KR20110009249A - 인간 파필로마 바이러스의 바이러스 유사 입자 - Google Patents

인간 파필로마 바이러스의 바이러스 유사 입자 Download PDF

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KR20110009249A
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마틴 안네 세실 웨트텐도르프
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 HPV 16, HPV 18, HPV 31 및 HPV 45 유전자형으로부터 유래된 L1 단백질 또는 작용성 L1 단백질 유도체를 함유하는 VLP를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

인간 파필로마 바이러스의 바이러스 유사 입자 {VIRUS-LIKE PARTICLES OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS}
본 발명은 HPV에 대한 백신에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 바이러스 유사 입자들(VLPs), 특히 인간 파필로마 바이러스(HPV) 유래 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 포함하는 백신에 관한 것이다.
파필로마 바이러스는 고도로 종 특이적인 작은 DNA 종양 바이러스이다. 지금까지, 100종 이상의 개별적인 인간 파필로마 바이러스(HPV) 유전자형이 기술되었다. HPV는 일반적으로 피부(예를 들어, HPV-1 및 -2) 또는 점액성 표면(예를 들어, HPV-6 및 -11)에 특이적이고, 통상적으로 수개월 또는 수년간 존속하는 양성 종양(사마귀)을 유발한다. 이러한 양성 종양은 관련 개체를 괴롭힐 수 있으나 몇몇 예외를 제외하고 생명을 위협하지 않는다.
일부 HPV는 또한 암과 관련이 있다. HPV와 인간 암 사이의 가장 강한 양성 관련성은 HPV-16 및 HPV-18과 자궁경부 종양 사이에 존재하는 관련성이다. 자궁 경부암은 개발도상국에서 가장 흔한 악성종양으로 매년 세계에서 약 500,000건의 새로운 증례가 발생하고 있다. 현재 백신을 사용하여 1차 HPV-16 감염과, 심지어는 확립된 HPV-16 함유 암을 효과적으로 치료하는 것이 기술적으로 가능하다. HPV-16에 대한 예후 및 치료적 백신접종의 전망에 대한 검토를 위해서는 문헌[Cason J. Clin. Immunother, 1994: 1(4) 293-306, 및 Hagenesse M.E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555-556, 559-564]을 참조할 수 있다.
다소 차이는 있지만, 기술된 모든 HPV 게놈은 적어도 8개의 초기 유전자(early gene) E1 내지 E8, 및 2개의 후기 유전자 L1 및 L2를 가진다. 또한, 업스트림 조절 영역은 HPV 게놈의 대부분의 전사를 조절하는 것으로 보이는 조절 서열을 가진다.
HPV L1 기재 백신은 WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 및 WO 94/05792에 개시되어 있다. 이러한 백신은 단량체인 L1 항원, 캡소머, 또는 바이러스 유사 입자를 포함할 수 있다. VLP의 제조 방법은 당 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 WO 9913056 및 US 6245568에 기술된 바와 같이 증강된 균질성을 제공하는 VLP 분해-재조립(disassembly-reassembly) 방법을 포함한다. 이러한 입자는 추가적으로 L2 단백질을 포함할 수 있다. L2 기재 백신은 예를 들어 WO 93/00436에 기술되어 있다. 다른 HPV 백신은 E7과 같은 초기 단백질 또는 L2-E7과 같은 융합 단백질에 기재한다.
HPV 백신에 대한 연구에도 불구하고 자궁경부 암에 대해 광범위하게 효과적인 백신은 아직 없다.
본 발명은 인간 파필로마 바이러스에 대한 개선된 백신에 관한 것이다.
제 1 측면에서, 본 발명은 HPV 16, HPV 18, HPV 31, 및 HPV 45 유래 L1 단백질 또는 작용성 L1 단백질 유도체를 함유하는 VLP를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 HPV 16, HPV 18, HPV 31 및 HPV 45 유래 L1 단백질 또는 작용성 L1 단백질을 함유하는 VLP들을 조합시키는 것을 포함하는 백신 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 HPV 16, HPV 18, HPV 31 및 HPV 45 유래 L1 단백질 또는 작용성 L1 단백질 유도체를 함유하는 VLP 혼합물의 자궁경부암 예방용 백신을 제조하기 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 HPV 16, HPV 18, HPV 31 및 HPV 45 VLP의 혼합물을 포함하는 백신과 같은 상기에 기술된 백신을 자궁경부암에 걸릴 위험에 있는 개체에게 유효량 전달하는 것을 포함하는 자궁경부암 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명의 VLP는 예를 들어 본원에 참조로 통합되는 WO 99/13056에 개시된 당기술분야의 표준 방법을 사용하여 전장 HPV L1 단백질 또는 특정 L1 유도체로부터 형성될 수 있다.
VLP를 형성하는데 사용되는 L1 단백질은 트렁케이션(truncation)된 L1 단백질인 것이 바람직하다. 바람직하게는 하나 이상의 VLP는 트렁케이션된 L1 단백질을 포함하고, 바람직하게는 조합 백신 내의 모든 L1 단백질이 트렁케이션된 L1 단백질이다. 바람직하게는 트렁케이션은 핵 국소화 신호를 제거한다. 바람직하게는 트렁케이션은 C-말단 트렁케이션이다. 바람직하게는 C-말단 트렁케이션은 50개 미만의 아미노산을 제거하고, 보다 바람직하게는 40개 미만의 아미노산을 제거한다. 가장 바람직하게는 C-말단 트렁케이션은 HPV 16으로부터 34개 아미노산을 제거하고 HPV 18로부터 35개 아미노산을 제거한다.
트렁케이션된 L1 단백질은 적합하게는 작용성 L1 단백질 유도체이다. 작용성 L1 단백질 유도체는 면역 반응을 유발할 수 있고(이때, 필요한 경우, 적합한 애주번트가 접종된다), 이러한 면역 반응은 전장 L1 단백질로 구성된 VLP 및/또는 L1 단백질이 유래된 HPV 타입을 인지할 수 있다.
