JPH05506230A - Ｃ型肝炎ウイルスエピトープ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ型肝炎ウィルスエピトープ １、　主尻立茨五分国 本発明は非経口的に伝染させた非Ａ１非Ｂ型肝炎ウイルス（ＰＴ−ＮＡＮＢＢ、 現在はＣ型肝炎ウィルスと呼ばれる）で感染した患者からの血清を用いて免疫反 応する特異的ペプチドウィルス抗原、これらのペプチドを符号化するポリヌクレ オチドシーケンス、これらのペプチドを生成できる発現システム、およびヒトの 血清中のＰＴ−ＮＡＮＢＨ感染を検出するためのペプチドの使用方法に関するも のである。

２、　ｊＬ！！ｉｉＬ アドキンスら、Ｃｅ１ｌ　旦４１３−４２３　（１９９０）。

アウスベル・エフ・エムら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ」紐蝕■、ジョン・ウイリイ・アンド、ソング・インコーホレイ テッド、メディアＰＡ。

ブラドリイ・ディ・ダブリュら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ、＋　１４８：２ 　（１９８３）。

プラドリイ・ディ・ダブリュら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６９：１　 （１９８８）。

プラドリイ・ディ’ダプリエら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 、　ＬＩＳＡ。

８４：６２７７　（１９８７）。

チッムツンスキ・ビーら、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｂｅｍ、　１６２：１５６　（１ ９８７）。

チ５−・キュー・エルら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４．３５９　（１９８９）。

Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｉｏ 　＋　Ｗｉｌｅｙ　Ｔｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　１０章。

シーンスターク・ジエイ・エルら、５ｅｙｌＬｉｖｅｒ　Ｄｊｓａａｓｅ、　６ ：６７フェラミスコ・ジェイ・アールら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５ ７（１８）：１１０２４　（１９８２）。

グブラー・ニーら、Ｇｅｎｅ、　２５：２６３　（１９８３）。

フニー・ティ’ヴイら、ｔｎ　ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ： 　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　＾　ｒｏａｃｈ　（Ｄ、Ｇｌｏｖｅｒ、ｅｄ、）Ｉ ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８５）。

クライン・ビーら、Ｂｊｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｂｙｓ、＾ＣＴＡ　８１５：４ ６８　（１９８５）。

クオ・ジーら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４：３６２　（１９８９）。

カイト・ジェイら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１５７：１０５　（１９８２） 。

マニアナス０テイら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒ　ＭａｎｕａｌＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　（１９８２）。

ミラー◆ジエイ・エイチ、Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｔｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　ＮＹ　（１９７２） 。

ムリス・ケイ、米国特許第４，６８３，２０２号、１９８７年７月２８日発行。

行。

レイニス・シイら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：１３３５　（１９９０）。

サンガー・エフら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　 ７虹５４６３　（１９７７）。

シャー２・ニス・ジエイら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３３：１０７６　（１９８６ ）。

５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｖｗｕｎｏｌｏ 　＋　（ミシエル・ビー・ディら著）　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ 、、　１１Ｇ１４１６−４４０　（１９８０）。

スミス・デ４’ビーら、Ｇｅｎｅ、　６７：３１　（１９ＢＢ）。

サザン・イー、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６９：１５ ２　（１９８０）。

チジフセン′ビー、Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｉｍｍｕ ｎｏａｓｓａｙｓ。

５ｃｉｅｎｔｉｆｔｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｔｎｇ　Ｃｏ、、　ＮＹ、　ＮＹ＋　１ ９８５＋　ｐ、　３３５゜ウィルソン・ダブリュら、Ｃｅ１ｌ　Ｓ鉦１１５９− １１６９　（１９８８）。

ウオー・ニス・エル・シー、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｊｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ　６ ８：３８９（１９７９）。

ヤング・アール・エイ、およびアール・ダプリュ・ディビス、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０．１９９４−１１９８　（１９８ ３）。

３、　光里亘ｌ東 Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）およびＢ型肝炎ウィルス＜ＨＢＶ）とは違うウィル スによるウィルス性肝炎は非Ａ１非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼ばれてきた。さ らに最近、にＡＮＢＩ（は少なくとも２種、そして多分それ以上の、全く別個の ウィルスを含むことが明らかになった。

これらのうちの１種は、腸内伝染させたＮＡＮＢＦＩまたはＥＴ−ＮＡＮＢＨと して知られており、食物および飲料水が糞便物質によって汚染された公衆衛生の 貧しい地域に支配的に制約されている。Ｅ型肝炎ウィルス（ＲＥＶ）と呼ばれる このウィルスの一部の分子クローニングが最近記述された（レイニスら）。

非経口的に伝染させたＮＡＮＢＨｌまたは、ＰＴ−ＮＡＮＢＨとして知られる第 二のＮＡＮＢウィルスタイプは、非経口的経路によって、一般には血液または血 液製品にさらされることによって、伝染される。

約１０％の輸血はＰＴ−ＮＡＮＢ）１５染の原因となり、そしてそれらの約半分 は慢性病の状態に移行する（シーンスターク）。

ヒトの受血者において輸血後ＩＪＡＮＢＩＩを生成したと記録されているヒト血 清は、チンパンジーにおいてＰＴ−ＮＡＮＢＨを首尾よく感染させることに使用 された（ブラドリイ）、感染させたチンパンジーラリ−を構築するために使用さ れた０次にＰＴ−１１４ＮＢ！（特異的ｃＤＮＡクローンおよびウィルス配列を 同定したこの方法は、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウィルス剤の７．３００隣接塩基対をつ くるフラグメントを同定するためのプローブとして使用された（ＥＰＯ特許出願 ８８３１Ｑ９２２．５、出＠１１／１８／８８）　、同し方法は本発明者らによ って、ここに開示されたＰＴ−ＮＡＮＢＨペプチドおよびポリヌクレオチド配列 の２つをＦＡ’ｌＬするために使用された。配列されたウィルス荊はＩＩｃＶと 名付けられた（上記ＥＰＯ特許出ＩＩ）。

令名は、ＨＣＶウィルス剤によって符号化された１つの免疫原性ペプチドが報告 されている（チョー、クオ、ＥＰＯ出ｒｎ８８３１０９２２゜このペプチドはＣ −１００と名付けられ、ＦＴ−ＩＪＡＮＢＩ（血清の免疫イムノアッセイにおい て使用され、８０％までの慢性ＮＡＮＢＨ標本、および約１５％の急性ＮＡＮＢ ＦＩ標本と免疫特異的に反応することが見出され急性と慢性のＰＴ−ＮＡＮＢＩ （感染の両方を含む大きい割合のＦＴ−＃ＡＮ８Ｈ感染血液と免疫反応するペプ チド抗原の１種または集合体を与えることが望ましい。

４、　又里生量！ 本発明のひとつの一般的な目的は、慢性ＨＣＶ感染の個体からの大きい割合の血 清と免疫反応するペプチド、および急性ＨＣＶ感染と結合した血清と免疫反応す るペプチド、を含むＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）で感染したヒトからの血清と免 疫反応する組換えポリペプチドを提供することである。

本発明の他の目的は、ペプチド抗原の組換え製造のための配列を符号化する１（ ＣＶポリヌクレオチド配列、およびペプチド抗原を用いるＨＣＶ感染のヒト血清 を検出するための診断方法を提供することである。

本発明は、−面においては、ＨＣＶで感染したヒトからの血清と免疫反応するペ プチド抗原を含む１本発明における１個のペプチド抗原は ａ）ＨＣＶコード配列によって符号化され；ｂ）５０４アミノ酸残基を有し；そ してｃ　）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４として示されるカルボキシ末端配列を有す る、）（ＣＶポリペプチドの免疫反応部分を含む。

本発明の他のペプチド抗原は、次の配列のいずれかひとつの免疫反応部分を含む ：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２　、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　８、ＳＥＱ　Ｉ［］ 　ＮＯ：１０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２、ＳＥＱ　１０　ＮＯ：Ｉ４、ＳＥＱ 　ＩＯＮＱ：１６、ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ｌＢ、ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２０、Ｓ ＥＱ　１０　ＮＯ：２２、ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：２４、およびＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：２６゜他の面においては、本発明ばＨＣＶ感染に対し特異的な抗体を含むヒ ト血液をスクリーニングする際に使用するための診断キットを含む。このキット はＣ型肝炎ウィルス（）ｆｃＶ）で感染したヒトからの血清と免疫反応する少な くとも１種のペプチド抗原を含む：このキットに使用するための特異的ペプチド 抗原は上述し本発明の好適例のひとつは、４０９−１−１　（ｃ−ａ）（ＳＥＱ 　Ｉｎ　ＮＯ：８）およびＨＣＶキャプシド誘導プロティン（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏｓ：　１２．１４．１６゜１８、２０．２２．２４．および２６）の１種を含 む診断キットである：２つの特定例は４０９−１−１（ｃ−ａ）とＣｌＮＣ４５ ０キヤプシド誘導ペプチド、および４０９−１−Ｈｃ−ａ）とＣＩＮ（：３６０ キヤプシド誘導ペプチドである。

本発明のひとつの例では抗原を個体支持体に固定化する。ＨＣＶ特異的抗体と固 定化抗原への結合は、固体支持体を検出できるレポーターを用いてラベルする働 きをするレポーター標識抗ヒト抗体によって検出される。

キットは、（ｉ）ＨＣＶ５染テスト個体からの血清と上記ペプチド抗原を反応さ せ、そして（ｉｉ）結合抗体の存在に対して抗原を試験することによって、個体 中のＨＣＶ感染を検出するための方法に使用される。

ペプチドの抗原は、本発明の他の面に従って、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）で感 染させたヒトからの血清と免疫反応する組換えペプチド抗原を発現するための発 現システムを使用して生成される。ペプチドを符号化するポリヌクレオチドの読 み取り枠（ＯＲＦ）を含む選択された発現ベクターは適当なホストに導かれ、こ れは発現ベクターにおけるＯＲＦの発現を促進する条件下に培養される。

ひとつの例において、ポリヌクレオチドはラムダｇｔｌｌファージベクターの発 現部位に挿入され、ベクターはＥ、ｃｏｌｉホストに導入される。括弧で示した 抗原のコード配列を含むベクターを含むＬｃｏｌｉホストを寄託した：　ＡＴＣ ＣＮｏ、４０９０１　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３）　、ＡＴＣＣＮｏ、４０８９ ３　（ＳＥＱ　（Ｄ　ＮＯ：１）、ＡＴＣＣＮｏ、４０７９２　（ＳＥＱ　ＩＤ Ｎ０ニア）、ＡＴＣＣＮｏ、４０８７６　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）、　ｐＧ ＥＸおよびｐＥＴはＨＣＶ抗原を発現するために使用された２種の他のベクター である。上記配列の発現のための他の適当なベクターおよびホストの組み合わせ は当業者清と免疫反応するポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドも本発明 の一部を成す０本発明の１種のポリヌクレオチドはポリペプチドを符号化し、こ のポリペプチドはａ）ＨＣＶコード配列によって符号化され；ｂ）５０４アミノ 酸残基を有し；そてしＣ）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：４として示されるカルボキシ 末端配列を有する、ペプチド配列の免疫反応部分を含み；そして、前記ペプチド 抗原のカルボキシ末端アミノ酸配列はＳＥＱ　１０　ＮＯ：３として示されるポ リヌクレオチド配列によって符号化される。

本発明の他のポリヌクレオチドは次の配列のいずれか１種を含む：　ＳＥＱ　１ ０　Ｎｏ：　１　、ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　３、ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　５　、 ＳＥ［ｌ　ＩＤ　Ｎｏ：　７、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　９　、　ＳＥＱ　Ｉｎ　 ＮＯ：１１、　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１３、　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５、　Ｓ ＥＱ　Ｉｆ）　ＮＯ：Ｉ７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ９、ＳＥＱ　ＩＤＮ０：２ １、ＳＥＱ　ＩＤＮ０：２３、およびＳＥＱ　ｒ［ｌ　ＮＯ：２５．本発明のこ れらの目的と特徴および他の目的と特徴は次の詳細な説明を図面を参照して読む と、さらに一層明らかになるだろう。

５、−　（７）　ｆｌｌ玉 肌図１本発明の方法による核酸セグメントのオーバーラツプ結合フラグメントを 生成する工程を示し；図２はＨＣＶゲノムの７，３００塩基対部分に沿ってオー バーラツプブライマー領域と結合領域の部位を示し；図３はクローン４０挿入物 のＤＮＡコード配列を示す、下線の配列はＲ，プライマー領域に相当する。

図４はクローン３６挿入物のＤＮＡコード配列を示す、下線の配列は、それぞれ 、Ｆｌ、Ｆｌ、およびＲ，プライマー領域に相当する。

図５は４０９−１−１　（ａｂｃ）クローン挿入物に対するＤＮＡおよびプロテ ィンコード配列を示す、この配列の“Ａ”ｆｉ（域は■によって表され、“Ｂ″ 領域閣とムによって表され、“Ｃ”領域はムと＊によって表されている。

図６は４０９−１−１　（ｃ−ａ）クローン挿入物に対するＤＮＡおよびプロテ ィンコード配列を示す。

図７は４０９−１−Ｈａｂｃ）クローン挿入物に相当する領域ＨＣＶゲノムから 得られたクローンのグループを示す。

図８ＡはｐＧＥＸ　−ＧＧＩ挿入物に対するＩ）ＮＡおよびプロティンコード配 列を示す、第１行百の上の３個のＧは置換が行われクローンｐＧＥＸ　−（ａｐ Ａを生じる位置を示す０図８８はｐＧＥＸ−Ｃａｐ＾挿入物コード配列に対する ＤＮＡおよびプロティン配列を示す、カルボキシおよびアミノ末端欠失を生しる ポリメラーゼ鎖反応に使用されるプライマーは下にヌクレオチドラインに禾され ている。プライマーの配列はその意味（コードＩ）で示されている。　ＮＧ　（ 非コード）プライマーの実際の配列は指示配列の逆補体である。コードプライマ ーは］を引いてあり、逆（非コード）プライマーは太い下線を引いである。大文 字で示された配列は正確にマツチしており、小文字で示された配列は末端制限部 位（５′末端の匣および３″末端のＢａｍＨＩ　）を案内するために使用される “ミスマツチ”の配列である０位置２４．２７、および３ｏで“スリッパリイコ ドン”を除くため部分的に代えた３個のヌクレオチドは配列の上に示した野性タ イプＡ残基で肉太活字で示されている。

図９はｐＧＥＸ　−ＣａｐＡで符号化されたＨＣＶ−コアプロティンの水感応プ ロットを示す、カルボキシおよびアミノ末端欠失を生じるために使用されたプラ イマーの相対位置は、矢印によってプロティンコード配列に関連して示されてい る。

図ＩＯはＨＣＶキャプシドプロティン碩域のエビト〜ブマンブを示す。

以下に定義される語は次の意味を有する：ｌ、“非経口的に伝染させた非Ａ、非 Ｂ型肝炎ウィルス作用因（ＰＴ−ＮＡＮＢＢ）　”は、（ｉ）非経口的に伝染さ せた感染肝炎の原因となり、（ｉＤチンパンジーにおいて伝染性があり、（ｆｉ ｔ）　Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）　、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、およびＥ 型肝炎ウィルス（ＨＥ　Ｖ）から血清学的に異なるウィルス、ウィルスタイプ、 またはウィルスクラスを意味する。

２、“ＨＣＶ　（ＨＣＶ）”は、ポリヌクレオチド配列が付録に示したＨＣＶの ７，３００塩基対の配列、および退化コドンのような配列の変異、またはＨＣＶ の異なる単離体または種に存在できる変異を含むＰＴ−ＮＡＮＢＨウィルス作用 囚を意味する。

３．２種の核酸フラグメントは、マニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ旦、、 ｇＨ，ｃｉｔ　、、　ｐｐ、　３２０−３２３）に記載されたハイブリッド形成 条件下に互いにハイプリント形成できるならば１相同”である、この条件は、次 の洗浄条件＝３０分毎に温室で２回、２　Ｘ５ＣＣ，０，１％ＳＤＳ　、次ニ３ ０分、５０℃で１回、２　Ｘ５ＣＣ，０，１％Ｓ［ｌＳ　、次ニ１０分毎に室温 で２回、２ＸＳＣＣを使用し、相同配列は各々約２５〜３０％の塩基対ミスマツ チを含むことを示すことができる。さらに特に、相同核酸鎖は１５〜２５％の塩 基対ミスマツチ、さらに好ましくは５〜１５％の塩基対ミスマツチを含む、これ らの相同の程度は、当該分野では良く知られているように、遺伝子ライブラリー （または他の遺伝子物質Ｒ）からのクローンの同定のためのハイブリッド形成条 件またはさらに激しい洗浄条件を用いて選択することができる。

４、上記（２）に定義されたＨＣＶウィルスゲノムの領域と同じ塩基対配列を実 質的に有する場合、ＤＮＡフラグメントはＨＣＶｌから誘導”される。

５、　ＰＴ−ＮＡＮＢＩＩまたはＨＣＶウィルス作用因からそれぞれ誘導される ｃＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントの読み取り枠によって符号化されるならば、 プロティンはＰＴ−ＮＡＮＢＨまたはＨＣＶウィルス作用囚“から誘導°される 。

ひとつとして、ｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターラムダｇｔｌｌ中の感染血 清から調整する。次にｃＤＮＡ配列を、ＰＴ−ＮＡＮＢＨ−感染血清と免疫反応 させるペプチドの発現に対して選択する。このアプローチによって同定された組 換えプロティンは診断テストにおける基質として用いられるペプチドに対する候 補者を与える。さらに、このアプローチによって同定された核酸コード配列は、 さらにＰＴ−ＮＡＮＢＨコード配列の同定のための有用なハイブリッド形成プロ ーブとして役立つ。

ＰＴ−ＮＡＮＢＨコード配列から発生するクローンを同定するために有用なアプ ローチを免疫スクリーニングするために、良く定義されたＰＴ−ＮＡＮ８１１ウ ィルス源が重要である。このような源を生じるために、源としてファクターＶＩ ＩＩ濃縮物を用いる伝染性ＰＴ−ＮＡＮＢＨ作用因でチンパ作用−（１７７１， 実施例ＩＡ）を感染させた（Ｂｒａｄｌｅｙ）。

ファクターＶＩＩＩ濃縮物は少なくとも２種類の非経口感染ＮＡＮＢ型肝炎（Ｐ Ｔ−ＮＡＮＢＨ）を含むことが知られティた。後にＨｃＶ　（ＨＣＶ）と呼ばれ たクロロホルム感性作用因に加えて、２丁−ＮＡＮ［ｌＨのクロロホルム耐性型 も濃縮物中に伝染された（Ｂｒａｄｌｅｙ、　１９８３）　：実施例１に示した 方法では、感染血清は、稀釈しないで、遠心分離によってベレットに小さく丸め 、ｃＤＮＡライブラリーは得られたベレットウィルスから生成した（実施例ＩＢ およびＩｃ）、感染起源のヒト血清を同じ方法で処理した。　ｃＤＮＡライブラ リーは、たとえば、出発物質としてペレット血清から抽出した＋？ＮＡを用いる ランダムプライマー法によって生成した（実施例ＩＢおよびＩＣ）０次に得られ たｃＤＮＡ分子を適当なベクター、例えば、ペプチド抗原の発現とスクリーニン グに対して、ラムダｇｔｌｌに、そしてハイブリッド形成スクリーニングに対し て、ラムダｇｔｌｏにクローンした（実施例Ｉ　Ｃ（ｉｖ））　、ラムダｇｔｌ ｌは、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子の翻訳終止コドンの５３塩基対上流に独 特なＥｃｏＲｒ挿入部位を含む特に育用な発現ベクターである。従って、挿入配 列は、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子のＮ−末端部分、異種ペプチド、および 任意にはベーターガラクトシダーゼペプチドのＣ−末端領域（このＣ−末端領域 は異種ペプチドコード配列が翻訳終止コドンを含まない場合に発現される）を含 むベーターガラクトシダーゼ配合プロティンとして発現される。このベクターは また、任意の温度、例えば、３２℃でウィルス性の温源性の原因となり、そして 高温、例えば、４２℃でウィルス性の溶菌を導く温度感性リプレッサー（ｃＩ８ ５７）を生成する。このベクターの利点は次の物を含む：　（１）高度に有効な 組換えクローンの生成、（２）許容されたしかも非許容ではない温度にてホスト 細胞に基づく溶原化ホスト細胞を選択する能力、および（３）高水準の組換え融 合プロティンの生成。さらに、異種挿入をもつファージは不活性のベーターガラ クトシダーゼ酵素を生成するので、挿入部をもつファージは一般にベーターガラ クトシダーゼ着色基質反応を用いて同定される。

実施例１〜３に報告されたスクリーニング方法において、各ｃＤＮＡライブラリ ーは１匹のＰＴ−ＮＡＮＢＨ感染チンパンジー（１７７１）および４人のＰＴ− ＮＡＩＩＩＩＩＩ（悪染ヒトの血清（ＥＧ阿、ＢＶ、　ＷＥＩ（およびＡＧと呼 ぶ）から調製した。これら５種類のライブラリーはＰＴ４４ＮＢＨ陽性ヒトまた はチンパンジー血清を用いて免疫スクリーニングした（実施例２）：ｌＩＩ　ラ ムダｇｔｌｌクローンは少なくとも１種の血清と免疫反応した。これらの１１１ クローンのうち、９３は正常のＤＮＡを用いて挿入ハイブリッド形成するために 試験した。挿入は放射性標識を付し、旧ｎｄｒｒｒ／ＥｃｏＲｒ二重消化ヒト末 梢リンパ球（ＰＢＬ）ＤＮＡに対してプローブとして使用した（実施例３）、挿 入物の約４６％（４３／９３）は正常ヒトＰＢＬ　ｒ）ＨＡを用いてハイブリッ ド形成し、従って因性として特徴がある（実施例３）、これら１１個のクローン のうち、２個のＰＴ−ＮＡＮＢＨクローンは次の特性を持つものとして同定され た。１個のクローン（クローン４０）は正常ヒトＰＢＬ　ＤＮＡに対するハイブ リッド形成テストを繰り返すことによって明らかに外因性であり、比較的小さい 挿入寸法（約０．５キロ塩基）を有し、そして陰性のコントロール血清と全く反 応しない。第２のクローン（クローン３６）は多重ＦＴ−ＮＡＮＢＨ抗血清との 反応性を示すし、比較的大きい挿入寸法を有しく約１．５キロ塩基）、そして正 常ヒトＰＢＬ　ＤＮＡに対するバイブリフト形成テストによって外因性であった 。

クローン３６と４０の免疫反応特性は表１にまとめて示しである（実施例３）、 クローン３６はチンパンジーの雲７７１血清および２種のＨＣＶ−陽性ヒト血清 、ＡＧおよびＢＶと免疫反応した。クローン３６抗原は陰性コントロール血清Ｓ ＫＦと免疫反応しなかった。クローン４０はチンパンジーｌ７７１血清と免疫反 応し、陰性コントロール血清をスクリーニングのために使用する場合、明らかに 反応しなかつクローン３６のＤＮＡ配列は一部決定され、これは図４に示した。

この配列は付録に示したＨＣＶ配列のヌクレオチド５０１０ないし６５１６に対 応する。またＤＮＡ配列はクローン４０挿入物に対しても決定された１図３）。

この配列はヌクレオチド６５１５ないし７０７０付近の領域でＨＣＶ配列（付録 ）に一致する。２個の他のチンパンジーｌ７７１クローン、クローン４４および ４５の挿入物はハイブリッド形成および配列分析によってクローン４０に相同で あることが見いだされた（実施例４）、クローン３６オよび４０に対する配列は 隣接し、クローン３６配列は付録に示したようにクローン４０配列の５°に位置 する。従って、これら２個のクローンは上述の免疫スクリーニング方法によって ＨＣＶゲノムの重要なブロックの単離を示す。

４個ノラムダｇｔｌｌりａ−ン３６．４０．４４、および４５はＣＡ９４０４３ 、レフトウッドシティ、ペップスコツトドライブ５０５、シーンラプス・インコ ーホレイテッド、シーンラプス・カルチャー・コレクション、に寄託した。さら に、クローン３６および４０のラムダｇＬ１１クローンはＭＤ２０８５２　、ロ ックビル、バークローン叶、１２３０１、アメリカン・タイプカルチャー・コレ クシ３ンに寄託し、寄託番号ＡＴＣＣ４０９０１およびＡＴＣＣ４０８３９を与 えられた。

ＩＩｌ、ハイブリッドノ　によるＰＴ−ＮＡＮＢ）Ｉ配置占セクションＩｆで同 定されたポリヌクレオチドは、さらにＨＣＶ配列を同定するためにハイブリッド 形成方法においてプローブとして使用することができる。次にこれらは追加の配 列を同定するためのプローブとして試用することができる。ポリヌクレオチドは ランダムフラグメントを生成するように部分消化によって直接クローンまたはフ ラグメントにすることができる。得られたクローンはＨＣＶ抗原コード配列を同 定するため上記のように免疫スクリーニングすることができる。

ＨＣＶ配列を運ぶクローンを同定するためどのようにしてクローン３６および４ ０の挿入物を使用することができるかを示すため、クローン４０の挿入物を単離 し、ラムダｇｔｌｏに確立された個々のｃＤＮ＾ライブラリーに対してハイブリ ッド形成プローブとして使用した（上記）。クローン４０を使用して、約２４個 の独立したハイブリッド形成陽性クローンをプラーク精製した（実施例５）、異 なるから得られるよりはむしろ、ハイブリッド形成信号が血清源がらのものであ ることを示している（表２）。クローンのうちの１個、クローン４０挿入物とハ イブリッド形成によって陽性にテストされた１０８−２−５は、約３．７　ｋｂ の挿入物を有していた（実施例６）。このような大きい挿入物をもっているので 、クローン１０８−２−５はさらに分析のために選ばれた。このｃＤＮＡクロー ンの血清源はＥＧＭヒ）　ＰＴ４ＡＮ８）１血清であった（実施例１）。

１０８−２−５の挿入物はラムダｇｔｌＯクローンのεｃｏＲＩ消化、電気泳動 分離、および電気溶出によって単離された（実施例６）、単離された挿入物は、 ＤＮａｓｅｌで処理してランダムフラグメントを生成しく実施例６）、得られた 消化フラグメントは免疫スクリーニングのためラムダｇｔｌｌファージベクター に挿入した。１０８−２−５フラグメントのラムダｇｔｌｌクローンはヒト（Ｂ Ｖおよび正常）およびチンパンジー１１７７１血清を用いる免疫スクリーニング をした（実施例６）。１２個の陽性クローンを第１ラウンドの免疫スクリーニン グによってヒトおよびチンパンジー血清を用いて同定した。１２個のクローンの うち７個はプラーク精製しチンパンジー５７７１血清を用いて再スクリーニング した。挿入ＯＮ＾の部分ＤＮＡ配列は得られた２個のクローンに対して決定され 、３２８−１６−１および３２８−１６−２と名付けられた。これら２個のクロ ーンは本質的にクローン４０と一致する配列を含んでいた（実施例６）。

クローン３６挿入物はラムダｇｔｌｏに生成した元のｃＤＮＡライブラリーをプ ローグするのと類似した方法で使用することができる。クローン３６の特異的サ ブフラグメントはポリメラーゼ鎖反応によってまたは分割後に制限エンドヌクレ アーゼを用いて単離することができる。これらのフラグメントは放射活性標識を 付け、ラムダｇｔｌｏで生成したｃＤＮＡライブラリーに対してプローブとして 使用することができる（実施例ＩＣ）、特に、クローン３６挿入物の５゛末末端 列はこの領域をオーバーラツプするクローンを同定するためのプローブとして有 用である。

さらに、末端クローン３６挿入物配列および末端クローン４０挿入物配列によっ て与えられた配列は、例えば基質としてＲＮＡを生成したチンパンジーｌ７７１ 血清を使用する第−鎖ＤＮＡ合成反応（マニアチスら；シャーフら）において特 異的配列プライマーとして有用である。　ｃＤＮＡの第二鎖の合成は不規則にプ ライムされる。上記方法はクローン３６および４０挿入配列に近接した５゛の核 酸領域に対応するｃＤＮＡ分子を同定または生成する。これらの新しく単離され た配列は順番にさらにフランキング配列を同定するために、そしてＨＣＶゲノム を構成する配列を同定するために試用することができる。上述したように、新し いＨＣＶ配列を単離した後、ポリヌクレオチドをクローンして免疫スクリーニン グにかけてＨＣＶ抗原を符号化する特異的配列を同定することができる。

Ｉｖ、オーバーラツプしているクローン　ムフーグメントのこのセフシランでは 、ＨＣＶ診断抗原として有用なＨＣＶペプチドを生成し同定するための方法を説 明する０本方法は核酸のセグメントを測る一連のオーバーラツプ結合フラグメン トを生成するために使用される。付録にその配列が示されているＨＣＶゲノムの ７，３００　塩基対セグメントを測る一連のオーバーランプ結合フラグメントを 生成するための方法の応用は、図１および２を参照して記述されるであろう。

この方法の第一工程として、図１を参照すると、挿入物の核酸は二重鎖ｊＩＮＡ 型で得られる０代表的には、これはゲノムＩ）ＮＡフラグメントを単離して、あ るいは試料液中に存在するＲＮＡ種からｃＤＮＡｓを生成することによって行わ れる。後者の方法は既知のＰＴ−ＮＡＮＢＨ感染のチンパンジーまたはヒトから の血清中に存在するＮＡＮＢＨウィルス性ＲＮＡから二重１１ＯＮ＾を生成する ために使用される。

ここで試料中のＲＮＡは、例えばＰＥＧ沈澱とりオンのグアニジニウムチオイソ シアネート抽出によって単離され、第１１ｅＤＮＡ合成に通したプライマーと反 応させる。

第１鎖ｃＤＮ＾ブライミングはランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、ま たは配列特異的プライマーによって行われる。プライマー条件は、（ａ）関係す る核酸セグメントを集合的に測るｃＤＮＡフラグメントの発生を最適にし、そし て（ｂ）長さが約１０００塩基対に好ましくは等しいかまたは大きいｃＤＮＡフ ラグメントを生成するように選択される。ＨＣＶＲＮＡに応用される１つの方法 では、第１Ｍ合成は、既知のＨＣＶゲノム配列の長さに沿って間隔を置いた領域 に相補的である配列特異的プライマーを使用して行われる。プライマーの位置は ＨＣＶゲノムセグメントのマツプを示している図２においてＡ、Ｂ、　Ｃ，およ びＤにて示されている。ＨＣｖゲノムにおけるプライマーの塩基対の位置は以下 の実施例７に与えられている。第１１合成に続いて、第２　ｃＤＮＡ［は標準法 によって合成される。

この方法での結合フラグメントは、記述されるオーバーラツプ領域プライマーの ベアを使用して、上記のように得られた２重鎮ＤＮＡの配列特異的増幅によって 生成される０本発明の方法の重要な利点によれば、二重ＨＤＮＡの分量が直接の 配列特異的増幅に対して低すぎる場合にも結合フラグメントを生成できることで ある。

この制限は、例えば、ＮＡＮＢＨ感染血清から生成したＨＣＶｃＤＮＡを使用し て見いだされた。ここで、増幅のために入手できる二重鎖ＯＮ＾の総量はまず配 列独立単一プライマー増幅（ＳＩＳＰＡ）として知られる技法によって匪１す【 的茎工増幅される。

