환 중 2개 이상(예를 들어, 바람직하게는 2개, 바람직하게는 3개, 보다 바람직하게는 4개)을 포함한다.
보다 특정한 실시 양태에서, Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드의 NTD는 상기 열거된 아미노산 치환 중 2개 이상(예를 들어, 바람직하게는 2개, 바람직하게는 3개, 보다 바람직하게는 4개)을 포함한다.
따라서, 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 서열 번호 24 또는 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열과 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이것으로 이루어지고, 여기에서 위치 17에서 잔기는 글루타민이 아니고, 위치 207에서 잔기는 이소로이신이 아니고, 위치 25에서 잔기는 프롤린이 아니고, 위치 27의 잔기가 알라닌이 아니고, 위치 28의 잔기가 이소로이신이 아닌 것, 위치 33의 잔기는 글루타메이트가 아니며, 위치 37의 잔기는 메티오닌이 아니며, 위치 39의 잔기는 로이신이 아니며, 위치 41의 잔기는 글루타메이트가 아니며, 위치 44의 잔기는 페닐알라닌이 아니며, 위치 50의 잔기는 아르기닌이 아니고, 위치 52의 잔기는 아스파라긴이 아니며, 위치 68의 잔기는 발린이 아니며, 위치 129의 잔기는 이소로이신이 아니고, 위치 131의 잔기가 페닐알라닌이 아니고, 위치 133의 잔기가 리신이 아니며, 위치 135의 잔기가 페닐알라닌이 아니며, 위치 141의 잔기가 이소로이신이 아니며, 위치 146의 잔기가 아르기닌이 아니고, 위치 158의 잔기가 아르기닌이 아니고, 위치 159의 잔기가 리신이 아니고, 위치 181의 잔기가 리신이 아니고, 위치 191의 잔기가 아르기닌이 아니고, 위치 198의 잔기가 리신이 아니고, 위치의 잔기가 200은 리신이 아니며, 위치 205의 잔기는 발린이 아니며, 위치 208의 잔기는 글루타메이트가 아니며, 위치 214의 잔기는 아르기닌이 아니며, 위치 216의 잔기는 리신이 아니며, 위치 218의 잔기는 프롤린이 아니며, 위치 222의 잔기는 리신이 아니고, 위치 223의 잔기는 이소로이신이 아니고, 위치 229의 잔기는 티로신이 아니고, 위치 232의 잔기는 프롤린이 아니며, 위치 235의 잔기는 트레오닌이 아니며, 위치 248의 잔기는 248 글루타메이트가 아니고, 위치 289의 잔기가 아르기닌이 아니고, 위치 291의 잔기가 트립토판이 아니며, 위치 307의 잔기가 트레오닌이 아니거나, 및/또는 위치 318의 잔기가 리신이 아니고; 바람직하게는 위치 27의 잔기는 아르기닌, 위치 28의 잔기는 알라닌, 위치 33의 잔기는 알라닌, 위치 41의 잔기는 알라닌, 위치 44의 잔기는 알라닌, 위치 50의 잔기는 알라닌, 위치 52에서의 잔기는 글루타민이고, 위치 68에서의 잔기는 알라닌, 위치 129에서의 잔기는 알라닌, 위치 131에서의 잔기는 알라닌, 위치 133에서의 잔기는 알라닌, 위치 135에서의 잔기는 알라닌, 위치 141에서 잔기는 알라닌, 위치 146에서 잔기는 알라닌, 위치 158에서 잔기는 알라닌, 위치 159에서의 잔기는 알라닌, 위치 181에서의 잔기는 알라닌, 위치 191에서의 잔기는 알라닌, 위치 198에서 잔기는 알라닌, 위치 200의 잔기는 알라닌, 위치 205의 잔기는 알라닌, 위치 208의 잔기는 알라닌, 위치 214의 잔기는 알라닌, 위치 216의 잔기는 알라닌, 위치의 잔기 218은 알라닌, 위치 222의 잔기는 알라닌, 위치 223의 잔기는 알라닌, 위치 229의 잔기는 알라닌, 위치 232의 잔기는 알라닌, 위치 235의 잔기는 알라닌, 위치 248의 잔기는 알라닌, 위치 289의 잔기는 알라닌, 위치 291의 잔기는 알라닌, 위치 307의 잔기는 알라닌, 및/또는 위치 318의 잔기는 알라닌이다.
바람직한 구체 예에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열과 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이것으로 이루어진 인간 Wnt7a의 NTD의 변이체이다: 여기서, 위치 17의 잔기는 글루타민이 아니며, 위치 20의 잔기는 이소로이신이 아니고, 위치 25의 잔기는 프롤린이 아니며, 위치 27의 잔기는 알라닌이 아니며, 위치 28의 잔기는 이소로이신이 아니며, 위치 33에서 잔기는 글루타메이트가 아니고, 위치 37에서의 잔기가 메티오닌이 아니고, 위치 39에서의 잔기가 로이신이 아니고, 위치 41에서의 잔기가 글루타메이트가 아니고, 위치 44에서의 잔기가 페닐알라닌이 아니고, 위치 50에서의 잔기가 아르기닌이 아니고, 위치 52의 잔기는 아스파라긴이 아니며, 위치 68의 잔기는 발린이 아니며, 위치 129의 잔기가 이소로이신이 아니고, 위치 131의 잔기가 페닐알라닌이 아니고, 위치 133의 잔기가 리신이 아니며, 위치 135의 잔기가 페닐알라닌이 아니며, 위치 141의 잔기가 이소로이신이 아니며, 위치 146의 잔기 아르기닌이 아니고, 위치 158의 잔기가 아르기닌이 아니고, 위치 159의 잔기가 리신이 아니고, 위치 181의 잔기가 리신이 아니고, 위치 191의 잔기가 아르기닌이 아니고, 위치 198의 잔기가 리신이 아니고, 위치 200의 잔기가 리신이 아니고, 위치 205의 잔기가 발린이 아니며, 위치 208의 잔기가 글루타메이트가 아니며, 위치 214의 잔기가 아르기닌이 아니며, 위치 216의 잔기가 리신이 아니며, 위치 218의 잔기가 프롤린이 아니고, 위치 222의 잔기가 리신이 아니고, 위치 223의 잔기가 이소로이신이 아니고, 위치 229의 잔기가 티로신이 아니고, 위치 232의 잔기가 프롤린이 아니거나, 및/또는 위치 235의 잔기가 트레오닌이 아니다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 서열 번호 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103 , 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 또는 121, 바람직하게는 서열 번호 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 47, 48, 49, 53, 54, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 80 , 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 , 111, 112, 114, 118, 119 또는 121, 보다 바람직하게는 서열 번호 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 47, 48, 49, 53, 54, 68, 69, 70, 71 72, 74, 76, 80, 81 또는 83(도 8)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진다.
바람직한 구체 예에서, 이러한 변형에서, 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 159에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 하나 이상(바람직하게는 3 이하, 바람직하게는 2 이하, 더욱 바람직하게는 하나)의 다른 아미노산 잔기 바람직하게는 알라닌(A) 잔기, 세린(S) 또는 로이신(L) 잔기에 의해 치환된다. 보다 바람직한 구체 예에서, 본원에 개시된 제제는 서열 번호 28, 80, 81, 85, 118 또는 119, 바람직하게는 서열 번호 28 또는 85, 더욱 바람직하게는 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 구성되거나 또는 이것으로 구성된다.
특정 실시 양태에서, Wnt7 폴리펩티드의 변이체는 전장 야생형 Wnt7 폴리펩티드의 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링 활성의 35% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95 이상 %, 99% 이상, 바람직하게는 100%를 갖는다. 바람직한 구체 예에서, Wnt7 폴리펩티드의 변이체는 전장 야생형 Wnt7 폴리펩티드의 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성의 70% 이상을 갖는다. 특정 실시 양태에서, Wnt7 폴리펩티드의 변이체는 전장 야생형 Wnt7 폴리펩티드의 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성보다 더 높은(예를 들어 1.1-배, 1.2-배, 1.3-배, 1.4-배, 1.5-배, 1.6-배, 1.7 배, 1.8 배, 1.9 배 또는 2 배 더 높거나 그 보다 더 높음) GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성을 갖는다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 물에 가용성이다. 예를 들어, Wnt 폴리펩티드의 팔미토일화된 Frizzled-결합 도메인 대신 Frizzled-특이적 항체 또는 이의 단편을 사용함으로써 제제의 용해도를 증가시킬 수 있다.
추가의 측면은 본원에 개시된 바와 같은 제제를 코딩하는 핵산에 관한 것으로, 여기서 제제는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드이다.
"인코딩"은 특정 아미노산 서열, 예를 들어 하나 이상의 원하는 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해 해당 유기체의 유전자 코드에 의해 상응하는, 핵산 서열 또는 이의 일부(들), 또는 주형 전사 생성물(예를 들어, RNA 또는 RNA 유사체) 관계에서 다른 핵산 서열을 의미한다.
본원에 개시된 바와 같은 제제를 코딩하는 핵산의 발현을 허용하기 위해, 제제는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드이고, 핵산은 핵산 발현 카세트 및/또는 벡터에 삽입될 수 있다.
따라서, 추가의 측면은 프로모터 및/또는 전사 및 번역 조절 신호에 작동 가능하게 연결된, 본원에 개시된 바와 같은 제제를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "핵산 발현 카세트"는 핵산 단편, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 재조합 핵산 분자가 삽입되도록 발현될 수 있는 핵산 분자, 전형적으로 DNA를 지칭하며, 여기서 상기 핵산 분자는 핵산 단편의 발현을 제어하는 하나 이상의 핵산 서열이다. 핵산 단편의 발현을 제어하는 이러한 더 많은 핵산 서열의 비 제한적 예는 프로모터 서열, 오픈 리딩 프레임 및 전사 종결자를 포함한다.
바람직하게는, 핵산 발현 카세트는 상기 하나 이상의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함할 수 있다. "오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF"는 번역 개시 코돈으로 시작하고 그 자체로 알려진 번역 종결 코돈으로 닫히고 내부 프레임 내 번역 종결 코돈을 포함하지 않는 연속적인 코딩 뉴클레오티드 트리플릿(코돈)을 지칭하고, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 잠재적으로 인코딩할 수 있다. 따라서,이 용어는 당 업계에서 사용되는 "코딩 서열"과 동의어일 수 있다.
"작동 가능한 연결"은 발현하고자하는 조절 서열 및 서열이 상기 발현을 허용하는 방식으로 연결되는 연결이다. 예를 들어, 예를 들어 프로모터 및 ORF와 같은 서열은 상기 서열 사이의 연결 특성이:(1) 프레임-시프트 돌연변이의 도입을 초래하지 않는 경우( 2) ORF의 전사를 지시하는 프로모터의 능력을 방해하고,(3) 프로모터 서열로부터 ORF가 전사되는 능력을 방해한다. 따라서, "작동 가능하게 연결된"은 프로모터와 같은 발현 제어 서열이 관심 서열의 전사/발현을 효과적으로 제어하도록 유전자 작제물에 통합되는 것을 의미할 수 있다.
전사 및 번역 조절 서열 또는 발현에 필요한 요소의 정확한 성질은 발현 환경에 따라 다양할 수 있지만, 전형적으로 전사 종결자 및 임의로 인핸서를 포함한다.
"프로모터"에 대한 언급은 가장 넓은 맥락에서 취해야 하며, 정확한 전사 개시 및 유전자 발현의 정확한 공간적 및/또는 시간적 제어 또는 예를 들어 내부 또는 외부(예를 들어, 외인성) 자극에 대한 그의 반응에 필요한 전사 조절 서열을 포함한다. 보다 특히, "프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합하여 전사를 개시하는 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자상의 영역을 나타낼 수 있다. 프로모터는 바람직하게는 전사가 제어하는 서열의 상류, 즉 5 '에 위치하는 것이 바람직하지만, 반드시 그런 것은 아니다. 전형적으로, 원핵생물에서 프로모터 영역은 프로모터 자체 및 RNA로 전사될 때 단백질 합성의 개시를 알리는 서열(예를 들어, Shine-Dalgarno 서열)을 모두 함유할 수 있다. 프로모터 서열은 또한 "인핸서 영역"을 포함할 수 있으며, 이는 유전자-클러스터에서 유전자의 전사 수준을 향상시키기 위해 단백질(즉, 트랜스-작용 인자)과 결합될 수 있는 하나 이상의 DNA 영역이다. 인핸서는 전형적으로 코딩 영역의 5 '말단에 있는 반면, 프로모터 서열과 분리될 수도있다. 예를 들어 유전자의 인트론 영역 내에 있거나 3'유전자의 코딩 영역에 있을 수 있다.
구현에서, 본 명세서에서 고려되는 프로모터는 구성성이거나 유도성일 수 있다. 구성성 프로모터는 표준 배양 조건 하에서 발현이 일정한 프로모터인 것으로 이해된다. 유도성 프로모터는 하나 이상의 유도 신호에 반응하는 프로모터이다. 예를 들어, 유도성 프로모터는 화학적으로 조절될 수 있고(예를 들어, 전사 활성이 알코올, 테트라사이클린, 스테로이드, 금속 또는 다른 소분자와 같은 화학적 유도제의 존재 또는 부재에 의해 조절되는 프로모터) 또는 물리적으로 조절될 수 있다 (예를 들어, 전사 활성이 빛 또는 고온 또는 저온과 같은 물리적 유도제의 존재 또는 부재에 의해 조절되는 프로모터). 유도성 프로모터는 또한 화학적 또는 물리적 신호에 의해 직접 조절되는 하나 이상의 전사 인자에 의해 간접적으로 조절될 수 있다. 프로모터의 비 제한적 예는 T7, U6, H1, 레트로 바이러스 Rous 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 사이토 메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포 글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다.
용어 "종결자" 또는 "전사 종결자"는 일반적으로 전사 종결을 알리는 전사 단위의 말단에있는 서열 요소를 지칭한다. 예를 들어, 종결자는 일반적으로 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 ORF(3')의 하류에 위치한다. 예를 들어, 재조합 핵산이 2개 이상의 ORF를 함유하는 경우, 예를 들어, 다중-시스트로닉 전사 단위를 연속적으로 정렬하고 함께 형성하는 경우, 전사 종결자는 유리하게는 3'의 최 하류 ORF에 위치될 수 있다.
특정 구체 예에서, 핵산 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터, 인핸서, ORF 및/또는 전사 종결자에 작동 가능하게 연결된 본원에 개시된 바와 같은 제제를 코딩하는 핵산을 포함한다.
추가 측면은 본원에 개시된 바와 같은 제제를 인코딩하는 핵산, 또는 본원에 개시된 바와 같은 핵산 발현 카세트, 예컨대 바이러스 벡터를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 핵산 단편, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 재조합 핵산 분자가 삽입 및 클로닝될 수 있는, 즉 전파되는 핵산 분자, 전형적으로 DNA를 지칭한다. 따라서, 벡터는 전형적으로 하나 이상의 독특한 제한 부위를 함유할 것이며, 클로닝된 서열이 재현 가능하도록 정의된 세포 또는 비히클 유기체에서 자율 복제할 수 있다. 벡터는 바람직하게는 벡터를 함유하는 수용자 세포의 선택을 허용하기 위해 예를 들어 항생제 내성 유전자와 같은 선택 마커를 함유할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지, 박테리오파지 유래 벡터, PAC, BAC, 선형 핵산, 예를 들어 선형 DNA, 트랜스포즌, 바이러스 벡터 등을 제한없이 포함할 수 있다(예를 들어, Sambrook et al. , 1989; Ausubel 1992). 바이러스 벡터는 특히 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터, 예를 들어 HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV에 기초한 벡터를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 원하는 발현 시스템, 예를 들어, 시험관 내, 세포, 기관 및/또는 유기체에서 핵산 또는 그에 도입된 오픈 리딩 프레임의 발현을 허용 및/또는 효과 시키도록 구성된다. 예를 들어, 발현 벡터는 유리하게는 적합한 조절 서열을 포함할 수 있다.
특정 벡터를 선택하는데 있어서 중요한 요소는 다음을 포함한다: 수령인 세포의 선택, 벡터를 포함하는 수령인 세포가 벡터를 포함하지 않는 수령인 세포로부터 쉽게 인식되고 선택될 수 있음; 특정 수용자 세포에서 바람직한 벡터의 카피 수; 벡터가 염색체 내로 통합되거나 수용 세포에서 염색체 외로 유지되는 것이 바람직한지; 및 상이한 종의 수용자 세포 사이에서 벡터를 "셔틀링(shuttle)"할 수 있는지의 여부.
발현 벡터는 자율적이거나 통합적일 수 있다. 핵산은 플라스미드, 파지, 트랜스포즌, 코스미드 또는 바이러스 입자와 같은 발현 벡터의 형태로 세포에 도입될 수 있다. 재조합 핵산은 염색체 외적으로 유지될 수 있거나 세포 염색체 DNA에 통합될 수 있다. 발현 벡터는 선택된 조건(예를 들어, 우라실 생합성에 필요한 효소를 인코딩하는 URA3, 또는 로이신 생합성에 필요한 효소를 인코딩하는 LEU2, 또는 필요한 효소를 인코딩하는 TRP1)에서 세포 생존에 필요한 단백질을 인코딩하는 선별 마커 유전자를 함유하여, 목적하는 핵산으로 형질전환된 세포의 검출 및/또는 선택을 가능하게 한다. 발현 벡터는 또한 자율 복제 서열(ARS)을 포함할 수 있다. ARS는 동원체(CEN) 및 복제 기점(ORI)을 포함할 수 있다. 예를 들어, ARS는 ARS18 또는 ARS68일 수 있다.
통합 벡터는 일반적으로 적어도 제 1 삽입 가능한 DNA 단편, 선택 가능한 마커 유전자 및 제 2 삽입 가능한 DNA 단편의 연속 배열된 서열을 포함한다. 제 1 및 제 2 삽입 가능한 DNA 단편은 각각 길이가 약 200개(예를 들어, 약 250개, 약 300개, 약 350개, 약 400개, 약 450개, 약 500개 또는 약 1000개 이상)인 뉴클레오티드이고, 형질전환될 세포 종의 게놈 DNA의 부분에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 발현에 관심있는 핵산을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 마커 유전자 전 또는 후에, 이 벡터에 제 1 및 제 2 삽입 가능 DNA 단편 사이에 삽입된다. 통합 벡터는 형질전환 전에 선형화되어 관심있는 뉴클레오티드 서열의 세포 게놈으로의 통합을 용이하게 할 수 있다.
벡터를 관심 세포에 도입하기 전에, 벡터는 대장균(E. coli)과 같은 박테리아 세포에서 성장(예를 들어, 증폭)될 수 있다. 벡터 DNA는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 박테리아 세포로부터 단리될 수 있으며, 이는 박테리아 환경으로부터 벡터 DNA의 정제를 초래한다. 정제된 벡터 DNA는 페놀, 클로로포름 및 에테르로 광범위하게 추출될 수 있으며, 이들 단백질은 포유동물 세포에 독성이 있을 수 있기 때문에 플라스미드 DNA 제제에 대장균 단백질이 존재하지 않는 것이 보장된다.
다른 곳에 언급된 바와 같이, 제제는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 이는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 의한 발현을 통해 적합하게 수득될 수 있고, 발현 작제물 인코딩으로 형질전환되고 상기 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 상기 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현을 위해 구성된 후 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 정제된다.
따라서, 추가의 측면은 본원에 교시된 핵산, 핵산 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
특정 구체 예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 동물 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.
용어 "숙주 세포" 및 "숙주 유기체"는 박테리아와 같은 원핵생물 및 진핵생물, 예컨대 효모, 진균, 원생동물, 식물 및 동물을 포함하는 세포 또는 유기체를 적절하게 지칭할 수 있다. 숙주 세포는 단세포 유기체, 예를 들어 박테리아(예를 들어, 대장균, 장티푸스균, 세라티아 마르세스센 또는 바실러스 서브틸리스), 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 또는 피히아 파스토리스) 및 (배양된) 식물 세포(예를 들어, 애기장대 또는 담배로부터) 및 (배양된) 동물 세포(예를 들어, 척추 동물 동물 세포, 포유동물 세포, 영장류 세포, 인간 세포 또는 곤충 세포)이다. 숙주 유기체로는 특히 식물 및 동물, 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 온혈 동물, 더욱 바람직하게는 척추 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 영장류와 같은 다세포 유기체; 인간이 아닌 동물 및 동물 카테고리가 특히 고려된다.
