JP2002112797A - 組み換え型ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の調製方法及び抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高い抗原活性を有する組み換え型Ｂ型肝炎ウ
イルス抗原を大量に生産することができる組み換え型Ｂ
型肝炎ウイルス表面抗原の調製方法及び組み換え型Ｂ型
肝炎ウイルス表面抗原を提供する。 【解決手段】 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のＳ抗原の４
つの抗原部位を含む抗原決定領域と、膜貫通領域を形成
する少なくとも４つのアミノ酸をコードする領域を含む
遺伝子を用いて調製することを特徴とする組み換え型Ｂ
型肝炎ウイルス表面抗原の調製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高い抗原活性を有
するＢ型肝炎ウイルス表面抗原を得ることができる組み
換え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の調製方法及び組み換
え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、Ｂ型肝炎ウイルスの免疫学的に高
活性な抗原タンパク質、特に診断に有用な表面抗原タン
パク質を安価に供給できる方法が望まれている。

【０００３】例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を、酵
母、動物細胞等を用いた組み換え抗原として製造する方
法が開発されている（特開平６−９０７８１号公報、特
開平２−１５０２９２号公報及び特開平２−１６３０８
９号公報）。

【０００４】しかしながら、上記の方法では、組み換え
体の生産性はそれほど優れておらず、しかも、その抗原
性は感染患者血液から得られる天然型の抗原のそれに比
べて低かった。また、動物細胞を用いる系は、培養、株
の維持等の面で細菌を用いる場合に比べて高価であり、
操作も煩雑であり、培養し始めてから精製するまでに長
い時間を要するものであった。

【０００５】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原は、また、大腸
菌を用いた組み換え系では、抗原タンパク質の大腸菌に
対する毒性のため、ほとんど発現しないことが知られて
いる（Ｇｅｎｅ，３０，１９８４，２０１−２１０、Ｇ
ｅｎｅ，１６０，１９９５，１７９−１８４）。大腸菌
にとって毒性があると思われる部分は、主に抗原タンパ
ク質の疎水性領域であり、その部分を欠損させた遺伝子
を種々の方法により作製し、大腸菌でタンパク質を発現
させることに成功した例もある。

【０００６】しかしながら、それらはＮ末端（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，１９８
３，３５８１−３５９１、Ｇｅｎｅ，３０，１９８４，
２０１−２１０）、又は、Ｃ末端（Ｇｅｎｅ，１６０，
１９９５，１７９−１８４）のどちらか一方のみを何残
基か欠損させたものであったり、欠損させるアミノ酸の
数が少ないものであったりし、発現量は多いものではな
かった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、高い抗原活性を有する組み換え型Ｂ型肝炎ウイルス
表面抗原を大量に生産することができる組み換え型Ｂ型
肝炎ウイルス表面抗原の調製方法及び組み換え型Ｂ型肝
炎ウイルス表面抗原を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、Ｂ型肝炎ウイ
ルス表面抗原のＳ抗原の４つの抗原部位を含む抗原決定
領域と、膜貫通領域を形成する少なくとも４つのアミノ
酸をコードする領域を含む遺伝子を用いて調製すること
を特徴とする組み換え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の調
製方法及び組み換え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原であ
る。以下に、本発明を詳述する。

【０００９】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、コア粒子
とそれらを取り囲むエンベロープ（表面）とからなる二
重構造をなしており、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（以
下、ＨＢｓ抗原という）は、Ｓ抗原、ｐｒｅ−Ｓ１抗原
及びｐｒｅ−Ｓ２抗原の３種類の抗原により構成されて
いる。上記ＨＢｓ抗原は、ＨＢＶ−ＤＮＡのＳ抗原遺伝
子、Ｓ抗原遺伝子の上流のｐｒｅ−Ｓ１抗原遺伝子及び
ｐｒｅ−Ｓ２抗原遺伝子によりコードされている。本明
細書中、上記ＨＢｓ抗原とは、Ｓ抗原のみのもの、Ｓ抗
原及びｐｒｅ−Ｓ１抗原が連結したもの、並びに、Ｓ抗
原、ｐｒｅ−Ｓ１抗原及びｐｒｅ−Ｓ２抗原が連結した
もののことをいう。

