PT97428B - Processo para a preparacao de epitopos do virus da hepatite c - Google Patents

Description

Titular; GENELABS INCORPORATED

Epígrafe; PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE EPITOPOS DO VIROS DA HEPATITE C£

MEMÓRIA DESCRITIVA

1. Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a antigénios virais peptidicos específicos que são imunoreactivos com o soro de pacientes infectados pelo virus da hepatite não-A, nâo-B transmitido parentericamente (PT-NANBH, agora designado virus da hepatite C), a sequências polinucleotidicas que codificam os péptidos, a um sistema de expressão capaz de produzir os péptidos, e a métodos de utilização dos péptidos para detecção de infecçdes pelo PTNANBH no soro humano.

2. Referências;

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3. Antecedentes:

A hepatite virai resultante da infecção por um virus, que não seja o virus da hepatite A (HAV), ou o virus da hepatite B (HBV), tem sido referida como hepatite não A, não B (NANBH). Mais recentemente, tornou-se claro que a NANBH envolve pelo menos duas, ou talvez mais, viroses bastante distintas. Uma destas, conhecida como NANBH de transmissão entérica, ou ETNANBH, é predominantemente contraída em áreas de sanidade precária onde a comida e a água para beber sofreram contaminação com matéria fecal. A clonagem molecular de uma porção deste virus, referido como virus da hepatite E (HEV), foi recentemente descrita (Reyes et al.).

segundo tipo de virus NANB, conhecido como NANBH de transmissão parentérica, ou PT-NANBH, é transmitido por via parentérica, geralmente por exposição ao sangue ou produtos sanguíneos. Aproximadamente 10% das transfusões provocam infecções por PT-NANBH e cerca de metade destas progridem para um estado de doença crónica (Dienstag).

Soro humano, classificado como produtor de NANBH pós3 transfusional em receptores humanos, tem sido usado com sucesso para produzir infecções PT-NANBH em chimpanzés (Bradley). 0 RNA isolado do soro dos chimpanzés infectados tem sido usado para construir patrimónios de cDNA num vector de expressão para imunoscreening com soro humano com PT-NANBH em estado crónico. Este procedimento identificou um clone de cDNA especifico de PTNANBH e a sequência virai foi então usada como sonda para identificar fragmentos que atingem os 7300 pares de bases contíguos de um agente virai de PT-NANBH (Pedido de patente EPO 88310922.5, depositado em 18/11/88). 0 mesmo procedimento foi usado pelos presentes inventores para obter dois dos péptidos de PT-NANBH e sequências polinucleotidicas aqui reveladas. A sequência virai do agente foi denominada HCV (HCV) (Pedido de patente EPO referida acima).

Até à data tem sido referido um péptido imunogénico codificado pelo agente virai do HCV (Choo, Kuo, Pedido EPO 88310922.5). Este péptido, designado por C-100, tem sido usado em imuno-ensaios com soro PT-NANBH, e verifica-se que reage imuno-especificamente com cerca de 80% das amostras crónicas de NANBH e com cerca de 15% de amostras agudas de NANBH (Kuo).

Deseja-se o fornecimento de um ou de uma colecçâo de antigénios peptidicos que são imunoreactivos com uma percentagem mais elevada de sangues infectados com PT-NANBH, incluindo tanto as infecções crónicas como agudas de PT-NANBH.

4. Sumário da Invenção:

objectivo geral da invenção é fornecer polipéptidos recombinantes imunoreactivos, com soro humano infectado pelo

virus da hepatite C (HCV), incluindo um péptido que é imunoreactivo com uma elevada percentagem de soros de indivíduos com infecções crónicas pelo HCV, e pêptidos imunoreactivos com o soro associado com a infecção aguda pelo HCV.

Um outro objectivo da invenção é fornecer uma sequência polinucleotidica do HCV codificando uma sequência para a produção recombinante dos antigénios peptidicos, e um método de diagnóstico para detecção de soro humano infectado pelo HCV usando os antigénios peptidicos.

A invenção inclui, num aspecto, um antigénio peptidico que é imunoreactivo com soro humano infectado pelo HCV. Um antigénio peptidico nesta invenção inclui uma porção imunoreactiva de um polipéptido de um HCV que:

a) é codificado por uma sequência codificante de HCV;

b) tem 504 residuos de aminoácidos; e

c) tem a sequência carboxi-terminal apresentada como SEQ ID NO: 4.

Outros antigénios peptidicos da invenção incluem uma porção imunoreactiva de qualquer uma das sequências seguintes: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, e SEQ ID NO:26.

Num outro aspecto, a invenção inclui kits de diagnóstico para utilização na pesquisa de sangue humano contendo anticorpos específicos contra infecções pelo HCV. O kit inclui, pelo menos, um antigénio peptidico que é imunoreactivo com soro humano infectado pelo virus da hepatite C (HCV): antigénios peptidicos específicos para utilização no kit são referidos acima.

Uma das incorporações preferidas da presente invenção é um kit de diagnóstico contendo a 409-1-1 (c-a) (SEQ ID NO:8) e uma das proteínas derivadas da cápside do HCV (SEQ ID NOs:12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26): duas incorporações particulares, sendo a 409-1-1 (c-a) com o péptido C1NC450 derivado da cápside, e a 409-1-1 (c-a) com o péptido C1NC360 derivado da cápside.

Numa incorporação da presente invenção, o antigénio é imobilizado num suporte sólido. A ligação dos anticorpos específicos contra o HCV ao antigénio imobilizado é detectada por um anticorpo anti-humano de informação marcado que actua de modo a referenciar o suporte sólido com uma marca detectável.

kit é utilizado num método para detecção de infecções pelo HCV num indivíduo por: (i) soro reactivo de um teste de um indivíduo infectado pelo HCV com o referido antigénio peptidico e (ii) exame do antigénio pesquisando a presença de anticorpo ligado.

Os antigénios peptidicos são produzidos, de acordo com outro aspecto da invenção, usando um sistema de expressão para expressar um antigénio peptidico recombinante que é imunoreactivo com soro humano infectado com o virus da hepatite C (HCV). Um vector de expressão seleccionado contendo uma estrutura aberta de leitura (ORF), de um polinucleótido que codifica o péptido é introduzido num hospedeiro apropriado, que é cultivado sob condições que promovem a expressão da ORF no vector de expressão.

Numa incorporação, o polinucleótido é inserido num local de expressão num vector fago lambda gtll e o vector é introduzido numa E. coli hospedeira. As seguintes E. coli «CSSBto.

hospedeiras foram depositadas e contêm vectores incluindo as sequências codificadoras dos antigénios referidos entre parênteses; ATCC No. 40901 (SEQ ID N0:3), ATCC No. 40893 (SEQ ID N0:l) ATCC No. 40792 (SEQ ID NO;7) e ATCC No. 40876 (SEQ ID NO:9). pGEX e pET são outros dois vectores que foram usados para expressar antigénios HCV. Será referido que a determinação de outras combinações de vectores e hospedeiros apropriados para a expressão das sequências referidas acima estão dentro do âmbito de indivíduos mestres na arte.

Também fazendo parte da invenção encontram-se polinucleótidos que codificam polipéptidos imunoreactivos com soro humano infectado pelo virus da hepatite C (HCV). Um polinucleótido da presente invenção codifica um polipéptido em que o polipéptido inclui uma porção imunoreactiva de uma sequência peptidica que:

a) é codificada por uma sequência HCV codificante;

b) tem 504 resíduos de aminoácidos; e

c) tem a sequência carboxi-terminal apresentada como SEQ ID NO;4; e, em que a sequência aminoacidica carboxi-terminal do referido antigénio peptidico é codificada pela sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO:3.

Outros polinucleótidos da invenção incluem qualquer uma das seguintes sequências: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:21, SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:25,

Estes e outros objectivos e características da invenção tornar-se-ão mais aparentes quando a seguinte descrição detalhada for lida em conjunto com as respectivas figuras.

5. Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 ilustra os passos da produção de fragmentos sobreponiveis de ligação de um segmento de ácido nucleico, de acordo com os métodos da presente invenção;

A figura 2 mostra as posições de regiões do primer e regiões de ligação sobreponiveis, ao longo de uma porção de 7300 pares de bases do genoma do HCV.

A figura 3 mostra a sequência codificante do DNA da inserção do clone 40. As sequências sublinhadas correspondem a uma região primer R_g.

A figura 4 mostra a sequência codificante do DNA da inserção do clone 36. As sequências sublinhadas correspondem , respectivamente, às regiões de primer F₇, F₈ e R₈.

A figura 5 mostra o DNA e as sequências codificantes da proteina, para a inserção de um clone 409-l-l(abc). A região A desta sequência é delineada por quadrados, a região B é delineada por um quadrado e um triângulo, e a região C por um triângulo e um asterisco.

A figura 6 mostra o DNA e as sequências codificantes da proteina, para a inserção de um clone 409-1-1(c-a).

A figura 7 ilustra os grupos de ciones que têm sido obtidos a partir do genoma do HCV nas regiões correspondentes à inserção do clone 409-1-1(abc).

A figura 8A mostra o DNA e as sequências codificantes da proteina para a inserção do pGEX-GGl. Os três Gs acima da primeira linha indicam onde foram feitas substituições para gerar o clone pGEX-CapA. A figura 8B mostra o DNA e sequências proteicas para a sequência codificante da inserção pGEX-CapA. Os primers usados nas reacções em cadeia das polimerases para gerar delecções de grupos carboxi e amino terminais estão indicadas abaixo da linha de nucleótidos. As sequências dos primers estão indicadas no sentido (cadeia codificante). A sequência actual dos primers NC (não codificantes) é o complemento reverso da sequência indicada. Os primers codificantes estão sublinhadosy primers reversos (não codificantes) estão sublinhados duas vezes. As sequências apresentadas em letras maiúsculas são correspondências exactas. As sequências apresentadas em letras minúsculas são sequências não correspondentes usadas para introduzir os sites de restrição terminal (Ncol nas extremidades 5' e BamHl nas extremidades 3'). Os três nucleótidos que foram alterados para remover os codões incertos nas posições 24, 27 e 30, são indicados por caracteres em realce e com os residuos desordenados do tipo A apresentados acima da sequência.

A figura 9 mostra um gráfico do comportamento em relação à água da proteina do core do HCV codificada por pGEXCapA. O local relativo dos primers, usado para gerar delecções de grupos carboxi e amino terminais, são indicados por setas relativamente à sequência codificante da proteina.

A figura 10 mostra um mapa do epitopo da região proteica da cápside do HCV.

6. Descrição Detalhada da Invenção

I. Definições

Os termos definidos abaixo têm os seguintes significados no presente texto:

1. Agente virai da hepatite não A, não B de transmissão parentérica (PT-NANBH), refere-se a um virus, tipo de virus, ou classe de virus que (i) causa hepatites infecciosas de transmissão parentérica, (ii) é transmissível em chimpanzés, (iii) é serologicamente distinto do virus da hepatite A (HAV), do virus da hepatite B (HBV) e virus da hepatite E (HEV).

2. HCV (HCV) refere-se a um agente virai da PT-NANBH cuja sequência polinucleotidica inclui a sequência da região de 7300 pares de bases do HCV fornecido no Apêndice e variações da sequência, como codões degenerados, ou variações que podem estar presentes em diferentes isolados ou estirpes de HCV.

3. Dois fragmentos de ácidos nucleicos são homólogos” se são capazes de se hibridar um com o outro sob condições de hibridação descritas em Maniatis et al.,op. cit., pp. 320-323, utilizando as seguintes condições de lavagem: 2 x SCC, 0,1% SDS, duas vezes à temperatura ambiente, 30 minutos cada; depois 2 x SCC, 0,1% SDS, a 50°C uma vez, 30 minutos; depois 2 x SCC, à temperatura ambiente duas vezes, 10 minutos cada, as sequências homólogas que contêm no máximo cerca de 2530% de não correspondência de pares de bases, podem identificar-se. De preferência, cadeias de ácidos nucleicos homólogas contêm 15-25% de não correspondência de pares de bases, preferencialmente 5-15% de não correspondência de pares de bases. Estes graus de homologia podem ser seleccionados utilizando condições de lavagem ou hibridação mais estritas para identificação de clones de patrimónios de genes (ou outras fontes de material genético), como é bem conhecido pelos peritos nestas áreas.

4. Um fragmento de DNA é derivado do HCV se tem substancialmente a mesma sequência de pares de bases que uma região do genoma do HCV virai que foi definido acima em (2).

5. Uma proteina é derivada de um agente virai da PT-NANBH ou HCV, se é codificada por uma estrutura aberta de leitura de um fragmento de cDNA ou RNA derivados de um agente virai da PT-NANBH ou HCV, respectivamente.

II. Seleçcão Molecular de Clones por Despiste Imunológico

A medida que nos aproximamos da identificação molecular de um clone de agentes de PT-NANBH, são preparados patrimónios de cDNA a partir de soros infectados no vector de expressão lambda gtll. São então seleccionadas as sequências de cDNA para expressão de péptidos que são imunoreactivos com soro infectado com PT-NANBH. As proteínas recombinantes identificadas por esta tentativa fornecem candidatos para péptidos que podem servir de substratos em testes de diagnóstico. Ainda, as sequências codificantes de ácidos nucleicos identificadas por esta tentativa servem como úteis sondas de hibridação para a identificação de mais sequências codificantes de PT-NANBH.

De modo a fazer do despiste imunológico uma iniciativa útil na identificação de clones originários de sequências codificantes de PT-NANBH, é importante uma bem definida fonte de virus PT-NANBH. Para gerar tal fonte, um chimpanzé (#771; Exemplo IA) foi infectado com agentes transmissíveis de PT-NANBH usando um concentrado de factor VIII como fonte (Bradley). Sabia-se que o concentrado de factor VIII continha, pelo menos, duas formas de hepatite NANB de transmissão parentérica (PT-NANBH). Em adição a um agente sensivel ao clorofórmio, que foi subsequentemente designado HCV (HCV), foi também transmitida no concentrado, uma forma de PT-NANBH resistente ao clorofórmio (Bradley, 1983):

No método ilustrado no exemplo 1, o soro infectado foi precipitado, sem diluição, por centrifugação e foram construídos patrimónios de cDNA do precipitado virico resultante (Exemplos IB e 1C). Soros humanos infectados foram tratados do mesmo modo. Criaram-se patrimónios de cDNA, e.g., usando como material de inicio o RNA extraido do precipitado sérico, por um método de escolha ao acaso do primer (Exemplo IB e 1C). As moléculas de cDNA resultantes foram então clonadas num vector adequado, por exemplo, lambda gtll, para expressão e despiste de antigénios peptidicos e lambda gtlO, para despiste por hibridação (Exemplo lc(iv)). 0 lambda gtll é um vector de expressão particularmente útil, que contém um único local de inserção para a EcoRl, 53 pares de bases a montante do codão de terminação de tradução do gene da beta-galactosidase. Assim, uma sequência inserida é expressa como uma proteina de fusão da beta-galactosidase, que contém a porção N-terminal do gene da beta-galactosidase, o péptido heterólogo e, opcionalmente, a porção C-terminal do péptido da beta-galactosidase (sendo a porção C-terminal expressa quando a sequência codificante do péptido heterólogo não contém o codão de terminação da tradução). Este vector também produz um repressor sensivel à temperatura (CI857) que causa lisogenia virai a temperaturas permissivas, e.g., 32°C e que conduz à lise virai a elevadas temperaturas, e.g., 42°C. As vantagens deste

vector incluem: (1) geração de um clone recombinante altamente eficiente, (2) capacidade de selecção de células hospedeiras lisogénicas com base no crescimento da célula hospedeira a temperaturas permissivas, mas não a temperaturas não permissivas, e (3) elevados niveis de produção de proteina de fusão recombinante. Ainda, uma vez que um fago contendo uma inserção heteróloga produz uma enzima beta-galactosidase inactiva, fagos com inserções são tipicamente identificados usando uma reacção de substrato colorido para a beta-galactosidase.

No procedimento de despiste mencionado nos exemplos 13, patrimónios individuais de cDNA foram preparados a partir do soro de um chimpanzé infectado por PT-NANBH (#771) e quatro seres humanos infectados por PT-NANBH (designados por EGM, BV, WEH e AG) . Estes cinco patrimónios sofreram um despiste imunológico utilizando um soro positivo PT-NANBH humano ou de chimpanzé (Exemplo 2): Foram identificados 111 clones lambda gtll que eram imunoreactivos com, pelo menos, um dos soros. Destes 111 clones, 93 foram sujeitos a pesquisas para hibridação de inserções com DNA normal. As inserções foram marcadas radioactivamente e usadas como sondas contra o DNA do linfócito periférico humano duplamente digerido HindIII/EcoRI (PBL) (Exemplo 3). Aproximadamente 46% (43/93) das inserções hibridaram com o DNA do PBL humano normal e por esta razão foram postas de parte. Inserções de 11 clones imunopositivos PT-NANBH, derivados do soro do chimpanzé #771, foram caracterizadas como exógenas ao DNA do PBL humano normal (Exemplo 3). Destes 11 clones foram identificados 2 clones PT-NANBH tendo as seguintes características. Um clone (clone 40) era claramente exógeno, por humano repetidos testes de hibridação contra o DNA do PBL normal, tinha uma zona de inserção relativamente pequena (aproximadamente 0,5 kilobases), e era muito pouco reactivo com o soro controle negativo. 0 segundo clone (clone 36) revelou-se reactivo com múltiplos anti-soros PT-NANBH, tinha uma zona de inserção relativamente grande (aproximadamente 1,5 kilobases), e era exógeno por testes de hibridação contra o DNA do PBL humano normal. As características imunoreactivas dos clones 36 e 40 estão resumidas na Tabela 1 (Exemplo 3). O clone 36 era imunoreactivo com o soro do chimpanzé #771 e com dois soros humanos positivos para o HCV, AG e BV. O antigénio do clone 36 não foi imunoreactivo com o soro controle negativo SKF. O clone 40 era imunoreactivo com o soro do chimpanzé #771 e totalmente não reactivo quando se usava o soro controle negativo para o despiste.

A sequência do DNA do clone 36 foi determinada em parte e é apresentada na figura 4. Esta sequência corresponde aos nucleótidos de 5010 a 6516 da sequência de HCV fornecida no apêndice. A sequência de DNA foi também determinada para a inserção do clone 40 (Figura 3). Esta sequência é homóloga à sequência de HCV (Apêndice), aproximadamente na região dos nucleótidos 6515 a 7070. As inserções de dois outros clones de chimpanzés #771, clones 44 e 45, revelaram-se, por hibridação e análise de sequências (Exemplo 4), homólogas ao clone 40. As sequências para os clones 36 e 40 são sequências contíguas, com as sequências do clone 36 localizadas na posição 5' das sequências do clone 40 como se apresenta no Apêndice. Assim estes dois clones representam o isolamento de um bloco significativo do genoma do HCV pelos métodos de despiste imunológico descritos acima.

Os quatro clones lambda gtll 36, 40, 44 e 45 foram depositados na Genelabs Culture Collection, Genelabs Incorporated, 505 Penobscot Drive, Redwood City, CA 94063. Ainda, os clones lambda gtll dos clones 36 e 40 foram depositados na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville MD, 20852 com os números de depósito ATCC 40901 e ATCC 40893.

III. Identificação da Sequência de PT-NANBH por Métodos de Hibridação

Os polinucleótidos identificados na secção II podem ser empregues como sondas em métodos de hibridação para identificar mais sequências de HCV, e estas podem então ser usadas como sondas para identificar sequências adicionais. 0 polinucleótido pode ser clonado directamente ou fragmentado por digestão parcial para gerar fragmentos ao acaso. Os clones resultantes podem ser imunologicamente pesquisados como se descreve acima para identificar as sequências codificantes do antigênio do HCV.

Para ilustrar como as inserções dos clones 36 e 40 podem ser usadas para identificar clones possuidores de sequências de HCV, a inserção do clone 40 foi isolada e usada como sonda de hibridação contra os patrimónios de cDNA individuais estabelecidos no lambda gtlO (ver acima). Utilizando a sonda do clone 40, aproximadamente 24 clones independentes de hibridação positiva foram purificados em placa (Exemplo 5). Os sinais positivos surgiram com frequências diferentes em patrimónios de cDNA a partir de diferentes fontes de soros, sugerindo que os sinais de hibridação eram provenientes das fontes de soro e não resultantes de um mesmo contaminante comum introduzido durante a sintese ou clonagem do cDNA (Tabela 2). Um dos ciones, 108-2-5, que deu positiva a hibridação com a inserção do clone 40, tinha uma inserção de aproximadamente 3,7 kb (Exemplo 6). Uma vez que tinha uma inserção tão grande, o clone 108-2-5 foi escolhido para análises posteriores. A fonte de soro deste clone de cDNA foi o soro humano EGM PT-NANBH (Exemplo 1).

A inserção do 108-2-5 foi isolada por digestão do clone lambda gtlO pela EcoRl, fraccionamento electroforético e electroeluição (Exemplo 6). A inserção isolada foi tratada com uma DNase I para gerar fragmentos ao acaso (Exemplo 6), e os fragmentos resultantes da digestão foram inseridos no vector fago lambda gtll para despiste imunológico. Os ciones lambda gtll dos fragmentos do 108-2-5 foram imunologicamente pesquisados (Exemplo 6) usando soro humano (BV e normal) e de chimpanzé #771. Foram identificados 12 ciones positivos no primeiro despiste imunológico realizado com soro humano e de chimpanzé. 7 dos 12 ciones foram purificados em placa e sujeitos a novo despiste usando soro de chimpanzé #771. Para dois dos ciones resultantes, designados 328-16-1 e 328-16-2, foram determinadas sequências de DNA parciais da inserção de DNA. Estes dois ciones continham sequências esseneialmente idênticas às do clone 40 (Exemplo 6).

A inserção do clone 36 pode ser usada de um modo similar servindo de sonda para o património de cDNA original gerado no lambda gtlO. Subfragmentos específicos do clone 36 podem ser isolados pela reacção em cadeia das polimerases ou após clivagem com endonucleases de restrição. Estes fragmentos podem

ser radioactivamente marcados e usados como sondas contra os patrimónios de cDNA gerados no lambda gtlO (Exemplo lc). Em particular, as sequências 5' terminais da inserção do clone 36 são úteis como sondas para identificar clones sobreponiveis a esta região.

Ainda, as sequências fornecidas pelas sequências de inserção terminais do clone 36 e as sequências de inserção terminal do clone 40 são úteis como primers de sequências especificas na reacção de sintese da primeira cadeia de DNA (Maniatis et al.; Scharf et al.) usando, por exemplo, o soro do chimpanzé #771 que gerou RNA como substrato. A sintese da segunda cadeia de cDNA tem um primer escolhido ao acaso. Os procedimentos acima referidos identificam ou produzem moléculas de cDNA correspondentes a regiões de ãcidos nucleicos que são adjacentes em 5' às conhecidas sequências de inserção dos clones 36 e 40. Estas sequências recentemente isoladas podem, por sua vez, ser usadas para identificar outras sequências colocadas nos flancos, e assim por diante, para identificar as sequências que compõem o genoma de HCV. Como está descrito acima, após o isolamento das novas sequências de HCV, os polinucleótidos podem ser cionados e imunologicamente pesquisados para identificar sequências especificas codificantes para antigénios de HCV.

IV. Geração de Fragmentos de Ligação Cionados Sobreponiveis

Esta secção descreve um método para produzir e identificar péptidos de HCV que podem ser úteis como antigénios de diagnóstico de HCV. 0 presente método é usado para gerar uma série de fragmentos de ligação sobreponiveis que abrangem um segmento do ãcido nucleico. A aplicação do método para gerar uma série de fragmentos de ligação sobreponiveis que abrangem um segmento de 7300 pares de bases do genoma de HCV, cuja sequência é dada em apêndice, vai ser descrita com referência às figuras 1 e 2.

Como primeiro passo no método, e com referência à figura 1, o ácido nucleico com interesse é obtido sob a forma de DNA em cadeia dupla. Tipicamente, isto é feito por isolamento de fragmentos de DNA genómico ou pela produção de cDNAs a partir de espécies de RNA presentes na amostra fluida. O método mais recente é usado para gerar cadeias duplas de DNA a partir de RNA virai NANBH presente no soro de chimpanzés, ou humano, com uma infecçâo PT-NANBH conhecida. Aqui, o RNA da amostra é isolado, e.g., por extracção dos viriões PEG precipitados com tiocianato de guanidinium e reacção com um primer adequado à sintese da primeira cadeia de cDNA.

Os primers para a primeira cadeia de cDNA podem ser escolhidos ao acaso, primers oligo dT, ou primer(s) com sequências especificas. As condições de emparelhamento dos primers são seleccionadas para (a) optimizar a geração de fragmentos de cDNA que vão abranger o segmento de ácido nucleico com interesse, e (b) produzir fragmentos de cDNA que são preferencialmente iguais ou maiores que cerca de 1000 pares de bases de comprimento. Num método aplicado ao RNA do HCV, a sintese da primeira cadeia é realizada usando primers com sequências especificas que são complementares a regiões espaçadas ao longo do comprimento da conhecida sequência genómica do HCV.

As posições dos primers sao indicadas em A, B, C e D na figura 2, que mostra um mapa do segmento do genoma de HCV. As localizações dos pares de bases dos primers no genoma de HCV são dadas no Exemplo 7 referido abaixo. A seguir à sintese da primeira cadeia, a segunda cadeia de cDNA é sintetizada por métodos Standard.

Os fragmentos de ligação no método são produzidos por amplificação de sequências especificas do DNA de cadeia dupla obtido como se refere acima, usando pares de primers sobreponiveis a regiões ainda a descrever. De acordo com uma importante vantagem do método da presente invenção, é possivel gerar fragmentos de ligação mesmo quando a quantidade de DNA em dupla cadeia é demasiado baixa para amplificação directa de sequências especificas. Esta limitação foi descoberta, por exemplo, com cDNAs do HCV produzidos a partir de soro infectado por NANBH. Aqui, a quantidade de DNA em dupla cadeia disponível para amplificação é primeiro amplificado não especificamente por uma técnica conhecida como Amplificação de Sequências Independentes por Primer Unico (SISPA) .

A técnica SISPA encontra-se pormenorizada no Pedido de Patente Norte Americana para Técnicas de Amplificação para RNA e DNA, No. de série 224.961, depositada em 26 de julho de 1988. 0 método de aplicação à amplificação dos fragmentos de cDNA do HCV é também descrito no Exemplo 7. Resumidamente, primers de ligação de sequências conhecidas são ligados a extremidades opostas da cadeia dupla de DNA numa amostra de DNA. Estes ligandos fornecem, então, sequências terminais comuns para amplificação iniciada por primer”, usando primers complementares à sequência ligando/primer. Tipicamente, o método SISPA é efectuado em 20-30 ciclos de amplificação, usando ciclos de temperatura para atingir uma desnaturação sucessiva e polimerização iniciada por primer da segunda cadeia de DNA.

A figura 1 ilustra a amplificação SISPA de um duplex de DNA, para gerar fragmentos amplificados que possuem regiões de sequências conhecidas Pi· Como se viu, a mistura de fragmentos inclui, pelo menos, alguns fragmentos que (a) são sobreponiveis a regiões P| com outros fragmentos na mistura e (b) contêm regiões de ligação completas entre as regiões adjacentes e P_i+1.

Colectivamente, cada região de ligação ligada pelas regiões sobreponiveis associadas construindo o segmento, está presente em, pelo menos, um fragmento de DNA.

A produção de fragmentos de ligação sobreponiveis, de acordo cora os métodos da presente invenção, ê realizada utilizando o método da reacção em cadeia das polimerases (PCR), descrito na Patente Norte Americana No. 4.683.195. Ao efectuar este passo do método, primeiro o segmento total com interesse é dividido numa série de intervalos sobreponiveis ligados por regiões de sequências conhecidas, como se acabou de descrever. Na figura 2, o segmento de 7300 pares de bases do genoma de HCV foi dividido em 10 intervalos, cada um com 500-1000 pares de bases de comprimento. Os intervalos são designados de acordo com os primers F, de sentido e o Rj reverso usados na amplificação da sequência, como se vai descrever. A seleçcão dos intervalos é conduzida por (a) a sequência de pares de bases em cada extremidade do intervalo tem que ser conhecida e, (b) de preferência, o comprimento do intervalo deve andar entre os 500 e

os 2.000 pares de bases.

No método aplicado ao segmento com 7.300 pares de bases do genoma de HCV, as regiões sobreponiveis entre os 10 intervalos foram adicionalmente amplificadas para verificar que a amostra de cDNA amplificada por SISPA continha cDNA do HCV suficiente para se observar amplificação pelo PCR dos fragmentos de ligação do HCV, e que as regiões do HCV ao longo de todo o comprimento do genoma estavam disponíveis para amplificação. Cada região sobreponivel do segmento pode ser definida por um par de primers que inclui um primer de sentido F_i e um primer reverso R_i que são complementares a cadeias opostas de extremidades opostas da região sobreponivel. Tipicamente, os primers têm cerca de 20 pares de bases de comprimento e abrangem uma região sobreponivel de cerca de 200 pares de bases. As 11 regiões sobreponiveis no segmento de HCV e as regiões correspondentes aos primers de sentido e reverso em cada região, são dados no Exemplo 8.