이러한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 적절히 단리될 수 있다. 특정 성분(예를 들어, 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드)과 관련하여 용어 "단리된"은 일반적으로 이러한 성분이 분리되어 존재 하는 것, 예를 들어, 자연 환경의 하나 이상의 다른 구성 요소와 분리되거나 분리되어 제조 및/또는 유지되는 것이다. 예를 들어, 분리된 인간 또는 동물 단백질 또는 복합체는 자연적으로 발생하는 인간 또는 동물 신체로부터 분리되어 존재할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 바람직하게는 "정제된" 한정자를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된" 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산은 절대 순도를 요구하지 않는다. 대신에, 이는 그러한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산이 다른 분석물에 비해 이들의 존재비(종래 질량 또는 중량 또는 농도로 편리하게 표현됨)가 출발 조성물 또는 샘플에서보다 더 큰 별개 환경에 있음을 나타낸다. 별개의 환경은 예를 들어 단일 용액, 겔, 침전물, 동결 건조물 등과 같은 단일 배지를 나타낸다. 정제된 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 예를 들어 실험실 또는 재조합 합성, 크로마토 그래피, 분취 전기 영동, 원심 분리, 침전, 친화 정제 등을 포함하는 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 정제된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 바람직하게는 중량 기준으로 약 10%,보다 바람직하게는 약 50%, 예를 들어 약 60%, 보다 더 바람직하게는 약 70%, 예를 들어 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 별개 환경의 단백질 함량을 갖는다. 단백질 함량은, 예를 들어, 선택적으로 Hartree 1972(Anal Biochem 48: 422-427)에 의해 기술된 Lowry 방법(Lowry et al. 1951. J Biol Chem 193: 265)에 의해 결정될 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 순도는 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 결정될 수 있다. 핵산의 양은 흡광도 A260을 측정함으로써 결정될 수 있다. 핵산의 순도는 흡광도 A260/A280, 또는 아가로스-또는 폴리 아크릴 아미드-겔 전기 영동 및 브롬화 에티듐 또는 유사한 염색에 의해 측정될 수 있다.
또한, 핵산을 동물 세포 내로 도입하는 몇몇 잘 알려진 다른 방법이 있으며, 이들 중 임의의 것을 본원에 사용할 수 있다. 가장 간단하게, 핵산은 표적 세포/표적 조직으로 직접 주입될 수 있다. 다른 방법으로는 핵산을 함유하는 박테리아 원형질체와 수용자 세포의 융합, 염화칼슘, 루비듐 클로라이드, 염화 리튬, 인산 칼슘, DEAE 덱스트란, 양이온 성 지질 또는 리포좀과 같은 조성물의 사용 또는 수용체-매개 세포 내 이입과 같은 방법, 생물학적 입자 폭격( "유전자 총"방법), 바이러스 벡터(즉, 렌티 바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 안티바이러스로부터 유도 됨)에 의한 감염, 전기 천공 법 등이 있다. 핵산 분자를 표적 세포로 전달하기에 적합한 다른 기술 또는 방법은 폴리(락트-코-글리콜 산) 중합체 성 미소구로부터 NA 분자의 연속 전달 또는 제품을 전달하는 마이크로 펌프로 보호된(안정화된) NA 분자(들)의 직접 주입을 포함한다. 다른 가능성은 이식 가능한 약물 방출 생분해성 미소 구체의 사용이다. 또한, 다양한 유형의 리포좀(면역 리포좀, PEG 화(면역) 리포좀), 양이온 성 지질 및 폴리머, 나노 입자 또는 덴드리머, NA(폴리-락트-코-글리콜 산) 폴리머 미소구, 이식 가능한 약물 방출 생분해성 미소구에서의 NA의 캡슐화; 및 뉴클레아제 억제제 아우린트리카르복실산과 같은 보호제와 NA의 공동-주입이 예상된다. 상이한 상기 언급된 전달 모드 또는 방법의 조합이 또한 사용될 수 있음이 명백하다.
특정 실시 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터는 바이러스 벡터, 바람직하게는 중추 및/또는 말초 신경계(예를 들어, 뇌-특이적 바이러스 벡터)를 향한 바이러스 벡터이다. 추가의 특정 실시 양태에서, 바이러스 벡터는 중추 신경계(CNS) 뉴런-특이적 아데노-관련 바이러스 혈청형 9(AAV9) 돌연변이체이다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 Deverman et al., Nat Biotechnol, 34:204-209 (2016) 및 Chan et al., Nat Neurosci, 20(8): 1172-1179 (2017)에 기술된 바와 같이 펩티드 SAQTLAVPFKA(서열 번호 55) 또는 SDGTLAVPFKA(서열 번호 56)를 나타내는 CNS 세포-특이적 AAV-PHP.B 또는 AAV-PHP.eB 바이러스 벡터이다.
바람직한 구체 예에서, 바이러스 벡터는 혈액 뇌 장벽 내피세포-특이적 바이러스 벡터이다. 추가의 바람직한 구체 예에서, 바이러스 벡터는 혈액 뇌 장벽 내피세포-특이적 캡시드 아데노-관련 바이러스 혈청 형 2(AAV2) 돌연변이체이다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 Kφrbelin et al., EMBO Molecular Medicine, 8, 609-625 (2016)에 기재된 펩티드 NRGTEWD(서열 번호 57)를 나타내는 혈액 뇌 장벽 내피세포-특이적 AAV-BR1 바이러스 벡터이다.
추가 측면은 본원에 개시된 바와 같은 제제, 본원에 개시된 바와 같은 제제를 코딩하는 핵산, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 발현 카세트 또는 본원에 개시된 바와 같은 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약제학적 제형 또는 조성물은 부품 키트에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 당 업계에 사용되는 의미와 일치하며 약제학적 조성물의 다른 성분과 상용성이고 이의 수용자에게 유해하지 않은 것을 의미한다.
본원에 사용된 "담체" 또는 "부형제"는 임의의 및 모든 용매, 희석제, 완충제(예를 들어, 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수), 가용화제, 콜로이드, 분산 매질, 비히클, 충전제, 킬레이트 제(예: 예를 들어, EDTA 또는 글루타티온), 아미노산(예를 들어, 글리신), 단백질, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 향료, 방향제, 증점제, 저장소 효과를 달성하기 위한 제제, 코팅제, 항진균제, 방부제, 산화 방지제, 등장성 조절제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당 업계에 잘 알려져있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 물질과 양립할 수 없는 한, 치료 조성물에서의 이의 사용이 고려될 수 있다.
약제학적 조성물을 제형화하는데 사용하기 위한 예시적인 비 제한적 담체는 예를 들어 수-중-유 또는 유 중수 에멀젼, 정맥 내(IV) 사용에 적합한 유기 공용매를 포함하거나 포함하지 않는 수성 조성물, 리포좀 또는 계면 활성제-함유 리포좀, 미소구, 마이크로비드 및 마이크로솜, 분말, 정제, 캡슐, 좌약, 수성 현탁액, 에어로졸 및 당업자에게 명백한 다른 담체를 포함한다.
본원에 의도된 바와 같은 제약 조성물은 본질적으로 임의의 투여 경로, 예를 들어 경구 투여(예를 들어, 경구 섭취 또는 흡입), 비강 내 투여(예를 들어, 비강 내 흡입 또는 비강 내 점막 적용), 비경구 투여(예를 들어, 피하, 정맥 내(IV), 근육 내, 복강 내 또는 흉골 내 주사 또는 주입), 경피 또는 경점막(예를 들어, 경구, 설하, 비강 내) 투여, 국소 투여, 직장, 질 또는 내부 기관 주입 등을 위해 제형화될 수 있다. 이러한 방식으로, 방법 및 조성물에 의해 달성될 수 있는 치료 효과는 예를 들어 주어진 적용의 특정 요구에 따라 전신, 국소, 조직-특이적일 수 있다.
예를 들어, 경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 알약, 정제, 래커 정제, 코팅된(예를 들어, 당-코팅된) 정제, 과립, 경질 및 연질 젤라틴 캡슐, 수성, 알콜 성 또는 유성 용액, 시럽, 에멀젼 또는 현탁액 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 비 제한적으로, 경구 투여 형태의 제조는 분말 형태로, 임의로 미분된 하나 이상의 고체 담체를 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 적합한 양의 제제를 균일하고 친밀하게 함께 배합하여, 알약, 정제 또는 캡슐로 블렌드를 제형화함으로써 달성될 수 있다. 예시적이지만 비 제한적인 고형 담체는 인산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 활석, 당(예를 들어, 글루코스, 만노스, 락토스 또는 수크로스와 같은), 당 알코올(예를 들어, 만니톨), 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로오스, 폴리 비닐 피롤리딘, 저 융점 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다. 약제학적 조성물을 함유하는 압축 정제는 본원에 개시된 바와 같은 제제를 상기 기재된 바와 같은 고체 담체와 균일하고 친밀하게 혼합하여 필요한 압축 특성을 갖는 혼합물을 제공한 다음, 혼합물을 적합한 기계에서 형태 및 원하는 크기로 압축하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐 및 좌약에 적합한 담체는 예를 들어 지방, 왁스, 반고체 및 액체 폴리올, 천연 또는 경화유 등이다.
예를 들어, 경구 또는 비강 에어로졸 또는 흡입 투여를 위해, 약제학적 조성물은 예시적인 담체, 예를 들어 식염수, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리콜, DPPC, 메틸 셀룰로스를 갖는 용액 또는 분말 분산제와의 혼합물, 또한 벤질 알코올 또는 다른 적합한 방부제, 생체 이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로 카본 및/또는 당 업계에 공지된 다른 가용화제 또는 분산제를 사용하여 제형화될 수 있다. 에어로졸 또는 스프레이 형태로 투여하기에 적합한 제약 제제는 예를 들어 본원에 교시된 제제의 용액, 현탁액 또는 에멀젼 또는 제약상 허용되는 용매, 예컨대 에탄올 또는 물 또는 이들 용매의 혼합물 중의 생리학적으로 허용되는 염이다. 필요한 경우, 제형은 또한 다른 약제학적 보조제, 예컨대 계면 활성제, 유화제 및 안정제 및 추진제를 추가로 함유할 수 있다. 예시적으로, 전달은 1 회용 전달 장치, 미스트 분무기, 호흡 활성화 분말 흡입기, 에어로졸 계량 투여 흡입기(MDI) 또는 당 업계에서 이용가능한 수많은 분무기 전달 장치를 사용하여 이루어질 수 있다. 또한, 미스트 텐트 또는 기관 내 튜브를 통한 직접 투여가 또한 사용될 수 있다.
점막 표면을 통한 투여용 담체의 예는 특정 경로, 예를 들어, 경구, 설하, 비강 등에 의존한다. 경구 투여시, 예시적인 예에는 제약 등급의 만니톨, 전분, 락토스, 스테아르 산 마그네슘, 나트륨 사카라이드, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘이 포함된다. 만니톨이 바람직하다. 비강 내로 투여될 때, 예시적인 예는 폴리에틸렌 글리콜, 인지질, 글리콜 및 당지질, 수크로스 및/또는 메틸 셀룰로오스, 락토오스와 같은 증량제 또는 벤즈 알코늄 클로라이드, EDTA와 같은 방부제를 포함하거나 포함하지 않는 분말 현탁액을 포함한다. 특히 예시적인 구체 예에서, 포스포리피드 1,2 디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC)은 본 발명의 화합물의 비강 내 투여를 위해 약 0.1 내지 3.0 mg/ml의 농도로 약 0.01-0.2%의 등장성 수성 담체로서 사용된다.
예를 들어, 비경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 유리하게는 적합한 용매, 희석제, 가용화제 또는 유화제 등을 갖는 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 제형화될 수 있다. 적합한 용매는 제한없이 물, 생리 식염수 용액 또는 알코올, 예를 들어, 에탄올, 프로판올, 글리세롤, 또한 당 용액, 예를 들어 글루코스, 전화당, 수크로오스 또는 만니톨 용액, 또는 대안적으로 언급된 다양한 용매의 혼합물이다. 주 사용 용액 또는 현탁액은 적합한 비 독성, 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예컨대 만니톨, 1,3-부탄디올, 물, 링거액 또는 등장성 염화나트륨 용액, 또는 적합한 분산 또는 습윤 및 현탁제, 예를 들어 멸균, 의학자극이 없는, 합성 모노-또는 디 글리세라이드를 포함하는 고정유, 및 올레산을 포함하는 지방산을 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 본 발명의 제제 및 이의 약제학적으로 허용되는 염은 또한 동결 건조될 수 있고, 수득된 동결 건조물은 예를 들어 주사 또는 주입 제제의 제조에 사용된다. 예를 들어, 정맥 내 사용을 위한 담체의 하나의 예시적인 예는 10% USP 에탄올, 40% USP 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 600 및 USP 주사용수(WFI)의 혼합물을 포함한다. 정맥 내 사용을 위한 다른 예시적인 담체에는 10% USP 에탄올 및 USP WFI; USP WFI 중 0.01-0.1% 트리에탄올 아민; 또는 USP WFI 중 0.01-0.2% 디팔미토일 디포스파티딜콜린; 및 1-10% 스쿠알렌 또는 비경구 식물성 수-중-유 에멀젼을 포함한다. 피하 또는 근육 내 사용을 위한 담체의 예로는 인산 완충 식염수(PBS) 용액, WFI 중 5% 덱스트로스 및 5% 덱스트로스 중 0.01-0.1% 트리에탄올 아민 또는 USP WFI 중 0.9% 염화나트륨, 또는 1 ~ 10% USP 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 예컨대 5% 덱 스트로스 또는 0.9% 염화나트륨과 같은 나머지 양의 허용가능한 등장성 용액의 1 내지 2 또는 1 내지4 혼합물; 또는 USP WFI 중의 0.01-0.2% 디팔미토일 디포스파티딜콜린 및 1 내지 10% 스쿠알렌 또는 비경구 식물성 수-중-유 에멀젼을 포함한다.
수성 제제가 바람직한 경우, 이는 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 하나 이상의 적합한 계면 활성제, 예를 들어 인지질 계면 활성제를 포함하는 미셀 분산액 형태일 수 있다. 인지질의 예시적인 예는 디아실 포스파티딜 글리세롤, 예컨대 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DPMG), 디팔미토일 포스파티딜 글리세롤(DPPG), 및 디스테아로일 포스파티딜 글리세롤(DSPG), 디아실 포스파티딜 콜린, 예컨대 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DPMC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC) 및 디스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC); 디아실 포스파티드산, 예컨대 디미리스토일 포스파티드산(DPMA), 디파니토일 포스파티드산(DPPA) 및 디스테아로일 포스파티드산(DSPA); 및 디아실 포스파티딜 에탄올 아민, 예컨대 디미리스토일 포스파티딜 에탄올 아민(DPME), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올 아민(DPPE) 및 디스테아로 포스파티딜 에탄올 아민(DSPE)을 포함한다. 전형적으로, 수성 제형에서 계면 활성제: 활성 물질 몰비는 약 10: 1 내지 약 1:10, 보다 전형적으로는 약 5: 1 내지 약 1: 5 일 것이지만, 특정 목적에 가장 적합한 수성 제형에서 임의의 유효량의 계면활성제가 사용될 수 있다.
좌제의 형태로 직장으로 투여될 때, 이들 제제는 본 발명에 따른 화합물을 상온에서는 고체이지만 직장을 액체화 및/또는 용해시켜 약물을 방출하는 적당한 비 자극성 부형제, 예컨대 코코아 버터, 합성 글리세리드 에스테르 또는 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 제조될 수 있다.
마이크로캡슐, 임플란트 또는 로드(rod)에 적합한 담체는 예를 들어 글리콜산 및 락트산의 공중합체이다.
당업자는 상기 설명이 완전한 것이 아니라 예시적인 것임을 인식할 것이다. 실제로, 다양한 추가의 치료 기술에서 본원에 기술된 특정 조성물을 사용하기에 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 같이, 많은 추가의 제형 기술 및 제약상 허용되는 부형제 및 담체 용액이 당업자에게 널리 공지되어 있다.
바람직한 구체 예에서, 제제, 제제를 코딩하는 핵산, 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트, 핵산 또는 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터, 숙주 세포 또는 본원에 교시된 약제학적 조성물은 비경구 투여된다. 더욱 바람직하게는, 약제, 약제를 코딩하는 핵산, 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트 또는 핵산을 포함하는 벡터, 핵산 발현 카세트, 숙주 세포 또는 본원에 교시된 바와 같은 약제학적 조성물은 정맥 내 투여, 예를 들어 주사에 의해 투여된다.
특정 실시 양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 제제, 제제를 코딩하는 핵산, 또는 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트는 유전자 요법에 사용된다. 추가의 특정 실시 양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 제제, 제제를 코딩하는 핵산, 또는 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트는 뇌-지향성 유전자 요법, 보다 구체적으로, 혈액 뇌 장벽 내피세포 지향 유전자 요법과 같은 중추 및/또는 말초 신경계-지향성 유전자 요법에 사용된다.
따라서, 본 명세서에서 유전자 요법이 필요한 대상체에서 유전자 요법, 특히 중추 및/또는 말초 신경계-지향성 유전자 요법을 위한 방법이 본원에 제공되고, 유전자 요법은 다음을 포함한다: 대상체, 특히 대상체의 중추 및/또는 말초 신경계에서 본원에 교시된 바와 같은 핵산 발현 카세트 또는 벡터를 도입하고; 대상체, 특히 대상체의 중추 및/또는 말초 신경계에서 본원에 교시된 바와 같이 핵산에 의해 인코딩된 치료적 유효량의 제제를 발현시킨다.
본원에 사용된 용어 "유전자 요법"은 도입에 사용된 방법에 관계없이 치료 적 또는 예방 목적으로 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 이러한 방법은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 벡터-매개 유전자 전달(예를 들어, 바이러스 감염/형질감염, 또는 다양한 다른 단백질-기반 또는 지질-기반 유전자 전달 복합체에 의한)과 같은 잘 알려진 다양한 기술을 포함한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 안정적으로 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 안정적인 유지에는 도입된 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에 적합한 복제 기점을 함유하거나 염색체 외 레플리콘(예를 들어, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체와 같은 숙주 세포의 레플리콘에 통합될 것이 일반적으로 요구된다. 당 업계에 공지된 바와 같이, 다수의 벡터가 유전자를 포유동물 세포로 전달하는 것을 매개할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 약제의 벡터-매개 유전자 전달, 약제를 코딩하는 핵산, 본원에 교시된 바와 같은 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트는 중추 및/또는 말초 신경계를 향한 바이러스 벡터(예를 들어, AAV-PHP.B 및 AAV-PHP.eB 바이러스 벡터) 또는 본원의 다른 곳에 기재된 혈액 뇌 장벽 내피세포에 특이적인 바이러스 벡터(예를 들어, AAV-BR1 바이러스 벡터)를 사용하여 수행될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 제제를 코딩하는 핵산, 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트, 핵산을 포함하는 벡터 또는 핵산 발현 카세트 또는 본원에 교시된 바와 같은 약제학적 조성물은 주사(예를 들어, 정맥 내) 또는 본원에 교시된 핵산 또는 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 동종 이계 세포의 이식에 의해 대상체에게 투여된다. 투여시, 주사 또는 이식된 동종 이형 세포는 본원에서 교시된 바와 같이 생체 내에서 약제를 코딩하는 핵산을 전사 및 번역할 것이다. 선택적으로 투여될 하나 이상의 다른 활성 화합물과 조합하여 본원에 교시된 제제의 투여량 또는 양은 개별 경우에 따라 다르며, 통상적으로 최적의 효과를 달성하기 위해 개별 환경에 적합하도록되어 있다. 따라서, 단위 용량 및 요법은 치료될 장애의 본질 및 중증도, 및 대상의 종, 성별, 연령, 체중, 일반적인 건강, 식이, 모드 및 투여 시간, 면역 상태 및 치료될 인간 또는 동물의 개별 반응성, 사용된 화합물의 효능, 대사 안정성 및 작용 기간, 치료될 급성 또는 만성 또는 예방적 여부, 또는 본 발명의 제제에 추가되는 다른 활성 화합물의 투여 여부에 의존한다. 치료 효능을 최적화하기 위해, 본원에 교시된 제제는 상이한 투여 요법으로 먼저 투여될 수 있다. 전형적으로, 조직 내 제제의 수준은 예를 들어 주어진 치료 요법의 효능을 결정하기 위해 임상 시험 절차의 일부로서 적절한 스크리닝 분석을 사용하여 모니터링될 수 있다. 투여 빈도는 의료 전문가(예를 들어, 의사, 수의사 또는 간호사)의 기술 및 임상 판단 내에 있다. 전형적으로, 투여 체제는 최적의 투여 파라미터를 확립할 수 있는 임상 시험에 의해 확립된다. 그러나, 개업의는 전술한 요인들 중 하나 이상, 예를 들어 대상체의 연령, 건강, 체중, 성별 및 의학적 상태에 따라 이러한 투여 방식을 변경할 수 있다. 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 변할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 제제 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 독성 및 치료 효능은 예를 들어 세포 배양 또는 실험 동물에서의 공지된 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 이러한 절차는 예를 들어 LD50(군중의 50%에 치사량) 및 ED50(군중의 50%에서 치료 유효량)을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며, LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 약제학적 조성물이 사용될 수 있지만, 정상 세포(예를 들어, 비 표적 세포)에 대한 잠재적 손상을 최소화하기 위해 이러한 화합물을 영향을 받는 조직의 부위로 표적화하는 전달 시스템을 설계하도록 주의를 기울여야 하고, 따라서 부작용을 줄인다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 적절한 대상체에 사용하기 위한 투여량 범위를 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물의 용량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 사용되는 제약 조성물의 경우, 치료 유효 용량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정될 수 있다. 세포 배양물에서 측정된 IC50(즉, 증상의 최대 최대 억제를 달성하는 약제학적 조성물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 용량을 동물 모델에서 결정할 수 있다. 이러한 정보는 인간의 유용한 복용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
제한없이, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 본원에 교시된 제제의 전형적인 투여량(예를 들어, 전형적인 일일 투여량 또는 전형적인 간헐적 투여량, 예를 들어, 2 일마다, 3 일마다, 4 일마다, 5 일마다, 6 일마다, 1 주일마다, 2 주일마다, 3 주일마다, 매월 또는 기타의 전형적인 투여량)은 상기 언급된 인자에 따라 대상체의 체중당 약 10 ㎍/kg 내지 약 500 ㎍/kg 범위, 예를 들어 20-400㎍/㎏ 또는 20-200㎍/㎏ 또는 20-100 ㎍/㎏ 또는 40-80㎍/㎏일 수 있다.
