JPS6322098A - Ｂ型肝炎ウイルス抗原とその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原（以下、ｒ＋ｓ
ｓ抗原」という）に関するものである。

更に詳しくは、ＨＢｓ抗原に随伴するポリペプチド、プ
レー）（ＢｓＫ原（Ｊ：Ｊ、’ＦｒＰｒｅＳＪという）
に含まれるアミノ酸１０個のポリペプチドを有するＨＢ
ｓ抗原に関する、本発明の抗原は、安全性、有効性並び
に均質性を兼眞した高純度の８型旺−炎ワクチンとして
優れて有用であり、しかも、安価かつ安全に大量生産で
きるものである。本発明の抗原は、高度の免疫学的特異
性を有するため、抗Ｂ型肝炎ウィルスの優れた診断剤と
して有用であると共に、抗ウイルス抗体の作成にも使用
できる。

［従来の技術］ 急性並びに慢性のＢ型肝炎、及び慢性のＢ型肝炎に連座
して生じる肝硬変並びに肝癌は、いずれも、Ｂ型肝炎ウ
ィルスの感染の関与していることが知られている。また
１Ｂ型肝炎の患者は、東南アジア及びアフリカ中央部の
多発地帯を中心にして全世界に分散して潜在しており、
その数は約２１人に遠い日本での潜在的患者数は、人口
の約２．５％に当たる約３００万人であると５１算され
ている。従って、Ｂ型肝炎は日本のみならず、全世界の
重大感染症であり、その予防、早期診断及び治療は、世
界的な重要課題になっている。

Ｂ型肝炎ウィルスの完全粒子は、ディン粒子と呼ば机、
直径が約４２ｎｍの球形の大型粒子であり、その表面は
ＨＢｓ抗原で覆われており、−方、その内部には直径約
２７ｎｍのコアを有する。

コアには、部分的に一本鎖からなる全体として環状の二
本！１１ＤＮＡ、及びＯＮΔポリメラーゼが存在する。

ウィルス遺伝子としてのＨＤＮＡの艮ざは、−末鎖の部
分を二本鎖に人工ｆ）’Ｊ１．：Ｉ復させた完全な二本
鎖の状態では、約３２００塩基対に相当する。ＨＢｓ抗
原は２２６ｆＡのアミノ酸のポリペプチドであり、その
平均分子母は２．４Ｘ１０６ダルトンである。自然状態
下の一部のＨＢｓにはＰｒｅ３が随伴し結合していると
考えられている。尚、Ｐｒｅ３は、１６３仏の７ミノ酪
からなるポリペプチドである。また、ＨＢｓ抗原は、そ
の抗原性についての診断学及び疫学では大戦、４種の亜
型、ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、及びａｙｗの各型に分類
されており、日本を含むアジア諸ｌではａｄｒ型が、一
方、欧米諸国ではａｄｗ型が分布の主流を占めているこ
とが知られている。

［発明が解決しようとする問題点］ Ｂ型肝炎ウィルスは、その宿主域が極めて狭く、ヒト及
びチンパンジーに限られており、ウィルス培養宿主とし
て細胞培養を用いて生産することが不可能である。その
ため、ＨＢＳ抗原は、高濃度のＢ型肝炎つィルス粒子の
保持者である無症候キャリアーの血液から、遠心法、ｌ
ｉｉ！１安沈′Ｒ法等により分離精製されている。しか
しながら、かかるヒト血液の供給口には限度があるため
、世界の需要を満たす（まどＨＢｓ抗原を大」生産する
ことはできない。このことが、ＨＢｓ抗原が貴重かつ高
価であることの要因になっている。

上記は、当業者の衆知するところであり、これを解決す
るため、すてに槌々の試みがなされている。例えば、組
換えＤＮ、Ａ技術を用いてＨＢｓ抗原を大腸菌、枯草菌
、シュードモナス几菌、酵母、カビ類等の形質転換体で
生産（特開昭５５−１０４８８７、特開昭５６−６３９
９５．特開昭５７−１８１０９９．特開昭５７〜２０９
２９８゜特開昭５９−４８０８２．特開昭５９−３１７
９９つ、特開昭５９−３６６９９．特開昭５９−７４９
８８．特開昭６０−８９４３１．公表昭５６−５０１１
２８）；組換えＤＮＡ技術を用いてＨ３ｓ抗原を体ｌｌ
１ｌ胞培養の形質転換体で生産（特開昭５８−９９５）
；Ｂ型肝炎ウィルスの持続感染培養細胞系で）−Ｉ　Ｂ
　Ｓ抗原を生産（特開昭５６−１５００２０）；ＨＢｓ
抗原ノ化学合成（［［５７−１３６５２７）等をあげる
ことができる。しかしながらこれらの試みは、ＨＢＳ抗
原の生産収率や免疫原性、更には、品質に関し、難点及
び欠陥があるため、未だ実用化されていない。

［問題点を解決するための手段及び作用］本発明者らは
、前記問題点を解決すべく鋭意研究を行った結果、Ｂ型
肝炎ウィルス（以下［ＨＢＶＪという）の感染防１ｌＩ
Ｉの１能を有するＨＢＳ抗原並びにｐｒｅ３をコードす
る遺伝子ＤＮＡをクローニングすることに成功した。更
に、クローニングにより得られたＤＮＡの塩基配列を決
定すると共に、かかるクローニングされたＤＮＡを組換
え遺伝子技術により発現させたところ、優れた免疫原性
と品質とを兼備したＨＢｓ抗原が安全かつ安価に、しか
も安定して出産できることを見出した。本発明者らは、
これらの知見に基づき、本発明を完成した。

本発明によれば、次式（１）： ％式％ （式中Ａｌａはアラニン、Ａｒｏはアルギニン。

Ａｓｎはアスパラギン、ＡＳｐはアスパラギン酸。

ＣｙＳはシスティン、Ｇｌｎはグルタミン、ＧＩＵはグ
ルタミン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、
Ｉｌｅはインロイシン、Ｌｙｓはリジン、１−ｅｕはロ
イシン、Ｍｅｔはメチオニン。

Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏはプロリン。

Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｒｐはトリプ
トファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリンの各残基
をそれぞれ表わす）、で表わされるアミノ酸配列を有す
ることを特徴とするＨＢｓ抗原が提供される。

また、本発明によれば、前記（Ｉ）式で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを用いて、
組換えＤＮＡ技術によりＨＢｓ抗原を産生ずる形質転換
体を取１！！シ、これを培養し、これより単離￥Ｉｉ製
する等によりＨＢｓ抗原を製造する方法が提供される。

更にまた、本発明によれば、前記（Ｉ）で表されるアミ
ノ酸配列を有するＨＢｓ抗原を抗体産生に有効な伍含有
するワクチンが提供される。

本発明のＨＢｓ抗原は前記（Ｉ）式で表されるアミノ酸
配列を有するものであり、前記（１）式で表されるアミ
ノ酸配列は、ＨＢｓ抗原の全アミノ酸２２６ｇ、及びＨ
Ｂｓ抗原に隣接したＰｒｅＳの部分のアミノＭ１０個が
連係したものである。

前記（１）式で表されるアミノ酸配列を有するＨＢｓｉ
原は次のようにして製造することができる。

（Ｉ）ディン粒子（ＨＢＶウィルス完全粒子）のＩＩ−
−ＨＢＶのコアに存在するＨＢｅ抗原の保有者は活動性
肝炎の［１が高いため、その血中にはゲイン粒子の存在
の可能性が高い。従って、ゲイン粒子を取るための出発
材料としてＨＢｅ抗原陽性ｌｔｈ液の使用が望ましい。