본 발명의 VLP는 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이와 같은 전장 또는 트렁케이션된 HPV L1 단백질의 돌연변이를 포함하여 다른 타입의 작용성 단백질 유도체를 포함할 수 있다. 적합한 유도체는 또한 코돈 최적화된 서열을 포함한다. L1 단백질 또는 유도체는 또한 L1 단백질과 L2 또는 초기 단백질의 융합 단백질과 같은 융합 단백질일 수 있다. 바람직하게는 융합 단백질은 단지 하나의 HPV 유전자형 유래 단백질을 포함한다. 하나의 유전자형 유래 L1 단백질이 다른 유전자형 유래 L1 단백질에 결합되어 있는 키메라 L1 단백질로부터 형성된 VLP는 바람직하지 않다.
L1 단백질 또는 작용성 단백질 유도체는 적합하게는 VLP를 형성할 수 있고, VLP 형성은 예를 들어 전자 현미경 및 동적 레이저 광 산란과 같은 표준 기술에 의해 평가될 수 있다.
바람직하게는 VLP의 다분산도(polydispersity)는 본원에 기술된 조건 하에서 맬버른 제타사이저 3000HS(Malvern Zetasizer 3000HS)를 사용하여 측정된 경우에 0.15 미만이고, 가장 바람직하게는 0.1 미만이고, 보다 바람직하게는 0.08 미만이다.
용어 '단백질'의 사용 또는 특정 단백질 예를 들어 'L1'에 대한 언급은 이하에서 다르게 기술되거나 문맥으로부터 명확하지 않으면 작용성 단백질 유도체에 대한 언급을 포함하는 것으로 취급된다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 본 발명의 백신은 단지 4개의 VLP 타입-HPV 16, HPV 18, HPV 31 및 HPV 45 VLP를 가진다. 바람직하게는 VLP는 이들 4개의 유전자형 각각으로부터 유래된 L1-단독 VLP이다.
대안적으로 또 가장 바람직하게, 백신은 5가 백신을 만드는 추가의 HPV 가(valency)를 포함한다. 바람직하게는, 추가의 백신가는 HPV 52, 53, 58, 33, 35, 56, 및 59 중 하나로부터 상기와 같이 L1 단백질 또는 작용성 유도체를 포함하는 VLP이다. 바람직하게는, 5번째 유전자형은 백신이 남아메리카에서 사용될 경우에는 HPV 33이거나, 아시아에서 사용될 경우에는 HPV 52, 53, 또는 58이다.
본 발명은 또한 6개 이상의 유전자형을 가지는 백신을 제공하기 위하여 2개 이상의 추가 백신가를 포함하는 백신까지 확대된다.
하나의 바람직한 구체예에서, 조합물은 HPV 6a, 6b, 또는 HPV 11 유전자형 유래 VLP를 제외한다.
바람직하게는 본 발명의 백신은 자궁경부암을 예방하는데 적어도 55% 효과적이고, 보다 바람직하게는 자궁경부암을 예방하는데 60%, 65%, 70%, 75%, 바람직하게는 80% 이상 효과적이다. 의문의 여지를 피하기 위해, 자궁경부암의 예방에 있어서의 %효능은 HPV 감염에 의해 유발되는 모든 자궁경부암에 대한 보호를 의미하며, 단지 하나의 유전자형에 의해 유발되는 암에 대한 보호만을 의미하는 것이 아니다. 예방은, 바람직한 백신이 2, 3, 4, 5년 이상에 걸쳐 동등하게 효과적이지만, 적합하게는 최초 백신접종 후 1년에 걸쳐 평가될 수 있다. %효능은 특정한 지리학적 영역에 백신 제형을 표적화하기 위해 적절한 HPV 유전자형을 선택함에 의해 증가될 수 있다.
바람직하게는, 백신 내의 VLP의 조합은 각 VLP 타입의 면역원성을 감소시키지 않는다. 특히, 본 발명의 조합물 중의 HPV VLP 간에 간섭작용이 없어서 본 발명의 조합 VLP 백신으로 그 백신에 존재하는 각 HPV 유전자형에 의한 감염증에 대해 효과적인 보호를 제공할 수 있는 것이 바람직하다. 적합하게는 조합물 중의 소정의 VLP 타입에 대한 면역 반응은, 개별적으로 측정되었을 때의 동일한 VLP 타입의 면역 반응의 적어도 50%, 바람직하게는 100% 또는 실질적으로 100%이다. HPV 16 및 HPV 18 VLP에 대한 반응에 대해서, 본 발명의 조합 백신은 바람직하게는 조합된 HPV 16/HPV 18 VLP 백신에 의해 제공되는 면역 반응의 적어도 50%인 면역 반응을 유도한다. 적합하게는, 본 발명의 백신에 의해 유발되는 면역 반응은 각 VLP 타입의 보호 효과가 여전히 관찰되는 수준이다. 면역 반응은 적합하게는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 항체 반응에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 백신은 HPV 감염 및/또는 질병을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 백신은 자궁경부 암종 또는 CIN III 후유증을 유발하는 바이러스 로드 및 또는 감염을 감소시키기 위해 치료적으로 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 HPV 감염과 관련된 질병의 치료 및 감염 또는 질병의 예방을 위한 본 발명의 백신의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HPV 16, 18, 31, 및 45에 대한 면역 반응의 유발에서 본 발명의 VLP 조합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 백신은 임의적으로 HPV 6a, 6b, 및/또는 HPV 11 유전자형으로부터 유래된 L1 단백질을 함유하는 VLP와 같은 생식기 사마귀에 대한 보호를 제공하는 VLP와 제형화될 수 있다.
바람직하게는 VLP는 HPV L1 단백질만을 포함하고 L2 단백질 또는 단백질 단편을 포함하지 않는다.