예로서 제한없이, 본원에 교시된 제제의 용량은 약 5㎍/㎏, 또는 약 10㎍/㎏, 또는 약 15㎍/㎏, 또는 약 20㎍/㎏, 또는 약 25㎍/㎏, 또는 약 30㎍/㎏, 또는 약 35㎍/㎏, 또는 약 40㎍/㎏, 또는 약 45㎍/㎏, 또는 약 50 mg/kg, 또는 약 60㎍/㎏, 또는 약 70㎍/㎏, 또는 약 80㎍/㎏, 또는 약 90㎍/㎏, 또는 약 100㎍/㎏, 또는 약 200㎍/㎏, 또는 약 300㎍/㎏ 또는 약 400 ㎍/kg, 또는 약 500 ㎍/kg이다.
특정 실시 양태에서, 본원에 교시된 제제는 (부분적으로) 이식된 지속 전달 시스템과 같은 지속 전달 시스템을 사용하여 투여된다. 당업자는 이러한 지속 전달 시스템이 본원에 교시된 바와 같은 제제를 보유하기 위한 저장소, 펌프 및 주입 수단(예를 들어, 튜브 시스템)을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 지속 전달 시스템은 뇌에 이식된 미니 삼투 펌프 시스템일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 제제는 제약 조성물의 주성분 또는 유일한 활성 성분이다.
추가의 측면은 의약으로서 사용하기 위한, 본원에 개시된 바와 같은 제제, 본원에 개시된 바와 같은 제제를 코딩하는 핵산, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 발현 카세트, 본원에 개시된 바와 같은 벡터 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가의 측면은 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 장애를 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애를 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본원에 개시된 바와 같은 제제, 본원에 개시된 바와 같은 제제를 코딩하는 핵산, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 발현 카세트, 본원에 개시된 바와 같은 벡터 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
"치료" 또는 "처치"라는 용어는 이미 발전된 질환 또는 상태의 치료적 처치, 예를 들어 이미 발전된 신경 혈관 장애, 또는 신경 혈관 기능 장애를 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애의 치료 및 예방 또는 예방 조치를 포함하고, 여기서 목적은 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 CNS 장애의 발생, 발달 및 진행을 예방하는 것과 같은 바람직하지 않은 고통의 발생 가능성을 예방하거나 감소시키는 것이다. 유리한 또는 바람직한 임상 결과는 하나 이상의 증상 또는 하나 이상의 생물학적 마커의 완화, 질병 정도의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 둔화, 개선 또는 질병 상태의 완화 등이다. "치료"는 또한 치료를 받지 않으면 예상 생존과 비교하여 생존 연장을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "신경 혈관 장애" 또는 "신경 혈관 질환"은 뇌 혈관계 및/또는 척수를 공급하는 혈관계에 영향을 미치는 질환 또는 병리학적 변경 또는 상태를 지칭한다. 상기 용어는 뇌 및/또는 척추 내에 또는 이를 공급하는 혈관의 이상을 포함한다. 이상은 (i) 저산소증, 허혈 또는 뇌졸중을 유발할 수 있는 뇌로의 혈류를 감소시키는 동맥의 협착 및/또는 (ii) 뇌 동맥류를 유발하고 두개 내 출혈의 위험을 증가시킬 수 있는 동맥의 약화이나 이에 제한되지 않을 수 있다. 신경 혈관 질환의 비 제한적인 예는 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 허혈/재관류 손상, 뇌 동맥류, 동정맥 기형(AVM), 해면 기형, 혈관염, 뇌출혈, 지주막하 출혈, 척추 혈관 기형, 경동맥 협착증, 모야모야병 및 두개골 내부의 죽상동맥경화증이다.
본원에 사용된 "신경 혈관 기능 이상을 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애" 또는 "신경 혈관 기능 이상을 포함하는 CNS 질환"이라는 문구는, 신경 혈관 기능 장애에 의해 야기되거나, 기여되거나, 또는 전형적으로 뇌 및/또는 척추 내에서 또는 혈관 및/또는 공급하는 혈관의 구조 및/또는 기능의 이상을 초래하는 CNS를 집합적으로 형성하는, 뇌 및/또는 척수의 구조 및/또는 기능에 영향을 미치는 신경계 장애 그룹을 지칭한다. 신경 혈관 기능 장애를 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애의 비 제한적 예는 다발성 경화증, 허혈성 뇌졸중, 뇌암, 간질, 치매, 혈관성 치매, HIV-1-관련 치매, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴병, 근위축성 축삭경화증, 전염성 뇌 질환, 외상성 뇌 손상, 편두통 및 만성 외상성 뇌병증이다.
언급된 경우를 제외하고, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 동물, 바람직하게는 온혈 동물, 더욱 바람직하게는 척추 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 영장류, 특히 인간 환자 및 비-인간 포유류와 영장류 환자를 포함한다. 바람직한 대상체는 인간 대상체이다. 용어 "대상체" 또는 "환자"는 치료를 필요로 하는 대상체, 보다 구체적으로 주어진 증상, 특히 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 장애를 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애의 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체를 포함한다. 이러한 대상은 상기 증상으로 진단된 대상, 상기 증상이 발생하기 쉬운 대상 및/또는 상기 증상이 예방되는 대상을 제한없이 포함할 수 있다.
본원에 교시된 바와 같은 제품 및 방법은 본원에 교시된 바와 같은 치료적 및/또는 예방적 유효량의 제제, 본원에 개시된 바와 같은 제제를 코딩하는 핵산, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 발현 카세트, 본원에 개시된 바와 같은 벡터 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물을 이러한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 신경 혈관 장애 또는 CNS 장애를 갖는 대상체에서 투여하는 것을 허용한다. 본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 외과의, 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 추구하는 대상에서 생물학적 또는 의약 반응을 유도하는 활성 화합물 또는 약제의 양을 지칭한다. 특히 치료되는 질환 또는 상태의 증상의 완화를 포함할 수 있다. 용어 "예방 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 요구되는 장애의 발병을 피험체에서 억제 또는 지연시키는 활성 화합물 또는 약제의 양을 지칭한다. 본원에 교시된 바와 같은 치료제 및/또는 예방적으로 유효한 용량의 제제, 제제를 코딩하는 핵산, 핵산 발현 카세트 또는 약제학적 조성물을 결정하는 방법이 당 업계에 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은, 투여될 때 신경 혈관 장애 또는 CNS 장애를 갖는 환자의 치료와 관련하여 긍정적인 반응을 가져오는, 약제, 약제를 인코딩하는 핵산, 핵산 발현 카세트 또는 약제학적 조성물의 양을 나타낸다.
본원에 교시된 적절한 치료 유효량의 제제, 제제를 코딩하는 핵산, 핵산 발현 카세트 또는 약제학적 조성물은 질환 상태 및 중증도, 및 환자의 연령, 크기 및 증상의 특성에 따라 자격 있는 의사에 의해 결정될 수 있다.
추가의 측면은 치료를 필요로하는 대상체에서 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 신경 혈관 장애 또는 CNS 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에는 치료적 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 제제, 본원에 개시된 바와 같은 제제를 코딩하는 핵산, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 발현 카세트, 본원에 개시된 바와 같은 벡터 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
추가 측면은 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 CNS 장애의 치료를 위한 의약 제조를 위한, 본원에 개시된 바와 같은 제제, 본원에 개시된 바와 같은 제제를 코딩하는 핵산, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 발현 카세트, 본원에 개시된 바와 같은 벡터 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
특정 실시 양태에서, 상기 신경 혈관 장애는 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 허혈/재관류 손상, 뇌 동맥류, 동정맥 기형(AVM), 해면 기형, 혈관염, 뇌출혈, 지주막하 출혈, 척수 혈관 기형, 동맥 협착증, 모야모야병 및 두개골 내부의 죽상동맥경화증 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 상기 CNS 장애는 다발성 경화증, 허혈성 뇌졸중, 뇌암, 간질, 치매, 혈관성 치매, HIV-1-관련 치매, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴병, 근위축성 축삭경화증, 감염성 뇌 질환, 외상성 뇌 손상, 편두통, 만성 외상성 뇌병증 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 측면은 시험 제제가 GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링은 활성화시키나 ECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링은 그렇지 않은지를 결정하는 것을 포함하는, 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 CNS 장애의 예방 또는 치료에 유용한 치료제로서 유용한 제제를 확인하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것이다. 용어 "시험관 내"는 일반적으로 신체, 예를 들어 동물 또는 인체의 외부 또는 밖을 의미한다. 이 용어는 또한 "생체 외"를 포함한다. "시험관 내"의 한 예는 조직 세포 배양에 있다.
본원에 사용된 용어 "시험 제제"는 GPR124/RECK/Frizzled/LRP 매개 Wnt 신호를 활성화하지만 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP 매개 Wnt 신호는 활성화하지 않는지를 결정하는데 바람직한, 임의의 화학 물질(예를 들어, 무기 또는 유기), 생화학적 또는 생물학적 물질, 분자 또는 거대 분자(예를 들어, 생물학적 거대 분자), 이들의 조합 또는 혼합물, 결정되지 않은 조성물의 샘플, 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로 만들어진 추출물이다.
GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링 및 Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링의 활성화 또는 활성화 결여의 결정은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다. 예를 들어, Super TOPFlash 플라스미드(예: Super 8x TOPFlash 플라스미드, Addgene 플라스미드 # 12456)로 일시적으로 형질감염된 세포 또는 안정적으로 일시적으로 형질감염된 Super Top Flash 리포터 세포주(예: HEK293 STF 세포주)는 Frizzled, LRP, GPR124 및/또는 Reck 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드로 (함께) 형질감염될 수 있고, 상기 세포에서 Wnt 시그널링 활성의 지표로서 시험 제제의 첨가에 응답하여 세포의 루시페라제 활성을 결정하는데 사용된다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료제로서 유용한 제제를 확인하기 위한 시험관 내 방법은 시험 제제를 GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링이 가능한 세포와 접촉시키고 상기 Wnt 시그널링을 측정하고, 시험 제제를 Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되지만 GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되지 않은 Wnt 시그널링이 가능한 세포와 접촉시키고 상기 Wnt 시그널링을 측정하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "접촉" 또는 "접촉하는"은 하나 이상의 제 1 성분(예: 하나 이상의 분자, 생물학적 개체, 세포 또는 물질)을 하나 이상의 제 2 성분(예: 하나 이상의 분자, 생물학적 실체, 세포 또는 물질)과 함께, 제 1 성분(들)이 가능하다면 제 2 성분(들)에 결합하거나 조절할 수 있거나 제 2 성분(들)이 가능하다면 제 1 성분(들)에 결합하거나 조절할 수 있는 방식으로 가져오는 것을 의미한다. 이러한 조절은 직접적으로, 즉 제 1 및 제 2 구성 요소(들) 사이의 직접적인 상호 작용에 의해 발생할 수 있으며; 또는 간접적으로, 예를 들어, 제 1 구성 요소(들)가 하나 이상의 추가 구성 요소(들)와 상호 작용하거나 이를 조정할 때, 하나 이상이 제 2 구성 요소(들)이 차례로 상호 작용하거나 이를 조정하거나, 또는 그 반대일 수 있다. 용어 "접촉"은 문맥에 따라 "노출", "인큐베이팅", "혼합", "반응하는", "처리하는"등과 동의어일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 시험 제제는 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링이 가능한 세포 및/또는 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링이 가능하지만 상기 세포를 제제를 코딩하는 핵산, 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트 또는 본원에 교시된 핵산 또는 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질감염시킴으로써GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링은 불가능한 세포와 잡촉할 수 있다. Wnt 시그널링을 측정하는 것은 전형적으로, 예를 들어 Wnt-반응성 유전자의 증가 또는 β-카테닌의 핵 위치를 검출함으로써, Wnt 시그널링의 활성화, 바람직하게는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 표준 또는 β-카테닌-의존적 Wnt 신호의 활성화를 측정하는 것을 의미한다. Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링의 활성화를 측정하는 다른 방법은 당 업계에 공지된 바와 같이 4-세포 단계 배아의 하나의 복부 할구에 시험 제제를 미세주입할 때 제노푸스의 배아 발생 동안 등 축 복제의 확립을 연구하는 것이다. Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링의 활성화를 결정하는 또 다른 방법은 당 업계에 공지된 바와 같이 시험 제제를 1 내지 4-세포 단계 배아에 미세주입할 때 제브라피시(Danio rerio)의 배아 발생 동안 전뇌 및 눈 구조의 확립을 연구하는 것이다. Wnt 시그널링 활성의 레벨은 기준값과 비교될 수 있다. 기준값은 대조군 샘플(예를 들어, 자극되지 않은 세포 집단 또는 대조군과 접촉된 세포 집단의 샘플)에 대한 값일 수 있다.
GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt 시그널링이 가능한 세포는 전형적으로 이의 원형질 막에서 GPR124, RECK, Frizzled 및 LRP를 포함하고 Wnt/β-카테닌 시그널링 경로의 하류 구성원을 함유하는 세포이다. Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되지만 GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되지 않은 Wnt 시그널링이 가능한 세포는, 전형적으로 그의 원형질 막에서 Frizzled 및 LRP를 포함하고 Wnt/β-카테닌 시그널링 경로의 하류 구성원을 함유하나, 혈장 막에 GPR124 폴리펩티드 및/또는 RECK 폴리펩티드를 포함하지 않는 세포이다.
GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 Wnt 시그널링을 매개할 수 있는 세포는, 뇌 내피세포 또는 세포주와 같은, GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링에 필요한 모든 세포 성분을 자연적으로 발현하는 세포일 수 있다. GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 Wnt 시그널링을 매개할 수 있는 세포는 또한, 변형될 수 있는 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링에 필요한 세포 성분을 자연적으로 모두는 발현하지 않거나 전혀 발현하지 않는 세포일 수 있고, 이는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포와 같이, GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링에 필요한 누락된 세포 성분을 보상하기 위해 유전자 조작되는 것과 같이 변형될 수 있다. 이러한 변형은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 GPR124 및/또는 RECK 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염시키는 것을 포함한다.
본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 수용체 폴리펩티드의 부재, 또는 이를 포함하지 않거나 함유하지 않는 것은 이와 관련하여 세포막에서 상기 수용체 폴리펩티드의 완전한 부재를 지칭하지는 않지만, 당업자에게 공지된 단백질 분석법에 의해 검출될 수 없거나 또는 감도 범위 미만인 수용체 폴리펩티드의 양을 지칭할 수 있다.
RECK 폴리펩티드, Frizzled 폴리펩티드 및/또는 LRP 폴리펩티드에 결합하는 능력에 대해 시험 제제를 스크리닝함으로써 예비 스크리닝을 수행할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료제로서 유용한 제제를 확인하기 위한 시험관 내 방법은 시험 제제가 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있는지 여부를 측정하고, 임의로 시험 제제가 Frizzled 폴리펩티드 및/또는 LRP 폴리펩티드에 결합할 수 있는지 여부를 측정하는 것을 포함한다.
결합 분석은 RECK 폴리펩티드, Frizzled 폴리펩티드 및/또는 LRP 폴리펩티드를 시험 제제와 접촉시키고 시험 제제 및 RECK 폴리펩티드, Frizzled 폴리펩티드 및/또는 LRP 폴리펩티드가 결합 복합체를 형성하는 충분한 시간을 허용하는 것을 포함할 수 있다. 결합 복합체의 형성은 공 면역 침전, 이분자 형광 상보, 라벨 전사, 탠덤 친화성 정제, 화학적 가교 및 형광 공명 에너지 전달과 같은 본원의 다른 곳에 기술된 단백질-단백질 결합을 측정하기 위한 임의의 확립된 분석 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 단백질 결합 분석은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 무 세포 시스템 또는 세포 용해물 또는 단리된 또는 배양된 세포 또는 단리된 또는 배양된 조직에서 수행될 수 있다.
결합 분석에서, 하나 이상의 제제, RECK 폴리펩티드, Frizzled 폴리펩티드 및/또는 LRP 폴리펩티드는 표지에 결합될 수 있으며, 여기서 표지는 검출 가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있다. 이러한 표지 또는 신호의 비 제한적인 예는 방사성 동위 원소, 형광 표지 또는 신호, 화학 발광 표지 또는 신호, 효소, 특이적 결합 분자 또는 입자(예를 들어, 자성 입자)를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료제로서 유용한 제제를 확인하기 위한 시험관 내 방법은 검정의 효율을 개선하고, 최적 단백질-단백질 결합을 촉진하고/하거나 비 특이성 또는 배경 상호 작용을 감소시키는 하나 이상의 시약의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 시약의 비 제한적인 예는 염, 중성 단백질(예를 들어, 알부민), 세제, 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제 및 항균제이다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료제로서 유용한 제제를 확인하기 위한 시험관 내 방법은 시험 제제를 1시간 내지 48시간, 6 시간 내지 36 시간, 12 시간 내지 24 시간, 0.5 내지 120분, 1 분 내지 90분, 5 분 내지 60분, 또는 10분 내지 30분 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. .
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 바와 같이 치료제로서 유용한 제제를 확인하기 위한 시험관 내 방법은 시험 제제를 4℃ 내지 40℃의 온도에서 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
특정 구체 예에서, 접촉은 단리된 또는 배양된 세포 또는 단리된 또는 배양된 조직에서 수행될 수 있다. 특정 구성 요소와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된"은 일반적으로 이러한 구성 요소가 그 자연 환경의 하나 이상의 다른 구성 요소로부터 분리되어 존재 하거나 또는 분리되어 제조되거나 및/또는 분리되어 유지됨을 의미한다. 보다 구체적으로, 세포 또는 조직과 관련하여 본원에 사용된 용어 "단리된"은 이러한 세포 또는 조직이 동물 또는 인체의 일부를 형성하지 않음을 의미한다. 단리된 세포 또는 조직은 시험관 내에서 적절하게 배양 또는 재배될 수 있다. "배양" 또는 "세포 배양"이라는 용어는 당 업계에서 일반적이며, 세포의 유지 및 잠재적으로 시험관 내 세포의 확장(증식, 증식)을 지칭한다. 전형적으로, 인간 세포와 같은 포유동물 세포와 같은 동물 세포는, 7℃, 5% v/v CO2 및> 95% 습도와 같은 체외 세포 배양에 도움이되는 공지된 조건에서, 목적에 적합한 용기(예를 들어, 96-, 24 -또는 6-웰 플레이트, T-25, T-75, T-150 또는 T-225 플라스크 또는 세포 공장)에서 적합한 세포 배양 배지에 노출시킴으로써(즉, 이들과 접촉함으로써) 배양된다.
본원에 사용된 용어 "배지"는 세포의 유지, 바람직하게는 세포의 증식에 도움이되는 임의의 세포 배양 배지를 광범위하게 포함한다. 전형적으로, 배지는 액체 배양 배지일 것이며, 이의 조작(예를 들어, 경사 분리, 피펫팅, 원심 분리, 여과 등)을 용이하게 한다.