尚、ディン粒子のＩＩは公知の常法、例えば、超遠心法
等により行うことができる。

（ｆｆ）内在性ＤＮＡポリメラーゼで修復したＨＢＶＤ
ＮＡの回収−−ＨＢＶの環状の二本鎖ＤＮＡは、部分的
に一本鎖になっているので、ＨＢＶ粒子に内在するＤＮ
Ａポリメラーゼを利用して全領域が二本鎖になるよう常
套の術式により修復する。修復されたＤＮＡの抽出並び
に回収は、フェノール抽出法等、常用の方法で行うこと
ができる。

（Ｉｆｆ）ＨＢＶＤＮＡのクローニングー−この工程で
用いるクローニングベクターとしては、大腸菌、枯草菌
等の原核細胞を宿主とするプラスミド、また、λフ？−
ジ、Ｔ４系ファージ由来のベクターなど、公知のものを
使用できる。この工程では、クローニングベクターとそ
の宿主細胞と組合せて選択使用することが望ましい。ま
た、クローニングされたＨ　Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａの検出
及び同定は、公知の常法、例えば、ブラックハイブリタ
ゼイションやサザンプロットハイプリダイゼイション法
で行うことができる。尚、このとき用いるプローブは、
公知の常法１例えば、後述の実施例２に記載の方法によ
り調製できる。この工程で留意すべき点として、前記（
ＩＦ）工程では、通常、極めて撤回のＨＢＶＤＮＡＬか
回収できないので、かかる微量のＨＢＶＤＮＡをクロー
ニングする場合には、クローニングの確率の高いファー
ジベクターを用いて、予めＨＢＶＤＮＡのクローニング
を達成する必要がある。次いで、クローニングされたＨ
ＢＶＤＮＡをｉ！１幅するため、プラスミドベクターを
用いて再クローニングする必要がある。

（ｒＶ）Ｈａｓ抗原発現プラスミドの構築と改造−−こ
の工程で用いるベクターとしては、大腸菌、枯草菌等の
原核細胞を宿主とする発現ベクター、酵母を含む真核細
胞を宿主とする発現ベクター、発現用シャトルベクター
、ワクシニアウィルス、ＳＶ４０等のウィルス遺伝子由
来の発現ベクターなど公知のものを使用できる。この工
程では、発現ベクターとその宿主細胞とを組合せて選択
使用することが望ましい。この工程で特に留意すべき困
ｎな点として、ＨＢＶＤＮＡと公知の発現ベクターとを
単純に連係したものを宿主細胞に移入することにより得
られた形質転換体では、抗原性、免疫原性等を有するＨ
Ｂｓ抗原の生産がほとんど期待できないことである。従
って、ＨＢＶＤＮＡと公知の発現ベクターとの連係には
大概、次の工夫を要する：所望の抗原性並びに免疫原性
を得るため、ＨＢＶＤＮＡのどの部分を発現ベクターに
連係するかを決定する：ＨＢｓ抗原の産生母を可能な限
り高める：発現産物の抗原性並びに免疫原性を高める：
発現ベクター及びその形質転換体の遺伝的安全性を高め
る二発現産物を細胞外へ分泌させるなどして、電画工程
を容易にする；発現産物が細胞内の蛋白分解醇素により
分解されないようにする；形質転換体の培養条件を可能
な限り単純化し、その培養を容易にする。これらの工夫
は、主に発現ベクターの改造構築により達成できる。

（Ｖ）発現用プラスミドによる酵母の形質転換と形質転
換体Ｎｆｆ１の単離−一発現用ブラスミドの移入による
Ｍｌの形質転換は、アルカリカチオン法等の公知の方法
で行うことができる。また、形質転換体！シ母の１０離
は、予め発現ベクターに組込んだ薬剤耐性、アミノ酸要
求性等の遺伝子の形質発現を指標として達成できる。、
１８標としては、多数のコロニーの中から所望の形質転
換体を釣り上げることになるので、形質転換体の識別又
は検出が迅速かつ容易に行える詣標を選択使用する必要
がある。

（Ｖｌ＞形質転換体ｌｌ？母の培養とＨＢｓ抗原の抽出
−一形質転換体ＩＩＩ母を公知の常法により培養し、Ｈ
Ｂｓ抗原を産出させる。なお、ＨＢｓ抗原の産生聞を高
めると共に、それを安定化するため、培地組成、培養条
件、形質転換体の継代等を適宜選択する。ＨＢＳ抗原の
抽出は、物理的に菌体を破砕するなど公知の常法により
行うことができる。

（Ｖｌ）形質転換体酵母のＨＢｓＢｓ抗原産生側定−一
前記（Ｖｌ＞で肖られた抽出物中のＨＢＳ抗原の産生量
は、公知の常法３例えば、ＨＢＳ抗［ｉｉ（３１１＋定
キツトにより測定できる。

（■）ＨＢＳ構造遺伝子の塩基配列の決定−−ＨＢｓ抗
原の産生のあった形質転換体から発現ベクターを抽出し
、そのベクター上に連係しているＨＢＳＩＩＩＩ造遺伝
子の塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、公知の常
法、例えば、ジデオキシチェインターミネータ−法等に
より行うことができる。

（ｒＸ）生産されたＨＢｓ抗原の分子量の測定と同定−
一公知の常用の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法等により分子量の測定と同定とを行うことができる
。また、抗原性による同定は、常用の寒天ゲル内沈降反
応等で達成できる。

尚、Ｈａｓ抗原の同定は、後述の実施例９にに記載のよ
うに、二つ以上の方法を組合せて用いることにより、確
実に行うことが望ましい。

（Ｘ）生産されたＨＢｓ抗原の免疫原性の検定−一公定
の「生物学的製剤基準」　（厚生省告示用１５９ｉに準
拠し、マウスやモルモットを用いて力価試験を行う必要
がある。

