DK169953B1 - Rekombinant plasmid bærende et Hepatitis B virus-overfladeantigen, transformeret gærcelle samt fremgangsmåde til fremstilling af Hepatitis B virus-overfladeantigen - Google Patents
Rekombinant plasmid bærende et Hepatitis B virus-overfladeantigen, transformeret gærcelle samt fremgangsmåde til fremstilling af Hepatitis B virus-overfladeantigen Download PDFInfo
- Publication number
- DK169953B1 DK169953B1 DK372183A DK372183A DK169953B1 DK 169953 B1 DK169953 B1 DK 169953B1 DK 372183 A DK372183 A DK 372183A DK 372183 A DK372183 A DK 372183A DK 169953 B1 DK169953 B1 DK 169953B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- gene
- yeast
- plasmid
- recombinant plasmid
- dna
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 90
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title claims description 51
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 32
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 108
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 67
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 60
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 40
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 31
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 claims description 26
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 16
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 16
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 101100479039 Caenorhabditis elegans aars-1 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 10
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 10
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 claims description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 claims description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 6
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 5
- 101710167911 Repressible acid phosphatase Proteins 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 8
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100298224 Arabidopsis thaliana POT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010089921 CTCGAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000035888 Immune-mediated thrombotic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101100285000 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 101150015939 Parva gene Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Description
i DK 169953 B1
Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt rekombinant plasmid, der indeholder DNA-sekvenser fra gær, DNA-sekvenser, der hidrører fra Escherichia coli-plasmid og en DNA-sekvens, der koder for Hepatitis B virus-overfladeantigen, hvor sekvenserne fra gær omfatter 5 ars 1 samt 2μ ori, hvilket plasmid er ejendommeligt ved, at DNA- sekvensen, der koder for Hepatitis B virus-overfladeantigen er under kontrol af ekspressionskontrolområdet af det represserbare sure phosphatasegen fra gær, en transformeret gærcelle som fremstilles ved at transformere en gærcelle med det rekombinante plasmid, og en 10 fremgangsmåde til fremstilling af Hepatitis B virus-overfladeantigen, som er ejendommelig ved, at den transformerede gærcelle dyrkes i et medium, og det dannede antigen indsamles på sædvanlig måde. Opfindelsen angår især et rekombinant plasmid, der fås ved at indsætte genet for hepatitis B virus (HBV) overfladeantigen (i det følgende benævnt 15 "HBs-antigen", "HBsAg" eller "s-antigen") i en shuttle-vektor, der kan replikere i såvel Escherichia coli og gær, neden for ekspressionskontrolområdet for det represserbare sure phosphatasegen (dette område benævnes i det følgende "sur phosphatasepromotor" eller "surt phosphatasegen"), som bæres på vektoren, en gærcelle, som er trans-20 formeret med det rekombinante plasmid, og en fremgangsmåde til fremstilling af et immunologisk aktivt HBs-antigen (HBsAg), som omfatter dyrkning af den transformede gærcelle i et hensigtsmæssigt medium under sådanne betingelser, at den sure phosphatasepromotor ikke represseres.
25 Hepatitis-B, der sædvanligvis opstår ved transfusion af blod fra HBV-positive patienter eller andre, er vanskelig at helbrede, og der findes ikke noget lægemiddel, som egner sig til fuldstændig helbredelse deraf. Den mest hensigtsmæssige profylakse er en vaccine, der består af HBs-antigen. Det er imidlertid meget vanskeligt at frem-30 stille HBsAg-vaccine i industriel målestok, fordi HBV kun er smitsomt for mennesker og chimpanser (det er aldrig lykkedes at fremstille cellekulturer inficeret med HBV), og som følge af denne specificitet af HBV kan HBsAg kun fås fra humant blodserum.
Det er for nylig blevet foreslået at fremstille HBsAg i E. coli ved 35 hjælp af rekombinant DNA i stedet for at anvende humant blodserum (jfr. japansk offentliggørelsesskrift nr. 104.887/1980). I henhold 2 DK 169953 B1 til denne metode, hvor der gøres brug af E. coli, er det imidlertid stadig vanskeligt at fremstille det ønskede HBsAg i industriel målestok, fordi det dannede HBsAg let nedbrydes i E. coli-cellerne, og yderligere vækst af E. coli inhiberes af det dannede HBsAg, hvilket 5 fører til en nedsat produktion af HBsAg.
For ganske nylig er det beskrevet, at HBs-antigenpartikler med held er blevet fremstillet i gær (jfr. Nature, 298, 1982, s. 347-350). I denne rapport beskrives rekombination af et gen, som indkoder et HBs-protein, med en E. coli-gær shuttle-vektor neden for en alkoholdehy-10 drogenase I (ADH1)-promotor, der sædvanligvis anvendes ved fremstilling af interferon i gær. Ved denne metode er mængden af fremstillet HBs-protein imidlertid meget lille (2-5 μg pr. 200 ml gærkultur) sammenlignet med fremgangsmåden i henhold til nærværende opfindelse, og det er derfor ikke tilfredsstillende at fremstille det ønskede 15 HBs-antigen i industriel målestok.
I Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1979, side 2157-61 er der beskrevet et plasmid, der kan replikere i både E.coli og gær, og som indeholder genet for sur phosphatase under kontrol af ekspressionskontrolområdet fra sur phosphatase, men der er ikke antydet noget om at rekombinere 20 til det rekombinante plasmid ifølge nærværende opfindelse til ekspression af HBs-antigenet.
Nærværende opfindere har grundigt undersøgt mulighederne for at udvikle en forbedret metode til fremstilling af HBsAg i industriel målestok. Som følge heraf har det vist sig, at det ønskede HBsAg kan 25 fremstilles i stor målestok ved at rekombinere et gen for HBs-antigen med en specifik plasmidvektor, som har et gærgen og et E. coli-gen, og som bærer det represserbare sure phosphatasegen fra gær, inklusive phosphatasepromotoren, transformere en gærcelle med det således vundne rekombinante DNA og dyrke den transformerede gærcelle, og det 30 således vundne HBsAg har de samme immunologiske egenskaber som HBsAg, der stammer fra humant blodplasma.
Et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et ^ hidtil ukendt rekombinant plasmid, i hvilket der er indsat et gen for HBs-antigen. Et andet formål med opfindelsen er at tilvejebringe en 3 DK 169953 B1 transformeret gærcelle, der fremstilles ved at transformere en gærcelle med det ovennævnte hidtil ukendte rekombinante plasmid. Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af HBsAg i industriel målestok.
5 Det rekombinante plasmid bærende et HBV-gen ifølge opfindelsen fås ved at anvende en shuttle-vektor, som både har et E. coll-gen og et gærgen og kan replicere i begge, og ved at rekombinere et gen for HBs-antigen i vektoren neden for den sure phosphatasepromotor, som bæres på vektoren, hvorved hele strukturgenet for sur phosphatase 10 eller et bestemt område oven for phosphatasestrukturgenet fortrinsvis slettes. Den transformerede gærcelle fremstilles ved at transformere en gærcelle med det således vundne plasmid, som udtrykker HBs-genet, på kendt måde. Det ønskede HBs-protein kan fremstilles ved at dyrke den transformerede gærcelle i et hensigtsmæssigt medium, fortrinsvis 15 under sådanne betingelser, at den sure phosphatasepromotor ikke represseres.
Det rekombinante plasmid, den transformerede gærcelle og fremstilling af HBsAg ved hjælp af en transformeret gærcelle beskrives i detaljer nedenfor.