【００１０】ＨＢｓ抗原には、主に４種のサブタイプ、
即ち、ａｄｗ型、ａｄｒ型、ａｙｗ型及びａｙｒ型が知
られており、Ｓ抗原の特定部位におけるアミノ酸の違い
によりサブタイプが決定される。本発明でいうＢ型肝炎
ウイルス表面抗原のＳ抗原の４つの抗原部位とは、ｄ／
ｙを決定する抗原部位であるＨＢｓ抗原のＳ抗原Ｎ末端
から１２２番目のアミノ酸、また、ｒ／ｗを決定する抗
原部位であるＳ抗原Ｎ末端から１６０番目のアミノ酸、
共通ａ抗原を決定する部位であるＳ抗原Ｎ末端から１２
６番目及び１４５番目のアミノ酸のことをいう。発明で
いうＢ型肝炎ウイルス表面抗原のＳ抗原の４つの抗原部
位を含む抗原決定領域は、Ｓ抗原において少なくとも４
つの抗原部位を含んでいれば、欠失、置換、付加、挿入
など改変がされていてもよい。好ましくは、天然型のＢ
型肝炎ウイルス表面抗原のＳ抗原の抗原決定領域、すな
わち、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のＳ抗原のＮ末端から
１００〜１７０番目のアミノ酸をコードする領域若しく
はそれに近いものが挙げられる。

【００１１】ＨＢｓ抗原のａｄｒ型のＳ抗原遺伝子を配
列表の配列番号１（Ｌｏｎｃａｒｅｖｉｃ，Ｉ．Ｆ．ｅ
ｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１８，４９４０）に、ａｄｗ型のＳ抗原遺伝子
を配列番号２（Ｏｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，１９８３，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，１７４
７）にそれぞれ示す。また、ａｄｒ型、ａｄｗ型の遺伝
子を大腸菌で頻度が高いコドンに置き換えた配列を、配
列番号３、配列番号４に示す。

【００１２】本発明でいう膜貫通領域を形成する少なく
とも４つのアミノ酸とは、αヘリックスを形成しうるも
のであれば、特に限定されない。一般的にαヘリックス
を形成しやすいアミノ酸として、アラニン、グルタミン
酸、ロイシン、メチオニンなどが知られている。尚、膜
貫通領域の形成を阻害しない範囲で、他のアミノ酸が付
与されていてもよい。アミノ酸が４つ未満の場合には、
αヘリックスを形成することができない。天然のＢ型肝
炎ウイルスの表面抗原部分は脂質膜に一部が埋もれた構
造を持つことが知られており（坂本 穣ら、1997、検査
と技術、25(7)、280-284）、上記膜貫通領域を形成する
少なくとも４つのアミノ酸をコードする領域を含むこと
により、上記抗原部位の構造が安定し、高い抗原活性を
有する組み換え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を調製する
ことができる。上記膜貫通領域は、実験的、あるいは計
算化学的に推定することができる（Stirk, H. J. et a
l., 1992, Intervirology, 33, 148-158; Berting, A.
et al.,1995, Intervirology, 38, 8-15）。

【００１３】上記膜貫通領域を形成する少なくとも４つ
のアミノ酸としては、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のＳ抗
原における膜貫通領域を形成するアミノ酸から選ばれる
ことが好ましく、具体的には、Ｓ抗原のＮ末端から９〜
２７番目のアミノ酸の膜貫通領域Ｉ（以下ＴＭＩとい
う）、Ｓ抗原のＮ末端から７７〜１００番目のアミノ酸
の膜貫通領域ＩＩ（以下ＴＭＩＩという）、Ｓ抗原のＮ
末端から１７０〜１８７番目のアミノ酸の膜貫通領域Ｉ
ＩＩ（以下ＴＭＩＩＩという）、Ｓ抗原のＮ末端から１
８９〜２０９番目のアミノ酸の膜貫通領域ＩＶ（以下Ｔ
ＭＩＶという）が挙げられる。このアミノ酸の膜貫通領
域は、文献や計算ソフトにより推定可能であり、数残基
程度前後することがある。

【００１４】本発明で用いられるＢ型肝炎ウイルス表面
抗原のＳ抗原の遺伝子としては、感染患者から分離され
るＢ型肝炎ウイルスのゲノムＤＮＡからクローン化した
ものを用いることが可能である。また、化学合成と遺伝
子工学的手法との組み合わせによって調製される合成遺
伝子を使用することも可能である。