전형적으로, 배지는 당 업계에 공지된 기본 배지 제형을 포함할 것이다. 많은 기본 배지 제제(예를 들어, American Type Culture Collection, ATCC 또는 Invitrogen, Carlsbad, California에서 구입 가능)를 사용할 수 있고, Eagle의 최소 필수 배지(MEM), Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM), 알파 변형 최소 필수 배지(alpha-MEM), 기초 배지 필수(BME), Iscove의 수정된 Dulbecco 배지(IMDM), BGJb 배지, F-12 영양소 혼합물(Ham), Liebovitz L-15, DMEM/F-12, 필수 변형된 Eagle 배지(EMEM), RPMI-1640, 배지 199, Waymouth의 MB 752/1 또는 윌리엄스 배지 E, 및 이들의 변형 및/또는 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 기초 배지의 조성물은 당 업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 배양된 세포에 필요한 배지 및/또는 배지 보충제의 농도를 변형 또는 조절하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다.
이러한 기초 배지 제제는 그 자체로 공지된 포유동물 세포 발달에 필요한 성분을 함유한다. 제한이 아닌 예시로서, 이들 성분은 무기 염(특히 Na, K, Mg, Ca, Cl, P 및 가능하게는 Cu, Fe, Se 및 Zn을 함유하는 염), 생리학적 완충제(예를 들어, HEPES, 중탄산염), 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및/또는 핵산 염기, 리보스, 데옥시리보스, 아미노산, 비타민, 항산화 제(예: 글루타티온) 및 탄소 공급원(예: 글루코오스, 피루브산 나트륨, 아세트산 나트륨) 등을 포함할 수 있다. .
배양에 사용하기 위해, 기초 배지에는 하나 이상의 추가 성분이 공급될 수 있다. 예를 들어, 최적의 성장과 팽창을 위해 필요한 미량 원소와 물질을 세포에 공급하기 위해 추가 보충제를 사용할 수 있다. 또한, 항산화 보충제, 예를 들어 β-머 캅토 에탄올이 첨가될 수 있다. 많은 기초 배지가 이미 아미노산을 함유하고 있지만, 일부 아미노산, 예를 들어 L-글루타민은 나중에 보충될 수 있는데, 이는 용액 중에 있을 때 덜 안정한 것으로 알려져 있다. 배지에는 항생제 및/또는 항진균제 화합물, 예컨대 전형적으로 페니실린 및 스트렙토마이신의 혼합물, 및/또는 암포테리신, 암피실린, 겐타 마이신, 블레오 마이신, 하이그로 마이신, 카나마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 날리딕산, 네오마이신, 니스타틴, 파로모마이신, 폴리믹신, 퓨로마이신, 리팜피신, 스펙티노마이신, 테트라사이클린, 타일로신 및 제오신이 예시되지만, 이에 제한되지는 않는 다른 화합물이 추가로 공급될 수 있다.
지질 및 지질 담체는 또한 세포 배양 배지를 보충하는데 사용될 수 있다. 이러한 지질 및 담체는 시클로덱스트린, 콜레스테롤, 알부민에 컨쥬게이트된 리놀레산, 알부민에 컨쥬게이트된 리놀레산 및 올레산, 컨쥬게이트되지 않은 리놀레산, 알부민에 컨쥬게이트된 리놀레산-올레산-아라키돈산, 알부민에 컨쥬게이트된 및 컨쥬게이트되지 않은 올레산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 알부민은 유사하게 지방산이 없는 제형에 사용될 수 있다.
포유동물 혈장 또는 혈청으로 세포 배양 배지를 보충하는 것도 고려된다. 혈장 또는 혈청은 종종 세포 생존 및 확장을 촉진하는 세포 인자 및 성분을 함유한다. 선택적으로, 혈장 또는 혈청은 열 불활성화될 수 있다. 열 불활성화는 당 업계에서 주로 보체를 제거하기 위해 사용된다. 열 불활성화는 전형적으로 일정하게 혼합하면서 56℃에서 30 내지 60분, 예를 들어 30분 동안 혈장 또는 혈청을 항온 처리하는 단계를 포함하며, 그 후 혈장 또는 혈청은 점차 주변 온도로 냉각된다. 당업자는 상기 절차의 일반적인 수정 및 요건을 알고 있을 것이다. 선택적으로, 혈장 또는 혈청은 저장 또는 사용 전에 멸균될 수 있다. 통상적인 살균 수단은 예를 들어, 1㎛ 미만, 바람직하게는 0.5㎛ 미만, 예를 들어 0.45㎛, 0.40㎛, 0.35㎛, 0.30㎛ 또는 0.25㎛, 보다 바람직하게는 0.2㎛ 미만 또는 그 이하, 예를 들어 0.15㎛ 이하, 0.10㎛ 이하의 기공 크기를 갖는 하나 이상의 필터를 통한 여과를 포함할 수 있다. 본원에 교시된 바와 같이 배지에 사용하기에 적합한 혈청 또는 혈장은 인간 혈청 또는 혈장, 또는 비인간 동물, 바람직하게는 비인간 포유동물, 예를 들어 비인간 영장류(예를 들어, 여우 원숭이, 원숭이, 유인원), 태아 또는 성체 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 토끼, 마우스 또는 쥐의 혈청 또는 혈장 등 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 바람직한 구체 예에서, 본원에 교시된 배지는 소 혈청 또는 혈장, 바람직하게는 태아 소(송아지) 혈청 또는 혈장, 더욱 바람직하게는 태아 소(송아지) 혈청(FCS 또는 FBS)을 포함할 수 있다. 인간 세포를 배양할 때, 배지는 바람직하게는 자가 또는 동종 이계 인간 혈청 또는 혈장과 같은 인간 혈청 또는 혈장, 바람직하게는 자가 또는 동종 이계 인간 혈청과 같은 인간 혈청, 더욱 바람직하게는 자가 인간 혈청 또는 혈장, 보다 더 바람직하게는 자가 인간 혈청을 포함할 수 있다 .
특정 바람직한 구체 예에서, 혈청이 없는 배지(즉, 화학적으로 정의된 배지)를 제공하기 위해, 혈청 또는 혈장은 혈청 대체물에 의해 배지에서 치환될 수 있다. 무 혈청 배지의 제공은 특히 배지 또는 이의 분획(들)을 대상체, 특히 인간 대상체에 투여하는 관점(예를 들어, 개선된 생체 안전성)에서 유리할 수 있다. 용어 "혈청 치환"은 세포 배양 배지에서 동물 혈청의 기능(예를 들어, 세포 유지 및 성장지지 기능)을 대체하는데 사용될 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 통상적인 혈청 대체물은 전형적으로 비타민, 알부민, 지질, 아미노산, 트랜스페린, 항산화 제, 인슐린 및 미량 원소를 포함할 수 있다. KOSR(KnockOut Serum Replacement), N2, B27, 인슐린 트랜스페린-셀레늄 보충제(ITS) 및 G5와 같은 많은 상용화된 혈청 대체 첨가제는 잘 알려져 있으며 당업자에게 쉽게 이용 가능하다.
혈장 또는 혈청 또는 혈청 대체물은 약 0.5% v/v 내지 약 40.0% v/v, 바람직하게는 약 5.0% v/v 내지 약 20.0% v/v, 예를 들어, 약 5.0% v/v 내지 약 15.0% v/v,보다 바람직하게는 약 8.0% v/v 내지 약 12.0% v/v, 예를 들어, 약 10.0% v/v의 비율(혈장 또는 혈청 또는 혈청 대체물/매체 부피)로 본원에 교시된 바와 같이 배지에 포함될 수 있다.
적합한 단리된 또는 배양된 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 인간 세포 또는 비인간 포유동물 세포를 포함하는 진균 세포일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 포유동물 세포, 인간 세포 또는 비인간 포유동물 세포와 같은 동물 세포가 바람직하다. 세포는 1차, 2차, 3 차 세포등을 포함할 수 있거나, 클론 세포주를 포함하여 불멸화 세포주를 포함할 수 있다. 박테리아 세포의 비 제한적인 예는 대장균, 예르시니아 엔테로콜리티카, 브루셀라균, 장티푸스균, 세라티아 마르세센스, 바실러스 서브틸리스를 포함한다. 곰팡이 세포의 비 제한적 예는 야로위아 리포리티카, 아르술라 아데니니보란스, 피히아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파, 사카로마이세스 세레비지애, 또는 쉬조사카로마이세스 폼베를 포함한다. 곤충 세포의 비 제한적 예는 Schneider 2 세포와 같은 황색 초파리 유래의 세포, Sf9 및 Sf21 세포와 같은 열대거세미나방으로부터 유래된 세포주, 또는 High Five 세포와 같은 남방은무늬밤나방의 애벌레로부터 유래된 세포를 포함한다. 인간 세포의 비 제한적인 예는 인간 HeLa(자궁경부암) 세포주를 포함한다. 조직 배양 실무에서 공통적인 다른 인간 세포주는 특히 인간 배아 신장 293 세포(HEK 세포), DU145(전립선암), Lncap(전립선암), MCF-7(유방암), MDA-MB-438(유방암), PC3(전립선암), T47D(유방암), THP-1(급성 골수성 백혈병), U87(교모세포종), SHSY5Y(신경 모세포종) 또는 Saos-2 세포(뼈암)을 포함한다. 영장류 세포의 비 제한적인 예는 베로(아프리카 녹색 원숭이 버빗원숭이 신장 상피 세포주) 세포, 및 COS 세포이다. 설치류 세포의 비 제한적 예는 랫트 GH3(뇌하수체 종양), CHO(중국 햄스터 난소), PC12(유색 세포종) 세포주 또는 마우스 MC3T3(배아 두개관) 세포주이다. 이러한 세포는 다양한 상업적 공급원 및 연구 자원 시설, 예컨대 American Type Culture Collection(Rockville, MD)로부터 얻을 수 있다.
특정 구체 예에서, 세포는 온전한 세포막을 가질 수 있다. 다른 구체 예에서, 세포막은 투과성이 있어(일시적으로 또는 영구적으로) 온전한 세포막을 가로질러 덜 효과적으로 운반되거나 운반되지 않는 세포막을 가로지르는 성분의 확산을 허용한다. 세포막 투과에 적합한 세제는 사포닌(예를 들어, 디지토닌), TritonTM X-100, 또는 폴리솔베이트 20을 제한없이 포함한다. 세포는 살아 있거나 또는 생존할 수 있거나 생존할 수 없다.
폴리펩티드 및/또는 핵산을 생존 세포에 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 인산 칼슘 공침, 전기 천공, 미세주입, 원형질체 융합, 리포펙션, 엑소좀 매개 형질감염, 폴리아민 형질감염 시약을 사용한 형질감염, 핵산-코팅된 텅스텐 미세 발사체에 의한 세포의 충격, 바이러스 입자 전달 등을 포함할 수 있다. 이러한 도입은 또한 전달, 형질감염 또는 형질전환으로 지칭될 수 있다. 폴리펩티드 또는 핵산을 세포 내로 전달하기 위해 세포 침투 펩티드(CPP)가 또한 사용될 수 있다. CPP 전좌는 3 가지 주요 진입 메커니즘으로 분류될 수 있다: 막에 직접 침투, 내포작용-매개 진입, 및 일시적 구조의 형성을 통한 전좌. CPP는 전형적으로 리신 또는 아르기닌과 같은 양으로 하전된 아미노산의 높은 상대 풍부도를 함유하거나 극성/하전 아미노산 및 비극성, 소수성 아미노산의 교대 패턴을 함유하는 서열을 갖는 아미노산 조성을 갖는다. 이들 2 가지 유형의 구조는 각각 다 양이온성 또는 양친매성으로 지칭된다. CPP의 제 3 부류는 순 전하가 낮거나 세포 흡수에 결정적인 소수성 아미노산 그룹을 갖는 비극성 잔기만을 함유하는 소수성 펩티드이다. 발견된 초기 CPP 중 하나는 인간 면역 결핍 바이러스 1(HIV-1)로부터의 전사 활성화 전사 활성화제(Tat)였으며, 이는 배양에서 수많은 세포 유형에 의해 주변 배지로부터 효율적으로 흡수되는 것으로 밝혀졌다. 그 이후로, 알려진 CPP의 수가 상당히 확대되었고 보다 효과적인 단백질 형질 도입 특성을 갖는 소분자 합성 유사체가 생성되었다. CPP는 Penetratin, Tat(48-60), Transportan 및 (R-AhX-R4)(Ahx = 아미노헥사노일)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. US 8,372,951은 세포 침투 효율이 높고 독성이 낮은 호산구 양이온 단백질(ECP)에서 유래한 CPP를 제공한다. CPP를 그 카고(cargo)와 함께 척추 동물 대상으로 전달하는 양상도 제공된다. CPP의 추가 측면 및 이의 전달은 US 8,575,305; US 8; 614,194 및 US 8,044,019에 게시되어 있다. CPP는 예를 들어 티오에테르 결합 또는 입자의 형성을 통해 당 업계에 공지된 바와 같이 카고와 접합되거나 복합될 수 있다.
관심있는 폴리펩티드 또는 RNA를 코딩하는 발현 카세트 또는 발현 벡터와 같은 발현가능한 핵산 분자가 당 업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 제공될 수 있다. 발현가능한 핵산 분자는 전형적으로 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및/또는 관심 RNA 분자를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자(들)에 작동 가능하게 연결된 프로모터(들)를 포함할 수 있다. 프로모터는 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 인간 세포 또는 비인간 포유동물 세포와 같은 관심 세포에서 관심 폴리펩티드 및/또는 RNA의 발현에 영향을 미치도록 선택되거나 구성될 수 있다.
세포가 배양되는 배양 배지에 시험 제제를 첨가함으로써 세포를 시험 제제와 접촉시킬 수 있다. 시험 제제를 코딩하는 핵산은 당업자에게 공지되어 있고 본원의 다른 곳에 기재된 조건 하에서 벡터 내에 포함된 세포에 제공될 수 있다. 대안적으로, 시험 제제를 코딩하는 핵산은 바이러스 벡터를 통해 세포에 제공될 수 있으며, 즉 세포는 시험 물질을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자와 접촉된다. 바이러스 벡터는 전형적으로 생산 감염에 필요한 바이러스 단백질을 생산하는 능력이 결여되도록 변형되었다. 특정 실시 양태에서, 시험 제제가, 예를 들어 본원의 다른 곳에 기술된 분석에서 측정된, GPR124/RECK/Frizzled/LRP 수용체 복합체에 의해 매개되는 Wnt/β-카테닌 시그널링이, 중성 물질 또는 음성 대조군에 의해 유도된 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-중재 Wnt/β-카테닌 신호 기준선 또는 백그라운드와 비교하여, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 250배 이상, 500배 이상, 750배 이상, 1000배 이상, 1x104배 이상 또는 1x105배 이상 강화시키는 경우, 본원에 개시된 바와 같은 치료제로서 유용한 제제로서 확인될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 시험 제제는 상기 제제에 의해 유도된 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성이 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에서 상기 제제에 의해 유도된 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성보다 3.5배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15 배 이상, 15 배 이상, 20배 이상, 25 배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 500배 이상 1000배 이상, 1x104배 이상 또는 1x105배 이상인 경우 본원에 개시된 바와 같은 치료제로서 유용한 제제로 확인될 수 있다.
임의의 상기 스크리닝 방법에 의해 본원에 개시된 바와 같이 치료제로서 유용한 것으로 초기에 확인된 시험 제제는 인간에서 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애를 모방하기에 적합한 동물 모델에 의해 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 겉보기 활성을 검증하기 위해 추가로 시험될 수 있다.
본 출원은 또한 다음의 진술에 제시된 양태 및 실시 형태를 제공한다:
진술 1. G-단백질 연결 수용체(GPR)124/RECK/Frizzled/지방단백질 수용체 관련 단백질(LRP)-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제로서, 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124 부재 시 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않는 것을 특징으로 하는 제제.
진술 2. 진술 1에 있어서, 상기 제제는 RECK 및 GPR124의 존재 하에 세포막에서 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드의 이종체화를 유도할 수 있지만, RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에는 아닌 것을 특징으로 하는 제제.
진술 3. 진술 2에 있어서, 상기 제제는 RECK 및 GPR124의 존재 하에 세포막에서 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있지만, RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에는 아닌 것을 특징으로 하는 제제.
진술 4. 진술 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 GPR124 및/또는 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제제.
진술 5. 진술 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있는 제제.
진술 6. 진술 5에 있어서, 상기 제제는 RECK 폴리펩티드의 시스테인 노트 4(CK4) 영역, CK5 영역 또는 CK4 및 CK5 영역에 결합할 수 있는 제제.
진술 7. 진술 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 Frizzled 폴리펩티드의 시스테인-풍부 도메인(CRD)에 결합할 수 있는 제제.
진술 8. 진술 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 LRP 폴리펩티드의 DKK 결합 부위 및/또는 Wnt 결합 부위에 결합할 수 있는 제제.
진술 9. 진술 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 제제는 화학 물질, 항체, 항체 단편, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 펩티드, 펩티드유사체, 앱타머, 포토앱타머, 스피에겔머(Spiegelmer) 및 핵산을 포함하거나 이들로 구성된 그룹에서 선택되며, 바람직하게는 상기 제제는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
진술 10. 진술 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제가 RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인 및 LRP-결합 도메인을 포함하고, 상기 RECK-결합 도메인, 상기 Frizzled-결합 도메인, 및 상기 LRP-결합 도메인은 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드와 같은 Wnt7 폴리펩티드로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 제제.
진술 11. 진술 10에 있어서, 상기 RECK 결합 도메인이 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제:
-아미노산 서열 HVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC에 대해 적어도 25% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(서열 번호 17); 또는
-아미노산 서열 VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT(서열 번호 18)에 대해 적어도 25% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
-아미노산 서열 VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET(서열 번호 19)에 대해 적어도 25%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
-아미노산 서열 XXXVXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXKXXXX(서열 번호: 20), VXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXK(서열 번호: 21), XXXVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXKXXXX(서열 번호: 22) 또는 VXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXK(서열 번호: 23 임), 상기에서 X는 어떤 아미노산도 될 수 있고, 바람직하게 아미노산 서열은 서열 번호 18 또는 서열 번호 19 중 어느 하나와 적어도 50% 서열 동일성을 나타낸다.
진술 12. 진술 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드의 단편과 같은 Wnt7 폴리펩티드의 단편이거나 본질적으로 이것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 제제.
진술 13. 진술 12에 있어서, 상기 단편이 Wnt7 폴리펩티드의 N-말단 도메인(NTD)이거나 본질적으로 이것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 제제.
진술 14. 진술 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드의 변이체와 같은 Wnt7 폴리펩티드의 변이체인 것을 특징으로 하는 제제.
진술 15. 진술 14에 있어서, 다음을 특징으로 하는 제제:
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 17에 해당하는 위치의 글루타민(Q) 잔기는 글루타민(Q) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 20에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기는 이소로이신(I) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 25에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기는 프롤린(P) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 27에 해당하는 위치의 알라닌(A) 잔기는 알라닌(A) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 아르기닌(R) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 28에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기는 이소로이신(I) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환되고;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 33에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기는 글루타메이트(E) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 37에 해당하는 위치의 메티오닌(M) 잔기가 글루타메이트(M) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 39에 해당하는 위치의 로이신(L) 잔기는 글루타메이트(L) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 41에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기는 글루타메이트(E) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 44에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기는 페닐알라닌(F) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 50에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 52에 해당하는 위치의 아스파라긴(N) 잔기는 아스파라긴(N) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 글루타민(Q) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 68에 해당하는 위치의 발린(V) 잔기는 발린(V) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 129에 상응하는 위치의 이소로이신(I) 잔기는 이소로이신(I) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 131에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기는 페닐알라닌(F) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 133에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 135에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기는 페닐알라닌(F) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 141에 상응하는 위치의 이소로이신(I) 잔기는 이소로이신(I) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 146에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 158에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 159에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A), 세린(S) 또는 로이신(L) 잔기에 의해 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 181에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 191에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 198에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 200 위치에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 205에 해당하는 위치의 발린(V) 잔기는 발린(V) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 208에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기는 글루타메이트(E) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 214에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 216에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 218에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기는 프롤린(P) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 222에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 223에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기는 이소로이신(I) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 229에 해당하는 위치의 티로신(Y) 잔기는 티로신(Y) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 232에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기는 프롤린(P) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 235에 해당하는 위치의 트레오닌(T) 잔기가 트레오닌(T) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환되고, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기에 의해 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 248에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기는 글루타메이트(E) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 289에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 291에 해당하는 위치의 트립토판(W) 잔기는 트립토판(W) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
-서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 307에 해당하는 위치의 트레오닌(T) 잔기는 트레오닌(T) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환되고, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기에 의해 치환됨; 및/또는
-서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 318에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨 .
진술 16. 진술 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 제제를 인코딩하는 핵산에 있어서, 상기 제제는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드인 것을 특징으로 하는 핵산.
진술 17. 프로모터 및/또는 전사 및 번역 조절 신호에 작동 가능하게 연결된, 진술 16에 따른 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트.