20 1) HBV-Gen
Det HBV-gen, som skal indsættes i shuttle-vektoren, er et HBV-DNA af undertypen adr, som ofte forekommer i Japan og i sydøstasiatiske lande, og som klones af E. coll. HBV-DNA'et indeholder et genkendelsessted for hvert af restriktionsenzymerne Ihol og BamHI. Dette 25 fragment, fx et fragment med et Xhol-sted ved den ende, der fås ved at digerere med Xhol, har en struktur som vist i fig. 1, hvor HBs-genet og HBc-genet findes i samme retning.
Som vist i fig. 1 indledes den HBs-kodende sekvens ved det 28. nucle-otid fra 5'-enden, når der spaltes med Xhol, og omfatter en nucleo-30 tidsekvens, der svarer til 226 aminosyrer, og et HBc-gen neden for dette i samme retning. Når dette fragment af HBs-genet (HBV-DNA med en længde på 3,2 kb) behandles med BanMl, deles det i et fragment (med en længde på ca. 1,3 kb), der indeholder et HBs-gen, og et 4 DK 169953 B1 fragment (med en længde på ca. 1,9 kb), der indeholder et HBc-gen. 4
Dette HBs-gens nucleotidsekvens er blevet bestemt af nærværende opfindere og er som vist i fig. 2. (DNA-Sekvensen for HBV-genet af undertypen adw, der ofte forekommer i europæiske lande og U.S.A., er 5 allerede kendt). Både HBs-genet og HBc-genet har ikke nogen mellemliggende sekvens. I fig. 2 betegner den øverste linje nucleotidse-kvensen af et område for bestemmelse af "s"-antigen, og den nederste linje betegner en aminosyresekvens, som indkodes deraf, og det tal, der er anført oven for nucleotidsekvensen, betegner antallet af 10 aminosyrer fra "s-"antigenets N-terminal. De tre linjer nedenfor betegner henholdsvis data for ad/yw-typen (analyseret af Pasek et al., Nature 282, 1979, s. 575-579), adw-typen (analyseret af Valenzuela et al., Nature 280, 1979, s. 815-819) og ayw-typen (analyseret af Charnay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1979, s. 2222-15 2226).
HBV-DNA'et fremstilles på følgende måde.
Viruspartikler (Dane-partikler) isoleres fra blodet af en person, som har et HBe-antigen, på kendt måde. HBV-DNA'et (3.200 bp) har sædvanligvis en dobbeltstrenget cirkulær struktur, men ca. 15-50% af dets 20 områder er enkeltstrengede. For at omdanne de enkeltstrengede områder til dobbeltstrengede områder, der egner sig til kloning af genet, behandles det derfor med en endogen DNA-polymerase ved den af Sattier og Robinson beskrevne metode (jfr. F. Sattier & W.S. Robinson, "Hepatitis B-viral DNA molecules have cohesive ends", Journal of Virology 25 32, 1979, s. 226-233). Efter omdannelse af alle områder til dobbelt strengede DNA ekstraheres DNA'et og ampliflceres ved kloning i E. coli og behandles derefter med et hensigtsmæssigt restriktionsenzym, hvorved fås et fragment, som anvendes til konstruktion af det ønskede plasmid.
30 HBV-DNA'et er fortrinsvis af undertypen adr, der ofte observeres i Japan og andre sydøstasiatiske lande, men kan være HBV af undertypen adw og ayw, som ofte observeres i europæiske lande og U.S.A.
5 DK 169953 B1 2) Shuttle-vektor
Den shuttle-vektor, der anvendes i nærværende opfindelse, er en plasmidvektor, der indeholder både gærgen og E. coli-gen, og som bærer det represserbare sure phosphatasegen fra gær, fx Saccharomyces 5 cerevisiae.
Gærgenet omfatter en DNA-sekvens, som er nødvendig for replikation af et plasmid i gær uafhængig af chromosomet, fx en DNA-sekvens, der er nødvendig til autonom replikation af gær (som betegnes "ars 1"), og en DNA-sekvens, som er nødvendig for replikation af 2 μη DNA (som 10 betegnes "2 μοτϊ"), og indeholder eventuelt et gen, som er nyttigt som selektiv markør af den transformerede gær. Den selektive markør omfatter fx et leucindannende gen, et histidindannende gen, et tryp-tophandannende gen, et uracildannende gen, et adenindannende gen eller lignende, der kan anvendes alene eller som en kombination af to 15 eller flere af disse gener.
E. coli-genet indeholder en DNA-sekvens, som er nødvendig for repll-kation af plasmidet i E. coli-celler, fx en DNA-sekvens et repli-kationsindledende område fra plasmidet ColEI, og indeholder fortrinsvis et gen, som er nyttigt som selektiv markør af den transformerede 20 E. coli. Den selektive markør omfatter fx et ampicillinresistensgen, et kanamycinresistensgen, tetracyclinresistensgen, chloramphenicol-resistensgen eller lignende, der kan anvendes hver for sig eller i kombination af to eller flere af disse gener. Almindeligt anvendt Æ.col i.-DNA er pBR322, der indeholder et ampicillinresistensgen og et 25 tetracyclinresistensgen.
Den shuttle-vektor, som anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, er ejendommelig ved, at den bærer den represserbare sure phosphata-sepromotor fra gær. Denne sure phosphatasepromotor er sædvanligvis promotor for et polypeptid på 60.000 dalton (P60), der udgør phos-30 phatasen.
Et repræsentativt eksempel på en shuttle-vektor er en shuttle-vektor, som er fremstillet af nærværende opfindere ved at rekombinere et gær-DNA, som indeholder ars 1, 2 μοτί og et leucindannende gen (Leu 2) 6 DK 169953 B1 som gen fra gær, med et E. coll-plasmid pBR322. Shuttle-vektoren betegnes ”pAT77" og fremstilles på følgende måde.
Et EcoRI - fragment på ca. 8000 nucleotidpar (8 kb), der indeholder et polypeptidgen (P60) på 60.000 dalton, hvilket udgør den represserbare 5 sure phosphatase (jfr. PNAS 77, 1980, s. 6541-6545, og PNAS 79, 1982, s. 2157-2161), indsættes i EcoRI-stedet på det kendte E. coli-plasmid pBR322 (jfr. Sutcliffe, J.G.; Cold Spring Harbor Symposium 43, 1979, s. 77-90), hvorved fås et plasmid, som anvendes som udgangsmateriale. Dette EcoRI-fragment (det 8 kb lange DNA-fragment) indeholder et 10 enkelt genkendelsessted for restriktionsenzymet Sall, der deler fragmentet i et ca. 2,8 kb og ca. 5,2 kb langt fragment, idet ampi-cillinresistensgenet på pBR322 findes i det ca. 2,8 kb lange fragment.
Udgangsplasmidet digereres med restriktionsenzymet Sall og sammen-15 føjes igen med T4 DNA-ligase, hvorved fås et plasmid, som mangler det 5,2 kb lange fragment fra Sall-stedet til det sure phosphatasegen (plasmidet betegnes "pAT25"). pAT25 er et plasmid, der består af et fragment (ca. 3,7 kb langt) fra EcoRI-stedet til Sall-stedet på pBR322, der indeholder ampicillinresistensgenet, og et fragment (ca.
20 2,8 kb langt) fra EcoRI-stedet til Sall-stedet på det sure phosphata segen fra gær, idet begge fragmenter er sammenkoblet ved den tilsvarende ende deraf.
I EcoRI-stedet på det ovennævnte pAT25 indsættes et EcoRI-fragment (1,4 kb langt), som indeholder en DNA-sekvens, som er nødvendig for 25 den autonome replikation i gær (ars 1), og et Trp 1-gen fra gær (jfr.