【００１５】本発明で用いられるＢ型肝炎ウイルス表面
抗原のＳ抗原の４つの抗原部位を含む抗原決定領域と、
膜貫通領域を形成する少なくとも４つのアミノ酸をコー
ドする領域を含む遺伝子の全長は、５０４塩基対以下で
あることが好ましい。これ以上だと、得られるＢ型肝炎
ウイルス表面抗原の発現量が少なくなる恐れがある。

【００１６】本発明の組み換え型ＨＢｓ抗原の調製方法
において、上記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のＳ抗原の４
つの抗原部位を含む抗原決定領域と、膜貫通領域を形成
する少なくとも４つのアミノ酸をコードする領域を含む
遺伝子（以下、組み換え遺伝子という）を作製する方法
としては特に限定されず、例えば、制限酵素を用いる方
法、ＰＣＲによる方法等の通常の遺伝子工学的手法を用
いることができる。なかでも、簡便性の点から、制限酵
素部位をつけた適当なプライマーを設計し、ＰＣＲによ
り作製する方法が好ましい。また、遺伝子のプライマー
を設計する際にヒスチジン部位、またはヒスチジン部位
及びトロンビン等のプロテアーゼ切断部位をもつ遺伝子
プライマーを設計し、それを用いたＰＣＲによって本発
明で用いられる組み換え遺伝子を調製してもよい。

【００１７】本発明の組み換え型ＨＢｓ抗原の調製方法
において、上記組み換え遺伝子を発現させる方法として
は特に限定されないが、上記組み換え遺伝子を、タンパ
ク質折り畳み因子をコードする遺伝子とともに共発現さ
せる方法等が好適に用いられる。上記タンパク質の折り
畳み因子は、タンパク質の正常な立体構造形成の効率を
向上させるので、宿主中で共発現させることにより、組
み換え型ＨＢｓ抗原の発現量を増大させることができ
る。上記タンパク質折り畳み因子としては、例えば、ジ
スルフィド結合異性化酵素、ペプチジルプロリルシスト
ランスイソメラーゼ（以下、ＰＰＩアーゼという）、シ
ャペロン等が挙げられる。なお、本明細書中において、
共発現とは２種以上の遺伝子を宿主中で発現させること
を意味する。

【００１８】上記ジスルフィド結合異性化酵素は、酸化
還元剤存在下でタンパク質のジスルフィド結合の組み換
えを促進する。上記ジスルフィド結合異性化酵素は、ほ
とんど全ての生物に存在し、数多くのその遺伝子がクロ
ーン化されており、これらを利用することが可能であ
る。例えば、真核生物では、プロテインジサルフィドイ
ソメラーゼ（ＰＤＩ）があり、バクテリアでは、プロテ
インジサルフィドイソメラーゼの活性モチーフを有する
チオレドキシンであるＤｓｂファミリーが存在する。

【００１９】上記ジスルフィド結合異性化酵素遺伝子を
調製する方法としては、上記組み換え遺伝子の調製方法
として例示した方法等が挙げられる。例えば、ゲノムＤ
ＮＡを鋳型として、適当な制限酵素サイトを含むように
一部の塩基配列を合成してＰＣＲ用プライマーを作製
し、それを用いたＰＣＲ法によって調製することができ
る。

【００２０】上記ＰＰＩアーゼとは、プロリン残基のＮ
末端側ペプチド結合の回転を促進する作用を有する酵素
である。上記ＰＰＩアーゼは、ほとんど全ての生物に存
在し、その遺伝子の数多くのものがクローン化されてい
るので、これらを利用することが可能である。上記ＰＰ
Ｉアーゼ遺伝子を調製する方法としては、上記組み換え
遺伝子の調製方法として例示した方法等が挙げられる。

【００２１】上記シャペロンは、熱ショックタンパク質
の一種であり、細胞が温度変化等の様々な環境ストレス
に曝された際に生産され、ＡＴＰ存在下、タンパク質の
折り畳みや安定化に関与することが知られている。上記
シャペロンとしては、バクテリア型のＧｒｏｕｐＩ型、
並びに、真核生物及び古細菌型のＧｒｏｕｐＩＩ型シャ
ペロンが知られており、いずれも好適に用いられる。上
記シャペロン遺伝子を調製する方法としては、上記ＨＢ
ｓ抗原遺伝子の調製方法として例示した方法等が挙げら
れる。