Os primers Fí/Rí são adicionados ao material de DNA amplificado numa mistura da reacção PCR e a região sobreponivel ligada pelos primers é amplificada por 20-30 ciclos térmicos. 0 material da reacção é então fraccionado, e.g., por electroforese em gel de agarose e sondado pela presença da sequência desejada, e.g., por Southern blotting (Southern), usando uma sonda oligonucleotidica radioactivamente marcada que é especifica para uma porção interna da região sobreponivel. Como se descreve no Exemplo 8, este método foi bem sucedido na produção de fragmentos amplificados para cada uma das 11 regiões sobreponiveis F^/R^ no segmento do genoma de HCV. Os fragmentos das regiões

sobreponiveis podem ser usados como sondas para os correspondentes (dois) fragmentos de ligação ligados pela região sobreponivel. Faz-se notar, no entanto, que este passo de amplificação foi empregue para confirmar a presença de cDNA amplificãvel ao longo do comprimento do genoma de HCV e não como um passo essencial na produção dos fragmentos de ligação desejados. Este passo está omitido da figura 1.

Os fragmentos de ligação F^/Rj são produzidos por uma técnica de PCR com dois primers na qual os fragmentos de DNA amplificados por SISPA são amplificados por um par de primers consistindo num primer de sentido Fi de uma região sobreponivel e o primer reverso Rj de uma região sobreponivel adjacente. As 10 regiões sobreponiveis no segmento de HCV e as regiões correspondentes aos primers de sentido e reverso, em cada região, são dadas no Exemplo 9. As condições tipicas de são referidas no Exemplo 9. Os fragmentos em cada mistura reaccional são isolados e

e.g., por electroforese em gel para confirmar as esperadas dimensões do fragmento. Técnicas de Southern blot podem ser sondadas com sondas de oligonucleõtidos complementares a regiões internas localizadas entre os extremos do fragmento, para confirmar a esperada sequência dos fragmentos. Como se mostra ao fundo da figura 1, o método gera um conjunto completo de fragmentos de ligação, em que cada fragmento é ligado por regiões sobreponiveis P_i e P_i+1.

O método, como se aplica à produção de 10 fragmentos de ligação sobreponiveis do genoma de HCV de 7.300 pares de bases, é descrito no Exemplo 9. Como se demonstra, por critério de amplificação amplificados purificados,

dimensões em gel de electroforese e por critério de sequência por Southern blot, o método foi bem sucedido na geração dos 10 fragmentos sobreponiveis abrangendo o genoma de HCV.

Note-se que o método de amplificação com sequências que servem de flancos poder ser aplicado à geração de fragmentos de DNA correspondentes às sequências de inserção dos clones 36 e 40, que também foram obtidos por despiste imunológico. Os primers de ligação que servem de flancos às inserções são facilmente usados para gerar sequências correspondentes às inserções do clone. Por exemplo, a amplificação com dois primers dos fragmentos de cDNA amplificados por SISPA (Exemplo 7) usando o par de primers F₁₂/R_g (cujas sequências são dadas no Exemplo 8) é levada a cabo sob condições similares às descritas no Exemplo 9. A mistura do fragmento amplificado é fraccionada por electroforese em agarose, em agarose a 1,0%, e a banda esperada recolhida do gel e eluida.

fragmento amplificado e purificado é tratado com o fragmento Klenow da DNA polimerase I para assegurar que as moléculas têm uma terminação cega. O fragmento é então ligado aos ligandos da EcoRI (Exemplo 10). A mistura é digerida com EcoRI e inserida num vector lambda gtll. Os clones resultantes contêm a totalidade das sequências codificantes das inserções, quer do clone 36 quer do clone 40.

Alternativamente, os fragmentos originalmente amplificados 36/40 (primers F₁₂/Rg) é rapidamente tratado com Exonuclease III (Boehringer Mannheim, conforme instruções dos fabricantes), para gerar uma familia de fragmentos com diferentes extremidades 5'. Os produtos da digestão são tratados como se refere acima e ligados ao vector lambda gtll. As placas resultantes são então sujeitas a despiste imunológico.

Além disso, diferentes conjuntos de primers diferentes dos primers F₁₂/Rg descritos acima, podem ser usados para gerar directamente sequências codificando a totalidade, ou uma porção dos clones 36 e 40. Por exemplo, os primers F₈/R₉ podem gerar um fragmento correspondente a uma porção das sequências 3' da inserção do clone 36 (Figura 4) e todas as sequências de inserção do clone 40 (Figura 3). Também os primers F₇/R₈ podem ser usados para gerar directamente um fragmento correspondente à porção das sequências 5' presentes na inserção do clone 36 (Figura 4).

V. Fragmentos Peptldicos Imunoreactivos da PT-NANBH

Vários novos antigénios peptidicos que são imunoreactivos com soro humano e de chimpanzé infectado com NANBH, têm sido gerados a partir de fragmentos de ligação NANBH produzidos acima, de acordo com os métodos da presente invenção. Ainda, este método tem regiões antigénicas confirmadas, identificadas previamente por despiste imunológico (secção II acima) do património de cDNA. Os péptidos antigénicos derivados de fragmentos de ligação são preferencialmente produzidos num método que envolve primeiro a digestão de cada um dos fragmentos de ligação acima referidos com DNasel, sob condições de digestão parcial, dando origem a fragmentos de DNA digeridos dentro das dimensões de 100-300 pares de bases, como se ilustra no Exemplo 10. Os fragmentos digeridos podem ser fraccionados pelas suas dimensões, por exemplo por electroforese em gel, para seleccionar

aqueles que possuem as dimensões desejadas.

Os fragmentos digeridos de cada fragmento de ligação são então inseridos num vector de expressão adequado. Um exemplar vector de expressão é o lambda gtll, cujas vantagens foram descritas acima.

Para a inserção no vector de expressão, os fragmentos digeridos podem ser modificados, se necessário, para conter ligandos de locais de restrição seleccionados, tais como os ligandos da EcoRl, de acordo com o procedimento convencional. Tipicamente, os fragmentos de digestão têm extremidades cegas, ligadas com ligandos para a EcoRl e introduzidos no corte do lambda gtll para a EcoRl. Estas técnicas recombinantes são bem conhecidas dos peritos nestes assuntos (e.g., Maniatis et al.).

património genómico virai resultante pode ser verificado para confirmar que um património relativamente grande (representativo) foi produzido para cada fragmento de ligação. Isto pode realizar-se, no caso do vector lambda gtll, infectando um hospedeiro bacteriano adequado, semeando a bactéria, e examinando as placas para perda de actividade da beta-galactosidase, como se evidencia por placas limpas.

A presença de um fragmento de inserção digerido nas placas limpas pode ser confirmado por amplificação do DNA do fago, usando primers específicos para a região do fago gtll que servem de flancos ao local de inserção da EcoRl, como se descreve no Exemplo 10B. Os resultados da tabela 3 mostram que uma grande percentagem das placas testadas em cada património de fragmentos de ligação continha uma inserção de um fragmento digerido.

Os patrimónios dos fragmentos de ligação podem também ser sujeitos a pesquisa para detecção de antigénios peptidicos que são imunoreactivos com soro humano ou de chimpanzé infectado por PT-NAMBH crónica, em fase de convalescença ou crónica. Um método preferido de despiste imunológico é descrito no Exemplo 10B. Aqui, a proteina recombinante produzida pela bactéria infectada pelo fago, é transferida das placas para o filtro. Após lavagem, o filtro é incubado com o soro teste, reagindo depois com um anticorpo marcado de identificação, IgG anti-humano. A presença do antigénio peptidico no filtro é então pesquisada quanto à presença da marcação de identificação. Como se pode ver na Tabela 3, vários dos patrimónios dos fragmentos de ligação eram positivos para péptidos imunoreactivos na pesquisa primária.

método de despiste imunológico que acabámos de descrever pode ser usado para identificar placas de patrimónios de cada um dos patrimónios dos fragmentos de ligação que são imunoreactivos com o soro humano ou de chimpanzé com infecção PTNANBH crónica, em fase de convalescença ou aguda. Um procedimento exemplar de despiste é dado no Exemplo 11, em que os patrimónios dos 10 fragmentos de ligação de HCV são pesquisados com soros infectados por PT-NANBH (a) soro humano crónico, (b) pool de soros de chimpanzé com a doença aguda e (c) pool de soros de chimpanzé crónicos. Dos 10 patrimónios examinados, apenas o património Fj/Riq não deu reacção imunológica positiva com qualquer dos três soros. Vários dos fragmentos de patrimónios , incluindo F₃/R₄, F₆/R₁₂, F₁₂/R₇ e F₇/R₈ mostraram 5 ou mais reacções positivas com soro de chimpanzé com doença aguda, indicando que cada um destes patrimónios expressa um ou mais antigénios peptidicos úteis na detecção de infecções PT-NANBH

agudas humanas ou de chimpanzés.

património do fragmento F₇/R₈ corresponde a um fragmento interno da inserção do clone 36 (Secção II; Figura 4). Consequemente, o método do fragmento de ligação confirmou que esta região de DNA codifica um antigénio útil. Ainda, o património do fragmento F₈/r₉ contém as sequências presentes na inserção do clone 40 (Secção II: Figuras 3 e 4). Os resultados na tabela 4 indicam que, pelo menos um antigénio peptidico eficaz na detecçâo da presença de um soro com infecção crónica, foi isolado a partir do património do fragmento F₈/R₉.

VI. Péptidos Imunoreactivos 409-1-1

A. Despiste Imunoreactivo

Duas das placas imunoreactivas identificadas por despiste imunoreactivo, designadas 409-1-1 (abc) e 409-l-l(c-a), foram testadas pesquisando-se a imunoreactividade contra um soro proveniente de um indivíduo com PT-NANBH crónica que mostrava uma forte imunoreactividade contra o antigénio peptidico 5-1-1 do HCV (Kuo). O péptido antigénico do HCV, 5-1-1, foi anteriormente identificado como imunoreactivo contra uma elevada percentagem de soro humano com PT-NANBH crónica. O antigénio 5-1-1 é codificado pela sequência entre os pares de bases 3731 e 3857 no genoma de HCV (Apêndice) e ele próprio está contido num péptido antigénico maior C-100 codificado pela sequência entre os pares de bases 3531 e 4442. Este último péptido é empregue num kit de diagnóstico comercial para detecçâo de infecções humanas por HCV (Ortho/Chiron). 0 kit reage positivamente com cerca de 80% das amostras humanas com PT-NANBH crónica e cerca de 15% dos soros com PT-NANBH aguda, como se faz notar acima.

fago 409-1-1 (c-a) foi identificado por despiste imunológico e purificado em placa, como se descreve acima. Um clone relacionado, designado 409-l-l(abc), foi descrito na antecedente do presente Pedido (No. de Série 07/505.611, aqui incorporado por referência). 0 clone 409-l-l(abc) foi designado 409-1-1 na aplicação do clone de origem. As designações a, b e c ) referem-se a três regiões da sequência 409-1-1(abc) (ver Figura 5). A sequência codificante 5-1-1 foi isolada por uma reacção em cadeia das polimerases usando primers oligonucleotidicos complementares às extremidades da região codificante 5-1-1 e clonada no lambda gtll, para expressão sob condições de indução de uma proteina beta-galactosidase mista que inclui a região peptidica antigénica 5-1-1. O fago 5-1-1 foi identificado e purificado em placa por métodos similares.

Os antigénios 409-1-1(c-a) e 5-1-1 foram comparados por despiste imunológico em placa com um painel de 28 soros: normais (2 dadores), humanos com PT-NANBH crónica (6 dadores), normal de chimpanzés (7 dadores), de chimpanzés com PT-NANBH aguda (5 dadores) e de chimpanzés com PT-NANBH crónica (8 dadores) e os resultados foram apresentados na tabela 5 no Exemplo 12. Como se pode ver na tabela 5, os péptidos 5-1-1 e 409-1-1(c-a) reagiram com a maioria dos soros crónicos humanos e de chimpanzé, embora o péptido 409-1-1(c-a) tivesse detectado uma percentagem mais elevada de amostras de soro crónico humano (83% vs 66%). O soro humano crónico que foi detectado pelo péptido 409-l-l(c-a), mas

nâo pelo 5-1-1 provinha de um paciente (BV) que morreu de uma infecção fulminante de NANBH. Uma vez que o antigénio 5-1-1 está contido no antigénio C-100 no formato de kit disponível eomercialmente (Ortho/Chiron), tinha interesse determinar se o antigénio C-100 dava um mais amplo alcance de reactividade com o soro teste. Os resultados são apresentados à direita na Tabela 5 abaixo. 0 único soro humano NANBH testado foi o soro BV referido acima que n3o foi detectado pelo 5-1-1. Este soro também não era imunoreactivo com o antigénio C-100 (0/1). Nem o antigénio C-100 | era reactivo com nenhum dos cinco soros de chimpanzé com infecçáo aguda que foram testados (0/5) . Notou-se também que o antigénio 409-1-1 (c-a) é imunoreactivo com três dos cinco soros de chimpanzé com infecçáo aguda, comparado com apenas 1 em 5 para o antigénio 5-1-1. Os resultados indicam que o antigénio 409-1-1(ca) possui uma mais ampla imunoespecificidade com o soro PT-NANBH e constituiria, assim, um superior agente de diagnóstico. Os resultados obtidos com o 409-1-1(c-a) são comparáveis aos resultados obtidos usando o 409-1-1(abc).

Nota-se aqui que a sequência codificante do 409-1-1 (abc) está contida no fragmento de ligação F₄/R₅ e não se sobrepõe à sequência da região codificante do C-100 (e 5-1-1) que existe nos fragmentos de ligação F₄/R₅ e Fg/Rg. A sequência codificante relativamente longa do péptido 409-1-1(abc) ilustra que fragmentos de ligação de maiores dimensões (substancialmente maiores que 300 pares de bases) são gerados no passo da digestão parcial usado na produção de fragmentos de digestão para a expressão de antigénios.

O péptido 409-l-l(abc), que constitui um aspecto da invenção, possui a sequência aminoacidica que é apresentada na SEQ ID NO:10. A sequência codificante do DNA correspondente à inserção no clone 409-1-1 é dada na Figura 5 e é apresentada como SEQ ID NO:9.

O péptido 409-l-l(c-a), que constitui outro aspecto da invenção, tem a sequência aminoacidica apresentada como SEQ ID NO:8. A sequência codificante de DNA correspondente à inserção no clone 409-1-1(c-a) é dada na Figura 6 e apresentada como SEQ ID NO:7. A relação entre a sequência codificante do 409-1-1(c-a) e 409-l-l(abc) é referida no Exemplo 12. Resumidamente, o 409-1l(c-a) consiste numa região carboxi-terminal do 409-l-l(abc) transportada para o terminus amina da sequência codificante 4091-1, com um corte da sequência codificante 3' 409-1-1 remanescente.

Mais geralmente, a invenção inclui um antigénio peptidico que é imunoreactivo com soro humano infectado pelo HCV. Estes antigénios peptidicos são rapidamente identificáveis pelos métodos da presente invenção.

Os antigénios obtidos a partir da região correspondente às sequências de HCV codificando os antigénios 409-1-1 foram ainda caracterizados como se segue. Os primers apresentados na Tabela 7 foram usados para gerar uma familia de fragmentos sobreponiveis amplificados derivados desta região. Vários padrões foram usados para as reacções de amplificação do DNA (Tabela 8). As relações das sequências codificantes para cada um dos clones resultantes estão gráficamente ilustradas na Figura 7. Os fragmentos amplificados foram então clonados em véctorés lambda gtll (Exemplo 13).

—rEstes fragmentos clonados foram então sujeitos a despiste imunológico (Exemplo 13). 7 dos 9 clones deram um resultado positivo por despiste imunológico preliminar (Tabela 9). Estes 7 clones foram então testados contra uma bateria mais extensa de amostras de soros PT-NANBH, incluindo numerosas amostras clinicas humanas. A sensibilidade dos antigénios, por ordem decrescente, para reactividade com o soro usado para despiste foi como se segue: 33cu > 33c > 409-l-l(c-a) > 409-1-1F1R2 > 409-l-l(abc) ~= 409-1-la > 5-l-l> 409-l-l(c+270). Como se pode ver por estes resultados todos os clones alternativos, com excepção do 409-l-l(c+270), constituíram um antigénio mais sensível que o 5-1-1. No entanto, embora o 33cu e o 33c fossem antigénios muito sensíveis, neste ensaio eles reagiram ligeiramente com soro que se sabia ser negativo para o HCV e pode, por isso, ser menos especifico. De acordo com os resultados, a série 409-1-1 parece preferível para uso como antigénios de diagnóstico, uma vez que são mais específicos para os anticorpos induzidos por HCV.

despiste imunológico foi estendido para inclusão dos epitopos codificados dos clones 36 e 45: a insersâo do clone 45 é essencialmente a mesma que a inserção do clone 40 (Exemplo 4). Como se pode ver pelos resultados apresentados na Tabela 11, os antigénios produzidos pelos clones 36 e 40, embora não tão sensíveis como o 409-1-1(c-a), apresentam sinais imunopositivos específicos do HCV com amostras seleccíonadas. Assim, os dois métodos apresentados na presente invenção, (i) despiste imunológico de patrimónios de cDNA gerados directamente a partir de RNA sérico, e (ii) despiste imunológico de patrimónios de fragmentos amplificados, revelaram-se ambos métodos eficazes na identificação de sequências de cDNA codificando antigénios virais. Ainda, a confirmação dos antigénios codificados nos clones 36 e 40, por identificação de antigénios correspondentes a estas regiões de HCV usando o método do património do fragmento amplificado, valida a utilidade deste método.

B. Purificação Peptidica

Os péptidos recombinantes da presente invenção podem ser purificados por procedimentos Standard de purificação de proteinas, que podem incluir a precipitação diferencial, cromatografia de separação por dimensões moleculares, cromatografia de troca iónica, utilização do ponto isoeléctrico, electroforese em gel e cromatografia de afinidade. No caso de uma proteína de fusão, como as proteinas de fusão da betagalactosidase preparadas como se refere acima, a proteína de fusão pode ser rapidamente isolada por cromatografia de afinidade, passando material de lise celular através de um suporte sólido ao qual estão ligados anticorpos anti-betagalactosidase. Por exemplo, a purificação de uma proteína de fusâo/beta-galactosidase, derivada das sequências codificantes do 409-l-l(c-a), por cromatografia de afinidade, é descrita no Exemplo 14.

Uma proteina de fusão contendo o péptido 409-1-1(a) fundido com a proteina glutatiâo-S-transferase (Sj26), tem também sido expresso usando o sistema vector pGEX nas células de E. coli KM392 (Smith) . Este sistema de expressão tem a vantagem de a proteina de fusão ser geralmente solúvel e assim podendo ser isolada sob condições não desnaturantes. A proteína fundida Sj26 pode ser rapidamente isolada por cromatografia de afinidade com o substrato glutatiâo (Smith). Este método de expressão destas proteinas de fusão é dado no Exemplo 15 e é aplicável a qualquer das outras sequências codificantes de antigénios descritas na presente invenção.

Também incluido na invenção está um vector de expressão, como os vectores lambda gtll ou pGEX descritos acima, contendo as sequências codificantes do 409-1-1(a) e a expressão de elementos de controle que permitem a expressão da região codificante num hospedeiro apropriado. A sequência codificante está contida na sequência dada acima correspondendo aos pares de bases 2755-3331 do genoma de HCV. Os elementos controle incluem geralmente um promotor, um codão de iniciação de tradução e sequências de terminação de tradução e transcrição, e um local de inserção para introdução da inserção no vector. No caso dos dois vectores ilustrados no Exemplo 15, os elementos controle controlam a sintese da proteína que é fundida com o antigénio peptidico heterólogo. Estes vectores de expressão podem ser rapidamente construídos para outras sequências codificantes de antigénios descritos pela presente invenção.

Os vectores lambda gtll contendo as seguintes regiões codificantes foram depositados na The American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville MD, 20852: a região codificante do 409-l-l(abc), designada gtll/-409-l-l (abc), ATCC No. 40876; a região codificante do 409-1-1(c-a), designada GTll/409-l-l(c-a) ATCC No. 40792; clone 36, designado gtll/36, ATCC No. 40901; e clone 40, designado gtll/40, ATCC No. 40893.

HCV

VII. Clones Imunoreactivos do Antigénio da Cápside do

No congresso de hepatologia de 1990, foi apresentada uma região do comprimento total da sequência do ácido nucleico do HCV, residuos nucleotidicos 325-970, contendo o HCV não codificante, proteína estrutural do core e sequências codificantes de proteínas do envelope, assim como sequências de partes de uma poliproteina da cápside. No decurso das experiências realizadas a favor da presente invenção, a região codificante correspondente à proteina da cápside foi mais claramente definida.

Foram construídos primers para a reacção em cadeia das polimerases a partir de sequências de HCV seleccionadas que viriam a gerar produtos de amplificação dos nucleótidos 325-970 do comprimento total do genoma de HCV (ver Apêndice). Estes primers, SF2(C) e SR1(C), são apresentados no Exemplo 16. Os primers continham sequências não complementares que codificavam locais de clivagem para enzimas de restrição facilitando as subsequentes manipulações de clonagem. Os primers foram utilizados em reacções de amplificação contendo moléculas de cDNA do HCV amplificadas por SISPA como substracto (Exemplo 7). Os produtos de amplificação resultantes foram clonados nos vectores pGEX e pET (Exemplo 16). 0 vector pGEX permite a expressão de sequências codificantes inseridas como proteínas de fusão da proteina Sj26, glutatião-S-transferase. A inserção no vector pET permite a expressão da sequência codificante inserida independentemente de sequências de fusão.

Estes clones foram então sujeitos a uma pesquisa imunológica utilizando soro que se sabia ser reactivo com antigénios-HCV (Exemplo 17). Vários clones, em ambos os vectores, foram identificados como sendo imunoreactivos com soro anti-HCV (no pGEX, clones 14, 15, 56, 60 e 65, Exemplo 17, Tabela 13). Observou-se que as proteínas de fusão produzidas a partir dos clones no pGEX eram mais pequenas do que o esperado.

clone 15 foi seleccionado para produção em larga escala da proteina de fusão Sj26/antigénio-HCV. O produto da proteina de fusão (aproximadamente 29 kd) era mais pequeno que o produto de fusão esperado (aproximadamente 50 kd, Exemplo 17). Além disso, a produção da proteina de fusão preparada por este processo foi inesperadamente baixa.

Os clones 15 e 56 foram escolhidos para sequenciação de ácidos nucleicos do antigénio-HCV contendo inserções (Exemplo 18). As sequências dos dois clones eram muito similares com excepção de que o clone 15 tinha um codão de terminação com inicio no nucleótido da posição 126. Este resultado sugeriu que os 42 aminoácidos terminais, codificados pela inserção do HCV, eram imunogénicos em relação ao soro anti-HCV utilizado para despiste imunológico.

Para testar a sugestão de que o terminal amina da poliproteina do HCV era antigénica, foi construído um oligopéptido sintético correspondendo essencialmente aos residuos aminoacidicos 6-24 da Figura 8A: Este péptido tinha uma imunoreactividade muito forte com o soro anti-HCV tal como foi testado por ELISA. Primers para PCR (Figura 8, Cl e NC105) foram desenhados para gerar um clone correspondente a esta região (Figura 10, C1NC105, SEQ ID NO:25). Três outros péptidos sintéticos foram testados, um dos quais era fortemente imunoreactivo com o soro anti-HCV (residuos aminoacidicos 47-74, Figura 8A) sendo os dois restantes fracamente imunoreactivos (residuos aminoacidicos 39-60 e 101-121, Figura 8A). Estes péptidos sintéticos confirmam a presença de uma região fortemente antigénica na extremidade amino terminal da poliproteina do HCV na região da proteina da cápside.

A sequência do clone 56, designada pGEX-GGl-56, é mostrada na Figura 8A e é apresentada na listagem de sequências i

como SEQ ID NO:11. A sequência mostra que o clone tem uma longa estrutura aberta de leitura. Quando foi induzida a produção da proteina de fusão , verificou-se a produção de uma proteina de fusão menor que o produto esperado, semelhante em tamanho ao produto do clone 15. A sequência nucleotidica dos ciones revelou uma região com pré-disposição para um movimento translacional em torno da estrutura, AAAAAAAAAA (Atkins et al., Wilson et al.). Tal sequência nucleotidica pode contribuir para a libertação de proteinas menores quando se expressam estes ciones na E. coli.

I Num esforço para melhorar o nivel de expressão das proteinas de fusão, a terceira posição nucleotidica de vários codões ao longo desta região foi alterada para a G resultando na sequência AGAAGAAGAA (Exemplo 20): As alterações não tiveram efeitos na sequência codificante da proteina (residuos aminoacidicos 8-10, Figura 8A). Esta inserção modificada foi clonada no vector pGEX e o plasmídeo resultante foi chamado pGEX-CapA.

Foi preparado um teste de avaliação do comportamento frente à água para as sequências codificantes da proteina da inserção do pGEX-GGl (Exemplo 19, Figura 9). Os resultados destas análises indicam que a região carboxi-terminal da proteína codificada, aproximadamente resíduos aminoacidicos 168-182, tinham a potencialidade de se tornar num segmento de ligação da membrana. Uma vez que era pouco provável que o segmento de ligação da membrana fornecesse um antigênio forte, e uma vez que a produção excessiva de proteínas com estas regiões pode afectar adversamente o crescimento das células bacterianas, gerou-se uma série de deleções carboxi-terminais a partir do pGEX-CapA (Exemplo 20).

Para gerar as delecções carboxi-terminais, os primers da PCR foram desenhados para serem complementares a várias regiões da proteína codificada na inserção pGEX-CapA. Os primers usados para gerar as deleções carboxi-terminais são dados na Tabela 14 e a localização dos primers, relativamente à sequência codificante da inserção é apresentada na Figura 8B. Os fragmentos de delecção da extremidade carboxi-terminal foram clonados no vector pGEX e foram produzidas proteínas de fusão Sj26/inserção HCV. Estas proteínas de fusão foram então sujeitas

I a uma pesquisa com soro anti-HCV e criou-se um mapa do epitopo gerado para os polipéptidos imunoreactivos (ver Figura 10). Os clones C1NC270, C1NC360 e C1NC450 expressaram todos niveis elevados das proteínas de fusão Sj26/proteina de fusão HCV. Além disso, todas estas proteinas de fusão correspondem às dimensões previstas a partir das suas sequências codificantes de ácidos nucleicos. Os clones C1NC520 e C1NC580 originaram uma fraca produção de proteinas de fusão, sugerindo que, quando a região hidrofóbica dos residuos aminoacidicos 168-182 está presente,

c.

pode, em parte, ser responsável pelas baixas produções de proteinas obtidas previamente.

A análise de delecçao foi continuada para posterior exploração das regiões antigénicas do antigénio HCV codificado no pGEX-CapA. Uma série de delecções amino-terminais (primers na Tabela 15), combinadas com delecções carboxi-terminais, foram geradas usando primers de PCR: a localização de todos os primers está ilustrada na Figura 8B.

Os resultados da análise das delecções são apresentados na Tabela 16 e na Figura 10. Estes resultados, combinados com os dados referentes ao péptido sintético apresentados acima, sugerem que a proteina da cápside (que compreende a extremidade Nterminal da poliproteina de HCV) tem duas regiões imunoreactivas dominantes. Ambas as regiões imunoreactivas são úteis quando utilizadas como antigénios de diagnóstico. A região compreendendo os primeiros 35 aminoãcidos abrange um dos epitopos, e a região que envolve os residuos 34-90 engloba o outro dominio fortemente imunoreactivo.

Em resumo, todos os clones pGEX, contendo a extremidade I N-terminal da poliproteina de HCV, e 34, 90, 120, ou 150 residuos produziram grandes quantidades de proteina de fusão que mostrou ser eficazmente reconhecida pelo soro positivo de HCV. A expressão das inserções PCR, contendo os residuos de aminoácidos 34-90, era também fortemente imunoreactiva, enquanto inserções codificando os residuos 90-120 ou 90-150 não eram imunoreactivos, demonstrando que estas regiões não eram reconhecidas por soro humano. Estes resultados sugerem que as regiões importantes para a produção de antigénios recombinantes está compreendida entre os resíduos de 1 a 90.

Análises das proteínas pGEXClNC450 e pET360 mostraram que a inclusão destes antigénios em formatos de Western e ELISA permitiram a identificação de soros positivos para o HCV que haviam sido previamente identificados como HCV negativos ou HCV indeterminados. Do mesmo modo, a inclusão destes epitopos permite a geração de um sistema de pesquisa melhorado (Exemplo 21).

VIII. Anticorpos de Anti-Antigénio de HCV

Por outro lado a invenção inclui anticorpos específicos contra os antigénios recombinantes da presente invenção. Tipicamente, para preparar anticorpos, um animal hospedeiro, como um coelho, é imunizado com o antigénio purificado ou com o antigénio proteico de fusão. 0 soro ou plasma hospedeiro é colhido após um intervalo de tempo apropriado e este soro é testado para anticorpos específicos contra o antigénio. O Exemplo 15 descreve a produção dos anticorpos do soro de coelho que são específicos contra os antigénios 409-1-1 nas proteínas de fusão Sj26/409-l-l(a) e beta-galactosidase/409-l-l(c-a). Estas técnicas saó igualmente aplicáveis aos outros antigénios da presente invenção.

A fracção gama globulinica ou os anticorpos IgG de animais imunizados pode ser obtida, por exemplo, por utilização de sulfato de amónio saturado ou Sephadex DEAE, ou outras técnicas conhecidas dos peritos neste campo, para produção de anticorpos policlonais.

Alternativamente, o antigénio purificado ou a proteina antigénica de fusão podem ser usados na produção de anticorpos monoclonais. Aqui, o baço ou linfócitos de um animal imunizado são removidos e imortalizados ou usados para preparar hibridomas por métodos conhecidos dos peritos nestas técnicas. Para produzir um hibridoma humano-humano, é seleccionado um linfócito humano dador. Um conhecido dador a ser infectado por um virus de HCV (em que a infecçâo foi demonstrada, por exemplo, pela presença de anticorpos anti-virus no sangue), pode servir como um dador de linfócitos adequado. Os lifócitos podem ser isolados a partir de uma amostra de sangue periférico ou a partir de células do baço se o dador for sujeito a esplenectomia. 0 virus de Epstein-Barr (EBV) pode ser usado para imortalizar linfócitos humanos, ou um parceiro humano de fusão pode ser usado para produzir hibridomas humano-humano. A imunização primária in vitro com péptidos pode também ser usada na geração de anticorpos monoclonais humanos.