진술 18. 진술 16에 따른 핵산 또는 진술 17에 따른 핵산 발현 카세트, 예컨대 바이러스 벡터를 포함하는 벡터.
진술 19. 진술 16에 따른 핵산, 진술 17에 따른 핵산 발현 카세트 또는 진술 18에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
진술 20. 진술 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 제제, 진술 16에 따른 핵산, 진술 17에 따른 핵산 발현 카세트, 진술 18에 따른 벡터, 또는 진술 19에 따른 숙주 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
진술 21. 의약으로서 사용하기 위한, 진술 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 제제, 진술 16에 따른 핵산, 진술 17에 따른 핵산 발현 카세트, 진술 18에 따른 벡터, 진술 19에 따른 숙주 세포, 또는 진술 20에 따른 약제학적 조성물.
진술 22. 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 진술 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 제제, 진술 16에 따른 핵산, 진술 17에 따른 핵산 발현 카세트, 진술 18에 따른 벡터, 진술 19에 따른 숙주 세포, 또는 진술 20에 따른 약제학적 조성물.
진술 23. 진술 22에 있어서, 상기 신경 혈관 장애가 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 허혈/재관류 손상, 뇌 동맥류, 동정맥 기형(AVM), 해면 기형, 혈관염, 뇌출혈, 지주막하 출혈, 척추 혈관 기형, 경동맥 협착증, 모야모야병 및 두개 내 동맥 경화증 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되거나, 또는 상기 CNS 장애는 다발성 경화증, 허혈성 뇌졸중, 뇌암, 간질, 치매, 혈관성 치매, HIV-1-관련 치매, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴병, 근 위축성 측삭 경화증, 전염성 뇌 질환, 외상성 뇌 손상, 편두통 및 만성 외상성 뇌병증 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제제.
진술 24. 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 CNS 장애의 예방 또는 치료에 유용한 치료제로서 유용한 제제를 확인하기 위한 시험관 내 방법에 있어서, 상기 방법은 시험 제제가 GPR124/RECK/Frizzled/Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링를 활성화시키지만 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링은 활성화시키지 않는지를 측정하는 것을 포함하는 시험관 내 방법.
진술서 25. 진술서 24에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관 내 방법.
-시험 제제를 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링이 가능한 세포와 접촉시키고 상기 Wnt 시그널링을 측정하는 단계; 및
-시험 제제를 Frizzled/LRP-매개 Wnt 신호전달을 가능하지만 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 신호전달은 할 수 없는 세포와 접촉시키고, 상기 Wnt 신호를 측정하는 단계.
진술 26. 진술 24 또는 25에 있어서, 시험 제제가 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관 내 방법.
본 발명은 특정 실시 예와 관련하여 설명되었지만, 전술한 설명에 비추어 많은 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 첨부된 청구 범위의 사상 및 넓은 범위에서 다음과 같이 모든 대안, 수정 및 변형을 포함하도록 의도된다.
본원에 개시된 본 발명의 양태 및 구체 예는 하기 비 제한적 실시 예에 의해 추가로 지지된다.
실시 예
실시 예 1. Wnt 리간드-특이적 시그널링을 위한 분자 메커니즘
1. 재료 및 방법
1.1. 제브라피시 라인
제브라피시(Danio rerio)를 14 시간 명/10시간 암 사이클에서 28℃로 유지시켰다. 배아는 유럽 및 국가의 윤리 및 동물 복지 지침(프로토콜 승인 번호: CEBEA-IBMM-2017-22: 65)에 따라 표준 조건 하에서 얻어지고 양육되었다. (C. B. Kimmel, W. W. Ballard, S. R. Kimmel, B. Ullmann, T. F. Schilling, Dev. Dyn. 203, 253-310(1995))에 따라 스테이징이 수행되었다. 특징적인 형질전환 및 돌연변이 라인 Tg(kdrl: GFP) s843, Tg(kdrl: ras-mCherry) s896 및 gpr124s984(Danio rerio) 라인을 이 연구에 사용했다(B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1?25(2015); S.-W. Jin, D. Beis, T. Mitchell, J.-N. Chen, DYR Stainier, Development. 132, 5199?209(2005); NC Chi et al., Genes Dev. 22 , 734-739(2008)).
1.2. 모폴리노, RNA 작제물 및 미세주입
gpr124(5'-ACTGATATTGATTTAACTCACCACA-3 ')(B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25(2015))에 대한 스플라이스 차단 모폴리노는 유전자 도구(Eugene, OR)로부터 입수하여 2ng에서 1-세포 단계에서 주입하였다. mMessage mMachine SP6 키트(Ambion, Carlsbad, CA)를 사용하여 NotI 소화 후 pCS2 플라스미드로부터 합성 mRNA를 전사하고 1-세포 단계 제브라피시 배아에 주입하였다.
1.4. 발현 플라스미드 작제물
Fz1(addgene # 42253) 및 Fz5(addgene # 42267)를 제외한 In-Fusion 클로닝(Takara, Mountain View, CA)을 사용하여 재조합 후 모든 Wnt 시그널링 성분 및 기타 작제물을 pCS2 벡터의 CMV 프로모터로부터 발현시켰다. 단일 점 돌연변이 변이체, 결실 및 키메라를 In-Fusion 클로닝 및 탠덤 중첩 PCR 생성물을 사용하여 생성하였다. 모든 작제물은 생거 시퀀싱에 의해 확인되었다. Reck 변이체의 결실은 다음 아미노산에 해당한다: ReckΔCK1: 46-93; ReckΔCK2: 113-150; ReckΔCK3: 160-206; ReckΔCK4: 225-272; ReckΔCK5: 301-347; ReckΔCK1-5: 46-347; ReckΔCRD: 352-484 및 ReckΔKAZAL: 636-798. HA 태그를 Reck의 잔기 22, Gpr124의 잔기 49 및 Fz5의 잔기 22 뒤에 삽입하였다. FLAG 태그는 Gpr124에서 잔기 49 뒤에 삽입되었다.
1.5. 세포 배양 및 HEK293(T) 돌연변이체 세포주
HECC293T 세포는 ATCC(CRL-3216)로부터 입수하였고 HEK293 STF 세포주는 제레미 나단(John Jeremy Nathans)(John Hopkins)에 의해 친절하게 제공되었다. WT 및 돌연변이 세포를 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM/F12 배지(Lonza, Switzerland, Basel)에서 배양하고 5% CO2로 평형화된 가습 인큐베이터에서 유지시켰다. GPR124 및 RECK는 HEK293 STF 세포에서 CRISPR/Cas9 접근법을 사용하여 유 전적으로 무효화되었고, LRP5, LRP6 및 FZ는 HEK293T 세포에서 유사하게 무효화되었다. CRISPR/Cas9 가이드 서열은 http://crispr.mit.edu/ 웹 사이트를 사용하여 설계되었고 pSpCas9(BB)-2AGFP으로 복제되었다(FA Ran et al., Nat. Protoc. 8, 2281-308(2013)). GFP + 세포의 상위 1%를 형질감염 후 48시간에 FACS(AriaIII, BD Biosciences, San Jose, CA)에 의해 단리하고 클론 확장을 위해 96-웰 플레이트에 분포시켰다. 돌연변이 세포주의 유전자 특성 분석을 용이하게 하기 위해 고분해능 용융 분석에서 다중 피크 유도체 용융 곡선을 생성하는 클론이 카운터-선택되었다. 각 표적 부위에 대해 프로토 스페이서 인접 모티프(PAM) 부위를 중심으로 한 ~ 1000 bp PCR 산물의 Sanger 시퀀싱 및 pCRTM-Blunt II-TOPO®(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 PCR 생성물의 8개 이상의 서브 클론으로 돌연변이를 확인했다. 반복적인 CRISPR/Cas9-매개 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 세포주를 얻었다.
1.6. STF 이중 루시페라제 분석
세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 리포펙타민 2000(Life Technologies, Carlsbad, CA)으로 24 시간 후에 3 회 형질감염시켰다. 웰 당 형질감염된 플라스미드 DNA의 양은 각각의 발현 벡터에 대해 최적화되었다: 달리 명시되지 않는 한 레닐라 루시페라제(0.5 ng)(Jeremy Nathans(John Hopkins)에 의해 친절하게 제공됨), Wnt 리간드(20 ng), Fz 수용체(5 ng), Lrp(2.5 ng), Gpr124(10 ng), Reck(5 ng) 및 Dkk-1(10 ng). 빈 pCS2 벡터를 사용하여 DNA의 총량을 웰당 100 ng로 조정하였다. STF 세포주를 사용하거나 20 ng의 M50 Super 8x TOPFlash 플라스미드(Addgene 플라스미드 # 12456)를 공동 형질감염시켜 이중 루시페라제 분석을 수행하였다. 세포를 수동 용해 완충액(E1960, WI, Promega, WI)에서 수확하고, 형질감염 후 48시간에 이중 루시페라제 리포터 분석 시스템(E1960, Promega, Madison, WI)을 사용하여 반딧불 및 레닐라 루시페라제의 활성을 순차적으로 측정하였다. 형질감염 24시간 후 96-웰 플레이트에서 90% 합류로 1: 1: 1 혼합물로서 세포를 플레이팅하여 도 1c의 경쟁 분석을 수행하였다. 공동 배양 24시간 후 루시페라제 활성을 측정하였다.
1.7. 면역 형광 및 근접 결찰 분석
세포를 유리 코팅된 챔버(IBIDI, Martinsried, Germany)에서 성장시키고 24 시간 후에 리포펙타민 2000(Life Technologies, Carlsbad, CA)으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후 실온(RT)에서 10분 동안 4% 파라 포름알데히드로 세포를 고정시켰다. 면역 형광 염색(IF)의 경우, 세포를 1% BSA-PBS에서 30분 동안 차단 한 후 실온에서 1시간 동안 1차 항체에 노출시켰다. 3 회 PBS 세척 후, 세포를 실온에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. Wnt 리간드의 항-V5 염색을 위해, 세포를 2차 항체 용액과 함께 배양하기 전에 PBS 0.1% Tween 20에서 10분 동안 추가로 세척하였다. 근접 결찰 분석(PLA)(Sigma-Aldrich, MO, St. Louis, MO)의 경우, 세포를 37℃에서 30분 동안 제조업자가 제공한 차단 용액으로 차단한 후, 1차 항체와 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 3회 세척하고 PLA 프로브 항-토끼 PLUS 및 항-마우스 MINUS와 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 2 회 PBS 세척 후, 세포를 37℃에서 30분 동안 Duolink 결찰 용액과 함께 인큐베이션하였다. 두 번의 PBS 세척 후, 세포를 37℃에서 100분 동안 Duolink 증폭 용액과 함께 배양하였다. 하기 항체가 사용되었다: IF 및 PLA에 대해 1: 500의 마우스 단일클론 항-V5(R96025, Life Technologies, Carlsbad, CA), IF 및 PLA에 대해 1: 400의 정제된 다클론 래빗 항-HA(H6908, St. Louis, MO) 및 1: 5000의 항-마우스 Alexa488-접합된 이차 항체(Thermo Fisher Scientific, MA, Waltham, MA). PBS에서 10 ㎍ ml-1로 희석된 Hoechst로 2 분 동안 세포를 염색하였다.
1.8. 웨스턴 블롯팅, 도트블롯 및 공동 면역 침전
다음 항체가 사용되었다: 토끼 항-DVL2(1: 1000, 3216, Cell Signaling Technology, 네덜란드 라이덴), 토끼 항-DVL2-포스포 T224(1: 1000, ab124941, Abcam, 영국 캠브리지) 및 항-마우스 β-액틴(1: 50,000, A5441, Sigma-Aldrich, 세인트루이스, MO), 닭 항-GFP(1: 5000, GFP-1010, Aves, Tigard, OR) 및 마우스 단일클론 항-FLAG M2(1: 1000, F1804, Sigma-Aldrich, 세인트루이스, MO). 도트 블롯 분석은 BioDot SF 장치(Bio-Rad, Munich, Germany)를 사용한 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. 상등액의 연속 희석물을 니트로셀룰로오스 막(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에 스포팅했다. 건조 후, 웨스턴 블롯에 위해 막을 상기 기재된 바와 같은 항체와 함께 인큐베이션하였다. 공 면역 침전을 위해, 6-웰 플레이트로부터 형질감염된 HEK293T 세포를 2회 세척하고 PBS로 플레이트로부터 분리하였다. 세포를 원심 분리에 의해 펠렛화하고 단백질 억제제(ThermoFisher Scientific, MA, Waltham, MA)를 함유하는 용해 완충액(150 mM NaCl, 25 mM 트리스(pH 7.5), 1% NP40)에서 4℃에서 30분 동안 용해시켰다. 원심 분리 후, 상청액을 항-FLAG M2 친화성 겔(A2220, Sigma, St. Louis, MO)과 함께 4℃에서 3시간 동안 배양하였다. 비드를 용해 완충액으로 5회 세척하고 동량의 2x Laemmli 샘플 완충액으로 비등시켰다.
1.9. 현미경 및 이미지 처리
세포 및 제브라피시 배아를 LSM710 공 초점 현미경으로 이미지화하고 이미지를 ImageJ에서 처리하였다. 라이카 M165 FC에서 눈 융합 표현형의 이미지를 촬영하였다. 뇌 혈관 구조의 표현은 Imaris 소프트웨어(BitPlane, Zurich, Switzerland)를 사용하여 생성되었다. PLA 양성(PLA +) 영역 및 DAPI 양성(DAPI +) 영역의 백분율은 약 50 내지 100개의 세포를 함유하는 이미지에서 ImageJ를 사용하여 계산되었다. 고정 임계 값을 수동으로 적용한 후 PLA + 면적을 측정하였다. 이미지 J에서 "디폴트" 임계 값 방법을 적용한 후 DAPI + 영역을 측정했다.
1.10. 구조 모델링
Xenopus Wnt8a(PDB ID: 4F0A)의 구조(C. Y. Janda, D. Waghray, A. M. Levin, C. Thomas, K. C. Garcia, Science. 337, 59-64(2012))는 Wnt7a의 시작 모델로 사용되었다. 누락된 잔기 및 치환은 모델러B. Webb, A. Sali, Current Protocols in Bioinformatics (John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA, 2016), vol. 54, p. 5.6.1-5.6.37.) 프로그램을 사용하여 모델링되었다. 모델링 전략에는 Wnt8에서 관찰된 기존의 이황화 가교에 대한 계산이 포함되었다. 초기 최고의 모델은 Cα가 억제된 상태에서 진공에서 공액-그라디언트 에너지 최소화를 겪은 다음, 두 번째 최소화 단계에서 해방되었다. 그런 다음이 모델을 워터 박스에 내장하고 150mM에서 Na + 카운터 이온을 추가하여 전기 중립을 달성했다. 전체 시스템은 다시 3000 단계로 에너지를 최소화했다. 분자 역학 시뮬레이션은 일정한 온도(310 K) 및 일정한 압력(1 atm)에서 NAMD 2.7 프로그램을 사용하여 0.5 ns 동안 주기적 경계를 두고 CHARMM36을 힘장으로 사용했다(JC Phillips et al., J. Comput. Chem. 26, 1781-1802(2005). 2 fs의 시간 단계는 운동 방정식을 통합하는 데 사용되었다. 단거리 상호 작용은 12 A에서 차단되었고 부드러운 입자 메쉬 Ewald 방법은 정전기 상호 작용을 계산하는 데 사용되었다. 수소 원자는 SHAKE 알고리즘을 사용하여 제약되었다. 결과 모델은 안정적인 시뮬레이션의 평균 표현이다.
1.11. 재조합 단백질 및 합성 펩티드
Reck-CK-Fc 융합 단백질은 리포펙타민 2000(Life Technologies, Carlsbad, CA)으로 형질감염된 72시간 후에 HEK293T 세포 배양액의 상청액으로부터 무 혈청 프리 스타일 293 발현 배지(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 회수되었다. 수집 후, 상청액은 원심 분리(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에 의해 50 회 농축되거나 단백질 G 친화성 정제(단백질 G Sepharose 4 Fast Flow, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)가 행해졌다. PAGE 후 쿠마시 블루 염색을 사용하여 단백질 순도를 평가하였다. 합성 Wnt 링커 펩티드는 Chinapeptide Co., Ltd로부터 90% 이상의 순도로 수득하였다.
1.12. 등온 적정 열량 측정
ITC 적정은 Affinity ITC(TA Instruments)에서 수행되었다. 측정 전에, Reck-CK-Fc 및 모든 Reck-CK-Fc 융합물을 Tris-NaCl 완충액(50mM Tris pH8, 300mM NaCl)으로 투석하였다. 각각의 경우에, Wnt-유래 펩티드는 단백질 투석의 마지막 단계로부터 완충액으로 제조되었다. 열량계에서 검사하기 전에 샘플을 여과 및 탈기하고 적정을 25℃에서 수행하였다. 모든 실험은 75rpm의 교반 속도로 일정한 부피의 2㎕의 적정제를 세포(200㎕)로 주입하는 것으로 이루어졌다. 공칭 샘플 농도는 세포에서 20㎛ 내지 40㎛이고 주사기에서 400㎛ 내지 1.0mM이었다. 280nm에서의 흡광도 측정 또는 BCA 방법에 의해 투석 또는 완충액 교환 후 실제 샘플 농도를 측정하였다. 모든 데이터는 MicroCal Origin ITC 7.0 및 NanoAnalyze 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석되었다.
1.13. 원자 현미경
얇은 금 층으로 코팅된 유리 커버 슬립을 자외선 및 오존(UV-O) 세정제(제트 라이트)에서 15분 동안 세정한 후, 1mM 16-메르캅토도데카헥산 산 및 1-메르캅토-1-운데칸올을 1:99 부피비로 함유하는 에탄올 용액에 밤새 담근다. 이어서, 기판을 에탄올로 헹구고, N2로 건조시키고, 동일한 부피의 20 mg ml-1 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 50 mg ml-1 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-아르보디이미드(EDC)를 함유하는 용액에 30분 동안 첨가하였다. 수득한 NHS 활성화 표면을 초순수로 세정하고, 실온에서 1시간 동안 100㎕의 10 ㎍ ml-1 단백질 G 용액과 함께 배양하였다. 이어서, 샘플을 세척 완충액(3x 5 분)으로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 100㎕ 차단 완충액에서 추가로 배양하였다. 마지막으로, 50㎕의 0.2 ㎍ ml-1 Reck-CK-Fc 용액을 1시간 동안 기판에 첨가하고, 세척 완충제로 헹구고 이어서 AFM 실험에 사용하였다. Nanoscope VIII Multimode AFM(Bruker)을 사용하여 실온에서 PBS 완충액에서 단일-분자 힘 분광분석(SMFS) 측정을 수행하였다. 질화규소 팁 및 0.01-0.06 N m-1의 공칭 스프링 상수를 갖는 삼각형 AFM 캔틸레버(MSCT, Bruker)가 사용되었다. 캔틸레버는 Butt et al. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology 6, 1-7 (1995)에 기재된 열잡음 방법을 사용하는 각 실험의 말단에서 영점 수정되었다. Wildling et al., Probing binding pocket of serotonin transporter by single molecular force spectroscopy on living cells. J. Biol. Chem. 287, 105-113 (2012)에 기재된 프로토콜에 따라 NHS-PEG27-말레이 미드 링커를 사용하여, C 말단에 첨가된 시스테인 잔기를 연결하는 Pep7b를 공유적으로 부착시키도록 기능화된 팁을 유도체화하였다. 기능화 후, 캔틸레버를 PBS(3 x 5 분)로 세척하고 AFM 실험에 사용될 때까지 4℃에서 웰당 2 ml의 PBS를 함유하는 다중벽 접시의 개별 웰에 저장하였다. 힘-거리 곡선은 250pN의 가해진 힘, 0.25초의 접촉 시간 및 1 ㎛ s-1의 일정한 접근 및 후퇴 속도를 사용하여 1x 1㎛2 영역에 걸쳐 32x32 픽셀 어레이로 기록되었다. 동적 힘 분광분석 측정의 경우, 캔틸레버의 후퇴 속도는 20nm s-1, 100nm s-1, 200nm s-1, 1 ㎛ s-1, 2 ㎛ s-1, 10 ㎛ s-1 및 20 ㎛ s-1로 변경되었다. 전형적으로, 특정 후퇴 속도로 각각의 캔틸레버에 대해 적어도 2000개의 힘-거리 곡선이 수행되었다. 수집된 날짜는 Nanoscope Analysis스코프 소프트웨어(Bruker)를 사용하여 분석되었다. 각 곡선의 후퇴 세그먼트가 분석되었고, 결합 점은 접촉점으로부터 5 내지 50nm의 거리에서 발생하는 경우 특이적인 것으로 간주되었다. 최소 접착력이 추가로 사용하여 결합 확률을 계산하고 힘 분포 히스토그램을 구축하였다. 측정된 상호 작용의 에너지 환경을 재구성하기 위해, 팁 캔틸레버가 표면으로 튀어 나오기 전의 접착력의 기울기로, 힘 대 시간 곡선으로부터 로딩 속도를 계산하였다. 로딩 속도와 힘의 의존성은 동적 힘 분광분석 플롯에 그려졌다.
