KR100217483B1 - C형 간염 바이러스 에피토프 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 개체로 부터의 혈청과 면역반응하는 펩티드 항원이 개시된다. 여러 항원은 만성 및 급성 HCV 감염을 가지는 것으로 확인된 개체에 존재하는 항체와 면역학적으로 반응한다. 항원은 사람에서 HCV 감염 검출을 위한 진단 방법에 유용하다. 또한 본 발명에는 항원성 펩티드에 대한 오픈 리딩 프레임 서열을 코드화하는 폴리누클레오티드를 함유하는 해당 게놈성 단편 클론들이 개시된다.

Description

[발명의 명칭]

C형 간염 바이러스 에피토프

[발명의 분야]

본 발명은 비경구적으로 전염된 비A비B형 간염 바이러스(PT-NANBH, 이하 C형

간염 바이러스라 칭한다)로 감염된 환자로부터의 혈청과 면역반응하는 특정 펩티드 바이러스 항원, 펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드 서열, 펩티드를 생성할 수 있는 발현 시스템, 및 사람 혈청에서 PT-NANBH 감염을 검출하기 위하여 펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다.

[참고문헌]

[발명의 배경]

A형 간염 바이러스(HAV) 및 B형 간염 바이러스(HBV) 이외의 바이러스로 인한 바이러스성 간염은 비A비B형 간염(NANBH)으로서 언급되어 왔다. 보다 최근에 이르러, NANBH가 최소한 2개, 아마도 그 이상의 아주 다른 바이러스들을 포함하고 있다는 것이 분명해졌다. 장으로 전염되는 NANBH 또는 ET-NANBH로서 알려져 있는 그 중 하나는, 음식과 음료수가 분변물질로 오염되어 있는 장소인 위생시설이 불량한 지역에서 주로 감염된다. E형 간염 바이러스(HEV)로서 언급되는 이 바이러스의 일부의 분자 클로닝은 최근에 기술되었다(참조:Reyes et al).

비경구적으로 전염되는 NANBH 또는 PT-NANBH로서 알려져 있는 두 번째 NANB 바이러스 타입은, 비경구적 경로, 전형적으로는 혈액 또는 혈액 생성물에의 노출에 의해 전염된다. 대략 10의 수혈이 PT-NANBH 감염을 유발하며, 이중에서 약 반 정도가 만성 질병 상태로 진전된다(Dienstag).

사람의 수혈자에서 수혈후 NANBH를 생성하는 것으로 증명된 사람 혈청은, 침팬지에서 PT-NANBH 감염을 유발시키는 데에 성공적으로 사용되었다(Bradley). 감염된 침팬지 혈청으로부터 분리된 RNA는 만성상태의 사람 PT-NANBH 혈청으로 면역 스크리닝하기 위해 사용된 발현벡터에서 cDNA 라이브러리를 제조하는데 사용되어 왔다. 이 과정은 PT-NANBH 특이적 cDNA 클론을 확인하였고, 그후 바이러스 서열은 PT-NANBH 바이러스 병원체의 7,300의 연속 염기쌍을 구성하는 단편을 확인하기 위한 프로브로서 사용되었다(1988년 11월 18일 출원된 EPO 공개 공보 제318,216호). 동일한 과정이 본 발명자들에 의해, 본원에 개시된 2개의 PT-NANBH 펩티드 및 폴리누클레오티드 서열을 유도하기 위하여 사용되었다. 서열화된 바이러스 병원체는 HCV라 명명되었다(상기 EPO 특허출원).

지금까지 HCV 바이러스 병원체에 의해 코드화되는 1종의 면역원성 펩티드가 보고되어 있다(Choo, Kuo, EPO 공개 공보 제318,216호). C-100으로 표시되는 이 펩티드는 PT-NANBH 혈청의 면역검정에 사용되어 왔고, 만성 NANBH 샘플의 80이하 및 급성 NANBH 샘플의 약 15와 면역특이적으로 반응하는 것으로 밝혀져 왔다(Kuo).

급성 및 만성 PT-NANBH 감염을 포함하여, PT-NANBH-감염된 혈액의 더 높은와 면역반응하는 1종 또는 1군의 펩티드 항원을 제공하는 것이 바람직하다.

[발명의 개요]

본 발명의 한 가지 목적은, 만성 HCV-감염 개체로부터의 혈청의 높은와 면역반응하는 펩티드와, 급성 HCV 감염과 관련된 혈청과 면역반응하는 펩티드들을 포함하여, C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 사람으로부터의 혈청과 면역반응하는 재조합 폴리펩티드를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 펩티드 항원의 재조합체 생성을 위한 서열을 코드화하는 HCV 폴리누클레오티드 서열 및 펩티드 항원을 사용하여 HCV-감염된 사람 혈청을 검출하기 위한 진단 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 1가지 일면에서, HCV로 감염된 사람으로부터의 혈청과 면역반응하는 펩티드 항원을 포함한다. 본 발명의 한 펩티드 항원은 a) HCV 코딩 서열에 의해 코드화되고; b) 504개의 아미노산 잔기를 가지며; c) SEQ ID NO:4로서 표시되는 카르복시-말단 서열을 갖는 HCV 폴리펩티드의 면역반응성 부분을 포함한다.

본 발명의 다른 펩티드 항원은 하기 서열중 어느 하나의 면역반응성 부분을 포함한다:SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 및 SEQ ID NO:26.

또 다른 일면에서, 본 발명은 HCV 감염에 대하여 특이적인 항체를 함유하는 사람 혈청을 스크리닝하는데 사용하기 위한 진단 키트를 포함한다. 키트는 C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 사람으로부터의 혈청과 면역반응하는 1종 이상의 펩티드 항원체를 포함한다:키트에 사용하기 위한 특정 펩티드 항원은 상기 제시되어 있다.

본 발명의 한 바람직한 구체예는 409-1-1(c-a)(SEQ ID NO:8) 및 HCV-캡시드 유도된 단백질(SEQ ID NO:12,14,16,18,20,22,24 및 26)중의 하나를 함유하는 진단 키트이다:2가지 특정 구체예는 C1NC450 캡시드 유도된 펩티드가 포함된 409-1-1(c-a)와 C1NC360 캡시드 유도된 펩티드가 포함된 409-1-1(c-a)이다.

본 발명의 한 구체예에서, 항원은 고체 지지체상에 고정된다. 고정된 항원에 대한 HCV-특이적 항체의 결합은, 검출가능한 리포터로 고체 지지체를 표지시키기 위해 작용하는 리포터 표지된 항-사람 항체에 의해 검출된다.

키트는 (ⅰ) HCV-감염된 시험 개체로부터의 혈청과 상기 펩티드 항원을 반응시키고 (ⅱ) 결합된 항체의 존재에 대하여 항원을 조사함으로써, 개체내 HCV 감염을 검출하기 위한 방법에 사용된다.

본 발명의 또 다른 측면을 따르면, 펩티드 항원은 C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 사람으로부터의 혈청과 면역반응하는 재조합 펩티드를 발현시키기 위한 발현 시스템을 사용하여 제조된다. 펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유하고 있는 선택된 발현 벡터는 적당한 숙주에 도입되고, 이 숙주는 발현 벡터에서 ORF의 발현을 촉진하는 조건하에 배양된다.

한 구체예에서, 폴리누클레오티드는 람다 gt11 파지 벡터의 발현 부위에 삽입되고, 벡터는 대장균 숙주에 도입된다. 괄호안에 표시된 항원의 코딩 서열을 포함하고 있는 벡터들을 함유하는 다음의 대장균 숙주들이 기탁되었다:ATCC NO. 40901(SEQ ID NO:3:1990.9.27.), ATCC NO. 40893(SEQ ID NO:1:1990.9.20.), ATCC NO. 40792(SEQ ID NO:7:1990.4.18.), ATCC NO. 40876(SEQ ID NO:9:1990.8.28.). pGEX 및 pET는 HCV 항원을 발현시키기 위해 사용되어온 2개의 다른 벡터들이다. 상기 서열의 발현을 위한 다른 적절한 벡터의 결정 및 숙주 조합은 당 분야의 숙련자의 기술 수준 내에 있다는 것이 인지될 것이다.

또한 본 발명의 일부분을 구성하는 것은 C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 사람으로부터의 혈청과 면역반응하는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드이다. 본 발명의 한 폴리누클레오티드는, a) HCV 코딩 서열에 의해 코드화되고; b) 504개의 아미노산 잔기를 가지며; c) SEQ ID NO:4로서 표시되는 카르복시-말단 서열을 가지는 펩티드 서열의 면역반응성 부분을 포함하며, 상기 펩티드 항원의 카르복시-말단 아미노산 서열이 SEQ ID NO:3으로서 표시된 폴리누클레오티드 서열에 의해 코드화되는 폴리펩티드를 코드화한다.

본 발명의 그 밖의 폴리누클레오티드는 하기 서열 중의 어느 하나를 포함한다:SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:25.

본 발명의 이러한 목적과 그 밖의 목적 및 특징은 하기의 상세한 설명이 첨부된 도면과 함께 이해될때 더욱 완벽하게 드러날 것이다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 본 발명의 방법에 따라, 핵산 절편의 중복하는 연결 단편을 제조하는 단계를 도시하는 도면이다.

제2도는 HCV 게놈의 7,300 염기쌍 부분을 따라서 중복 프라이머 영역 및 연결 영역의 위치를 도시하는 도면이다.

제3도는 클론 40 삽입물의 DNA 코딩 서열을 도시하는 도면이다. 밑줄이 그어진 서열은 R9 프라이머 영역에 해당한다.

제4도는 클론 36 삽입물의 DNA 코딩 서열을 도시하는 도면이다. 밑줄이 그어진 서열은 각각 F7, F8 및 R8 프라이머 영역에 해당한다.

제5도는 409-1-1(abc) 클론 삽입물에 대한 DNA 및 단백질 코딩 서열을 도시하는 도면이다. 이 서열의 A 영역은 사각형에서 사가형까지이고, B 영역은 사각형에서 삼각형까지이며, C 영역은 삼각형에서 별표까지이다.

제6도는 409-1-1(c-a) 클론 삽입물에 대한 DNA 및 단백질 코딩 서열을 도시하는 도면이다.

제7도는 409-1-1(abc) 클론 삽입물에 해당하는 영역에 있는 HCV 게놈으로부터 수득된 클론의 군을 도시하는 도면이다.

제8(a)도는 pGEX-GG1 삽입물에 대한 DNA 및 단백질 코딩 서열을 도시한다. 첫번째 줄 위의 세개의 G는 클론 pGEX-CapA를 생성하기 위하여 치환이 이루어진 장소를 가리킨다. 제8(b)도는 pGEX-CapA 삽입물 코딩 서열에 대한 DNA 및 단백질 서열을 도시하는 도면이다. 카르복시 및 아미노 말단 결실을 생성하기 위하여 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머는 누클레오티드 줄의 아래에 표시된다. 프라이머의 서열은 센스(sense)(코딩 가닥)로 표시된다. NC(비코딩) 프라이머의 실제 서열은 표시된 서열의 역상보물이다. 코딩 프라이머는 한 줄로 밑줄이 그어져 있고, 역(비코딩) 프라이머는 두 줄로 밑줄이 그어져 있다. 대문자로 표시된 서열은 정확한 매치(match)이다. 아래에 있는 문자들로 표시된 서열은 말단 제한부위(5' 말단에서의 NcoI과 3' 말단에서의 Bam HI)를 도입하기 위해 사용된 미스매치(mismatch)이다. 위치 24, 27 및 30에서 불안정한 코돈(siippery codon)을 제거하기 위해 변경된 3개의 누클레오티드는 서열 위에 도시된 야생형 A잔기로 진하게 표시된다.

제9도는 pGEX-CapA에 의해 코드화된 HCV-코아 단백질의 수치료 도표를 도시하는 도면이다. 카르복시 및 아미노 말단 결실을 생성하기 위해 사용된 프라이머의 상대적인 위치는, 화살표에 의해 단백질 코딩 서열에 관련하여 표시된다.

제10도는 HCV 캡시드 단백질 영역의 에피도프 지도를 도시하는 도면이다.

[발명의 상세한 설명]

Ⅰ. 정의

하기 규정된 용어들은 본원에서 하기의 의미를 갖는다:

1. 비경구적으로 전염된 비A비B형 간염 바이러스 병원체(PT-NANBH)는 (ⅰ) 비경구적으로 전염되는 감염성 간염을 유발하고, (ⅱ) 침팬지에서 전염될 수 있고, (ⅲ) A형 간염 바이러스(HCV), B형 간염 바이러스(HBV) 및 E형 간염 바이러스(HEV)와는 혈청학적으로 구별되는 바이러스, 바이러스 유형 또는 바이러스 클래스를 의미한다.

2. HCV(HCV)는 폴리누클레오티드 서열이 부록에 제시된 HCV의 7,300 염기쌍 영역의 서열, 및 축중 코돈과 같은 서열의 변이체 또는 HCV의 다양한 분리물 또는 스트레인에 존재할 수 있는 변이체를 포함하는 PT-NANBH 바이러스 병원체를 의미한다.

3. 2개의 핵산 단편이 문헌[Manistis et al. op.cit., pp. 320-323]에 기재된 혼성화 조건하에 다음과 같은 세척 조건:2SCC, 0.1SDS, 실온에서 2회, 각각 30분씩 세척한 후, 2SCC, 0.1SDS로 50에서 1회, 30분간 세척하고, 그런 다음 2SCC, 실온에서 2회, 각각 10분씩 세척하는 조건을 이용하여 서로 혼성화되는 경우, 최대 약 25-30의 염기쌍의 미스매치를 함유하는 상동 서열이 확인될 수 있다면 2개의 핵산 단편은 상동이다. 더욱 바람직하게는 상동 핵산 가닥은 15 내지 25, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 15의 염기쌍의 미스매치를 함유한다. 이러한 상동성의 정도는 당분야에 널리 알려져 있는 바와 같이, 유전자 라이브러리(또는 그 밖의 유전 물질 공급원)로부터의 클론을 확인하기 위한 보다 엄격한 세척 또는 혼성화 조건을 사용함으로써 선택될 수 있다.

4. DNA 단편은 이것이 실질적으로 상기(2)에서 규정된 HCV 바이러스 게놈의 영역과 동일한 염기쌍 서열을 가지고 있는 경우,HCV로부터 유도된다.

5. 단백질은 이것이 PT-NANBH 또는 HCV 바이러스 병원체로부터 각각 유도된 cDNA 또는 RNA 단편의 오픈 리딩 프레임에 의해 코드화되는 경우, PT-NANBH 또는 HCV 바이러스 병원체로부터 유도된다.

Ⅱ. 면역스크리닝에 의한 분자 클론 선택

PT-NANBH 병원체의 분자 클론을 확인하기 위한 한 방법으로서, cDNA 라이브러리가 발현 벡터람다 gt11에서 감염된 혈청으로부터 제조된다. 그런 다음, cDNA 서열이 PT-NANBH-감염 혈청과 면역반응하는 펩티드의 발현에 대해 선택된다. 이 방법에 의해 확인된 재조합 단백질은 진단 시험에서 기질로서 작용할 수 있는 펩티드 후보들을 제공한다. 또한, 이 방법에 의해 확인된 핵산 코딩 서열은 추가의 PT-NANBH 코딩 서열의 확인을 위한 유용한 혼성화 프로브로서 작용한다.

면역스크리닝을 PT-NANBH 코딩 서열로부터 유래하는 클론을 확인하기 위한 유용한 방법으로 만들기 위해서는, PT-NANBH 바이러스의 잘 규정된 공급원이 중요하다. 이러한 공급원을 생성하기 위하여, 침팬지(#771; 실시예 1A)를 공급원으로서 인자 Ⅷ 농축물을 사용하여 전염성 PT-NANBH 병원체로 감염시켰다(Bradley). 인자 Ⅷ 농축물은 2가지 이상의 형태의 비경구적으로 전염되는 NANB간염(PT-NANBH)을 함유하는 것으로 알려져 있다. HCV(HCV)라 명명되는 클로로포름-민감성 병원체 뿐만 아니라 PT-NANBH의 클로로포름 내성 형태가 또한 농축물로 전염되었다(Bradleu, 1983).

실시예 1에 예시된 방법에서, 감염된 혈청은 희석없이 원심분리에 의해 펠릿화되고, cDNA 라이브러리가 이 펠릿화된 바이러스로부터 생성되었다(실시예 1B 및 1C). 감염된 사람 공급원으로부터의 혈청도 동일한 방식으로 처리되었다. cDNA 라이브러리는 예컨대, 출발 물질로서 펠릿화된 혈청으로부터 추출된 RNA를 사용하는 랜덤 프라이머법에 의해 생성되었다(실시예 1B 및 1C). 그런 다음, 생성된 cDNA 분자는 적당한 벡터, 예를 들면 펩티드 항원의 발현 및 스크리닝을 위해서는 람다 gt11 및 혼성화 스크리닝을 위해서는 람다 gt10에 클로닝되었다(실시예 1C(ⅳ)). 람다 gt11은 베타-갈락토시다제 유전자의 번역 종결 코돈의 53 염기쌍 업스트림 위치에 독특한 EcoRⅠ 삽입부위를 함유하고 있는 특히 유용한 발현 벡터이다. 따라서, 삽입된 서열은 베타-갈락토시다제 유전자의 N-말단 부분, 이종성 펩티드, 및 임의로 베타-갈락토시다제 펩티드의 C-말단 영역을 함유하는 베타-갈락토시다제 융합 단백질로서 발현되며, C-말단 부분은 이종 펩티드 코딩 서열이 번역 종결 코돈을 함유하지 않는 경우에 발현된다. 또한 이 벡터는 허용 온도, 예컨대 32에서 바이러스 용원(lysogeny)을 유발하고, 승온, 예컨대 42에서 바이러스 용해를 유도하는 온도 민감성 리프레서(cl857)를 생성한다. 이 벡터의 장점은 (1) 매우 효율적인 재조합 클론 생성, (2) 비허용온도는 아닌 허용 온도에서 숙주세포 성장을 기준으로 하여 용원화된 숙주 세포를 선택하는 능력, 및 (3) 고수준의 재조합 융합 단백질 생성이라는데에 있다. 또한, 이종성 삽입물을 함유하고 있는 파지가 비활성 베타-갈락토시다제 효소를 생성하기 때문에, 삽입물 함유 파지는 전형적으로 베타-갈락토시다제 착색된-기질 반응을 이용하여 확인된다.

실시예 1-3에 기재된 스크리닝 과정에서, 개객의 cDNA 라이브러리는 한 마리의 PT-NANBH 감염된 침팬지(#771)와 4명의 PT-NANBH 감염된 사람(각각 GEM, BV, WEH 및 AG로 표시됨)의 혈청으로부터 제조되었다. 이들 5개의 라이브러리는 PT-NANBH 양성 사람 또는 침팬지 혈청을 사용하여 면역스크리닝되었다(실시예 2):하나 이상의 혈청과 면역반응하는 111개의 람다 gt11 클론이 확인되었다. 이들 111개의 클론 중에서 93개가 정상 DNA와의 삽입물 혼성화에 대해 조사되었다. 삽입물은 방사성 표지되고, HindⅢ/EcoRⅠ으로 이중 소화된 사람 말초 림프구(PBL) DNA에 대한 프로브로서 사용되었다(실시예 3). 약 46(43/93)의 삽입물이 정상 사람 PBL DNA와 혼성화되었으므로 조사는 계속되지 않았다. 침팬지 #771 혈청으로부터 유도된 11개의 PT-NANBH-면역양성 클로니들로부터의 삽입물은 정상 사람 PBL DNA에 대해 외인성인 것으로 특징화되었다(실시예 3). 11개의 클론중에서 2개의 PT-NANBH 클론이 하기 특징을 갖는 것으로 확인되었다. 하나의 클론(클론 40)은 정상 사람 PBL DNA에 대한 반복된 혼성화 시험 결과 분명히 외인성이었고, 비교적 작은 크기의 삽입물(대략 0.5킬로염기)을 가지며, 네가티브 대조 혈청과 매우 비반응성이었다. 2번째 클론(클론 36)은 다중 PT-NANBH 항혈청과 반응성인 것으로 나타나고, 상대적으로 큰 크기(대략 1.5킬로염기)의 삽입물을 가지며, 정상 사람 PBL DNA에 대한 혼성화 시험 결과 외인성이었다. 클론 36과 40의 면역반응 특성은 표 1에 요약되어 있다(실시예 3). 클론 36은 침팬지 #771 혈청 및 2개의 HCV-양성 사람 혈청인 AG 및 BV와 면역반응하였다. 클론 36항원은 네가티브 대조 혈청인 SKF와는 면역반응하지 않았다. 클론 40은 침팬지 #771 혈청과 면역반응하였고, 스크리닝을 위해 네가티브 대조 혈청이 사용된 경우에는 전혀 반응하지 않았다.