Os anticorpos secretados pelas células imortalizadas são pesquisados para determinar os clones que secretam anticorpos com a especificidade desejada, por exemplo, utilizando o método de Western blot descrito no exemplo 15.

I IX. Utilidade

A. Método diagnóstico e Kit

Os antigénios obtidos pelos métodos da presente invenção são vantajosos para uso como agentes de diagnóstico para anticorpos anti-HCV presentes em soros infectados pelo HCV; particularmente, os antigénios 409-1-1 (409-1-1(abc), 409-l-l(ca), e antigénios relacionados (ver Tabela 9)); o antigénio do cione 36; o antigénio do cione 40 e o antigénio da cápside. Como se fez notar acima, muitos dos antigénios oferecem a vantagem sobre os conhecidos reagentes de antigénio HCV 5-1-1 e C-100 pelo facto de serem imunoreactivos com um mais amplo grupo de soros infectados por PT-NANBH, particularmente soro de infecções agudas. Isto é particularmente verdadeiro para combinações dos antigénios 409-1-1 com os antigénios proteicos do core do HCV como se descreve na secção 7 acima referida. Os antigénios 409-1l(c-a) e Cap450 foram combinados num kit de ELISA e testados contra os kits de HCV produzidos pela Abbott e Ortho. Os antigénios da presente invenção identificam consistentemente mais amostras HCV + com um elevado grau de especificidade que é comparável a, ou melhor do que os kits da Abbott e da Ortho.

Numa configuração preferida de diagnóstico, o soro em teste reage com um reagente em fase sólida tendo ligado um antigénio (ou antigénios) de superfície do HCV obtido pelos métodos da presente invenção, e.g., o antigénio 409-l-l(c-a) e o antigénio Cap450. Após a ligação do anticorpo anti-HCV ao reagente e remoção dos componentes séricos não ligados por lavagem, faz-se reagir o reagente com um anticorpo anti-humano de marcação, para ligação deste ao reagente em proporção á quantidade de anticorpo anti-PT-NANBH ligado ao suporte sólido. 0 reagente é novamente lavado para remover o anticorpo marcado não ligado, e a quantidade de anticorpo marcado associado com o reagente é determinado. Tipicamente o agente de marcação é uma enzima que se detecta por incubação da fase sólida, em presença de um substrato fluorimétrico ou colorimétrico apropriado.

O reagente da superfície sólida, no ensaio acima, é preparado por técnicas conhecidas para ligação de material proteico a um material de suporte sólido, como esferas poliméricas, varetas, prato de 96 cúpulas ou material filtrante. Estes métodos de ligação incluem geralmente a adsorção não especifica da proteína ao suporte, ou ligação covalente da proteina, tipicamente através de um grupo amina livre, a um grupo quimicamente reactivo no suporte sólido, tal como um grupo carboxil, hidroxil ou aldeido activado.

Numa segunda configuração diagnóstica, conhecida como ensaio homogéneo, o anticorpo ligado a um suporte sólido produz algumas alterações no meio reaccional que podem ser directamente detectadas no meio. Tipos gerais de ensaios homogéneos conhecidos, propostos até agora, incluem (a) marcadores de movimento rotativo, onde a ligação do anticorpo ao antigênio é detectada por uma alteração da mobilidade relacionada (alargamento dos picos de rotação cindidos), (b) marcadores fluorescentes, onde a ligação é detectada por uma alteração na eficiência da fluorescência, (c) marcadores enzimáticos, onde a ligação do anticorpo produz interacções enzima/subestrato, (d) marcadores ligados a liposomas, onde a ligação conduz à lise do liposoma e libertação do marcador encapsulado. A adaptação destes métodos aos antigénios proteicos da presente invenção segue métodos convencionais para preparação de reagentes homogéneos de ensaio.

envolve proteico ligado.

humano ou uma

Em cada um dos ensaios descritos acima, o método a reacção do soro de um individuo teste com o antigênio , e pesquisa no antigênio pela presença de anticorpo A pesquisa pode envolver a ligação de um anticorpo antimarcado ao anticorpo em exame, seja uma IgM (fase aguda) IgG (fase de convalescência ou crónica), e medição da quantidade de marcador ligado ao suporte sólido, tal como no primeiro método, ou pode envolver observação do efeito de ligação do anticorpo a um reagente de ensaio homogéneo, como no segundo método.

Também fazendo parte da invenção encontra-se um sistema de ensaio ou kit para levar a cabo o método de ensaio descrito. O kit inclui geralmente um suporte com antigénio de HCV recombinante ligado á sua superfície (e.g., os antigénios 409-11, etc., como acima), e um anticorpo anti-humano de identificação marcado para detecçâo do anticorpo anti-antigénio-PT-NANBH ligado à superfície.

Como foi descrito na secção III acima, os antigénios peptidicos associados com vários dos patrimónios dos fragmentos de ligação, são imunoreactivos com soro de chimpanzés com NANBH aguda, indicando que os péptidos seriam úteis na detecçâo de uma infecção aguda NANBH em soro humano. Em particular, um ou mais antigénios peptidicos, produzidos pelos patrimónios dos fragmentos de ligação, F₈/R_g (reactivo com soro crónico), F₃R₄, F₆B₁₂, F₁₂R₇, F₇R₈, ^{ou F}7^R8 (q^ue são mostrados no Exemplo 11 para produção de um ou mais antigénios peptidicos que são imunoreactivos com soro de chimpanzé com a doença em fase aguda) podem ser combinados com os antigénios 409-1-1 fornecendo uma composição diagnóstica capaz de reagir imunologicamente com uma elevada percentagem de amostras de soros humanos com NANBH crónica ou aguda. Ainda, como foi discutido na secção VII acima, a inclusão dos antigénios proteicos da cápside de HCV da presente invenção acrescentam um nivel extra de sensibilidade.

Uma terceira configuração diagnóstica envolve o uso dos anticorpos anti-HCV descritos na secção VI acima, capazes de detectar antigénios específicos do HCV. Os antigénios de HCV podem ser detectados, por exemplo, utilizando um ensaio de captura antigénica onde os antigénios de HCV, presentes nas amostras de soro candidatas, reagem com um anticorpo monoclonal especifico para o HCV. 0 anticorpo monoclonal é ligado a um substrato sólido e o antigénio é então detectado por um segundo, diferente anticorpo anti-HCV marcado: os anticorpos monoclonais da presente invenção, que são dirigidos contra antigénios específicos do HCV, são particularmente adequados a este método de diagnóstico.

B. Vacina Peptídica

Os antigénios de HCV identificados pelos métodos da presente invenção, e.g. 409-l-l(c-a) e antigénios proteicos do core do HCV, podem ser formulados para uso numa vacina contra o HCV. A vacina pode ser formulada por métodos Standard, por exemplo, num diluente apropriado como a água, soro fisiológico, soluções salinas tamponadas, adjuvantes completos ou incompletos e outros semelhantes. 0 imunogénio é administrado usando técnicas Standard para indução de anticorpos , como por administração subcutânea de soluções estéreis e fisiologicamente compatíveis contendo partículas virais ou antigénios inactivados ou atenuados. Uma resposta imunológica produzindo uma quantidade de partículas virais, é tipicamente administradas por vacinação por injecção, geralmente num volume de um mililitro ou menos.

Um exemplo especifico da composição de uma vacina

inclui, num adjuvante farmacologicamente aceitável, um péptido recombinante 409-1-1(c-a). A vacina é administrada em intervalos periódicos, até ser detectado no soro um titulo de anticorpos anti-HCV significativo. Estas vacinas podem também compreender combinações dos antigénios de HCV da presente invenção.

C. Imunoprofilaxia Passiva

Os anticorpos anti-HCV da invenção podem ser usados como meios de conseguir uma resposta imunológica anti-HCV, uma vez gue os complexos anticorpo-virus são reconhecidos por macrófagos e outras células efectoras. Os anticorpos podem ser administrados em quantidades semelhantes às usadas para outras administrações terapêuticas de anticorpos. Por exemplo, uma pool de gama globulina é administrada a 0,02-0,1 ml/lb de peso corporal, durante a incubação inicial de outras doenças virais como a raiva, sarampo e hepatite B, para interferir com a entrada do virus nas células. Assim, anticorpos que reagem com , por exemplo, o antigénio 409-1-1(c-a) podem ser passivamente administrados, isoladamente, num cocktail com outros anticorpos anti-virais ou em conjunto com outro agente anti-viral, a um hospedeiro infectado por um virus PT-NANBH, para permitir a resposta imunitária e/ou eficácia de uma droga anti-viral.

Os Exemplos que se seguem ilustram vários aspectos da invenção, mas não pretendem, de modo algum, limitar o seu âmbito.

Materiais

A DNA polimerase I (fragmento de Klenow) da E. coli foi obtida a partir dos reagentes da Boehringer Mannheim Biochemicals

(Indianapolis. IN). A DNA ligase T4 e a DNA polimerase T4 foram obtidas a partir da New England Biolabs (Beverly, MA); os filtros de nitrocelulose obtiveram-se a partir da Schleicher and Schuel (Keene, NH).

Ligandos oligonucleotidicos sintéticos e primers foram preparados usando sintetizadores automáticos de oligonucleótidos comercialmente disponíveis. Alternativamente, podem ser adquiridos oligonucleótidos sintéticos desenhados pelo cliente, por exemplo, na Synthetic Genetics (San Diego, CA). 0 kit de sintese de cDNA e os kits de marcação aleatória de primers foram obtidos na Boehringer-Mannheim Biochemical (BMB, Indianapolis, IN).

Exemplo 1

Construção de Patrimónios de cDNA contendo NANB

A.	Infecção	de um chimpanzé por HCV
Um	chimpanzé	(#771) foi inoculado com	uma preparação	de
VIII	que se	sabia causar hepatite	não-A nâo-B	de

transmissão parentérica (PT-NANBH), em pacientes humanos tratados com concentrado de factor VIII (Bradley). Alterações ultraestruturais pós-infecçâo nos tecidos hepáticos foram observadas por microscopia electrónica e foi observada uma elevação da ALT (alanina aminotransferase) no chimpanzé infectado. Estas observações são coerentes com uma infecção PT-NANBH.

B. Isolamento de RNA a partir do soro

Foi colhido soro do chimpanzé infectado, acima

I

referido, (#771) e de quatro fontes clinicas humanas de PT-NANBH (EGM, BV, CC e WEH). Dez mililitros de cada soro não diluido foram precipitados por centrifugação a 30K, durante 3 horas num rotor SW40, a 4°C. 0 RNA foi extraido do precipitado resultante de cada soro usando as seguintes modificações do método do fenol a quente de Feramisco et al. Resumidamente, para cada amostra individual de soro, o precipitado foi resuspendido em 0,5 ml de 50 mM NaOAC, pH=4,8, contendo 1% de SDS. Um volume igual de fenol a 60°C foi adicionado, e incubado durante 15 minutos a 60°C com i agitação ocasional em vortex. Esta mistura foi transferida para uma microcentrifuga de tubos de 1,5 ml e sujeita ao movimento de rotação por 2 minutos, à temperatura ambiente, numa microcentrifuga de bancada. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo de microcentrifuga. A fase aquosa foram adicionados 50 microlitros de NaOAC 3 M, pH=5,2 e dois volumes de etanol a 100%.

Esta solução foi mantida a -70°C durante, aproximadamente, 10 minutos e depois centrifugada numa microcentrifuga a 4°C durante 10 minutos. 0 precipitado resultante foi resuspenso em 100 microlitros de ãgua destilada estéril gelada. Foram adicionados a esta solução 10 microlitros de NaOAC, pH=5,2 e dois volumes de etanol a 100%. A solução foi mantida a -70°C durante, pelo menos, 10 minutos. O precipitado de RNA foi recuperado por centrifugação numa microcentrifuga a 12.000 X g durante 15 minutos a 5°C. 0 precipitado foi lavado em etanol a 70% e seco sob vácuo.

C. Sintese do cDNA (i) Sintese da primeira cadeia

A sintese de moléculas de cDNA foi conseguida como se

7=^ descreve a seguir. As preparações de RNA acima descritas foram resuspensas, cada uma em 26 microlitros de água destilada estéril gelada (tratada com dietil pirocarbonato, Maniatis et al.), 10 X microlitros de tampão de reacção (0,5 M Tris HC1, pH=8,5; 0,4 M

KC1; 0,1 M MgCl₂; 4 mM DTT), 10 microlitros de uma solução nucleotidica (dGTP, dATP, dTTP e dCTP, cada um na concentração de mM), 5 microlitros de primer aleatório, 0,25 microlitros de

P-dCTP, 2 microlitros de transcriptase reversa AMV e 2 microlitros de RNASIN (Promega), num volume total de reacção de 50 microlitros. Esta mistura foi incubada por uma hora a 42°C.

(ii) Sintese da segunda cadeia de cDNA

Para a mistura reaccional de sintese da primeira cadeia, foram adicionados os seguintes componentes: 2 X 55 microlitros de tampão de sintese da segunda cadeia (50 mM Tris HC1, pH=7,0; 60 mM KC1); 2 microlitros de RNase H; 5 microlitros de DNA polimerase I e 2 microlitros da solução de nucleótidos acima referida. A reacção foi incubada por uma hora a 12°C, seguida de uma hora de incubação à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi extraida com igual volume de fenol/clorofórmio, 1:1, seguida de uma extracção usando clorofórmio/álcool isoamilico, 24:1. Para cada mistura reaccional foi adicionado como transportador 1 microlitro de 10 mg/ml de tRNA. 0 cDNA foi precipitado por adição de dois volumes de etanol a 100% e arrefecimento a -70°C durante 15 minutos. O cDNA foi recuperado por centrifugação, o precipitado lavado com etanol a

70% e seco sob vácuo.

.,1 clonagem (iii) Preparação do cDNA de dupla cadeia para a

Para fornecer extremidades compatíveis com o vector, ca da uma das preparações de dupla cadeia de cDNA foi terminada com ligandos da EcoRI do seguinte modo, cDNA foi tratado com EcoRI metilase sob as seguintes condições: o precipitado de cDNA foi resuspenso em 1 X 20 microlitros de tampão metilase (50 mM Tris HC1, pH=7,5; lmM EDTA; 5mMDTT), 2 microlitros de S-adenosil-metionina 0,lmM (SAM) e 2 microlitros de EcoRI metilase (New England Biolabs). A reacção foi incubada durante 30 minutos a 37°C. O tampão TE (10 mM Tris HC1, pH=7,5; lmM EDTA, pH=8,0) foi adicionado para atingir um volume final de 80 microlitros. A mistura reaccional foi extraída com igual volume de fenol/clorofórmio (1:1) e depois com igual volume de clorofórmio/álcool isoamilico (24:1). O cDNA foi precipitado com dois volumes de etanol.

Para maximizar o número de extremidades cegas para adição dos ligandos (Maniatis et al, 1982) o cDNA foi então tratado com o fragmento de Klenow da DNA polimerase 1. 0 cDNA precipitado foi resuspenso em 11,5 microlitros de água destilada. Os seguintes componentes foram adicionados ao cDNA resuspenso: 5 X 4 microlitros NTB (10 X NTB solução stock: 0,5 M Tric.Cl pH=7,2; 0,1 M MgSO₄; ditiotreitol 1 mM (DTT); 500 microgramas/ml de albumina sérica bovina (BSA); 3 microlitros de MgCl2 0,1 M, 1,5 microlitros de 10 GATC (uma solução contendo 10 mM de cada nucleótido G, A, T, e C) e 1 microlitro de Klenow (Boehringer Mannheim Biochemicals). A mistura reaccional foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. A mistura reaccional foi extraída com fenol/clorofórmio e clorofórmio/álcool isoamílico, como está descrito acima, e depois precipitada com dois volumes de etanol.

precipitado de cDNA foi resuspenso em 12 microlitros de água destilada. Foram adicionados aos ligandos resuspensos os seguintes componentes: 5 microlitros de ligandos fosforilados com EcoRl (New England Biolabs), 10 X 2 microlitros de tampão de ligação (0,66M Tris.Cl pH=7,6, 50 mM MgCl₂, 50 mM DTT, lOmM ATP) e 1 microlitro de ligase DNA T4. A reacção foi incubada a 14°C durante a noite. Na manhã seguinte a reacção foi incubada a 67°C durante 3 minutos para inactivar a ligase e depois momentaneamente arrefecida. A mistura reaccional de ligação foram adicionados 10 X 2,5 microlitros de tampão de elevada salinidade de digestão e restrição (Maniatis et al.) e 2,5 microlitros de enzima EcoRl e a mistura foi incubada a 37°C por, pelo menos 6 horas, podendo estender-se a uma noite. Para remover o excesso de ligandos a mistura de digestão foi colocada num gel de agarose a 1,2% e os componentes da reacção fraccionados por dimensões por electroforese. As fracções de dimensões de 0,3-1,3 Kb e 1,3-7 Kb foram electroeluidas para papel NA45 (Schleicher e Schuell). 0 papel NA45, com o cDNA eluido a ele ligado, foi colocado numa centrífuga de tubos de 1,5 ml contendo 0,5 ml de solução de eluição (arginina 50 mM, NaCl 1 Μ, pH=9,0). O tubo foi então colocado a 67°C durante, aproximadamente, uma hora, para permitir ao cDNA ser eluido do papel para a solução. A solução foi então extraída com fenol/clorofórmio, clorofórmio/álcool isoamílico e precipitada com dois volumes de etanol. Os precipitados de cDNA resultantes foram resuspendidos em 20 microlitros TE (pH=7,5).

(iv) Clonagem do cDNA em vectores lambda

Os ligandos usados na construção dos cDNAs continham um local para a EcoRI que permitia a inserção directa dos cDNAs amplificados em vectores lambda gtlO e gtll (Promega, Madison WI). Vectores lambda foram comprados ao fabricante (Promega) que já tinham sido previamente digeridos com a EcoRI e tratados com fosfatase alcalina bacteriana, para remover o fosfato 5' e evitar a ligação do vector consigo próprio.

As preparações de cDNA ligadas à EcoRI foram ligadas a ambos os lambdas gtlO e gtll (Promega). As condições da reacção de ligação foram as que se seguem: 1 microlitro de vector DNA (Promega, 0,5 mg/ml); 0,5 ou 3 microlitros de cDNA de inserção; 10 X 0,5 microlitros de tampão de ligação (0,5 M Tris-HCl, pH=7,8; 0,1 M MgCl₂; 0,2 M DTT; 10 mM ATP; 0,5 g/ml BSA), 0,5 microlitros T4 DNA ligase (New England Biolabs) e água destilada para um volume final de reacção de 5 microlitros.

Os tubos da reacção de ligação foram colocados a 14°C durante a noite (12-18 horas). O cDNA ligado foi embalado na manhã seguinte por procedimentos Standard usando um sistema de embalagem do DNA lambda (GIGAPAK, Stratagene, LaJolla, CA) e plaqueado a várias diluições para determinar o titulo e frequência de recombinaçâo dos patrimónios. Um ensaio Standard Xgal azul/branco foi usado para pesquisar os patrimónios lambda gtll (Miller; Maniatis et al.). A E. coli HG415 (de Howard Gersenfeld, Dept. de Patologia, Stanford School of Medicine) bactéria responsável pelo plaquear, que permite apenas a formação de placa por clones recombinantes, foi usada para plaquear os patrimónios de lambda gtlO. A estirpe Standard, E. coli C600hF~ pode ser usada como alternativa à E. coli HG415.

Exemplo 2

Pesquisa da Produção de Antigénios PT-NANBH nos Patrimónios de cDNA

Os cinco patrimónios lambda gtll gerados no Exemplo 1 I foram pesquisados para antigénios virais específicos e codificados do HCV, por despiste imunológico. Os fagos foram plaqueados para formação de placa usando uma estirpe de E. coli responsável pelo plaquear, E. coli KM 392 (Kevin, Moore, DNax, Paio Alto, CA). Alternativamente pode ser usada a E. coli Y1088.

As proteínas de fusão, expressas pelos clones lambda gtll, foram pesquisadas com anticorpos séricos (Young et al.) a partir das seguintes fontes: chimpanzé #771 e vários soros humanos PT-NANBH (incluindo EGM, BV, WEH e AG).

Dos patrimónios lambda gtll (Exemplo 1), )

aproximadamente 111 clones independentes deram reacção imunológica positiva com, pelo menos, um dos soros de chimpanzé ou humano infectado por PT-NANBH. Estes clones dos fagos foram purificados em placa e o fago recombinante destinado a purificação de DNA (Maniatis et al.).

Exemplo 3

Pesquisa de Hibridação Genómica de Clones Imunopositivos

Dos 111 fagos recombinantes purificados em placa,

obtidos no Exemplo 2, 93 foram isolados (Maniatis et al.) e digeridos pela EcoRI conforme instruções do fabricante (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). Aproximadamente 1,0 micrograma de cada amostra de DNA do fago digerido foi colocado em cúpulas de amostra de gel de agarose a 1,0% preparado usando TAE (0,004m Tris Acetato, 0,001M EDTA). As amostras de DNA foram então separadas electroforeticamente. As bandas de DNA foram visualizadas por coloração com brometo de etidio (Maniatis et al.). As inserções foram claramente identificadas para cada um dos 93 clones, purificadas por electroeluíção usando NA45 e depois radioactivamente marcadas por corte e translacçâo (Maniatis et al.).

DNA de linfócitos humanos de sangue periférico (PBL), sofreu uma digestão de restrição com Hind III e EcoRI, aplicado num gel de agarose a 0,7% (como acima, excepto 10 microgramas de DNA que foram aplicados em linha) e os fragmentos separados por electroforese. Os fragmentos de cDNA nos geles de agarose foram transferidos para filtros de nitrocelulose (Southern) e o DNA genómico foi sondado com as inserções do lambda gtll, obtidas por corte e translacçâo, que foram preparadas acima.

Os filtros foram lavados (Southern; Maniatis et al.) e expostos a um filme de raios X. Quarenta e três das 93 inserções do clone lambda revelaram uma reacção positiva de hibridação com o DNA de PBL humano. Entre as restantes inserções, que claramente não hibridaram com o DNA dos PBL, encontravam-se 11 inserções derivadas dos clones do chimpanzé #771 que eram também claramente imunopositivos como se refere no Exemplo 2. Destes 11 clones, dois tinham as características imunoreactivas resumidas na Tabela 1. Os soros do chimpanzé #771 e dos AG, BV e WEH humanos eram amostras crónicas de PT-NANBH e SKF era uma amostra sérica humana normal.

Tabela 1

Soros Designação do Clone

	36	40
#771	+	+
AG	+	-
BV	+	-
WEH	-	-
SKF	-	-
0 clone 40	(designação original	de pesquisa do clone
304-12-1) era ciaramente exógeno, i.e.,	não derivado de DNA
humano normal, como	se evidencia por	testes de hibridação

repetidos contra DNA de PBL humanos normais, e um segundo clone, designado clone 36 (designação original de pesquisa do clone 3031-4), era não só exógeno mas também reactivo com múltiplos antisoros PT-NANBH.

Exemplo 4

Sequenciação de Clones

A sequenciação de DNA foi efectuada nos clones 36 e 40 como se descreve no Exemplo 3. Primers de sequenciação comercialmente disponíveis (New England Biolabs), homólogos às sequências que servem de flancos à sequência lambda nas extremidades 5' e 3' da inserção, foram inicialmente usados para a sequenciaçâo. A medida que a sequenciaçâo progredia, os primers foram construídos para corresponder a sequências recentemente descobertas. Primers oligonucleotidicos sintéticos foram preparados utilizando sintetizadores oligonucleotidicos automáticos comercialmente disponíveis. Alternativamente, é possível a obtenção de oligonucleótidos sintéticos desenhados pelo cliente, por exemplo, da Synthetic Genetics (San Diego, CA).

As sequências de DNA foram determinadas para a inserção completa do cione 40 (apresentado como SEQ ID NOíl e também revelado na Figura 3); esta sequência corresponde aos nucleótidos 6516 a 7070 do genoma de HCV (Apêndice). Subsequentemente, observou-se que as inserções presentes nos clones 44 e 45 (dois outros clones dos 11 clones identificados no Exemplo 3) sofrem hibridação cruzada com a inserção do cione 40. A sequenciaçâo parcial dos clones 44 e 45 revelou que as sequências obtidas a partir destes dois clones correspondem à sequência do cione 40. Uma sequência parcial da inserção do cione 36 foi determinada e é apresentada como SEQ ID NO:3; a sequência completa é apresentada como SEQ ID NO:5 e é também revelada na Figura 4. A sequência do cione 36 corresponde aos nucleótidos 5010 a 6515 dada no apêndice.

Exemplo 5

Pesquisa do Património de cDNA no lambda gtlO

Os patrimónios do cDNA no lambda gtlO, gerados no Exemplo 1, foram sujeitos a pesquisa quanto à presença de sequências homólogas à inserçaõ do cione 40.

Os patrimónios do lambda gtlO foram colocados em placa a uma densidade de aproximadamente 10^ particulas/placa e foram preparados elevadores de placas de acordo com Maniatis et al. Os filtros foram indicados usando tinta da índia para permitr o alinhamento dos filtros com a placa mãe de onde se elevou a placa. As partículas de bactéria e do fago foram lisadas e os filtros de nitrocelulose foram processados e sujeitos a temperaturas elevadas como foi previamente descrito (Maniatis et al.). A solução de pré-hibridaçâo, por filtro, consistia no seguinte: 5,4 ml de tampão de pré-hibridaçâo (50 ml 1 M de Tris HCl, pH=7,5; 2 ml de EDTA 0,5 M, pH=8,0; 50 ml de SDS a 10%; 20 X 150 ml de SSC (Maniatis et al.); e, 238 ml de ãgua destilada gelada); 6,0 ml de formamida; 50 X 0,4 ml de solução de Denhardt (5 g de FICOL; 5 g de polivinilpirrolidona; 5 g de albumina sérica bovina; até um volume total de 500 ml âgua destilada gelada); e 0,2 ml de DNA de cadeia única, de esperma de salmão (10 mg/ml). Cada filtro foi colocado num saco de plástico e foi-lhe dicionada a solução de pré-hibridação. 0 saco foi selado e incubado durante a noite a 37°C com mistura intermitente do conteúdo.

DNA do clone lambda 40 foi isolado (Maniatis et al.) e digerido com a EcoRI. Os fragmentos resultantes fraccionados em gel de agarose e visualizados por coloração com brometo de etldio (Maniatis et al.). 0 fragmento de DNA correspondente à inserção do clone 40, aproximadamente 500 pares de bases, foi isolado a partir da agarose por electroeluição para ο NA45. A suspensão aquosa do fragmento purificado foi extraida uma vez com uma solução de fenol/clorofórmio 1:1, e uma vez com uma solução de clorofórmio/álcool isoamilico 24:1. 0 DNA foi então precipitado

I com etanol e resuspenso em água estéril.

A inserção do clone 40 foi radioactivamente marcada por corte e translacção, e usada para sondar os filtros de levantmento da placa do lambda gtlO. A solução de prê-hibridação foi removida dos filtros. Cada filtro foi hibridado com a sonda sob as seguintes condições: 5,0 ml de tampão de hibridação (5 ml de Tris HCl 1M, ph=7,5; 0,2 ml de EDTA 0,5 M, pH=8,0; 5,0 ml de SDS a 10%; 20 X 14,9 ml de SSC (Maniatis et al.); 10 g de sulfato de dextrano; e água destilada gelada até um volume total de 50 ml); 5,0 ml de formamida; 50 X 0,4 ml de solução de Denhardt (5 g de FICOL; 5 g de polivinilpirrolidona; 5g de albumina sérica bovina; até um volume total de 500 ml com água destilada gelada); e 0,2 ml de DNA em cadeia simples, de esperma de salmão (10 mg/ml). A esta mistura de hibridação foram adicionados 50-250 microlitros de sonda desnaturada (fervida 5-10 minutos e rapidamente arrefecida em gelo), resultando em aproximadamente g

cpm de sonda marcada por filtro. A mistura de hibridação contendo a sonda marcada foi então adicionada ao saco de plástico contendo os filtros. O saco foi aberto e colocado sob um prato de vidro, num banho de água a 37°C, durante a noite, com mistura intermitente do conteúdo.

No dia seguinte, a solução de hibridação foi removida e os filtros lavados três vezes, 5 minutos de cada vez, em SSC 2 X (Maniatis et al.) contendo 0,5% de SDS à temperatura ambiente. Os filtros foram então lavados durante uma hora em SSC 2 X, contendo SDS 0,5 %, a 50°C. Os filtros foram então lavados durante 15-60 minutos em SSC 0,1 X, contendo 0,1% SDS a 50°C e, finalmente, 2 X SSC, 15 minutos, 2-3 X à temperatura ambiente. Os filtros lavados

foram secos e depois expostos a um filme de raios X para detecção das placas positivas.

Foram purificadas, aproximadamente, 24 placas dos patrimónios de lambda gtlO a partir das, aproximadamente, 200 placas que deram teste positivo com a pesquisa por hibridação (Tabela 2).