1.14. 통계 분석
GraphPad 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다. P 값은 정규 분포 데이터(STF 및 PLA 분석)의 다중 및 단일 비교에 대한 일원 분산 분석(Post Hoc Dunnett 's test) 및 Student 's t 테스트와 정규 분포 데이터(CtA 정량)의 다중 비교에 대한 Kruskal-Wallis(post hoc Dunn 's test)에 의해 계산되었다; * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001.
2. 결과
2.1. Reck는 Frizzled-독립적 Wnt7-특이적 수용체이다
Wnt/Fz 결합 관계는 무차별 적이며, 다수의 Wnt가 개별 Fz에 결합하기 위해 경쟁하고 다수의 Fz가 단일 Wnt에 반응할 수 있다. 최근의 결정학적 연구는 Wnt/Fz 상호 작용 화학이 명백한 Wnt 및 Fz 쌍과 양립할 수 없고, Wnt/Fz 접촉이 보존된 잔기 또는 동일한 화학적 변형에 의해 지배됨을 확인하였다(CY Janda, D. Waghray, AM Levin, C. Thomas, KC Garcia, Science. 337, 59-64(2012)). 이러한 관찰은 세포가 때때로 반대되는 생물학적 기능을 갖는 다수의 Wnt 리간드의 공간적 및 일시적으로 겹치는 발현 패턴을 어떻게 해석하는지에 대한 의문을 제기한다.
적절한 예는 Wnt7a 및 Wnt7b에 의한 포유동물 전뇌 및 복부 척수 혈관 발달의 독점적 제어이다(JM Stenman et al., Science. 322, 1247-1250(2008); R. Daneman et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 106, 641-646(2009); S. Liebner et al., J. Cell Biol. 183, 409-417(2008)). 구체적으로, 신경 전구체 유래 Wnt7에 반응하고 Wnt/β-카테닌 시그널링을 활성화시키기 위해, 뇌 내피세포(EC)는 G 단백질-커플링된 수용체의 접착 클래스의 고아 멤버인 Gpr124를 발현해야 하나(M. Cullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5759-5764 (2011); F. Kuhnert et al., Science. 330, 985-989 (2010); K. D. Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 2807-2812 (2011); Y. Zhou, J. Nathans, Dev. Cell. 31, 248-256 (2014); E. Posokhova et al., Cell Rep. 10, 123-130 (2015); B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25 (2015)) as well as the GPI-anchored glycoprotein Reck (B. Vanhollebeke et al., 2015; F. Ulrich et al., Development. 143, 147-159 (2015)). Gpr124 and Reck physically interact and synergistically stimulate Wnt7-specific responses (B. Vanhollebeke et al., 2015; C. Cho, P. M. Smallwood, J. Nathans, Neuron. 95, 1056-1073 (2017)), 시그널링 모듈이 Wnt7을 다른 국소적으로 발현된 다른 Wnt 리간드와 어떻게 구별할 수 있는지는 알려져 있지 않다.
Wnt7이 이 시그널링 모듈 내에서 어떻게 구체적으로 인식되는지하는, 척추 동물 세포에서 Frizzled 수용체 및 이들의 Lrp5/6 공동 수용체의 편재에 의해 본질적으로 복잡한 문제가 결정되었다. 따라서, 정의 노드에서 수용체 복합체 성분이 유전적으로 고갈된 제 1 세포주 세트는 (i) 모든 10개의 FZ 유전자(FZ1-10-/-), (ii) LRP5 및 LRP6(LRP5-/-;LRP6-/-)) 또는 (iii) HEK293 세포에서 다중화된 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발을 통한 GPR124 및 RECK(GPR124-/-; RECK-/-)을 표적으로 하는 것에 의해 생성되었다. Wnt7 결합의 결정 인자를 확인하기 위해, V5-태그된 Wnt 리간드는 이들 세포주에서 일시적으로 발현되었다. Wnt3a-V5가 아닌 Wnt7a-V5는 WT, FZ1-10-/- 및 LRP5-/-; LRP6-/- 세포의 원형질 막에서 면역 검출될 수 있지만 GPR124-/-; RECK-/- 세포의 원형질 막에서는 아니다(도 1a). 단독으로 또는 Gpr124와 조합된 Reck 발현의 이소성 복원은 이들 세포에서 Wnt7a-V5 막 표지를 특이적으로 복원하기에 충분하지만, Gpr124 발현 단독은 그렇지 않았다(도 1b). 예상한 바와 같이, Fz5는 기준선 Wnt7 시그널링을 매개하는 이 Frizzled 수용체의 능력을 반영하는 Wnt7a-V5 결합에 대해 경쟁력이 있었다.
세포 경쟁 실험을 이용하여, Reck는 Fz가 없을 때 Wnt7a를 모집하는 것으로 밝혀졌다. Reck을 발현하지만 Gpr124ΔICD는 그렇지 않은 Fz1-10-/- 세포의 공동 배양은 이웃하는 GPR124-/-;RECK-/- STF(Super Top Flash) 리포터 세포에서 Wnt7a-Fz5 시그널링을 현저하게 감소시킬 수 있기 때문이다(도 1c). 주목할만한 것은, 이 리간드 포획 분석에서, Gpr124는 C-말단 ICD 도메인이 부족하여 Gpr124/Reck 복합체의 표면 노출된 부분으로 분석이 제한되었다. 다음으로, PLA는 Wnt7a 결합에 필요한 Reck의 도메인을 맵핑하는데 사용되었다. Reck은 5개의 N-말단 시스테인-노트(CK) 모티프, 시스테인이 풍부한 도메인(CRD) 및 3개의 Kazal 모티프로 구성되며, GPI-앵커 부위 이전에 EGF-유사 모티프가 산재되어 있다. Reck의 각 도메인에 대해 HA 에피토프-태깅된 결실 변이체의 수집을 생성하고, PLA 신호를 정량화하였다. 이 분석은 N-말단 시스테인-노트 도메인, 보다 특히 CK4 및 CK5가 결합에 필요하다는 것을 보여주었다(도 1d). 이들 결과와 일치하여, ReckΔCK4 발현은 또한 경쟁 분석에서 비활성이었다(도 1c).
Reck이 지배적인 Wnt7 결합 결정요인인 것으로 보이지만, Wnt 시그널링에서의 그의 기능은, Wnt7a 결합에 추가로 연루된 것으로 본원에 나타낸 도메인인, N-말단 CK 도메인을 통해 Gpr124와 복합체를 형성하는 능력에 의존하는 것으로 알려져 있다(Y. Zhou, J. Nathans, Dev. Cell. 31, 248-256(2014); B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25(2015)). HA-Reck 및 HA-Fz5와 달리, HA-Gpr124는 Wnt7a-V5로 표현할 때 PLA 신호를 생성하지 않는다(도 1e). 그러나, 태그가없는 Gpr124의 공 발현시 Wnt7a-V5/HA-Reck PLA 신호의 4 배 증가가 검출되었다(도 1f). Gpr124에 의한 이러한 결합 자극은 Gpr124/Reck 복합체의 형성에서 N-말단 CK1 모티프의 역할과 일치하여 Reck CK1 및 CK2에 의존적이었다(C. Cho, PM Smallwood, J. Nathans, Neuron. 95, 1056?1073(2017)).
요컨대, PLA가 확산성 세포 외 리간드와 막 수용체 사이의 직접적인 상호 작용을 위한 유효한 프록시로 작용한다는 암묵적 가정으로, 이러한 결과는 Reck가, Wnt7에 대한 결합이 CK 도메인 내에서 Gpr124의 근위 결합에 의해 강화된, 처음보고된 Fz-비 의존적 Wnt 리간드-특이적 수용체를 구성함을 시사한다(도 1g).
2.2. Wnt7 인식은 Wnt 리간드의 매우 다양하고 본질적인 장애 링커 영역을 포함한다
Wnt 리간드는 높은 수준의 재조합 생산에 대해 아주 다루기 힘들어 전장 재조합 Wnt7과 Reck 사이의 무 세포 생화학적 또는 생물 물리적 상호 작용 연구를 방지한다.
리간드 N-말단 도메인(NTD)의 팔미토일화된 '엄지' 및 '검지' C-터미널 도메인(CTD)의 소수성 잔기를 통해, Wnt 리간드는 구상 Fz 시스테인이 풍부한 도메인 (CRD)을 꼬집는 인간의 손을 연상시키는 2-도메인 구조를 채택한다. Fz 바인딩과 관련된 구조는 주로 '엄지'와 '검지'의 끝 부분에 있다. 두 도메인은 NTD의 유연한 도메인 간 링커 영역을 통해 연결된다.
특정 도메인 또는 잔기에 대해 결실되거나 다른 Wnt 리간드로부터 선택된 도메인을 운반하도록 조작된 Wnt7 변이체의 집합이 생성되었다(도 2a). 이들 키메라 리간드는 각각 PLA에 적용되어, Reck 결합이 Wnt7a NTD에서만 독점적으로 발생한다는 것을 밝혀냈다. 놀랍게도, Wnt7aNTD만으로는 전장 Wnt7a만큼 강력하게 Reck에 결합했지만 Wnt7aCTD는 그렇지 않았다(도 2b). Fz 결합에 연루된 팔미톨레산은, 세린 206 결합된 Reck에서 효율적으로 팔미토일화될 수 없는 돌연변이체 Wnt7aS206A처럼, Reck 상호 작용에 관여하지 않았다. Reck에 의한 Wnt7a의 NTD 인식 모드는 CTD가 Xenopus Wnt8a(XWnt8a) 및 뮤린 Wnt4 및 Wnt16의 등가 도메인으로 교체된 키메라 Wnt7a 리간드에 의해 확인되었다. 이들 결합 분석은 Reck가 Fz에 의해 관여된 부위와는 다른 부위에서 Wnt7a NTD에 매립된 모티프를 인식함으로써 Wnt 리간드를 구별한다는 것을 보여준다.
링커 영역이 없는 더 작은 NTD 변이체, Wnt7a1-212 및 Wnt71-237은 Reck에 결합하지 않았다. Fz 결합 부위로부터 떨어진 Wnt7a 링커 영역의 공간적 분리와 결합된 이 돌연변이 분석은, Reck가 이 링커 모티프를 통해 적어도 부분적으로 Wnt7a를 해독함을 시사한다. Wnt 리간드 패밀리에 걸쳐 가장 가변적인 모티프인 링커 영역은 척추 동물 계통군 전체에 걸쳐 Wnt7 오르소로그(orthologues) 사이에서 강력한 진화 보존을 나타낸다(도 2d). 상호 작용 부위를 정확하게 맵핑하기 위해, 본 발명자들은 Wnt7a의 101 개의 단일 잔기 변이체의 수집에 대한 Gpr124/Reck-의존성 STF 시그널링을 분석하였다(도 2c). 돌연변이된 잔기는 Wnt7a와 Wnt7b 사이에 엄격하게 또는 화학적으로 보존된 표면 노출된 NTD 잔기에 해당하지만, XWnt8a 또는 다른 Wnt 리간드에서는 발견되지 않았다. 도 2c에 도시된 바와 같이, 시험된 변이체의 ~ 80%가 WT Wnt7a만큼 활성이었지만, 단지 8 개의 Wnt7a 변이체(밑줄이 그어진)만이 Gpr124/Reck-의존적 시그널링을 10% 미만으로 감소시켰다. 하나(I37)의 임계 잔기를 제외한 모든 잔기가, 6 개의 링커 도메인에 대한 추가 맵핑을 가진, 예측된 Wnt7a 구조의 상단 또는 후면에 클러스터링된다. 모든 중요 잔기는 인간에서 물고기까지 Wnt7 오르소로그 사이에 엄격하게 보존되며, Wnt3a를 포함한 다른 Wnt에는 없다(도 2d). 본 발명자들은 Wnt7 링커 변이체의 비 활성이 LRP5/6, Reck 또는 둘 다에 대한 결합 결함으로 인한 것인지의 여부를 추가로 조사하였다. Reck 결합의 기능과 관련하여, 링커 영역 내에서 Wnt7a의 4 잔기 변이체((V241A, F251A, L252A, K262A; 여기서 치환은 mWnt7a 전구체 폴리펩티드의 아미노산 위치를 나타냄)인 Wnt7a4A는 WT Wnt7a와 비교하여 감소된 Reck PLA 신호를 나타냈다. 이 더 낮은 활성은 약간 개선된 분비율에도 불구하고 일어났다(도 2e).
무 세포 시스템에서 Reck-Wnt7 결합을 조사하기 위해, 고순도 Reck-CK-Fc 융합 단백질(및 이의 변이체, 즉 HA-Reck-CK△CK1-Fc, HA-Reck-CK△CK2-Fc; HA-Reck-CK△CK3-Fc; HA-Reck-CK△CK4-Fc; 및 HA-Reck-CK△CK5-Fc)을 HEK293T 세포 상청액으로부터 회수하고, 등온 적정 열량 측정법(ITC)에 의해 정제된 29 아미노산 긴 합성 Wnt7a 및 Wnt7b 링커 펩티드(pWnt7a 및 pWnt7b)로 적정했다. ITC는 pWnt7a 및 pWnt7b가 각각 7㎛ 및 1.2㎛의 친화도로 Reck에 직접 결합함을 확인하였다(도 2f). 대조군으로서, Wnt7a4A(pWnt7a4A)에 상응하는 합성 펩티드뿐만 아니라 Wnt3a(pWnt3a)의 등가 링커 펩티드는 Reck-CK-Fc에 결합하지 않는 것으로 나타났다. pWnt7b 결합은 Reck CK4 및 CK5를 필요로하지만 CK1, CK2 및 CK3은 필요하지 않았으며, PLA를 현저하게 미러링하여 배양된 세포를 생성하였다. ITC 분석에 의해 제공된 결과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 단일 분자 힘 분광분석(SMFS)을 사용하여 단일 분자 수준에서 결합 친화도를 측정하였다(도 2g). Reck-CK-Fc에 대한 pWnt7b의 결합은 5㎛의 측정된 해리 상수(KD)로 검출될 수 있었다. 두 기술 사이의 근본적인 차이에도 불구하고, ITC와 SMFS는 측정된 결합 친화도 값 사이에 밀접한 일치를 제공했다.
이러한 데이터는 모두 Wnt7이 '시그니처' 링커 모티프를 통해 적어도 부분적으로 Reck에 의해 인식됨을 보여준다. 그러나, 세포가 강화된 Wnt7-특이적 세포 반응을 나타 내기 위해서는, Reck-바운드 Wnt7이 효율적인 시그널링 활성화 및 형질 도입 기계에 기능적으로 통합되어야 한다.
2.3. Gpr124는 Wnt7 시그널링 및 뇌 혈관 형성 동안 GPCR을 형질전환시키는 고전적인 신호로 작용하지 않는다
원형질막의 유일한 외부 리플릿에 대한 GPI-앵커링 모드로 인해, Reck 자체는 막 이중층을 가로 질러 Wnt7 시그널을 형질 도입할 가능성이 제한되어 있으므로, 시그널 형질 도입은 수용체 복합체의 다른 성분, 즉 Gpr124 및/또는 Fz/Lrp5/6에 의존한다.
이 시그널 형질 도입 메커니즘을 밝히기 위해, Gpr124와 Fz/Lrp5/6 복합체 사이의 기능적 관계는 배양된 세포에서 평가되었다. "Fz-free" 및 "Lrp5/6-free"세포를 사용하여, Gpr124/Reck의 기능이 Fz 및 Lrp5/6 기능에 엄격하게 의존한다는 것이 유전적으로 확립되었다(도 3a-e). 그들의 각각의 CRD 및 DKK1-민감성 Wnt 리간드 결합 도메인은 시그널링에 필수적이며, 이는 Wnt7이 고전적인 방식으로 Fz/Lrp5/6에 결합하고 활성화한다는 것을 암시한다.
제브라피시 CNS 맥관구조의 발현은 쉽게 정량화할 수 있는 혈관 신생 발아 과정에서 Reck/Gpr124 신호에 엄격히 의존하는 것으로 나타났다. 따라서 생리적 Wnt7 입력 수준에 대한 반응으로 생체 내에서 구조 기능 분석을 수행하는 주요 설정으로 이루어진다(B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25(2015); N. Bostaille, A. Gauquier, L. Twyffels, B. Vanhollebeke, Biol. Open. 5, 1874-1881(2016)). 1-세포 단계 WT 또는 gpr124-/-배아에서 합성 mRNA의 주입을 사용하여, 본 발명자들은 N-말단 세포 외 부분(Gpr124ΔECD), 7개-스팬 부분(Gpr124ΔTM2-7) 또는 C-말단 세포질 연장(Gpr124ΔICD)이 없는 3개의 Gpr124 변이체의 활성을 평가(도 4a)하는 것으로 시작하였다. Gpr124ΔECD 및 Gpr124ΔICD의 이소성 발현은 gpr124 돌연변이체에서 뇌 혈관 신생을 회복시키지 못했지만, Gpr124ΔTM2-7 활성은 생체 내 뇌 혈관 신생 (도 4b, c) 및 시험관 내 STF 분석에서 Wnt 활성(도 4d)을 유발하기에 충분하였다.
Gpr124ΔTM2-7의 이러한 보유된 능력은 예상되지 않았다: Gpr124는 조작된 Gpr124ΔTM2-7 돌연변이 단백질에 존재 하지 않는 7 개의 막 횡단 스팬의 리간드-유도 입체 구조 리모델링에 의해 세포 내에서 세포 외 자극을 중계하는 수용체 수퍼 패밀리인 GPCR이다. 이러한 결과에 기초하여, Gpr124는 막을 통한 시그널링이 필요하지 않기 때문에 Wnt7 시그널링을 촉진할 때 고전적인 GPCR로서 작용하지 않을 수 있는 것으로 보인다.
대신, Gpr124는 이 모듈에서 그 활성이 렉킹-결합 세포 외 도메인(ECD) 및 구조적으로 결합되지 않은 세포 내 도메인(ICD)에 의존하는 시그널링-결핍 막 관통 단백질로서 작용하는 것으로 보인다. 본 발명자들은 Gpr124 ICD가, Fz와 상호 작용하는 Wnt 시그널링의 중요한 이펙터인, Dishevelled를 통해 작동할 수 있다는 가설을 세웠다. 이 'Dvl 가설'은 Gpr124와 밀접한 관련이 있는 접착 GPCR인 Gpr125가 C-말단 ICD 도메인을 통해 Dvl과 물리적으로 상호 작용하고(X. Li et al., Development. 140, 3028-3039).(2013)) Gpr124의 ICD가 Gpr125의 ICD로 대체된 Gpr124/125 하이브리드는 제브라피시에서 뇌 혈관 신생을 촉진할 수 있다(B. Vanhollebeke et al., Elife. 4, 1-25(2015))(도 4e 참조)는 발견에 근거한 것이다. 유사하게, Gpr124 ICD가, Dvl에 결합하는 것으로 알려진, Fz2 ICD로 대체된 Gpr124/Fz2 하이브리드(Gpr124ICDFz2)가 경쟁력이 있었다. 대조적으로, 전장 Fz2는 그렇지 않았다. 특히, Gpr124ICDFz2의 활성은 Fz2 ICD 내의 KTxxW 및 ETTV 모티프 Dvl 결합 부위에 의존적이었다(도 4e).
2.4. Dvl 중합체는 Fz 및 Gpr124를 연결함으로써 리간드-특이적 Wnt 세포신호전달체를 조립한다
FZ1-10-/-HEK293T 세포에서 N-말단 FLAG-태그된 Gpr124와 Dvl-GFP 사이에서 수행된 공동-면역 침전 실험은 C-말단 ETTV가 없는 경우에도 Gpr124와 Dvl 사이의 상호 작용을 확인하였다(도 5a). Fz와 달리, Gpr124는 β-카테닌 안정화의 Wnt 시그널링 활성화 상류의 초기 지표인 인산화된 Dvl 수준의 검출 가능한 증가를 산출하지 않았다(SI Yanagawa, F. Van Leeuwen, A. Wodarz, J. Klingensmith, R. Nusse, Genes Dev. 9, 1087?1095(1995); X. Huang et al., Science. 339, 1441-1445(2013))(도 5b). 이러한 Gpr124-유도 Dvl 활성화의 부재는 신호-결핍 단백질로서 Gpr124를 확인한 도 4의 실험과 일치한다. 함께 살시한, 이러한 실험 Wnt7 신호 활동을 중재할 수 있는 구성 Gpr124 바인딩 파트너로 Dvl을 식별한다.
