JP5572972B2 - インスリン分泌促進剤などの薬物のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
インスリンが関係する代表的な疾患である糖尿病は、インスリンの分泌が不全となったI型糖尿病(Type I diabetes mellitus)と、II型糖尿病(Type II diabetes mellitus)とがある。
I型糖尿病においては、インスリンに対する応答性は維持されているため、インスリン製剤(例、ウシ、ブタの膵臓から抽出された動物インスリン製剤;大腸菌またはイーストを用い、遺伝子工学的に合成したヒトインスリン製剤など)の投与、またはインスリン分泌促進剤[例、スルホニルウレア剤(例、トルブタミド、グリペンクラミド、グリクラジド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリクロピラミド、グルメピリド、グリピザイド、グリブゾール等)、レパグリニド、セナグリニド、ナテグリニド、ミチグリニド等]の投与によって血糖値のコントロールが可能である。
インスリン製剤は、作用時間により超速効型、速効型、中間型、持続型、混合型(超速効型+中間型、即効型+中間型)、持効溶解型などに分けられる。これらのインスリン製剤は、患者の症状、状態に応じて適宜選択して投与される。
インスリン分泌促進剤としては、上記のように種々の薬物が知られているが、食前低血糖、食後高血糖などが発生しやすいという問題がある。
全反射蛍光法によって、蛍光タンパク質の一種であるGFPの変異体とインスリンとの融合タンパク質(インスリン−EGFP)の分泌を観察したことが報告されている(非特許文献1:J. Biol. Chem. 277,3805-3808 (2002))。より具体的には、ガラス底面結合部位における、インスリン−EGFP融合タンパク質輸送小胞からのエキソサイトーシス現象を観察したことが報告されている。
2分子励起法によって、蛍光色素を細胞同士が密接に接着した空間に浸透させ、インスリンを含む分泌小胞が細胞膜に融合して形成されるΩ型構造の出現を観察したことが報告されている(非特許文献2:Science, 297, 1349-1352 (2002))。
しかし、全反射蛍光法および2分子励起法のいずれの方法も、細胞全体におけるエキソサイトーシス部位の局在を特定することができない、分泌されたタンパク質の定量ができない、などの問題がある。
ガウシアルシフェラーゼ(Gaussia Luciferase, GLuc)を用いて、ヒトDBH(dopamine β-hydroxylase)のシグナルペプチド(DBHsp)とガウシアルシフェラーゼ(GLase)との融合タンパク質(DBHsp-GLase)の細胞外分泌過程を発光イメージング法によって観察したことが報告されている(非特許文献4:FEBS Letters, 581, 4551-4556 (2007))。
しかしながら、発光イメージング法による、ホルモン、成長因子等の機能するタンパク質あるいはペプチドのエキソサイトーシスの観察については報告されていない。
MMP、特にゼラチナーゼは、細胞外マトリックスのタンパク質分解による癌の転移拡散に関与していることが知られている。例えば、ゼラチナーゼであるMMP−2およびMMP−9は、特定の腫瘍進行事象において増加することが知られている。MMP−2およびMMP−9は、基底膜の主成分であるIV型コラーゲンおよび変性コラーゲン(ゼラチン)を分解して、腫瘍転移を引き起こす。また、MMP−2およびMMP−9による、主にIV型コラーゲンからなる血管膜の破壊は、腫瘍転移に重要な役割を果たすことが知られている。
また、より有効な腫瘍転移抑制剤(MMP−2阻害剤など)などの薬物のスクリーニング方法も望まれている。
また、プロMMP−2とルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を用いることによって、細胞からのMMP−2分泌を発光イメージング方法によって観察し、細胞からのMMP−2分泌量を定量しうること、細胞外における拡散動態を評価しうることなどを見いだした。
これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
[1] プレプロインスリンとルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を用いて、細胞からのインスリン分泌を調節する物質をスクリーニングする方法、
[2] ルシフェラーゼが、分泌型ルシフェラーゼである上記[1]記載のスクリーニング方法、
[3] 分泌型ルシフェラーゼが、ガウシアルシフェラーゼである上記[2]記載のスクリーニング方法、
[4] ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記[3]記載のスクリーニング方法:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列を含有するタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
[5] ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記[4]記載のスクリーニング方法:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
[6] プレプロインスリンが、以下の(e)〜(h)のいずれかに記載のポリペプチドである上記[1]〜[5]のいずれかに記載のスクリーニング方法:
(e)配列番号:10のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号:10のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(g)配列番号:10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(h)配列番号:9の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
[7] プレプロインスリンが、プレプロインスリンのシグナルペプチドと、以下の(i)〜(l)のいずれかに記載のポリペプチドからなる上記[6]記載のスクリーニング方法:
(i)配列番号:4のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:4のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(k)配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(l)配列番号:3の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
[8] プレプロインスリンのシグナルペプチドが、配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、上記[7]記載のスクリーニング方法、
[9] 融合タンパク質が、以下の(m)〜(p)のいずれかに記載のポリペプチドである上記[1]〜[8]のいずれかに記載のスクリーニング方法:
(m)配列番号:12のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:12のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(o)配列番号:12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(p)配列番号:11の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
[10] さらに、CCDカメラまたはフォトンカウンティングカメラを用いて発光を検出する工程を含む、上記[1]〜[9]のいずれかに記載のスクリーニング方法、
[11] プレプロインスリンとルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
[12] ルシフェラーゼが、分泌型ルシフェラーゼである上記[11]記載のポリヌクレオチド、
[13] 分泌型ルシフェラーゼが、ガウシアルシフェラーゼである上記[12]記載のポリヌクレオチド、
[14] ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記[13]記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列を含有するタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
[15] ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記[14]記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
[16] プレプロインスリンが、以下の(e)〜(h)のいずれかに記載のポリペプチドである上記[11]〜[15]のいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:10のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号:10のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(g)配列番号:10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(h)配列番号:9の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
[17] プレプロインスリンが、プレプロインスリンのシグナルペプチドと、以下の(i)〜(l)のいずれかに記載のポリペプチドからなる上記[16]記載のポリヌクレオチド:
(i)配列番号:4のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:4のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(k)配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(l)配列番号:3の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
[18] プレプロインスリンのシグナルペプチドが、配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、上記[17]記載のポリヌクレオチド、