この５ＩＳＰＡ技法は１９８８年７月２６日に出願された共有の米国特許出願番 号第２２４．９６１号のＲＮＡおよび［１ｌＩＡ増幅技術”に詳述されている。

ＨＣＶｃＤＮＡフラグメントの増幅に応用される方法もまた実施例７に記載して いる。簡単に述べると、既知の配列リンカ−プライマーをＤＮＡ試料中の二重鎖 ＤＮＡの反対側の端部に結合させる０次に、これらのリンカ−は、リンカ−／プ ライマー配列に相補的なプライマーを使用して、プライマー開始増幅に対して共 通の端部配列を与える０代表的には、５ｒＳＰＡ法は、第２　ｔＪ￥Ｉ）ＮＡの 連続変性とプライマー開始重合を行うように熱サイクリングを用いて、２０〜３ ０サイクルの増幅に対して行われる。

図１は既知の配列領域Ｐ、をもつ増幅フラグメントを形成するための二ＭＤＮＡ のＳＩＳＰＡ増幅を示す０図に見られるように、フラグメント混合物は、（ａ） 混合物中の他のフラグメントとＰ、領域にてオーバーラツプし、（ｂ）隣接した Ｐ、およびＰ２゜１領域の間に完全な結合領域を含む少なくとも若干のフラグメ ントを含む、集合的には、セグメントを作る結合したオーバーラツプ領域によっ て連結した各結合領域は、少な（とも１個のＤＮＡフラグメント中に存在する。

オーバーラツプ結合フラグメントの生成は本発明の方法によれば、米国特許第４ ，６８３．１９５に記載されたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる 。この方法の工程を行う際に、まず、前記のように、関連のある全セグメントを 既知の配列の領域によって結合された一連のオーバーラツプしている間隔に分け る０図２において、ＨＣＶゲノムの７．３００塩基対セグメントは、各々が約５ ００〜１　、０００塩基対の長さでＩＯの間隔に分けた。この間隔は、これから 述べるようとしている配列を増幅する際に用いられる前進Ｆ。

と逆ＲＪプライマーにしたがって表される０間隔の選択は（ａ）間隔の各端部に て塩基対配列が知られていることめ必要性、および（ｂ）約５００と２．０００ 塩基対の間の好ましい長さの間隔によって案内される。

ＨＣＶゲノムの７．３００塩基対セグメントに応用される方法において、１０個 の間隔の間のオーバーラツプ領域は付加的に増幅され、ＳＩＳＰＡ増幅ｃＤＮＡ 試料がＨＣＶ結合フラグメントのＰＣＲ増幅を認めるに十分なＨＣＶｃＤＮＡを 含んでいること、およびゲノムの全長に沿ったＨＣＶＭＭが増幅に対して入手で きることを証明した。

セグメントにおける各オーバーランプ領域は、オーバーラツプの反対側端部の反 対側鎖に相補的である前進プライマーＦ８と逆プライマーＲ３を含む一対のプラ イマーによって画定することができる１代表的にはプライマーは長さが約２０塩 基対であり約２００塩基対のオーバーラツプ領域を測る。ＨＣＶセグメントにお ける１１個のオーバーラツプ領域と各領域における前進と逆のプライマーに対応 する領域とを実施例８に与える。

ＰＣＲ反応ミックスにおける増幅ＤＮＡ物質にプライマーＦｉ／Ｒ。

を添加し、プライマーによって結合したオーバーラツプ領域を２０〜３０の熱サ イクルによって増幅する０次に反応勧賞を、例えば、アガロースゲル電気泳動に よって分別し、所望の配列の存在に対して、例えば、オーバーランプ領域の内側 部分に対して特異的な放射標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、サザンブ ロッティング（サザン）によって、プローブする。実施例８に記述したように、 この方法はＨＣＶゲノムセグメントにおける１１個のＦ。

／Ｒｉオーバーランプ領域の各々に対して増幅フラグメントを生成することに成 功した。このオーバーラツプ領域フラグメントはオーバーラツプ領域によって結 合された対応する（２つの）結合フラグメントに対してプローブとして使用する ことができる。しかしながら、この増幅工程はＨＣＶゲノムの長さに沿って増幅 できるｃＤＮＡの存在を確認するために用いられ、所望の結合フラグメントを生 成する際の基本的な工程としてでは用いられないことを強調する。この工程は図 １には示していない。

５ＩＳＰＡ増幅ＤＮＡフラグメントが１つのオーバーラツプ領域の前進プライマ ーＦ８および近接するオーバーラツプ領域の逆プライマーＲＪから成る一対のプ ライマーによって増幅される２つのプライマーのＰＣＲ方法によって、結合フラ グメントＦｉ／Ｒｊは生成される。ＨＣＶセグメントの１０個のオーバーラツプ 領域および各領域における前進および逆プライマーに対応する領域は実施例９に 与えられる０代表的な増幅条件は実施例９に与えられる。

各反応混合物における増幅フラグメントは、例えば、ゲル電気泳動によって単離 され精製され、期待されるフラグメント寸法を確立する。サザンブＣ７７）は、 フラグメント端部の間に位置する内部領域に相補的なオリゴヌクレオチドプロー ブを用いてプローブすることができ、フラグメントの期待される配列を確立する ０図１の下部に示したように、この方法は結合フラグメントの完全なセットを生 じ、そこでは各フラグメントが、オーバーラツプ領域Ｐ、およびＰ４．１によっ て結合されている。

この方法は、７．３００塩基対のＨＣＶゲノムのオーバーランプ結合フラグメン トを生成するために応用されるように、実施例９に記載されている。ゲル電気泳 動での寸法基準によって、およびサザンブロフティングによる配列基準によって 示されるように、この方法はＨＣＶゲノムに広がるオーバーラツプフラグメント の１０個全部を生成することに成功した。

上記のフランキング配列増幅方法が、免疫スクリーニングによっても得られたク ローン３６と４０の挿入配列に対応する口ＨＡフラグメントの生成に応用出来る ことは、高く評価されるだろう。挿入物の側面に位置するリンカ−プライマーは クローン挿入物に対応する配列を生成するために容易に用いられる０例えば、Ｆ １□／Ｒ９プライマー対（その配列は実施例８に示される）を用いる５ｒＳＰＡ 増幅ｃＤＮＡフラグメント（実施例７）の２個のプライマーの増幅は、実施例９ に記述したものと類催した条件下に行われる。増幅したフラグメント混合物はア ガロース電気泳動によって１．０％アガロースで分別され、期待されるバンドは ゲルがらカットされて溶出する。

精製した増幅フラグメントはＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントを用 いて処理され、分子が平滑末端であることを保証する０次にフラグメントをＥｃ ｏＲＩリンカ−に連結する（実施例１０）。

混合物はＥｃｏｌ？Ｉを用いて消化されラムダｇｔｌｌベクターに挿入され−る 。得られたクローンはクローン３６または４０の挿入物のいずれかの完全なコー ド配列を含む。

また、最初の増幅３６／４０フラグメント（プライマーＦ　＋　ｚ／　Ｒｔ）を 簡単にエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて処理しくベーリンガーマンハイム、製 造者の指示通り）、異なる５°末端をもつフラグメントの１つのグループを生成 する。消化生成物は上記のように処理してラムダｇｔｌｌベクターに連結する０ 次に得られたプラグを免疫スクリーンにかける。

さらに、上記のＦ＋ｚ／Ｒｑプライマーとは別の異なる組のプライマーを使用し て、クローン３６と４０の全部または一部を符号化する配列を直接生成すること ができる０例えば、プライマーＦｌ／Ｒ？は、クローン３６の挿入物の３゛配列 の一部（図４）およびクローン４０の挿入物配列の全部（図４）に対応するフラ グメントを生成することができる。また、プライマーＦｔ／Ｒｔを使用して、ク ローン３６の挿入物に存在する５゛配列の一部に相当するフラグメントを直接生 成することができる（図４）。

Ｖ、　ＰＴ−ＮＡＮＢＩ（・　ペプチドフラグメント本発明の方法に従って、ヒ トおよびチンパンジーＮＡＮＢ）ｌ　５染血清からの血清に免疫反応する幾つか の新しいペプチド抗原を上記で生成したＮＡＮＢＨ結合フラグメントから生成し た。さらに、この方法は先にｃＤＮＡライブラリー免疫スクリーニングによって 同定した（上記セクションＩＩ）抗原領域をｉ認した。結合フラグメントから誘 導された抗原ペプチドは、まず上記の結合フラグメントの各々をＤＮａｓｅｌを 用いて部分消化条件下に消化し、実施例１０に示したように、１００〜３００塩 基対の大きさの範囲でｆｌ！勢にＤＮＡ消化フラグメントを生成する工程を含む 方法で好ましく生成される。消化フラグメントは、例えばゲル電気泳動によって 大きさを分別し、所望の大きさの範囲で選択することができる。

各結合フラグメントからの消化フラグメントは次に適当な発現ベクターに挿入さ れる。ひとつの例示的な発現ベクターはラムダｇｔｌｌであり、その利点は上述 した。

発現ベクターに挿入するため、消化フラグメントを修飾し、必要により、従来の 方法に従って、ＥｃｏＲＩリンカ−のような選択された制限部位リンカ−を含ま せる０代表的には、消化フラグメントはＥｃｏＲＩリンカ−と平滑末端結合され 、ＥｃｏＲＩ−切断ラムダｇｔｌｌに導入される。このような組換え技法は当該 分野では良く知られている（例えば、マニアチスら）。

得られたウィルス性ゲノムライブラリーはチェックして、比較的大きい（代表的 な）ライブラリーを各結合フラグメントに対して生成したことを確認することが できる。これは、ラムダｇｔ１１ベクターの場合には、適当なバクテリヤホスト に感染させ、バクテリアを培養し、そして透明プラークによって証明されるよう に、ベーターガラクトシダーゼ活性の損失に対するプラークを試験することによ って行うことができる。

透明プラーク中の消化フラグメント挿入物の存在は、実施例１Ｏ已に記載された ように、ＥｃｏＲＩ挿入部位の側面に位置するｇｔｌｌファージの領域に対し特 異的なプライマーを用いて、ファージＤＮＡを増幅することによって確認するこ とができる。その結果は表３に示され、各結合プライマーライブラリーにおいて 試験されたプラークの大きい割合が消化フラグメント挿入物を含んでいた。

また、結合フラグメントライブラリーは、ＰＴ−ＮＡＮＢＩ＋慢性、回復期、ま たは急性の感染で同定されたヒトまたはチンパンジー血清を用いて免疫反応する ペプチド抗原に対してスクリーニングすることができる。好適な免疫スクリーニ ング方法は実施例１０Ｂに記載されている。ここではファージ感染バクテリアに よって生成した組換えプロティンはプラークからフィルターに移される。洗浄後 、フィルターを試験血清とインキュベートし、次いでリポータ−標識抗ヒトＩｇ Ｇ抗体と反応させる０次にフィルター上のペプチド抗原の存在をレポーターの存 在に対してアッセイする０表３から認められるように、結合フラグメントライブ ラリーの幾つかは第一のスクリーンにおける免疫反応性ペプチドに対して陽性で ある。

前記免疫スクリーニング法は、既知の慢性、回復期、または急性のＰＴ−ＮＡＮ ＢＨ感染を有するヒトまたはチンパンジーからの血清と免疫反応する結合ライブ ラリーの各々からライブラリープラークを同定するために使用することができる 。ひとつの例示的なスクリーニング方法は実施例１１に与えられ、１０個のＨＣ Ｖ結合フラグメントライブラリーは既知のＰＴ−ＮＡＮＢＨの（ａ）ヒトの慢性 血清、（ｂ）チンパンジーの急性混注血清および（Ｃ）チンパンジーの慢性混注 血清を用いてスクリーニングを行う、この試験した１０個のライブラリーのうち 、Ｆ＋／Ｒ＋。ライブラリーだけがこれら３種の血清のいずれとも陽性の免疫反 応を与えなかった。幾つかのフラグメントライブラリーは、Ｆ　ｘ／　Ｒａ、Ｆ ！／Ｒ，□、Ｆ１□／　Ｒ７、およびＦ７／Ｒ１１、を含めて、チンパンジーの 急性血清と５以上の陽性反応を見せたが、これらのライブラリーの各々が、チン パンジーまたはヒトの急性ＰＴ４ＡＮ８Ｊ（！！染を検出するために有効な１以 上のペプチド抗原を発現することを示している。

フラグメントライブラリーＦ　ｙ／　Ｒ＊はクローン３６挿入物の内部フラグメ ントに相当する（セフ２３２１１．図４）、従って、結合フラグメント法はこの ＤＮＡ　８Ｎ域が有用な抗原を符号化することを確認した。さらに、フラグメン トライブラリーＦ　ｓ／　Ｒ−は、クローン４０挿入物に存在する配列を含む（ セクション■に図３および４）０表４の結果は、慢性感染血清の存在を検出する ために有効な少なくとも１つのペプチド抗原がＦ　＊／　Ｒｑフラグメントライ ブラリーから単離されたことを示している。

Ｖｌ　＝　４０９−１−１ペプチド Ａ、　免疫反応性スクリーニング 免疫反応性スクリーニングによって同定された２個の免疫反応性プラーク、４０ ９−１−１（ａｂｃ）および４０９−１−１　（ｃ−ａ）を、５−１−ＩＨＣＶ ペプチド抗原に対し強い免疫反応を示すことが良く証明されているＦＴ−ＮＡＮ ＢＨ慢性血清に対する免疫反応性について試験した（クオ）、この５−１−ＩＨ ＣＶペプチド抗原は前もって、高率のヒトＰＴ−ＮＡＮＢＨ慢性血清に対して免 疫反応性であると同定された。５−１−１抗原はＨＣＶゲノム（付録）において 塩基対３７３１と３８５７との間の配列によって符号化され、それ自体は塩基対 ３５３１と４４４２との間の配列によって符号化されるさらに大きいペプチド抗 原Ｃ−１００に含まれている。後者のペプチドはヒトＨＣＶ感染の検出用の市販 品診断キットに用いられる（オルソ／カイロン）、このキットは、上述のように 、約８０％のヒト慢性ＰＴ−ＮＡＮＢ）ｌ試料、および約１５％のヒト急性ＦＴ −ＮＡＮＯ）Ｉ血清と陽性に反応することが報告されている。

４０９−１−Ｈｃ−ａ）ファージは、概略を上述したように、免疫スクリーニン グによって同定しプラーク精製した。　４０９−１−１（ａｂｃ）と名付けた関 連するクローンは、本願の親出閤に記載された（米国特許出願番号０７１５０５ ，６１１、ここに参考文献として組み込まれる）、クローン４０９−１−１　（ ａｂｃ）は親出願では４０９−１−１　と名付けられた。ａ、ｂおよびＣの名称 は４０９−１−Ｈａｂｃ）配列の３つの領域に関連している（図５参照）　、　 ５−１−１コ一ド配列は、５−１−１コード領域の末端に相補的なオリゴヌクレ オチドブライマーを使用するポリメラーゼ鎖反応によって単離され、５−１−１ 抗原ペプチド領域を含む融合ベーターガラクトシダーゼプロティンの誘導条件下 に発現のためのラムダｇｔｌｌにクローンした。５−１−１フアージを同様の方 法で同定しプラーク精製した。

４０９−１−１（ｃ−’ａ）および５−１−１抗原を、正常（２ドナー）、ヒト ＰＴ−ＮＡＮＢＨ−慢性（６ドナー）、チンパンジー正常（７ドナー）、チンパ ンジーＰＴ−ＮＡＮＢＨ−急性（５ドナー）、およびチンパンジーＰＴ〜ＮＡＮ ＢＨ−慢性（８ドナー）からの２８の血清のパネルを用いてプラーク免疫スクリ ーニングによって比較し、その結果を実施例１２の表５に示した０表５から判る ように、５−１−１および４０９−１−１（ｃ−ａ）ペプチドは大抵のヒトおよ びチンパンジーの慢性血清と反応したが、４０９−１−１（ｃ−ａ）ペプチドは 高率のヒト慢性血清試料（８３％対６６％）を検出した。　４０９−１−Ｈｃ− ａ）ペプチドによって検出されたが、５−１−１によって検出されなかった慢性 ヒト血清は劇症のＮｏｏＨ感染で死んだ患者（ＢＶ）からのものであった、　５ −１−１抗原は市販品として入手できるキットフォーマット中のｃ−ｉｏｏ抗原 内に含まれているので、Ｃ−１００抗原が試験血清と広い範囲の反応性を与える かどうかを決定することは興味があった。その結果は以下の表５の右側に示しで ある。試験したヒｌ−ＮＡＮＢＨ血清のみが５−１−１によつて検出されない上 記ＢＶ血清であった。またこの血清はＣ−１ｏｏ抗原と免疫反応しなかった（０ ／１）、またＣ−１００抗原は試験した５匹の急性チンパンジーのいずれとも反 応しなかった（０１５）、さらに５−１−１抗原に対し５匹のうち１匹のみであ ったのと比較して、４０９−１−１（ｃ−ａ）抗原は試験した５匹の急性チンパ ンジー血清のうち３匹のものと免疫反応性があることが注目される。これらの結 果は４０９−１−１（ｃ−ａ）抗原がＰＴ−ＮＡＮＢＩＩ血清と広く免疫特異性 を有しており、従って優れた診断薬を提供するのであろうことを示している。４ ０９−１−１（ｃ−ａ）で得られた結果は４０９−１−１（ａｂｃ）を用いて得 られた結果と比較できる。

ここに４０９−１−１（ａｂｃ）コード配列がＲ＊／　Ｒｓ結合フラグメントに 含まれ、ＦＪＲｓおよびＦｓ／Ｒｈ結合フラグメントにあるＣ−１００（および ５−１−１）コード領域の配列にオーバーラツプしないことが注目される。　４ ０９４−Ｈａｂｃ）ペプチドの比較的長いコード配列は、さらに大きい寸法の消 化フラグメント（実賞的に３００塩基よりも大きい）は抗原発現に対して消化フ ラグメントを生成するのに使用される部分消化工程において生成されることを示 している。

本発明のひとつの特徴を形成する４０９−１−１　（ａｂｃ）ペプチドは、ＳＥ Ｑ　１０　ＮＯ：１０と示されるアミノ酸配列を存している。　４０９−１−１ クローン中の挿入物に対応するＤＮＡコード配列は図５に与えられ、ＳＥＱ　１ ０　ＮＯ：９として示される。

本発明の他の特徴を形成する４０９−１−１（ｃ−ａ）ペプチドは、ＳＥＱ　１ ＯＮＯ＝８として示されるアミノ酸配列を存する。　４０９−１−１（ｃ−ａ） クローン中の挿入物に対応するＤＮＡコード配列は図６に与えられ、ＳＥＱ　１ ０　ＮＯニアとして示される。　４０９４−（ｃ−ａ）　と４０９−１−１　（ ａｂｃ）のコード配列の間の関係は実施例１２に略記されている。簡単に述べる と４０９−１−１（ｃ−ａ）は、残りの３’　４−９−１−Ｈａｂｃ）コード配 列の先端切断と共に、４０９−１−１コ一ド配列のアミノ末端に移動した４０９ −１−ＨａｂＣ）のカルボキシ末端領域から成る。

さらに一般的に、本発明はＨＣＶ感染のヒトからの血清と免疫反応するペプチド 抗原を含む、このようなペプチド抗原は容易に本発明の方法によって同定するこ とができる。

４０９−１−１抗原を符号化するＨＣＶ配列に対応する領域から得られた抗原は さらに、次のような特徴がある０表７に示したプライマーは、この領域から導か れたオーバーランプする増幅フラグメントのファミリイを生成するために使用し た。　ＤＮＡ増幅反応のために複数の鋳型を使用した（表８）、互いに得られた クローンのコード配列の関係は図７に図式的に示しである。増幅フラグメントを 次にラムダｇｔｌｌベクターにクローニングさせた（実施例工３）。

次にこれらのクローンフラグメントを免疫スクリーニングした〈実施例１３）。

試験した９個のクローンのうち７個は予備免疫スクリーニングによって陽性であ った（表９）、これらの７個のクローンを次に、多数のヒトの臨床試料を含むＰ Ｔ−ＮＡＮ８１（血清試料の一層広い一層に対して試験した。スクリーニングに 対して使用した血清との反応性に対して、抗原の感受性は減少する順で次のよう であった：　３３ｃｕ　＞３３ｃ　＞　４０９−１−１　（ｃ−ａ）　＞　４０ ９−１−１−ＦＩＲ２＞　４０９−１−１（ａｂｃ）　２４０９−１−１ａ＞５ −Ｉ−１＞４０９−１−１（ｃ＋２７０）、これらの結果から認められるように 、４０９−１−１（ｃ　＋２７０）を除いて、代わりになるりローンの全部が５ −１−１よりも感受性の大きい抗原を与える。しかし、３３ｃｕと３３ｃは非常 に敏感な抗原であったが、このアンセイでは、これらは、ＨＣＶに対して陰性で あり、従って特異性が小さいと知られている血清と僅かに反応する。従って、４ ０９−１−１シリーズはＨＣＶ誘導抗体に対し一層特異的であるので、診断抗原 として使用するために好ましいと見られる。

免疫スクリーニングは広がってエピトープを符号化したクローン３６と４５を含 む：クローン４５の挿入物はクローン４０の挿入物と殆ど同じである（実施例４ ）６表１１に示した結果から認められるように、クローン３６と４０によって生 成した抗原は、４０９−１−１（ｃ−ａ）はど敏感ではないが、選択された試料 を」いてＨＣＶ−特異的免疫陽性信号を生じる。従って、本発明に示されるこの ２つの方法、（ｉ）血清誘導ＲＮＡから直接生成したｃＤＮＡライブラリーの免 疫スクリーニング、および（ｉｉ）増幅フラグメントライブラリーの免疫スクリ ーニングは、両方共にウィルス性抗原を符号化するｃＤＮＡ配列を同定する方法 に有効であると見られる。さらに、増幅フラグメントライブラリー法を用いるこ れらＨＣＶ　領域に対する抗原の同定によって抗原を符号したクローン３６と４ ０の確立は、増幅フラグメント法の育用性をＷ１認する。

Ｂ、ペプチド精製 本発明の組換えペプチドは、示差沈澱、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン 交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動およびアフィニティク ロマトグラフィーを含む標準ブコテイン精製法によって精製することができる。

上記のように調製されたベーターガラクトシダーゼ融合プロティンのような融合 プロティンの場合には、表面結合抗ベーターガラクトシダーゼ抗体をもつ固体支 持体上に細胞溶菌物質を通して、融合プロティンはアフィニティクロマトグラフ ィーによって容易に単離することができる０例えば、４０９−１−１（ｃ−ａ） コード配列から誘導されたベーターガラクトシダーゼ／融合プロティンのアフィ ニティクロマトグラフィー精製は、実施例Ｉ４に記載されている。

グルタチオン−３−）ランスフェラーゼ（Ｓｊ２６）プロティンで融合した４０ ９−１−１（ａ）ペプチドを含む融合プロティンは、また、Ｌｃｏｌｔ　ＫＭ３ ９２細胞（スミス）中のｐＧＥＸベクターシステムを用いて発現された。この発 現システム番よ、融合プロティンが一般に溶解性であり、従って非変性条件下に 単離することができる利点がある。

融合５ｊ２６プロテインはグルタチオン基質アフィニティクロマトグラフィーに よって容易に単離することができる（スミス）、融合プロティンを発現するこの 方法は実施例１５に示され、本発明によって記載された他の抗原コード配列のい ずれかに応用できる。

また本発明に含まれるものは、４０９−１−１（ａ）コード配列および適当なホ ストにおいてコード領域を発現出来る発現コントロール要素を含む上述のラムダ ｇｔｌｌまたはｐＧＥＸのような発現ベクターである。コード配列はＨＣＶゲノ ムの塩基対２７５５〜３３３１に対応する上記配列に含まれる。一般にコン）Ｃ ７−ル要素は、プロモーター、翻訳開始コドン、および翻訳および転写終結配列 、および挿入物をベクターに導入するための挿入部位を含む、実施例１５に示し た現ベクターは本発明によって記載された他の抗原コード配列に対して容易に構 築することができる。

次のコード領域を含むラムダｇｔｌｌベクターはＭＤ　２０８５２、ロックビル 、バークローンドライブ１２３０１、ザ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクシランに寄託した：　ｇｔｌｌ／４０９−１−１（ａｂｃ）と名付けられた ４０９−１−１（ａｂｃ）コード領域、ＡＴＣＣＮｏ、４０８７６；　ｇｔｌｌ ／４０９−１−１（ｃ−ａ）と名付けられた４０９−１−１（ｃ−ａ）コード領 域、ＡＴＣＣＮｏ、４０？９２；　ｇｔｌｌ／３６と名付けられたクローン３６ 、ＡＴＣＣＮｏ、４０９０１；およびｇｔｌｌ／４０と名付けられたクローン４ ０．　ＡＴＣＣＮｏ、４０８９３゜ＶＩｌ、ＨＣＶ−キャプシド　の　・、　ク ローン１９９０年の肝臓学会議にて、全長ＨＣＶ核酸配列の領域が示され、ポリ プロティン配列のキャプシド部分として、ＨＣＶをコードし持して行われた実験 過程で、キャプシドプロティンに対応するコきる。　ｐＥＴベクターへの挿入は 融合配列から独立した挿入コードおよび６５、実施例１７、表１３）　、　ｐＧ ＥＸのクローンから生成された融るために選択された。融合プロティン生成物（ 約２９ｋｄ）は期待された融合生成物（約５０ｋｄ、実施例１７）よりも小さか った。さらに、この調製による融合プロティンの収率は意外にも低かった。

クローン１５と５６はＨＣＶ抗原含有挿入物の核酸配列決定のため用される抗Ｈ ＣＶ血清に関しては免疫原性であることを示唆してンが長い読み取り枠をもつこ とを示している。融合プロティンの生成を誘導する際に期待される生成物よりも 小さい融合プロティンは、クローン１５生成物に僚た大きさで生成された。クロ ーンのヌクレオチド配列は翻訳フレームシフトし易い領域、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ Ａに現れた（アドキンスら、ウィルソンら）、このようなヌクレオチド配列は、 これらのクローンがＥ、ｃｏｌｉで発現されるときプロティンの低収率に貢献で きる。融合プロティン発現のレベルを改良するための努力では、この領域を通し て複数のコドンの第３のヌクレオチドの位！が配列ＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡになる Ｇに変化した（実施例２０）：この変化はプロティンコード配列には何の影響も ながった（アミノ酸残基８−１０、図８Ａ）、この改変された挿入物はｐＧＥＸ ベクターにクローンされ、得られたプラスミドはｐＧＥＸ　−Ｃａ９＾と名付け た。

水感応プロットをｐＧＥＸ−ＧＧＩ（実施例１９、図９）の挿入のプロティンコ ード配列に対して生成させた。この分析の結果は符号化プロティンのカルボキシ 末端領域、およそアミノ酸残基１６８−１８２が、膜スパンニングセグメントで あるためポテンシャルを有することを示した。膜スパンニングセグメントが強い 抗原を与えることは見込みがないので、また、これらの領域をもつプロティンの 過剰生産がバクテリア細胞の成長に不利な影響を与えることができるので、一連 のカルボキシ末端欠失はｐＧＥＸ　−ＣａｐＡから生成した（実施例２０）。

カルボキシ末端欠失部を生成するために、ＰＣＲプライマーはｐＧＥＸ−Ｃａｐ Ａ挿入物符号化プロティンの種々の領域に相補的であるように設計された。カル ボキシ末端欠失部を生成するために使用されたプライマーは表１４に示され、挿 入物コード配列に関してプライマーの位置は図８Ｂに示される。カルボキシ末端 欠失フラグメントはｐＧＥＸベクターにクローニングし、５ｊ２６／　ＨＣＶ挿 入物融合プロティンを生成した。これらの融合プロティンを次に抗ＨＣ■血清お よび免疫反応ポリペプチドに対して生成したエピトープマツプを用いてスクリー ニングした（図１０参照）、クローンＣｌＮＣ２７０ＳＣＩＮＣ３６０、および ＣｌＮＣ４５０全部が高イレヘル０）Ｓｊ２６／　ＨＣＶ融合プロティンを発現 した。さらに、これらの融合プロティン全部がこれらの核酸コード配列から予言 される寸法に対応していた。

りｏ　−７ＣＩＮＣ５２０とＣｌＮＣ５８０は、アミノ酸残基１６８−１８２の 疎水性領域が存在するとき融合プロティンの収率が低く、これは一部は予じめ得 られた低いプロティン収率の原因であることを示唆する。

ｐＧＥＸ　−ＣａｐＡ符号化ＨＣＶ抗原の抗原性領域をさらに吟味するために欠 失分析を続けた。カルボキシ末端欠失部と組合わせた一連のアミノ末端欠失部（ 表１５のプライマー）はＰＣＲプライマーを用いて生成されたニプライマー全部 の位置は図８Ｂに示されている。

欠失分析の結果は表１６と図１Ｏに示されている。これらの結果は上記の合成ペ プチドのデーターと組合わせて、キャプシドプロティン（これはＨＣＶポリプロ ティンのＮ−末端から成る）は２個の優勢な免疫反応性領域をもっことを示唆し ている。これら免疫反応性領域の両方共、診断抗原としてを用である。第１の３ ５アミノ酸から成る領域はエピトープのひとつに広がり、残１＆３４−９０に広 がる領域は他の強い免疫反応性の領域を含む。

まとめると、ＨＣＶポリプロティンのＮ−末端を含むｐＧＥＸクローンの全部お よび３４．９０．１２０または１５０残基は、ＨＣＶ陽性血清によって有効に認 められる大量の融合プロティンを生成した。アミノ酸基！３４−９０を含むＰＣ Ｂ挿入部の発現はまた強い免疫反応性があり、一方、残基９０−１２０または９ ０−１５０を符号化する挿入部は免疫反応性がなく、これらの領域がヒト血清に よって認められないことを示した。この結果は組換え抗原の生成に対して重要な 領域が残基１から９０までの間に含まれていることを示唆している。

ｐＧ［！ＸＣｌＮＣ４５０プロティンとｐＥ７３６０プロティンの分析は、これ らの抗原がウェスタンおよびＥＬＩＳＡフォーマントに含まれていると先に）（ ＣＶ陰性またはＨＣＶ不定として同定されたＨＣＶ陽性血清の同定が可能である ことを示した。従って、これらのエピトープが含まれていると、改善されたスク リーニングシステムを形成することができる（実施例２１）。

ＶＩＩｌ、訳且旦ヱ五里症生 他の特徴において、本発明は、本発明の組換え抗原に対して特異的な抗体を含む ９代表的には、抗体を調製するため、ウサギのようなホスト動物を精製した抗原 または融合プロティン抗原を用いて免疫にする。ホスト血清またはプラズマは適 当な時間間隔で収集され、この血清は抗原に対して特異的な抗体に対して試験さ れる。実施９１１５は５ｊ２６／４０９−１−１　（ａ）における４０９−１− １抗原およびベーターガラクトダーゼ／４０９−１−１　（ｃ−ａ）融合プロテ ィンに対して特異的であるウサギ血清抗体の生成を記載している。これらの技法 は本発明の他の抗原にも同様に応用できる。

免疫動物のガンマグロブリン部分またはＩｇＧ抗体は、例えば、飽和硫酸アンモ ニウムまたは［１ＥＡＥセフアデツクス、またはポリクロナール抗体を生成する ために当業者に知られている他の技法を使用して得ることができる。