PMS 76, 1979, s. 1035-1039), hvorved fås et plasmid (med betegnelsen "pAT26"). Ars 1-Trp 1-fragmentet har et enkelt genkendelsessted for restriktionsenzymet Hindlll inde i Trp 1-genet.
I Eindlll-stedet på pAT26 indsættes et Eindlll-fragment, som indehol-30 der et leucindannende gen fra gær (Leu 2) og en DNA-sekvens, som er nødvendig for replikation af 2 pm DNA (2 μοτί) (jfr. Tohe, A., Guer-ry, P., Wichener, R.B., J. Bacteriol. 141, 1980, s. 413-416), hvorved fås den ønskede shuttle-vektor pAT77.
7 DK 169953 B1 pAT77 og pAM82, som er afledt deraf som beskrevet nedenfor, har den i fig. 3 viste struktur. I fig. 3 betegner den tykke linje det gen, som stammer fra E. coli-plasmidet pBR322, og det resterende område er gener fra gær. Nærmere betegnet indeholder pAT77 et fragment fra 5 ÆcoRI-stedet op til Sall-stedet indeholdende ampicillinresistensgenet (Apr) fra pBR322 som E. coli-gener, og et fragment fra ÆcoRI-stedet forbundet med pBR322 op til Sall-stedet gennem ars 1, 2 /zori og Leu 2-gener i den nævnte rækkefølge og videre oven for det sure phospha-tasegen, idet E. coli-genet og gærgenet er forbundet ved fcoRI-stedet 10 og Sall-stedet. pAT77 kan replikere i E. coli-celier på grund af tilstedeværelsen af pBR322-genet og kan også replikere i gær på grund af tilstedeværelsen af ars 1- og 2 μοτί - generne. Endvidere indeholder dette plasmid som den selektive markør for transformanten et ampicil-linresistensgen (Apr) på E. coli-siden og et leucindannende gen 15 (Leu 2) på gærsiden og har derfor tilfredsstillende egenskaber som shuttle-vektor.
Shuttle-vektoren er nødvendig til fremstilling af det rekombinante plasmid under anvendelse af E. coli, og når en gærcelle er transformeret med det rekombinante plasmid, er E. coli-genet ikke nødvendigt, 20 men kan slettes derfra.
Genkortet omkring den sure phosphatasepromotor i shuttle-vektoren pAT77 er vist i fig. 4. JBstEII-Sall-områdets nucleotidsekvens i denne shuttle-vektor er blevet bestemt af nærværende opfindere og er som vist i fig. 5, ATG-Codonen (methionin), som er vist i fig. 4 og 5, er 25 indledningscodonen for den sure phosphatase. Nærmere betegnet indeholder det represserbare sure phosphatasegenfragment (ca. 2,8 kb) af denne vektor det område, som dækker fra ca. 2,7 kb oven for strukturgenet til det 82. nucleotidpar (82 bp) i strukturgenet.
Shuttle-vektoren pAT77 spaltes ved behandling med restriktionsenzymet 30 Sall efterfulgt af behandling med exonucleasen BaI31, hvorved en del af eller hele strukturgenet for sur phosphatase som vist i fig. 4 og 5 og eventuelt forskellige yderligere områder oven for dette slettes. Denne sletning udføres for hensigtsmæssige områder før sur phosphatase-promotorområdet: TATATAA (Hogness-kasse), dvs. -100 bp.
35 De områder, der skal slettes, kan kontrolleres ved betingelserne for 8 DK 169953 B1 behandling med exonucleasen og ligger sædvanligvis i området fra +1 til -100 bp, fortrinsvis fra +1 til -50 bp. Når sletningen udføres over et for bredt område ovenfor, dvs. over -100 bp, bliver det vanskeligt at kontrollere den sure phosphatasepromotor, hvilket 5 medfører en nedsættelse af udbyttet af det ønskede HBsAg ved dyrkning af de transformerede gærceller. Hvis sletningen på den anden side udføres i utilstrækkeligt omfang, således at en del af det sure phosphatasestrukturgen er tilbage, dannes der ufordelagtigt en hybrid mellem HBs-antigenet og et phosphatasepeptid.
10 Efter sletning af en del af eller hele det sure phosphatasestrukturgen og eventuelt nogle områder oven for dette rekombineres en syntetisk eller naturlig linker hermed, fx en Sall-linker eller Xhol-linker, hvilket giver et cirkulært plasmid, hvorved fås en shuttle-vektor, som kan udtrykke et fremmed gen i ren form under kontrol af 15 den sure phosphatasepromotor. Denne shuttle-vektor kan nemt spaltes ved det sted, hvor rekombinationen skal finde sted, ved at behandle med et sædvanligt re s tr iktions enzym såsom Sall eller Xhol og anvendes derfor fortrinsvis til rekombination af det ønskede gen.
3) Konstruktion af et HBs-genudtrykkende plasmid 20 Det rekombinante plasmid ifølge opfindelsen, dvs. et plasmid, som er rekombineret med et HBs-gen, fremstilles ved at spalte den ovennævnte shuttle-vektor med et restriktionsenzym, som svarer til en anvendt lænke, fx Sall eller Xhol, og derefter rekombinere det resulterende spaltede fragment med HBV-DNA som ovenfor beskrevet. De således 25 vundne plasmider amplificeres af E. coli, og kun det plasmid, som er rekombineret i den rigtige retning, udvælges ved at analysere ved hjælp af digerering med restriktionsenzymerne Xhol eller Sall (indsætning) , JTcoRI og Xhol (indsættelsesretning).
4) Transformation af gær
30 Den gærcelle, som skal transformeres, omfatter en mutantstamme af gær, som er komplementær med det selektive markørgen i den transformerede gærcelle, som bæres på plasmidet, fx en leucinkrævende mutant, Saccharomyces cerevisiae AH22 [a, leu 2, his 4, Can 1 (Cir+)J
9 DK 169953 B1 (jfr. Hirmen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 75, 1978, s. 2157-2161). Efter amplifikation ved hjælp af E. coli overføres det rekombinante plasmid til mutantstammen af gær på sædvanlig måde, fx ved at blande plasmid-DNA med celler, som fås ved at omdanne dem til 5 spheroplaster efterfulgt af behandling med calcium, hvorved transformationen finder sted. Det ønskede transformerede gær udvælges og isoleres fra den således behandlede gærkultur på grundlag af ekspressionen af et gen på vektoren, som er komplementært med mutationen af værtsgærcellen, fx ekspression af et leucindannende gen.
10 Ud over den ovennævnte leucinkrævende stamme kan der som gærcelle anvendes andre mutantstammer såsom en histidirikrævende stamme, tryp-tophankrævende stamme, uracilkrævende stamme, adeninkrævende stamme eller lignende. Et eksempel på en anden stamme er S. cerevisiae SHY3 (a, ste-VC9, ura 3, trp 1, leu 2, his 3, ade 1, can 1).
15 5) Dyrkning af transformeret gær og fremstilling af HBsAg
Det ovenfor vundne transfornerede gær dyrkes på sædvanlig måde i et medium, som indeholder phosphorsyre, og cellerne i logaritmisk vækstfase overføres til et uorganisk phosphatfrit medium og dyrkes derefter under sådanne betingelser, at den sure phosphatasepromotor 20 ikke represseres. Efter dyrkningen indsamles og lyseres de dannede celler på sædvanlig måde, hvorved fås en lyseret celleopløsning, som indeholder en stor mængde af det ønskede HBsAg.