[19] 融合タンパク質が、以下の(m)〜(p)のいずれかに記載のポリペプチドである上記[11]〜[18]のいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(m)配列番号:12のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:12のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(o)配列番号:12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(p)配列番号:11の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
[20] 上記[11]〜[19]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
[21] 上記[20]記載の組換えベクターが導入された形質転換細胞、
[22] 細胞株由来である上記[21]記載の形質転換細胞、
[23] 細胞株が、哺乳動物由来である上記[22]記載の形質転換細胞、
[24] 細胞が、膵臓β細胞由来である上記[21]〜[23]のいずれかに記載の形質転換細胞、
[25] 上記[21]〜[24]のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、インスリンの細胞外分泌を観察する方法、
[26] 上記[21]〜[24]のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞におけるインスリンのエキソサイトーシス部位の局在を特定する方法、
[27] 上記[21]〜[24]のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞外に分泌されたインスリンを定量する方法、
[28] 上記[21]〜[24]のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞におけるインスリンの分泌頻度を特定する方法、
[29] 上記[21]〜[24]のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞外に分泌されたインスリンの拡散動態を観察する方法、
[30] 上記[21]〜[24]のいずれかに記載の形質転換細胞を含むキット、
[31] 薬物のスクリーニングのためのキットである、上記[30]記載のキット、
[32] さらにルシフェリンを含む、上記[30]または[31]記載のキット、
[33] プレプロインスリンとルシフェラーゼとの融合タンパク質、
[34] ルシフェラーゼが、分泌型ルシフェラーゼである上記[33]記載のタンパク質、
[35] 分泌型ルシフェラーゼが、ガウシアルシフェラーゼである上記[34]記載のタンパク質、
[36] ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記[35]記載のタンパク質:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列を含有するタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
[37] ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記[36]記載のタンパク質:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
[38] プレプロインスリンが、以下の(e)〜(h)のいずれかに記載のポリペプチドである上記[33]〜[37]のいずれかに記載のタンパク質:
(e)配列番号:10のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号:10のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(g)配列番号:10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(h)配列番号:9の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
[39] プレプロインスリンが、プレプロインスリンのシグナルペプチドと、以下の(i)〜(l)のいずれかに記載のポリペプチドからなる上記[38]記載のタンパク質:
(i)配列番号:4のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:4のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(k)配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(l)配列番号:3の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
[40] プレプロインスリンのシグナルペプチドが、配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチドである上記[39]記載のタンパク質、
[41] 以下の(m)〜(p)のいずれかに記載のポリペプチドを含有する上記[33]〜[40]のいずれかに記載のタンパク質:
(m)配列番号:12のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:12のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(o)配列番号:12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(p)配列番号:11の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド
などを提供する。
(1B) プロMMP−2とルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を用いて、MMP−2の分泌および/または活性を阻害する物質、癌転移抑制剤などの薬物をスクリーニングする方法、
(2B) ルシフェラーゼが、分泌型ルシフェラーゼである上記(1B)記載のスクリーニング方法、
(3B) 分泌型ルシフェラーゼが、ガウシアルシフェラーゼである上記(2B)記載のスクリーニング方法、
(4B) ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記(3B)記載のスクリーニング方法:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列を含有するタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
(5B) ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記(4B)記載のスクリーニング方法:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
(6B) プロMMP−2が、以下の(e)〜(h)のいずれかに記載のポリペプチドである上記(1B)〜(5B)のいずれかに記載のスクリーニング方法:
(e)配列番号:18のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号:18のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(g)配列番号:18のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(h)配列番号:17の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
(7B) プロMMP−2が、プロMMP−2のシグナルペプチドと、以下の(i)〜(l)のいずれかに記載のポリペプチドからなる上記(6B)記載のスクリーニング方法:
(i)配列番号:14のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:14のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(k)配列番号:14のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(l)配列番号:13の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
(8B) プロMMP−2のシグナルペプチドが、配列番号:16のアミノ酸配列からなるポリペプチドである上記(7B)記載のスクリーニング方法、
(9B) 融合タンパク質が、以下の(m)〜(p)のいずれかに記載のポリペプチドである上記(1B)〜(8B)のいずれかに記載のスクリーニング方法:
(m)配列番号:20のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:20のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(o)配列番号:20のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(p)配列番号:19の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
(10B) さらに、CCDカメラまたはフォトンカウンティングカメラを用いて発光を検出する工程を含む、上記(1B)〜(9B)のいずれかに記載のスクリーニング方法、
(11B) プロMMP−2とルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(12B) ルシフェラーゼが、分泌型ルシフェラーゼである上記(11B)記載のポリヌクレオチド、
(13B) 分泌型ルシフェラーゼが、ガウシアルシフェラーゼである上記(12B)記載のポリヌクレオチド、
(14B) ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記(13B)記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列を含有するタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
(15B) ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記(14B)記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