前記工程で最終的にクローニングされたＨＢＳ抗原をコ
ードするＤＮＡは次式（ＩＩ）で表される塩基配列を有
する： ＡＴＧ　ＴＣＧ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＣＣ
Ｔ　ＧＣＡ　ＣＣＧ　ＡＡＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＣＡ
ＣＡ　ＡＣＡ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＴＴＣＣＴＡ　ＧＧＡ
ＣＣＣＣＴＧ　ＣＴＣＧＴＧ　ＴＴＡ　ＣＡＧ　ＧＣＧ
　ＧＧＧ　ＴＴＴ　ＴＴＣＴＴＧ　ＴＴＧ　ＡＣＡ　Ａ
ＧＡ　ＡＴＣＣＴＣＡＣＡ　ＡＴＡ　ＣＣＡ　ＣＡＧＡ
ＧＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣＴＣＧ　ＴＧＧ　ＴＧＧ　ＡＣＴ
　ＴＣＴ　ＣＴＣＡＡＴＴＴＴ　ＣＴＡ　ＧＧＧ　ＧＧ
Ａ　ＧＣＡ　ＣＣＣＡＣＧ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＧＧＣＣ
ＡＡ　ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＣＡＧ　ＴＣＣＣＣＡ　ＡＣＣ
ＴＣＣＡＡＴ　ＣＡＣＴＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＣＴＣＴ　
ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＴＧＴ　ＣＣＴＧＧ
ＣＴＡＴ　ＣＧＣＴＧＧ　ＡＴＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　Ｃ
ＧＧ　ＣＧＴ　ＴＴＴＡＴＣＡＴＡ　ＴＴＣＣＴＣＴＴ
ＣＡＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＴＧＣＣＴＣＡＴＣ
ＴＴＣＴＴＧ　ＴＴＧ　ＧＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＧＡ
ＣＴＡＣＣＡＡ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＴＴＧ　ＣＣＣＧＴ
Ｔ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＣＴＡ　ＣＴＴＣＣＡ　ＧＧＡ　
ＡＣＡ　ＴＣＡ　ＡＣＴ、ＡＣＣＡＧＣＡＣＧ　ＧＧＡ
　ＣＣＡＴＧＣＡＡＧ　ＡＣＣＴＧＣＡＣＧ　ＡＴＴ　
ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＧＧＡＡＣＣＴＣＴ−ＡＴＧ
　ＴＴＴ　ＣＣＣＴＣＴ　ＴＧＴ　ＴＧＣＴＧＴ　ＡＣ
ＡＡＡＡ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＧＡＣＧＧＡ　ＡＡＣＴＧ
ＣＡＣＴ　ＴＧＴ　ＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡ　ＴＣＡ
　ＴＣＣＴＧＧ　ＧＣＴ　ＴＴＣＧＣＡ　ＡＧＡＴＴＣ
ＣＴＡ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＧＣＣＴＣＡ　ＧＴ
ＣＣＧＴ　ＴＴＣＴＣＣＴＧＧ　ＣＴＣＡＧＴ　ＴＴＡ
　ＣＴＡ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＴＴＴ　ＧＴＴＣＡＧ　Ｔ
ＧＧ　ＴＴＣＧＴＡ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　ＴＣＣＣＣＣＡ
ＣＴ　ＧＴＴＴＧＧ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＡＴＡ
　ＴＧＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＴＧＧ　ＴＡＴＴＧＧ　Ｇ
ＧＧ　ＣＣＡ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　ＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴ
ＴＧ　ＡＧＴＣＣＣＴＴＴ　ＴＴＡ　ＣＣＧ　ＣＴＡ　
ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＴＴＣＴＴＴＴＧＴ　ＣＴＴ
　ＴＧＧ　ＧＴＡ　ＴＡＣＡＴＴ・　・　・　・　・　
（ＩＩ） （式中、△はデオキシアデニル酸残基、Ｇはデオキシグ
アニル酸残基、Ｃはデオキシシチジル酸残基及び丁はデ
オキシチミジル酸残基を表わし、式（ｎ）の左端および
右端はそれぞれ５′−水酸基側および３″−水酸基側を
表ゎづ） 上記Ｊ：Ａ基配列配列前記式（Ｉ）のアミノ酸配列を変
えない限り、遺伝Ｂ’ｉ１号の重複に基づき、その１１
基配列の少なくとも１つの塩基を別の塩基と置換するこ
とが可能である。本発明のＨＢｓ抗原は、上記塩基配列
を有するＤＮＡを公知の組換えＤＮＡ技術を用いて複製
可能な発現ベクターに結合して組換え体ＤＮＡを得、こ
れを宿主細胞に移入して形質転換体を得、この形質転換
体を培養することにより産生せしめることができる。前
記式（ｎ）で表される塩基配列を有するＤＮＡは前述の
工程（１）〜ＩＸ）を繰返すことによって１りることが
できる。また、該ＤＮＡはその一部または全部を市販の
ＤＮＡ合成装ＨＷを用いることにより有機合成すること
もできる。

組換えＤＮＡ技術で本発明のＨＢｓ抗原を製造する際に
用いる宿主及び発現ベクターとしては、前述の工程（Ｉ
Ｖ）に記載のものを用いることができる。

形質転換体の培養により産生されたＨＢｓ抗原は形ｉ転
換体の１１１１１１を破砕するなどして抽出した後、公
知の常法、例えば、ろ過、塩析、遠心分離、カラムクロ
マトグラフィー等を組合わせることにより精製すること
ができる。

また、上記塩基配５１］のＤＮＡは、発現ベクターとの
連係技術に基づき、発現ベクター由来のペプチド、リン
カ−由来のペプチド、１０個以外のアミノ酸数からなる
ｐｒｅ３由来のペプチド、ＨＢＳ抗原及びＰｒｅＳ以外
のＨＢＶ構造蛋白由来のペプチド等が付加したペプチド
として発現させることができる。この場合、これらのペ
プチドを化学的または′ＰＩ素的に切断するか、もしく
は抗原性に影響がなければ、そのまま用いることができ
る。

本発明の抗原を遺伝子工学的に製造するために用いるＤ
ＮＡは、その一部または全部を市販のＤＮＡ合成Ｖｉ置
装により有機合成することができる。

また、本発明の抗原は、市販のペプチド合成装Ｍ等によ
り有別合成することができる。更にまた、公知の蛋白学
工学の手法により本発明の抗原の各エピトープのデザイ
ン、合成及び修飾をも容易に行うことができる。

本発明の抗原は、Ｂ型肝炎ワクチンの有効成分として用
いることができる。ワクチンの調製（よ、本発明の抗原
を、滅菌済の生理的食塩水、リン酸緩衝液等の等張液に
添加して行う。この場合、ペプトン、アミノｕ、ｍ類な
どを安定剤として用いることが望ましく、また、本発明
の抗原をホルマリン等であらがしめ固定化してお（こと
も可能である。更に、液状ワクチンだけではなく、免疫
原性を高めるため、アジュバントを添加した沈降ワクチ
ンやリポソームワクチン、また、高度に安定化し輸送を
容易にするため、凍結乾燥ワクチン等をＩＩＩすること
もできる。更にまた、予防接種での被接種率を高め、接
種費用を節減するため、他種ワクチンとの混合ワクチン
をも調製できる。その上、分子接合法や細胞内で關訳後
のｒｉ飾を用いて本発明の抗原に例えば、糖鎖等号導入
し、品質を高めることも可能である。尚、ワクチンのド
ーズ当たりの抗原母は、通常、０．００１〜１０００μ
Ｊである。

また、本則の抗原は、ＨＢＶ感染や肝炎患者な対する免
疫学的診断剤として用いることができる。例えば、酵素
結合抗体免疫アッセイ、逆受身赤血球凝集反応、更に、
螢光色素、！）素及び放射性同位元素等で標識された抗
原又は抗体を用いるその他の種々の診断試験等において
も有用である。

抗ＨＢＳ抗体の検出及び同定用の抗原として用いる場合
には、上記の各種試験並びに反応についての公知の術式
に従って、調製かつ使用する。本発明の抗原な用いて抗
体を作成する場合には、本発明の抗原を実験用動物等に
接種し抗体を産生させた後、被接種動物の血液又は体液
を採取するか、又は公知の細胞融合技術を用いる。これ
より容易に作成されるポリクローナル抗体及びモノクロ
ナール抗体は、１−ＩＢｓ抗原の検出及び同定用の抗体
として、上記の各種試験並びに反応についての公知の術
式に従って調製かつ使用ｆる。

更にまた、本発明の抗原又はこれを用いて作成される抗
体は、抗原抗体反応に基づくバイオセパレーター、バイ
オリアクター、並びにバイオセンサー等に用いることが
できる。この場合には、本発明の抗原又は抗体を基板又
は支持体に公知の常法により固定化する。更に、使用目
的に従い、本発明の抗原とその抗体は、螢光色素、酵素
、放射性同位元素等により公知の常法のもとでＩＩＥし
て用いることができる。

次に本発明を実施例により説明するが、本発明は以下の
実施例に限定されるものではない。

実施例１ ディン粒子（ＨＢＶウィルス粒子）の精製；外来患者の
検体血液をプールして得たＨＢｅ抗原陽性血清を１０．
０００ｒｐｍ、１０分５５℃で遠心し、上溝を得る、次
に、これを２８．ＯＯ’Ｏｒｐｍ、４時間、５℃で遠心
し、沈漬を（稈る。この沈渣を１０ｍ１　　ＴＮＥＭＥ
ＢＳＡ（’０．０１Ｍ　　ト’ＪスＨｃ１．ＤＨ７，５
，０，１Ｍ　　’ＮａＣ１，Ｏ，ＯＯＩＭ　　ＥＤＴＡ
、０．１％２メルカプトエタノール、１ｍＱ／ｍｌ　　
ＢＳＡ）に再浮遊した後、３０％蔗糖を含むＴ　Ｎ　Ｅ
　Ｍ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　Ａをクッションにして４０．０００
ｒｏｍ、１３時間、５℃で遠心する。この沈漬を４００
μＩのＴＮＥＭＥ　（上記ＴＮＥ〜ＩＥＢＳＡより１ｍ
Ｑ／ｍＩＢｓＡを除いたもの）に再浮遊し、精製ディン
粒子溶液を得た。