また代わりに、精製抗原または融合抗原プロティンを使用してモノクロナール抗 体を生成する。ここで、免疫動物からの膵臓またはリンパ球を除去し、不死化ま たは使用して当業者に良く知られている方法でハイブリドーマを調整する。ヒト −ヒトハイブリドーマを生成するため、ヒトのリンパ球ドナーを遺灰する。ＨＣ えば血液中の抗ウイルス性抗体の存在によって示された）は、適当なリンパ球ド ナーとして役立つことができる。リンパ球は末梢血液試料から単離することがで き、またはドナーが牌切除術を行っている場合には牌ｌＩ細胞を使用することが できる。エプスタイン・バール・ウィルス（Ｅ　Ｂ　Ｖ）を使用してヒトリンパ 球を不死化し、またはヒト融合パートナ−を使用してヒト−ヒトハイブリドーマ を生成することができる。ペプチドとの一次イン・ヴイトロ免疫化もまたヒトモ ノクロナール抗体の生成に用いることができる。　不死化細胞によって分泌され た抗体はスクリーニングされ、所望の特異性の抗体を分泌するクローンを、例え ば、実施例１５に記載したウェスタンプロット法を用いて決定する。

ｒｘ、１盈 Ａ０診断方法およびキット 本発明の方法によって得られた抗原はＨＣＶ感染血清に存、在する抗ＨＣＶ抗体 に対する診断薬として使用するために有利である；特に４０９−１−Ｈ抗原４０ ９−１−Ｈａｂｃ）、４０９−１−１（ｃ−ａ））　、および関連する抗原（表 ９参照）；クローン３ε抗原；およびクローン４０抗原およびキャプシド抗原、 上記のように、多くの抗原は、広範囲のＰＴ−ＮＡＮＢＨ感染血清、特に急性感 染血清と免疫反応する既知のＨＣＶ抗原試薬５−１−１およびＣ−１００よりも 有利である。これは特に上記セフシランＶｌｌに記載したように、ＨＣＶコアプ ロティン抗原と４０９−１−１抗原との組合せから真実である。抗原４０９−１ −１（ｃ−ａ）およびＣａｐ４５０はＥＬＩＳＡ試験キットに組込み、アボット およびオルソによって生成されたＨＣＶ試験キットに対して試験した０本発明の 抗原はアボットおよびオルソの試験キットに匹敵するかまたはそれよりも良く、 高い程度の特異性をもつ一層多くのＨＣＶ＋試料を矛盾なく同定する。

好適な診断構成のひとつでは、本発明の方法によって得られた表面結合ＨＣＶ抗 原（単数または複数）、例えば４０９−１−１（ｃ−ａ）抗原およびＣａｐ４５ ０抗原を有する固相試薬と試験血清を反応させる。

試薬に抗ＨＣＶ抗体を結合し、洗浄によって結合していない血清化合物を除去し た後、試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体に結合した抗 −ＰＴ−ＮＡＮＢＨの量に比例してレポーターを試薬に結合する。再び試薬を洗 浄して結合していない４１１識抗体を除去し、試薬と結合したレポーターの量を 測定する。−級には、レポーターは適当な蛍光または比色定量基質の存在で固相 をインキュベートして検出する酵素である。

上記アッセイにおける固体表面試薬はプロティン物質を固体支持体物質、例えば ポリマービーズ、計深棒、９６ウエルプレートまたはフィルター物質に結合する 既知の技法によって調整される。

これらの結合法は一般に支持体へのプロティンの非特異的吸着または、代表的に は遊離アミノ基を介して、活性化カルボキシル、ヒドロキシル、またはアルデヒ ド基のような、固体支持体上で化学的に反応する基にプロティンを共有結合する ことを含む。

均質アッセイとして知られている第２の診断構成では、固体支持体に結合する抗 体は媒体中に直接検出することができる反応媒体において若干の変化を生じる。

令名に提案された均質アッセイの既知の一般的なタイプは、（ａ）抗原に結合す る抗体が報告された移動度における変化（スピンスピリットピークの広がり）に よって検出されるスピン−標識レポーター、（ｂ）結合が蛍光収率の変化によっ て検出される蛍光レポーター、（Ｃ）抗体結合が酵素／基質相互作用に影響する 酵素レポーター、および（ｄ）結合がリポソーム溶菌および被包性レポーターの 放出を導くリポソーム結合リポータ−を含む０本発明のプロティン抗原へのこれ らの方法の適合は、均質なアッセイ試薬を調製するための従来の方法に従う。

上記各アッセイにおいて、アッセイ法は各試験からの血清をプロティン抗原と反 応させ、結合した抗体の存在に対して抗原を試験することを含む。この試験は標 識された抗ヒト抗体を試験される抗体、ＩｇＭ（急性期）またはＩｇＧ（回復期 または慢性期）に結合し、最初の方法のように、固体支持体に結合したレポータ ーの量を測定することを含み、または第２の方法のように、均質アッセイ試薬に 結合する抗体の効果を観察することを含むことができる。

また本発明を形成する部分は前記アッセイ法を行うためのアッセイシステムまた はキットである。一般にキットは表面結合組換えＨＣＶ抗原（例えば、上記の４ ０９−１−１抗原等）を有する支持体、および表面結合抗ＰＴ−ＮＡＮＢＨ抗原 抗体を検出するためのレポーター標識抗ヒト抗体を含む。

上記のセクションＩＩＩで述べたように、結合フラグメントライブラリーの幾つ かと結合したペプチド抗原はチンパンジーからの急性ＮＡＮＢＨ血清と免疫反応 性であり、これはペプチドがヒト血清中の急性ＮＡＮＢＩＩ感染を検出するため に有用であることを示している。特に結合フラグメントライブラリーによって生 成した１個以上のペプチド抗原、Ｆ＊／Ｒｅ（慢性血清と反応へＦ　ｚ　Ｒ−１ Ｆ　ｈ　Ｂ　ｒ　ｚ、Ｆ＋ｚＲｔ、Ｆ、Ｒ＠またはＦ、Ｒ＊（これらは実施例１ １に示されており、急性チンパンジー血清と免疫反応する１個以上のペプチド抗 原を生成する）は、４０９−１−１抗原と結合することができ、高い割合の慢性 と急性の両方のヒ）　ＮＡＮＢＩ（血清試料と免疫反応することができる診断組 成物を提供する。さらに上記セクションｖｒＩに記載したように本発明のＨＣＶ キャプシドプロティン抗原の含有は特別の水準の感度を与える。

第３の診断構成は上記セクションＶｌで記載したＨＣＶ特異的抗原を検出できる 抗ＨＣＶ抗体の使用を含む。ＨＣＶ抗原は、例えば、候補の血清試料中に存在す るＨＣＶ抗原がＨＣＶ特異的モノクロナール抗体と反応する抗原捕獲アッセイを 用いて検出することができる。モノクロナール抗体は固体基質に結合し、次いで 抗原を第２の異なる標識を付けた抗ＨＣＶ抗体によって検出する二ＨＣＶ特異的 な抗原に対して向けられている本発明のモノクロナール抗体は特にこの診断法に 通している。　。

Ｂ、ペプチドワクチン 本発明の方法によって同定されるＨＣＶ抗原、例えば４０９−１−１（Ｃ−ａ） およびＨＣＶコアプロティン抗原はＨＣＶワクチンに使用するため配合すること ができる。ワクチンは標準方法によって、例えば、水、生理食塩水、緩衝塩水、 完全または不完全アジュバント等中に適当に希釈して配合することができる。免 疫原は抗体誘導のための標準技法を用いて、例えば不活化または弱毒ウィルス粒 子または抗原を含む生理的に適合性の殺菌溶液を皮下注射して投与される。ウィ ルス粒子の免疫応答生成量は代表的にはワクチン注射に代表的には１ミリリツト ル以下の容量で投与される。

ワクチン組成物の特定例は、製薬学的に容認できるアジュバント、組換え４０９ −１−１　（ｃ−ａ）ペプチドに含む。ワクチンは抗ＨＣＶ抗体のかなりの滴定 量が血清中に検出されるまで定期的に間隔をおいて投与される。この種のワクチ ンはまた本発明のＨＣＶ抗原の組合せから成ることができる。

ジおよび他のエフェクター細胞によって認められるので、抗ＨＣＶ免疫応答を高 める手段として使用することができる。抗体は抗体の他の治療投与の為に使用さ れるもとに似た分量で投与することができる。例えば、混合したガンマグロブリ ンは、細胞にウィルスが入らないように狂犬病、はしかおよびＢ型肝炎のような 他のウィルス病の初期の潜伏期に０．０２〜０．１ｍｌ／Ｉｂ体重で投与する。

従って、例えば、４０９−１−（ｃ−ａ）抗原と反応する抗体は単独で他の抗ウ ィルス剤と“カクテル”しであるいはＰＴ−ＮＡＮＢＨウィルスで感染したホス トに別の抗ウィルス剤を組合わせて受動的に投与し、抗つィル薬の免疫応答およ び／または有効性を高めることができる。

次の実施例は本発明の種々の特徴を説明するものであるが、これらに制限される ものではない。

林料 Ｅ、　Ｃａ１ｆ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウフラグメント）はべ−リン ガ−・マンハイム・バイオケミカルス（ＩＮ、インディアナポリス）から入手し た。　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよびＴ４　ＤＮＡポリメラーゼはニューイングラ ンド・バイオラプス（ＭＡ、ベイバリイ）から入手した：ニトロセルロースフィ ルターはシュリーヘル・アンド・シュエル（ＮＨ、キーン）から入手した。

合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーは市販品として入手できる自 動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて調整した。また、顧客がデザインした合 成オリゴヌクレオチドを、例えばシンセテインク・ジエネティックス（ＣＡ、サ ンジエゴ）から購入することができる。ｃＤＮＡ合成キットおよびランダムプラ イミングラベル化キットは、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル（ＩＮ 、インディアナポリス、ＢＭＢ）から入手した。

スＪＬＬＬ ＮＡＮＢ”　ｃＤＮＡライプーリーの Ａ、ＨＣＶを用いたチンパンジーの感染ファクターＶＩＩＩ濃縮物（ブラドリイ ）を用いて治療したヒトの患者に非Ａ非Ｂ型肝炎（ＰＴ−ＮＡＮＢＨ）を非経口 的に伝染させることが知られているファクターＶＩＩＩ製剤を用いて、チンパン ジー（＃７７１）に接種した。肝臓組織における感染後の超微細構造の変化は電 子顕微鏡によって認められ、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフアーゼ）の上昇 が感染したチンパンジーに観察された。これらの観察はＰＴ−ＮＡＮＢＨ感染と 一致した。

Ｂ、血清からのＲＮＡの単離 上記感染チンパンジー（＄７７１）および４人のヒ）　ＰＴ−ＮＡＮＢＨ６床Ｒ （ＥＧＭ、ＢＶ、　ＣＣおよび−Ｅｌ（）から血清を収集した。稀釈していない 血清の１０ミリリツトルを３０Ｋにて３時間、５Ｗ４０ローター中で４℃にて遠 心分離してベレット状にした。フエラミスコらの熱フェノール方法を次に示すよ うに改変して得られた各血清ペレットから１２ＮＡを抽出した。簡単に述べると 、各個別の血清試料に対して、せた０等量の６０℃のフェノールを添加して１５ 分間６０℃にて随時の渦巻混合を行いインキニーベートした。この混合物を１． ５ｍｌのマイクロフユージチューブに移し、２分間室温でテーブルトップマイク ロフユージをスピンさせた。水相を新しいマイクロフユージチューブに移した。

水相に、５０μｌの３　Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　、ｐＨ・５．２および２容量の１００ ％エタノールを添加した。この溶液を一７０℃にて約１０分間保持し、次いでマ イクロフユージ中で４℃にて１０分間スピンしたして、得られたペレットを１０ ０μｌの段面ガラス蒸留水に再懸濁した。この１０μｌのＮａ０Ａｃ溶液ｐＨ＝ ５．２に、２容量の１００％エタノールを添加した。この溶液を一７０℃にて少 なくとも１０分間保持した。　ＲＮＡベレフトをマイクロフユージ中で１２，０ ＯＯＸ　ｇにて１５分間５℃で遠心分離して回収したシ、ペレントを７０％エタ ノール中で洗浄し真空下に乾燥させた。

Ｃ，ｃＤＮＡの合成 （ｉ）第１鎖合成 ｃＤＮＡ分子の合成を次のようにして行った。上述のＩＩＮＡ製品を各々、２６ μｌ殺菌ガラス蒸留水（ジエチルピロカーボネートで処理した、マニアチスら） 、５μＩのＩＯＸ反応緩衝液（０，５ＭのトリスＨＣＩ、　ｐＨ・８．５．０． ４Ｍ　ＭＣ１，０，１ＭのＭｇＣｈ；　４ｍＭのＤＴＴ）　、１０μＩのヌクレ オチド溶液（ｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰ、それぞれ５ ＭＭの濃度）、５μｌのランダムプライマー、０．２５７７１　ノ”Ｐ−ｄＣＴ Ｐ、　２μＩのＡＭＶ　リバーストランスクリブターゼ、および２μ夏のＲＮＡ ５ＩＩＩＩ　（プロメガ）を全反応量５０μｍに再懸濁させた。この混合物を１ 時間４２℃にてインキニーベートした。

（ｉｉ）第２鎖ｃＤＮＡ合成 第１Ｍ合成反応混合物に次の成分を添加した＝５５μｌの２×第２９合成緩衝液 （５０ｍＭ（７）　）　！Ｊ　スＨＣｌ５ｐ１ｈ１．Ｏ；　６０＋＋＋ＭＩ７） ＫＣＩ）　ｉ　２　Ｉ　１のＲＮａｓｅＨ；　５μｌのＤＡＭポリメラーゼｆ、 および２μｍの上記ヌクレオチド溶液０及応は１時間１２℃にてインキユベート し、次いで１時間室温でインキユベートした０反応混合物を等量の１：１フエノ ール／クロロホルムで抽出し、次に２４：１クロロホルム／イソアミルアルコー ルを用いて抽出した。各反応混合物に１μｌの１０ｍｇ／　ｍｌ　ｔＲＮＡをキ ャリヤーとして添加した。ｃＤＮＡは２容量の１００％エタノールを添加して一 ７０℃にて１５分間冷却して沈澱させた。　ｃＤＮＡを遠心分離によって収集し 、ペレットを７０％エタノールで洗浄し真空下に乾燥させた。

（ｉｉｉ）クローニング用二重鎖ｃＤＮＡの調製ベクター適合性末端を与えるた め、二重ＭｃＤＮＡｍ製物の各々を次の方法でＥｃｏＲＩ　リンカ−と末端結合 させた。

ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラーゼを用いて次の条件下に処理した：　ｃＤＮＡＤ ＮＡペレットμｍ　１×メチラーゼ緩衝液（５Ｏ＊ＭのトリスＨＣＩ　、　ｐＨ −７，５；　１　＋ｌｌＨのＨＤＴＡ　；　５８ＭのＤＴＴ）、２μｍの０．１ ｍＭ　Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡ？Ｉ）および２μｍのＥｃｏＲＩメチ ラーゼにニーイングランド・バイオラプス）に再懸濁した。反応は３０分間で３ ７℃でインキニーベートした。　ＴＥ１１１衝液（１０ｍＭのトリス）ＩＣＩ　 、、ｐ）Ｉ＝７．５；　１ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐ）Ｉ−８，０）を添加して晟 終容量８０μｍとした０反応混合物を等量のフェノール／クロロホルム（１：　 １）を用いて、次いで等量のクロロホルム／イソアミアルコール（２４：１）を 用いて抽出した。　ｃＤＮＡは２容量のエタノールを用いて沈澱させた。

リンカ−（マニアチスら、１９８２）の添加に対して平滑末端の数を最大にする ため、次にｃＤＮＡをＤＮＡＮＡ４５ペ−パーレノウフラグメントで処理した。

ペレットのｃＤＮＡを１１．５μｍの蒸留水に再懸濁させた０次の成分を再Ｍｆ ｉｃＤＮａに添加した＝４μｌの５ＸＮＴＢ（ＩＯＸＮＴＢ貯藏溶液：　０．５ ＭのトリスＣ１ｐＨ−７，２；　０．ＩＭのＭｇ５Ｏ＊；　ＩＩＩＭのジチオト レイトール（０↑Ｔ）　；　５００μｇ／曽１のウシ胎児血清アルブミン（ＢＳ Ａ））　；　３μｍのＯ，Ｉ？Ｉの？ＩｇＣＩｇ、１．５　μｍのｌ０ＧＡＴＣ （各ヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ、およびＣを１０■Ｈ含有する溶液）、および１μ ｍのフレノウ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス）９反応混合物を 室温３０分間インキュベートした６反応混合物を上述のようにフェノール／クロ ロホルムおよびクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、次いで２容量の エタノールで沈澱させた。

ｃＤＮＡＤＮＡベレット、ｕｌのＢｙ水に再懸濁させた。再懸濁したリンカ−に 次の成分を添加した５μＩのＥｃｏＲＩホスホリル化リンカ−にニーイングラン ド・バイオラプス）、２μｍのＩＯＸ連結緩衝液（０，６６ＭのトリスＣ１ｐＨ ＝７．６．５０ｍＭのＭｇｃｈ　、５０＋ｗＭのＤＴＴ、１軸ＨのＡＴＢ）およ び１μｌのτ４　［ＩＮＡリガーゼ、反応は工４℃で一晩中インキユベートした ０次の朝、反応は６７℃にて３分間インキュベートし、リガーゼを不活性化して 、次に瞬間的に冷却して行った。連結反応混合物に２５μｍのＩＯＸ高塩高銀制 限消化緩衝液ニアチスら）および２．５μｌのＥｃｏＲＥ酵素を添加し、混合物 を少なくとも６時間ないし一晩中、３７℃でインキユベートした。過剰のリンカ −を除去するため、消化混合を１，２％のアガロースゲルに充填し、反応成分を 電気泳動によって大きさにより分別した。大きさにより分別した０、３〜１．３ ｋｂおよび１．３〜７ｋｂの範囲をＮＡ４５ペーパー（シュライヘルおよびシュ エル）に電気溶出させた。溶出したｃＤＮＡが結合したＮＡ４５ペーパーを０． ５ｍｌの溶出溶液（５Ｏ＊Ｍアルギニン、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，ｐＬ９．０）を含 む１．５霧１　のミクロフユージチューブに置いた。次にチューブを６７℃にて 約１時間おいてｃＤＮＡをペーパーから溶液に溶出させた０次に溶液をフェノー ル／クロロホルム、クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、２容量のエ タノールで沈澱させた。得られたｃＤＮＡペレットを２０μｌのｎｃｐＨ・７． ５）に再懸濁させた。

（ｉｖ）　ｃＤＮＡのラムダベクターのクローニングｃＤＮ＾の構築に試用した リンカ−は、ラムダｇｔｌｏおよびｇｔｌｌベクターに（プロメガ、マジソン、 罰）に増幅ｃＤＮＡを直接挿入させるＥｃｏＲＩ部位を含んでいた。ラムダベク ターを製造業者（プロメガ）から購入したが、これは既にＥｃｏＲＩで消化し、 バクテリア性アルカリホスファターゼを用いて処理し、５゛ホスフエートを除去 して、ベクターの自己連結を防いだ。

ＥｃｏＲＩ　リンカ−ｃＤＮＡの調製はラムダｇｔｌＯおよびｇｉｌｌの両方（ プロメガ）に連結させた。連結反応の条件は次のようであった：１μｌのベクタ ーＤＮＡ　（プロメガ、０．５ｍｇ／ｍｌ）　；　０．５または３μｍの挿入物 ｃＤＮＡ；　０．５μｌの１０×連結緩衝液（０，５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ −７，８；　０．ＩＭのＭｇＣＩｔ；　０．２ＭのＤＴＴ　；　ｌ　Ｏ＋＊Ｍの ＡＴＰ；０．５ｇ／ｓｌ　のＢＳＡ）、０．５　μｍのＴ４　ＤＮＡリガーゼに ューイングランド・バイオラプス）および最終反応容量が５μＩになる蒸留水。

連結反応チューブを１４℃にて一晩中（１２〜１８時間）放１した。

連結したｃＤＮＡを次の朝、ラムダＤＮＡパフキングシステム（ＧＩＧＡＰＡＫ 、ラジョラ、ストラタジーン、ＣＡ）を使用して標準方法によって包装し、次に 種々の稀釈物で培養し、ライブラリーのタイターおよび組換え頻度を決定した。

標準のＸ−ｇａｌ青／白アンセイを用いてラムダｇｔｌｌライブラリーをスクリ ーニングした（ミラー；マニアチスら）、＆ｌＩ換えクローンによってプラク形 成のみが可能であるＥ、ｃｏｌｔ　ＨＧ４１５　（ハワード・ゲルセンフェルト からのもの、スタッフォード・オブ・メディシン、病理学部門）培養バクテリア を、ラムダｇｔｌｏライブラリーを培養するために使用した。標準種、Ｅ、ｃｏ ！ｉ　Ｃ６００ｈＦはＥ、ｃｏｌｉ　ＨＧ４１５の代わりとして使用することが できる。

大旌班主 ＰＴ−ＮＡＮＢＨの　のためのｃＤＮＡ−イブ−ｆ−のスクリーニング実施例Ｉ で生成した５個のラムダｇｔｌｌライブラリーを免疫スクリーニングによってウ ィルス抗原を符号化した特異的ＨＣＶに対してスクリーニングした。ファージを ニジエリシア・コリ・バクテリア培養菌種Ｅ、ｃｏｌｉ　ＫＭ３９２　（ケビン ・ムアー、ＤＮａχ、パロ・アルド、ＣＡ）を用いるプラーク形成のために培養 した。代わりに、って発現された融合プロティンは次の超厚からの血清抗体（ヤ ングら）を用いてスクリーニングした：チンパンジー１７７１および種＊　１７ ）　ｔ＝　＋−ＰＴ−ＮＡＮＢ）ｌ血清（ＥＧＭ、ＢＶ、　ＷＥＨおよびＡＧを 含む）。

ラムダｇｔｌｌライブラリー（実施例１）から、約１１１個の独立したクローン が少なくとも１個のチンパンジーまたはヒトのＰＴ−ＮＡＮ８Ｆ＋血清との陽性 の免疫反応を与えた。３個のファージクローンはプラーク精製され、組換えファ ージはＤＮＡ精製に対して成長した（マニアチスら）。

スｍ クローンの゛ツムバイブ１−トノ 実施例２で得られた１１１個のプラーク精製組換えファージのうち、９３個を単 離しくマニアチスら）、そして製造者の指示によりＥｃｏＲＩを用いて消化させ た（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリイス、ガイテルスブルグＭＯ）　、約１． ０マイクログラムの各消化ファージＤＮＡ試料をＴＡＢ　（０，０４門〇トリス アセテート、Ｏ，０ＯＩＨのＥＤＴＡ）を用いて調製した１、０％アガロースゲ ルの試料ウェルに装填した。

次にＤＮＡ試料を電器泳動で分離した。　ＩＩＮＡバンドを臭化エチジウム染色 （マニアチスら）によって明視化した。挿入物はＮ＾４５を用いる電気溶出によ って精製した９３個のクローン各々に対し明らかに同定され、次に二７クトラン スレーシジン（マニアチスら）によって放射活性標識した。

ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）　ＤＮＡをＨｉｎｄｌｌｒおよびＥｃｏＲＩを 用いて制＠消化し、０．７％アガロースゲルに装填し、（１０ｕ　ｇのＤＮＡを ル−ンに対して装填したことを除き上記と同様に）、そしてフラグメントを電気 泳動で分離した。アガロースゲル中のＤＮＡフラグメントはニトロセルロースフ ィルター（サザン）に移し、ゲノムＤＮＡを上記の二ンクトランスレーションラ ムダｇｔｌｌ挿入物を用いてプローブした。

濾液を洗浄しくサザン；マニアチスら）、ＸｖＡフィルムに感光させた。９３ラ ムダクローンの挿入物のうち５３がヒトＰＢＬ　ＤＮＡに陽性ハイブリッド形成 反応を示した。ＰＡＬ　ＤＮＡと明らかにハイブリッドしなかった残りの挿入物 のうち、１１個の挿入物は、また実施例２から明らかに免疫陽性であったチンパ ンジー１７７１クローンから誘導された。これら１１個のクローンのうち、２個 のクローンは表１に示した免疫反応特性を有していた。チンパンジー１７７１お よびヒトＡｇ、　ＢＶおよび−ＥＨは慢性ＰＴ−ＮＡＮＢＨ血清試料であり、Ｓ ＫＦは正常ヒト血清試料であった。

１工 ＡＧ　＋　− ＢＶ　＋　− クローン４０（元のクローンスクリーニング名称３０４−１２−１）は明らかに 外因性であり、すなわち、正常ヒトＰＢＬ　ＤＮＡに対して繰り返されたハイブ リッド形成試験によってｉ認されたように、正常ヒ）　ＤＮＡから誘導されず、 クローン３６（元のクローンスクリーニング名称３０３〜１−４）と名付けられ た第２のクローンは、外因性であるばかりか、多重ＰＴ−ＮＡＮＢＨ抗血清と反 応する。

叉立斑↓ Ｌ旦二ヱ■■且犬足 ＤＮＡ配列決定は実施例３に記載したようにクローン３６および４０で行った。

挿入物の５”および３°末端でフランキングラムダ配列に一致する市販品として 入手できる配列決定プライマーにューイングランド・バイオラプス）を初めに配 列決定のために使用した。

配列決定として進行プライマーを新しく発見された配列に対応するように構築し た０合成オリゴヌクレオチドブライマーは、市販品として入手できる自動化オリ ゴヌクレオチド合成器を用いて調製した。代わりに、顧客が設計した合成オリゴ ヌクレオチドを、例えばジンセチッチク・ジェネティクス（サンジエゴ、ＣＡ） から購入することができる。

ＤＮＡ配列はクローン４０　（ＳＥＱ　ＩＤＮＱ：１として示され、また図３に 示されている）の完全挿入物に対して決定した：この配列はＨＣｖゲノム（付録 ）のヌクレオチド６５１６ないし７０７０に相当する。

続いて、クローン４４および４５に存在する挿入物（１１個のクローンのうち２ 個の他のクローンは実施例３で同定された）は、クローン４０挿入物に対してク ロスハイブリッドすることが見出された。

クローン４４および４５の部分配列決定は、これら２個のクローンから得られた 配列がクローン４０の配列に匹敵することを示した。クローン３６挿入物の部分 配列を決定し、ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３として示す；完全な配列はＳＥＱ　Ｉｎ 　ＮＯ：５として示され、これも図４に示しである。クローン３６の配列は付録 に示したヌクレオチド５０１０ないし６５１５に相当する。

１血舅工 立左ｌ工印胚婁己り辷μｍ１盃ブｌユニ」シ肇ソ辷ニョ乙久実施例１に生成した ラムダｇｔｌｏにおけるｃＤＮＡライブラリーはクローン４０挿入物に一致する 配列の存在に対してスクリーニングした。

ラムダｇｔｌｏライブラリーを約１０４プラーク／プレートの密度で培養し、プ ラークリフトはマニアチスらに従って調製した。フィルターはプラークリフトを 行った親プレートを用いてフィルターを配列させるように墨汁を用いて指示した 。バクテリアとファージ粒子を溶解し、ニトロセルロースフィルターを上記のよ うに処理し焼いた（マニアチスら）、予備ハイブリッド形成溶液はフィルター当 り、次のものから成る：　５．４ｍｌの予備ハイブリッド形成緩衝液（５ｆ）＋ １のＩＭのトリスｆｆｃＩ、　ｐＦＩ・７．５；　２　ｔｓＩの０．５？ｌのＥ ＤＴＡ、ｐＨ−８，０；　５０ｍ１の１０％ＳＯ５；　１５０ｍ１の２０ＸＳＳ Ｃ（マニアチスら）；および２３８腸Ｉのガラス蒸留水）；　６．Ｏｍｌのホル ムアミド；　０−４ｔａＩノ５０×デンハルト溶液（５ｇのＦｒｃｏｌ、Ｌ、　 ：　５　ｇのポリビニルピロリドン；５ｇのウシ血清アルブミン；ガラス蒸留水 で全量５００ｍ１にした）；そして０．２層１の一本鎖す−モン血清りＮＡ　（ １０ｍｇ／膳１）＃各フィルターをプラスチックバッグに入れて予備ハイブリッ ド形成溶液を添加した。バッグを密封し、３７℃にて内容物を断続混合して一晩 中インキュベートした。

クローン４０ラムダＤＮＡを単離しくマニアチスら）　、ＥｃｏＲＩを用いて消 化した。得られたフラグメントはアガロースゲルで分別し、臭化エチジウム染色 （マニアチスら）によって明視化した。クローン４０挿入物に対するＤＮＡフラ グメントの約５００塩基対はＮ＾４５への電気溶出によってアガロースから単離 された。精製したフラグメントの水性懸濁は一回は１：ｌのフェノール／クロロ ホルム溶液を用いて、−回は２４：１のクロロホルム／イソアミルアルコール溶 液を用いて抽出した９次に、ＤＮＡはエタノールを用いて沈澱させて殺薯水に再 懸濁させた。

クローン４０挿入物を二フクトランスレーションによって放射活性標識を行い、 ラムダｇｔｌＯプラクリフトフィルターをプローブするために使用した。予備ハ イプリント形成溶液をフィルターから除去した。各フィルターは次の条件下にプ ローブを用いてハイブリッド形成した：　５．Ｏｍｌのハイブリッド形成緩衝液 （５ｇｍｌのＩＭトリスＫＣＩ、　ｐＨ−７，５；　０．２＋ｗｌの０．５？ｌ のＥＤＴＡ、　ｐＨ＝８．０　；　５．Ｏｍｌ　の１０％ＳＯ５；　１４．９ｍ ｌの２０　Ｘ　ＳＳＣ（７ニアチスら）；１０ｇのデキストランサルフェート； およびガラス蒸留水を全量５０ｍ１まで）　；　５．Ｏ＋ｓｌのホルムアミド； 　０．４ｍｌの５０Ｘデンハーツの溶液（５ｇのＦＩＣＯＬｌ、；５ｇのポリビ ニルピロリドン；５ｇのウシ血清アルブミン；ガラス蒸留水を用いて５００１　 の全量にした）；および０．２ｍｌ　の−末鎖サーモン血清ＤＮＡ　（１０ｍｇ ／ｓｌ）、このハイブリッド形成ミックスに５０〜２５０μｍの変性プローブ（ ５〜１０分間沸騰させて氷上で急速冷却した）を添加し、フィルター当り約１０ ”ｃｐｍの標識プローブが得られた。標識プローブを含有するハイブリッド形成 ミックスを次にフィルターを含むプラスチックバッグに添加した。バッグを再密 封し内容物を断続混合しながら３７℃の水浴で一晩中、ガラスプレート下に置い た。

次の日、ハイブリッド形成溶液を除去し、室温にて、０．５％ＳＤＳを含む２　 Ｘ　ＳＳＣ（マニアチスら）中で、各５分間、３回フィルターを洗浄した０次に フィルターを１時間、０．５％ＳＤＳを含む２ｘｓｓｃ中で５０℃にて洗浄した ０次にフィルターを１５〜６０分間、０゜１％ＳＯ５を含むＱ、１ｘｓｓｃ中で 、５０℃にて洗浄し、最後に２ＸＳＳＣで１５分間、２〜３×室温にて洗浄した 。洗浄したフィルターを乾燥し、次いで陽性プラークの検出用Ｘ線フィルムに感 光させた。

ラムダｇｔｌｏのライブラリーからの約２４プラークをハイブリッド形成スクリ ーニングによって陽性に試験した約２００個のプラークからプラーク精製した（ 表２）。

ｌ主 ライブラリー　ｃＤＮＡ起原　対し陽性／プレートＥＧＭ　ヒト　≧５０ 大土斑立 クローン４０　に　西　な−ム　ｔｌｏ　ｃＤＮＡ−イブ−リークローンの クローン４０挿入物に相同関係をもつ実施例５に同定されたクローンを標準制限 分析によって分析し、挿入物の大きさを決定した。

