JP7186400B2 - ゲノム的に再コードした生物におけるセレノ－生物製剤の製造 - Google Patents

Description

本出願は、２０１６年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／３８１，３１６号、及び、２０１７年７月２８日に出願された同第６２／５３７，９８６号の利益を主張するものであり、それら出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。

ファイル名称「ＵＴＦＢ＿Ｐ１１７４ＷＯ．ｔｘｔ」で格納され、（マイクロソフトウィンドウズ（登録商標）で測定した）３３０５ＫＢであり、かつ、２０１７年８月３０日に作成をした配列表を、本明細書と共に電子的に提出をするものであり、そして、その内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。

本発明は、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｎａｖａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈが付与した認可番号第ＦＡ９５５０－１０－１－０１６９号、及び、ｔｈｅ Ｓｐａｃｅ ａｎｄ Ｎａｖａｌ Ｗａｒｆａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐａｃｉｆｉｃが付与した認可番号第Ｎ６６００１－１４－２－４０５１号で特定される政府支援の下で完成をした。わが国の政府は、本発明において、一定の権利を有する。

本発明は、タンパク質生物製剤の分野に関する。特に、本発明は、有益な特性を有するタンパク質生物製剤を製造する方法に関する。

モノクローナル抗体、タンパク質治療薬、及び、ワクチンを含むタンパク質生物製剤は、がん、感染症、ならびに、免疫疾患、及び、その他の疾患に対する有効な治療法であり、数１０億ドル規模の市場を形成している。しかし、ほとんどの生物製剤は、微生物細胞では形成できない化学結合、すなわち、ジスルフィド類によって安定化されているため、大部分が高価な哺乳類細胞系で製造しなければならない。さらに、ジスルフィド結合は、化学的な還元を受けやすいため、血清や細胞内などの環境では切断される可能性があるので、多くの生物製剤の半減期を短くする。

大多数の生物製剤、すなわち、９８％の治療用モノクローナル抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物系で製造される。ＣＨＯ細胞は、ヒト様グリコシル化を生じるという利点を有しており、また、ジスルフィドを担持したタンパク質を高収率で製造するために必要な折り畳みシャペロンと酸化還元機構とを有している。しかしながら、ＣＨＯ細胞は、微生物施設よりも多額の設備投資を実質的に必要としており、製造期間の長期化（数日に対して数週間～数ヶ月）を招き、消耗品（例えば、培地）の費用が何倍にも高騰し、さらには、内因性レトロウイルス様粒子を除去するための追加の精製工程を必要とする。

細菌においてジスルフィドを担持した生物製剤を製造する２つの既存のアプローチがある。第１は、細胞内の化学的環境を変化させて、酸化させ、ジスルフィド形成を許容させることであるが、この変化は、中枢代謝に劇的な影響を及ぼすものであり、また、タンパク質の生産だけでなく発酵性能をも損ない得る。第２のアプローチは、ペリプラズムと呼ばれる小さな酸化コンパートメントに対して新生の生物製剤を分泌することである。このアプローチでは、分泌過程でのエネルギー損失が故に収率が低くなり、また、凝集によって、産物の損失にも影響が非常に及びやすくなる。これらの不都合が故に、いずれのアプローチも、ジスルフィドを担持した生物製剤の大規模生産に一般的に使われることはなく、高価な哺乳類バイオプロセスが幅をきかせている。重要なことに、いずれのアプローチも、ジスルフィド結合が、細胞質または血液などの環境における還元剤に対して敏感である、という本質的な問題は解決していない。

当該技術分野において、費用対効果の高い方法でタンパク質生物製剤を製造する方法が依然として待望されている。当該技術分野において、血液及び細胞質での安定なタンパク質生物製剤の製造方法が依然として待望されている。

本発明のある態様では、少なくとも２つのセレノシステイン残基を含むタンパク質であって、少なくとも２つの当該セレノシステイン残基の間に少なくとも１つのジセレニド結合を有するタンパク質を提供する。当該タンパク質は、配列番号１～１６３１、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む。当該タンパク質は、配列番号１～１６３０、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含み得る。当該タンパク質は、配列番号１６３１の配列と、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列とを含み得る。

本発明の別の態様では、（ｉ）配列番号４７２～８０１、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される重鎖配列、ならびに、（ｉｉ）配列番号８１２～１１３１、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される軽鎖配列を含む抗体分子を提供する。当該抗体分子での０～十五対のセレノシステイン残基が、０～十五対のシステイン残基と置換される。当該抗体は、当該重鎖と当該軽鎖との間に少なくとも１つのジセレニド結合を含み得る。当該抗体は、当該重鎖内、及び／または、当該軽鎖内に少なくとも１つの鎖内ジセレニド結合を含み得る。

本発明のさらに別の態様では、修飾インスリンタンパク質を提供する。同タンパク質は、（ｉ）配列番号１１４２、１１４４、１１４６、１１４８、１１５０、１１５２、及び、１１５４、ならびに、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列から選択される配列を有するＡ鎖、ならびに、（ｉｉ）配列番号１１４３、１１４５、１１４７、１１４９、１１５１、１１５３、及び、１１５５、ならびに、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列から選択される配列を有するＢ鎖を含む。当該タンパク質は、当該Ａ鎖と当該Ｂ鎖との間に少なくとも１つのジセレニド結合を含む。

本発明の１つの態様では、割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるように、ゲノム的に再コード化した細菌宿主を提供する。当該細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていない当該コドンで置き換えられているタンパク質の変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含む。当該変異型は、配列番号１～１６３１、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む。当該変異型は、配列番号１～１６３０、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含み得る。当該変異型は、配列番号１６３１の配列、及び、当該配列と少なくとも８０％同一の配列を含み得る。

本発明の別の態様では、細菌宿主を提供する。当該細菌宿主は、割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるように、ゲノム的に再コードしている。当該細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていないコドンで置換されているモノクローナル抗体の変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含む。当該モノクローナル抗体は、ＶＬ鎖を含んでおり、そして、当該ＶＬ鎖の第２３位と第８８位は、セレノシステイン残基で置換されている。当該モノクローナル抗体は、ＶＨ鎖を含んでおり、そして、当該ＶＨ鎖の第２２位と第９２位は、セレノシステイン残基で置換されている。

本発明のさらに別の態様では、タンパク質の変異型を製造する方法を提供する。当該タンパク質は、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、また、当該変異型は、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有する。割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるようにゲノム的に再コードしている細菌宿主を培養する。当該細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていない当該コドンで置換されているタンパク質の変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含む。当該培養は、当該タンパク質の当該変異型を発現する条件下で行う。当該変異型は、配列番号１～１６３１、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む。当該変異型は、配列番号１～１６３０、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含み得る。当該変異型は、配列番号１６３１の配列と、当該配列と少なくとも８０％同一の配列とを含み得る。

本発明の１つの態様では、モノクローナル抗体の変異型を製造する方法を提供する。当該モノクローナル抗体は、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、そして、当該変異型は、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有する。割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるようにゲノム的に再コードしている細菌宿主を培養する。当該細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていないコドンで置換されている当該モノクローナル抗体の当該変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含む。当該培養は、当該モノクローナル抗体の当該変異型を発現する条件下で行う。当該モノクローナル抗体は、ＶＬ鎖を含んでおり、そして、ＶＬ鎖の第２３位と第８８位は、セレノシステイン残基で置換されている。当該モノクローナル抗体は、ＶＨ鎖を含んでおり、そして、当該ＶＨ鎖の第２２位と第９２位は、セレノシステイン残基で置換されている。

本発明の別の態様では、タンパク質の変異型で哺乳動物を処置する方法を提供する。当該タンパク質の当該変異型を、当該哺乳動物に投与する。当該タンパク質は、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有する。当該変異型は、システイン残基同士の間のジスルフィド結合の代わりに、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有する。当該変異型は、配列番号１～１６３１、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む。当該変異型は、配列番号１～１６３０、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含み得る。当該変異型は、配列番号１６３１の配列と、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列を含み得る。

本発明のさらに別の態様では、モノクローナル抗体の変異型で哺乳動物を治療する方法を提供する。当該モノクローナル抗体の当該変異型を、当該哺乳動物に投与する。当該モノクローナル抗体は、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、そして、当該変異型は、システイン残基間のジスルフィド結合の代わりにセレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有する。当該モノクローナル抗体は、ＶＬ鎖を含んでおり、そして、当該ＶＬ鎖の第２３位と第８８位は、セレノシステイン残基で置換されている。当該モノクローナル抗体は、ＶＨ鎖を含んでおり、そして、当該ＶＨ鎖の第２２位と第９２位は、セレノシステイン残基で置換されている。