【００２２】本発明の組み換え型ＨＢｓ抗原の調製方法
において、上記宿主としては特に限定されず、例えば、
大腸菌等の細菌、酵母、昆虫、動物細胞等が挙げられ
る。なかでも、培養日数が短い点及び培養操作が簡便な
点から、宿主は、細菌又は酵母であることが好ましい。

【００２３】また、この中でも特に大腸菌が培養操作及
びその後の蛋白質精製操作が簡便であるという点から望
ましく、大腸菌の中でも特に、タンパク質のジスルフィ
ド結合を還元する酵素を少なくとも１つ欠損させた大腸
菌（以下ジスルフィド結合還元酵素欠損株という。）で
あることが好ましい。上記タンパク質のジスルフィド結
合を還元する酵素としては、大腸菌の細胞内の２種類の
ジスルフィド結合還元システムであるチオレドキシンシ
ステムとグルタチオンシステムに関与する酵素であるチ
オレドキシンリダクターゼとグルタチオンリダクターゼ
が挙げられる。これらの酵素を少なくとも１つ、より好
ましくは２つ欠損させたものが挙げられる。これらのジ
スルフィド結合還元酵素欠損株を宿主として用いると、
大腸菌内ではジスルフィド結合が還元されず、タンパク
質のＳ−Ｓ結合が形成されたままとなり、タンパク質本
来の構造が保たれた状態でタンパク質が生産される。こ
のことにより、タンパク質の可溶性が向上し、生産量を
増加させることができる。特にＨＢｓ抗原は、ジスルフ
ィド結合を形成するアミノ酸であるシステイン含量は２
０〜２５％と非常に高いため、ジスルフィド結合還元酵
素欠損株を用いる効果が非常に大きい。

【００２４】本発明の組み換え型ＨＢｓ抗原の調製方法
において、上記組み換え遺伝子と、ジスルフィド結合異
性化酵素遺伝子、ＰＰＩアーゼ遺伝子、シャペロン遺伝
子等のタンパク質折り畳み因子の遺伝子とを共発現させ
る方法としては、別々のベクターに挿入する方法、同じ
ベクターに挿入する方法が挙げられる。上記別々のベク
ターに挿入する方法としては、まず、上記組み換え遺伝
子と上記タンパク質折り畳み因子の遺伝子とをそれぞれ
共存可能な別々のベクターに挿入して、２種のプラスミ
ドを作製する。次いで、上記２種のプラスミドで上記宿
主を形質転換する。上記ベクターには、予め互いに異な
る任意の薬剤耐性遺伝子が導入されたものを使用し、２
種のプラスミドが組み込まれた形質転換体をその薬剤存
在下で培養することによって、２種の薬剤耐性遺伝子が
ともに発現したものを選択することができる。

【００２５】上記宿主として大腸菌を使用する場合、例
えば、クローン化した上記組み換え遺伝子をｐＢＲ系の
Ｔ７プロモーター等を有する発現ベクターに挿入してＨ
Ｂｓ抗原発現プラスミドを作製し、一方、ｐＢＲ系ベク
ターと共存可能であるｐＡＣＹＣベクター等に、Ｔ７プ
ロモーター、ターミネーター等とともにジスルフィド結
合異性化酵素遺伝子、ＰＰＩアーゼ遺伝子、シャペロン
遺伝子等のタンパク質折り畳み因子の遺伝子を導入す
る。ＨＢｓ遺伝子発現プラスミド及びタンパク質折り畳
み因子の遺伝子発現プラスミドに、互いに異なる任意の
薬剤耐性遺伝子を導入することによって、２種の発現プ
ラスミドを大腸菌内で維持させることが可能となる。

【００２６】また、上記同じベクターに挿入する方法と
しては、上記組み換え遺伝子及び上記タンパク質折り畳
み因子の遺伝子を同一のベクターに、タンデム又は逆方
向に並べて挿入する方法が挙げられる。