異なるｃＤＮＡ起原に対してプローブとしてクローン４０挿入物を用いるプレー トに対し陽性ハイブリッド形成信号の元の頻度は表２の最後のカラムに示されて いる。これらの陽性信号がラムダｇｔｌＯライブラリー中の異なるｃＤＮＡ起原 に対して異なる頻度で生じたことは、ハイブリッド形成信号が、ｃＤＮＡ合成ま たはクローニングの間に導入された普通の汚染よりはむしろ血清源から生じたこ とが示唆される。

クローン４０挿入物を用いてハイブリッド形成によって同定されたＥＧＰ発生ｃ ＤＮＡからのクローン（１０８−２−５）のひとつは、約３．７ｋｂの挿入物を 有し、さらに分析のために選択された。挿入物はクローンのＥｃｏＲＩ消化、電 気泳動分別、および電気溶出（実施例５）によって単離された。挿入物を部分消 化（マニアチスら）される条件下にＤＮａａｅ　Ｉで処理してランダムフラグメ ントを生成した。

得られたフラグメントは発現用ラムダｇｔｌｌベクターに挿入した。

次にラムダｇｔｌｌクローンはヒト（ＢＶおよび正常）およびチンパンジー１１ ７７１血清を用いて免疫スクリーニングした（実施例２）。

１２個の陽性クローンをヒトおよびチンパンジー血清を用いて第１ラウンド免疫 スクリーニングによって同定した。１２個のクローンのうち７個をプラーク精製 し、チンパンジー血清（ｓ７７１）を用いて再スクリーニングした。挿入物ＤＮ Ａの部分ＤＮＡ配列は、３２８−１６−１および３２Ｂ−１６−２と命名した最 大の配列をもつ得られた２個のクローンに対して決定した。２個のクローンは本 質的にクローン４０と同一の配列をもっていた。

１隻勇工 ＨＣＶ　ｃＤＮフーグメントの゛ Ａ、　ｃＤＮＡフラグメントの調製 慢性ＰＴ−ＮＡＮＢＨのチンパンジーから得られたプラズマブールは、センター ズ・フォア・ディシーズ・コントロール（ＣＤＣ）（アトランタ、ＧＡ）から入 手した。直接ベレットにするかまたはＰＥＧ沈澱後、刊行物の方法（チ３ムチン スキイ）に従って、ｌ？ＮＡをグアニジニウム　チオシアネート−フェノール− クロロホルム抽出によってピリオンから抽出した。ベレットにしたＲＮＡをオリ ゴｄＴまたはランダムプライマーを用いるｃＤＮＡ合成、またはＫＣＶ配列特異 的プライマーおよび市販のｃＤＮＡキット（ベーリンガー・マンハイム）を用い るｃＤＮＡ合成のために使用した。

ひとつの方法では、第１［ｃＤＮＡの合成は、下記に示す配列を有する名称Ａ、 Ｂ、Ｃ１およびＤの４個のプライマーを添加して行われた。これらの配列は示さ れたＨＣＶゲノム碩域に相補的である。

Ａ　：　５’−ＧＣＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＧＧＧＣ−３’、塩基対３９ ４−４１３に相補的；Ｂ：５″−ｒ、ｃｃｃＧＴｃＡＴＧａｃＧＧ（＊ＴＣＧＧ −３’、塩基対２９６０−２９８０に相補的；Ｃ：　５’−ＣＧＡＧＧＡＧＣＴ ＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧ−３’、塩基対５２３９−５２５８に相補的；および Ｄ二５°−ＴＧＧＴＴＣＴＡＴＧＧＡＧＴＡＧＣＡＧＧＣＣＣＣＧ−３”、塩基 対７２５６−７２８に相補的。

第２ｆｆｌｃＤＮＡ合成はグブラーおよびホフマンの方法によって行った０反応 は市販のキットに示された標準ｃＤＮ八合へ法のもとに行われた。

Ｂ、ｃＤＮ＾フラグメントの増幅 上記のｃＤＮＡを平滑末端として次の配列をもつリンカ−／プライマーに連結し たニ リンカー／プライマー：５″−ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３ ”　Ａ−鎖３’−ＴＴ　ＣＣＴ　ＴＡＡ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＧＣＧ　ＡＧＣ−５ °　Ｂ　−饋ｃＤＮ＾およびリンカ−を０．３ないし０．６フイス単位の７４　 ［ＩＮＡリガーゼの存在で１：１００モル比にて混合した−　１．５＋ｗＭのＭ ｇＣ１ｔおよび５（］ｗＭのＫＣＩを含む１００．１の１０ｍＭトリス−ＣＩ緩 衝液、ｐＨ８，３（１１衝液Ａ）に、約ｌＸｌ０−’μｇのリンカ−末端ｃＤＮ Ａ、　ｄ（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３’）の配列を有す る２ｔｔＦ１のリンカ−／プライマーＡ　（ＡＩＪＩＩ）　、それぞれ２００μ ｈのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ　。

および２．５単位のサームス・アクアチフス豆抱」旦ユ虹旦旦旦）ＤＮＡポリメ ラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）を添加した０反応混合物を変性のため９４℃まで ３０秒間加熱し、ブライマーアニーリングのため５０℃まで３０秒間冷却させ、 次に７２℃まで０．５〜３分間加熱してＬｋポリメラーゼによってプライマーを 伸長させた。連続した加熱、冷却、およびポリメラーゼ反応を含む複製反応を、 パーキン・エルマー・センスＤＮＡ熱サイクラ−の補助器具を用いて、さらに２ ５回繰返した。これは、５ＩＳＰＡ　（配列独立単一プライマー増＠）増幅ＤＮ Ａフラグメントのプールになる。

スＪＪＬ影 プライマー　のフラグメントの− 実施例７からの増幅ｃＤＮＡフラグメントを１００μｍの緩衝液Ａ、１μｈの等 モル量の下記のプライマー対の１個、それぞれ２００μ片のｄＡＴＰ、　ｄＣＴ Ｐ、　ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、および２．５１１位のサームス・アクアチフ ス（Ｔｈｅｒ＊ｕｓ　ａ　ｕａｅｔｃｕｓ）　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｇポリ メラーゼ）を混合した。各プライマー対は二重ゲノムＤＮＡのオーバーランプ領 域Ｐ、の上流端にてコード鎖に同一である前進（上流）プライマーＦｉ、および 領域Ｐ、の下流端にてコードに相補的である逆プライマーＲ５を含む、プライマ ーのセントはそれぞれ約２００塩基対のオーバーランプ領域を明確にし、近接す るオーバーラツプするプライマー領域間（すなわち、Ｆ＋／Ｒｔペアの近接する ペア間）の間隔は約０．５〜１キロベースである。プライマーに対し相補的であ るＦＩＣＶの領域は以下に示される：Ｆ１．塩基対１８３−２０１；　Ｒ，、塩 基対３６１−３８０Ｆ１．、塩基対５７６−５９５．　Ｒ，。、塩基対８４１− ８６０Ｆ２．塩基対１０８０−１１００；　Ｒｔ　、塩基対１２５４−１２７３ Ｆ３．塩基対１９２９−１９４８；　Ｒ３、塩基対２０６７−２０８６Ｆ４ｒ塩 基対２７５４−２７３３；　Ｒａ＋塩基対２９２０−２９４０Ｆ３．塩基対３６ ０１−３６２０；　Ｒｓ　、塩基対３７４５−３７６４Ｆ！＋塩基対４３０１− ４３２０；　Ｒ６＋塩基対４４２３−４４４２ＦＩ！、塩基対４８４７　４８６ ５；　Ｒ１ｇ、塩基対４７１５−４７３４Ｆｆｆ＋塩基対５０４７　５０６６； 　Ｒｙ　、塩基対５２００−５２１６ＦＩ＋塩基対５８８５−５９０４；　Ｒ， 、塩基対６０２Ｂ　−６０４７Ｆ９．塩基対６９０２−６９２１；　Ｒ，、塩基 対７０５１−７０７０各Ｆ、／　Ｒｉプライマー対を用いて５ＩＳＰＡ増幅した ｃＤＮＡフラグメントのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅は上記で使用した条 件と似ている条件下に、約２５サイクルでｊテわれた。

上記からの増幅フラグメント混合物をＣ５９Ａアガロースで電気泳動によつて各 々分別し、ニトロセルロースフィルター（サザン）に移した。ニトロセルロース 結合フラグメントのハイブリッド形成は、各々内部配列オリゴヌクレオチドプロ ーブを用いて、各フラグメントが期待された配列を含むことを確認した。ハイブ リッド形成は、標準法に従って、ポリヌクレオチドキナーゼによって放射標識さ れた内部オリゴヌクレオチドを用いて行われた。

！崖±１ ムフーグメントのｉｌ＋ この実施例ではＨＣＶ配列の大きくオーバーラツプする結合フラグメントの調製 を記載する。実施例７からの５ＩＳＰＡ増幅ｃＤＮＡフラグメントを１００μｌ の緩衝液Ａ、以下に示したプライマー対の各々において前進および逆プライマー を１μＨの等モル量、各２００μＨのｄＡＴＰＳｄＣＴＰＳｄＧＴＰ、およびｄ ＴＴＰ、および２．５単位のサームス・アクアチフス（Ｔｈｅｒ＋ｗｕｓ　ａ　 ｕ■１ｃｕｓ）　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｇポリメラーゼ）を、実施例８のよ うに混合した。各プライマー対は前進プライマーＦ１および逆プライマーＲＪを 含み、Ｆ、はひとつのオーバーランプ領域Ｐ３に対し前進プライマーであり、Ｒ ５は近接するオーバーランプ領域の逆プライマーである。従って、各結合フラグ メントは２つの近接するオーバーランプ領域に広がる。プライマーの組は各々約 ０．５〜１キロベースの連結フラグメントを明確にする。プライマー対の配列は 実施例８に与えられる。

各プライマー対によって広がったＨＣＶ配列（付録）のオーバーラツプ連結フラ グメントは以下に与えられる：Ｆｌ／Ｒ１゜、塩基対１８３−８６０ Ｆ１゜／Ｒｔ、塩基対５７６−１２７３Ｆ、／Ｒｆｆ、塩基対１０８０−２０８ ６Ｆ　３／　Ｒｔ、塩基対１９２９−２９４０Ｆ＃／Ｒｓ、塩基対２７５４−３ ７６２ＦＳ／Ｒ１，塩基対３６０１−４４４２Ｆａ／Ｒ＋ｚ塩基対４３０１−４ ８６５Ｆ１□／Ｒ１，塩基対４７１５−５２１６Ｆｔ／Ｒａ、塩基対５０４７− ６０４７Ｆ、／Ｒ９，塩基対５８８５−７０７０各Ｆ、／　Ｒ，プライマー対を もつ５ＩＳＰＡ増幅ｃＤＮＡフラグメントの２つのプライマー増幅は上述の条件 と似ている条件下に、約２５サイクルで行われた。

上記からの増幅フラグメント混合物は１．２％アガロースのアガロース電気泳動 によって各々分別され、上記のように放射標識された内部オリゴヌクレオチドを 用いてハイブリッド形成のためにニトロセルロースフィルター（サザン）に転移 させた。この分析は各結合フラグメントが近接オーバーランプ領域から２つの末 端プライマー配列を含むことを確認した。各連結フラグメントに含まれる配列は 付録に示される。

１４１１則 クローン　ベブチドフーグメントのｉ Ａ、ＤＮＡフラグメント消化 実施例９からの結合フラグメント１０個の各々を、標準消化緩衝液（０，５Ｍの トリスＨＣＩ、　ｐＨ７，５；　１ｍｇ／−１のＢＳＡ；　１０ｍＭのＭｎＣＩ ｚン中に、約ＩＩ＋ｇ／ｍｌの濃度まで！Ａ１ｆｔさせて、ＤＮＡ５ｅＴを用い て室温にて種々の時間（１〜５分）で消化させた。これらの反応条件は先の較正 の検討から決定され、優先的に１００〜３００塩基対のフラグメントを生成する ために必要なインキュベージシンの時間を決定した。物質はエタノール沈澱の前 にフェノール／クロロホルムを用いて抽出された。

消化混合物中のフラグメントを平滑末端としてＥｃｏＲｒ　リンカ−を用いて連 結した。得られたフラグメントは、Ｐｈ１Ｘ１７４／Ｈａｅｌｌｌおよびラムダ ／旧ｎｄｌｌｌ　サイズマーカーを用い、１．２％のアガロースゲルノミ気泳動 （５〜１０ｖ）Ｃ１１）ニよッテ分析した。　１００〜３００ｂｐフラクシッン をＮＡ４５ストリツプ（シュライヘルおよびシュエル）に溶出させ、次に１．５ Ｉｌｌのマイクロチューブに溶出溶液（ＩＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのアルギニン 、ｐ１１９．０）を用いて入れて、６７℃で３０〜６０分間インキュベートした 。溶出したＤＮＡをフェニール／クロロホルムで抽出し、次に２容量のエタノー ルで沈澱させた。ペレフトを２０μｍ０ＴＦＪ衝液（０，０１ＭのトリスＭＣ１ ，ｐＨ７，５，０，００１ＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させた。

Ｂ、消化フラグメントのクローニング ラムダｇｔｌｌファージベクター（ヤングら）をプロメガ・バイオチク（マジソ ン、１ｌｌ）から入手した。このクローニングヘクターはベーターガラクトシタ ーゼ翻訳終止コドンから上流の部位５３塩基対をクローニングする唯一のＥｃｏ Ｒｌを有していた。パートＡの各結合フラグメントからの部位消化フラグメント は、０．５〜１．０μｇのＥｃｏＲＩ−裂開ラムダｇｔｌｌ、０．３〜３μｌの 上記大きさにしたフラグメント、０．５μｍの１０×結合緩衝液（上記）　、０ ．５μｌのＤＮＡリガーゼ（２００単位）、および５μｌの蒸留水を混合して、 ＥｃｏＲｌ　部位に導入した。混合物は一晩中１４℃にてインキュベートし、続 いて標準法（マニアチス、２５６〜２６８頁）に従って、イン・ビトロパフケー ジングをした。

パッケージされたファージは、ケビン・ムーア博士のＤＮＡ×（パロ・アルド、 ＣＡ）から入手したＥ、ｃｏｌｉ株ＫＭ３９２感染させるために使用した７代わ りに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ番号３７１９ ７）から入手できるＥ、ｃｏｌｉ株Ｙ１０９０を使用できる。上記の約１０’〜 ＩＯ’ｐｆｕのファージストックを用いて感染させたＸ？１３９２細胞のローン を１５０１のプレートに準備して５〜１６時間、３７℃にてインキュベートし、 転化させた。感染したバクテリアは標準のＸ−ｇａｌ基質プラークアッセイ法（ マニアチス）を用いてＸ−ｇａｌの存在でベータガラクトシダーゼ活性（透明プ ラーク）のロスをチェックした。

消化フラグメント挿入を含む単一ファージの同定は次のようにして確認した。透 明単一プラーク（単一ファジーの子孫を含む）をプレートから除き、抽出緩衝液 （マニアチス）に懸濁しファージＤＮＡを遊離した。ファージ抽出物を、ラムダ ｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ部位からのいずれかの方間に離れた約７０塩基対であるプ ライマーの存在で、上記ＤＮＡ増幅混合物に添加した。従って消化フラグメント 挿入物を含むファージは約１４０塩基対プラス挿入物の増幅消化フラグメントを 生成するだろう、ファージＤＮＡ増幅は上記のように２５サイクルの増幅で行わ れた。試験した各プラグからの反応物質を１．５％アーガロースで分別し、増幅 した消化フラグメントの太きさを試験した０組換えないファジーは１４０塩基対 バンドを与えたが、組換えファージは１４０塩基対プラス挿入物配列の大きさの バンドを与えた。この結果は下記の表３の２欄（ＲＥＣＦｒｅｇ）に示され、６ 個の連結フラグメントライブラリーは下記の表３の最初の欄に示した。　２４１ １の分母はプライマー増幅によってアッセイされたプラークの全数である０分子 はフラグメント挿入物を含む透明プラークの数である。従って、３／１５はアッ セイされた１５個の透明プラークの全数のうち３個のプラークがＰＣＲによって 陽性であったことを意味する。

ｌ」 ライブラリー’　Ｒ［ＩＣＦｒｅｇ！１°スクリーン”　ＰＡ／ＲＥＣ’Ｆ、Ｒ ３１２３／１５　２　０．３３ Ｆ２Ｒ，ｓｌ　７／１２　０　− Ｆ−Ｒｓ　１３　９／１０　１０　０．３７ＦｓＲｂ　１１５　１１／１２　３ ７　１．３５Ｆ？Ｒ＠　＄７　０／１２　１　− ＦＪ、１１０　３／１２　５８　７．７３１−指示された連結クローンの部分Ｄ Ｎａｓｅｌ消化によって構築されたライブラリー ２−挿入物フランキンゲラムダｇｔｌｌプライマーを用いてＰＣＲによって測定 された組換え頻度 ３−１．５　Ｘ１０フアージの慢性ヒトＰＴＪＪＡＩＪＢ）ｌ血清（１：１００ ）を用いた第１のスクリーニング ４−Ｐ＾／ＲＥＣは培養された組換えの実数当りの検出された陽性領域の数を示 す 各連結フラグメントに対して構築された消化フラグメントのライブラリーは、ヒ トＰＴ−ＮＡＮＢＩ（血清免疫反応するペプチドの発現に対してスクリーニング した。ファージ感染バクテリアのローンはニトロセルロースシートでかぶせてＰ Ｔ−ＮＡＮＢＨ組換えペプチドをプラークから濾紙に移した。プレートとフィル ターを、対応するプレートとフィルターにマツチするように指示した。

フィルターを６〜１２＃間後に除去し、ＴＢＳ　Ｍ新液（１０鰯ｊのトリス、ｐ Ｈ８，０，１５０ｍＭのＮａＣ１）で３回洗浄し、ＡＩＢ（１％ゼラチンを含む ＴＢＳ緩衝液）でブロックし、再びＴＢＳで洗浄し、抗血清（ＡＩＢで１　：　 １００まで稀釈、１２〜１５■ｌ／プレート）を用いて夜通しインキュベートし た。シートを２回ＴＢＳ中で洗浄し、次にアルカリ性ホスファターゼ共役抗ヒト ＩｇＧを用いてインキュベートして抗血清によって認識される抗原を含むフィル ター部位にてＮｍ抗体を結合させた。最終洗浄の後、フィルターを、５ａ＋１の アルカリ性ホスファターゼ緩衝液（１００ｍＭのトリス、９．５．１００ｍＭの ＮａＣ１，５ａｔＭのＭｇＣｈ）中の１６μｌのＢＣＩＰ　（４℃にて維持され た５（ｂ＋ｇ／謹１のストック溶液）を混合した３３μｌのＮＢＴ（４℃にて維 持された５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液）を含有する基質媒体中に展開させた０ 反応した基質は、抗血清によって認識されたように、抗原生成の地点で沈澱した 。

第１のスクリーンで抗原陽性反応（ｌｌｉｉ性領域ＰＡ）を示したプラークの全 数を表３の３欄に与える０表中の４欄はスクリーニングした（　Ｘ　１０３）組 換えファージの全数当りの陽性領域の頻度である。

従って、この最後の欄は、この特定の血清試料を用いる特定の連結フラグメント から発現した抗原の相対的免疫原性の測定値であス」１九Ｕ。

血清を用いてスクリーニングした。５匹のチンパンジーからの慢性および急性の チンパンジー血清をそれぞれセンターズ・フォア・ディシーズ・コントロールか ら人手した。

下の表４に示した連結フラグメントからの消化フラグメントライブラリーを、実 施例ＩＯに記述したスクリーニング方法を用いてって、確認された陽性領域の数 を示す１代表的には第１のスクリーン中、陽性領域の約９０〜９５パーセントが 、第２のスクリーニングによって陽性に試験された。括弧内の記載事項は第２の スクリーンで確認されなかった陽性の領域を示す。

プラリーにおいて１０以上の陽性を与える。これらのデータは特定のライブラリ ーにおいて組換頻度に対して集められているのではなく、従って、種々の連結フ ラグメントの比較免疫原性を反映しｌ土 Ｐ、Ｒ，！　（４００）　５　１０（２００）Ｆｌ、Ｒ，２１７（２００）　９ （２００）Ｆ、ＲＩ　Ｏ２０１０（１３０） ｐ、ｐ、！　純プラーク 急性フール簡チンパンジーのＣＤＣパネル慢性ブール−チンパンジーのＣＯＣパ ネル１豆■肥 ４０９−１−１−抗原に対する免疫スクリーニングＡ、プラーク免疫スクリーニ ング Ｆ、／Ｒ，連結フラグメントの第１スクリーンで同定された複数のれる消化ブラ グメントはＨＣＶゲノムに存在する塩基対とクローン４０９−１−１　（ａｂｃ ）に存在する塩基対の２つの組に相当する。参照を容易にするため、３つの領域 （ａ、ｂおよびＣ）を４０９−１−１（ａｂｃ）クローンにおいて命名された（ 下記および図５参照）、塩基対の量れ、共同所有の特許出願番号５０５，６１１ に記載され、＾ＴＣＣＮｏ、　４０８−ジはヒトＰＴ−ＮＡＮＢＩ（血清を用い 第１および第２のスクリーニングによってそれぞれ、上記のように同定、精製さ れた。

精製したｇｔｌｌ／４０９−１−１　（ｃ−ａ）およびｇｔｌｌ／Ｓ−１−１ク ローンは、各々、陰性ラムダｇｔｌｌファージと混合し、培養し、下の表５に示 したように、正常およびＮＡＮＢＨ感染のヒトおよびチンパンジーからの異なる ドナー血清を多数用いて免疫スクリーニングした。各プレートを複数の等しい領 域区画に分け、ニトロセルロース転写フーニングした。表５は、５−１−１およ び４０９−１−１　（ｃ−ａ）ペプチドによって各グループの血清に対して検出 された陽性の数を示し、ＥＬＩＳＡフォーマント中のＣ−１００テストと比較し た。

ｌ工 験した５個の血清のうちＮ個が陽性であることを意味する。

クチリアを感染させた。これらのバクテリアはアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクシランから入手した。バクテリア・ホストは温度誘導条件下（フニー） にベクターによって符号化されたベーターガラクシダーゼ／ペプチド抗原融合プ ロティンを発現させる。

感染したバクテリアを画線培養し、３２℃で一晩中またはコロニが出現するまで 生長させ、各コロニーをレプリカ平板培養し、３２℃と４２℃にて生長を試験し た。ファージゲノムの組込みを示す３２℃で生長したが４２℃では生長しなかっ たバクテリアコロニーを使用して、−晩飽和させたｌ■ＩのＮＺＹＤＴ　（マニ アチス）ブイヨンＡを接種し、バクテリア培養菌を使用して、代表的には１時間 の培養を必要とする約０．２ないし０．４の０．Ｄ、までエアレーシッンで培養 した、１０ｍ１の培養菌を接種した０次に培養菌を４３℃の水そう中で急速に４ ３℃まで上げて、１５分間振り動かしてラムダｇｔｌｌペプチド合成を誘導し、 さらに３７℃で１時間培養した。

細胞を遠心分離によってペレットにして、１ｍｌのベレット物質ヲ１００Ｉ！■ の溶菌緩衝液（５％のメルカプトエタノール、２．４％のＳＯＳおよび１０％の グリセロールを含む６２ｍＭのトリス、ｐＨ７，５）に再懸濁させた０等分に分 けて（約１５μｌ）直接ゲルに装填し５ｏｓ−ｐ＾ＧＨによって分別した。電気 泳動後、既知の方法（アウスベルら）に従い分別バンドを電気溶出によってニト ロセルロースフィルターに移した。

溶解物をＤＮａｓｅｌを用いて処理し、熔解物中の粘度が次第に失われていくこ とによって証明されるように、バクテリアＤＮＡを消化した。物質の一部をトリ トンＸ−１００ＴＮおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）を用いて、最終濃 度２％トリドア　Ｘ−１００”および０．５％ＳＯ５となるまで稀釈した。可溶 化しない物質を遠心分離によって除去し、上澄液をＳＤＳポリアクリルアミド電 気泳動（Ｓ０５−ＰＡＧＥ）によって分別した。関係するペプチド抗原を同定す るためにゲルの一部を着色し、相当する着色されなかったバンドをニトロセルロ ースフィルターに移した。

５−１−５抗原コ一ド配列（実施例１１）もまた、文献の方法（スミス）に従っ て、ｐＧＥＸベクターシステムを用いるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ 融合プロティンとして発現した。バクテリア溶解物から得られ５ＤＳ−ＰＡＧＥ によって分別された融合プロティンを、上述のように、ウェスタン・プロティン グのためニトロセルロースフィルターに移した。

ウェスタン・プロティングは実質的に実施例１０に記載したように行った。簡単 に述べると、フィルターを＾ＩＢでブロックし、ヒトおよびチンパンジーの正常 、慢性のＮＡＮＢＨ、およびＢ型肝炎（ＨＢＶ）血清試料を含めて、表５に同定 した血清試料と反応させた。

ニトロセルロースに結合する特異的抗体の存在は、さらにアルカリ性フォスファ ターゼ標識抗ヒトｒｇＧの免疫結合によってアッセイした。　５ｊ２６１５−１ −１融合プロティンおよび／４０９−１−１（ｃ−ａ）融合プロティンを用いる ウェスタン・プロット分析の結果は表６に示されている。データは４０９−１− Ｈｃ−ａ）および５−１−１ペプチド抗原がヒトおよびチンパンジーＮＡＮＢＨ 抗血清と特異的に免疫反応することを確認する。

ｌ旦 ヒト　正常　２　０　０ ヒトＮＡＮＢ７５５ ヒ１−ＨＢＶ１００ チンパンジー　正常　５　０　０ チンパンジー　ＮＡＮＯ６５５ ｆ７ハ７シー　ＨＢＶ　１　０　０ １施斑Ｕ ゛　クローンの 代替クローンを、ヒトおよびチンパンジーＮＡＮＢＨ抗血清と特異的に免疫反応 する符号化抗原として実施例１２に同定した領域から生成した０表７に示したプ ライマーをＨＣＶまたは４０９−１−１　（ａｂｃ）コード配列から選択し種々 のオーバーラツプするクローンを生成した。

ｌエ エ立ヱヱニ　■ ３３Ｃ−ＦＩ　ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＴＧＴ３ ３Ｃ−ＲＩ　ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＴＧ４０９ −１−１　（ｃ−ａ）　Ｆ　ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＣＧＣＣＣＧＣＣＧＡＧ ＡＣＴＡＣ４０９−１−１−ＦＩ　ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＡ ＧＡＧＡＴＣＣＣ４０９−１−１４２ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＧＴＡＴＴＧ ＣＡＧＴＣＴＡＴＣ４０９−１−１−Ｆ３　ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＡＣＣＣＡ ＧＡＣＡＧＴＣＧＡＴ４０９−１−１−Ｒ５ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＡ ＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＧ４０９−１−１　（ｃ−ａ）ＲＣＣＧＡＡＴＴＣＧ ＣＣＡＧＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴ？４０９−１−ＩＣＲＣＣＧＡＡＴＴＣ ＧＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＣＧＧＧＡＡＧ表７に示したプライマーを実施例７Ｂお よび８に記載したようにＤＮＡ増幅反応に使用した：各反応に使用したプライマ ーと鋳型は表８に示される０次に増幅フラグメントを、標準条件下で（マニアチ スら）　、　ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメントを用いて処理し、分 子末端に満たした。平滑末端増幅フラグメントを標準の条件にＥｃｏＲＩを用い て消化し、本質的に実施例１０Ｂに記載したようにラムダｇｔｌ１発現ベクター にクローンした。得られた挿入物は図７に比較のために並べられている。

Ｌ ３３ＣｃＤＮＡ　”　３３−Ｃ−Ｆｌ　と４０９−１−１−Ｒ２３３ＣＬＩ　ｃ ＤＮＡ　”　３３−Ｃ−Ｐｉ　と３３−Ｃ−Ｒｌ４０９４−１（Ｆ＋Ｒｔ）　ｇ ｔｌｌ　４０９−１−１（ｃ−ａ）　４０９−１−１−Ｆｌと４０９−１−１− Ｒ２４０９−１−１（ａ）　ｇｔｌｌ　４０９−１−１（ｃ−ａ）　４０９−１ −１−Ｆｌと４０９−１−１ｃａＲ４０９−１−１（ｃ）　ｇｔｌｌ　４０９− １−１（ｃ−ａ）　４０９−１−１ｃａＦと４０９−１−ＩＣ１１４０９−１− Ｈｃ＋２７０）　ｇｔｌｌ　４０９−１−１（ｃ−ａ）　４０９−１−１ｃａＦ と４０９−１−１−Ｒ２４０９−１−１ｕ　ｇｔｌｌ　４０９−１−１（ｃ−ａ ）　４０９−１−１−Ｆ３と４０９−１”−１ｃａＲ°実施例７からの増幅ｃＤ ＮＡ 実施例１２に生成した代替クローンを実質的に実施例１０Ｂに記載されたように 免疫スクリーニングした。実施例１２で生成したクローン４０９−１−１　（ａ ｂｃ）および４０９−１−１　（ｃ−ａ）もまた、次の免疫スクリーニングに含 まれた。予備免疫スクリーニングの結果を表９に示しである。

ｌユ ＧＩＪ−１−目玉 ４０９−１−１　（ａｂｃ）　＋　ＮＤ４０９−１−１　（ＦＩＲ２）　＋　Ｎ ０４０９−１−１　（ａ）　＋　ＮＤ ４０９４−１　（ｃａ）　＋　ＮＤ ４０９−１−Ｌ　（ｃ）　−− ４０９−１−１（ｃ＋２７０）　＋　ＮＤＧＬ４−１血清はヒトの慢性Ｐ↑−Ｎ ＡＮＢＨ血清であった。　ＧＬＩ−１を用いてクローンが陰性に試験された場合 、さらにＦＥＣ、ヒトの慢性ＰＴ−ＮＡＮＢＨ血清を用いてスクリーニングによ って試験した。

上述の予備免疫スクリーニングによって陽性に試験された９個の代替クローンの うちの７個は一層の血清に対してさらに広くスクリーニングした。さらに、クロ ーンＣ１００（背景参照）をスクリーニングに含めた。このさらに網羅的なスク リーニングの結果を表１０に示しである。

１則 スクリーニングのために使用した血清試料は次のように同定された：　Ｓ）［Ｆ 、　ＰＴ−ＮＡＮＢＨ陰性；ＦＥＣ，ＰＴ−ＮＩＩＮＢＦＩ陽性；Ｂｖ、コミエ ニ別のチンパンジーからのプール血清試料である：チンパンジー血清試料はセン ターズ・フォア・ディシーズ・コントロールから人手した０表１Ｏに示したスコ アシステムは次のように定義された質的なスコアシステムである；（−）、明ら かに陰性；　（＋）　、（１＋）、（２＋）、（３＋）、陽性信号の強度が増加 、（３＋）は最強の信号である；０）は不定であり、２回の読み取りが異なり、 繰り返さない。

表１０に示されたデータを考慮して、免疫スクリーニングによって抗原の感度は ３３Ｃｕ　＞　３３ｃ　＞　４０９−１−１（ｃ−ａ）　＞　４０９−１−１− ＦＩＲ２＞４０９−１−Ｈａｂｃ）≧４０９−１−１ａ　＞　５−１−１　＞　 ４０９−１−１−（ｃ＋２７０）である、３３ｃｕと３３ｃは敏怒な抗原であっ たが、全血清に対して高いバンクグラウンドで反応した。従って、４０９−Ｉ− １シリーズは、ＨＣＶ誘導抗体に一層特異的であるから、診断抗原として一層有 用である。

免疫スクリーニングをさらに広げて、上記で同定されたクローン３６および４５ （クローン４０に相当する）符号化エピトープを含ませた０表１１は免疫スクリ ーニングの結果を示す。