Gpr124, Reck 및 Fz/Lrp5/6은 배양된 세포에서 고차 수용체 복합체를 형성하는 것으로 제안되었다(C. Cho, P. M. Smallwood, J. Nathans, Neuron. 95, 1056-1073(2017)). 본 발명자들은 Gpr124 ICD가 Dvl을 통해 이 복합체를 조립할 수 있다고 추론했다. Dvl 분자는 실제로 그들의 N-말단 Dix 도메인의 헤드-테일(head-to-tail) 자기-조립을 통한 동적 중합을 통해 세포신호전달체를 조립한다. 이러한 자기-연관은 키나제 및 세포 내 기계 장치의 성분을 포함하여 다양한 세포질 Wnt 시그널링 조절 단백질의 국소 농도를 허용한다(M. Gammons, M. Bienz, Curr. Opin. Cell Biol. 51, 42?49(2018), M Bienz, Trends Biochem. Sci. 39, 487-495(2014)). Dvl이 Gpr124 및 Fz와 물리적으로 상호 작용함에 따라, Gpr124 및 관련된 Reck-결합 Wnt7은 역동적 Wnt 세포신호전달체에 포획되어 Fz 시그널링에 이용 가능한 Wnt7 리간드의 국소 농도를 증가시킨다.
Wnt 세포신호전달체는 원형질 막에서 또는 그 아래에서 형성되는 Dvl이 풍부한 크고 구멍이 뚫린 구조로서 광 현미경에 의해 쉽게 검출된다(M. Bienz, Trends Biochem. Sci. 39, 487-495(2014); J. Bilic et al., Science. 316, 1619-1622(2007); MV Gammons, M. Renko, CM Johnson, TJ Rutherford, M. Bienz, Mol. Cell. 64, 92-104(2016)). Fz 및 Gpr124가 Dvl-의존적 방식으로 Wnt 세포신호전달체에서 공동-분포되는지 여부를 결정하기 위해, 개별적으로 발현된 Fz-GFP 및 Gpr124-tagRFP의 국소화가 먼저 세포층 심층(DEL) 세포에서 검사되었다. Fz4는 전체 원형질막 주변을 장식하는 대신, Gpr124-tagRFP는 세포 접촉에 축적되었다. 이 차별되는 막 위치는 Dvl 발현시 유지되었다(도 5c). 그들의 Dvl 결합능과 일치하여, 두 수용체는 Dvl을 각각의 막 구획으로 모집하였다(도 5d). 그러나, Gpr124-tagRFP 및 Fz4-GFP가 공동-발현되었을 때, Gpr124-tagRFP는 세포 간 접합부에서 고정된 상태로 유지되었지만, Fz4-GFP는 Dvl-의존적 방식으로 Gpr124 막 서브 도메인에 정량적으로 재배치되었다(도 5e). 여기에서 단백질은 EVL 세포막에서 특히 명백한 Wnt 세포신호전달체-연상성 누점 구조에서 공동 국재화되었다(도 5f). 본 발명자들은 DEL 세포에서 Dvl-의존적 Fz/Gpr124 상호 작용을 시험하기 위한 분석으로서 이분자 형광 상보를 사용하였다. Gpr124-VN155(I152L) 및 Fz1-VC155의 공동-주입은 실제로 Dvl-의존적 방식으로 밝은 접합 신호를 생성하여(도 5g), Fz 및 Gpr124가 Dvl 스캐폴드 단백질을 통해 간접적으로 상호 작용함을 입증하였다. 이것은 Wnt 리간드 식별 잠재력이 부여된 Wnt 세포신호전달체 내에서 관련 Reck-바운드 Wnt7과 함께 Fz/Lrp5/6 및 Gpr124의 공간 클러스터링을 위한 분자 메커니즘을 제공하여, Gpr124/Reck 양성 세포의 Wnt7-특이적 반응을 설명한다(최종 모델, 도 6 참조).
요약하면, 이 연구는 척추 동물 세포의 Wnt 디코딩 능력에 대한 첫 번째 구조적 및 메카니즘적 통찰력을 제공한다. 또한 진화적으로 제한된 Wnt 구조는, 지금까지 Norrin과 같이 구조적으로 관련이 없는 Frizzled 리간드를 필요로 한다고 생각되는 속성인, 리간드 특이적 세포 반응을 허용하기에 충분한 다양성과 고유의 가소성을 보유하고 있다(MB Lai et al., Cell Rep. 19, 2809-2822(2017)). Wnt 진화 및 기능에 대한 이러한 구조적 통찰력은 추가적인 Wnt 디코딩 모듈이 존재함을 시사하여 다른 Wnt 또는 Fz 패밀리 구성원에 대한 응답으로 셀룰러 동작의 미세 조정을 가능하게 한다.
실시 예 2: Reck에 의한 Wnt7의 분자 인식은 Wnt/Fz 상호 작용 요건을 최소화한다
1. 재료 및 방법
1.1. 제브라피시 라인
제브라피시(Danio rerio)는 벨기에 주의 규칙(프로토콜 승인 번호: CEBEA-IBMM-2017-22: 65)에 따라 표준 조건에서 길러지고 처리되었다. Tg(-17.0neurog1: EGFP)w61(McGraw et al., J. Neurosci 28(47): 12558-69(2008))을 사용하였다.
1.2. 모폴리노, RNA 구조 및 미세주입
다음의 스플라이스-차단 모폴리노(MO)(GeneTools, Eugene, OR)를 1-세포 단계에서 배아에 주입하였다: Wnt7aa(TTCCATTTGACCCTACTTACCCAAT, 6 ng). mMessage mMachine SP6 키트(Ambion, Carlsbad, CA)를 사용하여 NotI 소화 후 pCS2 플라스미드로부터 합성 mRNA를 전사하고 1-세포 단계 제브라피시 배아에 주입하였다. 제노푸스 미세주입의 경우, 15 pg의 Wnt7a 또는 Wnt7aK190A 또는 Wnt7a1-278 mRNA를 4-세포 단계 배아의 하나의 복부 블라스토머에 주입하였다.
1.3. 발현 플라스미드 작제물
Fz1(addgen # 42253) 및 Fz5(addgen # 42267)를 제외한 In-Fusion 클로닝(Takara, Mountain View, CA)을 사용하여 재조합 후 모든 Wnt 시그널링 성분 및 다른 발현 작제물을 pCS2 벡터의 CMV 프로모터로부터 발현시켰다. 단일-포인트 돌연변이 변이체 및 결실은 In-Fusion 클로닝 및 탠덤 겹침 PCR 생성물을 사용하여 생성되었다. 모든 구축물은 시퀀싱에 의해 확인되었다.
1.4. 세포 배양 및 HEK293 돌연변이 세포주
HECC293T 세포는 ATCC(CRL-3216)로부터 입수하였고 HEK293 STF 세포주는 제레미 나단(John Jeremy Nathans)(John Hopkins)에 의해 제공되었다. 세포를 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM/F12 배지(Lonza, 스위스 바젤)에서 배양하고 5% CO2로 평형화된 가습 배양기에서 유지시켰다.
1.5. STF 이중 루시페라제 분석
세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 리포펙타민 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 24 시간 후에 3 회 형질감염시켰다. 웰당 형질감염된 플라스미드 DNA의 양은 각각의 발현 벡터에 대해 최적화되었다: 달리 명시되지 않는 한 레닐라 루시페라제(0.5ng), Wnt(20ng), Fz(5ng), LRP(2.5ng), Gpr124(10ng), Reck(10ng). 빈 pCS2 벡터를 사용하여 DNA의 총량을 웰당 100 ng로 조정하였다. 세포를 수동 용해 완충액(E1960, Promega, Wisconsin)에서 수거하고, 형질감염 후 48시간에 이중 루시페라제 리포터 분석 시스템(E1960, Promega, Madison, Wisconsin)을 사용하여 반딧불 및 바다팬지 루시페라제의 활성을 순차적으로 측정하였다.
1.6. 현미경 및 이미지 처리
제브라피시 배아를 LSM710 공 초점 현미경으로 이미지화하고 이미지를 ImageJ에서 처리하였다. 제브라피시 발달 표현형의 이미지를 Leica M165 FC에서 촬영했다. 제노푸스 애벌레를 올림푸스 SZX16으로 이미지화하였다.
1.7. 통계 분석
GraphPad 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다. p-값은 정규 분포 데이터(STF assays)의 다중 및 단일 비교에 대한 일원 분산 분석(Post Hoc Dunnett 's test)과 Student's t test에 의해 그리고 비정규 분포 데이터(DRG 정량)의 다중 비교에 대한 Kruskal-Wallis(post hoc Dunn 's test)에 의해 계산되었다; * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001.
2. 결과
본 발명자들은 실험 1에서, Reck가 Fz에 의해 관여된 것과는 다른 부위에서, Wnt7a 내의 링커를 인식함으로써 Wnt 리간드를 구별한다는 것을 확인하였다. 따라서, 결합 메커니즘은 세포 내 스캐폴드에 의해 함께 유지된 고차 Wnt7/Reck/Gpr124/Fz/LRP5/6 복합체의 형성에 적합한 것으로 보이고, 여기서 Wnt7은 Fz, Reck 및 LRP5/6에 의해 동시에 결합된다. 본 발명자들은 또한 Wnt7a의 N-말단 도메인(Wnt7a1-278)이 여전히 Reck에 결합한다는 것을 밝혀냈다.
다음으로, Fz5 및 Gpr124/Reck/Fz/LRP 시그널링에 대한 이들 Wnt7a의 절단된 변이체의 STF 활성을 평가하였다(도 7a). Fz5를 통한 Wnt 시그널링은, Wnt/Fz 접촉 부위 둘 모두의 보존을 필요로 하고, 절단 또는 팔미톨레산의 부재에 의해 하나가없는 모든 Wnt7a 변이체는 Fz5 시그널링을 자극할 수 없었다(도 7a). 단일 도메인 Wnt7a1-278은 Gpr124/Reck/Fz1을 통해 ~ 40% 신호 용량을 유지했다(도 7a, 화살표 끝). 본 발명자들은 Wnt7, Fz, LRP5/6 및 Reck에 의해 형성된 복합체 내에서, Reck에 의해 제공되는 추가 접촉점이 리간드 검지에서 누락된 Wnt/Fz 상호 작용을 보상하고 있다고 제안하였다.
Fz5 시그널링로부터 Gpr124/Reck/Fz/LRP 시그널링을 위해 Wnt7a 내에 필수적인 잔기를 구별하기 위해, Wnt7a의 단일 잔기 변이체의 집합에 대한 Gpr124/Reck/Fz/LRP 또는 Fz5 의존성 STF 시그널링을 분석하였다(도 7b, 7c). Fz5 신호에 대해 비활성이지만 여전히 Gpr124/Reck/Fz/LRP-매개 Wnt 신호, 특히 Gpr124/Reck/Fz/LRP-매개 Wnt를, 야생형 성숙 전장 Wnt7a의 Gpr124/Reck/Fz/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성의 적어도 35%로, 활성화시키는 42개의 전장 mWnt7a 변이체(7b의 박스 내)가 확인되었다(도 7b-7c, 표 3 참조). 이들 변이체 중 31 개,보다 구체적으로, Wnt7a 변이체 Q48A(Q17A), I51A(I20A), P56A(P25A), A58R(A27R); I59A(I28A); E64A(E33A); M68A(M37A), L70A(L39A), E72A(E41A); F75A(F44A); V99A(V68A); I160A(I129A); F162A(F131A); K164A(K133A); I172A(I141A); R189A(R158A); K190A(K159A); K190L(K159L); K212A(K181A); R222A(R191A); K229A(K198A); K231A(K200A); V236A(V205A); E239A(E208A); P249A(P218A); Y260A(Y229A); P263A(P232A); T266A(T235A); W322A(W291A); T338A(T307A) 및 N83Q(N52Q)(여기서 치환은 mWnt7a 전구체 폴리펩티드의 아미노산 위치를 나타내고괄호 안의 치환은 mWnt7a 성숙 폴리펩티드의 아미노산 위치를 나타냄, 표 3 참조))는 Gpr124/Reck/Fz/LRP-매개 Wnt 시그널링를 야생형 성숙 전장 Wnt7a의 Gpr124/Reck/Fz/LRP-매개 Wnt 시그널링 활성의 70% 이상까지 활성화시킬 수 있다(도 7 b-c).
시험관 내에서, Wnt7a1-278 및 Wnt7aK190A(Gpr124/Reck Fz/LRP 시그널링을 위한 31 개의 선택적 변이체 중 하나)는 Gpr124/Reck가 없는 경우 임의의 Fz를 통해 시그널링하지 않았다(도 7d). 따라서, 제브라피시 접합체에서의 mRNA 주입시, Wnt7a1-278 및 Wnt7aK190A는 잘 견디며 각각 1 ng 및 100 pg까지 후방 또는 심한 해부학적 변화를 나타내지 않았다(도 7d-e). 대조적으로, 3 pg의 Wnt7a mRNA는 Wnt 시그널링의 이소성 활성화에 의해 전뇌 및 눈 구조의 상실을 유도하였고(Kim et al., Nature 407(6806): 913-6(2000)), 보다 높은 용량에서 이형 배아를 초래하였다 10pg(도 7e-f).
유사하게, 제노푸스 배아에 주입했을 때, Wnt7a는 고전적인 Wnt/β-카테닌 시그널링 결과인 축 복제를 야기한 반면, Wnt7a1-278 및 Wnt7aK190A는 그렇지 않았다(도 7g). Wnt7a1-278 및 Wnt7aK190A에 의해 유발된 식별 가능한 발달 결함이 없기 때문에 100 pg mRNA 주입 후 Wnt7aa 몰판트에서 상당한 DRG 구조가 가능한 반면, 10 pg의 최고 허용 용량으로 주입된 Wnt7aa mRNA는 DRG 뉴런의 한계 복원만 나타냈다(도 7h).
함께, 이러한 실험은 대체 Fz 경로에 표적 활성을 나타내지 않고 생체 내에서 Gpr124/Reck/Fz/LRP 의존 반응을 이끌어내는, Gpr124/Reck/Fz/LRP 선택적 제제로 Wnt7a1-278 및 Wnt7aK190A를 규명하고, 그에 의해 리간드-특이적 Fz 시그널링 경로가 크게 증가된 선택성을 갖는 신규한 Wnt 제제를 개발하도록 맞춤화될 수 있다는 개념을 제공한다. 실험 섹션에서 Wnt7a 폴리펩티드 변이체에서의 아미노산 치환의 위치는 Wnt7a 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열(즉, 신호 펩티드 포함)과 관련하여 명시된다. 표 3은 Wnt7a 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 아미노산 치환의 위치 및 성숙 Wnt7a 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 그들의 상응하는 위치를 나타낸다.
마우스 Wnt7aK190A 또는 Wnt7a1-278의 유전자 도입 내피 발현은 Wnt7aa-/-돌연변이체 제브라피시에서 GPR124/RECK-의존적 뇌 혈관 형성을 유발하고 (GLUT1 발현에 의해 평가된 바와 같이) 혈액-뇌 장벽을 회복시켰다(도 9a-c). 마우스 Wnt7, Wnt7aK190A 및 Wnt7a1-278은 내피-특이적 kdrl(혈관 내피 성장 인자 수용체 kdr-유사) 프로모터의 제어하에 Wnt7aa-/-배아의 내피에서 일시적으로 발현되었다. Wnt7 리간드는 형질전환 마커로서 BFP(청색 형광 단백질)를 갖는 양방향성 작제물로서 발현되었다. 주입되지 않은 배아와 대조적으로, 세 리간드 모두는 CtAs 형성을 회복시킨다. 60 hpf Wnt7aa-/-배아에서 Wnt7, Wnt7aK190A 및 Wnt7a1-278의 형질전환 발현 후 CtA의 항-GLUT1 면역 형광 염색은 혈액-뇌 장벽 성숙을 나타냈다.
상기의 관점에서, Wnt7a 변이체는 대안적인 Fz 경로상의 표적 활성을 나타내지 않으면서 생체 내에서 GPR124/RECK-의존성 반응을 유도하는 GPR124/RECK-선택적 제제이다.
mWnt7a 전구체 폴리펩티드에서 아미노산 위치 성숙 mWnt7a 폴리펩티드에서
아미노산 위치
Q48A Q17A
I51A I20A
P56A P25A
A58R A27R
I59A I28A
E64A E33A
M68A M37A
L70A L39A
E72A E41A
F75A F44A
V99A V68A
R81A R50A
N83Q N52Q
I160A I129A
F162A F131A
K164A K133A
F166A F135A
I172A I141A
R177A R146A
R189A R158A
K190A K159A
K190L K159L
K190S K159S
K212A K181A
R222A R191A
K229A K198A
K231A K200A
V236A V205A
E239A E208A
R245A R214A
K247A K216A
P249A P218A
K253A K222A
I254A I223A
Y260A Y229A
P263A P232A
T266A T235A
E279A E248A
R320A R289A
W322A W291A
T338A T307A
K349A K318A
마우스 및 인간 야생형 전장 성숙 Wnt7a의 1차 아미노산 서열은 동일하다.
실시 예 3: 뇌졸중 모델(일시적인 중뇌 동맥 폐색(tMCAO))이 행해진 마우스에서 마우스 Wnt7aK190A의 바이러스 벡터 전달
1. 재료 및 방법
1.1. AAV 플라스미드 작제물의 생성(AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190A-p2A-EGFP)
전장 mWnt7aK190A 변이체를 pCAG 프로모터의 조절 요소 하에서 측면 ITR 서열을 함유하는 pAAV 형질전환 벡터에 클로닝하였다. Wnt7 변이체는 자동-절단 p2A 펩티드의 중간체에 의해 EGFP에 대한 융합으로 표현되었다. pAAV-형질전환 플라스미드, 헬퍼 플라스미드(AAV-PHP.eB 캡시드 변이체 + rep + 삽입 서열을 코딩함) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 HEK293 세포의 3중 동시-형질감염에 의해 Korbelin et al., 2016에 기술된 바와 같이 AAV 벡터를 생성 및 정제하였다. .
"Wnt7aK190A"의 K190A는 mWnt7a 전구체 폴리펩티드에서의 아미노산 위치를 나타낸다.
1.2. 동물 연구
10마리의 C57BL/6 마우스를 AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190A-p2A-EGFP 또는 AAV-PHP.eB 제어 벡터(1×1011 vg/마우스)를 함유하는 50㎕의 농축 벡터(1×1011 vg/mouse)로 정맥으로 주사하였다. 감염 2 주 후, EGFP 신호를 CNS 내피세포에서 평가하여 형질전환 발현을 확인하였다.
마우스에 1시간 동안 tMCAO를 가하고 tMCAO 5 일 후 TTC(2,3,5-트라이 페닐 테트라 졸륨 클로라이드) 염색을 통해 경색 크기를 측정하였다. 내인성 혈장 단백질 누출(면역 글로불린 및 피브리노겐)을 측정함으로써 재관류 1시간 후 혈액 뇌 장벽(BBB) 수준에서의 누출 분석을 수행하였다. tMCAO 후 관류 5일 후에 마우스의 생존을 평가하였다.
2. 결과
마우스 뇌에서 광범위한 형질전환 발현을 입증하기 위해 GFP 인코딩 작제물을 사용하였다(도 10a).
생체 내 뇌졸중에 대한 마우스 Wnt7aK190A의 효과를 평가하기 위해, 마우스 Wnt7aK190A를 발현하는 뇌 특이적 아데노-관련 벡터가 생성되었다.
마우스 Wnt7aK190A를 포함하는 벡터를 주사한 모든 마우스는 감소된 뇌졸중 부피를 나타냈다(도 10b).
실시 예 4: 뇌졸중의 마우스 모델을 시행한 마우스에서 Wnt7aK190S 또는 Wnt7aK190L의 바이러스 벡터 전달(일시적 중뇌 동맥 폐색(tMCAO))
1. 재료 및 방법
1.1. AAV 플라스미드 작제물(AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190S-p2A-EGFP 및 AAV-PHP.eB-CAG-mWnt7aK190L-p2A-EGFP)의 생성
AAV 플라스미드 작제물은 실시 예 3, 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 생성된다.
"Wnt7aK190S"의 K190S 및 "Wnt7aK190L"에서 K190L은 mWnt7a 전구체 폴리펩티드에서의 아미노산 위치를 나타낸다.
1.2. 동물 연구
동물 연구는 실시 예 3, 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 수행된다.
2. 결과
마우스 Wnt7aK190S 또는 Wnt7aK190L을 포함하는 벡터를 주사한 마우스에서 뇌졸중 부피 감소를 측정하였다.