클론 36의 DNA 서열이 부분적으로 결정되었고, 이것은 제4도에 도시되어 있다. 이 서열은 부록에 제시된 HCV 서열의 누클레오티드 5010 내지 6516에 해당한다. 또한 DNA 서열은 클론 40 삽입물에 대해 결정되었다(제3도). 이 서열은 약 누클레오티드 6515 내지 7070의 영역에 있는 HCV 서열(부록)과 상동이다. 2개의 다른 침팬지 #771 클론, 클론 44 및 45의 삽입물이 혼성화 및 서열분석에 의해 클론 40과 상동인 것으로 밝혀졌다(실시예 4). 클론 36과 40에 대한 서열은 연속 서열이며, 클론 36 서열은 부록에 표시된 바와 같이 클론 40 서열의 5'에 위치하고 있다. 따라서, 이들 2개의 클론은 전술된 면역스크리닝 방법에 의한 HCV 게놈의 상당한 블록(block)의 분리를 나타낸다.

4개의 람다 gt11 클론 36, 40, 44 및 45는 미합중국 94063 캘리포니아 레드우드 시티 페노브스코트 드라이브 505에 소재한 제네랩스 인코포레이티드의 제네랩스 컬춰 콜렉션에 기탁되었다. 또한, 람다 gt11 클론인 클론 36과 40을 미합중국 20852 메릴랜트 록빌 파크론드라이브 12301에 소재한 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁하여, 기탁번호 ATCC 제40901호와 ATCC 제40893호를 부여받았다.

Ⅲ. 혼성화 방법에 의한 PT-NANBH 서열 확인

섹션 Ⅱ에서 확인된 폴리누클레오티드는 추가의 HCV 서열을 확인하기 위해 혼성화 방법에서 프로브로서 사용될 수 있고, 이어서 추가의 서열을 확인하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 폴리누클레오티드는 직접 클로닝되거나 부분 소화에 의해 단편화되어 랜덤 단편이 생성될 수 있다. 생성되는 클론은 HCV 항원 코딩 서열을 확인하기 위해 전술한 바와 같이 면역스크리닝될 수 있다.

클론 36과 40의 삽입물이 HCV 서열을 함유하는 클론을 확인하기 위해 어떻게 사용될 수 있는가를 설명하기 위하여, 클론 40의 삽입물이 분리되어 람다 gt10에서 확정된 개개의 cDNA 라이브러리(상기 참조)에 대한 혼성화 프로브로서 사용되었다. 클론 40 프로브가 사용되어 약 24개의 독립 혼성화-양성 클론이 플라크 정제되었다(실시예 5). 양성 신호는 상이한 혈청 공급원으로부터의 cDNA 라이브러리에서 상이한 빈도로 발생되는데, 이는 혼성화 신호가 cDNA 합성 또는 클로닝 도중에 도입된 일부 공통 오염물로부터 생성된 것이라기 보다는 혈청 공급원으로부터 생성된 것임을 암시한다(표 2). 클론 40 삽입물과의 혼성화에 의해 양성으로 시험된 클론 중 하나인 108-2-5는 약 3.7kb의 삽입물을 가지고 있다(실시예 6). 이 클론은 큰 삽입물을 가지고 있기 때문에, 클론 108-2-5가 추가의 분석을 위해 선택되었다. 이 cDNA 클론의 혈청 공급원은 EGM 사람 PT-NANBH 혈청이었다(실시예 1).

108-2-5의 삽입물은 람다 gt10 클론의 EcoRⅠ 소화, 전기영동 분별, 및 전기 용출에 의하여 분리되었다(실시예 6). 분리된 삽입물은 랜덤 단편을 생성하기 위해 DNasel로 처리되었고(실시예 6), 생성되는 소화 단편들은 면역스크리닝을 위해 람다 gt11 파지 벡터에 삽입되었다. 108-2-5 단편들의 람다 gt11 클론들은 사람(BV 및 정상) 및 침팬지 #771 혈청을 사용하여 면역스크리닝되었다(실시예 6). 사람 및 침팬지 혈청과의 제1회 면역스크리닝에 의해 12개의 양성 클론이 확인되었다. 12개의 클론중에서 7개가 플라크 정제되었고, 침팬지 #771 혈청을 사용하여 리스크리닝되었다. 삽입물 DNA의 부분적인 DNA 서열이 328-16-1과 328-16-2로 표시되는 생성되는 클론중 2개에 대해 결정되었다. 이들 2개의 클론은 클론 40과 본질적으로 동일한 서열들을 함유하였다(실시예 6).

클론 36 삽입물은 람다 gt10에 생성된 원래의 cDNA 라이브러리를 프로빙하기 위해 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 클론 36의 특정 하위단편(subfragmqnt)은 중합효소 연쇄반응에 의해 또는 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 절단 후에 분리될 수 있다. 이들 단편들은 방사성 표지되어, 람다 gt10에서 생성된 cDNA 라이브러리에 대한 프로브로서 사용될 수 있다(실시예 1C). 특히, 클론 36 삽입물의 5' 말단 서열은 이 영역과 중복하는 클론들을 확인하기 위한 프로브로서 유용하다.

또한 말단 클론 36 삽입물 서열 및 말단 클론 40 삽입물 서열에 의해 제공된 서열은 예컨대 침팬지 #771 혈청으로 생성된 RNA를 기질로서 사용하는 제1가닥 DNA 합성 반응(참고문헌:Maniatis et al.; Scharf et al.)에서 특이한 서열 프라이머로서 유용하다. cDNA의 제2가닥 합성은 불규칙적으로 프라이밍된다. 상기 과정은 공지된 클론 36과 40 삽입물 서열들의 5'쪽에 인접한 핵산 영역에 상응하는 cDNA 분자들을 확인 또는 생성시킨다. 새롭게 분리된 이들 서열은 추가의 플랭킹 서열 등을 확인하고, HCV 게놈을 구성하는 서열들을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 전술된 바와 같이, 새로운 HCV 서열들이 분리된 후에, HCV 항원을 코드화하는 특정 서열을 확인하기 위해 폴리누클레오티드가 클로닝되고 면역스크리닝될 수 있다.

Ⅳ. 중복하는 클로닝된 연결 단편의 생성

이 단원에서는 HCV-진단 항원으로서 유용할 수 있는 HCV 펩티드를 생성하고 확인하는 방법이 설명된다. 본 방법은 핵산 절편에 걸쳐있는 일련의 중복하는 연결 단편을 생성하기 위해 이용된다. HCV 게놈의 7,300 염기쌍 절편(이 서열은 부록에 제시됨)에 걸쳐있는 일련의 중복하는 연결 단편 생성에 상기 방법을 적용하는 것은 제1도 및 2도를 참조하여 설명될 것이다.

방법의 제1단계로서, 및 제1도를 참조하면, 관심있는 핵산은 2중 가닥 DNA 형탤서 얻어진다. 전형적으로, 이 단계는 게놈 DNA 단편을 분리하거나 샘플 유체에 존재하는 RNA 종으로부터 cDNA를 생성시킴으로써 수행된다. 후자의 방법은 공지의 PT-NANBH로 감염된 침팬지 또는 사람으로부터 혈청에 존재하는 NANBH 바이러스 RNA로부터 이중 가닥 DNA를 생성하는데 사용된다. 샘플 중의 RNA는 예컨대 PEG 침전된 비리온의 구아니디늄 티오시아네이트 추출에 의해 분리되고, 제1가닥 cDNA 합성에 적당한 프라이머와 반응된다.

제1가닥 cDNA 프라이밍은 랜덤 프라이머, 올리고 dT 프라이며, 또는 서열-특이적 프라이머(들)에 의해 이루어질 수 있다. 프라이머 조건은 (a) 관심있는 핵산 절편에 일괄하여 걸쳐있는 cDNA 단편들의 생성을 최적화하고 (b) 바람직하게는 길이가 약 1,000 염기쌍 이상인 cDNA 단편들을 생성하기 위하여 선택된다. HCV RNA에 적용된 한 방법에서, 제1가닥 합성은 공지의 HCV 게놈 서열의 길이를 따라 존재하는 간격이 있는 영역과 상보적인 서열-특이적 프라이머들을 이용하여 수행된다. 프라이머 위치는 HCV 게놈 절편의 지도를 도시하는 제2도에서 A, B, C 및 D에 표시되어 있따. HCV 게놈 중의 프라이머 염기쌍 위치는 하기 실시예 7에 제시되어 있다. 제1가닥 합성 후에, 제2cDNA 가닥이 표준 방법에 의해 합성된다.

방법에서 사용되는 연결 단편은 이하 설명될 한 쌍의 중복-영역 프라이머의 쌍을 사용하여, 상술한 바와 같이 수득한 이중 가닥 DNA의 서열-특이적 증폭에 의하여 제조된다. 본 발명의 방법의 중요한 장점에 따르면, 이중 가닥 DNA의 양이 직접적 서열-특이적 증폭에는 너무 적은 경우에도 연결 단편이 생성될 수 있다. 이러한 제한은 예컨대 NANBH 감염된 혈청으로부터 제조된 HCV cDNA들을 사용하여 밝혀졌다. 이때에 먼저 증폭에 이용가능한 이중 가닥 DNA의 양이 서열 독립성 단일-프라이머 증폭(SISRA)으로서 공지된 기법에 의해 비특이적으로 증폭된다.

SISPA 기법은 본 출원인의 공동 소유인, 1988년 7월 26일 출원된 미국 특허 출원 일련번호 제224,961호 RNA와 DNA의 증폭기법(RNA and DNA Amplification Techniques)에서 상세하게 설명된다. HCV cDNA 단편들의 증폭에 적용된 방법은 또한 실시예 7에서도 설명된다. 간단히 말하면, 공지 서열 링커 프라이머가 DNA 샘플중의 이중 가닥 DNA의 반대쪽 말단에 부착된다. 그런 다음 이들 링커는 링커/프라이머 서열에 상보적인 프라이머를 사용하는 프라이머-개시 증폭에 대하여 공통 말단 서열을 제공한다. 전형적으로, SISPA 방법은 연속 변성 및 제2가닥 DNA의 프라이머-개시 중합을 달성하기 위해 열적 주기를 이용하여 증폭의 20 내지 30주기 동안 수행된다.

제1도는 공지 서열 영역 Pi를 갖는 증폭된 단편을 형성하기 위하여 이중 DNA를 SISPA 증폭시키는 것을 도시한다. 도시된 바와 같이, 단편 혼합물은 (a) 혼합물 중의 다른 단편과 영역 Pi에서 중복하고, (b) 인접한 Pi와 Pi+1 영역 사이의 완전한 연결 영역을 함유하는 일부 이상의 단편을 포함한다. 종합해보면, 절편을 구성하는 관련 중복 영역들에 의해 경계를 이룬 각각의 연결 영역은 하나 이상의 DNA 단편에 존재한다.

본 발명의 방법에 따르는 중복 연결 단편들의 제조는 미국 특허 제4,683,195호에 기재된 중합효소 연쇄 반응(PCR)법을 이용하여 수행된다. 방법중 이러한 단계를 실시하는 경우, 먼저 관심있는 전체 절편이 상술한 바와 같이 공지 서열의 영역에 의해 경계를 이루는 일련의 중복 간격으로 나누어진다. 제2도에서, HCV 게놈의 7,300 염기쌍 절편은 10개의 간격으로 나누어졌고, 각각의 길이는 약 500-1,000 염기쌍이다. 간격은 하기 설명되는 바와 같이 서열 증폭에 사용된 정방향 Fi와 역방향 Rj 프라이머에 따라 표시된다. 간격의 선택은 (a) 간격의 각각의 말단에 있는 염기쌍 서열이 공지가 되어야 한다는 필요조건과, (b) 약 500과 2,000 염기쌍 사이의 바람직한 간격 길이에 의해 안내된다.

HCV 게놈의 7,300 염기쌍 절편에 적용된 방법에서, 10개의 간격 사이의 중복 영역은, SISPA 증폭된 cDNA 샘플이 HCV 연결 단편들의 PCR-증폭을 관찰하기에 충분한 HCV cDNA를 함유하였고, 게놈의 전체 길이에 걸친 HCV 영역이 증폭에 사용될 수 있는지를 증명하기 위하여 추가로 증폭되었다. 절편내의 각각의 중복 내영역은 중복 영역의 반대쪽 말단의 반대쪽 가닥에 상보적인 정방향 프라이머 Fi와 역방향 프라이머 Ri를 포함하는 한 쌍의 프라이머에 의해 규정될 수 있다. 프라이머들은 전형적으로 길이가 약 20 염기쌍이며, 약 200 염기쌍의 중복 영역에 걸쳐있다. HCV 절편내의 11개의 중복 영역과 각각의 영역에 있는 정방향 및 역방향 프라이머에 대응하는 영역은 실시예 8에 설명되어 있다.

프라이머 Fi/Ri는 PCR 반응 혼합물 중의 증폭된 DNA 물질에 첨가되며, 프라이머들에 의해 경계가 지워진 중복 영역은 20-30 열적주기에 의해 증폭된다. 그런 다음, 반응물질은 예컨대 아가로스 겔 전기영동에 의해 분류되고, 예컨대, 중복 영역의 내부 부분에 특이적인 방사성표지된 올리고누클레오티드 프로브를 사용하는 서던 블롯팅(Southern)에 의해 소망하는 서열의 존재에 대해 프로빙된다. 실시예 8에 설명되는 바와 같이, 이 방법은 HCV 게놈 절편에 있는 각각의 11개의 Fi/Ri 중복 영역에 대하여 증폭된 단편들을 제조하는데 성공적이었다. 중복 영역 단편들은 중복 영역에 의하여 연결된 유사한(2개의) 연결 단편에 대한 프로브로서 사용될 수 있다. 그러나, 이 증폭 단계가 소망하는 연결 단편의 제조에 필수적인 단계로서가 아니라, HCV 게놈의 길이를 따라 존재하는 증폭가능한 cDNA의 존재를 확인하기 위해 사용되었음이 강조된다. 단계는 제1도에는 생략되어 있다.

연결 단편 Fi/Rj는 SISPA-증폭된 DNA 단편들이 하나의 중복 영역의 정방향 프라이머 Fi와 인접한 중복 영역의 역방향 프라이머 Rj로 구성되는 한쌍의 프라이머에 의해 증폭되는 2-프라이머 PCR 과정에 의해 제조된다. HCV 절편에 있는 10개의 중복 영역 및 각각의 영역에 있는 정방향 및 역방향 프라이머에 해당하는 영역은 실시예 9에 설명되어 있다. 전형적인 증폭 조건도 실시예 9에 설명되어 있다. 각각의 반응 혼합물 중의 증폭된 단편들은 예컨대 겔 전기 영동에 의해 분리 및 정제됨으로써 예상된 단편 크기가 확인된다. 서던 블롯은 단편의 서열을 확인하기 위해 단편 말단 사이에 위치한 내부 영역에 상보적인 올리고누클레오티드 프로브로 프로빙될 수 있다. 제1도의 하부에 도시된 바와 같이, 방법은 연결 단편의 완전한 세트를 생성시키며, 각각의 단편은 중복 영역 Pi와 Pi+1에 의해 경계지워진다.

7,300 염기쌍의 HCV 게놈의 중복 연결 단편을 생성하기 위해 적용된 방법은 실시예 9에 설명되어 있다. 겔 전기 영동에 대한 크기 표준 및 서던 블롯팅에 의한 서열 표준에 의해 증명되는 바와 같이, 방법은 HCV 게놈에 걸쳐 있는 10개의 모든 중복 단편을 생성시키는 데에 성공적이었다.

상기 플랭킹 서열 증폭 방법이, 면역스크리닝에 의해 도한 얻어진, 클론 36과 40의 삽입 서열에 해당하는 DNA 단편들의 생성에도 적용될 수 있음이 인정될 거싱다. 삽입물 양쪽에 있는 링커 프라이머들은 클론 삽입물에 해당하는 서열 생성에 쉽게 사용된다. 예를 들어, F12/R9 프라이머 쌍(이것의 서열은 실시예 8에서 제시된다)을 사용하는 SISPA-증폭된 cDNA 단편들의 2-프라이머 증폭(실시예 7)은, 실시예 9에 기재된 것과 유사한 조건하에서 수행된다. 증폭된 단편 혼합물은 1.0아가로스상에서의 아가로스 전기 영동에 의해 분류되고, 예측된 밴드는 겔로부터 절단되고 용출된다.

정제된 증폭 단편은 분자가 평활 말단이 됨을 보증하기 위해 DNA 중합효소 Ⅰ의 클레노우 단편으로 처리된다. 그런 다음, 단편은 EcoRⅠ 링커들에 결찰된다(실시예 10). 그런 다음, 혼합물은 EcoRⅠ으로 소화되고, 람다 gt11 벡터안에 삽입된다. 생성되는 클론은 클론 36 또는 클론 40 삽입물 중 어느 하나의 완전한 코딩 서열을 함유한다.

다른 방법으로, 원래의 증폭된 36/40 단편(프라이머 F12/R9)이 엑소누클레아제Ⅲ(Boehringer Mannheim, 제조업자의 지시대로 사용함)로 처리되어 상이한 5' 말단을 갖는 단편의 패밀리가 생성된다. 이들의 소화생성물이 상기와 같이 처리되고 람다 gt11 벡터 안으로 결찰된다. 그런 다음, 생성되는 플라크가 면역스크리닝된다.

또한, 상술한 F12/R9 프라이머 이외의 상이한 세트의 프라이머가 직접 클론 36 및 40의 일부 또는 전부를 코드화하는 서열 생성에 사용될 수 있다. 예를 들어, 프라이머 F8/R9는 클론 36의 삽입물의 3' 서열의 일부(제4도)와 클론 40의 삽입 서열 전부(제3도)에 해당하는 단편을 생성할 수 있다. 또한, 프라이머 F7/R8은 클론 36의 삽입물에 존재하는 5' 서열의 일부에 해당하는 단편을 직접 생성하는데 사용될 수 있다(제4도).

Ⅴ. PT-NANBH 면역반응성 펩티드 단편들

사람 및 침팬지 NANBH 감염된 혈청으로부터의 혈청과 면역반응하는 여러개의 신규한 펩티드 항원은 본 발명의 방법에 따라 상기 생성된 NANBH 연결 단편으로부터 생성되었다. 또한, 이 방법으로 cDNA 라이브러리 면역스크리닝(상기 섹션 Ⅱ)에 의해 이미 확인된 항원성 영역이 확인되었다. 연결 단편으로부터 유도된 항원 펩티드들은 바람직하게는 실시예 10에 설명되는 바와 같이 먼저 각각의 상기 연결 단편을 부분 소화 조건하에 DNaseⅠ로 소화시켜, 주로 크기 범위가 100-300 염기쌍인 DNA 소화단편을 수득하는 것을 포함하는 방법으로 제조된다. 소화 단편들은 예컨대, 겔 전기 영동에 의하여 크기 분류되어 원하는 크기 범위의 것들이 선택될 수 있다.

그런 다음, 각각의 연결 단편으로부터의 소화 단편들이 적당한 발현 벡터 안으로 삽입된다. 하나의 전형적인 발현 벡터는 람다 gt11이며, 이 벡터의 장점은 앞서 설명되었다.

발현 벡터 안으로의 삽입을 위해서는, 소화단편은 필요에 따라 통상적인 과정에 의해 EcoRⅠ 링커와 같은 선택된 제한 부위 링커를 함유하도록 변형될 수 있다. 전형적으로, 소화 단편은 평활 말단으로 되며, EcoRⅠ 링커와 결찰된 후, EcoRⅠ 절단된 람다 gt11안에 도입된다. 그러한 재조합 기법은 당분야에 널리 공지되어 있다(참조:Maniatis et al.).