パネルｆ：　血清変換標本 スクリーニング血清ＧＬｆ−１、ＦＥＣ、ＢＶ、およびＳＫＦは上記に定義した ０番号を付した血清試料はＰＴ−ＮＡＮＢＨ陽性であるヒト臨床血清試料に相当 する：これらの試料はフランスのパリのホスピタル・う・ペティ・サルベトリエ ールのフランソヮーズ・ファビアニルネル博士から入手した。表１１に示した結 果がら見られるように、クローン３６および４０によって生成された抗体は、４ ０９−１−１　（ｃ−ａ）のように敏悪ではないが、ＨＣＶ特異的免疫陽性信号 を出す。

１施■］ ４０９−１−ＩＡプロティンの 抗ベーターガラクトシダーゼと共役したセファローズ４Ｂビーズをプロメガから 購入した。このビーズを２＊Ｉのカラムに充填して続いて０．０２％のアジ化ナ トリウムのホスフェート緩衝食塩水と１０１（ＤＴＸｌｌｉ衝液（１０新液Ｉ　 Ｉ）　）リス！ｌ！新液、ｐＨ７，４，１％ｆ７）７ブロチニン）を用いて洗浄 した。

実施例Ｉ２からのｇｔｌｌ／４０９−１−１　（ｃ−ａ）を用いて感染させたＢ ＮＮＩ０３リゾゲンを用いて５００ｍ１のＮＺＹＤ丁ブイヨンに接種した。培養 物を約０．２ないし０．４の０．Ｄ、までエアレージタンで３２℃にて培養し、 次に４３℃の水そう中で１５分間４３℃まで急速に上げ、てｇｔｌｌペプチド合 成を誘導し、さらに３７℃にて１時間培養した。細胞を遠心分離によってペレフ トにして、１０ｇ＋１の溶菌緩衝液（１０ｓ＋Ｍのトリス、ｐＨ７，４、使用直 前に添加した１％のアプロチニンと２％のトリトンＸ−１００”を含む）に懸濁 させた。再懸濁細胞を液体窒素で凍らせ、次に解凍し、実質的に完全な細胞溶菌 となった。溶解物をＤＮａｓｅｌで処理し、溶解物中の粘度が次第に失われてい （ことによって証明されるように、バクテリアおよびファージＤＮＡを消化した 。可溶化しない物質を遠心分離によって除去した。

不純物を除去した溶解ＩＦＩｔをセファロースカラムに装填し、カラムの両端を 閉鎖し、カラムを室温で２時間、４℃で１６時間、ロータリーシェーカーに入れ た。カラムが固定した後、１０ｓｌのＴＸ＠衝液新液浄した。融合プロティンを ０．１Ｍの炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ１０を用いて溶出した。全量１４ｍ１ の溶出緩衝液をカラムに通し、最初の４〜６ｍｌの溶出液に融合プロティンが溶 出した。

アフィニテイカラムからの最初の６■ｌをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ”−３０カートリ ツジ（アミコン、マサチュセフッ州、デンバー）中で濃縮した。最終のプロティ ン濃縮物を４００μｌのＰＢＳ緩衝液に再懸濁させた。プロティン純度は５Ｏ５ −ＰＡＧＥによって分析した。単一の顕著なバンドが観察された。

大施九■ ４０９−１１　（ｃ−ａ）　のＵ ラムダｇｔｌｌからの４０９−１−１（ｃ−ａ）消化フラグメントをファジーの ＥｃｏＲＩ消化によって放出し、″＾゛領域をゲル電気泳動によって精製した。

精製されたフラグメントはｐＧＥＸ発現ベクター（スミス）に導入した。　４０ ９−１−１（ａ）ペプチド抗原を含むグルタチオンｓ−トランスフェラーゼ融合 プロティン（Ｓｊ　２６融合プロティン）の発現はＥ、ｃｏｌｉ株ＫＭ３９２　 （上記）で行った。融合プロティンを溶解バクテリアから単離し、文献の方法ス ミス）に従って、グルタチオン共役ビーズを充填したカラムでアフィニティクロ マトグラフィーによって単離した。

精製された５ｊ２６／４０９−１−１（ａ）融合プロティンをウサギにフロイン ト補助液で皮下注射した。約１ｍｇの融合プロティンを０日と２１日目に注射し 、ウサギの血清を４２日と５６日目に採取した。

精製された５ｊ２６１５−１−１融合プロティンを同様に５−１−１フラグメン トを符号化する増幅ＨＣＶフラグメントを用いて調製した。融合した５ｊ２６１ ５−１−１プロテインを用いて、同じ免疫化スケジュールに従って第２のウサギ を免疫化した。第３のウサギを同様に、コントロールのバクテリア溶解物から得 られた精製５ｊ２６プロテインを用いて免疫化した。

次のバクテリア培養液からのミニ溶解物を実施例１２に記載したように！１ｍ！ ！した：　（１）　ＫＭ３９２細胞はｐＧＥＸ、５−１−１挿入物を含むｐＧＥ Ｘ、そして４０９−１−１（ａ）挿入物を含むｐＧＥＸを用いて感染させた；そ して（２）　ＢＮＮ１０３は５−１４挿入物を含むラムダｇｔｌｌおよび４０９ −１−１　（ｃ−ａ）挿入物を含むｇｔｌｌを用いて感染させた。ミニ溶解物を Ｓ［１Ｓ−ＰＡＧＥによって分別し、バンドは実施例１２で記述したようにウェ スタン・プロッティングのためのニトロセルロースフィルターに移した０表１２ は、５種の溶解物調製物（表中の左側に示される抗原を含む）を３種のウサギ免 疫血清の各々を用いてスクリーニングしたときに観察された免疫反応のパターン を示している。これらの結果をまとめると、コントロール（Ｓｊ　２６）のウサ ギからの血清は５ｊ２６およびＳｊ　２６融合プロティン抗原の各々と免疫反応 した。　５ｊ２６１５−１−１融合プロティンを用いて免疫化した動物からの血 清は３種のＳｊ　２６抗原すべて、およびベーターガラクトシダーゼ１５−１− Ｉ　８合プロティンと反応し、これは５−１−１抗原との特異的免疫反応の存在 を示している。　５ｊ２６／４０９−１−１（ａ）融合プロティンを用いて免疫 化した動物からの血清は３種の５ｊ２６抗原すべて、およびベーターガラクトシ ダーゼ／４０９−１−１（ｃ−ａ）融合プロティンと反応し、これは４０９−１ −１（ａ）抗原との特異的免疫反応の存在を示している。血清はどれもベータガ ラクトシダーゼ（市販品として入手）と免疫反応しなかった。

ｌ肥 Ｕ　放生 ５ｊ２６　５−１−１／５ｊ２６　４０９−１−１（ａ）／Ｓｊ２６５ｊ　２６ ／４０９−１−１　（ａ）を用いて免疫化した動物からの血清に存在する抗４０ ９−１−Ｈａン抗体は実施例１２に記載した一般法に従って、アフィニティクロ マトグラフィーによって精製されるが、セファロースビーズに誘導したりガント は、抗−ベーターガラクトシダーゼ抗体よりもむしろ、精製されたベーターガラ クトシダーゼ／４０９−１−Ｈｃ−ａ）融合プロティンである。

１隻班用 ＨＣｖキャプシドブローインコード配　のクローニングこの実施例ではＨＣＶキ ャプシドプロティンのＮ末端領域を符号化する）ＩＣＶコード配列のクローニン グについて記述する。

ＨＣＶキャプシド会合抗原のプロティンの配列は全長のＨＣＶ配列（付録参照） のヌクレオチド残基３２５−９７０に相当する９次の配列はＰＣＲプライマーと して使用され、この領域をクローニングした：　５Ｆ２（Ｃ）、全長（７）　Ｈ ＣＶ配列（付録）のヌクレオチド３２５で５゛末端で始まる、５’−ＧＣＧＣＣ Ｃ訂ＧＧＧＣＡＣＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣ＾；およびＳｉ２０　（Ｃ）、 全長のＨＣＶ配列（付録）のヌクレオチド９６９で３゛末端で始まる、５　’　 −ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＡＣＴＣ（Ｇ／Ａ）　ＴＡＣＡＣＡＭＴ　（Ａ ／Ｇ）　ＣＴ　（Ｃ／Ｔ）　ＧＡＧＴＴ　（Ａ／Ｇj　Ｇ　。

ＳＦ２　（Ｃ）　／Ｓ１？１　（Ｃ）のプライマーペアを用いて生成されるフラ グメントの期待される大きさは６４４塩基対であった。

実施例７からの５ＩＳＰＡ増幅ｃＤＮＡフラグメントは、実施例８にあるように 、１００１の緩衝液Ａ、それぞれ１μＭの等モル量の上記Ｓｌ？２とＳＦＬプラ イマー、それぞれ２００　ｔｔ阿のｄＡＴＰ、　ｄｃＴＰ、　ｄＧＴＰ、および ｄＴＴＰ、および２．５単位のテルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｔａｕｓ７　 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｇポリメラーゼ）を用いて混合した。

上記キャプシドプライマーベアを用いた５ＩＳＰＡ特異的増幅ｃＤＮＡフラグメ ントは、実施例７に記載した条件と似た条件下に、７２℃で１分間、約３０サイ クルで行われた。

上記からの増幅フラグメント混合物をそれぞれ、１．２％の二重アガロースゲル 上のアガロースゲル電気泳動によって分別し、ゲルの一方は、次の配列をもつ放 射活性標識オリゴヌクレオチド（サザン）を用いてハイブリッド形式のためのニ トロセルロースフィルターに移した：　ＳＦ３（Ｍ／Ｅ）、全長のＨＣＶ配列（ 付録）のヌクレオチド７９２で５゛末端で始まる、５’　−ＧＣＧＣＣＣＡＴＧ ＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣＧＴＧ、このヌクレオチドはＳＦ２　（Ｃ）お よび５ＲＩ（Ｃ）プライマーを用いて生成した増幅生成物に対し内側の配列に相 当する。　１５のＰＣＲ生成物のうち８つは内側プローグを用いて陽性のハイブ リッド形成信号を与えるものと同定された。

ベクターｐＧＥＸ　（実施例１５）およびｐＥＴ（／ハゲン、ＷＩ５３７１１　 、？ジソン、サイエンスドライブ５６５）を挿入物によって符号化されたプロテ ィン配列のｍ菌発現のために選択した。　ｐＧＥＸベクターは５ｊ２６（実施例 １２および１５参照）に対し融合プロティンとして挿入コード配列の発現を与え 、ｐＥＴベクターはクローン化配列単独の発現を与えた。キャプシド配列をクロ ーン化するために、増幅生成物のバンドは二重ゲルから励起させた。　ＤＮＡを アガロースから抽出し、Ｎｃｏ　ＩおよびＢａｍＨＩを用いて二重消化させた。

　Ｂａａ＋［ＩＩ／Ｎｃｏｌクローニング部位を含むｐＧＥＸベクターもまたＢ ａ５ａｌおよび皿を用いて二重消化させた。ベクターと抽出されたＤＮＡを次に 標準の条件下に連結し、連結混合物は細菌細胞に形質転換させた。

細菌形質転換細胞をアンピシリン選択下に培養し、プラスミドＤＮＡはアルカリ 性溶菌（マニアチスら）によって単離された。単離したプラスミドＤＮＡはＮｃ ｏ　ｒおよびＢａｓ［を用いて消化した。消化生成物を次にアガロースゲルで電 気泳動分離した。ゲルをニトロセルロースに移し、上記のように放射活性種ｒＡ ＳＦ３を用いて試験した。１２個のクローンがサザンプロット分析によって関係 する挿入物をもつことを確認した。

クローンは実質的に同じ方法でｐＥＴベクターに生成させた。

裏施且旦 のＨＣｖキャプシドプロティンクローンの・スクリーニング この実施例では実施例工８で得られた推定ＨＣＶキャプシドプロティンクローン の免疫学的スクリーニングを記載する。

実施例１６で得られた１２個のクローンのうち７個のクローン（クローン欝８． １４．１５．５６．６０．６５、および６６）のプロティンミニｉ容解物を実施 例１２に記載したように調製した。これらのミニ溶解物を上記のように分別し、 ウェスタンプロット分析のためにニトロセルロースに移した０表１３は７個の溶 解物の調製物を指示された血清を用いてスクリーニングするとき認められる免疫 反応のバクスクリーニングのために使用した血清試料は次のように同定された： 　ＳＫＦ、　ＨＣＶ陰性；ＦＥｃ、　ｎｃｖ陽性；ＢＶ、コミユニティ取得ＨＣ Ｖ；Ａ６およびＢ９はＨＣＶ陽性であるヒトの臨床血清試料に相当する。

ウェスタン・プロットで同定された免疫反応性バンドは全部、期待された大きさ の５０ｋｄよりも小さかった（下記のクローン化挿入物の予言されたコード配列 に基づ＜）。

クローンＩ５はＳｊ　２６融合プロティン（スミスら）のスケールアップ生成の ために選択された。１リツトルのクローン１５の調製品により約２００μｇの精 製した免疫反応性物質を生成した。免疫反応性物質のバルクは約２９ｋｄにて走 行する主要な二重バンドに現れた。

この調製品からの収率は意外にも低かった二代表的には９ＧＥＸシステムを用い ると、１リツトルのプロティン調製品は５０〜１００ｍｇの範囲で融合プロティ ンを生成する。

１隻五■ クローン１５および５６の　１ クローン１５および５６の挿入物（実施例１７に述べた）を製造業者の指示（Ｕ Ｓバイオケミカル・コーボレーシクン・タレベランド、ＯＨ）によりジデオキシ 鎖末端技法（サンガー、１９７９）を用いて配列した。

各クローンはｐＧＥＸベクターの５ｊ２６読取り枠と隣接する読取り枠をもって いた。クローン挿入物の配列は少数の重要でない配列の変化だけでほぼ同一であ った：クローン１５の配列はヌクレオチド位置１２６で始まる末端コドンをもっ ていた。クローン１５に対する配列データはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１として図 ８Ａに示されている。

挿入物の配列はヌクレオチド位置２５ないし位置３４（図８Ａ）からのアデニン 残基のランの異常な特徴を示した：この種の配列は翻訳フレームシフト（ウィル ソンら、アドキンスら）を促すことが知られている配列に似ている。５ｊ２６コ 一ド配列に隣接する読取り枠は約２３．５ｋｄのプロティンを予言する。従って この構成物（スミスら）において約２６ｋｄの大きさのＳｊ　２６プロテインフ ラグメントを与えると、完全融合プロティンは約５０ｋｄであると予言されるだ ろう。

スｍ クローン５６によ　て、　れたブローインの　感・１　プロットインテリジェネ ティクスＰＣ／Ｇ［！ＮＥ’Ｎソフトウェアパッケージからの５ＯＡＰプログラ ムを使用して図９の水感応性プロットを生成した。　５ＯＡＰプログラムはカイ トらの方法を使用して、プロティンの配列とその水感応性をプロットした。評価 のために使用したインターバルは１１アミノ酸であった０図９においてプロット の疎水性の側はプラスの値の範囲に相当し、親水性の側はマイナスの値の範囲に 相当する。

水感応性プロットは（ｉ）キャプシドプロティンのアミノ末端の親水性、（ｉｉ ）約１２２ないし１６２のアミノ酸残基の領域の比較的疎水な性質、および（ｉ ｉｉ）約１６８−１８２のアミノ酸残基の疎水性を示す。

さらに、アミノ酸残基１６８−１８２の領域は膜スパンニングセグメント（フレ インら）であるためのポテンシャルを証明する。

裏施班放 クローン５６ブローインコード令　の この実施例ではＨＣＶキャプシドプロティンの一連のカルボキシおよびアミノ末 端欠失の生成、および得られたプロティンの免疫反応性へのこれらの影響を記載 する。

Ａ、クローン５６のカルボキシ末端欠失ＨＣＶ　＊ヤプシドプロテインの発現を 改善するための１つのステップとして、翻訳フレームシフトの推定領域を変更し て、この領域に起こるフレームシフトの可能性を減らした。リジンをコードする 各ＡＡＡコドン（ヌクレオチド位置２７．３ｏおよび３３、図８Ａ）における各 コドン（位置２７．３０．および３３、図８Ａ）における第３のヌクレオチドを 、標準のＰｃｔ？　ミスマツチ技法（アウスベルら、ムリス、ムリスら）を用い てＡからＧに変えた。これらの置換部位は、対応するＡの部位の上に配置した３ 個のＧの部位によって図８Ａに示されている。変更したＩ）ＧＥＸクローンの配 列は実施例１９と同様に確認し、クローンをｐＧＥＸ−Ｃａｐ＾と命名した。ク ローンｐｃＥＸ−ＣａｐＡの挿入配列は［８Ａに示され、ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ： Ｉ３として表した。

欠失クローンは表１４に示したＰＣＲプライマーを用いて生成した。

表１４においてＢａｍＨ１部位はイタリック体であり、末端コドンは下線を引い である。

ｌ■ カルボキシ末端欠失プライマー １、　Ｃ１５’−ＣＧＡ　ＴＣＣ入τＧ　ＧＧＣＡＣＧ　入Ａ？　ＣＣＴ　ＡＡ Ａ　ＣＣ２、ＨＣ５Ｂ０５１−Ｇ　ＧＣＣＧＧＡ　’！”ＣＣ３ＧＧＣＣにＡ　 ＡＧＣ，ＧＧＧ　ＣＡＣＡＧコ、　ＮＣ５２０５’−Ｇ　ＧＣＣＧＧＡ　ＴＣＣ ３ＡＣＣＡＧＧ　ＭＧ　ＧＴＴ　ＣＣＣＴＧＴ　ＴＣＣ４、ＮＣ４５０５’−Ｇ 　ＧＣＣＧＧＡ　’！’ＣＣ工工ΔＧＧｃ　ＣＣＴ　ＧＧＣ入ＣＧ　ＧＣＣＴＣ Ｃ５、ＮＣコロ０　５’−Ｇ　ＧＣＣＧＧＡ　ＴＣＣユニＬへ　ＣＡ＾　ＡＴ’ ｒ　ＧＣＧ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　入ＣＧ　ＣＣ６、ＮＣ２７０５／−Ｇ　ＧＣＣＧ ＧＡ　ＴＣＣ工工Δ　Ｇｅｅ　ＣＴＣＡＴＴ　ＧＣＣＡＴＡ　ＧＡＧ増幅反応は 実質的に実施例１６に述べたように、各１１１ｃプライマーを用いて一対にした プライマーＣ１および精製プラスミドｐＧＥＸ−ＣａｐＡを鋳型として用いて行 った；増幅反応は９５℃で１分間、５０℃で２分間、７２℃で３分間、２０サイ クルでアニールした。

次の配列の比較は、図８Ｂに示した核酸配列に関して与えられる。　ＣＩプライ マーは、開始するメチオニンの近くのＮｃｏ　Ｉ部位を含むｐＧＥＸ−Ｃａｐ＾ 挿入物の共通の５゛末端に相当する。ＮＣプライマーの配列は各々、例えばヌク レオチドの位置５８０にてＮＣ５８０プライマーの相同配列を示したヌクレオチ ドの位置にて始まる。終止コドンはＢａ５ｅｒ部位に続き、その位置に挿入され る。表１４に与えられたプライマーの位置は図８Ｂに示される。プロティン配列 に間してプライマーの近似した位置は図９に示されている。

得られた増幅生成物はポリアクリルアミドゲルで電気泳動により大きさを分別し 、近接した大きさのＯＮ＾生成物はゲルから電気溶出させた。増幅生成物を発現 のためにｐＧＥＸおよびｐＥＴベクターの両方にクローン化した。挿入物の配列 を実施例１８に記載したように確認した。

カルボキシ末端欠失部を含むｐＧＩ！χベクターをＥ、　ｃｏ　Ｉ　ｉに形質転 換させ、融合プロティンは実質的に次のように精製した。融合プロティンの発現 はＩ　ＰＴＧを用いて３〜４時間で促した。細胞を６．ＯＯＯｒｐｍにて１０分 間で取り出した０次にＥ、ｃｏｌｉをＭＴＰＢＳ　ＩＩ衝新液１５（ｌｓＭのＮ ａＣｌ　；　１６ｍＭのＮａｔＨＰＯ，；　４ｓＭのＮａＨｚＰＯ＊；　ｐＨ＝ ８．０）に溶解し、その後、１％の°トリトンＸ−１００″、３　μｇ／ｍｌの ＤＮａｓｅｒ、および１ｍＭのＰＭＳＦを添加した。溶解物をＩｓ、　０００ｒ ｐ■にて２０分間遠心分離した。上澄液を捨ててベレットを８Ｍの尿素に再懸濁 させた。再＠濁成分をＢＩＯ−ＧＥＬ　ＳＰ−５−ＰＭ’カラムを用いてＨＰＬ Ｃによって分離した。代表的には、融合プロティンは顕著なピークであった：融 合プロティンの位置をウェスタン・プロット分析によって確認した。クローンＣ ｌＮＣ２７０、ＣｌＮＣ３６０、およびＣｌＮＣ４５０すべてが高水準で５ｊ２ ６融合プロティンを発現した：融合プロティンはすべて、５ｊ２６プロテインに 融合した挿入コード配列から予言された大きさに対応しており、ＨＣＶ陽性血清 と免疫反応があった（ウェスタン・プロットは実施例１７に記載したように行っ た）。上澄液を捨てたが殆どの分量の融合プロティンはまだ上澄液に存在してい た。クローンＣｌＮＣ５２０およびＣｌＮＣ５８０は融合プロティンの収率が小 さかった。

ＨＣｖキャプシド領域のエピトープマツプは図１０に示しである。挿入物ＣｌＮ Ｃ４５０、ＣｌＮＣ３６０およびＣｌＮＣ２７０に相当する配列をコードする免 疫反応性プロティンの位置を示している。　ＣｌＮＣ４５０、ＣｌＮＣ３６０お よびＣｌＮＣ２７０の配列はＳＥＱ　１０　ＮＯ：１５、ＳＥＱ　！［）　ＮＯ ：１７およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９として配列リストにそれぞれ示しである 。

Ｂ、クローン５６のアミノ末端欠失 アミノ末端欠失クローンを、表１５に示したＰＣＲプライマーを用いて生成した 。

ｌ■ 増幅反応は実質的に上述した通りに、表１６に示されたプライマーベアおよび精 製されたプラスミドｐＧＥＸ−ＣａｐＡを鋳型として用いて行った：含まれる増 幅反応は１分間９５℃にて、２分間５０℃にて、３分間７２℃にて２０サイクル でアニールした。

１旦 ＮＦＩＺプライマー　ＣＱＯＨプライマー　プロティンは生成？免疫反応は？（ ：１００　ＮＣ４５０低い　有り ＮＧ３６０　有り　有り Ｃ２７０ＮＣ２７０有り　有り ＮＣ４５０有り　否 ＮＣ３６０有り　否 Ｃ３６０ＮＣ４５０有り　否 次の配列の比較は図８Ｂに示された核酸配列に関して与えられ、図では上記のＡ からＧへの置換はｐＧＥＸ−ＣａｐＡの配列に関して行われた。ＮＣ６６０プラ イマーは、挿入物の末端付近のＢａｇ）１１部位を含むｐＧＥＸ−Ｃａｔ３Ａの 共通の３°末端に相当する。Ｃプライマーの配列は各々指示されたヌクレオチド の位１で始まるが、例えばＮＣ１００プライマーの配列はヌクレオチド１００で 始まる。各Ｃプライマーは得られた増幅生成物中にインフレーム開始コドンを導 入する。表１５に与えられたプライマーの位置は図８Ｂに示しである。

得られた増幅生成物を上記のように発現のためｐＧＥＸおよびｐＥＴベクターに クローン化した。挿入物の配列を確認した。

カルボキシ末端欠失を含む９ＧＥＸベクターをＥ、ｃｏｌｉに形質転換し、プロ ティンミニ溶解物を調製し、プロティンの免疫反応性を上記のようにウェスタン ・ブロンドによって分析した０分析の結果を表１６ニ示す、　りｏ　−ンｃＩ０ ＯＮｃ２７０とＣ１００ＮＣ３６０は高水準テＳｊ　２６融合プロティンを発現 した：融合プロティンは、Ｓｊ　２６プロテインに対して融合した挿入物コード 配列から予言される大きさに対応していた。

ＨＣＶキャプシド領域のエピトープマツプは図１０に示しである：挿入物Ｃ１０ ０ＮＣ２７０、Ｃ１００ＮＣ３６０，Ｃ２７ＯＮＣ３６０，オヨびＣ２７ＯＮＣ ４５０ニ対応するプロティンコード配列の位置を示している。Ｃ１００ＮＣ２７ ０とＣ１００ＮＣ３６０（７）配列は、ツレツレ、ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：２１、 オヨびＳＥＱ　ｒＤＮｏ　：　２３として配列リストに示しである。

ス１±旦 キャプシド　る　れた　スクリーニングこの実施例では複数のグループの血清に 対する本発明の種々のＨＣｖ抗原の免疫反応性の３つの異なる比較を記載する。

Ａ、　Ｃａｐ４５０抗原の有効性 表１７はＮＡＮＢ型肝炎惑染の疑いがある患者からの５０個のヒト血清試料の結 果を示す、　ＥＬＩＳＡアフセイは次の３種類の抗原を用いて実質的にチジフセ ンによって記載されたように行われた：　Ｃ１００，４０９−１−１（ｃ−ａ） 、ｃ３３ｕ、　Ｃａｐ４５０　（ｐＧＥＸ−ＣＩＮＣクローンのプロティン生成 ＠！Ｊ）、モして４０９−１−１（ｃ−ａ）とＣａｐ４１５０は一つのウェルで 最も悪魔の高い結果を与えるように最適化した。これらのＥＬＩＳＡデータをア ポ７　トｃ１００テストと比較した。

患者の血清が、５ｊ２６の本来のプロティンの血清の吸光度の３倍の吸光度であ るならば、Ｓｊ’１６融合プロティン（４０９−１−ＩＣａ、　３３ｕ　。

５−１−１　、およびＣａｐ４５０）に対して陽性と評価した。陰性のコントロ ール血清の吸光度の平均の３倍の吸光度であるならば、試料をＰＥＴ抗原（Ｃａ ｐ３６０）に対し陽性と評価した。コントロール陽性血清の吸光度に等しいかそ れよりも大きいならば、合わせた４０９−１−ＩＣａ／Ｃａｐ４５０Ｃａ／Ｃミ ル４５０アツセイ陽性と評価した。コントロール陽性血清の１０％以内の試料は 弱陽性と評価した。

〔試料１〜１９：バイオブシイＨＢＳ　Ａｇ（−）によって実験した慢性活性肝 炎。

〔試料２０〜４４　：急性ウィルス性肝炎Ｈａｓ　Ａｇ（２）、ＩＳＭ抗ＨＢＣ （−）、ＩｇＭ抗−ＨＡＶ（−）。

〔試料４５〜５０：バイオブシイＨａｓ　Ａｇ（−）によって実験した慢性活性 肝炎。〕 紅 °“陽性　（低番す これらの結果は、Ｃａｐ４５０ミル４５０プロテイン中の抗ＨＣＶ抗体の存在を 検出するために良好な感度をもつことを示している。３種の追加試料（６，３７ および４７）を検出した。さらに、これらの結果はＣａρ４５０および４０９− １−１（ｃ−ａ）の組合せを使用して、ヒト血清試料中の抗ＨＣＶ抗体の検出の ために極めて有効であるキットをつくることができることを示している。

Ｂ、　Ｃａｐ４５０およびＣａｐ３６０表１８の結果は、ヒト血清中に存在する ＨＣＶ抗体を検出するためＣａｐ４５０およびＣａｐ３６０抗原（プロティン生 成物はｐＥＴ−ＣＩＮＣ３６０によって符号化される）の有効性を示す。試料は 、示した各個体の抗原を用い、または１個のウェルに合わせた４０９−１−Ｌ（ ｃ−ａ）およびＣａｐ４５０抗原を用いてＥＬＩＳＡによってＨＣＶの存在につ いて試験した。

ｌ」 Ｇ−１３１急性肝炎；Ｐｔ’Ｃ，Ｏ，’−−−−−−Ｇ−１３２急性肝炎：Ｐ【 “ｃ、ｏ、”−−−−−−Ｇ−１４３急性肝炎；Ｐｔ“ｃ、ｏ、”−−−−−− Ｇ−２８５急性肝炎；Ｐｔ″Ｃ，Ｏ，’ＮＤ　ＮＤ　ＮＯＮＤ　１１０　−Ｇ− ４３電撃性肝臓病　−一一一一− Ｇ−３８［１！性Ｂ型肝炎　−一一一一−Ｇ−４５コミユニティ 取得Ｃ型肝炎　−１＋Ｔ＋ Ｇ−１３Ｃ型肝炎　＋　ｌ　＋　＋−１−＋Ｇ−１２Ｃ型肝炎　＋−＋　＋＋＋ Ｇ−６Ｃ型肝炎　−−一−−− Ｇ−４９ＥｔｏＨ肝硬変　−−一一一−Ｇ−２５ＥｔＯＨ肝硬変　−−−−−− Ｇ−１１０８ｔＯＨ肝硬変　−−＋　＋ｌ＋Ｇ−４６ＥｔＯＨ肝硬変　−−一一 一−Ｇ−１２３１ＮＣＬＴ　−−−−−− Ｇ−１２２１ＮＣＬＴ　−＋　−−−−Ｇ〜１２５診断なし　−１＋　＋ｉ＋ Ｇ−１２４診断なし　−−−＋＋＋ これらの結果は、抗原４０９−１−１（ｃ−ａ）およびＣａｐ３６０またはＣａ ｐ４５０の組合せがＩＩｃＶ感染の検出に対して有効な診断道具となることを示 している。５種類の追加試料（Ｇ１５０、Ｇ１５１．　ＧＩＩＯ，Ｇ１２５、お よびＧ１２４）はＣ１００のテスト単独と比較したこれらのＥＬＩＳＡを用いて 検出した。

Ｃ，ｐＥ７３６０ 表１９の結果はヒト血清中に存在するＨＣＶ抗体を検出するためのｐＥＴ３６０ の有効性を示す。示された各個体の抗原を用い、または１個のウェルに合わせた ４０９−１−１（ｃ−ａ）およびｐＥ７３６０抗原を用いてＥＬＩＳＡによって ＨＣＶの存在について試験した。

、表旦 これらの結果は、抗原４０９−１−１（ｃ−ａ）およびｐＥ７３６０の組合せが ＨＣν感染の検出に対してを効な診断道具となることを示している。

３種類の追加試料はＣ１００のテスト単独と比較したこれらのＥＬＩＳＡを用い て検出した。

本発明は特定の実施例、方法、構成および用途に関して記載されているが、当業 者には本発明から離れることなく種々の変化および改変を行うことができること は明らかだろう。