Afhængig af arten af gæren, fx når der anvendes en Pho80 mutantstamme (jfr. Thoe, A. et al,, J. Bacteriol. 145, 1981, s. 221-232), behøver 25 dyrkningen ikke nødvendigvis at blive udført under sådanne betingelser, at den sure phosphatasepromotor ikke represseres, men kan udføres under sædvanlige betingelser, hvorved der direkte fås det ønskede HBsAg i stor mængde.
Det således vundne HBsAg er det samme som det naturlige HBsAg, som 30 stammer fra humant blodplasma, hvad angår immunologiske egenskaber, og er derfor nyttig til fremstilling af HBV-vaccine ligesom HBsAg fra humant blodplasma.
10 DK 169953 B1
Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempel.
EKSEMPEL
1) Fremstilling af HBV-DNA i) Fremstilling af virus-DNA
5 700 ml blodplasma samlet i pulje fra 10 personer, som er positive med hensyn til HBsAg (undertype adr) og HBeAg, centrifugeres ved 5000 rpm i 20 minutter for at fjerne uopløst materiale. Den resulterende opløsning centrifugeres ved 4°C og 18.000 rpm i 8 timer, og det resulterende bundfald genopløses i 10 ml af en puffer (pH-værdi 7,5) 10 bestående af 10 millimol Tris-HCl, 0,1 M NaCl og 1 millimol EDTA.
Opløsningen anbringes på toppen af et centrifugerør, som indeholder 30% saccharose, som centrifugeres ved 4QC og 39.000 rpm i 4 timer.
Det resulterende bundfald genopløses i den samme puffer som beskrevet ovenfor.
15 For at lette den følgende procedure udsættes pufferopløsningen for reaktionen af HBV-DNA-polymerase ved at behandle den i en blanding (500 μΐ) af 67 millimol Tris-HCl (pH-værdi 7,5), 80 millimol NH^Cl, 25 millimol MgCl2, 0,5% NP40 (Tergitol®, fremstillet af Sigma Co.), 0,1% 2-mercaptoethanol, 330 μπι dCTP (deoxycytidin-triphosphat), dGTP 20 (deoxyguanosin-triphosphat), og dATP (deoxyadenosin-triphosphat), 0,5 /imol a-[^2p]dTTP (deoxythymidin-triphosphat) ved 37°C i 3 timer, og til reaktionsblandingen sættes det samme volumen 100 millimol EDTA-opløsning. Ved den ovennævnte DNA-polymerasereaktion omdannes det enkeltstrengede DNA-område til dobbeltstrenget DNA, hvorved fås et 25 [32p]-mærket materiale. Dette materiale anbringes i toppen af et centrifugerør, hvor 30%'s, 20%'s og 10%'s vandige opløsninger af saccharose er pakket i lag i den nævnte rækkefølge, og det centrifugeres ved 4°C og 39.000 rpm i 4,5 timer.
For at digerere de proteiner, der er stærkt bundet til DNA, behandles 30 det ovenfor vundne bundfald i en blanding (200 μΐ) af 1 mg/ml pronase E (fremstillet af Kaken Kagaku K.K.) og 0,2% vandig natriumlaurylsul-fatopløsning ved 37°C i 2 timer. Den resulterende blanding ekstra- 11 DK 169953 B1 heres to gange med 200 pi phenol, og den resulterende DNA-holdige ekstrakt vaskes med ether for at fjerne phenolopløsningsmidlet, hvorved fås en opløsning af HBV-DNA. Det således vundne DNA har en specifik radioaktivitet på 2,5 x 10** cpm/pg og kan anvendes til 5 digerering med restriktionsenzymer.
ii) Kloning af HBV-DNA
Det ovenfor vundne dobbeltstrengede cirkulære HBV-DNA klones under anvendelse af λ-phag Sharon 16A DNA som vektor og klones derefter på ny under anvendelse af det kendte plasmid pACYC!77 som vektor på 10 følgende måde.
A) Kloning i λ-phag Sharon 16A værtsvektor: 20 ng HBV-DNA behandles med endonuclease Xhol i en blanding (20 pi) af 10 millimol Tris-HCl (pH-værdi 7,4), 7 millimol MgC^, 100 milli-mol NaCl og 7 millimol 2-mercaptoethanol ved 37°C i 2 timer. Den 15 resulterende blanding ekstraheres med 20 pi phenol og derefter med ether, og til den vandige fase sættes et dobbelt så stort volumen afkølet ethanol for at udfælde DNA. Blandingen holdes ved -70eC i 1 time og centrifugeres derefter ved 10.000 rpm i 5 minutter, og det udfældede DNA udvindes. Det således fraskilte bundfald opløses i en 20 blanding (5 pi) af 10 millimol Tris-HCl (pH-værdi 7,4) og 1 millimol EDTA. HBV-DNA'et og en ækvimolær mængde λ-phag Sharon 16 A DNA (med et genkendelsessted for Xhol), der fås ved spaltning med endonuclease Xhol på samme måde som ovenfor beskrevet, omsættes med T4 DNA-ligase [en blanding af 50 millimol Tris-HCl (pH-værdi 7,4), 10 millimol 25 MgCl2, 10 millimol dithiothreitol, 100 pg/ml kalveserumalbumin, 0,5 millimol ATP og 0,5 pi enzympræparat (T4-ligase, fremstillet af Takara Biomedicals, 1-5 x 10^ enhed/ml)] ved 4°C i 18 timer. Reaktionsblandingen ekstraheres med phenol og ether og udsættes derefter for udfældning med ethanol på samme måde som ovenfor beskrevet. Det 30 således vundne bundfald opløses i en blanding (10 pi) af 10 millimol Tris-HCl (pH-værdi 7,4) og 1 millimol EDTA.
Det således sammenføjede DNA udsættes for in vitro pakning til dan- 12 DK 169953 B1 nelse af λ-phag på samme måde som beskrevet i Methods in Enzymology 68, s. 299-309, og yderligere plader (10^) dannes derfra på en L-agarplade (23 x 23 cm) under anvendelse af E. coli DP50 SupF (jfr. Blattner, F.R. et al., Science 196, 1977, s. 161) som indikator.
5 Disse plader udsættes for pladehybridisering under anvendelse af det ovenfor fremstillede -mærkede HBV-DNA som prøve (jfr. Science 196, 1977, s. 180) for at udvælge plader dannet ud fra den phag, som har HBV-DNA, hvorved et flertal af de ønskede phager skilles fra.
B) Genkloning under anvendelse af plasmid pACYC177 som vektor: 10 Phag-DNA fremstilles ud fra den ovenfor under A) vundne phag med HBV-DNA under anvendelse af E. coli DP50-SupF som den bakterie, der skal inficeres, på samme måde som beskrevet i Methods in Enzymology 68, 1979, s. 245-378. Det således vundne DNA digereres med Xhol tinder de ovenfor beskrevne betingelser i 2 timer, og den resulterende reak-15 tionsblanding udsættes for elektrophorese på en 0,75% agarosegel for at isolere HBV-DNA (3,2 kb). HBV-DNA'et absorberes i DEAE (diethyl-aminoethylcellulose) papir (fremstillet af Toyo Roshi, Japan) for at adskille det fra vektor-DNA og elueres derefter med 1 M vandig saltopløsning, hvorved fås HBV-DNA med Xhol - terminaler i begge ender.
20 Plasmid pACYCl77 (jfr. Chang, A.C.Y. og Cohen, S.N., J. Bacterial.
13Λ, 1978, s. 1141-1156), som har et enkelt .Xhol-spaltningssted i dets kanamycinresistensgen, digereres med Xhol, og produktet renses ved phenolekstraktion, etherbehandling og ethanoludfældning på samme måde som beskrevet ovenfor.