생성되는 바이러스 게놈 라이브러리는 비교적 큰(대표적인) 라이브러리가 각각의 연결 단편들에 대해 생성되었는지를 확인하기 위해 조사될 수 있다. 이는 람다 gt11 벡터의 경우, 적당한 박테리아 숙주를 감염시키고, 박테리아를 플레이팅하고, 투명한 플라크에 의해 증명되는 바와 같이 베타-갈락토시다제 활성의 결핍에 대한 플라크를 조사함으로써 수행될 수 있다.

투명한 플라크 중의 소화-단편 삽입물의 존재는 실시예 10B에서 설명되는 바와 같이 EcoRⅠ 삽입 부위를 플랭킹하는 gt11 파지의 영역에 특이적인 를 사용하여 파지 DNA를 증폭시킴으로써 확인될 수 있다. 표 3에 나타난 결과는 각각의 연결 단편 라이브러리에서 시험된 대다수의 플라크가 소화-단편 삽입물을 함유 하였음을 보여준다.

또한 연결 단편 라이브러리는 PT-NANBH 만성, 회복기 또는 급성 감염으로 확인된 사람 또는 침팬지 혈청과 면역반응하는 펩티드 항원에 대해 스크리닝될 수 있다. 하나의 바람직한 면역스크리닝 방법이 실시예 10B에 설명되어 있다. 이 방법에서 파지 감염된 박테리아에 의해 생성된 재조합 단백질은 플라크로부터 필터로 전달된다. 세척후, 필터는 시험 혈청과 인큐베이티오딘 다음, 리포터 표지된 항-사람 IgG 항체와 반응한다. 그런 다음, 필터상의 펩티드 항원의 존재가 리포터의 존재에 대해 측정된다. 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 여러개의 연결 단편 라이브러리는 1차 스크린에서 면역 활성 펩티드에 대하여 양성이었다.

상술된 면역스크리닝 방법은 공지의 만성, 회복기, 또는 급성 PT-NANBH 감염된 사람 또는 침팬지로부터의 혈청과 면역반응하는 각각의 연결 라이브러리로부터의 라이브러리 플라크를 확인하는데 이용될 수 있다. 하나의 전형적인 스크리닝 과정이 실시예 11에 제공되어 있으며, 여기에서, 10개의 HCV 연결 단편 라이브러리가, 공지의 PT-NANBH (a) 사람 만성 혈청, (b) 침팬지 급성 풀링된 혈청 및 (c) 침팬지 만면역반응성 풀링된 혈청으로 스크리닝된다. 조사된 10개의 라이브러리 중에서 F1/R10 라이브러리만이 세 가지 혈청 중 어느 것과도 양성의 면역반응을 나타내지 않았다. F3/R4, F6/R12, F12/R7, 및 F7/R8을 포함한 여러개의 단편 라이브러리들은, 침팬지 급성 혈청과 5 이상의 양성 반응을 나타냈고, 이는 이들 각각의 라이브러리가 침팬지 또는 사람 급성 PT-NANBH 감염을 검출하는데 유용한 하나 이상의 펩티드 항원을 발현함을 나타낸다.

단편 라이브러리 F7/R8은 클론 36 삽입물의 내부 단편에 해당한다(섹션 Ⅱ; 제4도). 따라서, 연결 단편 방법은 이 DNA 영역이 유용한 항원을 코드화함을 확인하였다. 또한, 단편 라이브러리 F8/R9는 클론 40 삽입물에 존재하는 서열을 함유한다(섹션 Ⅱ:제3도 및 4도). 표 4의 결과는 만성 감염 혈청의 존재를 검출하는데 효과적인 하나 이상의 펩티드 항원이 F8/R9 단편 라이브러리로부터 단리되었음을 나타낸다.

Ⅵ. 면역반응성 409-1-1 펩티드

A. 면역반응적 스크리닝

409-1-1(abc) 및 409-1-1(c-a)로 표시된, 면역반응적 스크리닝에 의해 확인된 면역반응성 플라크 중 2개가, 5-1-1 HCV 펩티드 항원에 대해 강한 면역반응성을 나타내었던, 잘 알려져 있는 PT-NANBH 만성혈청에 대한 면역반응성에 대해 시험되었다(Kuo). 5-1-1 HCV 펩티드 항원은 사람 PT-NANBH 만성 혈청의 거의 대부분에 대해 면역반응성을 나타내는 것으로 이미 확인되어 있다. 5-1-1 항원은 HCV 게놈의 염기쌍 3731과 3857 사이의 서열에 의해 코드화되며(부록), 그 자체가 염기쌍 3531과 4442 사이의 서열에 의해 코드화되는 보다 큰 펩티드 항원 C-100에 포함된다. 후자의 펩티드는 사람 HCV 감염의 검출을 위한 시판되는 진단용 키트에 사용된다(오르토/키론(Ortho/Chiron)). 키트는 상기 주지된 바와 같이 약 80의 사람 만성 PT-NANBH 샘플, 및 약 15의 사람 급성 PT-NANBH 혈청과 양성 반응하는 것으로 보고된다.

409-1-1(c-a)파지는 상기에 대략 설명된 바와 같이, 면역스크리닝에 의해 확인되고 플라크 정제되었다. 관련된 클론, 409-1-1(abc)로 표시된 클론은 본 출원의 모출원(미국 출원 일련번호 07/505,611)에 설명되어 있다. 클론 409-1-1(abc)는 모출원에는 409-1-1로 표시되었다. a, b 및 c라는 표시는 409-1-1(abc)서열의 세 영역을 의미한다(제5도 참조). 5-1-1 코딩 서열은 5-1-1 코딩 영역의 양 말단과 상보적인 올리고누클레오티드 프라이머들을 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 단리되었고, 5-1-1 항원 펩티드 영역을 포함하는 융합된 베타-갈락토시다제 단백질의 유도 조건하에 발현을 위해 람다 gt11에 클로닝되었다. 유사한 방법에 의해 5-1-1 파지가 확인되고 플라크 정제되었다.

409-1-1(c-a)와 5-1-1 항원은, 정상인(2명의 도너), 사람 PT-NANBH-만성(6명의 도너), 정상 침팬지(7마리의 도너), 침팬지 PT-NANBH-급성(5마리의 도너), 및 침팬지 PT-NANBH-만성(8마리의 도너)으로부터의 28개의 혈청의 패널에 의한 플라크 면역스크리닝에 의해 비교되었고, 그 결과는 실시예 12의 표 5에 나타난다. 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 409-1-1(c-a) 펩티드가 보다 높은의 사람 만성 혈청 샘플(83대 66)을 검출하였다고 하더라도, 5-1-1과 409-1-1(c-a) 펩티드는 대부분의 사람 및 침팬지 만성 혈청과 반응하였다. 5-1-1이 아닌 409-1-1(c-a) 펩티드에 의해 검출된 만성 사람 혈청은 전격성 NANBH 감염으로 사망한 환자(BV)로부터 취한 것이었다. 5-1-1 항원이 시판중인 키트 포맷(오르토/키론)에서 C-100 항원에 함유되기 때문에, C-100 항원이 시험 혈청과 더 넓은 범위의 반응성을 제공하는지의 여부를 측정하는 것이 관심의 대상이었다. 결과는 하기 표 5의 우측에 나타난다. 시험된 유일한 사람 NANBH 혈청은 5-1-1에 의해 검출되지 않은 상기 BV 혈청이었다. 또한, 이 혈청은 C-100 항원과도 면역반응하지 않았다(0/1). 시험된 5개의 급성 침팬지 혈청 중 어느 것도 C-100 항원과 반응하지 않았다(0/5). 또한 409-1-1(c-a) 항원이 5-1-1 항원에 대하여 5개 중 단지 1개와 반응하는 것과 비교하여, 시험된 5개의 급성 침팬지 중 혈청 중 3개와 면역반응하는 것이 주목된다. 결과는 409-1-1(c-a) 항원이 PT-NANBH 혈청과 더 넓은 면역특이성을 가지며, 이로써 더 우수한 진단제를 제공할 것임을 암시한다. 409-1-1(c-a)로 수득된 결과는 409-1-1(abc)로 수득된 결과와 유사하다.

본원에서 409-1-1(abc) 코딩 서열이 F4/F5 연결 단편에 함유되어 있으며, F₄/R₅및 F₅/R₆연결 단편에 있는 C-100(및 5-1-1) 코딩 영역의 서열과 중복되지 않는다는 것이 주목된다. 409-1-1(abc) 펩티드의 비교적 긴 코딩 서열은 보다 큰 크기의 소화 단편(실질적으로 300 염기쌍 보다 큼)이 항원 발현을 위한 소화 단편을 제조하는데 사용된 부분 소화 단계에서 생성됨을 설명한다.

본 발명의 1가지 일면을 구성하는 409-1-1(abc) 펩티드는 SEQ ID NO:10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 409-1-1 클론에 있는 삽입물에 해당하는 DNA 코딩 서열은 제5도에 제시되며 SEQ ID NO:9로 표시된다.

본 발명의 또 다른 일면을 구성하는 409-1-1(c-a) 펩티드는 SEQ ID NO:8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 409-1-1(c-a) 클론에 있는 삽입물에 해당하는 DNA 코딩 서열은 제6도에 제시되며 SEQ ID NO:7로 표시된다. 409-1-1(c-a)와 409-1-1(abc)의 코딩 서열 간의 관계는 실시예 12에 약술되어 있다. 간단히 말하면, 409-1-1(c-a)는 409-1-1 코딩 서열의 아미노산 말단으로 이동된 409-1-1(abc)의 카르복시 말단 영역으로 구성되며, 409-1-1(abc) 코딩 서열의 잔류 3'은 절단된다.

보다 일반적으로, 본 발명은 HCV로 감염된 사람으로부터의 혈청과 면역반응하는 펩티드 항원을 포함한다. 이러한 펩티드 항원은 본 발명의 방법에 의하여 쉽게 확인될 수 있다.

409-1-1 항원을 코드화하는 HCV 서열에 해당하는 영역으로부터 수득된 항원은 하기와 같이 추가로 특징화된다. 표 7에 나타난 프라이머는 이 영역으로부터 유도된 중복하는 증폭 단편들의 하나의 패밀리를 생성하기 위해 사용되었다. 여러개의 주형이 DNA 증폭 반응에 대해 사용되었다(표 8). 생성되는 클론의 코딩 서열의 상호관계는 제7도에 그래프로 도시된다. 그런 다음, 증폭된 단편들은 람다 gt11 벡터내에 클로닝되었다(실시예 13).

그후, 이들 클로닝된 단편이 면역스크리닝되었다(실시예 13). 9개의 클론중 7개가 예비 면역스크리닝에 의해 양성으로 시험되었다(표 9). 그런 다음, 7개의 클론이 많은 사람 임상 샘플을 포함하여 보다 많은 양의 PT-NANBH 혈청 샘플에 대해 시험되었다. 스크리닝에 대해 사용된 혈청과의 반응성에 대한 항원들의 민감도는 내림차순으로 다음과 같았다:33cu33c409-1-1(c-a)409-1-1-F1R2409-1-1(abc) 409-1-1a5-1-1409-1-1(c+270). 이들 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 409-1-1(c+270)을 제외한 모든 대용 클론들은 5-1-1 보다 민감한 항원을 제공하였다. 그러나, 33cu와 33c가 매우 민감한 항원이라고 하더라도, 이 검정에서 이들은 HCV에 대하여 네가티브인 것으로 알려진 혈청과 아주 미미하게 반응하였고, 따라서 덜 특이적일 수 있다. 따라서, 409-1-1 시리즈가 HCV 유도된 항체에 보다 특이적이기 때문에 진단 항원으로서 사용하기에 바람직한 것으로 여겨진다.

클론 36과 45 코드화된 에피토프를 포함하도록 면역스크리닝을 연장시켰다:클론 45의 삽입물은 본질적으로 클론 40의 삽입물과 동일하다(실시예 4). 표 11에 나타난 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 클론 36과 40에 의해 생성된 항원들은 409-1-1(c-a) 만큼은 민감하지 않지만, 선택된 샘플에 대해 HCV-특이적 면역양성 신호를 산출한다. 따라서, 본 발명에 제시된 2가지 방법인 (ⅰ) 혈청 유도된 RNA로부터 직접 생성된 cDNA 라이브러리의 면역스크리닝법 및 (ⅱ) 증폭된 단편 라이브러리의 면역스크리닝법은 둘 모두 바이러스 항원을 코드화하는 cDNA 서열을 확인하는 효과적인 방법으로 여겨질 수 있다. 또한, 증폭된 단편 라이브러리 방법을 이용하여 이들 HCV 영역에 해당하는 항원의 확인에 의해 클론 36과 40 코드화된 항원을 확인하는 것은 증폭된 단편 방법의 유용성을 입증한다.

B. 펩티드 정제

본 발명의 재조합 펩티드들은 차동 침전, 분자 체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 등전점 포커싱, 겔 전기 영동 및 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있는 표준 단백질 정제 과정에 의해 정제될 수 있다. 전술한 바와 같이 제조된 베타-갈락토시다제 융합 단백질과 같은 융합 단백질의 경우, 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해, 세포 용해 물질을 표면 결합된 항-베타-갈락토시다제 항체를 갖는 고체 지지체상에 통과시킴에 이해 쉽게 분리될 수 있다. 예를 들어, 409-1-1(c-a) 코딩 서열들로부터 유도된 베타-갈락토시다제/융합 단백질의 친화성 크로마토그래피에 의한 정제는 실시예 14에 설명되어 있다.

또한 글루타티온-S-트란스페라제(Sj26) 단백질과 융합된 409-1-1(a) 펩티드를 함유하는 융합 단백질은 대장균 KM 392 세포에서 pGEX 벡터 시스템을 사용하여 발현되었다(Smith). 이 발현 시스템은 융합 단백질이 일반적으로 가용성이어서, 불변성 조건하에 단리될 수 있다는 잇점을 지닌다. 융합된 Sj26 단백질은 글루타티온 기질 친화성 크로마토그패피에 의해 신속하게 단리될 수 있다(Smith). 이러한 융합 단백질을 발현시키는 이 방법은 실시예 15에 제공되어 있으며, 본 발명에 기재된 그 밖의 모든 항원 코딩 서열에 적용될 수 있다.

또한 본 발명에는 적당한 숙주에서 코딩 영역을 발현시키는 발현 조절 엘레먼트와 409-1-1(a) 코딩 서열을 함유하는 상술된 람다 gt11 또는 pGEX 벡터와 같은 발현 벡터가 포함된다. 코딩 서열은 HCV 게놈의 염기쌍 2755-3331에 해당하는 상기에 제시된 서열내에 포함된다. 조절 엘레먼트는 일반적으로 프로모터, 번역 개시 코돈, 번역 및 전사 종결 서열, 및 삽입물을 벡터에 도입하기 위한 삽입부위를 포함한다. 실시예 15에 예시되는 두 가지 벡터의 경우, 조절 엘레먼트들은 이종 펩티드 항원과 융합되는 단백질의 합성을 조절한다. 이러한 발현 벡터는 본 발명에 의해 설명된 그 밖의 항원 코딩 서열에 대해 쉽게 제조될 수 있다.

다음의 코딩 영역들을 함유하고 있는 람다 gt11 벡터들이 미합중국 20852 메릴랜드 록빌 파크로온 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁되어 있다:gt11/409-1-1(abc)로 표시되는 409-1-1(abc) 코딩영역(ATCC NO. 40876); gt11/409-1-1(c-a)로 표시되는 409-1-1(c-a) 코딩영역(ATCC NO. 40792); gt11/36으로 표시되는 클론 36(ATCC NO. 40901); 및 gt11/40으로 표시되는 클론 40(ATCC NO. 40893).

Ⅶ. HCV-캡시드 항원의 면역반응성 클론

1990년도 간질환학 회의에서, HCV 비코딩 구조 코아 단백질과 엔벨로프 단백질 코딩 서열을 폴리단백질 서열의 캡시드 부분으로서 함유하고 있는, 누클레오티드 잔기 325-970의 온길이의 HCV 핵산 서열 영역이 발표되었다. 본 발명을 지지하기 위해 수행된 실험과정 중에, 캡시드 단백질에 해당하는 코딩 영역이 보다 분명하게 규정되었다.

중합효소 연쇄 반응 프라이머들은 온길이의 HCV 게놈(부록 참조)의 누클레오티드 325-970의 증폭 생성물을 생산할 선택된 HCV 서열로부터 제조되었다. 이들 프라이머인 SF2(C)와 SR1(C)가 실시예 16에서 설명된다. 프라이머들은 후속되는 클로닝 조작을 용이하게 하기 위한 제한 효소 절단 부위들을 코드화하는 비상보적 서열을 함유하였다. 프라이머들은 SISPA 증폭된 HCV cDNA 분자(실시예 7)를 기질로서 함유하는 증폭반응에 사용되었다. 생성되는 증폭 생성물은 pGEX 및 pET 벡터내에 클로닝되었다(실시예 16). pGEX 벡터는 삽입된 코딩 서열을 Sj26 단백질, 즉, 글루타티온-S-트란스페라제에 대한 융합 단백질로서 발현시킨다. pET 벡터내로 삽입되면 융합 서열과는 무관한 삽입된 코딩 서열이 발현된다.

그런 다음, 이들 클론은 HCV-항원과 반응하는 것으로 알려져 있는 혈청을 사용하여 면역스크린되었다(실시예 17). 두 벡터내의 여러 개의 클론이 항-HCV 혈청과 면역반응하는 것으로 확인되었다(pGEX의 경우, 클론 14,15,56,60 및 65, 실시예 17, 표 13). pGEX내의 클론으로부터 생성된 융합 단백질은 예상보다 작은 것으로 관찰되었다.

클론 15는 Sj26/HCV-항원 융합 단백질의 대규모 제조를 위핸 선택되었다. 융합 단백질 생성물(약 29kd)은 예상했던 융합 생성물(약 50kd, 실시예 17)보다 작았다. 또한, 이 제조법에 의한 융합 단백질의 수율은 예상밖으로 낮았다.

클론 15와 56이 HCV-항원 함유 삽입물의 핵산 서열화를 위해 선택되었다(실시예 18). 이들 2개의 클론의 서열은 클론 15가 누클레오티드 위치 126에서 시작하는 종결 코돈을 가지고 있는 것을 제외하고는 매우 유사하였다. 이 결과는 HCV 삽입물에 의해 코드화된 아미노 말단의 42개 아미노산이 면역스크리닝을 위해 사용된 항-HCV 혈청에 대하여 면역원성임을 암시한다.

HCV 폴리단백질의 아미노 말단이 항원성이라는 암시를 시험하기 위하여, 본질적으로 제8(a)도의 아미노산 잔기 6-24에 해당하는 합성 올리고펩티드가 제조되었다:이 펩티드는 ELISA에 의해 시험된 바와 같이 항-HCV 혈청과 매우 강한 면역반응성을 가졌다. 이 영역(제10도, C1NC105, SEQ ID NO:25)에 해당하는 클론을 생성하기 위하여 PCR 프라이머들(제8도, C1과 NC105)이 고안되었다. 3개의 다른 합성 펩티드가 시험되었고, 그 중 하나는 항-HCV 혈청과 강력하게 면역반응하였고(아미노산 잔기 47-74, 제8(a)도), 2개는 약하게 면역반응하였다(아미노산 잔기 39-60 및 101-121, 제8(a)도). 이들 합성 펩티드들은 캡시드 단백질 영역내의 HCV 폴리단백질의 아미노 말단 끝에 있는 강한 항원성 영역의 존재를 확인시켜준다.

pGEX-GG1-56으로 표시된 클론 56의 서열은 제8(a)도에 도시되며, SEQ ID NO:11로서 서열 목록에 표시된다. 융합 단백질의 생성이 유도되었을때, 예상했던 생성물 보다 작은 융합 단백질이 생성되었으며, 이것은 클론 15 생성물과 크기가 유사하였다. 클론의 누클레오티드 서열은 번역시 프레임 이동이 쉬운 영역인 AAAAAAAAAA(참조:Atkins et al., Wilson et al.)를 나타냈다. 이러한 누클레오티드 서열은 이들 클론이 대장균에서 발현될 때 낮은 단백질 수율에 기여할 수 있다. 융합 단백질 발현의 수준을 향상시키기 위해, 이 영역을 통한 수 개의 코돈의 세번째 누클레오티드 위치를 G로 변화시켰고, 그 결과 서열 AGAAGAAGAA이 생성되었다(실시예 20):변화는 단백질 코딩 서열(아미노산 잔기 8-10, 제8(a)도)에는 영향을 미치지 않았다. 이 변형된 삽입물은 pGEX 벡터에 클론되었고, 생성되는 플라스미드는 pGEX-CapA로 명명되었다.

pGEX-GGI의 삽입물의 단백질 코딩 서열에 대한 수치료 도표가 작성되었다(실시예 19, 제9도). 이 분석의 결과는 약 아미노산 잔기가 168-182인 코드화된 단백질의 카르복시 말단 영역이 막 스패닝 절편이 될 가능성이 있음을 나타내었다. 막 스패닝 절편이 강력한 항원을 제공하지 않는 것으로 여겨지고 이들 영역을 포함한 단백질의 과잉생성이 박테리아 세포의 성장에 불리한 영향을 미칠 수 있기 때문에, 일련의 카르복시 말단 결실이 pGEX-CapA로부터 생성되었다(실시예 20).