(16B) プロMMP−2が、以下の(e)〜(h)のいずれかに記載のポリペプチドである上記(11B)〜(15B)のいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:18のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号:18のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(g)配列番号:18のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(h)配列番号:17の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
(17B) プロMMP−2が、プロMMP−2のシグナルペプチドと、以下の(i)〜(l)のいずれかに記載のポリペプチドからなる上記(16B)記載のポリヌクレオチド:
(i)配列番号:14のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:14のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(k)配列番号:14のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(l)配列番号:13の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
(18B) プロMMP−2のシグナルペプチドが、配列番号:16のアミノ酸配列からなるポリペプチドである上記(17B)記載のポリヌクレオチド、
(19B) 融合タンパク質が、以下の(m)〜(p)のいずれかに記載のポリペプチドである上記(11B)〜(17B)のいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(m)配列番号:20のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:20のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(o)配列番号:20のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(p)配列番号:19の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
(20B) 上記(11B)〜(19B)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(21B) 上記(20B)記載の組換えベクターが導入された形質転換細胞、
(22B) 細胞株由来である上記(21B)記載の形質転換細胞、
(23B) 細胞株が、哺乳動物由来である上記(22B)記載の形質転換細胞、
(24B) 細胞が、癌細胞由来である上記(21B)〜(23B)のいずれかに記載の形質転換細胞、
(25B) 上記(21B)〜(24B)のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、MMP−2の細胞外分泌を観察する方法、
(26B) 上記(21B)〜(24B)のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞におけるMMP−2のエキソサイトーシス部位の局在を特定する方法、
(27B) 上記(21B)〜(24B)のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞外に分泌されたMMP−2を定量する方法、
(28B) 上記(21B)〜(24B)のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞におけるインスリンの分泌頻度を特定する方法、
(29B) 上記(21B)〜(24B)のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞外に分泌されたMMP−2の拡散動態を観察する方法、
(30B) 上記(21B)〜(24B)のいずれかに記載の形質転換細胞を含むキット、
(31B) 薬物のスクリーニングのためのキットである、上記(30B)記載のキット、
(32B) さらにルシフェリンを含む、上記(30B)または(31B)記載のキット、
(33B) プロMMP−2とルシフェラーゼとの融合タンパク質、
(34B) ルシフェラーゼが、分泌型ルシフェラーゼである上記(33B)記載のタンパク質、
(35B) 分泌型ルシフェラーゼが、ガウシアルシフェラーゼである上記(34B)記載のタンパク質、
(36B) ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記(35B)記載のタンパク質:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列を含有するタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
(37B) ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質である上記(36B)記載のタンパク質:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質、
(38B) プロMMP−2が、以下の(e)〜(h)のいずれかに記載のポリペプチドである上記(33B)〜(37B)のいずれかに記載のタンパク質:
(e)配列番号:18のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号:18のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(g)配列番号:18のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(h)配列番号:18の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
(39B) プロMMP−2が、プロMMP−2のシグナルペプチドと、以下の(i)〜(l)のいずれかに記載のポリペプチドからなる上記(38B)記載のタンパク質:
(i)配列番号:14のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:14のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(k)配列番号:14のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(l)配列番号:13の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
(40B) プロMMP−2のシグナルペプチドが、配列番号:16のアミノ酸配列からなるポリペプチドである上記(39B)記載のタンパク質、
(41B) 以下の(m)〜(p)のいずれかに記載のポリペプチドを含有する上記(33B)〜(40B)のいずれかに記載のタンパク質:
(m)配列番号:20のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:20のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(o)配列番号:20のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(p)配列番号:19の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
なども提供する。
本発明の薬物のスクリーニング方法は、プレプロインスリンまたはMMP−2などの分泌タンパク質とルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を用いて、細胞からのインスリン分泌を促進(または調節)する物質またはMMP−2の分泌および/もしくは活性を阻害する物質、癌転移抑制剤などの薬物をスクリーニングする方法である。
本発明の薬物のスクリーニング方法は、より具体的には、例えば、プレプロインスリンとルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を用いて、細胞からのインスリン分泌を発光イメージング法によって観察し、試験物質を添加した場合と添加しない場合とのインスリン分泌量などを比較することによって、細胞からのインスリン分泌を促進(または調節)する物質をスクリーニングする方法である。
本発明の薬物のスクリーニング方法は、また、例えば、プロMMP−2とルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を用いて、試験物質を添加した場合と添加しない場合とのMMP−2分泌などを比較することによって、MMP−2の分泌および/または活性を阻害する物質、癌転移抑制剤などの薬物をスクリーニングする方法である。
以下、本発明をその実施態様に基づいて詳細に説明する。
[スクリーニング方法1]
以下の工程(a)〜工程(d)を含む、細胞からのインスリン分泌を調節する物質のスクリーニング方法:
工程(a):プレプロインスリンと、ルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換した細胞を、試験物質の存在下および非存在下において培地中で培養する工程;
工程(b):本発明の形質転換体内で本発明の融合タンパク質を発現させ、本発明の融合タンパク質を、ルシフェリンを含有する培地中(細胞外)に分泌させる工程;
工程(c):細胞外に分泌された融合タンパク質を発光イメージング法により観察する工程;および
工程(d):試験物質の存在下と非存在下との融合タンパク質の発現を比較する工程。
[工程(a)]
(1)ルシフェラーゼ
本発明で用いられるルシフェラーゼとは、発光基質であるルシフェリンが酸素存在下で酸化されてオキシルシフェリンとなる反応を触媒する酵素を意味する。このルシフェラーゼによって触媒される、ルシフェリンの酸素による酸化反応をルシフェリン−ルシフェラーゼ反応という。ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じたオキシルシフェリンは励起状態で生成し、それが基底状態になるときに発光する。
本発明で用いられるルシフェラーゼとしては、分泌型ルシフェラーゼであるのが好ましく、さらにセレンテラジン系ルシフェラーゼであるのが好ましく、特にガウシアルシフェラーゼ(Gaussia luciferase)が好ましい。セレンテラジン系ルシフェラーゼとしては、例えば、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケ(レニラ、Renilla)ルシフェラーゼ、プレウロマンマルシフェラーゼ、メトリディアルシフェラーゼ、オプロフォーラス(ヒメオドシエビ)ルシフェラーゼなどがあげられる。
分泌型ルシフェラーゼとは、分泌シグナルペプチドを有し、細胞外に分泌されうるルシフェラーゼを意味する。