25 Det således vundne pACYC177 spaltet med Xhol blandes med det ovenfor vundne Xhol-terminale HBV-DNA i et molforhold på 1:5, og blandingen sammenføjes med T4 DNA-ligase i 18 timer som ovenfor beskrevet.
Det ovenfor vundne sammenføjede DNA-præparat (10 jul) sættes til en væskekultur af E. coli (0,1 ml), der fremstilles ved at behandle en 30 dyrkningsvæske indeholdende E. coli χ1776 [jfr. R. Ill Curtiss et al., "Molecular cloning of recombinant DNA" (red. W.A. Scott og R.
Werner) s. 99, Academic Press, 1977] ved den i M.V. Norgard, Gene 3, 1978, s. 279, beskrevne metode, og blandingen blandes godt og lades 13 DK 169953 B1 henstå ved 0°C i 25 minutter. Blandingen påføres på en L-agarplade, som indeholder 20 Mg/ml ampicillin, 1 /zg/ml a-biotin, 100 Mg/ml diaminopimelinsyre og 20 /ig/ml thymin, og inkuberes ved 37°C natten over. De resulterende kolonier påføres både på en agarplade, som 5 indeholder 20 /ig/ml kanamycin, og en agarplade, der indeholder 20 /ig/ml ampicillin, og de kolonier, som kun vokser på den agarplade, som indeholder ampicillin, udvælges. pACYC177 har et ampicillinresi-stensgen og et kanamyc inre sis tens gen, men når der indsættes HBV-DNA på Xhol-stedet i kanamycinresistensgenet, mister det sin kanamycin-10 resistens. De udvalgte kolonier har således et rekombinant DNA bestående af pACYC177-HBV-DNA. Fra de således udvalgte kolonier fremstilles et plasmid ved den af K. Matsubara beskrevne metode (jfr. J. Virol. 16, 1975, s. 479). Det således vundne plasmid, dvs. det rekom-binante DNA bestående af pACYC177-HBV-DNA (som betegnes "pHBV"), 15 behandles med Xhol under de samme betingelser som ovenfor beskrevet, hvorved fås et samlet HBV-DNA-fragment (3,2 kb). Når det behandles med Xhol og BamHI, fås desuden et fragment (ca. 1,3 kb), som indeholder et HBsAg-gen.
2) Fremstilling af shuttle-vektorerne pAM81, 82, 83 og 84 20 Et FcoRI-fragment på ca. 8000 nucleotidpar (8 kb) indeholdende et polypeptidgen (P60) på 60.000 dalton, der udgør den represserbare sure phosphatase (fås fra gær S288C genbank, jfr. Clarke, L. og Carbon, J., Cell 9, 1976, s. 91-99), indsættes i FcoRI-stedet på det kendte E. coli plasmid pBR322, hvorved fås et plasmid, som anvendes 25 som udgangsmateriale.
Udgangsplasmidet digereres med restriktionsenzymet Sall og gensammenføjes med T4 DNA-ligase, hvorved fås plasmid pAT25, der mangler et 5,2 kb langt fragment for Sall-stedet til det sure phosphatasegen (plasmid pAT25 består af et fragment (ca. 3,7 kb langt) fra ÆcoRI-30 stedet til SalI-stedet på pBR322, der indeholder ampicillinresistens-genet, og et fragment (ca. 2,8 kb langt) fra EcoRI-stedet til SalI-stedet på det sure phosphatasegen fra gær, idet begge fragmenter er forbundne ved den tilsvarende ende deraf).
14 DK 169953 B1 I EcoRI-stedet på pAT25 indsættes et EcoRI-fragment (1,4 kb), som indeholder ars 1 og Trp 1-genet, som fremstilles ved at behandle et plasmid "iRP7 (jfr. Struhl, K. et al., Proc. Hati. Acad. Sci. U.S.A.
76, 1979, s. 1035-1039) med ifcoRI, hvorved fås plasmid pAT26. Dette 5 ars 1-Trp 1-fragment har et enkelt genkendelsessted for restriktionsenzymet flindlll inde i Trp 1-genet.
I Rindlll-stedet på pAT26 indsættes et Hindlll-fragment, som indeholder et Leu 2- og 2 /iori-gen, som fremstilles ved at behandle plasmidet pSLEl (jfr. Tohe, A. et al., J. Bacteriol. 141, 1980, 10 s. 413-416) med Hindlll til fremstilling af den ønskede shuttle- vektor pAT77. pAT77 indeholdt i Saccharomyces cerevisiae (dvs. Sac-charomyces cerevisiae AH22/pAT77) er deponeret i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan i henhold til Budapest-traktaten under deponeringsbetegnelsen "FERM 15 BP-324".
Det således vundne pAT77 (1 μg) spaltes med Sall og behandles derefter med exonucleasen BaI31 (0,1 U) i en opløsning (50 μΐ) af 20 millimol Tris-HCl (pH-værdi 8,2), 12 millimol CaCl2, 12 millimol MgCl2, 0,2 mol NaCl og 1 millimol EDTA i 0,5-1 minut. Reaktionsblan-20 dingen ekstraheres med phenol og udfældes med ethanol på den ovenfor beskrevne måde. Det resulterende bundfald behandles med Xhol-linker (1 pmol) og T4 DNA-ligase under de ovenfor beskrevne betingelser i 12 timer.
E. coli χ1776 behandles med den ovenfor vundne reaktionsblanding ved 25 den i R. III. Curtiss et al., "Molecular cloning of recombinant DNA" (red. W.A. Scott og R. Werner, s. 99, Academic Press, 1977) beskrevne måde for at transformere E. coli χ1776, hvorved fås en ampicillin-resistenstransformant. Plasmid DNA fremstilles ud fra de resulterende transformantkolonier ved den af K. Matsubara beskrevne fremgangsmåde 30 (jfr. J. Virol. 16, 1975, s. 479). I henhold til Maxam-Gilbert-metoden (jfr. Maxam, A. & Gilbert, W., PNAS 74, s. 560-564) bestemmes det resulterende DNA's nucleotidsekvens, og endvidere bestemmes det område af det sure phosphatasegen, som er blevet slettet med Bal31.
Blandt dette DNA udvælges og isoleres de ønskede plasmider pAM81, 15 DK 169953 B1 pAM82, pAM83 og pAM84, der fuldstændig mangler hele phosphatasestruk-turgenet.
Idet "A" i codonen ATG, som indkoder den første aminosyre (methionin) i produktet P60 af phosphatasestrukturgenet betegnes "+1", slettes 5 følgende områder i disse shuttle-vektorer: pAM81, indtil +2, pAM82, indtil -33, pAM83, indtil -50 og pAM84, indtil -51. pAM81, pAM82, pAM83 og pAM84, som findes i Saccharomyces cerevlsiae (dvs. Saccharo-myces cerevisiae AH22/pAM81, AH22/pAM82, AH22/pAM83 og AH22/pAM84) er deponeret i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial 10 Science and Technology, Japan i henhold til Budapest- traktaten med deponeringsbetegnelserne henholdsvis "FERM BP-325", "FERM BP-313", FERM BP-327" og "FERM BP-326".
3) Fremstilling af HBsAG-genekspressionsplasmider i) Fremstilling af plasmider indeholdende hele HBV-DNA'et 15 HBV-DNA, der fås ved behandling af plasmidet pHBV (pACYC177- HBV-DNA) med Xhol, rekombineres med den med Xhol spaltede shuttle-vektor pAM81, pAM82, pAM83 og pAM84 i molforholdet 5:1 ved at sammenføje med T4 DNA-ligase under de samme betingelser som ovenfor beskrevet.