実施例２ 内在性ＤＮＡポリメラーぜで４復したＨＢＶＤＮＡの回
収：　　ｙＩａディン粒子溶液５０μｍに１５０μｌの
ＴＥ（１０ｍＭ　　トリスＨＣＩ、ｐＨ８，０，１ｍＭ
ＥＤＴＡ）を加え、次に１００μｍの反応溶液（０，３
３Ｍ　　Ｉ−リスＨＣＩ　　ｐＨ８，０，０，１２５Ｍ
　　ＭｑＣＩ、０．４ＭＮＨ４０１，０，４％　　ＮＰ
−４０，０，５％２メルカプトエタノール、２ｍＭ　　
ｄＡＴＰ、２ｍＭ　　ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ　　ｄＣＴ
Ｐ＜０．５ｍＭ　　ｄＧＴＰ、３ＭＭ　　ａ　［３２Ｐ
Ｉ　ｃｊｃＴＰ。

３ＭＭ　α［３２Ｐ］ｄＧＴＰ）を加え３７℃で２時間
反応させる。次に各７．５μｍの１０ｍ〜１ｄＣＴＰ及
びｄＧＴＰを加え、３７℃でさらに３時間反応させる。

このポリメラーゼ反応によりＨＢＶＤＮＡの一末鎖部分
カｒｉｔｕすｎ、［Ｐ］？’ラベルされた材料が得られ
る。このＨＢＶＤＮＡをウィルス粒子から取り出す為、
上記反応液に３Ｃ１ｌの０．５Ｍ、ＥＤＴＡ　　ｐＨ８
，Ｏと１００μｍの５ｍＱ／ｍｌ　　プロテアーゼに、
５０ｕＩの１０％ＳＯ８を加え５６℃で２時間反応させ
る。さらに水飽和フェノール５５０μＩで３回抽出した
後、セファデックスＧ−５０カラムでボイド（ｖＯｌｄ
）画分を分取し［３２Ｐ］ラベルしたＨＢＶＤＮＡを得
た。

実施例３ ＨＢＶＤＮＡのクローニング：実施例２で得られたＨＢ
Ｖを各種制限酵素により消化すると、ＸｈｏＩとＢａｍ
ＨＩの切断部位をそれぞれ１カ所もっことがわかり、こ
れらの制限酵素により、クローニングできることが分っ
た。そこで、まず、λフアージシャロン２８（ベセスダ
リサーチラボラトリーズ社製）のＸｈｏ　１部位にクロ
ーニングし、さらに、プラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍ
Ｈｒサイトにクローニングする。

（Ａ）λフアージシャロン２８のＸｈＯ１１位へのクロ
ーニング：前記ＨＢＶＤＮＡを１０ｍＭトリスＨＣ１，
７ｍＭＭ０ＣＩ２．１００ｍＭＮａＣｌ、７ｍ〜１２−
メルカプトエタノール氾液に溶解し、１１限酵素Ｘｈｏ
ｌにより、３７℃、１時間処理する。次に、等量の水飽
和フェノールで抽出し、２倍量の冷エタノールと１／１
０１の３Ｍ酢酸カリウムｐＨ４，８を加え一２０℃に１
時間静置し、ＤＮＡを沈澱させる。１００００ｒｃ＋ｍ
。

１０分間遠心分離し、沈澱するＤＮＡを回収する。

またλフアージシャロン２ＢＤＮＡ（Ｘｈｏｌ認識部位
を１カ所有する）も同様の方法でｘｈＯＩｌすＲ裂ｔ、
、前記のＨＢＶ−ＤＮＡ　（Ｘｈｏ　１でｒＡ裂）と混
合し、６７ｍＭトリスＨＣｌ　ｐＨ７゜６．６．７ｍＭ
ＭａＣ１２，１００ｕａ／ｍＩゲラチン、１０ｍＭジチ
オスレイトール、１ｍＭＡＴＰ条件下で１２℃、１２時
間開４−ＤＮＡリガーゼを動かせる。このｄ合液を前記
と同（工にフェノール抽出、エタノール沈澱し、得られ
た沈漬を１０μｍのＴＥに溶解する。

この槌にして得たＤＮＡを市販のλ−ＤＮＡｉｎ　　Ｖ
ｉｔｒＯＤａＣｋａＱｉｎＱ　　ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ
　　Ｃｏ、Ｌｔｄ、）を用い、常法通り（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　　ｉｎ　　ｌ：ｎｚｙｍｏｌ。

ｏＶ　　（１９７８）６８．２９９−３０９）　　ｉ　
　ｎｖｉｔｒｏ　　ｐａｃｋａｇｉｎｇを行い、大腸菌
ＤＰ５０　　　Ｆ株に吸着させ、Ｌ−寒天培地（バｕｐ クトトリブトン１％、イーストエキストラクト０゜５％
、！！化ナトリウム０．５％、寒天１．５％。

ｐ）１７．２〜７．４）に拡げ、３７℃で５〜８時間培
養する。プラークが形成の後、［遺伝子操作マニュアル
Ｊ　　（ｐ６８〜７３，１Ｍ１社サイエンティフィック
、１９８２年９月２０日発行）に記載の方法により、プ
ラークハイプリダイゼイションを、実施例２で得た３２
ＰラベルのＨＢＶ−ＤＮＡをプローブとして用いて行い
、ＨＢＶ−ＤＮＡが組み込まれたクローンを多数分離し
た（第１図）。

（Ｂ）プラスミドｐＢＲ３２２の３ＭｍＨＩサイトへの
再クローニング：前記（Ａ）で得られたＨＢＶ−ＤＮＡ
組み込まれたファージを大腸菌ＤＰ５０ｓｕｐＦ株に感
染させ、遺伝子ｉＱ作マニュアル、Ｐｌｌ−２０の方法
にしたがって、ファージを大患に調製、ざらに、ファー
ジＤＮＡｅ得る。得られたファージＤＮＡを前記と同様
の方法でＸｈ。

Ｉ開裂し、この反応液を１％低融点アガロース電気泳初
にかけ９餡した約３，２ｋｂのＨＢＶ−ＤＮＡ１片な含
むゲルを５倍容聞のＴＥと共に、６５℃に加温し溶解す
る。この溶液を前記と同様の方法でフェノール抽出、エ
タノール沈澱した後、得られた沈漬を前記と同様の条件
でＴ４リガーゼで反応させＭ鎖状ＤＮＡを環状ＤＮＡと
する。反応液を前記と同様の方法でフエノル抽出、エタ
ノール沈澱し、得られた沈漬を、１０ｍＭトリスＨＣＩ
　ＤＨ８，０，７ｍＭ１ｖｌａＣＩ２，１００ｍＭＮａ
Ｃ＋、２ｍ〜１２−メルカプトエタノール０１％ウシ血
清アルブミン混液に溶解し、制限酵素３ａｍＨＩで開裂
し、さらに、フェノール抽出。

エタノール沈澱し、両端が３ａｍＨＩとなったＨＢＶ−
ＤＮＡを得る。

つぎに、プラスミドｐＢＲ３２２を同様にＢａｍＨｌで
ＩＲ裂し、先に得たＢａｍＨＩで開裂したＨＢＶ−ＤＮ
Ａと混合し、前記と同様の条件でＴ４リガーゼと反応さ
せ、得られたＤＮＡを用い。