本明細書において、ルシフェラーゼが分泌型ルシフェラーゼである場合には、シグナルペプチドを有していてもよく、シグナルペプチドを欠いていてもよい。
ガウシアルシフェラーゼとは、Gaussia princeps由来のルシフェラーゼを意味する。本明細書において、ガウシアルシフェラーゼとは、シグナルペプチドを有していてもよく、シグナルペプチドを欠いていてもよい。すなわち、シグナルペプチドを欠くガウシアルシフェラーゼも、ガウシアルシフェラーゼに含まれる。
実質的に同質の活性もしくは機能とは、例えば、(i)前記タンパク質が、発光基質であるルシフェリンと、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を示す機能、
(ii)前記タンパク質が示すルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じる発光の最大発光強度(Imax)が、配列番号:8のアミノ酸配列が示すルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じる発光の最大発光強度の1/4以上、好ましくは1/3以上、より好ましくは1/2以上、さらに好ましくは1/1.5以上であること、(iii)前記タンパク質が示すルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じる発光の半減期(T1/2)が、配列番号:8のアミノ酸配列が示すルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じる発光の半減期の4倍以下、好ましくは3倍以下、より好ましくは2倍以下、さらに好ましくは1.5倍以下であることなどを意味する。上記の実質的に同質の活性もしくは機能を「ルシフェラーゼ活性」と称することもある。上記の発光活性や発光パターンの測定は、例えば、Methods in Enzymology 326, 165-174 (2000)などに記載の方法によって測定することができる。具体的には、例えば、前記タンパク質に、酸素存在下ルシフェリンを加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置を用いて発光活性または発光パターンを測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えばTD−4000(ラボサイエンス社製)、Berthold960(ベルトール社製)などを使用することができる。
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」については、後述する。
本発明で用いられるルシフェリンとは、ルシフェラーゼによる触媒作用により、酸素存在下で酸化されてオキシルシフェリンとなる物質を意味する。このルシフェラーゼによって触媒される、ルシフェリンの酸素による酸化反応をルシフェリン−ルシフェラーゼ反応という。ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により生じたオキシルシフェリンは励起状態で生成し、それが基底状態になるときに発光する。すなわち、ルシフェリンは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を示す発光性基質である。
本発明で用いられるルシフェリンは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基質特異性があるため、用いられるルシフェラーゼに応じて適宜選択される。例えば、ルシフェリンとしてガウシアルシフェラーゼを使用する場合には、セレンテラジン(coelenterazine, CTZ)が用いられる。その他のセレンテラジン系ルシフェラーゼ(例、変異型ウミシイタケ(レニラ、Renilla)ルシフェラーゼ、プレウロマンマルシフェラーゼ、メトリディアルシフェラーゼ、オプロフォーラス(ヒメオドシエビ)ルシフェラーゼなど)を使用する場合にも、セレンテラジンが用いられる。
インスリンは、21個のアミノ酸残基からなるA鎖と、30個のアミノ酸残基からなるB鎖から構成されるペプチドホルモンであり、グルコースの代謝調節において重要な役割を果たしている。インスリンは、86個のアミノ酸残基からなる前駆体であるプロインスリンが、2箇所の塩基性ジペプチド部位で酵素的に切断されてA鎖とB鎖となり、2箇所でジスルフィド結合することにより生成される。プロインスリンは、N末端に24個のアミノ酸残基からなるプレペプチド(シグナルペプチド)が結合したプレプロインスリンとして合成されるが、粗面小胞体を貫通した直後にプレペプチドが切断されてプロインスリンが生成される。
実質的に同質の活性もしくは機能とは、例えば、(i)前記タンパク質からシグナルペプチドの切断、2箇所の塩基性ジペプチド部位における切断および2箇所のジスルフィド結合の形成により生成した物質が、血糖値を降下させる機能、(ii)前記タンパク質からシグナルペプチドの切断、2箇所の塩基性ジペプチド部位における切断および2箇所のジスルフィド結合の形成により生成した物質の血糖値降下活性が、配列番号:10のアミノ酸配列からなるタンパク質から生成したインスリンの血糖降下活性の、1/4以上、好ましくは1/3以上、より好ましくは1/2以上、さらに好ましくは1/1.5以上であることなどを意味する。上記の実質的に同質の活性もしくは機能を「インスリン活性」と称することもある。上記の血糖降下活性は、例えば、試験動物(マウス、ラット、自然発症糖尿病モデルマウスKKAy、など)に被検物質を投与し、投与前後の血糖値を公知の血糖値測定方法、市販の血糖値測定器、血糖値測定キットなどを用いて測定することができる。試験等物としては、例えば、KKAy/Taマウス(日本クレア株式会社)、血糖測定器、血糖測定キットなどとしては、例えば、グルコカード ダイアメーターα、ダイアセンサー(アークレイ株式会社)、血糖測定器グルテストエース(GT−1640)(株式会社三和化学研究所)、血糖測定装置デキスターZ(バイエルメディカル株式会社)、血糖測定器アントセンスII(バイエル−三共株式会社)、血糖測定装置アキュチェック・コンフォート(ロシュ・ダイアグノスティクス)、グルコースCII−テストワコー(和光純薬株式会社)などを用いることができる。
インスリン濃度は、公知の方法、市販のインスリン測定キットなどを用いて測定することができる。例えば、インスリン測定キット(森永生科学研究所)などを用いてインスリン濃度を測定することができる。
(i)配列番号:4のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:4のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(k)配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(l)配列番号:3の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。
プレプロインスリンのシグナルペプチドとしては、配列番号:6のアミノ酸からなるペプチドが好ましい。
実質的に同質の活性もしくは機能とは、例えば、(i)前記タンパク質からシグナルペプチドの切断、2箇所の塩基性ジペプチド部位における切断および2箇所のジスルフィド結合の形成により生成した物質が、血糖値を降下させる機能、(ii)前記タンパク質からシグナルペプチドの切断、2箇所の塩基性ジペプチド部位における切断および2箇所のジスルフィド結合の形成により生成した物質の血糖値降下活性が、配列番号:10のアミノ酸配列からなるタンパク質から生成したインスリンの血糖降下活性の、1/4以上、好ましくは1/3以上、より好ましくは1/2以上、さらに好ましくは1/1.5以上であることなどを意味する。
本明細書において、プレプロインスリンと、ルシフェラーゼとの融合タンパク質とは、上述のプレプロインスリンと、上述のルシフェラーゼとの融合タンパク質を意味する。
上述したように、ルシフェラーゼが分泌型ルシフェラーゼである場合には、シグナルペプチドを有していてもよく、シグナルペプチドを欠いていてもよい。
本明細書において、プレプロインスリンと、ルシフェラーゼとの融合タンパク質を、「本発明の融合タンパク質」と称することがある。
(m)配列番号:12のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:12のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(o)配列番号:12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(p)配列番号:11の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。
本明細書において、前述したプレプロインスリンと、ルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを「本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」と称することがある。
本明細書において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」と称することがある。
DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞・組織由来のcDNA、細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(以下、RT-PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%(w/v)SDS、50%(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%(w/v)SDS、50%(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)%SDS、50%(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また目的の変異(欠失、付加、置換および/または挿入)を導入した配列をそれぞれの5’端に持つ1組のプライマーを用いたPCR(例えば、Ho S. N. et al., Gene 77, 51 (1989)、など参照)によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