本発明の１つの態様では、構築された核酸分子とｔＲＮＡ分子とを含むインビトロ翻訳系を提供する。当該構築された核酸分子は、一対のシステイン残基が、一対のセレノシステイン残基と置換されているタンパク質の変異型をコードする。当該変異型は、配列番号１～１６３１、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む。当該変異型は、配列番号１～１６３０、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含み得る。当該変異型は、配列番号１６３１の配列と、当該配列と少なくとも８０％同一の配列とを含み得る。当該核酸分子は、割り当てがされていないコドンを含むか、または、同族コドン抑制を利用して、セレノシステイン（複数可）を成長しているポリペプチドに取り込む。当該ｔＲＮＡ分子は、割り当てがされていない当該コドンに対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡである。

本発明の他の態様では、構築された核酸分子、及び、ｔＲＮＡ分子を含むインビトロ翻訳系を提供する。当該構築された核酸分子は、ＶＬ鎖を含むモノクローナル抗体の変異型をコードする。当該ＶＬ鎖の第２３位と第８８位は、セレノシステイン残基で置換されている。当該モノクローナル抗体は、ＶＨ鎖を含んでおり、当該ＶＨ鎖の第２２位と第９２位は、セレノシステイン残基で置換されている。当該構築された核酸分子は、当該核酸において割り当てがされていないコドンと置換している少なくとも一対のシステインコドンを含む。当該ｔＲＮＡ分子は、割り当てがされていない当該コドンに相補的なアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡである。

本発明のさらに別の態様では、タンパク質の変異型を製造するための方法を提供する。当該タンパク質は、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、当該変異型は、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有する。当該タンパク質の当該変異型をコードする構築された核酸配列を翻訳する。当該構築された核酸配列は、割り当てがされていないコドンと置換している一対のシステインコドンを含む。当該変異型は、配列番号１～１６３１、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む。当該変異型は、配列番号１～１６３０、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含み得る。当該変異型は、配列番号１６３１の配列と、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列とを含み得る。当該翻訳の工程は、割り当てがされていない当該コドンに対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡを使用する。

本発明の１つの態様では、試料を試験する方法を提供する。試料を、タンパク質の変異型と接触させて、反応混合物を形成する。当該タンパク質は、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有する。当該変異型は、システイン残基同士の間のジスルフィド結合の代わりに、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有する。当該変異型は、配列番号１～１６３１、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む。当該変異型は、配列番号１～１６３０、及び、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含み得る。当該変異型は、配列番号１６３１の配列と、当該配列と少なくとも８０％が同一である配列とを含み得る。当該反応混合物を試験して、当該タンパク質の当該変異型に結合した特異的結合パートナーを検出する。

本発明の別の態様では、試料を試験するための方法を提供する。試料を、モノクローナル抗体の変異型と接触させて、反応混合物を形成する。当該モノクローナル抗体は、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有する。当該変異型は、システイン残基同士の間のジスルフィド結合の代わりに、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有する。当該モノクローナル抗体は、ＶＬ鎖を含んでおり、そして、当該ＶＬ鎖の第２３位と第８８位は、セレノシステイン残基で置換されている。当該モノクローナル抗体は、ＶＨ鎖を含んでおり、そして、当該ＶＨ鎖の第２２位と第９２位は、セレノシステイン残基で置換されている。当該反応混合物を試験して、当該タンパク質の当該変異型に結合した特異的結合パートナーを検出する。

本発明のさらに別の態様では、修飾抗体を提供する。同修飾抗体は、少なくとも１つのジセレニド結合を含む。

本発明の１つの態様では、修飾インスリンタンパク質を提供する。同修飾インスリンタンパク質は、セレノシステインに置換する少なくとも１つのシステインを有する配列番号１６３０の残基９０～１１０を有するＡ鎖、セレノシステインに置換する少なくとも１つのシステインを有する配列番号１６３０の残基２５～５４を有するＢ鎖、及び、当該Ａ鎖と当該Ｂ鎖との間の少なくとも１つのジセレニド架橋を含む。