Património

Tabela 2

Fonte de cDNA

Positivos/

Placa

EGM	Humano	~=50
BV	Humano	~=100
WEH	Humano	~=25
#771	Chimpanzé	~=10-15

Exemplo 6

Análise dos Patrimónios de cDNA do lambda gtlO de Clones Homólogos à Inserção do Clone 40

Os clones identificados no Exemplo 5, que possuem homologia com a inserção do clone 40, foram analizados por técnicas Standard de restrição e as dimensões das inserções foram determinadas. As frequências originais de sinais de hibridação positiva, por placa, usando a inserção do clone 40 como sonda contra as diferentes fontes de cDNA, são apresentadas na última coluna da Tabela 2. 0 facto de os sinais positivos surgirem com frequências diferentes para as diferentes fontes de cDNA nos patrimónios lambda gtlO, sugere que os sinais de hibridação são originados a partir da fonte de soro e não de contaminações comuns introduzidas durante a sintese ou clonagem de cDNA.

Um dos ciones (108-2-5) do património de cDNA gerado a partir do EGM, identificado por hibridação com a inserção do clone 40, tinha uma inserção de aproximadamente 3,7 Kb e foi escolhido para mais análises. A inserção foi isolada por digestão do clone pela EcoRl, fraccionamento electroforético e electroeluição (Exemplo 5). A inserção foi tratada com DNase I sob condições resultando na digestão parcial (Maniatis et al.) para gerar fragmentos ao acaso. Os fragmentos resultantes foram inseridos em véctorés lambda gtll para expressão. Os ciones lambda gtll foram então sujeitos a despiste imunológico (Exemplo 2) utilizando soro humano (BV e normal) e do chimpanzé #771. Foram identificados 12 ciones positivos pelo primeiro despiste imunológico realizado com o soro humano e de chimpanzé. Sete dos 12 ciones foram purificados em placa e de novo sujeitos ao despiste imunológico usando soro de chimpanzé (#771). Sequências parciais do DNA inserido foram determinadas para dois dos ciones resultantes que possuíam as sequências maiores, designados 32816-1 e 328-16-2. Os dois ciones tinham sequências esseneialmente idênticas ao clone 40.

Exemplo 7

Preparação de Fragmentos de cDNA do HCV Amplificados

A. Preparação dos fragmentos de cDNA

Uma pool de plasma obtido de um chimpanzé com hepatite crónica PT-NANBH foi obtido dos Centers for Disease Control (CDC) (Atlanta, GA). Após precipitação directa ou precipitação PEG, o RNA foi extraido dos viriões por extracção com guanidinium tiocianato-fenol-clorofórmio, de acordo com métodos publicados (Chomczynski). 0 RNA precipitado foi usado para a sintese do cDNA utilizando oligo dT ou primers ao acaso, ou primers de sequências especificas de HCV e um kit comercial de cDNA (Boeheringer-Mannheim).

Num método, a sintese da primeira cadeia de DNA foi conseguida por adição de quatro primers, designados A, B, C e D, tendo as sequências apresentadas abaixo. Estas sequências são complementares às regiões genómicas do HCV indicadas:

A: 5'-GCGGAAGCAATCAGTGGGGC-3', complementar aos pares de bases 394-413;

B. 5'-GCCGGTCATGAGGGCATCGG-3', complementar aos pares de bases 2960-2980;

C: 5'-CGAGGAGCTGGCCACAGAGG-3', complementar aos pares de bases 5239-5258; e

D: 5'-TGGTTCTATGGAGTAGCAGGCCCCG-3', complementar aos pares de bases 7256-7280.

A sintese da segunda cadeia de cDNA foi efectuada pelo método de Gubler e Hoffman. As reacções foram efectuadas sob condições Standard de métodos de sintese do cDNA no kit comercial.

B. Amplificação dos fragmentos de cDNA cDNA referido acima tinha extremidades cegas e estava ligado ao ligando/primer possuindo a sequência seguinte:

Ligando/primer: 5'-GGA ATT CGC GGC CGC TCG-3' cadeia A 3'-TT CCT TAA GCG CCG GCG AGC-5' cadeia B

O cDNA e o ligando foram misturados numa razão molar de

1:100, na presença de 0,3 a 0,6 unidades Weiss T4 DNA ligase.

Para 100 microlitros de tampão Tris-Cl 10 mM, pH=8,3, contendo

MgCl₂ 1,5 mM e KCl 50 mM (Tampão A) foram adicionados cerca de 1

X 10 microgramas de cDNA de extremidade ligando, ligando/primer A (cadeia A) 2 micromolar, tendo a sequência d(5'-GGAATTCGCGGCCGCTCG-3'), dATP, dCTP,dGTP e dTTP cada um 200 micromolar e 2,5 unidades de DNA polimerase do Thermus aquaticus (Tag polimerase). A mistura reaccional foi aquecida a 94°C durante 30 segundos para desnaturação, deixada arrefecer até 50°C durante 30 segundos para emparelhamento dos primers, e depois aquecida até 72°C durante 0,5-3 minutos para permitir a extensão do primer pela Taq polimerase. A reacção de replicação que envolveu aquecimento sucessivo, arrefecimento e reacção da polimerase, foi repetida 25 vezes adicionais com a ajuda de um ciclizador termal de DNA Perkin-Elmer Cetus. Isto resulta numa pool de fragmentos de DNA amplificados por SISPA (amplificação independente e de primer único da sequência).

Exemplo 8

Preparação de Fragmentos de Pares de Primers

Os fragmentos amplificados de cDNA do Exemplo 7 foram misturados com 100 microlitros de Tampão A, 1 micromolar de quantidades de igual molaridade de um dos pares de primers dados abaixo, 200 micromolar de dATP, dCTP, dGTP, e dTTP e 2,5 unidades de DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq polimerase). Cada par de primers inclui um primer de sentido (montante) Fi que é idêntico à cadeia codificante na extremidade a montante

numa região sobreponivel P5 de DNA genómico em duplex, e um primer reverso que é complementar ao código da extremidade a jusante da região P^. Cada um dos conjuntos de primers define uma região sobreponivel de cerca de 200 pares de bases e o espaço entre regiões de primers sobreponiveis e adjacentes (i.e., entre pares adjacentes de pares Fi/RJ é de cerca de 0,5-1 kilobases. As regiões de HCV que são complementares aos primers

são	dadas	abaixo:
Flr	pares	de bases 183-201; Rlz pares de bases 361-380
F10z	pares	de bases 576-595; R10, pares de bases 841-860
	pares	de bases 1080-1100; R2, pares de bases 1254-1273
*3'	pares	de bases 1929-1948; R3, pares de bases 2067-2086
	pares	de bases 2754-2733; R4, pares de bases 2920-2940
	pares	de bases 3601-3620; R5, pares de bases 3745-3764
F6z	pares	de bases 4301-4320; R6, pares de bases 4423-4442
F12z	pares	de bases 4847-4865; R12, pares de bases 4715-4734
	pares	de bases 5047-5066; R7, pares de bases 5200-5216
*8'	pares	de bases 5885-5904; R8, pares de bases 6028-6047
*9'	pares	de bases 6902-6921; Rg, pares de bases 7051-7070

A amplificação pela reacção em cadeia das polimerases (PCR) dos fragmentos de cDNA amplificados por SISPA com cada par de primers F_i/R_i foi efectuada sob condições similares às utilizadas acima, com cerca de 25 ciclos.

As misturas de fragmentos amplificados referidos acima foram fraccionadas por electroforese em agarose a 1,5% e transferidas para filtros de nitrocelulose (Southern). A hibridação dos fragmentos ligados à nitrocelulose, cada um com uma sequência oligonucleotldica interna sonda, confirmaram que cada fragmento continha as sequências esperadas. A hibridaçâo foi efectuada com um oligonucleótido interno marcado radioactivamente pela polinucleótido quinase, de acordo com os métodos Standard.

Exemplo 9

Preparação de Fragmentos de Ligação

Este exemplo descreve a preparação de grandes fragmentos de ligação sobreponiveis das sequências do HCV. Os fragmentos de cDNA amplificados por SISPA, do Exemplo 7, foram misturados com 100 microlitros de Tampão A, 1 micromolar de quantidades molares idênticas de primers de sentido e reversos, em cada um dos pares de primers referidos abaixo, 200 micromolar cada dATP, dCTP, dGTP, e dTTP e 2,5 unidades de DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq polimerase), como no Exemplo 8. Cada par de primers inclui um primer de sentido e um primer reverso Rj, em que é o primer de sentido para uma região sobreponivel P_iz e Rj é o primer reverso da região sobreponivel adjacente. Assim, cada fragmento de ligação abrange duas regiões sobreponiveis adjacentes. Cada conjunto de primers define um fragmento de ligação de cerca de 0,5 -1 Kb. As sequências dos pares de primers são dadas no Exemplo 8. Os fragmentos de ligação sobreponiveis das sequências de HCV (Apêndice), abrangidas por cada par de primers, é dada abaixo:

Fi/Ri0f	pares	de	bases	183-860
Fl()/R2'	pares	de	bases	576-1273
F2/R3/	pares	de	bases	1080-2086
F3/R4r	pares	de	bases	1929-2940

F4/R5, pares de bases 2754-3762

F₅/R₆, pares de bases 3601-4442 ^f6/^r12í pares de bases 4301-4865 ^f12/^r7z pares de bases 4715-5216

F7/R3, pares de bases 5047-6047

Fg/Rg, pares de bases 5885-7070

A amplificação com dois primers dos fragmentos de cDNA amplificados por SISPA, com cada par de primers F^Rj foi efectuado sob condições similares às descritas acima, com cerca de 25 ciclos.

As misturas de fragmentos amplificados referidos acima foram fraccionadas por electroforese em agarose a 1,2%, e transferidas para filtros de nitrocelulose (Southern) para hibridação com sondas de oligonucleótidos internos radioactivamente marcados, como acima. As análises confirmaram que cada fragmento de ligação continha as duas sequências de primers das extremidades de regiões sobreponiveis adjacentes. As sequências contidas em cada um dos fragmentos de ligação são indicadas no Apêndice.

Exemplo 10

Preparação dos Fragmentos Peptldicos Clonados

A- Digestão de fragmentos de DNA

Cada um dos 10 fragmentos de ligação do Exemplo 9 foi suspenso num tampão de digestão Standard (0,5 M Tris HCl, pH=7,5; lmg/ml BSA; 10 mM MnCl2) para uma concentração de cerca de 1

mg/ml e digerida com DNAse I à temperatura ambiente por tempo variado (1-5 minutos). Estas condições de reacção foram determinadas a partir de um estudo prévio de calibraçâo, no qual o tempo de incubação necessário para produzir predominantemente 100-300 fragmentos de pares de bases era determinado. O material foi extraido com fenol/clorofórmio antes da precipitação pelo etanol.

Os fragmentos na mistura de digestão tinham extremidades cegas e ligados com ligandos EcoRI. Os fragmentos ! resultantes foram analizados por electroforese (5-10V/cm) em gel de agarose a 1,2%, usando Phixl74/HaeIII e lambda/HindIII como marcadores de dimensões. A fracção de 100-300 pares de bases foi eluida para tiras NA45 (Schleicher e Schuell), que foram então colocadas em microtubos de 1,5 ml com solução de eluição (NaCl 1M, arginina 50 mM,pH09,0), e incubado a 67°C durante 30 a 60 minutos. O DNA eluido foi extraido com fenol/clorofórmio e depois precipitado com dois volumes de etanol. O precipitado foi resuspenso em 20 microlitros de tampão TE (0,01 M Tris HCl, pH=7,5, EDTA 0,001 M) .

>

B. Clonagem dos Fragmentos Digeridos

O vector fago lambda gtll (Young et al.) foi obtido da Promega Biotec (Madison, WI). Este vector de clonagem tem um único local de clonagem para a EcoRI, 53 pares de bases a montante do codão de terminação de tradução da betagalactosidase. Os fragmentos de digestão parcial de cada fragmento de ligação na Parte A foram introduzidos no local da EcoRI por mistura de 0,5-1,0 microgramas de lambda gtll clivado65

EcoRI, 0,3-3 microlitros dos fragmentos de dimensões acima referidos, 10 X 0,5 microlitros de tampão de ligação (acima), 0,5 microlitros de DNA ligase (200 unidades), e água destilada para 5 microlitros. A mistura foi incubada durante a noite a 14°C, seguida por empacotamento in vitro, de acordo com os métodos Standard (Maniatis, pp. 256-268).

Os fagos embalados foram usados para infectar estirpes de E. coli KM392, obtida pelo Dr. Kevin Moore, DNAX (Paio Alto, CA). Alternativamente, pode ser usada a estirpe de E. coli Y1090, disponível na American Type Culture Collection (ATCC No. 37197). Uma cultura celular de KM392, infectada com cerca de 10³-10⁴ pfu do stock de fago referido acima, foi preparada numa placa de 150 mm e incubada e invertida, durante 5-16 horas a 37°C. Nas bactérias infectadas pesquisou-se a perda de actividade da betagalactosidase (placas claras), na presença de X-gal, usando um método de ensaio X-gal de substrato em placa (Maniatis).

A identificação de placas simples, contendo uma inserção de fragmento digerido, foi confirmada como se segue. Placas simples claras (contendo a progénie de um fago simples) foram removidas da placa e suspensas em tampão de extracção (Maniatis) para libertar o fago DNA. O fago extraido foi adicionado á mistura de amplificação de DNA acima, na presença de primers que se encontram distanciados cerca de 70 pares de bases, em ambas as direcções, a partir do local da EcoRI do lambda gtll. Assim, o fago contendo uma inserção de um fragmento de digestão, vai libertar um fragmento digerido amplificado de cerca de 140 pares de bases mais a inserção. A amplificação do DNA do fago foi efectuada como se descreve acima, com 25 ciclos

de amplificação. 0 material de reacção de cada placa testada foi fraccionado em agarose a 1,5% e examinado para determinação das dimensões do fragmento digerido amplificado. 0 fago não recombinante deu uma banda de 140 pares de bases, e o fago recombinante uma banda que é em dimensões os 140 pares de bases mais a sequência de inserção. Os resultados são apresentados na coluna 2 (Freq REC) da Tabela 3 abaixo, para os patrimónios dos 6 fragmentos de ligação indicados na primeira coluna na Tabela 3 abaixo. O denominador na entrada da coluna 2 é o número total de placas ensaiadas por amplificação por primer. 0 numerador é o número de placas claras contendo inserções de fragmentos. Assim, 3/15 significa que 3 placas deram positivas por PCR, num total de 15 placas claras que foram testadas.

Tabela 3

F2R3	#2	3/15
F3R4	#1	7/12
F4R5	#3	9/10
F5R6	#5	11/12
F7R8	#7	0/12
F8R9	#10	3/12

Património¹ Freq REC²

3 lo Desprste	AP/REC
2	0,33
0	-
10	0,37
37	1,35
1	-
58	7,73

1- Patrimónios construídos por digestão parcial com DNasel do clone de ligação indicado.

2- A frequência de recombinaçâo determinada por PCR com inserções nos flancos dos primers gtll.

3- Despiste primário com soro humano crónico PT-NANBH (1:100) no fago 1,5X10.

4- ΑΡ/REC indica o número de áreas positivas detectadas por número real de recombinantes plagueados.

património dos fragmentos digeridos, construído para cada fragmento de ligação, foi pesquisado para expressão de péptidos que são imunoreactivos com um soro humano PT-NANBH. A cultura de bactérias infectadas pelo fago foi coberta com papel de nitrato de celulose, transferindo os péptidos recombinantes de PT-NANBH das placas para filtros de papel. A placa e filtro foram indexados para fazer corresponder as posições na placa e no filtro.

filtro foi removido após 6-12 horas, lavado três vezes com tampão TBS (10mM Tris, pH=8,0, NaCl 150mM), bloqueado com AIB (tampão TBS com 1% de gelatina), lavado de novo em TBS, e incubado durante a noite com o anti-soro (diluido de 1:100 em AIB, 12-15 ml/placa). 0 papel foi lavado duas vezes em TBS e depois incubado com fosfatase alcalina conjugada com IgG antihumana, para ligar o anticorpo marcado a locais do filtro contendo o antigénio reconhecido pelo anti-soro. Após uma lavagem final, o filtro foi colocado num meio substrato contendo 33 microlitros de NTB (50 mg/ml solução em stock mantida a 4°C), misturado com 16 microlitros de BCIP (50 mg/ml solução em stock mantida a 4°C) em 5 ml de tampão fosfato alcalino (Tris lOOmM, 9,5, NaCl 100 mM, 5 mM MgCl2). 0 substrato que reagiu precipitou nos pontos de produção antigénica, como se reconhece pelo antisoro.

número total de placas que revelaram reacção antigénica positiva (Areas positivas PA) no despiste primário é dado na terceira coluna da Tabela 3. A quarta coluna da tabela é a frequência de áreas positivas por número total de fago recombinante pesquisado (X 10 ) . Esta última coluna é por isso

uma medida da imunogenicidade relativa do antigénio expresso a partir de um fragmento de ligação particular utilizando esta amostra de soro em particular.

Exemplo 11

Pesquisa de Fragmentos Digeridos

Os patrimónios dos fragmentos digeridos de cada um dos 10 fragmentos de ligação de Exemplo 9 foram pesquisados com soro humano de um paciente com PT-NANBH crónica, e com uma mistura de soros de chimpanzés com infecçâo PT-NANBH aguda e infecçâo PTNANBH crónica. Soro individual de 5 chimpanzés com a doença aguda ou crónica foram obtidos nos Centers for Disease Control.

Os patrimónios dos fragmentos digeridos a partir dos fragmentos de ligação indicados na Tabela 4 abaixo foram pesquisados com cada um dos três soros, usando o procedimento de despiste descrito no Exemplo 10. 0 número total de áreas positivas observadas em cada placa (elaboração de um património de um fragmento) é dado na tabela. Os dados na tabela que não estão entre parênteses representam o número de áreas positivas que são confirmadas por purificação em placas, i.e., por novo plaquear de placas das áreas positivas a baixa diluição e confirmando uma área positiva (pesquisa secundária). Tipicamente, cerca de 90-95% das áreas positivas na pesquisa primária deram positiva a pesquisa secundária. Os dados entre parênteses indicam áreas positivas que não foram confirmadas numa segunda pesquisa.

Como se vê na Tabela 4, todos excepto um dos patrimónios dos fragmentos de ligação continham sequências

soro codificando antigénios peptídicos que são imunoreactivos com humano ou de chimpanzé com uma infecção crónica. Cinco dos patrimónios continham sequências codificando para antigénios imunoreactivos com soros com a doença aguda, indicando que um ou mais dos antigénios neste grupo são eficazes na detecção de soro de infecção aguda. Três destes últimos patrimónios —F3/R4, F₁₂/R₇, e F₇/R₈ — deram mais de 10 positivos em cada património. Estes dados não foram corrigidos para a frequência de recombinação num património particular e por isso não reflectem a imunogenicidade comparativa dos vários fragmentos de ligação.

Tabela 4

Clones Humanos	Clones P.P. P.P. Mistura Aguda	Clones P.P. Mistura Crónica
F1R10	0	0	0
F10R2	4	2	4
F2R3	4	0	1
F3R4	0	10	10
F4R5	5	0	7
F5R6	34	0	(42)
F6R12	(400)	5	10(200)
F12R7	2	17(200)	9(200)
F7R8	0	20	10(130)
F8R9	60	0	1
( )	= Não purificados em placa

P.P. = Placa Pura

Mistura Aguda = Painel CDC dos Chimpanzés Mistura Crónica = Painel CDC dos Chimpanzés

Exemplo 12

Pesquisa Imunológica do Antigênio 409-1-1

A. Pesquisa Imunolõgica em Placa

Várias placas claras identificadas no despiste primário do fragmento de ligação F₄/R₅ voltaram a plaquear-se e a purificar-se em placa. Uma das placas purificadas foi designada gtll/409-1-1(c-a). 0 fragmento digerido contido no clone 409-1l(c-a) corresponde a dois conjuntos de pares de bases presentes no genoma de HCV e presentes no clone 409-l-l(abc). Para facilidade de referência, três regiões (a, b e c) foram designadas no clone 409-l-l(abc) (ver abaixo e na Figura 5). A maior homologia de pares de bases corresponde, aproximadamente, aos nucleótidos 2754 a 3129 do Apêndice (a região a, ver Figura 5, região delineada por quadrados), e a homologia mais curta corresponde, aproximadamente, aos nucleótidos 3242 a 3311 do Apêndice (a região c, ver Figura 5): normalmente, a região c localiza-se a uma distância, aproximadamente, de 112 nucleótidos da extremidade 3' da região a (ver Figura 5). A sequência completa da inserção do gtll/409-1-1(c-a) é dada na Figura 6 e apresentada como SEQ ID NO:7. Este clone surgiu através de uma ligação que ocorreu entre dois fragmentos independentes de DNasel, gerados a partir do clone de ligação F₄/R₅ e tem um ATCC No. 40792. Um clone relacionado, designado 409-l-l(abc), tem sido

descrito no Pedido de Patente pertença da requerente com o No. de Série 505.611 e tem o No. de ATCC 40876.

Um cione lambda gtll correspondente à sequência imunoreactiva referida no Pedido EPO 88310922.5, e designado 5-11, foi preparado por amplificação com primer especifico dos fragmentos de cDNA amplificados gerados no Exemplo 7. A sequência 5-1-1 corresponde aos pares de bases 3730-3858 da sequência do HCV (Apêndice), no fragmento de ligação F₅/R₆. Os primers usados para amplificação de fragmentos são oligómeros de 20 pares de bases complementares às sequências de sentido e reversas dos pares de bases 3732-3857 da sequência 5-1-1. Ambos os oligómeros têm incorporados os sites para a EcoRI nas suas extremidades, e o oligómero de sentido é desenhado para assegurar uma continua estrutura de leitura aberta com o gene da beta-galactosidase. A sequência 5-1-1 amplificada foi purificada por electroforese em gel de agarose e clonada no fago lambda gtll, Os métodos de amplificação e clonagem foram os descritos acima. Os fagos contendo as sequências 5-1-1 foram identificados e purificados por despiste primário e secundário, respectivamente, com soro humano PT-NANBH, também como se descreve acima.

Cada um dos clones purificados, gtll/409-l-l(c-a) e gtll/5-1-1, foi misturado com fago lambda gtll negativo, plaqueado e sujeito a despiste imunológico com um certo número de soros de diferentes dadores normais e humanos e de chimpanzé infectados por NANBH, como se indica na Tabela 5 abaixo. Cada placa foi dividida em várias secções de área igual, e as secções correspondentes no filtro de tranferência de nitrocelulose foram separadamente pesquisadas com o soro do dador indicado, usando o

I

método de despiste imunológico descrito no Exemplo 11. 0 número de positivos, detectado para cada grupo de soro pelos péptidos 51-1 e 409-l-l(c-a), é apresentado, bem assim como uma comparação com o teste C-100 num formato de ELISA, na Tabela 5.

Tabela 5

Fonte	Diagnóstico	# Dadores	# Positivos
5-1-1	409-l-l(c-a)	C-100
Humano	Normal	2	0	0	NT
Humano	ANAB	6	4	5	0/1*
Chimp	Normal	7	0	0	0/5
Chimp	Aguda	5	1	3	0/5
Chimp	Crónica	8	7	7	5/5

NT, não testado; * apenas foi testado o soro BV; N/5 significa que houve N positivos em 5 soros testados.

B. Pesquisa por Western Blot

Para despiste por Western Blot, o fago gtll/409-l-l(ca) do Exemplo 11 foi usado para infectar a bactéria E. coli BNN103 sensivel à temperatura. Estas bactérias foram obtidas no American Type Culture Collection. A bactéria hospedeira permite a expressão de uma proteína de fusão beta-galactosidase/antigénio peptidico, codificada pelo vector sob condições de indução da temperatura (Hunyh).

As bactérias infectadas foram cultivadas em faixa, a uma temperatura de 32°C, durante a noite, ou até as colónias se

I tornarem aparentes, e as colónias individuais foram repicadas e semeadas, e foi examinado o seu crescimento a 32°C e a 42°C. Colónias bacterianas que cresceram a 32°C, mas não a 42°C, indicando a integração do genoma do fago, foram usadas para inocular 1 ml de meio A NZYDT (Maniatis) saturado durante a noite, a cultura bacteriana foi usada para inocular 10 ml de cultura, que foi incubada com gaseificação para uma D.O. de cerca de 0,2 a 0,4, tipicamente requerendo uma hora de incubação. A cultura foi então trazida rapidamente para uma temperatura de 43°C, num banho de água a 43°C, e agitada durante 15 minutos para induzir a sintese do péptido do lambda gtll e ainda incubado a

37°C durante uma hora.

As células foram precipitadas por centrifugação, e 1 ml do material precipitado foi resuspenso em 100 microlitros de tampão de lise (Tris 62 mM, pH=7,5 contendo mercaptoetanol 5%, SDS 2,4% e glicerol 10%). Foram colocadas aliquotas (cerca de 150 microlitros) directamente em geles e fraccionadas por SDS-PAGE. Após electroforese, as bandas fraccionadas foram transferidas por electroeluiçâo para filtros de nitrocelulose, de acordo com métodos conhecidos (Ausubel et al.).

lisado foi tratado com DNasel para digerir o DNA da bactéria, como se evidencia por uma perda gradual de viscosidade no lisado. Uma aliquota do material foi diluído com Triton XTM

100 e dodecil sulfato de sódio (SDS) para uma concentração TM final de Triton X-100 de 2% e 0,5% SDS. O material não solubilizado foi removido por centrifugação e o sobrenadante foi fraccionado por electroforese em poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). Uma porção do gel foi corada, para identificar o antigénio

peptidico de interesse e a banda correspondente nâo corada foi transferida para um filtro de nitrocelulose.

A sequência codificante do antigénio 5-1-1 (Exemplo 11) também foi expressa como uma proteina de fusão glutatiâo-stransferase utilizando o sistema vector pGEX , de acordo com os métodos publicados (Smith). A proteina de fusão, obtida do lisado bacteriano e fraccionada por SDS-PAGE, foi transferida para um filtro de nitrocelulose por Western blot, como acima.

A técnica de Western blot foi efectuada, substancialmente, como se descreve no Exemplo 10. Resumidamente, os filtros foram bloqueados com AIB, depois reagiram com amostras de soros identificadas na Tabela 5, incluindo amostras de soros normais, crónicas NANBH e com hepatite B (HBV). A presença de anticorpos de ligação especifica aos filtros de nitrocelulose foi ensaiada ainda por ligação imunológica de IgG anti-humana marcada com a fosfatase alcalina. Os resultados das análises de Western Blot com as proteínas de fusão SJ26/5-1-1 e /409-l-l(c-a) são revelados na Tabela 6. Os dados confirmam que os antigénios peptidicos 409-1-1(c-a) e 5-1-1 são especificamente imunoreactivos com anti-soro NANBH humano e de chimpanzé.

Tabela

Fonte	Diagnóstico	#Dadores	#	Positivos
			Sj26 5-1-	beta-gal 1 409-l-l(c-a
Humano	Normal	2	0	0
Humano	NANB	7	5	5
Humano	HBV	1	0	0

Chimp	Normal	5	0	0
Chimp	NANBH	6	5	5
Chimp	HBV	1	0	0

Exemplo 13 - A

Geração de Clones Alternativos

Foram gerados clones alternativos a partir da região identificada no Exemplo 12 como codificando um antigénio especificamente imunoreactivo com antisoro NANBH humano e de chimpanzé. Os primers apresentados na Tabela 7 foram seleccionados de sequências codificantes do HCV ou do 409-1l(abc), para gerar uma variedade de clones sobreponiveis.

Primer

33C-F1

33C-R1

409-l-l(c-a)F

409-1-1-F1

409-1-1-R2

409-1-1-F3

409-1-1-R5

409-l-l-(c-a)R

409-1-1CR

Tabela 7

Sequência

CCGAATTCGCGGTGGACTTTATCCCTGT

CCGAATTCCAGAGCAACCTCCTCGATG

CCGAATTCCGCACGCCCGCCGAGACTAC

CCGAATTCTCCACCACCGGAGAGATCCC

CCGAATTCCACACGTATTGCAGTCTATC

CCGAATTCGTCACCCAGACAGTCGAT

CCGAATTCCCCTCCCAAAATTCAAGATGG

CCGAATTCGCCAGTCCTGCCCCGACGTT

CCGAATTCGTCCTGGCACACGGGAAG

Os primers apresentados na Tabela 7 foram usados em reacções de amplificação do DNA como se descreve nos Exemplos 7B e 8: os primers e moldes usados em cada reacção são apresentados na Tabela 8. Os fragmentos amplificados foram então tratados com o fragmento de Klenow da DNA polimerase I, sob condições Standard (Maniatis et al.), para preencher as extremidades das moléculas. Os fragmentos amplificados de extremidades cegas foram digeridos com a EcoRI sob condições Standard e clonados no vector de expressão lambda gtll essencialmente como se descreve no Exemplo 10B. As inserções resultantes estão alinhadas para comparação na Figura 7.

Tabela 8

Fragmentos gerados	Molde	Primers
33C	CDNA*	33-C-F1 e 409-1-1-R2
33CU	cDNA*	33-c-fl e 33-C-R1
409-1-1(F1R2)	gtll 409-l-l(c-a)	409-1-1-F1 e 409-1-1-R2
409-l-l(a)	gtll 409-l-l(c-a)	409-1-1-F1 e 409-1-lcaR
409-l-l(c)	gtll 409-l-l(c-a)	409-1-lcaF e 409-1-1CR
409-l-l(c+270)	gtll 409-l-l(c-a)	409-1-lcaF e 409-1-1-R2
409-1-lu	gtll 409-l-l(c-a)	409-1-1F3 e 409-1-lcaR

♦Fragmentos de cDNA amplificados do Exemplo 7

Exemplo 13 - B

Pesquisa Imunológica dos Clones Alternativos

Os clones alternativos gerados no Exemplo 12 foram pesquisados imunologicamente essencialmente como se descreve no Exemplo 10B. Os clones 409-l-l(abc) e 409-l-l(c-a), gerados no Exemplo 12, foram também incluídos nos seguintes despistes imunológicos. Os resultados do despiste imunológico preliminar são apresentados na Tabela 9.