E. coli *1776 transformeres med reaktionsblandingen, og plasmid-DNA 20 fremstilles ud fra den resulterende ampicillinresistenstransformant på den ovenfor beskrevne måde. Det således fremstillede DNA analyseres med forskellige restriktionsenzymer såsom Xhol, Xbal og tfindlll, hvorved indsætningen af HBV-DNA i vektorerne og dennes retning bestemmes.
25 De således vundne HBsAg-genekspressionsplasmider har et HBs-gen og et HBc-gen i den rækkefølge neden for phosphatasepromotoren, og plasmi-derne bestående af HBV-DNA rekombineret med shuttle-vektorerne pAM81, pAM82, pAM83 og pAM84 betegnes henholdsvis pAH201, pAH203, pAH205 og pAH207.
16 DK 169953 B1 ii) Fremstilling af et plasmid med et indsat HBsAg-genfragment
Et HBsAg-genfragment (3 /ig) fremstillet ved spaltning af plasmid pHBV med BaæHI behandles med T4 DNA-polymerase (0,2 U) i en opløsning (100 μΐ) af 67 millimol Tris-HCl (pH-værdi 8,6), 6,7 millimol MgCl2, 5 10 millimol 2-mercaptoethanol, 6,7 pmol EDTA og 16,7 millimol (NH^)2 SO^, der indeholder 200 μταοί αΑΤΡ, aCTP, aTTP og aGTP, i 30 minutter for at udfylde BamHI-spaltningsenden. Reaktionsblandingen udsættes for phenolekstraktion og ethanoludfældning som ovenfor beskrevet. Det resulterende bundfald kobles med Xhol- lænker i et 10 molforhold på 1:10 med T4 DNA-ligase under samme betingelser som ovenfor beskrevet. Efter phenolekstraktion og ethanoludfældning behandles det resulterende plasmid med Xhol, hvorved fås et HBsAg-genfragment (ca. 1,3 kb) med en Xhol-spaltningsterminal i begge ender. Det således vundne fragment sammenføjes med shuttle-vektoren 15 pAM82, der spaltes med Xhol i et molforhold på 5:1 under anvendelse af T4 DNA-ligase, og E. coli *1776 transformeres med den ovenfor vundne reaktionsblanding på samme måde som beskrevet i trin i), hvorved fås plasmid-DNA.
I det således vundne plasmid indsættes HBsAg-gen i den rigtige ret-20 ning neden for phosphatasepr omo toren i vektoren pAM82, hvilket plasmid betegnes pASlOl.
4) Fremstilling af transformeret gær
Den som udgangsmateriale anvendte gær er Saccharomyces cerevisiae AH22 [a, leu 2, his 4, can 1 (Cir+)], der er deponeret i Fermentation 25 Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
Japan i henhold til Budapest-traktaten under deponeringsbetegnelsen "FERM BP-312". Den som udgangsmateriale anvendte gær inokuleres i YPD-medium (100 ml) bestående af 2% polypepton, 1% gærekstrakt og 2% glucose, og blandingen inkuberes ved 30°G natten over, hvorefter 30 cellerne indsamles ved centrifugering. De således indsamlede celler vaskes med 20 ml steriliseret vand og suspenderes i en opløsning (5 ml) af 1,2 mol sorbitol og 100 /ig/ral zymolyase 60.000 (fremstillet af Seikagaku Kogyo K.K., Japan), og suspensionen lades henstå ved 30°G i 30 minutter, hvorved fås spheroplast. Den således fremstillede 17 DK 169953 B1 spheroplast vaskes med 1,2 mol sorbitolopløsning tre gange og suspenderes derefter i en opløsning (0,6 ml) af 2 mol sorbitol, 10 millimol CaCl2 og 10 millimol Tris-HCl (pH-værdi 7,5). Den således fremstillede suspension deles i små testrør i et volumen på 60 μΐ. Til suspen-5 sionen sættes en opløsning af det rekombinante plasmid pAH203 (30 μΐ) fremstillet ovenfor i trin 3). Efter grundig blanding tilsættes 0,1 mol CaCl2 (3 μ!) i en slutkoncentration på 10 millimol CaCl2, og blandingen lades henstå ved stuetemperatur i 5-10 minutter. Til den resulterende blanding sættes i hvert testrør 1 ml af en opløsning af 10 20% polyethylenglycol 4000, 10 millimol CaCl2 og 10 millimol Tris-HCl (pH-værdi 7,5), og blandingen lades henstå ved stuetemperatur i ca.
20 minutter. Den resulterende blanding (0,2 ml i hvert testrør) sættes til et medium (10 ml) bestående af 22% sorbitol, 2% glucose, 0,7% gærnitrogenbaseaminosyre, 2% YPD, 20 /xg/ml histidin og 3% agar, 15 der holdes ved en konstant temperatur på 45°C. Efter nænsom blanding sættes blandingen i et lag til en plade af minimalmedium indeholdende 1,2 mol sorbitol, som tidligere er blevet fremstillet, og som består af 0,7% gærnitrogenbaseaminosyre, 2% glucose, 20 /tg/ml histidin og 2% agar og lades stivne derpå. Pladen inkuberes ved 30eC, hvorved fås en 20 koloni af gær, som ikke kræver leucin. Kolonien inkuberes i et Burk-Holder minimalmedium beriget med 20 /ig/ml histidin [jfr. Tohe, A. et al., J. Bacteriol. 113, 1973, s. 727-738], hvorved fås den ønskede transformerede gær Saccharomyces cerevlsiae pAH203.
På tilsvarende måde som ovenfor beskrevet med undtagelse af, at der 25 anvendes de rekombinante plasmider pASlOl, pAH201 og pAH205 i stedet for plasmid pAH203, fremstilles følgende transformeret gær:
Saccharomyces cerevislae pASlOl Saccharomyces cerevislae pAH201 Saccharomyces cerevisiae pAH205 30 5) Fremstilling af HBsAg med den transformerede gær
Hver koloni af de transformerede gærceller vundet i trin 4) ovenfor påføres på en agarplade med Burk-Holder minimalmedium beriget med 20 pg/ml histidin og inkuberes ved 30°C til dannelse af en koloni (for at bekræfte tilstedeværelsen af den transformant, der ikke kræver 18 DK 169953 B1 leucin). De resulterende celler adskilles fra kolonien, inokuleres i Burk-Holder minimalmedium beriget med 20 jig/ml histidin og inkuberes ved 30°C. Efter ca. 24 timer indsamles cellerne i logaritmisk vækstfase ved centrifugering og suspenderes i 10 ml minimalmedium, som 5 ikke indeholder phosphorsyre (fremstilles ved at erstatte KH2PO4. i Burk- Holder minimalmedium med KCl efterfulgt af berigelse med 20 /ig/ml histidin) i en cellekoncentration på ca. 4 x 10® celler/ml.
Efter inkubation ved 30°C i ca. 24 timer centrifugeres dyrknings-væsken ved 4000 rpm i 10 minutter for at indsamle cellerne. De såle-10 des fraskilte celler suspenderes i en opløsning (3 ml) af 1,2 mol sorbitol, 50 millimol phosphatpuffer (pH-værdi 7,2), 14 millimol 2-mercaptoethanol og 100 pg/ml zymolyase 60.000 (fremstillet af Seikagaku Kogyo K.K., Japan), og blandingen rystes nænsomt ved 30°C i 30 minutter, hvorved fås spheroplast. Spheroplasten indsamles ved 15 centrifugering og suspenderes grundigt i en opløsning (1 ml) af 0,1% Triton® X-100 og 50 millimol phosphatpuffer (pH-værdi 7,2), omrøres grundigt og centrifugeres derefter ved 7000 rpm i 10 minutter, og den resulterende supernatant tages som den gærlyserede opløsning.