本発明の別の態様は、天然のヒトインスリンタンパク質にある２つのシステイン残基を置換する少なくとも２つのセレノシステイン残基を含む修飾ヒトインスリンタンパク質である。同タンパク質は、少なくとも２つの当該セレノシステイン残基の間に少なくとも１つのジセレニド結合を有する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
少なくとも２つのセレノシステイン残基を含むタンパク質であって、少なくとも２つの前記セレノシステイン残基の間に少なくとも１つのジセレニド結合を有しており、前記タンパク質が、配列番号１～１６３０、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む前記タンパク質。
（項目２）
少なくとも２つのセレノシステイン残基を含むタンパク質であって、少なくとも２つの前記セレノシステイン残基の間に少なくとも１つのジセレニド結合を有しており、前記タンパク質が、配列番号１６３１の配列、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列を含む、項目１に記載のタンパク質。
（項目３）
配列番号４７２～８０１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される重鎖配列と、配列番号８１２～１１３１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される軽鎖配列とを含む抗体分子であって、前記抗体分子でのセレノシステイン残基の０～十五対が、０～十五対のシステイン残基で置換されており、かつ、前記抗体が、前記重鎖と前記軽鎖との間に少なくとも１つのジセレニド結合を含む、前記抗体分子。
（項目４）
配列番号１１４２、１１４４、１１４６、１１４８、１１５０、１１５２、及び、１１５４から選択される配列、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列を有するＡ鎖、配列番号１１４３、１１４５、１１４７、１１４９、１１５１、１１５３、及び、１１５５から選択される配列、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列を有するＢ鎖を含む修飾インスリンタンパク質であって、前記タンパク質が、前記Ａ鎖と前記Ｂ鎖との間に少なくとも１つのジセレニド結合を含む、前記修飾インスリンタンパク質。
（項目５）
割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるようにゲノム的に再コードした細菌宿主であって、前記細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていない前記コドンで置換されたタンパク質の変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含み、前記変異型は、配列番号１～１６３０、及び、前記前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む、前記細菌宿主。
（項目６）
割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるようにゲノム的に再コードした細菌宿主であって、前記細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていない前記コドンで置換されたタンパク質の変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含み、前記変異型は、配列番号１６３１の配列、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列を含む、項目５に記載の前記細菌宿主。
（項目７）
前記変異型が、モノクローナル抗体である、項目５または６に記載の細菌宿主。
（項目８）
前記モノクローナル抗体が、配列番号４７２～８０１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される重鎖配列を含む、項目７に記載の細菌宿主。
（項目９）
前記モノクローナル抗体が、配列番号８１２～１１３１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される軽鎖配列を含む、項目７に記載の細菌宿主。
（項目１０）
前記モノクローナル抗体が、配列番号１６～２４３、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、項目７に記載の細菌宿主。
（項目１１）
前記モノクローナル抗体が、配列番号２４４～４７１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を含む、項目７に記載の細菌宿主。
（項目１２）
前記モノクローナル抗体が、配列番号１～１５、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される定常鎖配列をさらに含む、項目１０または１１に記載の細菌宿主。
（項目１３）
前記変異型が、治療用タンパク質である、項目５または６に記載の細菌宿主。
（項目１４）
前記変異型が、予防用タンパク質である、項目５または６に記載の細菌宿主。
（項目１５）
割り当てがされていない前記コドンが、ＵＡＧである、項目５または６に記載の細菌宿主。
（項目１６）
割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるようにゲノム的に再コードした細菌宿主であって、前記細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていない前記コドンで置換されたモノクローナル抗体の変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含み、前記モノクローナル抗体は、ＶＬ鎖を含んでおり、かつ、前記ＶＬ鎖の第２３位と第８８位が、セレノシステイン残基で置換されており、及び、前記モノクローナル抗体は、ＶＨ鎖を含んでおり、かつ、前記ＶＨ鎖の第２２位と第９２位が、セレノシステイン残基で置換されている、前記細菌宿主。
（項目１７）
割り当てがされていない前記コドンが、ＵＡＧである、項目１６に記載の細菌宿主。
（項目１８）
タンパク質の変異型を製造する方法であって、前記タンパク質が、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型が、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記方法は、
割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるように、ゲノム的に再コードした細菌宿主を培養することを含み、前記細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていない前記コドンで置換されている前記タンパク質の変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含み、前記培養は、前記タンパク質の変異型が発現される条件下であり、前記変異型は、配列番号１～１６３０、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む、前記方法。
（項目１９）
タンパク質の変異型を製造する項目１８に記載の方法であって、前記タンパク質が、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型が、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記方法は、
割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるように、ゲノム的に再コードした細菌宿主を培養することを含み、前記細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていない前記コドンで置換されている前記タンパク質の変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含み、前記培養は、前記タンパク質の変異型が発現される条件下であり、前記変異型は、配列番号１６３１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列を含む、項目１８に記載
の方法。
（項目２０）
培地または前記細菌宿主の細胞に由来する前記タンパク質の前記変異型を回収する工程をさらに含む、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記変異型が、モノクローナル抗体である、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２２）
前記モノクローナル抗体が、配列番号４７２～８０１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される重鎖配列を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記モノクローナル抗体が、配列番号８１２～１１３１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される軽鎖配列を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記モノクローナル抗体が、配列番号１６～２４３、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記モノクローナル抗体が、配列番号２４４～４７１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記モノクローナル抗体が、配列番号１～１５、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される定常鎖配列をさらに含む、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
前記変異型が、治療用タンパク質である、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２８）
前記変異型が、予防用タンパク質である、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２９）
割り当てがされていない前記コドンが、ＵＡＧである、項目１８または１９に記載の方法。
（項目３０）
モノクローナル抗体の変異型を製造する方法であって、前記モノクローナル抗体が、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型が、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記方法は、
割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるように、ゲノム的に再コードした細菌宿主を培養することを含み、前記細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていない前記コドンで置換されている前記モノクローナル抗体の変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含み、前記培養は、前記モノクローナル抗体の変異型が発現される条件下であり、前記モノクローナル抗体は、ＶＬ鎖を含んでおり、かつ、前記ＶＬ鎖の第２３位と第８８位が、セレノシステイン残基で置換されており、及び、前記モノクローナル抗体は、ＶＨ鎖を含んでおり、かつ、前記ＶＨ鎖の第２２位と第９２位が、セレノシステイン残基で置換されている、前記方法。
（項目３１）
割り当てがされていない前記コドンが、ＵＡＧである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
タンパク質の変異型で哺乳動物を処置する方法であって、
前記タンパク質の前記変異型を前記哺乳動物に投与する工程を含み、前記タンパク質は、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型は、システイン残基同士の間の前記ジスルフィド結合の代わりにセレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記変異型は、配列番号１～１６３０、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群より選択される配列を含む、前記方法。
（項目３３）
タンパク質の変異型で哺乳動物を処置する項目３２に記載の方法であって、
前記タンパク質の前記変異型を前記哺乳動物に投与する工程を含み、前記タンパク質は、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型は、システイン残基同士の間の前記ジスルフィド結合の代わりにセレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記変異型は、配列番号１６３１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記投与が、静脈内投与である、項目３２または３３に記載の方法。
（項目３５）
前記タンパク質が、モノクローナル抗体である、項目３２または３３に記載の方法。
（項目３６）
前記タンパク質が、治療用タンパク質である、項目３２または３３に記載の方法。
（項目３７）
前記タンパク質が、予防用タンパク質である、項目３２または３３に記載の方法。
（項目３８）
モノクローナル抗体の変異型で哺乳動物を処置する方法であって、
前記モノクローナル抗体の前記変異型を前記哺乳動物に投与する工程を含み、前記モノクローナル抗体は、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型は、システイン残基同士の間の前記ジスルフィド結合の代わりにセレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記モノクローナル抗体は、ＶＬ鎖を含んでおり、かつ、前記ＶＬ鎖の第２３位と第８８位が、セレノシステイン残基で置換されており、及び、前記モノクローナル抗体は、ＶＨ鎖を含んでおり、かつ、前記ＶＨ鎖の第２２位と第９２位が、セレノシステイン残基で置換されている、前記方法。
（項目３９）
前記抗体分子での少なくとも一対のセレノシステイン残基が、一対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体。
（項目４０）
前記抗体分子での一対のセレノシステイン残基が、一対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目４１）
前記抗体分子での二対のセレノシステイン残基が、二対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目４２）
前記抗体分子での三対のセレノシステイン残基が、三対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目４３）
前記抗体分子での四対のセレノシステイン残基が、四対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目４４）
前記抗体分子での五対のセレノシステイン残基が、五対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目４５）
前記抗体分子での六対のセレノシステイン残基が、六対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目４６）
前記抗体分子での七対のセレノシステイン残基が、七対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目４７）
前記抗体分子での八対のセレノシステイン残基が、八対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目４８）
前記抗体分子での九対のセレノシステイン残基が、九対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目４９）
前記抗体分子での十対のセレノシステイン残基が、十対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目５０）
前記抗体分子での十一対のセレノシステイン残基が、十一対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目５１）
前記抗体分子での十二対のセレノシステイン残基が、十二対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目５２）
前記抗体分子での十三対のセレノシステイン残基が、十三対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目５３）
前記抗体分子での十四対のセレノシステイン残基が、十四対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目５４）
前記抗体分子での十五対のセレノシステイン残基が、十五対のシステイン残基で置換されている、項目３に記載の抗体分子。
（項目５５）
構築された核酸分子とｔＲＮＡ分子とを含むインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系であって、構築された前記核酸分子が、一対のシステイン残基が一対のシステイン残基で置換されたタンパク質の変異型をコードし、前記変異型が、配列番号１～１６３１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含み、前記核酸分子が、割り当てがされていないコドンドンを含み、あるいは、同族コドン抑制を利用して、セレノシステイン残基を取り込み、前記ｔＲＮＡ分子は、割り当てがされていない前記コドンに対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡである、前記インビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目５６）
前記変異型が、モノクローナル抗体である、項目５５に記載のインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目５７）
前記モノクローナル抗体が、配列番号４７２～８０１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される重鎖配列を含む、項目５５に記載のインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目５８）
前記モノクローナル抗体が、配列番号８１２～１１３１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される軽鎖配列を含む、項目５５に記載のインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目５９）
前記モノクローナル抗体が、配列番号１６～２４３、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、項目５５に記
載のインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目６０）
前記モノクローナル抗体が、配列番号２４４～４７１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を含む、項目５５に記載のインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目６１）
前記モノクローナル抗体が、配列番号１～１５、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される定常鎖配列をさらに含む、項目５５に記載のインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目６２）
前記変異型が、治療用タンパク質である、項目５５に記載のインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目６３）
前記変異型が、予防用タンパク質である、項目５５に記載のインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目６４）
割り当てがされていない前記コドンが、ＵＡＧである、項目５５に記載のインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目６５）
構築された核酸分子とｔＲＮＡ分子とを含むインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系であって、前記構築された核酸分子が、モノクローナル抗体の変異型をコードするものであって、同モノクローナル抗体は、ＶＬ鎖を含んでおり、かつ、前記ＶＬ鎖の第２３位と第８８位はセレノシステイン残基で置換されており、そして、前記モノクローナル抗体はＶＨ鎖を含んでおり、かつ、前記ＶＨ鎖の第２２位と第９２位はセレノシステイン残基で置換されており、前記構築された核酸分子は、前記核酸分子において割り当てがされていないコドンと置換された少なくとも一対のシステインコドンを含み、前記ｔＲＮＡ分子は、割り当てがされていない前記コドンに相補的なアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡである、前記インビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目６６）
割り当てがされていない前記コドンが、ＵＡＧである、項目６５に記載のインビトロ翻訳系またはインビトロ転写及び翻訳系。
（項目６７）
タンパク質の変異型を製造する方法であって、前記タンパク質が、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型が、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記方法は、
前記タンパク質の前記変異型をコードする構築された核酸配列をインビトロで翻訳することを含み、前記構築された核酸配列において、一対のシステインコドンが、割り当てがされていないコドンで置換されており、前記変異型は、配列番号１～１６３０、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含み、前記翻訳の工程が、割り当てがされていない前記コドンに対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡを使用する、前記方法。
（項目６８）
タンパク質の変異型を製造する項目６７に記載の方法であって、前記タンパク質が、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型が、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記方法は、
前記タンパク質の前記変異型をコードする構築された核酸配列をインビトロで翻訳することを含み、前記構築された核酸配列において、一対のシステインコドンが、割り当てがされていないコドンで置換されており、前記変異型は、配列番号１６３１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含み、前記翻訳の工程が、割り当てがされていない前記コドンに対応するアンチコドンを有するセレノシ
ステインｔＲＮＡを使用する、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記変異型が、モノクローナル抗体である、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７０）
前記モノクローナル抗体が、配列番号４７２～８０１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される重鎖配列を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記モノクローナル抗体が、配列番号８１２～１１３１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される軽鎖配列を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記モノクローナル抗体が、配列番号１６～２４３、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７３）
前記モノクローナル抗体が、配列番号２４４～４７１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７４）
前記モノクローナル抗体が、配列番号１～１５、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される定常鎖配列をさらに含む、項目７２または７３に記載の方法。
（項目７５）
前記変異型が、治療用タンパク質である、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７６）
前記変異型が、予防用タンパク質である、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７７）
割り当てがされていない前記コドンが、ＵＡＧである、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７８）
試料を試験する方法であって、
試料を、タンパク質の変異型と接触させて反応混合物を形成する工程であって、前記タンパク質が、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型が、システイン残基同士の間の前記ジスルフィド結合の代わりに、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記変異型は、配列番号１～１６３０、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列からなる群から選択される配列を含む、前記工程、及び
前記反応混合物を試験して、前記タンパク質の前記変異型に結合した特異的結合パートナーを検出する工程、
を含む前記方法。
（項目７９）
試料を試験する項目７８に記載の方法が、
試料を、タンパク質の変異型と接触させて反応混合物を形成する工程であって、前記タンパク質が、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型が、システイン残基同士の間の前記ジスルフィド結合の代わりに、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記変異型は、配列番号１６３１、及び、前記配列と少なくとも８０％が同一である配列を含む、前記工程、及び
前記反応混合物を試験して、前記タンパク質の前記変異型に結合した特異的結合パートナーを検出する工程、
を含む項目７８に記載の方法。
（項目８０）
試料を試験する方法であって、
試料を、モノクローナル抗体の変異型と接触させて反応混合物を形成する工程であって、前記モノクローナル抗体が、システイン残基同士の間にジスルフィド結合を有しており、前記変異型が、システイン残基同士の間の前記ジスルフィド結合の代わりに、セレノシステイン残基同士の間にジセレニド結合を有しており、前記モノクローナル抗体は、ＶＬ鎖を含んでおり、かつ、前記ＶＬ鎖の第２３位と第８８位はセレノシステイン残基で置換されており、そして、前記モノクローナル抗体はＶＨ鎖を含んでおり、かつ、前記ＶＨ鎖の第２２位と第９２位はセレノシステイン残基で置換されている、前記工程、及び
前記反応混合物を試験して、前記タンパク質の前記変異型に結合した特異的結合パートナーを検出する工程、
を含む前記方法。
（項目８１）
少なくとも１つのジセレニド結合を含む修飾抗体。
（項目８２）
前記ジセレニド結合が、存在する特異性が同じ抗体でのジスルフィド結合の位置にある、項目８１に記載の修飾抗体。
（項目８３）
前記ジセレニド結合が、分子間である、項目８１に記載の修飾抗体。
（項目８４）
ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及び、ＩｇＭからなる群から選択されるアイソタイプから選択される、項目８１に記載の修飾抗体。
（項目８５）
セレノシステインに置換する少なくとも１つのシステインを有する配列番号１６３０の残基９０～１１０を有するＡ鎖、セレノシステインに置換する少なくとも１つのシステインを有する配列番号１６３０の残基２５～５４を有するＢ鎖、及び、前記Ａ鎖と前記Ｂ鎖との間にある少なくとも１つのジセレニド結合を含む、修飾インスリンタンパク質。
（項目８６）
天然のヒトインスリンタンパク質にある２つのシステイン残基を置換する少なくとも２つのセレノシステイン残基を含み、少なくとも２つの前記セレノシステイン残基の間に少なくとも１つのジセレニド結合を有する、修飾ヒトインスリンタンパク質。
（項目８７）
組換え細菌において製造される、項目８６に記載の修飾ヒトインスリンタンパク質。
（項目８８）
セレノシステインｔＲＮＡが、前記細菌のアンバーコドンを認識するように前記組換え細菌が再コードされる、項目８７に記載の修飾ヒトインスリンタンパク質。