配列表 （１）　一般情報： （ｉ）出願人ニレイエス、グレゴリイ キム、ジュンスウ　ピー メフクリ、ランドルフ シモンセン、クリスチャン　シー （ｉ　＋）発明の名称二Ｃ型肝炎ウィルスエピトープ（ｉｉｉ）配列番号：２６ （ｉｖ）通信住所： （＾）受信人：ビータ−ジェイ　デーリンガ−（Ｂ）街区：　ｐ、　ｏ、ボック ス　６０８５０（Ｃ）市：パロ　アルド （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：　９４３０６ （ν）コンピュータ読み取り形式： （Ａ）媒体型：フロッピィディスク （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）操作システム：　ＰＣ −００５／ＭＳ−００５（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン　レリース１１１． ０．バージョン１１．２５（ｖｉ）現行出願データ： （Ａ）出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ９１１０２３７０（Ｂ）出願口：　１９９１年 ４月５日 （Ｃ）分Ｍ： （ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：　ＵＳ　５０５，６１１（Ｂ）　出願口：　０６−ＡＰＲ−１ ９９０（νｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：　ｕｓ　ｓ９４，８５４（Ｂ）出願口：　０９−ＯＣＴ−１９ ９０（ｖｉｉｉ）代理人情報： （＾）名前：ファビアン、ガリイ　アール（Ｂ）登録番号：　３３，８７５ （Ｃ）参照／認可番号：　４６００−０７６．２１（ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話：　（４１５）　３２３−８３０２（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１ のための情ａ：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５６１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　［の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二車鎖状 （ｉｆ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　＋１ＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗感作：無し くｖｉ）起′ａ： （Ａ）生物体：Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　３０４−１２−１ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位’７７：　１．．５６１ （ｘｉ）　配列の記’１１：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１ＴＣＣＴＡＴ　ＧＡＴ　 ＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴフτ　ＧＡＣＴＣＣＡＣＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＡＧ　ＡＧ ＣＧＡＣＡＴＣ９６Ｓ＠ｒ　Ｔｙｒ　Ｍｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｇ　Ｐｈｅ　 Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　Ａｓｐ　ｒｌｅＣ ＧＴ　ｈＣＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ｋＴｃ　ＴＡＣＣＡＡ　ＴＧＴ　ＴＧ Ｔ　ＧｋＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＣＡＡ　ＧＣＣ１４４人ｒ９　Ｔｈｒ　ＧＬｕ　 Ｇｌｕ　Ａｌ轟　Ｉｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｃｙｇ　Ａｇｐ　Ｌａｕ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＡｌａＣＧＣＧＴＧ　ＧＣＣＡＴＣｋｋＧ　ＴＣＣＣ ＴＣＡＣＣＧｋＧ　ＡＧＧ　Ｃ７丁　τＡＴＧ丁丁　ＧＧＧ　ＧＧＣＣＣ’Ｔ　 １９２Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ＩＩｓ　Ｌｙｅ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｔ　Ｃ １ｕ　Ａｒｇ　ＩＪｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

ｒ　ＡＣＣＡＡＴ　ＴＣＡ　ＡＧＧ　ＧＧＧ　ＧＡＧ　ＡＡＣＴＧＣＧＧＣＴＡ Ｔ　ＣＧＣＡＧＧ　ＴＧＣＣＧＣＧＣＧ　２４０Ｌｓｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓ＠ ｒ　Ａｒｇ　にＡｙ　Ｇｌｕ　Ａｇｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　入ｒｑ　人ｒ ｇ　ＣＹ＠　Ａｒｇ　ＡｌａＡＧＣＧＧＣＧＴＡ　ＣＴＧ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　Ａ ＧＣＴにＴ　ＧＧＴ　ＡＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴ　ＴＧＣＴＡＣＡＴＣ２ＢＢＳ ｓｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａ ｇｎ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙ＊τｙｒ　ｒｌｅＩＩｓ　９０　９５ ＡＡＧ　ＧＣＣＣにＣＧＣＡ　ＧＣＣＴＧＴ　ＣＧＡ　ＧＣＣＧＣＡ　ＧＧＧ　 ＣＴＣＣＡＧ　ＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＴＧ　３３６Ｌｙｅ　Ａｌａ　入ｒｇ　Ａ ｌａ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　入ｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａ ｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｍａｔｌｏｏ　１０５　１１０ ＣＴＣにＴＧ　ＴＧＴ　ＧＧＣＧＡＣＧＡＣττＡ　ＧＴＣＧＴＴ　ＡＴＣ７０ 丁　ＧＡＡ　ＡＧＣにＣＧ　ＧＧＧ　ＣＴＣ３８４Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｐ　Ａ＋＋ｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｓｓｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＶａP ＧＡＧ　ＧＡＧＧＡＣＧＣＧ　にＣＧ　ＡＧＣＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＣＣＴＴＣＡ ＣＧ　ＧＡＧ　ＧＣτＡτＧ　ＡＣＣＡＧＣ；　４３２Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ 　Ａｌａ　Ａｌａ　５ｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ 　Ａｌａ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ　ＡｒｇτＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＧＧＧ　Ｇ ＡＣＣＣＣＣＣＡ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＴＡＣにＡＣＴＴＧ　ＧＡＧ　４ ８０Ｔｙｒ　５ａｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒ ｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｕユ４５　１５０ 　ユ５５　１６０ ＣＴＣＡＴＡ　ＡＣＡ　ＴＣＡ　ＴＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＧＴＧ　ＴＣＡ　Ｇ ＴＣＧＣＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＯＣＴ　５２８Ｌｅｕ　工ｌ＠　丁ｈｒ　Ｓａｔ 　Ｃｙｇ　Ｓｅｒ　Ｓ＠ｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　５ａｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ｋｈｓ 　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ１６５　１７Ｑ　１７５ ＣＣ＾　入ＡＧ　ＡＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＣＣＣＯＧ　ＧＡＡ　丁τ Ｃ５６１Ｇｌｙ　ＬＹ＊＾ｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａ ｒｇ　Ｇｌｕ　ＰＭ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２のための情報：（ｉ）配列 の特徴： （Ａ）長さ：１８７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記［：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｖ ａｌ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｌｙｅ　Ｓｉｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓτｈｒ　Ｐｒ ｏ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ　ＰｈｅＳ＠ｒ　Ｔｙｒ　Ｍｐ　Ｔｈｒ　入ｒｇ　Ｃｙｍ　 Ｐｈｅ　Ａｇｐ　Ｓ＠ｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　ＡＭＰ　 ＩｌａＡｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｉｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｃ ｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ａｍｐ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＡｌａＡｒｇ　Ｖａ ｌ　Ａｌａ　Ｘｉ＠Ｌｙｅ　Ｓ＠ｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ 　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｓｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ａｙｓ　 Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ５ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖ ａｌ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　５ａｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌ ａｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｘ１ｓＬｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌ ａ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ＾ｓｐ　Ｃｙｍ 　Ｔｈｒ　Ｍｅｔｌｏｏ　１０５　１１０ Ｌ札Ｖａｌ　Ｃｙ廖Ｇｌｙ　Ｍｐ　Ａｍｐ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＩＩｓ　 Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　５釘Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａ１Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ 　ＡＬａ　Ｓｉｒ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　八ｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ 　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ１コ０　１３５　１４０ Ｔｙｒ　Ｓａｔ　Ａｌａ　Ｆ’ｒ口Ｐｒｏ　Ｇｌｙ＾ｕｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇ ｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ１４５　１５０　１５ ５　ユ６０ Ｌａｕ　ＸＬｍ　丁ｈｒ　５＊ｒ　Ｃｙｍ　Ｓｉｒ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　ＶａＬ　 Ｓｅｒ　ＶａＩ　入１ａ　ＨＬｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　八１１１６５　１７０　１ フ５ ＧＬｙ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　 Ｇｌｕ　Ｐｈ・１１１０　１ｌｌｓ （２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：３のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２５２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （０）トポロジー二車鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　５ＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗悪作：無し くｖｉ）起Ｂ： （Ａ）生物体：肝炎ＨＣＶウィルス （Ｂ）　ＩＩ株：　ＣＤＣ （ｖｉ　ｉ）　直接の起ａ： （Ａ）クローン：　３０３−１−４ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．２５２ （ｘｉ）　配列の記載二ＳＥ０１０　ＮＯ：３ＡＡＣＴＣＣＧＴＧ　ＴＧＧ　Ａ ＡＡ　ＣＡＣＣＴＴ　ＣＴＣ，ＧｋＡ　ＧＡＣ入Ａτ　ＣＴＡ　ＡＣＡ　ＣＣＡ 　Ａ丁へ　ＧＡＣ４８Ａｓｎ　５ｅｒ　Ｖａｌτｒｐ　Ｌｙｓ　Ａａｐ　Ｌａｕ 　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｇｎ　Ｖａｌτｈｒ　Ｐｒｏ工ｌｅ　Ａｓｐｌ　 Ｓ　１０　１ｓ ＡＣ？　ＡＣＣｋＴｃ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＭＧ　入ＡＣＧＭ；　Ｇ？’？　ＴＴ ＣＴＧＣＧＴＴ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡに　ＡＡＣ９６Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ 　Ｍｔ　ＡＬａ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＶａＬ　 Ｇｉｎ　Ｐｒ口　Ｇｌｕ　ＬｙｅｅＧＧ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　入＾Ｇ　ＣＣＡ　Ｏ ｃＴ　ＣＯＴ　ｃ？（：　Ａｒｅ　ＣＴｃ　ＴＴＣＣＣＣＣＡＴ　Ｃ′ＴＧ　Ｇ ＧＣＣ，ＴＧ@１４４ Ｇｕｙ　ＧＬｙ　入ｘｑ　Ｌｙｍ　Ｐｒｏ　入↓ａ　入ｒｇ　Ｌａｕ　Ｕｎ　Ｖ ａＬ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　ＶａｌＣＧＣＧＴＣａＴＧＣ Ｇｋｋ　ＡＡＧ　ＡＴｅ；　００７ｍ　丁ＡＣＧ＾ＣＧτＣＧＴτ＾Ｃｅ　入＾ ＧＣ丁ＣＣＣＣ１９２人ｒ９　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　ｌｌ ａ　Ｌａｕ　Ｔｉｔ　入−ｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｌｙ−Ｌａｕ　Ｐｒ。

ＴＴＧ　ＯＣｅ　ＧＴＯＡＴＣＧＧＡ　ＡＧＣＴＣＣＴＡＣｃｃｘ　ＴＴＣＣＡ Ａ　ＴＡＣＴＣＡ　ｅｃＡ　ＧＧＡ　ＣｋＧ　２４０山１ｕ　入１ａ　Ｖａｌ　 Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｓ＠ｒ　Ｔｙｒ：　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ 　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇ１■ ６Ｓ　）０　フＳ　８０ ＣＯＧ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　Ｔ’ＴＣ２５２ｋｘｑ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　Ｐｌ’ｌ＠ （２）’ＢＥＱ　１０　ＮＯ：４のための情報：（６Ｄ）　：配列の特ｆ！ｌｌ ！： ｆぐ＾）長さ＝８４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 、、ｃｏ）トポロジー二車鎖状 （ｔｉ　）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記ＩＩ：　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：４ａｍｎ　Ｓａｔ　Ｖａｌ　 丁ｒｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　ＧＬｕ　Ａｓｐ　Ａｇｎ　Ｖａｌ　 丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｐｌ　５　１０　１５ 丁ｈ！−Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｍ・セ　＾１直　ＬｙＩＩ　ｋｍｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ 　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＶａＬ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌ）■ にｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｍ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　入ｒｇ　Ｌｅｕ　！ｉ＠　 Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ入ｒｇ　Ｖａｌ　Ｃ ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｍ＠ｔ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ａｍｐ　Ｖａｌ　Ｖ ａｌ　丁ｈｒ　Ｌｙｅ　Ｌａｕ　Ｐｒ。

Ｌａｕ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒ　Ｓ＠ｔ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　 Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｇ１ｎ６５フ０フＳ８０ Ａｒｇ　ＶＪＬＩ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：５のための情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：　１５１２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ講１１ＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗感作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体二〇型肝炎ウィルス （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　３０３−１−４ （ｉｘ）　特＠： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．１５１２ （ｘｉ）　配列の記１１１：　５ＥＩＩＩ　ＴＤ　ＮＯ：５ＧＡＧ　ＧＣＧ　Ｇ ＣＣＧＧＧ　ＣＧＡ　ＡＧＣｍ　ＧＣＧ　ＡにＧ　ＧＧＡ　ＴＣＡ　ＣＣＣＣＣ Ｃ丁ＣＴ　ＧＴＧ　ＧＣＣ２４０Ｇｌｕ　ＡＬａ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　入 ｒｇ　Ｌａｕ　入Ｌａ　入ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖ ａｌ　Ａ１ｍ６５　フＯ７５８０ ＡＧＣＴＣＣＴＣＧ　ＧＣＴ　ＡＣＣ（ＪＧ　ＣＴＡ　ＴＣＣＧＣＴ　ＣＣＡ　 ＴＣＴ　ＣＴＣＡＡＧ　ＧＣＡ　ＡＣ’Ｔ　ＴＧＣ２Ｂ８Ｂａｒ　Ｓｉｒ　Ｓｓ ＋ｒ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｂａｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｌ ｓｕ　Ｌｙｓ　入１＆　Ｔｈｒ　Ｃ１■ ＡＣＣＧＣＴＡＡＣＣＡＴ　ＧＡＣＴＣＣＣＣＴ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＧＡＧＣＴ ＣＡＴＡＧＡＧ　ＧＣＣ入ＡＣＣＴＣ３コロ丁ｈｒ　入１ａ　Ａｇｎ　Ｈｉｓ　 Ａ腐ｐ　５ａｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　入Ｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　工ｉｓ　Ｇｌｕ　 Ａｌａ　ｋｉｎ　Ｌ＊ｕ１ｏｏ　１０５　１１０ ＣＴＡ　ＴＧＧ　ＡＧＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＧＧＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣ 入ＣＣＡＧＧ　ＧＴ’Ｔ　ＧＡＧ　ＴＣＡ　ＣＡＡ　３８４Ｌｔｕ　Ｔｒｐ　Ａ ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｍｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｇｎ　Ｘ１ａ　Ｔｈｒ　Ａｒ ｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　ＧｌｕＡＡＣＡＡＡ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＡＴＴ　 ＣＴＧ　ＧＡＣＴＣＣＴＴＣＧＡＴ　ＣＣＧ　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＣＧ　ＧＡＧ　 ＧＡＧ　４３２人ｓｎ　Ｌｙｅ　ＶＪＬＩ　Ｖａｌ　Ｘ１ａ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　 ５釘　Ｐｈ＠　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ１コ ０　１３５　１４０ ＧＡＣＧＡＧ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ＡＴＣＴＣＣＧ’ｒＡ　ＣＣＣＧＣＡ　ＧＡＡ 　ＡＴＣＣＴＧ　ＣＧＧ　ｋＡＧ　ＴＣ’Ｔ　ＣＧＧ　４１P０ ＾ｓｐ　ＧＬｕ　Ａｒｇ　（Ｌｕ　！ｌ＠Ｓ＠ｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ＾１ａ　Ｇｌ ｕ　Ｉｌｅ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　５ｅｒ　ＡｒｇＡＧＡ　ＴＴＣＧＣＣＣ ＡＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＣＣＣＧＴＴ　ＴＧＧ　ＧＣＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＧＡＣ 丁入丁　入ＡＣＣＣＣ５２８＾ｒｇ　Ｐｈｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　ＡＬａ　ＴＡｕ 　Ｐｒｏ　ＶａＩ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　入ｍｎ 　Ｐｒ。

ＣＣＧ　ＣＴＡ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＡｃＧ　ＴＧＧ　入ＡＡ　ＡＡＧ　ＣＣＣＧ ＡＣＴＡＣＧＡＡ　ＣＣＡ　ＣＣ’Ｔ　ＧＴＧ　ＧＴＣ５７U Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　 Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＶａｌＣＡＴ　ＧＧＣＴｌ ：τ　ＣＣＧ　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　入ＡＧ　丁ＣＣＣＣＴ　ＣＣ Ｔ　ＧτＧＣＣτ　ＣＣＧ　ＣＣＴ　６Q４ ）ｕｓ　Ｇｌｙ　ＣｙｔＩ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｅ 　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＰｒB ＣＧＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　Ｃｃｅ　ｘｃｃ　ＧＴＧ　ＣＴＣＣＴＣＡＣＴ　ＧＡ Ａ　ＴＣＡ　ＡＣＣＣＴＡ　ＴＣＴ　ＡＣＴ　Ｇｅｅ　６７Q ＴＴＧ　ＧＣＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡ　ＡＧＣｍ　ＧＧＣＡＧＣＴ ＣＣ丁ＣＡ　ＡＣＴ　ＴＣＣＧＧＣ７２０Ｌａｕ　ＡＬａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａ Ｌａ　Ｔｈｒ　＾よ′ｇ　Ｓａｔ　Ｆ’ｈ＠　Ｇｌｙ　Ｓａｔ　Ｓｅｒ　Ｓ＠ｔ 　Ｔｈｒ　５瞠ｒ　Ｇ撃■ ２２５　２コ０　２３５　２４０ Ｇ？Ａ　Ａｃｅ　ＣＡＣＡＴＣＡＡ（：　ＴＣＣＧＴＧ　ＴＧＧ　ＡＡＡ　Ｇｋ ＣＣＴ’ｒ　Ｃ’！’Ｇ　Ｇｋｋ　Ｇ＾ＣＡＡτＧτＡ　１Q９６ ｋＣＡ　ＣＣＡ　ＡＴＡ　ＣＡＣＡＣ？　Ａｃｅ　ＡＴＣＡ’ｒＧ　ＧＣＴ　Ａ ＡＧ　入＾ＣＧＡＧ　ＧＴＴ　ｆｆ１ｃ　ＴＣＣＧＴＴ　１R４４ τｈｒ　Ｐｒｏ　ＸＬａ　Ｍｐ　Ｔｈｒτｈｒ　Ｘｌ−Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｌｙｓ 　Ａｓｎ　ＧＬｕ　Ｖａｌ　Ｐｈ電Ｃｙｍ　ＶａｌＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ｋ ＡＧ　ＧＧＩｆｆ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　ＣＧＴ　ＣＴＣ ＡＴＣＧＴＧ　ＴＴＣＣＣＣ１R９２ Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　ＬＹＩ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　 入１ａ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　ＩＩ＠　ＶＪＬＩ　Ｐｈ・　ＰｒB ＧｋＴ　ＣＴＧ　ＧＧＣＧＴＧ　ＣＧＣＧＴＧ　ＴＣＣＧＡＡ　ＡＡに　ＡＴＣ にＧＣＴ　ＴＴＣＴｋＣＧＡＣＧτＧＧＴτ　１４４゜Ａｓｐ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ 　ＶａＬ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ｅｙｓＧｌｕ　Ｌｙｅ　Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｌａｕ　 Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａ１ＡＣＣＡＡＧ　（”ＴＣＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧ ＴＧ＾ＴＧ　ＧＣＡ　ＡＧＣτｃｃτＡＣＧＧＡ　ＴＴＣＣＡＡ　ＴＡＣ１４８ ８Ｔｈｒ　Ｌｙｅ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ 　Ｓｅｒ　Ｓｉｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　ＴｙｒτＧＡ　Ｃ（Ｊ　 ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＣＩＪ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ｆｆｃ　１！＋１２ｓｉｒ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ｋｒｑ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ（２）　ＳＥＱ　Ｔｌ）　 ＮＯ：６のための情報二（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５０４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉ＋）分子の型ニブロチイン 入ｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　ｃｌｎ　入１ａＬ会ｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａ ｌａ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　ＡＩＩｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｒロ工ｉｓ　Ｔｈｒ　Ｃ １ｙ　Ａｓｐ　ＡＩ＋ｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒτｈｒ　Ｓｓｒ　Ｓｓｒ　Ｇｌｕ　Ｐ ｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｕｒ　ＧｌｙＶａｌ　Ｓ＠ｒ　Ｓａｒ　ＧＬｕ　入１ ａ　Ｍｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　λ−ｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ｅｙｓ　ｅｙｓ　Ｓａｒ 　Ｍｔ　５ａｒＳａｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＧＬｎ　Ａｘｑ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　Ｐ ｈｅ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯニアのための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４７７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数−二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｔ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗感作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体二Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）　１株：　ＣＤＣ （Ｃ）各個の分＊、ロドニイ （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　４０９−１−１　（ｃ−ａ）（ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　Ｃ［１Ｓ （Ｂ）位置：　１．．４７７ （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯニアＧＡＡ　ＴＴＣＣＧＣＡＣＧ 　ＣＣＣＧＣＣＧＡＧ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＣＴＴ　ＡＧＧ　ＣＴＡ　ＣＧＧ　Ｇ ＣＧ　ＴＡＣＡＴＧ　４８ＧＬｕ　Ｐｈ−人ｔｑ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇ ｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＶａＩ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｔｙｒ　Ｍ ｅｔＩ　Ｓ　１０　１ｓ ＡＡＣＡＣＴ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　ＣＣＣＧＴＧ　ＴＧＣＣＡＧ　にＡＣ ＧＧＡ　ＡＴτ　ＣＣＧ　ＴＧＣＣＣＧ　ＴＧＣ９６＾ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＸＬｇａ 　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　Ｐ＋”ｏ　Ｓ浮秩F ＡＣＣＡＣＣＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣＧＣＴ　ＴＴＴ　ＴＡＣＧＧＣＡＡＧ　Ｇ ＣＴ　ＡＴＣＣＣＣＣＴＣＧＡＡ　ＧＴＡ　１４４丁ｈｒ　Ｔｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇ Ｌｕ　ＸＬ・　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐ ｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｖａ１ｋＴｃ　ＡＡＧ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＡＧＡ　ＣＡ Ｔ　ＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴ　ＣＡＴ　丁ＣＡ　ＡＡＧ　ＡＪＧ　ＡＡＧ　Ｔ ＧＣ１９２ＸＬ＊　Ｌ、ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＨＬｍ　Ｌａｕ　Ｌｉ ＠Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓ＠ｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｖ　Ｌｙｓ　ＣｙｓＧＴＣＧ Ｔｔ：　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＡＣｅ　ＧｋＴ　ＧＣＣＣ’ｒＣＡＴＩＩ；　ＡＣｅ 　ＧＧＣ７１丁　ＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣ３コロｖａｌ　Ｖａｎ−Ｖａｌ＾Ｌ ａ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ＾ｌａ　Ｌａｕ　５ｅａｔτｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ 　ＧＬｙ＾−ｐ　Ｐｈ会１００　ＬＯ５ｌｌロ Ｓａｔニーｕ　ｌｖｐ　！’ｒｏ　Ｔｈｅ　Ｐｈ・　丁ｈｒ　ｕ＠　ＧＬ％ｌ　 Ｔｈｅ　工ｉｓ　Ｔｈｅ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ＧＬｎ　＾１ｐ↓コ０　１コ５　１ ４０ ＧＣｒ　ＧＴＣ”ｒｃｃ　ＣＧＣＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＸ；Ｔ　ＣＧＧ　ＧＧＣＡ ＧＯＡＣＴ　ＧＧＣＡｃＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣ４７７＾１１１　ＶＪＬＩ　！！＋ ＊ｒ　入ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　入ｒ９　人ｒｇ　Ｇｌｙ　入ｔ９　Ｔｈｅ　Ｇ ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：８のための情報： （１）配列の特＠： （Ａ）長さ：１５９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記１！：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：８Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　入ｒ９　 丁ｈｒ　Ｐｒ口　ＡＬａ　ＧＬＬＩ　Ｔｈｒ　丁ｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌａｕ 　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｔｙｒ　Ｍｅ■ ｌ　Ｓ　１０　１ｓ Ａｓｎ　Ｔｈｅ　Ｐｒ口　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｍ　にｉｎ　 Ａｓｐ　ＧＬｙ　工１＠　Ｐｒｏ　Ｓｕｒ　Ｐｒｏ　５ｅｔ２ｏ　２５　コ０ Ｔｈｒτｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠ｔｙｒ　０１ＹＬＹＩ 　ＡＬａ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌコ５　４０　４５ ＾１ｍ　Ｖａｌ　５ｔｒｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ 　Ａｒｇ　丁ｈｒ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ＰＭ＋４Ｓ　１５０　１ｓｓ （２）　ＳＥＱ　Ｉ［ｌ　ＮＯ：９のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５５８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　Ｈの数−二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｊｉ）分子の型：　ｃＯＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｆ　ｉ）仮説：無し くνｌ）起源： （Ａ）生物体；Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　４０９−１−１　（ａｂｃ）（ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：１．５５８ （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：９１６５　１７０　１フ５ （２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１０のための情報：（ｉ）配列の特徴： （＾）長さ：１８６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記＠：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１０Ｐｈ＊　Ａｓｐ　Ｓａｒ　 Ｖａｌ　ＸＬ＊　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ａｇｎ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　八ｇｐＰｈ・　Ａｓｐ　Ｓ＠ｒ　Ｓ＠ｒ　Ｖａｌ　Ｌ ａｕ　Ｃ’ｙｍ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　入１ａ　Ｃ１ｙ　Ｃｙｓ　 Ａｌａ　Ｔｒ■ １４５　１５０　ｌｓｓ　１６０ ＴＹｒ　Ｇｌｕ　ｔａｕ　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　入１ａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　丁ｈｒ　 Ｖａｌ　入ｒｇＬｅｕ　入ｒｇ　ＡＬａ　Ｔｙｒ　Ｍ・ｔＡｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙ　Ｌ・ｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｗ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ（２）　５ＥＱ ＩＤＮＯ：１１のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝６５７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　＠ＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｆｖ）抗感作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体二Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）　８株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起Ｒ： （Ａ）クローン：　ＧＧＩ （ｉ　ｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．６４５ （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１１ＡＴＥ：　ＧＧＣＡｃＧ　 ＾＾丁　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＣＣ’Ｔ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＣＡＡＡ　 Ｃ０丁　入ＡＣＡＣＣ入ＡＣ４８Ｃｔ２Ｔ　ＣＧＣＣＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡＣＧＴ ＣＡＡＯＴ？ＣＣＣＧ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧ（、Ｔ　ｅＡＣＡＴＣＧＴＴ　ＧＧＩ 　９６〜〜Ｃ丁Ｃｏ　Ｎ４　Ａττ　ＧτＧ　丁ＡＣＧＡＧ　丁為＾τＡＧＧＧ Ａ丁　ｅｃ　６５）ＡｇＩ′Ｉｓ＠ｒ　Ｓ＠ｒ　！ｌ＠　ＶＪＬＩＴｙｒ　Ｇｌ ｕ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１２のための情報：（ｉ）配列の特？！！［： （Ａ）長さ：２１５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１２ａｓｔ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｎ　Ｌｙ−人ｔ ｑ　Ａ廖ｎ　丁ｈｒｘ纒ｎｌ　Ｓ　１０　１５ 人ｒｇ　入ｒｇ　ｌ１ｒｏ　Ｇｉｎ　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　Ｐｈ＊　Ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　工ｉｓ　Ｖａｌ　（Ｓ撃■ Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＬａｕＬ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＧＬｙ　Ｐ ｒｏ　Ａｒｇ　ｕｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　ＡｌａＴｈｒ　Ａｒｇ　ＬＹＩ Ｉ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　入ｒｇ　Ｏｌ ｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　ｌ’秩B Ｓｏ　５５　６０ Ｘ１＊　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ＡＬａ　＾ｒ９　人ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　 入ｒ９　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ６ｓ）Ｏ７５１１０ 丁ｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　ｆ’ｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ 　ＧＬｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ｔｒ■ Ｌ＊ｕ　Ｌａｕ　Ｓａｔ　Ｐｒｏ　ｌｒｇ　Ｇｕｙ　Ｓ＠ｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 ５＊ｒτｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏτｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒ。

ｉｏｏ　１０５　１１０ 人ｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓｓｒ　入ｒｇ　Ａｇｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　 Ｖａｌ　Ｘ１ａ　八ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ入ａｎ　ｓｓｒ　ｓ ｉｒ　工ｉｓ　Ｖａｌ　％ｒ　ＧＬｕ（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１３のため の情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６５７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　１１の数二二本鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｓ＋ＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗悪作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体＝Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉ　ｉ）　直接の起ｌｌ： （Ａ）クローン：　ＣａｐＡ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　Ｃ［１Ｓ （Ｂ）位置：　１．．６４５ （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　ｒ（ｌ　ＮＯ：ｌ３ＡＴに　ＣＱＧＣＡＣＧ 　ＡＡＴ　ＣＣＴ　＾Ａ＾　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＭＧ　ＡＡＣｋ＾ＡＣＧ 丁　入ＡＣＡｅｎＣＡＡＣ４８ＴＴＣｃＴＴ　ｃＴＧ　ＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣ ？　ｉｃ　ＴＴＧ　ｋＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣＣ００丁　ＴＣＯＧｅｅ　丁Ａｃ　５ ７６ＡＡＣＴＣＧ　ＡにＣＡＴＴ　ＧＷ　？ＡＣＧｋＧ　ＴＡＡＴＭ、ＧＧｋＴ 　ＣＣ６５７ＡＩｌｎ　Ｂａｒ　Ｓｕｒ　工１＠　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ２工 ０　２１５ （２）　ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：１４のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ；２１５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 Ｃ４ｊ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記１２：　ｓｅａ　ＩＩ）　ＮＯ：１４ｒｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒ ｐ　Ｐｒｏ　Ｌａｗ　Ｔｙｔ　Ｇｌｙ　ｘｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｉ　Ｇｌ ｙ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＴｒｐＳＳ　９０　９５ １８０　１１ｉ＋５　１９０ ａＬｎ　ＶａＬ　Ａｒｇ　Ａ＃ｎ　Ｂａｒτｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｗ　Ｔｙｒ　Ｈ Ｌｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ＾ａｎ　ａｓｐ　Ｃｙ＠　Ｐｒ。

ユ９５　２００　２０５ 人ｇｎ　Ｓ＠ｒ　５会ｒ　Ｉｌ＠　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ（２）　ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：１５のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４５３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍｌ？ＮＡ（ｉｆｉ）仮説：無し くｉｖ）抗感作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体＝Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起ｆｉ： （Ａ）クローン：　ＣＩＮＣ４５０ （ｉ　ｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　Ｃ［］５ （Ｂ）位置：　１．．４５０ （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５ＡＴＧ　ＧＧＣＡＣ＋ｌ； 　ＡＡＴ　００丁　入＾Ａ　００丁　ＣＡＣＡＡＧ　入＾ＧＡ＾ＣＡ＾ＡＣＧ丁 　＾＾ＣＡＣＣ入＾Ｃ４ＢＣＯＴ　ＣＧＣＣＣＡ　Ｃへ７３　ＧＡＣＣＴＣＡＡ Ｇ　ｆ丁ｃ　ＣＣＧ　ＧＯＴ　ＧＧＣＧＧＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣ０７丁　００丁　 ９６ＧＧＡ　０７丁　丁ＡＣＴＴＧ　ＴＴＧ　ＣＣＧ　ＣＧＣＡＧＧ　ＧＧＣＣ ＣＴ　ＡＧＡ　ＴｒＧ　００丁　ＣＴＧ　ＣＧＣＧＣＧ　１４４ｋｃＧ　ＡＧＡ 　入ＡＧ　ＡＣＴ　ＴＣＣＧＡＧ　ＣＧＧ　ＴＣＧ　ＣＭ　ＣＣＴ　ＣにＡ　Ｃ ＧＴ　ＡＣＡ　ＣＣＴ　Ｃ＾ＧＣＣτ　１９Q τｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙ−丁ｈｒ　５＊ｒ　Ｇｌｕ　入ｒｇ　Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　Ｐ ｒｏ　入ｘｑＧ工ｙ　Ａｒｇ　入ｒｑＧ工ｎ　Ｐｒ。

ＡτＣＣＣＣＡＡＧ　ＧＣＴ　ＣＧＴ　Ｃ（、Ｇ　ＣＣＣＧＡＧ　ＧＧＣＡＧＧ 　ＡＣＣＴＧＧＧＣＴ　ＣＡＧ　ＣＣＣＧＧＧ　２４０ＴＡＣＣＣ’ｒ　ＴＧＧ 　ＣＣＣＣＴＣＴＡＴ　ＧＧＣＡＡＴ　ＧＡＯＧＧＣＴＧＣＧＧＧ　ＴにＧ　Ｇ ＣＧ　ＧＧＡ　ＴＣＧ　２８８ＣＴＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＣＣＣＧＴ　ＧＧＣ７ ０丁　ＣＧＧ　ＣＣＴ　ＡＧＣＴＧＧ　ＧＧＣＣＣＣＡＣＡ　ＣＡＣＣＣＣ３３ ５Ｌ＊ｕ　Ｌａｕ　Ｓｓｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｃ１ｙ　Ｓｉｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ 　Ｓｉｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｍｐ　Ｐｒ。