［Ｎ４ｏｌｅｃｕｌａｒ　　　ｃｌｏｎｉｎｏＪ　　（
１）２５４　〜２５５．Ｃｏｌｄ　　　Ｓｐｒｉｎｇ　
　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｙ．１９８２
年発行）に記載の方法に従い、大腸菌χ１７７６株を形
質転換し、アンピシリンを２５μＱ／−含むｖＮ菌試験
用培地３（０＋ｒｃｏ社製〉プレート上に拡げる。ｐＢ
Ｒ３２２のＢａｍＨ＋切断部位にＨＢＶ−ＤＮＡをクロ
ーニングすることにより、このプラスミドを持つ大腸菌
は、アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性の性質
を示す。この性質を°示す大腸菌より、前述のｒＭｏ　
ｌ　ｅｃｕ　Ｉ　ａｒｃ　ｌ　ｏｎ　ｉ　ｎａＪ　（Ｄ
３６８　〜３６９）に記載の方法に従い、プラスミドＤ
ＮＡを抽出する。このプラスミド［）ＮＡを前記と同ｔ
ｌの方法でＢａｍＨＩをｒＡ裂し、前述の「遺伝子操作
マニュアル」（ｐ７３〜８０）に２観の方法でサザーン
・ハイブリダイゼイションを、実施例２でで得た３２Ｐ
ラベルのＨＢＶ−ＤＮＡをプローブに用いて行い、約３
．２ｋｂのＨＢＶ−ＤＮＡがクローニングされているこ
とを確認するとともに、ｐＭＩＢｌｌ（１！工研条寄第
１ｏ８１号）を得た（第１図）。

実施例４ Ｈａｓ抗原発現プラスミドの構部と改造：実施例３で得
たプラスミドＣ）ＭｌＢｌｌを制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ及び
ＢａｍＨＩ消化し、ＨＢｓｌ伝子ｌ金子約３．２ｋｂの
断片を得る．また、プラスミドｐＰＨＯ５（Ｋｅｎｊｉ
　　Ａ．、ｅｔ　　ａｔ，。

Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　　Ｒｅｓ．１０．１７４１。

１９８２）をＩＩＩ　Ｉ　Ｎ素ＢａｍＨ　１、３ａ　Ｉ
　Ｉ消化し、ＰＨＯ５ブＯモーター遺伝子を含む約０．
６ｋｔ）のＤＮＡ断片を１ηる．更に、かかる２つのＤ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連係させた後、
ｖ１限ＮＪＩＢａｍｌ−１１Ｆ開裂し、約１．９ｋｂの
ＰＨ０５プロモーターとＨａｓ遺伝子とを持つＤＮＡ断
片を得た。次いで、該ＤＮＡ断片を、プラスミドＯＢＲ
３２５を制限酵素Ｂａｍ）−ＩＩ及びアルカリホスファ
ターゼで消化したＤＮＡ断片と混合し、Ｔ４リガーゼで
反応させ、ＤＢＲ３２５の３ａｍＨｒ部位にＰＩ−１０
５プロモーター下流にＨＢｓ遺伝子が同一方向にクロー
ニングされたプラスミドを得る。このプラスミドをυ１
限酵素Ｋｐｎｔで消化し、さらに、エキソヌクレアーゼ
８ａ１３１で消化することにより、ＰＨ０５の構造遺伝
子の開始コドンＡＴＧを欠失したプラスミドｐＨ８１　
０３が多数得られる。このプラスミドを各クローン毎に
ＢａｍＨｒで消化し、プラスミドＹＥｐ１３の９ａｍＨ
Ｉサイトにクローニングし、発現用プラスミドＤＢＨ１
０３系列（第２図）を得た。

実施例５ 発現用プラスミドによる酵母の形質転換と形質転換体酵
母の単離：発現用プラスミドを用いて、酵母（ｓａｃｃ
ｈｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＨＹ４
株（ＡＴＣＣ　　ＮＱ４４７７２）をアルカリカチオン
法で形質転換するため、酵母をＹＰ［）培地（バクトペ
ブトン２％．イーストエキストラクト１％，デキストロ
ース２％）にて培養する．培養液を５−とり、２５００
ｒｐｍ，５分間遠心し菌体を５ｍＩのＴＥに浮遊し、さ
らに、遠心して得られた菌体を０．６ｄのＴＥに再浮遊
する。この内の０．５−に等足の０．２〜１酢酸リチウ
ム液を加え、３０℃で６０分間インキュベートする。次
いで、０，１ｄをとり、これに前述の発現用プラスミド
を５〜１０μｍ加え、３０℃で３０分間再びインキュベ
ートする。０．１ｍの７０％ポリエチレングライコール
４０００液を加え、更に３０℃で６０分間インキュベー
トしたのち、蒸留水２ｄを加え、２５０Ｏｒｐｍで５分
間遠心し、菌体を少囚の′ＦＡ留水に再浮遊した後にロ
イシンを含まない選択培地であるＳＤ寒天培地（０゜６
７％バクトイーストナイトロジエンベースアミノ酸フリ
ー（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％デキストロース、各々２０
（ＪＱ／ｄのウラシル、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒス
チジン、２％寒天）に拡げ、３０℃で培養し、出現した
コロニーをＬｉ１鰭した。

実施例６ 形質転換体酵母の培養とＨＢＳ抗原の抽出二実施例５で
得た形質転換体酵母を、第１リン酸カリ１．５０／Ｉを
含む完全合成培地バルクホルダー培地（Ｂｕｒｋｈｐｌ
ｄｅｒ、Ｐ、Ｒ，、ｅｔａ　１．、Ａｍ、Ｊ、Ｂｏｔａ
ｎｙ、３０．２０６、．１９４３：各々２ＣＩＱ／ｍｌ
のウラシル。

Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジンを含む）に接種し
、３０℃で２４時時間上う培養後、２５０Ｑｒｐｍで５
分間遠心して集菌する。−度、菌体を蒸留水で洗浄後、
第１リン酸カリの代りに塩化カリ１．５０／ｌを含むバ
ルクホルダー培地に植込み、更に３０℃で２４時時間上
う培養する。菌体を遠心操作により集め、洗浄後５０ｍ
〜１リン酸バッファーｐＨ７，２に再浮遊し、ガラスピ
ーズ（φ０．４５−０．５５ｍｍ）　を加え、強り振ト
うして菌体を破砕し、１０．０００ｒｏｍで１０分間遠
心して、上清を１分離して酵母抽出液を得た。

実施例７ 形質転換体酵母のＨａｓ抗原産生量の測定：酵母抽出液
中のＨａｓ蛋白の定量は市販の）−ＩＢｓ抗原測定キッ
ト（オースリア■、アボット社製）を使用し、実施例５
で得た形質転換体酵母クローンのＨＢＳ抗原産生量を測
定したところ、プラスミドＤＢＨ１０３−ＭＥ５を持つ
クローンによる産生旦が最も高かった。また、ｐＢＨ１
０３−ＣＴと命名したプラスミドを有するクローンもＨ
ＢＳ抗原産生を示した。その結果を第１表に示す。

第１表 形質転換体酵母　　　形質転換体１１！母クローンが有
する　　クローンのＨＢｓプラスミド　　　　　抗原産
生（ｎＱ／ｍ１）ｐ　Ｂ　Ｈ１０３−Ｍ　Ｅ　５　　　
　　９５３ＤＢＨ１０３−ＣＴ　　　　　　　１８４実
施例８ プラスミドＤＢＨ１０３−ＭＥ５１７）ＰＨＯ５ブＯモ
ーター及び）１８９構造遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定
：　プラスミドＤＢＨ１０３−〜＋Ｅ５を各種！７１限
酊素で切断し、プラスミドｐＵｃ１２（Ｍｅｓｓ　ｉ　
ｎｏ、Ｊ、（１９８３）Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　　ｉｎ　　ＺｎｚｙｍｏｌｏＱＶ、１０１．ｐａ
ｒｔＣ，２０）にクローニングし、ジデオキシチェーン
ターミネータ−法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、。