(i)プレプロインスリンと分泌型ルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(ii)プレプロインスリンとガウシアルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(iii)プレプロインスリンと、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質(ガウシアルシフェラーゼ)との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列を含有するタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(iv)プレプロインスリンと、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のタンパク質(ガウシアルシフェラーゼ)との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号:7の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;
(v)以下の(e)〜(h)のいずれかに記載のポリペプチド(プレプロインスリン)と、前記(i)〜(iv)のいずれかに記載のルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド:
(e)配列番号:10のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号:10のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(g)配列番号:10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(h)配列番号:9の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(vi)プレプロインスリンのシグナルペプチドと、以下の(i)〜(l)のいずれかに記載のポリペプチドからなるポリペプチド(プレプロインスリン):
(i)配列番号:4のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:4のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(k)配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(l)配列番号:3の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
と、前記(i)〜(iv)のいずれかに記載のルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(vii)配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチド(プレプロインスリンのシグナルペプチド)と、以下の(i)〜(l)のいずれかに記載のポリペプチドからなるポリペプチド(プレプロインスリン):
(i)配列番号:4のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:4のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(k)配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(l)配列番号:3の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド、
と、前記(1)〜(4)のいずれかに記載のルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(viii)以下の(m)〜(p)のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、前記(i)〜(vii)のいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(m)配列番号:12のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:12のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
(o)配列番号:12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(p)配列番号:11の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;
などがあげられる。
(6)組換えベクター
適当なベクターにプレプロインスリンとルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド(本発明のポリヌクレオチド(DNA))を連結(挿入)することにより、本発明の融合タンパク質を発現しうるベクターを得ることができる。
本明細書において、本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを「本発明の組換えベクター」と称することがある。
より具体的には、精製されたポリヌクレオチド(DNA)を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド(例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などがあげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルスなど)などがあげられる。
本発明のポリヌクレオチドは、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能なように連結される。用いられるプロモーターとしては、形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Trpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH1プロモーター、GALプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
本発明の組換えベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列(SD配列)、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがあげられる。
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチド(すなわち、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド)を含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。
本明細書において、本発明の組換えベクターを含有する形質転換体を「本発明の形質転換体」と称することがある。
本発明の形質転換体を作成するための宿主としては、本発明のポリヌクレオチド(DNA)を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)などがあげられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21などがあげられる。
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、本発明の融合タンパク質が生成され、培養液中に本発明の融合タンパク質が分泌される。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)などを、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)などを培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、たとえばバークホールダー(Burkholder)最小培地(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980))や0.5%(w/v)カザミノ酸を含有するSD培地(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984))があげられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する培地としては、たとえば約5〜20%(v/v)の胎児牛血清を含むMEM培地(Science, 122, 501 (1952)),DMEM培地(Virology, 8, 396 (1959))などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する培地としては、Grace's Insect Medium(Nature,195,788(1962))に非働化した10%(v/v)ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
[工程(b)]
(8)本発明の融合タンパク質の発現(生成)と細胞外への分泌
培地中には、本発明の融合タンパク質中のルシフェラーゼと特異的にルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を起こすことができるルシフェリンを添加しておく。本発明の融合タンパク質が細胞外に分泌されると、培地中のルシフェリンとルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を起こし、発光する。この発光を観察、検出または測定することによって、本発明の融合タンパク質の局在(分布)、分泌、定量などを観察、検出または測定することができる。
(9)発光イメージング
本明細書において、発光イメージングとは、発光を観察、検出または測定することを意味する。
本発明の形質転換体は、本発明の融合タンパク質を発現、分泌することができる。本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質中のルシフェラーゼと、前記ルシフェラーゼに特異的なルシフェリンとの間でルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を起こすことができる。前述したように、このルシフェリン−ルシフェラーゼ反応により発光を生じる。この発光を観察、検出または測定することにより、本発明の融合タンパク質の局在(分布)、分泌、定量などを観察、検出または測定することができる。
極微弱光検出CCDイネージングカメラとしては、EM−CCDカメラ(例、浜松ホトニクス株式会社製モデルC9100-13、浜松ホトニクス株式会社製モデルC9100-14、プリンストンインスルメント社製モデルQuantEM、ホトメトリクス社製Evolve, ベルトール社製モデルNightOWL II LB983 em100など)が好ましい。フォトンカウンティングカメラとしては、市販されている装置、例えば浜松ホトニクス株式会社製VIMカメラ(例、モデルC2741-35Aなど)などを使用することができる。なお、浜松ホトニクス社製VIMカメラは、光増幅装置およびCCDカメラを備えている。