실시 예 5: 뇌졸중의 마우스 모델을 시행한 마우스에서 Wnt7a 변이체 제제의 바이러스 벡터 전달(일시적 중뇌 동맥 폐색(tMCAO))
1. 재료 및 방법
AAV 플라스미드 작제물은 실시 예 3, 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 생성되고 동물 연구는 실시 예 3, 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 수행된다.
2. 결과
뇌졸중 용적 감소는 마우스 Wnt7aQ48A, Wnt7aI51A, Wnt7aP56A, Wnt7aA58R, Wnt7aI59A, Wnt7aE64A, Wnt7aM68A, Wnt7aL70A, Wnt7aE72A, Wnt7aF75A, Wnt7aR81A, Wnt7aN83Q, Wnt7aV99A, Wnt7aI160A, Wnt7aF162A, Wnt7aK164A, Wnt7aF166A, Wnt7aI172A, Wnt7aR177A, Wnt7aR189A, Wnt7aK212A, Wnt7aR222A, Wnt7aK229A, Wnt7aK231A, Wnt7aV236A, Wnt7aE239A, Wnt7aR245A, Wnt7aK247A, Wnt7aP249A, Wnt7aK253A, Wnt7aI254A, Wnt7aY260A, Wnt7aP263A, Wnt7aT266A, Wnt7aE279A, Wnt7aR320A, Wnt7aW322A, Wnt7aT338A 또는 Wnt7aK349A를 포함하는 벡터를 주사한 마우스에서 측정된다.
음성 대조군으로서, 뇌 부피 감소는 마우스 Wnt7aR49A, Wnt7aE103A 또는 Wnt7aL192A를 포함하는 벡터가 주사된 마우스에서 측정된다.
치환은 mWnt7a 전구체 폴리펩티드에서 아미노산 위치를 지칭한다.
SEQUENCE LISTING <110> Universit?Libre de Bruxelles <120> WNT SIGNALING AGONIST MOLECULES <130> ULB-100-PCT <150> 18163777.8 <151> 2018-03-23 <160> 121 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1338 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Gly Ala Gly Gly Arg Arg Met Arg Gly Ala Pro Ala Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Pro Leu Leu Pro Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Pro Glu Ala Arg 20 25 30 Gly Ala Pro Gly Cys Pro Leu Ser Ile Arg Ser Cys Lys Cys Ser Gly 35 40 45 Glu Arg Pro Lys Gly Leu Ser Gly Gly Val Pro Gly Pro Ala Arg Arg 50 55 60 Arg Val Val Cys Ser Gly Gly Asp Leu Pro Glu Pro Pro Glu Pro Gly 65 70 75 80 Leu Leu Pro Asn Gly Thr Val Thr Leu Leu Leu Ser Asn Asn Lys Ile 85 90 95 Thr Gly Leu Arg Asn Gly Ser Phe Leu Gly Leu Ser Leu Leu Glu Lys 100 105 110 Leu Asp Leu Arg Asn Asn Ile Ile Ser Thr Val Gln Pro Gly Ala Phe 115 120 125 Leu Gly Leu Gly Glu Leu Lys Arg Leu Asp Leu Ser Asn Asn Arg Ile 130 135 140 Gly Cys Leu Thr Ser Glu Thr Phe Gln Gly Leu Pro Arg Leu Leu Arg 145 150 155 160 Leu Asn Ile Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ser Leu Gln Pro Gly Val Phe 165 170 175 Asp Glu Leu Pro Ala Leu Lys Val Val Asp Leu Gly Thr Glu Phe Leu 180 185 190 Thr Cys Asp Cys His Leu Arg Trp Leu Leu Pro Trp Ala Gln Asn Arg 195 200 205 Ser Leu Gln Leu Ser Glu His Thr Leu Cys Ala Tyr Pro Ser Ala Leu 210 215 220 His Ala Gln Ala Leu Gly Ser Leu Gln Glu Ala Gln Leu Cys Cys Glu 225 230 235 240 Gly Ala Leu Glu Leu His Thr His His Leu Ile Pro Ser Leu Arg Gln 245 250 255 Val Val Phe Gln Gly Asp Arg Leu Pro Phe Gln Cys Ser Ala Ser Tyr 260 265 270 Leu Gly Asn Asp Thr Arg Ile Arg Trp Tyr His Asn Arg Ala Pro Val 275 280 285 Glu Gly Asp Glu Gln Ala Gly Ile Leu Leu Ala Glu Ser Leu Ile His 290 295 300 Asp Cys Thr Phe Ile Thr Ser Glu Leu Thr Leu Ser His Ile Gly Val 305 310 315 320 Trp Ala Ser Gly Glu Trp Glu Cys Thr Val Ser Met Ala Gln Gly Asn 325 330 335 Ala Ser Lys Lys Val Glu Ile Val Val Leu Glu Thr Ser Ala Ser Tyr 340 345 350 Cys Pro Ala Glu Arg Val Ala Asn Asn Arg Gly Asp Phe Arg Trp Pro 355 360 365 Arg Thr Leu Ala Gly Ile Thr Ala Tyr Gln Ser Cys Leu Gln Tyr Pro 370 375 380 Phe Thr Ser Val Pro Leu Gly Gly Gly Ala Pro Gly Thr Arg Ala Ser 385 390 395 400 Arg Arg Cys Asp Arg Ala Gly Arg Trp Glu Pro Gly Asp Tyr Ser His 405 410 415 Cys Leu Tyr Thr Asn Asp Ile Thr Arg Val Leu Tyr Thr Phe Val Leu 420 425 430 Met Pro Ile Asn Ala Ser Asn Ala Leu Thr Leu Ala His Gln Leu Arg 435 440 445 Val Tyr Thr Ala Glu Ala Ala Ser Phe Ser Asp Met Met Asp Val Val 450 455 460 Tyr Val Ala Gln Met Ile Gln Lys Phe Leu Gly Tyr Val Asp Gln Ile 465 470 475 480 Lys Glu Leu Val Glu Val Met Val Asp Met Ala Ser Asn Leu Met Leu 485 490 495 Val Asp Glu His Leu Leu Trp Leu Ala Gln Arg Glu Asp Lys Ala Cys 500 505 510 Ser Arg Ile Val Gly Ala Leu Glu Arg Ile Gly Gly Ala Ala Leu Ser 515 520 525 Pro His Ala Gln His Ile Ser Val Asn Ala Arg Asn Val Ala Leu Glu 530 535 540 Ala Tyr Leu Ile Lys Pro His Ser Tyr Val Gly Leu Thr Cys Thr Ala 545 550 555 560 Phe Gln Arg Arg Glu Gly Gly Val Pro Gly Thr Arg Pro Gly Ser Pro 565 570 575 Gly Gln Asn Pro Pro Pro Glu Pro Glu Pro Pro Ala Asp Gln Gln Leu 580 585 590 Arg Phe Arg Cys Thr Thr Gly Arg Pro Asn Val Ser Leu Ser Ser Phe 595 600 605 His Ile Lys Asn Ser Val Ala Leu Ala Ser Ile Gln Leu Pro Pro Ser 610 615 620 Leu Phe Ser Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro Pro Val Pro Pro Asp 625 630 635 640 Cys Thr Leu Gln Leu Leu Val Phe Arg Asn Gly Arg Leu Phe His Ser 645 650 655 His Ser Asn Thr Ser Arg Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly Lys Arg Arg 660 665 670 Gly Val Ala Thr Pro Val Ile Phe Ala Gly Thr Ser Gly Cys Gly Val 675 680 685 Gly Asn Leu Thr Glu Pro Val Ala Val Ser Leu Arg His Trp Ala Glu 690 695 700 Gly Ala Glu Pro Val Ala Ala Trp Trp Ser Gln Glu Gly Pro Gly Glu 705 710 715 720 Ala Gly Gly Trp Thr Ser Glu Gly Cys Gln Leu Arg Ser Ser Gln Pro 725 730 735 Asn Val Ser Ala Leu His Cys Gln His Leu Gly Asn Val Ala Val Leu 740 745 750 Met Glu Leu Ser Ala Phe Pro Arg Glu Val Gly Gly Ala Gly Ala Gly 755 760 765 Leu His Pro Val Val Tyr Pro Cys Thr Ala Leu Leu Leu Leu Cys Leu 770 775 780 Phe Ala Thr Ile Ile Thr Tyr Ile Leu Asn His Ser Ser Ile Arg Val 785 790 795 800 Ser Arg Lys Gly Trp His Met Leu Leu Asn Leu Cys Phe His Ile Ala 805 810 815 Met Thr Ser Ala Val Phe Ala Gly Gly Ile Thr Leu Thr Asn Tyr Gln 820 825 830 Met Val Cys Gln Ala Val Gly Ile Thr Leu His Tyr Ser Ser Leu Ser 835 840 845 Thr Leu Leu Trp Met Gly Val Lys Ala Arg Val Leu His Lys Glu Leu 850 855 860 Thr Trp Arg Ala Pro Pro Pro Gln Glu Gly Asp Pro Ala Leu Pro Thr 865 870 875 880 Pro Ser Pro Met Leu Arg Phe Tyr Leu Ile Ala Gly Gly Ile Pro Leu 885 890 895 Ile Ile Cys Gly Ile Thr Ala Ala Val Asn Ile His Asn Tyr Arg Asp 900 905 910 His Ser Pro Tyr Cys Trp Leu Val Trp Arg Pro Ser Leu Gly Ala Phe 915 920 925 Tyr Ile Pro Val Ala Leu Ile Leu Leu Ile Thr Trp Ile Tyr Phe Leu 930 935 940 Cys Ala Gly Leu Arg Leu Arg Gly Pro Leu Ala Gln Asn Pro Lys Ala 945 950 955 960 Gly Asn Ser Arg Ala Ser Leu Glu Ala Gly Glu Glu Leu Arg Gly Ser 965 970 975 Thr Arg Leu Arg Gly Ser Gly Pro Leu Leu Ser Asp Ser Gly Ser Leu 980 985 990 Leu Ala Thr Gly Ser Ala Arg Val Gly Thr Pro Gly Pro Pro Glu Asp 995 1000 1005 Gly Asp Ser Leu Tyr Ser Pro Gly Val Gln Leu Gly Ala Leu Val 1010 1015 1020 Thr Thr His Phe Leu Tyr Leu Ala Met Trp Ala Cys Gly Ala Leu 1025 1030 1035 Ala Val Ser Gln Arg Trp Leu Pro Arg Val Val Cys Ser Cys Leu 1040 1045 1050 Tyr Gly Val Ala Ala Ser Ala Leu Gly Leu Phe Val Phe Thr His 1055 1060 1065 His Cys Ala Arg Arg Arg Asp Val Arg Ala Ser Trp Arg Ala Cys 1070 1075 1080 Cys Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro His Ala Pro Pro Arg Ala 1085 1090 1095 Leu Pro Ala Ala Ala Glu Asp Gly Ser Pro Val Phe Gly Glu Gly 1100 1105 1110 Pro Pro Ser Leu Lys Ser Ser Pro Ser Gly Ser Ser Gly His Pro 1115 1120 1125 Leu Ala Leu Gly Pro Cys Lys Leu Thr Asn Leu Gln Leu Ala Gln 1130 1135 1140 Ser Gln Val Cys Glu Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Glu Gly Glu 1145 1150 1155 Pro Glu Pro Ala Gly Thr Arg Gly Asn Leu Ala His Arg His Pro 1160 1165 1170 Asn Asn Val His His Gly Arg Arg Ala His Lys Ser Arg Ala Lys 1175 1180 1185 Gly His Arg Ala Gly Glu Ala Cys Gly Lys Asn 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Glu Ala Val His Val Glu 195 200 205 Pro Val Arg Ala Ser Arg Asn Lys Arg Pro Thr Phe Leu Lys Ile Lys 210 215 220 Lys Pro Leu Ser Tyr Arg Lys Pro Met Asp Thr Asp Leu Val Tyr Ile 225 230 235 240 Glu Lys Ser Pro Asn Tyr Cys Glu Glu Asp Pro Val Thr Gly Ser Val 245 250 255 Gly Thr Gln Gly Arg Ala Cys Asn Lys Thr Ala Pro Gln Ala Ser Gly 260 265 270 Cys Asp Leu Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asn Thr His Gln Tyr Ala 275 280 285 Arg Val Trp Gln Cys Asn Cys Lys Phe His Trp Cys Cys Tyr Val Lys 290 295 300 Cys Asn Thr Cys Ser Glu Arg Thr Glu Met Tyr Thr Cys Lys 305 310 315

Claims (25)

  1. G-단백질 연결 수용체(GPR)124/RECK/Frizzled/지방단백질 수용체 관련 단백질(LRP)-매개 Wnt 시그널링을 활성화시킬 수 있는 제제로서, 상기 제제는 RECK 및/또는 GPR124 부재 시 Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링을 활성화시키지 않는 것을 특징으로 하는 제제.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제제는 RECK 및 GPR124의 존재 하에 세포막에서 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드의 이종체화를 유도할 수 있지만, RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에는 아닌 것을 특징으로 하는 제제.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 제제는 RECK 및 GPR124의 존재 하에 세포막에서 Frizzled 및 LRP 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있지만, RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에는 아닌 것을 특징으로 하는 제제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 GPR124 및/또는 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 제제.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 제제.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 제제는 RECK 폴리펩티드의 시스테인 노트 4(CK4) 영역, CK5 영역, 또는 CK4 및 CK5 영역에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 제제.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 Frizzled 폴리펩티드의 시스테인-풍부 도메인(CRD)에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 제제.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 LRP 폴리펩티드의 DKK 결합 부위 및/또는 Wnt 결합 부위에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 제제.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 화학 물질, 항체, 항체 단편, 항체-유사 단백질 스캐폴드, 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 펩티드, 펩티드유사체, 앱타머, 포토앱타머, 스피에겔머(Spiegelmer) 및 핵산을 포함하거나 이들로 구성된 그룹에서 선택되며, 바람직하게는 상기 제제는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 RECK-결합 도메인, Frizzled-결합 도메인 및 LRP-결합 도메인을 포함하고, 상기 RECK-결합 도메인, 상기 Frizzled-결합 도메인, 및 상기 LRP-결합 도메인은 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드와 같은 Wnt7 폴리펩티드로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 제제.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 RECK 결합 도메인이 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제:
    -아미노산 서열 HVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYC에 대해 적어도 25% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(서열 번호 17); 또는
    -아미노산 서열 VEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDT(서열 번호 18)에 대해 적어도 25% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    -아미노산 서열 VEVVRASRLRQPTFLRIKQLRSYQKPMET(서열 번호 19)에 대해 적어도 25%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    -아미노산 서열 XXXVXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXKXXXX(서열 번호: 20), VXAXRXXXXXFLXIXXXXXYXK(서열 번호: 21), XXXVXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXKXXXX(서열 번호: 22) 또는 VXAXRXXXXXFLXXXXXXXXXK(서열 번호: 23 임), 상기에서 X는 어떤 아미노산도 될 수 있고, 바람직하게 아미노산 서열은 서열 번호 18 또는 서열 번호 19 중 어느 하나와 적어도 50% 서열 동일성을 나타낸다.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드의 단편과 같은 Wnt7 폴리펩티드의 단편이거나 본질적으로 이들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제제.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 단편이 Wnt7 폴리펩티드의 N-말단 도메인(NTD)이거나 본질적으로 이것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 제제.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 Wnt7a 또는 Wnt7b 폴리펩티드의 변이체와 같은 Wnt7 폴리펩티드의 변이체인 것을 특징으로 하는 제제.
  15. 제 14 항에 있어서, 다음을 특징으로 하는 제제:
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 17에 해당하는 위치의 글루타민(Q) 잔기는 글루타민(Q) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 20에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기는 이소로이신(I) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 25에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기는 프롤린(P) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 27에 해당하는 위치의 알라닌(A) 잔기는 알라닌(A) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 아르기닌(R) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 28에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기는 이소로이신(I) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환되고;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 33에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기는 글루타메이트(E) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 37에 해당하는 위치의 메티오닌(M) 잔기가 글루타메이트(M) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 39에 해당하는 위치의 로이신(L) 잔기는 글루타메이트(L) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 41에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기는 글루타메이트(E) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 44에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기는 페닐알라닌(F) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 50에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 52에 해당하는 위치의 아스파라긴(N) 잔기는 아스파라긴(N) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 글루타민(Q) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 68에 해당하는 위치의 발린(V) 잔기는 발린(V) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 129에 상응하는 위치의 이소로이신(I) 잔기는 이소로이신(I) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 131에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기는 페닐알라닌(F) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 133에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 135에 해당하는 위치의 페닐알라닌(F) 잔기는 페닐알라닌(F) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 141에 상응하는 위치의 이소로이신(I) 잔기는 이소로이신(I) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 146에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 158에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 159에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A)에 의해 치환되고, 세린(S) 또는 로이신(L) 잔기;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 181에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 191에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 198에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 200 위치에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 205에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 205에 해당하는 위치의 발린(V) 잔기는 발린(V) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 208에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기는 글루타메이트(E) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 214에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 216에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 218에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기는 프롤린(P) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 222에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 223에 해당하는 위치의 이소로이신(I) 잔기는 이소로이신(I) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 229에 해당하는 위치의 티로신(Y) 잔기는 티로신(Y) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 232에 해당하는 위치의 프롤린(P) 잔기는 프롤린(P) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 235에 해당하는 위치의 트레오닌(T) 잔기가 트레오닌(T) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환되고, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기에 의해 치환된다 ;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 248에 해당하는 위치의 글루타메이트(E) 잔기는 글루타메이트(E) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 289에 해당하는 위치의 아르기닌(R) 잔기는 아르기닌(R) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 291에 해당하는 위치의 트립토판(W) 잔기는 트립토판(W) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨;
    -서열 번호 24 또는 서열 번호 51의 위치 307에 해당하는 위치의 트레오닌(T) 잔기는 트레오닌(T) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환되고, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기에 의해 치환된다 ; 그리고/또는
    -서열 번호: 24 또는 서열 번호: 51의 위치 318에 해당하는 위치의 리신(K) 잔기는 리신(K) 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(A) 잔기로 치환됨.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 제제를 인코딩하는 핵산에 있어서, 상기 제제는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드인 것을 특징으로 하는 핵산.
  17. 프로모터 및/또는 전사 및 번역 조절 신호에 작동 가능하게 연결된, 제 16 항에 따른 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트.
  18. 바이러스 벡터와 같은, 제 16 항에 따른 핵산 또는 제 17 항에 따른 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  19. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 제제, 제 16 항에 따른 핵산, 제 17 항에 따른 핵산 발현 카세트 또는 제 18 항에 따른 벡터, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 의약으로 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 제제, 제 16 항에 따른 핵산, 제 17 항에 따른 핵산 발현 카세트, 제 18 항에 따른 벡터 또는 제 19 항에 따른 약제학적 조성물.
  21. 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 중추 신경계(CNS) 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 제제, 제 16 항에 따른 핵산, 제 17 항에 따른 핵산 발현 카세트, 제 18 항에 따른 벡터 또는 제 19 항에 따른 약제학적 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 신경 혈관 장애가 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 허혈/재관류 손상, 뇌 동맥류, 동정맥 기형(AVM), 해면 기형, 혈관염, 뇌출혈, 지주막하 출혈, 척추 혈관 기형, 경동맥 협착증, 모야모야병 및 두개 내 동맥 경화증 및 이들의 조합으로부터 선택되거나, 또는 상기 CNS 장애는 다발성 경화증, 허혈성 뇌졸중, 뇌암, 간질, 치매, 혈관성 치매, HIV-1-관련 치매, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴병, 근 위축성 측삭 경화증, 전염성 뇌 질환, 외상성 뇌 손상, 편두통 및 만성 외상성 뇌병증 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제제.
  23. 신경 혈관 장애 또는 신경 혈관 기능 이상을 포함하는 CNS 장애의 예방 또는 치료에 유용한 치료제로서 유용한 제제를 확인하기 위한 시험관 내 방법에 있어서, 상기 방법은 시험 제제가 GPR124/RECK/Frizzled/Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링를 활성화시키지만 RECK 및/또는 GPR124의 부재 하에 Frizzled/LRP-매개된 Wnt 시그널링은 활성화시키지 않는지를 측정하는 것을 포함하는 시험관 내 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관 내 방법.
    -시험 제제를 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 시그널링이 가능한 세포와 접촉시키고 상기 Wnt 시그널링을 측정하는 단계; 및
    -시험 제제를 Frizzled/LRP-매개 Wnt 신호전달을 가능하지만 GPR124/RECK/Frizzled/LRP-매개 Wnt 신호전달은 할 수 없는 세포와 접촉시키고, 상기 Wnt 신호를 측정하는 단계.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 시험 제제가 RECK 폴리펩티드에 결합할 수 있는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관 내 방법.
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