Tabela 9

		GLI-1	FEC
33C		+	ND*
33cu		+	ND
409-1-1	(abc)	+	ND
409-1-1	(F1R2)	+	ND
409-1-1	(a)	+	ND
409-1-1	(ca)	+	ND
409-1-1	(c)	-	-
409-1-1	(c+270)	+	ND
409-1-1	u		—

* não realizado.

soro GLI-1 era um soro humano crónico PT-NANBH. Se um clone testado com GLI-1 dá negativo era ainda examinado por pesquisa com FEC, um soro humano crónico PT-NANBH.

Os 7 dos 9 clones alternativos que deram positivo o despiste imunológico preliminar referido acima foram mais extensivamente pesquisados contra uma bateria de soros. Em adiçao, o clone C100 (ver antecedentes) foi incluido na pesquisa. Os resultados desta pesquisa mais exaustiva são apresentados na Tabela 10.

Tabela 10 ANTIGÉNIO

Soro

Cl 00	33C	33Cu	40911 abc	409-1 1 FIR2	409-ΙΑ	1 409-11 c + 270	40911 ca	5-11
SKF(-)								..
FEC(+)	+	+ 3	+ 3	+ 1	+ 2	+ 2	<	+ 2 + 2
BV	+ 2	+ 3	1	+ 1	-.· 1	-	+1	-
Bar	+ 2	+ 2	1			-	*
PPM	-	•		•		-	-
AP	+ 1	+ 2	-	I			I	•
CP +	+ 2	+ 3	+ 2	4» 3	ψ 3	1	+ 3	+ 2

7 +

+ +

+ +

B18 A7

C7

A3

B7

C12 +

+· 1	4- 1 + 3	I + 1	1 + 1	4» 1	+ 1	1 1 + 1
+ 2	+ 3	+ 1	+ 2	+ 2		+ 2	+ 1
-	1	+ 1	1	1			1
-	+1	I	+ 1			1	1
4- 1	+ 2	+ 1	+ 1		1	+ 1	+ 1
+ 2	+ 3	+ 1	+· 1	+ 1		+ 2	+ 1
+ 2	+ 3	+ 1	+ 1	*- 1		+ 2	+ 1
I I	I + 1	1	I			I	1
+1	+ 2	+ 1	+ 2	+ 1		+ 1	1
+ 1	+ 2	+ 2	+ 2	* 3	x	+3	+1
+3	+ 3	+ 1	+ 3	+3	«H	+3	-
+3	+ 3	+1	+ 1	+ 3	-	+3	+3
+ 2	+ 3	-	-		-	-	-
+3	+ 3	+ 1	*2	+1	-	+ 2	-
+2	+3	I	+ 3	+3	-	+3	I
+2	+ 3	-	-		-	-	-

-,.........—

As amostras de soro usadas na pesquisa foram identificadas como se segue: SKF, PT-NANBH negativo; FEC, PTNANBH positivo; BV, NANBH de aquisição comunitária, Bar, PT-NANBH positivo; PP (pré-inoculação de mistura de soro de chimpanzé), PT-NANBH negativo; AP (mistura de soro de chimpanzé HCV agudo), PT-NANBH positivo; e, CP (mistura de soro de chimpanzé HCV crónico) PT-NANBH positivo. As amostras de soro numeradas correspondem a amostras séricas clinicas humanas que eram PTNANBH positivas. Os soros PP, CP, e AP eram amostras de misturas de soros de 5 chimpanzés diferentes: as amostras de soro dos chimpanzés foram obtidas dos Centers for Disease Control. 0 sistema de registo apresentado na Tabela 10 é um sistema qualitativo de registo definido como se segue: (-), um claro negativo; (+), (1+), (2 + ), (3+), aumento de intensidade do sinal positivo, com o (3+) sendo o sinal mais forte; e (I) significa Indeterminado, era que duas leituras foram diferentes e não repetidas.

Em vista dos dados apresentados na Tabela 10 a sensibilidade dos antigénios em· termos de despiste imunológico é 33cu > 33c > 409-l-l(c-a) > 409-1-1-F1R2 > 409-l-l(abc) >= 409-1la > 5-1-1 > 409-l-l-(c*t-270) . Embora o 33cu e o 33c fossem antigénios sensíveis, reagiam contra todos os soros com demasiadas substâncias interferentes. Assim, as séries 409-1-1 sao mais úteis como antigénios de diagnóstico uma vez que sao mais específicos para anticorpos induzidos pelo HCV. — despiste imunológico foi ainda ampliado para incluir os epitopos codificados dos clones 36 e 45 (corresponde ao clone 40) que foram identificados acima. A tabela 11 mostra os resultados do despiste imunológico.

Tabela 11

PAINEL I: ESPECIMENS DE SEROCQNVERSAQ

SORO	ANTIGÉNIO 409-1-1 36 (c-a)	45	gtll
C-100	33C	5.1.1
GLI-1	+	4 +	2 +	44- —	3 +	-
FEC	+	4 +	3 +	4+ 3+	aar	—
BV	-	3 +	-	34* -	-	·*
SKF(norm)	—	—	—	— *
1-NO1/D69	*w	I	-	<M a*	-	-
2- »/D124	-	4*	-	- -	—
3- ”/D146	«	I	—	— «w	«»
4- »/D211	-	+	-		-	-
5-N00/D22	—	+	I	I
6- /D29	-	2 4-	4-	2 +		w
7- »/D41	-	34-	2 4-	3 +
8- ”/D60	-	4 +	3 +	4+ —		w
9- ”/D137	+	4 +	4 +	4+ 2 +	-	—

(Cont. Tabela il)

10-N240/D0 -	I	-	I			w
11- »/D45 -	-	—	·*	»
12- /D71 -	I	—	I	m	OT
13- /D89 -	I	—	**	«a»		OT
14- »/D106 -	I	—	—
15- ”/D155 -	I	«w	**
16-N228/D0 -	I		-		-	-
17- /D31 -	I	—	*“	*
18- /D41	I	—			M»
19- ”/D51 -	I		—
20- /D73 -	I	—	“·
21- ”/D93 -	-	-				-
22- ”/D127 -				#*
23-N192/D114	-	I		-	«>	-
24- ”/D184 -	—	—	*		w
25- /D224 -	-	—		M	w»
26- ”/D280 -	I
27-N176/D0	I	*	-	-	-
28- »’/D66 -	-	*	M»
29- /D77	-		-r
30- /D94 -	-	*	*·	*
31- /D200 -
32-N170/D0	—		-	-	-	-
33- /D27	I	—	«M
34- /D49	—
35- ”/D64	w
36- »/D183 -	**		**	**
37- /D278 -	—	—		*

					ANTIGÉNIO
hlJHU		c-	-100 33C	5,1.1	409	-1-1 36	4
gtll
				,(..Qr,aJ
38-N144/D63	w	I			-M	-	M»
39- ”/D72	-	I	-	-	—	—	MM
40- /D91	+	2 +	4	2 +	-	*·	**
41- ”/D289	+	4 +	+	3 +	2 +		MM
42- /D233	4·	4 +	3 +	4 +	29-
43-N122/D0	-	I	-		MH	HM	-
44- »/D51	-	I	I	I	·»		«M
45- /D57	-	2 +	I	+	—
46- ”/D72	4-	2 +	-	3 +	I		HM
47- ' /D94	4·	3 +	4-	. 4 +	4*	—
48- /D199	+	4 +	24-	4 +	+	MM	«M
49-N31/D0	-	I	-	«*	-	«M
50- /D140	-	-	-	*	—	··	<MM
51- /D154	-	-	-	-	—		•M
52- /D170	MM	-	-	-	—	—	—
53- »/D210	-	-	-	-	-	—	*
54- /D266	-	-	-	-	*	*	W
55 - ”/D336	-	-	-	-	-	-	-
56- /D394	··	—	—	·*	«M	*·
57-N16/D0	-	-	-	-	-	-	-
58- ”/D47	-	-	-	-		—	MH
59- /D62	-	-	-	-			w.
60- /D83	-	-	-	-		**
61- »/D137	-	-	-	-	M*	-	«M
61- /D167	-	-	-	-		—	—
63- /D197	-	-	-	-	—	—	MM
64- ”/D370

>1

Os soros de pesquisa GLI-1, FEC, BV, e SKF foram definidos acima. As amostras de soro numeradas correspondem a amostras séricas clinicas humanas que eram PT-NANBH positivas: estas amostras foram obtidas pelo Dr. Francoise Fabiani-Lunel, Hospital La Pitie Salpetrieri, Paris, França. Como se pode ver pelos resultados apresentados na Tabela 11, os antigénios produzidos pelos clones 36 e 40, embora não tão sensíveis como o 409-1-1(c-a), dão origem a sinais imunopositivos específicos do

HCV.

Exemplo 14

Isolamento das Proteinas de Fusão do 409-1-1

Esferas de Sepharose 4B, conjugadas com anti-beta galactosidase, foram obtidas da Promega. As esferas foram embaladas em colunas de 2 ml e lavadas sucessivamente com tampão fosfato salino com 0,02% de azida de sódio e 10 ml de tampão TX (tampão Tris 10 mM, pH=7,4, aprotinina 1%).

Lisogénios de BNN103, infectados com gtll/409-l-l(c-a) do Exemplo 12, foram usados para inocular 500 ml de meio NZYDT. A cultura foi incubada a 32°C com gaseificação a um D.O. de cerca de 0,2 a 0,4, depois levada rapidamente a uma temperatura de 43°C num banho de água a 43°C, durante 15 minutos, para induzir a sintese dos péptidos de gtll, e ainda incubada a 37°C durante 1 hora. As células foram precipitadas por centrifugação, suspensas em 10 ml de tampão de lise (Tris 10 mM, pH=7,4 contendo 2% de TM

Triton X-100 e 1% de aprotinina, adicionada imediatamente antes da utilização. As células resuspensas foram congeladas em nitrogénio liquido, depois descongeladas, resultando numa lise celular substancialmente completa. O lisado foi tratado com DNasel para digestão do DNA bacteriano e fágico, como se evidencia por uma perda gradual da viscosidade do lisado. 0 material não solubilizado foi removido por centrifugação.

material do lisado clarificado foi colocado na coluna de Sepharose, as extremidades da coluna foram fechadas, e a coluna foi colocada num agitador rotativo por 2 horas à temperatura ambiente, e 16 horas a 4°C. Após a preparação da coluna, a mesma foi lavada com 10 ml de tampão TX. A proteina de fusão foi eluida com tampão carbonato/bicarbonato 0,1 H, pH 10. Um total de 14 ml do tampão de eluição foi passado pela coluna, e a proteina de fusão eluida nos primeiros 4-6 ml do eluato.

Os primeiros 6 ml de eluato da coluna de afinidade

ΦΜ foram concentrados em cartuchos Centricon -30 (Amicon, Danvers, Mass.). 0 concentrado de proteina final foi resuspenso em 400 microlitros de tampão PBS. A pureza da proteina foi analisada por SDS-PAGE. Observou-se uma única banda proeminente.

Exemplo 15

Preparação do Anticorpo Anti-409-1-1(c-a)

Os fragmentos de digestão do 409-1-1(c-a) do lambda gtll foram libertados por digestão do fago pela EcoRI, e a região A purificada por electroforese em gel. O fragmento purificado foi introduzido no vector de expressão pGEX (Smith). A expressão da proteina de fusão glutatião-s-transferase (Sj26 proteina de fusão), contendo o antigénio peptidico 409-l-l(a), foi conseguida na estirpe de E. coli KM392 (acima). A proteina de fusão foi isolada a partir de bactérias lisadas, e isolada por cromatografia de afinidade numa coluna cheia de esferas conjugadas com glutatião, de acordo com métodos publicados (Smith).

A proteina de fusão purificada Sj26/409-l-l(a) foi injectada subcutaneamente em adjuvante de Freund's num coelho. Aproximadamente 1 mg da proteina de fusão foi injectada nos dias 0 e 21, e o soro do coelho foi recolhido nos dias 42 e 56.

Uma proteina de fusão Sj26/5-l-l purificada foi preparada por um processo similar utilizando um fragmento de HCV amplificado codificando o fragmento 5-1-1. A proteina de fusão Sj26/5-l-l foi usada para imunizar um segundo coelho, seguindo a mesma escala de imunização. Um terceiro coelho foi similarmente imunizado com proteina Sj26 purificada obtida a partir de lisado bacteriano de controlo.

Minilisados das seguintes culturas bacterianas foram preparados como se descreve no Exemplo 12: (1) células KM392 infectdas com pGEX, pGEX que contém a inserção 5-1-1, e pGEX contendo a inserção 409-l-l(a); e (2) BNN103 infectadas com lambda gtll contendo a inserção 5-1-1 e gtll contendo a inserção 409-l-l(c-a). Os minilisados foram fraccionados por SDS-PAGE, e as bandas transferidas para filtros de nitrocelulose por Western blot como está descrito no Exemplo 12. A tabela 12 mostra o padrão de imunoreacçâo que foi observado quando os preparados dos cinco lisados (contendo os antigénios apresentados à esquerda na tabela) foram sujeitos a pesquisa com cada um dos três soros imunes de coelho. Resumindo os resultados, o soro dos coelhos controle (Sj26) era imunoreactivo com cada um dos Sj26 e antigénios proteicos de fusão Sj26. Soro do animal imunizado com com a protéina de fusão Sj26/5-l-l reagiu com os três antigénios Sj-26 e com a proteina de fusão beta-gal/5-1-1, indicando a presença de uma imunoreacção especifica com o antigénio 5-1-1. Soro do animal imunizado com a proteina de fusão Sj26/409-l-l(a) reagiu com os três antigénios Sj-26 e com a proteina de fusão beta-gal/409-l-l(c-a), indicando a presença de uma imunoreacção especifica com o antigénio 409-l-l(a). Nenhum dos soros foi imunoreactivo com a beta-galactosidase (obtida de fonte comercial).

Tabela 12

Antigénios

Anticorpos

Sj26

5-l-l/Sj26

409-l-l(a)/-sj26

S j 2 6 +

5-1-1/ (Sj26) +

5-1-1/ (β-bal)

409-l-l(a) (Sj26) +

409-l-l(c-a) (β-gal) + + + + +

+ + anticorpo anti-409-1-1(a) presente no soro do animal imunizado com o Sj26/409-l-l(a) é purificado por cromatografia de afinidade, seguindo os procedimentos gerais descritos no Exemplo 12, mas onde o derivado ligado às esferas de Sepharose é a proteina de fusão beta-gal/409-1-1(c-a), em vez do anticorpo anti-beta-galactosidase.

Exemplo 16

Clonagem das Sequências Codificantes das Proteínas da Càpside do HCV exemplo descreve a clonagem das sequências codificantes do HCV que codifica a região N-terminal das proteínas da càpside do HCV.

A sequência proteica do antigênio associado à càpside do HCV corresponde aos residuos nucleotidicos 325-970 do comprimento total da sequência de HCV (ver Apêndice A). As seguintes sequências são utilizadas como primers de PCR para clonar esta região: SF2(C), tendo a extremidade 5' inicio no nucleótido 325 do comprimento total da sequência de HCV (Apêndice), 5'-GCGCCCATGGGCACGATTCCCAAACCTCA; eSRl(C) tendo a extremidade 3' inicio no nucleótido 969 do comprimento total da sequência de HCV (Apêndice), 5'-GCCGGATCCCTATTACTC(G/A) TACACAAT(A/G)CT(C/T)GAG-TT(A/G)G. As dimensões previstas do fragmento gerado usando o par de primers SF2(C)/SR1(C) eram de 644 pares de bases.

Os fragmentos de cDNA do Exemplo 7 amplificados por SISPA foram misturados com 100 microlitros de tampão A, 1 micromole de igual quantidade molar de cada um dos primers referidos acima SR2 e SF1, 200 micromole de cada um dos dATP, dCTP, dGTP, e dTTP, e 2,5 unidades de DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq polimerase), tal como no Exemplo 8.

A amplificação especifica dos fragmentos de cDNA amplificados por SISPA com o par de primers da cápside referido acima foi efectuada sob condições similares às descritas no Exemplo 7, com um minuto a 72°C e cerca de 30 ciclos.

Cada mistura dos fragmentos amplificados mencionados acima foi fraccionada em geles duplos de agarose a 1,2 % por electroforese em gel de agarose, e um dos geles transferido para filtros de nitrocelulose (Southern), para hibridação com um oligonucleótido marcado radioactivamente (Southern) tendo a seguinte sequência: SF3(M/E), tendo a extremidade 5' inicio no nucleótido 792 do comprimento total da sequência de HCV (Apêndice), 5'-GCGCCCATGGTTCTGGAAGACGGCGTG. Este oligonucleótido corresponde a uma sequência interna do produto de amplificação gerado pela utilização dos primers SF2(C) e SR1(C). Oito dos quinze produtos PCR foram identificados, o que nos dá por intermédio de uma sonda interna, um sinal positivo de hibridação.

Os vectores pGEX (Exemplo 15) e pET (NOVAGEN, 565 Science Drive, Madison, WI 53711) foram escolhidos para expressão bacteriana de sequências proteicas codificadas pelas inserções. O vector pGEX forneceu a expressão das sequências codificantes inseridas como proteinas de fusão para Sj26 (ver Exemplos 12 e 15) e o vector pET forneceu a expressão das sequências clonadas isoladas. Para cionar as sequências da cápside, as bandas dos produtos de amplificação foram retirados do gel duplo. O DNA foi extraído da agarose e duplamente digerido com Ncol e BamHI. Um vector pGEX contendo os locais de clonagem para as BamHI/Ncol foi também duplamente digerido pelas BamHI e Ncol. 0 vector e DNA extraidos foram então ligados sob condições Standard e a mistura de ligação transformada em células bacterianas.

Os transformantes bacterianos foram cultivados sob selecção da ampicilina, e o DNA plasmídico isolado por lise alcalina (Maniatis et al.). 0 DNA plasmídico isolado foi digerido com Ncol e BamHI. Os produtos de digestão foram electroforeticamente separados em gel de agarose. 0 gel foi transferido para nitrocelulose e sondado com o SF3 marcado radioactivamente como acima. Confirmou-se que 12 ciones tinham uma inserção de interesse, de acordo com a técnica de análise de

Southern blot.

No vector pET, os ciones foram esseneialmente gerados do mesmo modo.

Exemplo 17

Pesquisa Imunológica dos Supostos Ciones de Proteinas da Cápside do HCV

Este exemplo descreve a pesquisa imunológica dos supostos ciones de proteinas da cápside do HCV que foram obtidos no Exemplo 18.

Dos 12 ciones obtidos no Exemplo 16, os minilisados proteicos de 7 ciones (ciones #8, 14, 15, 56, 60, 65 e 66) foram preparados como se descreve no Exemplo 12. Estes minilisados foram fraccionados como se descreve e transferidos para nitrocelulose por técnica analitica de Western blot. A tabela 13 apresenta o padrão de imunoreacção que se observou quando as preparações dos 7 lisados foram pesquisadas com os soros indicados.

Tabela 13

Clone

SJ26

5-1-1

409-1-1

Soro

SKF FEL A6 B9 BV + + + + + + + + +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

As amostras de soro usadas para a pesquisa foram identificadas como se segue: SKF, HCV negativo; FEC, HCV positivo; BV, HCV de aquisição comunitária; A6 e B9 correspondem a amostras séricas clinicas humanas HCV positivas.

As bandas imunoreactivas identificadas por Western blot eram todas de dimensões inferiores à dimensões esperadas de 50 kd (baseado na sequência codificante previsível dos clones inseridos, ver abaixo).

O clone 15 foi escolhido para produção em larga escala

da proteina de fusão Sj26 (Smith et al.). Um litro da preparação do clone 15 originou cerca de 200 microgramas de material imunoreactivo purificado. A maior parte do material imunoreactivo apareceu numa banda dupla maior que correu a aproximadamente 29 kd. O resultado desta preparação foi inesperadamente baixo: normalmente com o sistema pGEX, uma preparação de um litro de proteina origina de 50 a 100 mg de proteina de fusão.

Exemplo 18

Sequências dos Ácidos Nucleicos dos Clones 15 e 56

As inserções dos clones 15 e 56 (discutidas no Exemplo 17) foram sequenciadas conforme as instruções do fabricante (US Biochemical Corporation, Cleveland OH) utilizando a técnica dideoxi de terminação da cadeia (Sanger, 1979). Cada um dos clones tinha uma estrutura aberta de leitura contigua á estrutura de leitura Sj26 do vector pGEX. As sequências das inserções dos clones eram quase idênticas, apenas com algumas variações menores de sequência: a sequência do clone 15 tinha um codão de terminação com inicio na posição nucleotidica 126. Os dados de sequência para o clone 56, são apresentados como SEQ ID NO: 11 na Figura 8A.

A sequenciação das inserções revelou a caracteristica invulgar de uma sequência de residuos de adenina desde a posição nucleotidica 25 até à posição 34 (Figura 8A): estas sequências são similares a sequências que se sabe promoverem uma troca na translacçâo da estrutura (Wilson et al., Atkins et al.). A estrutura aberta de leitura contigua à sequência codificante Sj26, prevê uma proteina de aproximadamente 23,5 kd. Assim, dadas

as dimensões aproximadas de 26 kd do fragmento proteico Sj26 nesta construção (Smith et al.), a proteina de fusão completa teria uma dimensão previsível de, aproximadamente, 50 kd.

Exemplo 19

Gráfico do Comportamento Frente à Agua da Proteina Codificada pelo Clone 56 programa SOAP ,TM do pacote de software da IntelliGenetics PC/GENE foi usado para gerar o gráfico do comportamento em relação à água da Figura 9. 0 programa SOAP utiliza o método de Kyte et al. para traçar o gráfico do comportamento da proteina ao longo da sua sequência. O intervalo usado para o processamento por computador foi de 11 aminoácidos. Na figura 9, a porção hidrofóbica do gráfico corresponde ao intervalo de valores positivos, e a porção hidrofilica aos valores negativos.

O gráfico indica (i) a natureza hidrofilica da extremidade amino da proteina da cápside, (ii) a natureza relativamente hidrofóbica da região de residuos aminoacidicos de aproximadamente 122 a 162, e (iii) a natureza hidrofóbica dos residuos aminoacidicos de aproximadamente 168-182.

Além disso, a região de residuos aminoacidicos 168-182 demonstra um potencial para ser um segmento envolvente da membrana (Klein et al.).

Exemplo 20

Análise das Delecções da Região Codificante da Proteina do Clone 56

Este exemplo descreve uma geração de uma série de delecções amino e carboxi terminais da proteina da cápside do HCV e o efeito destas delecções na imunoreactividade das proteínas resultantes.

A. Delecções carboxi-terminais do clone 56.

Como passo destinado a melhorar a expressão da proteina da cápside do HCV, a suposta região de alteração translacional da estrutura foi modificada para reduzir a probabilidade de uma alteração de estrutura nesta região. Em cada codão AAA, a lisina codificada, (posição nucleotidica 25 a 33, Figura 8A) o terceiro nucleótido em cada codão (posição 27, 30 e 33, Figura 8A) foi alterado de A para G utilizando técnicas Standard de má combinação (Ausubel et al., Mullis, Mullis et al.). Os locais destas substituições são indicados na Figura 8A pelos três Gs colocados sobre as correspondentes As. A sequência do clone pGEX modificado foi confirmada como no Exemplo 19 e o clone foi designado pGEX-CapA. A sequência de inserção do clone pGEX-CapA é apresentada na Figura 8B como SEQ ID NO: 13.

Os clones delectados foram gerados usando os primers PCR dados na Tabela 14. Na Tabela 14 o site da BamHI aparece em itálico e o codão de terminação sublinhado.

Tabela 14

PRIMERS DE DELECÇÂO CARBOXI-TERMINAL

1. Cl 5'-CGA TCC ATG GGC ACG AAT CCT AAA CC

2.

NC580

5'-G

GCC

GGA

TCC

TTA

GGC

CGA

AGC

GGG

CAC

AG

3.

NC520

5'-G

GCC

GGA

TCC

TTA

ACC

AGG

AAG

GTT

CCC

TGT

TGC

4.

NC450

5'-G

GCC

GGA

TCC

TTA

GGC

CCT

GGC

ACG

GCC

TCC

5.

NC360

5'-G

GCC

GGA

TCC

TTA

CAA

ATT

GCG

CGA

CCT

ACG

CC

6.

NC270

5'-G

GCC

GGA

TCC

TTA

GCC

CTC

ATT

GCC

ATA

GAG

As reacções de amplificação foram efectuadas essencialmente como se descreve no Exemplo 16, utilizando o primer Cl emparelhando com cada um dos primers NC, tendo como molde o plasmídeo purificado pGEX-CapA: a reacção de amplificação durou 1 minuto a 95 °C, emparelhamento 2 minutos a 50°C, e 3 minutos a 72°C durante 20 ciclos.

As seguintes comparações de sequências são dadas relativamente à sequência de ácidos nucleicos apresentada na Figura 8B. O primer Cl corresponde à extremidade 5' comum da inserção do pGEX-CapA que contém um site para a Ncol perto da iniciação metionina. Cada sequência dos primers NC começa na posição nucleotidica indicada, por exemplo, a sequência homóloga do primer NC580 termina na posição nucleotidica 580. Um codão de terminação é inserido nessa posição, após o site para a BamHI. As posições dos primers” dadas na Tabela 14 são indicadas na Figura 8B. A localização aproximada dos primers em relação à sequência da proteina são indicadas na Figura 9.

Os produtos resultantes da amplificação foram fraccionados, de acordo com as suas dimensões, por electroforese em gel de poliacrilamida, e os produtos de DNA de dimensões adequadas electroeluidos do gel. Os produtos de amplificação foram clonados quer no vector pGEX quer no vector pET para expressão. As sequências das inserções foram confirmadas como se descreve no Exemplo 18.

Os vectores pGEX, contendo as delecções carboxi— terminais foram transformados na E. coli e as proteinas de fusão purificadas essencialmente como se segue. A expressão das proteinas de fusão foi induzida com IPTG por 3-4 horas. As células foram então colhidas a 6.000 rpm durante 10 minutos. As E. coli foram então lisadas em tampão MTPBS (NaCl 150 mM; Na₂HPO₄ 16 mM; NaH₂PO₄ 4 mM, pH=8,0), após o que foram adicionados TRITON X-100 1%, DNase I 3 microgramas/ml e PMSF 1 mM. Os lisados foram centrifugados a 15.000 rpm durante 20 minutos. Os sobrenadantes foram rejeitados e os precipitados resuspensos em ureia 8 M. Os componentes da resuspensão foram separados por HPLC usando uma coluna BIO-GEL SP-5-PW. Tipicamente, a proteina de fusão constituia o pico predominante: A localização da proteina de fusão foi confirmada por análise por Western blot. Os clones C1NC270, C1NC360 e C1NC450 expressaram proteinas de fusão Sj26 a niveis elevados: todas as proteinas de fusão correspondiam às dimensões previstas da sequência codificante inserida fundida com a proteina Sj26, e eram imunoreactivas com soro HCV positivo (as técnicas de Western blot foram realizadas como se descreve no Exemplo 17). Embora os sobrenadantes tivessem sido rejeitados, quantidades substanciais das proteinas de fusão estavam também presentes nos sobrenadantes. Os clones C1NC520 e C1NC580 geraram pequena quantidade de proteinas de fusão.

Um mapa do epitopo da região da cápside do HCV é apresentado na Figura 10: a localização das sequências codificantes da proteina imunoreactiva correspondentes às inserções C1NC450, C1NC360, e C1NC270 está indicada. As sequências do C1NC450, C1NC360 e C1NC270 são apresentadas na listagem de sequências como SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 19, respectivamente.

B. Delecções amino terminais do clone 56

As delecções amino-terminais dos ciones foram geradas usando os primers PCR referidos na Tabela 15.

Tabela 15

PRIMERS DE DELECÇÕES AMINO TERMINAIS

1.	C100	GAG	CCC	ATG	GGT	GGA	GTT	TAC	TTG	TTG CC
2.	C270	GAG	CCC	ATG	GGC	TGC	GGG	TGG	GCG	GG
3.	C360	GAG	CCC	ATG	GGT	AAG	GTC	ATC	GAT	ACC

As reacções de amplificação foram efectuadas esseneialmente como se descreve acima usando os pares de primers apresentados na Tabela 16, e como molde o plasmídeo purificado pGEX-CapA: A reacção de amplificação incluiu 1 minuto

a 95°C,	emparelhamento	2 minutos a 50°C e 3	minutos a 72°C
durante 2 0	ciclos.	Tabela 16
Primer NH2	Primer CooH	Proteina Produzida?	Imunoreactiva?
C100	NC450	BAIXO	SIM
	NC360	SIM	SIM
	NC270	SIM	SIM
C270	NC450	SIM	NAO
	NC360	SIM	NAO

(Continuação Tabela 16)

C360 NC450 SIM NAO

As seguintes comparações de sequências são dadas relativamente à sequência de ácidos nucleicos apresentada na Figura 8B, onde as substituições acima referidas de A para G foram efectuadas para a sequência do pGEX-CapA. 0 primer NC660 corresponde à extremidade 3' comum da inserção do pGEX-CapA que contém um site para a BamHl perto da extremidade da inserção. Cada sequência dos primers C tem início na posição nucleotidica indicada, por exemplo, a sequência do primer NC100 tem inicio na posição nucleotidica 100. Cada um dos primers C introduz um codão de iniciação no interior da estrutura no produto de amplificação resultante. As posições dos primers dadas na Tabela 15 estão indicadas na Figura 8B.