카르복시 말단 결실을 생성하기 위해 PCR 프라이머는 pGEX-CapA 삽입물 코드화된 단백질의 다양한 영역과 상보적이 되도록 디자인되었다. 카르복시 말단 결실을 생성하기 위해 사용된 프라이머들은 표 14에 제시되며, 삽입물 코딩 서열에 관한 프라이머들의 위치는 제8(b)도에 표시된다. 카르복시 말단 결실 단편들은 pGEX 벡터내에 클로닝되었고, Sj26/HCV-삽입물 융합 단백질이 생성되었다. 그런 다음, 이들 융합 단백질은 항-HCV 혈청으로 스크리닝되었고, 면역반응성 폴리펩티드에 대하여 토프 지도가 작성되었다(제10도 참조). 클론 C1NC270, C1NC360, 및 C1NC450은 모두 높은 수준의 Sj26/HCV 융합 단백질을 발현하였다. 또한, 이들 융합 단백질은 모두 이들의 핵산 코딩 서열로부터 예측되는 크기에 상응한다. 클론 C1NC520과 C1NC580은 저수율의 융합 단백질을 생성하였는데, 이는 아미노산 잔기 168-182의 소수성 영역이 존재하는 경우에 그것이 앞서 수득된 불량한 단백질 수율의 부분적인 원인이 될 수 있음을 암시한다.

추가로 pGEX-CapA 코드화된 HCV 항원의 항원성 영역을 분석하기 위해 결실 분석을 계속하였다. 카르복시 말단 결실과 조합된 일련의 아미노산 결실(표 15의 프라이머)이 PCR 프라이머들을 사용하여 생성되었다:모든 프라이머들의 위치는 제8(b)도에 도시된다.

결실분석의 결과는 표 16과 제10도에 나타난다. 상기에 제시된 합성 펩티드 데이타와 조합해볼 때 이들 결과는 캡시드 단백질(HCV 폴리단백질의 N-말단을 포함함)이 2개의 우세한 면역반응성 영역을 가지고 있음을 암시한다. 이들 면역반응성 영역은 둘 모두 진단 항원으로서 유용하다. 처음 35 아미노산을 포함하고 있는 영역은 에피토프 중의 하나에 걸쳐있고, 잔기 34-90에 걸쳐 있는 영역은 다른 강력한 면역반응성 도메인을 포함한다.

요약하면, HCV 폴리단백질의 N-말단 및 34, 90, 120 또는 150 잔기 중의 어느 하나를 함유하고 있는 pGEX 클론은 모두 HCV 양성 혈청에 의하여 효율적으로 인식되는 것으로 밝혀진 다량의 융합 단백질을 생성하였다. 또한 아미노산 잔기 34-90을 함유하고 있는 PCR 삽입물의 발현은 강력히 면역반응성인 반면에, 잔기 90-120 또는 90-150을 코드화하는 삽입물들은 면역반응성이지 않았는데, 이는 이들 영역이 사람 혈청에 의해 인식되지 않았음을 입증한다. 이 결과는 재조합 항원의 제조에 중요한 영역들이 잔기 1 내지 잔기 90 사이에 함유되어 있음을 암시한다.

pGEXC1NC450 단백질과 pET360 단백질의 분석은 웨스턴과 ELISA 포맷에 이들 항원을 함입시키면, HCV 음성 또는 HCV 불확정(indeterminate) 중 어느 하나로 이미 확인되었던 HCV 양성 혈청의 확인이 가능해짐을 보여주었다. 따라서, 이들 에피토프들의 함입은 개선된 스크리닝 시스템의 생성을 가능하게 한다(실시예 21).

Ⅷ. 항-HCV 항원 항체

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 재조합 항원에 대하여 특이적인 항체를 포함한다. 전형적으로, 항체를 제조하기 위해 토끼와 같은 숙주 동물이 정제된 항원 또는 융합된 단백질 항원으로 면역된다. 숙주 혈청 또는 혈장은 적절한 시간 간격으로 수집되고, 이 혈청은 항원에 대해 특이적인 항체에 대하여 시험된다. 실시예 15는 Sj26-409-1-1(a)와 베타-가락토시다제/409-1-1(c-a) 융합 단백질 형태의 409-1-1 항원에 대하여 특이적인 토끼 혈청 항체의 제조를 설명하고 있다. 이들 기법은 본 발명의 다른 항원에도 동일하게 적용될 수 있다.

면역된 동물의 감마 글로불린 분획 또는 IgG 항체는 예컨대, 포화 암모늄 술페이트 또는 DEAE 세파덱스를 사용하거나 다클론성 항체 제조에 대해 당분야의 숙련자에게 공지되어 있는 그 밖의 기법을 사용하여 수득될 수 있다.

대안적으로, 정제된 항원 또는 융합된 항원 단백질이 단클론성 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 여기에서, 면역된 동물로부터 비장 또는 림프구가 분리되어, 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 하이브리도마를 제조하기 위해 불멸화되거나 사용된다. 사람-사람 하이브리도마를 제조하기 위해서는, 사람 림프구 공여자가 선택된다. HCV 바이러스로 감염된 것으로 알려져 있는 공여자(여기에서, 감염은 예컨대 혈액 중의 항-바이러스 항체의 존재에 의해 나타남)가 적당한 림프구 공여자의 역할을 할 수 있다. 림프구가 말초혈 샘플로부터 단리될 수 있거나, 공여자가 비장절개수술을 받은 경우에는 비장세포가 사용될 수 있다.

엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(EBV)가 사람 림프구를 불멸화시키기 위해 사용될 수 있거나 사람 융합 파트너가 사람-사람 하이브리도마를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 또한 펩티드에 의한 1차 시험관내 면역화가 사람 단클론성 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

불멸화된 세포에 의해 분비된 항체는 예컨대, 실시예 15에서 설명되는 웨스턴 블롯 방법을 이용하여, 원하는 특이성을 가지는 항체를 분비하는 클론을 결정하기 위해 스크리닝된다.

Ⅸ. 활용도

A. 진단방법 및 키트

본 발명의 방법에 의해 수득된 항원 특히, 409-1-1 항원 409-1-1(abc), 409-1-1(c-a), 및 관련 항원(표 9 참조), 클론 36 항원, 및 클론 40 항원 및 캡시드 항원은 HCV 감염된 혈청에 존재하는 항-HCV 항체에 대한 진단제로서 사용하기에 유리하다. 주지된 바와 같이, 다수의 항원이 보다 광범위한 PT-NANBH 감염된 혈청, 특히 급성 감염 혈청과 면역반응한다는 점에서 공지의 HCV 항원 시약 5-1-1과 C-100에 비해 장점을 제공한다. 이것은 특히 섹션 Ⅶ에서 설명된 바와 같이 HCV-코아 단백질 항원과 409-1-1 항원의 조합에 대해 사실이다. 항원 409-1-1(c-a)와 Cap 450은 ELISA 시험 키트에서 조합되었고, 애봇트와 오르토(Abbott Ortho)에 의해 제조된 HCV 시험 키트에 대해 시험되었다. 본 발명의 항원은 애봇트와 오르토 시험 키트와 유사하거나 더욱 양호한 고도의 특이성을 가지면서 더 많은 HCV 양성 (+) 샘플을 일관되게 확인한다.

한 바람직한 진단 형태에서, 시험 혈청은 바람직의 방법에 의해 수득된 표면 결합된 HCV 항원(또는 항원들), 예컨대 409-1-1(c-a) 항원과 Cap450 항원을 가지고 있는 고체상 시약과 반응한다. 항-HCV 항체가 시약에 결합하고, 세척에 의해 미결합된 혈청 성분을 제거한 후에, 시약을 리포터 표지된 항-사람 항체와 반응시켜, 고체 지지체상에 있는 결합된 항-PT-NANBH 항체의 양이 비례하여 리포터를 시약에 결합시킨다. 시약은 다시 세척되어 미결합된 표지된 항체가 제거되고, 시약과 결합된 리포터의 양이 측정된다. 전형적으로, 리포터는 적당한 형광계 또는 비색계 기질의 존재하에 고체상을 인큐베이팅함으로써 검출되는 효소이다.

상기 검정에 사용된 고체 표면 시약은, 단백질 물질에 중합체 비드, 딥 스틱(dip sticks), 96-웰 플레이트 또는 필터 재료와 같은 고체 지지체 물질에 부착시키기 위한 공지된 기법에 의해 제조된다. 이들 부착 방법은 일반적으로 지지체에 대한 단백질의 비특이적 흡착, 또는 활성화된 카르복실, 히드록실 또는 알데히드 그룹과 같은 고체 지지체상에 있는 화학 반응기에 대한 전형적으로 유리 아민기를 통한 단백질의 공유 부착을 포함한다.

균일 검정으로서 알려져 있는 제2진단 형태에서, 고체 지지체에 결합하는 항체는 배지에서 직접 검출될 수 있는 반응배지의 약간의 변화를 생성시킨다. 지금까지 제안된 균일 검정법의 공지된 일반적 유형은 (a) 항원에 결합하는 항체가 보고된 이동성의 변화(스핀 분할 피크의 광역화)에 의해 검출되는 스핀 표지된 리포터, (b) 결합이 형광성 효율의 변화에 의해 검출되는 형광 리포터, (c) 항체 결합이 효소/기질 상호작용을 초래하는 효소 리포터, 및 (d) 결합이 리포좀 용해와 캡슐화된 리포터의 방출을 유지하는 리포좀 결합된 리포터를 포함한다. 본 발명의 단백질 항원들에 대한 이들 방법의 적용은 균일 검정 시약을 제조하기 위한 종래의 방법을 따른다.

전술된 각각의 검정법에서, 검정 방법은 시험 개체로부터의 혈청을 단백질 항원과 반응시키고 결합된 항체의 존재에 대해 항원을 조사하는 것을 포함한다. 조사는 표지된 항-사람 항체를 조사하려는 항체, 즉, IgM(급성 단계) 또는 IgG(회복 또는 만성 단계)중 어느 하나에 부착시키고, 제1방법에서와 같이 고체 지지체에 결합된 리포터의 양을 측정하는 것을 포함하거나, 제2방법에서와 같이 균일 검정 시약에 대한 항체 결합의 효과를 관찰하는 것을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 일부를 구성하는 것은 전술된 검정 방법을 수행하기 위한 검정 시스템 또는 키트이다. 키트는 일반적으로 표면 결합된 재조합 HCV 항원(예컨대 409-1-1 항원 등, 상기한 바와 같음), 및 표면 결합된 항-PT-NANBH-항원 항체를 검출하기 위한 리포터 표지된 항-사람 항체를 포함한다.

상기 섹션 Ⅲ에 논의된 바와 같이, 여러개의 연결 단편 라이브러리와 관련된 펩티드 항원들은 침팬지로부터의 급성 NANBH 혈청과 면역반응하는데, 이는 펩티드가 사람 혈청에서 급성 NANBH 감염을 검출하는데 유용함을 나타낸다. 특히, 연결 단편 라이브러리, F8/R9(만성혈청과 반응함), F3R4, F6B12, F12R7, F7R8, 또는 F7R8(실시예 11에서 급성 침팬지 혈청과 면역반응하는 하나 또는 그 이상의 펩티드 항원을 생성하는 것으로 나타남)에 의해 생성된 하나 이상의 펩티드 항원은, 409-1-1 항원과 조합되어 만성 및 급성 사람 NANBH 혈청 샘플의 대부분과 면역반응할 수 있는 진단 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 상기 섹션 Ⅶ에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 HCV-캡시드 단백질 항원의 함입은 여분의 민감성을 부여한다.

제3진단 형태는 상기 섹션 Ⅵ에서 설명된, HCV 특이적 항원을 검출할 수 있는 항-HCV 항체들의 사용을 포함한다. HCV 항원들은 예컨대 후보 혈청 샘플에 존재하는 HCV 항원이 HCV 특이적 단클론성 항체와 반응하는 항원 포획 검정법을 사용하여 검출될 수 있다. 단클론성 항체가 고체 기질에 결합된 다음, 항원이 제2의 상이한 표지된 항-HCV 항체에 의해 검출된다:HCV 특이적 항원에 대해 유도되는 본 발명의 단클론성 항체들은 이 진단 방법에 특히

적당하다.

B. 펩티드 백신

본 발명의 방법에 의해 확인된 HCV 항원, 예컨대 409-1-1(c-a)와 HCV-코아 단백질 항원은 HCV 백신에서 사용하기 위해 제형화될 수 있다. 백신은 물, 식염수, 완충 식염수, 완전 또는 불완전 보조제 등과 같은 적당한 희석제 중에서 표준 방법에 의해 제형화될 수 있다. 면역원은 비활성화되거나 약화된 바이러스 입자 또는 항원을 함유하고 있는 생리적으로 적합한 멸균 용액의 피하 투여와 같은 항체 유도를 위한 표준 기법을 사용하여 투여된다. 면역반응을 생성하는 양의 바이러스 입자가 전형적으로 1회 백신 주사 당 전형적으로 1이하의 부피로 투여된다.

백신 조성물의 구체적인 실례는 약리학적으로 허용되는 보조제중에 재조합 409-1-1(c-a) 펩티드를 포함한다. 백신은 항-HCV 항체의 상당한 역가가 혈청에서 검출될 때까지 주기적으로 간격을 두고 투여한다. 또한 이러한 백신은 본 발명의 HCV 항원들의 조합을 포함할 수 있다.

C. 수동 면역예방

본 발명의 항-HCV 항체는, 항체-바이러스 복합체가 마크로파지 및 그 밖의 이펙터 세포들에 의해 인식되기 때문에, 항-HCV 면역반응의 증강 수단으로서 사용될 수 있다. 항체는 항체의 그 밖의 치료 투여를 위해 사용된 양과 유사한 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 풀링된 감마 글로불린은 세포내로의 바이러스 침입을 방해하기 위하여 광견병, 발진성 질병 및 B형 간염과 같은 그 밖의 바이러스성 질병의 초기 인큐베이션 동안에 파운드(1b) 체중당 0.02 내지 0.1로 투여된다. 따라서, 예컨대 409-1-1(c-a) 항원과 반응하는 항체는 면역반응 및/또는 항바이러스 약물의 효력을 증강시키기 위해 그 밖의 항-바이러스 항체와의 칵테일(cocktail)에서 단독으로, 또는 또 다른 항-바이러스제와 조합된 형태로, PT-NANBH 바이러스에 감염된 숙주에게 수동 투여될 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 다양한 일면을 예시하는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

[재료]

대장균 DNA 중합효소 Ⅰ(클레노우 단편)은 뵈링거 만하임 바이오케미칼스(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)로부터 구입하였다. T4 DNA 리가아제와 T4 DNA 중합효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스사(미국 메사츄세츠 비벌리 소재)로부터 구입하였고, 니트로 셀룰로오스 필터는 쉴라이헤르 앤드쉬엘(Schleicher and Schuel, Keene, NH)로부터 구입하였다.

합성 올리고누클레오티드 링커와 프라이머는 시판되는 자동 올리고누클레오티드 합성기를 사용하여 제조하였다. 대안적으로, 주문설계된 합성 올리고누클레오티드를 예컨대 신세틱 제너틱스(Synthetic Genetics, San Diego, CA)사로부터 구입할 수 있다. cDNA 합성 키트와 랜덤 프라이밍 표지화 키트는 뵈링거-만하임 바이오케미칼(BMB, Indianapolis, IN)로부터 구입하였다.

[실시예 1]

[NANBH-함유 cDNA 라이브러리의 제조]

A. HCV에 의한 침팬지의 감염

침팬지(#771)를, 제Ⅷ인자 농축물로 처리된 사람 환자에서 비경구적으로 전염되는 비A비B형 간염(PT-NANBH)을 유도하는 것으로 알려져 있는 제Ⅷ인자 제제형으로 접종시켰다(Bradley). 감염후의 간조직의 초구조적 변화를 전자 현미경으로 관찰하였고, ALT(알라닌 아미노 트란스페라제) 상승을 감염된 침팬지에서 관찰하였다. 이들 관찰은 PT-NANBH 감염과 일치한다.

B. 혈청으로부터의 RNA의 분리

상술한 감염된 침팬지(#771)와 4명의 PT-NANBH 임상 공급자(EGM, BV, CC 및 WEH)로부터 혈청을 수집하였다. 각각의 희석하지 않은 혈청 10를 30K에서 3시간동안, 4에서 SW 40로터로 원심분리함으로써 펠릿화하였다. RNA를 다음과 같이 페라미스코(Feramisco et al.) 등의 고온 페놀법을 변형시켜 사용하여 생성된 각각의 혈청 펠릿으로부터 추출하였다. 간단히 말하면, 각각의 개별적인 혈청 샘플에 대하여, 펠릿을 1SDS를 함유하는 0.5의 50mH NaOAc, pH=4.8중에 재현탁시키고, 동부피의 60페놀을 첨가하고, 60에서 15분 동안 때때로 와동시키면서 인큐베이팅하였다. 이 혼합물을 1.5마이크로퓨즈 튜브에 옮기고, 테이블 탑 마이크로퓨즈에서 실온에서 2분 동안 회전시켰다. 수성상을 새로운 마이크로퓨즈 튜브에 옮기고, 수성 상에 50의 3M NaOAc, pH=5.2와 2부피의 100에탄올을 첨가하였다. 이 용액을 -70에서 약 10분간 유지시킨후 마이크로퓨즈에서 4에서 10분간 회전시켰다. 생성되는 펠릿을 100의 멸균 유리 류수에 재현탁시키고, 이 용액에 10의 NaOAc, pH=5.2와 2부피의 100에탄올을 첨가하였다. 이 용액을 -70에서 10분 이상 동안 유지시킨 후, 5에서 15분 동안 12,000×g로 마이크로퓨즈에서 원심분리함으로써 펠릿을 회수하였다. 펠릿을 70에탄올로 세척하고 진공하에 건조시켰다.

C. cDNA의 합성

(ⅰ) 제1가닥 합성

cDNA 분자를 다음과 같이 합성하였다. 상술된 RNA 제제형을 각각, 26의 멸균 유리 증류수(디에틸 피로카보네이트로 처리됨, Maniatis et al.), 5의 10×반응완충액(0.5M Tris HCl, pH=8.5; 0.4M KCl; 0.1M MgCl2 4mM DTT). 10의 누클레오티드 용액(각각 5mM 농도인 dGTP, dATP, dTTP, 및 dCTP), 5의 랜덤 프라이머, 0.25의 32P-dCTP, 2의 AMV 역전사효소, 및 2의 RNASINP(Promega)중에 전체 반응 부피가 50가 되도록 재현탁시켰다. 이 혼합물을 42에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다.