本明細書に接した当業者には自明であろうこれらの態様、及び、その他の態様は、ヒト及び動物の疾患の処置のための、ならびに、治療薬、診断薬、検査薬、及び、予防薬を製造及び使用するための方法及び産物を、当該技術分野に提供をする。

ジセレニド結合とジスルフィド結合との特性の比較を示す。 ジセレニド生物製剤が、ジスルフィド類よりも、血清における半減期を劇的に改善することを示す。 Ａ～Ｂは、ノイズを除去した質量スペクトルを拡大したもの（図３Ａ）と、１０μＭの抗－ＭＳ２ ｓｃＦｖの断片シーケンスマップ（図３Ｂ）とを示す。断片スペクトルを、Ｓ／Ｎ閾値が３であるＸｔｒａｃｔを使用してノイズを除去し、そして、ＰｒｏＳｉｇｈｔ Ｌｉｔｅを使用して分析した。ジセレニド結合の形成は、マークしたセレノシステイン（Ｕ）残基同士の間の断片イオンの欠如として示される。セリン取り込みに対応する質量ピークは検出されなかった。 Ａ～Ｂは、ノイズを除去した質量スペクトルを拡大したもの（図３Ａ）と、１０μＭの抗－ＭＳ２ ｓｃＦｖの断片シーケンスマップ（図３Ｂ）とを示す。断片スペクトルを、Ｓ／Ｎ閾値が３であるＸｔｒａｃｔを使用してノイズを除去し、そして、ＰｒｏＳｉｇｈｔ Ｌｉｔｅを使用して分析した。ジセレニド結合の形成は、マークしたセレノシステイン（Ｕ）残基同士の間の断片イオンの欠如として示される。セリン取り込みに対応する質量ピークは検出されなかった。 ６つの異なるセレノ生物製剤についてのタンパク質発現を示す。当該ゲル上の配列１～６は、配列表の配列番号１６２０～１６２５に対応する。ジセレニド結合は、配列番号１６２０ ＳｅＣｙｓ２３－ＳｅＣｙｓ９７、及び、ＳｅＣｙｓ１３８－ＳｅＣｙｓ１９２、配列番号１６２１ ＳｅＣｙｓ２３－ＳｅＣｙｓ９７、ＳｅＣｙｓ１３８－ＳｅＣｙｓ１９２、ＳｅＣｙｓ２６７－ＳｅＣｙｓ３２７、及び、ＳｅＣｙｓ３７３－ＳｅＣｙｓ４３１、配列番号１６２２ ＳｅＣｙｓ２４－ＳｅＣｙｓ９８、配列番号１６２３ ＳｅＣｙｓ２４－ＳｅＣｙｓ９８、ＳｅＣｙｓ１６４－ＳｅＣｙｓ２２４、及び、ＳｅＣｙｓ２７０－ＳｅＣｙｓ３２８、配列番号１６２４ ＳｅＣｙｓ３２－ＳｅＣｙｓ９２、及び、ＳｅＣｙｓ１３８－ＳｅＣｙｓ１９６、ならびに、配列番号１６２５ ＳｅＣｙｓ４－ＳｅＣｙｓ２８、及び、ＳｅＣｙｓ８６－ＳｅＣｙｓ９２、にある。 ２つの異なるセレノ生物製剤についてのタンパク質発現を示す。当該ゲル上の配列７～８は、配列表の配列番号１６２６～１６２７に対応する。ジセレニド結合は、配列番号１６２６ ＳｅＣｙｓ１８３－ＳｅＣｙｓ１９０、ＳｅＣｙｓ２１０－ＳｅＣｙｓ２３４、及び、ＳｅＣｙｓ２９２－ＳｅＣｙｓ２９８、ならびに、配列番号１６２７ ＳｅＣｙｓ１８３－ＳｅＣｙｓ１９０、ＳｅＣｙｓ２３８－ＳｅＣｙｓ２９８、及び、ＳｅＣｙｓ３４４－ＳｅＣｙｓ４０２、にある。 ２つの異なるセレノ生物製剤についてのタンパク質発現を示す。当該ゲル上の配列９～１０は、配列表の配列番号１６２８～１６２９に対応する。ジセレニド結合は、配列番号１６２８ ＳｅＣｙｓ５４－ＳｅＣｙｓ１６６、及び、ＳｅＣｙｓ１８３－ＳｅＣｙｓ１９０、ならびに、配列番号１６２９ ＳｅＣｙｓ２４－ＳｅＣｙｓ８９、及び、ＳｅＣｙｓ１４９－ＳｅＣｙｓ２４４、にある。 Ａ～Ｂは、異なる酸化還元条件における、野生型（ジスルフィド）、及び、セレノ（ジセレニド）抗－ＲＣＡ ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡデータを示す。野生型（Ａ）、及び、セレノ（配列番号１６３１、Ｂ）－抗ＲＣＡ ｓｃＦｖを、０、１、１０、または、５０ｍＭのＤＴＴを含むＴＢＳ ｐＨ７．５で、１μＭに希釈し、そして、３７℃で、１６時間インキュベートした。リシンＡ－鎖（Ｓｉｇｍａ Ｌ９５１４）を、ＰＢＳで、１０μｇ／ｍＬに希釈し、４℃で、一晩、９６穴プレートに結合させた。コントロールプレートを、５％ｗ／ｖのスキムミルクを含有するＰＢＳで結合した。プレートを、ＰＢＳで洗浄し、そして、ＰＢＳ ５％ｗ／ｖスキムミルクで２時間ブロックした。ＤＴＴとのインキュベーションの後に、ｓｃＦｖを、５％ｗ／ｖスキムミルクと０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０とを含むＰＢＳで、０、０．２５、０．５、１、１．５、２、４、６、８、１０、１５、及び、２０ｎＭに希釈して、そして、２５℃で、２時間、４重に結合させた。二次抗体（抗－ポリヒスチジン－ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ Ａ７０５８）を、５％ｗ／ｖのスキムミルクと０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで、１／１０，０００に希釈し、そして、２５℃で、２時間、結合させた。プレートを、ＴＭＢと一種に、２５℃で、１０分間、撹拌しながらインキュベートし、そして、２Ｍ Ｈ _２ ＳＯ _４ を添加して発色を停止した。直ちに、吸光度を４５０ｎｍで測定した。すべての結合、ブロッキング、及び、酵素的工程を、４５０ｒｐｍで、オービタルシェーカーで行い、そして、すべての洗浄を、ＰＢＳ、または、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで行った。野生型抗－ＲＣＡ ｓｃＦｖのみが、１及び１０ｍＭのＤＴＴで実質的な結合の喪失を示しており、そして、セレノ－抗－ＲＣＡについては、ＷＴ ｓｃＦｖと比較して、結合の喪失は、すべての濃度で実質的に無効であった。 Ａ～Ｂは、２つの異なる生物製剤の野生型（ジスルフィド）、及び、セレノ（ジセレニド）変異体についての熱シフトデータを示す。精製した野生型及びセレノ（配列番号１１３２）ｈＧＨ（Ａ）、及び、野生型及びセレノ（配列番号１６２９）ハーセプチンｓｃＦｖ（Ｂ）の異なる還元条件における熱変性を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ リアルタイムＰＣＲシステムにおけるｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ色素を用いてモニターした。還元剤ＤＴＴを、５μｇのｈＧＨ－Ｃｙｓ／ＳｅＣｙｓ、及び、２μｇのハーセプチン ｓｃＦｖ－Ｃｙｓ／ＳｅＣｙｓに、０Ｍ及び１０ｍＭの濃度で三重に添加し、続いて、室温で、１０分間、インキュベートした。これらのタンパク質を、２５℃～９８℃まで、０．０３℃／秒の直線勾配で変性させた。融点（Ｔ_ｍ）を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ｄＦ／ｄＴの最小値を求めて決定した。ｈＧＨ試料（Ａ）は、ＤＴＴの双方の濃度で、単一の最小値を示した。ｈＧＨ－ＣｙｓのＴ_ｍは、ＤＴＴの不存在下での７７℃から、１０ｍＭのＤＴＴの存在下での６０℃まで低下した。このＳｅＣｙｓ変異体は、Ｃｙｓ変異体と比較して、還元条件下で顕著な安定化を示しており、ＤＴＴの不存在下で７５℃のＴ_ｍを、また、１０ｍＭのＤＴＴで６６℃のＴ_ｍを示した。ハーセプチン（Ｂ）について、当該Ｃｙｓ変異体は、双方の条件において、２つの最小のｄＦ／ｄＴを示した。１０ｍＭ ＤＴＴを添加すると、優勢なＴ_ｍ最小値は、高い方の温度（７０℃）の最小値から、低い方の温度（５８℃）にシフトした。対照的に、ハーセプチン－ＳｅＣｙｓは、双方のＤＴＴ濃度において、最小値を１つしか持っていなかった。やはり、このＳｅＣｙｓ変異体は、還元条件下で安定化を示し、Ｔ_ｍは、ＤＴＴ不存在下での６８℃から、１０ｍＭのＤＴＴで６４℃まで低下した。