Den ovenfor vundne lyserede opløsning (20 μΐ) testes med HBs-antigen 20 RIA-kit (fremstillet af Abbott, U.S.A.) udtrykt i HBs-antigenaktivitet. Resultaterne er vist i tabel 1.
Tabel 1 HBsAg-aktivitet 25 Klon nr. Vært Plasmid (cpm) 1 S. cerevisiae pAH201 10.597 AH22 (FERM BP-312) 2 " pAH203 13.008 30 3 " pAH205 5.548 4 ” pASlOl 11.200
Sammenligning " pAM82* 320 19 DK 169953 B1 * Denne vektor har intet HBV eller HBs-gen og anvendes som negativ sammenligningsvektor.
Den negative kontrol i RIA-kittet har en aktivitet på 310 cpm, og den positive kontrol deri har en aktivitet på 17.500 cpm.
5 Hvad angår den gær lyserede opløsning (som udvundet ovenfor fra S.ce-revisiae AH22/pAH203), beregnes reaktiviteten og mængden af antigen i henhold til et parallellinge-assay under anvendelse af et kit til detektering af HBsAg som ovenfor beskrevet (jfr. Finney, D.J. Statistical Method in Biological Assay, 2. udgave, Griffin, London, 10 1964) , idet renset HBsAg fra humant blodserum anvendes som kontrolan tigen. Resultaterne er vist i fig. 6. Det fremgår af fig. 6, at mængden af antigen i 10 ml dyrkningsvæske af de transformerede gærceller er så forholdsvis høj som 2 pg/ml. Sammenlignet med mængden af antigen opnået i Nature, 298, 1982, s. 347-350 er den med S.cerevi-15 siae AH22/pAH203 opnåede mængde af HBsAg således 8-20 gange højere.
Det fremgår endvidere, baseret på paralleliteten med kontrolantigenet, at det HBsAg, som fremstilles ifølge opfindelsen, har tilsvarende reaktivitet (antigenicitet, immunogenicitet, etc.) som det HBsAg, der findes i humant blodplasma.
20 Den ovenfor vundne lyserede opløsning blev i portioner på 0,4 ml inokuleret subcutant i marsvin (hunner, 300-380 g, 10 dyr) én gang om ugen i 3 uger, og antistoffet i blodplasmaet blev bestemt med et kit til detektering af anti-HBs-antistof (AUSAB, fremstillet af Abbott, U.S.A.). Der blev som følge heraf observeret anti-HBs-antistof i alle 25 dyrene.
Fremstillingen af værtsvektoren og HBs-antigen derfra ifølge opfindelsen er således meget nyttig til fremstilling af et antigen mod hepatitis-B-inducerende stof (Dane-partikler), og HBs-antigen fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er nyttigt til fremstil-30 Ung af HBV-vaccine og diagnostiske reagenser.
Claims (17)
1. Rekombinant plasmid, der indeholder DNA-sekvenser fra gær, DNA- t sekvenser, der hidrører fra Escherichia coli-plasmid og en DNA-sekvens, der koder for Hepatitis B virus-overfladeantigen, hvor sekven- 5 serne fra gær omfatter ars 1 samt 2μ ori, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen, der koder for Hepatitis B virus-overfladeantigen er under kontrol af ekspressionskontrolområdet af det represserbare sure phosphatasegen fra gær, som er et gen kodende for et polypeptid på 60.000 dalton (P60), som udgør phospha-10 tasen, idet hele phosphatasestrukturgenet og et område i området fra +1 (ATG) til -100 bp oven for dette er slettet.
2. Rekombinant plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det område, der slettes oven for phosphatasestrukturgenet, er i området fra +1 til -50 bp.
3. Rekombinant plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ovennævnte sekvenser fra gær omfatter ars 1 og 2 /xori og et selektivt markørgen for transformeret gær.
4. Rekombinant plasmid ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det selektive markørgen er valgt 20 blandt et leucindannende gen, et histidindannende gen, et trypto-phandannende gen, et uracildannende gen og et adenindannende gen, eller en kombination af to eller flere af disse.
5. Rekombinant plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ovennævnte sekvenser fra E. coli-plas-25 mid omfatter en DNA-sekvens, der er nødvendig for replikation af genet i E. coli-celler.
6. Rekombinant plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ovennævnte sekvenser fra E. coli-plasmid omfatter en DNA-sekvens, der er nødvendig for replikation af 30 genet i E. coli -celler, og et selektivt markørgen for transformeret E. coli. * DK 169953 Bl 21
7. Rekombinant plasmid ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det selektive markørgen er valgt blandt et ampicillinresistensgen, et kanamycinresistensgen, et tetra-cyclinresistensgen og et chloramphenicolresistensgen, eller en kombi-5 nation af to eller flere af disse.
8. Rekombinant plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at E. coli-plasmidet er et E. coli-plasmid pBR322, som indeholder et ampicillinresistensgen og et tetra-cyclinresistensgen.
9. Rekombinant plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plasmidvektoren er en shuttle-vektor, som består af et gærplasmid og et E. coli-plasmid, idet gærplasmidet indeholder ars 1, 2 /iori, Leu 2 og ekspressionskontrolområdet for det represserbare sure phosphatasegen i den nævnte rækkefølge, idet hele 15 det sure phosphatasestrukturgen og et bestemt område i området fra +1 til -100 bp oven for phosphatasestrukturgenet er slettet, og idet E. coli-plasmidet er E. coli-plasmid pBR322, som indeholder et ampicillinresistensgen og et tetracyclinresistensgen.
10. Rekombinant plasmid ifølge krav 1, 20 kendetegnet ved, at DNA-sekvenserne, der koder for Hepatitis B virus-overfladeantigen, omfatter et fragment, som indeholder hele HBs-genet svarende til 226 aminosyrer.
11. Rekombinant plasmid ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det fragment, der indeholder hele HBs-25 genet, er hele HBV-DNA'et, som spaltes med restriktionsenzymet Xhol.
12. Rekombinant plasmid ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det fragment, der indeholder hele HBs-genet, er et fragment, som fremstilles ved at spalte HBV-DNA'et med restriktionsenzymerne Xhol og BamRl.
13. Transformeret gærcelle, kendetegnet ved, at den fremstilles ved at transformere en gærcelle med det rekombinante plasmid ifølge krav 1. DK 169953 B1 ' 22
14. Transformeret gærcelle Ifølge krav 13, , kendetegnet ved, at den som udgangsmateriale anvendte gær er valgt blandt en leucinkrævende mutantstamme, en histidinkrævende . mutantstamme, en tryptophankrævende mutantstamme, en uracilkrævende 5 mutants tamme eller en adeninkrævende mutants tamme.
15. Transformeret gærcelle ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den som udgangsmateriale anvendte gær er en leucinkrævende mutantstamme Sacchaxomyces cerevisiae AH22 [a, Leu 2, His 4, Can 1 (Cir+)] (FERM BP-312).
16. Fremgangsmåde til fremstilling af Hepatitis B virus-overfladean tigen, kendetegnet ved, at den transformerede gærcelle ifølge krav 13 dyrkes i et medium, og det dannede antigen indsamles på sædvanlig måde.