Os produtos de amplificação resultantes foram clonados nos vectores pGEX e pET para expressão como se descreve acima. As sequências das inserções foram confirmadas.

Os vectores pGEX contendo as delecções carboxiterminais foram transformadas na E. coli, preparados de minilisados proteicos, e a imunoreactividade das proteinas analizada por Western blot como está descrito acima. Os resultados das análises são apresentados na Tabela 16. Os clones C100NC270 e C100NC360 expressam proteinas de fusão Sj26 a elevados niveis: as proteinas de fusão corresponderam às dimensões previstas a partir da sequência codificante da inserção fundida com a proteína Sj26.

Um mapa do epitopo da região da cápside do HCV é , - ·: λϊϊ apresentada na Figura 10: são indicadas as localizações das sequências codificantes da proteina correspondente às inserções C100NC270, C100NC360, C270NC360, e C270NC450. As sequências para C100NC270 e C100NC360 são apresentadas na listagem de sequências como SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:23, respectivamente.

Exemplo 21

Pesquisa Imunológica Alargada Utilizando o Antigénio da Cápside

Este exemplo descreve três comparações diferentes da imunoreactividade dos vários antigénios de HCV da presente invenção, para várias baterias de soros.

A. Eficácia do antigénio Cap450.

A Tabela 17 mostra os resultados de 50 amostras séricas humanas de pacientes com suspeita de infecçâo por hepatite NANB.

Os ensaios de ELISA foram essencialmente realizados como está descrito por Tijssen, usando os três antigénios seguintes: C100, 409-1-1(c-a), C33u, Cap450 (o produto proteico do clone pGEXC1NC450), e com o 409-l-l(c-a) e o cap4150 numa cúpula que foi optimizada para dar resultados mais sensíveis. Estes dados de ELISA foram comparados com o teste C100 da Abbot.

soro dos pacientes foi apresentado em coluna como positivo para as proteinas de fusão Sj26 (409-1-1 ca, 33u, 5-1-1 e Cap450) se a absorvância foi três vezes a absorvância desse soro na proteina nativa Sj26. Uma amostra foi apresentada em coluna como positiva em antigénios pET (cap360), se a absorvância foi três vezes a média da absorvância do soro controle negativo.

Um soro de um paciente foi apresentado em coluna como positivo no ensaio combinado 409-1-1 ca/cap450 se a absorvância foi equivalente ou superior à do soro controle positivo. Amostras dentro de 10% em relação ao soro controle positivo foram

declaradas como positivos fracos.	crónica activa	provado	por
	(Amostras 1-19:	Hepatite
biópsia.	HBS Ag(-).
	Amostras 20-44:	Hepatite	virai aguda :	HBsAg(l),	ISM
Anti-HBCi	(-), IgM anti-HAV(
	Amostras 45-50:	Hepatite	crónica activa	provado	por

bióps ia. HBs Ag(-).

Tabela 17

PAINEL COREANO II

	Amostra #	C10C	409-1-1 fc-a)	C3 3u i	cap 4 50	combinação 409-1-1 (c-a) +CAP450
1		4*	4-	................ 4	4	+
2			4-	*	4·	+
3			4·		4
4		4	4·	•	+	+
5			4·	4		+
6		-	+	♦·	4-	+
7			4·	4	+	+
8		*	4	♦	•f·	+

100

9		4-	-	-4·	4*	4*
10		+	-	*	#	+
11		4·	4·	4-	*	+
12		4	4-	4-	+	+
13		+	4»	f	+	+
14		+	+	4-	+	+
15		+	4-	•í	4*	+
16		4·	4*	4-	*	4·
17		4*	+	+	+	+
18		4*	+	4-	+	+
19		4·	-	-	-	-
20	945	-	-	-	-	... .
21	988	4-	4·	4-	*	4·
22	3383		-	-		-
23	4072	-	-	-	-	-
24	4242	-	-	-	-	-
25	4490	-	-	-	-	-

= positivo (baixo)

101

	amostra #	C10C	409-1-1 (c~a'	C3?U	cap 450	combinação 409-1-1 (c-a) +CAP450
26	4816	-	-	-	w
27	5322	-	-	-	-	-
28	6603	-	-	-	-	-
29	7923	-	-	-	-	-
30	9033	-	-	-	-	-
31	9768	-	-	-	-	*
32	9775	-		-		-
3J	10197	4·	-	-	4*	w+
34	10200	-	-	-	*	-
35	10409	-	-	-	-	-
36	10811	-	-		-	-
37	11209	-			4-	ND
38	12245	-	-	-	-	-
39	12143	-	-		-	-
40	12519	-	-		V*	-
41	13510	-	-	-	-	-
42	14018	-		-	-	-
43	14188	-	-	-	-	-
44	13437	-	-	-	-	-
45	863	-	-		-	-
46	3354	-	-		-	-
47	12640	-		►	4·	+
48	13095	-	*		w»	w+
49	14501	-	-	-		-
50	14345		4·	4»	4·	+

* - positivo (baixo)

102

Os resultados demonstram que a proteina Cap450 tem boa sensibilidade para detectar a presença de anticorpos anti-HCV em amostras séricas. Três amostras adicionais (6, 37, e 47) foram detectadas. Além disso, estes resultados indicam que a combinação do Cap450 e 409-1-1(c-a) pode ser usado para produzir um kit muito eficaz para a detecçâo de anticorpos anti-HCV em amostras séricas humanas.

)

B. Cap450 e Cap360.

Os resultados na Tabela 18 demonstram a eficácia dos antigénios Cap450 e Cap360 (o produto proteico codificado por pET-ClNC360) para detectar anticorpos HCV presentes no soro humano. As amostras foram testadas para detectar a presença de HCV por ELISA usando cada antigénio individual apresentado, ou com os antigénios 409-l-l(c-a) e Cap450 combinados numa cúpula.

Tabela 18

Soro	Diagnóstico do Paciente	C100	ELISA 5-1-1	409-1-1 (c-a)	C33u	Cap 360	Combinado (409-1-1) + Cap450
G-131	Hepatite Aguda; Pt C.O.
G-132	II	II	—	—	—	—	—	—
G-143	II	11	—	—	—	—	—	—
G-285	u	u	ND	ND	ND	ND	ND	—
G-150	Hepatite Aguda P.T.; Pt G.L.			I	I	+	+
G-151	II	II	—	—	I		+	+

103

G-152

- + +

ND ND +

G-153 - - I

G-286 ND ND ND

G-43 Doença Hepatica - Fulminante

G-l Hepatite Aquisi- ND I ção Comunitária + + + +

G-109	II ” 4- —	+	+	+	+
G-l 14	11	11	ND	—	—	—	—	-*
G-128	11	II	+	—	I	+	+	+
G-3	11	11	—	—		—	—	—
G-126	It	II	—	—	—	—	—	+
G-127	11	II	+	I	+	+	—	+
G-42	Hep. Aqui. Comu. Idiopática
G-51	Hepatite B Aqui. Comunitária			+	+	+	+
G-27	II	11		—	—
G-22	II	11	—	—	—	—	—	—
G-40	II	II	—	—	—		—	—
G-31	II	II	+	—	+	+	+	+
G-45	II	II	—	—	—	—	—	—
G-3 8	Hepatite B Fulminante
G-41	Hepatite C Aqui. Comunitária			I	+	I	+
G-13	Hepatite	c	+	I	+	+	+	+
G-12	II	11	+	—	+	+	+	+
G-6	II	II	—	—	—	—	—	—
G-49	Cirrose EtOH	—	—	—	—	—	—
G-25	II	II	—	—	—	—	—	—

104

X

G-110	tl tl — _	+	+	I	+
G-46	II II	—	—	—	—	—	—
G-272	Transplante Hepático Infantil	ND	-	-	-	-	-
G-274	11 II	ND	—	+	+	—	—
G-16	PBC		—	+	+	—	—
G-123	INC LT	—	—	—	—	—	—
G-122	11 II	—	+	—	—	—
G-125	Sem Diagnóstico	—	I	4-	+	I	+
G-124	11 II	—	—	—	+	+	+
	Estes resultados	indicam	que a	combinação	do	antigénio
409-1-	l(c-a) e Cap360	ou	Cap450	resulta numa	ferramenta de

diagnóstico eficaz para a detecção de infecções	HCV.	Cinco
amostras adicionais (G150, G151, G110, G125 e	G124)	foram
detectadas por este método de ELISA, comparando apenas C100.	com o
C. pET360
Os resultados da tabela 19 demonstram a	eficácia do
pET360 na detecção de anticorpos HCV presentes no soro humano. As

amostras foram testadas por ELISA para a presença de HCV utilizando individualmente cada antigénio apresentado, ou com os antigénios 409-l-l(c-a) e pET360 combinados na mesma cúpula.

105

Tabela 19

	C100	5-1-1	409-l-l(c-a)	C33u	pET360	Comb.409-1-1 (c-a) + pET360
A	+	-	+	+	-	+
B	+	+	+	+	-	+
C	+	-	-	+	-	+
D	+	+	+	- -	+
E	+	-	w+	+	+	+
F	-	-	-	-	-	-
G	+	-	w+	+	+	+
H	-	-	+	+	+	+
I	-	-	-	-	-	-
J	-	-	-	-	-	-
K	-	-	-	+	+	+
L	-	-	-	-	-	-
M	-	-	-	-	-	-
N	-	w+	-	+	+	+
0	+	w+	+	+	+	+
P	+	w+	+	+	+	+
Q	-	-	-	-	-	-
R	-	-	-	-	-	-
S					—

Estes resultados indicam que a combinação dos antigénios 409-1-1(c-a) e pET360 resultam numa ferramenta eficaz

106 ^rf de diagnóstico na detecção da infecção HCV. Três amostras adicionais foram detectadas por este método de ELISA comparando apenas com o C100.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência a incorporações particulares, métodos, construções e utilizações, será evidente para os especialistas nestas técnicas que várias alterações e modificações podem ser efectuadas sem se afastarem do âmbito da invenção.

107 (1) INFORMAÇÃO GERAL:

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(i) REQUERENTE: Gregory Reyes

Jungsuh P. Kim Randolph Moeckli Crhistian C. Simonsen (ii) TITULO DA INVENÇÃO: Epitopos do Virus da

Hepatite C

CIDADE: ESTADO: PAIS: E. CODIGO:

(C) (D) (E) ÍF) (iii) NUMERO DE SEQUÊNCIAS: 26 (iv) DIRECÇÃO DE CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: Peter J. Dehlinger (B) RUA: 350 Cambridge Ave., Suite 100 Paio Alto Califórnia U.A.

94306 (v) FORMATO DE LEITURA PARA O COMPUTADOR:

(A) TIPO MEDIO: diskette (B) COMPUTADOR: IBM PC Compatível (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS SOBRE O PRESENTE PEDIDO:

(A) NUMERO DO PEDIDO:

(B) DATA DO DEPOSITO:

(C) CLASSIFICAÇAO:

(vii) DADOS SOBRE PEDIDO ANTERIOR:

(A) NUMERO DO PEDIDO: US 505.611 (B) DATA DO DEPOSITO: 6 de Abril de 1990 | (Vii) DADOS SOBRE PEDIDO ANTERIOR;

(A) NUMERO DO PEDIDO: US 594.854 (B) DATA DO DEPOSITO: 9 de Outubro de 1990 (viii) REPRESENTANTE/AGENTE DE INFORMAÇÃO:

(A) NOME: Gary R. Fabian (B) NUMERO DO REGISTO: 33.875 (C) NUMERO DE REFERENCIA/DOCUMENTO: 4600-076.21 (ix) INFORMAÇÃO POR TELECOMUNICAÇÃO:

(A) TELEFONE: (415) 323-8302 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO; 561 pares de base (B) TIPO; ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA; linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA; cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO; Não (iv) ANTI-SENTIDO; Não (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC (Vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: 304-12-1 (ix) A REALÇAR:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..561 (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:1:

GAA TTC CTC GTG

CAA Gin 5

GCG Ala

TGG AAG TCC AAG

AAA Lys

ACC Thr

CCA ATG GGG TTC

48

Glu 1

Phe Leu

Vai

Trp Lys

Ser

Lys 10

Pro

Met

Gly 15

Phe

TCG

TAT

GAT

ACC

CGC

TGC

TTT

GAC

TCC

ACA

GTC

ACT

GAG

AGC

GAC

ATC

96

Ser

Tyr

Asp

Thr

Arg

Cys

Phe

Asp

Ser

Thr

Vai

Thr

Glu

Ser

Asp

Ile

20

25

30

CGT

ACG

GAG

GAG

GCA

ATC

TAC

CAA

TGT

TGT

GAC

CTC

GAC

CCC

CAA

GCC

144

Arg

Thr

Glu

Glu

Ala

Ile

Tyr

Gin

Cys

Cys

Asp

Leu

Asp

Pro

Gin

Ala

35

40

45

CGC

GTG

GCC

ATC

AAG

TCC

CTC

ACC

GAG

AGG

CTT

TAT

GTT

GGG

GGC

CCT

192

Arg

Vai

Ala

Xle

Lye

Ser

Leu

Thr

Glu

Arg

Leu

Tyr

Vai

Gly

Gly

Pro

50

55

60

CTT Leu 65

ACC AAT TCA AGG

GGG GAG AAC TGC GGC TAT CGC AGG

TGC Cys

CGC Arg

GCG Ala 80

240

Thr

Asn

Ser Arg

Gly 70

Glu

Asn

Cys Gly

Tyr 75

Arg

Arg

AGC

GGC

GTA

CTG ACA

ACT

AGC

TGT

GGT AAC

ACC

CTC

ACT

TGC

TAC

ATC

288

Ser

Gly

Vai

Leu Thr

Thr

Ser

Cys

Gly Asn

Thr

Leu

Thr

Cys

Tyr

Ile

85

90

95

AAG

GCC

CGG

GCA GCC

TGT

CGA

GCC

GCA GGG

CTC

CAG

GAC

TGC

ACC

ATG

336

Lys

Ala

Arg

Ala Ala

Cys

Arg

Ala

Ala Gly

Leu

Gin

Asp

cys

Thr

Met

100

105

110

CTC

GTG

TGT

GGC GAC

GAC

TTA

GTC

GTT ATC

TGT

GAA

AGC

GCG

GGG

GTC

384

Leu

Vai

Cys

Gly Asp

Asp

Leu

Vai

Vai Ile

Cys

Glu

Ser

Ala

Gly

Vai

115

120

125

CAG

GAG

GAC

GCG GCG

AGC

CTG

AGA

GCC TTC

ACG

GAG

GCT

ATG

ACC

AGG

432

Gin

Glu

Asp

Ala Ala

Ser

Leu

Arg

Ala Phe

Thr

Glu

Ala

Met

Thr

Arg

130

135

140

TAC

TCC

GCC

CCC CCC

GGG

GAC

CCC

CCA CAA

CCA

GAA

TAC

GAC

TTG

GAG

480

Tyr

Ser

Ala

Pro Pro

Gly

Asp

Pro

Pro Gin

Pro

Glu

Tyr

Asp

Leu

Glu

145

150

155

160

CTC

ATA

ACA

TCA TGC

TCC

TCC

AAC

GTG TCA

GTC

GCC

CAC

GAC

GGC

GCT

528

Leu

Ile

Thr

Ser Cys

Ser

Ser

Asn

Vai Ser

Vai

Ala

His

Asp

Gly

Ala

165

170

175

GGA

AAG

AGG

GTC TAC

TAC

CTC

ACC

CGG GAA

TTC

561

Gly

Lys

Arg

Vai Tyr

Tyr

Leu

Thr

Arg Glu

Phe

-

180

185

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ

ID NO:2

*

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 187 Aminoácidos (B) TIPO; aminoacidica (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:2:

Glu 1

Phe

Leu Val

Gin Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro Met Gly

Phe

5

10

15

Ser

Tyr

Asp

Thr

Arg

Cys

Phe

Asp

Ser

Thr

Val

Thr

Glu

Ser

ASp

Ile

20

25

30

Arg

Thr

GlU

Glu

Ala

Ile

Tyr

Gin

Cys

Cys

Asp

Leu

Asp

Pro

Gin

Ala

35

40

45

Arg

Val

Ala

Ile

Lys

Ser

Leu

Thr

Glu

Arg

Leu

Tyr

Val

Gly

Gly

Pro

50

55

60

Leu

Thr

Asn

Ser

Arg

Gly

Glu

Asn

Cys

Gly

Tyr

Arg

Arg

Cys

Arg

Ala

65

70

75

80

Ser

Gly

Val

Leu

Thr

Thr

Ser

Cys

Gly

Asn

Thr

Leu

Thr

Cys

Tyr

Ile

85

90

95

Lys

Ala

Arg

Ala

Ala

Cys

Arg

Ala

Ala

Gly

Leu

Gin

Asp

Cys

Thr

Met

100

105

110

Leu

Val

Cys

Gly

Asp

Asp

Leu

Val

Val

Ile

Cys

Glu

Ser

Ala.Gly

Val

115

120

125

Gin

Glu

Asp

Ala

Ala

Ser

Leu

Arg

Ala

Phe

Thr

Glu

Ala

Met

Thr

Arg

130

135

140

Tyr

Ser

Ala

Pro

Pro

Gly

Asp

Pro

Pro

Gin

Pro

Glu

Tyr

Asp

Leu

Glu

145

150

155

160

Leu

Ile

Thr

Ser

Cys

Ser

Ser

Asn

Val

ser

Val

Ala

His

Asp

Gly

Ala

165

170

175

Gly

Lys

Arg

Val

Tyr

Tyr

Leu

Thr

Arg

Glu

Phe

180 185 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 252 pares de base (B) TIPO: Acido Nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (HCV) (B) ESTIRPE: CDC (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: 303-1-4 (ix) A REALÇAR:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..252 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO: 3:

AAC TCC

GTG TGG

AAA GAC CTT CTG GAA GAC AAT GTA ACA CCA ATA GAC

48

Asn 1

Ser

Vai

Trp

Lys Asp 5

Leu

Leu

Glu

Asp 10

Asn

Vai

Thr

Pro

Ile 15

Asp

ACT

ACC

ATC

ATG

GCT

AAG

AAC

GAG

GTT

TTC

TGC

GTT

CAG

CCT

GAG

AAG

96

Thr

Thr

Ile.

Met

Ala

Lys

Asn

Glu

Vai

Phe

Cys

Vai

Gin

Pro

Glu

Lys

20

25

30

GGG

GGT

CGT

AAG

CCA

GCT

CGT

CTC

ATC

GTG

TTC

CCC

GAT

CTG

GGC

GTG

144

Gly

Gly

Arg

Lys

Pro

Ala

Arg

Leu

Ile

Vai

Phe

Pro

Asp

Leu

Gly

Vai

35

40

45

CGC

GTG

TGC

GAA

AAG

ATG

GCT

TTG

TAC

GAC

GTG

GTT

ACC

AAG

CTC

CCC

192

Arg

Vai

Cys

Glu

Lys

Met

Ala

Leu

Tyr

Asp

Vai

Vai

Thr

Lys

Leu

Pro

55 60

TTG GCC GTG ATG GGA

AGC TCC TAC GGA TTC CAA TAC TCA CCA GGA CAG

240

Leu 65

Ala Vai

Met Gly

Ser 70

Ser

Tyr Gly

Phe

Gin Tyr Ser Pro Gly Gin

75

80

CGG

GTT

GAA

TTC

252

Arg

Vai

Glu

Phe

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA (A) COMPRIMENTO: 84 aminoácidos (B) TIPO: aminoacidica (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLECULAR: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:4:

Asn 1

Ser

Vai Trp

Lys Asp 5

Leu

Leu

Glu

Asp 10

Asn

Vai

Thr

Pro Ile 15

Asp

Thr

Thr

Ile

Met

Ala

Lys

Asn

Glu

Vai

Phe

Cys

Vai

Gin

Pro

Gly

Lys

20

25

30

Gly

Gly

Arg

Lys

Pro

Ala

Arg

Leu

Ile

Vai

Phe

Pro

Asp

Leu

Gly

Vai

35

40

45

Arg

Vai

Cys

Glu

Lys

Met

Ala

Leu

Tyr

Asp

Vai

Vai

Thr

Lys

Leu

Pro

50

55

60

Leu

Ala

Vai

Met

Gly

Ser

Ser

Tyr

Gly

Phe

Gin

Tyr

Ser

Pro

Gly

Gin

70 75 80

Arg Vai Glu Phe (2) IMFORMAÇAO PARA A SEQ ID NO:5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

) (A) COMPRIMENTO: 1512 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: 303-1-4 (ix) A REALÇAR;

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..1512 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:5:

GAA TTC TTC ACA

GAA TTG GAC

GGG Gly

GTG Val

CGC Arg 10

CTA CAT

AGG Arg

TTT GCG CCC

48

Glu 1

Phe

Phe

Thr

Glu 5

Leu

Asp

Leu

His

Phe

Ala 15

Pro

ccc

TGC

AAG

ccc

TTG

CTG

CGG

GAG

GAG

GTA

TCA

TTC

AGA

GTA

GGA

CTC

96

Pro

Cys

Lys

Pro

Leu

Leu

Arg

Glu

Glu

Val

Ser

Phe

Arg

Val

Gly

Leu

20

25

30

CAC

GAA

TAC

CCG

GTA

GGG

TCG

CAA

TTA

CCT

TGC

GAG

CCC

GAA

CCG

GAT

144

His

Glu

Tyr

Pro

val

Gly

Ser

Gin

Leu

Pro

Cys

Glu

Pro

Glu

Pro

Asp

35

40

45

GTG

GCC

GTG

TTG

ACG

TCC

ATG

CTC

ACT

GAT

CCC

TCC

CAT

ATA

ACA

GCA

192

Vai

Ala

Vai

Leu

Thr

Ser

Met

Leu

Thr

Asp

Pro

Ser

His

He

Thr

Ala

50

55

60

GAG

GCG

GCC

GGG

CGA

AGG

TTG

GCG

AGG

GGA

TCA

CCC

CCC

TCT

GTG

GCC

240

Glu

Ala

Ala

Gly

Arg

Arg

Leu

Ala

Arg

Gly

Ser

Pro

Pro

ser

Val

Ala

65

70

75

80

AGC TCC Ser Ser

TCG Ser

GCT Ala

AGC Ser 85

CAG Gin

CTA Leu

TCC GCT Ser Ala

CCA Pro 90

TCT Ser

CTC AAG GCA ACT TGC

288

Leu

Lys

Ala

Thr 95

Cys

ACC

GCT

AAC

CAT

GAC

TCC

CCT

GAT

GCT

GAG

CTC

ATA

GAG

GCC

AAC

CTC

336

Thr

Ala

Asn

His

Asp

Ser

Pro

Asp

Ala

Glu

Leu

Ile

Glu

Ala

Asn

Leu

)

100

105

110

CTA

TGG

AGG

CAG

GAG

ATG

GGC

GGC

AAC

ATC

ACC

AGG

GTT

GAG

TCA

GAA

384

Leu

Trp

Arg

Gin

Glu

Met

Gly

Gly

Asn

Ile

Thr

Arg

Val

Glu

Ser

Glu

115

120

125

AAC

AAA

GTG

GTG

ATT

GTG

GAC

TCC

TTC

GAT

CCG

CTT

GTG

GCG

GAG

GAG

432

Asn

Lys

Vai

Vai

Ile

Leu

Asp

Ser

Phe

Asp

Pro

Leu

Val

Ala

Glu

Glu

130

135

140

GAC

GAG

CGG

GAG

ATC

TCC

GTA

CCC

GCA

GAA

ATC

CTG

CGG

AAG

TCT

CGG

480

Asp

Glu

Arg

Glu

Ile

Ser

val

Pro

Ala

Glu

Ile

Leu

Arg

Lys

Ser

Arg

145

150

155

160

AGA

TTC

GCC

CAG

GCC

CTG

CCC

GTT

TGG

GCG

CGG

CCG

GAC

TAT

AAC

CCC

528

Arg

Phe

Ala

Gin

Ala

Leu

Pro

Val

Trp

Ala

Arg

Pro

Asp

Tyr

Asn

Pro

155

170

175_

CCG

CTA

GTG

GAG

ACG

TGG

AAA

AAG

CCC

GAC

TAC

GAA

CCA

CCT

GTG

GTC

576

Pro

Leu

Vai

Glu

Thr

Trp

Lys

Lys

Pro

Asp

Tyr

Glu

Pro

Pro

Val

Val

180

185

190

CAT

GGC

TGT

CCG

CTT

CCA

CCT

CCA

AAG

TCC

CCT

CCT

GTG

CCT

CCG

CCT

624

His

Gly

Cys

Pro

Leu

Pro

Pro

Pro

Lys

Ser

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Pro

195

200

205

CGG

AAG

AAG

CGG

ACG

GTG

GTC

CTC

ACT

GAA

TCA

ACC

CTA

TCT

ACT

GCC

672

Arg

Lys

Lys

Arg

Thr

Vai

Val

Leu

Thr

Glu

Ser

Thr

Leu

Ser

Thr

Ala

210

215

220

TTG

GCC

GAG

CTC

GCC

ACC

AGA

AGC

TTT

GGC

AGC

TCC

TCA

ACT

TCC

GGC

720

Leu

Ala

Glu

Leu

Ala

Thr

Arg

Ser

Phe

Gly

Ser

Ser

Ser

Thr

Ser

Gly

225

230

235

240

ATT

ACG

GGC

GAC

AAT

ACG

ACA

ACA

TCC

TCT

GAG

CCC

GCC

CCT

TCT

GGC

768

Ile

Thr

Gly

Asp

Asn

Thr

Thr

Thr

Ser

Ser

Glu

Pro

Ala

Pro

Ser

Gly

245

250

255

—-

TGC

CCC

CCC

GAC

TCC

GAC

GCT

GAG

TCC

TAT

TCC

TCC

ATG

CCC

CCC

: CTG

816

Cys

Pro

Pro

Asp

Ser

Asp

Ala

Glu

Ser

Tyr

Ser

Ser

Met

Pro

Pro

Leu

260

265

270

GAG

GGG

GAG

CCT

GGG

GAT

CCG

GAT

CTT

AGC

GAC

GGG

TCA

TGG

TCA

ACG

864

Glu

Gly

Glu

Pro

Gly

Asp

Pro

Asp

Leu

Ser

Asp

Gly

Ser

Trp

Ser

Thr

'i

275

280

285

GTC

AGT

AGT

GAG

GCC

AAC

GCG

GAG

GAT

GTC

GTG

TGC

TGC

TCA

ATG

TCT

912

Vai

Ser

Ser

Glu

Ala

Asn

Ala

Glu

Asp

val

Val

Cys

Cys

Ser

Met

Ser

290

295

300

TAC

TCT

TGG

ACA

GGC

GCA

CTC

GTC

ACC

CCG

TGC

GCC

GCG

GAA

GAA

CAG

960

Tyr

ser

Trp

Thr

Gly

Ala

Leu

Vai

Thr

Pro

Cys

Ala

Ala

Glu

Glu

Gin

305

310

?315

320

AAA

CTG

CCC

ATC

AAT

GCA

CTA

AGC

AAC

TCG

TTG

CTA

CGT

CAC

CAC

AAT

1008

Lys

Leu

Pro

Ile

Asn

Ala

Leu

Ser

Asn

Ser

Leu

Leu

Arg

His

His

Asn

325

330

335

TTG

GTG

TAT

TCC

ACC

ACC

TCA

CGC

AGT

GCT

TGC

CAA

AGG

CAG

AAG

AAA

1056

Leu

Vai

Tyr

Ser

Thr

Thr

Ser

Arg

Ser

Ala

Cys

Gin

Arg

Gin

Lys

Lys

340

345

350

GTC

ACA

TTT

GAC

AGA

CTG

CAA

GTT

CTG

GAC

AGC

CAT

TAC

CAG

GAC

GTA

1104

Vai

Thr

Phe

Asp

Arg

Leu

Gin

Vai

Leu

Asp

Ser

His

Tyr

Gin

Asp

Val

355

360

365

CTC

AAG

GAG

GTT

AAA

GCA

GCG

GCG

TCA

AAA

GTG

AAG

GCT

AAC

TTG

CTA

1152

Leu

Lys

Glu

Vai

Lys

Ala

Ala

Ala

Ser

Lys

Val

Lys

Ala

Asn

Leu

Leu

370

375

380

TCC

GTA

GAG

GAA

GCT

TGC

AGC

CTG

ACG

CCC

CCA

CAC

TCA

GCC

AAA

TCC

1200

Ser

Vai

Glu

Glu

Ala

Cys

Ser

Leu

Thr

Pro

Pro

His

Ser

Ala

Lys

Ser

385

390

395

400

AAG

TTT

GGT

TAT

GGG

GCA

AAA

GAC

GTC

CGT

TGC

CAT

GCC

AGA

AAG

GCC

1248

Lys

Phe

Gly

Tyr

Gly

Ala

Lys

Asp

Vai

Arg

Cys

His

Ala

Arg

Lys

Ala

405

410

415

GTA

ACC

CAC

ATC

AAC

TCC

GTG

TGG

AAA

GAC

CTT

CTG

GAA

GAC

AAT

GTA

1296

Vai

Thr

His

Ile

Asn

Ser

Vai

Trp

Lys

Asp

Leu

Leu

Glu

Asp

Asn

Val

420

425

430

1344

ACA Thr

CCA Pro

ATA GAC ACT ACC

ATC ATG

GCT AAG AAC GAG GTT TTC TGC

GTT Val

Ile 435

Asp Thr

Thr

Ile

Met 440

Ala Lys

Asn

Glu

Val 445

Phe

Cys

CAG

CCT

GAG

AAG

GGG

GGT

CGT

AAG

CCA

GCT

CGT

CTC

ATC

GTG

TTC

CCC

Gin

Pro

Glu

Lys

Gly

Gly

Arg

Lys

Pro

Ala

Arg

Leu

Ile

Val

Phe

Pro

450

455

460

GAT

CTG

GGC

GTG

CGC

GTG

TGC

GAA

AAG

ATG

GCT

TTG

TAC

GAC

GTG

GTT

Asp

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Cys

Glu

Lys

Met

Ala

Leu

Tyr

Asp

Val

Val

465

470

475

480

ACC

AAG

CTC

CCC

TTG

GCC

GTG

ATG

GGA

AGC

TCC

TAC

GGA

TTC

CAA

TAC

Thr

Lys

Leu

Pro

Leu

Ala

Val

Met

Gly

Ser

Ser

Tyr

Gly

Phe

Gin

Tyr

485

490

495

1392

1440

1488

TCA	CCA	GGA	CAG	CGG	GTT	GAA	TTC
Ser	Pro	Gly	Gin	Arg	Val	Glu	Phe

500

1512 (2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID ΝΟ:6ί (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 504 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO MOLECULAR: proteina