(ⅱ) 제2가닥 cDNA 합성

제1가닥 합성 반응 혼합물에 다음 성분들을 첨가하였다:55의 2×제2가닥 합성 완충액(50mM Tris HCl, pH=7.0; 60mM KCl); 2의 RNase H; 5의 DNA 중합효소 Ⅰ, 및 2의 상술한 누클레오티드 용액. 반응물을 12에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후, 실온에서 1시간 인큐베이팅하였다. 반응 혼합물을 동부피의 1:1 페놀/클로로포름으로 추출한 후, 24:1의 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하였다. 각각의 반응 혼합물에 운반체로서 1의 10/tRNA를 첨가하였다. 2부피의 100에탄올을 첨가하고 -70에서 15분간 냉각시킴으로써 cDNA를 침전시켰다. cDNA를 원심분리에 의해 수집하고, 펠릿을 70에탄올로 세척하여 진공하에 건조시켰다.

(ⅲ) 클로닝을 위한 이중 가닥 cDNA의 제조

벡터 적합성 양 말단을 제공하기 위하여, 각각의 이중 바닥 cDNA 제제형을 다음 방식으로 EcoRⅠ 링커로 테일링하였다.

cDNA를 다음 조건하에 EcoRⅠ 메틸레아제로 처리하였다 : cDNA 펠릿이 20의 1×메틸라아제 완충액(50mM Tris HCl, pH=7.5; 1mM EDTA; 5mM DTT), 2의 0.1mM S-아데노실-메티오닌(SAM) 및 2의 EcoRⅠ 메틸라아제(New England Biolabs) 중에 재현탁되는 조건. 반응물을 37에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH=7.5; 1mM EDTA, pH=8.0)을 첨가하여 최종 부피를 80로 만들었다. 반응 혼합물을 동 부피의 페놀/클로로포름(1:1)으로 추출한후, 동 부피의 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)로 추출하였다. 2부피의 에탄올로 cDNA를 침전시켰다.

그런 다음, 링커의 첨가를 위해 평활 말단의 수를 최대화하기 위하여[Maniatis et al, 1982], cDNA를 DNA 중합효소 Ⅰ의 클레노우 단편으로 처리하였다. 펠릿화된 cDNA를 11.5의 증류수에 재현탁시키고, 다음의 성분을 재현탁된 DNA에 첨가하였다:4의 5×NTB(10×NTB 원액:0.5M Tris Cl, pH=7.2; 0.1M MgSO4; 1mM 디티오트레이톨(DTT); 500/의 우혈청알부민(BSA)); 3의 0.1M MgCl2, 1.510GATC (10mM의 각각의 누클레오티드 G, A, T 및 C를 함유하고 있는 용액), 및 1의 클레노우(Boehringer Mannheim Biochemicals). 반응 혼합물을 실온에서 30분간 인큐베이팅하였다. 반응 혼합물을 전술한 바와 같이 페놀/클로로포름으로 추출한 후, 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출한 다음, 2부피의 에탄올로 침전시켰다.

cDNA 펠릿을 12의 증류수에 재현탁시키고, 재현탁된 링커에 다음 성분들을 첨가하였다:5의 EcoRⅠ 인산화된 링커(New England Biolabs), 2의 10×결찰 완충액(0.66M Tris.Cl, pH=7.6, 50mM MgCl2, 50mM DTT, 10mM ATP) 및 1의 T4 DNA 리가아제. 반응액을 14에서 밤새 인큐베이팅하고, 다음날 아침, 반응액을 67에서 3분간 인큐베이팅하여 리가아제를 비활성화시킨 다음 잠시 냉각시켰다. 결찰 반응 혼합물에 2.5의 10×고염 제한 소화 완충액(Maniatis et al.)과 2.5의 EcoRⅠ 효소를 첨가하고, 혼합물을 37에서 6시간 이상 내지 밤새 인큐베이팅하였다. 과잉의 링커를 제거하기 위해 소화 혼합물을 1.2아가로스 겔 상에 로딩시킨후 전기 영동에 의해 반응 성분을 크기 분류하였다. 0.3-1.3kb와 1.3-7kb 범위의 크기 분획을 NA45 페이퍼(Schleicher and Schuell) 상에서 전기 용리시켰다. 용리된 cDNA가 결합된 NA45 페이퍼를, 0.5의 용리 용액(50mM의 아르기닌, 1M NaCl, pH=9.0)을 함유하고 있는 1.5의 마이크로퓨즈 튜브에 넣은 다음, 튜브를 약 1시간 동안 67에서 놓아두어, cDNA가 페이퍼로부터 용액으로 용리되도록 하였다. 그런 다음, 용액을 페놀/클로로포름과 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고, 2부피의 에탄올로 침전시켰다. 생성되는 cDNA 펠릿을 20의 TE(pH=7.5)에 재현탁시켰다.

(ⅳ) cDNA의 람다 벡터내로의 클로닝

cDNA의 제조에 사용된 링커들은 람다 gt10과 gt11 벡터(Promega, Madison, WI)내로의 증폭된 cDNA의 직접적인 삽입을 허용하는 EcoRⅠ 부위를 함유하였다. 람다 벡터들은 제조업체(Promega)로부터 구입하였고, 이들 벡터는 이미 EcoRⅠ으로 소화되고 박테리아 알칼리성 포스파타아제로 처리되었다(5'포스페이트를 제거하여 벡터의 자체 결찰을 방지하기 위해).

EcoRⅠ-링커 연결된 cDNA 제제를 람다 gt10과 gt11(Promega)둘 모두에 결찰시켰다. 결찰 반응의 조건은 다음과 같았다:1의 벡터 DNA(Promega, 0.5/); 0.5 또는 3의 삽입 cDNA; 0.5의 10×결찰 완충액(0.5M Tris-HCl, pH=7.8; 0.1M MgCl2; 0.2M DTT; 10mM ATP; 0.5g/BSA), 0.5의 T4 DNA 리가아제(New England Biolabs) 및 최종 부피를 5로 만드는 증류수.

결찰 반응 튜브를 14에서 밤새(12-18시간) 놓아두었다. 결찰된 cDNA를 다음날 아침에 람다 DNA 패키징 시스템(GIGAPAK, Stratagene, Lajolla, CA)을 사용하는 표준 과정에 의하여 패키징한 후, 다양한 희석률로 플레이팅하여 라이브러리의 역가와 재조합 빈도를 측정하였다. 표준 X-gal 블루/화이트 검정법을 사용하여 람다 gt11 라이브러리를 스크리닝하였다(Miller; Maniatis et al.). 재조합 클론들에 의하여 단지 하나의 플라크 형성만을 허용하는 대장균 HG415(Stanford School of Medicine, Dept. of Pathology Howard Gersenfeld로부터 얻음) 플레이팅(plating) 박테리아를 사용하여 람다 gt10 라이브러리를 플레이팅하였다. 표준 균주인 대장균 C600hF-를 대장균 HG415의 대용물로서 사용할 수 있다.

[실시예 2]

[PT-NANBH 항원의 제조를 위한 cDNA 라이브러리의 스크리닝]

실시예 1에서 생성된 5개의 람다 gt11 라이브러리를 특이한 HCV 코드화된 바이러스 항원에 대해 면역스크리닝에 의해 스크리닝하였다. 파지를 대장균 박테리아 플레이팅 균주인 대장균 KM392[Kevin Moore, DNax, Palo Alto, CA]를 사용하여 플라크 형성을 위해 플레이팅하였다. 대안적으로, 대장균 Y1088을 사용할 수 있다. 람다 gt11 클론에 의해 발현된 융합 단백질을 침팬지 #771 및 다양한 사람 PT-NANBH 혈청(EGM, BV, WEN 및 AG을 포함함)으로부터의 혈청 항체(Young et al.)로 스크리닝하였다.

람다 gt11 라이브러리(실시예 1)로부터 대략 111개의 독립적인 클론들이 하나 이상의 침팬지 또는 사람 PT-NANBH 혈청과 양성 면역반응을 보였다. 이들 파지 클론을 플라크 정제하고, 재조합 파지를 DNA 정제를 위해 성장시켰다(Maniatis et al.).

[실시예 3]

[면역반응 클론들의 게놈 혼성화 스크리닝]

실시예 2에서 수득된 111개의 플라크 정제된 재조합 파지중에서, 93개를 단리하여(Maniatis et al.), 재조업자(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD)의 지시대로 EcoRⅠ으로 소화시켰다. 각각의 소화된 파지 DNA 샘플의 약 1.0을 TAE(0.04m Tris Acetate, 0.001M EDTA)를 사용하여 제조된 1.0아가로스 겔의 샘플웰에 로딩시켰다. 그런 다음, DNA 샘플을 전기 영동적으로 분리하고, DNA 밴드를 에티디움 브로마이드 염색에 의해 가시화하였다(Maniatis et al.). 삽입물을 93개의 클론 각각에 대하여 분명하게 확인하였고, NA 45를 사용하여 전기용리에 의해 정제한 후, 닉 번역에 의해 방사성 표지하였다(Maniatis et al.).

사람 말초혈 림프구(PBL) DNA를 HindⅢ와 EcoRⅠ으로 제한 소화시키고, 0.7아가로스 겔에 로딩시키고(상기와 같음, 단, 레인마다 10의 DNA를 로딩시킴), 단편을 전기 영동적으로 분리하였다. 아가로스 겔중의 DNA 단편을 니트로셀룰로오스 필터에 옮기고(Southern), 게놈 DNA를 상기에서 제조된 닉 번역된 람다 gt11 삽입물로 프로빙하였다.

필터를 세척하고(Southern; Maniatis et al.) X-선 필름에 노출시켰다. 93개의 람다 클론 삽입물 중 43개가 사람 PBL DNA와 양성 혼성화 반응을 나타냈다. PBL DNA와 분명하게 혼성하지 않은 나머지 삽입물중에서, 실시예 2로부터 분명하게 면역양성이었던 침팬지 #771 클론으로부터 유도된 삽입물은 11개였다. 이들 11개의 클론중에서, 2개의 클론이 표 1에 요약된 면역반응 특성을 지녔다. 침팬지 #771과 사람 Ag, BV 및 WEH는 만성 PT-NANBH 혈청 샘플이었고, SKF는 정상 사람 혈청 샘플이었다.

클론 40(원래 클론 스크리닝 표시 304-12-1)은, 정상 사람 PBL DNA에 대한 반복 혼성화 시험에 의해 입증되는 바와 같이 분명히 외인성이며, 즉, 정상 사람 DNA로부터 유도되지 않았고, 클론 36으로 표시된 2번째 클론(원래 클론 스크리닝 표시 303-1-4)은 외인성일 뿐만 아니라 다수의 PT-NANBH 항혈청과도 반응하였다.

[실시예 4]

[클론의 서열화]

실시예 3에 기재된 바와 같이 클론 36과 40에 대해 DNA 서열화를 수행하였다. 삽입물의 5'과 3' 말단에 있는 플랭킹 람다 서열과 상동인 시판중인 서열화 프라이머(New England Biolabs)을 서열화를 위해 초기에 사용하였다. 서열화가 진행됨에 따라 프라이머들을 새롭게 발견된 서열에 상응하도록 제조하였다. 합성 올리고누클레오티드 프라이머는 시판중인 자동화 올리고누클레오티드 합성기를 사용하여 제조하였다. 다른 방법으로, 주문설계된 합성 올리고누클레오티드를 예컨대 신테틱 제네틱스(Synthetic Genetics)(San Diego, CA)로부터 구입할 수 있다.

DNA 서열을 클론 40의 완전한 삽입물에 대하여 측정하였다(SEQ ID NO:1로 표시되며 또한 제3도에 도시됨); 이 서열은 HCV 게놈(부록)의 누클레오티드 6516에서 7070에 해당한다. 계속해서, 클론 44와 45(실시예 3에서 확인되는 11개의 클론 중 2개의 다른 클론)에 존재하는 삽입물이 클론 40 삽입물과 교차 혼성화하는 것으로 밝혀졌다. 클론 44와 45의 부분적인 서열화는, 이들 두 클론으로부터 수득된 서열이 클론 40의 서열과 매치됨을 보여주었다. 클론 36 삽입물의 일부 서열이 결정되었고, 이것은 SEQ ID NO:3으로 표시된다; 완전한 서열은 SEQ ID NO:5로 표시되며, 또한 제4도에 도시한다. 클론 36의 서열은 부록에 제시된 뉴클레오티드 5010 내지 6515에 해당한다.

[실시예 5]

[람다 gt10내의 cDNA라이브러리의 스크리닝]

실시예 1에서 생성된 람다 gt10내의 cDNA 라이브러리를 클론 40 삽입물과 상동인 서열의 존재에 대하여 스크리닝하였다.

람다 gt10 라이브러리를 플레이트 당 약 104 플라크의 밀도로 플레이팅하고, 플라크 리프트(lift)를 마니아티스 등의 방법을 따라 제조하였다. 필터를 먹물로 색인을 달아 플라크 리프트가 수행되는 원래 플레이트와 필터를 정렬시켰다. 박테리아와 파지입자를 용해시키고, 니트로셀룰로오스 필터를 처리하고, 상술된 바와 같이 베이킹하였다(Maniatis et al.). 필터 당 예비 혼성화 용액은 다음 성분으로 구성하였다:5.4의 예비 혼성화 완충액(50의 1M Tris HCl, pH=7.5; 2의 0.5M EDTA, pH=8.0; 50의 10SDS; 150의 20×SSC(Maniatis et al.); 및 238의 유리증류수; 6.0의 포름아미드; 0.4의 50×덴하르트 용액(5g의 FICOLL; 5g의 폴리비닐 피롤리돈; 5g의 우혈청 알부민; 유리 증류수로 전체 부피를 500로 만듦); 및 0.2의 단일 가닥 연어 정자 DNA(10/). 각각의 필터를 플라스틱 백에 넣고 예비 혼성화 용액을 첨가하였다. 백을 밀봉하고, 내용물을 불연속적으로 혼합하면서 37에서 밤새 인큐베이팅하였다.

클론 40 람다 DNA를 단리하고(Maniatis et al.) EcoRⅠ으로 소화시켰다. 생성되는 단편을 아가로스 겔 상에서 분류하고 에티디움 브로마이드 염색에 의해 가시화하였다(Maniatis et al.). 클론 40 삽입물에 해당하는 약 500 염기쌍의 DNA 단편을 NA45 상에서의 전기용리에 의해 아가로스로부터 단리하였다. 정제된 단편의 수성 현탁액을 1:1 페놀/클로로포름 용액으로 1회, 24:1 클로로포름/이소아밀 알코올 용액으로 1회 추출하였다. 그런 다음, 에탄올로 DNA를 침전시키고 멸균수에 재현탁시켰다.

클론 40 삽입물을 닉번역에 의해 방사성표지하고, 람다 gt10 플라크 리프트 필터를 프로빙하기 위해 사용하였다. 예비 혼성화 용액을 필터로 부터 제거하고, 각각의 필터를 다음 조건하에 프로브와 혼성화시켰다:5.0의 혼성화 완충액(5의 1M Tris Hcl, pH=7.5; 0.2의 0.5M EDTA, pH=8.0; 5.0의 10SDS; 14.9의 20×SSC(Maniatis et al.); 10g의 덱스트란 술페이트; 및 총부피를 50로 만드는 유리 증류수); 5.0의 포름아미드; 0.4의 50×덴하르트 용액(5g의 FICOLL; 5g의 폴리비닐피롤리돈; 5g의 우혈청 알부민; 총부피를 500로 만드는 유리 증류수); 및 0.2의 단일 가닥 연어 정자 DNA(10/). 이 혼성화 혼합액에 50-250의 변성된 프로브(5-10분 동안 비등시키고, 얼음상에서 급속 냉각시킴)를 첨가하여, 필터당 약 10⁶cpm의 표지된 프로브를 수득하였다. 그런 다음, 표지된 프로브를 함유하고 있는 혼성화 혼합액을 필터를 함유하고 있는 플라스틱 백에 첨가하였다. 백을 재밀봉하고, 불연속적으로 내용물을 혼합해주면서 밤새 37수조에서 유리판 밑에 놓아 두었다.

다음날 혼성화 용액을 제거하고, 필터를 실온에서 0.5SDS를 함유하고 있는 2×SSC(Maniatis et al.)로 각각 5분씩 3회 세척하였다. 그런 다음, 필터를 50에서 1시간 동안 0.5SDS를 함유하고 있는 2×SSC로 세척하고, 50에서 15 내지 60분 동안 0.1SDS를 함유하고 있는 0.1×SSC로 세척한 다음, 마지막으로 실온에서 15분 동안 2×SSC로 2 내지 3회 세척하였다. 세척된 필터를 건조시킨 후 양성 플라크의 검출을 위해 X-선 필름에 노출시켰다.

람다 gt10 라이브러리로부터 약 24개의 플라크를 혼성화 스크린에 의해 양성으로 시험된 약 200개의 플라크로 부터 플라크 정제하였다(표 2).

[실시예 6]

[클론 40 삽입물과 상동인 람다 gt10 cDNA 라이브러리 클론의 분석]

클론 40 삽입물에 대해 상동성을 지닌 것으로 실시예 5에서 확인된 클론들을 표준 제한 분석에 의해 분석하였고, 삽입물 크기를 측정하였다. 상이한 cDNA 공급원에 대한 프로브로서 클론 40 삽입물을 사용하는 경우의 플레이트당 양성 혼성화 신호의 본래 빈도는 표 2의 마지막 열에 표시되어 있다. 람다 gt10 라이브러리에서 상이한 cDNA 공급원에 대하여 상이한 빈도로 이들 양성신호가 발생하는 것은 혼성화 신호가 cDNA 합성 또는 클로닝 도중에 도입된 통상적인 오염물 보다는 혈청 공급원으로부터 유래한다는 것을 암시한다.

클론 40 삽입물과의 혼성화에 의해 확인된 EGM 생성된 cDNA 라이브러리로부터의 클론들 중 하나(108-2-5)는 약 3.7kb의 삽입물을 가졌고, 이것을 추가의 분석을 위해 선택하였다. 삽입물을 클론의 EcoRⅠ 소화, 전기 영동 분류, 및 전기 용리에 의해 단리하였다(실시예 5). 삽입물을 부분 소화를 유도하는 조건하에 DNaseⅠ로 처리하여(Maniatis et al.), 랜덤 단편을 제조하였다. 생성되는 단편들을 발현을 위해 람다 gt11 벡터에 삽입하였다. 그런 다음, 람다 gt11 클론을 사람(BV 및 정상) 및 침팬지 #771 혈청을 이용하여 면역스크리닝하였다(실시예 2). 사람과 침팬지 혈청으로 제1회 면역스크리닝하여 12개의 양성 클론을 확인하였다. 12개의 클론중 7개를 플라크 정제하고 침팬지 혈청(#771)을 사용하여 리스크리닝하였다. 삽입물 DNA의 일부 DNA 서열을, 328-16-1과 328-16-2로 표시되는 가장 큰 서열을 갖는 생성된 클론 중 2개에 대해 결정하였다. 2개의 클론은 클론 40과 본질적으로 동일한 서열을 가졌다.

[실시예 7]

[증폭된 HCV cDNA 단편의 제조]

A. cDNA 단편의 제조

만성 PT-NANBH에 걸린 침팬지로부터 수득된 혈장 푸울을 질병 통제 센타(CDC)(Atlanta, CA)로부터 얻었다. 직접 펠릿화 또는 PEG 침전후에, RNA를, 공개된 방법(Chomczunski)에 따라 구아니디움 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출에 의해 비리온으로부터 추출하였다. 펠릿화된 RNA를 올리고 dT 또는 랜덤 프라이머, 또는 HCV 서열-특이적 프라이머들과 시판되는 cDNA 키트(Boehringer-Mannheim)를 사용하는 cDNA 합성을 위해 사용하였다.

한 가지 방법에서, 제1가닥 cDNA의 합성은 하기 제시한 서열을 갖는 4개의 프라이머 A, B, C 및 D의 첨가에 의해 이루어졌다. 이들 서열은 표시된 HCV 게놈 영역과 상보적이었다:

제2가닥 cDNA 합성은 구블러(Gubler)와 호프만(Hoffman)의 방법에 의해 수행하였다. 반응을 시판되는 키트에 제공된 표준 cDNA 합성법에 따라 수행하였다.