配列表は、本出願の開示の一部を形成しており、そして、本開示の一部を構成するものとして援用する。

本発明者らは、ポリペプチド類、及び、セレノシステインアミノ酸同士の間のジセレニド結合によって安定化される生物製剤に折り畳まれるゲノム的に再コードした生物（ＧＲＯ）において、ポリペプチド類を製造するための方法を開発した。システインアミノ酸同士の間のジスルフィド結合は、約－２２０ｍＶの酸化還元電位を有するのに対して、ジセレニド結合は、約－３８０ｍＶの酸化還元電位を有する。細菌性サイトゾルは、一般的には、約－２８０～－３００ｍＶの酸化還元電位を有するので、ジスルフィド類ではなく、ジセレニド類は還元を回避して、当該サイトゾルで形成され、そして、存続する。ジセレニド類は、ジスルフィド類と同じ幾何学的結合角及びねじれ、ならびに、非常に類似した結合長を有するので、それらは、ポリペプチドの三次元構造を攪乱せずにポリペプチド類に置換され得る（図１）。さらに、血液などの意図したインビボ環境は、グルタチオン、アルブミン、及び、チオレドキシンなどの還元剤を含有するので、ポリペプチド類でのジスルフィド類を還元することができ、当該ポリペプチドの展開を招くこととなり、また、ジスルフィド類が複数ある場合には、間違ったシステインが互いに結合するように、当該ジスルフィド類を「処理する」のである。これらのいずれもが、当該ポリペプチドの意図した生物製剤的活性を無効にする。ジセレニド類の酸化還元電位が低いため、血清または精製した血清の還元成分に曝露した場合、それらは、還元に対して抵抗性を持つようになり（図２）、ジスルフィドを担持した対応物よりも長い血清半減期を得ることとなる（Ｍｕｔｔｅｎｈａｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）。

ジセレニドを形成するセレノシステインを担持したペプチド類は、固相ペプチド合成によってインビトロで製造し得る（Ａｒｍｉｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆａｖｉ－Ｈｅｍａｍｉ ｅｔ ａｌ．，）が、この工程は、治療適用、特に、タンパク質のために必要な収量に見合った規模にはできない。しかしながら、組換えセレノタンパク質のインビボでの生産は、セレノシステインがタンパク質中に出現し得る場所について、厳密な配列要件によって制限される。特に、セレノシステイン挿入配列（ＳＥＣＩＳ）エレメントは、特殊酵素（ｓｅｌＡ、ｓｅｌＤ）、ｔＲＮＡ（ｓｅｌＣ）、及び、伸長因子（ｓｅｌＢ）からなる内在性セレノシステイン翻訳機構を動員するために、セレノシステイン組込み部位でコードＤＮＡ配列に出現しなければならない。代わりに、本発明者らは、アンバーストップコドンなどの割り当てがされていないコドンを有する再コードしたＥ．ｃｏｌｉ株を、対応するＤＮＡコード配列にアンバー停止コドンを導入して、セレノシステインのポリペプチド類への標的配置を許容する、抗－アンバーアンチコドンを有する改変したセレノシステインｔＲＮＡと一緒に用いる。一般的には、再コードは、すべての天然に存在する割り当てがされていないコドンをゲノムからの除去、ならびに、割り当てがされていないコドンに関連する翻訳機構を除去または不活性化（例えば、アンバー、放出因子１を除去または不活性化）を伴う。修飾ｔＲＮＡは、内因性伸長因子ＥＦ－Ｔｕと相互作用する。当該技術分野で周知の通り、その他のコドン、一般的には稀なコドンを再コードすることができる。Ｏｓｔｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５３：８１９－８２２，２０１６を参照されたい。ｍＲＮＡでのコドン、及び、ｔＲＮＡでのアンチコドンは、一般的には、相補的塩基配列のトリプレットである。

再コードしたタンパク質は、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞などの細菌で、または、インビトロで、翻訳系、または、連鎖転写－翻訳系で合成し得る。そのような再コードしたタンパク質をコードする遺伝子またはｍＲＮＡは、天然には存在しておらず、かつ、天然に存在するコード配列の変異体である。

関連する配列表に示すタンパク質の多くは、ジスルフィド結合に関与するすべてのシステイン残基を、セレノシステイン残基で置換したものであるが、当該置換の利点を得るためにすべてのシステイン残基を置換する必要はない。１つのジセレニド結合でも、タンパク質の安定性を向上し得る。あらゆる数のジセレニド結合（セレノシステイン対）は、タンパク質のジスルフィド結合で置換され得る。タンパク質がＮ個のジスルフィド結合を有する場合、当該タンパク質は、Ｎ、Ｎ－１、Ｎ－２、Ｎ－３、Ｎ－４、....、１までの範囲で結合を有し得る。ジセレニド結合とジスルフィド類との組み合わせが異なるタンパク質は、配列番号１２２０～１６３１に示される。システインとセレノシステイン残基との間の結合、別名、セレニルスルフィドを形成することも可能である。この結合は、ジスルフィド（－２２０ｍＶ）よりも低い酸化還元電位（－２７０ｍＶ）を有するが、細菌細胞質（－２８０ｍＶ）よりは低くない。当該セレニルスルフィド結合は、特定の酸化還元環境における還元に対する耐性を高めるために使用され得る。単一のジスルフィドで結合されたシステインの代わりにセレノシステインを用いることで、あるいは、単一のジセレニドで結合されたセレノシステインの代わりにシステインを用いることで、本明細書に記載の方法を使用して、セレニルスルフィドは、ジセレニドの代わりに使用され得る。