ｅｔ　　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｅ　ｔ　、ＵＳＡ、工１．５４６３．　１９７７：＋
ａｔｔｏｒｉ、Ｍ、、ｅｔ　　　ａｌ　　　Ａｎａｉ、
Ｂｉｏｌ、、工旦ユ、２３２．１９８６）にてＤＮＡ１
！基配列を決定した。

その結果、プラスミドｐＢＨ１０３−ＭＥ５のＨａｓ構
造遺伝子は、本来の２２６個のアミノ酸のＮ末にＰｒｅ
Ｓ由来の９個のアミノ酸と開始コドンＡＴＧ由来のメチ
オニンの計１（［のアミノ酸を余分に持つ蛋白をコード
していた（第３図）また、ＤＢＨ１０３−ＣＴについて
も同様の方法で塩基配列を決定した。その結果、該ＨＢ
Ｓ構造遺伝子は、ＨＢＶ本来の２２６囮のアミノ酸のみ
からなっていることが判明したく第３図）。

実施例９ 形質転換体酵母５ＨＹ４／ｐＢＨＩ　０３−ＭＥ５によ
り産生されるＨａｓ抗原の分子量測定及び同定：　実施
例６に２駅の方法で組換え体酵母５ＨＹ４／１）ＢＨｌ
　０３−ＭＥ５を培養し抽出液を得る。この抽出液に活
性炭２％（〜Ｖ／Ｗ）を加え、室温で３０分攪拌する。

次に３００Ｏｒｐｍ１０分間遠心し、上清をｑる。この
上清を膜濃縮り、　ｔｃ　Ｉ、２０〜５０％（Ｗ／Ｗ）
の蔗ＩＬ！Ｉ密度勾Ｒにｆｆ１ｆｆｌし、２０．ＯＯＯ
ｒｐｍ２０時間遠心シタところＨＢＳ抗原は蔗糖３５％
付近に活性のピークを示した、この両分を５０ｍＭリン
酸バッファーｐＨ７，２に透析し、比重１．２になる様
ＣｓＣ１を加え４２．ＯＯＯｒｐｍ４０時間遠心スルと
比重１．２１にＨＢＳ抗原活性のｐｅａｋを示す。この
精％ｕＨＢＳ溶液を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動し、ニトロセルロース躾ヘゲル上の蛋白をブロッ
ティングし、市販の抗ヒトＨＢｓヤーｆ血清［ダ’：Ｊ
　（ＯＡＫＯ）社１ｔ−ＨＲＰＯ標識したものと反応さ
せ、４−クロロ−インドナフトールを発色させることに
よりＨＢｓ抗原を同定した。その結果、分子Ｉｎ２４Ｋ
ｄの位置にバンドが検出された（第４図）。

更に、抗ヒト）−ＩＢｓヤギ血清（ダコ社製）、ヒト血
液由来Ｈａｓ抗原、及び上記の精製ＨＢｓ抗原を用いて
π天ゲル内沈降反応を行う：０．８Ｗ／％アガロースゲ
ル上の三つの穴（各穴は三角形の頂点の位置関係にある
）のそれぞれに、上記血清または抗原を５０μＩ加え、
室温で一夜反応させて、出現する沈降線をｖＡ察する。

上記血清とヒト血液由来Ｈａｓ抗原との間の沈降線は、
上記血清と本発明の蹟’ＩＩＨＢｓ抗原との間の沈降線
と完全に融合していた。従って、本発明のＩＩＨａＳ抗
原は、ヒト血液由来ＨＢｓ抗原と抗原性が同一であると
判定された。

実施例１０ 形質転換体Ｍ母５ＨＹ４／ＤＢＨ１０３−ＭＥ５により
産生されるＨＢｓ抗原の免疫原性の検定：　実施例９に
記載の方法により、精製ＨＢＳ抗原を得る。次いで、「
生物学的製剤基準」　（厚生省告示第１５９号）に定め
られた沈降Ｂ型肝炎ワクチン製剤基準に準随して、ワク
チンのｙＪ製とマウス力価試験を行う：生理的食塩水を
用いて、上記精製抗原４０μｇ／ｍｌ及び水酸化アルミ
ニウム０．４ｍＧ／ｍｌをｖＡＩＪ４１、かかる両液を
等澁混合し、アルミｒＪ：降Ｂ型肝炎ワクチンを試作す
る。該ワクチンを生後５週のＢＡＬＢ／Ｃマウス１０匹
の背部にそれぞれ１ｍｌずつ皮下接種する。

接種から５週間後に採血し、血中抗体価を受身赤血球凝
集反応により測定する。その結果を第２表に示す。

第２表 ワクチン　　　　相対力価 参　　　照　　　品２）　　　　　　ｉ、。

１）本発明のワクチン： ２）国立予防衛生研究所交付の力価試験用「参照沈降Ｂ
型肝炎ワクチン」 ［発明の２１１渠］ 本発明のＨＢＳ抗原はクローニングされたＨ３ｓ抗原遺
伝子を遺伝子工学ｒ！Ｌ術により発現させて製造するた
め、ＨＢＶが感染したヒトの血液を取扱う従来技術に比
べ、生産工程下でのバイオハザードの確率は実質的に皆
無になる。また、生産コストが大幅に低減されると共に
、財界の需要を満たし得るだけのＨＢＳ抗原の置屋が可
能になる。

更に、培地を含む培養系の組成と構成がすべて既知であ
るため、精製が容易になり、＾純度の製品が得られる。

その上、製品の分子構造が明確であるため、有効性並び
に安全性が優れて高くかつ均質な生物学的製剤、及び極
めて特異性の高い＾性能の診断剤の提供が可能になる。

尚、この発明の優れた抗原性と免疫原性は実施例９及び
１０に記載の通りである。

４　図面のＩＩＢ甲な説明 第１図は、ＨＢＶＤＮＡのクローニング、及びプラスミ
ドｐＭＩＢ１１作成のフローチャート；第２図は、プラ
スミドｐＢＨ１０３系列作成のブローチヤード：第３図
は、本発明の１−（Ｂｓ抗原の遺伝子ＤＮＡの塩基配列
及びアミノ酸配列；第４図は、５Ｏ８−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動による本発明のＨＢＳ抗原の同定と分
子ｆｆ１ｌ定の結果；をそれぞれ示す。

第１　Ｚ シ？Ｏン２８フｙ−′）ＤＮＡ　　　　　　　　　　　
　＠　　　０ａｎｅｈｌ子第２図 ｃ＝ｌ＋Ｉｃ；！Ｊｔ−Ｃ３ｏＵ＞Ｕ＞口０ｌ−０１−
ＯＣＩ（’＋　＜　−ｍ　＜−の　りり−じ−い　マＵ
Ｌ、ＬＪＬ−−Ｑ０００　−〇リリリー　ヘＱ巳り２Ｎ
＜　ｏ　＜　ｏ　　　　＋−ｏ　Ｉ＋ｏ　　　　Ｉ−＋
１１１　）−１／１（ＩＬＩ（Ｊｌ−ＬＪＩ＋ｌＪＬ＋
　　　じスＱΣＩＪ　Ｌ　ＩＪ　ｏ＋Ｕ　（Ｌ　ＬＪ　
（Ｌ　　　　←ＬＪ　［−ｕ＜Ｌ、＜Ｌ＋ＵＩ＋ＩｊＬ
−（０＜０ すｒ、ｌＪ、ｃ　　　　ＬＪＪ：＋りぶ　　　リＬ＋ｔ
ＪＬ。