発光イメージングは、光検出装置に加えて、さらに顕微鏡を使用して行ってもよく、顕微鏡を使用するのが好ましい。顕微鏡としては、市販されている顕微鏡、例えば、オリンパス株式会社製倒立型顕微鏡モデルIX71、IX81などを使用してもよい。
発光イメージングは、光検出装置に加えて、さらに光増幅管、半導体光増幅装置などのイメージインテンシファイア(光増幅装置)を使用して行ってもよく、光増幅装置を使用するのが好ましい。光増幅装置としては、半導体受光素子を使用した光増幅装置(例、GaAsP(ガリウムヒ素リン)イメージインテンシファイアなど)、光電子増倍管などを使用することができる。光増幅装置としては、GaAsPイメージインテンシファイア(例、浜松ホトニクス株式会社製モデルC8600-04など)が好ましい。
(10)細胞からの本発明の融合タンパク質分泌またはインスリン分泌を促進(または調節)する化合物のスクリーニング
上述したように、試験物質非存在下および試験物質存在下、本発明の形質転換体を培養し、それぞれの場合における本発明の融合タンパク質の分泌量などを、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による発光を観察することによって測定する。試験物質非存在下と、試験物質存在下とにおける本発明の融合タンパク質の分泌量などを比較することによって、細胞からの本発明の融合タンパク質分泌またはインスリン分泌などを促進(または調節)する物質をスクリーニングすることができる。
より具体的には、(i)試験物質非存在下、本発明の形質転換体を培養した場合の本発明の融合タンパク質の分泌量などと、(ii)試験物質存在下、本発明の形質転換体を培養した場合の本発明の融合タンパク質の分泌量などを発光イメージングによって測定し、比較することにより、細胞からの本発明の融合タンパク質分泌またはインスリン分泌を促進(または調節)する物質をスクリーニングすることができる。
以下の工程(a’)〜工程(d’)を含む、細胞からのMMP−2分泌を調節する物質のスクリーニング方法:
工程(a’):ルシフェラーゼと、プロMMP−2との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換した細胞を、試験物質の存在下および非存在下において培地中で培養する工程;
工程(b’):本発明の形質転換体内で本発明の融合タンパク質を発現させ、本発明の融合タンパク質を、ルシフェリンを含有する培地中(細胞外)に分泌させる工程;
工程(c’):細胞外に分泌された融合タンパク質を発光イメージング法により観察する工程;および
工程(d’):試験物質の存在下と非存在下との融合タンパク質の発現および/または活性、もしくは癌転移抑制活性などを比較する工程。
[工程(a’)]
(1’)ルシフェラーゼ
本発明で用いられるルシフェラーゼは、前記[スクリーニング方法1]で説明した通りである。ルシフェラーゼとしては、前記[スクリーニング方法1]に記載したものと同様のものがあげられ、同様のものが好ましい。
本発明で用いられるルシフェリンは、前記[スクリーニング方法1]で説明した通りである。ルシフェリンとしては、前記[スクリーニング方法1]に記載したものと同様のものがあげられ、同様のものが好ましい。
マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)−2は、細胞外マトリックスおよび結合組織の主成分の分解および修復に関与する、亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。MMP−2は、基底膜の主成分であるIV型コラーゲンおよび変性コラーゲン(ゼラチン)を分解する活性を有している。また、MMP−2は、主にIV型コラーゲンからなる血管膜を破壊する活性を有している。このような活性により、MMP−2は腫瘍転移に重要な役割を果たしている。
MMP−2は、N末端にシグナルペプチドが結合したプロMMP−2として合成される。プロMMP−2は、シグナルペプチドが切断されることにより活性化され、MMP−2が生成される。
実質的に同質の活性もしくは機能とは、例えば、(i)前記タンパク質からシグナルペプチドの切断により生成した活性タンパク質のIVコラーゲン分解活性または変性コラーゲン(ゼラチン)分解活性が、配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質から生成したMMP−2の活性のIVコラーゲン分解活性または変性コラーゲン(ゼラチン)分解活性の、1/4以上、好ましくは1/3以上、より好ましくは1/2以上、さらに好ましくは1/1.5以上であることなどを意味する。上記の実質的に同質の活性もしくは機能を「MMP−2活性」と称することもある。前記のIVコラーゲン分解活性または変性コラーゲン(ゼラチン)分解活性は、IVコラーゲンまたは変性コラーゲン(ゼラチン)に前記タンパク質またはMMP−2を添加して一定時間分解反応を行い、残存したIVコラーゲンまたは変性コラーゲン(ゼラチン)をHPLC法、ゲル電気泳動法などを用いて定量することにより測定することができる。
(i’)配列番号:14のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(j’)配列番号:14のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するタンパク質;
(k’)配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するタンパク質;および
(l’)配列番号:3の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するタンパク質。
プロMMP−2のシグナルペプチドとしては、配列番号:16のアミノ酸からなるペプチドが好ましい。
本明細書において、プロMMP−2と、ルシフェラーゼとの融合タンパク質とは、上述のプロMMP−2と、上述のルシフェラーゼとの融合タンパク質を意味する。
上述したように、ルシフェラーゼが分泌型ルシフェラーゼである場合には、シグナルペプチドを有していてもよく、シグナルペプチドを欠いていてもよい。
本明細書において、プロMMP−2と、ルシフェラーゼとの融合タンパク質も、「本発明の融合タンパク質」と称することがある。
(m’)配列番号:20のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(n’)配列番号:20のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するタンパク質;
(o’)配列番号:20のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するタンパク質;および
(p’)配列番号:19の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつMMP−2活性を有するポリペプチドを含有するタンパク質。
本明細書において、プロMMP−2と、ルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと称することがある。
本明細書において、前述の本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」と称することもある。
(6')組換えベクター
適当なベクターにプロMMP−2と、ルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド(本発明のポリヌクレオチド(DNA))を連結(挿入)することにより、本発明の融合タンパク質を発現しうるベクターを得ることができる。
本明細書において、前記の本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを「本発明の組換えベクター」と称することがある。
本発明の組換えベクターは、より具体的には、前記と同様にして作成することができる。
このようにして得られた、本プロMMP−2と、ルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド(すなわち、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド)を含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。
本明細書において、前記の本発明の組換えベクターを含有する形質転換体も「本発明の形質転換体」と称することがある。
本発明の形質転換体は、より具体的には、前記と同様にして作成することができる。
本発明の形質転換体の培養は、前記と同様に、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、本発明の融合タンパク質が生成され、培養液中に本発明の融合タンパク質が分泌される。
(9’)発光イメージング
発光イメージングは、前記と同様にして実施することができる。
(10’)細胞からの本発明の融合タンパク質分泌またはMMP−2分泌を促進(または調節)する化合物のスクリーニング
上述したように、試験物質非存在下および試験物質存在下、本発明の形質転換体を培養し、それぞれの場合における本発明の融合タンパク質の分泌量などを、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による発光を観察することによって測定する。試験物質非存在下と、試験物質存在下とにおける本発明の融合タンパク質の分泌量などを比較することによって、細胞からの本発明の融合タンパク質分泌またはMMP−2分泌などを促進(または調節)する物質をスクリーニングすることができる。
より具体的には、(i')試験物質非存在下、本発明の形質転換体を培養した場合の本発明の融合タンパク質の分泌量などと、(ii')試験物質存在下、本発明の形質転換体を培養した場合の本発明の融合タンパク質の分泌量などを発光イメージングによって測定し、比較することにより、細胞からの本発明の融合タンパク質分泌またはMMP−2分泌を促進(または調節)する物質をスクリーニングすることができる。
ヒト由来のプレプロインスリンとガウシアルシフェラーゼとの融合タンパク質を発現させるための発現ベクターpcDNA3-hINS-GLucを、下記の方法に従って作成した。