置換したセレノシステインを有するジスルフィド安定化生物製剤の配列は、標準的な実験室用振とうフラスコで、ｍｇ／Ｌのスケールで、本発明者らの方法を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉのサイトゾルで製造され、そして、微生物発酵槽において、ｇ／Ｌ生産までスケール化され得る。これらの配列は、治療用タンパク質、ワクチン、及び、モノクローナル抗体、抗体断片、抗体コンジュゲート、及び、その他の免疫グロブリン様分子を含む。Ｆｖドメインは、あらゆるヒトＦｃドメインと組み合わせられ得る。さらに、可変軽鎖でのＫａｂａｔ番号付与法で第２３位と第８８位のシステインをセレノシステインで置換し、及び／または、可変重鎖でのＫａｂａｔ番号付与法で第２２位と第９２位のシステインをセレノシステインで置換することで、あらゆるＦｖドメインが製造され得る。免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及び、ＩｇＥ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び、ＩｇＧ４サブクラスを含む）は、代表的なクラスとして、これらの方法で製造され得るものであり、それらは、当業者に公知のＩｇκまたはλの定常軽鎖変異体のいずれかと組み合わせたあらゆる定常変異体を有する。開示した配列でのいずれのセレノシステインも、システインの存在が、当該ポリペプチドの発現、折り畳み、または、意図した機能を妨げない限りは、システインとして維持され得る。本発明者らは、抗体一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ、図３、６）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、図６）、ＰＤ－Ｌ１（図４）、ヒトＦｃの変異体（図４）、及び、ヒトＦｃの変異体に対するＰＤ－Ｌ１及びｈＧＨの融合（図４及び５）について意図したジセレニド結合に関与するセレノシステインの製造及び検証の方法を以下に開示するが、これらの方法は、モノクローナル抗体全体、その他の抗体断片、抗体コンジュゲート、その他の治療用タンパク質、及び、ワクチンにも適用する。

治療、診断、バイオセンシング、及び、予防のための生物製剤は、２つのセレノシステイン残基の間にジセレニド結合を有する本発明にしたがって作製及び使用され得る。この技術及び改変は、あらゆるタンパク質生物製剤に有用であり得、ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、図８）、抗体及び抗体断片（図７及び８）、サイトカイン、成長因子、構造タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌａｎｔｕｓ（商標）、Ｎｏｖｏｒａｐｉｄ（商標）、Ｈｕｍａｌｏｇ（商標）、Ｈｕｍｕｌｉｎ（商標）、Ｌｅｖｅｍｉｒ（商標）、Ａｐｉｄｒａ（商標）、及び、Ｔｒｅｓｉｂａ（商標）などのインスリン産物は、配列番号１１４２～１１５５に示すように、そのような修飾と共に有用であり得る。これらのインスリン産物のＡ鎖は、配列番号１１４２、１１４４、１１４６、１１４８、１１５０、１１５２、及び、１１５４に示されるように修飾され得る。これらのインスリン産物のＢ鎖は、配列番号１１４３、１１４５、１１４７、１１４９、１１５１、１１５３、及び、１１５５に示されるように修飾され得る。これらのジセレニド結合は、分子内または分子間であり得る。そのような修飾に適した追加のタンパク質は、プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、抗体ドメイン（複数可）に対するＰＤ－Ｌ１融合タンパク質、ＰＤ－Ｌ１の一部、例えば、抗体ドメイン（複数可）に対して融合した、または、融合していない結合ドメイン、抗体ドメイン（複数可）に対して融合した、または、融合していないヒト成長ホルモン、及び、ハーセプチン（図４～８）がある。これは、かように修飾が可能なタンパク質の完全なリストになることを意図するものではない。

特定の例示的なタンパク質は、本開示の一部を形成する配列表において特定の配列を用いて示されているが、これらの配列は、使用され、そして、完全に忠実に再現される必要はない。当該技術分野で公知の通り、対立遺伝子変異及び多型を含むタンパク質に対するわずかな修飾は、それらの使用及び機能にとって有害ではないタンパク質の部分において起こり得る。したがって、本発明の有用なタンパク質は、配列表に示される正確な配列を有していてもよく、あるいは、わずかに相違し得る。例えば、有用なタンパク質は、少なくとも９９パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９４パーセント、少なくとも９３パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９１パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも８９パーセント、少なくとも８８パーセント、少なくとも８７パーセント、少なくとも８６パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも８４パーセント、少なくとも８３パーセント、少なくとも８２パーセント、８１パーセント、または、少なくとも８０パーセントを同一とし得る。

本発明にしたがって製造することができるタンパク質は、目的が制限されていない。同タンパク質は、治療用タンパク質、予防用タンパク質（ワクチンなど）、酵素タンパク質、内分泌タンパク質、シグナル伝達タンパク質、足場タンパク質、診断用タンパク質、分析用タンパク質などであり得る。一般的に、ジセレニド結合は、還元剤の存在下で当該タンパク質をさらに安定化させる。

当該タンパク質は、宿主細胞内で、または、インビトロで、無細胞合成系で作製され得る。宿主細胞は、確実に再コード可能なあらゆるものとし得る。これらは、開発が十分に進んだ遺伝系を有する細菌細胞であり得、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉがある。また、その他の細菌種も、使用され得る。当該タンパク質を製造するための無細胞系は、共役転写／翻訳系、または、翻訳系のみであり得る。本発明の方法の重要な態様は、化学合成手段よりもむしろ、生物製剤合成の使用である。

再コードした細胞を構築された核酸配列を用いて培養することは、当該技術分野で公知のあらゆる手段で行われ得る。この培養は、振盪フラスコまたは発酵槽において、バッチ式または連続式であり得、あるいは、より大きな容器に収容した小さな粒子の固体表面などに固定化され得る。一般的には、当該培地は、Ｎａ_２ＳｅＯ_３などのセレン供給源を用いて補充される。当該技術分野で公知の通り、当該所望のタンパク質変異体の製造は、誘導物質または抑制物質の制御下であり得る。当該技術分野で公知のあらゆるかような系は、構築及びタンパク質生産の便宜のために選択され得る。

かような処置を必要とする対象への治療用、診断用、または、予防用タンパク質の投与は、当該技術分野において公知であり、かつ、タンパク質に適したあらゆる手段によるものであり得る。それらとしては、静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、経口、冠状動脈内、及び、頭蓋内送達があるが、これらに限定されない。安定性と標的とが故に、ある種のタンパク質は、ある種の送達に適している。治療用タンパク質の投与は、例えば、液体または固体である充填剤、希釈剤、賦形剤、緩衝剤、安定剤、または、封入材料などの１つ以上の医薬として許容される担体を含むことができる。

上記した開示は、本発明を概説するものである。本明細書で開示した参考文献のすべてを援用する、ことをここに明示する。専ら例示目的で本明細書に記載がされ、かつ、本発明の範囲の限定を意図していない以下の特定の例を参照することで、より確かな理解が得られる。

例１
ｓｃＦｖの発現及び精製
システインコドンの代わりにセレノシステインの取り込みを指示するＵＡＧコドンを有する抗－アルファＭＳ２ ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子を担持するプラスミドｐＡＣＹＣ－ＰｃａＵ－ａＭＳ２で形質転換したＲＴΔＡ ２Ｘ３１０Ｋ細胞を、１０００μｇ／ｍＬのカルベニシリン、１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、及び、２５μＭ Ｎａ_２ＳｅＯ_３を補充した１Ｌのテリフィック培地で、１／２５０に希釈し、そして、対数増殖期の中期に、３，４－ジヒドロキシ安息香酸（１ｍＭ）で誘導し、続いて、３７℃で、一晩、増殖させた。細胞を、８０００×ｇで、１０分間、遠心分離して回収し、そして、プロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリート、ミニＥＤＴＡ不含、Ｒｏｃｈｅ）、及び、リゾチーム（０．５ｍｇ．ｍＬ^－１）を含む２５ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、及び、１０％ グリセロール、ｐＨ８．０）で再懸濁した。穏やかに攪拌しながら、４℃で、２０分間インキュベートした後に、細胞を、超音波処理（Ｍｏｄｅｌ ５００、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）して溶解し、３５０００×ｇで、３０分間、遠心分離を３度行って浄化した。溶解物を、０．２μｍの膜を通して濾過し、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂及び重力流カラムを用いるＩＭＡＣで、タンパク質を回収した。溶出液を、３ｍＬに濃縮し、そして、ｐＨ７．５のＴＢＳに対して透析を行い、続いて、サイズ排除ＦＰＬＣで、見かけが均一になるまで精製した。有意な割合の試料が透析の際に沈殿し、そして、新たな割合の試料が、安定性の低い／可溶性の二量体の形態で存在した。可溶性ａＭＳ２セレノ－ｓｃＦｖモノマーの最終収量は、３ｍｇ／Ｌであった。