＜ｈ−＜ｈ−（：）−（）−（ＪＱｊＪＬ０コＵコ　　
　リ０ＩＪＯＦ−０←０ １−、　ＯＪ　）−ＩＬＩ　　　Ｕμ八　　（ＪＬ、（
ＪＬＬＪＪＬＪＪ　　　　ＩＪ（ＬＩＪｌｌ、　　　　
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ｔ　　　）−ｏＪ）−ａｒ　　　リＬ、ＬＪＬ←」←Ｊ
　　　　ＬＪＪＣＪＪ　　　　リＣＬＱ工じコ（ｊ　：
ｌ　　　　）−ａｌ　）−Ｕ　　　　＜　Ｌ　＜　Ｌｌ
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　　←」←」）−＋巳←（Ｌ　　　　）−ψヒリρ　　
　ロＵωＵ６Ｊロ　ロ←ｅ＋仁０　ロリ的り１ロΦ←ぶ
Ｉ−二す　１く−く哨囚　−＜−＜−リ１−　（Ｌ　Ｉ
＋龜　　−＜　＜　＜　（−ｃｒリエリ＝−Ｕ　Ｏ＋Ｌ
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　ヒ０Ｉ−Ｏ’）−■Ｉ−−←υ）＋υ　　　ＬＩＩ＋
ｔＪＬ　　　　ＬＪ−’ｔＪ−’Ｕ　Ｊ　（）　Ｊ　　
　　ｇ　ＣＬＵ　（Ｌ　　　　ｕ　＜　ｌｊ　＜リコじ
）　　　　Ｉ−Ｉ／ＩＦ−１←０）−０）−υＩ−υ　
　　　じＸじ諷　　　　ＬＪ　Ｌ、　ＩＪ　Ｌ。

す」す」　　　←す←（Ｊ　　　　ＵＯｊＪ（Ｌし：Ｉ
ｖコ　　　リフリフ　　　リーＵ４トυＨ６Ｊ！−６Ｊ
　＋−Ｑｌ　　　Ｃｊ刈ハＬ、１ＪＵＪ　　　　　ｌ−
Ｊ←」　　　　←Ｕｔ−Ｕｉ１　　　　１−１１７１）
−ｂ’＋　　　　リαｕ　ｃｔ　　　　＜　＞＜　＞１
、：＋＋、、ＱＬ＋＜噴く哨　　　じ−リーＵ＜Ｕ＜　
　　　　じ＜　１．：＋＜　　　　　（ｊリリリじコリ
フ　　　←）←コ　　　　（ＪＩ＋ｔＪＬ＋）−［Ｆ］
Ｉ＋６ＪＩ−＋６Ｊ←υ　　　　Ｕ勺ＵのＵＪｔＪＪ　
　　　ＬＪＪＩＪＪ　　　　＜りく■ＱφｕＩ７１　　
ｕａ＋ｕυ　　　＜−＜−ａＬａＬ＋　　　　１−＋ｐ
＋ｓ　　　　　ｕｓｕｚｔＪ（ＩＪ（）−（Ｌ）＋龜　
　　＜Ｉ−＋＜ト）−Ｌ＋←Ｌ＋Ｕａｌすυ　　　く島
イ為く＼く＞　　　←−←−じ−リー Ｉ＋←←←　　　（−＜−（ｊりじじ り＞Ｕ為　　　リコＵ〕　　　く０イ０じ−Ｑ−Ｉ　　
　１−＋υＩ−υ　　　ＬＩＬ、ＵＬ。

じＬ−＋リリ　　　ＬＪ　」ｕ　Ｊ　　　　（Ｊ　ａ、
　（Ｊ侃Ｏヒ［Ｆ］Ｈυロ　０（Ｊ６Ｊす６Ｊ００←−
一一ロｃｏＩ＋−←−い　寸−ρト二−０←弓−弓ト”
Ｆ　＜　−（−寸　の←工←―請　■Ｕ〉す〉り１−１
１１１−Ｌｌ’ｌ　　　　　　　＋−か←い　　　　　
　Ｈし←−リメリ＞　　　　　　リーリー　　　　　　
リＪ：ＬＪ、二ヒＵｌ＋リ　　　ＵｃＣｔＪ（（←くヒ
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　。

Ｕ二ＩＪＪ：　　　　ｌ−１１１１−づ　　　り−Ｑ−
＜１−＋＜１＋　　　リ〉す〉　　　Ｕ匡り龜り蛸Ｕリ
　　　＜　−（Ｌ　　　　ｕ　ＬすＬす＞す＞　　　Ｕ
ωＵＶ　　　　リυすυＩ＋（Ｊｌ＋ＬＪ　　　　ｌ−
ψＩ−リ　　　Ｈψ−ψ＜＞＜＼　　　じ１１１．りへ
　　　リ＼ａ＞リーリー　　　じり、すＬＩ　　　じ−
じ−りＬ−１ＩＣＵ　　　ヒ←←←　　　Ｃりじ０じＬ
Ｉじり、Ｕへりへ　　　リ０すＱ すＱすａＪ　　　　リＬ−リー　　　−二−二１＋哨Ｉ
−蛸　　　←ヒ←←　　　ト龜ヒエ０＜−＜Ｌロ　ロ＜
）＜■ロ　ローｍ−一〇の　　　クリぷり二〇　−リＬ
じ−Ｃト←ヴヒ弓マ寸＜ｈ＜１−＋寸　の＜＜＜＜マ　
いり〉じ〉ｈ塚　　　　Ｉ−叶１　　　く−く弔　　　
Ｆ−ｕ←υＵ＞す２　　　リーＵ−＋ｊ：ヒ二 ）−ＩＪＩ−ＩＪ　　　　ｕ＜じく　　　←エヒエ（Ｊ
　ＩＱＩＪ　Ｉ／ＩＵ　ａｌ　Ｕ　ＬＩＪ＜　Ｏ＜　０
す＞じ＞　　　１−ぶ←二　　　Ｕ−Ｕ−←す←（Ｊ　
　　　Ｉ＋（Ｌ　ｌ−（Ｌ　　　　Ｕ　Ｏ，、（Ｊ　Ｉ
Ｆ−１Ｉ′＋Ｈ哨　　　Ｈ田←−リーじ−じ＞じ＞　　
　Ｑ−リー　　　Ｉ−叶ｉ）＋す＋Ｕ　　　　じくりく
　　　リ＞ａ＞１−　Ｌ　ｌ−Ｌ、　　　　リＯＬじへ
　　　くフくコＩＪＱＪＵυ　　　じＬリー　　　←υ
←Ｑ←切）＋リ　　　トヒｌ＋ｌ−ｔＪＪＩＪＪ（Ｊ　
ＯＩＪ　ＯＬＪ　Ｌ　ｕ　Ｌ、　　　　＜）〈フｕＬ＋
ｕＬ、ＩＪυすυ　　　ヒυ←υＬＪ　ＣＬ　（Ｊ　Ｃ
Ｌ　　　　ｌ−１／１　）−１７１）−Ｊ　＋　ＪＩ−
＋６Ｊ＋−＋υ　　　＜　Ｌ、　（Ｌ、　　　　Ｉ−−
ヒーＩ−＋ｚ＋−＋ｘ　　　　ｕ　ｕｕ　Ｕ　　　　ｔ
ｒ　ｖａ　ｅＪ）−（Ｌ　）−ＣＬ　　　　Ｉ−蛸トい
　　　く力くりじ４Ｊリー　　　＜Ｏ＜ＯＵフリコ Ｆ−ａＪ）−ａｌ　　　　ＵＬＵＬ　　　　Ｉ−Ｕｌ−
υ＜】＜ユ　　　リ上り龜　　　しＪ　ＩＪ　Ｊｌ−Ｌ
）−Ｌ、　　　ＵａＩｕａＪａｏ、ｖ＝ＵυＱＵ　　　
　←−トー　　　リＩ−Ｌ＋し＋−＋ψ←リ　　　＜−
（−１−１−）＋←Ｕ　Ｌ、ｔＪ　Ｌ　　　ＬＩ　Ｏ（
Ｊ　Ｏり一（ＪＬＩＪ　Ｊ：（Ｊ　二（Ｊ　Ｌ、　ＩＪ
　ＬＩＪ　Ｕ　Ｑ　Ｕく←く←　　　リ（Ｌ（ＪＯＬ　
　　　ｌ−力ヒ哨リフじコ　　　ＩＪＬＬ）Ｌ。