ＣＧＧ　ＣＣ；Ｔ　ＡＧＧ　ＴＣＧ　ＣＧＣＭＴ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　Ｃ ＴＣＡＴＣＧＡＴ　ＡＣＣＣＴＴ　ＡＣＩＩ；　ＴＧＣ３８S ＧＧＣＴＴＣＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧ　ＴＡＣＡＴＡ　ＣＣＧ　ＣＴＣ ＧＴＣＧＧＣＧＣＣＣＣＴ　Ｃ’ｌゴ　４３２Ｇｌ：Ａ　ＧＧＣ０ＣＴＧＣＣ＾ ｃｃ　ａｃｃ　τＡｌｋ　４５３Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　＾１ａＡｒｑ　＾１ 蟲（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１６のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｆ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記＠：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１６（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎ Ｏ：１７のための情報：（ｉ）配列の特＠： （＾）長さ：３６０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＣＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮ＾（ｉｉｉ）仮説：無し くｉν）抗怒作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体：Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （νｉｉ）　直接の起′ａ： （Ａ）クローン：　ＣｌＮＣ３６０ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．３５７ （ｘｉ）　配列の記＠：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７ＣＯＴ　ＣＧＣＣＣＡ　Ｃ ＡＣＯＡＣＧＴＣＭＧ　Ｔ’ｒＣＣｃＧ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＧＴ　ＣＡＧ　ｋＴ ｃ　ＧＴＴ　ＣＣＴ　９６ＧｃＡ　ＣＴＴ　ＴＡＣＴＴＧ　ＴＴＧ　ＣＣＧ　Ｃ Ｃ；ＣＪｋＧＧ　ｃｃｃ　ＣＣＴ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＣＧＣＧ ＣＧ　P４４ ＡＣＧ　ｋＫｉｋ　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＴＣＣＣＡＧ　ｏＡ　ＴＣＣＣＡＡ　００ 丁　ＣＧＡ　ＣＧＴ　Ｍ；Ａ　ＣＧＴ　ＣＡＧ　ＣＣ’ｒ　P９２ ＴＡＣＣＣ’Ｔ　ＴＧＧ　ＣＣＣＣＴＣＴＡＴ　Ｇｃｅ　ｋＡＴ　ＧＡＧ　ＧＧ ＣＴＧＣＧＧＧ　丁ＧＧ　ＧＣＧ　ＧＧＡ　丁ＧＧ　２１３W Ｃ？ＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ｃｃｃ　ｃｃ丁　ＣＣＣ〒Ｃ丁　ＣＧＧ　ＣＣｒ　ＡＧ Ｃ丁０４：　ＧＧＣＣＣＣＡＣＡ　ＣＡＣ（：ＣＣ３３６Ｌ＊ｕ　Ｌａ５ｓ　Ｓ ａｔ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｓｒ　Ｔｒｐ　Ｇ ｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｍｐ　ｐｒB Ｚｏｏ　１０５　１１０ ＣＧＧ　ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＴＣＪＩ；　ＣＧＣＡＡＴ　ＴＴＧ　ＴＡＡ　３６０ ＾ｒ９　＾ｒ９　人ｒｑ　Ｓｉｒ　入ｒ９　＾ａｎ　Ｌ＠ｕ（２）　Ｓ［ｉｏ　 １０　ＮＯ：１８のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｔｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：１Ｂ丁ｈｒ　＾ｇｑ　ｚｙｓ　 Ｔｈｒ　Ｓ値ｒ　ＧＬｕ　Ａｒｇ　Ｓａｔ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　 Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

ｓｏ　ｓｓ　ｓ。

（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：１９のための情報：（ｉ）配列の特？！［＝ （Ａ）長さ：２７３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　１Ｍの数二二本鎖 （０）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）仮説：＃＃シ （ｉｖ）抗感作：無し くｖｉ）起源： （＾）生物体二〇型肝炎ウィルス ＣＢ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起−ａ： （Ａ）クローン：　ＣｌＮＣ２７０ （ｆ）　特徴； （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．２７０ （×１）配列の記１！：ＳεΩＩＤ　ＮＯ：１９ＴＡＣＣ（？　’ｌ’？Ｊ　Ｃ ＣＣＣテＣ丁Ａ丁　ＣＧＣＭテ　Ｇ＾ＧＧＧＣτＡＡ　２７コ（２）　ＳＥＱ　 Ｉｎ　ＮＯ：２０のための情報：（υ配列の特徴： （Ａ）長さ＝９０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （０）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　Ｉｌｌ　ＮＯ：２０ｘｓｔ　ＧＬｙ　Ｔｈｅ 　Ａｇｎ　１ｌｒｏ　ＬＹ＠　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｙｅ　Ｔ、ｙｍ　Ａｓｎ　Ｌ Ｙ＠　入ｒｑ　Ａｇｏ　Ｔｈｅ　＾Pｎ １５　１０　ｉｓ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　にｉｎ　ｋｊｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　Ｐｈ＊　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＸＬｍ　Ｖａｌ　ＧｌｙＧｌｙ　Ｖａｎ　？ ｙｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　入ｒ９　人ｒｇ　ＧＬｙ　Ｐｒｏ　入ｒｇ　Ｌ ａｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　入ｒｇ　Ａｌｌココ５　４０　４５ Ｔ？ｒ　入ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｂ＠ｒ　ＧＬｕ　Ａｒｇ　Ｓｕｒ　ＧＬｎ　 Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｃ１ｙ　＾ｒ９　人ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２１のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８３塩基対 （Ｂン型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ｃＤＰＩＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗感作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体：Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　Ｃ１００ＮＣ２７０（ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．１８Ｑ （ｘｉ）　配列の記１！：　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：２１（２）　ＳＥ口ＴＤ　Ｎ Ｏ：２２のための情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：６０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記［：　ＳＥ［ｌ　ＩＩＩ　ＮＯ：２２（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ＝２７０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　＊の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二車鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ■ＲＮＡ（ｉｉｔ）仮説：無し くｉｖ）抗惑作：無し （ｖｉ）起１！ｌ： （Ａ）生物体二Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）　１１株：　Ｃ［１Ｃ （ｖＨ）　直接の起Ｓ： （＾）クローン：　Ｃ１００ＮＣ３６０（ｉｘ）　特徴； （Ａ）名称／記号：　Ｃ０５ （Ｂ）位ｉｌｌ：　１．．２６７ （ｘｉ）　配列の記Ｈ：　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：２３ＧＡＣＣＣＣＣＧＧ　ｅＧ Ｔ　＾ＧＧ　ＴＣＧ　ＣＧＣｋＡＴ　ＴＴＧ　？ＡＡ　２７０Ａｓｐ　Ｐｒｏ＾ ｒ９　ｋｒｑ　ｋｒｑ　Ｓ＠ｒ　Ａ１９　Ａｓｎ　Ｌｓｕ（２）　ＳＦ！Ｑ　１ ０　ＮＯ：２４のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記＠：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２４（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｗ Ｏ：２５のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　１０６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　［の数二二本鎖 （０）トポロジー：直鎖状 ）　（ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説；無し くｉｖ）抗感作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体：Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　ＣｌＮＣ１０５ （ｉｘ）　特＠： （Ａ）名称／記号：　Ｃ０５ （Ｂ）位置：　１．．１０５ （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２５ＧＧＡ　Ｇ’！’Ｔ　ＴＴＡ 　＾　ユ。６Ｇｌｙ　Ｖｉｌ　Ｌ＠ｕ （２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：２６のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型；プロティン （ｘｉ）　配列の記＠：　５Ｅ’口ｒＤ　ＮＯ：２６Ｇｌｙ　ＶａＬ　Ｌｓｕ Ｓ 配列表 （１）　一般情報： （ｉ）出願人：　レイニス、グレゴリイシモンセン、クリスチャン　シー （ｉｉ）発明の名称＝Ｃ型肝炎ウィルスエピトープ（ｉｉｉ）配列番号＝２６ （ｉ　ｖ）通信住所： （Ａ）受信人：ビータ−ジェイ　デーリンガ−（Ｂ）　ｍ区：３５０ケンブリツ ジ　アベニエ〜、スート１００（Ｃ）市：バロ　アルド （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：　９４３０６ （Ｖ）コンピュータ読み取り形式： （Ａ）媒体型：フロッピィディスク （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＮ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）操作システム：　ＰＣ −ＤＯ３／正−０ＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン　レリース＃１．（１ ，バージョンＪ１１．２５（ｖｉ）Ｉｉｔ行出願データ： （Ａ）出願番号； （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類； （ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：　ＩＪＳ　５（１５，６１１（Ｂン出願日：　０６−ＡＰＲ− １９９０（ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：　Ｕ５５９４．８５４（Ｂ）出願日：　０９−ＧＣＩ−１９９ ０（νｊｉｉ）代理人情報： （＾）名前：ファビアン、ガリイ　アール（Ｂ）登録番号：　３３，８７５ （Ｃ）参照／認可番号：　４６００−０７６．２１（ｉｘ）通信情報： （＾）電話：　（４１５）　３２３−８３０２（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１ のための情報：０）配列の特徴； （Ａ）長さ：５６１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎮 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉ　り分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　＊ＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗感作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体二〇型肝炎ウィルス （Ｂ）　！ｉｒ株：　ＣＤＣ （ｖｉ　ｉ）　直接の起Ｉｌ［： （Ａ）クローン：　３０４−１２−１ （ｉｘ）　特＠： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．５６１ （ｘｉ）　配列の記ｉｆ！：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ＩＣＡＡ　′！？ｃ　ｃｒ ｃ　ｅｒａ　ｅＡＡ　ａｃＣ丁ｃｃ　入ＡＧ　丁ｃｃ　入ＡＧ　入＾＾　Ａｃｅ 　ＧＣＡ　入丁ＣＧＧＯ７丁（４Ｂｆｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｖ龜Ｉ　Ｇｉｎ　 入１直　τｒｐ　ＬＹ−Ｓａｔ　Ｌｙｅ　Ｌｙ−丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｇｌ ｙ　Ｐｈ＠ＣＧ？　ｋｃＱ　Ｃａｂ；　ＧＡＩ；　ＧＣＡ　Ａ？ｅ　Ｔ’Ｍ：　 ＣｊｌＪＬ　ＴＣＩ　ＴＵＴ　（ＳＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣｅＡＡ　ＧbＣ）４ ４ 人ｒ９　テｈｒＧλｕ　ＯＬｕ　Ｊｕａ　工ｉｓ　テＹｔ　ＧＬｎ　ＣＹｍ　Ｃ ７−入ｔｐＬｗａ　入ｇｐ　ｌ１ｒｏ　Ｇｉｎ　入１１コＳ　４０　４％ ｍｅＧＷＧＣＣＡ丁Ｃ＾＾ｃＩＣＣｃ丁Ｃ＾ＣＣＧＭＡＭ−ＯＣ丁丁τ入丁ζＴ テｃｃｃｃｃｃｃｃτ１９２人ｒｇ　Ｖａｎ　ＡＬａ　ＸＬｍ　Ｌ、ｙｍ　Ｓａ ｔ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｏｌｕ　入ｒｇＬｅｕ　↑ｙｒＶ龜Ｉ　Ｇｌｙ　Ｇｋｙ　 ｉ’ｒ口Ｓｏ　５５　６０ １：？Ｔ　Ａｃｔ：　ＡＡτ　丁ｅＡ　Ａ５ｃ　ＧＧＣＧＡＧ　ＡＡｅ　？ｃｅ 　ＧＧＣＴｋＴ　Ｃｒ３ＣＡＧＧ　ＴＧＣ２ＣＧＣＩ：　２S０ Ｌ−ν　Ｔｈｒ　＾ｘｎ　ｊａｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　（ｌｕ　入＃ｎ　ｅｒａ　 ＧＬｙ　テｙｒ　入ｒ９＾Ｑ　（Ｙ＠　Ｍ９　人１畠６Ｓ　〕Ｏフ５　１０ 真ＧＣＧＣＣＧ？Ａ　ｅｉＧ　入Ｃλ　＾Ｃ丁　為ＧＣＴσ丁　ＧＣＴ　入＾Ｃ 入ＣＣＣ丁ＣＡＣ〒　丁ａｅ　τ入ＣＡτＣ２８８ｒｊ＊ｒ　Ｇｌｙ　ＶａＩ　 Ｌａ＋ａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｔ　ｅｙｅ　Ｇｌｙ　Ａ＊ｎ　丁ｈｒ　Ｌａｕ 　Ｔｈｒ　ｅｙｓ　丁ｙｒ　！堰B ＪｋＡＧ　ＧＣＣＣｔｄ５　ＧＣＡ　ＧＣＣテｅｒ　ＯＪ　ＯＣＣ（：ＣＡ　Ｇ ｃａ　ＣＴＣａｘ　ａｘＣＴＣＣＡｃｔ：　ＡＴ’Ｃｉ　コR６ Ｌｙｓ　１１８　＾ｒｇＪＬＬ畠　Ａｌａ　ｅｙｅ　＾ｒ９　人五ａｋ工ａ　Ｃ Ｌｙ　Ｌａｕ　ＧＬｎ　入ｘｐ　ｅｙｓ　丁ｈｒ　ＭＥｚｏｏ　１ｏｓ　工１゜ Ｃｚ　（：ＴＯＭ丁　ａａＣＧＡｅ　ＧＮ：　？丁Ａ　ＣＴＣ６丁丁　入！Ｍ丁 　ＧＡＡ　＾（：ＣＧＷ　ＧＧＧ　０ｒｏ　３８４ｊＪｕ　ＶａＩ　Ｃｙｓ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｐ　ｊｖｉｐ　Ｌ＃ＩＩ　Ｖａｌ　Ｖａｎ　ＸＬｍ　ＣＹｍ　ＱＬｕ 　Ｓｓｒ　ＡＬａ　Ｇｉｙ　Ｖ≠■ 工！Ｓ　１２０　Ｌ２５ ＣＭ、ＧＡＩ５　Ｇｌｄ：　ＧＣＧ　ＧｃＧ　ｋＱｃ　ＣＴＧ　ＮＪ　ＧＣＣＴ ＴＣｋｃＤ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＡτＧ　ＡＣＣｋＱＣ４３２ＩＪＪ　ＧＬｕ　ｊ ｕｐ　ｊｕａ　入↓１１　５ＩＩｒ　Ｌｅｕ　＾ｒ９　人↓ａｓｈ−Ｔｈｒ　Ｇ Ｌｕ　ｘｌａ　Ｎｅｔ　Ｔｈｒ　＾ｒ９１コ０１コ５１４０ 丁入ｅ　ＴＣ：ＣＧＣｔ：　（：ｅｌ：　ｅｃｃ　ＧＧＣＣ，入ＣＣＣＣＣＪ： ：＾　Ｃ＾＾　Ｃ’ｅＡＧλ＾　τＡＣＧＡｅ　ＴＴＣＧｋ戟G　４１１０ ？ｙｒ　Ｓｓｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒ口　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　 Ｇｉｎ　Ｐｔｏ　Ｇｌｕ　Ｔｙｔ　Ａｓｐ　Ｌ會ｕ　ＧＬｕＣ？ｅ　Ａ？Ａ　Ａ （Ｊ　ＴＣＡ　πＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＧＴｃ、ＴＣＡ　Ｃ：ＴＣＧＣＣＣＪｋ ＣＧＡＣＧＣＣＣＣブ　５２１１Ｌ＠ｕ　工１書　Ｔｈｒ　ｊａｒ　＋’ｙｓ　 ５ＩＩｒ　ｓｉｒ　Ａｊｎ　ＶＪＬＩ　＄＠ｒ　Ｖａｎ　入１蟲　Ｒｉｇ　入ｍ ｐ　Ｇｌｙ　`１１　 １６％　！７０　１７Ｓ ｃａａ　ＡＡＣＡＧＧ　Ｇ？Ｃτに丁Ａｅ　ＣＴＣＡｅｅ　（！　ＧＡＡ　’ｆ ｆｅ　５６ｉＧｌｙ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　ＶａＩ　Ｔｙｔ　Ｔｙｔ　Ｌａｗ　Ｔｈ ｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐｈ・（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のための情報：（ ＋）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記１ｍ：　５１！Ｑ　Ｉｎ　ＮＯ：２ＧＬｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ 　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　入１蟲　丁ｒｐ　ＬｙＩ＋　！＠ｒ　Ｌｙｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈ ｒ　Ｐｒｃｌ　Ｍａｃ　Ｃ１ｙ　Ｐ■■ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　Ｉの数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の型二ｃＤＮＡ　ｔｏ禦ＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗悪作：無し くｖｌ）起源： （Ａ）生物体：肝炎１１ＣＶウイルス （Ｂ）　ｉ１株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　３０３−１−４ （ｔｘ）　特＠： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．２５２ （ｘｉ）　配列の記載：　Ｓｔ！０１０　ＮＯ：３寡鍔ｆｆＧＡＡπＣＣ２５ ２Ａｒ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　ｉ’ｈａ （２）　ＳＥＱ　ＩＩ）　ＮＯ：４のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二８４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉ　＋）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ ：５のための情報：（＋）配列の特＠： （Ａ）長さ：　１５１２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｆ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｗＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗怒作二無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体二Ｃ型肝炎ウィルス （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　３０３−１−４ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．１５１２ （ｘｉ）配列の記ｌｉｊ：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：５（ｘｉ）　ｓｚｇｔ＋ｚｓ ｃｚ　ｏｔｓｃｘｘｐｒｘｏｓ：　５ＥＱ　ＺＤ　ＮＯ＋５＋ＣＣＣＴＧＣＡＡ Ｇ　ＣＣＣｒｒＧ　ｃＴＧ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ＧｋＧ　ＧＴｋ　ＴＣＡ　ＴＴＣ ＡＣＡ　にＴＡ　ＧＯＡ　（：’ｒｅ　９U Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｙ＠Ｐｒｏ　Ｌｍｕ　Ｌｍｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖ ａｌ　Ｓａｔ　Ｐｈ＊　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌ・Ｕ３Ｏ２５３０ ＣＡＣＧ＾Ａ　ＴＡｅ　ＣＣＧ　ＧＴＡ　ＧＧｅ；　丁Ｃ１：ＣＡ＾　ττＡ　 ００丁　πＣａ＾Ｇ　ＣＣＣＧＡ＾　ＣＣＧ　Ｇλτ　１４S Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　？ｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｓｒ　Ｇｉｎ　！、ａｕ 　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　＾ｇ■ ＣＡＴに　ＧＣＣＧＴＧ　ＴＴＣＡｃｔ：　ＴＣＣＡ′１″ｃ　ｌ：Ｔｃ　ＡＣ ？　ＣＡＴ　ＣＣＣＴＣＣＣＡＴ　ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＧＯＡ@１９２ Ｖａｌ　入１ｍ　Ｖａｌ　Ｌ＠ｕ　τｈｘ　５＠ｒ　Ｍ＠ｔ　Ｌｍｕ　丁ｈｒ　 ＾ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　＋４ｉｓ　ＸＬ鐙　τｈｘ　入１■ Ｓｏ　５５　６０ ＧＡＧ　にＣＧ　ＧＣＣＧＧＧ　ＣＧ＾　入ＧＧ　ＴＴＧ　ＧＣＧ　ＮＡＧ　Ｇ ＯＡ　ＴＣＡ　ＣＣＣＣＣＣＴＣＴ　ＧＴＧ　ＧＣＣ２４０Ｇｌｕ　Ａ１１　人 １ａ　Ｇｌｙ　＾ｒ９人ｒ９　Ｌｍｕ　＾１ａ　入ｒｇ　にＡｙ　Ｓｉｒ　ｌ’ ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　Ｖａｌ　＾１１丁ＣＡ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ｃＡｌ：Ｉ　 ＣＩＪ　ＧＴτ　Ｇ＾＾　ττＣ１５１２Ｉａａｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　 Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　Ｉ’ｈｓ（２）　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：６のための情 報：（＋）配列の特＠： （Ａ）長さ：５０４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：６Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　丁 ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　入ｒｇ　Ｌａｕ　Ｈｉｓ　入 ｒｑ　Ｐｈａ　入Ｌａ　Ｐｒ。

ユ５１０１５ Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　入ｒｇ　（：ｌｕ　Ｇｌｕ 　Ｖａｌ　Ｓ＠ｔ　ＰＭ　入ｒｇ　Ｖａｌ　Ｃ１ｙ　Ｌ口ｕＨｉｓ　ＧＬｕ　Ｔ ｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　にｌｙ　Ｓ＠ｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇ ｌｕ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　ＡｓｐコＳ　４０　４５ Ｖａｌ　Ａ工ｍ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　５ｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ｈｉｓ　！Ｌａ　Ｔｈｒ　＾１１＋＋−１１！＋＋　 ｅＪｊＦ　＋’：ｌｔｔ　１１１１　＆−１’ｌ　入１ａ　（Ｊｕ　Ａｇｅ　Ｖ ａｌ　ＶＪＩＩ　ＣＶｇ　Ｃｙｓ　Ｓ・秩@８・ｔＳ・ｒ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアのための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４７７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｔｖ）抗惑作：無し くｖｊ）起ｆｌ： （Ａ）生物体二Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　Ｃ０Ｃ （Ｃ）各個の分ｊｉｌ＝　ロドニイ （ｖｉ　ｉ）　直接の起源： （・Ａ）クローン：　４０９−１−１　（ｃ−ａ）（ｉｘ）　特＠： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．４７７ （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：７（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ ：８のための情報：（＋）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：８＾ａｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇ Ｌｙ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｍ　にｌｒ、Ａｍｐ　Ｇａｙ　Ｉｌｅ　Ｐ ｒｏ　５＊ｒ　Ｐｒｏ　５鐙ｒ２ｏ　２５　３０ 丁ｈｒ　ＴＭ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌ＠　Ｐｒｏ　Ｐｈｓ　Ｔｙｒ　Ｏｌｙ　Ｌ ｙｓ　Ａｌａ　ｆニー　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌコ５　４０　４５ ＸＬ＠　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ　Ｇｕｙ　Ａｒｇ　ｉｔｓ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｐｈｓ　 Ｃｙｇ　１ｌｉｓ　Ｓａｔ　ＬＹ麿ＴＹ＠　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ１ユ５　１２０　１ ２５ ｍａｒ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｈｓ　Ｔｈｒ　工１＠　Ｇｌｕ　 丁ｈｒ　Ｉｌｅ　丁ｈｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇ工ｎＡ虐Ｐｉａ　Ｖａｌ　５＊ｒ 　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　入ｒｇ　Ｃ１ｙ　入ｒ９　丁ｈｒ　（ｌｙ 　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐ＋１＠１４５　１ｓｏ　１ｓｓ （２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：９　（７）ための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５５８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　１Ｎの数−二本鎖 （Ｄ）トポロジー二車鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃｒＪＮＡ　ｔｏ　ｄＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体二Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　４０９−１−１　（ａｂｃ）（］Ｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．５５８ （ｘｉ）　配列の記＠：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：９ＧＴＡ　ＡＴＣｋｋＧ　ＣＣ Ｇ　ＧＧＧ　ＡＧＡ　ＣＡＴ　＋：？Ｃ入τｅ　ｉｃ　ｉＴ　ＣＡＴ　τＣ＾　 入＾Ｇ　ＡＡＩＩ；　ｋＡに　X６ ａｃｅ　ＴへＣ丁入ｃ　ａｃｅ　ｃｃテ　０７丁　ＧＡ（：　０丁に　ＴＣＣ： 　ＣＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣ（、Ｓｅ　Ｇ入丁　１９Q Ａｌａ　ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　（ｆｌｙ　Ｌｅｕ　ｋｍｐ　ｖａｌ　ｊａｒ 　Ｖａｌ　工１＊　ｆｌｒｏ　Ｔｈｒ　５ａｒ　Ｇｌｙ　入IＰ Ｇ？？　ＣＴＣＣ；ＴＣＧＴＧ　ＧＣＡ　Ａｃｅ　ＣＡＴ　ＧＣＣＣＴＣＡＴＣ Ａｃｅ　ＧＧｅ　？Ａ？　Ａ（：ＣＧＧＣＧＡＣ２４０ＴＴＣＧＡＣＴＣＣＧＴ Ｇ　Ａ丁＾　ＧｋＣＴＧＣＡＡ？　Ａｃｃ　ＴＣ；Ｔ　ＣＴＣＡｃｅ　（ＪＧ　 Ａ（Ｊ　にＴＣＧＡ７　２１１８ＧＡＴ　ＧＣ？　ｅｉＴｃ　ＴＣＣＣＧＣＡＣ Ｔ　ＣＡＡ　ＣＯ？　ＣＧＧ　ＣＣＣＭＵＧ　ＡＣＴ　ＧＧＣｋＧＧ　ＧＧＧ　 ｋｋＧ　３８S ？ｒＣＧＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣ（：Ｔ（：　ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＴＧＣ丁Ａ丁　 ＯＡ（：　ＧＣＡ　ＧＧｃ　丁Ｃ丁　ＧＣτ　丁Ｇに　４１P０ ？ＡＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＡｃｅ　ＣＣＣＧｅｅ　ＯＡＩ；　ＡｃＴ　入ＣＡ　Ｇ ＴＴ　ＡＧＧ　Ｃ’ＴＡ　Ｃｌ２Ａ　ＣＣＧ　丁ＡＣＡ丁Ｇ@５２８ ＡＡＣＡＣＣＣＣＧ　Ｇｌｌ；Ｉ：　Ｃ？’Ｔ　（：（：ＣＧＴ’Ｇ　’Ｉ’Ｇ ＣＣＡＧ　にＡＣ５５８Ａｓｎ　Ｔｈｘ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ　！’ｒｏ　 Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐユ８０　ユ８５ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１０のための情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：１８６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）配列の記＠：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１０Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｃ １ｙ　Ｇｌｕ　工ｌ＠　Ｐｒｏ　Ｐｈｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ＾ｌａ　ｉｔ ｓ　Ｐｒｏ　Ｌｍｕ　Ｇｌｕ＾１ａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　入ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ 　Ａｍｐ　Ｖａｌ　５＊ｒ　ＶＪＬＩ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　丁ｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌ ｙ　λｇ■ ｔｈ＠　＠ａｆ　Ｌａｕ　Ａｍｐ　Ｐｔｏ　Ｔｈｒ　Ｐｈｓ　Ｔｈｅ　工ｌｅｅ 　Ｇｌｕ　Ｔｈｅ　１工ｍ　Ｔｈｅ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉ■ ＾ｓｐ　ＡＬｍ　Ｖｍｌ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｔｈｅ　ＧＬｎ　入ｔ９　Ａｒｇ　 Ｏｌｙ　Ａｒｇ　丁ｈｒ　ｅｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ＬｙｍエエＳ　工２０　１ ２ｓ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｘ工ｍ　？ｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　ＶａＬ　Ａ１１ｌ　Ｄｅｃ ｓ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｕ　Ａｒｇ　Ｐｒａ　ｍａｒ　Ｇｌｙ　Ｍ■■ ｐｈｍ　Ａｍｐ　ｊａｒ　ｍａｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　（’Ｙ＠　ＧＬｕ　Ｃｙａ 　ＴＹｒ　Ａ１１ｐ　入１ａ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａ１蟲　丁窒■ １４５　工Ｓｏ　１５％　１６０ 人闘　Ｔｈｅ　Ｐｒｏ　Ｏｌｙ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｖ＆Ｘ　ｅｙｓ　Ｇｉｎ　Ａ ｍｐ（２）　ＳＲＱ　ｒＤ　ＮＯ：１１のための情報：（ｉ）配列の特ｒ＆： （Ａ）長さ二６５７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ”）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二車鎖状 （１１）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）仮説：無し くｉｖ）抗悪作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体二Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　Ｃ０Ｃ （ｖｉ　ｉ）　直接の起ａ： （Ａ）クローン：　ＧＧＩ （ｉｘ）　特＠： （Ａ）名称／記号：　Ｃ０５ （Ｂ）位置：　１．．６５７ （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１ＧＧ（：　ＧＴＧ　ＡＡＣ ＴＡＴ　Ｇ（Ｊ　入ＣＡＧＧＧ　入ＡＣ（Ｐｒ　ＣＣ：τ　ｃｃ丁　ＴＣＣ丁Ｃ 丁　ττＣ７０丁　入τＣ５２８’！”ｌ’ｃ　ＣＴｒ　Ｃｉ　ＧＣＣＣ丁ｃｃ τＣ丁Ｃτ　ＴＣＣＴｍ　ＡＣＴ　ＧＴＩ：　ＣｅＣＧＣＴ　ＴＣＣＧＣＣＴＡ Ｃ５７６Ｐｈ＠　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｌ・ｕ　Ｌａｕ　Ｓｉｒ　Ｃｙｍ　 Ｌａｕ　Ｔｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　入Ｌａ　５ｅｒ　ＡＬａ　？ｙｒ１８０　Ｘ ａＳ　ユ９０ α＾＾　ＧＴＧ　ＣＧＣ入ＡＣＴＣＣ＾ＣＧ　ＧＧＧ　Ｃ］１゛　ＴＡＣＣＡＣ ｃ丁Ｃ入ｃｃ　入Ａτ　Ｇへ丁　丁にＣＣＣτ　６２４Ｇｉｎ　Ｖａｌ　入ｒ９ 　Ａｇｎ　５＊ｒ　Ｔｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　？ｙｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　丁ｈｒ 　＾釘　Ａｍｐ　Ｃｙｓ　Ｐｒ。