ヒトプレプロインスリンをコードするBamHI-EcoRI cDNAフラグメントは、IMAGE cDNA クローン3950204 (http://image.llnl.gov/image/html/vectors.shtml参照)を鋳型として、PCR法によって取得した。PCR反応は、KOD-plus-DNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製)と、プライマーであるhINS-P1 (5'ctc GGATCC AGCCACC ATG GCC CTG TGG ATG CGC CT 3'; 下線はBamHI認識部位)(配列番号:21)およびhINS-P2 (5'ctt GAA TTC GTT GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3'; 下線はEcoRI 認識部位)(配列番号:22)を用い、サイクル条件は、25サイクル;15秒/96℃、15秒/55℃、45秒/68℃で実施した。得られたDNAフラグメントは、制限酵素BamHIおよびEcoRIを用いて消化した後、pcDNA3-GLuc-BEベクター(FEBS Letters, 581, 4551-4556 (2007)記載)のBamHI/EcoRI部位に挿入することによって、発現ベクターpcDNA3-hINS-GLucを構築した。
得られた発現ベクターpcDNA3-hINS-GLucにより発現されるタンパク質は、インスリンのシグナルペプチド配列、プロインスリンおよびガウシアルシフェラーゼからなる融合タンパク質である。
マウス膵臓β細胞であるMIN6株は、10%ウシ胎仔血清(インビトロジェン社製)および2-メルカプトエタノール50μMを添加した、高グルコース濃度のDMEM培地(シグマ社製)中で培養した。
実施例1−1で得られた発現ベクターのMIN6細胞株へのトランスフェクションは、LipofectAMINE2000(インビトロジェン社製)を使用し、トランスフェクション後、細胞はCO2インキュベーターにて、37度で24時間培養した。
形質転換細胞における融合ガウシアルシフェラーゼ蛋白質の分泌発現の確認は、セレンテラジンを発光基質として、Biochem. Biophys. Res. Commun. 365, 96-101(2007)記載の方法に従い、発光活性をルミノメーターAB2200 (アトー社製)により測定した。 その結果、形質転換したMIN6細胞への高グルコース(20 mMグルコース )刺激による培養液での、発光活性は、処理前と比較して約7倍増加した(図1)。 このことは、本発現ベクターpcDNA3-hINS-GLuc-動物培養細胞系において、インスリンの分泌評価するこができることが明らかとなった。
インスリンの分泌を可視化するためのMIN6細胞は、ガラス表面がポリ-D-リジンで処理された35 mm培養皿(Mat-Tek社製)で培養した。
高濃度グルコースを添加刺激することにより細胞より分泌するインスリンを、インスリン-GLase融合タンパク質の発光シグナルを用いて可視化するために、EM−CCDカメラを使用した、
20 mMグルコースでの刺激後、インスリン-GLase融合タンパク質の分泌を示す発光スポットが頻繁に観察された(図2-中央:発光シグナルの画像)。 細胞の明視野像画像と発光画像を重ね合わすことにより、細胞からのインスリンの分泌画像をえることができ、細胞における分泌部位の特定が可能である(図2-右)。
さらに、100ミリ秒での高速発光画像を連続的に、編集することにより、インスリンのリアルタイムに分泌を映像化することができる(図3)。その結果、すべての発光画像の最大発光強度から作成された連続合成画像の編集により、MIN6細胞の形質転換体の細胞塊の細胞間隙から、インスリン-GLase融合タンパク質が分泌していることが示された。
分泌発光を示した細胞について、それぞれ図2-中央の細胞領域1〜3で示し、細胞領域1〜3内の平均発光強度の経時的な変化を算出した(図4)。
スルホニル尿素系の血糖降下薬であるグリベンクラミドは、内因性インスリンの分泌を促進することにより、血糖降下させる。このインスリンの分泌促進をインスリン-GLase 発現MIN6細胞を用いて、その効果を評価した。具体的には、実施例1-1で調製した発現ベクターpcDNA3-hINS-GLucを、実施例1-2の記載の方法によりMIN6細胞に形質転換を行ない、インスリン-GLase 発現細胞を調製した。MIN6細胞株を3 mlの生理食塩水(PBS)で2回洗浄した後、それぞれ、コントロール(未処理)は2 mMグルコース、20 mMグルコース、10 (M グリベンクラミド(和光純薬社製)を含む2(lの低グルコース改変KRHB緩衝液を添加し、0、3、4、6、8、10、15、30分ごとに、2 ml分得し、ルシフェラーゼ活性を実施例1-2の記載の方法で測定した。図9に示すように、グリベンクラミド処理することにより、インスリンの分泌が促進することが明らかとなり、本ベクター発現細胞系において、薬剤評価が可能であることが示された。
ヒト由来のマトリックスメタロプロテイナーゼ2(hMMP-2)のシグナルペプチドを有するプロヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ2(pro-hMMP-2)とガウシアルシフェラーゼ(GLase)との融合タンパク質を発現させるための発現ベクターpcDNA3-hMMP2-GLucを、下記の方法に従って作成した。
hMMP-2プロタンパク質のコード領域を、IMAGE cDNA クローン3161383(I.M.A.G.E.コンソーシアムの作成したcDNAクローン)から、PCR法(サイクル条件:25サイクル;15秒/98℃、15秒/55℃、2分/68℃)によって調製した。PCR法は、KOD-plus-DNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製)と、プライマーセットhMMP-2-P1 (5' ggc AAGCTT AGCCACC ATG GAG GCG CTA ATG GCC C 3'; 下線はBamHI 認識部位)(配列番号:23)およびhMMP2-P2 (5'ggc GAATTC GCA GCC TAG CCA GTC GGA T 3'; 下線はEcoRI認識部位)(配列番号:24)を用いて実施した。得られたPCRフラグメントは、制限酵素BamHIおよびEcoRIを用いて消化した後、pcDNA3-GLuc-BEベクター(FEBS Letters, 581, 4551-4556 (2007)記載)のBamHI/EcoRI部位に挿入することによって、発現ベクターpcDNA3-hMMP2-GLucを構築した。 得られた発現ベクターpcDNA3-hMMP2-GLucにより発現されるタンパク質は、hMMP-2のシグナルペプチド配列、hMMP-2およびGLaseからなる融合タンパク質である。
ヒト子宮頚癌細胞由来細胞株であるHeLa細胞を、10%ウシ胎仔血清(インビトロジェン社製)を添加したDMEM培地(シグマ社製)中で培養した。
実施態様3−1で得られた発現ベクターpcDNA3-hMMP2-GLucによるHeLa細胞株の形質転換体の作成は、Fugene HD(ロッシュ社製)を使用し、トランスフェクション後、細胞はCO2 インキュベーターにて、37度で24時間培養した。
ヒトメタロプロテイナーゼ2(hMMP-2)-GLase融合タンパク質の細胞外分泌のイメージングは、ガラス表面が未処理35 mm培養皿(旭硝子株式会社製)で培養し、前記実施例1−3と同様の方法に従って実施した。
[配列番号:2]ガウシアルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す。
[配列番号:3]ヒトプロインスリンをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
[配列番号:4]ヒトプロインスリンのアミノ酸配列を示す。
[配列番号:5]ヒトプレプロインスリンのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
[配列番号:6]ヒトプレプロインスリンのシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
[配列番号:7]実施例(Example)1−1および実施態様(Embodiment)3−1で用いられた、シグナル配列を欠くガウシアルシフェラーゼ(GLase(K18-D185))をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
[配列番号:8]配列番号:7で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド(GLase(K18-D185))のアミノ酸配列を示す。
[配列番号:9]実施例(Example)1−1で用いられた、ヒトプレプロインスリンをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
[配列番号:10]配列番号:9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド(ヒトプレプロインスリン)のアミノ酸配列を示す。
[配列番号:11]実施例(Example)1−1で用いられたヒトプレプロインスリンと、シグナル配列を欠くガウシアルシフェラーゼ(GLase(K18-D185))との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
[配列番号:12]配列番号:11で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
[配列番号:13]ヒトMMP−2をコードするポリヌクレオチドの塩基配列。
[配列番号:14]ヒトMMP−2のアミノ酸配列。
[配列番号:15]ヒトプロMMP−2のシグナル配列をコードするポリヌクレオチド。
[配列番号:16]ヒトプロMMP−2のシグナル配列のアミノ酸配列。
[配列番号:17]実施態様(Embodiment)3−1で用いられた、ヒトプロMMP−2をコードするポリヌクレオチドの塩基配列。
[配列番号:18]配列番号:17で表されるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド(ヒトプロMMP−2)のアミノ酸配列。
[配列番号:19]実施態様(Embodiment)3−1で用いられた、ヒトプロMMP−2と、シグナル配列を欠くガウシアルシフェラーゼ(GLase(K18-D185))との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列。
[配列番号:20]配列番号:19で表されるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列。
[配列番号:21]実施例1−1で用いられたプライマーの塩基配列。
[配列番号:22]実施例1−1で用いられたプライマーの塩基配列。
[配列番号:23]実施態様3−1で用いられたプライマーの塩基配列。
[配列番号:24]実施態様3−1で用いられたプライマーの塩基配列。
Claims (35)