본 발명의 백신은 L1 단백질 또는 유도체에 더하여 다른 단백질 또는 단백질 단편을 포함할 수 있다. 단백질/펩티드는 VLP 내에 캡슐화되거나 VLP들과의 혼합물로 함께 제형화되어 VLP의 L1 단백질과의 키메라 형태로 전달될 수 있다. 다른 단백질 또는 펩티드가 또한 본 발명의 백신과 함께 투여될 수 있다.
한 측면에서, 백신은 예를 들어 문헌[K.Kawana et al Vaccine 19, 2001, p1496-1502]에 개시된 바와 같이 L2 펩티드와 같은 HPV L2 단백질 또는 L2 유도체를 포함하며, 여기서 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 백신은 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8 또는 이들의 면역학적 활성 유도체와 같은 HPV 초기 항원과 제형화될 수 있다. 키메라 형태로 전달되는 경우에 초기 항원의 약 30 내지 60개 아미노산의 면역원성 단편을 사용하는 것이 바람직하다.
임의적으로, 백신은 또한 비-HPV 항원과 제형화되거나 함께 투여될 수 있다. 적합하게는, 이들 항원은 다른 질병, 가장 바람직하게는 단순 포진 바이러스, 클라미디아 및 HIV와 같은 성을 매개로 전달되는 질병에 대해 보호작용을 제공할 수 있다. 본 발명자들은 특히 백신이 HSV로부터 유래된 gD 또는 이들의 트렁케이트(truncate), 바람직하게는 문헌 WO 99/45957에 기술된 바와 같은 gD2t 단백질을 포함하는 것을 선호한다. 이러한 방식으로 백신은 HPV 및 HSV 둘 모두에 보호 작용을 제공한다. 바람직한 HIV 항원은 문헌 WO/9916884 및 WO/0154719에 기술되어 있다.
본 발명은 전체적으로 L1 단독의 VLP와 같은, HPV 16, 18, 31, 및 45 유래 캡시드 단백질을 함유하는 VLP의 혼합물에 관한 것이다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 HPV 16 VLP, HPV 18 VLP, HPV 31 VLP 및 HPV 45 VLP의 혼합물을 포함하는 백신을 제공한다. 본원의 'HPV 16 VLP'는 예를 들어 L1 단백질 또는 L1 유도체가 HPV 16으로부터 유래된 L1 VLP를 의미한다. 동일한 명명 원칙이 HPV 18, HPV 31, 및 HPV 45 VLP와 같이 본원에 기술된 다른 VLP에도 확장되어 적용된다.
바람직하게는 각 VLP는 하나의 HPV 유전자형으로부터만 유래된 L1 단백질을 함유한다. 이러한 백신은, HPV 16, 18, 31, 및 45 유래 개별적인 VLP를 생성하고 이러한 VLP를 조합하여 제형화될 수 있다. 바람직하게는 L1 이외의 VLP 중의 다른 HPV 단백질은 없다.
또한, HPV 16 유래 L1 및 L2를 가진 VLP와 같은 하나의 HPV 유전자형으로부터만 유래된 단백질을 함유하는 VLP가 바람직하다.
그러나, 본 발명의 대안적인 구체예에서, VLP는 혼합 VLP, 제 2 유전자형 유래 L1 단백질과 조합된 하나의 유전자형 유래 L1 단백질을 포함하는 혼합 VLP일 수 있고, 여기서 상이한 L1 단백질은 키메라 L1 단백질이 아니고 동일한 캡시드 구조 내에서 함께 결합하여 면역원성 VLP를 형성한다.
바람직한 조합물은 유전자형 16, 18, 31, 및 45의 교환을 포함하고, 예를 들어 본 발명은 혼합 HPV 31/HPV 45 VLP와 조합된 혼합 HPV 16/HPV 18 VLP, 또는 혼합 18/45 VLP와 조합된 혼합 16/31 VLP를 포함할 수 있다. 1개의 VLP 내의 2개 초과의 L1 유전자형의 조합이 또한 고려된다.
혼합 VLP는 개개의 L1 단백질의 분리된 발현에 의해 생성되고 조합되어 본원에 예시된 바와 같은 VLP를 형성할 수 있다. 대안적으로 다수의 L1 단백질은 동일한 세포 내에서 하나 이상의 DNA 구조물로부터 발현될 수 있다. 예를 들어, 다수의 DNA 구조물은 숙주 세포로 형질전환되거나 트랜스펙션될 수 있고, 각 벡터가 상이한 L1 단백질을 엔코딩한다. 대안적으로, 공유된 프로모터 또는 다수의 개별적인 프로모터에 의해 조절되는 다수의 L1 유전자를 가지는 단일 벡터가 사용될 수 있다. IRES 요소가 또한 적절한 경우에 벡터에 혼입될 수 있다. 이러한 발현 방법을 사용하여 함께 발현된 L1 단백질은 후속하는 VLP 형성을 위해 함께 정제될 수 있거나 자발적으로 혼합 VLP를 형성한 후에 정제될 수 있다.
혼합 VLP가 사용되는 경우에, 혼합 VLP 생성에 대한 바람직한 공정은, 상이한 파필로마바이러스 유전자형으로부터 유래된, L1 단백질과 같은 VLP L1 단백질 또는 유도체를 제조하고, 이들 단백질을 필요한 경우 혼합하고 이를 조립(assembly)하여 혼합 VLP를 생성하는 것을 포함한다. L1 단백질은 미정제 추출물의 형태일 수 있고, 혼합 전에 부분적으로 정제되거나 또는 정제될 수 있다. 바람직하게는 단백질은 조합되기 전에 적어도 부분적으로 정제된다. 임의적으로, 혼합 VLP의 추가 정제가 조립 후에 수행될 수 있다. 추가의 항원이 사용되는 경우에, 이들은 적절한 경우에 첨가될 수 있다.