＾ＡＣＴＣＩＩｉ　八〇ＣＲＴＴ　０丁に　ＴＡＣＧ＾Ｇ　τ入＾　丁ＡＧ　Ｇ ＩＧＡ　ＴＣＣ６５７Ｍｎ５＊ｒＳ＠ｒ工１ｍＶａｌフ）邑ｒ（：ｌｕ＠＊Ｇｌ ｙＳ＊ｒ２ユ０　２１５ （２）　５Ｅ（１１０ＮＯ：１２のための情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ＝２１９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１２？ｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　Ｌａｕ　？ｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＧＬｕ　Ｃ１ｙ　Ｃｙａ　Ｃ１ｙ　 Ｔｒｐ　入Ｌａ　Ｃ１ｙ　ＴｒｐＬｅｕ　Ｌａｕ　５＠ｒ　Ｐｒｏ　入ｒｇ　Ｇ Ｌｙ　ｍａｒ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　５ｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｉ’ｒｏ　Ｔｈｒ　 入ｓｐ　ＰｒB 入ｒ９　人ｒ９　人ｒｇ　Ｓａｔ　入ｒｑ　人−ｎ　Ｌ、＊ｕ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｍ 　Ｖａｌ　エエ＊　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｓｕ　Ｔｈｅ　Ｃ：凾■ Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　入１１　Ａｍｐ　Ｌａｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　？ｙｒ　工Ｌｅ　 Ｐ’ｒｏ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａ１鳳　Ｐｒ口　Ｌａ■ Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｇｎ　ｔｙｒ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｙ　Ａｇｎ　Ｌｓｕ　 ｌｒｏ　Ｃ１ｙ　Ｃｙｓ　Ｓ信ｒ　Ｐｈｅ　Ｓｉｒ　１工１Ｐｈｓ　Ｌａｕ　Ｌ ａｕ　入１ａ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｅ　Ｖａｌ　Ｐ ｒｏ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　入↓ａ　ＱｒＧ工ｎ　Ｖａｌ　入ｒ９　人ａｎ　５＊ｒ 　Ｔｈｒ　ＧＬＹ　Ｌａｕ　？ｙｒ　Ｈｉｍ　Ｖａｌ　Ｔｈｅ　Ａｇｎ　八＠Ｐ 　（ｙｌｌ　ＰｒB ＾纒ｎ　Ｓａｔ　Ｓｅｒ　！ｉｓ　ＶａＬ　ｆｙｒ　ＧＬｕ　脅＊　Ｇｌｙ　５ ｅｒ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１３のための情ｇ＠：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６５７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　Ｈの数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　５ＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉい抗感作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体二〇型肝炎ウイルス （Ｂ）　Ｅ１株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　ＣａｐＡ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　Ｃ０５ （Ｂ）位置：　１．．６５７ （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１３（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎ Ｏ：１４のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二車鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン ゛（ｘｉ）　配列の記載：　５Ｅ１１１０　ＮＯ：１４Ａｓｎ５＊ｒＳｉｒ工λ ＠Ｖａｌ？ｙｒＧｌｕ・会Ｇｌｙｍａｒ２１Ｑ　２１５ （２）　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：１５のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４５３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　ｔｉｔＯ数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮ＾（ｉｉ　ｉ）仮説：無し くｉｖ）抗怒作：無し くｖｉ）起源： （Ａ）生物体二Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起源二 （Ａ）クローン：　ＣｌＮＣ４５０ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．４５３ ＧＧＴ　ＣＧＣＣＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡＣＧ丁ＣｋｋＧ　ＴＴＣＣ（ｉ　ＧＧＴ　 ＧＧｅ　ＧＧＴ　Ｃ＾ＧＡ丁ＣＧτ丁　０１２丁　９６ＡｅＣＡＧＡ　ＡＡＧ　 ｋｃ丁　丁ＣＣＧ＾Ｇ　ＣＧＧ　ＴＣＧ　ＣＡＡ　ＣＣ？　ＣＣ：Ａ　００丁　 入ＧＡ　ｌ：ｌ：丁　ａｘｅ　ｃｃ噤@上９２ （２）　ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：１６のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１５０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記ｉａｉ：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１６１ａｕ　Ｌｓｕ　Ｂａ ｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｕｙ　Ｓｅｘ　八ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　丁ｒｐ　Ｃ１ ｙ　Ｐｒｏ　丁ｈｒ　＾ｍｐ　Ｐｒロ１コ０１３５１４０ Ｃ１ｙ　ｅｌｙ　入１畠　＾１ａ　Ａｒｇ　Ａｉｍユ４５　１５０ （２）　５ＥＱＩＤＮＯ：１７のための情報：（・ｉ’）配列の特＠： （Ａ）長さ＝３６０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （ロ）トポロジー二車鎮状 （１１）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ＭＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗怒作：無し くｖｉ）起ａ： （Ａ）生物体二Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （νｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　ＣｌＮＣ３６０ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．３６０ （ｘｉ）　配列の記［：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１７Ａ？Ｇ　ＧＧＣＡＣＧ　Ａ ＡＴ　Ｃ：ＣＴ　ＡＡＩＩＩ　ＣＴｒ　（ＪＧ　入Ｍ　ＭＧ　ＡＡＣＡＡＡ　０ ０丁　ＡＡＣＡｃＣ入ＡＣ４８０ＧＡ　ＣＴ？　ＴＡＣ’！’Ｔ′ｃ　ＴＴＧ　 ＣＣＣＣ１：ＣｋＧＧ　Ｃ；ＧＣＣＣＴ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　Ｃ ＧＣＧＣＧ@１４４ ＣＴＣＣＴＧ　ＴＣＴ　Ｉｌ：ＣＣＣＣＴ　ＧＣ＋ＣＴＣＴ　ｃｆＡ　ＣＣＴ　 ＡＧＣ＄　ｇｃ　ＣＣＣＡＣＡ　Ｇ入ＣＣＣ＝　＝コロＬａｕ　Ｌａｕ　５＠ｒ 　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　にｅｌｙ　５ｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　５ａｒ　Ｔｒｐ　Ｓｌ ｙ　Ｐｒｏτｈｒ＾卯Ｐｒ口ＣＧＧ　ＣＯＴ　ＡＧＧ　Ｔ（Ｘ；　ＣＧＣｊＬＡ Ｔ　ＴＴＧ　ＴＡ　コロＣＡｒｇ　Ｍｇ　Ａｒｇ　Ｓａｔ　Ａｒｇ＾−ｎ　Ｌａ ｕ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１８のための情報：（１）配列の特徴； （Ａ）長さ：１１９アミノ酸 （８）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型・プロティン （ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１８τｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙ薯　 〒ｈｒ　５４Ｉｒ　Ｃ１ｕ　入ｒｇ　Ｓｉｒ　ＧＬｎ　Ｐｒｏ　入ｒｇ　Ｇｌｙ 　＾ｒ９　八ｒｇ　ＧＬｎ　ＰｒB Ｓｏ　５５　６０ Ｌ鈎　Ｌａｕ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒ口　入ｒｇ　にｌγ　Ｓ＠ｒ　Ｍ９　Ｐｒｏ　５Ｉ Ｉｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　τｈｒ　＾ｓｐ　Ｐｒ。

）００　１ｏｓ　ｕ口 Ａｒｇ　ＡＪ＋ｑ　ｋｒｑ　Ｍａｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎシ川（用）　ＳＥＱ　１０ 　ＮＯ：１９ノための情報：、（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ；２７３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗感作：無し くｖｉ）起＃： （Ａ）生物体二〇型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （Ｖ口）　直接の起ａ： （＾）クローン：　ＣｌＮＣ２７０ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　Ｃ０５ （Ｂ）位ｚ：　１．．２７３ （ｘｉ）　配列の記＠：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎ Ｏ：２０のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記＠：　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：２０ＴＩ′Ｌｒ　入ｒｇ　Ｌｙ ｍ　丁ｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｃ１ｕ　入ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　入ｒｇ　Ｇｌ ｙ　λｒ９　人ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐ秩B Ｓｏ　、　５５　６０ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２１のための情報：（ｉ）配列の特徴： ゛（Ａ）長さ：１８３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　ｉｉの数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｗＲＮＡ（ｔｉｉ）仮説：無し くｉｖ）抗感作：無し くｖｉ）起′ａ： （Ａ）生物体：Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起ａ： （Ａ）クローン：　Ｃ１００ＮＣ２７０（１×）特徴： （Ａ）名称／記号：　Ｃ０５ （Ｂ）位１：　１．．１８３ （ｘｉ）　Ｉｌｅ列ノ記Ｒ：　ＳＥＱ　ＩＤＮ０：２１（２）　ＳＥＱ　１０　 ＮＯ：２２のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二６０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列０）記［：　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：２２ＧｉｎＰｒｏｌｅＰｒｏ Ｌｙｓ＾１１１に９人ｒｇＰｒｏＧユｕ（ｉユｙＡｒｑ丁ｈｒ？ｒｐ入１ａＧｌ ｎコＳ　４０　４５ （２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：２３のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （０鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直１１状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＷＡ　ｔｏ　ｄＮＡ（ｊＨ）仮説：無し くＩν）抗悪作：無し くν１）起源： （Ａ）生物体：Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　Ｃ０Ｃ （ｖｉｉ）　直接の起源： （Ａ）クローン：　Ｃ１００ＮＣ３６０（ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１．．２７０ （ｘｉ）　配列の記＠：　ＳＥＱ　ＩＱ　ＮＯ：２３ＣＣＣＧＧＧ　Ｔ入ＣＣＣ Ｔ　ＴＧＧ　ＣＣＣＣＴＣＴｋＴ　ＧＧＣ入＾Ｔ　Ｇｆｉ！：、にＧＣＴＧＧ　 ＧＧＣＴにＧ　ＣＣＧ　１９２Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　丁ｒｐ　Ｉ’ ｒｏ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｗｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ａｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔ ｒｐ　Ａｌ■ ＧＧＡ　Ｔｃ５　ＣＴＣｅ’ｒＧ　ＴｃＴ　ｅＣＣＣＩＪ　ＧＧＣＴＣＴ　ＣＧ ＣＣ１ｆｆ　ＡＧＣ丁（：ＣＧＧＣＣＣＣＡＣ＾　２４０Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　しｗ 　Ｌａｕ　５＊ｒ　Ｐｒｏ　ｋｒｑ　＋ｌｙ　Ｓｅｒ　ｋｔｑ　Ｐｒｏ　５ｅｒ 　Ｔｒｐ　にＧｌｙ　Ｐｒｏτｈｒ６５　）Ｏ７５８０ ａＡｅ　ｃｃｃ　ｃｃｃ　ｃｃ丁　ＡＧＣＴＣＧ　ＣＩ：ＣＡＩＬ丁　ＴｉＧ　 Ｔｋ　２７０Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓａｔ　入ｒ９　人ａ ｎ　ＬａＩ＋Ｂ５　９０ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２４（７）ための情報二（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の型ニブロチイン （ｘｉ）　配列の記！ｌ：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４Ｍｔ　に１ｙ　Ｇｌｙ　 Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｉ４ｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　入ｒ９　人ｒｇ　Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　 入ｒｇ　Ｌａｕ　にＡｙ　Ｖａｌｌ　５　１０　ｉｓ Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　入ｒｑ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　Ｇｌｕ　入ｒｇ　 Ｓａｔ　Ｇｉｎ　ｆ’ｒｏ　入ｒｇ　Ｇｌｙ　入ｒ９　＾ｒX ２０　２５　コ０ Ｇｉｎ　Ｐｒ口Ｘｉｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｕ　（：ｌｙ　Ａｒｇτｈｒτｒｐ　Ａｉａ　Ｇｉｎコ５　４０　４５ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｐｒ口　Ｌｓｕ　ｉＹｒ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　ＡｌａＣｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌ ｓｕ　Ｌａｕ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　にＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 ５ｓｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　τｈ■ Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＪＬｒｇ　入ｒ９　Ａｒｇ　５＠ｒ　入ｒｑ　Ａｓｎ　Ｌ＠に ＋（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋２５のための情報（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　１０６塩基対 （Ｂ）型：槙酸 （Ｃ）鎖の数−二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の型：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　＠ＲＮＡ（目１）仮説：無し くｉｖ）抗悪作：無し くνｉ）起ｆｉ： （＾）生物体：Ｃ型肝炎ウィルス （Ｂ）菌株：　ＣＤＣ （ｖｉｉ）　直接の起ｆｉ＝ （Ａ）クローン：　ＣｌＮＣ１０５ （ｉｘ）　特徴： （Ａ）名称／記号：　Ｃ０５ （Ｂ）位置：　１．．１０６ （ｘｉ）　配列の記＠：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎ Ｏ：２６のための情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の型ニブロチイン （ｘｌ）配列の記ｉ：　ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋２６Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌａｕ コ５ 付録 付録 付録 付録 付録 付録 ゲノＬＭＡ　ＲｆｆＡ ＤＮＡフラグメント 既知の配列領域Ｒ５をもつＯＮ＾フラグメント増幅連結フラグメント ＧＡＡ　ＴＴＣＣＴＣＧＴＧ　ＣＡＡ　ＧＣＧ　ＴＧＧ　ＭＧ　ＴＣＣＡＡＧ　 ＡＡＡ　ＡＣＣＣＣＡ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　’ＴＣＴＣＧ　ＴＡＴ　ＣＡＴ　入Ｃ ＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴ　ＧＡＣＴＣＣＡＣＡ　ＣＴＣ入Ｃτ　ＩＩ、ＩＷ　ＡＧ ＣＣλＣＡτＣＣＧ丁　入ＣＧ　ＧＡＧ　ＣＡＣＣＣＡ　ＡＴＣ丁入ＣＣ入ＡＴ Ｇ丁　丁Ｇτ　ＧＡＣＣ丁ｃｃ入ＣＣＣＣＣＡＡ　ＧＣＣＣにＣＧＴＧ　ＧＣＣ ＡＴＣＡＡＧ　ＴＣＣＣＴＣＡＣＣＣＡＧ　ＡＧＧ　ＣＴＴ　丁Ａτ　ＧＴＴ　 ＧＧＧ　ＧＧＣＣＣＴＣＴＴ　ＡＣＣＡＡＴ　ＴＣｈ　ＡＧＧ　ＧＧＧ　ＱＡＧ 　ＡＡＣＴＧＣＧＧＣＴＡＴ　ＣＧＣＡＧＧ　丁ＧＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣ ＧＴＡ　ＣＴＣＡＣＡ　ＡＣＴ　ＡＧＣ’ｒＧ？　ＧＧＴ　ＡＡＣＡＣＣＣＴＣ Ｍ：Ｔ　ＴＧＣＴＡＣＡＴＣＡＡＧ　ｃＣｃ　ＣＧＧ　ＧＣＡ　ＧＣＣＴＧＴ　 ＣＧＡ　ＧＣＣＧＣＡ　ＧＧＧ　Ｃ”ｒＣＣＡＧ　ＣＡＣＴＣＣ入ＣＣＡ丁ＧＣ τＣＧＴＧ　７０丁　ＧＧＣｃ入ｃｃｘｃ　ττ入ＧτＣＧττ　ＡＴＣＴＧＴ 　ＣＡＡ　ＡＧＣＧＣＧ　ＧＧＧ　Ｇτ０ＣＡＧ　ＣＡＧ　（ａｃ　ＧＣＣ；　 ＧＣＧ　ＡＧＣＣ丁Ｇ入ＧＡ　ＧＣＣτＴＣＡＣＧ　ＧＡＧ　ＧＣτ入τＧ　Ａ ＣＣＡＧＧτＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＧＧＧ　ＣＡＣＣＣＣＣＣＡ　ＣＡ Ａ　Ｃ二人Ｃ入Ａτ入ＣＧ入ＣτＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡ　ＡＣＡ　ＴＣＡ　丁 ＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＧＴＧ　ＴＣＡ　ＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧＣ Ｔ■ｓ　τ　丁　ＧＥ　工　ＰｒＹＧＫＡＩＰＬＥＣＣｋＣＣＡＣＣＣＧＡ　Ｇ ＡＧ　ＡτＣＣＣ丁　τ丁τ　ＴＡＣＧＧＣ入ＡＧ　ＧＣＴ　入τＣＣＣＣＣτ ｃｃ入ＡＶＺＫＧＧＲＢＬｒｒＣ！１５ＫＫＫ Ｇ′ｒＡ　Ａｒｃ　ＡＡＧ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＡＧＡ　ＣＡＴ　ＣＴＣＡ’ｒＣ ＴＴＣＴＧＴ　ＣＡＴ　τα入　入入Ｇ　入入ＧＡ入ＧＣＤＥＬ　入　入　ＫＬ ＶＡＬＧｒＮＡＶＴＧＣＧＡＣＱＡＡ　ＣＴＣＧＣご　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＣＴＧ 　ＧＴＣＧＣＡ　ＴＴＣＧＧＣ入子ＣＡＡτ　ＧＣＣＧτＧＡＹＹＲＧＬＤＶＳ Ｖ　工　Ｐ？５ＧＤＧＣＣＴＡＣＴＡＣＣＧＣＧＧＴ　ＣＴＴ　ＧＡＣＧ’ｒＧ 　ＴＣＣＣＴＣ入τＣＣＣＧ　ＡＣＣＡＧＣＧＧＣＱ入丁ｖｖｖｖｘ　丁　ＤＡ Ｉ、Ｍ’ｒＧＹＴＧＤＧＴＴ　ＧＴＣＧＴＣＧＴＧ　ＧＣＡ　ＡＣＣＧｋＴ　Ｇ ＣＣＣＴＣＡＴＧ　ｘｃｃ　ＧｃＣＴＡＴ　ＡＣＣＧＧＣＧＸｃＦ’Ｄｓｖ　工 　ＤＣＮＴＣＶＴＱＴＶＤτＴＣＧＡＣＴＣ：Ｇ　ＧＴＧ　Ａ’ｔ’Ａ　ＣＡＣ ＴＧＣＡＡＴ　ＡＣＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣＡＣＣＳＡＧ　Ａ（Ｊ　ＧＴＣＧＡＴｒ ｓＬＤＰＴ］ｉ”？　工　ＥＴＺ　丁　ＬＰＱＴＴＣＡＧＣＣＴＴ　ＧＡＣｃｃ 丁　λｃｃ　丁ＴＣＡＣＣＡＴ？　ＱＡＧ　ＡＣＡ　ＡＴＣＡＣＧ　ＣＴＣＣＣ ＣＣＡＧＤＡＶＳＲＴＱＲＲＧＲＴＧ　■　ＲＧＫＣａＴ　ＧＣＴ　ＧＴＣＴＣ ＣＣＧＣＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＧＴ　ＣＧＧ　ＧＧＣＡＧＧ　ＡＣＴ　ＧＧＣＡＧ Ｇ　ＧＧＧ　Ａ入ＧＰＧＩＹＲｒＶＡＰＧＥＲＰＳＧＭ ｃｃλ　ＧＧＣ入ＴＣＴＡＣＡＧＡ　ＴＴＴ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＣＧ　ＧＧＧ 　ＱＡＧ　（ＧＣＣＣＣＴＣＣＧＧＣＡτＧＦＤ５ＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡＳ Ｆ ’！’ＴＣＧＡＣＴＣＧ　ＴＣＣにＴＣＣＴＣ７０丁　ＧＡＧ　”ｒＧＣ’ｒＡ ？　ＧＡＣＧＣＡ　ＧＧＣ丁ＧＴ　ＧＣＴ　ＴＣＧＴ　Ｅ　ＬＡ　丁　ＰＡＥＴ ’！’ＶＲＬＲＡＹＭＴＡＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＡＣＧ　ＣＣＣＧＣＣＧＡＧ　Ａ ＣＴ　ＡＣＡ　ＣＴＴ　ＡＧＧ　ＣＴＡ　ＣＧｋ　ＧＣＧ　ＴＡＣＡＴＧ■→− １１Ａ、■÷ムＢ、ム一−☆Ｃ 足　ミ　８　畳　８　日　ご　冨　８ご　？　：？ｌ−１ｉ−＋　ψ　○　−ト 　ψ　ロ　ロ　く　Ｈ■　句　ロ　ｏｐ　−←　の　Ｑ　り　υ　−ＣＪＦ−１ ω　−トー＜　−　←　Φ　ト　−Ｃ！＋＜　ω　−＜　１−Ｉ　ＣＪ　：ｅ　 ｈ　−ロ　〉エピトープ　比較／描写 ４０９．１．ｌ　（ｕ）　（１０５ｂｐ）４０９．１．１　（Ｃ）　（７Ｑｂｐ ）　−４０９，１，１（Ｃ◆２７０） （３４０ｂｐ） Ｆｉｇ、７ Ｆｉ（１，８Ａ ｌｏ　２０　コ０　４０　５０　６０ ７０　！１０　９０　ＬＯＯ１１０１２０１１０１４０１５０１６０Ｌｌｏ　１ ８０Ｆｉｇ、８Ｂ コ１０　３２０　３コ０　コ４０　コ５０　コロ０コフＯコ８０　コ９０　４０ ０　４１０　４２０４コ０　４４０　４５０　４６０　４７０　４１１０Ｇｌｙ Ｖａｌ＾ｓｉｎ’ｒｙｒ入１ａＴｈｒＧ１ｙ＾ｍｎＬａｕＰｒｏＧｌｙＣｙｓＳ ａｒＰｈｄａｒ工１ａＰｈａＬａｕＬａｕ＾１ａ５５０　５ｇ０　５７０　５８ ０　５９０　６００要　約　書 Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）で感染した個体からの血清と免疫反応するペプチド 抗原を開示する。幾つかの抗原は慢性および急性のＨＣＶ感染を有するとして同 定された個体に存在する抗体と免疫学的に反応する。これらの抗原はヒトにおけ るＨＣＶ感染を検出するための診断方法に有用である。また、抗原性のペプチド に対して読み取り枠配列を符号化するポリヌクレオチドを含む対応するゲノムフ ラグメントクローンを開示する。

国際調査報告 一１ｐＣ：ｒｍ　Ｏ（ｍ　ｍ　１ｕｌｌ　・Ｐｋｌ　ｆｉ　Ｏ＆１刺Ｓ＾　４６ ５９７ リカ合衆国　カリフォルニア州　９４３０６　ノ曵ロ　アルド、キブコート　１ ９６０３

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）で感染したヒトからの血清と免疫反応する組換 えポリペプチド。
2. ２．ａ）ＨＣＶコード配列によって符号化され；ｂ）５０４アミノ酸残基を有し ；そしてｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４として示されるカルボキシ末端配列を有す る、ＨＣＶポリペプチドの免疫反応性部分を含む、請求項１記載のポリペプチド 。
3. ３．完全な５０４残基ペプチドを含む請求項２記載のポリペプチド。
4. ４．カルボキシ末端アミノ酸配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３として示されるポリ ヌクレオチド配列によって符号化される、請求項３記載のポリペプチド。
5. ５．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０９０１によって同定されたエシェリシア・コリ（Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）宿主に含まれる発現ベクターによって生成され る、請求項３記載のポリペプチド。
6. ６．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２として示されるペプチド配列の免疫反応性部分を含 む、請求項１記載のポリペプチド。
7. ７．明記される配列を含む請求項６記載のポリペプチド。
8. ８．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１として示されるポリヌクレオチド配列によって符号 化される、請求項７記載のポリペプチド。
9. ９．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０８９３によって同定されたエシェリシア・コリ（Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）宿主に含まれる発現ベクターによって生成され る、請求項７記載のポリペプチド。
10. １０．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８として示されるペプチド配列を含む、請求項１記 載のポリペプチド。
11. １１．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７として示されるポリヌクレオチド配列によって符 号化される、請求項１０記載のポリペプチド。
12. １２．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０として示されるペプチド配列を含む、請求項１ 記載のポリペプチド。
13. １３．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９として示されるポリヌクレオチド配列によって符 号化される、請求項１２記載のポリペプチド。
14. １４．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４、ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０、ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：２２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４、およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ ６として示されるペプチド配列から成る群から選ばれるペプチド配列を含む、請 求項１記載のポリペプチド。
15. １５．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３、ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：１５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９、ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：２１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３、およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ ５として示されるポリヌクレオチド配列の群から選ばれるポリヌクレオチド配列 によって符号化される、請求項１記載のポリペプチド。
16. １６．Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）を用いて感染させたヒトからの血清と免疫反 応する少なくとも１種のペプチド抗原、および前記抗体の抗原への結合を検出す るための装置から成るＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染に対し特異的な抗体を含 むヒト血液をスクリーニングする際に使用するための診断キット。
17. １７．抗原が、 ａ）ＨＣＶコード配列によって符号化され；ｂ）５０４アミノ酸残基を有し；そ してｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４として示されるカルボキシ末端配列を有する、 ＨＣＶポリペプチド配列の免疫反応性部分を含む、請求項１６記載のキット。
18. １８．抗原が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２として示されるペプチド配列の免疫反応 性部分を含む、請求項１６記載のキット。
19. １９．抗原が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８として示されるペプチド配列の免疫反応 性部分を含む、請求項１６記載のキット。
20. ２０．さらに第二の抗原を含み、この第二の抗原が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２ 、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２、ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：２４、およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６として示されるペプチド配列か ら成る群から選ばれるペプチド配列の免疫反応性部分を含む、請求項１９記載の キット。
21. ２１．抗原が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０として示されるペプチド配列の免疫反 応性部分を含む、請求項１６記載のキット。
22. ２２．抗原が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４、ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０、Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４、およびＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：２６として示されるペプチド配列から成る群から選ばれるペプチド配列の免 疫反応性部分を含む、請求項１６記載のキット。
23. ２３．前記検出装置が、前記ペプチドを結合する固体支持体、およびレポーター 標識抗ヒト抗体を含み、前記血清抗体の前記抗原への結合がレポーター標識抗体 の前記固体表面への結合によって検出できる、請求項１６記載のキット。
24. ２４．ＨＣＶ感染試験個体からの血清を、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）で感染し たヒトからの血清と免疫反応する少なくとも一個のペプチド抗原を用いて反応さ せ、そして結合した抗体の存在に対して抗原を試験する各工程から成る個体にお けるＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法。
25. ２５．ペプチド抗原が、 ａ）ＨＣＶコード配列によって符号化され；ｂ）５０４アミノ酸残基を有し；そ してｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４として示されるカルボキシ末端配列を有する、 ＨＣＶペプチドの免疫反応性部分を含む、請求項２４記載の方法。
26. ２６．ペプチド抗原が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２として示される配列の免疫反応 性部分を含む、請求項２４記載の方法。
27. ２７．ペプチド抗原が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８として示される配列の免疫反応 性部分を含む、請求項２４記載の方法。
28. ２８．さらに第二の抗原を含み、この第二の抗原が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２ 、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２、ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：２４、およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６として示されるペプチド配列か ら成る群から選ばれるペプチド配列の免疫反応性部分を含む、請求項２４記載の 方法。
29. ２９．ペプチド抗原が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０として示される配列の免疫反 応性部分を含む、請求項２４記載の方法。
30. ３０．抗原が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４、ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０、Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４、およびＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：２６として示されるペプチド配列から成る群から選ばれるペプチド配列の免 疫反応性部分を含む、請求項２４記載の方法。
31. ３１．前記ペプチド抗原を固体支持体に結合し、前記反応がペプチド抗原と支持 体との反応を含み、続いて支持体とレポーター標識抗ヒト抗体とを反応させ、そ して前記試験が固体支持体上のレポーター標識抗体の存在を検出することを含む 、請求項２４記載の方法。
32. ３２．適当な宿主に、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）で感染したヒトからの血清と 免疫反応するポリペプチドを符号化するポリヌクレオチド配列を有する読み取り 枠（ＯＲＦ）を含む組換え発現システムを導入し、そこではベクターが前記宿主 においてＯＲＦを発現するように設計されており、そして ＯＲＦ配列の発現で得られる条件下に前記宿主を培養する各工程から成る、Ｃ型 肝炎ウィルス（ＨＣＶ）で感染したヒトからの血清と免疫反応するポリペプチド を生成する方法。
33. ３３．ポリペプチドが、 ａ）ＨＣＶコード配列によって符号化され；ｂ）５０４アミノ酸残基を有し；そ してｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４として示されるカルボキシ末端配列を有し、前 記ペプチド抗原のカルボキシ末端アミノ酸配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３として 示されるポリヌクレオチド配列によって符号化される、ＨＣＶポリペプチドの免 疫反応性部分を含む、請求項３２記載の方法。
34. ３４．発現ベクターがラムダｇｔ１１ファージベクターであり、宿主がＥ．ｃｏ ｌｉであり、導入したベクターを含む宿主がＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０９０１によっ て同定される、請求項３３記載の方法。
35. ３５．ポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２として示される配列を有し、ポリ ヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で示される配列を有する、請求項３２記 載の方法。
36. ３６．発現ベクターがラムダｇｔ１１ファージベクターであり、宿主がＥ．ｃｏ ｌｉであり、導入したベクターを含む宿主がＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０８９３によっ て同定される、請求項３５記載の方法。
37. ３７．ポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８として示される配列を有し、ポリ ヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７として示される配列を有する、請求項３ ２記載の方法。
38. ３８．発現ベクターがラムダｇｔ１１ファージベクターであり、宿主がＥ．ｃｏ ｌｉであり、導入したベクターを含む宿主がＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０７９２によっ て同定される、請求項３７記載の方法。
39. ３９．ポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０として示される配列を有し、ポ リヌクレオチＦがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９として示される配列を有する、請求項 ３２記載の方法。
40. ４０．発現ベクターがラムダｇｔ１１ファージベクターであり、宿主がＥ．ｃｏ ｌｉであり、導入したベクターを含む宿主がＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０８７６によっ て同定される、請求項３９記載の方法。
41. ４１．ポリペプチドが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４ 、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：２０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４、およびＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：２６として示されるペプチド配列から成る群から選ばれるペプチ ド配列の免疫反応性部分を含む、請求項３２記載の方法。
42. ４２．発現ベクターがｐＧＥＸまたはｐＥＴベクターであり、宿主がＥ．ｃｏｌ ｉである、請求項４１記載の方法。
43. ４３．選択された発現ベクター中に読み取り枠の発現を支持できる宿主、そして 前記ペプチド抗原を符号化するポリヌクレオチド配列を有する読み取り枠（ＯＲ Ｆ）を含む選択された発現ベクターから成る、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）で感 染したヒトからの血清と免疫反応する組換えペプチド抗原を発現するための発現 装置。
44. ４４．ペプチド抗原が、 ａ）ＨＣＶコード配列によって符号化され；ｂ）５０４アミノ酸残基を有し；そ してｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４として示されるカルボキシ末端配列を有し；そ して、前記ペプチド抗原のカルボキシ末端アミノ酸配列がＳＥＱＩＤ　ＮＯ：３ として示されるポリヌクレオチド配列によって符号化される、 ＨＣＶポリペプチド配列の免疫反応性部分を含む、請求項４３記載の発現装置。
45. ４５．発現ベクターがラムダｇｔ１１ファージベクターであり、宿主がＥ．ｏｏ ｌｉであり、導入したベクターを含む宿主がＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０９０１によっ て同定される、請求項４４記載の発現装置。
46. ４６．ペプチド抗原がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２として示される配列を有し、ポリ ヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１として示される配列を有する、請求項４ ３記載の発現装置。
47. ４７．発現ベクターがラムダｇｔ１１ファージベクターであり、宿主がＥ．ｃｏ ｌｉであり、導入したベクターを含む宿主がＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０８９３によっ て同定される、請求項４６記載の発現装置。
48. ４８．ペプチド抗原がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８として示される配列を有し、ポリ ヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７で示される配列を有する、請求項４３記 載の発現装置。
49. ４９．発現ベクターがラムダｇｔ１１ファージベクターであり、宿主がＥ．ｃｏ ｌｉであり、導入したベクターを含む宿主がＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０７９２によっ て同定される、請求項４８記載の発現装置。
50. ５０．ペプチド抗原がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０として示される配列を有し、ポ リヌクレオチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９で示される配列を有する、請求項４３ 記載の発現装置。
51. ５１．発現ベクターがラムダｇｔ１１ファージベクターであり、宿主がＥ．ｃｏ ｌｉであり、導入したベクターを含む宿主がＡＴＣＣ　Ｎｏ．４０８７６によっ て同定される、請求項５０記載の発現装置。
52. ５２．ポリペプチドが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４ 、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：２０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４、およびＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：２６として示されるペプチド配列から成る群から選ばれるペプチ ド配列の免疫反応性部分を含む、請求項４３記載の発現装置。
53. ５３．発現ベクターがｐＧＥＸまたはｐＥＴベクターであり、宿主がＥ．ｃｏｌ ｉである、請求項５２記載の発現装置。
54. ５４．Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）で感染したヒトからの血清と免疫反応するポ リペプチドを符号化するポリヌクレオチド。
55. ５５．ポリペプチドが、 ａ）ＨＣＶコード配列によって符号化され；ｂ）５０４アミノ酸残基を有し；そ してｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４として示されるカルボキシ末端配列を有し；そ して、前記ペプチド抗原のカルボキシ末端アミノ酸配列がＳＥＱＩＤ　ＮＯ：３ として示されるポリヌクレオチド配列によって符号化される、 ペプチド配列の免疫反応性部分を含む、請求項５４記載のポリヌクレオチド。
56. ５６．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１として示されるポリヌクレオチド配列を含む、請 求項５４記載のポリヌクレオチド。
57. ５７．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９として示されるポリヌクレオチド配列を含む、請 求項５４記載のポリヌクレオチド。
58. ５８．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３、ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：１５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９、ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：２１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３、およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ ５として示されるポリヌクレオチド配列の群から選ばれるポリヌクレオチド配列 を含む、請求項５４記載のポリヌクレオチド。