【００２７】上記宿主として大腸菌を使用する場合、例
えば、ｐＢＲ系のＴ７プロモーターを有する発現ベクタ
ーを用い、Ｔ７プロモーター制御下のジスルフィド結合
異性化酵素遺伝子、ＰＰＩアーゼ遺伝子、シャペロン遺
伝子等のタンパク質折り畳み因子発現ユニットと、同じ
くＴ７プロモーター制御下のＨＢｓ抗原発現ユニットと
をタンデムに設置する。又は、上記タンパク質折り畳み
因子発現ユニットと、上記ＨＢｓ抗原発現ユニットとを
逆向きに設置してもよい。この発現ベクターが組み込ま
れた形質転換体を、そのベクターが耐性をもつ薬剤存在
下で培養し、発現誘導することにより、宿主中でタンパ
ク質折り畳み因子遺伝子と、上記組み換え遺伝子とを共
発現させることができる。

【００２８】上記組み換え遺伝子及び上記タンパク質折
り畳み因子の遺伝子が上記宿主中で共発現していること
は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）を行い、それらの遺伝子産物
の分子量を測定することにより確認することができる。

【００２９】発現した組み換え型ＨＢｓ抗原を精製する
方法としては特に限定されず、例えば、硫安分画、ゲル
濾過カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロ
マトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、等の常法により行うこ
とができる。

【００３０】得られた組み換え型ＨＢｓ抗原の活性測定
法としては特に限定されず、例えば、天然型ＨＢｓ抗原
に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を
作製し、それらを使った酵素免疫測定法（ＥＩＡ）やＲ
ＩＡ等により行うことができる。上記ＨＢｓ抗原の活性
測定法には、市販の分析キット等を利用することも可能
である。

【００３１】本発明の組み換え型ＨＢｓ抗原の調製方法
は、上述のような構成からなるので、高い抗原活性を有
する組み換え型ＨＢｓ抗原を簡便に大量に調製すること
ができる。本発明の組み換え型ＨＢｓ抗原の調製方法に
より得られる組み換え型ＨＢｓ抗原もまた本発明の１つ
である。

【００３２】

【発明の実施の形態】以下に実施例を挙げて本発明を更
に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限
定されるものではない。

【００３３】実施例１ （プラスミドの作製）配列番号３に示されるａｄｒ型Ｈ
Ｂｓ抗原のＳ抗原遺伝子のうち、Ｎ末端の１〜７４番目
までのアミノ酸及びＣ末端の１〜３９番目までのアミノ
酸をコードする領域を欠損させ、Ｎ末端にヒスチジン６
残基分のタグ部分とトロンビン切断部位が付加させ、４
つの抗原部位を含む抗原決定領域と上記ＴＭＩＩと上記
ＴＭＩＩＩを含む遺伝子をＰＣＲにより作製した。これ
をＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断後、同制限酵素処理が施
されたＴ７プロモーターを有する発現ベクターに導入し
てｐＴＨＢＮｏ．１を作製した。

【００３４】（大腸菌によるタンパク質の発現）発現ベ
クターｐＴＨＢＮｏ．１を保持する大腸菌をカルベニシ
リン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹＴ培地（トリプ
トン２０ｇ、酵母エキス８ｇ、ＮａＣｌ１５ｇ／Ｌ）に
てＯＤ６００ｎｍが０．６−１．０まで３７℃で培養し
た後、１ｍＭＩＰＴＧを添加することによって発現を誘
導した。ＩＰＴＧ添加後、更に３時間培養を行い、菌体
を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の発
現を確認した結果、約１０ｋＤａのタンパク質に相当す
るバンドが検出された。

【００３５】（発現タンパク質の精製）得られた発現タ
ンパク質を含む、超音波破砕した菌体の可溶性画分を、
ニッケルカラム（HiTrap Chelating カラム； Amersham
Pharmacia Biotech社製）で常法に従って精製し、この
タンパク質のヒスチジンタグ部分をトロンビンによって
切断した。約１３ｋＤａの回収画分についてＮ末端アミ
ノ酸配列分析を行った結果、上記Ｎ末端及びＣ末端欠損
ＨＢｓ抗原（以下、ＨＢＮｏ．１という）であることが
判明した。回収されたＨＢＮｏ．１のタンパク質量を表
１に示す。

【００３６】（抗原性の評価）回収されたＨＢＮｏ．１
の０．１５μｇを、５０ｍＭ Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で希釈した後、更にヒト管理血清Ｌ−コンセ
ーラＮ「ニッスイ」（日水製薬社製）で０．０１５μｇ
／ｍＬにまで希釈した。抗原希釈液の抗原性を、ＨＢｓ
抗原測定用ＥＩＡキット、エンザイグノスト−ＨＢｓＡ
ｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＩＩ（デイド・ベーリング
社製）によって評価した。結果を表１に示す。同様に患
者由来天然型ＨＢｓ抗原についても評価した。結果を表
１に示す。