하나의 구체예에서, 혼합 VLP는 2개 이상의 VLP의 분해(disassembly), 후속하여 재조립 전에 적합한 때에 분해된 VLP 성분을 조합함에 의해 제조될 수 있다. 이러한 접근은, 예를 들어 일부 효모주에서 나타나는 것처럼 L1 단백질이 발현될 때에 VLP가 자발적으로 형성되는 경우에 적합하다. L1 단백질의 발현이 자발적인 VLP 형성을 유발하지 않는 경우에, L1 단백질 또는 캡소머의 제조는 VLP로 조립되기 전에 조합될 수 있다.
VLP의 조립은 일반적으로 환원제의 제거에 의해 달성된다. 이와 같이, 혼합 VLP 생성에서, 단백질의 혼합은 바람직하게는 단백질의 혼합물로부터 환원제를 제거하기 전에 일어난다. 바람직하게는, 혼합 VLP의 생성은 VLP가 형성되는 조건 하에서 혼합물로부터 환원제를 제거함에 의해 분리된 L1 단백질의 혼합물로부터 혼합 VLP를 형성하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 재조립 공정은 β-머켑토에탄올과 같은 환원제를 제거하여 수행된다.
그러나, VLP 형성이 pH, 금속 이온 및 염분 뿐만 아니라 환원제의 존재에 의존한다는 것이 공지되어 있다. 이와 같이, 특정 환경 하에서, VLP는 환원제의 존재 하에 형성되어야 하는 것이 예견될 수 있다. 상이한 유전자형으로부터의 단백질을 혼합하는 것은, 혼합된 VLP가 형성되도록 하는 환경 조건이 pH, 금속 이온, 염분, 환원성 환경 또는 이들의 조합이든지 간에, 이러한 환경 조건의 변경 전에 일어나야 한다는 것이 본 발명에서 중요하다.
혼합 VLP가 사용되는 경우에, 바람직하게는 VLP의 성분이 최종 혼합 VLP에서 요망되는 비율로 혼합된다. 예를 들어, HPV 16 및 HPV 18로부터의 부분적으로 정제된 동일한 양의 L1 단백질의 혼합물은 대략 동일한 양의 각각의 단백질을 가지는 혼합 VLP를 제공한다.
백신 용액은 문헌 WO 98/44944 및 WO 0045841과 같은 당분야에 공지된 조성물에 의해 안정화될 수 있고, 상기 문헌은 본원에 참조로 통합된다.
본 발명의 모든 백신에 있어서, 백신이 10 내지 15세, 바람직하게는 10 내지 13세의 사춘기 소녀의 백신 접종을 위해 사용되는 것이 바람직하다. 백신은 또한 이상 자궁경부 세포진 검사(pap smear) 또는 HPV에 의해 유발되는 상처의 제거에 따르는 외과술 후의 여성에게 투여될 수 있다.
바람직하게는, 백신이 2 또는 3 용량 요법, 예를 들어 각각 0, 1 개월 요법 또는 0, 1, 및 6 개월 요법으로 전달된다. 적합하게는, 백신접종 요법은 5 내지 10년 후, 바람직하게는 10년 후에 재접종(booster) 주사를 포함한다.
바람직하게는 백신은, 비록 투여 전에 동결건조되고 재구성될 수 있을지라도, 액체 백신 제형이다.
본 발명의 백신은 또한 VLP와 조합하여 애주번트를 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 VLP는 알루미늄과 조합하여 사용되고 적합하게는 알루미늄 애주번트 상에 흡착되거나 부분적으로 흡착된다. 3D-MPL 또는 QS21과 같은 Th1 타입 반응을 자극하는 애주번트가 바람직하다. 적합하게는, 애주번트는 알루미늄 포스페이트 및 3D-MPL과 같은, 바람직하게는 3D-PL과 조합된 알루미늄 염이다.
바람직한 애주번트는 알루미늄 하이드록시드이고, 알루미늄 하이드록시드와 3D-MPL의 조합이 특히 바람직하다.
VLP가 알류미늄 함유 애주번트 상에 흡착되는 경우에, 애주번트는 바람직하게는 VLP가 혼합되어 최종 백신 제품을 형성하기 전에 첨가된다.
백신은 또한 안정화제로서 알루미늄 또는 알루미늄 화합물을 포함할 수 있고, 본 발명은 또한 VLP가 알루미늄 염 상에 흡착된 안정화된 조합 백신에 관한 것이다. 적합하게는 VLP는 알루미늄이 존재하지 않는 경우보다 알루미늄 염 상에 흡착된 후에 시간에 따라 보다 안정하다. 바람직하게는 안정화된 VLP는 실시예 1 섹션 C3에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있다.
본 발명의 백신은 경구, 국소, 피하, 점막(통상적으로 질내), 정맥내, 근내, 비강내, 설하, 피내 투여 및 좌약과 같은 다양한 경로 중 하나에 의해 제공될 수 있다. 근내 및 피하 전달이 바람직하다.
VLP 및 다른 단백질의 투여량은 개체의 상태, 성, 연령 및 체중, 백신의 투여 경로 및 HPV에 따라 다양할 것이다. 그 양은 또한 VLP 타입의 수에 따라 다양할 수 있다. 적합하게는 전달은 면역학적 보호 반응을 유발하기에 적합한 VLP의 양으로 수행된다. 적합하게는, 각 백신 용량은 1-100㎍의 각각의 VLP, 바람직하게는 5-80㎍, 보다 바람직하게는 5-30㎍의 각각의 VLP, 가장 바람직하게는 5-20㎍의 각각의 VLP를 포함하고, 5㎍, 6㎍, 10㎍, 15㎍ 또는 20㎍가 특히 바람직하다.
본 발명의 다가 백신은 적합하게는 정제된 L1 VLP를 조합함에 의해 생성된다. L1 VLP의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있고 예를 들어 WO 9531532, WO 9615247, WO 00/09671, 및 US 5888526에 도시된 방법을 포함하며 이들의 전체 내용은 본원에 통합된다.
적합하게는 본 발명의 VLP는 VLP의 분해 및 재조립에 의해 제조되어 균질하고 순수한 VLP를 제공한다. 적합한 공정의 예는 WO 0057906, US 6245568, 및 WO 9913056에 있다.
바람직하게는 VLP는 Sf9 또는 Hi-5 세포와 같은 곤충 세포로부터 제조될 수 있지만, 대장균(E. coli) 또는 효모 세포, 예를 들어 에스. 세레비지애(S. cerevisiae), 에스. 폼베(S. pombe), 또는 피치아 종(Pichia sp .)과 같은 임의의 적합한 세포가 또한 사용될 수 있다.
바람직하게는 L1 발현 후에 VLP의 정제는 음이온 교환 크로마토그래피(디메틸 아미노 에틸-DMAE), 음이온 교환 크로마토그래피(트리메틸아미노에틸-TMAE), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 나노미터 여과 또는 한외여과와 같은 여과, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피의 하나 이상의 단계를 포함한다. 바람직하게는 하나 이상의 음이온 교환 단계가 정제 과정 동안 수행되고, 보다 바람직하게는 2 단계의 음이온 교환 단계가 사용된다. 바람직하게는 하나 이상의 음이온 교환 정제 단계가 단백질을 혼합하기 전에 수행된다. 임의적으로 UV 조사 단계가 적용될 수 있다.
의문의 여지를 피하기 위하여, 본원에서 인용된 모든 문서의 전체 교시 내용은 참조로 통합된다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예 및 도면에 의해 설명된다:
도 1은 EM에 의해 평가된 HPV 16 VLP와 비교하여 혼합 VLP를 도시한다.
도 2 및 도 3은 혼합 VLP의 크기 분포를 도시한다.
도 4는 혼합 HPV 16, 18, 31, 45 조합 백신 대 HPV 16 대조군에서 VLP 16에 대한 항체 반응을 도시한다.
도 5는 혼합 HPV 16, 18, 31, 45 조합 백신 대 HPV 18 대조군에서 VLP 18에 대한 항체 반응을 도시한다.
도 6은 혼합 HPV 16, 18, 31, 45 조합 백신 대 HPV 31 대조군에서 VLP 31에 대한 항체 반응을 도시한다.
도 7은 혼합 HPV 16, 18, 31, 45 조합 백신 대 HPV 45 대조군에서 VLP 45에 대한 항체 반응을 도시한다.
실시예 1
HPV 16 및 HPV 18 L1 VLP의 조합물은 본원에 상술되어 있다. 다른 HPV 유전자형 유래 L1 단백질은 이미 당기술분야에 공지된 유사한 방법에 의해 용이하게 생성될 수 있다.
A. HPV 16/18 L1 VLP 의 제조
HPV 16 및 HPV 18 VLP의 생성은 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다-예를 들어, WO 9913056을 참조할 수 있다. HPV 16/18 단백질은 해당 HPV 16 또는 18 L1 유전자를 엔코딩하는 재조합 바큘로바이러스로 감염된(MOI 0.3) 트리코플루시아니(Trichiplusiani)(하이 화이브TM) 세포에서 발현시켰다. 세포를 감염 후 약 72 시간 후에 수집하였다.
B. 세포 수집/항원 추출
항원(L1-16/18)을 농축, 추출, 청징(clarification)의 세 단계 방법으로 Hi5 세포로부터 추출하였다. 농축 단계는 배양 배지의 90%로의 제거로 구성되고, 접선흐름방식 여과(tangential flow filtration)에 의해 수행하였다. 추출 단계는 저장 완충액(Tris 20mM, pH 8.5)으로 수행하였다. 배양 부피와 동일한 부피를 사용하여 추출을 수행하였다. 부드러운 교반 하에 최소 반 시간의 접촉 시간을 사용하였다. 청징은 접선흐름방식 여과에 의해 수행하였다.
C. 정제
정제 공정은 실온에서 수행하였다. β-머켑토에탄올(4% w/w)를 두 항원 L1-16/18에 대해서 VLP가 캡소머로 분해되도록 추출물에 첨가하였다. 글리세롤을 β-머켑토에탄올을 첨가하기 바로 전에 10% w/w의 농도가 되도록 첨가하였다.
사용된 모든 완충액을 2℃ 내지 8℃에서 저장하기 전에 0.22㎛ 필터 상에서 여과하였다. 각 정제 단계 전에, 겔 메트릭스를 살균하고 시료를 로딩하기 전에 적절한 완충액으로 평형화시켰다.
HPV 16 및 18 둘 모두로부터 L1의 분리된 정제를 위한 정제방법을 제시하였다. 이들 방법은 대체로 유사하고 하기 단계를 포함한다:
음이온 교환 크로마토그래피(디메틸 아미노 에틸-DMAE),
음이온 교환 크로마토그래피(트리메틸 아미노 에틸-TMAE),
하이드록시아파타이트 크로마토그래피,
나노미터 여과(플라노바),
한외여과,
HPV 18을 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피(옥틸 세파로오스 사용), 또는 HPV 16을 위한 음이온 교환 크로마토그래피(DEAE); 및
무균 여과.
구체 사항:
C1 L1 -18 항원의 정제
음이온 교환 크로마토그래피 DMAE
청징된 추출물(∼150㎎/㎖의 L1 단백질을 가진 ∼1g/㎖의 농도의 단백질)을 음이온 교환 컬럼(디메틸 아미노 에틸)에 적용하였다. (트리스 20mM/NaCl 200mM/4% β-머켑토에탄올 BME) 완충액, pH 7.9±0.2로 용리시켰다. 항원을 약 5배 컬럼 부피로 용리시키고 용리된 프로필을 280nm에서 모니터링하였다.