ヒＶ←Ｖ　　　＜諷く為 ＩＪ　Ｊ　ＩＪ　Ｊ　　　　　　１−１−←Ｈ）−Ｌ−
？　Ｌ−＜　−＜　−＋ すＶすａＪ　　　　、）−弓Ｈづ くりく哨　　　じ〉す〉 （０（ＯじｃＬじへ ｕ　ＬＩＬＩ　ＬＩ　　　リーじ− ＩＪ　Ｌ　ｔＪ　Ｑｌ）−１−）＋← ＬＩ＋＞Ｕさ　　　←コヒコ リーじ−　　　Ｉ＋６Ｊ　）−４１ 図　　　　リリリじ　　　Ｑ」す」 す０＋り色　　　ＵυすＶ すＬＬｊＬ　　　　−ぶト： ←←←ヒ　　　Ｉ−＋Ｑ＋１−＋色 り４Ｊリ一　　　ヒ０←Ｖ Ｉ−＋υ）−＋ｌｉ＋　　　　％＋−←−くΣく乏　　
　＜−〈− リ−ａｗ　　　　＜ｏ＜。

１−　ａｌ　ｌ−ＩＬＩ　　　Ｌ）　ＬＩＩＪ　Ｌ＜Σ
＜Σ　　　Ｌ）　（Ｌ　ＬＩ乙 （ｊへじへ　　　く〕くフ じＬ＋Φ−　　　←６ＪＨａｔ ←←１−１＋　　　←」ヒ」 （ａＪ　（ＣＩＩＪ　　　　＜コく〕 ←−←−じ５じ３ ＜−＜− ←−Ｈ−＋　　　　ｌｊ　Ｏす０ ←−←−ＩＪＬＬＪＬ。

じ〉じ〉　　　Ｕ匡り色 ＜１くし　　　くコくコ ＵυＵυ　　　）＋６Ｊ←Ｖ １−ψＩ−哨　　　）−Ｊ　）−Ｊ Ｉ−＋フトコ　　　←ＩＩＪ←υ ）＋［Ｆ］）−＋［Ｆ］　　　Ｉ−−二←二ＵＪ（ＪＪ
　　　　←（Ｌ）−＋上 りへりへ　　　ｕ　ｏ　ｕ　。

じＬＩす１＋ＩＪ　Ｌ、　ＬＩ　Ｌ− ←Ｉ−＋←←　　　ＩＪ　ＣＬ　ＬＪ　（Ｌ第４図 抗ヒトＨＢｓヤギ血清 酵　　酵 母母 ＨＢｓ抽 抗　　出 原液 手続補正書（自発） １　事件の表示 昭和６１年特許願第１４３４１２号 ２　発明の名称 ガタカンエン　コウゲン　セイゾウホウＢ型肝炎ウィル
ス抗原とその製造法 ３　補正分する者 ｉ件との関係　特許出願人 スイタシャマダオ力 住所　大仄府吹田市山田丘３番１号 オオサカダイガクナイ 大阪大学内 フカイ　　コウノスケ 理事長深井　孝之助 ５　手続補正の日付　「自発」 ６　補正の対象 「明細書の発明の詳細な説明の欄」 ７　補正の内容 明細書の発明の詳細な説明の欄の記載を下記の通り訂正
する： べ−ジ　行　　　　　　補正前　　　　　　　　補正後
９　下１０〜　２．４ｘ　１０６ダルトン　　２．３Ｘ
刊卒下り １０　上２　　　Ｂ型肝炎ウィルスは、　Ｂ型肝炎ウィ
ルスの宿主域は、 「その宿主域が」を 削除する ｎ　　上３　　　ライ　　　　　　　　　かつライＪＩ
　上４　　　ルス培養宿主　　　　　ルスの培養宿主Ｉ
Ｉ　　　ＩＩ　　　　細胞培養を用いて生　　細胞培養
を用いるこ産するこ　　　　　　　のウィルスの生産は
未だ、 ＩＩ　　上５　　　とが不可能である。　　達成されて
いない。

１０〜　下１〜　　特開昭５９−３ｔ　７９９９　　　
　特開昭５９−３１７９９１１　上１ １７　下３　　　遺伝的安全性　　　　　遺伝的安定性
２１　下２　　　遺伝暗号の重複　　　　遺伝子暗号の
縮重２８　上９　　　実施例２で得　　　　　３２ｐラ
ベルとせずに実施例２と同様にし て得 ページ　行　　　　　　補正前　　　　　　　　補正後
２８　下９　　　所もつこと　　　　　　所もつこと２
９　上１　　　混液に　　　　　　　　混液５０μｇに
３０　上７　　５〜８時　　　　　　６時ノｌ　下４　
　　　ＢＶ−ＤＮＡ　　　　　ＢＶ−ＤＮＡが３３　上
６　　約３．２ｋｂ　　　　　約１．．３ｋｂノｌ　　
上８　　　　　１０．１７４１．　　　　　　１１．１
６５７゜ｊノ　　上９　　　　　１９８２　　　　　　
　　　　　１９８３３４　上７　　　ＹＥｐ１３　　　
　　　ＹＥｐ１３　（ＡＴＣＣＮｏ、３７ｔ１５） ３５　下Ｉ　　　Ｂｕｒｋｈｐｌｄｅｒ　　　　　Ｂｕ
ｒｋｈｏｌｄｅｒ３７　下３　　２ｎｚｙｍｏｌｏｏｙ
　　　　　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ３８　上３　　　ｅ
ｔ　ａｔ　Ａｎａｉ、Ｂ　　　　　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎ
ａｌ、Ｂ３９　下７　　　　ＨＲＰＯＨＲＰＯ（西洋ワ
サビ　ペルオキシダー ゼ） （以下余白）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 ・・・・・（ I ） （式中Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎ
   はアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシ
   ステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸
   、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはイ
   ソロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｌｅｕはロイシン、Ｍｅ
   ｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏは
   プロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｒ
   ｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリ
   ンの各残基をそれぞれ表わす）、で表わされるアミノ酸
   配列を有するヒトＢ型肝炎ウィルス抗原。 ２）次式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 ・・・・・（ I ） （式中Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎ
   はアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシ
   ステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸
   、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはイ
   ソロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｌｅｕはロイシン、Ｍｅ
   ｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏは
   プロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｒ
   ｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリ
   ンの各残基をそれぞれ表わす）、で表わされるアミノ酸
   配列を有するヒトＢ型肝炎ウィルス抗原の製造方法にし
   て、 （１）前記式（ I ）で表わされるアミ ノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを複製可
   能な発現ベクターに結合して組換え体ＤＮＡを得、 （２）得られた組換え体ＤＮＡで微生 物または培養細胞を形質転換して形質転換体を形成せし
   め、 （３）該形質転換体を該微生物または 培養細胞から分離し、 （４）得られた形質転換体を培養して、 該形質転換体にＢ型肝炎ウィルス表面抗原をコードする
   ＤＮＡを発現せしめて該抗原を産出させ、そして、 （５）該抗原を培養した形質転換体か ら単離精製することを含むヒトＢ型肝炎ウィルス抗原の
   製造方法。 ３）次式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ・・・・・（ I ） （式中Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎ
   はアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシ
   ステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸
   、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはイ
   ソロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｌｅｕはロイシン、Ｍｅ
   ｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏは
   プロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｒ
   ｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバリ
   ンの各残基をそれぞれ表わす）、で表わされるアミノ酸
   配列を有するヒトＢ型肝炎ウィルス抗原を抗体産生に有
   効な量含有するワクチン。