【００３７】（抗ＨＢｓ抗体検査）得られたＨＢＮｏ．
１が固相化された９６穴プレートを用いて、Ｂ型肝炎感
染患者抗体陽性血清２０検体について抗ＨＢｓ抗体検査
を行った。なお、上記Ｂ型肝炎感染患者抗体陽性血清
は、患者プール血清から精製された固相化ＨＢｓ抗原を
用いるＥＩＡによって陽性であったものを用いた。検査
結果を表１に示す。

【００３８】実施例２ （プラスミドの作製）配列番号３に示されるａｄｒ型Ｈ
Ｂｓ抗原のＳ抗原遺伝子のうち、Ｎ末端の１〜７４番目
までのアミノ酸及びＣ末端の１〜５７番目までのアミノ
酸をコードする領域を欠損させ、Ｎ末端にヒスチジン６
残基分のタグ部分とトロンビン切断部位が付加させ、４
つの抗原部位を含む抗原決定領域と上記ＴＭＩＩを含む
遺伝子をＰＣＲにより作製した。これをＮｄｅＩ−Ｂａ
ｍＨＩで切断後、同制限酵素処理が施されたＴ７プロモ
ーターを有する発現ベクターに導入してｐＴＨＢＮｏ２
を作製した。

【００３９】（大腸菌によるタンパク質の発現）発現ベ
クターｐＴＨＢＮｏ．２を保持する大腸菌をカルベニシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＹＴ培地（トリプ
トン２０ｇ、酵母エキス８ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）にて
ＯＤ６００ｎｍが０．６−１．０まで３７℃で培養した
後、１ｍＭＩＰＴＧを添加することによって発現を誘導
した。ＩＰＴＧ添加後、さらに３時間培養を行い、菌体
を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の発
現を確認した結果、約１２ｋＤａのタンパク質に相当す
るバンドが検出された。

【００４０】（発現タンパク質の精製）発現タンパク質
を含む、超音波破砕した菌体の可溶性画分を、ニッケル
カラム（HiTrap Chelating カラム； Amersham Pharmac
ia Biotech社製）で常法に従って精製し、このタンパク
質のヒスチジンタグ部分をトロンビンによって切断し
た。約１０ｋＤａの回収画分についてN末端アミノ酸配
列分析を行った結果、上記N末端及びC末端欠損ＨＢｓ抗
原（以下、ＨＢＮｏ．２という）であることが判明し
た。回収されたＨＢＮｏ．２のタンパク質量を表１に示
す。

【００４１】（抗原性の評価）ＨＢＮｏ．２を用いて、
実施例１と同様にして抗原性を評価した。結果を表１に
示す。

【００４２】実施例３ 大腸菌を、タンパク質のジスルフィド結合を還元する酵
素であるチオレドキシンリダクターゼを欠損させた大腸
菌に変更したこと以外は実施例１と同様にしてタンパク
質の発現を行い、発現タンパク質の精製を行った。回収
されたタンパク質量、抗原性の評価結果を表１に示す。

【００４３】実施例４ 大腸菌を、タンパク質のジスルフィド結合を還元する酵
素であるチオレドキシンリダクターゼとグルタチオンリ
ダクターゼの２つを欠損させた大腸菌に変更したこと以
外は実施例１と同様にしてタンパク質の発現を行い、発
現タンパク質の精製を行った。回収されたタンパク質
量、抗原性の評価結果を表１に示す。

【００４４】比較例１ （プラスミドの作製）配列番号３に示されるａｄｒ型Ｈ
Ｂｓ抗原のＳ抗原遺伝子（アミノ酸を全く欠損させない
天然型）を作製した。この遺伝子を、実施例１と同様に
して発現ベクターに導入し、ｐＴＨＢを作製した。 （大腸菌によるタンパク質の発現と発現タンパク質の精
製）得られたｐＴＨＢを用いて実施例１と同様の操作を
行ったが、可溶性のタンパク質を回収することはできな
かった。 （抗原性の評価）患者由来天然型ＨＢｓ抗原を用いて、
実施例１と同様にして抗原性を評価した。結果を表１に
示す。 （抗ＨＢｓ抗体検査）患者由来天然型ＨＢｓ抗原を用い
て、実施例１と同様にして抗ＨＢｓ抗体検査を行った。
結果を表１に示す。