B. cDNA 단편의 증폭

앞의 cDNA를 평활 말단으로 만들어, 다음 서열을 가지는 링커/프라이머에 결찰시켰다:

cDNA와 링커를 0.3 내지 0.6바이스(Weiss) 유닛의 T4 DNA 리가아제의 존재하에 1:100 몰비로 혼합하였다. 1.5mM MgCl2와 50mM Cl을 함유하고 있는 100의 10mM Tris-Cl 완충액, pH 8.3(완충액 A)에, 약 1×10^-3 의 링커가 말단에 부착된 cDNA, d(5'-GGAATTCGCGGCCGCTCG-3') 서열을 갖는 2M의 링커/프라이머 A(A-가닥), 200M의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 및 2.5 단위의 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 중합효소(Taq 중합효소)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 94로 30초 동안 가열하여 변성시키고, 50로 30초 동안 냉각시켜 프라이머를 어닐링시킨후, 72로 0.5 내지 3분간 가열하여 Taq 중합효소에 의해 프라이머를 연장시켰다. 연속 가열, 냉각, 및 중합효소 반응을 포함하는 복제 반응을 페르킨-엘머 세투스 DNA 써멀 싸이클러(Perkun-Elmer Cetus DNA thermal cycler)로 추가로 25회 반복하였다. 본래 SISPA(서열 독립성 단일 프라이머 증폭) 증폭된 DNA 단편의 하나의 풀(pool)이 생성되었다.

[실시예 8]

[프라이머-쌍 단편의 제조]

실시예 7로부터 증폭된 cDNA 단편을 100의 완충액 A, 1M의 등몰량의 하기 제시된 프라이머쌍 중의 하나, 200M의 각각의 dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP, 및 2.5 단위의 테무스 아쿠아티쿠스 DNA 중합효소(Taq 중합효소)와 혼합시켰다. 각각의프라이머 쌍은 2중 게놈 DNA의 중복영역 Pi의 업스트림 말단에 있는 코딩 가닥과 동일한 정방향(업스트림) 프라이머 Fi 및 영역 Pi의 다운스트림 말단에 있는 코딩 가닥과 상보적인 역방향 프라이머 Ri를 포함한다. 프라이머 세트는 각각 약 200 염기쌍의 중복영역을 규정하며, 인접한 중복 프라이머 영역들 사이(즉, Fi/Ri쌍의 인접한 쌍 사이)의 거리는 약 0.5 내지 1kb이다. 프라이머와 상보적인 HCV의 영역을 아래에 제시한다:

각각의 Fi/Ri 프라이머 쌍을 사용하는 SISPA 증폭된 cDNA 단편의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭은 상기 이용된 조건과 동일한 조건하에 약 25주기로 수행하였다.

상기로부터의 증폭된 단편 혼합물을 각각 1.5아가로스상에서의 전기 영동에 의하여 각각 분류하고, 니트로셀룰로스 필터에 옮겼다(Southern). 내부 서열 올리고누클레오티드 프로브와 각각의 니트로셀룰로스 결합된 단편과의 혼성화는 각각의 단편이 예상했던 서열을 함유하였음을 확인하여 주었다. 혼성화는 표준 방법에 따라, 폴리누클레오티드 키나아제에 의해 방사성 표지된 내부 올리고누클레오티드로 수행하였다.

[실시예 9]

[연결 단편의 제조]

본 실시예는 HCV 서열의 큰 중복 연결 단편의 제조를 설명한다. 실시예 7로부터의 SISPA 증폭된 cDNA 단편들을, 실시예 8에서와 같이 100의 완충액 A, 하기 제시된 각각의 프라이머쌍 중의 1M의 등몰량의 정방향 및 역방향 프라이머, 200M의 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 2.5 단위의 테르무스 아쿠아티쿠스 DNA 중합효소(Taq 중합효소)와 혼합시켰다. 각각의 프라이머 쌍은 정방향 프라이머 Fi와 역방향 프라이머 Rj를 포함하는데, Fi는 하나의 중복 영역 Pi에 대한 정방향 프라이머이고, Rj는 인접한 중복 영역의 역방향 프라이머이다. 따라서, 각각의 연결 단편은 2개의 인접한 중복 영역에 걸쳐있다. 프라이머 세트는 각각 약 0.5 내지 1kb의 연결 단편을 규정한다. 프라이머 쌍의 서열은 실시예 8에 제시되어 있다. 각각의 프라이머 쌍에 의해 점유되어 있는 HCV 서열(부록)의 중복하는 연결 단편은 다음과 같다:

각각의 Fi/Rj 프라이머 쌍을 사용하는 SISPA 증폭된 cDNA 단편의 2-프라이머 증폭은 전술된 조건과 유사한 조건하에 약 25 주기로 수행하였다.

상기로부터의 증폭된 단편 혼합물을 각각 1.2아가로스상에서의 전기 영동에 의해 분류하고, 니트로셀룰로스 필터에 옮겨(Southern) 상기와 같이 방사성 표지된 내부 올리고누클레오티드 프로브와 혼성화시켰다. 분석에 의해 각각의 연결 단편이 인접한 중복 영역으로부터의 2개의 말단 프라이머 서열을 함유하였음이 확인되었다. 각각의 연결 단편에 함유된 서열은 부록에 표시되어 있다

[실시예 10]

[클로닝된 펩티드 단편의 제조]

A. DNA 단편소화

실시예 9로부터의 10개의 연결 단편을 각각 표준 소화 완충액(0.5M Tris HCl,pH 7.5; 1/BSA; 10mM MnCl2)에 약 1/농도로 현탁시키고, DNAseⅠ로 실온에서 다양한 시간(1-5분)동안 소화시켰다. 이들 반응 조건은 선행 보정 실험으로부터 결정된 것으로, 이 실험에서는 주로 100 내지 300 염기쌍 단편을 제조하는데 필요한 인큐베이션 시간이 측정되었다. 물질을 페놀/클로로포름으로 추출한 후 에탄올로 침전시켰다.

소화 혼합물중의 단편을 평활 말단으로 만들어서 EcoRⅠ 링커와 결찰시켰다. 생성되는 단편을 Phi×174/HaeⅢ 및 람다/HindⅢ 크기 마아커를 사용하여 1.2아가로스겔 상에서 전기 영동(5-10V/cm)에 의해 분석하였다. 100 내지 300bp의 분획을 NA 45 스트립(strip)(Schleicher and Schuell)상에서 용리시킨 후, 용리 용액(1M NaCl, 50mM 아르기닌, pH 9.0)이 들어있는 1.5마이크로 튜브에 넣고, 67에서 30 내지 60분 동안 인큐베이팅하였다. 용리된 DNA를 페놀/클로로포름으로 추출한 후 2부피의 에탄올로 침전시켰다. 펠릿을 20의 TE 완충액(0.01M Tris HCl, pH 7.5, 0.001M EDTA)에 재현탁시켰다.

B. 소화 단편의 클로닝

람다 gt11 파지 벡터(Young et al.)를 Promega Biotec(Madison, WI)으로부터 구입하였다. 이 클로닝 벡터는 베타-갈락토시다제 번역 종결 코돈으로부터 53염기쌍 업스트림 위치에 유일한 EcoRⅠ 클로닝 부위를 가지고 있다. A 파트에서 각각의 연걸 단편으로부터의 부분소화 단편은 0.5 내지 1.0의 EcoRⅠ-절단된 람다 gt11, 0.3-3의 상기 크기 분류된 단편, 0.5의 10×결찰 완충액(상기와 같음), 0.5의 리가아제(200 단위), 및 전체 부피를 5로 만드는 증류수를 혼합함으로써 EcoRⅠ 부위에 도입시켰다. 혼합물을 14에서 밤새 인큐베이팅한 후, 표준 방법(Maniatis, pp. 256-268)에 따라 시험관내 패키징하였다.

패키징된 파지를 사용하여 DNAX의 케빈 무어박사(Dr. Kevin Moore, DNAX; Palo Alto, CA)로부터 얻은 대장균주 KM392를 감염시켰다. 대안적으로, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에서 입수할 수 있는 대장균 균주 Y1090(ATCC No. 37197)을 사용할 수 있다. 상기로부터 얻은 약 103-104pfu의 파지스톡(stock)으로 감염된 KM392 세포의 집단(lawn)을, 150mm 플레이트상에 준비하여 37에서 5 내지 16시간 동안 역상태로 인큐베이팅하였다. 감염된 박테리아를 표준 X-gal 기질 플라크 검정법(Maniatis)을 이용하여 X-gal의 존재하에 베타-갈락토시다제 활성의 소실(투명 플라크)에 대해 조사하였다.

소화 단편 삽입물을 함유하는 단일 플라크의 확인은 다음과 같이 확증되었다. 투명한 단일 플라크(단일 파지의 자손을 함유함)를 플레이트로부터 분리하여, 추출 완충액(Maniatis)에 현탁시킴으로써 파지 DNA를 방출시켰다. 파지 추출물을 람다 gt11의 EcoRⅠ 부위로부터 양방향으로 약 70 염기쌍 떨어져 위치한 프라이머의 존재하에 상기 DNA 증폭 혼합물에 첨가하였다. 따라서, 소화-단편 삽입물을 함유하고 있는 파지는 약 140 염기쌍에 삽입물이 더해진 증폭된 소화 단편을 산출할 것이다. 파지 DNA 증폭은 상술한 바와 같이 25 증폭 주기로 수행하였다. 시험한 각 플라크로부터의 반응 물질을 1.5아가로스 상에서 분류하고, 증폭된 소화 단편들의 크기에 대하여 조사하였다. 비재조합 파지는 140 염기쌍 밴드를 나타냈고, 재조합 파지는 140 염기쌍에 삽입물 서열이 더해진 크기의 밴드를 나타냈다. 결과는 하기 표 3에서 제1열에 표시된 6개의 연결 단편 라이브러리에 대하여 하기 표 3의 제2열(REC Freq)에 나타낸다. 제2열의 분모는 프라이머 증폭에 의하여 검정된 전체 플라크 수이다. 분자는 삽입물을 함유하고 있는 투명한 플라크의 수이다. 따라서, 3/15은 검정된 전체 15개의 투명한 플라크 중에서 3개의 플라크가 PCR에 의해 양성으로 시험되었음을 의미한다.

1-표시된 연결 클론의 부분 DNase 1 소화에 의해 제조된 라이브러리

2-람다 gt11 프라이머를 플랭킹하는 양측의 삽입물을 사용한 PCR에 의해 측정된 재조합 빈도

3-1.5×10 파지에 대한 만성 사람 PT-NANBH 혈청(1:100)에 의한 1차 스크리닝

4-PA/REC는 플레이팅된 재조합체의 실제 개수당 검출된 양성 영역의 개수를 나타낸다.

각각의 연결 단편에 대해 제조된 소화 단편의 라이브러리를 사람 PT-NANBH 혈청과 면역반응하는 펩티드의 발현에 대해 스크리닝하였다. 파지 감염된 박테리아 집단을 니트로셀룰로오스 시트와 중첩시켜, PT-NANBH 재조합 펩티드를 플라크로부터 필터지로 옮겼다. 플레이트와 필터를 해당하는 플레이트와 필터 위치를 매치시키기 위해 색인을 달았다.

6 내지 12시간 후에 필터를 분리하여, TBS 완충액(10mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl)으로 3회 세척하고, AIB(1젤라틴이 첨가된 TBS 완충액)로 차단시키고, 다시 TBS로 세척한 후 항혈청(AIB중에 1:100으로 희석됨, 12-15/플레이트)과 함께 밤새 인큐베이팅하였다. 시트를 TBS로 2회 세척한 후, 알칼리성 포스파타제가 컨쥬게이팅된 항-사람 IgG와 함께 인큐베이팅하여, 항혈청에 의해 인지된 항원을 함유하는 필터 부위에 표지된 항체를 부착시켰다. 최종 세척후, 필터를 5의 알칼리성 포스파타제 완충액(100mM Tris, 9.5, 100mM NaCl, 5mMCl2)중의 16의 BCIP(4에서 유지된 50/의 원액)와 혼합된 33의 NBT(4에서 유지된 50/의 원액)을 함유하고 있는 기질 배지에서 전개시켰다. 반응된 기질은 항혈청에 의해 인식되는 바와 같이, 항원 생성 지점에서 침전되었다.

1차 스크리닝에서 항원-양성 반응(양성 영역(PA))을 보인 플라크의 총수는 표 3의 제3열에 나타난다. 표 4의 제4열은 스크리닝된 재조합 파지의 전체 개수 당 양성 영역의 빈도이다(×103). 따라서, 이 마지막 열은 이러한 특정 혈청 샘플을 사용하여 특정 연결 단편으로부터 발현된 항원의 상대적 면역원성의 척도이다.

[실시예 11]

[소화 단편의 스크리닝]

실시예 9로부터의 10개의 연결 단편 각각의 소화 단편 라이브러리를 만성 PT-NANBH에 걸린 사람 환자로부터의 혈청, 및 급성 PT-NANBH 감염 및 만성 PT-NANBH 감염 침팬지로부터의 풀링된 혈청으로 스크리닝하였다. 질병 통제 센터로부터 5마리의 침팬지로부터의 만성 및 급성 침팬지 혈청을 얻었다.

하기 표 4에 나타낸 연결 단편으로부터의 소화 단편 라이브러리를, 실시예 10에서 설명한 스크리닝 과정을 사용하여, 3개의 혈청 각각으로 스크리닝하였다. 각각의 플레이트에서 관찰된 양성 영역의 총수(하나의 단편 라이브러리를 구성함)가 표에 나타난다. 괄호로 되어 있지 않은 표의 기재 사항은 플라크 정제 즉, 저희석률에서 양성 영역으로부터 플라크를 리플레이팅하고 양성 영역을 확인함으로써(2차 스크린) 확인된 양성 영역의 수를 나타낸다. 전형적으로 1차 스크린에서 양성 영역의 약 90 내지 95가 2차 스크리닝에 의해 양성으로 시험되었다. 괄호안의 기재사항은 2차 스크린에서 확인되지 않은 양성영역을 나타낸다.

표 4에 나타나는 바와 같이, 하나를 제외한 모든 연결 단편 라이브러리가 만성 사람 또는 침팬지 감염 혈청과 면역반응하는 펩티드 항원을 코드화하는 서열을 함유하였다. 라이브러리중 5개는 급성 혈청과 면역반응하는 항원을 코드화하는 서열을 함유하며, 이는 이 그룹 중의 하나 이상의 항원이 급성-감염 혈청을 검출하는데 효과적임을 의미한다. 이들 후자의 라이브러리중 3개-F3/R4, F12/R7, 및 F7/R8-는 각각의 라이브러리에서 10을 넘는 양성을 제공하였다. 이들 데이타는 특정 라이브러리에서의 재조합 빈도에 대해 보정되지 않은 것이며, 따라서, 다양한 연결 단편의 비교 면역원성을 반영하지 않는다.

[실시예 12]

[409-1-1-항원에 대한 면역스크리닝]

A. 플라크 면역스크리닝

F₄/R₅연결 단편의 1차 스크리닝에서 확인된 여러 개의 투명한 플라크를 리플레이팅하고 플라크 정제하였다. 정제된 플라크중 하나를 gt11/409-1-1(c-a)로 표시하였다. 클론 409-1-1(c-a)에 함유된 소화 단편은 HCV 게놈과 클론 409-1-1(abc)에 존재하는 2세트의 염기쌍에 해당한다. 참조의 용이함을 위해, 세 영역(a,b 및 c)을 409-1-1(abc) 클론으로 표시하였다(하기 및 제5도 참조). 염기쌍의 가장 긴 상동성은 부록의 누클레오티드 2754 내지 3129에 해당하며(a 영역, 제5도에서 네모로 표시된 영역 참조). 보다 짧은 상동성은 부록의 누클레오티드 3242 내지 3311에 해당한다(C 영역, 제5도 참조):정상적으로 c 영역은 a 영역의 3' 말단으로부터 약 112 누클레오티드 떨어져 있는 곳에 위치한다(제5도 참조). gt11/409-1-1(c-a) 삽입물의 완전한 서열은 제6도에 도시되며, SEQ ID NO:7로 표시된다. 이 클론은 F4/R5 연결 클론으로부터 생성된 2개의 독립적인 DNaseⅠ 단편들 사이의 결찰 사건을 통하여 제조되며, ATCC No. 40792를 갖는다. 409-1-1(abc)로 표시되는 관련 클론은 본 출원인의 공동 소유 특허 출원 일련번호 제0505,611호에 기재되었으며, ATCC No. 40876을 갖는다.

EPO 공개 공보 제318,216호에서 발표되고 5-1-1로 표시되는 면역반응성 서열에 해당하는 람다 gt11 클론을 실시예 7에서 생성된 증폭된 cDNA 단편의 프라이머-특이적 증폭에 의해 제조하였다. 5-1-1 서열은 연결 단편 F₅/R₆에서 HCV 서열(부록)의 염기쌍 3730-3858에 해당한다. 단편 증폭에 사용된 프라이머는 3732 내지 3857 염기쌍 5-1-1 서열의 정방향 및 역방향 서열과 상보적인 20 염기쌍 올리고머이다. 둘 모두의 올리고머는 이들 말단에 EcoRⅠ 부위가 혼입되어 있으며, 정방향 올리고머는 베타-갈락토시다제 유전자를 포함하는 연속 오픈 리딩프레임을 보장하도록 고안된다. 증폭된 5-1-1 서열을 아가로스겔 전기 영동에 의하여 정제되고 람다 gt11 파지에 클로닝시켰다. 증폭 및 클로닝 방법은 상술한 바와 같았다. 5-1-1 서열을 함유하고 있는 파지를 확인하고, 전술한 바와 같이 사람 PT-NANBH 혈청을 사용하여 각각 1차 및 2차 스크리닝에 의해 정제하였다.

정제된 gt11/409-1-1(c-a)와 gt11/5-1-1 클론을 각각 네가티브 람다 gt11 파지와 혼합시키고, 플레이팅하고, 하기 표 5에 나타난 바와 같이 정상 및 NANBH 감염된 사람 및 침팬지로부터의 다수의 상이한 도너 혈청으로 면역스크리닝하였다. 각각의 플레이트를 여러개의 등적 섹션으로 나누고, 니트로셀룰로스 이동 필터 상의 해당 섹션을 실시예 11에서 설명된 면역스크리닝 방법을 이용하여 표시된 도너 혈청으로 별도로 스크리닝하였다. 5-1-1과 409-1-1(c-a) 펩티드에 의해 혈청의 각각의 그룹에 대해 검출된 양성의 수 뿐만 아니라 ELISA 포맷의 C-100 시험과의 비교 결과를 표 5에 나타낸다.

B. 웨스턴 블롯 스크리닝

웨스턴 블롯 스크리닝을 위해, 실시예 11로부터의 gt11/409-1-1(c-a) 파지를 사용하여 대장균 BNN103 온도 민감성 박테리아를 감염시켰다. 이들 박테리아는 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션으로부터 입수하였다. 박테리아 숙주는 온도 유도 조건하에 벡터에 의해 코드화된 베타-갈락토시다제/펩티드 항원 융합 단백질을 발현시키다(Hunyh).

감염된 박테리아를 스트리킹(streak)하고, 32에서 밤새 또는 콜로니가 가시화될 때까지 성장시키고, 개개의 콜로니를 복제 플레이팅하고, 32및 42에서의 성장에 대해 조사하였다. 파지 게놈의 통합을 나타내는 42가 아닌 32에서 성장한 박테리아 콜로니를 사용하여 1의 NZYDT(Maniatis) 브로쓰를 접종시켰다. 밤새 배양하여 포화된 박테리아 배양액을 사용하여 10의 배양액을 접종시키고, 이것을 전형적으로 약 1시간에 걸쳐 통기시키면서 배양하여 O.D.가 약 0.2 내지 0.4가 되게 하였다. 그런 다음, 배양액을 재빨리 43수조에 넣어 43로 만든 다음, 15분 동안 진탕시켜 람다 gt11 펩티드 합성을 유도하고, 추가로 37에서 1시간 동안 배양하였다.

원심분리에 의하여 세포를 펠릿화하고 1의 펠릿화된 물질을 100의 용해 완충액(5메르캅토에탄올, 2.4의 SDS 및 10글리세롤을 함유하는 62mM Tris, pH 7.5)에 재현탁시켰다. 일정액(약 15)을 겔상에 직접 로딩하고 SDS-PAGE에 의해 분류하였다. 전기 영동후, 분류된 밴드를 공지 방법(Ausubel et al.)에 따라 전기 용리에 의해 니트로셀룰로스 필터에 옮겼다.