すべてのシステインコドンの代わりにセレノシステインの取り込みを指示するＵＡＧコドンを有する抗－ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子を担持するプラスミドｐＡＣＹＣ－ＴｅｔＯ－ａＴＮＦで形質転換したＲＴΔＡ ２Ｘ３１０Ｋ－Ｔ７細胞を、１０００μｇ／ｍＬのカルベニシリン、３３μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、及び、２５μＭ Ｎａ_２ＳｅＯ_３を補充した１Ｌのテリフィック培地で、１／２５０に希釈し、そして、対数増殖期の中期に、２００ｎｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリンで誘導し、続いて、３０℃で、一晩、増殖させた。細胞を回収し、前述のようにして、ＩＭＡＣで精製した。沈殿を減らすために、試料を大量（＞６ｍＬ）に透析した。タンパク質試料を、サイズ排除ＦＰＬＣ、あるいは、アニオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム）のいずれかで、均質になるまで精製した。抗－ＲＣＡ、抗－ＧＭ－ＣＳＦ、及び、抗－インターフェロンガンマセレノｓｃＦｖを、同じ手順で精製した。可溶性セレノ－ｓｃＦｖモノマーの最終収量は、０．５～１ｍｇ／Ｌの範囲であった。

例２
質量分析
インタクトなタンパク質試料を、前述の方法を用いて分析した。セレノタンパク質試料を、１０ｋＤａの分子量カットオフフィルターを用いて、ＬＣ－ＭＳグレードの水に緩衝液交換した。一旦、緩衝液交換が完了次第に、それらの試料を、メタノール／水／ギ酸（５０／４９／１）溶液で、２０μＭに希釈した。希釈した後に、タンパク質溶液を、エレクトロスプレーイオン化を介して、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、３μＬ．分^－１の速度で注入した。セレノシステインの取り込みを確認するために、インタクトなタンパク質質量分析を、２４０ｋの解像度で行い、そして、２０回のスキャンを平均した。当該タンパク質配列の特徴決定を、前述のように、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に接続された１９３ｎｍエキシマレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｉｎｃ．）を使用する紫外光解離（ＵＶＰＤ）で行った。各々のＵＶＰＤスペクトルについて、２．５ｍＪの２つのレーザーパルスを使用し、そして、２５０回のスキャンを平均した。Ｘｔｒａｃｔノイズ除去アルゴリズム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＭＳ１スペクトルのノイズを除去した。また、Ｘｔｒａｃｔを使用して、ＵＶＰＤマススペクトルのノイズを除去した後に、ＰｒｏｓｉｇｈｔＰＣ ３．０を使用して分析をした。４つの組み込み部位（ジセレニド結合の形成が故に、１個の水素原子の控除分を含む）で６１．９１４６ダルトンの修飾をセリン残基に付加して、セレノシステインを含有するタンパク質を検索した。組込み効率は、修飾したタンパク質ピークの面積を、修飾されていないタンパク質ピークと修飾したタンパク質ピークとの合計面積で割って算出した。各々のタンパク質に使用したピーク面積は、各同位体クラスターに由来する５つの最も豊富なピークの積分面積の合計であった。

例３
非標準アミノ酸を有するポリペプチドの発現に適したＵＡＧゲノム的に再コードした生物
ＵＡＧコドン翻訳機能が完全に除去されているゲノム的に再コードした生物（ＧＲＯ）を使用して、ＵＡＧに非標準アミノ酸（ＮＳＡＡ）を明確に組み込む。本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ｌａｊｏｉｅ，Ｍ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃａｌｌｙ ｒｅｃｏｄｅｄ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｅｘｐａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２，３５７－３６０，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ． １２４１４５９（２０１３）を参照されたい。ゲノム的に再コードした生物は、改めて割り当てをした１つ以上のトリプレットコドンを含んでおり、セレノシステインなどの非標準アミノ酸（ＮＳＡＡａ）の組み込みを容易にし得る。当業者に公知の方法を使用して、トリプレットコドンを改めて割り当てて、セレノシステインなどの非標準アミノ酸を組み込むことができる。本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ｌａｊｏｉｅ，Ｍ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｏｄｉｎｇ ｉｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２，３６１－３６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ． １２４１４６０（２０１３）を参照されたい。また、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ｔｈｙｅｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．， Ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｔＲＮＡ^Ｓｅｃ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ，ＪＡＣＳ １３７（１），４６－４９，（２０１５）も参照されたい。また、Ｏｓｔｒｏｖ，ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｓｉｇｎ， ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏｗａｒｄ ａ ５７－ｃｏｄｏｎ ｇｅｎｏｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，８１９－８２２，２０１６も参照されたい。あるいは、当業者に公知の方法を使用して、クワドラプレットコドンを用いて、非標準アミノ酸を組み込むことができる。本明細書の一部を構成するものとしてそれらの各々の全内容を援用する、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｃｏｄｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０１， ７５６６－７５７１， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０４０１５１７１０１（２００４）， Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｋ．，Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｇａｒｃｉａ－Ａｌａｉ，Ｍ．＆ Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｖｉａ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ－ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，４４１－４４４,（２０１０）、及び、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ａ．，Ｌａｊｏｉｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｘｉａｏ，Ｈ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ａ Ｕｎｉｑｕｅ Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ Ｃｏｄｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｙｉｎｇ Ｎｏｎ－Ｎａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，ｎ／ａ－ｎ／ａ，ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１４０２１０４（２０１４）を参照されたい。非機能的なＵＡＧトリプレットに基づいて、クワドラプレットＵＡＧＡコドンを特異的かつ効率的にデコードする直交アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）／ｔＲＮＡ対が開発されており、大きなタンパク質収率をもたらすＵＡＧＡコドンに、セレノシステインなどの非標準アミノ酸が着実に組み込まれている。かようなクワドラプレットコドンは、本方法で使用し得る。

進化した直交アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）／ｔＲＮＡ対を使用して、多様な化学的性質を有する１００を超えるＮＳＡＡが合成されており、そして、共翻訳的にタンパク質に組み込まれている。本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ｌｉｕ，Ｃ．Ｃ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａｄｄｉｎｇ ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ． Ａｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９，４１３－４４４，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｃｈｅｍ．０５２３０８．１０５８２４（２０１０）を参照されたい。非標準アミノ酸は、チロシンまたはピロリジンに基づいてデザインされている。ａａＲＳ／ｔＲＮＡは、プラスミド、または、ゲノム的に再コードした生物のゲノムに提供され得る。直交ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対は、タンパク質にＮＳＡＡを生体直交的に組み込むために使用される。ベクターに基づいた過剰発現系を使用して、天然コドン機能を、再割り当てしたその機能と競合させ得る。本明細書の一部を構成するものとしてそれらの各々の全内容を援用する、Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２，４９８－５００（２００１），Ｙｏｕｎｇ，Ｔ．Ｓ．，Ａｈｍａｄ，Ｉ．，Ｙｉｎ，Ｊ．Ａ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３９５，３６１－３７４（２００９）、及び、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ａ．，Ｓｕｎ，Ｓ．Ｂ．、Ｆｕｒｍａｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｘｉａｏ，Ｈ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ． Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ－ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ－Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５２，１８２８－１８３７，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ４０００２４４（２０１３）を参照されたい。天然のＵＡＧ翻訳機能を完全に無くしてしまえば、極めて小さなａａＲＳ／ｔＲＮＡ機能で、効率的なＮＳＡＡ取り込みが十分に達成され得る。ＧＲＯベースのＮＳＡＡ取り込みは、ベクターベース、及び／または、ゲノムベースのａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を使用することができる。ゲノムベースのａａＲＳ／ｔＲＮＡ対が、利用可能なＮＳＡＡの不在下での標準アミノ酸の取り込みの誤りを減らすために使用されている（本明細書の一部を構成するものとして援用するＭａｎｄｅｌｌ ａｎｄ Ｌａｊｏｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｆｅｂ５；５１８（７５３７）：５５－６０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ １４１２１）。

ＵＡＧコドン機能は、ゲノム的に再コードした生物において完全に再割り当てがされているので、セレノシステインのようなＮＳＡＡは、表現型に影響を及ぼさずに、ゲノム的に再コードした生物に組み込まれ得る。ゲノム的に再コードした生物へのＮＳＡＡの取り込みは、セレノシステインなどの非標準アミノ酸、及び、ａａＲＳのための誘導物質の増殖培地への補充に関与し得る。あるいは、当該ａａＲＳは、構造的に発現し得る。あるいは、本開示の通りに、当該内在性セリル－ｔＲＮＡシンテターゼを用いて、セレノシステインｔＲＮＡをセリル化し、当該ｔＲＮＡに、ｓｅｌＡ及びｓｅｌＤを含む酵素が作用して、ｔＲＮＡ^ｓｅｃ（セレノシステイン荷電ｔＲＮＡ）を製造し得る。培地に亜セレン酸ナトリウムなどのセレン供給源を補充して、ｔＲＮＡ^ｓｅｃの製造を改善し得る。所望のタンパク質は、あらゆる所望のタンパク質の過剰発現システム（例えば、Ｔ７－ＲＮＡＰ、構造的取り込み、または、ＩＰＴＧ／アロラクトース、アンヒドロテトラサイクリン、アラビノース、ラムノース、または、その他の誘導性システムに基づいた誘導性発現）を用いて過剰発現することができる。タンパク質の架橋（ジセレニド結合）は、タンパク質の折り畳みでの近接性及び配向性に基づいて自発的に形成され得るものであり、そして、当該タンパク質は、その他のあらゆる過剰発現産物として取り扱うことができる。