【００４５】

【表１】

【００４６】

【発明の効果】本発明の組み換え型ＨＢｓ抗原の調製方
法は、上述の構成より成るので、抗原活性の高い組み換
え型ＨＢｓ抗原を安価に得ることができ、それを用いる
ことにより免疫測定試薬の製造等に有用である。

【００４７】

【配列表】 <110> 積水化学工業株式会社 SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. <120> 調製方法及び抗原 <130> 00P01661 <160> 4 <210> 1 <211> 681 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 1 atg gag aac aca aca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag 48 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc cta aca ata cca cag agt cta 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cag tca cca acc tct 192 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn Gln Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 aca tca act acc agc acg gga cca tgc aag acc tgc acg att cct gct 384 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 caa gga acc tct atg ttt ccc tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac 432 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 gga aac tgc act tgt att ccc atc cca tca tcc tgg gct ttc gca aga 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 ttc cta tgg gag ggg gcc tca gtc cgt ttc tcc tgg ctc agt tca cta 528 Phe Leu Trp Glu Gly Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Ser Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tca gtt ata tgg atg atg tgg tat tgg gga cca agt ctg tac aac atc 624 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 ttg agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta 672 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att taa 681 Tyr Ile 225 <210> 2 <211> 678 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 2 atg gag aac atc aca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag 48 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata ccg cag agt cta 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga tca ccc gtg tgt 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys 35 40 45 ctt ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tcc 192 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgt cct cca att tgt cct ggt tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc tta ttg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gat tat caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta att cca gga 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 tca aca aca acc agt acg gga cca tgc aaa acc tgc acg act cct gct 384 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125 caa ggc aac tct aag ttt ccc tca tgt tgc tgt aca aaa cct acg gat 432 Gln Gly Asn Ser Lys Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp 130 135 140 gga aat tgc acc tgt att ccc atc cca tcg tcc tgg gct ttc gca aaa 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 tac cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tct tgg ctc agt tta cta 528 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tca gct ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac agc atc 624 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 gtg agt ccc ttt ata ccg ctg tta cca att ttc ttt tgt ctc tgg gta 672 Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att 678 Tyr Ile 225 <210> 3 <211> 678 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 3 atg gaa aac act act tct ggt ttc ctg ggt ccg ctg ctg gta ctg cag 48 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gca ggt ttc ttc ctg ctg aca cgt atc ctc aca att cca cag tct ctg 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tct tgg tgg act tct ctc aat ttt ctg ggt ggt gca ccg act tgc 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 cct ggc caa aat tct cag tcc cca acc tcc aat cac tct cca acc tct 192 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgc cct cca att tgc cct ggc tat cgc tgg atg tgc ctg cgt cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc att ttc ctc ttc atc ctg ctg ctg tgc ctc atc ttc ctg ctg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gac tac caa ggt atg ctg cca gtt tgc cct ctg ctt cca ggt 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 aca tct acc acc agc act ggt cca tgc aag acc tgc act att cct gct 384 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 caa ggt acc tct atg ttt ccg tct tgc tgc tgc aca aaa cct tct gac 432 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 ggt aac tgc act tgc att ccg atc cca tct tcc tgg gct ttc gca cgt 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 ttc ctg tgg gag tgg gcc tct gtc cgt ttc tcc tgg ctc tct ctg ctg 528 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggt ctg tct ccg act gtt tgg ctg 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tct gtt att tgg atg atg tgg tat tgg ggt cca tct ctg tac aac atc 624 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 ctg tct ccg ttt ctg cct ctg ctg cca att ttc ttc tgc ctt tgg gta 672 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att 678 Tyr Ile 225 <210> 4 <211> 678 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 4 atg gaa aac act act tct ggt ttc ctg ggt ccg ctg ctg gta ctg cag 48 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gca ggt ttc ttc ctg ctg aca cgt atc ctc aca att cca cag tct ctg 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tct tgg tgg act tct ctc aat ttt ctg ggt ggt gca ccg act tgc 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 cct ggc caa aat tct cag tcc cca acc tcc aat cac tct cca acc tct 192 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgc cct cca att tgc cct ggc tat cgc tgg atg tgc ctg cgt cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc att ttc ctc ttc atc ctg ctg ctg tgc ctc atc ttc ctg ctg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gac tac caa ggt atg ctg cca gtt tgc cct ctg ctt cca ggt 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 aca tct acc acc agc act ggt cca tgc aag acc tgc act att cct gct 384 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 caa ggt acc tct atg ttt ccg tct tgc tgc tgc aca aaa cct tct gac 432 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 ggt aac tgc act tgc att ccg atc cca tct tcc tgg gct ttc gca aaa 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 ttc ctg tgg gag tgg gcc tct gtc cgt ttc tcc tgg ctc tct ctg ctg 528 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggt ctg tct ccg act gtt tgg ctg 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tct gtt att tgg atg atg tgg tat tgg ggt cca tct ctg tac aac atc 624 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 ctg tct ccg ttt ctg ccg ctg ctg cca att ttc ttc tgc ctt tgg gta 672 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att 678 Tyr Ile 225