음이온 교환 크로마토그래피 TMAE
제 1 단계의 용라물을 1 부피의 H2O/BME 4%로 희석하였다. 그 다음, 희석된 용리물을 제 2 음이온 교환 컬럼(트리스 메틸 아미노 에틸)에 적용하였다. 용리를 (20mM 트리스/NaCl 200mM/4% BME) 완충액, pH 7.9±0.2로 수행하였다. 항원을 약 4배 컬럼 부피로 용리시키고 용리된 프로필을 280nm에서 모니터링하였다.
하이드록시아파타이트 크로마토그래피
TMAE 단계의 용리물을 하이드록시아파타이트(HA) 컬럼에 적용하였다. 시료 적용 후에, 겔을 대략 2.5 컬럼 부피의 (NaH2PO4 100mM/NaCl 30mM/4% BME) 완충액, pH 6.0±0.2로 용리시켰다.
나노미터 여과( 플라노바 )
HA 용리물을 하기 조건을 달성하도록 희석하였다:
(NaH2PO4 25mM/NaCl 10mM/4% BME) 완충액, pH 7.5±0.2.
다음에, 0.2㎛ 예비필터와 0.12m2의 플라노바 15N 필터상에서 연속하여 여과하였다. 여과를 일정 압력 200mbar±20mbar에서 수행하였다.
한외여과
한외여과를 폴리에테르설폰 막(센트라메이트 카세트 0.1m2, 100kD)이 구비된 접선흐름방식 여과 시스템으로 수행하였다. 플라노바 용리물을 하기 조건에 도달하도록 처리하였다: (NaH2PO4 100mM/NaCl 30mM/4% BME), pH 6.0±0.2; 다음에 이를 여과 시스템에 로딩하고 5배 희석하고 ∼10배 출발 부피의 (NaH2PO4 20mM/NaCl 500mM) 완충액, pH 6.0±0.2의 연속적인 주입으로 투석여과하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피( 옥틸 세파로오스 )
한외여과 통과물을 옥틸 세파로오스 컬럼에 적용하였다. 이러한 크로마토그래피 단계를 대략 5배 컬럼 부피의 (Na3PO4 20mM/NaCl 500mM)완충액, pH 6.0±0.2로 음성 모드로 수행하였다.
무균 여과
정제된 L1-18 항원 용액을 0.22㎛ 막으로 여과하여 멸균하였다.
C2 L1 -16 항원의 정제
음이온 교환 크로마토그래피 DMAE
청징된 추출물을 음이온 교환 컬럼(디메틸 아미노 에틸)에 적용하였다. (트리스 20mM/NaCl 180mM/4% BME) 완충액, pH 7.9±0.2로 용리시켰다. 항원을 약 4배 컬럼 부피로 용리시키고 용리 프로필을 280nm에서 모니터링하였다.
음이온 교환 크로마토그래피 TMAE
제 1 단계의 용리물을 1배 부피의 H2O/BME 4%로 추출하였다. 다음에, 희석된 용리물을 제 2 음이온 교환 컬럼(트리메틸아미노에틸)에 적용하였다. (20mM 트리스/NaCl 180mM/4% BME) 완충액, pH 7.9±0.2로 용리시켰다. 항원을 대략 5배 컬럼 부피로 추출하고 용리 프로필을 280nm에서 모니터링하였다.
하이드록시아파타이트 크로마토그래피( HA )
TMAE 단계의 용리물을 HA 컬럼에 적용하였다. 시료를 적용한 후에, 겔을 대략 3배 컬럼 부피의 (NaH2PO4 100mM/NaCl 30mM/4% BME) 완충액, pH6.0±0.2로 용리하였다.
나노미터 여과( 플라노바 )
HA 용리물을 하기 조건에 도달하도록 희석하였다: (NaH2PO4 25mM/NaCl 10mM/4% BME) 완충액, pH 7.5±0.2.
다음에, 0.2㎛ 예비필터와 0.12m2의 플라노바 15N 필터상에서 연속하여 여과하였다. 여과를 일정 압력 200mbar±20mbar에서 수행하였다.
한외여과
한외여과를 폴리에테르설폰 막(센트라메이트 카세트 0.1m2, 100kD)이 구비된 접선흐름방식 여과 시스템으로 수행하였다. 플라노바 용리물을 하기 조건을 달성하도록 처리하였다: (NaH2PO4 100mM/NaCl 30mM/4%BME), pH 6.0±0.2; 다음에, 이를 여과 시스템에 로딩하고 5배 농축하여 ∼10배 출발 부피의 (NaH2PO4 20mM/NaCl 500mM) 완충액, pH 6.0±0.2의 연속적인 주입으로 투석여과하였다.
음이온 교환 크로마토그래피 DEAE
한외여과 용리물을 평형 완충액 (Na3PO4 20mM/NaCl 250mM), pH 6.0±0.2의 전도성에 맞추고 음이온 교환 컬럼(디메틸 아미노 에틸) 상에 적용하였다.
(NaH2PO4 20mM/NaCl 500mM) 완충액, pH 6.0±0.2로 용리시켰다. 항원을 대략 3배 컬럼 부피로 용리시키고 용리 프로필을 280nm에서 모니터링하였다.
무균 여과
정제된 L1-16 항원 용액을 0.22㎛ 막 상에서 여과하여 멸균하였다.
C3
각 VLP 타입을 독립적으로 흡착시켜 농축된 흡착 1가를 생성하였다.
VLP16 농축된 흡착 1가의 제조:
60㎍의 정제된 HPV16 유래 VLP를 가볍게 교반시켜 실온에서 1시간 동안 6.0±0.2의 pH에서 150㎍의 Al(OH)3로부터의 Al3 + 상에 흡착시켰다. 이러한 농축된 흡착 1가를 +4℃에서 저장하였다. 제조물을 원심분리하고 상청액 중의 VLP를 정량함에 의해 흡착을 체크하였다.
VLP18 농축된 흡착 1가의 제조:
60㎍의 정제된 HPV18 유래 VLP를 가볍게 교반시키면서 실온에서 1 시간 동안 6.0±0.2의 pH에서 150㎍의 Al(OH)3로부터의 Al3 +상에 흡착시켰다. 이러한 농축된 흡착 1가를 +4℃에서 저장하였다. 제조물을 원심분리하고 상청액 중의 VLP를 정량함에 의해 흡착을 체크하였다.
D. 최종 백신 제조물:
상기 방법에 의해 제조된 농축된 흡착 1가를 조합하여 용량당 20㎍의 각각의 VLP를 함유하는 상청액을 형성하였다. 최종 백신을 +4℃에서 저장하였다.
20㎍ 각각의 VLP의 농도로 HPV 31 및 45로부터의 VLP를 첨가하여 4가 백신을 완성하였다.
조합된 흡착 벌크 또는 개별적인 흡착 벌크를 3D-MPL과 같은 애주번트와 추가로 혼합할 수 있다.
실시예 2
A HPV 16/18 L1 VLP 의 제조
상기와 같은 표준 프로토콜을 사용하여 HPV 16 및 HPV 18 VLP를 생성하였다.
B 혼합 VLP 의 형성
본 발명의 공정은 HPV L1 16 및 18의 재조립을 함께 수행하여 혼합 VLP가 형성되도록 HPV L1 16 및 18 VLP의 분해 및 그 후의 재조립 단계를 포함한다.
HPV 16 및 18 VLP를 VLP가 재조립되는 시점 전에 상기 공정의 임의의 적합한 지점에서 조립할 수 있다.
실시예 2에 의해 특정 방법이 시험되었다:
1 HA 단계 후의 두 항원의 혼합. HA 푸울의 L1 농도에 기초하여, 두개 성분을 동일한 농도의 HPV16 및 18에 도달하도록 혼합하여 UF 단계를 시작하였다. 이러한 경우에, 한외 여과 단계 후에, 옥틸 세파로오스 단계를 HPV16 과정에서 수행된 DEAE 단계가 후속하는 HPV18 정제 단계에 대한 것과 같이 수행하였다.
2. 두 추출물의 혼합 및 공동정제. 추출물 중의 L1 농도에 기초하여, 2가를 동일한 농도의 HPV16 및 18에 도달하도록 혼합하고 DMAE 단계를 출발하였다. 또한, 한외여과 단계 후에, 옥틸 세파로오스 단계를 HPV 16 방법에서 수행한 바와 같이 DEAE 단계가 후속하는 HPV18에 대한 것과 같이 수행하였다.
Figure pat00001
DMAE 단계에서의 HPV16 - HPV18 VLP 혼합
동일한 흐름도를 적용하였고, 다만, UF 단계 대신에 DMAE 단계에서 혼합을 수행하였다. 음이온 교환 DMAE TMAE 단계에서 용리를 위해 사용된 농도는 200mM이었다.
결과
UF 단계에서의 HPV16 - BPV18 VLP -혼합
2 로트의 혼합된 VLP(로트 번호 31b165c 및 31b166c)를 HPV16 및 HPV18 L1 단백질을 조합시킴에 의해 생성하였다.
SDS - PAGE 에 의한 순도
혼합 VLP의 순도는 "전형적인" HPV 16 또는 HPV 18 벌크 둘 모두에서만큼 양호하였다. 벌크의 순도는 95% 초과였다.
EM 데이터-도1
31B165C(완료 후 UF 보유물)의 EM을 전형적인 HPV16 로트(39B122c)와 비교하였다. VLP는 잘 형성되고 응집체 없이 크기면에서 균질하였고; 캡소머의 일부 리본은 두 실험 모두에 존재하였다.
크기 분포
VLP의 크기 분포를 멜버른 제타사이저 3000HS를 사용하여 결정하였다.
시료를 멜버른 분석을 위한 플라스틱 큐벳으로 희석시키지 않은 채(800㎕/큐벳) 측정하였다.
기술적 조건은 하기와 같았다:
- 레이저 파장: 532nm,
- 레이저 분말: 50mW,
- 90°에서 검출되는 광 산란,
- 온도: 25℃,
- 기간: 소프트웨어에 의한 자동 결정,
- 총수: 3회의 연속적인 측정,
- Z-평균 지름: 큐물런트(cumulant) 분석에 의함, 크기 분포: 콘틴(contin) 방법에 의함.
HPV18L1-VLP에 대한 전형적인 결과는 양호한 다분산성(〈0.1)을 보이는 70-80nm였다.
HPV16L1-VLP에 대한 전형적인 결과는 양호한 다분산성(〈0.1)을 보이는 60-70nm였다.
혼합 VLP에 대하여 하기와 같은 결과가 얻어졌다:
31 B165c: 양호한 다분산성을 보이는 85nm(0.08). VLP는 성숙 초기에 거의 완전하게 형성된다.
31 B166c: 양호한 다분산성을 보이는 76nm(0.08).
동적 레이저 광 산란에 의해 측정된 로트 31 B165c 및 31 B166c의 크기 분포는 도 2 및 도 3에 도시하였다.
DMAE 단계에서 혼합된 HPV16 - HPV18 VLP
로트 번호 31 B167B를 로트 E18L1C005(HPV18) 및 39B167(HPV16)으로부터 제조하였다.
SDS - PAGE 에 의한 순도
혼합 VLP의 순도는 "전형적인" 벌크 둘 모두 만큼 양호하였다.
벌크의 순도는 95% 초과였다.
크기 분포
VLP의 크기 분포를 맬버른 제타사이저 3000HS를 사용하여 결정하였다.
HPV18L1-VLP에 대한 전형적인 결과는 양호한 다분산성(〈0.1)을 보이는 70-80nm였다.
HPV16L1-VLP에 대한 전형적인 결과는 양호한 다분산성(〈0.1)을 보이는 60-70nm였다.