용해물을 DNaseⅠ로 처리하여 박테리아 DNA를 소화시켰다. 이는 용해물의 점진적인 점도 소실에 의해 증명된다. 물질의 일정액을 트리톤 X-100TM 및 도데실 황산나트륨(SDS)으로 희석하여 최종 농도가 2트리톤 X-100TM과 0.5SDS가 되도록 하였다. 용해되지 않은 물질은 원심분리에 의해 제거하고, SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동(SDS-PAGE) PAGE에 의해 상등액을 분류하였다. 겔의 일부를 염색하여 관심있는 펩티드 항원을 확인하였고, 해당하는 염색되지 않은 밴드를 니트로셀룰로스 필터상에 옮겼다.

또한 5-1-1 항원 코딩 서열(실시예 11)을, 공개된 방법(Smith)에 따라 pGEX 벡터 시스템을 사용하여 글루타티온-S-트란스페라제 융합 단백질로서 발현시켰다. 박테리아 용해물로부터 수득되고, SDS-PAGE에 의해 분류된 융합 단백질을 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯팅을 위해 니트로셀룰로스 필터에 옮겼다.

웨스턴 블롯팅을 실시예 10에 설명한 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 필터를 AIB로 차단한 후, 사람 및 침팬지의 정상, 만성 NANBH, 및 B형 간염(HBV) 혈청 샘플을 포함하는 표 5에서 확인된 혈청 샘플과 반응시켰다. 니트로셀룰로스 필터에 결합하는 특이한 항체의 존재를 알칼리성 포스파타제 표지된 항-사람 IgG의 추가의 면역결합에 의하여 검정하였다. Sj26/5-1-1 융합 단백질 및/409-1-1(c-a) 융합 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석의 결과는 표 6에 나타난다. 데이타는 409-1-1(c-a)와 5-1-1 펩티드 항원이 사람과 침팬지 NANBH 항혈청과 특이적으로 면역반응하는 것을 확인시킨다.

[실시예 13]

[대용 클론의 생성]

사람과 침팬지 NANBH 항혈청과 특이적으로 면역반응하는 코드화 항원으로서 실시예 12에서 확인된 영역으로부터 대용 클론을 생성하였다. 표 7에 나타난 프라이머를 HCV 또는 409-1-1(abc) 코딩 서열들로 부터 선택하여 다양한 중복 클론들을 생성하였다.

표 7에 나타난 프라이머를 실시예 7b와 8에서 설명한 바와 같이 DNA 증폭 반응에 사용하였다:각각의 반응에 사용된 프라이머와 주형들은 표 8에 나타난다. 그런 다음, 증폭된 단편을 표준 조건(Maniatis et al.)하에 DNA 중합효소 Ⅰ의 클레노우 단편으로 처리하여 분자의 말단을 채웠다. 평활 말단이 된 증폭된 단편을 표준 조건하에 EcoRⅠ으로 소화시키고, 본질적으로 실시예 10B에서 설명한 바와 같이 람다 gt11 발현 벡터안에 클로닝시켰다. 생성되는 삽입물이 비교를 위해 제7도에 도시된다.

[실시예 13]

[대용 클론의 면역스크리닝]

실시예 12에서 생성된 대용 클론을 본질적으로 실시예 10b에서 설명한 바와 같이 면역스크리닝하였다. 실시예 12에서 생성된 클론 409-1-1(bac)와 409-1-1(c-a)를 또한 다음 면역스크리닝에 포함시켰다. 1차 면역스크리닝의 결과가 표 9에 나타난다.

GLI-1 혈청은 사람 만성 PT-NANBH 혈청이었다. 클론이 GLI-1에 의해 음성으로 시험된 경우, 사람 만성 PT-NANBH 혈청인 FEC로 스크리닝함으로써 추가로 조사하였다.

상기 예비 면역스크리닝에 의해 양성으로 시험된 9개의 대용 클론중에서 7개를 일련의 혈청에 대하여 더욱 집중적으로 스크리닝하였다. 또한, 클론 C100(발명의 배경 참조)을 스크리닝에 포함시켰다. 이러한 보다 철저한 스크리닝의 결과가 표 10에 나타난다.

스크리닝에 사용된 혈청 샘플은 다음과 같이 확인되었다:SKF, PT-NANBH 음성; FEC, PT-NANBH 양성; BV, 지역 획득 NANBH; Bar, PT-NANBH 양성; PP(접종전에 풀링된 침팬지 혈청), PT-NANBH 음성; AP(급성 HCV 풀링된 침팬지 혈청), PT-NANBH 양성; 및 CP(만성 HCV 풀링된 침팬지 혈청) PT-NANBH 양성. 숫자로 표시된 혈청 샘플은 PT-NANBH 양성인 사람 임상 혈청 샘플에 해당한다. PP, CP 및 AP 혈청은 5마리의 상이한 침팬지로부터의 푸울링된 혈청이었다:침팬지 혈청 샘플을 질병 통제 센타로부터 입수하였다. 표 10에 나타난 기록 시스템은 다음과 같이 규정된 정성적 기록 시스템이다:(-) 명백한 음성; (+), (1+), (2+), (3+), 양성신화의 증가하는 강도이며, (3+)이 가장 강한 신호임; 및 (I)은 2개의 판독값이 상이하고 반복되지 않은 불확정함을 나타낸다.

표 10에 나타난 데이타로 볼때, 면역스크리닝의 견지에서 항원의 감도는 33Cu33c409-1-1(c-a)409-1-1-F1R2409-1-1(abc)≥409-1-1a5-1-1409-1-1-(c+270)이다. 33cu와 33c가 민감한 항원이지만, 이들은 모든 혈청에 대해 높은 바탕값으로 반응한다. 따라서 409-1-1 계열이 HCV 유도된 항체에 대해 더욱 특이적이기 때문에 진단 항원으로서 보다 유용하다.

상기에서 확인된 클론 36과 45(클론 40에 해당함) 코드화된 에피토프를 포함하도록 면역스크리닝을 추가로 확대시켰다. 표 11은 면역스크리닝의 결과를 나타낸다.

스크리닝 혈청 GLI-1, FEC, BV 및 SKF가 상기에서 규정되었다. 숫자로 표시된 혈청 샘플은 PT-NANBH 양성인 사람 임상 혈청 샘플에 해당한다:이들 샘플은 프랑스 파리에 소재한 호스피탈 라피티 살페트리에(Hospital LA Pitie Salretriere)의 프란코와즈 파비아니-루넬(Francoise Fabiani-Lunel) 박사로 부터 입수하였다. 표 11에 나타난 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 클론 36과 40에 의해 생성된 항원은 409-1-1(c-a)처럼 민감하지는 않지만, HCV-특이적 면역 양성신호를 산출한다.

[실시예 14]

[409-1-1 융합 단백질의 단리]

항-베타 갈락토시다제와 포합된 세파로스 4B 비드를 Promega로부터 구입하였다. 비드를 2컬럼에 팩킹하고, 계속해서 0.02아지드 나트륨과 10TX 완충액(10mM Tris 완충액, pH 7.4, 1아프로티닌)이 첨가된 인산염-완충 식염수로 세척하였다.

실시예 12로부터의 gt11/409-1-1(c-a)로 감염된 BNN103 용원균을 사용하여 500의 NZYDT 브로쓰를 접종시켰다. 32에서 통기시키면서 O.D.가 약 .2 내지 .4가 되도록 배양액을 인큐베이팅한 후, 43수조에 15분간 넣어 신속하게 온도를 43로 만들어서, gt11 펩티드 합성을 유도하고, 추가로 37에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 원심분리에 의하여 세포를 펠릿화하고, 10의 용해 완충액(사용 직전에 첨가된 1아프로티닌과 2트리톤 X-100TM을 함유함 10mM Tris, pH 7.4)에 현탁시켰다. 재현탁된 세포를 액체 질소중에서 동결시킨후, 해동시켜서, 실질적으로 완전하게 세포를 용해시켰다. 용해물을 DNaseⅠ로 처리하여 박테리아 및 파지 DNA를 소화시켰다. 이는 용해물의 점진적인 점도 소실로 증명된다. 용해되지 않은 물질을 원심분리에 의해 제거하였다.

정화된 용해물질을 세파로스 컬럼 상에 로딩시키고, 컬럼의 양 말단을 막고, 컬럼을 회전 진탕기상에 실온에서 2시간 동안 및 416시간 동안 방치하였다. 컬럼을 정착시킨 후 10의 TX 완충액으로 세척하였다. 융합된 단백질을 0.1M 탄산염/중탄산염 완충액(pH 10)으로 용리시켰다. 전체 14의 용리 완충액을 컬럼에 통과시키고, 융합 단백질을 용리액의 처음 4-6에서 용리시켰다.

친화성 컬럼으로부터의 처음 6의 용리액을 CentriconTM-30 카트리지(Amicon, Danvers, Mass.)에서 농축시켰다. 최종 단백질을 농축물을 400의 PBS 완충액에 재현탁시키고, 단백질 순도를 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단일의 두드러진 밴드가 하나 관찰되었다.

[실시예 15]

[항-409-1-1(c-a) 항체의 제조]

람다 gt11으로부터의 409-1-1(c-a) 소화 단편을 파지의 EcoRⅠ 소화에 의해 방출시키고, A 영역을 겔 전기 영동에 의하여 정제하였다. 정제된 단편을 pGEX 발현벡터 안에 도입시켰다(Smith). 409-1-1(a) 펩티드 항원을 함유하는 글루타티온 S-트란스페라제 융합 단백질(Sj26 융합 단백질)의 발현은 대장균주 KM 392(상기에서 설명됨)에서 이루어졌다. 용해된 박테리아로부터 융합 단백질을 단리하고, 공개된 방법(Smith)에 따라 글루타티온 컨쥬게이팅된 비드로 팩킹된 컬럼상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 분리하였다.

정제된 Sj26/409-1-1(a) 융합 단백질을 프로인트 보조제에 담아 토끼에게 피하주사하였다. 약 1의 융합 단백질을 0일과 21일에 주사하여 42일과 56일에 토끼 혈청을 채취하였다.

정제된 Sj26/5-1-1 융합 단백질을 5-1-1 단편을 코드화하는 증폭된 HCV 단편을 사용하여 유사하게 제조하였다. 융합된 Sj26/5-1-1 단백질로 동일한 면역화 스케줄에 따라 제2토끼를 면역시켰다. 제3토끼도 마찬가지로 대조 박테리아 용해물로부터 수득된 정제된 Sj26 단백질로 면역시켰다.

실시예 12에서 설명한 바와 같이 다음의 박테리아 배양액으로부터 미니 용해물을 제조하였다:(1) pGEX, 5-1-1 삽입물을 함유하고 있는 pGEX 및 409-1-1(a) 삽입물을 함유하고 있는 pGEX로 감염된 KM392 세포; 및 (2) 5-1-1 삽입물을 함유하고 있는 람다 gt11 및 409-1-1(c-a) 삽입물을 함유하고 있는 gt11로 감염된 BNN103. 미니 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분류하고, 실시예 12에서 설명한 바와 같이 웨스턴 블롯팅을 위해 밴드를 니트로셀룰로스 필터에 옮겼다. 표 12는 5가지 용해물 제제형(표에서 좌측에 표시된 항원을 함유함)를 3마리 토끼의 각각의 면역혈청으로 스크린했을 때 관찰된 면역반응의 패턴을 나타낸다. 결과를 요약하면, 대조(Sj26) 토끼로 부터의 혈청은 각각의 Sj26과 Sj26 융합 단백질 항원 각각과 면역반응하였다. Sj26/5-1-1 융합 단백질로 면역된 동물로부터의 혈청은 3개의 모든 Sj-26 항원 및 베타-gal/5-1-1 융합 단백질과 반응하였는데, 이는 5-1-1 항원과의 특이한 면역반응의 존재를 나타낸다. Sj26/409-1-1(a) 융합 단백질로 면역된 동물로부터의 혈청은 3개의 모든 Sj-26 항원 및 베타-갈/409-1-1(c-a) 융합 단백질과 반응하였는데, 이는 409-1-1(a) 항원과의 특이한 면역반응의 존재를 나타낸다. 베타-갈락토 시다제(시판중인 공급원으로부터 입수됨)와 면역반응하는 혈청은 없었다.

Sj26/409-1-1(a)로 면역된 동물로부터의 혈청에 존재하는 항-409-1-1(a) 항체를 실시예 12에서 설명한 일반적인 방법에 따라 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한다. 그러나, 이때 세파로스 비드에 대해 유도체화된 리간드는 항체-베타-갈락토시다제 항체이기 보다는 정제된 베타-gal/409-1-1(c-a) 융합 단백질이다.

[실시예 16]

[HCV 캡시드 단백질 코딩 서열의 클로닝]

본 실시예는 HCV 캡시드 단백질의 N-말단 영역을 코드화하는 HCV 코딩 서열의 클로닝을 설명한다.

HCV-캡시드 관련 항원의 단백질 서열은 온길이의 HCV 서열(부록 A 참조)의 누클레오티드 잔기 325-970에 해당한다. 다음의 서열을 이 영역을 클로닝하기 위한 PCR 프라이머로서 사용하였다:SF2(C), 온길이의 HCV 서열(부록)의 누클레오티드 325에서 출발하는 5' 말단인 5'-GCGCCCATGGGCACGATTCCCAA ACCTCA; 및 SR1(C), 온길이의 HCV 서열(부록)의 누클레오티드 969에서 출발하는 3' 말단인 5'-GCCGGATCCCTATTACTC(G/A)TACACAAT(A/G)CT(C/T)GAGTT(A/G)G. SF2(C)/SR1(C) 프라이머쌍을 사용하여 생성된 단편의 예상 크기는 644 염기쌍이었다.

실시예 7로부터의 SISPA 증폭된 cDNA 단편을 실시예 8에서와 같이 100의 완충액 A, 1M의 등몰량의 상기 제시된 각각의 SR2와 SF1 프라이머, 200M의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 및 2.5 단위의 테르무스 아쿠아티쿠스 DNA 중합효소(Taq 중합효소)와 혼합하였다.

상기 제시된 캡시드 프라이머 쌍을 이용하는 SISPA 증폭된 cDNA 단편의 특이한 증폭은 실시예 7에서 설명한 것과 유사한 조건하에 72에서 1분간 약 30주기로 수행하였다.

상기로부터의 증폭된 단편 혼합물을 이중 1.2아가로스겔 상에서 아가로스겔 전기 영동에 의해 각각 분류하고, 겔중 하나를 니트로셀룰로오스 필터에 옮겨(Southern), SF3(M/E) 온길이의 HCV 서열(부록)의 누클레오티드 792에서 출발하는 5' 말단인 5'-GCGCCCATGGTTCTGGAAGACGGCGTG를 갖는 방사성 표지된 올리고누클레오티드와 혼성화시켰다(Southern). 이 올리고누클레오티드는 SF2(C)와 SR1(C) 프라이머를 사용하여 생성된 증폭 생성물의 내부에 있는 서열에 해당한다. 15개의 PCR 생성물 중에 8개가 내부 프로브로 양성 혼성화 신호를 제공하는 것으로 확인되었다.

삽입물에 의해 코드화된 단백질 서열의 박테리아 발현을 위해 벡터 pGEX(실시예 15)와 pET(NOVAGEN, 565 Science Drive, Madison, WI 53711)를 선택하였다. pGEX 벡터는 Sj26에 대한 융합 단백질로서 삽입된 코딩 서열의 발현을 제공하였고(실시예 12 및 15 참조), pET 벡터는 클로닝된 서열만의 발현을 제공하였다. 캡시드 서열을 클로닝하기 위하여, 증폭생성물 밴드를 복제 겔로부터 절출시켰다. 아가로스로부터 DNA를 추출하고, NcoI과 BamHI로 이중 소화시켰다. 또한 BamHI/NcoI 클로닝 부위를 함유하고 있는 pGEX 벡터를 BamHI과 NcoI으로 이중 소화시켰다. 그런 다음, 벡터와 추출된 DNA를 표준 조건하에서 결찰시키고, 결찰 혼합물을 박테리아 세포안으로 형질 전환시켰다.

박테리아 형질 전환체를 암피실린 선택하에 배양하고 플라스미드 DNA를 알칼리용해에 의해 분리하였다(Maniatis et al.). 분리된 플라스미드 DNA를 NcoI과 BamHI으로 소화시킨 후, 소화 생성물을 아가로스겔 상에서 전기 영동적으로 분리하였다. 겔을 니트로셀룰로오스에 옮기고 상기와 같이 방사성 표지된 SF3으로 프로빙하였다. 서던 블롯 분석에 의하여 12개의 클론이 관심있는 삽입물을 가지는 것으로 확인되었다. 본질적으로 동일한 방식으로 pET 벡터에서 클론들을 생성하였다.

[실시예 17]

[추정 HCV 캡시드 단백질 클론의 면역학적 스크리닝]

본 실시예는 실시예 18에서 수득된 추정 HCV 캡시드 단백질 클론의 면역학적 스크리닝을 설명한다.

실시예 16에서 수득된 12개의 클론중에 7개의 클론(클론 #8,14,15,56,60,65, 및 66)의 단백질 미니 용해물을 실시예 12에서 설명한 바와 같이 제조하였다. 이들 미니용해물을 설명한 바와 같이 분류하여, 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로오스에 옮겼다. 표 3은 7개의 용해물 제제형을 표시된 혈청으로 스크리닝하였을때 관찰된 면역반응의 패턴을 보여준다.

스크리닝에 사용된 혈청 샘플은 다음과 같이 확인되었다:SKF, HCV 음성; FEC, HCV 양성; BV, 지역 획득 HCV; A6과 B9는 HCV 양성인 사람 임상 혈청 샘플에 해당한다.

웨스턴 블롯에 대해 확인된 면역반응 밴드는 모두 예상했던 크기인 50kd(클론된 삽입물의 예측되는 코딩 서열을 토대로 함, 하기 참조)보다 작았다.

Sj26 융합 단백질의 대규모 제조를 위해 크론 15을 선택하였다(Smith et al.). 클론 15의 1ℓ 제제형은 약 200의 정제된 면역반응성 물질을 생산하였다. 대부분의 면역반응성 물질이 대략 29kd에서 이동하는 주요 이중 밴드에 나타났다. 이 제제형으로부터의 수율은 예상외로 낮았다:전형적으로 PGEX 시스템을 사용하는 경우에 1리터 단백질 제제형은 50 내지 100의 융합 단백질을 생산한다.

[실시예 18]

[클론 15와 56의 핵산서열]

클론 15와 56(실시예 17에서 논의됨)의 삽입물을 디데옥시 사슬 종결기법(Sanger, 1979)을 사용하여 제조업자(US Biochemical Corporation, Cleveland OH)의 지시대로 서열화하였다. 각각의 클론은 pGEX 벡터의 Sj26 리딩 프레임에 인접한 오픈 리딩 프레임을 지녔다. 클론 삽입물의 서열은 단지 몇 개의 미소한 서열 변화를 제외하고는 거의 동일하였다:클론 15의 서열은 누클레오티드 위치 126에서 출발하는 종결 코돈을 지녔다. 클론 56에 대한 서열 데이타는 SEQ ID NO:11로 표시되며, 제8(a)도에 도시되어 있다.

삽입물의 서열화는 누클레오티드 위치 25에서 위치 34까지의 아데닌잔기의 연속의 독특한 특징을 밝혀냈다(제8(a)도):이러한 서열은 번역 프레임 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있는 서열과 유사하다(Wilson et al., Atkins et al.). Sj26 코딩 서열과 인접하는 오픈 리딩 프레임은 약 23.5kd의 단백질을 예견한다. 따라서, 이 구조물에서 약 26kd 크기의 Sj26 단백질 단편이 주어지면(Smith et al.), 완전한 융합 단백질은 약 50kd일 것으로 예측될 것이다.