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA33 CA01 EA04 GA11 HA11 4B064 AG33 BA13 CA02 CA06 CA19 CC24 CE02 CE10 DA01 DA13 4B065 AA26X AA72X AA96Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C085 AA08 BA89 DD21 DD62 4H045 AA11 BA10 BA32 CA02 DA86 EA31 EA50 EA53 EA54 FA74 GA21 HA05

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のＳ抗原の４
   つの抗原部位を含む抗原決定領域と、膜貫通領域を形成
   する少なくとも４つのアミノ酸をコードする領域を含む
   遺伝子を用いて調製することを特徴とする組み換え型Ｂ
   型肝炎ウイルス表面抗原の調製方法。
2. 【請求項２】 上記抗原決定領域のＮ末端に、膜貫通領
   域を形成する少なくとも８個のアミノ酸をコードする領
   域を有する遺伝子を用いて調製することを特徴とする請
   求項１記載の組み換え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の調
   製方法。
3. 【請求項３】 上記抗原決定領域のＮ末端に、膜貫通領
   域を形成する８〜４０個のアミノ酸をコードする領域を
   有する遺伝子を用いて調製することを特徴とする請求項
   １〜２記載の組み換え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の調
   製方法。
4. 【請求項４】 上記抗原決定領域のＣ末端に、膜貫通領
   域を形成する少なくとも８つのアミノ酸をコードする領
   域を有する遺伝子を用いて調製することを特徴とする請
   求項１〜３記載の組み換え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
   の調製方法。
5. 【請求項５】 上記抗原決定領域のＣ末端に、膜貫通領
   域を形成する８〜６０個のアミノ酸ををコードする領域
   を有する遺伝子を用いて調製することを特徴とする請求
   項１〜４記載の組み換え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の
   調製方法。
6. 【請求項６】 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のＳ抗原のＮ
   末端から１００〜１７０番目のアミノ酸をコードする領
   域を上記抗原決定領域とし、上記抗原決定領域のＮ末端
   に、上記膜貫通領域としてＢ型肝炎ウイルス表面抗原の
   Ｓ抗原のＮ末端から７５〜１００番目のアミノ酸をコー
   ドする領域、上記抗原決定領域のＣ末端に、上記膜貫通
   領域としてＢ型肝炎ウイルス表面抗原のＳ抗原のＮ末端
   から１７０〜１８７番目のアミノ酸をコードする領域を
   有する遺伝子を用いて調製することを特徴とする請求項
   １〜５記載の組み換え型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の調
   製方法。
7. 【請求項７】 上記遺伝子の全長が５０４塩基対以下で
   あることを特徴とする請求項１〜６記載の組み換えＢ型
   肝炎ウイルス表面抗原の調製方法。
8. 【請求項８】 宿主として、細菌又は酵母を用いること
   を特徴とする請求項１〜７記載の組み換えＢ型肝炎ウイ
   ルス表面抗原の調製方法。
9. 【請求項９】 宿主として、タンパク質のジスルフィド
   結合を還元する酵素を少なくとも１つ欠損させた大腸菌
   を用いることを特徴とする請求項１〜８記載の組み換え
   Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の調製方法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜９記載の組み換えＢ型肝炎
    ウイルス表面抗原の調製方法によって得られることを特
    徴とするＢ型肝炎ウイルス表面抗原。