17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at dyrkningen af den transformerede gær udføres under sådanne betingelser, at den sure phosphatasepromotor ikke represseres.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14246082 | 1982-08-16 | ||
| JP57142460A JPS5931799A (ja) | 1982-08-16 | 1982-08-16 | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK372183D0 DK372183D0 (da) | 1983-08-15 |
| DK372183A DK372183A (da) | 1984-02-17 |
| DK169953B1 true DK169953B1 (da) | 1995-04-10 |
Family
ID=15315829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK372183A DK169953B1 (da) | 1982-08-16 | 1983-08-15 | Rekombinant plasmid bærende et Hepatitis B virus-overfladeantigen, transformeret gærcelle samt fremgangsmåde til fremstilling af Hepatitis B virus-overfladeantigen |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4778761A (da) |
| JP (1) | JPS5931799A (da) |
| KR (1) | KR890000096B1 (da) |
| CA (1) | CA1270217A (da) |
| DK (1) | DK169953B1 (da) |
| ES (2) | ES524942A0 (da) |
| IL (1) | IL69423A0 (da) |
| SU (1) | SU1387878A3 (da) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| JPS5936699A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | シヤトルベクタ− |
| JPS5974985A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-04-27 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
| JPS61139391A (ja) * | 1984-12-11 | 1986-06-26 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 単純ヘルペスウィルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミドおよび形質転換酵母 |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| US5190877A (en) * | 1987-09-03 | 1993-03-02 | Gist-Brocades N.V. | Saccharomyces strains for maltose fermentation |
| US4883865A (en) * | 1987-09-30 | 1989-11-28 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+s antigen |
| AP129A (en) * | 1988-06-03 | 1991-04-17 | Smithkline Biologicals S A | Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells |
| US6319501B1 (en) * | 1990-07-19 | 2001-11-20 | Health Research, Inc. | Method of immunizing against hepatitis B virus |
| LT3988B (en) | 1992-02-17 | 1996-06-25 | Fermentas Biotech Inst | Recombinant plasmides pfs19, pfps2-48 and pjlfds1 codingsynthesis of human hepatite b of surfice virus antigenes, methods fof producing thereof |
| US5531990A (en) * | 1993-12-15 | 1996-07-02 | Health Research, Inc. | Method of raising an immune response with an anti-idiotypic antibody having correspondence with human hepatitis B surface antigen |
| IL118626A0 (en) * | 1996-06-11 | 1996-10-16 | Xtl Biopharmaceuticals Limited | Anti HBV antibody |
| US6451572B1 (en) * | 1998-06-25 | 2002-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Overexpression of phytase genes in yeast systems |
| DK1165806T3 (da) * | 1999-03-31 | 2005-12-05 | Cornell Res Foundation Inc | Phosphataser med forbedret phytaseaktivitet |
| US6841370B1 (en) * | 1999-11-18 | 2005-01-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase |
| BRPI0213813B1 (pt) | 2001-10-31 | 2018-11-21 | Cornell Res Foundation Inc | método para aprimorar o valor nutricional de uma ração consumida por um animal monogástrico e ração |
| WO2004024885A2 (en) * | 2002-09-13 | 2004-03-25 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve aspergillus phytases |
| US7919297B2 (en) | 2006-02-21 | 2011-04-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase |
| US8540984B2 (en) * | 2006-08-03 | 2013-09-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Phytases with improved thermal stability |
| KR101445903B1 (ko) | 2007-05-02 | 2014-09-29 | 메리얼 리미티드 | 향상된 발현 및 안정성을 갖는 ｄｎａ 플라스미드 |
| US8192734B2 (en) | 2007-07-09 | 2012-06-05 | Cornell University | Compositions and methods for bone strengthening |
| CN112680464B (zh) * | 2020-12-10 | 2022-04-26 | 南京农业大学 | 一种单甲基砷和三价锑氧化酶基因arsV及其编码的蛋白和应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2444713A1 (fr) * | 1978-12-18 | 1980-07-18 | Pasteur Institut | Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant |
| FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
| US4615974A (en) * | 1981-08-25 | 1986-10-07 | Celltech Limited | Yeast expression vectors |
| US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
| US4546082A (en) * | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| AU584580B2 (en) * | 1982-09-08 | 1989-06-01 | Smith Kline - Rit | Hepatitis B virus vaccine |
| CA1341302C (en) * | 1983-02-22 | 2001-10-09 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein |
-
1982
- 1982-08-16 JP JP57142460A patent/JPS5931799A/ja active Granted
-
1983
- 1983-08-03 IL IL69423A patent/IL69423A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-08-12 ES ES524942A patent/ES524942A0/es active Granted
- 1983-08-13 KR KR1019830003794A patent/KR890000096B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-08-15 DK DK372183A patent/DK169953B1/da not_active IP Right Cessation
- 1983-08-15 SU SU833635804A patent/SU1387878A3/ru active
- 1983-08-16 CA CA000434726A patent/CA1270217A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-03-01 ES ES540895A patent/ES8802162A1/es not_active Expired
-
1987
- 1987-01-20 US US07/004,424 patent/US4778761A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1270217A (en) | 1990-06-12 |
| ES8600059A1 (es) | 1985-10-01 |
| KR840005745A (ko) | 1984-11-15 |
| DK372183D0 (da) | 1983-08-15 |
| DK372183A (da) | 1984-02-17 |
| JPS6155950B2 (da) | 1986-11-29 |
| US4778761A (en) | 1988-10-18 |
| IL69423A0 (en) | 1983-11-30 |
| KR890000096B1 (ko) | 1989-03-07 |
| JPS5931799A (ja) | 1984-02-20 |
| ES524942A0 (es) | 1985-10-01 |
| SU1387878A3 (ru) | 1988-04-07 |
| ES8802162A1 (es) | 1988-04-01 |
| ES540895A0 (es) | 1988-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK169953B1 (da) | Rekombinant plasmid bærende et Hepatitis B virus-overfladeantigen, transformeret gærcelle samt fremgangsmåde til fremstilling af Hepatitis B virus-overfladeantigen | |
| KR940005588B1 (ko) | 효모에서 b형 간염 바이러스 단백질을 제조하는 방법 | |
| EP0414374B1 (en) | Novel antigens and methods for their preparation | |
| EP0105149B1 (en) | Recombinant plasmid containing hepatitis b virus gene, yeast transformed with said recombinant plasmid, and production of hepatitis b virus surface antigen | |
| FI104639B (fi) | Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylotrooppisissa hiivoissa | |
| US4738926A (en) | Method for purification of HBs antigen | |
| CA1334386C (en) | Method for producing hepatitis b virus proteins in yeast | |
| US4997767A (en) | Yeast shuttle vector | |
| IE60387B1 (en) | Hepatitis B virus vaccine | |
| EP0344864A2 (en) | Method for producing nonhyperglycosylated hepatitis B virus protein | |
| CA1277264C (en) | Method for culturing transformed yeast | |
| EP0339567A1 (en) | Expression of Hepatitis B PreS 2 Protein in Methylotrophic Yeasts | |
| SK118293A3 (en) | Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles | |
| EP0218474A2 (en) | Novel DNA and polypeptide | |
| SK118193A3 (en) | Hbv surface proteins with reduced host cabohydrate | |
| US5707862A (en) | Shuttle vector | |
| EP0533263A2 (en) | A multivalent hepatitis B virus vaccine | |
| JPS6291196A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の製法 | |
| KR900005534B1 (ko) | 복합 프로모터를 이용한 효모 발현 벡터에 의한 b형 간염 바이러스 표면항원들의 제조방법 | |
| EP0277770A1 (en) | Alpha-mating factor promoter is modified by deleting pre-pro secretory leader sequence | |
| IE67139B1 (en) | Synthesis of human virus antigens by yeast |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |