CN100528226C - 人乳头瘤病毒的病毒样颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有来源于HPV 16，HPV 18，HPV 31和HPV 45基因型的L1蛋白或功能性的L1蛋白衍生物的VLPs的疫苗组合物。

Description

人乳头瘤病毒的病毒样颗粒
本发明涉及抗HPV的疫苗。特别地，本发明涉及包含病毒样颗粒(VLPs)，特别是含有来源于人乳头瘤病毒(HPV)的蛋白的病毒样颗粒的疫苗。
乳头瘤病毒是具有高种属特异性的小DNA肿瘤病毒。迄今为止，已报道了超过100种的个人乳头瘤病毒(HPV)基因型。HPVs通常对皮肤(例如HPV-1和-2)或粘膜表面(例如HPV-6和-11)具有特异性，并且通常导致持续数月或数年的良性肿瘤(疣)的产生。这种良性肿瘤可给相关的个体带来痛苦，但除了少数特例外，其倾向于不对生命造成威胁。
一些HPVs也与癌症相关。在HPV和人类癌症之间最强的正相关为存在于HPV-16和HPV-18与宫颈癌之间的关联。宫颈癌是发展中国家中存在的最常见的恶性肿瘤，在世界范围内每年发生约500,000新病例。目前已能应用疫苗在技术上实现主动地抗击原发性的HPV-16感染，甚至是已经形成的含HPV-16的癌细胞。有关抗HPV-16的预防性和治疗性疫苗接种的前景的回顾，参见Cason J.，Clin.Immunother.1994；1(4)293-306 & Hagenesee M.E.，Infections in Medicine1997 14(7)555-556，559-564。
虽然的确有较小的变异发生，但所有记载的HPVs基因组具有至少8个早期基因-E1至E8，和2个晚期基因L1和L2。此外在一上游调节区中存在似乎是调控HPV基因组的大多数转录事件的调控序列。
在WO9400152、WO9420137、WO9302184和WO9405792中公开了基于HPV L1的疫苗。这种疫苗可以包括作为单体的L1抗原、壳粒或病毒样颗粒。制备VLPs的方法是本领域公知的，其包括用于增强均一性的VLP的分解-重组装方法，例如如WO9913056和US6245568中所述的。这种颗粒还可以包括L2蛋白。基于L2的疫苗，在例如WO9300436中进行了描述。其他的HPV疫苗基于早期蛋白，例如E7或融合蛋白，例如L2-E7。
尽管进行了有关HPV疫苗的开发工作，但是仍然未开发出具有广泛效果的抗宫颈癌的疫苗。
本发明涉及一种抗人乳头瘤病毒的改进疫苗。
本发明的第一方面涉及一种含有ULPs的疫苗组合物，所述的VLPs包含来源于HPV 16、HPV 18、HPV 31和HPV 45的L1蛋白或功能性的L1蛋白的衍生物。
本发明还涉及一种疫苗的生产方法，所述方法包括组合含有来源于HPV 16、HPV 18、HPV 31和HPV 45的L1蛋白或功能性的L1蛋白衍生物的VLPs。
本发明进一步涉及含有来源于HPV 16、HPV 18、HPV 31和HPV 45的L1蛋白或功能性的L1蛋白衍生物的VLPs混合物在制备用于预防宫颈癌的疫苗中的应用。
本发明进一步涉及一种预防宫颈癌的方法，所述方法包括对处于患宫颈癌风险中的个体给药有效量的如上所述的疫苗，例如包含HPV16、HPV 18、HPV 31和HPV 45的VLPs混合物的疫苗。
采用本领域的标准方法，例如按照WO9913056中所公开的方法(内容在此并入参考)，可通过全长HPV L1蛋白或特定的L1衍生物来形成本发明的VLPs。
优选地，用于形成VLP的L1蛋白为截短的L1蛋白。优选地，至少一种VLPs包括一截短的L1蛋白，并且优选地，联合疫苗中的所有L1蛋白均为截短的L1蛋白。优选地，所述截短除去了核定位信号。优选地，所述截短为C-末端截短。优选地，所述C-末端截短除去了少于50个的氨基酸，更优选地，除去了少于40个的氨基酸。最优选地，C-末端截短从HPV 16中除去了34个氨基酸，从HPV 18中除去了35个氨基酸。
截短的L1蛋白为合适的功能性L1蛋白衍生物。功能性L1蛋白衍生物能引发免疫应答(如果需要，当合适的佐剂存在的情况下)，所述的免疫应答能识别由全长L1蛋白和/或衍生L1蛋白的HPV类型组成的VLP。
本发明中的VLPs也可包含其他类型的功能性蛋白衍生物，包括全长或截短的HPV L1蛋白的突变体，例如缺失、取代或插入突变体。合适的衍生物还包括密码子优化的序列。L1蛋白或衍生物也可以是一种融合蛋白，例如L1蛋白与L2或某种早期蛋白的融合体。优选地，融合蛋白包含来源于单一HPV基因型的蛋白。不优选其中来源于一种基因型的L1蛋白与来源于另外基因型的L1蛋白连接形成的嵌合L1蛋白构成的VLPs。
L1蛋白或功能性蛋白衍生物适合于形成VLP，并且可以通过标准技术，例如，举例来说，电子显微镜检查和动态激光光散射技术来评价VLP的形成。
优选地，VLPs的多分散性小于0.15，最优选小于0.1，并且，当在如本文所述的条件下，采用Malvern Zetasizer 3000HS来测量时，更优选地为小于0.08。
在下文中，除非特别说明或上下文中明显地显示出，使用术语‘蛋白’或参考特定蛋白，如参考‘L1’是要包括参考功能性蛋白衍生物。
在本发明的优选方面，本发明中的疫苗仅有4种VLP类型-HPV16、HPV 18、HPV 31和HPV 45VLPs。优选地VLPs为来源于该4种基因型中的每一种的唯有L1的VLPs。
备选地，并且最优选地，所述疫苗包括一附加的HPV效价，从而制成五价疫苗。优选地，附加的效价为包括L1蛋白或如上文所述的来源于HPV 52，53，58，33，35，56和59之一的功能性衍生物的VLP。优选地，当所述的疫苗在南美洲使用时，第五种基因型为HPV 33；当所述疫苗在亚洲使用时，第五种基因型为HPV 52，53或58。
本发明同样扩展至包含2个或更多个附加效价的疫苗，从而提供具有6种或更多种基因型的疫苗。
在一优选的实施方式中，所述组合排除了来自HPV 6a，6b或HPV11基因型的VLPs。
优选地，本发明中的疫苗在宫颈癌预防中至少有55％的效果，更优选地有60％，65％，70％，75％，优选有80％或更高的宫颈癌预防效果。为了避免疑问，本发明的预防宫颈癌的％有效率是指防止发生由HPV感染诱导的所有的宫颈癌的保护作用，并不单指防止发生由一种基因型导致的癌症的保护作用。虽然优选疫苗在2、3、4、5或更长的年限中具有相同的效果，但可以在初次接种后的1年后合适地评估其预防效果。通过选择合适的HPV基因型使疫苗制剂靶向特定的部位，可以增加％有效率。
优选地，疫苗内的VLPs组合不降低每一VLP类型的免疫原性。特别优选地，本发明的组合中的HPV与VLPs之间不存在相互干扰，由此本发明中的联合VLP疫苗能提供针对疫苗中呈现的每一HPV基因型感染的有效的保护作用。针对联合疫苗中的特定VLP型的适当的免疫应答，应当至少等于单独测定该VLP类型引起的免疫应答的50％，优选100％或大体上100％。为了对HPV 16和HPV 18VLPs产生应答，本发明的联合疫苗优选地引发联合HPV 16/HPV 18VLP疫苗所引发的应答的至少50％。本发明的疫苗产生的合适的免疫应答为其中每一VLP类型的保护效果仍可见的水平。可适当地测量免疫应答，例如如此处所示的通过抗体应答。
本发明的疫苗可用于治疗或预防HPV感染和/或疾病。例如，该疫苗可用于治疗性地减少导致宫颈癌或CIN III后遗症的病毒负载和/或感染。因此，本发明涉及本发明的疫苗在治疗性治疗与HPV感染相关的疾病和在预防感染或疾病中的应用。本发明还涉及本发明中的VLP组合在产生抗HPV 16，18，31和45的免疫应答中的应用。
任选地，本发明中的疫苗可采用能提供抗生殖性疣保护的VLPs来配制，例如用含有来源于HPV 6a，6b和/或HPV 11基因型的L1蛋白的VLPs来配制。
优选地，所述的VLPs仅含HPV L1蛋白，且不含L2蛋白或蛋白片段。
本发明中的疫苗除了含有L1蛋白或其衍生物外，还可含有其他蛋白或蛋白片段。蛋白/肽可与VLP中的L1蛋白一起呈嵌合体形式来给药，其被包裹在VLP中或与VLP′s共同配制成混合物的形式。其他蛋白或肽也可与本发明中的疫苗共给药。
在一个方面中，所述疫苗包含HPV L2蛋白或L2衍生物，比如L2肽，举例来说如K.Kawana等在Vaccine 19，(2001)p1496-1502中所公开的，在此也并入参考。在进一步的优选实施方式中，本发明的疫苗可采用HPV早期抗原，比如E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，E8或其免疫活性衍生物来进行配制。当以嵌合体形式给药时，优选地采用早期抗原的约30-60个氨基酸的免疫原性片段。
任选地，所述疫苗也可采用非-HPV抗原来配制或共给药。合适的这些抗原可提供针对其他疾病的保护，最优选地为性传播疾病例如单纯疱疹病毒、衣原体和HIV。我们特别优选所述疫苗包括HSV的gD或其截短片段，优选gD2t蛋白，如WO 9945957中所述。以这种方式，所述疫苗提供了抗HPV和HSV两者的保护。优选如WO9916884和WO/0154719所述的HIV抗原。
本发明一般涉及含有来源于HPV16，18，31和45的衣壳蛋白的VLPs，如唯有L1的VLPs的混合物。
在一特别优选的实施方式中，本发明提供了一种合有HPV16VLPs、HPV18VLPs、HPV 31VLPs和HPV 45VLPs混合物的疫苗。
例如此处引用‘HPV 16VLP’，就是引用L1VLP，其中的L1蛋白或L1衍生物来源于HPV 16。引伸来说，相同的命名原则适用于此处所述的其他VLPs，例如HPV 18、HPV 31和HPV 45VLPs。
优选地，每一VLP含有仅来源于1种HPV基因型的L1蛋白。这样的疫苗可通过生产来源于HPV 16，18，31和45的单独的VLPs，并随后将该VLPs组合来配制。优选地，除了L1外，在VLP中没有其他的HPV蛋白。
含有仅来源于一种HPV基因型的VLPs也是优选的，例如含有来源于HPV 16的L1和L2的VLPs。
但是，在本发明的备选的实施方式中，VLPs可以是混合的VLPs，混合的VLP含有来源于一种基因型的L1蛋白与来源于第二种基因型的L1蛋白的组合，其中不同的L1蛋白不是嵌合体L1蛋白，但其在同一衣壳结构中相互结合形成免疫原性VLPs。
优选的组合包括基因型16，18，31和45的任意组合排列-例如，本发明可包括混合的HPV 16/HPV 18 VLP与混合的HPV31/HPV 45 VLP的组合，或混合的16/31 VLPS与混合的18/45 VLPs的组合。同时也可考虑在1种VLP中的多于2种的L1基因型的组合。
如本文中的实施例所示，可通过个别的L1蛋白的独立表达，并随后组合形成VLPs来生产混合的VLPs。可选地，多种L1蛋白可经一个或多个DNA构建体，在同一细胞内表达。例如，每一载体编码不同L1蛋白的多重DNA构建体可被转化或转染至宿主细胞。可选地，可采用携带多重L1基因的单个载体，其中所述基因受同一启动子或多个单独启动子的调控。适当的话，也可将IRES元件组装至载体中。采用这种表达方式，可共同纯化共表达的L1蛋白以用于随后的VLP形成，或共表达的L1蛋白可自发地形成能随后被纯化的混合VLPs。
当采用混合的VLPs时，优选的混合VLP的生产方法包括：从不同的乳头瘤病毒基因型制备VLP L1蛋白或其衍生物，例如L1蛋白；如果需要，混合该蛋白并装配该蛋白从而产生混合的VLPs。混合前L1蛋白可以是粗提物形式、部分纯化的或纯化形式。优选地，在被组合前，所述蛋白至少被部分地纯化。任选地，在组装后可进一步纯化所述的混合VLPs。当采用附加抗原时，则这些抗原可在适当的情况下添加。
在一具体的实施方式中，通过分解2个或多个VLPs，并在重组装前的任何合适的时间点，将该分解的VLP组分组合成混合VLPs。当L1蛋白，例如在一些酵母菌株中发生表达时，在VLPs自发形成的情况下，该方法较为合适。当L1蛋白的表达不能导致VLP的自发形成时，L1蛋白或壳粒的制剂可在装配成为VLPs前进行组合。
通过除去还原剂通常可实现VLPs的组装。比如，在混合VLP的生产中，优选地，在从蛋白混合物中除去还原剂前进行蛋白混合。优选地，混合VLPs的生产包括在允许VLPs形成的条件下，通过从混合物中除去还原剂而从分解的L1蛋白混合物中完成混合VLP形成的步骤。
优选地，重组装步骤在去除还原剂，如β-氢硫基乙醇后完成。
不过，目前已知VLP的形成依赖于pH、金属离子和盐浓度以及还原剂的存在。由于这样，在特定的环境下，可以设想，VLPs可在还原剂存在的情况下形成。对于本发明来说唯一重要的是，来源于不同基因型的蛋白的混合是在允许混合VLPs形成的环境条件改变之前发生的，不论其是pH、金属离子、盐浓度、还原环境或这些的组合。
当采用混合VLPs时，优选地将VLPs组分按其在最终的混和VLP中的所需比例混合。例如，相同量的部分纯化的来源于HPV 16和HPV18的L1蛋白混合物提供了一种具有大约相等量的各蛋白的混合VLP。
通过本领域已知的成分，可使包含混合VLPs的疫苗溶液保持稳定，如WO9844944、WO0045841中所述，在此并入参考。
对于本发明的所有疫苗，优选地，所述疫苗用于接种10-15岁，优选10-13岁的处于青春期的女孩。所述疫苗也可给药至子宫颈涂片检查异常或接受由HPV导致的损伤切除手术后的妇女。
优选地，所述疫苗以2次或3次剂量的接种方案来进行接种，例如，0，1月的接种方案，或0，1，6月的接种方案。合适的疫苗接种方案包括5到10年后的加强注射，优选地为10年。
尽管所述疫苗可被冷冻干燥和在给药前重新配制，优选地，所述疫苗为一种液体疫苗制剂。
本发明的疫苗还可含有与VLPs组合的佐剂。合适的本发明中的VLPs与铝组合使用，并且适合吸附或部分地吸附于铝佐剂的表面。同样优选的佐剂为那些能刺激Th1类型应答的佐剂，例如3DMPL或QS21。合适的佐剂为铝盐，优选地与3DMPL联合使用，比如磷酸铝和3D-MPL。
一种优选的佐剂为氢氧化铝，其中氢氧化铝与3D-MPL的组合特别优选。
当VLPs被吸附至含铝的佐剂表面时，优选地在VLPs混合形成最终疫苗产物前添加所述佐剂。
所述疫苗还可含有铝或铝化合物作为稳定剂，并且本发明也涉及其中VLPs被吸附至铝盐表面的稳定的联合疫苗。适当地，VLPs在吸附至铝盐表面后比在不存在铝的情况下更能保持长时间稳定。优选地可根据实施例1 C3部分的方法来获得或可获得稳定的VLPs。
本发明中的疫苗可采用多种途径中的任意一种来给药，例如口服的、局部的、皮下的、粘膜的(典型为阴道的)、静脉内的、肌肉内的、鼻内的、舌下的、真皮内的和经栓剂方式。优选肌肉内的和真皮内的给药方式。
VLP和其他蛋白的剂量将根据条件变化而变化：性别、个体的年龄和体重、给药途径和疫苗的HPV。其数量同时也根据VLP类型的数目而变化。适当地，所述给药为施用一定量的适合产生免疫保护性应答的VLP。适当地，每一疫苗剂量包括1-100μg的各VLP，优选5-80μg，更优选5-30μg的各VLP，最优选5-20μg的各VLP，其中5μg，6μg，10μg，15μg或20μg是特别优选的。
本发明的多价疫苗可通过混合纯化的L1 VLPs来合适地生产。生产L1 VLPs的方法为本领域已知的方法，其包括例如WO9531532，WO9615247，WO0009671和US5888526中所记载的方法，其全部内容在此并入参考。
合适地，本发明的VLPs是通过VLPs的分解和重组装产生均一的和纯的VLPs来制备的。WO0057906，US6245568和WO9913056提供了恰当方法的实施例。
虽然也可采用任何合适的细胞，例如大肠杆菌或酵母细胞，比如，酿酒酵母(S.cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(S.pombe)或毕赤酵母(Pich ia sp.)，但是优选地，VLPs通过昆虫细胞，例如Sf9或Hi-5细胞来制备。
优选地，在L1表达后的VLPs纯化包括一步或多步阴离子交换色谱(二甲基氨基乙基-DMAE)、阴离子交换色谱(三甲基氨基乙基-TMAE)、羟基磷灰石色谱、过滤，如纳米过滤或超滤、或疏水相互作用色谱。优选地，在纯化过程中实施至少一步阴离子交换步骤，更优选地采用两步阴离子交换步骤。优选地，在蛋白混合前，至少实施一步阴离子交换纯化步骤。任选地，可采用一UV照射步骤。
为了避免疑问，全部引述文件的教导均在此并入参考。
本发明通过下述非限制性的实施例和附图进行举例说明，其中：
图1说明了经电镜评估，混合的VLPs与HPV 16VLPs的比较；
图2和3说明了混合VLPs的大小分布；
图4说明了针对在混合的HPV 16，18，31，45联合疫苗中的VLP16与HPV 16对照相比的抗体应答；
图5说明了针对在混合的HPV 16，18，31，45联合疫苗中的VLP18与HPV 18对照相比的抗体应答；
图6说明了针对在混合的HPV 16，18，31，45联合疫苗中的VLP31与HPV 31对照相比的抗体应答；和
图7说明了针对在混合的HPV 16，18，31，45联合疫苗中的VLP45与HPV 45对照相比的抗体应答。
实施例1
在此详述了HPV 16和HPV18 L1 VLPs的组合。来源于其他HPV基因型的L1蛋白可容易地采用本领域已知的类似的方法来生产。
A  HPV 16/18 L1 VLPs的制备
HPV 16和HPV 18 VLPs的生产可采用标准的方法来进行-例如，参见WO9913056。HPV16/18蛋白在经编码感兴趣的HPV 16或18 L1基因的重组杆状病毒(0.3的MOI)感染的拟尺蠖(Trichoplusia ni)(High FiveTM)细胞(密度为约350000细胞/ml)中表达。在感染后约72小时收获细胞。
B细胞收获/抗原提取
通过一种浓缩、抽提、澄清的三步法，从Hi5细胞中提取抗原(L1-16/18)。浓缩步骤包括除去至多90％的培养基，并通过切向流过滤来进行。提取步骤用低渗缓冲液(Tris 20mM，pH 8.5)进行。与培养物等体积的缓冲液用于提取步骤。在平稳搅动的情况下，采用最小半小时的接触时间。通过切向流过滤来进行澄清。
C纯化
在室温下进行纯化步骤。对于两种抗原L1-16/18，为了将VLP′s分解成壳粒，向提取物中加入β-氢硫基乙醇(4％w/w)。在添加β-氢硫基乙醇之前，加入甘油至浓度最高为w/w 10％。
在2℃-8℃下储存前，将所有使用的缓冲液均采用0.22μm的过滤器进行过滤。在进行每步纯化前，在加样前需消毒凝胶基质并采用适当的缓冲液来平衡。
为了从HPV16和18中分别纯化L1，提出了纯化方案。这些方案大致类似，并包括如下步骤：
阴离子交换色谱(二甲基氨基乙基-DMAE)，
阴离子交换色谱(三甲基氨基乙基-TMAE)，
羟基磷灰石色谱，
纳米过滤(Planova)，
超滤，
针对HPV 18采用疏水相互作用色谱(采用辛基琼脂糖凝胶)或针对HPV 16采用阴离子交换色谱(DMAE)；和
除菌过滤。
特别地：
C1 L1-18抗原的纯化
阴离子交换色谱DMAE
将澄清的提取物(约1g/ml浓度的蛋白，其L1蛋白为约150mg/ml)加样至阴离子交换柱(二甲基氨基乙基)。采用(Tris 20mM|NaCl200mM|4％的β-氢硫基乙醇BME)缓冲液，在pH 7.9±0.2条件下进行洗脱。在约5倍柱体积的情况下洗脱抗原，并在280nm条件下检测洗脱图谱。
阴离子交换色谱TMAE
采用1体积的H2O/BME 4％来稀释第一步的洗脱物。然后将稀释的洗脱物加样于第二阴离子交换柱上(三甲基氨基乙基)。采用(Tris20mM|NaCl 200mM|4％BME)缓冲液，在pH7.9±0.2条件下进行洗脱。在约4倍柱体积的情况下洗脱抗原，并在280nm条件下检测洗脱图谱。
羟基磷灰石色谱
TMAE步骤的洗脱物被加样至羟基磷灰石(HA)柱。
当样品加样后，采用约2.5倍柱体积的(NaH2PO4 100mM|NaCl30mM|4％BME)缓冲液，在pH 6.0±0.2条件下来洗脱凝胶。
纳米过滤(Planova)
稀释HA洗脱物，从而达到如下条件：(NaH2PO4 25mM|NaCl 10mM|4％BME)的缓冲液，pH 7.5±0.2。
然后将其依次在0.2μm的预过滤器和0.12m2的Planova 15N过滤器上过滤。过滤在恒定压强200毫巴±20毫巴下进行。
超滤
采用装有聚醚砜膜(Centramate盒0.1m2，100kD)的切向流超滤系统来进行超滤。
处理Planova洗脱物，从而达到如下条件：(NaH2PO4 100mM|NaCl30mM|4％BME)的缓冲液，pH 6.0±0.2；然后将其加样至该系统中，浓缩5倍，并通过连续地注入大约10倍于开始体积的(NaH2PO420mM|NaCl 500mM)的缓冲液，pH 6.0±0.2，来进行渗滤。
疏水相互作用色谱(辛基琼脂糖凝胶)
将超滤渗透物加样于辛基琼脂糖凝胶柱上。
该色谱步骤以反向方式进行，采用约5倍柱体积的(NaH2PO420mM|NaCl 500mM)的缓冲液，pH 6.0±0.2。
除菌过滤
通过在一0.22μm的膜上过滤来对纯化的L1-18抗原溶液进行除菌。
C2 L1-6抗原的纯化
阴离子交换色谱DMAE
将澄清的提取物加样至阴离子交换柱(二甲基氨基乙基)。
采用(Tris20mM|NaCl 180mM|4％BME)缓冲液，在pH 7.9±0.2条件下进行洗脱。在约4倍柱体积的情况下洗脱抗原，并在280nm条件下监测洗脱图谱。
阴离子交换色谱TMAE
采用1体积的H2O/BME 4％来稀释第一步的洗脱物。然后将稀释的洗脱物加样于第二阴离子交换柱上(三甲基氨乙基)。采用(Tris20mM|NaCl 180mM|4％BME)缓冲液，在pH 7.9±0.2条件下进行洗脱。在约5倍柱体积的情况下洗脱抗原，并在280nm条件下监测洗脱图谱。
羟基磷灰石色谱(HA)
将TMAE步骤的洗脱物加样至羟基磷灰石HA柱。
当样品加样后，采用约3倍柱体积的(NaH2PO4 100mM|NaCl 30mM|4％BME)缓冲液，在pH 6.0±0.2条件下来洗脱凝胶。
纳米过滤(Planova)
稀释HA洗脱物，从而达到如下条件：(NaH2PO4 25mM|NaCl 10mM|4％BME)的缓冲液，pH 7.5±0.2。
然后将其依次在0.2μm的预过滤器和0.12m2的Planova 15N过滤器上过滤。在恒定压强200毫巴±20毫巴下进行过滤。
超滤
采用装有聚醚砜膜(Centramate盒0.1m2，100kD)的切向流超滤系统来进行超滤。
处理Planova洗脱物，从而达到如下条件：(NaH2PO4 100mM|NaCl30mM|4％BME)的缓冲液，pH 6.0±0.2；然后将其加样至该系统中，浓缩5倍，并通过连续地注入10倍于开始体积的(NaH2PO4 20mM|NaCl500mM)的缓冲液，pH 6.0±0.2，来进行渗滤。
阴离子交换色谱DEAE
调节超滤洗脱物至平衡缓冲液(Na3PO4 20mM|NaCl 250mM)，pH6.0±0.2的电导率，并将其加样至阴离子交换柱(二乙基氨基乙基)。
采用(NaH2PO4 20mM|NaCl 500mM)缓冲液，在pH 6.0±0.2的条件下进行洗脱。在约3倍柱体积的情况下洗脱抗原，并在280nm条件下监测洗脱图谱。
除菌过滤
通过在0.22μm的膜上过滤来对纯化的L1-16抗原溶液进行除菌。
C3
单独地吸附每一VLP类型从而获得浓缩的吸附的单价物。
制备VLP16的浓缩吸附单价物：
来源于HPV16的60μg的纯化VLPs，在pH 6.0±0.2的条件下，经室温下温和搅拌1小时，被吸附至来源于Al(OH)3的150μg的Al3+上。将该浓缩吸附的单价物保存于+4℃下。通过离心该制剂和测量上清中的VLPs来检验吸附情况。
制备VLP18的浓缩吸附单价物：
来源于HPV18的60μg的纯化VLPs，在pH 6.0±0.2的条件下，经室温下温和搅拌1小时，被吸附至来源于Al(OH)3的150μg的Al3+上。将该浓缩吸附的单价物保存于+4℃下。通过离心该制剂和测量上清中的VLPs来检验吸附情况。
D最终疫苗的制备：
将通过上述方法制备的浓缩吸附单价物组合形成每剂含有20μg每种VLP的悬浮液。将最终疫苗保存于+4℃下。
以每种VLP 20μg的浓度添加来源于HPV31和45的VLPs，从而制成4价疫苗。
联合吸附的整批物质，或单个吸附的整批物质可进一步与佐剂，例如3D-MPL混合。
实施例2
A HPV16/18 L1 VLPs的制备
采用上述的标准方法生产HPV 16和HPV 18VLPs。
B混合VLPs的形成
本发明的方法涉及HPV16和18VLPs的分解和重组装，从而HPVL1 16和18的重组装在一起发生从而允许混合VLP的形成。
可以在上述方法中的VLPs重组装的时间点前的任何合适的时间点将HPV16和18VLPs混合。
例如，测定了2种特异性的方案：
1.在HA步骤后混合两种抗原。基于在HA库中的L1浓度，混合该两种组分，使HPV16和18达到相等的浓度，进而开始超滤步骤。在这种情况下，在超滤步骤后，如HPV 18纯化那样进行一辛基琼脂糖凝胶步骤；随后，按照在HPV 16方法中的操作方式进行DEAE步骤。
2.混合两种提取物并进行共纯化。基于在提取物中的L1浓度，混合该二种效价物，使HPV16和18达到相等的浓度，进而开始DMAE步骤。再一次，在超滤步骤后，如HPV 18那样进行一辛基琼脂糖凝胶步骤；随后如HPV 16方法中的操作方式进行DEAE步骤。
HPV16-HPV18 VLP-在超滤步骤中的混合
Figure C0380634700161
HPV16-HPV18 VLP-在DMAE步骤中混合