[실시예 19]

[클론 56에 의해 코드화된 단백질의 수치료 도표]

인텔리제네틱스(IntelliGenetics) PC/GENETM 소프트웨어 팩키지로부터의 SOAP 프로그램을 사용하여 제9도의 수치료 도표를 작성하였다. SOAP 프로그램은 단백질의 서열을 따라 단백질의 수치료성을 도표화하기 위하여 카이트(Kyte) 등의 방법을 이용한다. 계산에 사용된 간격은 11 아미노산이었다. 제9도에서, 도표의 소수성 쪽은 양성값 범위에 해당하고, 친수성 쪽은 음성값 범위에 해당한다.

수치료 도표는 (ⅰ) 캡시드 단백질의 아미노 말단의 친수성 성질, (ⅱ) 아미노산 잔기 약 122에서 162의 영역의 상대적으로 소수성인 성질, 및 (ⅲ) 아미노산 잔기 약 168-182의 소수성 성질을 나타낸다.

나아가, 아미노산 잔기 168-182의 영역은 막 스패닝 절편이 될 가능성을 입증한다(Klein et al.).

[실시예 20]

[클론 56 단백질 코딩 영역의 결실 분석]

본 실시예는 HCV 캡시드 단백질의 일련의 카르복시 및 아미노 말단 결실의 생성 및 이들 결실이 결과의 단백질의 면역반응성에 미치는 영향을 설명한다.

A. 클론 56의 카르복시 말단 결실

HCV 캡시드 단백질의 발현을 개선하기 위한 한 단계로서, 번역 프레임 이동의 추정 영역을 변형시켜 이 영역에서 발생하는 프레임 이동의 가능성을 감소시켰다. 리신을 코드화하는 각각의 AAA 코돈에서, (누클레오티드 위치 25 내지 33, 제8(a)도) 각 코돈에 있는 세번째 누클레오티드(위치 27,30 및 33, 제8a도)를, 표준 PCR 미스매치 기법(Ausubel et al., Mullis, Mullis et al.)을 사용하여 A에서 G로 변경시켰다. 이들 치환 부위는 제8(a)도에서 해당하는 A 위에 위치된 세 개의 G에 의해 표시된다. 변형된 pGEX 클론의 서열을 실시예 19에서와 같이 확인하고, 클론을 pGEX-CapA로 명명하였다. 클론 pGEX-CapA의 삽입 서열은 제8(b)도에 도시되며, SEQ ID NO:13으로 표시된다.

결실 클론을 표 14에 나타난 PCR 프라이머를 사용하여 생성하였다. 표 14에서, BamHI 부위는 이탤릭체로 표시하고 종결 코돈은 밑줄을 그었다.

증폭반응은 본질적으로 실시예 16에서 설명한 바와 같이 NC 프라이머의 각각과 쌍을 이룬 프라이머 C1을 사용하여 수행하였고, 정제된 플라스미드 pGEX-CapA를 주형으로 사용하였다:증폭 반응은 95에서 1분 동안, 50에서 2분 동안 어닐링시키고, 72에서 3분 동안을 20주기 동안 실시하였다.

다음의 서열 비교는 제8(b)도에 표시된 핵산 서열에 대하여 나타낸 것이다. C1 프라이머는 개시 메티오닌 가까이 있는 NcoI 부위를 함유하는 pGEX-CapA 삽입물의 공통 5'에 해당한다. NC 프라이머의 각각의 서열은 표시된 누클레오티드 위치, 예컨대 누클레오티드 위치 580에서 NC580 프라이머 말단과 상동인 서열에서 출발한다. 종결 코돈은 BamHI 부위 다음에 있는 그 서열에서 삽입된다. 표 14에 나타낸 프라이머의 위치는 제8(b)도에 표시한다. 단백질 서열에 관련한 프라이머의 근사 위치는 제9도에 표시되어 있다.

생성되는 증폭 생성물을 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 영동적으로 크기 분류하고, 적절한 크기의 DNA 생성물을 겔로부터 전기 용리시켰다. 증폭 생성물을 발현을 위해 pGEX와 pET 벡터내 클로닝하였따. 삽입물의 서열은 실시예 18에서 설명한 바와 같이 확인하였다.

카르복시 말단 결실을 함유하고 있는 pGEX 벡터를 대장균 안에 형질전환시키고, 융합 단백질을 다음과 같이 정제하였다. 융합 단백질의 발현을 IPTG로 3 내지 4시간 동안 유도하였다. 그런 다음, 세포를 6,000rpm에서 10분 동안 수확하였고, 대장균을 MTPBS 완충액(150mM NaCl; 16mM Na2HPO4; 4mM NaH2PO4; pH=8.0)에 용해시킨 후, 1TRITON X-100, 3/의 DNase Ⅰ, 및 1mM PMSF를 첨가하였다. 용해물을 15,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 버리고, 펠릿을 8M 우에아에 재현탁시켰다. 재현탁 성분을 BIO-GEL SP-5-PW 칼럼을 사용하여 HPLC에 의해 분리하였다. 전형적으로, 융합 단백질은 눈에 띄는 피크였다:융합 단백질의 위치는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다. 클론 C1NC270, C1NC360 및 C1NC450은 모두 Sj26 단백질에 융합된 삽입물 코딩 서열로 부터 예견된 크기에 해당하며 HCV-양성 혈청과 면역반응하였다(실시예 17에 설명한 바와 같이 웨스턴 블롯을 수행함). 상등액을 버리긴 하였지만, 또한 상당량의 융합 단백질이 상등액에 존재하였다. 클론 C1NC520과 C1NC580은 저수준의 융합 단백질을 생산하였다.

HCV 캡시드 영역의 에피토프 지도는 제10도에 도시한다:삽입물 C1NC450, C1NC360 및 C1NC270에 해당하는 면역반응성 단백질 코딩 서열의 위치가 표시된다. C1NC450, C1NC360 및 C1NC270의 서열들은 서열 목록에 각각 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:19로 표시되어 있다.

B. 클론 56의 아미노 말단 결실

아미노 말단 결실 클론을 표 15에 제시한 PCR 프라이머를 사용하여 생성하였다.

증폭 반응은 전술한 바와 같이 표 16에 나타낸 프라이머쌍과, 주형으로서 정제 플라스미드 pGEX-CapA를 사용하여 수행하였다:증폭반응에는 95에서 1분간, 50에서 5분간 어닐링, 및 72에서 3분간이 20주기 동안 포함되었다.

다음의 서열 비교는 제8(b)도에 나타난 핵산 서열에 대해 제공된다. 여기에서 상술된 A에서 G로의 치환이 pGEX-CapA의 서열에 대해 이루어졌다. NC660 프라이머는 삽입물의 말단에 인접한 BamHI 부위를 함유하는 pGEX-CapA 삽입물의 공통 3' 말단에 해당한다. C 프라이머 각각의 서열은 표시된 누클레오티드 위치, 예컨대 누클레오티드 위치 100에 있는 NC100 프라이머의 서열에서 출발한다. 각각의 C 프라이머는 생성되는 증폭 생성물에 프레임-내부 개시 코돈을 도입시킨다. 표 15에 제시된 프라이머의 위치는 제8(b)도에 도시되어 있다.

생성되는 증폭 생성물을 전술한 바와 같이 발현을 위해 pGEX와 pET 벡터에 클로닝하고, 삽입물의 서열을 확인하였다.

카르복시 말단 결실을 함유하고 있는 pGEX 벡터를 대장균 안에 형질전환시키고, 단백질 미니용해물을 제조하여 단백질의 면역반응성을 전술한 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 분석 결과는 표 16에 나타난다. 클론 C100NC270과 C100NC360은 Sj26 융합 단백질을 고수준으로 발현하였다:융합 단백질은 Sj26 단백질에 융합된 삽입물 코딩 서열로부터 예견된 크기에 상응한다.

HCV 캡시드 영역의 에피토프 지도는 제10도에 도시되어 있다:삽입물 C100NC270, C100NC360, C270NC360 및 C270NC450에 해당하는 단백질 코딩 서열의 위치가 표시된다. C100NC270과 C100NC360에 대한 서열들은 서열 목록에 각각 SEQ ID NO:21과 SEQ ID NO:23으로서 표시된다.

[실시예 21]

[캡시드 항원을 사용한 확장 면역스크리닝]

본 실시예는 혈청의 여러 공급원에 대한 본 발명의 다양한 HCV 항원의 면역반응성의 3가지 상이한 비교를 설명한다.

A. Cap450 항원의 효과

표 17은 NANB 간염 감염으로 추정되는 환자들로부터의 50개의 사람 혈청 샘플의 결과를 나타낸다. ELISA 측정은 다음의 3가지 항원을 사용하여 Tijssen에 의해 설명된 바와 같이 수행하였다:C100, 409-1-1(c-a), C33u, Cap450(pGEX-C1NC450 클론의 단백질 생성물). 한 웰에서 409-1-1(c-a)와 cap4150을 가장 민감한 결과를 제공하기 위해 최적화시켰다. 이들 ELISA 데이타를 애보트(Abbott) C100 시험과 비교하였다.

흡광도가 Sj26 음성 단백질에 대한 환자 혈청의 흡광도의 3배인 경우, 환자 혈청을 Sj26 융합 단백질(409-1-1 ca, 33u, 5-1-1 및 cap450)에 대해 양성으로 기록하였다. 샘플의 흡광도가 음성 대조 혈청의 평균 흡광도의 3배인 경우, 그 샘플을 pET 항원(cap360)에 대해 양성으로 기록하였다. 환자 혈청의 흡광도가 대조 양성 혈청의 흡광도 이상인 경우, 환자 혈청을 조합된 409-1-1 ca/cap450 측정에 대해 양성으로 기록하였다. 대조 양성 혈청의 10이내의 샘플이 약한 양성으로 기록되었다.

샘플 1-19:생체검사에 의해 만성 활성 간염으로 증명됨. HBS Ag(-).

샘플 20-44:급성 바이러스 간염 HBsAg(1), ISM 항-HBC(-), IgM 항-HAV(-).

샘플 45-50:생체검사에 의해 만성 활성 간염으로 증명됨. HBsAg(-).

결과는 Cap450 단백질이 혈청 샘플의 항-HCV 항체의 존재를 검출하기 위하여 양호한 민감도를 가지고 있음을 증명한다. 3개의 추가의 샘플(6,37 및 47)을 검출하였다. 또한 이들 결과는 Cap450과 409-1-1(c-a)의 조합이 사람 혈청 샘플에서 항-HCV 항체의 검출에 매우 효과적인 키트 제조에 사용될 수 있음을 나타낸다.

B. Cap450과 Cap360

표 18의 결과는 사람 혈청에 존재하는 HCV 항체를 검출하기 위한 Cap450과 Cap360 항원(pET-C1NC360에 의해 코드화된 단백질 생성물)의 효력을 증명한다. 샘플들을 제시된 각각의 별개의 항원을 사용하여, 또는 한 웰에 조합된 409-1-1(c-a)와 Cap450 항원을 사용하여 ELISA에 의해 HCV의 존재에 대하여 시험하였다.

이들 결과는 항원 409-1-1(c-a)와 Cap360 또는 Cap450의 조합이 HCV 감염의 검출을 위한 효과적인 진단 도구를 제공함을 나타낸다. 5개의 추가의 샘플(G150, G151, G110, G125 및 G124)이 단독 C100 시험과 비교되는 ELISA 방법으로 검출되었다.

C. pET360

표 19의 결과는 사람 혈청에 존재하는 HCV 항체를 검출하기 위한 pET360의 효능을 입증한다. 샘플을 제시된 각각의 개별적인 항원을 사용하여, 또는 한웰에 조합된 409-1-1(c-a)와 pET360 항원으로 ELISA에 의하여 HCV의 존재에 대하여 시험하였다.

이들 결과는 항원 409-1-1(c-a)와 pET360의 조합이 HCV 감염의 검출에 대해 효과적인 진단 도구를 제공함을 나타낸다. 3개의 추가의 샘플을, 단독 C100 시험과 비교되는 이들 ELISA로 검출되었다.

본 발명을 특정한 구체예, 방법, 제조 및 용도에 관하여 설명하였으나, 본 발명으로부터벗어남이 없이 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 당분야의 숙련자에게는 명백할 것이다.

서열 목록

(1) 일반적인 정보:

(ⅰ) 출원인:그레고리 레이스

중수 피. 김

란돌프 모에클리

크리스티안 씨. 시몬센

(ⅱ) 발명의 명칭:C형 간염 바이러스 에피토프

(ⅲ) 서열의 수:26

(ⅳ) 통신처

(A) 수신인:피터 제이. 델링거

(B) 스트리트:슈트 150 캠브리지 애브뉴 350

(C) 도시:팔로 알토

(D) 주:캘리포니아

(E) 국가:미합중국

(F) 우편번호:94306

(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체 유형:플로피 디스크

(B) 컴퓨터:IBM PC 호환기종

(C) 작동 시스템:PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어:Patentln Release #1.0, Version #1.25

(ⅵ) 현재 출원 상황:

(A) 출원번호:

(B) 출원일:

(C) 분류:

(ⅶ) 우선 출원 상황:

(A) 출원번호:US 505,611

(B) 출원일:1990년 4월 6일

(ⅶ) 우선 출원 상황:

(A) 출원번호:US 594,854

(B) 출원일:1990년 10월 9일

(ⅷ) 변리사/대리인 상황:

(A) 성명:게리 알. 파비안

(B) 등록번호:33,875

(C) 참고/서류 번호:4600-076.21

(ⅸ) 연락처:

(A) 전화:(415)323-8302

(2)SEQ ID NO:1에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특성:

(A) 길이:561 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:304-12-1

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..561

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:1:

(2) SEQ ID NO:2에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:187 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:2:

(2) SEQ ID NO:3에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:252 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:303-1-4

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..252

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:3:

(2) SEQ ID NO:4에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:84 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:4:

(2) SEQ ID NO:5에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:1512 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:303-1-4

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..1512

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:5

(2) SEQ ID NO:6에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:504 아미노산

(B) 타입:아미노산

(C) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:6:

(2) SEQ ID NO:7에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:477 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(C) 개체·분리 클론명:Rodney

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:409-1-1(c-a)

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..477

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:7:

(2) SEQ ID NO:8에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:159 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:8:

(2) SEQ ID NO:9에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:558 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:409-1-10(abc)

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..558

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:9:

(2) SEQ ID NO:10에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:186 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:10:

(2) SEQ ID NO:11에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:657 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:GG1

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..657

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:11:

(2) SEQ ID NO:12에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:219 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:12:

(2) SEQ ID NO:13에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:657 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:CapA

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..657

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:13:

(2) SEQ ID NO:14에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:219 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:14:

(2) SEQ ID NO:15에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:453 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:C1NC450

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..453

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:15:

(2) SEQ ID NO:16에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:150 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:16:

(2) SEQ ID NO:17에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:360 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:C1NC360

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..360

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:17:

(2) SEQ ID NO:18에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:119 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:18:

(2) SEQ ID NO:19에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:273 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:C1NC270

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..273

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:19:

(2) SEQ ID NO:20에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:90 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:20:

(2) SEQ ID NO:21에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:183 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:C100NC270

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..183

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:21:

(2) SEQ ID NO:22에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:60 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:22:

(2) SEQ ID NO:23에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:270 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:C100NC360

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..270

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:23:

(2) SEQ ID NO:24에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:106 염기쌍

(B) 타입:핵산

(C) 쇄의 수:2본쇄

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:cDNA 내지 mRNA

(ⅲ) 추정 서열:없음

(ⅳ) 안티-센스:없음

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명:C형 간염 바이러스

(B) 균주:CDC

(A) 길이:89 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:24:

(2) SEQ ID NO:25에 대한 정보:

(ⅶ) 직접적인 공급원:

(B) 클론:C1NC105

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키:CDS

(B) 위치:1..106

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:25:

(2) SEQ ID NO:26에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이:35 아미노산

(B) 타입:아미노산

(D) 토폴로지:선형

(ⅱ) 분자 타입:단백질

(xi) 서열 표시:SEQ ID NO:26:

Claims (16)

1. C형 간염 바이러스(HCV)와 특이적으로 면역반응하는 혈청 항체를 함유하는 사람 혈액을 스크리닝하는데 사용하기 위한 진단 키트로서, SEQ ID NO:6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HCV 폴리펩티드 항원, 및 HCV 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함하는 진단 키트.
2. C형 간염 바이러스(HCV)와 특이적으로 면역반응하는 혈청 항체를 함유하는 사람 혈액을 스크리닝하는데 사용하기 위한 진단 키트로서, SEQ ID NO:2으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HCV 폴리펩티드 항원, 및 HCV 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함하는 진단 키트.
3. C형 간염 바이러스(HCV)와 특이적으로 면역반응하는 혈청 항체를 함유하는 사람 혈액을 스크리닝하는데 사용하기 위한 진단 키트로서, SEQ ID NO:8으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HCV 폴리펩티드 항원, 및 HCV 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함하는 진단 키트.
4. C형 간염 바이러스(HCV)와 특이적으로 면역반응하는 혈청 항체를 함유하는 사람 혈액을 스크리닝하는데 사용하기 위한 진단 키트로서, SEQ ID NO:10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HCV 폴리펩티드 항원, 및 HCV 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함하는 진단 키트.
5. 제1항에 있어서, 검출 수단이 펩티드가 부착되는 고형 지지체 및 리포터 표지된 항-사람 항체를 포함하며, HCV 폴리펩티드 항원에 대한 혈청 항체의 결합이 혈청 항체에 대한 리포터 표지된 항체의 결합에 의해 검출될 수 있음을 특징으로 하는 키트.
6. 제2항에 있어서, 검출 수단이 펩티드가 부착되는 고형 지지체 및 리포터 표지된 항-사람 항체를 포함하며, HCV 폴리펩티드 항원에 대한 혈청 항체의 결합이 혈청 항체에 대한 리포터 표지된 항체의 결합에 의해 검출될 수 있음을 특징으로 하는 키트.
7. 제3항에 있어서, 검출 수단이 펩티드가 부착되는 고형 지지체 및 리포터 표지된 항-사람 항체를 포함하며, HCV 폴리펩티드 항원에 대한 혈청 항체의 결합이 혈청 항체에 대한 리포터 표지된 항체의 결합에 의해 검출될 수 있음을 특징으로 하는 키트.
8. 제4항에 있어서, 검출 수단이 펩티드가 부착되는 고형 지지체 및 리포터 표지된 항-사람 항체를 포함하며, HCV 폴리펩티드 항원에 대한 혈청 항체의 결합이 혈청 항체에 대한 리포터 표지된 항체의 결합에 의해 검출될 수 있음을 특징으로 하는 키트.
9. C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 사람으로부터의 혈청과 특이적으로 면역반응하는 펩티드 항원을 포함하는, 체내의 C형 간염 바이러스(HCV) 감염을 진단하기 위한 조성물로서, 펩티드 항원이, a) HCV 코딩 서열에 의해 코드화되고; b) 504개의 아미노산 잔기를 가지며; c) SEQ ID NO:6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 조성물.
10. C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 사람으로부터 혈청과 특이적으로 면역반응하는 펩티드 항원을 포함하는, 체내의 C형 간염 바이러스(HCV) 감염을 진단하기 위한 조성물로서, 펩티드 항원이 SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
11. C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 사람으로부터 혈청과 특이적으로 면역반응하는 펩티드 항원을 포함하는, 체내의 C형 간염 바이러스(HCV) 감염을 진단하기 위한 조성물로서, 펩티드 항원이 SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
12. C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 사람으로부터 혈청과 특이적으로 면역반응하는 펩티드 항원을 포함하는, 체내의 C형 간염 바이러스(HCV) 감염을 진단하기 위한 조성물로서, 펩티드 항원이 SEQ ID NO:10로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
13. 제9항에 있어서, 펩티드가 검출성 리포터 표지된 항-사람 항체와 반응할 수 있는 고형 지지체에 부착됨을 특징으로 하는 조성물.
14. 제10항에 있어서, 펩티드가 검출성 리포터 표지된 항-사람 항체와 반응할 수 있는 고형 지지체에 부착됨을 특징으로 하는 조성물.
15. 제11항에 있어서, 펩티드가 검출성 리포터 표지된 항-사람 항체와 반응할 수 있는 고형 지지체에 부착됨을 특징으로 하는 조성물.
16. 제12항에 있어서, 펩티드가 검출성 리포터 표지된 항-사람 항체와 반응할 수 있는 고형 지지체에 부착됨을 특징으로 하는 조성물.