- N末端側から順にプレプロインスリンとガウシアルシフェラーゼを配置してなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を用いて、細胞からのインスリン分泌を調節する物質をスクリーニングする方法。
- ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のタンパク質である請求項1記載のスクリーニング方法:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列を含有するタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。 - ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のタンパク質である請求項2記載のスクリーニング方法:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。 - プレプロインスリンが、以下の(e)〜(g)のいずれかに記載のポリペプチドである請求項1〜3のいずれかに記載のスクリーニング方法:
(e)配列番号:10のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号:10のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(g)配列番号:10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。 - プレプロインスリンが、プレプロインスリンのシグナルペプチドと、以下の(i)〜(k)のいずれかに記載のポリペプチドからなる請求項4記載のスクリーニング方法:
(i)配列番号:4のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:4のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(k)配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。 - プレプロインスリンのシグナルペプチドが、配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項5記載のスクリーニング方法。
- 融合タンパク質が、以下の(m)〜(o)のいずれかに記載のポリペプチドである請求項1〜6のいずれかに記載のスクリーニング方法:
(m)配列番号:12のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:12のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(o)配列番号:12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。 - さらに、CCDカメラまたはフォトンカウンティングカメラを用いて発光を検出する工程を含む、請求項1〜7のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- N末端側から順にプレプロインスリンとガウシアルシフェラーゼを配置してなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のタンパク質である請求項9記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列を含有するタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。 - ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のタンパク質である請求項10記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。 - プレプロインスリンが、以下の(e)〜(g)のいずれかに記載のポリペプチドである請求項9〜11のいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:10のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号:10のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(g)配列番号:10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。 - プレプロインスリンが、プレプロインスリンのシグナルペプチドと、以下の(i)〜(k)のいずれかに記載のポリペプチドからなる請求項12記載のポリヌクレオチド:
(i)配列番号:4のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:4のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(k)配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。 - プレプロインスリンのシグナルペプチドが、配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項13記載のポリヌクレオチド。
- 融合タンパク質が、以下の(m)〜(o)のいずれかに記載のポリペプチドである請求項9〜14のいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(m)配列番号:12のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:12のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(o)配列番号:12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。 - 請求項9〜15のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項16記載の組換えベクターが導入された形質転換細胞。
- 細胞株由来である請求項17記載の形質転換細胞。
- 細胞株が、哺乳動物由来である請求項18記載の形質転換細胞。
- 細胞が、膵臓β細胞由来である請求項17〜19のいずれかに記載の形質転換細胞。
- 請求項17〜20のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、インスリンの細胞外分泌を観察する方法。
- 請求項17〜20のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞におけるインスリンのエキソサイトーシス部位の局在を特定する方法。
- 請求項17〜20のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞外に分泌されたインスリンを定量する方法。
- 請求項17〜20のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞におけるインスリンの分泌頻度を特定する方法。
- 請求項17〜20のいずれかに記載の形質転換細胞を用いて、細胞外に分泌されたインスリンの拡散動態を観察する方法。
- 請求項17〜20のいずれかに記載の形質転換細胞を含むキット。
- 薬物のスクリーニングのためのキットである、請求項26記載のキット。
- さらにルシフェリンを含む、請求項26または27記載のキット。
- N末端側から順にプレプロインスリンとガウシアルシフェラーゼを配置してなる融合タンパク質。
- ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のタンパク質である請求項29記載のタンパク質:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列を含有するタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。 - ガウシアルシフェラーゼが、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のタンパク質である請求項30記載のタンパク質:
(a)配列番号:8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号:8のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(c)配列番号:8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。 - プレプロインスリンが、以下の(e)〜(g)のいずれかに記載のポリペプチドである請求項29〜31のいずれかに記載のタンパク質:
(e)配列番号:10のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号:10のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(g)配列番号:10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。 - プレプロインスリンが、プレプロインスリンのシグナルペプチドと、以下の(i)〜(k)のいずれかに記載のポリペプチドからなる請求項32記載のタンパク質:
(i)配列番号:4のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(j)配列番号:4のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(k)配列番号:4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。 - プレプロインスリンのシグナルペプチドが、配列番号:6のアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項33記載のタンパク質。
- 以下の(m)〜(o)のいずれかに記載のポリペプチドを含有する請求項29〜34のいずれかに記載のタンパク質:
(m)配列番号:12のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号:12のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド;および
(o)配列番号:12のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリン活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド。
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