采用相同的流程表，只不过混合是在DMAE步骤中而不是超滤步骤中进行的。在阴离子交换DMAE TMAE步骤中用于洗脱的浓度为200mM。
结果
HPV16-HPV18 VLP-在超滤步骤混合
通过组合HPV 16和HPV 18L1蛋白，产生了2批混合VLPs(批号为31b165c和31b166c)。
SDS-Page纯化
混合VLPs的纯度与“经典的”HPV 16或HPV 18整批物质相同。整批物质的纯度高于95％。
EM数据-图1
将31B165C的电镜照片(成熟后的超滤保留物)与经典的HPV 16(批次39B122c)作了比较。很好地形成VLPs，大小均一，无聚集；在两个实验中均出现了某些壳粒的带。
大小分布
采用Malvern Zetasizer 3000 HS来确定VLPs的大小分布。
将样品在未稀释的情况下置于塑料比色杯中测量，用于Malvern分析(800μl/比色杯)。
采用的技术条件为：
-激光波长：532nm，
-激光功率：50mW，
-在90°处检测散射光，
-温度：25℃，
-持续时间：通过软件自动确定
-次数：3次连续的测量，
-z-平均直径：通过累积分析，
大小分布：通过Contin方法测定。
HPV18L1-VLP′s的经典结果是：70-80nm且具有良好的多分散性(＜0.1)
HPV16 L1-VLP′s的经典结果是：60-70nm且具有良好的多分散性(＜0.1)
对于混合VLP′s，获得了下述结果：
31 B165c：85nm且具有良好的多分散性(0.08)。在成熟的初期VLP′s差不多完全形成。
31B166c：76nm且具有良好的多分散性(0.08)。
通过动态激光光散射测量的批次31B165c和31B166c的大小分布示于图2和3中。
在DMAE步骤中混合的HPV16-HPV18VLP
从批次E18L1C005(HPV18)和39B167(HPV16)中制备批次号31B167B。
通过SDS-Page测定的纯度
混合VLP′s的纯度与“经典的”整批物质的相同。
整批物质的纯度高于95％。
大小分布
采用Malvern Zetasizer 3000HS来确定VLP′s的大小分布。
HPV18L1-VLP′s的经典结果是：70-80nm且具有良好的多分散性(＜0.1)
HPV16L1-VLP′s的经典结果是：60-70nm且具有良好的多分散性(＜0.1)
对于混合VLP′s，获得了下述结果：
HPV16-HPV18 31B167B：74nm且具有良好的多分散性(0.07)。在成熟的初期VLP′s差不多完全形成。
实施例3-混合HPV 16，18，31，45联合疫苗的生产
介绍
采用添加有明矾+3D-MPL佐剂的C-末端截短的L1VLPs 16，18，31 & 45的组合物在Balb/C小鼠上进行免疫原性研究(在此‘佐剂A’为50μg铝盐和5μg 3D MPL)
分别在第0和21天对4组每组10只的小鼠进行两次肌肉内免疫，其采用：
1.VLP 31(2μg)/佐剂A
2.VLP 45(2μg)/佐剂A
3.VLP 16(2μg)和VLP 18(2μg)/佐剂A
4.VLP 16(2μg)，VLP 18(2μg)，VLP 31(2μg)，VLP 45(2μg)/佐剂A
在第35天在血清上监测到了针对VLPs 16，18，31和45的抗体应答(剂量II后的第14天)。
结果示于图4-7中
针对VLP16的抗体应答
●用在佐剂A上的VLP18配制的VLP 16(组3)或通过完整的组合(组4)，在II次免疫后的血清中诱导了很强的抗体应答。
●在两组中均检测到了定向的抗VLP 16的类似的抗体水平，并且没有观察到干扰现象。
针对VLP18的抗体应答
●用在佐剂A上的VLP16配制的VLP 18(组3)或通过完整的组合(组4)，在II次免疫后的血清中诱导了很强的抗体应答。
●在两组中均检测到了定向的抗VLP 18的类似的抗体水平(小于1.5倍的差异)，并且没有观察到干扰现象。
针对VLP31的抗体应答
●通过单独采用佐剂A配制的VLP 31(组1)或完整的组合(组4)，在II次免疫后的血清中诱导了很强的抗体应答。
●在两组中均检测到了定向的抗VLP 31的类似的抗体水平，并且没有观察到干扰现象。
抗VLP45的抗体应答
●通过单独采用佐剂A配制的VLP45(组2)或完整的组合(组4)，在II次免疫后的血清中诱导了很强的抗体应答。
●在两组中均检测到了定向的抗VLP 45的类似的抗体水平，并且没有观察到干扰现象。
结论
当4种VLPs(VLPs 16，18，31 & 45)作为组合物给药时，没有观察到干扰现象。

Claims (23)

1.一种包含VLPs的疫苗组合物，其中VLPs包含来源于HPV 16、HPV 18、HPV 31和HPV 45基因型的L1蛋白或功能性的L1蛋白衍生物，其中由疫苗产生的免疫应答处于仍然能观察到每一VLP类型的保护性效果的水平上。
2.一种如权利要求1所述的疫苗，其包含HPV 16VLPs、HPV 18VLPs、HPV 31VLPs和HPV 45VLPs的混合物，其中每一种VLP包含仅来源于1种HPV基因型的L1蛋白或功能性的L1蛋白衍生物。
3.一种如权利要求2所述的疫苗，其中VLPs为包含HPV L1蛋白或功能性的L1蛋白衍生物且不包含其他HPV蛋白的唯有L1的VLPs。
4.一种如前述任意一项权利要求所述的疫苗组合物，其包含基本上仅由来源于HPV 16、HPV 18、HPV 31和HPV 45的蛋白组成的VLPs。
5.一种如前述任意一项权利要求所述的疫苗组合物，其中至少一种L1蛋白为截短的L1蛋白。
6.一种如前述任意一项权利要求所述的疫苗组合物，其中所述组合物包括含有来源于附加的HPV基因型的L1蛋白或其功能性衍生物的VLP。
7.一种如权利要求6所述的疫苗组合物，其中附加的VLP包含选自HPV 33，52，53，58，35，56和59之一的L1蛋白或功能性L1蛋白衍生物。
8.一种如前述任意一项权利要求所述的疫苗组合物，其对预防宫颈癌至少有60％的有效性。
9.一种如前述任意一项权利要求所述的疫苗组合物，其另外包含选自E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7或E8的HPV早期抗原或其免疫活性片段。
10.一种如前述任意一项权利要求所述的疫苗组合物，其采用来源于能导致性传播疾病的生物体的抗原进行配制。
11.一种如权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述抗原为HSV抗原或其免疫活性片段。
12.一种如权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述抗原为HIV抗原或其免疫活性片段。
13.一种如权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述抗原为衣原体抗原或其免疫活性片段。
14.一种如前述任意一项权利要求所述的疫苗组合物，其含有HPV L2蛋白或其片段。
15.一种如前述任意一项权利要求所述的疫苗组合物，其另外含有一种佐剂。
16.一种如权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述的佐剂为铝盐。
17.一种如权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述的铝盐为氢氧化铝。
18.一种如权利要求16或17所述的疫苗组合物，其另外含有3D-MPL。
19.一种如权利要求1-18中任意一项所述的疫苗组合物，其中VLPs含有非嵌合体L1蛋白。
20.一种生产疫苗的方法，所述方法包括把包含来源于HPV 16、HPV 18、HPV 31和HPV 45的L1蛋白或功能性的L1蛋白衍生物的VLPs混合，从而形成如权利要求1-19中任意一项所述的疫苗。
21.包含L1蛋白或其功能性衍生物的HPV 16、HPV 18、HPV 31和HPV 45VLPs的混合物在制备用于预防或治疗与HPV感染相关的疾病的疫苗中的应用。
22.一种包含权利要求1-18中任意一项所述的疫苗的稳定的疫苗组合物，其中在混合前将来源于HPV 16，18，31和45的VLPs吸附于氢氧化铝的表面。
23.如权利要求1-22中任意一项所述的疫苗组合物、方法或应用，其中疫苗中的抗特定的VLP类型的免疫应答至少为单独测量时同一VLP类型引起的应答的50％。
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