혼합 VLP에 대하여 하기 결과가 수득되었다:
HPV16-HPV18 31B167B: 양호한 다분산성(0.07)을 보이는 74nm. VLP는 성숙 초기에 거의 완전하게 형성되었다.
실시예 3-혼합된 HPV 16, 18, 31, 45 조합 백신의 생성
도입
알룸(alum)+3D-MPL로 애주번트화된 C-말단 트렁케이션된 L1 VLP 16, 18, 31 & 45의 조합물을 사용하여 Balb/C 마우스에서 면역원성 연구를 수행하였다(본원에서 '애주번트 A'는 50㎍의 알루미늄 염 및 5㎍의 3D-MPL임)
10마리 마우스 4개 군을 각각 0일 및 21일째에 하기로 2회 근내 면역접종하였다:
1. VLP 31(2㎍)/애주번트 A
2. VLP 45(2㎍)/애주번트 A
3. VLP 16(2㎍) 및 VLP 18(2㎍)/애주번트 A
4. VLP 16(2㎍), VLP 18(2㎍), VLP 31(2㎍), VLP 45(2㎍)/애주번트 A
VLP 16, 18, 31, 및 45에 대한 항체 반응을 35일째(2차 투여 후 14일째)에 채취된 혈청상에서 모니터링하였다.
결과를 도 4 내지 7에 도시하였다.
VLP 16에 대한 항체 반응
ㆍ강한 항체 반응을 애주번트 A상의 VLP 18과 제형화된 VLP 16(그룹 3) 또는 완전한 콤보(combo)(그룹 4) 중 어느 하나에 의해 2차 투여 후 혈청에서 유발하였다.
ㆍVLP 16에 대해 유도된 항체를 유사한 수준으로 양 그룹에서 측정하였으며 간섭작용이 관찰되지 않았다.
VLP 18에 대한 항체 반응
ㆍ강한 항체 반응을 애주번트 A상의 VLP 16과 제형화된 VLP 18(그룹 3) 또는 완전한 콤보(combo)(그룹 4) 중 어느 하나에 의해 2차 투여 후 혈청에서 유발하였다.
ㆍVLP 18에 대해 유도된 항체를 유사한 수준으로 양 그룹에서 측정하였으며(1.5배 차이 미만), 간섭작용이 관찰되지 않았다.
VLP 31에 대한 항체 반응
ㆍ강한 항체 반응을 애주번트 A상에서 단독으로 제형화된 VLP 31(그룹 1) 또는 완전한 콤보(combo)(그룹 4) 중 어느 하나에 의해 2차 투여 후 혈청에서 유발하였다.
ㆍVLP 31에 대해 유도된 항체를 유사한 수준으로 양 그룹에서 측정하였으며,그 결과 간섭작용이 관찰되지 않았다.
VLP 45에 대한 항체 반응
ㆍ강한 항체 반응을 애주번트 A상에서 단독으로 제형화된 VLP 45(그룹 2) 또는 완전한 콤보(combo)(그룹 4) 중 어느 하나에 의해 2차 투여 후 혈청에서 유발하였다.
ㆍVLP 45에 대해 유도된 항체를 유사한 수준으로 양 그룹에서 측정하였으며,그 결과 간섭작용이 관찰되지 않았다.
결론
4개의 VLP(VLP 16, 18, 31, 및 45)가 조합물로서 전달되는 경우에 간섭작용이 관찰되지 않았다.

Claims (19)

  1. 애주번트로서 알루미늄 하이드록시드와 함께 HPV 16, HPV 18, HPV 31 및 HPV 45 유전자형 유래 L1 단백질 또는 작용성 L1 단백질 유도체를 함유하는 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함하는 백신 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 각 VLP가 2 ㎍ 이상의 양으로 존재함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, HPV 16 VLP, HPV 18 VLP, HPV 31 VLP 및 HPV 45 VLP의 혼합물을 포함하며, 상기 각 VLP가 단지 1개의 HPV 유전자형으로부터 유래된 L1 단백질 또는 작용성 L1 단백질 유도체를 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 VLP가 HPV L1 단백질 또는 작용성 L1 단백질 유도체를 포함하고 다른 HPV 단백질을 포함하지 않는 L1-단독 VLP임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, HPV 16, HPV 18, HPV 31 및 HPV 45 유래 단백질만으로 필수적으로 구성된 VLP를 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 L1 단백질이 트렁케이션(truncation)된 L1 단백질임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 HPV 유전자형으로부터 유래된 L1 단백질 또는 이들의 작용성 유도체를 함유하는 VLP를 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 추가의 VLP가 HPV 33, 52, 53, 58, 35, 56, 및 59 중 하나로부터 선택된 L1 단백질 또는 작용성 L1 단백질 유도체를 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 자궁경부암을 예방하는 데 60% 이상 효과적임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7 또는 E8로부터 선택된 HPV 초기 항원 또는 이들의 면역학적 활성 단편을 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 성적으로 전달되는 질병을 유발하는 유기체로부터 유래된 항원과 제형화됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 항원이 HSV 항원 또는 이들의 면역학적 활성 단편임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 항원이 HIV 항원 또는 이들의 면역학적 활성 단편임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 항원이 클라미디아 항원 또는 이들의 면역학적 활성 단편임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  15. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, HPV L2 단백질 또는 이들의 단편을 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 3D-MPL을 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  17. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VLP가 키메라가 아닌 L1 단백질을 함유함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  18. HPV 16, HPV 18, HPV 31 및 HPV 45 유래 L1 단백질 또는 작용성 L1 단백질 유도체를 함유하는 VLP를 알루미늄 하이드록시드와 함께 조합하여 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 백신을 형성하는 것을 포함하는 백신 제조 방법.
  19. HPV 16, HPV 18, HPV 31 및 HPV 45로부터의 VLP가 혼합 이전에 알루미늄 하이드록시드 상에 흡착되어 있는 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 백신을 포함하는 안정화된 백신 조성물.
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