例４
方法
関心のある遺伝子をコードする配列を、Ｔｅｔ－リプレッサーで制御するＴ７プロモーターを用いて、クロラムフェニコール耐性ベクターにクローニングした。ｔｅｔオペロンで制御する組み込みをしたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ベクターを、２×３１０ｋ細胞に形質転換した。細胞を、ＯＤが約０．６になるまで増殖させ、室温で、一晩、１００ｎｇ／ｍＬのａＴｃで誘導した。誘導した細胞をペレット化し、そして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、及び、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で再懸濁し、続いて、超音波処理をして溶解した。それら溶解物を、遠心分離して分離し、そして、ペレット化した。溶解時と同じ緩衝液で、上清を、Ｎｉ－親和性ビーズに対して流した。関心のあるタンパク質に、３００ｍＭ イミダゾールを添加して、ＰＢＳ ｐＨ ７．４に溶出した。精製した画分を、ＳＤＳ ｐａｇｅゲルに流した。１０個の異なるセレノ生物製剤についての結果を、図４～６に示す。
参考文献
本明細書の一部を構成するものとして引用した参考文献の各々の開示を援用する、ことをここに明示する。
１． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｃｏｄｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０１， ７５６６－７５７１， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０４０１５１７１０１ （２００４），
２． Ａｒｍｉｓｈａｗ， Ｃ．Ｊ．， Ｄａｌｙ， Ｎ．Ｌ．， Ｎｅｖｉｎ， Ｓ．Ｔ．， Ａｄａｍｓ， Ｄ．Ｊ．， Ｃｒａｉｋ， Ｄ．Ｊ． ＆ Ａｌｅｗｏｏｄ， Ｐ．Ｆ． Ａｌｐｈａ－ｓｅｌｅｎｏｃｏｎｏｔｏｘｉｎｓ， ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ａｌｐｈａ７ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１， １４１３６－４３ （２００６）．
３． Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ， Ａ．， Ｌａｊｏｉｅ， Ｍ． Ｊ．， Ｘｉａｏ， Ｈ．， Ｃｈｕｒｃｈ， Ｇ． Ｍ． ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ａ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ａ Ｕｎｉｑｕｅ Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ Ｃｏｄｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｙｉｎｇ Ｎｏｎ－ｎａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ． Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ， ｎ／ａ－ｎ／ａ， ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１４０２１０４ （２０１４）
４． Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ， Ａ．， Ｓｕｎ， Ｓ． Ｂ．， Ｆｕｒｍａｎ， Ｊ． Ｌ．， Ｘｉａｏ， Ｈ． ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ－ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ－Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５２， １８２８－１８３７， ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ４０００２４４ （２０１３）
５． Ｌａｊｏｉｅ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃａｌｌｙ ｒｅｃｏｄｅｄ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｅｘｐａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２， ３５７－３６０， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４１４５９ （２０１３）
６． Ｌａｊｏｉｅ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｏｄｉｎｇ ｉｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２， ３６１－３６３， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４１４６０ （２０１３）
７． Ｌｉｕ， Ｃ． Ｃ． ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ａｄｄｉｎｇ ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ． Ａｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７９， ４１３－４４４， ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｃｈｅｍ．０５２３０８．１０５８２４ （２０１０）
８． Ｍａｎｄｅｌｌ ａｎｄ Ｌａｊｏｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ． ２０１５ Ｆｅｂ ５；５１８（７５３７）：５５－６０． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４１２１，
９． Ｍｕｔｔｅｎｔｈａｌｅｒ， Ｍ．， Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ａ．， ｄｅ Ａｒａｕｊｏ， Ａ．Ｄ．， Ｄｅｋａｎ， Ｚ．， Ｌｅｗｉｓ， Ｒ．Ｊ． ＆ Ａｌｅｗｏｏｄ， Ｐ．Ｆ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｏｘｙｔｏｃｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５３， ８５８５－９６ （２０１０）．
１０． Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｈ．， Ｗａｎｇ， Ｋ．， Ｄａｖｉｓ， Ｌ．， Ｇａｒｃｉａ－Ａｌａｉ， Ｍ． ＆ Ｃｈｉｎ， Ｊ． Ｗ． Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｖｉａ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ－ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４６４， ４４１－４４４， （２０１０）
１１． Ｏｓｔｒｏｖ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｓｉｇｎ， ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏｗａｒｄ ａ ５７－ｃｏｄｏｎ ｇｅｎｏｍｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３， ８１９－８２２， ２０１６
１２． Ｓａｆａｖｉ－Ｈｅｍａｍｉ， Ｈ．， Ｇａｊｅｗｉａｋ， Ｊ．， Ｋａｒａｎｔｈ， Ｓ．， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｓ．Ｄ．， Ｕｅｂｅｒｈｅｉｄｅ， Ｂ．， Ｄｏｕｇｌａｓｓ， Ａ．Ｄ．， Ｓｃｈｌｅｇｅｌ， Ａ．， Ｉｍｐｅｒｉａｌ， Ｊ．Ｓ．， Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｍ．， Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ， Ｐ．Ｋ．， Ｙａｎｄｅｌｌ， Ｍ．， Ｌｉ， Ｑ．， Ｐｕｒｃｅｌｌ， Ａ．Ｗ．， Ｎｏｒｔｏｎ， Ｒ．Ｓ．， Ｅｌｌｇａａｒｄ， Ｌ． ＆ Ｏｌｉｖｅｒａ， Ｂ．Ｍ． Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｗａｒｆａｒｅ ｂｙ ｆｉｓｈ－ｈｕｎｔｉｎｇ ｃｏｎｅ ｓｎａｉｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２， １７４３－８ （２０１５）．
１３． Ｔｈｙｅｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｔＲＮＡ^Ｓｅｃ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ． ＪＡＣＳ １３７（１）， ４６－４９， （２０１５）
１４． Ｗａｎｇ， Ｌ．， Ｂｒｏｃｋ， Ａ．， Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ， Ｂ． ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２， ４９８－５００ （２００１）
１５． Ｙｏｕｎｇ， Ｔ． Ｓ．， Ａｈｍａｄ， Ｉ．， Ｙｉｎ， Ｊ． Ａ． ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ． Ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３９５， ３６１－３７４ （２００９），

Claims (8)

1. 少なくとも２つのセレノシステイン残基を含む修飾ヒトインスリンタンパク質であって、少なくとも２つの前記セレノシステイン残基の間に少なくとも１つのジセレニド結合を有しており、前記タンパク質が、配列番号１６３０の残基９０～１１０の配列またはその配列と少なくとも９０％が同一である配列を有するＡ鎖と、配列番号１６３０の残基２５～５４の配列またはその配列と少なくとも９０％が同一である配列を有するＢ鎖とを含み、前記少なくとも1つのジセレニド結合がＡ鎖内に発生する、前記修飾ヒトインスリンタンパク質。
2. Ａ鎖とＢ鎖との間の少なくとも１つのジセレニド結合をさらに含む、請求項１に記載の修飾ヒトインスリンタンパク質。
3. 組換え細菌において製造される、請求項２に記載の修飾ヒトインスリンタンパク質。
4. セレノシステインｔＲＮＡが、前記細菌のアンバーコドンを認識するように前記組換え細菌が再コードされる、請求項３に記載の修飾ヒトインスリンタンパク質。
5. 医薬として許容される担体中に請求項１～４のいずれか一項に記載の修飾タンパク質を含む組成物。
6. 対象を処置する際に使用するための組成物であって、医薬として許容される担体中に請求項１～４のいずれか一項に記載の修飾タンパク質を含む、組成物。
7. 前記組成物が、皮下投与のために製剤化されている、請求項５または６のいずれかに記載の組成物。
8. 割り当てがされていないコドンが、対応するアンチコドンを有するセレノシステインｔＲＮＡによって認識されるようにゲノム的に再コードした細菌宿主であって、前記細菌宿主は、一対のシステインコドンが、割り当てがされていない前記コドンで置換されたヒトインスリンタンパク質の変異型をコードする構築されたＤＮＡ配列を含み、前記変異型は、配列番号１６３０の残基９０～１１０の配列またはその配列と少なくとも９０％が同一である配列を有するＡ鎖と、配列番号１６３０の残基２５～５４の配列またはその配列と少なくとも９０％が同一である配列を有するＢ鎖とを含む、前記細菌宿主。

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