(

xi)

DES

•CRU

;ao

DA

SEQUENC

ΊΑ:

SEQ ID

NO

: 6:

Glu

Phe

Phe

Thr

Glu

Leu

Asp

Gly

Val

Arg

Leu

His

Arg

Phe

Ala

Pro

1

5

10

15

***· 41’

Pro

Cys

Lys

Pro

Leu

Leu

Arg

Glu

Glu

Val

Ser

Phe

Arg

Val

Gly

Leu

20

25

30

His

Glu

Tyr

Pro

Val

Gly

Ser

Gin

Leu

Pro

Cys

Glu

Pro

Glu

Pro

Asp

35

40

45

Val

Ala

Val

Leu

Thr

Ser

Met

Leu

Thr

Asp

Pro

Ser

His

Ile

Thr

Ala

50

55

60

Glu 65

Ala

Ala

Gly

Arg

Arg 70

Leu

Ala

Arg

Gly

Ser 75

Pro

Pro

Ser

Vai. Ala 80

Ser

Ser

Ser

Ala

Ser

Gin

Leu

Ser

Ala

Pro

Ser

Leu

Lys

Ala

Thr Cys

85

90

95

Thr

Ala

Asn

His

Asp

Ser

Pro

Asp

Ala

Glu

Leu

Ile

Glu

Ala

Asn Leu

100

105

110

Leu

Trp

Arg

Gin

Glu

Met

Gly

Gly

Asn

Ile

Thr

Arg

Vai

Glu

Ser Glu

115

120

125

Asn

Lys

Vai

Vai

Ile

Leu

Asp

Ser

Phe

Asp

Pro

Leu

Vai

Ala

Glu Glu

130

135

140

Asp

Glu

Arg

Glu

Ile

Ser

Vai

Pro

Ala

Glu

Ile

Leu

Arg

Lys

Ser Arg

145

150

155

160

Arg

Phe

Ala

Gin

Ala

Leu

Pro

Vai

Trp

Ala

Arg

Pro

Asp

Tyr

Asn Pro

165

170

175

Pro

Leu

Vai

Glu

Thr

Trp

Lys

Lys

Pro

Asp

Tyr

Glu

Pro

Pro

Vai Vai

180

185

190

His

Gly

Cys

Pro

Leu

Pro

Pro

Pro

Lys

Ser

Pro

Pro

Vai

Pro

Pro Pro

195

200

205

Arg

Lys

Lys

Arg

Thr

Vai

Vai

Leu

Thr

Glu

Ser

Thr

Leu

Ser

Thr'Ala

210

215

220

Leu

Ala

Glu

Leu

Ala

Thr

Arg

ser

Phe

Gly

Ser

Ser

Ser

Thr

Ser Gly

225

230

235

240

lie

Thr

Gly

Asp

Asn

Thr

Thr

Thr

Ser

Ser

Glu

Pro

Ala

Pro

Ser Gly

245

250

255

Cys

Pro

Pro

Asp

Ser

Asp

Ala

Glu

Ser

Tyr

Ser

Ser

Met

Pro

Pro Leu

260

265

270

Glu

Gly

Glu

Pro

Gly

Asp

Pro

Asp

Leu

Ser

Asp

Gly

Ser

Trp

Ser Thr

275 280 285

Val Ser 290

Ser Glu Ala Asn Ala Glu 295

Asp Val Val Cys 300

Cys

Ser

Met

Ser

Tyr

Ser

Trp

Thr

Gly

Ala

Leu

Val

Thr

Pro

Cys

Ala

Ala

Glu

Glu

Gin

305

310

315

320

Lys

Leu

Pro

Ile

Asn

Ala

Leu

Ser

Asn

Ser

Leu

Leu

Arg

HiS

His

Asn

325

330

335

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

Thr

Ser

Arg

Ser

Ala

Cys

Gin

Arg

Gin

Lys

Lys

340

345

350

Val

Thr

Phe

Asp

Arg

Leu

Gin

Val

Leu

Asp

ser

His

Tyr

Gin

Asp

Val

355

360

365

Leu

Lys

Glu

Val

Lys

Ala

Ala

Ala

Ser

Lys

Val

Lys

Ala

Asn

Leu

Leu

370

375

380

Ser

Val

Glu

Glu

Ala

Cys

Ser

Leu

Thr

Pro

Pro

His

Ser

Ala

Lys

Ser

385

390

395

400

Lys

Phe

Gly

Tyr

Gly

Ala

Lys

Asp

Val

Arg

Cys

His

Ala

Arg

Lys

Ala

405

410

415

Val

Thr

His

Ile

Asn

Ser

Val

Trp

Lys

Asp

Leu

Leu

Glu

Asp

Asn

Val

420

425

430

Thr

Pro'

Ile

Asp

Thr

Thr

Ile

Met

Ala

Lys

Asn

Glu

Val

Phe

Cys

Val

435

440

445

Gin

Pro

Glu

Lys

Gly

Gly

Arg

Lys

Pro

Ala

Arg

Leu

Ile

Val

Phe

Pro

450

455

460

Asp

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Cys

Glu

Lys

Met

Ala

Leu

Tyr

Asp

Val

Val

465

470

475

480

Thr

Lys

Leu

Pro

Leu

Ala

Val

Met

Gly

Ser

Ser

Tyr

Gly

Phe

Gin

Tyr

485

490

495

Ser

Pro

Gly

Gin

Arg

Val

Glu

Phe

500 (2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID NO:7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 477 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: N3o (Vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC ) (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Rodney (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: 409-1-1 (C-a) (ix) A REALÇAR:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..477 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO;7:

GAA Glu 1

TTC Phe

CGC Arg

ACG Thr

CCC Pro 5

GCC GAG Ala Glu

ACT ACA Thr Thr

GTT AGG CTA

CGG GCG TAC

ATG Met

48

Val 10

Arg

Leu

Arg

Ala

Tyr 15

AAC

ACT

CCG

GGG

CTT

CCC

GTG

TGC

CAG

GAC

GGA

ATT

CCG

TCC

CCG

TCC

96

Asn

Thr

Pro

Gly

Leu

Pro

Val

cys

Gin

Asp

Gly

Ile

Pro

Ser

Pro

Ser

20

25

30

ACC

ACC

GGA

GAG

ATC

CCT

TTT

TAC

GGC

AAG

GCT

ATC

CCC

CTC

GAA

GTA

144

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Pro

Phe

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ile

Pro

Leu

Glu

Val

35

40

45

ATC AAG GGG GGG AGA CAT CTC ATC TTC TGT CAT TCA AAG AAG AAG TGC Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys

GAC GAA CTC GCC

GCA AAG

CTG Leu

GTC Vai

GCA Ala

TTG Leu

GGC Gly 75

ATC AAT GCC GTG GCC

240

Asp 65

Glu

Leu

Ala

Ala

Lys 70

Ile

Asn

Ala

Val

Ala ·.. „ 80

TAC

TAC

CGC

GGT

CTT

GAC

GTG

TCC

GTC

ATC

CCG

ACC

AGC

GGC

GAT

GTT

288

Tyr

Tyr

Arg

Gly

Leu

Asp

Vai

Ser

Vai

Ile

Pro

Thr

Ser

Gly

Asp

Val

85

90

95

GTC

GTC

GTG

GCA

ACC

GAT

GCC

CTC

ATG

ACC

GGC

TAT

ACC

GGC

GAC

TTC

336

Vai

Vai

Vai

Ala

Thr

Asp

Ala

Leu

Met

Thr

Gly

Tyr

Thr

Gly

Asp

Phe

100

105

110

GAC

TCG

GTG

ATA

GAC

TGC

AAT

ACG

TGT

GTC

ACC

CAG

ACA

GTC

GAT

TTC

384

Asp

Ser

Vai

Ile

Asp

Cys

Asn

Thr

Cys

Vai

Thr

Gin

Thr

Val

Asp

Phe

115

120

125

AGC

CTT

GAC

CCT

ACC

TTC

ACC

ATT

GAG

AÇA

ATC

ACG

CTC

CCC

CAG

GAT

432

Ser

Leu

Asp

Pro

Thr

Phe

Thr

Ile

Glu

Thr

Ile

Thr

Leu

Pro

Gin

Asp

130

135

140

GCT

GTC

TCC

CGC

ACT

CAA

CGT

CGG

GGC

AGG

ACT

GGC

ACG

GAA

TTC

477

Ala

Vai

Ser

Arg

Thr

Gin

Arg

Arg

Gly

Arg

Thr

Gly

Thr

Glu

Phe

145

150

155

) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:8;

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 159 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:8:

Glu

Phe

Arg

Thr

Pro

Ala

Glu

Thr

Thr

Vai

Arg

Leu

Arg

Ala

Tyr

Met

1

5

10

15

Asn

Thr

Pro

Gly

Leu

Pro

Vai

Cys

Gin

Asp

Gly'

Ile

Pro

Ser

Pro

Ser

20

25

30

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Pro

Phe

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ile

Pro

Leu

Glu

Vai

35

40

45

Ile

Lys

Gly

Gly

Arg

His

Leu

Ile

Phe

Cys

His

Ser

Lys

I ys

Lyã

Cys

50

55

60

Asp

Glu

Leu

Ala

Ala

Lys

Leu

Vai

Ala

Leu

Gly

Ile

Asn

Ala

Vai

Ala

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Arg

Gly

Leu

Asp

Vai

Ser

Vai

Ile

Pro

Thr

Ser

Gly

Asp

Vai

85

90

95

Vai

Vai

Vai

Ala

Thr

Asp

Ala

Leu

Met

Thr

Gly

Tyr

Thr

Gly

Asp

Phe

100

105

110

Asp

Ser

Vai

Ile

Asp

Cys

Asn

Thr

Cys

Vai

Thr

Gin

Thr

Vai

Asp

Phe

115

120

125

Ser

Leu

Asp

Pro

Thr

Phe

Thr

Ile

Glu

Thr

Ile

Thr

Leu

Pro

Gin

Asp

130

135

140

Ala

Vai

Ser

Arg

Thr

Gin

Arg

Arg

Gly

Arg

Thr

Gly

Thr

Glu

Phe

145 150 155 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9 :

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO; 558 Pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Não (Vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: 409-1-1 (abc) (ix) A REALÇAR;

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..558

(Xi)

DESCRIÇÃO

DA

SEQUENCIA:

SEQ ID NO

:9:

'1 TCC

ACC

ACC

GGA

GAG

ATC

CCT

TTT

TAC

GGC

AAG

GCT

ATC

CCC

CTC

GAA .

48

Ser

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Pro

Phe

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ile

Pro

Leu

Glu

1

5

10

15

GTA

ATC

AAG

GGG

GGG

AGA

CAT

CTC

ATC

TTC

TGT

CAT

TCA

AAG

AAG

AAG

96

Vai

Ile

Lys

Gly

Gly

Arg

His

Leu

Ile

Phe

Cys

His

Ser

Lys

Lys

Lys

20

25

30

TGC

GAC

GAA

CTC

GCC

GCA

AAG

CTG

GTC

GCA

TTG

GGC

ATC

AAT

GCC

GTG

144

Cys

Asp

Glu

Leu

Ala

Ala

Lys

Leu

Vai

Ala

Leu

Gly

Ile

Asn

Ala

Vai

35

40

45

GCC

TAC

TAC

CGC

GGT

CTT

GAC

GTG

TCC

GTC

ATC

CCG

ACC

AGC

GGC

GAT

192

Ala

Tyr

Tyr

Arg

Gly

Leu

Asp

Vai

Ser

Vai

Ile

Pro

Thr

Ser

Gly

Asp

50

55

60

GTT

GTC

GTC

GTG

GCA

ACC

GAT

GCC

CTC

ATG

ACC

GGC

TAT

ACC

GGC

GAC

240

Vai

Vai

Vai

Vai

Ala

Thr

Asp

Ala

Leu

Met

Thr

Gly

Tyr

Thr

Gly

Asp

65

70

75

80

TTC

GAC

TCG

GTG

ATA

GAC

TGC

AAT

ACG

TGT

GTC

ACC

CAG

ACA

GTC

GAT

288

Phe

Asp

Ser

Vai

Ile

Asp

Cys

Asn

Thr

Cys

Vai

Thr

Gin

Thr

Vai.

Asp

85

90

95

TTC

AGC

CTT

GAC

CCT

ACC

TTC

ACC

ATT

GAG

ACA

ATC

ACG

CTC

CCC

CAG

336

Phe

Ser

Leu

Asp

Pro

Thr

Phe

Thr

Ile

Glu

Thr

Ile

Thr

Leu

Pro

Gin

100

105

110

GAT

GCT

GTC

TCC

CGC

ACT

CAA

CGT

CGG

GGC

AGG

ACT

GGC

AGG

GGG

AAG

384

Asp

Ala

Vai

Ser

Arg

Thr

Gin

Arg

Arg

Gly

Arg

Thr

Gly

Arg

Gly

Lys

115

120

125

CCA

GGC

ATC

TAC

AGA

TTT

GTG

GCA

CCG

GGG

GAG

CGC

CCC

TCC

GGC

ATG

432

Pro

Gly

Ile

Tyr

Arg

Phe

Vai

Ala

Pro

Gly

Glu

Arg

Pro

Ser

Gly

Met

130

135

140

480

TTC GAC TCG

TCC GTC CTC TGT GAG TGC

TAT Tyr

GAC GCA GGC TGT GCT

TGG Trp 160

Phe 145

Asp Ser

Ser

Vai

Leu 150

Cys

Glu Cys

Asp 155

Ala Gly

Cys

Ala

TAT

GAG

CTC

ACG

CCC

GCC

GAG

ACT

ACA

GTT

AGG

CTA

CGA

GCG

TAC

ATG

Tyr

Glu

Leu

Thr

Pro

Ala

Glu

Thr

Thr

Vai

Arg

Leu

Arg

Ala

Tyr

Met

165

170

175

AAC

ACC

CCG

GGG

CTT

CCC

GTG

TGC

CAG

GAC

Asn

Thr

Pro

Gly

Leu

Pro

Vai

Cys

Gin

Asp

528

558

180 185 (2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID NO:10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 186 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina

(

xi)

DES

CRIÇAO

DA

SEQUENC

IA:

SEQ

ID

NO:

10:

Ser

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Pro

Phe

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ile

Pro

Leu

Glu

1

5

10

15

Vai

Ile

Lys

Gly

Gly

Arg

His

Leu

Ile

Phe

Cys

His

Ser

Lys

Lys

Lys

20

25

30

Cys

Asp

Glu

Leu

Ala

Ala

Lys

Leu

Vai

Ala

Leu

Gly

Ile

Asn

Ala

Vai

35

40

45

Ala

Tyr

Tyr

Arg

Gly

Leu

Asp

Vai

Ser

Vai

Ile

Pro

Thr

Ser

Gly

Asp

50

55

60

Vai Vai Vai Vai Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp
65	70	75	80
Phe	Asp Ser Vai Ile Asp Cys Asn	Thr Cys Vai Thr	Gin Thr Vai Asp
	85	90	95
Phe	Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr	Ile Glu Thr Ile	Thr Leu Pro Gin
	100	105	110
Asp	Ala Vai Ser Arg Thr Gin Arg	Arg Gly Arg Thr	Gly Arg Gly Lys
	115 120		125
Pro	Gly Ile Tyr Arg Phe Vai Ala	Pro Gly Glu Arg	Pro Ser Gly Met
	130 135	140
Phe	Asp Ser Ser Vai Leu Cys Glu	Cys Tyr Asp Ala	Gly Cys Ala Trp
145	150	155	160
Tyr	Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr	Thr Vai Arg Leu	Arg Ala Tyr Met
	165	170	175
Asn	Thr Pro Gly Leu Pro Vai Cys	Gin Asp
	180	185
(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ	ID NO:11:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 657 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Náo (iv) ANTI-SENTIDO: N3o (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC (Vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: GG1

(ix) A REALÇAR:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..657 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:11:

ATG GGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AAA AAA AAC AAA CGT AAC ACC AAC

48

Met 1

Gly Thr

Asn Pro 5

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys 10

Asn

Lys

Arg Asn

Thr 15

Asn

CGT

CGC

CCA

CAG

GAC

GTC

AAG

TTC

CCG

GGT

GGC

GGT

CAG

ATC

GTT

GGT

96

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Vai

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Vai

Gly

20

25

30

GGA

GTT

TAC

TTG

TTG

CCG

CGC

AGG

GGC

CCT

AGA

TTG

GGT

GTG

CGC

GCG

144

Gly

Vai

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Vai

Arg

Ala

35

40

45

ACG

AGA

AAG

ACT

TCC

GAG

CGG

TCG

CAA

CCT

CGA

GGT

AGA

CGT

CAG

CCT

192

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

Gin

Pro

50

55

60

ATC

CCC

AAG

GCT

CGT

CGG

CCC

GAG

GGC

AGG

ACC

TGG

GCT

CAG

CCC

GGG

240

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

65

70

75

80

TAC

CCT

TGG

CCC

CTC

TAT

GGC

AAT

GAG

GGC

TGC

GGG

TGG

GCG

GGA

TGG

288

Tyr

Pro

Trp

pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Glu

Gly

Cys

Gly

Trp

Ala

Gly

Trp

85

90

95

CTC

CTG

TCT

CCC

CGT

GGC

TCT

CGG

CCT

AGC

TGG

GGC

CCC

ACA

GAC

CCC

336

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

Asp

Pro

100

105

110

CGG

CGT

AGG

TCG

CGC

AAT

TTG

GGT

AAG

GTC

ATC

GAT

ACC

CTT

ACG

TGC

384

Arg

Arg

Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

Lys

Vai

Ile

Asp

Thr

Leu

Thr

Cys

115

120

125

GGC

TTC

GCC

GAC

CTC

ATG

GGG

TAC

ATA

CCG

CTC

GTC

GGC

GCC

CCT

CTT

432

Gly

Phe

Ala

Asp

Leu

Met

Gly

Tyr

Ile

Pro

Leu

Vai

Gly

Ala

Pro

Leu

130 135 140

GGA

GGC

GCT

GCC

AGG

GCC

CTG

GCG

CAT

GGC

GTC

CGG

GTT

CTG

GAA

GAC

480

Gly

Gly

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

Ala

His

Gly

Vai

Arg

Vai

Leu

Glu

Asp

145

150

155

160

GGC Gly

GTG Vai

AAC TAT Asn Tyr

GCA Ala 155

ACA GGG AAC CTT CCT GGT TGC TCT TTC TCT ATC

528

Thr

Gly

Asn

Leu

Pro 170

Gly

Cys

Ser

Phe

Ser 175

Ile

TTC

CTT

CTG

GCC

CTG

CTC

TCT

TGC

TTG

ACT

GTG

CCC

GCT

TCG

GCC

TAC

576

Phe

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Vai

Pro

Ala

Ser

Ala

Tyr

180

185

190

CAA

GTG

CGC

AAC

TCC

ACG

GGG

CTT

TAC

CAC

GTC

ACC

AAT

GAT

TGC

CCT

624

Gin

Vai

Arg

Asn

Ser

Thr

Gly

Leu

Tyr

His

Vai

Thr

Asn

Asp

Cys

Pro

195

200

205

AAC

TCG

AGC

ATT

GTG

TAC

GAG

TAA

TAG

GGA

TCC

657

Asn

ser

Ser

Ile

Vai

Tyr

Glu

*

*

Gly

Ser

210 215 (2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID N0í12;

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 219 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:12:

Met

Gly

Thr

Asn

Pro

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

Asn

1

5

10

15

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Vai

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Vai

Gly

20

25

30

Gly

Vai

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Vai

Arg

Ala

35

40

45

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

Gin

Pro

50

55

60

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

65

70

75

80

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Glu

Gly

Cys

Gly

Trp

Ala

Gly

Trp

85

90

95

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

Asp

Pro

100

105

110

Arg

Arg

Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

Lys

Vai

Ile

Asp

Thr

Leu

Thr

Cys

115 120 125

Gly

Phe Ala Asp Leu 130

Met Gly Tyr 135

Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro 140

Leu

Gly

Gly

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

Ala

His

Gly

Val

Arg

Val

Leu

Glu

Asp

145

150

155

160

Gly

Vai

Asn

Tyr

Ala

Thr

Gly

Asn

Leu

Pro

Gly

Cys

Ser

Phe

Ser

Ile

165

170

175

Phe

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Val

Pro

Ala

Ser

Ala

Tyr

180

185

190

Gin

Vai

Arg

Asn

Ser

Thr

Gly

Leu

Tyr

His

Val

Thr

Asn

Asp

Cys

Pro

195

200

205

Asn

Ser

Ser

Ile

val

Tyr

Glu

*

*

Gly

Ser

210 215 (2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID NO:13:

(i) CARACTERITICAS DA SEQUENCIA (A) COMPRIMENTO: 657 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: CapA (ix) A REALÇAR:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..657 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:13:

ATG GGC ACG AAT CCT AAA CCT

CAG Gin

AAG Lys

AAG Lys 10

AAC Asn

AAA Lys

CGT AAC ACC Arg Asn Thr 15

AAC Asn

48

Met 1

Gly

Thr

Asn Pro Lys 5

Pro

CGT

CGC

CCA

CAG

GAC

GTC

AAG

TTC

CCG

GGT

GGC

GGT

CAG

ATC

GTT

GGT

96

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Vai

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Vai

Gly

20

25

30

GGA

GTT

TAC

TTG

TTG

CCG

CGC

AGG

GGC

CCT

AGA

TTG

GGT

GTG

CGC

GCG

144

Gly

Vai

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Vai

Arg

Ala

35

40

45

ACG

AGA

AAG

ACT

TCC

GAG

CGG

TCG

CAA

CCT

CGA

GGT

AGA

CGT

CAG

CCT

192

Thr

Arg

Lya

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

Gin

Pro

50

55

60

ATC

CCC

AAG

GCT

CGT

CGG

CCC

GAG

GGC

AGG

ACC

TGG

GCT

CAG

CCC

GGG

240

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

65

70

75

80

TAC

CCT

TGG

CCC

CTC

TAT

GGC

AAT

GAG

GGC

TGC

GGG

TGG

GCG

GGA

TGG

288

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Glu

Gly

Cys

Gly

Trp

Ala

Gly ..Trp

85

90

95

CTC

CTG

TCT

CCC

CGT

GGC

TCT

CGG

CCT

AGC

TGG

GGC

CCC

ACA

GAC

CCC

336

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

Asp

Pro

100

105

110

CGG

CGT

AGG

TCG

CGC

AAT

TTG

GGT

AAG

GTC

ATC

GAT

ACC

CTT

ACG

TGC

384

Arg

Arg

Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

Lys

Vai

Ile

Asp

Thr

Leu

Thr

Cys

115

120

125

GGC TTC GCC GAC CTC	ATG GGG TAC ATA CCG CTC GTC GGC GCC CCT CTT	432
Gly	Phe Ala 130	Asp Leu	Met	Gly Tyr 135	Ile	Pro Leu Val 140	Gly	Ala	Pro Leu
GGA	GGC GCT	GCC AGG	GCC	CTG GCG	CAT	GGC GTC CGG	GTT	CTG	GAA GAC	480
dy	Gly Ala	Ala Arg	Ala	Leu Ala	His	Gly Val Arg	Val	Leu	Glu Asp
145 I			150			155			160
GGC	GTG AAC	TAT GCA	ACA	GGG AAC	CTT	CCT GGT TGC	TCT	TTC	TCT ATC	528
Gly	Val Asn	Tyr Ala	Thr	Gly Asn	Leu	Pro Gly Cys	Ser	Phe	Ser,..Ile
		165				170			175
TTC	CTT CTG	GCC CTG	CTC	TCT TGC	TTG	ACT GTG CCC	GCT	TCG	GCC TAC	576
Phe	Leu Leu	Ala Leu	Leu	Ser Cys	Leu	Thr Val Pro	Ala	Ser	Ala Tyr
		180			185			190
CAA	GTG CGC	AAC TCC	ACG	GGG CTT	TAC	CAC GTC ACC	AAT	GAT	TGC CCT	624
Gin	Val Arg	Asn Ser	Thr	Gly Leu	Tyr	His Val Thr	Asn	Asp	Cys Pro
	195			200			205
AAC	TCG AGC	ATT GTG	TAC	GAG TAA	TAG	GGA TCC				657
Asn	Ser Ser	Ile Val	Tyr	Glu *	*	Gly Ser
	210			215
	(2)	INFORMAÇAC	ι SOBRE	A SEQ ID NO:14:
		(i) CARACTERÍSTICAS	DA SEQUENCIA:
			(A)	COMPRIMENTO: 219 aminoácidos
			(B)	TIPO: aminoácido
			(D)	TOPOLOGIA:	linear
		(ii)	TIPC	I DE MOLÉCULA: proteina

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA SEQ ID NO:14:

Met

Gly

Thr

Asn

Pro

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

Asn

1

5

10

15

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Val

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Val

Gly

20

25

30

Gly

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Val

Arg

Ala

35

40

45

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Prg

Gin

Pro

55 60

Ile 65

Pro Lys

Ala

Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gin Pro

Gly 80

70

75

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Glu

Gly

Cys

Gly

Trp

Ala

Gly

Trp

85

90

95

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

Asp

Pro

100

105

110

Arg

Arg

Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

Lys

Val

Ile

Asp

Thr

Leu

Thr

Cys

115

120

125

Gly

Phe

Ala

Asp

Leu

Met

Gly

Tyr

Ile

Pro

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

130

135

140

Gly

Gly

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

Ala

His

Gly

Val

Arg

Val

Leu

Glu

Asp

145

150

155

160

Gly

Val

Asn

Tyr

Ala

Thr

Gly

Asn

Leu

Pro

Gly

Cys

Ser

Phe

Ser

Ile

165

170

175

Phe

Leu

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Val

Pro

Ala

Ser

Ala

Tyr

180

185

190

Gin

Val

Arg

Asn

Ser

Thr

Gly

Leu

Tyr

His

Val

Thr

Asn

Asp

Cys

Pro

195

200

205

Asn

Ser

Ser

Ile

Val

Tyr

Glu

*

*

Gly

Ser

210

215

(2) INFORMAÇÃO

SOBRE

A SEQ ID NO:15:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 453 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) PONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: C1NC450 (ix) A REALÇAR:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..453 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA SEQ ID NO:15:

ATG GGC ACG

AAT Asn

CCT AAA CCT CAG AAG AAG AAC AAA CGT

AAC ACC AAC

48

Met 1

Gly

Thr

Pro 5

Lys

Pro Gin Lys

Lys 10

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr 15

Asn

CGT

CGC

CCA

CAG

GAC

GTC

AAG

TTC

CCG

GGT

GGC

GGT

CAG

ATC

GTT

GGT

96

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Vai

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Val

Gly

20

25

30

GGA

GTT

TAC

TTG

TTG

CCG

CGC

AGG

GGC

CCT

AGA

TTG

GGT

GTG

CGC

GCG

144

Gly

Vai

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

val

Arg

Ala

35

40

45

ACG

AGA

AAG

ACT

TCC

GAG

CGG

TCG

CAA

CCT

CGA

GGT

AGA

CGT

CAG

CCT

192

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

Gin

Pro

50

55

60

ATC

CCC

AAG

GCT

CGT

CGG

CCC

GAG

GGC

AGG

ACC

TGG

GCT

CAG

CCC

GGG

240

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

65

70

75

80

TAC

CCT

TGG

CCC

CTC

TAT

GGC

AAT

GAG

GGC

TGC

GGG

TGG

GCG

GGA

TGG

288

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Glu

Gly

Cys

Gly

Trp

Ala

Gly

Trp

85

90

95

CTC CTG TCT Leu Leu Ser

CCC Pro 100

CGT GGC TCT CGG

CCT AGC TGG GGC CCC ACA GAC

CCC Pro

336

Arg

Gly

Ser Arg

Pro 105

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr 110

Asp

CGG

CGT

AGG

TCG

CGC

AAT

TTG

GGT

AAG

GTC

ATC

GAT

ACC

CTT

ACG

TGC

384

Arg

Arg

Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

Lys

Vai

Ile

Asp

Thr

Leu

Thr

Cys

115

120

125

GGC

TTC

GCC

GAC

CTC

ATG

GGG

TAC

ATA

CCG

CTC

GTC

GGC

GCC

CCT

CTT

432

Gly

Phe

Ala

Asp

Leu

Met

Gly

Tyr

Ile

Pro

Leu

Vai

Gly

Ala

Pro

Leu

130

135

140

GGA

GGC

GCT

GCC

AGG

GCC

TA

453

Gly

Gly

Ala

Ala

Arg

Ala

145 150 (2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID NO:16:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 150 Aminoácidos (B) TIPO: aminoácido ($) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:16:

Met

Gly

Thr

Asn

Pro

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

Asn

1

5

10

15

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Vai

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Vai

Gly

20

25

30

Gly

Vai

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Vai

Arg

Ala

35

40

45

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

Gin

Pro

50

55

60

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

65

70

75

80

Tyr Pro

Trp

Pro

Leu 85

Tyr

Gly Asn Glu

Gly Cys 90

Gly Trp Ala Gly 95

Trp

Leu

Leu

ser

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

Asp

Pro

100

105

110

Arg

Arg

Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

Lys

Vai

Ile

Asp

Thr

Leu

Thr

Cys

115

120

125

Gly

Phe

Ala

Asp

Leu

Met

Gly

Tyr

Ile

Pro

Leu

Vai

Gly

Ala

Pro

Leu

130

135

140

Gly

Gly

Ala

Ala

Arg

Ala

145 150 (2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID NO:17:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 360 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: C1NC360 (ix) A REALÇAR:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..360

(xi)

DE

SCRIÇAO

DA

SEQ

!UEN<

CIA:

! SE

Q ID NO

:17

• ♦

ATG

GGC

ACG

AAT

CCT

AAA

CCT

CAG

AAG

AAG

AAC

AAA

CGT

AAC

ACC

AAC

48

Met

Gly

Thr

Asn

Pro

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

Asn

1

5

10

15

CGT

CGC

CCA

CAG

GAC

GTC

AAG

TTC

CCG

GGT

GGC

GGT

CAG

ATC

GTT

GGT

96

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Vai

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Vai

Gly

20

25

30

GGA GTT TAC

TTG TTG

CCG CGC AGG GGC CCT AGA

TTG GGT GTG CGC GCG

144

Gly

Vai

Tyr 35

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg 40

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly 45

Vai Arg Ala

ACG

AGA

AAG

ACT

TCC

GAG

CGG

TCG

CAA

CCT

CGA

GGT

AGA

CGT

CAG

CCT

192

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

Gin

Pro

50

55

60

ATC

CCC

AAG

GCT

CGT

CGG

CCC

GAG

GGC

AGG

ACG

TGG

GCT

CAG

CCC

GGG

240

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

65

70

75

80

TAC

CCT

TGG

CCC

CTC

TAT

GGC

AAT

GAG

GGC

TGC

GGG

TGG

GCG

GGA

TGG

288

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Glu

Gly

Cye

Gly

Trp

Ala

Gly

Trp

85

90

95

CTC

CTG

TCT

CCC

CGT

GGC

TCT

CGG

CCT

AGC

TGG

GGC

CCC

ACA

GAC

CCC

336

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

Asp

Pro

100

105

110

CGG

CGT

AGG

TCG

CGC

AAT

TTG

TA

360

Arg

Arg

Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

115

120

(2)

ι INFORMAÇÃO S'

OBRE A

SEQ

ID

NO:

18:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 119 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:18:

Met 1

Gly

Thr

Asn

Pro 5

Lys Pro Gin Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr

Asn

10

15

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Val

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Val

Gly

20

25

30

Gly

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Val

Arg

Ala

35

40

45

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

Gin

Pro

50

55

60

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

65

70

75

80 “· 1)

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Glu

Gly

Cys

Gly

Trp

Ala

Gly

Trp

85

90

95

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

Asp

Pro

100

105

110

Arg

Arg

Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

115

(2)

INFORMAÇÃO SOBRE A

SEQ

ID

NO,:

1-9.:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 273 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: N3o (Vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC (Vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: C1NC270 (ix) A REALÇAR;

(A) NOME/CHAVE; CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..273 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:19;

ATG	GGC	ACG	AAT	CCT	AAA
Met 1	Gly	Thr	Asn	Pro 5	Lys
CGT	CGC	CCA	CAG	GAC	GTC
Arg	Arg	Pro	Gin 20	Asp	Val
GGA	GTT	TAC	TTG	TTG	CCG
Gly	Val	Tyr 35	Leu	Leu	Pro
ACG	AGA	AAG	ACT	TCC	GAG
Thr	Arg 50	Lys	Thr	Ser	Glu
ATC	CCC	AAG	GCT	CGT	CGG
Ile 65	Pro	Lys	Ala	Arg	Arg 70
TAC	CCT	TGG	CCC	CTC	TAT
Tyr	Pro	Trp	Pro	Leu 85	Tyr

CCT	CAG	AAG	AAG	AAC	AAA
Pro	Gin	Lys	Lys 10	Asn	Lys
AAG	TTC	CCG	GGT	GGC	GGT
Lys	Phe	Pro 25	Gly	Gly	Gly
CGC	AGG	GGC	CCT	AGA	TTG
Arg	Arg 40	Gly	Pro	Arg	Leu
CGG	TCG	CAA	CCT	CGA	GGT
Arg 55	Ser	Gin	Pro	Arg	Gly 60
CCC	GAG	GGC	AGG	ACC	TGG
Pro	Glu	Gly	Arg	Thr 75	Trp
GGC Gly	AAT· Asn	GAG Glu	GGC Gly 90	TA

CGT AAC ACC Arg Asn Thr	AAC Asn	48
	15
CAG	ATC	GTT	GGT	96
Gin	Ile	Val.	Giy
	30
GGT	GTG	CGC	GCG	144
Gly	Val	Arg	Ala
45
AGA	CGT	CAG	CCT	192
Arg	Arg	Gin	Pro

GCT	CAG	CCC	GGG	240
Ala	Gin	Pro	Gly

273 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO;20:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA*.

(A) COMPRIMENTO; 90 aminoácidos (B) TIPO; aminoácido (O) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (XI) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA; SEQ ID NO*.20:

Met

Gly

Thr

Asn

Pro

Lys

Pro

Gin

Lys

Lye

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

Asn

1

5

10

15

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Vai

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Vai

Gly

20

25

30

Gly

Vai

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Vai

Arg

Ala

35

40

45

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

Gin

Pro

50

55

60

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

65

70

75

80

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Glu

Gly

85

90

(2

!) L

NFORMAÇ

AO PARA

. A

SEQ

ID

NO::

21:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 183 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: CDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Náo (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: C100NC270 (ix) A REALÇAR:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAOí 1..183 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:21:

ATG Met 1

GGT Gly

GGA GTT TAC TTG TTG CCG

CGC AGG GGC CCT AGA

TTG GGT

GTG Vai

Gly

Vai

Tyr 5

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg 10

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly 15

CGC

GCG

ACG

AGA

AAG

ACT

TCC

GAG

CGG

TCG

CAA

CCT

CGA

GGT

AGA

CGT

Arg

Ala

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

20

25

30

CAG

CCT

ATC

CCC

AAG

GCT

CGT

CGG

CCC

GAG

GGC

AGG

ACC

TGG

GCT

CAG

Gin

Pro

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

35

40

45

CCC

GGG

TAC

CCT

TGG

CCC

CTC

TAT

GGC

AAT

GAG

GGC

TA

Pro

Gly

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Glu

Gly

50

55

60

144

183 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:22:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 60 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:22:

Met

Gly

Gly

Vai

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Vai

1

5

10

15

Arg

Ala

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

20

25

30

Gin

Pro

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Al.a'

'Gin

35

40

45

Pro Gly Tyr Pro Trp

Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly (2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID NO:23:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 270 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: CDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Náo (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: C100NC360 (ix) A REALÇAR:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..270

	(xi)	DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA:	SEQ ID NO:23:
ATG GGT	GGA GTT	TAC TTG TTG CCG CGC AGG GGC	CCT AGA TTG GGT GTG 48
Met Gly	Gly Vai	Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly	Pro Arg Leu Gly Vai
1		5 - 10	15
CGC GCG	ACG AGA	AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA	CCT CGA GGT AGA CGT 96
Arg Ala	Thr Arg	Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin	Pro Arg Gly Arg Arg
	20	25	30
CAG CCT	ATC CCC	AAG GCT CGT CGG CCC GAG GGC	AGG ACC TGG GCT CAG 144
Gin Pro	Ile Pro	Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly	Arg Thr Trp Ala Gin
	35	40	45

CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGC TGC

GGG TGG GCG Gly Trp Ala

192

Pro Gly Tyr Pro Trp Pro

Leu Tyr 55

Gly Asn

Glu

Gly 60

Cys

50

GGA

TGG

CTC

CTG

TCT

CCC

CGT

GGC

TCT

CGG

CCT

AGC

TGG

GGC

CCC

ACA

240

Gly

Trp

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

65

70

75

80

GAC

CCC

CGG

CGT

AGG

TCG

CGC

AAT

TTG

TA

270

Asp

Pro

Arg

Arg

Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

85

90

(2)

INFORMAÇÃO

SOBRE

A SEQ ID NO:24:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO; 89 aminoácidos (B) TIPOi aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear

	(ii) TIPO	DE	MOLÉCULA:	proteina
	(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA SEQ ID NO:24	• «
Met	Gly Gly Val	Tyr	Leu Leu Pro	Arg Arg Gly	Pro	Arg	Leu	Gly	Val
1		5		10				15
Arg	Ala Thr Arg	Lys	Thr Ser Glu	Arg Ser Gin	Pro	Arg	Gly	Arg	Arg
	20			25			30
Gin	Pro Ile Pro	Lys	Ala Arg Arg	Pro Glu Gly	Arg	Thr	Trp	Ala	Gin
	35		40			45
Pro	Gly Tyr Pro	Trp	Pro Leu Tyr	Gly Asn Glu	Gly	Cys	Gly	Trp	Ala
	50		55		60
Gly	Trp Leu Leu	Ser	Pro Arg Gly	Ser Arg Pro	Ser	Trp	Gly	Pro	Thr
65			70	75					80
Asp	Pro Arg Arg	Arg	Ser Arg Asn	Leu

(2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID NO:25:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 106 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus da Hepatite C (B) ESTIRPE: CDC (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: C1NC105 (ix) A REALÇAR:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇAO: 1..106 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:25:

ATG Met 1

GGC ACG AAT CCT AAA

CCT CAG AAG AAG AAC AAA CGT AAC ACC AAC

48

Gly Thr Asn

Pro Lys 5

Pro

Gin

Lys

Lys 10

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr 15

Asn

CGT

CGC

CCA

CAG

GAC

GTC

AAG

TTC

CCG

GGT

GGC

GGT

CAG

ATC

GTT

GGT

96

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Val

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Val

Gly

20

25

30

GGA GTT TTA A 106

Gly Val Leu (2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID NO:26:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 35 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:26:

Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gin Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn

Arg Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Ile Val Gly 20 25 ³⁰

Gly Val Leu

FOLHAS - FOLHA 1

Apêndice

20 30 40 50 60

I I I I i I

CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGG

GTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCC

GCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACC

CGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG

CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA

GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT

CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACeTACAGCTGGG

GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC

GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT

CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA

TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG

AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC

TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC

AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG

CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG

GCGTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC

ACTACCCGTATAGGCTTTGGCTTTGGCATTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCA

TGATGGGCATATCCGAAACCGAAACCGTAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGT

GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG

CCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC

AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA

TTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT

CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA

GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT

TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG

AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC

CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC

GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG

GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGA

CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCT

ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG

TGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC

FOLHAS - FOLHA 2

Apêndice

TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCT

ACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA

TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC

AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCG

TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGA

ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACT

CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC

GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG

TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC

ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG

GCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA

CGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT

AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTAC

TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATG

CCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCG

GGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGC

GAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTT

CTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAA

ATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGG

TATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACC

CTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATA

GACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCGTCTAT

CCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGGAGA

GGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGGCGTCCCCGGCCCTCT

TACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCA

ATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGT

CGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACCAGCCTAACTGGCC

GCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGG

GGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCC

CCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGG

TGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCA

ACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGT

FOLHAS - FOLHA 3

Apêndice

TCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGG

AGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACATATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACC

GCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACC

CGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGG

TTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGG

AAATGGACCAGTGCTCCGTGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCC

GCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGT

CGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACA

TGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGG

ACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACC

CTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGT

GATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACA

TCACGGATAACTCCTCTCCAÇCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATG

AGTGCCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTAC

CTCCCACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATA

GAGGGTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATAT

AGGTGCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCA

TCCACGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGT

AGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCC

TCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGG

CCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTT

GGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAA

ATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATCG

TACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGC

GCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCA

CGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGT

CCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCA

GGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGT

CCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGAC

GGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTG

ATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCAT

TAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTA

TGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCG

ACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGC

FOLHAS FOLHA 4

Apêndice

GCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACT

CGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGA

CGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCT

GCCACTATCTGACGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGA

TCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCA

AGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGT

GGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCG

CCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGC

GCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGC

CGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCG

TCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCG

AGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGC

TGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATG

ACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTAC

CCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACC

GGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGG

AAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGT

TTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCA

GTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCG

CAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGC

CTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGT

GACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACA

CGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTT

GCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAA

TGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCG

ACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGC

GGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAG

CCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTC

AGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGC

TCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCG

AGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTG

TCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGAC

FOLHAS FOLHA 5

Apêndice

TCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCA

AGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGT

GTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCAT

CACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGG7AACGAAGTA

TGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCA

ACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGT

ACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTG

TGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAAC

TGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAG

ACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATC

ACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGA

TGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACT

GCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTÇAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCG

CGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGGGGGC

GAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCG

CTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGC

AGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTT

TCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAA

CCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCA

GGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGT

GCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCA

CGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGT

CTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCG

GAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGC

ACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGT

TGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACA

CCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCC

GGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGG

ACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTA

TGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGAT

GGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGGGCCCCT

CCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGA

GTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAAT

CATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTA

FOLHAS - FOLHA 6

Apêndice

ATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTGACAATC

TACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAG

TCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCC

AGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTAACCTGCCCCACGCGG

TACATAGGTTTGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAG

ATGTATCCAAACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATC

GACTCCACGAATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCG

CTGAGGTGCTTATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGC

TGTTGACGTCCATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGT

ACAACTGCAGGTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCA

TGGCGAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCAT

ACCGCTCCCCTAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTA

CTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTGATGCTGAGCTCATAGAGGCCA

GAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTACTGAGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGT

ACCTCCTATGGAGGCAGGAGATGGGCGGCAACATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAG

TGGAGGATACCTCCGTCCTCTACCCGCCGTTGTAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTC

TGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAGGACGAGCGGGAGATCTCCG

ACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAACACCGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGC

TACCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGGAGATTCGCCCAGGCCCTGCCCGTTTGGGCGC

ATGGGCGTCTTTAGGACGCCTTCAGAGCCTCTAAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCG

GGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAGCCCGACTACGAACCACCTG

CCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTCTGCACCTTTTTCGGGCTGATGCTTGGTGGAC

TGGTCCATGGCTGTCCGCTTCCACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGCCTCCGCCTCGGAAGA

ACCAGGTACCGACAGGCGAAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACGGAGGCGGAGCCTTCT

AGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGGCCGAGCTCGCCACCA

TCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCTCGAGCGGTGGT

GAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGACAACATCCTCTG

CTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTGTTGTAGGAGAC

AGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCC

TCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGG

CCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACGGTCAGTA

GGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGCCAGTCAT

FOLHAS - FOLHA 7

Apêndice

GTGAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACTCTTGGACAGGCGCAC

CACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGAATGAGAACCTGTCCGCGTG

TCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTAÀGCAACTCGT

AGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGATTCGTTGAGCA

TGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGA

ACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCT

AGAAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACCAGGACGTACTCAAGG

TCTTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCC

AGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCGTAGAGGAAGCTTGCA

TCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAACGATAGGCATCTCCTTCGAACGT

GCCTGACGCCGCCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGGCAAAAGACGTCCGTT

CGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCCGTTTTCTGCAGGCAA

GCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGAAAGACCTTCTGGAAGACA

CGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTGAGGCACACCTTTCTGGAAGACCTTCTGT

ATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCTAAGAACGAGGTTTTCTGCGTTCAGCCTG

TACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAAAGACGCAAGTCGGAC

AGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGCTCGTCTCATCGTGTTCCCCGATCTGGGCGTGCGCGTGT

TCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAGACCCGCACGCGCACA

GCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAAAGCTCCCCTTGGCCGTGATGGGAAGCT

CGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACCGGCACTACCCTTCGA

CCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGGGTTGAATTCCTCGTGCAAGCGTGGAAGT

GGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGCACGTTCGCACCTTCA

CCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACAGTCACTG

GGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAACTGAGGTGTCAGTGAC

AGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAATGTTGTGACCTCGACCCCCAAGCCC

TCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTTACAACACTGGAGCTGGGGGTTCGGG

GCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTATGTTGGGGGCCCTCTTACCAATTCAA

CGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATACAACCCCCGGGAGAATGGTTAAGTT

GGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCGAGCGGCGTACTGACAACTAGCTGTG

CCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGCTCGCCGCATGACTGTTGATCGACAC

GTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAGG

CATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGTCGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTCC

ACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGGGTCC

TGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACACTTTCGCGCCCCCAGG

I

FOLHAS - FOLHA 8

Apêndice

6901 AGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTAcTCCGCCCCCC TCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGTCCATGAGGCGGGGGG

6961 CTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACATCATGCTCCTCCAACG GACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCTCGAGTATTGTAGTACGAGGAGGTTGC

7021 TGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAA ACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTT

7081 CCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTCAATTCCTGGCTAG GGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATC

7141 GCAACATAATCATGTTTCCCCCCACACTGTGGGCGAGGATCATACTGATGACCCATTTCT CGTTCTATTAGTACAAACGGGGGTGTCACACCCGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGA

7201 TTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGG AATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCC

7261 CCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC GGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG

Claims (57)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para a preparação de um polipéptido recombinante caracterizado pelo facto de ser imunoreactivo com soro humano infectado com o virus da hepatite C (HCV), incuindo o polipéptido uma porção imunoreactiva de um polipéptido de HCV que:

   a) é codificado por uma sequência de HCV codificante;

   b) tem 504 residuos de aminoácidos; e

   c) tem a sequência carboxi-terminal apresentada como SEQ ID NO:4.
2. 2. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polipéptido incluir a totalidade do péptido de 504 residuos.
3. 3. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto da sequência do polipéptido aminoacidica carboxi-terminal ser codificada pela sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO: 3.
4. 4. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o polipéptido ser produzido pelo vector de expressão contido numa Escherichia coli hospedeira identificada por ATCC No. 40901.
5. 5. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polipéptido incluir uma porção imunoreactiva da sequência do péptido apresentada como SEQ ID NO: 2.
6. 6. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto do polipéptido incluir a sequência especificada.
7. 7. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o polipéptido ser codificado pela sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO:1.
8. 8. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o polipéptido ser produzido pelo vector de expressão contido numa Escherichia coli hospedeira identificada por ATCC No. 40893.
9. 9. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polipéptido incluir a sequência peptidica apresentada como SEQ ID NO:8.
10. 10. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o polipéptido ser codificado pela sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO:7.
11. 11. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polipéptido incluir a sequência peptidica apresentada como SEQ ID NO:10.
12. 12. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o polipéptido ser codificado pela sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO:9.
13. 13. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polipéptido incluir uma sequência peptidica seleccionada do grupo constituído por sequências peptidicas apresentadas como SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID

    N0:16, SEQ ID N0:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26.
14. 14. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polipéptido ser codificado por uma sequência polinucleotidica seleccionada do grupo de sequências polinucleotidicas apresentado como SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:2l, SEQ ID NO:23, e SEQ ID NO:25.
15. 15. Um kit de diagnóstico para pesquisa no sangue humano de anticorpos específicos contra a infecção pelo virus da hepatite C (HCV), caracterizado pelo facto de compreender pelo menos, um péptido de antigénio imuno-reactivo com sera de seres humanos infectados com o virus da hepatite C (HCV), e

    meios para detecçâo da ligação dos referidos anticorpos ao antigénio.
16. 16. Um kit, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o antigénio incluir uma porção imunoreactiva de uma sequência polipeptidica de um HCV que:

    a) é codificado por uma sequência de HCV codificante;

    b) tem 504 residuos de aminoácidos; e

    c) tem a sequência carboxi-terminal apresentada como SEQ ID NO:4.
17. 17. Um kit, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o antigénio incluir uma porção imunoreactiva da sequência peptídica apresentada como SEQ ID

    NO: 2.
18. 18. Um kit, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o antigénio incluir uma porção imunoreactiva da sequência peptidica apresentada como SEQ ID

    NO: 8.
19. 19. Um kit, conforme reivindicado na reivindicação 18, caracterizado pelo facto de conter ainda um segundo antigénio, incluindo o segundo antigénio uma porção imunoreactiva de uma sequência peptidica seleccionada do grupo constituído pelas sequências peptídicas apresentadas como SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:26.
20. 20. Um kit, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o antigénio incluir uma porção imunoreactiva da sequência peptidica apresentada como SEQ ID

    NO:10.
21. 21. Um kit, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o antigénio incluir uma porção imunoreactiva de uma sequência peptidica seleccionada de um grupo constituído pelas sequências peptídicas apresentadas como SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:26.
22. 22. Um kit, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de os referidos meios de selecção incluírem um suporte sólido ao qual o referido péptido está ligado, e um anticorpo anti-humano de referência marcado, podendo a ligação dos referidos anticorpos do soro aos referidos antigénios ser detectada pela ligação do anticorpo de referência marcado à referida superfície sólida.
23. 23. Um método de detecção da infecção pelo virus da hepatite C (HCV) num indivíduo, caracterizado pelo facto de compreender o soro reactivo proveniente de um teste de um indivíduo infectado pelo HCV, com pelo menos um antigénio peptidico imunoreactivo com o soro humano infectado pelo virus da hepatite C (HCV) e exame do antigénio pesquisando a presença de anticorpo ligado.
24. 24. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o antigénio peptidico incluir uma porção imunoreactiva de um péptido de HCV que:

    a) é codificado por uma sequência de HCV codificante;

    b) tem 504 resíduos de aminoácidos; e

    c) tem a sequência carbóxi-terminal apresentada como SEQ ID NO:4.
25. 25. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o antigénio peptidico incluir uma porção imunoreactiva da sequência apresentada como SEQ ID NO:2.
26. 26. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o antigénio peptidico incluir uma porção imunoreactiva da sequência apresentada como SEQ ID NO:8.
27. 27. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 23, caracterizado pelo facto de conter ainda um segundo antigénio, incluindo o segundo antigénio uma porção imunoreactiva de uma sequência peptidica seleccionada do grupo constituido pelas sequências peptidicas apresentadas como SEQ ID NO:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:26.
28. 28. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o antigénio peptidico incluir uma porção imunoreactiva da sequência apresentada como SEQ ID NO:10.
29. 29. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o antigénio incluir uma porção imunoreactiva de uma sequência peptidica seleccionada do grupo constituido pelas sequências peptidicas apresentadas como SEQ ID NO:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID N0:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:26.
30. 30. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o antigénio peptidico estar ligado a um suporte sólido, incluindo a dita reacção a reacção do antigénio peptidico com o suporte e, subsequentemente, a reacção do suporte com um anticorpo anti-humano de referência marcado, e incluindo o dito exame a detecçâo da presença de anticorpo de referência marcado no suporte sólido.
31. 31. Um método de produção de um polipêptido que é imunoreactivo com o soro humano infectado com o virus da hepatite C (HCV), caracterizado pelo facto de compreender a introdução num hospedeiro apropriado, um sistema de expressão de recombinação contendo uma estrutura aberta de leitura (ORF) tendo uma sequência polinucleotidica que codifica um polinucleótido que é imunoreactivo com soro humano infectado com o virus da hepatite C (HCV), em que o vector é concebido para expressar a ORF no referido hospedeiro, e a cultura do respectivo hospedeiro sob condições resultantes na expressão da sequência ORF.
32. 32. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 31, caracterizado pelo facto de o polipéptido incluir uma porção imunoreactiva de um polipéptido de HCV que:

    a) é codificado por uma sequência codificante de HCV;

    b) tem 504 resíduos de aminoácidos; e

    c) tem a sequência carboxi-terminal apresentada como SEQ ID NO:4; e onde a sequência aminoacidica carboxi-terminal do referido antigénio peptidico é codificada pela sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO:3.
33. 33. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 32, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser um vector fago lambda gtll, o hospedeiro é a E. coli e o hospedeiro contendo o vector introduzido é identificado por ATCC No. 40901.
34. 34. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 31, caracterizado pelo facto de o polipéptido ter a sequência apresentada como SEQ ID NO: 2, e o polinucleótido ter uma sequência apresentada como SEQ ID NO:1.
35. 35. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 34, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser um vector fago lambda gtll, o hospedeiro ser a E. coli, e sendo o hospedeiro, que contém o vector introduzido, identificado por ATCC No. 40893.
36. 36. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 31, caracterizado pelo facto de o polipéptido ter a sequência apresentada como SEQ ID NO:8 e o polinucleótido ter a sequência apresentada como SEQ ID NO:7.
37. 37. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 36, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser o vector fago lambda gtll, o hospedeiro ser a E. coli e o hospedeiro contendo o vector introduzido ser identificado por ATCC No. 40792.
38. 38. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 31, caracterizado pelo facto de o polipéptido ter a sequência apresentada como SEQ ID NO:10 e o polinucleótido ter a sequência apresentada como SEQ ID NO:9.
39. 39. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 38,

    caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser o vector fago lambda gtll, o hospedeiro ser a E. coli e o hospedeiro contendo o vector introduzido ser identificado por ATCC No.

    40876.
40. 40. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 31, caracterizado pelo facto de o polipéptido incluir uma porção imunoreactiva de uma sequência peptidica seleccionada do grupo constituído pelas sequências peptidicas apresentadas como SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:26.
41. 41. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 40, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser um vector pGEX ou pET, e o hospedeiro ser uma E. coli.
42. 42. Um sistema de expressão para expressar um antigénio peptidico recombinante que é imunoreactivo com o soro humano infectado com o virus da hepatite C (HCV), caracterizado pelo facto de compreender um hospedeiro capaz de suportar a expressão de uma estrutura aberta de leitura num vector de expressão seleccionado, e o vector de expressão seleccionado contendo uma estrutura aberta de leitura (ORF) tendo uma sequência polinucleotidica que codifica o referido antigénio peptidico.
43. 43. 0 sistema de expressão, conforme reivindicado na

    reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o antigénio peptidico incluir uma porção imunoreactiva de uma sequência polipeptidica de HCV que: a) é codificada por uma sequência codificante de HCV; b) tem 504 residuos de aminoácidos; e

    c) tem a sequência carboxi-terminal apresentada como SEQ ID NO:4; e em que a sequência aminoacidica carboxi-terminal do referido antigénio peptidico é codificada pela sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO:3.
44. 44. Um sistema de expressão, conforme reivindicado na reivindicação 43, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser o vector fago lambda gtll, de o hospedeiro ser a E. coli, e sendo o hospedeiro, contendo o vector introduzido, identificado por ATCC No. 40901.
45. 45. Um sistema de expressão, conforme reivindicado na reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o antigênio peptidico ter a sequência apresentada como SEQ ID NO:2 e tendo o polinucleótido a sequência apresentada como SEQ ID NO:1.
46. 46. Um sistema de expressão, conforme reivindicado na reivindicação 45, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser o vector fago lambda gtll, de o hospedeiro ser a E. coli, e sendo o hospedeiro contendo o vector introduzido identificado por ATCC No. 40893.
47. 47. Um sistema de expressão, conforme reivindicado na reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o antigênio peptidico ter a sequência apresentada como SEQ ID NO:8 e tendo o polinucleótido a sequência apresentada como SEQ ID NO:7.
48. 48. Um sistema de expressão, conforme reivindicado na reivindicação 47, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser o vector fago lambda gtll, de o hospedeiro ser a E. coli, e sendo o hospedeiro, contendo o vector introduzido, identificado por ATCC No. 40792.
49. 49. Um sistema de expressão, conforme reivindicado na reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o antigênio peptidico ter a sequência apresentada como SEQ ID NO:10, e o polinucleótido ter a sequência apresentada como SEQ ID NO:9.
50. 50. Um sistema de expressão, conforme reivindicado na reivindicação 49, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser um vector fago lambda gtll, de o hospedeiro ser a E. coli, e sendo o hospedeiro, contendo o vector introduzido, identificado por ATCC No. 40876.
51. 51. Um sistema de expressão, conforme reivindicado na reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o polipéptido incluir uma porção imunoreactiva de uma sequência peptídica seleccionada do grupo constituído pelas sequências peptidicas apresentadas como SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 e SEQ ID

    NO:26.
52. 52. Um sistema de expressão, conforme reivindicado na reivindicação 51, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser um vector pGEX ou pET e sendo o hospedeiro uma E.

    coli.
53. 53. Um processo para a preparação de um polinucleótido, caracterizado pelo facto de o polinucleótido codificar um polipéptido que é imunoreactivo com soro humano infectado com virus da hepatite C (HCV).
54. 54. Um processo para a preparação de polinucleótido, conforme reivindicado na reivindicação 53, caracterizado pelo facto de o polipéptido incluir uma porção imunoreactiva de uma

    a) é codificada por uma sequência HCV codificante;

    sequência peptidica que:

    b) tem 504 residuos de aminoácidos; e

    c) tem a sequência carboxi-terminal apresentada como

    SEQ ID NO:4; e onde a sequência aminoacidica carboxi-terminal do referido antigénio peptidico é codificada pela sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO:3.
55. 55. Um processo para a preparação de um polinucleótido, conforme reivindicado na reivindicação 53, caracterizado pelo facto de incluir a sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO:1.
56. 56. Um processo para a preparação de um polinucleótido, conforme reivindicado na reivindicação 53, caracterizado pelo facto de incluir a sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO:9.
57. 57. Um processo para a preparação de um polinucleótido, conforme reivindicado na reivindicação 53, caracterizado pelo facto de incluir a sequência polinucleotidica seleccionada do grupo de sequências polinucleotidicas apresentadas como SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19,